MX2013014203A - Eliminacion selectiva de celulas erosivas. - Google Patents

Abstract

La invención actual se refiere al tratamiento de enfermedades caracterizadas por destrucción de cartílago y/o erosión ósea. En particular la presente invención se refiere al tratamiento de osteoartritis, osteoporosis, artritis psoriásica o artritis reumática con un anticuerpo anti-NKG2A.

Description

ELIMINACION SELECTIVA DE CELULAS EROSIVAS CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere al tratamiento de erosión ósea y destrucción de cartílago. En particular el tratamiento de enfermedades óseas y destrucción de cartílago usando fármacos biológicos tal como por ejemplo, anticuerpos.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION Las células eliminadoras naturales (NK) son linfocitos derivados de médula ósea esenciales para defensa del hospedero contra ciertas infecciones y tumores. Tras la activación que rápidamente produce un intervalo de citocinas y puede mediar respuestas citotóxicas contra células infectadas, estresadas, o tumorigénicas . El papel de células NK en enfermedades inflamatorias crónicas está emergiendo, y cada vez es más apreciado que las células NK pueden jugar un papel importante en la modulación de respuestas de células T y B a través de su capacidad para promover la diferenciación y maduración de células dendríticas (DC) y polarización posterior de respuestas de célula T (ver por ejemplo, Cooper et al. (2004) Trends Immunol . 25: 47-52; Zhang et al. (2007) Blood Oct 1; 110(7): 2484-93). Además, estudios han mostrado que las células NK tienen la capacidad para eliminar directamente subconjuntos de células T activadas por medio de respuestas citotóxicas mediadas por célula (Lu et al. (2007) Ref: 245107 Immunity. 26: 593-604). La actividad de célula NK se regula por un mecanismo complejo que implica ambas señales de activación e inhibidoras (ver, por ejemplo, Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19: 197-223; Moretta et al. (2003) EMBO j EPub Dec 18; Ravetch et al. (2000) Science 290: 84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102: 1797-805; Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9: 694- Diversos receptores específicos NK diferentes han identificado que se implican en reconocimiento mediado por célula NK y eliminación de células objetivo deficientes de Clase I HLA. Un receptor de célula NK inhibidora importante es CD94/NKG2A, que interactúa con la molécula HLA-E de clase I MHC no clásica (ver, por ejemplo, Braud et . al. (1998) Nature 391: 795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95: 5199-5204; Vanee et al. (2002) PNAS 99: 868-873; Brooks et al. (199) J Immunol 162: 305-313; Miller et al. (2003) J Immunol 171: 1369-75; Brooks et al. (1997) J Esp Med 185: 795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311; no. de solicitud de Patente de E.U.A. 20030095965) .

CD94/NKG2A es un receptor inhibidor encontrado en subconjuntos de NK, células NKT y T, que restringe su eliminación de células que expresan el ligando CD94/NKG2A HLA-E que lleva péptidos pequeños típicamente derivados de la secuencia líder de otras moléculas de clase I MHC (ver, por ejemplo, W099/28748 y Braud et al. (1998) Nature 391: 795-799).

Diversos anticuerpos contra NKG2A se han descrito en la técnica. Por ejemplo Sivori et al. (Eur j Immunol 1996; 26: 2487) se refiere al anticuerpo Z270 anti-NKG2A de murino; Carretero et al. (J Exp ed 1999; 190: 1801-12) se refiere a anticuerpo 20D5 NKG2A anti-murino de rata; Solicitud de Patente de E.U.A., publicada como US20030095965 describe anticuerpo 3S9 de murino, que enlaza a NKG2A, NKG2C y NKG2E, solicitud de patente O06070286 describe anticuerpos monoclonales contra NKG2A y solicitud de patente WO2008/009545 describe el anticuerpo humZ270 humanizado y otros anticuerpos anti-NKG2A con cadena pesada variable sustancialmente idéntica y/o cadena ligera variable a aquellos de Z270.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad inflamatoria crónica donde la activación de mediadores inflamatorios producidos por múltiples subconjuntos celulares eventualmente resulta en destrucción de cartílago articular y hueso. Está generalmente aceptado que los subconjuntos celulares principales responsable de destrucción de cartílago y hueso en RA son sinoviocitos como fibroblastos (FLS) y osteoclastos, respectivamente. CD94-NKG2A que expresa células T y células NK puede suprimir inflamación al eliminar células proinflamatorias activadas. La activación de estas células se puede realizar por una serie de diferentes células y moléculas que incluyen macrófagos, células T CD4+ activadas y células B / células de plasma. Sin embargo, este regulador, actividad anti-inflamatoria se inhibe cuando receptores CD94-NKG2A emplean su ligando HLA-E en la superficie de células proinflamatorias . Al bloquear receptores CD94-NKG2A y evitar su señalización inhibitoria, N C141-0100 aumenta las actividades anti-inflamatorias de células T CD94-NKG2A+ reguladoras y células NK, que impulsa su capacidad para eliminar por ejemplo, células T CD4+ pro- inflamatorias activadas, y sinoviocitos como fibroblastos (FLS) . Una terapia que específicamente elimina erosión FLS de cartílago agresiva y suprime la formación de osteoclastos erosivos del hueso mientras que deja las células en. reposo no afectadas puede tener una ventaja significativa sobre las terapias RA actuales y podría potencialmente también con beneficio para los pacientes usarse en tratar osteroartritis (OA) y artritis psoriásica (PsA) .

Esta invención describe cómo un anticuerpo anti-NKG2A atenúa dos trayectorias patogénicas principales en RA, esto es, erosión de hueso y cartílago, por su capacidad para reducir la formación de osteoclastos que degradan el hueso y al mejorar selectivamente la eliminación de FLS que degrada el cartílago, respectivamente.

Los terapéuticos existentes que dirigen RA actúa directamente sobre componentes individuales de la cascada inflamatoria, y su eficacia con respecto a erosión de hueso es secundaria para su efecto anti- inflamatorio. Los mAbs anti -NKG2A capaces de inhibir enlace de HLA-E o que no competitivamente puede bloquear la función de CD94/NKG2A y estimular el mecanismo inmunoregulador endógeno de células NK, que resulta en eliminación selectiva de células que promueven degradación de cartílago, erosión ósea y reducción en IL-6, una citocina conocida para promover la inflamación. Por lo tanto, tratamiento terapéutico con un anti-NKG2A mAb puede tener un efecto directo en el paréntesis en enfermedades caracterizadas por la erosión de hueso o destrucción de cartílago.

La presente invención describe el uso de un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento del mismo, capaz de tratar la destrucción de cartílago y/o erosión ósea.

La presente invención describe el uso de un anticuerpo anti-NKG2A para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizada por la destrucción de cartílago y/o erosión ósea .

La presente invención describe el uso de un anticuerpo anti-NKG2A para el tratamiento de destrucción de cartílago y/o erosión ósea en donde el anticuerpo anti-NKG2A estimula la eliminación selectiva de células activadas que promueven la degradación del cartílago o erosión ósea. En una modalidad de la invención actual las células que degradan el cartílago son sinoviocitos como fibroblastos (FLS) . En una modalidad las células que erosionan el hueso son osteoclastos erosivos.

La presente invención describe el uso de un anticuerpo anti-NKG2A para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizada por la destrucción de cartílago y/o erosión ósea, en donde el anticuerpo anti-NKG2A estimula la eliminación selectiva de células activadas que promueven la degradación del cartílago o erosión ósea. En una modalidad de la invención actual las células que degradan el cartílago son sinoviocitos como fibroblastos (FLS) . En una modalidad las células que erosionan el hueso son osteoclastos erosivos.

Los anticuerpos NKG2A usados en la invención actual puede por cualquiera de los anticuerpos anti-NKG2A adecuados. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-NKG2A monoclonal . En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo anti-NKG2A humanizado. En una modalidad el anticuerpo es un anticuerpo anti-NKG2A completamente humano. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-NKG2A como se describe en la WO2008/009545. En una modalidad, el anticuerpo monoclonal anti-NKG2A es humZ270 como se describe en la publicación de patente WO2008/009545. En una modalidad el anticuerpo anti-NKG2A es un anticuerpo anti-NKG2A monoclonal como se describe en la publicación de patente O09092805. En una modalidad el anticuerpo anti-NKG2A es humZ199 como se describe en la publicación de patente O09092805.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS Las Figs. 1A-1E ilustran el perfil de expresión de un panel de moléculas de superficie celular expresadas por sinoviocitos generados in vitro como fibroblastos derivados del tejido sinovial de pacientes con artritis reumatoide (RA) .

- Fig. 1A muestra que los sinoviocitos como fibroblastos (FLS) derivados de pacientes con RA expresan CD55 (superposición de histograma derecho) , pero carece de CD68 (superposición de histograma izquierdo) .

- Fig. IB muestra que superficie celular RA-FLS expresa diversos ligandos para activar receptores de célula NK (por ejemplo, MICA, ULBP1, ULBP2 , ULBP3 , ICAM1, CD155, CD48) como se indica abajo cada superposición de histograma. Como manchas RA-FLS indicadas efectivamente con fusión NKp44-FC lo que sugiere que RA-FLS expresa un ligando supuesto para NKp44.

Fig. 1C muestra que un anticuerpo contra NKp44 dependiente de dosis evita enlace de una proteína de fusión NKp44-FC soluble sobre RA-FLS lo que sugiere que RA-FLS expresa un ligando capaz de interactuar con receptor NKp44.

- Fig. ID muestra que RA-FLS expresa ligandos HLA-E y HLA-G de clase I MHC, ligandos conocidos para reconocerse por receptores de célula NK (por ejemplo, CD94/NKG2A y LIR-1, respectivamente) .

- Fig. 1E muestra que RA-FLS expresa eliminación de receptor 5 (DR5) pero no DR4, receptores conocidos que enlazan TRAIL.

Las Figs . 2A-2H muestran que las células NK que expresan NKG2A presentan en sinovio RA y se pueden encontrar en áreas que contiene RA-FLS que expresa HLA-E.

- Fig. 2A muestra tejido sinovial RA manchado con un anticuerpo contra NKp46 humano. Las áreas manchadas oscuras son células que expresan NKp46.

- Fig. 2B muestra una sección adyacente del mismo tejido manchado con un anticuerpo contra NKG2A humano. Las áreas manchadas oscuras son células que expresan NKG2A.

Fig. 2C muestra una sección de tejido adyacente manchada con un anticuerpo de control de isótopo.

- Fig. 2D muestra la frecuencia de células NKG2A+/tej ido sinovial mm2 trazado contra la frecuencia de células NKp46+/tej ido sinovial mm2 como se evalúa por análisis de imagen digital cuantitativo. Los datos indican que la mayoría de las células NKG2A+ son células NK en el tejido sinovial RA inflamado.

Fig. 2E muestra tejido sinovial RA manchado con anticuerpo anti-HLA-E. Las células en el revestimiento sinovial, que incluyen RA-FLS, expresan HLA-E. La flecha indica un área de HLA-E oscuramente manchado que expresa células tipo FLS de revestimiento sinovial.

- Fig. 2F muestra que infiltrar células inmunitarias en el subrevestimiento sinovial expresa HLA-E Fig. 2G muestra tejido sinovial RA manchado con anticuerpo de control de isotipo - Fig. 2H muestra que células endoteliales vasculares expresan HLA-E Las Figs . 3A(i)-3D muestran que las células NK, que incluyen células NK sinoviales derivadas de pacientes RA, expresan un panel de receptores de activación conocidos para enlazar a ligandos que se expresan en RA-FLS.

- Figs. 3A(i) -3A(iii) : * Fig. 3A(i) muestra expresión de receptor de célula NK en células NK cerradas derivadas de SFMC de un paciente con RA representativo. Las células NK sinoviales expresan NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1 , 2B4 , LFA-1, y TRAIL, pero sin, o niveles muy bajos de NKG2C como se indica por las superposiciones de histograma abierto.

* Fig. 3A(ii) muestra reposo de células NK CD56brillantes de PBMC derivados de un donador saludable representativo. Las células NK CD56 brillantes expresan NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, y TRAIL, pero nada, o niveles muy bajos de NKG2C como se indica por las superposiciones de histograma abierto.

* La Fig. 3A. (iii) muestra células NK Nishi. Las células NK Nishi expresan NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, y TRAIL, pero ninguno, o niveles muy bajos de NKG2C como se indica por las superposiciones de histograma abierto .

Figs . 3B(i)-3B(ii) muestran que las células NK eliminan RA-FLS adherente in vitro: * Fig. 3B(i) muestra que las células NK cocultivadas con RA-FLS durante la noche resulta en la eliminación de RA-FLS adherente en una manera dependiente de dosis * Fig. 3B(ii) muestra al área bien cubierta por RA-FLS adherente cuando se cultiva solo, o cuando es co-cultivado con cantidad de disminución de células NK durante la noche, como se analiza por análisis de imagen de inmunomanchado .

- Fig. 3C muestra que las células NK se degranulan como se mide por expresión de superficie celular CD107a/b cuando se co-cultiva con RA-FLS, pero no cuando se cultiva solo, indicando que las células NK matan activamente RA-FLS.

- Fig. 3D muestra que enmascarar NKG2D, NKp44, NKp46, DNAM-l, o TRAIL expresadas por células NK resulta en matanza significativamente reducida de RA-FLS como se mide por Expresión de superficie celular CD107a/b en células NK efectoras.

Las Figs. 4A-4E muestran que RA-FLS se protegen de citotoxicidad mediada por célula NK por expresión de HLA-E capaz de ligarse a receptores de célula NK CD94-NKG2A inhibidores.

- Fig. 4A muestra que células NK sinoviales RA (panel superior) , células PB-NK saludables CD56brillantes (panel medio) , y células Nishi NK (panel inferior) toda la superficie celular expresa NKG2A (izquierda) , pero carece de KIRs (derecha) . Además, las células Nishi, pero no células NK sinoviales o células NK CD56brillante , expresan LIR1 (panel medio) - Fig. 4B muestra desgranulación de célula NK incrementada como se mide por expresión de superficie celular CD107a/b cuando las células NK son cocultivadas con A-FLS en la presencia de anti-NKG2A (panel derecho) , pero no en la presencia de anti-LIRl (panel izquierdo) .

- Fig. 4C muestra la depuración dependiente de célula NK incrementada de RA-FLS adherente cuando se trata con anti-NKG2A (imagen derecha) como se compara con el tratamiento con un control de isotipo (imagen media) . RA-FLS cultivado en la ausencia de células NK se muestra en la imagen de micrografía izquierda.

Fig. 4D muestra que las células NK sinoviales se desgranulan cuando se co-cultivan con RA-FLS autólogo (14%, izquierdo superior) y que enmascaran NKG2A resulta en desgranulación incrementada (44%, derecho superior). Las células T CD3+ CD8+ autólogas no desgranulan significativamente cuando se co-cultivan con RA-FLS autólogo en la ausencia (esto es, cultivos tratados de isotipo, izquierdo inferior) o presencia (derecho inferior) de anti-NKG2A.

Fig. 4E muestra que células PB-NK CD56brillantes recientemente aisladas y no estimuladas de donadores saludables desgranulan cuando son cocultivadas con RA-FLS en la presencia de anti-NKG2A pero mínimamente por cuando se trata con un anticuerpo de control de isotipo. El panel superior muestra un ejemplo representativo y el gráfico inferior muestra la expresión CD107a/b % en 5 células NK CD56brillantes de donante separado cocultivadas con RA-FLS en la presencia de un isotipo vs anti-NKG2A.

La Fig. 5A. muestra que bloquear NKG2A usando NNC141- 0100 (humZ270) lleva a eliminación mediada por célula NK incrementada de RA-FLS como se mide por un ensayo de liberación LDH. Las células efectoras NKL se muestran en la izquierda y las células NK Nishi en la derecha contra una célula objetivo RA-FLS representativa.

