KR20140037918A - 침식성 세포의 선택적 제거 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 특징으로 하는 질환의 치료에 관한 것이다. 특히 본 발명은 항-NKG2A 항체로 골관절염, 골다공증, 건선성 관절염 또는 류머티스성 관절염의 치료에 관한 것이다.

Description

침식성 세포의 선택적 제거{SELECTIVE ELIMINATION OF EROSIVE CELLS}
본 발명은 뼈 침식 (erosion) 및 연골 파괴의 치료, 특히 생물학적 제제, 예를 들어, 항체를 사용하는 뼈 및 연골 파괴 질환의 치료에 관한 것이다.
자연 살해 (natural killer; NK) 세포는 특정 감염 및 종양에 대한 숙주 방어에 필수적인 골수 유도된 림프구이다. 활성화시 그것들은 다양한 시토킨을 신속하게 생산하고 감염되거나, 스트레스를 받거나, 종양을 형성하는 세포에 대한 세포 독성 반응을 매개할 수 있다. 만성 염증성 질환에서 NK 세포의 역할이 부각되고, NK 세포가 수지상 세포 (DC)의 분화 및 성숙화 및 이후 T 세포 반응의 양극화를 촉진하는 능력을 통해 T 및 B 세포 반응의 조절에 있어서 중요한 역할을 할 수도 있다는 것이 점점 더 인정되고 있다 (예를 들어, Cooper et al. (2004) Trends Immunol. 25: 47-52; Zhang et al. (2007) Blood Oct 1;110(7):2484-93을 참고하면 된다). 게다가, 연구는 NK 세포가 세포-매개된 세포 독성 반응을 통해 활성화된 T 세포의 서브세트를 직접적으로 제거하는 능력을 갖는다는 것을 나타냈다 (Lu et al. (2007) Immunity. 26: 593-604).
NK 세포 활성은 활성화 및 억제 신호 둘 다를 수반하는 복합 메카니즘에 의해 조절된다 (예를 들어, Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223; Moretta et al. (2003) EMBO j EPub Dec 18; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-805; Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-
HLA 등급 I 결핍 표적 세포의 인식 및 살해에 수반되는, NK 세포 매개된 여러 다른 NK-특이적 수용체가 확인되었다. 한 이입 억제 NK 세포 수용체는 CD94/NKG2A이며, 이것은 비-고전적 MHC 등급 I 분자 HLA-E와 상호작용한다 (예를 들어, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (199) J Immunol 162:305-313; Miller et al. (2003) J Immunol 171:1369-75; Brooks et al. (1997) J Esp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311; 미국 특허 출원 번호 20030095965를 참고하면 된다).
CD94/NKG2A는 NK, NKT 및 T 세포의 서브세트에서 발견된 억제 수용체이며, 이것은 전형적으로 다른 MHC 등급 I 분자의 선도 서열로부터 유도된, CD94/NKG2A-리간드 HLA-E를 가지고 있는 작은 펩티드를 발현하는 세포의 그것들의 살해를 제한한다 (예를 들어, WO99/28748 및 Braud et al. (1998) Nature 391:795-799를 참고하면 된다).
NKG2A에 대한 다양한 항체가 업계에서 설명되었다. 예를 들어, Sivori et al. (Eur j Immunol 1996;26:2487)은 쥐 항-NKG2A 항체 Z270을 나타내고; Carretero et al.(J Exp Med 1999;190:1801-12)은 래트 항-쥐 NKG2A 항체 20D5를 나타내고; US20030095965로서 공개된 미국 특허 출원은 쥐 항체 3S9를 설명하며, 이것은 NKG2A, NKG2C 및 NKG2E에 결합하고, 특허 출원 WO06070286은 NKG2A에 대한 단클론성 항체를 개시하고 특허 출원 WO2008/009545는 사람화된 항체 humZ270 및 Z270의 그것과 실질적으로 동일한 가변 중쇄 및/또는 가변 경쇄를 갖는 다른 항-NKG2A 항체를 설명한다.
류머티스성 관절염 (Rheumatoid arthritis; RA)은 다중 세포 서브세트에 의해 생성된 염증 매개자의 활성화가 결국 관절 연골 및 뼈의 파괴를 일으키는 만성 염증성 질환이다. RA에서 연골 및 파괴의 원인이 되는 주요 세포 서브세트가 각각 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS) 및 용골 세포인 것으로 일반적으로 인정된다. CD94-NKG2A를 발현하는 T 세포 및 NK 세포는 활성화된 전염증성 세포를 살해함으로써 염증을 억제할 수 있다. 이들 세포의 활성화는 대식세포, 활성화된 CD4+ T 세포 및 B 세포/형질 세포를 포함하는 일련의 다른 세포 및 분자에 의해 성취될 수 있다. 하지만, 이 조절, 항-염증 활성은 CD94-NKG2A 수용체가 전염증성 세포의 표면에서 그것들의 HLA-E 리간드에 결합할 때 억제된다. CD94-NKG2A 수용체를 차단하고 그것들의 억제 신호 전달을 방지함으로써, NNC141-0100은 조절 CD94-NKG2A+ T 세포 및 NK 세포의 항-염증 활성을 향상시키며, 예를 들어, 활성화된 전염증성 CD4+ T 세포, 및 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)를 제거하는 능력을 상승시켰다. 나머지 세포가 영향을 받지 않는 채로 두면서 공격적인 연골-침식 FLS를 특이적으로 제거하고 뼈 침식성 용골 세포의 형성을 저해하는 치료는 현재 RA 치료를 통해 상당한 이점을 가질 수도 있고 잠재적으로 골관절염 (ostero arthritis; OA) 및 건선성 관절염 (psoretic arthritis; PsA)을 치료하는데 사용되는 환자를 위한 이익을 또한 가질 수 있다.
