CN103635487B - 选择性消除侵蚀性细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病的治疗。特别地，本发明涉及用抗‑NKG2A抗体治疗骨关节炎、骨质疏松、银屑病性关节炎或风湿性关节炎。

Description

选择性消除侵蚀性细胞
技术领域
本发明涉及骨侵蚀和软骨破坏的治疗。特别是使用生物药物(例如抗体)治疗骨和软骨破坏疾病。
背景技术
天然杀伤(NK)细胞是骨髓衍生的淋巴细胞，对于宿主防御某些感染和肿瘤是必需的。当活化时，它们迅速产生一系列的细胞因子，并可介导对抗感染的、应激的或致瘤性细胞的细胞毒性反应。NK细胞在慢性炎性疾病的作用正在显现，并越来越领会到，NK细胞通过它们促进树突细胞(DC)的分化和成熟以及随后T细胞应答的极化的能力，可在T和B细胞的调节中起重要作用(参见例如Cooper等 (2004) Trends Immunol. 25: 47-52； Zhang等(2007) Blood 10月1日；110(7):2484-93)。此外，研究表明NK细胞具有经由细胞介导的细胞毒性应答直接消除活化T细胞的亚组的能力(Lu (2007) Immunity. 26: 593-604)。NK细胞活性通过涉及活化和抑制性信号两者的复杂机制调节(参见，例如，Moretta等 (2001)Annu Rev Immunol 19:197-223；Moretta等(2003) EMBO j EPub 12月18日； Ravetch等(2000) Science 290:84-89； Zambello等(2003) Blood 102:1797-805；Moretta等(1997)Curr Opin Immunol 9:694-)。
已经鉴别出若干不同NK特异性受体，其涉及NK细胞介导的识别和HLA I类缺陷的靶细胞的杀伤。一种重要的抑制性NK细胞受体是CD94/NKG2A，其与非经典MHC I类分子HLA-E相互作用(参见, 例如，Braud等(1998) Nature 391:795-799； Lee等(1998) PNAS 95:5199-5204； Vance等(2002) PNAS 99:868-873； Brooks等(199) J Immunol 162:305-313； Miller等(2003) J Immunol 171:1369-75； Brooks等(1997) J Esp Med 185:795-800； Van Beneden等(2001) 4302-4311；美国专利申请号20030095965)。
CD94/NKG2A是存在于NK、NKT和T细胞亚组中的抑制性受体，其限制它们杀伤表达CD94/NKG2A-配体HLA-E(其携带得自其他MHC I类分子的前导序列的小肽)的细胞(参见，例如，WO99/28748和Braud等(1998) Nature 391:795-799)。
本领域已描述了各种抗-NKG2A的抗体。例如Sivori等(Eur j Immunol 1996；26:2487)提到鼠抗-NKG2A抗体Z270；Carretero等(J Exp Med 1999；190:1801-12)提到大鼠抗-鼠NKG2A抗体20D5；以US20030095965公布的美国专利申请描述了鼠抗体3S9，其与NKG2A、NKG2C和NKG2E结合，专利申请WO06070286公开了针对NKG2A的单克隆抗体，和专利申请WO2008/009545描述了人源化抗体humZ270，和具有与Z270的那些基本同一的可变重链和/或可变轻链的其它抗-NKG2A抗体。
概述
类风湿性关节炎(RA)是慢性炎性疾病，其中活化由多细胞亚组生产的炎性介质最终导致关节软骨和骨的破坏。通常认为，导致RA中软骨和骨破坏的主要细胞亚组分别是成纤维样滑膜细胞(FLS)和破骨细胞。表达CD94-NKG2A的T细胞和NK细胞可通过杀伤活化的促炎细胞抑制炎症。这些细胞的活化可通过一系列的不同细胞和分子(包括巨噬细胞、活化的CD4+T细胞和B细胞/浆细胞)来完成。然而，当CD94-NKG2A受体与它们的HLA-E配体在促炎细胞的表面结合(engage)时，该调节性、抗炎性活性受到抑制。通过阻断CD94-NKG2A受体并阻止它们的抑制性信号传导，NNC141-0100提高调节性CD94-NKG2A+T细胞和NK细胞的抗炎性活性，增强它们消除例如活化的促炎CD4+ T细胞和成纤维样滑膜细胞(FLS)的能力。特异性消除攻击性软骨侵蚀性FLS和抑制骨侵蚀性破骨细胞的形成，同时使其余细胞不受影响的疗法可具有优于当前RA疗法的显著优势，并可能对患者用于治疗骨关节炎(OA)和银屑病性关节炎(PsA)也有益处。
本发明公开了抗NKG2A抗体如何通过其减少退化骨的破骨细胞的形成的能力，和通过选择性提高消除退化软骨的FLS，分别减弱RA中两个主要的致病途径，即骨和软骨侵蚀。
靶向RA的现有疗法直接作用于炎性级联的单独组分，且它们关于骨侵蚀的功效对于它们的抗炎作用是次要的。能够抑制HLA-E结合的抗-NKG2A mAb，或其非竞争性可阻断CD94/NKG2A的功能，并刺激NK细胞的内源免疫调节性机制，导致选择性消除促进软骨退化、骨侵蚀的细胞，并降低IL-6(已知的促进炎症的细胞因子)。因此，用抗-NKG2A mAb的治疗性治疗可对特征为骨侵蚀或软骨破坏的疾病的发病机理有直接作用。
本发明公开了能够治疗软骨破坏和/或骨侵蚀的抗-NKG2A抗体，或其片段的用途。
本发明公开了抗-NKG2A抗体用于治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症的用途。
本发明公开了抗-NKG2A抗体用于治疗软骨破坏和/或骨侵蚀的用途，其中，所述抗-NKG2A抗体刺激选择性消除促进软骨退化或骨侵蚀的活化细胞。在本发明的一个实施方案中，所述退化软骨的细胞是成纤维样滑膜细胞(FLS)。在一个实施方案中，所述侵蚀骨的细胞是侵蚀性破骨细胞。
本发明公开了抗-NKG2A抗体用于治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症的用途，其中，抗-NKG2A抗体刺激选择性消除促进软骨退化或骨侵蚀的活化细胞。在本发明的一个实施方案中，所述退化软骨的细胞是成纤维样滑膜细胞(FLS)。在一个实施方案中，所述侵蚀骨的细胞是侵蚀性破骨细胞。
用于本发明的NKG2A抗体可是任何合适的抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗体是单克隆抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗体是人源化抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗体是全人抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗体是描述于WO2008/009545中的抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗-NKG2A单克隆抗体是描述于专利公布WO2008/009545中的humZ270。在一个实施方案中，该抗-NKG2A抗体是描述于专利公布WO09092805的单克隆抗-NKG2A抗体。在一个实施方案中，该抗-NKG2A抗体是描述于专利公布WO09092805中的humZ199。
附图简述
图1说明了由体外生成的源自类风湿性关节炎(RA)患者的滑膜组织的成纤维样滑膜细胞表达的一组细胞表面分子的表达概况。
-图1A.显示源自RA患者的成纤维样滑膜细胞(FLS)表达CD55(右直方图叠加)，但缺乏CD68 (左直方图叠加)。
-图1B.显示RA-FLS细胞表面表达用于活化NK细胞受体的若干配体(例如MICA、ULBP1、ULBP2、ULBP3、ICAM1、CD155、CD48)，如在各个直方图叠加下所指示的。如指示，RA-FLS用NKp44-FC融合物有效染色，表明RA-FLS对NKp44表达推定的配体。
-图1C.显示针对NKp44的抗体剂量-依赖地阻止可溶NKp44-FC融合蛋白在RA-FLS上结合，表明RA-FLS表达能够与NKp44受体相互作用的配体。
-图1D.显示RA-FLS表达MHC I类配体HLA-E和HLA-G，所述配体已知由NK细胞受体(例如分别为CD94/NKG2A和LIR-1)识别。
-图1E.显示RA-FLS表达死亡受体5(DR5)，而不是DR4，即已知结合TRAIL的受体。
图2显示表达NKG2A的NK细胞存在于RA滑膜中，并可在含有表达HLA-E的RA-FLS的区域中发现。
-图2A.显示用针对人NKp46的抗体染色的RA滑膜组织。深色的染色区域是表达NKp46的细胞。
-图2B.显示用针对人NKG2A的抗体染色的相同组织的相邻切片。深色区是表达NKG2A的细胞。
-图2C.显示用同种型对照抗体染色的相邻组织切片。
-图2D.显示NKG2A+细胞/mm2滑膜组织的频率，对NKp46+细胞/mm2滑膜组织的频率作图，如通过定量数字图像分析所评价的。该数据指示大部分NKG2A+细胞是发炎的滑膜组织中的NK细胞。
-图2E.显示用抗-HLA-E抗体染色的RA滑膜组织。在滑膜衬里(lining)中的细胞，包括RA-FLS，表达HLA-E。箭头指示深染的表达HLA-E的滑膜衬里FLS样细胞的区域。
-图2F.显示在滑膜衬里下层中的浸润免疫细胞表达HLA-E。
-图2G.显示用同种型对照抗体染色的RA滑膜组织。
-图2H.显示血管内皮细胞表达HLA-E。
-图3.显示NK细胞，包括源自RA患者的滑膜NK细胞，表达一组已知与RA-FLS上表达的配体结合的活化受体。
-图3A:
图3A(i)显示在源自代表性RA患者的SFMC的门控(gated)NK细胞上的NK细胞受体表达。如通过开放直方图叠加指示的，滑膜NK细胞表达NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1和TRAIL，但没有表达，或表达非常低水平的NKG2C。
图3A.(ii) 显示源自代表性健康供者的PBMC的静息CD56bright NK细胞。如开放直方图叠加指示的，CD56 bright NK细胞表达NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1和TRAIL，但没有表达，或表达非常低水平的NKG2C。
图3A. (iii)显示Nishi NK细胞。如开放直方图叠加指示的，Nishi NK细胞表达NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、DNAM1、2B4、LFA-1和TRAIL，但没有表达，或表达非常低水平的NKG2C。
图3B.显示在体外NK细胞消除粘附(adherent) RA-FLS：
图3B. (i)显示NK细胞与RA-FLS共培养过夜，导致以剂量依赖的方式消除粘附RA-FLS。
图3B (ii).显示如通过Immunospot图像分析的，当单独培养时，或与减少量的NK细胞共培养过夜时，由粘附RA-FLS覆盖的孔区域。
-图3C.显示如通过CD107a/B细胞-表面表达所测量的，当与RA-FLS共培养，而不是单独培养时，NK细胞脱粒，表明NK细胞主动地杀伤RA-FLS。
-图3D显示如通过在效应NK细胞上CD107a/B细胞表面表达测量的，掩蔽(masking)由NK细胞表达的NKG2D、NKp44、NKp46、DNAM-1或TRAIL导致RA-FLS的显著减少杀伤。
图4.显示RA-FLS通过表达能够连接抑制性CD94-NKG2A NK细胞受体的HLA-E，被保护免受NK细胞-介导的细胞毒性。
-图4A. 显示RA滑膜NK细胞(图顶部)、CD56bright健康PB-NK细胞(图中部)和Nishi NK细胞(图底部)，全都表达细胞表面NKG2A(左)，但缺乏KIR(右)。此外，Nishi细胞，而不是滑膜NK细胞或CD56bright NK细胞，表达LIR1(图中部)。
-图4B. 显示如通过CD107a/B细胞-表面表达测量的，当NK细胞与RA-FLS在抗-NKG2A存在下共培养时，NK细胞脱粒(右图)增加，但在抗LIR1存在下则没有增加(左图)。
-图4C. 显示与用同种型对照处理(中间图像)相比，当用抗-NKG2A处理(右图像)时，粘附RA-FLS的NK细胞-依赖性清除增加。在NK细胞不存在时培养的RA-FLS显示于左边的显微镜图像中。
- 图4D.显示当与自体的RA-FLS共培养时，滑膜NK细胞脱粒(14%，左上)，以及掩蔽NKG2A导致增加的脱粒(44%，右上)。当抗-NKG2A不存在(即同种型处理的培养物，左下)或存在(右下)下与自体的RA-FLS共培养时，自体的CD3+ CD8+ T细胞没有显著脱粒。
- 图4E.显示当与RA-FLS在抗-NKG2A存在下共培养时，来自健康供者的新鲜分离和未刺激的CD56bright PB-NK细胞脱粒，但当用同种型对照抗体处理时，极少这样。顶部图显示代表性的实例，底部图显示，在同种型相对于抗-NKG2A的存在下，与RA-FLS共培养的5个单独的供者CD56bright NK细胞中的% CD107a/b表达。
- 图5A.显示如通过LDH释放测定所测量的，使用NNC141-0100 (humZ270)阻断NKG2A导致NK细胞-介导的RA-FLS消除增加。NKL效应细胞显示于左边，Nishi NK细胞在右边，针对代表性RA-FLS靶细胞。
- 图5B.显示使用NNC141-0100 (humZ270)阻断NKG2A，导致代表性RA-FLS (RA-FLS2)的溶解提高，但不影响消除正常的包皮成纤维细胞的细胞系(FSK4)。
图6.显示NNC141-0100 (humZ270)抑制形成TRAP+ 多核破骨细胞:
- 图6A.显示在humIgG4同种型存在下培养7天的RA-SFMC的代表性实例。若干大的多核TRAP+细胞是可见的。
- 图6B.显示humZ270处理导致大的多核TRAP+细胞数量显著减少。
- 图6C.显示在源自RA患者的SFMC中的破骨细胞的形成，如指示，所述SFMC在同种型对照相对于抗-NKG2A(humZ270, NNC141-0100)的存在下，在培养基或IL-15中培养。在用IL-15刺激的培养物中掩蔽NKG2A导致TRAP+多核细胞数量减少。