La Fig 5B muestra que bloquear NKG2A usando NNC141 -0100 (humZ270) lleva a lisis incrementada de una RA-FLS representativa (RA-FLS2) pero no afecta la eliminación de una línea celular de fibroblastos de capullo normal (FSK4) .

Las Figs . 6A-6G muestran que NNC141-0100 (humZ270) inhibe la formación de osteoclastos multinucleados TRAP+ : - Fig. 6A muestra un ejemplo representativo de RA-SFMC cultivado por 7 días en la presencia de isotipo humlgG4.

Diversas células TRAP+ multinucleadas grandes son visibles.

- Fig 6B muestra que tratamiento humZ270 resulta en drásticamente reducir números de células TRAP+ multinucleadas grandes.

Fig. 6C muestra formación de osteoclastos en SFMC derivados de pacientes con RA cultivado en medio o IL-15 en la presencia de un control de isotipo vs anti-NKG2A (humZ270, NNC141-0100) como se indica. Enmascarar NKG2A en cultivos estimulados con IL-15 resulta en número reducido de células multinucleadas TRAP+.

- Fig. 6D muestra que la formación de osteoclastos que erosionan el hueso-mineral en SFMC derivados de pacientes con RA se suprime por tratamiento con NNC141-0100. Se muestra un ejemplo representativo de erosión mineral de hueso observada de un cultivo SFMC de paciente con no. 2357. SFMC se hicieron crecer en discos osteológicos en la presencia de IL-15 e isotipo mAb (izquierda) vs anti-NKG2A (humZ270( derecha). Los discos se mancharon con von Kossa y las áreas erosionadas se analizaron usando Analizador Immunospot S5 y apareció blanco contra el fondo oscuro.

- Fig. 6E SFMC derivados de pacientes con RA (n=5) se cultivaron en medio complementado con 10 ng/mL IL-15. En el comienzo del ensayo, 20 microgramo/mL de isotipo IgG4 humano (barra blanca) o 20 microgramo/mL de N C141 - 0100 (humZ270, barra negra) se agregaron a los cultivos. El área de disco erosionado SEM +/- de porcentaje medio se cuantificó usando Analizador Immunospot S5.

La Fig. 6F muestra que HumZ270 suprime la erosión mineral de hueso en cultivos de explantes de tejido sinovial RA. La figura muestra un ejemplo donde virutas de tejido sinovial de RA se hicieron crecer en pozos por triplicado en discos minerales óseos en la presencia de medio solo (control, superior), isotipo control (segundo de la parte superior) , infliximab (IFX, tercero de la parte superior) , o anti-NKG2A (humZ270, parte del fondo). Las áreas de luz representan erosión mineral de hueso.

- Fig. 6G muestra porcentaje de erosión mineral de hueso observado cómo se determina por análisis usando un Inmunomanchado analizado.

Figs . 7A-7C: - Fig. 7A muestra modulación de niveles de citocina como se mide en 24 hrs en cultivos in vitro SFMC tras el tratamiento con humZ270 (NNC141-0100, barras gris oscuro) como se compara con un control de isotipo (barras gris claro) . Una reducción significativa en niveles IL6 se observa tras enmascarar G2A. Además, se observa un incremento ligero en M-CSF.

- Fig. 7B muestra una comparación por parejas de niveles IL-6 producidos en la presencia de anti -NKG2A (NNC141-0100, humZ270) vs control de isotipo en cultivos RA-SFMC (n=ll) .

- Fig. 7C muestra que anti-NKG2A inhibe tanto el valor de referencia (esto es, medio solo) como la producción de IL-6 estimulada por IL-15 en cultivos ex vivo de SFMC derivados de pacientes con RA. La media y SD de dos pacientes con RA representativos se muestra.

Las Figs . 8A-8 muestran que las células NK presentes en tejido sinovial de RA expresan el receptor NKG2A inhibitorio y se localizan predominantemente en agregados linfoides adyacentes a sinoviocitos que expresan HLA-E, el ligando para CD94-NKG2A.

- Fig. 8A muestra tejido sinovial de RA de ID 1144-09 manchado para células NK con un anticuerpo anti-NKp46.

- Fig. 8B muestra tejido sinovial de RA de ID 1591-08 manchado para células NK con un anticuerpo anti-NKp46.

- Fig. 8C muestra tejido sinovial de RA de ID 1144-09, manchado para NKG2A con el anticuerpo Z199 (un anticuerpo anti-NKG2A) .

- Fig. 8D muestra tejido sinovial de RA de ID 1591-08, manchado para NKG2A con el anticuerpo Z199 (un anticuerpo anti -NKG2A) .

- Fig. 8E muestra tejido sinovial de RA de ID 1144-09, manchado para HLA-E con 1 anticuerpo 3D12.

- Fig. 8F muestra tejido sinovial de RA de ID 1591-08, manchado para HLA-E con el anticuerpo 3D12.

- Fig. 8G muestra tejido sinovial de RA de ID 1144-09, manchado para células T con un anticuerpo anti-CD3.

- Fig. 8H muestra tejido sinovial de RA de ID 1591-08, manchado para células T con un anticuerpo anti-CD3.

- Fig. 81 muestra tejido sinovial de RA de ID 1144-09, manchado con un anticuerpo de control de isotipo IgG2b.

- Fig. 8J muestra tejido sinovial de RA de ID 1591-08, manchado con un anticuerpo de control de isotipo IgG2b.

- Fig. 8K muestra una alta magnificación de fotografías de células NK NKp46+ de ID 1595-08.

- Fig. 8L muestra una alta magnificación de fotografías de células M NKG2A+ de ID 1595-08.

- Fig. 8M muestra un análisis de imagen digital para correlación del número de células NKG2A+ en sinovio de 15 pacientes con RA con el número de células NK NKp46+.

Las Figs . 9A-9C muestran que NKG2A y su ligando, HLA-E , se expresan en sinovio de pacientes con osteoartritis (OA) .

- Fig. 9A describe células NKG2A+ (anticuerpo Z199) entre linfocitos de infiltración.

- Fig. 9B describe expresión HLA-E (anticuerpo 3D12) al infiltrar células inmunitarias , células endoteliales y sinoviocitos .

Fig. 9C muestra un análisis de imagen digital para correlación de la frecuencia de células NKG2A+ con la de células NK en sinovio OA.

Las Figs. 10A-10D muestran que el ligando CD94 -NKG2A se encontró para expresarse en sinovio inflamado de no únicamente pacientes con RA y OA, sino también pacientes con PsA.

Fig. 10A describe tinción de muestras de tejido sinovial de paciente con RA.

Fig. 10B describe tinción de muestras de tejido sinovial de paciente con PsA.

Fig. 10C describe tinción de muestras de tejido sinovial de paciente con RO (OA????) - Fig. 10D describe tinción de muestras de tejido sinovial de control normal.

Las Figs . 11A-11E muestran la secuencia de aminoácido de: - Fig. HA: SEQ. ID. NO. 1.; humNKG2A, - Fig. 11B: SEQ. ID. NO. 2.; dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo humZ270, - Fig. 11C: SEQ. ID. NO. 3.; dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo humZ270, - Fig. 11D: SEQ. ID. NO. 4.; dominio variable de cadena pesada (VH) del anticuerpo humZ199f - Fig. 11E: SEQ. ID. NO. 5.; dominio variable de cadena ligera (VL) del anticuerpo humZ199.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION El término "anticuerpo" como se refiere en la presente se refiere a polipéptido derivado de una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal. El término incluye anticuerpos de longitud completa y cualquier fragmento de enlace a antígeno o cadenas sencillas del mismo. El término "anticuerpo", "anticuerpo monoclonal" y "mAb" como se usa en la presente descripción, se pretende hacer referencia a moléculas de inmunoglobulina y fragmentos del mismo que tienen la capacidad para específicamente enlazar a un antígeno. Una subclase de las inmunoglobulinas de interés farmacéutico particular son aquellas que pertenecen a la familia igG, que se pueden sub-dividir en los iso-tipos IgGl, IgG2 , IgG3 e IgG4. Las moléculas IgG se componen de dos cadenas pesadas interligadas por dos o varios enlaces de disulfuro y dos cadenas ligeras, una enlazada a cada una de las cadenas pesadas por un enlace de disulfuro. La cadena pesada IgG se compone de cuatro dominios Ig, que incluyen el dominio variable (VH) y tres dominios constantes (CH1, CH2 , y CH3) . Cada cadena ligera se compone de una región variable de cadena ligera (VL) y una región constante de cadena ligera (CL) . Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de enlace que interactúa con un antígeno. Las regiones VH y VL se pueden además subdividir en regiones de hipervariabilidad, llamadas regiones que determinan la complementariedad (CDRs) , intercaladas con regiones que están más conservadas, llamadas regiones de marco (FR) . Cada VH y VL se componen de tres CDRs y cuatro FRs, configurados de terminal amino a terminal carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1 , FR2 , CDR2 , FR3 , CDR3 , FR4.

Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar el enlace del anticuerpo a tejidos hospederos o factores, que incluyen diversas células del sistema inmune (por ejemplo, células efectoras) , receptores Fe (FcRs) y el primer componente (Clq) del sistema de complemento clásico. Enlazar a FcRs y Clq puede mediar efectos tal como ADCC o CDC.

Un anticuerpo de la invención puede ser cualquier anticuerpo de enlace NKG2A, el anticuerpo humZ270 (SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3) o el anticuerpo humZ199 (SEQ. ID. NO. 4 y SEQ. ID. NO. 5) o cualquier otro anticuerpo de la invención, o una variante de uno de cualesquiera de estos anticuerpos.

El término Z270 humanizado o humZ270 o hZ270 como se usa en la presente, comprende el anticuerpo descrito en la solicitud de patente WO08009545, que se incorpora como referencia en esta solicitud. El término Z199 humanizado o humZ199 como se usa en la presente descripción, comprende el anticuerpo descrito en la publicación de patente WO09092805 que se incorpora como referencia en la solicitud de patente actual .

Como se usa en la presente descripción, el término Ab comprende un anticuerpo, o un fragmento del mismo, que específicamente enlaza su Ag correspondiente. Los ejemplos de fragmentos de enlace de antígeno incluyen, pero no se restringen a, Fab, Fab ' , F(ab)2, F(ab')2, Fv (típicamente los dominios VL y VH de un grupo sencillo de un anticuerpo) , Fv de cadena sencilla (scFv; ver por ejemplo, Bird et al., Science 1988; 242: 42S-426; y Huston et al. PNAS 1988; 85: 5879-5883), dsFv, Fd (típicamente el dominio VH y CHI), y dAb (típicamente un dominio VH) fragmentos; VH, VL, VhH, y dominios V-NAR; moléculas monovalentes que comprenden una cadena VH sencilla y una VL sencilla; minicuerpos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos , y kappa cuerpos (ver, por ejemplo, III et al.. Protein Eng 1997; 10: 949-57); IgG de camello; IgNAR; así como uno o más CDRs aislados o un paratopo funcional, donde los CDRs aislados o residuos que enlazan antígeno o polipéptidos se pueden asociar o ligar juntos con el fin de formar un fragmento de anticuerpo funcional. Diversos tipos de fragmentos de anticuerpo se han descrito o revisado en, por ejemplo, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005; 2S: 1126-1136; WO2005040219 , y publicado en solicitudes de Patente de E.U.A. 20050238646 y 20020161201.

El término "fragmento que enlaza antígeno" de un anticuerpo se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que conserva la capacidad para específicamente enlazar a un antígeno, tal como NKG2A u otra molécula objetivo como se describe en la presente. Se ha mostrado que la función que enlaza antígeno de un anticuerpo se puede realizar por fragmentos de un anticuerpo de longitud completa. Los ejemplos de fragmentos de enlace abarcados dentro del término "fragmento de enlace a antígeno" de un anticuerpo incluyen un fragmento Fab, un fragmento F(ab')2, un fragmento Fab 1 , un fragmento Fd, un fragmento Fv, un fragmento ScFv, un fragmento dAb y una región que determina complementariedad aislada (CDR) . Los anticuerpos de cadena sencilla tal como scFv y anticuerpos de cadena pesada tal como VHH y anticuerpos de camello de dominio sencillo también se pretenden que se abarquen dentro del término "porción de enlace de antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se pueden obtener usando técnicas convencionales conocidas por aquellos de experiencia en la técnica, y los fragmentos se pueden separar por exclusión para utilidad de la misma manera como anticuerpos intactos.

Un fragmento "Fab" incluye un dominio variable y un dominio constante de la cadena ligera y un dominio variable y el primer dominio constante (CH1) de la cadena pesada. Un fragmento Fab' incluye una o más terminal de carboxi de cisteína ligadas a las cadenas pesada o ligera. Los fragmentos de anticuerpo F(ab')2 comprenden un par de fragmentos Fab que generalmente se ligan covalentemente cerca de sus extremos carboxi por cisteínas de bisagras. Otros acoplamientos químicos de fragmentos de anticuerpo también se conocen en la técnica. Un fragmento Fab conserva la capacidad del anticuerpo precursor para enlazar a su antígeno, potencialmente con una afinidad menor. Los fragmentos F(ab')2 son capaces de enlace divalente, mientras que fragmentos Fab se pueden enlazar de forma monovalente solamente. Generalmente, los fragmentos Fab carecen de los dominios CH2 y CH3 constantes, esto es, la parte Fe, donde la interacción con los receptores Fe ocurriría. Por lo tanto, los fragmentos Fab están en general faltos de funciones efectoras.

Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un reconocimiento de antígeno completo y sitio de enlace, y generalmente comprende un dímero de dominio variable de una cadena pesada y una ligera en estrecha asociación que puede ser covalente en naturaleza, por ejemplo en un fragmento de dominio variable de cadena sencilla (scFv) . Es en esta configuración que las tres regiones hipervariables de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis regiones hipervariables o un subconjunto del mismo confieren especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, aún un dominio variable sencillo que comprende únicamente tres regiones hipervariables específicas para un antígeno tiene la capacidad para reconocer y enlazar antígeno, aunque usualmente en una afinidad menor que el sitio de enlace completo (Cai & Garen, Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). Por ejemplo, anticuerpos camélidos que se presentan naturalmente que únicamente tienen un dominio variable de cadena pesada (VHH) pueden enlazar antígeno (Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).

Los fragmentos de anticuerpo "Fv de cadena sencilla" o "scFv" comprenden los dominios VH y VL de anticuerpo, donde estos dominios se presentan en una cadena de polipéptido sencillo. Generalmente, el polipéptido Fv además comprende un ligador de polipéptido entre los dominios VH y VL que permite al scFv formar la estructura deseada para enlace de antígeno. Para una revisión de scFv, ver Pluckthun, 1994, en: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol . 113, Rosenburg and Moore eds . Springer-Verlag, Nueva York, pp. 269-315.

El término "diacuerpos" se refiere a pequeños fragmentos de anticuerpo con dos sitios de enlace de antígeno, en cuyos fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptido (VH y VL) . Al usar un ligador que es demasiado corto para permitir el emparejamiento entre los dos dominios variables en la misma cadena, los dominios variables son forzados para emparejar con dominios complementarios de otra cadena, creando dos sitios de enlace de antígeno. Los diacuerpos se describen más completamente, por ejemplo, en EP 404,097; WO 93/11161; y Hollinger et al., 1993, Proc. Nati. Acad. Sci . USA, 90:6444-6448.

La expresión "anticuerpos lineales" se refiere a anticuerpos como se describe en Zapata et al., 1995, Protein Eng. , 8(10): 1057-1062. Brevemente, estos anticuerpos contienen un par de segmentos Fd de tándem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto con polipéptidos de cadena ligera complementaria, forman un par de regiones de enlace de antígeno. Los anticuerpos lineales pueden ser biespecífico o monoespecífico .