본 발명은 RA에서 NKG2A 항체가 각각 뼈-분해 용골 세포의 형성을 감소시키는 능력에 의해 및 연골-분해 FLS의 제거를 선택적으로 향상시킴으로써 어떻게 두 개의 주요 발병 경로, 즉, 뼈 및 연골 침식을 약화시키는지를 개시한다.
RA를 표적으로 하는 기존의 치료제는 염증성 캐스케이드의 개개의 성분에 직접적으로 작용하고, 뼈-침식에 관한 그것들의 효능은 항-염증 효과에 2차적이다. HLA-E의 결합을 억제할 수 있거나 비-경쟁적으로 CD94/NKG2A의 기능을 차단할 수 있고 NK 세포의 내인성 면역-조절 메카니즘을 자극할 수 있는 항-NKG2A mAb는 연골-분해, 뼈 침식을 촉진하는 세포의 선택적 제거 및 IL-6, 염증을 촉진하는 것으로 알려진 시토킨의 감소를 일으킨다. 따라서, 항-NKG2A mAb로 치료는 뼈-침식 또는 연골 파괴에 의해 특성화된 질환의 발병에 대한 직접적인 효과를 가질 수 있다.
본 발명은 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 치료할 수 있는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 단편의 사용을 개시한다.
본 발명은 연골 파괴 및/또는 뼈 침식에 의해 특성화된 질환 또는 장애의 치료를 위한 항-NKG2A 항체의 사용을 개시한다.
본 발명은 연골 파괴 및/또는 뼈 침식의 치료를 위한 항-NKG2A 항체의 사용을 개시하며 항-NKG2A 항체는 연골 분해 또는 뼈 침식을 촉진하는 활성화된 세포의 선택적 제거를 자극한다. 본 발명의 한 구체예에서 연골-분해 세포는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)이다. 한 구체예에서 뼈-침식 세포는 침식성 용골 세포이다.
본 발명은 연골 파괴 및/또는 뼈 침식에 의해 특성화된 질환 또는 장애의 치료를 위한 항-NKG2A 항체의 사용을 개시하며, 항-NKG2A 항체는 연골 분해 또는 뼈 침식을 촉진하는 활성화된 세포의 선택적 제거를 자극한다. 본 발명의 한 구체예에서 연골-분해 세포는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)이다. 한 구체예에서 뼈-침식 세포는 침식성 용골 세포이다.
본 발명에 사용된 NKG2A 항체는 어떤 적합한 항 NKG2A 항체가 될 수 있다. 한 구체예에서, 항체는 단클론성 항-NKG2A 항체이다. 한 구체예에서 항체는 사람화된 항-NKG2A 항체이다. 한 구체예에서 항체는 완전한 사람 항-NKG2A 항체이다. 한 구체예에서, 항체는 WO2008/009545에 설명된 항-NKG2A 항체이다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 단클론성 항체는 특허 공개 WO2008/009545에 설명된 humZ270이다. 한 구체예에서 항-NKG2A 항체는 특허 공개 WO09092805에 설명된 단클론성 항-NKG2A 항체이다. 한 구체예에서 항-NKG2A 항체는 특허 공개 WO09092805에 설명된humZ199이다.
도 1은 류머티스성 관절염 (RA)에 걸린 환자의 활막 조직으로부터 유도된 시험관 내에서 발생한 섬유아세포-유사 활막 세포에 의해 발현된 세포 표면 분자의 패널의 발현 프로파일을 설명한다.
- 도 1A는 RA 환자로부터 유도된 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)가 CD55 (오른쪽 막대그래프 오버레이)를 발현하지만 CD68 (왼쪽 막대그래프 오버레이)이 없다는 것을 나타낸다.
- 도 1B는 하기 각각의 막대그래프 오버레이에 지시된 바와 같이 RA-FLS 세포 표면이 NK 세포 수용체를 활성화하는 여러 리간드 (예를 들어, MICA, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ICAM1, CD155, CD48)를 발현한다는 것을 나타낸다. 지시된 바와 같이 RA-FLS는 NKp44-FC 융합체로 효과적으로 염색하고 RA-FLS는 NKp44에 대한 추정 리간드를 발현한다는 것을 제안한다.