- 图6D. 显示在源自RA患者的SFMC中的侵蚀骨矿物质的破骨细胞的形成，通过用NNC141-0100处理受到抑制。显示的是从RA患者号2357的SFMC培养物观察到的骨矿物质侵蚀的代表性实例。在IL-15和同种型mAB(左)相对于抗-NKG2A(humZ270，右)的存在下在骨学盘(osteologic disc)上培养SFMC。用von Kossa对盘染色，并使用Immunospot S5分析仪(Immunospot S5 Analyzer)分析侵蚀的区域，并显现为对较深背景的白色。
- 图6E.在补充有10ng/mL IL-15的培养基中培养源自RA患者(n=5)的SFMC。在测定的开始，将20微克/ml的人IgG4同种型对照(白色条)，或20微克/ml的NNC141-0100(humZ270，黑色条)加入到培养物中。使用Immunospot S5分析仪定量测定均值百分比+/-SEM侵蚀的盘区域。
- 图6F显示HumZ270抑制RA滑膜组织外植体培养物中的骨矿物质侵蚀。该图显示一个实例，其中，在单独培养基(对照，顶部)，同种型对照(顶部起第二个)，英利昔单抗(infliximab，IFX，顶部起第三个)或抗-NKG2A(humZ270，底部)的存在下，在骨矿物质盘上一式三份的孔中培养RA滑膜组织刮物(shaving)。浅色区域代表骨矿物质侵蚀。
图6G.显示如通过使用Immunospot分析仪的分析测定的所观察到的百分比骨矿物质侵蚀。
图7:
- 图7A.显示与同种型对照(浅灰色条)相比，用humZ270 (NNC141-0100，深灰条)处理后，在SFMC体外培养物中在24小时所测量的细胞因子水平的调节。在掩蔽NKG2A后观察到IL6水平的显著减少。此外，观察到M-CSF稍微增加。
- 图7B. 显示在抗-NKG2A(NNC141-0100, humZ270)相对于同种型对照的存在下，在RA-SFMC培养物(n=11)中生产的IL-6水平的成对比较。
- 图7C.显示在源自RA患者的SFMC的离体培养物中，抗-NKG2A抑制基线(即单独培养基)和IL-15刺激的IL-6生产两者。显示两名代表性RA患者的均值和SD。
图8. 显示存在于RA滑膜组织中的NK细胞表达抑制性NKG2A受体，并主要地定位在与表达HLA-E(即CD94-NKG2A的配体)的滑膜细胞相邻的淋巴集结中。
- 8A.显示用抗-NKp46抗体对来自ID 1144-09的RA滑膜组织的NK细胞染色。
- 8B.显示用抗-NKp46抗体对来自ID 1591-08的RA滑膜组织的NK细胞染色。
- 8C.显示用Z199抗体(抗-NKG2A抗体)对来自ID 1144-09的RA滑膜组织的NKG2A染色。
- 8D.显示用Z199抗体(抗-NKG2A抗体)对来自ID 1591-08的RA滑膜组织的NKG2A染色。
- 8E.显示用3D12抗体对来自ID 1144-09的RA滑膜组织的HLA-E染色。
- 8F.显示用3D12抗体对来自ID 1591-08的RA滑膜组织的HLA-E染色。
- 8G.显示用抗-CD3抗体对来自ID 1144-09的RA滑膜组织的T细胞染色。
- 8H.显示用抗-CD3抗体对来自ID 1591-08的RA滑膜组织的T细胞染色。
- 8I.显示用IgG2b同种型对照抗体对来自ID 1144-09的RA滑膜组织染色。
- 8J.显示用IgG2b同种型对照抗体对来自ID 1591-08的RA滑膜组织染色。
- 8K.显示来自ID 1595-08的NKp46+ NK细胞的高倍放大图片
- 8L.显示来自ID 1595-08的NKG2A+细胞M的高倍放大图片。
- 8M.显示对于来自15位RA患者的滑膜中的NKG2A+细胞的数量与NKp46+ NK细胞数量的相关性的数字图像分析。
图9.显示NKG2A和它的配体HLA-E，在骨关节炎(OA)患者的滑膜中表达。
- 9A.描述在浸润淋巴细胞中的NKG2A+细胞(Z199抗体)。
- 9B.描述通过浸润免疫细胞、内皮细胞和滑膜细胞的HLA-E表达(3D12抗体)。
- 9C.显示对于OA滑膜中NKG2A+细胞频率与NK细胞频率的相关性的数字图像分析。
图10.显示发现CD94-NKG2A配体不但在来自RA和OA患者，而且在来自PsA患者的发炎的滑膜中表达。
- 10A.描述来自RA患者的滑膜组织样品的染色。
- 10B.描述来自PsA患者的滑膜组织样品的染色。
- 10C.描述来自RO(OA????)患者的滑膜组织样品的染色。
- 10D.描述来自正常对照的滑膜组织样品的染色。
图11显示以下的氨基酸序列：
- 11A.: SEQ. ID. NO. 1.；humNKG2A,
- 11B.: SEQ. ID. NO. 2.；humZ270抗体的重链可变结构域(VH)，
- 11C.: SEQ. ID. NO. 3.；humZ270抗体的轻链可变结构域(VL)，
- 11D.: SEQ. ID. NO. 4.；humZ199抗体的重链可变结构域(VH)，
- 11E.: SEQ. ID. NO. 5.；humZ199抗体的轻链可变结构域(VL)。
描述
本文所称的术语“抗体”，指得自种系免疫球蛋白序列的多肽。该术语包括全长抗体和其任何抗原结合片段或单链。本文所用术语“抗体”、“单克隆抗体”和“mAb”意指有能力与抗原特异性结合的免疫球蛋白分子和其片段。药学上特别感兴趣的免疫球蛋白亚类是属于IgG家族的那些，其可再细分成同种型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。IgG分子由通过两个或若干个二硫键互连的两个重链与两个轻链(每个通过二硫键与每个重链连接)组成。IgG重链由四个Ig-结构域组成，包括可变结构域(VH)和三个恒定结构域(CH1、CH2和CH3)。每个轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。重链和轻链可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。VH和VL区可再细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，其中散布着更加保守的被称为架构区(FR)的区。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，按下列顺序从氨基-端至羧基-端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。
抗体的恒定区可介导抗体与宿主组织或因子的结合，所述宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)、Fc受体(FcR)和经典补体系统的第一成分。与FcR和C1q结合可介导例如ADCC或CDC作用。
本发明的抗体可以是任何结合NKG2A的抗体，humZ270抗体(SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3)，或humZ199抗体(SEQ. ID. NO. 4和SEQ. ID. NO. 5)，或本发明的任何其它抗体，或这些抗体中任何一种的变体。
本文所用术语人源化Z270或humZ270或hZ270，包含专利申请WO08009545中公开的抗体，所述专利申请通过引用结合于本申请中。本文所用术语人源化Z199或humZ199，包含专利公布WO09092805中的公开的抗体，所述专利公布通过引用结合于本专利申请中。
本文所用术语Ab包含与其相应的Ag特异性结合的抗体，或其片段。抗原-结合片段的实例包括但不限制于：Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab')2、Fv(典型地抗体单臂的VL和VH结构域）、单链Fv(scFv；参见例如Bird等, Science 1988； 242:42S-426；和Huston等PNAS1988； 85:5879-5883)、dsFv、Fd(典型地VH和CHI结构域)和dAb(典型地VH结构域)片段；VH、VL、VhH和V-NAR结构域；包含单个VH和单个VL链的单价分子；小抗体(minibodies)、二抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、四抗体(tetrabodies)和kappa体(kappa body)（参见例如Ill等，Protein Eng 1997；10：949-57)；骆驼IgG；IgNAR；以及一种或多种分离的CDR或功能性互补位，其中分离的CDR或抗原结合残基或多肽可缔合或连接在一起以形成功能性抗体片段。各种类型的抗体片段已经描述或综述于，例如Holliger和Hudson，NatBiotechnol 2005；2S，1126-1136；WO2005040219，以及公布的美国专利申请20050238646和20020161201中。
术语抗体的“抗原-结合片段”，指抗体的一个或多个片段，所述片段保留特异性结合抗原(例如NKG2A或描述于本文的另外的靶分子)的能力。已显示抗体的抗原结合功能可通过全长抗体的片段进行。包括在术语抗体的“抗原结合片段”内的结合片段的实例包括Fab片段、F(ab')2片段、Fab’片段、Fd片段、Fv片段、ScFv片段、dAb片段和分离的互补决定区(CDR)。单链抗体(例如scFv)和重链抗体(例如VHH)和单结构域骆驼抗体亦旨在包括在术语抗体的“抗原-结合部分”内。这些抗体片段可使用本领域技术人员已知的常规技术获得，且这些片段可以与完整抗体相同的方式针对效用(utility)进行筛选。
“Fab”片段包括轻链的可变结构域和恒定结构域，及重链的可变结构域和第一恒定结构域(CH1)。Fab'片段包括与重链或轻链的一个或多个半胱氨酸羧基端连接。F(ab')2抗体片段包含一对Fab片段，它们通常在它们的羧基端附近通过铰链半胱氨酸共价连接。在本领域中也已知抗体片段的其它化学偶联。Fab片段保留母体抗体结合它的抗原的能力，可能具有较低的亲和力。F(ab')2片段能够二价结合，而Fab片段仅能单价结合。通常，Fab片段缺乏恒定CH2和CH3结构域，即Fc部分，其中与Fc受体的相互作用会发生。所以，Fab片段通常没有效应功能。
“Fv”片段是包含完整抗原识别和结合位点的抗体片段，并通常包含紧密结合的一个重链和一个轻链可变结构域的二聚体，所述结合本质上可以是共价的，例如在单链可变结构域片段(scFv)中。在该结构中，每个可变结构域的三个高变区互相作用以定义在VH-VL二聚体表面上的抗原-结合位点。共同地，六个高变区或其亚组赋与抗体的抗原结合特异性。然而，即使仅包含对抗原特异的三个高变区的单个可变结构域也具有识别和结合抗原的能力，但是通常比整个结合位点的亲和力低(Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci.USA, 93: 6280-6285, 1996)。例如，仅具有重链可变结构域(VHH)的天然存在的骆驼样抗体(camelid antibody)可结合抗原(Desmyter等, J. Biol. Chem., 277: 23645-23650,2002； Bond等, J. Mol. Biol. 2003； 332: 643-655)。
“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于单个多肽链中。通常，Fv多肽进一步在VH和VL结构域间包含多肽接头，其使scFv能够形成所需的结构用于抗原结合。对scFv的综述，参见Pluckthun, 1994, 在: The Pharmacology ofMonoclonal Antibodies(单克隆抗体的药理学), 113卷, Rosenburg和Moore编辑,Springer-Verlag, New York, 269-315页。
术语“二抗体”指具有两个抗原-结合位点的小抗体片段，其中，片段包含在同样的多肽链(VH和VL)中与轻链可变结构域(VH)连接的重链可变结构域(VH)。通过使用太短而不能允许同一链上的两个可变结构域之间配对的接头，迫使可变结构域与另外的链的互补结构域配对，产生两个抗原-结合位点。二抗体在例如EP 404,097； WO 93/11161；和Hollinger等, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448中描述更加全面。
措辞“线性抗体(linear antibodies)”，指在Zapata等, 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062中描述的抗体。简要地，这些抗体包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，所述区段与互补轻链多肽一起形成一对抗原结合区。线性抗体可以是双特异性或单特异性的。
本文所用术语“单抗体(monobody)”，指具有重链可变结构域而没有轻链可变结构域的抗原结合分子。单抗体可在没有轻链时结合抗原，并典型地具有三个高变区，例如，命名为CDRH1、CDRH2、 和CDRH3的CDR。重链IgG单抗体具有由二硫键连接的两个重链抗原结合分子。重链可变结构域包含一个或多个高变区，优选CDRH3或HVL-H3区。
术语“高变区”，当在本文中使用时，指负责抗原-结合的抗体的氨基酸残基。高变区包含来自“互补决定区”或“CDR”(由轻链可变结构域中的残基24-34 (L1)、50-56 (L2)和89-97 (L3)，以及重链可变结构域中的31-35 (H1)、50-65 (H2)和95-102 (H3)的序列定义；Kabat等, Sequences of Protein of Immunological Interest, 第5版，PublicHealth Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))的氨基酸残基，和/或来自“高可变环”(由结构定义的，且对于每个抗体是不同的；参见，例如：Chothia和Lesk, 1987,J. Mol. Biol. 196:901-917)的那些残基。在一个实例中，HVL残基可包括轻链可变结构域中的26-32 (L1)、50-52 (L2)和91-96 (L3)，以及重链可变结构域中的26-32 (H1)、53-55 (H2)和96-101 (H3)。
使用常规的重组或蛋白工程技术可获得抗体片段，并且可按与完整抗体相同的方式，针对结合NKG2A或另外的功能，筛选片段。
本发明的抗体片段可通过截短制得，例如通过从多肽的N和/或C端去除一个或多个氨基酸。也可通过一个或多个内部缺失产生片段。