El término "monocuerpo" como se usa en la presente, se refiere a una molécula de enlace de antígeno con un dominio variable de cadena pesada y ningún dominio variable de cadena ligera. Un monocuerpo puede enlazar a un antígeno en la ausencia de cadenas ligeras y típicamente tiene tres regiones hipervariables , por ejemplo CDRs designadas CDRH1, CDRH2 , y CDRH3. Un monocuerpo IgG de cadena pesada tiene dos moléculas de enlace de antígeno de cadena pesada conectadas por un enlace de disulfuro. El dominio variable de cadena pesada comprende una o más regiones hipervariables, preferiblemente una región CDRH3 o HVL-H3.

El término "región hipervariable" , cuando se usa en la presente, se refiere a los residuos de aminoácido de un anticuerpo que son responsables de enlace de antígeno. La región hipervariable comprende residuos de aminoácido de una "región que determina complementariedad" o "CDR" (definido por secuencia como residuos 24-34 (Ll) , 50-56 (L2) y 89-97 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 31-35 (Hl) , 50-65 (H2) y 95-102 (H3) en el dominio variable de cadena pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991) ) y/o aquellos residuos de un "rizo hipervariable" (definido por estructura y diferentes para cada anticuerpo; ver, por ejemplo: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 901-917). En un ejemplo, residuos HVL pueden incluir, 26-32 (Ll) , 50-52 (L2) y 91-96 (L3) en el dominio variable de cadena ligera y 26-32 (Hl) , 53-55 (H2) y 96-101 (H3) en el dominio variable de cadena pesada.

Los fragmentos de anticuerpo se pueden obtener usando técnicas de manufactura por ingeniería de proteína o recombinante convencional, y los fragmentos se pueden separar por exclusión para enlazar a NKG2A, u otra función, de la misma manera como anticuerpos intactos.

Los fragmentos de anticuerpo de la invención se pueden hacer por truncamiento, por ejemplo, por eliminación de uno o más aminoácidos de los extremos de terminal N y/o C de un polipéptido. Los fragmentos también se pueden generar por uno o más eliminaciones internas.

Un anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, un fragmento de cualquier anticuerpo anti-NKG2A, el anticuerpo humZ270 (SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3) o el anticuerpo humZ199 (SEQ. ID. NO. 4 y SEQ. ID. NO. 5) o cualquier otro anticuerpo de la invención, o una variante de uno de cualesquiera de estos anticuerpos. Un anticuerpo de la invención puede ser, o puede comprender, una porción de enlace de antígeno de uno de estos anticuerpos, o variantes del mismo. Por ejemplo, el anticuerpo de la invención puede ser un fragmento Fab de uno de estos anticuerpos o variantes del mismo, o puede ser un anticuerpo de cadena sencilla derivado de uno de estos anticuerpos, o una variante del mismo.

Un anticuerpo de la invención puede ser un anticuerpo humano o un anticuerpo humanizado. El término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, se pretende que incluya anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales ambas de las regiones de marco y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante también se deriva de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (por ejemplo, las mutaciones introducidas por mutagénesis in vitro aleatoria o específica al sitio o por mutación somática in vivo) . Por otro lado, el término "anticuerpo humano", como se usa en la presente, no se pretende que incluya anticuerpos en los que las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otras especies de mamífero, tal como un ratón, se han injertado sobre secuencias de marco humanas.

Tal anticuerpo humano puede ser un anticuerpo monoclonal humano. Tal anticuerpo monoclonal humano se puede producir por un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo, un ratón transgénico, que tiene un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera fusionados a una célula inmortalizada.

Los anticuerpos humanos se pueden aislar de colecciones de secuencia incorporadas en las selecciones de secuencias de línea germinal humana, además diversificar con diversidad de secuencia natural y sintética.

Los anticuerpos humanos se pueden preparar por inmunización in vitro de linfocitos humanos seguido por transformación de los linfocitos con virus Epstein-Barr .

El término "derivados de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, tal como un conjugado del anticuerpo y otro agente o anticuerpo.

El término "anticuerpo humanizado", como se usa en la presente, se refiere a un anticuerpo quimérico humano/no humano que contiene una secuencia mínima (regiones CDR) derivados de una inmunoglobulina no humana. Un anticuerpo humanizado es, por lo tanto, una inmunoglobulina humana (anticuerpo receptor) en la que residuos de una región hiper-variable del receptor se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante) tal como de un ratón, rata, conejo, o primate no humano, que tiene la especificidad deseada, afinidad, y capacidad. En algunas instancias, los residuos FR de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Un ejemplo de tal modificación es la introducción de uno o más llamadas mutaciones traseras.

Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo receptor o en el anticuerpo donante. Estas modificaciones se hacen para perfeccionar además el desempeño de anticuerpo. En general, un anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todo de, al menos uno, y típicamente dos, dominios variables, en los cuales todos o sustancialmente todos de los lazos hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todos o sustancialmente todos de los residuos FR son aquellos de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado puede opcionalmente también comprender al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente que de una inmunoglobulina humana.

El término "anticuerpo quimérico" , como se usa en la presente descripción, se refiere a un anticuerpo que es ligero y genes de cadena pesada se han construido, típicamente por ingeniería genética, de variable de inmunoglobulina y genes de región constante que se originan de diferentes especies. Por ejemplo, los segmentos variables de genes de un anticuerpo monoclonal de ratón se puede unir a segmentos constantes humanos.

La región cristalizable del fragmento ("región Fc/dominio Fe") de un anticuerpo es la región "cola" de un anticuerpo que comprende los dominios CH2 y CH3 constantes. El dominio Fe puede interactuar con receptores de superficie celular llamados receptores Fe, así como algunas proteínas del sistema de complemento. La región Fe permite a los anticuerpos activar el sistema inmunitario. En un aspecto de la invención, anticuerpos se pueden manufacturar por ingeniería para incluir modificaciones dentro de la región Fe, típicamente para alterar una o más de sus propiedades funcionales, tal como vida media en suero, fijación de complemento, enlace de receptor Fe, estabilidad de proteína y/o citotoxicidad celular dependiente de antígeno, o carece del mismo. Además, un anticuerpo de la invención se puede modificar químicamente (por ejemplo, una o más fracciones químicas se pueden enlazar al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, nuevamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Preferiblemente, un dominio Fe modificado comprende uno o más, preferiblemente todos de las siguientes mutaciones que resultarán en afinidad disminuida a ciertos receptores Fe (L234A, L235E, y G237A) y en fijación de complemento mediada por Clq reducida (A330S y P331S) , respectivamente.

El isotipo de un anticuerpo de la invención puede ser IgG, tal como IgGl, tal como IgG2 , tal como IgG4. Si se desea, la clase de un anticuerpo se puede "cambiar" por técnicas conocidas. Por ejemplo, un anticuerpo que se produjo originalmente como una molécula IgM puede ser cambiado de clase a un anticuerpo IgG. Las técnicas de cambiado de clase también se pueden usar para convertir una subclase IgG a otra, por ejemplo: de IgGl hasta IgG2 o IgG4 ; de IgG2 hasta IgGl o IgG4; o desde IgG4 hasta IgGl o IgG2. También se pueden realizar producción por ingeniería de anticuerpos para generar moléculas quiméricas de región constante, por combinación de regiones de diferentes subclases IgG.

El término "epítopo", como se usa en la presente, se define en el contexto de una interacción molecular entre un "polipéptido de enlace de antígeno", tal como un anticuerpo (Ab) , y su "antígeno" correspondiente (Ag) . El término antígeno (Ag) se refiere a la entidad molecular usada para inmunización de un vertebrado inmunocompetente para producir el anticuerpo (Ab) que reconoce el Ag. En la presente, Ag se denomina más ampliamente y generalmente se pretende que incluya moléculas objetivo que se reconocen específicamente por el Ab, así incluir fragmentos o imitadores de la molécula usada en el proceso de inmunización para aumentar el Ab.

Generalmente, "epítopo" se refiere al área o región en un Ag al cual un Ab específicamente enlaza, esto es, el área o región en contacto físico con el Ab . Un epítopo de proteína puede comprender residuos de aminoácido en el Ag que están implicados directamente en enlazar a un Ab (también llamado el componente inmunodominante del epítopo) y otros residuos de aminoácido, que no se implican directamente en enlazar, tal como residuos de aminoácido del Ag que efectivamente se bloquean por el Ab (en otras palabras, el residuo de aminoácido está dentro de la "superficie excluida de solvente" y/o la "huella" del Ab) . El término epítopo en la presente incluye ambos tipos de sitios de enlace en cualquier región particular de NKG2A que específicamente enlazan a un anticuerpo anti-NKG2A, u otro agente específico de NKG2A de acuerdo con la invención, a menos que se establezca de otra manera (por ejemplo, en algunos contextos la invención se refiere a anticuerpos que enlazan directamente a residuos de aminoácido particulares) . NKG2A puede comprender un número de diferentes epítopos, que pueden incluir, sin limitación, (1) epítopo de péptido lineal, (2) epítopo conformacional que consiste de uno o más aminoácidos no contiguos ubicados cerca unos de otros en la conformación NKG2A madura; y (3) epítopo post-traducción que consiste, ya sea completo o en parte, de estructuras moleculares covalentemente enlazadas a NKG2A, tal como grupos de carbohidrato .

El epítopo para un par anticuerpo (Ab) /antígeno (Ag) determinado se puede definir y caracterizar en diferentes -niveles de cola usando una variedad de métodos de mapeo de epítopo experimental y computacional . Los métodos experimentales incluyen mutagénesis, cristalografía de rayos X, espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) , Espectrometría de Masa de intercambio de deuterio de hidrógeno (HX-MS) y diversos métodos de enlace de competencia; los métodos que se conocen en la técnica. Como cada método depende de un principio único, la descripción de un epítopo se liga íntimamente al método por el cual se ha determinado. Por lo tanto, dependiendo del método de mapeo de epítopo empleado, el epítopo para un par Ab/Ag determinado se definirá de forma diferente.

En su nivel más detallado, el epítopo para la interacción entre el Ag y el Ab se puede definir por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos presentes en la interacción Ag-Ab, así como información alrededor de sus contribuciones relativas a los termodinámicos de enlace. En un nivel menos detallado, el epítopo se puede caracterizar por las coordenadas espaciales que definen los contactos atómicos entre el Ag y Ab. En un nivel aún menos detallado el epítopo se puede caracterizar por los residuos de aminoácido que comprenden tal como se define por un criterio específico tal como la distancia entre átomos en el Ab y el Ag. En un nivel además menos detallado el epítopo se puede caracterizar a través de función, por ejemplo, por enlace de competencia con otros Abs . El epítopo también se puede definir más genéricamente como que comprende residuos de aminoácido para los que la sustitución por otro aminoácido alterará las características de la interacción entre el Ab y Ag.

En el contexto de una estructura de cristal derivada de rayos X definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, por ejemplo, un fragmento Fab, y su Ag, el término epí opo está en la presente, a menos que se especifique de otra manera o contradiga por el contexto, específicamente definido como residuos NKG2A caracterizados porque tiene un átomo de cadena (esto es, un átomo sin hidrógeno) dentro de una distancia de 4 Á desde un átomo de cadena en el A .

Del hecho de que las descripciones y definiciones de epítopos, dependiente del método de mapeo de epítopo usado, se obtienen en diferentes niveles de detalle, se puede llevar a cabo la siguiente tal comparación de epítopos para diferentes Abs en el mismo Ag de forma similar en diferentes niveles de detalle.

Los epítopos descritos en el nivel de aminoácido, por ejemplo, determinados de una estructura de rayos X, se dice que son idénticos si contienen el mismo conjunto de residuos de aminoácido. Los epítopos se dice que se superponen si al menos un aminoácido se comparte por los epítopos. Los epítopos son los que se separan (único) si ningún residuo de aminoácido se comparte por los epítopos.

Los epítopos caracterizados por enlace de competencia son los que se superponen si el enlace de los Abs correspondientes son mutuamente exclusivos, esto es, enlace de un Ab excluye enlace simultáneo del otro Ab. Los epítopos son los que se separan (único) si el Ag es capaz de acomodar enlace de ambos Abs correspondientes simultáneamente.

La definición del término "paratopo" se deriva de la definición anterior de "epítopo" al invertir la perspectiva. Por lo tanto, el término "paratopo" se refiere al área o región en el Ab al cual un Ag específicamente enlaza, esto es, con el que se hace contacto físico al Ag.

En el contexto de una estructura de cristal derivada de rayos X, definida por coordenadas espaciales de un complejo entre un Ab, tal como un fragmento Fab, y su Ag, el término paratopo está en la presente, a menos que se especifique de otra manera o contradiga por el contexto, específicamente definido como Ag los residuos caracterizados por que tienen un átomo de cadena (esto es, un átomo sin hidrógeno) dentro de una distancia de 4Á desde un átomo de cadena en NKG2A.

El epítopo y paratopo para un par de anticuerpo (Ab) /antígeno (Ag) determinado se puede identificar por métodos de rutina. Por ejemplo, la ubicación general de un epítopo se puede determinar al evaluar la capacidad de un anticuerpo para enlazar a diferentes fragmentos o polipéptidos NKG2A variantes. Los aminoácidos específicos dentro de NKG2A que hacen contacto con un anticuerpo (epítopo) y los aminoácidos específicos en un anticuerpo que hacen contacto con NKG2A (paratopo) también se pueden determinar usando métodos de rutina. Por ejemplo, el anticuerpo y molécula objetivo se puede combinar y el complejo Ab/Ag se puede cristalizar. La estructura de cristal del complejo se puede determinar y usar para identificar sitios específicos de interacción entre el anticuerpo y su obj etivo .

Los anticuerpos enlazados al mismo antígeno se pueden caracterizar con respecto a su capacidad para enlazar a su antígeno común simultáneamente y se puede someter a "pre clasificación" . En el contexto presente el término "pre clasificación" se refiere a un método para agrupar anticuerpos que se enlazan al mismo antígeno. La "pre clasificación" de anticuerpos se puede basar en enlace de competencia de dos anticuerpos a su antígeno común en ensayos basados en técnicas estándares tal como Resonancia de Plasmon Superficial (SPR) , ELISA o citometría de flujo.

Un "bin" se define por un anticuerpo de referencia. Si un segundo anticuerpo es incapaz para enlazar al antígeno al mismo tiempo como el anticuerpo de referencia, el segundo anticuerpo se dice que pertenece al mismo "bin" como el anticuerpo de referencia. En este caso la referencia y el segundo anticuerpo están compitiendo para enlazar al antígeno, así el par de anticuerpos se denomina "anticuerpos de competencia" . Si un segundo anticuerpo es capaz de enlazar al antígeno al mismo tiempo como el anticuerpo de referencia, el segundo anticuerpo se dice que pertenece a un "bin" separado. En este caso la referencia y el segundo anticuerpo no están compitiendo para enlazar al antígeno, así el par de anticuerpos se denomina "anticuerpos sin competencia" .

La "pre clasificación" de anticuerpo no proporciona información directa alrededor del epítopo. Los anticuerpos de competencia, esto es, anticuerpos que pertenecen al mismo "bin" pueden tener epítopos idénticos, que superponen epítopos o aún epítopos separados. Este último es el caso si el anticuerpo de referencia enlaza a su epítopo en el antígeno toma el espacio requerido para el segundo anticuerpo para poner en contacto su epítopo en el antígeno ("impedimento estérico"). Los anticuerpos sin competencia tienen epítopos separados.

El término "afinidad de enlace" está en la presente usado como una medida de la fuerza de una interacción no covalente entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno. El término "afinidad de enlace" se usa para describir interacciones monovalentes (actividad intrínseca) .