- 도 1C는 NKp44에 대한 항체가 투여량-의존적으로 RA-FLS 상에 가용성 NKp44-FC 융합 단백질의 결합을 방지한다는 것을 나타내며 RA-FLS가 NKp44 수용체와 상호작용할 수 있는 리간드를 발현한다는 것을 제안한다.
- 도 1D는 RA-FLS는 MHC 등급 I 리간드 HLA-E 및 HLA-G, NK 세포 수용체에 의해 인식되는 것으로 알려진 리간드를 발현한다는 것을 나타낸다 (예를 들어, 각각 CD94/NKG2A 및 LIR-1).
- 도 1E는 RA-FLS가 죽음 수용체 5 (DR5)를 발현하지만, DR4, TRAIL에 결합하는 알려진 수용체는 아니라는 것을 나타낸다.
도 2는 NKG2A를 발현하는 NK 세포가 RA 활막에 존재하고 HLA-E를 발현하는 RA-FLS를 함유하는 영역에서 발견될 수 있다는 것을 나타낸다.
- 도 2A는 사람 NKp46에 대한 항체로 염색된 RA 활막 조직을 나타낸다. 어두운 염색된 영역은 NKp46 발현 세포이다.
- 도 2B는 사람 NKG2A에 대한 항체로 염색된 같은 조직의 인접한 섹션을 나타낸다. 어두운 염색된 영역은 NKG2A 발현 세포이다.
- 도 2C는 이소토프 대조군 항체로 염색된 인접한 조직 섹션을 나타낸다.
- 도 2D는 정량 디지털 이미지 분석에 의해 평가된 NKp46+ 세포/mm2 활막 조직의 빈도에 대하여 플롯팅된 (plotted) NKG2A+ 세포/mm2 활막 조직의 빈도를 나타낸다. 데이터는 대부분의 NKG2A+ 세포가 염증이 생긴 RA 활막 조직에서 NK 세포인 것을 지지한다.
- 도 2E는 항-HLA-E 항체로 염색된 RA 활막 조직을 나타낸다. RA-FLS를 포함하는, 활막 내벽 (lining)의 세포는 HLA-E를 발현한다. 화살표는 어둡게 염색된 HLA-E를 발현하는 활막 내벽 FLS-유사 세포의 영역을 나타낸다.
- 도 2F는 활막 하위 내벽 (sublining)의 침투성 면역 세포는 HLA-E를 발현한다는 것을 나타낸다.
- 도 2G는 이소타입 대조군 항체로 염색된 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 도 2H는 혈관 내피 세포가 HLA-E를 발현한다는 것을 나타낸다.
도 3은 RA 환자로부터 유도된 활액 NK 세포를 포함하는, NK 세포는 RA-FLS상에 발현되는 리간드에 결합하는 것으로 알려진 활성화 수용체의 패널을 발현한다는 것을 나타낸다.
- 도 3A:
o 도 3A (i)은 대표적인 RA 환자의 SFMC로부터 유도된, 게이트된 (gated) NK 세포 상의 NK 세포 수용체 발현을 나타낸다. 활액 NK 세포는 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, 및 TRAIL을 발현하지만, 오픈 막대그래프 오버레이에 의해 지시된 바와 같이 없거나, 매우 낮은 수준의 NKG2C를 발현하지 않는다.
o 도 3A (ii)는 대표적인 건강한 기증체로부터 유도된 PBMC의 나머지 CD56bright NK 세포를 나타낸다. CD56bright NK 세포는 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, 및 TRAIL을 발현하지만, 오픈 막대그래프 오버레이에 의해 지시된 바와 같이 없거나, 매우 낮은 수준의 NKG2C를 발현하지 않는다.
o 도 3A (iii)은 Nishi NK 세포를 나타낸다. Nishi NK 세포는 NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, 및 TRAIL을 발현하지만, 오픈 막대그래프 오버레이에 의해 지시된 바와 같이 없거나, 매우 낮은 수준의 NKG2C를 발현하지 않는다.
- 도 3B는 NK 세포가 시험관 내에서 부착 RA-FLS를 제거한다는 것을 나타낸다:
o 도 3B (i)은 하룻밤 동안 RA-FLS와 함께 배양된 NK 세포는 용량 의존적 방식으로 부착 RA-FLS의 제거를 일으킨다.
o 도 3B (ii)는 Immunospot 이미지 분석에 의해 분석된 바와 같이, 단독으로 배양될 때, 또는 하룻밤 동안 NK 세포의 감소하는 양과 동시 배양될 때 부착 RA-FLS에 의해 커버된 웰 영역을 나타낸다.
- 도 3C는 CD107a/b 세포-표면 발현에 의해 측정된 바와 같이 NK 세포가 RA-FLS와 동시 배양될 때 탈과립화 하지만, 단독으로 배양될 때는 아니며, NK 세포가 활발히 RA-FLS를 살해한다는 것을 나타낸다.