本发明的抗体可以是，或可包含如下抗体的片段：任何抗-NKG2A抗体，humZ270抗体(SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3)，或humZ199抗体(SEQ. ID. NO. 4 和SEQ. ID.NO. 5)或本发明的任何其它抗体，或这些抗体中任一种的变体。本发明的抗体可以是，或可包含这些抗体或其变体中的一种的抗原结合部分。例如，本发明的抗体可以是这些抗体或其变体中的一种的Fab片段，或它可以是得自这些抗体或其变体中的一种的单链抗体。
本发明的抗体可以是人抗体或人源化抗体。本文所用术语“人抗体”意在包括具有可变区的抗体，其中，框架和CDR区两者源自人种系免疫球蛋白序列。此外，如果抗体包含恒定区，则恒定区也源自人种系免疫球蛋白序列。本发明的人抗体可包含不是由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或体内体细胞突变引入的突变)。另一方面。本文所用术语“人抗体”，并不意在包括这样的抗体：其中，源自另外的哺乳动物物种(例如鼠)的种系的CDR序列已被移植到人框架序列上。
这样的人抗体可以是人单克隆抗体。这样的人单克隆抗体可通过包含与无限增殖化细胞融合的B细胞的杂交瘤制备，所述B细胞得自具有包含人重链转基因和轻链转基因的基因组的转基因非人动物，例如转基因小鼠。
人抗体可从序列文库中分离，所述序列文库建立于人种系序列的筛选，用天然和合成序列多样性进一步多样化。
人抗体可通过体外免疫接种人淋巴细胞，接着用EB病毒转化淋巴细胞来制备。
术语“人抗体衍生物”，指人抗体的任何修饰形式，例如抗体和另外作用剂或抗体的缀合物。
本文所用术语“人源化抗体”，指人/非人嵌合抗体，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列(CDR区)。因此，人源化抗体是这样的人免疫球蛋白(受者抗体)：其中来自受者的高可变区的残基被来自非人物种(例如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)高变区的，具有所需特异性、亲和力和能力的残基(供者抗体)置换。在一些例子中，人免疫球蛋白的FR残基被相应的非人残基置换。这样的修饰的实例是引入一个或多个所谓的回复突变。
此外，人源化抗体可包含在受者抗体或供者抗体中未发现的残基。进行这些修饰以便进一步改善抗体性能。通常，人源化抗体将包含基本上所有的至少一种，典型两种可变结构域，其中，所有或基本上所有的高可变环对应于非人免疫球蛋白的那些，并且所有或基本上所有的FR残基是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体可任选包含至少一部分的免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地人免疫球蛋白的该部分。
本文所用术语“嵌合抗体”，指这样的抗体：它的轻链和重链基因已通常通过基因工程，由源自不同物种的免疫球蛋白可变和恒定区基因而构建。例如，可将来自小鼠单克隆抗体的基因的可变区段与人恒定区段连接。
抗体的片段可结晶区(“Fc区”/”Fc结构域”)是包含恒定CH2和CH3结构域的抗体的“尾部”区。Fc结构域可与被称为Fc受体的细胞表面受体，以及补体系统的一些蛋白相互作用。Fc区使抗体能够激活免疫系统。在本发明一个方面，可改造抗体以包括在Fc区内的修饰，典型地改变一个或多个它的功能性质，例如血清半寿期、补体结合、Fc-受体结合、蛋白稳定性和/或抗原-依赖的细胞的细胞毒性或其缺乏。此外，本发明的抗体可经化学修饰(例如，可将一个或多个化学部分与抗体连接)，或经修饰以改变它糖基化，以再次改变抗体的一个或多个功能性质。优选地，修饰的Fc结构域包含一个或多个，优选所有以下的突变，所述突变将分别导致对某些Fc受体(L234A、L235E和G237A)降低的亲和力，和减少的C1q-介导的补体结合(A330S和P331S)。
本发明的抗体的同种型可以是IgG，例如IgG1、例如IgG2、例如IgG4。如果需要，可通过已知技术“转换”抗体的类别。例如，原先作为IgM分子生产的抗体可类别转换成IgG抗体。类别转换技术也可用于将一种IgG亚类转化为另一种，例如从IgG1到IgG2或IgG4；从IgG2到IgG1或IgG4；或从IgG4到IgG1或IgG2。通过组合来自不同IgG亚类的区，改造抗体以产生恒定区嵌合分子，也可进行。
本文所用术语“表位”，在“抗原结合多肽”，例如抗体(Ab)，与它对应的“抗原”(Ag)之间的分子相互作用的上下文中定义。术语抗原(Ag)指用于免疫接种免疫活性的脊椎动物以生产识别该Ag的抗体(Ab)的分子实体。本文中，Ag被更广泛地称呼，且通常意在包括被Ab特异性识别的靶分子，因此包括在免疫接种过程中用于引发Ab的分子的片段或模拟物。
通常，“表位”指在Ag上的Ab特异性结合的区域或区，即与Ab物理接触的区域或区。蛋白表位可包含Ag中直接涉及与Ab结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性组分)，和没有直接涉及结合的其它氨基酸残基，例如由Ab有效阻断的Ag的氨基酸残基(也就是说，氨基酸残基在Ab的“溶剂-排除的表面(solvent-excluded surface)”和/或“足迹”内)。除另有说明，否则本文的术语表位包括与抗-NKG2A抗体或根据本发明的另外的NKG2A-特异性作用剂特异性结合的NKG2A的任何特定区中的两种类型的结合位点(例如，在某些情况下，本发明涉及直接结合特定氨基酸残基的抗体)。NKG2A可包含许多不同的表位，其可无限制包括：(1)线性肽表位；(2)构象表位，其由在成熟NKG2A构象中邻近彼此坐落的一个或多个非连续氨基酸组成；和(3)翻译后表位，其全部或部分由与NKG2A共价连接的分子结构组成，例如碳水化合物基团。
对于给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位，可使用多种实验性和计算性的表位作图法在不同级别的细节上进行定义和表征。实验性方法包括：诱变、X射线晶体分析法、核磁共振(NMR)光谱法、氢氘交换质谱(HX-MS)和各种竞争结合法；本领域已知的方法。因为每种方法依赖于独特的原理，表位的描述最终与测定其的方法紧密相关。因此，取决于采用的表位作图方法，对于给定的Ab/Ag对的表位将进行不同定义。
在其最详细的级别上，用于Ab和Ag间相互作用的表位，可通过定义存在于Ag-Ab相互作用中的原子接触的空间坐标，以及关于它们对结合热力学的相对贡献的信息，进行定义。在不太详细的级别上，表位可通过定义Ag和Ab之间的原子接触的空间坐标进行表征。在更不详细的级别上，表位可通过其包含的氨基酸残基(如通过特殊标准，例如Ab和Ag中的原子间的距离定义的)进行表征。在更加不详细的级别上，表位可通过功能，例如通过与其它Ab的竞争结合，进行表征。可更一般性的定义表位为包含被另外的氨基酸取代将改变Ab和Ag间的相互作用的性质的氨基酸残基。
在通过Ab(例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X射线衍生的晶体结构的上下文中，本文的术语表位，除非上下文另外指定或矛盾，明确地定义为NKG2A残基，其特征为具有与Ab中的重原子的距离在4 Å之内的重原子(即非氢原子)。
从在不同级别的细节上获得表位的描述和定义(依赖于使用的表位作图法)这样的事实，可得出结论，即在相同Ag上对于不同Ab的表位的比较，可类似地在不同级别的细节上进行。
在氨基酸级别描述的表位，例如由X射线结构测定的，如果它们包含同一套的氨基酸残基，则认为它们是同一的。如果表位共享至少一个氨基酸，则认为表位是重叠的。如果表位没有共享氨基酸残基，则认为表位是区别的(独特的)。
如果相应的Ab的结合是互相排斥的，即一个Ab的结合排斥其它Ab的同时结合，则认为以竞争结合表征的表位是重叠的。如果Ag能同时容纳两个相应Ab的结合，则认为表位是区别的(独特的)。
术语“互补位”的定义以反向的角度衍生自以上“表位”的定义。因此，术语“互补位”指在Ab上的与Ag特异性结合的区域或区，即抗体通过其与Ag物理接触。
在通过Ab(例如Fab片段)和它的Ag之间的复合物的空间坐标定义的X射线衍生的晶体结构的上下文中，本文的术语互补位，除非上下文另外指定或矛盾，明确定义为Ag残基，其特征为具有与NKG2A中的重原子距离在4 Å之内的重原子(即非氢原子)。
对于给定的抗体(Ab)/抗原(Ag)对的表位和互补位，可通过常规方法鉴定。例如，可通过评价抗体结合不同片段或变体NKG2A多肽的能力测定表位的一般位置。使用常规的方法，还可测定NKG2A内与抗体接触的特异性氨基酸(表位)，和抗体中与NKG2A接触的特异性氨基酸(互补位)。例如，可使抗体和靶分子组合，并使Ab/Ag复合物结晶。可测定复合物的晶体结构，并用于鉴定抗体和它的靶之间相互作用的特异性位点。
与相同抗原结合的抗体可关于它们同时结合它们共同抗原的能力进行表征，并可经受“分箱”(binning)。在上下文中，术语“分箱”指一种将结合相同抗原的抗体分组的方法。抗体的“分箱”可基于在测定中两个抗体与它们共同抗原的竞争结合，所述测定基于标准技术，例如表面等离振子共振(SPR)、ELISA或流式细胞术。
通过参照抗体定义“箱”。如果第二抗体不能与参照抗体同时结合抗原，则认为第二抗体与参照抗体属于同样的“箱”。在这样的情况下，参照和第二抗体为结合抗原而竞争，所以该对抗体被称为“竞争性抗体”。如果第二抗体能够与参照抗体同时结合抗原，则认为第二抗体属于区别的“箱”。在这样的情况下，参照和第二抗体没有为结合抗原而竞争，所以该对抗体被称为“非竞争性抗体”。
抗体“分箱”没有提供关于表位的直接信息。竞争性抗体，即属于相同“箱”的抗体，可具有相同的表位、重叠的表位，或甚至区别的表位。后者的情况是如此，如果在抗原上与它的表位结合的参照抗体，占据了在抗原上第二抗体接触它的表位所需的空间(位阻)。非竞争性抗体具有区别的表位。
术语“结合亲和力”在本文中用作为两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间非共价相互作用强度的度量。术语“结合亲和力”用于描述单价相互作用(内在活性)。
经由单价相互作用的两个分子(例如，抗体或其片段，和抗原)之间的结合亲和力，可通过测定解离常数(KD)来定量测定。继而，可通过对复合物形成和解离动力学的测量，例如通过SPR方法，来测定KD。对应于单价复合物缔合和解离的速率常数，被分别称为缔合速率常数ka(或kon)和解离速率常数kd(或koff)。KD通过等式KD = kd / ka与ka和kd相联系。
根据以上定义，与不同分子相互作用相关的结合亲和力，例如不同抗体对于给定的抗原的结合亲和力的比较，可通过比较各个抗体/抗原复合物的KD值进行比较。
类似地，可通过测定，并比较感兴趣的相互作用(例如抗体和抗原之间的特异性相互作用)的KD值与不感兴趣的相互作用的KD值，来评价相互作用的特异性。
典型地，抗体关于靶的KD将是关于其它非靶分子(例如环境中不相关的材料或伴随材料)的KD的1/2，优选1/5，更优选1/10。更优选地，KD将是1/50，例如1/100或1/200；甚至更优选1/500，例如1/1,000或1/10,000。
通过众所周知的方法可直接测定该解离常数的值，例如，通过评价配体(例如抗体)对靶的结合能力的标准测定是本领域已知的，并包括例如ELISA、蛋白质印迹、RIA和流式细胞术分析。通过本领域已知的标准测定，例如SPR，还可评价抗体的结合动力学和结合亲和力。
可进行竞争性结合测定，其中，将抗体与靶的结合，和该靶的另外的配体(例如另外的抗体)与该靶结合，进行比较。
本发明的抗体对于它的靶可具有以下KD：1×10-7M或更小、1×10-8M或更小，或1×10-9M或更小，或1×10-10M或更小、1×10-11M或更小，或1×10-12M或更小。]本发明的抗体的KD可小于[0.8 nM，例如小于0.7 nM，例如小于0.6 nM，例如小于0.5 nM，例如小于0.4 nM，例如小于0.3 nM，例如小于0.2 nM，例如小于0.1 nM，例如小于0.05 nM，例如小于0.025 nM，例如小于0.015 nM，例如在0.015 nM和0 nM之间。
如本领域已知的，术语“同一性”指如通过比较序列确定的两个或更多个多肽序列之间的关系。在本领域中，“同一性”还指如通过两个或更多的氨基酸残基的串(string)之间匹配的数量确定的，多肽之间的序列相关程度。“同一性”测量两个或更多序列中较小的之间相同匹配的百分比，其中空位比对(如有)，通过特定的数学模型或计算机程序(“算法”)解决。相关多肽的同一性可通过已知方法容易地计算。这样的方法包括但不限于描述于以下的那些：Computational Molecular Biology, Lesk, A. M.,编辑, OxfordUniversity Press, New York, 1988； Biocomputing: Informatics and GenomeProjects, Smith, D. W., 编辑, Academic Press, New York, 1993； ComputerAnalysis of Sequence Data, 部分1, Griffin, A. M.,和Griffin, H. G., 编辑.,Humana Press, New Jersey, 1994； Sequence Analysis in Molecular Biology, vonHeinje, G., Academic Press, 1987； Sequence Analysis Primer, Gribskov, M.和Devereux, J., 编辑, M. Stockton Press, New York, 1991；和Carillo等, SIAM J.Applied Math. 48, 1073 (1988)。
设计用于确定同一性的优选方法以得到所测序列之间的最大匹配。确定同一性的方法描述于公众可得的计算机程序中。用于确定两个序列之间同一性的优选计算机程序方法包括GCG程序包，包括：GAP (Devereux等, Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984)；Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP、BLASTN和FASTA (Altschul等, J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))。BLASTX程序可公开得自美国国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源(BLAST Manual, Altschul等 NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894； Altschul等, 见上)。众所周知的Smith Waterman算法也可用来确定同一性。