La afinidad de enlace entre dos moléculas, por ejemplo, un anticuerpo, o fragmento del mismo, y un antígeno, a través de una interacción monovalente se puede cuantificar por la determinación de la constante de disociación (KD) . A su vez, KD se puede determinar por la medición de los cinéticos de formación de complejo y disociación, por ejemplo, por el método SPR. Las constantes de velocidad que corresponden a la asociación y la disociación de un complejo monovalente se refieren como la constante de velocidad de asociación ka (o kon) y constante de velocidad de disociación kd (o k0ff) , respectivamente. KD se relaciona con ka y ka a través de la ecuación KD = kd / ka.

Siguiendo la definición anterior, las afinidades de enlace asociadas con diferentes interacciones moleculares, tal como comparación de la afinidad de enlace de diferentes anticuerpos para un antígeno determinado, se puede comparar por la comparación de los valores KD para los complejos anticuerpo/antígeno individuales .

Similarmente , la especificidad de una interacción se puede evaluar por la determinación y comparación del valor KD para la interacción de interés, tal como una interacción específica entre un anticuerpo y un antígeno, con el valor KD de una interacción no de interés.

Típicamente, el KD para el anticuerpo con respecto al objetivo será de 2 veces, preferiblemente 5 veces, más preferiblemente 10 veces menos que KD con respecto al otro, molécula no objetivo tal como material no relacionado o material complementario en el entorno. Más preferiblemente, el KD será 50 veces menos, tal como 100 veces menos, o 200 veces menos; aún más preferiblemente 500 veces menos, tal como 1,000 veces menos, o 10,000 veces menos.

El valor de esta constante de disociación se puede determinar directamente por métodos bien conocidos, tal como por ensayos estándares para evaluar la capacidad de enlace de ligandos tal como anticuerpos hacia objetivos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ELISAs, manchados Western, RIAs, y análisis de citometría de flujo. Los cinéticos de enlace y afinidad de enlace del anticuerpo también se pueden evaluar por ensayos estándares conocidos en la técnica, tal como SPR.

Un ensayo de enlace competitivo se puede llevar a cabo en el cual el enlace del anticuerpo al objetivo se compara al enlace del objetivo por otro ligando de ese objetivo, tal como otro anticuerpo.

Un anticuerpo de la invención puede tener un KD para su objetivo de 1 x 10-7M o menos, 1 x 10-8M o menos, o 1 x 10-9M o menos, o 1 x 10-10M o menos, 1 x 10-11M o menos, o 1 x 10-12M o menos.] El KD de un anticuerpo de la invención actual puede ser menos que [0.8 nM, tal como menos que 0.7 nM, tal como menos que 0.6 nM, tal como menos que 0.5 nM, tal como menos que 0.4 nM, tal como menos que 0.3 nM, tal como menos que 0.2 nM, tal como menos que 0.1 nM, tal como menos que 0.05 nM, tal como menos que 0.025 nM, tal como menos que 0.015 nM, tal como entre 0.015 nM y 0 nM.

El término "identidad" como se conoce en la técnica, se refiere a una relación entre las secuencias de dos o más polipéptidos , como se determina al comparar las secuencias. En la técnica, "identidad" también significa el grado de relación de secuencia entre polipéptidos, como se determina por el número de emparejamientos entre cadenas de dos o más residuos de aminoácido. La "identidad" mide el porcentaje de emparejamientos idénticos entre las más pequeñas de dos o más secuencias con alineaciones de espacio (si los hay) dirigidas por un modelo matemático particular o programa de computadora (esto es, "algoritmos"). La identidad de polipéptidos relacionados se puede calcular fácilmente por métodos conocidos. Tales métodos incluyen, pero no se limitan a, aquellos descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed.( Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing : Informatics and Genoma Projects, Smith, D. W., ed. , Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1 , Griffin, A. M., and Griffin, H. G. , eds . , Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988) .

Los métodos preferidos para determinar la identidad se diseñan para dar el emparejamiento mayor entre las secuencias probadas. Los métodos para determinar la identidad se describen en programas de computadora públicamente disponibles. Los métodos de programa de computadora preferidos para determinar la identidad entre dos secuencias incluyen el paquete de programa GCG, que incluye GAP (Devereux et al., Nucí. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, and FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol . 215, 403-410 (1990)). El programa BLASTX está disponible públicamente del Centro Nacional para Información de Biotecnología (NCBI) y otras fuentes (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra) . El algoritmo de Smith Waterman bien conocido también se puede usar para determinar identidad.

Por ejemplo, usando el algoritmo de computadora GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dos polipéptidos para los cuales el porcentaje de identidad de secuencia se ha de determinar se alinean para emparejamiento óptimo de sus aminoácidos respectivos (el "tramo emparejado", como se determina por el algoritmo) . Una penalidad de abertura de espacio (que se calcula como 3 veces la diagonal promedio; la "diagonal promedio" es el promedio de la diagonal de la matriz de comparación que se usa; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada emparejamiento de aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una penalidad de extensión de espacio (que es usualmente {fracción (1/10)} tiempos de la penalidad de abertura de espacio) , así como una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62 se usan en conjunto con el algoritmo. Una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol . 5, sup .3 (1978) para la matriz de comparación PAM 250; Henikoff et al., Proc . Nati. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) para la matriz de comparación BLOSUM 62) también se usa por el algoritmo.

Los parámetros preferidos para una comparación de secuencia de péptido incluyen lo siguiente: Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol . 48, 443-453 (1970); Matriz de comparación: BLOSUM 62 de Henikoff et al., PNAS USA 89, 109.15-10919 (1992); Penalización de Espacio: 12, Penalización de Longitud de Espacio: 4, Umbral de Similitud: 0.

El programa GAP es útil con los parámetros anteriores. Los parámetros antes mencionados son los parámetros por defecto para comparaciones de péptido (junto con ninguna penalización para espacios de extremo) usando el algoritmo GAP.

El término "semejanza" es un concepto relacionado, pero en contraste con "identidad", se refiere a una relación de secuencia que incluye ambos emparejamientos idénticos y emparejamientos de substitución conservadora. Si dos secuencias de polipéptido tienen, por ejemplo, aminoácidos idénticos (fracción (10/20)), y el resto son todas substituciones no conservadoras, luego la identidad de porcentaje y semejanza ambas serían 50%. Si, en el mismo ejemplo, hay 5 posiciones más donde hay substituciones conservadoras, luego la identidad de porcentaje permanece 50%, pero la semejanza por ciento sería 75% ((fracción (15/20) ) ) . Por lo tanto, en casos donde hay substituciones conservadoras, el grado de semejanza entre dos polipéptidos será mayor que la identidad de porcentaje entre estos dos polipéptidos .

Un "receptor" es definido como una estructura molecular presente en la superficie o dentro de una célula. Un receptor produce una respuesta celular característica, esto es, actividad biológica, cuando un ligando se enlaza. Un "ligando" para un receptor es definido como cualquier molécula (por ejemplo, péptido, polipéptido, carbohidrato, molécula pequeña o ion) que selectivamente es capaz de enlazar al receptor. Un ligando agonístico ("agonista") es un ligando que tras el enlace al receptor en algún grado es capaz de provocar la respuesta característica para el receptor. Un ligando antagónico ("antagonista") es un ligando que tiene la capacidad para enlazar al receptor y en algún grado bloquear la acción de un agonista, por ejemplo, el ligando natural del receptor.

NKG2A (OMIM 161555, la descripción completa de la cual está en la presente incorporada como referencia) es un miembro del grupo NKG2 de transcripciones (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173: 1017-1020). NKG2A se codifica por 7 exones que abarca 25 kb, mostrando algún empalme diferencial. Junto con CD94 , NKG2A forma el receptor inhibidor heterodimérico CD94/NKG2A, encontrado en la superficie de subconjuntos de células NK, células T a/ß, células T ?/d, y células NKT. Similar a receptores KIR inhibidores, esto posee un ITIM en su dominio citoplásmico . Como se usa en la presente, "NKG2A" se refiere a cualquier variante, derivado, o isoforma del gen NKG2A o proteína codificada. También se abarcan cualquier ácido nucleico o secuencias de proteína que portan una o más propiedades biológicas o funciones con NKG2A de longitud completa, tipo natural, y que portan al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad de nucleótido o aminoácido. El NKG2A humano comprende 233 aminoácidos en 3 dominios, con un dominio citoplásmico que comprende residuos 1-70, una región de transmembrana que comprende residuos 71-93, y una región extracelular que comprende residuos 94-233, de la siguiente secuencia: MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGN DKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASWTIWIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCG HCPEEWITYSNSCYYIGKERRT EESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVF RNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQV RLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO: 1) .

HLA-E (OMIM 143010, la descripción completa de la cual está en la presente incorporada como referencia) es una molécula MHC no clásica que se expresa en la superficie celular y regulada por el enlace de péptidos derivados de la secuencia de señal de otras moléculas de clase I MHC. HLA-E enlaza células asesinas naturales (NK) y algunas células T, que enlaza específicamente a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, y CD94/NKG2C (ver, por ejemplo, Braud et al. (1998) Nature 391: 795-799, la descripción completa de la cual está en la presente incorporada como referencia) . La expresión de superficie de HLA-E es suficiente para proteger células objetivo de lisis por CD94/NKG2A+ NK, T, o clones de célula NKT. Como se usa en la presente, "HLA-E" se refiere a cualquier variante, derivado, o isoforma del gen HLA-E o proteína codificada. También se abarcan cualquier ácido nucleico o secuencias de proteína que portan una o más propiedades biológicas o funciones con HLA-E de longitud completa, tipo natural, y que portan al menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, o mayor identidad de nucleótido o aminoácido .

En el contexto de la presente invención, "un agente que enlaza a receptor CD94/NKG2A humano" o "un anticuerpo anti- NKG2A" o "anticuerpo de enlace NKG2A" se refiere a cualquier agente y/o anticuerpo con enlace detectable a receptor CD94/NKG2A humano usando cualquier ensayo estándar donde el agente y/o anticuerpo se incuba en la presencia de CD94/NKG2A o NKG2A y enlace detectado por medio de, por ejemplo, radioetiquetados , métodos físicos tal como espectrometría de masa, o etiquetas fluorescentes directas o indirectas detectadas usando, por ejemplo, análisis citofluorométrico (por ejemplo, FACScan) . Cualquier cantidad de enlace por arriba de la cantidad vista con un agente de control, no específico indica que el agente enlaza al objetivo.

El término Z270 humanizado o humZ270 o hZ270 como se usa en la presente, comprende el anticuerpo (SEQ. ID. NO. 2 y SEQ. ID. NO. 3) describe en la solicitud de patente WO08009545, que se incorpora como referencia en esta solicitud. El término Z199 humanizado o humZ199 como se usa en la presente, comprende el anticuerpo (SEQ. ID. NO. 4. y SEQ. ID. NO. 5) descrito en la publicación de patente WO09092805 que se incorpora como referencia en la solicitud de patente actual.

"Grupos protectores" /"porciones que extienden la vida media" /"porciones que extienden la vida media" en la presente se entienden como uno o más grupos químicos enlazados a una o más funcionalidades de cadena de sitio de aminoácido tal como -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2 , o una o más estructuras de glicano N- y/o 0- y que pueden incrementar vida media circulatoria in vivo de proteínas terapéuticas/péptidos cuando se conjuga a estas proteínas/péptidos . Los ejemplos de "grupos protectores" incluyen pero no se limitan a: Ácidos grasos biocompatibles y derivados del mismo, Almidón de Hidroxi Alquilo (HAS) por ejemplo, Almidón de Hidroxi Etilo (HES) , Poli Etilen Glicol (PEG) , Poli (Glyx-Sery)n (HAP) , Ácido hialurónico (HA) , Polímeros de heparosan (HEP) , Polímeros basados en fosforilcolina (polímero PC) , Fleximeros, Dextrano, Ácido Poli-siálicos (PSA) , un dominio Fe, Transferrina, Albúmina, Elastina como péptidos, polímeros XTEN, Péptidos de enlace de albúmina, un péptido CTP, y cualquier combinación del mismo.

El término "proteína de fusión NKG2A Fe" significa en la presente para abarcar NKG2A fusionado a un dominio Fe que se puede derivar de cualquier anticuerpo isotipo.

La inflamación es la respuesta biológica compleja de tejidos a una variedad de estímulo, que incluyen patógenos, células dañadas, o irritantes. La inflamación es una respuesta protectora por el organismo para remover o aislar el estímulo perjudicial e iniciar el proceso curativo. La inflamación no es un sinónimo para infección - infección es invasión de un organismo por un patógeno exógeno, mientras que la inflamación es la respuesta de sistema inmunitario al patógeno.

La inflamación es una cascada de eventos que implican múltiples componentes, que incluyen la vasculatura (por ejemplo, células endoteliales , pericitos, células de músculo liso) , células del sistema inmunitario (por ejemplo, linfocitos T y B, monocitos, células dendríticas, neutrófilos) , mediadores solubles derivados de célula (citocinas, quimiocinas) y también células residentes en el tejido objetivo (por ejemplo, células epiteliales, fibroblastos sinoviales, células neuronales) . La inflamación aguda es de corta duración (horas hasta días) e implica en gran medida células residentes en tejido, migración de leucocitos y exudación de fluido y proteínas de plasma la sitio de inflamación. Esto resulta de cambio en flujo vascular, activación celular y componentes celulares que atraen leucocitos de circulación en el sitio de la lesión. La inflamación crónica es de duración prolongada en la que la inflamación activa, destrucción de tejido e intento de reparar están procediendo simultáneamente. La inflamación crónica puede resultar de infección persistente, exposición prolongada y repetida a agentes tóxicos o debido a autoinmunidad, un fenómeno por el cual las células inmunitarias del cuerpo atacan sus propios tejidos, causando daño.

Normalmente, el sistema inmunitario es capaz de distinguir entre las células normales del cuerpo (o "auto") y patógenos extraños o células anormales ("no auto) . En algunas instancias, el sistema inmunitario pierde la capacidad para reconocer "auto" como normal e inicia inapro iadámente una respuesta contra tejido o células. Esta respuesta deriva de una pérdida de tolerancia a auto y se denomina "autoinmunidad" . Las patologías que resultan de autoinmunidad frecuentemente tienen serias consecuencias clínicas y son uno de los principales problemas de salud en el mundo, especialmente en naciones desarrolladas. Lós ejemplos de tales enfermedades autoinmunitarias incluyen artritis reumatoide (RA) , psoriasis, artritis psoriásica, lupus eritematoso sistémico (SLE) , nefritis lúpica, diabetes tipo I, enfermedad de Grave, Enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , enfermedad de Crohns (CD) , colitis ulcerosa (UC) , síndrome del intestino irritable, esclerosis múltiple (MS) , miocarditis autoinmunitaria, enfermedad de Kawasaki, enfermedad de la arteria coronaria, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, enfermedad pulmonar intersticial, tiroiditis autoinmunitaria, escleroderma , esclerosis sistémica, osteoartritis , dermatitis atópica, vitíligo, enfermedad injerto vs . hospedero, síndrome de Sjogrens, nefritis autoinmune, síndrome de Goodpasture, polineuropatía desmielinizante inflamatoria crónica, alergia, asma y otras enfermedades autoinmunitarias que son un resultado de cualquier inflamación aguda o crónica.

El proceso por el cual el sistema inmunitario pierde la capacidad para reconocer "auto" como normal y la respuesta posterior dirigida contra el tejido o células, resulta en pérdida de tolerancia, un estado de "autoinmunidad" . Las patologías que resultan de autoinmunidad frecuentemente tienen serias consecuencias clínicas y son uno de los principales problemas de salud en el mundo.