- 도 3D는 효과기 NK 세포에 대하여 CD107a/b 세포 표면 발현에 의해 측정된 바와 같이 NK 세포에 의해 발현된 은폐 NKG2D, NKp44, NKp46, DNAM-1, 또는 TRAIL이 RA-FLS의 많이 감소한 살해를 일으킨다는 것을 나타낸다.
도 4는 RA-FLS가 억제 CD94-NKG2A NK 세포 수용체에 결찰할 수 있는 HAL-EDML 발현에 의해 NK 세포-매개된 세포 독성으로부터 보호된다는 것을 나타낸다.
- 도 4A는 RA 활액 NK 세포 (상단 패널), CD56bright 건강한 PB-NK 세포 (중간 패널), 및 Nishi NK 세포 (하단 패널) 모두가 세포 표면 NKG2A (왼쪽)을 발현하지만, KIRs (오른쪽)는 아니다. 게다가, Nishi 세포는 LIR1을 발현하지만, 활액 NK 세포 또는 CD56bright NK 세포는 아니다 (중간 패널).
도 4B는 항-NKG2A (오른쪽 패널)의 존재시 RA-FLS와 동시 배양되지만, 항-LIR1의 존재시에는 아닐 때 (왼쪽 패널) CD107a/b 세포-표면 발현에 의해 측정된 바와 같이 증가한 NK 세포 탈과립화 를 나타낸다.
도 4C는 이소타입 대조군 (중간 이미지)의 처리와 비교하여 항-NKG2A (오른쪽 이미지)가 처리될 때 부착 RA-FLS의 증가된 NK 세포-의존적 제거를 나타낸다. NK 세포의 부재시 배양된 RA-FLS는 왼쪽 미크로그래프 이미지에 나타난다.
- 도 4D는 활액 NK 세포가 자가 RA-FLS (14%, 왼쪽 상단)과 동시 배양될 때 탈과립화 하고 은폐 NKG2A는 증가한 탈과립화 (44%, 오른쪽 상단)를 일으킨다는 것을 나타낸다. 자가 CD3+ CD8+ T 세포는 항-NKG2A의 부재 (즉, 이소타입 처리된 배양물, 왼쪽 하단) 또는 존재시 (오른쪽 하단) 자가 RA-FLS와 동시 배양될 때 크게 탈과립화 하지 않는다.
- 도 4E는 건강한 기증체로부터 신선하게 분리되고 자극되지 않은 CD56bright PB-NK 세포가 항-NKG2A의 존재시 RA-FLS와 함께 동시 배양될 때 탈과립화 하지만 이소타입 대조군 항체가 처리되었을 때 최소한으로 탈과립화 한다는 것을 나타낸다. 상단 패널은 대표적인 예를 나타내고 하단 그래프는 이소타입 대 항-NKG2A의 존재시 RA-FLS와 동시 배양된 5개의 별도의 기증체 CD56bright NK 세포 상에서 % CD107a/b 발현을 나타낸다.
도 5A는 NNC141-0100 (humZ270)을 사용하여 NKG2A를 차단하는 것이 LDH 방출 검정에 의해 측정된 바와 같이 RA-FLS의 증가된 NK 세포-매개된 제거로 이어진다는 것을 나타낸다. NKL 효과기 세포는 대표적인 RA-FLS 표적 세포에 대하여 왼쪽에 나타나고 Nishi NK 세포는 오른쪽에 나타난다.
도 5B는 NNC141-0100 (humZ270)을 사용하여 NKG2A를 차단하는 것이 대표적인 RA-FLS (RA-FLS2)의 증가된 용해로 이어지지만 정상 포피 섬유아세포 세포주 (FSK4)의 제거에 영향을 미치지 않는다는 것을 나타낸다.
도 6은 NNC141-0100 (humZ270)은 TRAP+ 다핵성 용골 세포의 형성을 억제한다는 것을 나타낸다.
- 도 6A는 humIgG4 이소타입의 존재시 7일 동안 배양된 RA-SFMC의 대표적인 예를 나타낸다. 여러 큰 다핵성 TRAP+ 세포가 보인다.
- 도 6B는 humZ270 처리가 극적으로 감소된 수의 큰 다핵성 TRAP+ 세포를 발생시킨다는 것을 나타낸다.
- 도 6C는 지시된 바와 같이 이소타입 대조군 대 항-NKG2A (humZ270, NNC141-0100)의 존재시 배지 또는 IL-15에서 배양된 RA에 걸린 환자로부터 유도된 SFMC에서 용골 세포의 형성을 나타낸다. IL-15로 자극된 배양물에서 은폐 NKG2A는 감소된 수의 TRAP+ 다핵성 세포를 발생시킨다.
- 도 6D는 RA에 걸린 환자에 의해 유도된 SFMC에서 뼈-무기질 침식 용골 세포의 형성이 NNC141-0100의 처리에 의해 저해된다는 것을 나타낸다. RA 환자 번호 2357의 SFMC 배양물로부터 관찰된 뼈 무기질 침식의 대표적인 예가 나타난다. SFMC는 IL-15 및 이소타입 mAb (왼쪽) 대 항-NKG2A (humZ270, 오른쪽)의 존재시 골해부학적 디스크에서 성장되었다. 디스크는 본 코사 (von Kossa)로 염색되었고 침식된 영역은 Immunospot S5 Analyzer를 사용하여 분석되었고 더 어두운 배경에 대하여 흰색으로 나타난다.