例如，使用计算机算法GAP(Genetics Computer Group, University ofWisconsin, Madison, Wis.)，将待确定百分比序列同一性的两个多肽比对，用于优化它们相应氨基酸的匹配(如通过算法确定的“匹配跨度(matched span)”)。空位开放罚分(其被计算为3乘以平均对角；“平均对角”是使用的比较矩阵的对角的平均；“对角”是由特定比较矩阵分配给各个完美氨基酸匹配的分数或数和空位延伸罚分 (其通常是{分数(1/10)}乘以空位开放罚分)，以及比较矩阵，例如PAM 250或BLOSUM 62，与算法共同使用。算法也使用标准比较矩阵(对于PAM 250比较矩阵，参见 Dayhoff 等, Atlas of Protein Sequenceand Structure, 卷5, 增刊3 (1978)；对于BLOSUM 62比较矩阵，参见Henikoff等, Proc.Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992))。
对于肽序列比较的优选参数包括以下：
算法：Needleman等, J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970)； 比较矩阵：来自Henikoff等, PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)的BLOSUM 62；空位罚分：12，空位长度罚分：4，相似性阈值：0。
GAP程序与以上参数一起使用。使用GAP算法，前述参数是用于比较肽(连同对末端空位无罚分)的默认参数。
术语“相似性”是相关概念，但与“同一性”相对，指包括同一匹配和保守取代匹配两者的序列关系。如果两个多肽序列具有，例如 (分数(10/20))相同氨基酸，且剩余的全都是非保守取代，那么百分比同一性和相似性两者会是50%。如果，在同样的实例中，有5个更多的保守取代位置，那么百分比同一性保持50%，但是百分比相似性会是75%((分数(15/20)))。因此，在有保守取代的情况下，两个多肽间相似性的程度将高于这两个多肽间的百分比同一性。
“受体”被定义为存在于细胞的表面或内部的分子结构。当配体结合时，受体产生特征性细胞应答，即生物活性。对于受体的配体被定义为能够选择性结合受体的任何分子(例如肽、多肽、碳水化合物、小分子或离子)。激动配体(“激动剂”)是这样的配体：当在某种程度上与受体结合时能够引发对于受体的特征性应答。拮抗配体(“拮抗剂”)是有能力结合受体并在某种程度上阻断激动剂的作用的配体，例如受体的天然配体。
NKG2A (OMIM 161555，其全部公开内容通过引用结合于本文中)是转录物的NKG2组的成员(Houchins,等 (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020)。NKG2A由跨度25kb显示出一些差别剪接的7个外显子编码。NKG2A与CD94一起形成发现于NK细胞、α/β T细胞、γ/δ T细胞和NKT细胞的亚组的表面上的异二聚体抑制性受体CD94/NKG2A。与抑制性KIR受体类似，其在其胞质结构域具有ITIM。如用于本文中，“NKG2A”指NKG2A基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型(isoform)。还包括与野生型全长NKG2A共享一个或多个生物学性质或功能，并共享至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。人NKG2A在3个结构域中包含233个氨基酸，其中胞质结构域包含残基1-70，跨膜区包含残基71-93，和胞外区包含残基94-233，所述氨基酸序列如下：
HLA-E(OMIM 143010，其全部公开内容通过引用结合于本文中)是非经典MHC分子，其在细胞表面上表达，并通过源自其它MHC I类分子的信号序列的肽的结合调节。HLA-E结合天然杀伤(NK)细胞和一些T细胞，特异性结合CD94/NKG2A、CD94/NKG2B和CD94/NKG2C(参见，例如，Braud等(1998) Nature 391:795-799，其全部公开内容通过引用结合于本文中)。HLA-E的表面表达足以保护靶细胞免受CD94/NKG2A+ NK、T或NKT细胞克隆的溶解。如用于本文中，“HLA-E”指HLA-E基因或编码的蛋白的任何变体、衍生物或同种型。还包括与野生型全长HLA-E共享一个或多个生物学性质或功能，并共享至少70%、80%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或更高核苷酸或氨基酸同一性的任何核酸或蛋白序列。
在本发明的上下文中，“与人CD94/NKG2A受体结合的作用剂”或“抗-NKG2A抗体”或“NKG2A结合抗体”，指使用任何标准测定，与人CD94/NKG2A受体具有可检测的结合的任何作用剂和/或抗体，在所述测定中，所述作用剂和/或抗体在CD94/NKG2A或NKG2A的存在下孵育，并经由以下检测结合：例如，放射标记，物理方法例如质谱，或使用例如细胞荧光测定分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记。任何结合的量大于对于对照非特异性作用剂所见的量，表明该作用剂与靶结合。
本文所用术语人源化Z270或humZ270或hZ270，包含在专利申请WO08009545中公开的抗体(SEQ. ID. NO. 2和SEQ. ID. NO. 3)，所述申请通过引用结合于本申请中。本文所用术语人源化Z199或humZ199，包含专利公布WO09092805中公开的抗体(SEQ. ID. NO. 4.和SEQ. ID. NO. 5)，所述公布通过引用结合于本专利申请中。
本文中“延长性基团(protractive group)”/“延长半寿期的部分”/“延长半寿期的部分”理解为与一个或多个氨基酸侧链(site chain)官能团例如a-SH、-OH、-COOH、-CONH2、-NH2，或一个或多个N-和/或O-聚糖结构连接的一个或多个化学基团，并且当其与治疗蛋白/肽缀合时，可提高这些蛋白/肽的体内循环半寿期。“延长性基团”的实例包括但不限于：生物相容性脂肪酸和其衍生物、羟烷基淀粉(HAS)例如羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚(Glyx-Sery)n (HAP)、透明质酸(HA)、Heparosan聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物(PC聚合物)、Fleximer、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽、CTP肽和及其任何组合。
本文中术语“NKG2A Fc融合蛋白”意在包括与可源自任何抗体同种型的Fc结构域融合的NKG2A。
炎症是组织对多种刺激(包括病原体、损伤的细胞或刺激物)的复杂生物应答。炎症是生物体的保护性应答以去除或分离有害的刺激，并启动愈合过程。炎症不是感染的同义词―感染是由外源病原体对生物体的入侵，而炎症是免疫系统对病原体的应答。
炎症是涉及多组分的级联事件，包括脉管系统(例如，内皮细胞、周细胞、平滑肌细胞)，免疫系统的细胞(例如，T和B淋巴细胞、单核细胞、树突细胞、嗜中性粒细胞)，细胞衍生的可溶介质(细胞因子、趋化因子)，以及还有在被靶向的组织中的居留细胞(residentcell)(例如，上皮细胞、滑膜成纤维细胞、神经细胞)。急性炎症持续时间短(几小时到几天)，并主要涉及组织中的居留细胞、白细胞的迁移，及体液和血浆蛋白渗出到炎症位点。这起因于血管流量改变、细胞活化和引起白细胞从循环到受伤位点的细胞组分。慢性炎症持续时间延长，其中，活性炎症、组织破坏和尝试修复同时进行。慢性炎症可起因于持续感染、延长和重复暴露于毒剂，或由于自身免疫，即身体的免疫细胞攻击它们自己的组织，引起损害的现象。
正常地，免疫系统能够区分身体的正常细胞(或“自己”)和外来的病原体或异常细胞(“非自己”)。在某些情况下，免疫系统丧失识别“自己”为正常的能力，并不适当地启动对组织或细胞的应答。该应答源于对自己耐受的丧失，并称为“自身免疫”。起因于自身免疫的病理常常具有严重的临床后果，且是世界特别是发达国家中的一种主要健康问题。这样的自身免疫疾病的实例包括：类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病性关节炎、全身性红斑狼疮(SLE)、狼疮性肾炎、I型糖尿病、格雷夫斯病(Grave’s disease)、炎性肠病(IBD)、克罗恩病(Crohns disease; CD)、溃疡性结肠炎(UC)、肠易激综合征、多发性硬化(MS)、自身免疫性心肌炎、川崎病(Kawasaki disease)、冠状动脉疾病、慢性阻塞性肺病、间质性肺疾病、自身免疫性甲状腺炎、硬皮病、系统性硬化病、骨关节炎、遗传过敏性皮炎、白癜风、移植物抗宿主疾病、干燥综合症(Sjogrens’s syndrome)、自身免疫性肾炎、肺出血肾炎综合症(Goodpasture’s syndrome)、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病(chronic inflammatorydemyelinating polyneutopathy)、过敏反应、哮喘和由急性或慢性炎症导致的其它自身免疫疾病。
免疫系统丧失识别“自己”为正常的能力和针对组织或细胞的后续应答的过程，导致丧失耐受，即“自身免疫”状态。起因于自身免疫的病理常常具有严重的临床后果，且是世界上一种主要健康问题。
现可获得靶向的生物学治疗用于治疗某些自身免疫疾病和/或慢性炎性疾病。例如，类风湿性关节炎患者可用抗-CD20，即TNF拮抗剂(可溶的TNFR或抗-TNF-α)治疗；银屑病患者可用抗-CD11a治疗；多发性硬化患者可用INF-β治疗；溃疡性结肠炎患者可用抗-TNF-α治疗，和克罗恩病患者可用抗-TNF-α或抗-CD4整联蛋白治疗。不幸地是，接受用这些生物制剂的任一种治疗的大量患者可经历多种副作用，可无法应答，和/或可出现针对药物的中和抗体。仍然需要替代生物学药剂，其可特异性靶向病理，但其不影响健康细胞/组织，其导致较少或不那么严重的副作用，其可长期使用和/或其不导致中和抗体的产生。本发明涉及自身免疫和/或慢性炎性疾病患者中这些未满足的需求，公开适合在这样的治疗中使用的抗体。
类风湿性关节炎(RA)是全身性疾病，其影响整个身体，且是关节炎最常见形式的一种。它的特征在于关节的炎症，其引起疼痛、僵硬、发热(warmth)、发红和肿胀。该炎症是炎性细胞侵入关节的结果，且这些炎性细胞释放可消化骨和软骨的酶。因此，该炎症可引起严重的骨和软骨损害，和关节退化(joint deterioration)，和严重疼痛等其它生理效应。涉及的关节可丧失其形状和排列，导致疼痛和活动丧失。
本领域中已知有若干个类风湿性关节炎的动物模型。例如，在胶原诱导的关节炎(CIA)模型中，小鼠发展类似人类风湿性关节炎的炎性关节炎。因为CIA与RA共享相似的免疫学和病理学特征，这使得它成为筛选潜在的人抗-炎性化合物的合适模型。在该模型中的功效通过关节肿胀的降低来测量。临床中在RA中的功效通过减少患者症状的能力来测量，其作为关节肿胀、红细胞沉降率、C-反应性蛋白水平和血清因子水平的组合来测量。
与RA有关的软骨侵蚀或软骨破坏主要通过存在于滑膜内膜衬里的成纤维样滑膜细胞(FLS)的亚组驱动。FLS，有时也称为B型滑膜细胞或RA滑膜成纤维细胞(RASF)，是间充质来源的，并通过生产保持炎症的细胞因子来起重要作用，且它们是促成软骨破坏的蛋白酶的主要生产者。在RS中，FLS发展能够入侵到胞外软骨基质并进一步使关节损害加剧的攻击性表型。
本申请所指的软骨侵蚀或软骨破坏，是软骨组织的丧失或退化。
骨吸收，即由破骨细胞去除骨组织，是破骨细胞独特的功能，所述破骨细胞是源自单核细胞细胞谱系的特化的多核细胞。它们的分化由以下调节：巨噬细胞集落-刺激因子、RANK配体和骨保护素以及可正向或负向调节它们的分化、活化和/或存活的多种其它介质。破骨细胞发展特化的细胞骨架，其允许它建立在它自己和骨之间的隔离的微环境，其中骨蛋白和矿物质的退化通过涉及质子运输和酶释放的过程而发生。
本申请所指的骨侵蚀，是骨量或骨矿物质密度的丧失，这在骨吸收的速率稍微(或多于稍微)但持续高于骨形成速率时发生。
骨关节炎(OA)是关节炎最流行的类型，特别是在65岁以上的成年人中。该疾病的特征在于频繁导致慢性疼痛和残疾的慢性退化性关节病。由于在OA病例定义中的不同，特定关节中OA的报告发病率和流行率变化广泛。例如，OA可通过放射照相标准(放射照相OA)单独定义，通过典型症状(症状性OA)定义，或通过两者定义。使用放射照相标准，已鉴定手的远端和近端指节间关节为最常见受影响的关节，但它们是最不可能症状性的。相比之下，分别构成放射照相OA第二和第三常见位置的膝和髋部，几乎总是症状性的。第一跖趾和腕掌关节也是放射照相OA的常见位点，而肩关节、肘关节、腕关节和掌指关节很少发展原发性OA。
年龄是OA最一致鉴定的风险因素，且在男性50岁后和在女性40岁后，流行率急剧上升。通过典型症状、物理检查发现和放射照相改变三者来诊断OA。美国风湿病学会(American College of Rheumatology)已列出分类标准以帮助症状性OA患者的鉴定，其包括但不唯一依赖于放射照相检查发现。具有早期疾病的患者经历局部关节疼痛，其随着活动恶化并随着休息缓解，而具有严重疾病的那些可在休息时疼痛。由于内紊乱症(其为晚期疾病的结果)，承重关节可“锁住(lock)”或“无力(give way)”。早晨或不活动后僵硬(“凝胶现象”)很少超过30分钟。
骨关节炎关节中的物理检查发现包括：骨扩大、捻发音、冷积液(cool effusions)和减少范围的运动。在关节线触诊时压痛和被动运动时疼痛也是常见的，但对于OA不是独特的。OA(载玻片(slide))中放射照相检查发现骨赘形成、关节空间变窄、软骨下硬化和囊肿。骨赘的存在是最特异的放射照相标志物，尽管它指示相对晚期的疾病。