Terapéuticos biológicos dirigidos están ahora disponibles para el tratamiento de ciertas enfermedades autoinmunitarias y/o enfermedades inflamatorias crónicas. Por ejemplo, pacientes con artritis reumatoide se pueden tratar con anti-CD20, un antagonista TNF (TNFR soluble o anti-TNF-a) ; pacientes con psoriasis se pueden tratar con anti-CDlla,-pacientes con esclerosis múltiple se pueden tratar con INF-beta; pacientes con colitis ulcerosa se pueden tratar con anti-TNF-a y pacientes con enfermedad de Crohn se pueden tratar con anti-TNF-a o integrina anti-CD4.

Desafortunadamente, un gran número de pacientes que recibe tratamiento con uno de cualesquiera de estas biologías puede experimentar una variedad de efectos secundarios, podría dejar de responder, y/o puede desarrollar anticuerpos neutralizantes contra el fármaco. Todavía hay una necesidad por medicamentos biológicos alternativos que específicamente se dirigen a patologías, pero que no afectan células/tej ido saludables, que resulta en pocos o menos efectos secundarios graves, que se pueden usar a largo plazo y/o que no resultan en la generación de anticuerpos neutralizantes. La invención actual se refiere a estas necesidades no satisfechas entre pacientes con, enfermedades inflamatorias autoinmunitarias y/o crónicas, que describen anticuerpos que son adecuados para usarse en tal tratamiento.

La artritis reumatoide (RA) es una enfermedad sistémica que afecta todo el cuerpo y es una de las formas más comunes de artritis. Esta se caracteriza por inflamación de la articulación, que causa dolor, rigidez, calor, enrojecimiento e hinchazón. Esta inflamación es una consecuencia de células inflamatorias que invaden las articulaciones y estas enzimas que liberan células inflamatorias que pueden digerir el hueso y cartílago. Como un resultado esta inflamación puede llevar a daño de hueso y cartílago graves y a deterioro de articulaciones y severo dolor entre otros efectos fisiológicos. La articulación afectada puede perder su forma y alineación, que resulta en dolor y pérdida de movimiento.

Hay diversos modelos animales para artritis reumatoide conocidos en la técnica. Por ejemplo, en el modelo de artritis inducida por colágeno (CIA) , ratones desarrollan una artritis inflamatoria que se asemeja a artritis reumatoide humana. Ya que CIA comparte características inmunológicas y patológicas similares con RA, esto hace que sea un modelo adecuado para compuestos anti-inflamatorios humanos potenciales de separación por exclusión. La eficacia en este modelo se mide por disminución en hinchazón de articulación.

La eficacia en RA en la clínica se mide por la capacidad para reducir síntomas en pacientes que se mide como una combinación de hinchazón de articulación, velocidad de sedimentación globular, niveles de proteína reactiva C y niveles de factores de suero.

La erosión de cartílago o destrucción de cartílago asociadas con RA se impulsa principalmente por subconjuntos de Sinoviocitos como Fibroblastos (FLS) presentes en el revestimiento íntimo sinovial. El FLS, algunas veces también se refiere como sinoviocitos Tipo B o fibroblastos sinoviales RA (RASF) , son de origen mesenquimal y juegan un papel clave al producir citocinas que perpetúan inflamación y son principales productores de proteasas que contribuyen a destrucción de cartílago. En RS, FLS desarrolla un fenotipo agresivo capaz de invadir en la matriz de cartílago extracelular y agrava aún más el daño articular.

La erosión de cartílago o destrucción de cartílago como se refiere en esta solicitud, es la pérdida o degradación del tejido de cartílago.

La resorción ósea, la eliminación de tejido óseo por osteoclastos , es la única función de los osteoclastos , que son células multinucleadas especializadas derivadas del linaje celular de monocito. Su diferenciación se regula por factor de estimulación de colonia de macrófago, ligando RANK, y osteoprotegerina así como múltiples otros mediadores que pueden ya sea positivamente o negativamente regular su diferenciación, activación, y/o supervivencia. El osteoclasto desarrolla un citoesqueleto especializado que permite establecer un microambiente aislado entre sí mismo y el hueso, en donde la degradación de proteína ósea y minerales ocurre por un proceso que implica transporte de protón y liberación de enzima.

La erosión ósea, como se refiere en esta solicitud, es la pérdida de masa ósea o densidad mineral ósea, que sucede cuando hay una elevación leve (o más que leve) pero persistente en la velocidad de resorción ósea sobre la velocidad de formación ósea.

La osteoartritis (OA) es el tipo más prevalente de artritis, particularmente en adultos de 65 años y mayores. La enfermedad se caracteriza por artropatía degenerativa crónica que frecuentemente lleva un dolor crónico y discapacidad. Las velocidades de incidencia y prevalencia reportadas de OA en articulaciones específicas varían ampliamente, debido a diferencias en la definición de caso de OA. Por ejemplo, OA se puede definir por criterio radiográfico solo (OA radiográfica) , por síntomas típicos (OA sintomática) , o por ambos. Usando el criterio radiográfico, las articulaciones interfalángicas distales y proximales de la mano se han identificado como las articulaciones más comúnmente afectadas, pero son las menos propensas a ser sintomáticas.

En contraste, la rodilla y cadera, que contribuye a la segunda y tercera más comunes ubicaciones de OA radiográfica, respectivamente, son casi siempre sintomáticas. Las primeras articulaciones metatarsofalángica y carpometacarpiana también son sitios frecuentes de OA radiográfica, mientras que las articulaciones del hombro, codo, muñeca y metacarpofalángica rara vez desarrollan OA idiopática.

La edad es el factor de riesgo más consistentemente identificado para OA y las velocidades de prevalencia se elevan abruptamente después de los 50 años de edad en hombres y 40 años de edad en mujeres. OA se diagnostica por una triada de síntomas típicos, hallazgos físicos y cambios radiográficos. El Colegio Americano de Reumatología ha establecido los criterios de clasificación para ayudar en la identificación de pacientes con OA sintomática que incluye, pero no se basa únicamente en, hallazgos radiográficos. Los pacientes con experiencia en principios de la enfermedad localizan dolor de articulación que empeora con la actividad y se alivia con el reposo, mientras que aquellos con grave enfermedad pueden tener dolor en reposo. Las articulaciones que llevan peso pueden "bloquear" o "dar paso" debido a trastorno interno que es una consecuencia de enfermedad avanzada. La rigidez en la mañana o después de la inactividad ("fenómeno de gel") raramente excede 30 minutos.

Los hallazgos físicos en articulaciones osteoartríticas incluyen crecimiento óseo, crepitación, derrames frescos, y disminución de la amplitud de movimiento. Sensibilidad a la palpación en la línea de articulación y dolor en movimiento pasivo también son comunes, aunque no únicamente para OA. Los hallazgos radiográficos en OA (diapositiva) incluyen formación de osteofito, estrechamiento del espacio articular, esclerosis subcondral y quistes. La presencia de un osteofito es el marcador radiográfico más específico para aunque se indicativo de enfermedad relativamente avanzada.

Los radiografías se consideran la prueba "estándar de oro" para el diagnóstico de OA, pero los cambios radiográficos son evidentes únicamente relativamente tarde en la enfermedad. La necesidad es grande para un marcador biológico sensible y específico que permitiría tempranamente el diagnóstico de OA, y el seguimiento de su progresión. Los estudios de laboratorio de rutina, tal como velocidades de sedimentación y proteína reactiva c, no son útiles como marcadores para OA, aunque un estudio reciente sugiere que la elevación de C P predice más rápidamente la enfermedad progresiva. Diversos epítopos de componentes de cartílago, sin embargo, se han descrito que ofrecen alguna promesa como marcadores de OA. Por ejemplo, epítopo sulfato de condroitina 846, normalmente expresado únicamente en cartílago fetal y neonatal, se ha observado en OA, pero ningún fluido de cartílago y sinovial, de adulto normal. A lo largo de una vena similar, un epítopo único para colágeno de tipo II se ha descrito en cartílago OA, y se puede desenmascarar in vitro al exponer cartílago normal a MMPs . Este epítopo se puede medir en sangre y orina y puede resultar útil en diagnosticar o vigilar el progreso de OA. Los niveles de suero hialurónico elevados también se han mostrado por algunos que se correlacionan con OA radiográfica. El hallazgo de elevados niveles de proteína oligomérica de cartílago (COMP) en fluido sinovial después de lesión de articulación traumática puede presagiar el desarrollo de OA en la articulación lesionada. Otros marcadores potenciales de OA se enlistan pero son ya sea no fácilmente accesibles o carecen de la sensibilidad y especificidad requerida para considerarlos como marcadores OA potenciales.

Los síntomas clínicos de inflamación, la presencia de inflamación histológica en tejido sinovial OA y lesiones del cartílago tempranas en la frontera del sinovio inflamado son indicadores fuertes que la sinovitis es un factor decisivo en el paréntesis de OA. La vista tradicional de OA como una enfermedad únicamente de cartílago es obsoleta. La OA ahora se debe considerar para ser una enfermedad de articulación completa que incluye el tejido sinovial. El hueso, cartílago y sinovio se comunican por medio de interacciones célula a célula, a través de la liberación de mediadores solubles y por medio de señales mecánicas. La inflamación sinovial, a pesar de no ser un requisito previo para el desarrollo de OA, se implica claramente en descomposición de cartílago y por lo tanto en la progresión de la enfermedad. Dirigiendo el sinovio inflamatorio se debe retrasar o prevenir el daño de cartílago articular y la formación de osteofitos, especialmente en OA tempranamente.

La artritis psoriásica es un tipo de artritis inflamatoria que ocurre en un subconjunto de pacientes con psoriasis. En estos pacientes, la patología de la piel/síntomas se acompaña por hinchazón de articulación, similar a esa vista en artritis reumatoide. Presenta inflamación en áreas de la piel rojas, elevadas, irregulares, con escamas. La psoriasis f ecuentemente afecta las puntas de los codos y rodillas, el cuero cabelludo, el ombligo, y alrededor de las zonas genitales o ano.

El término "artritis psoriásica" denota un grupo heterogéneo de artritis que varía de enfermedad monoarticular periférica, oligoarticular y poliarticular, a implicación del esqueleto axial. Aún, a pesar de esta heterogeneidad clínica aparente, estas diversas presentaciones se unifican en su ocurrencia en individuos con manifestaciones cutáneas de psoriasis, sero-negatividad de factor reumatoide, asociaciones de antígeno de leucocito humano similar (HLA) y similitudes radiográficas.

Aproximadamente 2% de la población Caucásica en Norte América tiene psoriasis. De estos, 5-7% están afectados por una artritis inflamatoria de alguna forma. En general, hombres y mujeres están afectados con igual frecuencia, aunque la relación hombre:mujer verdadera puede variar dependiendo del subconjunto en cuestión. La incidencia pico está en la 4ta hasta 6ta décadas. La enfermedad de la piel psoriásica es anterior a la aparición de artritis en 70% de los casos, presenta coincidencias con artritis en 15% de los casos, y sigue la aparición de artritis en 15% de los casos.

La causa de artritis psoriásica se desconoce. La actividad de articulación periférica en artritis psoriásica es paralela a la actividad cutánea en 1/3 de los casos, mientras que la actividad de la enfermedad de la piel y esqueletal axial es probable que sean discordantes. Los factores genéticos parecen jugar un papel importante. Hay una concordancia del 70% para psoriasis en gemelos monocigóticos . Hay un riesgo incrementado 50 veces de desarrollar artritis psoriásica en familiares de primer grado de pacientes con la enfermedad. Hay un riesgo incrementado 20 veces de "transmisión" de enfermedad por un padre afectado como se compara con una madre afectada. Hay asociaciones epidemiológicas con la expresión de ambos alelos HLA de clase I y clase II. Los factores ambientales se han implicado. La infección estreptocócica puede precipitar el desarrollo de psoriasis guttate. La infección de VIH se puede presentar con ambas psoriasis y artritis psoriásica, así como empeorar la enfermedad existente. El traumatismo físico se ha reportado que precipita el desarrollo de artritis, lo que sugiere que la artritis psoriásica es la manifestación de un "fenómeno de Koebner profundo" . El carácter inflamatorio y autoinmunitario de la enfermedad se soporta no únicamente por la representación clínica, sino también por el papel que las células T y diversas citocinas han demostrado para jugar en tanto el inicio y perpetuación de la actividad de la enfermedad.

Factores que pueden presagiar un peor pronóstico incluyen implicación de piel extensa; una historia familiar fuerte de psoriasis; género femenino; comienzo de la enfermedad en <20 años de edad; la expresión de alelos HLA-B27, -DR3 o -DR4; y enfermedad poliarticular o erosiva.

La osteoporosis (OP) es una enfermedad de los huesos que lleva a una resistencia ósea dañada y riesgo incrementado de fractura (ver por ejemplo, Theill et al. (2002) Annu Rev Immunol 20: 795-23). En la osteoporosis la densidad mineral ósea (BMD) se reduce y la microarquitectura ósea se deteriora gradualmente, como se define por la Organización Mundial de la Salud (OMS) la enfermedad se define por una densidad mineral ósea que es 2.5 desviaciones estándar o más por debajo del pico de masa ósea media (promedio de adultos jóvenes, saludables). La enfermedad se puede clasificar como primario tipo 1, primario tipo 2, o secundario. La forma de osteoporosis más comunes en mujeres después de la menopausia se refiere como primario tipo 1 u osteoporosis postmenopáusica . La osteoporosis primaria tipo 2 (u osteoporosis senil) ocurre después de 75 años de edad y se ve en sujetos tanto del sexo femenino como masculino en una relación de 2:1. Finalmente, la osteoporosis secundaria puede surgir en cualquier edad y afecta a hombres y mujeres igualmente. Esta forma de osteoporosis resulta de problemas médicos de predisposición crónica o enfermedad, o uso prolongado de medicamentos tal como glucocorticoides . La resorción ósea es un factor patológico mayor en osteoporosis postmenopáusica. La rápida o relativamente rápida pérdida de masa ósea/densidad mineral ósea frecuentemente es causada por un incremento en el número de osteoclastos o por actividad de osteoclastos excesiva (Walsh et al. (2005) Immunol Rev 208: 228-251).

Los riesgos de osteoporosis se pueden reducir con cambios de estilo de vida (por ejemplo, dieta, ejercicio, prevención de caídas) y algunas veces medicación (por ejemplo, calcio, vitamina D, bisfosfonatos y varios otros) .

El término "tratamiento", como se usa en la presente, se refiere a la terapia médica de cualquier humano. Se espera que dicho sujeto haya sido sometido a un examen físico por un médico, que ha dado un diagnóstico provisional o definitivo que podría indicar que el uso de tal tratamiento específico es benéfico para la salud de tal sujeto humano. La sincronización y propósito de tal tratamiento puede variar de un individuo a otro, de acuerdo con el estado del momento actual de la salud del sujeto. Por lo tanto, tal tratamiento puede ser profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo.

En términos de la presente invención, tratamientos profiláctico, paliativo, sintomático y/o curativo pueden representar aspectos separados de la invención.

En un aspecto, la presente invención proporciona composiciones y formulaciones que comprenden moléculas de la invención, tal como los anticuerpos, fragmento de enlace a antígenos de anticuerpos, polinucleótidos , vectores y células descritas en la presente. Por ejemplo, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más anticuerpo o fragmento de enlace a antígeno de anticuerpos de la invención, formulado junto con un portador farmacéuticamente aceptable.

En consecuencia, un objeto de la invención es proporcionar una formulación farmacéutica que comprende tal anticuerpo que se presenta en una concentración desde 0.25 mg/ml hasta 250 mg/ml, y en donde tal formulación tiene un pH desde 2.0 hasta 10.0. La formulación puede además comprender un sistema amortiguador, conservadores, agentes de tonicidad, agentes quelantes, estabilizadores y tensoactivos. El uso de conservadores, agentes isotónicos, agentes quelantes, estabilizadores y tensoactivos en composiciones farmacéuticas es bien conocido por la persona experta. Se puede hacer referencia a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edición, 1995.