- 도 6E는 RA 환자 (n=5)로부터 유도된 SFMC가 10　ng/mL IL-15로 보충된 배지에서 배양되었다. 검정의 시작에, 20 미크로그램/mL 사람 IgG4 이소타입 (흰색 막대) 또는 20　미크로그램/mL NNC141-0100 (humZ270, 검은색 막대)이 배양물에 추가되었다. 평균 퍼센트 +/- SEM 침식된 디스크 영역은 Immunospot S5 Analyzer를 사용하여 정량되었다.
- 도 6F는 HumZ270이 RA 활막 조직 섹션 배양에서 뼈 무기질 침식을 저해한다는 것을 나타낸다. 도면은 배지 단독 (대조군, 상단), 이소타입 대조군 (상단에서 두 번째), 인플릭시맙 (IFX, 상단에서 세 번째), 또는 항-NKG2A (humZ270, 하단)의 존재시 RA 활막 조직 부스러기가 3배수의 웰에서 성장되는 예를 나타낸다. 밝은 영역은 뼈 무기질 침식을 나타낸다.
- 도 6G는 분석된 Immunospot을 사용하는 분석에 의해 결정된 바와 같이 관찰된 퍼센트 뼈 무기질 침식을 나타낸다.
도 7:
- 도 7A는 이소타입 대조군 (밝은 회색 막대)과 비교하여 humZ270 (NNC141-0100, 어두운 회색 막대)의 처리시 SFMC 시험관 내 배양에서 24시간에 측정된 시토킨 수준의 조절을 나타낸다. IL6 수준의 큰 감소가 은폐 NKG2A상에서 관찰된다. 게다가, M-CSF의 약한 감소가 관찰된다.
- 도 7B는 RA-SFMC 배양 (n=11)에서 항-NKG2A (NNC141-0100, humZ270) 대 이소타입 대조군의 존재시 생성된 IL-6 수준의 쌍 별 비교를 나타낸다.
- 도 7C는 항-NKG2A가 RA에 걸린 환자로부터 유도된 SFMC의 생체 외 배양에서 베이스라인 (즉, 배지 단독) 및 IL-15 자극된 IL-6 생성 둘 다를 억제한다는 것을 나타낸다. 두 명의 대표적인 RA 환자의 평균 및 SD가 나타난다.
도 8은 RA 활막 조직에 존재하는 NK 세포가 억제 NKG2A 수용체를 발현하고 HLA-E, CD94-NKG2A에 대한 리간드를 발현하는 활막 세포에 인접한 림프성 응집체에 대부분 위치한다는 것을 나타낸다.
- 8A는 NK 세포에 대하여 항-NKp46 항체로 염색된 ID 1144-09의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8B는 NK 세포에 대하여 항-NKp46 항체로 염색된 ID 1591-08의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8C는 NKG2A에 대하여 Z199 항체 (항-NKG2A 항체)로 염색된 ID 1144-09의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8D는 NKG2A에 대하여 Z199 항체 (항-NKG2A 항체)로 염색된 ID 1591-08의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8E는 HLA-E에 대하여 3D12 항체로 염색된 ID 1144-09의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8F는 HLA-E에 대하여 3D12 항체로 염색된 ID 1591-08의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8G는 T 세포에 대하여 항-CD3 항체로 염색된 ID 1144-09의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8H는 T 세포에 대하여 항-CD3 항체로 염색된 ID 1591-08의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8I는 IgG2b 이소타입 대조군 항체로 염색된 ID 1144-09의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8J는 IgG2b 이소타입 대조군 항체로 염색된 ID 1591-08의 RA 활막 조직을 나타낸다.
- 8K는 1595-08의 NKp46+ NK 세포의 고배율 사진을 나타낸다.
- 8L은 1595-08의 NKG2A+ NK 세포M의 고배율 사진을 나타낸다.
- 8M은 NKp46+ NK 세의 수로 15명의 RA 환자의 활막의 NKG2A+ 세포의 수의 보정을 위한 디지털 이미지 분석을 나타낸다.
도 9는 NKG2A 및 그것의 리간드, HLA-E가 골관절염 (OA)에 걸린 환자의 활막에서 발현된다는 것을 나타낸다.
- 9A는 침투성 림프구 사이의 NKG2A+ 세포 (Z199 항체)를 기술한다.
- 9B는 침투성 면역 세포, 내피 세포 및 활막 세포에 의한 HLA-E 발현 (3D12 항체)을 기술한다.
- 9C는 OA 활막의 NK 세포의 그것으로 NKG2A+ 세포의 빈도의 보정을 위한 디지털 이미지 분석을 나타낸다.
도 10은 CD94-NKG2A 리간드가 RA 및 OA 환자, 뿐만 아니라 PsA 환자의 염증이 생긴 활막에서 발현되는 것으로 발견되었다는 것을 나타낸다.