对于OA的诊断，放射照片被认为是“黄金标准”测试，但是放射照相的改变仅在疾病的相对晚期明显。十分需求一种灵敏和特异的生物学标志物，其使能够早期诊断OA并监测它的进展。常规实验室研究，例如沉降率和C-反应性蛋白，不是OA的有用标志物，但最近的研究表明CRP的提高预测更迅速进行性疾病。然而，已描述软骨组分的若干表位，其提供了作为OA标志物的希望。例如，通常仅在胎儿和新生儿软骨中表达的硫酸软骨素表位846，已在OA而不是正常成人软骨和滑液中观察到。以相似的方式，对于II型胶原独特的表位，已在OA软骨中描述，并可通过暴露正常软骨于MMP而在体外解掩蔽。该表位可在血液和尿液中测量，并可在诊断或监测OA进展中证明是有用的。有些人也证明升高的血清透明质酸(hyaluronan)与放射照相OA相关联。在创伤性关节损伤后滑液中升高的软骨低聚物蛋白(COMP)水平的发现，可预示损伤的关节中发展OA。列出OA的其它潜在的标志物，但要么不容易获得，要么缺乏考虑它们为潜在OA标志物所需的灵敏性和特异性。
炎症的临床症状，即OA滑膜组织中存在组织学炎症和在发炎的滑膜的边缘的早期软骨损害，强烈指示滑膜炎是OA发病机理中的关键因素。OA仅为软骨疾病的传统观点是过时的。现应认为OA是包括滑膜组织在内的整个关节疾病。骨、软骨和滑膜通过细胞-细胞相互作用的方式通讯，通过可溶介质的释放和经由机械信号。滑膜炎症，尽管不是OA发生的必要条件，明确地涉及软骨破坏并因此涉及该疾病的进展。靶向炎性滑膜应延迟或预防关节软骨损害和骨赘的形成，尤其在早期OA中。
银屑病性关节炎是炎性关节炎的一种类型，其发生在银屑病患者的亚组中。在这些患者中，皮肤病理/症状伴随着与类风湿性关节炎中所见类似的关节肿胀。其特征在于皮肤炎症的斑片的凸起的红色区域，具有脱屑。银屑病常常影响肘部和膝的尖端、头皮、肚脐和生殖器区域或肛门周围。
术语“银屑病性关节炎”表示关节炎的异质组，范围从外周单关节、少关节和多关节疾病到轴向骨骼受累(involvement)。然而，尽管这种明显的临床异质性，但是这些不同的表现以它们在具有银屑病的皮肤表现的个体中发生、类风湿因子血清阴性、相似的人白细胞抗原(HLA)缔合和放射照相相似性得以统一。
在北美大约2%的白种人群具有银屑病。在这些人中，5-7%以一些形式受炎性关节炎影响。总体上，男性和女性以相等的频率受影响，但是实际的男性：女性比可取决于讨论的亚组而变化。发病率高峰在第4至第6个十年中。银屑性皮肤疾病在70%的病例中早于关节炎的发病，在15%的病例中与关节炎同时呈现，并在15%的病例中跟随关节炎的发病。
银屑病性关节炎的起因是未知的。在1/3病例中，银屑病性关节炎中外周关节活动相当于皮肤的活动，然而皮肤的活动与轴向骨骼疾病很可能不一致。遗传因素似乎起着重要的作用。在同卵双胞胎中对于银屑病有70%的一致性。在银屑病性关节炎患者的一级亲属中，有增至50倍风险发展该疾病。与受影响的母亲比较，通过受影响的父亲的疾病“传染”有增至2倍的风险。I类和II类HLA等位基因两者的表达有流行病学关联。已牵涉环境因素。链球菌感染可促成滴状银屑病的发展。HIV感染可与银屑病和银屑病性关节炎两者存在，以及使现存疾病恶化。已报告物理创伤促成关节炎的发展，表明银屑病性关节炎是“深Koebner现象”的表现。该疾病的炎性和自身免疫特征不仅通过临床表现支持，也通过已证明的T-细胞和各种细胞因子在启动和保持疾病活性两者中起的作用支持。
可预示较差预后的因素包括：广泛的皮肤受累；强的银屑病家族历史；女性性别；疾病发病在<20岁的年龄；HLA-B27、-DR3或-DR4等位基因的表达；和多关节或侵蚀性疾病。
骨质疏松(OP)是骨的疾病，其导致受损的骨强度和增加风险的断裂(参见例如Theill等(2002) Annu Rev Immunol 20:795-23)。在骨质疏松中，骨矿物质密度(BMD)降低，且骨微结构逐步地退化，如世界卫生组织(WHO)定义的，该疾病定义为低于平均峰值骨量(年轻健康成人的平均)2.5个标准差或更多的骨矿物质密度。该疾病可分类为原发性1型、原发性2型或继发性。在绝经后女性中最常见的骨质疏松形式称为原发性1型或绝经后骨质疏松。原发性2型骨质疏松(或老年性骨质疏松)在75岁后发生，并以2:1的比例在女性和男性两者中见到。最后，继发性骨质疏松可在任何年龄出现，并均等地影响男性和女性。这种形式的骨质疏松起因于慢性素因性医疗问题或疾病，或长期使用药物，例如糖皮质激素。骨吸收是绝经后骨质疏松中的主要病理学因素。快速或相对快速地丧失骨量/骨矿物质密度常常由破骨细胞数量的增加或由过度的破骨细胞活性引起(Walsh 等 (2005)Immunol Rev 208:228-251)。
骨质疏松风险可随着生活方式改变(例如饮食、运动、预防跌倒)以及有时药物(例如钙、维生素D、二磷酸盐和若干其它)而降低。
本文所用术语“治疗”，指任何人的医学疗法。预期所述受试者已经过执业医师的身体检查，所述医师已给出初步或明确的诊断，其指示使用所述特定治疗对所述人受试者的健康是有益的。根据受试者健康现状，所述治疗的时机和目的可因人而异。因此，所述治疗可以是预防性、治标性、症状性和/或治愈性的。
关于本发明，预防性、治标性、症状性和/或治愈性治疗可代表本发明的不同方面。
在一个方面，本发明提供组合物和制剂，其包含本发明的分子，例如本文描述的抗体、抗体的抗原结合片段、多核苷酸、载体和细胞。例如，本发明提供一种药物组合物，其包含与药学上可接受的载体一起配制的本发明的一种或多种抗体或抗体的抗原结合片段。
因此，本发明的一个目的是提供包含以0.25mg/ml-250mg/ml浓度存在的这种抗体的药物制剂，其中，所述制剂的pH为2.0-10.0。所述制剂可进一步包含缓冲体系、防腐剂、张度剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在药物组合物中使用防腐剂、等渗剂、螯合剂、稳定剂和表面活性剂对于技术人员是熟知的。可参照Remington: The Science and Practice ofPharmacy, 第19版, 1995。
在一个实施方案中，药物制剂是水性制剂。这样的制剂典型地是溶液或混悬剂。术语“水性制剂”定义为包含至少50% w/w水的制剂。同样地，术语“水性溶液”定义为包含至少50% w/水的溶液，和术语“水性混悬剂”定义为包含至少50 %w/w水的混悬剂。
在另一个实施方案中，药物制剂是冷冻干燥的制剂，医生或患者在使用前将溶剂和/或稀释剂加入到其中。
在再一方面，药物制剂包含这种抗体的水性溶液和缓冲剂，其中，抗体以1mg/ml以上的浓度存在，并且其中所述制剂的pH为约2.0-约10.0。
本发明的抗体可胃肠外地给予，例如静脉内地、例如肌肉内地、例如皮下地。备选地，本发明的抗体可经由非胃肠外路径给予，例如经口或局部地。本发明的抗体可预防地给予。本发明的抗体可在治疗上给予(需要时)。
在本发明的上下文中，“选择性消除软骨破坏性细胞”指这样的过程，其中，针对NKG2A的抗体提高软骨破坏性细胞(例如成纤维样滑膜细胞(FLS)或其它软骨破坏性细胞)的NK细胞介导的消除，而不提高正常成纤维细胞(例如包皮成纤维细胞(FSK4细胞)或其它正常成纤维细胞)的消除。这种选择性消除可通过例如标准LDH释放测定或以其它已知的合适测定测量，其中，测量治疗性化合物消除软骨破坏性细胞的能力(参见实施例4和图5B)。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少5%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性至少增加10%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少 20%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少30%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少40%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少50%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少60%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少70%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少80%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少90%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少100%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少125%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少150%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少175%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少200%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少225%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少250%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少275%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少300%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少350%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少400%，或软骨破坏性细胞的特定细胞毒性增加至少500%。
在本发明的内容中，“减少形成侵蚀骨的细胞”指这样的过程，其中抗-NKG2抗体减少形成侵蚀骨的细胞，例如破骨细胞、TRAP+多核细胞或其它侵蚀骨的细胞。
减少的侵蚀骨的细胞形成可通过目视计数粘附的侵蚀骨的细胞(参见实施例6和图6)或测量减少的侵蚀骨的细胞形成的任何其它合适方法来体外测量。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少5%，或侵蚀骨的细胞减少至少10%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少20%，或侵蚀骨的细胞减少至少30%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少40%，或侵蚀骨的细胞减少至少50%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少60%，或侵蚀骨的细胞减少至少70%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少80%，或侵蚀骨的细胞减少至少90%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少100%，或侵蚀骨的细胞减少至少125%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少150%，或侵蚀骨的细胞减少至少175%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少200%，或侵蚀骨的细胞减少至少225%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少250%，或侵蚀骨的细胞减少至少275%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少300%，或侵蚀骨的细胞减少至少350%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少400%，或侵蚀骨的细胞减少至少450%。在一个实施方案中，抗-NKG2A抗体引起侵蚀骨的细胞减少至少500%。
此外，在本发明的内容中“减少形成侵蚀骨的细胞”指体外减少的骨矿物质侵蚀。
减少的体外骨矿物质侵蚀可通过在骨矿物质盘(即骨学盘)上培养细胞或组织，或通过其它合适的方法测量(参见实施例6和图6D、6E、6F和6G)。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少10%，或骨矿物质侵蚀减少20%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少30%，或骨矿物质减少40%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少50%，或骨矿物质侵蚀减少60%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少70%，或骨矿物质侵蚀减少80%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少90%，或骨矿物质侵蚀减少100%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少125%，或骨矿物质侵蚀减少150%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少175%，或骨矿物质侵蚀减少200%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少250%，或骨矿物质侵蚀减少300%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少350%，或骨矿物质侵蚀减少400%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少450%，或骨矿物质侵蚀减少500%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少550%，或骨矿物质侵蚀减少600%。在一个实施方案中，抗-NKG2A引起骨矿物质侵蚀减少650%，或骨矿物质侵蚀减少700%。
实施例