En una modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación acuosa. Tal formulación es típicamente una solución o una suspensión. Los términos "formulación acuosa" se definen como una formulación que comprende al menos 50% p/p de agua. Similarmente , el término "solución acuosa" se define como una solución que comprende al menos 50% p/p de agua, y el término "suspensión acuosa" se define como una suspensión que comprende al menos 50% p/p de agua.

En otra modalidad, la formulación farmacéutica es una formulación secada por congelado, a la cual el médico o el paciente agregan solventes y/o diluyentes antes de usar.

En un aspecto adicional, la formulación farmacéutica comprende una solución acuosa de tal anticuerpo, y una solución amortiguadora, en donde el anticuerpo se presenta en una concentración desde 1 mg/ml o por arriba, y en donde tal formulación tiene un pH desde alrededor de 2.0 hasta alrededor de 10.0.

Un anticuerpo de la invención se puede administrar parenteralmente, tal como intravenosamente, tal como intramuscularmente , tal como subcutáneamente.

Alternativamente, un anticuerpo de la invención se puede administrar por medio de una vía no parenteral, tal como por vía oral o por vía tópica. Un anticuerpo de la invención se puede administrar profilácticamente. Un anticuerpo de la invención se puede administrar terapéuticamente (a pedido) .

En el concurso de la presente invención "eliminación selectiva de células destructivas de cartílago" se refiere a un proceso en el cual un anticuerpo contra NKG2A incrementa Eliminación mediada por célula NK de células destructivas de cartílago, tal como por ejemplo, sinoviocitos como fibroblastos (FLS) u otras células destructivas de cartílago, mientras que no incrementa la eliminación de fibroblastos normales, tal como por ejemplo, fibroblastos de prepucio (células FSK4) u otras células de fibroblastos normales. Esta eliminación selectiva se puede medir por ejemplo por un ensayo de liberación LDH estándar o en otros ensayos adecuados conocidos, en los cuales la capacidad del compuesto terapéutico para eliminar las células destructivas de cartílago se mide (ver Ejemplo 4 y Fig. 5B) . En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 5% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 10% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 20% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 30% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 40% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 50% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 60% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 70% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 80% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 90% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 100% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 125% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 150% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 175% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 200% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 225% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 250% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 275% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 300% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 350% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago. En una modalidad, un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 400% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago, o al menos 500% de incremento en la citotoxicidad específica de las células destructivas de cartílago.

En el contenido de la presente invención "reduce la formación de células que erosionan el hueso" se refiere a un proceso en el cual un anticuerpo anti-NKG2A reduce la formación de células que erosionan el hueso, tal como por ejemplo, osteoclastos , células multinucleadas TRAP+ u otras células que erosionan el hueso.

La formación reducida de células que erosionan el hueso, se puede medir in vitro por conteo visual de células adherentes que erosionan el hueso (ver Ejemplo 6 y Fig. 6C) o cualquier otro método adecuado de medir la formación reducida de las células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 5% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 10% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 20% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 30% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 40% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 50% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 60% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 70% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 80% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 90% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 100% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 125% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 150% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 175% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti -NKG2A causa al menos 200% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 225% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 250% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 275% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 300% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 350% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 400% de reducción de células que erosionan el hueso o al menos 450% de reducción de células que erosionan el hueso. En una modalidad un anticuerpo anti-NKG2A causa al menos 500% de reducción de células que erosionan el hueso.

Además "reduce la formación de células que erosionan el hueso" en el concurso de la presente invención se refiere a erosión mineral de hueso reducida in vitro.

La erosión mineral de hueso in vitro reducida puede por medido al cultivar las células o tejido en discos minerales óseos (esto es, discos osteológicos) o por otros métodos adecuados, (ver Ejemplo 6 y Figs . 6D-6G) . En una modalidad un anti-NKG2A causa un 10% de reducción en erosión mineral de hueso o 20% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 30% de reducción en erosión mineral de hueso o 40% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 50% de reducción en erosión mineral de hueso o 60% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 70% de reducción en erosión mineral de hueso o 80% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 90% de reducción en erosión mineral de hueso o 100% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 125% de reducción en erosión mineral de hueso o 150% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 175% de reducción en erosión mineral de hueso o 200% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 250% de reducción en erosión mineral de hueso o 300% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 350% de reducción en erosión mineral de hueso o 400% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 450% de reducción en erosión mineral de hueso o 500% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 550% de reducción en erosión mineral de hueso o 600% de reducción en erosión mineral de hueso. En una modalidad un anti-NKG2A causa un 650% de reducción en erosión mineral de hueso o 700% de reducción en erosión mineral de hueso.

Ejemplos Ejemplo 1. Moléculas de superficie celular expresadas en sinoviocitos como fibroblastos de pacientes con RA.

En la Fig. 1A RA-FLS adherente derivado de tejido sinovial de RA se separaron usando EDTA 2 mM y superficie manchada para expresión de marcador CD55 de fibroblastos (histograma abierto; panel derecho) y marcador CD68 de macrófago (histograma abierto; panel izquierdo) . El histograma gris representa la tinción usando un anticuerpo de control de isotipo. Como se ve en la Fig. 1A, el RA-FLS muestra expresión homogénea de CD55 y carece de CD68 confirma el origen como fibroblastos de RA-FLS adherente.

Como se muestra en la Fig. IB RA-FLS expresa altos niveles de ULBP-1, ULBP-2 y ULBP3, bajos niveles de MIC-A, y ningún MIC-B, todos los ligandos conocidos para para la activación de receptor NKG2D de célula NK. Además, RA-FLS expresa CD155 (receptor PVR de poliovirus) y CD48, ligandos para DNAM-1 y 2B4, respectivamente. No se detectó cualquier expresión de CD112 (receptor 2 relacionado con poliovirus, PRR2), otro ligando reconocido por DNAM-1. Usando proteínas de fusión Fe de NKp30, NKp44, y NKp46, se detectó relativamente alta expresión de un ligando NKp44 supuesto en RA-FLS, mientras que NKp30-Fc y NKp46-Fc falla para manchar estas células. Las células se analizaron por citometría de flujo. Los histogramas rellenos representan control de isotipo relevante. Los histogramas son representativos para n = 3 donantes.

La Fig 1C ilustra que el enlace de proteína de fusión NKp44-FC soluble a RA-FLS fue específico y suprimido por la adición de dosis incrementadas de anti-NKp44 mAbRA-FLS adherente se separaron usando EDTA 2 mM, y superficie manchada con 10 ug/raL proteína de fusión NKp44-Fc (histograma abierto) o el mismo fragmento Fe (IgGl humano) como un control negativo (histograma gris) . Donde indican, NKp44-Fc se pre-incubó con anti-NKp44 o anti-NKp46 mAbs.

Como se demuestra en la Fig. ID, RA-FLS expresa altos niveles de ambos HLA-E y HLA-G, ligandos para los receptores de célula NK inhibidores CD94-NKG2A y LIR-1, respectivamente. Por lo tanto, HLA-E puede ser una molécula importante que protege RA-FLS de citotoxicidad mediada por célula NK en el sinovio inflamado, como la mayoría de células NK sinoviales expresan el receptor CD94 -NKG2A inhibidor.

En la Fig. 1E se demuestra que RA-FLS expresa eliminación de receptor 5 (DR5) pero no DR4. Estos receptores transducen señales apoptóticas sobre el reconocimiento por TRAIL (ligando inducido por apoptosis relacionada con TNF) . Por lo tanto, DR5 puede ser un ligando importante expresado en RA-FLS que se puede reconocer por TRAIL que expresan células que potencialmente pueden mediar eliminación celular RA-FLS dentro del tejido sinovial inflamado.

Ejemplo 2. NKG2A que expresa células NK se presentan en sinovio RA y se pueden encontrar en áreas que contienen HLA-E que expresa RA-FLS.

Las Figs . 2A, 2B, y 2C muestran secciones sinoviales de tejido en serie derivadas de un paciente con RA manchado con anti-NKp46 de ratón (células NK, Fig. 2A) , anti -NKG2A (Fig. 2B) y anticuerpo de control de isotipo (Fig 2C) . La Reactividad específica inmune su visualizó con diaminobenzidina (manchas oscuras en la micrografía) y núcleos se tiñeron con hematoxilina (manchas débiles) . Los resultados muestran que células NK NKp46+ se encuentran en el área de sub-revestimiento y unos pocos más cerca del revestimiento sinovial de sinovio RA (ver Fig. 2A) . La localización y frecuencia de células NK se encontraron que son muy similares a esas de las células NKG2A+ (ver Fig. 2B para comparación) . Y secciones manchadas con control de isotipo fueron en blanco (ver Fig. 2C) . Cuando se evalúa por análisis de imagen digital cuantitativo, la frecuencia de células NKG2A+ se encontró para correlacionar fuertemente (r2 = 0.950, p < 0.0001) con y para emparejar por número que de células NK, como se muestra en la Fig. 2D.

La expresión de HLA-E, el ligando para CD94 -NKG2A, en RA-FLS se evaluó in situ (Fig 2E-2H) . La aplicación del anticuerpo 3D12 anti-HLA-E sobre secciones de tejido sinovial de RA revela tinción del revestimiento íntimo, que se hace de sinoviocitos como macrófagos (MLS) y RA-FLS, como se muestra en la Fig. 2E ninguna tinción se observa usando un control de isotipo, como se demuestra en la Fig 2G. Además, ambas células inmunitarias de infiltración, mostradas en la Fig 2F y células endoteliales vasculares como se muestra en la Fig 2H expresan HLA-E en niveles relativamente altos.

Juntos, estos datos muestran que las células NK se puedan identificar entre la población de linfocitos de infiltración en el sinovio de paciente con RA, y sugiere que la mayoría, si no todas, células NK expresan NKG2A. Además, los subconjuntos de células NK NKG2A+ se encuentran en áreas cercanas a HLA-E+ RA-FLS. Por lo tanto, esto podría potencialmente significar que células NK NKG2A+ reconocen HLA-E en RA-FLS in situ.

Ejemplo 3: NKG2D, DNAM-1, NKp44, NKp46, y TRAIL se implican en citotoxicidad de célula NK hacia RA-FLS.

En la Fig. 3A tres diferentes tipos de células NK que se mancharon para la expresión de superficie de diversos receptores de célula NK se muestran (como histograma abierto) , como se indica abajo cada histograma, y tinción con un control de isotipo relevante también se muestra en cada panel (histograma gris llenado) . La Fig. 3A (i) muestra forma derivada de células NK SFMC de un paciente con RA representativo, la Fig. 3A (ii) muestra reposo células NK CD56 brillantes derivadas de PBMC de un donador saludable representativo y la Fig. 3A (iii) muestra células NK Nishi .

Las células se analizaron por citometría de flujo. Las células NK se definieron como viable CD3 -CD56brillante . Los datos muestran que las células NK sinoviales derivadas de pacientes con RA expresan diversos receptores de activación, y que muestran un patrón de expresión similar de receptores de activación a células NK CD56brillante y células NK Nishi.

La Fig. 3B (i) ilustra RA-FLS que se sembraron en 10 000 células/pozo en placas de 48 pozos, y crecen hasta confluencia (~ 48 000 células/pozo) por 72 horas, en cuyo punto Nishi se agregaron en la relación efector : obj etivo (E:T) indicada (se pusieron pozos por duplicado). RA-FLS y Nishi se co-cultivaron durante la noche a 37°C, células no adherentes se lavaron posteriormente y las células adherentes se fijaron con paraformaldehído al 4% y mancharon con Eosin. Una Analizador de Imagen de Inmunomanchado se usó para tomar imágenes y cuantificar el % de área de pozo cubierta (como se muestra en la Fig. 3B(ii)).

Los datos en la Fig 3B(i) y 3B(ii) muestran que las células NK eliminan RA-FLS adherente de plástico en una manera dependiente de dosis in vitro En la Fig. 3C y Fig. 3D i RA-FLS que se sembraron en 30 000 células/pozo en placas de 96 pozos, y en el siguiente día se agregaron 90 000 Nishi/pozo se demuestran. Nishi y FLS se co-cultivaron por 5 horas a 37°C con BD GolgiStop, anticuerpos anti -CD107a/b conjugados con FITC y 10 ug/mL que bloquea anticuerpos, o control de isotipo relevante, como se indica. La citometría de flujo se realizó para determinar degranulación Nishi. ns = no significativo, * P < 0.05, ** P < 0.005, *** P < 0.001.

La Fig. 3C muestra que las células NK únicamente desgranulan en la presencia de células objetivo FLS y no cuando se cultiva solo. La Fig. 3D muestra que RA-FLS son sensibles a citotoxicidad mediada por célula NK, y que NKG2D, DNAM1, NKp44, NKp46 y TRAIL todos se involucran en el reconocimiento específico de RA-FLS por células NK como se indica por una reducción significativa en expresión CD107a/b tras enmascarar tales receptores .

Ejemplo 4: RA-FLS se protegen de citotoxicidad mediada por célula NK por expresión de HLA-E capaz de interactuar con receptor CP94 -NKG2A inhibidores expresado por células NK La Fig 4A muestra histogramas representativos con células NK de RA-SFMC en la fila superior, reposo células NK CD56brillante de PBMC saludable en la fila del medio y células NK Nishi en la fila del fondo. La expresión de NKG2A (columna izquierda) , LIR-1 (columna del medio) y KIRs (columna derecha) se muestra (histogramas abiertos) comparados con control de isotipo correspondiente (histogramas rellenos grises) . Las células NK se mancharon para expresión de superficie usando anti-NKG2A, anti-LIRl, y un cóctel de mAbs anti-KIR y posteriormente analizaron por citometría de flujo. Las células NK se cerraron en células positivas CD56brillante negativo CD3 viable.

Los datos muestran que la mayoría de las células NK del fluido sinovial similares a células NK Nishi y células PB-NK CD56brillante expresa NKG2A pero carece de KIRs. En contraste a células NK del fluido sinovial, las 'células NK Nishi también expresan LIR-1.

La Fig 4B ilustra RA-FLS que se sembraron en 3-104 células/pozo en placas de 96 pozos, al siguiente día Nishi se agregaron en una relación E:T de 3:1 (experimentos anti-LIR-1, panel izquierdo) o 6:1 (experimentos anti-NKG2A, panel derecho) . Nishi y FLS se co-cultivaron por 5 horas a 37°C con BD GolgiStop, anticuerpos anti-CD107a/b conjugados con FITC y 10 ug/mL anticuerpos de bloqueo, o control de isotipo relevante, como se indica. La citometría de flujo se realizó para determinar desgranulación Nishi. ns = no significativo, ** P < 0.005, como se muestra en la Fig. 4B.

Los datos muestran que enmascarar NKG2A con un anticuerpo resulta en una desgranulación de célula NK significativamente incrementada hacia RA-FLS (panel derecho) , mientras que enmascarar LIR-1 no parece resultar en cualquier lisis incrementada de RA-FLS (panel izquierdo) . Por lo tanto, el hecho de que el tratamiento anti-NKG2A de células NK resulta en lisis incrementada de RA-FLS indica que moléculas HLA-E expresadas en RA-FLS presentan péptidos importantes apropiados para interactuar con inhibidores de receptor CD94-NKG2A .

La Fig. 4C demuestra RA-FLS que se sembraron en 2.4-104 células/pozo en placas de 96 pozos, al siguiente día 6-103 Nishi células NK/pozo sé agregaron (esto es, E:T de 1:4) . FLS y Nishi se co-cultivaron durante la noche con la adición de anti-NKG2A o control isotipo IgG4 humano. El siguiente día, las células no adherentes se lavaron, las células adherentes se fijaron con paraformaldehído al 4% y mancharon con Eosina. Los pozos se analizaron, y el % de área de pozo cubierto se cuantificó, usando un Analizador de Imagen de Inmunomanchado, como se muestra en la Fig. 4C. Por lo tanto, los datos muestra que enmascaran NKG2A resultan en una eliminación significativamente incrementada de RA-FLS adherente.