- 10A는 RA 환자의 활막 조직 샘플의 염색을 기술한다.
- 10B는 PsA 환자의 활막 조직 샘플의 염색을 기술한다.
- 10C는 RO (OA????) 환자의 활막 조직 샘플의 염색을 기술한다.
- 10D는 정상 대조군의 활막 조직 샘플의 염색을 기술한다.
도 11은 다음의 아미노산 서열을 나타낸다:
- 11A: SEQ ID NO 1; humNKG2A,
- 11B: SEQ ID NO 2; humZ270 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH),
- 11C: SEQ ID NO 3; humZ270 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL),
- 11D; SEQ ID NO 4; humZ199 항체의 중쇄 가변 도메인 (VH),
- 11E. SEQ ID NO 5; humZ199 항체의 경쇄 가변 도메인 (VL).
여기에 언급된 바와 같이 용어 "항체"는 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된 폴리펩티드를 나타낸다. 용어는 전체 길이 항체 및 어떤 항원 결합 단편 또는 이들의 단일 사슬을 포함한다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "항체", "단클론성 항체 및 "mAb"는 면역글로불린 분자 및 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 이들의 단편을 나타내기 위한 것이다. 원하는 특정 약의 면역글로불린의 하위 등급은 IgG 패밀리에 속한 것들이며, 이것은 이소타입 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 세분화될 수 있다. IgG 분자는 두 개 또는 다수의 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성되고, 하나는 이황화 결합에 의해 각각의 중쇄에 부착된다. IgG 중쇄는 네 개의 Ig-도메인으로 구성되며, 가변 도메인 (VH) 및 세 개의 불변 도메인 (CH1, CH2, 및 CH3)을 포함한다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (VL) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH 및 VL 영역은 프레임워크 영역 (FR)으로 불리는, 더 보존되는 영역과 함께 배치된, 상보성 결정 영역 (CDR)으로 불리는, 초가변성의 영역으로 더 세분화될 수 있다. 각각의 VH 및 VL은 세 개의 CDR 및 네 개의 FR로 구성되며, 아미노-말단에서 카르복시-말단으로 다음 순서로 배치된다: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.
항체의 불변 영역은 숙주 조직 도는 인자에 항체의 결합을 매개할 수도 있으며, 면역계의 다양한 세포 (예를 들어, 효과기 세포), Fc 수용체 (FcRs) 및 고전적 보체 시스템의 제1 성분 (C1q)을 포함한다. FcR 및 C1q에 결합은 ADCC 또는 CDC와 같은 효과를 매개할 수도 있다.
본 발명의 항체는 NKG2A 결합 항체, humZ270 항체 (SEQ ID NO 2 및 SEQ ID NO 3) 또는 humZ199 항체 (SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5) 또는 본 발명의 어떤 다른 항체, 또는 이들 항체 중 어느 하나의 변이체도 될 수 있다
여기에 사용된 바와 같이, 용어 사람화된 Z270 또는 humZ270 또는 hZ270은 특허 출원 WO08009545에서 개시된 항체를 포함하며, 이것은 본 출원에 참고로 포함된다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 사람화된 Z199 또는 humZ199는 특허 공개 WO09092805에 개시된 항체를 포함하며 본 특허 출원에 참고로 포함된다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 Ab는 항체, 또는 이들의 단편을 포함하며, 이것은 특이적으로 그것의 해당 Ag에 결합한다. 항원-결합 단편의 예는 분리된 CDR 또는 항원-결합 잔기 또는 폴리펩티드가 기능적 항체 단편을 형성하기 위해 함께 결합하거나 연결될 수 있는 경우, Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, Fv (전형적으로 항체의 단일 팔의 VL 및 VH 도메인), 단일 사슬 Fv (scFv; 예를 들어, Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; 및 Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883을 참고하면 된다), dsFv, Fd (전형적으로 VH 및 CH1 도메인), 및 dAb (전형적으로 VH 도메인) 단편; VH, VL, VhH, 및 V-NAR 도메인; 단일 VH 및 단일 VL 사슬을 포함하는 1가 분자; 미니바디 (minibody), 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody), 테트라바디 (tetrabody), 및 카파 바디 (예를 들어, Ill et al. Protein Eng 1997;10:949-57을 참고하면 된다); 낙타 IgG; IgNAR; 뿐만 아니라 하나 이상의 분리된 CDR 또는 기능적 파라토프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 다양한 타입의 항체 단편은, 예를 들어, Holliger and Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, 및 공개된 미국 특허 출원 20050238646 및 20020161201에 설명되거나 재논의되었다.