实施例1. 在来自RA患者的成纤维样滑膜细胞上表达的细胞表面分子。
在图1A中，使用2 mM EDTA使源自RA滑膜组织的粘附RA-FLS分离，并针对成纤维细胞-标志物CD55 (开放直方图；右图)和巨噬细胞-标志物CD68 (开放直方图；左图)的表达进行表面染色。灰色直方图表示使用同种型对照抗体染色。如图1A中所见，RA-FLS显示CD55的同质表达并缺乏CD68，确认了粘附RA-FLS的成纤维细胞样的起源。
如显示于图1B，RA-FLS表达高水平的ULBP-1、ULBP-2和ULBP3，低水平的MIC-A，且无MIC-B，这些都是已知的配体，用于活化NK细胞受体NKG2D。此外，RA-FLS分别表达CD155(骨髓灰质炎病毒受体PVR)和CD48，它们分别是DNAM-1与2B4的配体。我们没有检测到由DNAM-1识别的另一配体CD112(骨髓灰质炎病毒相关的受体2，PRR2)的任何表达。使用NKp30、NKp44和NKp46的Fc融合蛋白，在RA-FLS上我们检测到相对高表达的推定NKp44配体，而NKp30-Fc和NKp46-Fc未能染色这些细胞。通过流式细胞术分析细胞。填充的直方图表示相关的同种型对照。直方图是n ≥ 3个供者的代表。
图1C说明可溶NKp44-Fc融合蛋白与RA-FLS的结合是特异的，并通过加入增加剂量的抗-NKp44 mAb而消除。使用2 mM EDTA使粘附的RA-FLS分离，并用10 ug/mL NKp44-Fc融合蛋白(开放直方图)，或作为阴性对照(灰色直方图)的相同Fc片段(人IgG1)进行表面染色。若需要，用抗-NKp44或抗-NKp46 mAb预孵育NKp44-Fc。
如显示于图1D.中，RA-FLS表达高水平的HLA-E与HLA-G两者，它们分别为抑制性NK细胞受体CD94-NKG2A和LIR-1的配体。因此，在发炎的滑膜中，HLA-E可为保护RA-FLS免受NK细胞-介导的细胞毒性的重要分子，因为大多数滑膜NK细胞表达抑制性CD94-NKG2A受体。
在图1E.中显示RA-FLS表达死亡受体5 (DR5)而不是DR4。这些受体在被TRAIL(TNF相关凋亡诱导配体)识别时，转导细胞凋亡的信号。因此，DR5可为在RA-FLS上表达的可被表达TRAIL的细胞识别的重要配体，所述表达TRAIL的细胞潜在地可介导发炎的滑膜组织内的RA-FLS细胞死亡。
实施例2.表达NKG2A的NK细胞存在于RA滑膜中，并可在含有表达HLA-E的RA-FLS的 区域中发现。
图2A、2B和2C显示用小鼠抗-NKp46(NK细胞，图2A)、抗-NKG2A(图2B)和同种型对照抗体(图2C)染色的源自RA患者的系列滑膜组织切片。用二氨基联苯胺使免疫特异的反应性可见(显微照片中的深色点)，并用苏木精对细胞核复染色(淡色点)。结果显示NKp46+ NK细胞发现于衬里下层区域且少数更接近RA滑膜的滑膜衬里(参见图2A)。发现NK细胞的位置和频率与NKG2A+细胞的位置和频率非常相似(参见图2B用于比较)。且用同种型对照染色的切片是空白的(参见图2C.)。如显示于图2D.，当通过定量数字图像分析评价时，发现NKG2A+细胞的频率与NK细胞的频率强烈关联 (r2 = 0.950, p < 0.0001)，并且在数量上匹配。
在原位评价CD94-NKG2A的配体HLA-E在RA-FLS上的表达(图2E-H)。如显示于图2E，将抗-HLA-E抗体3D12应用到RA滑膜组织切片上揭示了内膜衬里的染色，所述内膜衬里由巨噬细胞样滑膜细胞(MLS)和RA-FLS组成。如显示于图2G，使用同种型对照没有观察到染色。此外，显示于图2F.的浸润免疫细胞和显示于图2H.的血管内皮细胞两者，以相对高的水平表达HLA-E。
这些数据一起表明了可从RA患者的滑膜中的浸润淋巴细胞群中鉴别NK细胞，并表明大多数(如果不是所有)NK细胞表达NKG2A。此外，在接近HLA-E+ RA-FLS的区域发现NKG2A+ NK细胞的亚组。因此，这可潜在地意味着NKG2A+ NK细胞原位识别RA-FLS上的HLA-E。
实施例3: NKG2D、DNAM-1、NKp44、NKp46和TRAIL涉及对RA-FLS的NK细胞细胞毒性。
在图3A.中，如在每个直方图下指示的，显示了三种不同类型的针对若干NK细胞受体的表面表达进行染色的NK细胞 (为开放直方图)，且也在每个图中显示了用相关的同种型对照的染色 (填充的灰色直方图)。图3A.(i)显示源自代表性RA患者的SFMC的NK细胞，图3A. (ii)显示源自代表性健康供者的PBMC的静息CD56 bright NK细胞，且图3A. (iii)显示Nishi NK细胞。
通过流式细胞术分析细胞。NK细胞被定义为活的CD3-CD56bright。数据显示源自RA患者的滑膜NK细胞表达若干活化受体，且它们对CD56bright NK细胞和Nishi NK细胞显示出相似的活化受体表达模式。
图3B.(i)显示RA-FLS，其以10000细胞/孔接种在48孔板中，并培养至汇合(~48000细胞/孔)，历时72小时，在这个时间点以指示的效应物：靶(E:T)比加入Nishi(设置一式两份的孔)。在37℃共培养RA-FLS和Nishi过夜，随后洗掉非粘附细胞，粘附细胞用4%低聚甲醛固定，并用曙红染色。使用ImmunoSpot图像分析仪(ImmunoSpot Image Analyzer)来照相，并定量测定%覆盖的孔区域(如显示于图3B. (ii))。
图3B (i)和3B(ii)中的数据显示在体外NK细胞以剂量依赖的方式消除塑料粘附RA-FLS。
在图3C.和图3D i中，展示了RA-FLS以30 000细胞/孔接种于96-孔板，并在第二天加入90 000 Nishi/孔。如指示，在37℃用BD GolgiStop、FITC-缀合的抗-CD107a/b抗体和10 ug/mL阻断抗体，或相关同种型对照共培养Nishi和FLS，历时5小时。进行流式细胞术以测定Nishi脱粒。ns =不显著, * P < 0.05, ** P < 0.005, *** P < 0.001。
图3C显示NK细胞仅在FLS靶细胞存在时脱粒，当单独培养时没有脱粒。图3D显示RA-FLS对NK细胞-介导的细胞毒性敏感，且NKG2D、DNAM1、NKp44、NKp46和TRAIL全部涉及NK细胞对RA-FLS的特异性识别，如通过掩蔽这些受体时CD107a/b表达的显著减少所指示的。
实施例4：RA-FLS通过表达能够与NK细胞表达的抑制性CD94-NKG2A受体相互作用 的HLA-E，而受保护免受NK细胞-介导的细胞毒性。
图4A显示代表性直方图，其中，来自RA-SFMC的NK细胞在顶行，来自健康PBMC的静息CD56bright NK细胞在中间行，和Nishi NK细胞在底行。显示NKG2A(左列)、LIR-1(中列)和KIR(右列)的表达(开放直方图)，相较于相应的同种型对照(灰色填充的直方图)。使用抗-NKG2A、抗-LIR1和抗-KIR mAb的混合物对NK细胞的表面表达染色，随后通过流式细胞术分析。关于活的CD3阴性CD56bright阳性细胞，对NK细胞进行门控。
数据显示与Nishi NK细胞和CD56bright PB-NK细胞相似的大多数滑液NK细胞表达NKG2A但缺乏KIR。与滑液NK细胞形成对比，Nishi NK细胞还表达LIR-1。
图4B显示RA-FLS，其以3∙104细胞/孔接种于96-孔板中，第二天以3：1(抗-LIR-1实验，左图)，或以6:1(抗-NKG2A实验，右图)的E:T比加入Nishi。如指示，在37℃用BDGolgiStop、FITC-缀合的抗-CD107a/b抗体和10 ug/mL阻断抗体或相关同种型对照来共培养Nishi和FLS，历时5小时。如显示于图4B，进行流式细胞术以测定Nishi脱粒。ns = 不显著, ** P < 0.005。
数据显示，用抗体掩蔽NKG2A导致对RA-FLS显著增加的NK细胞脱粒(右图)，而掩蔽LIR-1似乎没有导致RA-FLS的任何提高的溶解(左图)。因此抗-NKG2A处理NK细胞导致RA-FLS的溶解提高的事实表明，在RA-FLS表达的HLA-E分子呈现合适的肽，其对于与CD94-NKG2A抑制性受体的相互作用是重要的。
图4C显示RA-FLS，其以2.4∙104细胞/孔接种于96-孔板中，第二天加入6∙103 NishiNK细胞/孔(即1:4的E:T)。FLS和Nishi共培养过夜，其中加入抗-NKG2A或人IgG4同种型对照。第二天，洗掉非粘附细胞，粘附细胞用4%低聚甲醛固定，并用曙红染色。如显示于图4C，使用ImmunoSpot图像分析仪(ImmunoSpot Image Analyzer)分析孔，并定量测定%覆盖的孔区域。因此，数据显示掩蔽NKG2A导致粘附RA-FLS的消除显著提高。
RA-FLS以1.5∙104细胞/孔接种于96-孔板，第二天，每孔加入4.5∙104自体的SFMC(即E:T 3:1)。如显示于图4D，在37℃用BD GolgiStop、FITC-缀合的抗-CD107a/b抗体和10ug/mL阻断抗体，或人IgG4同种型对照共培养SFMC和RA-FLS，历时5小时。
因此，用mAb掩蔽NKG2A导致在体外自体RA-FLS的消除显著提高，这表明治疗性的给予抗-NKG2A mAb会导致在体内RA-FLS的消除提高。
图4E.显示接种于96-孔板中的3∙104 FLS/孔。第二天，通过磁性分离从健康供者血液中分离同种异体CD56brightCD16dim NK细胞，并立刻在37℃用BD GolgiStop、FITC-缀合的抗-CD107a/b抗体和10 ug/mL阻断抗体，或相关同种型对照，与RA-FLS (E:T 3:1)共培养5小时。进行流式细胞术以测定脱粒。NK细胞被定义为活的CD3-CD16dimCD56bright。底部图显示来自单个健康供者的CD56bright NK细胞分别与来自5名不同患者的RA-FLS共培养。* P < 0.05。
因此，在静息的新鲜分离的PB-NK细胞上用mAb掩蔽NKG2A，导致在体外同种异体RA-FLS的消除显著提高，再一次表明了治疗性给予抗-NKG2A mAb将导致在体内RA-FLS的消除提高。因此，可通过血流迁移至其它关节的传播攻击性疾病的RA-FLS可通过循环CD56bright PB-NK细胞(在掩蔽它们的CD94-NKG2A抑制性受体时)来消除。
图5A显示LDH释放测定，其被采用以评价FLS的NK细胞-介导的细胞毒性，所述测定在NNC141-0100(HumZ270，黑色条)、同种型对照(白色条)，或单独培养基(灰色条)的存在下，使用两个不同的NK细胞系(NKL，左；和Nishi，右)。NK细胞效应物对靶的比是1:1。图5B显示用NNC141-0100 (humZ270)阻断NKG2A导致代表性RA-FLS溶解的提高(RA-FLS2，左图)，但不影响正常包皮成纤维细胞细胞系的消除(FSK4，右图)。因此，将图3、图4和图5呈现的数据结合在一起，清楚地表明抗-NKG2A处理导致RA-FLS的NK细胞-介导的消除提高，而在针对NKG2A的阻断抗体(即HumZ270)的存在下，不影响正常成纤维细胞细胞系(FSK4)的NK细胞-介导的消除。
实施例6：用humZ270 (抗-NKG2A)治疗抑制形成TRAP+多核破骨细胞
图6A显示一个代表性实例，其中，源自RA患者的106 SFMC/孔，在补充有10 ng/mLIL-15的培养基中，培养7天。在测定的开始，用20微克/ml的人IgG4同种型对照(图6A.)，或20微克/ml的humZ270 (图6B.)处理培养物。可理解的是，在图6B中的抗-NKG2A处理导致表达TRAP的大塑料粘附多核细胞(即定义为破骨细胞)显著消除。
图6C. 显示从源自RA患者的SFMC获得的数据，所述SFMC已在单独培养基中(n=6)，或在补充有10ng/mL IL-15的培养基中(n=14)，培养7天。在测定的开始(定义为基线)，将20微克/mL的人IgG4同种型(白色和黑灰色条)或20微克/mL的NNC141-0100 (humZ270，浅灰色和黑色条)加入培养物中。破骨细胞被定量测定为TRAP+多核细胞的数量/孔。因此，将图6A、图6B和图6C结合在一起，显示在SFMC体外培养物中用针对NKG2A的抗体处理，导致破骨细胞的形成显著减少，如通过大的多核TRAP+细胞(即破骨细胞)的形成所测量的。因此，该发现表明RA患者中用抗-NKG2A mAb治疗性治疗将导致骨侵蚀(即RA的主要临床标志)的抑制。
在图6D中，显示从RA患者号2357的SFMC培养物观察到的骨矿物质侵蚀的代表性实例。在此，在IL-15和同种型mAb(左)相对于抗-NKG2A(humZ270，右)的存在下，在涂有骨矿物质基质薄层的盘上(即骨学盘)上培养SFMC。随后用von Kossa对盘染色，且受侵蚀的区域使用Immunospot S5分析仪(Immunospot S5 Analyzer)进行分析，并显现为对较深背景的浅色/白色区域。
在图6E中显示从总共5名RA患者中获得的数据。SFMC在补充有10ng/mL IL-15的培养基中培养。在测定的开始，将20微克/mL的人IgG4同种型(白色条)或20微克/mL的NNC141-0100 (humZ270，黑色条)加入培养物中。使用Immunospot S5分析仪(Immunospot S5Analyzer)定量测定均值百分比+/- SEM侵蚀的盘区域。将图6D和图6E结合在一起显示抗-NKG2A处理导致活性骨矿物质侵蚀破骨细胞的形成显著减少。因此，该发现表明RA患者中用抗-NKG2A mAb的治疗性治疗将导致骨侵蚀(即RA的主要临床标志)的抑制。
图6F显示HumZ270(抗-NKG2A)抑制直接离体培养的RA滑膜组织外植体培养物中的骨侵蚀。在补充有10% FBS、2% HuS、P/S、L-glut的IMDM培养基中，不加入mAb (对照)或加入同种型、英利昔单抗(IFX)或抗-NKG2A(humZ270)，培养滑膜组织刮物7天，所有mAb以10微克/mL在培养开始时加入。在一式三份的孔中设置该实验。在第7天，通过用200 uL Milli-Q™水冲洗孔3×而去除培养基和细胞。随后用200 uL漂白溶液(~6% NaOCl, ~5.2% NaCl)冲洗该盘5分钟，接着轻轻移液以移去任何残余细胞。最后，该盘用Milli-Q™水洗涤3×，风干并用von Kossa方法染色。从一式三份培养物的这个实例可理解到，与对照或同种型处理的培养物相比，humZ270处理RA滑膜组织外植体导致减少的侵蚀(浅色/白色区域)。