RA-FLS se sembraron en 1.5-104 células/pozo en placas de 96 pozos, al siguiente día 4.5-104 SFMC autólogo se agregaron por pozo (esto es, E:T 3:1) . SFMC y RA-FLS se co-cultivaron por 5 horas a 37°C con BD GolgiStop, anticuerpos anti-CD107a/b conjugados con FITC y 10 ug/mL que bloquean anticuerpos, o control de isotipo IgG4 humano, como se muestra en la Fig. 4D.

Por lo tanto, enmascarar NKG2A con mAb resulta en eliminación significativamente incrementada de RA-FLS autólogo in vitro, que sugiere que la administración terapéutica de un anti-NKG2A mAb resultaría en eliminación incrementada de RA-FLS in vivo.

La Fig. 4E muestra 3-104 FLS/pozo que se sembraron en placas de 96 pozos. El siguiente día, células NK CD56brillanteCD16dim alogénicas se aislaron de sangre de donador saludable por separación magnética e inmediatamente cocultivadas con RA-FLS (E:T 3:1) por 5 horas a 37°C con BD GolgiStop, anticuerpos anti-CD107a/b conjugados con FITC y 10 ug/mL anticuerpos de bloqueo, o control de isotipo relevante. La citometría de flujo se realizó para determinar la degranulación. Las células NK se definieron como CD3-CD16dimCD56brillante viable. El gráfico inferior muestra células NK CD56brillante de un donador saludable solo co-cultivado separadamente con RA-FLS de cinco pacientes diferentes. * P < 0.05.

Por lo tanto, enmascarar NKG2A con mAb en reposo, células PB-NK recientemente aisladas resulta en eliminación significativamente incrementada de RA-FLS alogénico in vitro, nuevamente sugiriendo que la administración terapéutica de un anti-NKG2A mAb resultaría en eliminación incrementada de RA-FLS in vivo. Por lo tanto, la propagación de enfermedad agresiva RA-FLS que puede emigrar a través del torrente sanguíneo a otras articulaciones se puede eliminar por la circulación de células PB-NK CD56brillante tras enmascarar su receptor inhibidor CD94 -NKG2A .

La Fig. 5A muestra un ensayo de liberación LDH que se empleó para evaluar citotoxicidad mediada por célula NK de FLS usando dos diferentes líneas de célula NK (NKL, izquierda; y Nishi, derecha) en la presencia de NNC141-0100 (HumZ270, barras negras), control de isotipo (barras blancas) , o medio solamente (barras grises) . El efector de célula K para dirigir la relación fue 1:1. La Fig. 5B muestra que bloquear NKG2A usando NNC141-0100 (humZ270) lleva a lisis incrementada de un RA-FLS representativo (RA-FLS2, panel izquierdo) pero no afecta la eliminación de una línea celular de fibroblastos de prepucio normal (FSK4, panel derecho) . Por lo tanto, tomados juntos los datos presentados en las Figs . 3A(i)-5B claramente sugieren que el tratamiento anti-NKG2A resulta en eliminación mediada por célula NK incrementada de RA-FLS mientras que la eliminación mediada por célula NK de una línea celular de fibroblastos normales (FSK4) no se ve afectada en la presencia de un anticuerpo de bloqueo (esto es, HumZ270) dirigido contra NKG2A.

Ejemplo 6: Tratamiento con humZ27Q (anti-NKG2A) inhibe la formación de TRAP+ osteoclasto multi nucleado La Fig. 6A muestra un ejemplo representativo donde 106 SFMC/pozo derivado de un paciente con RA se cultivaron por 7 días en medio complementado con 10 ng/mL IL-15. Los cultivos se trataron con 20 microgramo/ml de control isotipo IgG4 humano (Fig. 6A) o 20 microgramo/ml de humZ270 (Fig. 6B) en el comienzo del ensayo. Se puede apreciar que tratamiento anti-NKG2A en la Fig. 6B resulta en eliminación significativa de grandes células multinucleadas adherentes plásticas que expresan TRAP (esto es, definido como osteoclastos ) .

La Fig. 6C demuestra los datos obtenidos de SFMC derivados de pacientes con RA que se han cultivado por 7 días en medio solamente (n=6) o medio complementado con 10 ng/mL IL-15 (n=14) . En el comienzo del ensayo (definido como valor de referencia) , 20 microgramo/mL de isotipo IgG4 humano (barras blancas y gris oscuro) o 20 microgramo/mL de NC141-0100 (humZ270, barras negras y gris claro) se agregaron a los cultivos. Los osteoclastos se cuantificaron como números de TRAP+ multinuclear células/pozo. Por lo tanto, tomadas juntas las Fig. 6A-6C muestran que el tratamiento con un anticuerpo contra NKG2A en cultivos in vitro SFMC resulta en una reducción significativa de formación de osteoclasto como se mide por la formación de células TRAP+ multinucleadas grandes (esto es, osteoclastos) . Por lo tanto, los hallazgos sugieren que el tratamiento terapéutico en pacientes con RA con anti-NKG2A mAb resultaría en humedecimiento de erosión ósea, una importante característica clínica de RA.

En la Fig. 6D un ejemplo representativo de erosión mineral de hueso observada de un cultivo SFMC de paciente con no. 2357 se muestra. Aquí SFMC se hicieron crecer en discos recubiertos con una capa delgada de substrato mineral óseo (esto es, discos osteológicos) en la presencia de IL-15 e isotipo mAb (izquierda) vs anti-NKG2A (humZ270, derecha) . Los discos fueron posteriormente manchados con von Kossa y las áreas erosionadas se analizaron usando Analizador de Inmunomanchado S5 y aparece como zonas claras/blancas contra el fondo oscuro.

En la Fig. 6E los datos obtenidos de en total 5 pacientes con RA se demuestran. SFMC se cultivaron en medio complementado con 10 ng/mL IL-15. En el comienzo del ensayo, 20 microgramo/mL de isotipo IgG4 humano (barra blanca) o 20 microgramo/mL de NNC141-0100 (humZ270, barra negra) se agregaron a los cultivos. El área de disco erosionado SEM +/-de porcentaje medio se cuantificó usando analizador de Inmunomanchado S5. Tomados, juntos la Fig. 6D y Fig. 6E muestran que tratamiento anti-NKG2A resulta en una reducción significativa en la formación de osteoclasto de erosión mineral ósea activa. Por lo tanto, los hallazgos sugieren que el tratamiento terapéutico en pacientes con RA con anti-NKG2A mAb resultaría en humedecimiento de erosión ósea, una importante característica clínica de RA.

La Fig. 6F ilustra que HumZ270 (anti-NKG2A) suprime la erosión ósea en cultivos de explantes de tejido sinovial RA cultivado directamente ex vivo. Las virutas de tejido sinovial de RA se hicieron crecer por 7 días en medio IMDM complementado con FBS al 10%, HuS al 2%, P/S, L-glut sin adición de mAbs (control) o con adición de isotipo, infliximab (IFX) , o anti-NKG2A (humZ270) todos los mAbs en 10 microgramo/mL agregado en el comienzo del cultivo. El experimento se estableció en pozos por triplicado. En el día 7, el medio y las células se removieron al enjuagar los pozos 3x con 200 uL agua Milli-Q™. Los discos posteriormente se enjuagaron con 200 uL solución de cloro (-6% NaOCl , -5.2% NaCl) por 5 minutos seguido por pipeteo suave para desalojar cualquiera de las células restantes. Finalmente, los discos se lavaron 3x con agua Milli-Q™, se secaron al aire y mancharon con método von Kossa. Se puede apreciar de este ejemplo de cultivos por triplicado que tratamiento humZ270 de explantes de tejido sinovial de RA resulta en erosión disminuida (zonas claras/blancas) como se compara con control o cultivos tratados de isotipo.

En la Fig. 6G los resultados calculados (media +/- SEM) de cultivos por triplicado de virutas de tejido sinovial de RA que se han cultivado por 7 días en medio IMDM complementado con FBS al 10%, HuS al 2%, P/S, L-glut sin adición de mAbs (control) o con adición de isotipo, infliximab (IFX) , o anti -NKG2A (humZ270) todos los mAbs en 10 microgramo/mL agregados en el comienzo del cultivo, se ilustran. En el día 7, el medio y células se removieron al , enjuagar los pozos 3x con 200 uL agua Milli-Q™. Los discos posteriormente se enjuagaron con 200 uL de solución de cloro (-6% NaOCl, -5.2% NaCl) por 5 minutos seguido por pipeteo suave para desalojar cualquiera de las células restantes. Finalmente, los discos se lavaron 3x con agua Milli-Q™, secaron al aire y mancharon con método von Kossa. El tratamiento HumZ270 de explantes de tejido sinovial de RA resulta en erosión significativamente disminuida (p=0.005, prueba T de Students) como se compara con cultivos tratados con control o isotipo. Por lo tanto, tejido RA que crece directamente ex vivo en disco recubierto con minerales óseos (esto es, discos osteológicos) muestran capacidad erosiva significativa y tal actividad se inhibe directamente por tratamiento con anti- KG2A que sugiere claramente que el tratamiento terapéutico en pacientes con RA con anti-NKG2A suprimiría la erosión ósea, una importante característica clínica de RA.

Ejemplo 7: Modulación de niveles de citocina en cultivos in vitro SFMC tras el tratamiento con HumZ270 (NNC141-0100) En la Fig. 7A la modulación de niveles de citocina (media +/- SEM) en cultivos in vitro de SFMC derivados de pacientes con RA (n=ll) se demuestra. SFMC se cultivaron por 7 días en medio complementado con 10 ng/mL IL-15. Los cultivos se trataron con 20 microgramo/mL de isotipo IgG4 humano (barras gris claro) o 20 microgramo/mL de NNC141-0100 (humZ270, barras gris oscuro) en el comienzo del ensayo. El sobrenadante se cosechó en 24 horas y los niveles de citocinas se midieron por BioPlex. Los niveles IL-6 se reducen significativamente tras el tratamiento con anti-NKG2A, mientras que la producción de otras citocinas no se afecta significativamente, excepto para un incremento pequeño en M-CSF a 24 horas.

La Fig. 7B muestra una comparación por parejas entre los niveles IL-6 medidos en cultivos in vitro RA-SFMC estimulados con IL-15 y tratados con isotipo vs HumZ270 (anti-NKG2A) . Los niveles IL-6 se reducen significativamente tras enmascarar NKG2A en todos los cultivos in vitro SFMC.

En la Fig. 7C se demuestra que NNC141-0100 (humZ270) inhibe ambas producción de valor de referencia y IL-6 estimulada IL-15 en cultivos in vitro de SFMC derivados de pacientes con RA. Los niveles IL-6 producidos por SFMC derivados de 2 pacientes con RA se midieron en cultivos establecidos en medio solo o medio complementado con IL-15 10 ng/mL como se indica. Los cultivos se trataron con 20 microgramo/mL de isotipo IgG4 humano (barras negras) o 20 microgramo/mL de NNC141-0100 (humZ270, barras blancas) en el comienzo del ensayo. El sobrenadante se cosechó en 24, 48 y 72 horas y los niveles de IL-6 se midieron por BioPlex. Tomadas juntas, Figuras 7A-7C muestran que anti-NKG2A suprime tanto el valor de referencia como niveles IL-6 estimulados en cultivos in vitro SFMC. IL-6 es una citocina proinflamatoria importante implicada en la patogénesis de RA. Potencialmente , la reducción en IL-6 juega un papel en la reducción observada en la formación de osteoclasto.

Ejemplo 8: NKG2A y/o su ligando HLA-E se expresa en sinovio inflamado de RA, pacientes con osteoartritis (OA) y artritis psoriásica (PsA) Las células N presentes en tejido sinovial de RA expresan el receptor NKG2A inhibitorio y se localizan predominantemente en agregados linfoides adyacentes a sinoviocitos que expresan HLA-E, el ligando para CD94-NKG2A. Esto se muestra en las Figs. 8A-8M donde las fotografías representativas de tejido sinovial de RA de dos fuera de 15 donantes se representan (ID 1144-09: A, C, E, G, l e ID 1591-08: B, D, F, H, J) . Las secciones en serie de sinovio RA se mancharon para células NK con un anticuerpo anti-NKp46 (Fig. 8A y 8B) , por NKG2A con el anticuerpo Z199 (Fig. 8C y 8D) , por HLA-E con el anticuerpo 3D12 (Fig. 8E y 8F) y por células T con un anticuerpo anti-CD3 (Fig. 8G y 8H) . Ninguna tinción se observó usando un anticuerpo de control de isotipo IgG2b (Fig. 81 y 8J) . La reactividad específica inmunitaria su visualizó con diaminobenzidina (DAB) y núcleos se tiñeron con hematoxilina (barras = 100 µp\) . Las cabezas de flecha indican agregados linfoides en subrevestimiento tejido con NKp46, NKG2A, HLA-E y CD3 que expresan subcon untos de célula. Las flechas indican sinoviocitos HLA-E+ en capa de revestimiento sinovial hiperplástico adyacente a agregados linfoides con células NK. Los asteriscos indican células endoteliales vascular HLA-E+.

Las fotografías de alta magnificación de células NK NKp46+ (Fig. 8K) y células NKG2A+ (Fig. 8L) en secciones en serie de sinovio RA de un 3er donador (ID 1595-08) se muestran para enfatizar que la localización y frecuencia de células NK fueron muy similares a esas de células NKG2A+ . El análisis de imagen digital se usó para correlacionar el número de células NKG2A+ en sinovio de 15 pacientes con RA con el número de células. NK NKp46+ (Fig. 8M) . Los resultados se expresan como número de células por mm2 y muestran que la frecuencia de células NKG2A+ fuertemente se correlacionan con (r2=0.950, p<0.0001) y se emparejan por el número que de células NK. Las células NKG2A+ se presentaron en el sinovio de 13/15 pacientes con RA.

Juntos, estos datos muestran que las células NK se puedan identificar entre la población de linfocitos de infiltración en el sinovio de paciente con RA, y sugiere que la mayoría, si no todas, las células NK expresan NKG2A. El ligando para CD94-NKG2A, HLA-E, se expresa por muchas células inmunitarias de infiltración, células endoteliales vasculares y sinoviocitos ( sinoviocitos como macrófagos (MLS) y RA-FLS) . Los subconjuntos de células NK NKG2A+ se encuentran en áreas cercanas a sinoviocitos HLA-E+. Por lo tanto, esto podría potencialmente significar que células NK NKG2A+ reconocen HLA-E en RA-FLS in situ. Por otra parte, células inmunitarias de infiltración HLA-E+ y endotelio vascular también se pueden reconocer por células NK NKG2A* .

NKG2A y su ligando, HLA-E, se expresan en sinovio de pacientes con osteoartritis (OA) . Esto se muestra en las Figs . 9A-9C, que describe células NKG2A+ (anticuerpo Z199) entre linfocitos de infiltración (Fig. 9A) y expresión HLA-E (anticuerpo 3D12) al infiltrar células inmunitarias , células endoteliales y sinoviocitos (Fig. 9B) . Las células NKG2A+ se presentaron en el sinovio de 6/9 pacientes con OA. En contraste con pacientes con RA, la frecuencia de células NKG2A+ no parece correlacionarse con la de células NK en sinovio OA, cuando se cuantifica por análisis de imagen digital (r2=0.136, p=0.3295; Fig. 9C) , que indica que algunas de las células NK que infiltran sinovio OA no pueden expresar NKG2A.