용어 항체의 "항원-결합 단편"은 여기에 설명된 바와 같이 NKG2A 또는 또 다른 표적 분자와 같은 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 보유한 항체의 하나 이상의 단편을 나타낸다. 항체의 항원-결합 기능은 전체-길이 항체의 단편에 의해 수행될 수 있다는 것이 나타났다. 용어 항체의 "항원 결합 단편" 내에 포함되는 결합 단편의 예는 Fab 단편, F(ab')2 단편, Fab' 단편, Fd 단편, Fv 단편, ScFv 단편, dAb 단편 및 분리된 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. scFv와 같은 단일 사슬 항체 및 VHH 및 단일 도메인 낙타 항체와 같은 중쇄 항체는 또한 용어 항체의 "항원-결합 부분" 내에 포함되기 위한 것이다. 이들 항체 단편은 당업자에게 알려진 통상적인 기술을 사용하여 얻어질 수도 있으며, 단편은 온전한 항체와 같은 방식으로 활용을 위해 스크리닝 될 수도 있다.
"Fab" 단편은 경쇄의 가변 도메인 및 불변 도메인 및 중쇄의 가변 도메인 및 제1 불변 도메인 (CH1)을 포함한다. Fab' 단편은 중쇄 또는 경쇄에 대한 하나 이상의 시스테인 카르복시 말단 결합을 포함한다. F(ab')2 항체 단편은 일반적으로 힌지 시스테인에 의해 그것들의 카르복시 말단 근처에서 공유결합에 의해 결합된 Fab 단편의 쌍을 포함한다. 항체 단편의 다른 화학적 커플링 (coupling)은 또한 업계에 알려져 있다. Fab 단편은 잠재적으로 낮은 친화도로 그것의 항원에 결합하는 모체 항체의 능력을 보유한다. F(ab')2 단편은 2가 결합할 수 있는 반면에, Fab 단편은 1가로만 결합할 수 있다. 일반적으로, Fab 단편은 Fc 수용체와 상호작용이 발생하는 경우, 불변 CH2 및 CH3 도메인, 즉, Fc 부분이 없다. 따라서, Fab는 일반적으로 효과기 기능이 전혀 없다.
"Fv" 단편은 완벽한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이고, 일반적으로 자연에서, 예를 들어, 단일 사슬 가변 도메인 단편 (scFv)에서 공유결합될 수 있는 단단하게 결합된 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 도메인의 다이머를 포함한다. 각각의 가변 도메인의 세 개의 초가변 영역이 VH-VL 다이머의 표면상의 항원-결합 부위를 정의하기 위해 상호작용한다는 것은 이 구성에 해당한다. 종합해보면, 여섯 개의 초가변 영역 또는 이들의 서브세트는 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 하지만, 항원에 특이적인 세 개의 초가변 영역만을 포함하는 단일 가변 도메인은 항원을 인식하고 이에 결합하는 능력을 갖지만, 보통 전체 결합 부위보다 더 낮은 친화도를 갖는다 (Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). 예를 들어, 중쇄 가변 도메인 (VHH)만을 갖는 자연 발생한 카멜리드 (camelid) 항체는 항원에 결합할 수 있다 (Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; Bond et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).
"단일-사슬 Fv" 또는 "scFv" 항체 단편은 이들 도메인이 단일 폴리펩티드 사슬에 존재하는 경우, 항체의 VH 및 VL 도메인을 포함한다. 일반적으로, Fv 폴리펩티드는 scFv가 항원 결합을 위해 원하는 구조를 형성할 수 있게 하는 VH 및 VL 도메인 사이의 폴리펩티드 결합자를 더 포함한다. scFv의 재논의를 위해, Pluckthun, 1994, In: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg and Moore eds. Springer-Verlag, New York, pp. 269-315를 참고하면 된다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 작은 항체 단편을 나타내며, 여기에서 단편은 같은 폴리펩티드 사슬 (VH 및 VL)에서 경쇄 가변 도메인 (VL)에 연결된 중쇄 가변 도메인 (VH)을 포함한다.
같은 사슬 상의 두 개의 가변 도메인 사이에서 페어링 (pairing)을 허용하기에 너무 짧은 결합자를 사용함으로써, 가변 도메인은 또 다른 사슬의 상보성 도메인과 강제로 짝을 이룬다. 디아바디는, 예를 들어, EP 404,097; WO 93/11161; 및 Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448에서 더 충분히 설명된다.
표현 "선형 항체"는 Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10):1057-1062에 설명된 항체를 나타낸다. 간략히 말해, 이들 항체는 상보성 경쇄 폴리펩티드와 함께, 항원 결합 영역의 짝을 형성하는 탠덤 (tandem) Fd 세그먼트 (VH-CH1-VH-CH1)의 짝을 함유한다. 선형 항체는 이중 특이적 또는 단일특이적일 수 있다.
용어 "모노바디 (monobody)"는 여기에 사용된 바와 같이, 중쇄 가변 도메인을 갖지만 경쇄 가변 도메인을 갖지 않는 항원 결합 분자를 나타낸다. 모노바디는 경쇄의 부재시 항원에 결합할 수 있고 전형적으로 세 개의 초가변 영역, 예를 들어, CDRH1, CDRH2, 및 CDRH3으로 지정된 CDR을 갖는다. 중쇄 IgG 모노바디는 이황화 결합에 의해 연결된 두 개의 중쇄 항원 결합 분자를 갖는다. 중쇄 가변 도메인은 하나 이상의 초가변 영역, 바람직하게 CDRH3 또는 HVL-H3 영역을 포함한다.