在图6G中显示了来自RA滑膜组织刮物的一式三份培养物的计算结果(均值+/-SEM)，所述RA滑膜组织刮物在补充有10% FBS、2% HuS、P/S、L-glut的IMDM培养基中，加入mAb (对照)，或加入同种型、英利昔单抗(IFX)或抗-NKG2A(humZ270)培养7天，所有mAb以10微克/mL在培养开始时加入。在第7天，通过用200 uL Milli-Q™水冲洗孔3×而去除培养基和细胞。随后用200 uL漂白溶液(~6% NaOCl, ~5.2% NaCl)冲洗该盘5分钟，接着轻轻移液以移去任何残余细胞。最后，该盘用Milli-Q™水洗涤3×，风干并用von Kossa方法染色。与对照或同种型处理的培养物相比，HumZ270处理RA滑膜组织外植体导致显著减少的侵蚀(p=0.005，学生T检验)。因此，在涂有骨矿物质的盘(即，骨学盘)上离体直接生长的RA组织显示显著的侵蚀能力，且通过用抗-NKG2A处理显著地抑制这种活性，这清楚地表明RA患者中用抗-NKG2A治疗性治疗将抑制骨侵蚀，即RA的主要临床标志。
实施例7：用HumZ270 (NNC141-0100)处理后，在SFMC体外培养物中细胞因子水平 的调节
在图7A中展示了在源自RA患者(n=11)的SFMC体外培养物中细胞因子水平(均值+/- SEM)的调节。在补充有10 ng/mL IL-15的培养基中培养SFMC 7天。在测定的开始，用20微克/mL的人IgG4 同种型(浅灰色条)或20微克/mL的NNC141-0100 (humZ270，深灰色条)处理培养物。在24小时收获上清液，并通过BioPlex测量细胞因子水平。在用抗-NKG2A处理后，IL-6水平显著减少，而除了M-CSF在24小时少量增加外，其它细胞因子的生产没有显著受影响。
图7B显示在用IL-15刺激并用同种型相对于HumZ270(抗-NKG2A)处理的RA-SFMC体外培养物中测量的IL-6水平之间的成对比较。在所有SFMC体外培养物中，在掩蔽NKG2A后IL-6水平显著减少。
在图7C中，显示了在源自RA患者的SFMC体外培养物中，NNC141-0100 (humZ270)抑制基线和IL-15刺激的IL-6生产两者。在建立于单独培养基或建立于补充有如指示的10ng/mL IL-15的培养基的培养物中，测量由源自2名RA患者的SFMC生产的IL-6水平。在测定的开始，用20微克/mL的人IgG4同种型(黑色条)或20微克/mL的NNC141-0100 (humZ270，白色条)处理培养物。在24、48和72小时收获上清液，并通过BioPlex测量IL-6的水平。将图7A、7B和7C结合在一起显示，在SFMC体外培养物中，抗-NKG2A抑制基线和刺激的IL-6水平两者。IL-6是涉及RA发病机理的重要促炎细胞因子。潜在地，IL-6的减少在观察到的破骨细胞形成减少中发挥作用。
实施例8：NKG2A和/或它的配体HLA-E在来自RA、骨关节炎(OA)和银屑病性关节炎 (PsA)患者的发炎的滑膜中表达
存在于RA滑膜组织中的NK细胞表达抑制性NKG2A受体，并主要位于与表达HLA-E(即CD94-NKG2A的配体)的滑膜细胞相邻的淋巴集结中。这显示于图8，其中描绘了来自15名供者中的2名的RA滑膜组织的代表性图 (ID 1144-09: A、C、E、G、I和ID 1591-08: B、D、F、H、J)。对RA滑膜的系列切片的NK细胞用抗-NKp46抗体染色(图8A.和8B.)，对NKG2A用Z199抗体染色(图8C.和8D.)，对HLA-E用3D12抗体染色(图8E.和8F.)和对T细胞用抗-CD3 抗体染色(图8G.和8H.)。使用IgG2b同种型对照抗体没有观察到染色(图8I.和8J.)。用二氨基联苯胺(DAB)使免疫特异的反应性可见，并用苏木精对细胞核复染色(条=100μm)。箭头-头指示衬里下层组织中的淋巴集结，具有表达NKp46、NKG2A、HLA-E和CD3细胞亚组。箭头指示与具有NK细胞的淋巴集结相邻的增生滑膜衬里层的HLA-E+滑膜细胞。星号指示HLA-E+血管内皮细胞。
显示来自第三名供者(ID 1595-08)RA滑膜的系列切片中的NKp46+ NK细胞(图8K.)和NKG2A+细胞的高倍放大图，以强调NK细胞的位置和频率与NKG2A+细胞的位置和频率非常相似。使用数字图像分析以将来自15名RA患者滑膜中的NKG2A+细胞数量与NKp46+ NK细胞数量相关联(图8M.)。结果表示为细胞数量/mm2，且显示NKG2A+细胞的频率与NK细胞的频率强烈关联(r2=0.950, p<0.0001)，并且在数量上匹配。NKG2A+细胞存在于13/15 RA患者的滑膜中。
这些数据一起表明可从RA患者的滑膜中的浸润淋巴细胞群中鉴别NK细胞，并表明大多数(如果不是所有)NK细胞表达NKG2A。CD94-NKG2A的配体HLA-E，由许多浸润免疫细胞、血管内皮细胞和滑膜细胞(巨噬细胞样滑膜细胞(MLS)和RA-FLS)表达。在接近HLA-E+滑膜细胞的区域发现NKG2A+ NK细胞的亚组。因此，这可潜在地意味着NKG2A+ NK细胞原位识别RA-FLS上的HLA-E。此外，HLA-E+浸润免疫细胞和血管内皮还可由NKG2A+ NK细胞识别。
NKG2A和它的配体HLA-E，在骨关节炎(OA)患者的滑膜中表达。这显示于图9.，其描绘了浸润淋巴细胞中的NKG2A+ 细胞(Z199抗体) (图9A.)，和由浸润免疫细胞、内皮细胞和滑膜细胞的HLA-E 表达(3D12 抗体) (图9B.)。NKG2A+细胞存在于6/9 OA患者的滑膜中。与RA患者形成对比，当通过数字图像分析定量测定时，NKG2A+细胞的频率似乎与OA滑膜中NK细胞的频率无关联(r2=0.136, p=0.3295；图9C.)，这指示浸润OA滑膜的一些NK细胞可能没有表达NKG2A。
这些数据一起表明与RA滑膜的那些相似的OA滑膜细胞亚组中NKG2A和HLA-E表达。因此，NKG2A+ NK细胞可识别OA患者发炎的滑膜的HLA-E+滑膜细胞、血管内皮和浸润免疫细胞
发现CD94-NKG2A的配体HLA-E，不仅在来自RA和OA患者，也在来自银屑病性关节炎(PsA)患者的发炎的滑膜中表达。这显示于图10，其描绘了用抗HLA-E抗体mAb MEM-E/02染色来自RA、OA和PsA患者(如指示的)的滑膜组织样品。如图10中指示，在正常对照的滑膜中，在血管内皮中观察到HLA-E表达，而在位于滑膜衬里的滑膜细胞亚组中观察到HLA-E表达更弱。
这些数据显示在PsA患者的发炎的滑膜中，由滑膜细胞、内皮细胞和浸润免疫细胞的HLA-E表达，意味着NKG2A+细胞可识别这些患者中的这种HLA-E+细胞亚组。
尽管本发明的某些特征已在本文中说明和描述，对于本领域技术人员仍将想到许多修饰、替代、改变和等同。因此，应理解所附权利要求书意在覆盖落入本发明真正精神内的所有这种修饰和改变。
实施方案:
1. 一种用于治疗软骨破坏和/或骨侵蚀的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段。
2. 实施方案1的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，用于治疗减少软骨破坏和/或骨侵蚀对患者有益的疾病或病症。
3. 实施方案1或2的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗-NKG2A抗体刺激软骨破坏性细胞的选择性消除和/或减少侵蚀骨的细胞形成。
4. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中软骨破坏性细胞的选择性消除和/或骨侵蚀性细胞的减少对患者是有益的。
5. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述软骨破坏性细胞是成纤维样滑膜细胞(FLS)。
6. 前述实施方案1-5中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述侵蚀骨的细胞是破骨细胞。
7. 实施方案6的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，侵蚀骨的破骨细胞是TRAP+多核细胞。
8. 前述实施方案任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，用于治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症。
9. 实施方案8的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述疾病或病症是骨关节炎。
10. 实施方案8的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述疾病或病症是骨质疏松。
11. 实施方案8的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述疾病或病症是银屑病性关节炎。
12. 实施方案8的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述疾病或病症是风湿性关节炎。
13. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是其抗原结合片段。
14. 实施方案13的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体片段选自Fab、Fab'、F(ab)2、F(ab’)2、F(ab)3、Fv、单链Fv、dsFv、Fd片段、dAb片段、小抗体、二抗体、三抗体、四抗体、kappa体；骆驼IgG；IgNAR；和多特异性抗体片段。
15. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是Fab片段。
16. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是双特异性抗体。
17. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体与延长半寿期的部分缀合。
18. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述延长半寿期的部分包含一个或多个选自一个或多个由以下组成的清单的延长半寿期的部分：脂肪酸和其衍生物、羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、透明质酸(HA)、heparosan聚合物(HEP)、基于磷酰胆碱的聚合物、fleximer、葡聚糖、聚唾液酸(PSA)、Fc结构域、转铁蛋白、白蛋白、弹性蛋白样肽、XTEN聚合物、白蛋白结合肽和其任何组合。
19. 实施方案18的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体可与两种或更多种不同类型的延长半寿期的部分缀合。
20. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含突变的Fc结构域，其中，所述突变导致降低的Fcγ受体结合功能。
21. 实施方案20的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述Fc结构域包含一个或多个以下突变：L234A、L235E和G237A、A330S和P331S(根据Kabat编号方案)。
22. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体包含IgG4 Fc结构域。
23. 实施方案22的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述IgG4 Fc结构域包含S241P/S228P突变。
24. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是全长IgG4抗体或其片段。
25. 前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是人源化或人抗体。
26. 实施方案25的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是humZ270或humZ199。
27. 实施方案25或26的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是humZ270。
28. 实施方案25-27中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸残基31-35 (SYWMN)的CRD1序列，其中，这些氨基酸残基的一个或两个可由不同的氨基酸残基取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸50-59 (RIDPYDSETH)的CRD2序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可由不同的氨基酸残基取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸95-102 (YCARGGYD)的CDR3序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可由不同的氨基酸取代。
29. 实施方案25-28中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基24-34 (RASENIYSYLA)的CDR1序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可用不同氨基酸取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基50-56 (NAKTLAE)的CDR2序列，其中，这些氨基酸残基的一个或两个可用不同氨基酸取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基89-97 (QHHYGTPRT)的CDR3序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可用不同氨基酸取代。
30. 实施方案25-29中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸残基31-35 (SYWMN)的CRD1序列，和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸50-59 (RIDPYDSETH)的CRD2序列，和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸95-102 (YCARGGYD)的CDR3序列。