Juntos, estos datos muestran expresión de NKG2A y HLA-E en subconjuntos de célula sinovial OA similares a aquellos de sinovio RA. Por lo tanto, células NK NKG2A+ pueden reconocer sinoviocitos HLA-E+, endotelio vascular y células inmunitarias de infiltración en sinovio inflamado de pacientes con OA.

El ligando para CD94 -NKG2A, HLA-E, se encontró para expresarse en sinovio inflamado de no únicamente RA y OA, pero también pacientes con artritis psoriásica (PsA) . Esto se muestra en las Figs . 10A-10D que describe tinción de muestras de tejido sinovial de pacientes con RA, OA y PsA (como se indica) con el anti-HLA-E anticuerpo mAb MEM-E/02. En sinovio de controles normales, la expresión HLA-E se observa en endotelio vascular y, más débilmente, en subconjuntos de sinoviocitos ubicados en el revestimiento sinovial, como se indica en la Fig. 10A-10D.

Estos datos muestran expresión de HLA-E por sinoviocitos , endotelio vascular y células inmunitarias de infiltración en sinovio inflamado de pacientes con PsA, lo que significa que células NKG2A+ pueden reconocer tales subconjuntos de célula HLA-E+ en estos pacientes.

Mientras que ciertas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente, muchas modificaciones, sustituciones, cambios, y equivalentes se producirían por aquellos de experiencia ordinaria en la técnica. Por lo tanto, se ha de entender que las reivindicaciones adjuntas están destinadas para cubrir todas de tales modificaciones y cambios como los que caen dentro del espíritu verdadero de la invención.

MODALIDADES : 1. Un anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para el tratamiento de destrucción de cartílago y/o erosión ósea. 2. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 1, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno donde la reducción de destrucción de cartílago y/o erosión ósea es benéfico para el paciente. 3. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 1 o 2, en donde tal anticuerpo anti-NKG2A estimula la eliminación selectiva de células destructivas de cartílago y/o reduce la formación de células que erosionan el hueso. 4. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde la eliminación selectiva de las células destructivas de cartílago y/o reducción de células erosivas óseas, es benéfico para el paciente. 5. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de la modalidad precedente, en donde las células destructivas de cartílago son sinoviocitos como fibroblastos (FLS) . 6. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de la modalidad 1-5, en donde las células que erosionan el hueso son osteoclastos . 7. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 6, en donde el osteoclasto de erosión ósea son células multinucleadas TRAP+ . 8. Un anticuerpo anti-NKG2A, o fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por la destrucción de cartílago y/o erosión ósea. 9. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 8, en donde la enfermedad o trastorno es osteoartritis . 10. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 8, en donde la enfermedad de trastorno es osteoporosis . 11. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 8, en donde la enfermedad de trastorno es artritis psoriásica. 12. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 8, en donde la enfermedad de trastorno es artritis reumática. 13. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo es un fragmento de enlace a antígeno del mismo. 14. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 13, en donde el fragmento de anticuerpo se selecciona de un Fab, un Fab ' , un F(ab)2, un F(ab')2, un F(ab)3, un Fv, un Fv de cadena sencilla, un dsFv, un fragmento Fd, un fragmento dAb, un minicuerpo, un diacuerpo, un triacuerpo, un tetracuerpo, un cuerpo kappa; un IgG de camello; un IgNAR; y un fragmento de anticuerpo multiespecífico . 15. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo es un fragmento Fab. 16. Un anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo es un anticuerpo biespecífico . 17. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo se conjuga a una porción que se extiende de vida media. 18. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal porción que se extiende de vida media comprende una o más porciones que extienden la vida media seleccionadas de uno o más de la lista que consiste de: ácidos grasos y derivados del mismo, almidón de Hidroxi Etilo (HES) , Poli Etilen Glicol (PEG) , ácido hialurónico (HA) , polímeros de heparosan, Polímeros basados en fosforilcolina, fleximeros, dextrano, ácidos poli-siálicos (PSA) , un dominio Fe, transferrina , albúmina, Elastina como péptidos, polímeros XTEN, péptidos de enlace de albúmina, y cualquier combinación del mismo. 19. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 18, en donde el anticuerpo se puede conjugar con dos o más diferentes tipos de porciones que se extienden de vida media. 20. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo comprende un dominio Fe mutado, en donde tales mutaciones resultan en funciones de enlace de receptor Fcy reducidas. 21. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 20, en donde tal dominio Fe comprende uno o más de las siguientes mutaciones: L234A, L235E, y G237A, A330S y P331S (de acuerdo con el esquema de numeración de Kabat) . 22. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de la modalidad precedente, en donde tal anticuerpo comprende un dominio IgG4 Fe. 23. Un anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 22, en donde tal dominio IgG4 Fe comprende la mutación S241P/S228P. 24. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo es un anticuerpo IgG4 de longitud completa o fragmento del mismo. 25. Un anticuerpo anti-NKGA, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades precedentes, en donde tal anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano. 26. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 25, en donde tal anticuerpo es humZ270 o humZ199. 27. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 25 o 26, en donde tal anticuerpo es humZ270. 28. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-27, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - un secuencia CRD1 de residuos de aminoácido "31 hasta 35 (SY ) de la SEQ. ID. NO: 2, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-59 (RIDPYDSETH) de la SEQ. ID. NO: 2, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos residuos se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCARGGYD) de la SEQ . ID. NO: 2, en donde uno, dos o tres de estos aminoácidos residuos se pueden substituir por un aminoácido diferente . 29. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de modalidades 25-28, en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (RASENIYSYLA) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden sustituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (NAKTLAE) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QHHYGTPRT) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente. 30. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-29, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYWMN) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-59 (RIDPYDSETH) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCARGGYD) de la SEQ. ID. NO: 2. 31. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-30, en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (RASENIYSYLA) de la SEQ. ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (NAKTLAE) de la SEQ. ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QHHYGTPRT) de la SEQ. ID. NO: 3. 32. Un anti anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-31, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYWMN) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-59 (RIDPYDSETH) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCARGGYD) de la SEQ. ID. NO: 2; y en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (RASENIYSYLA) de la SEQ. ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (NAKTLAE) de la SEQ. ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QHHYGTPRT) de la SEQ. ID. NO: 3. 33. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-32, en donde la cadena pesada de tal comprende SEQ. ID. NO: 2 y la cadena ligera de tal anticuerpo comprende SEQ. ID. NO: 3. 34. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 1-24, que compite con el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 25-33, para enlazar a NKG2A. 35. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con la modalidad 25 o 26, en donde tal anticuerpo es humZ199. 36. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de acuerdo con cualquiera de las modalidades 25-26 o modalidad 35, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYAMS) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o una secuencia CDR3 de aminoácidos 99-108 (HGDYPRFFDV) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un aminoácido diferente . 37. Un anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 25-26 o 35-36, en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (SASSSVSSYIY) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (LTSNLAS) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QQWSGNPYT) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente. 38. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 25-26 o 35-37, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYAMS) de la SEQ . ID. NO: 4; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK) de la SEQ. ID. NO: 4; y/o - una CDR3 secuencia de aminoácidos -108 (HGDYPRFFDV) de la SEQ. ID. NO: 4. 39. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 25-26 o 35-38, en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (SASSSVSSYIY) de la SEQ. ID. NO: 5; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (LTSNLAS) de la SEQ. ID. NO: 5; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido -97 (QQ SGNPYT) de la SEQ. ID. NO: 5. 40. Un anti anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 25-26 o 35-39, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYWMN) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-59 (RIDPYDSETH) de la SEQ. ID. NO: 2; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCARGGYD) de la SEQ. ID. NO: 2; y en donde la cadena ligera de tal anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (RASENIYSYLA) de la SEQ . ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (NAKTLAE) de la SEQ. ID. NO: 3; y/o - una secuencia CDR3 dé residuos de aminoácido 89-97 (QHHYGTPRT) de la SEQ. ID. NO: 3. 41. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 25-26 o 35-40, en donde la cadena pesada de tal anticuerpo comprende SEQ. ID. NO: 4 y la cadena ligera de tal anticuerpo comprende SEQ. ID. NO: 5. 42. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-25, que compite con el anticuerpo de cualquiera de las modalidades 35-41, para enlazar a NKG2A. 43. El uso del anticuerpo anti-NKG2A, de cualquiera de las modalidades 1-7 o 13-42 para el tratamiento de una destrucción de cartílago y/o erosión ósea. 44. El uso del anticuerpo anti-NKG2A de la modalidad 43, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizada por la destrucción de cartílago y/o erosión ósea . 45. El uso del anticuerpo anti-NKG2A de la modalidad 44, en donde la enfermedad o trastorno es osteoartritis . 46. El uso del anticuerpo anti-NKG2A de la modalidad 44, en donde la enfermedad de trastorno es osteoporosis . 47. El uso del anticuerpo antÍ-NKG2A de la modalidad 44, en donde la enfermedad de trastorno es artritis psoriásica. 48. El uso del anticuerpo anti-NKG2A de la modalidad 44, -en donde la enfermedad de trastorno es artritis reumática. 49. El método de tratamiento de enfermedades o trastorno caracterizado por la destrucción de cartílago y/o erosión ósea, que comprende administrar el anticuerpo anti-NKG2A de cualquiera de las modalidades precedentes a un paciente. 50. El método de tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por la destrucción de cartílago, que comprende administrar el anticuerpo anti-NKG2A de cualquiera de las modalidades 1-49 a un paciente. 51. El método de tratamiento de una enfermedad o trastorno caracterizado por erosión ósea, que comprende administrar el anticuerpo anti-NKG2A de cualquiera de las modalidades 1-49 a un paciente. 52. El método de tratamiento de una enfermedad de trastorno caracterizado por destrucción de cartílago y erosión ósea, que comprende administrar el anticuerpo anti-NKG2A de cualquiera de las modalidades 1-49 a un paciente. 53. Un anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con cualquiera de las modalidades 1-49 para usarse como un medicamento. 54. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, formulación farmacéutica que comprende el anticuerpo de conformidad con una de cualesquiera de modalidades 1-49. 55. El uso del anticuerpo anti -NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, de conformidad con una de cualesquiera de las modalidades 1-49 para la manufactura de un medicamento.

Todas las referencias, que incluyen publicaciones, solicitud de patentes y patentes, citadas en la presente se incorporan por este medio como referencia en el mismo grado como si cada referencia individualmente y específicamente se indicó para incorporarse como referencia y se estableció en su totalidad en la presente descripción.

Todos los encabezados y subencabezados se usan en la presente por conveniencia únicamente y no deben interpretarse como que limitan la invención de cualquier manera, Cualquier combinación de los elementos descritos arriba en todas las variaciones posibles del mismo se abarcan por la invención a menos que se indique de otra manera en la presente o de otra manera se contradiga claramente por el contexto.

A menos que se indique expresamente de otra manera o claramente contradiga por el contexto, el término "o" en la presente se usa en sentido inclusivo de "y/o", y, en consecuencia, como implícitamente proporciona apoyo para una modalidad o aspecto en el cual el término es para interpretarse en el sentido exclusivo de "esto o aquello" .

Los términos "un/una" y "el/ella" y referentes similares como se usa en el contexto de describir la invención son para interpretarse para cubrir tanto el singular y el plural, a menos que se indique de otra manera en la presente o claramente contradiga por el contexto.

La recitación de intervalos de valores en la presente están destinados simplemente para servir como un método abreviado para referirse individualmente a cada valor separado que cae dentro del intervalo, a menos que se indique de otra manera en la presente, y cada valor separado se incorpora en la especificación como si fuera individualmente recitado en la presente. A menos que se establezca de otra manera, todos los valores exactos proporcionados en la presente son representativos de valores aproximados correspondientes (por ejemplo, todos los valores exactos ejemplares proporcionados con respecto a un factor particular o medición se pueden considerar también para proporcionar una medición aproximada correspondiente, modificada por "alrededor de," cuando proceda) .

Todos los métodos descritos en la presente se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otra manera en la presente o claramente de otra manera se contradiga por el contexto.

El uso de cualquiera y todos los ejemplos, o leguaje ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en la presente, se pretende simplemente aclarar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se indique de otra manera. Ningún lenguaje en la especificación se debe interpretar como que indica cualquier elemento es esencial para la práctica de la invención a menos que se establezca mucho explícitamente.

La cita e incorporación de documentos de patente en la presente se hace por conveniencia únicamente y no refleja cualquier punto de vista de la validez, patentabilidad y/o aplicabilidad de tales documentos de patente, La descripción en la presente de cualquier aspecto o modalidad de la invención usando los términos tal como "que comprende", "que tiene", "que incluye" o "que contiene" con referencia a un elemento o elementos se pretende proporcionar como apoyo por un aspecto similar o modalidad de la invención que "consiste de", "consiste esencialmente de", o "sustancialmente comprende" ese elemento particular o elementos, a menos que se establezca de otra manera o claramente contradiga por el contexto (por ejemplo, una composición descrita en la presente como que comprende un elemento particular se debe entender como también que describe una composición que consiste de ese elemento, a menos que se establezca de otra manera o claramente contradiga por el contexto) .

Esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia objeto recitada en los aspectos o reivindicaciones presentadas en la presente el grado máximo permitido por la ley aplicable.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones .

1. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de destrucción de cartílago y/o erosión ósea.

2. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la reivindicación 1, donde el anticuerpo anti-NKG2A estimula la eliminación selectiva de células destructivas de cartílago y/o reduce la formación de células que erosionan el hueso.

3. El anticuerpo anti-N G2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las células destructivas de cartílago son sinoviocitos como fibroblastos (FLS) .

4. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, donde las células que erosionan el hueso son osteoclastos .

5. El anticuerpo anti-NKG2A, o fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, para el tratamiento de una enfermedad o trastorno por medio de la destrucción de cartílago y/o erosión ósea.

6. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la reivindicación 5, donde la enfermedad o trastorno es osteoartritis .

7. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la reivindicación 5, donde la enfermedad de trastorno es osteoporosis .

8. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la reivindicación 5, donde la enfermedad de trastorno es artritis psoriásica.

9. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la reivindicación 5, donde la enfermedad de trastorno es artritis reumática.

10. El anti-NKGA anticuerpo, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, en donde el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o humano.

11. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con la modalidad 25, donde el anticuerpo es humZ270 o humZ199.

12. Un anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYWMN) de la SEQ. ID. NO: 2, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o - una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-59 (RIDPYDSETH) de la SEQ. ID. NO: 2, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCARGGYD) de la SEQ. ID. NO: 2, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un aminoácido diferente: y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (RASENIYSYLA) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden sustituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (NAKTLAE) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QHHYGTPRT) de la SEQ. ID. NO: 3, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente.

13. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, donde la cadena pesada del anticuerpo comprende: - una secuencia CRD1 de residuos de aminoácido 31 hasta 35 (SYAMS) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o una secuencia CRD2 de aminoácidos 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno, dos, tres o cuatro de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un residuo de aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de aminoácidos 99-108 (HGDYPRFFDV) de la SEQ. ID. NO: 4, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácidos se pueden substituir por un aminoácido diferente; y en donde la cadena ligera del anticuerpo comprende: - una secuencia CDR1 de residuos de aminoácido 24-34 (SASSSVSSYIY) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR2 de residuos de aminoácido 50-56 (LTSNLAS) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno o dos de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente; y/o - una secuencia CDR3 de residuos de aminoácido 89-97 (QQWSGNPYT) de la SEQ. ID. NO: 5, en donde uno, dos o tres de estos residuos de aminoácido se pueden substituir con un aminoácido diferente.

14. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 1-11, el cual compite con el anticuerpo de la reivindicación 12 o/y el anticuerpo de la reivindicación 13.

15. El anticuerpo anti-NKG2A, o un fragmento de enlace a antígeno del mismo, para usarse en el tratamiento de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones precedentes, para usarse como una formulación farmacéutica.