31. 实施方案25-30中任一项的抗NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基24-34 (RASENIYSYLA)的CDR1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基50-56 (NAKTLAE)的CDR2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基89-97(QHHYGTPRT)的CDR3序列。
32. 实施方案25-31中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸残基31-35 (SYWMN)的CRD1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸50-59 (RIDPYDSETH)的CRD2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸95-102 (YCARGGYD)的CDR3序列；
和其中，所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基24-34 (RASENIYSYLA)的CDR1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基50-56 (NAKTLAE)的CDR2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基89-97 (QHHYGTPRT)的CDR3序列。
33. 实施方案25-32中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中所述的重链包含包含SEQ. ID. NO: 2和所述抗体的轻链包含SEQ. ID. NO: 3。
34. 实施方案1-24中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片断与实施方案25-33中任一项的抗体竞争结合NKG2A。
35. 实施方案25或26的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是humZ199。
36. 实施方案25-26或实施方案35之一的抗-NKG2A抗体或抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸残基31-35 (SYAMS)的CRD1序列，其中，这些氨基酸残基的一个或两个可由不同氨基酸残基取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)的CRD2序列，其中这些氨基酸残基的一个、两个、三个或四个可由不同的氨基酸取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸99-108 (HGDYPRFFDV)的CDR3序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可由不同氨基酸取代。
37. 实施方案25-26或35-36中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基24-34 (SASSSVSSYIY)的CDR1序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可用不同氨基酸取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基50-56 (LTSNLAS)的CDR2序列，其中，这些氨基酸残基的一个或两个可用不同的氨基酸取代；和/或
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基89-97 (QQWSGNPYT)的CDR3序列，其中，这些氨基酸残基的一个、两个或三个可用不同氨基酸取代。
38．实施方案25-26或35-37中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸残基31-35 (SYAMS)的CRD1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)的CRD2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 4的氨基酸-108(HGDYPRFFDV)的CDR3序列。
39. 实施方案25-26或35-38中任一项的抗NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基24-34 (SASSSVSSYIY)的CDR1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基50-56 (LTSNLAS)的CDR2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 5的氨基酸残基-97 (QQWSGNPYT)的CDR3序列。
40. 实施方案25-26或35-39中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含：
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸残基31-35 (SYWMN)的CRD1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸50-59 (RIDPYDSETH)的CRD2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 2的氨基酸95-102 (YCARGGYD)的CDR3序列；
和其中，所述抗体的轻链包含：
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基24-34(RASENIYSYLA)的CDR1序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基50-56 (NAKTLAE)的CDR2序列；和/或
- SEQ. ID. NO: 3的氨基酸残基89-97(QHHYGTPRT)的CDR3序列。
41. 实施方案25-26或35-40中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体的重链包含SEQ. ID. NO: 4和所述抗体的轻链包含SEQ. ID. NO: 5。
42. 实施方案1-25中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段与实施方案35-41中任一项的抗体竞争结合NKG2A。
43. 实施方案1-7或13-42中任一项的抗-NKG2A抗体用于治疗软骨破坏和/或骨侵蚀的用途。
44. 实施方案43的抗-NKG2A抗体用于治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症的用途。
45. 实施方案44的抗-NKG2A抗体的用途，其中，所述疾病或病症是骨关节炎。
46. 实施方案44的抗-NKG2A抗体的用途，其中，所述疾病或病症是骨质疏松。
47. 实施方案44的抗-NKG2A抗体的用途，其中，所述疾病或病症是银屑病性关节炎。
48. 实施方案44的抗-NKG2A抗体的用途，其中，所述疾病或病症是风湿性关节炎。
49. 治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者前述实施方案中任一项的抗-NKG2A抗体。
50. 治疗特征为软骨破坏的疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者实施方案1-49中任一项的抗-NKG2A抗体。
51. 治疗特征为骨侵蚀的疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者实施方案1-49中任一项的抗-NKG2A抗体。
52. 治疗特征为软骨破坏和骨侵蚀的疾病或病症的方法，所述方法包括给予患者实施方案1-49中任一项的抗-NKG2A抗体。
53. 实施方案1-49中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段用做药物。
54. 一种抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段药物制剂，所述药物制剂包含实施方案1-49中任一项的抗体。
55. 实施方案1-49中任一项的抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段在制造药物中的用途。
本文引用的所有参考文献，包括出版物，专利申请和专利引入本文作为参考，如同分别和特别表明每篇文献引入本文作为参考并且全文引入本文一样。
本文使用的所有标题和副标题仅仅是为了方便，不应解释为以任何方式限制本发明
上述要素以其所有可能变化的任何组合包括在本发明中，除非本文另外指明或另外明显与上下文矛盾。
除非在上下文中另外明确指出或明显与上下文矛盾，本文的术语“或"以“和/或"的包括性的含义使用，并且相应地，如同为这样的实施方案或方面暗示提供支持：其中该术语应该被解释为“或这或那”的排它性含义。
如描述本发明的上下文所使用的术语“一个"和“一种”“所述"和类似对象应被解释为涵盖单数和复数，除非本文另外指明或与上下文明显矛盾。
本文中数值范围的叙述仅仅意在作为分别提及每个落入范围内的单独数值的简写法，除非本文另外指明，且每个单独数值引入说明书如同其分别在本文中叙述一样。除非另外陈述，本文提供的所有精确数值代表相应的大概数值(例如，关于具体因素或测量提供的所有精确示例性数值也被认为提供了相应的大概测量，适当时用“约”修饰)。
描述于本文的所有方法可以任何合适的顺序进行，除非本文另外指名或除非与上下文明显矛盾。
本文提供的任何和所有实例，或示例性语言(例如“例如”)的使用，仅仅意图更好地阐明本发明，并且不对本发明的范围施加限制，除非另外指明。说明书中的语言不应理解为指明了任何要素对于实施本发明是必要的，除非尽可能多的明确陈述。
本文中专利文献的引用和结合仅仅为了方便，并且不反映所述专利文献的有效性、可专利性和/或可实施性的任何观点。
本文关于一个要素或多个要素使用术语例如“包含”、“具有”“包括”、“含有”的本发明任何方面或实施方案的描述，意在对“由该具体要素或多个要素组成”、“基本上由该具体要素或多个要素组成”或“基本上包含”该具体要素或多个要素的本发明类似方面或实施方案提供支持，除非另外陈述或明显与上下文矛盾(例如，本文描述为包含具体要素的组合物应理解为也描述了由该要素组成的组合物，除非另外陈述或明显与上下文矛盾)。
本发明包括所适用法律最大程度允许的本文呈现的方面或权利要求中叙述主题的所有修饰和等同。

Claims (15)

1.抗-NKG2A抗体或其抗原结合片段在制备用于治疗软骨破坏和/或骨侵蚀的药物中的用途，所述抗体能够抑制HLA-E结合或非竞争性阻断CD94/NKG2A，其中所述软骨破坏和/或骨侵蚀在以下疾病或病症期间发生：骨关节炎、骨质疏松、银屑病性关节炎或风湿性关节炎。
2.权利要求1的用途，其中，所述抗-NKG2A抗体刺激软骨破坏性细胞的选择性消除和/或减少侵蚀骨的细胞形成。
3.权利要求2的用途，其中，所述软骨破坏性细胞是成纤维样滑膜细胞(FLS)。
4.权利要求2的用途，其中，所述侵蚀骨的细胞是破骨细胞。
5.权利要求1或2的用途，用于治疗特征为软骨破坏和/或骨侵蚀的疾病或病症。
6.权利要求5的用途，其中所述疾病或病症是骨关节炎。
7.权利要求5的用途，其中所述疾病或病症是骨质疏松。
8.权利要求5的用途，其中所述疾病或病症是银屑病性关节炎。
9.权利要求5的用途，其中所述疾病或病症是风湿性关节炎。
10.权利要求1或2的用途，其中所述抗体是人源化抗体或人抗体。
11.权利要求1或2的用途，其中所述抗体是humZ270或humZ199。
12.权利要求1或2的用途，其中所述抗体的重链包含：
- SEQ ID NO: 2的氨基酸残基31-35 (SYWMN)的CDR1序列；和/或
- SEQ ID NO: 2的氨基酸50-59 (RIDPYDSETH)的CDR2序列；和/或
- SEQ ID NO: 2的按照Kabat的氨基酸95-102的CDR3序列；
和其中所述抗体的轻链包含：
- SEQ ID NO: 3的氨基酸残基24-34 (RASENIYSYLA)的CDR1序列；和/或
- SEQ ID NO: 3的氨基酸残基50-56 (NAKTLAE)的CDR2序列；和/或
- SEQ ID NO: 3的氨基酸残基89-97 (QHHYGTPRT)的CDR3序列。
13.权利要求1或2的用途，其中所述抗体的重链包含：
- SEQ ID NO: 4的氨基酸残基31-35 (SYAMS)的CDR1序列；和/或
- SEQ ID NO: 4的氨基酸50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)的CDR2序列；和/或
- SEQ ID NO: 4的氨基酸99-108 (HGDYPRFFDV)的CDR3序列；
和其中所述抗体的轻链包含：
- SEQ ID NO: 5的氨基酸残基24-34 (SASSSVSSYIY)的CDR1序列；和/或
- SEQ ID NO: 5的氨基酸残基50-56 (LTSNLAS)的CDR2序列；和/或
- SEQ ID NO: 5的氨基酸残基89-97 (QQWSGNPYT)的CDR3序列。
14.权利要求1或2的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段与权利要求12的抗体或/和权利要求13的抗体竞争。
15.权利要求1或2的用途，其中所述抗体或其抗原结合片段用作药物制剂。
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