용어 "초가변 영역"은, 여기에 사용될 때, 항원-결합의 원인이 되는 항체의 아미노산 잔기를 나타낸다. 초가변 영역은 "상보성-결정 영역" 또는 "CDR"의 아미노산 잔기 (서열에 의해 경쇄 가변 도메인에서 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 31-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3)로 정의됨; Kabat et al., Sequences of 단백질 of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) 및/또는 "초가변 루프 (loop)"의 잔기 (구조에 의해 정의되고 각 항체에 대하여 다르다; 예를 들어: Chothia and Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196:901-917을 참고하면 된다)를 포함한다. 한 예에서, HVL 잔기는 경쇄 가변 도메인에서 26-32 (L1), 50-52 (L2) 및 91-96 (L3) 및 중쇄 가변 도메인에서 26-32 (H1), 53-55 (H2) 및 96-101 (H3)을 포함할 수 있다.
항체 단편은 통상적인 재조합 또는 단백질 조작 기술을 사용하여 얻어질 수도 있고, 단편은 온전한 항체와 같은 방식으로, NKG2ADP 결합, 또는 또 다른 기능에 대하여 스크리닝 될 수 있다.
본 발명의 항체 단편은 절단에 의해, 예를 들어, 폴리펩티드의 N 및/또는 C-말단 끝으로부터 하나 이상의 아미노산의 제거에 의해 만들어질 수도 있다. 단편은 또한 하나 이상의 내부 결실에 의해 생성될 수도 있다.
본 발명의 항체는 항-NKG2A 항체, humZ270 항체 (SEQ ID NO 2 및 SEQ ID NO 3) 또는 humZ199 항체 (SEQ ID NO 4 및 SEQ ID NO 5) 또는 본 발명의 어떤 다른 항체, 또는 이들 항체 중 어느 하나의 변이체의 단편일 수도 있거나, 포함할 수도 있다. 예를 들어, 본 발명의 항체는 이들 항체 또는 이들의 변이체 중 하나의 Fab 단편일 수도 있거나, 그것은 이들 항체, 또는 이들의 변이체 중 하나로부터 유도된 단일 사슬 항체일 수도 있다.
본 발명의 항체는 사람 항체 또는 사람화된 항체일 수도 있다. 용어 "사람 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 가변 영역을 갖는 항체를 포함하기 위한 것이며, 여기에서 프레임워크 및 CDR 영역 둘 다가 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 게다가, 항체가 불변 영역을 함유하면, 불변 영역은 또한 사람 생식세포 면역글로불린 서열로부터 유도된다. 본 발명의 사람 항체는 사람 생식세포 면역글로불린 서열에 의해 암호화되지 않는 아미노산 잔기 (예를 들어, 시험관 내에서 무작위 또는 부위-특이적 돌연변이 유발 또는 생체 내에서 체세포 돌연변이에 의한 돌연변이)를 포함할 수도 있다. 반면에, 용어 "사람 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 항체를 포함하기 위한 것이며 여기에서 마우스와 같은 또 다른 포유동물 종의 생식세포로부터 유도된 CDR 서열이 사람 프레임워크 서열로 이식된 항체를 포함하기 위한 것이 아니다.
이러한 사람 항체는 사람 단클론성 항체일 수도 있다. 이러한 사람 단클론성 항체는 불멸화된 세포에 융합된 사람 중쇄 이식유전자 및 경쇄 이식유전자를 포함하는 게놈을 갖는 형질변환 비사람 동물, 예를 들어, 형질변환 마우스로부터 얻은 B 세포를 포함하는 히브리도마 (hybridoma)에 의해 생성될 수도 있다.
사람 항체는 사람 생식세포 서열의 선택으로 구성된 서열 라이브러리로부터 분리될 수도 있으며, 천연 및 합성 서열 다양성으로 더 다양화된다.
사람 항체는 사람 림프구의 시험관 내 예방 접종에 의해 제조된 후 이어서 엡스타인-바 바이러스 (Epstein-Barr virus)로 림프구의 형질전환될 수도 있다.
용어 "사람 항체 유도체"는 사람 항체의 어떤 변형된 형태, 예를 들어, 항체 및 또 다른 약제 또는 항체의 콘쥬게이트 (conjugate)도 나타낸다.
용어 "사람화된 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 비-사람 면역글로불린으로부터 유도된 최소 서열 (CDR 영역)을 함유하는 사람/비-사람 키메라 항체를 나타낸다. 사람화된 항체는, 따라서, 사람 면역글로불린 (수령체 항체)이며 여기에서 수령체의 초가변 영역의 잔기는 마우스, 래트, 토끼, 또는 비-사람 영장류와 같은 비-사람 종의 초가변 영역의 잔기 (기증체 항체)로 대체되고, 이것은 워하는 특이성, 친화도, 및 수용력을 갖는다. 일부 예에서, 사람 면역글로불린의 FR 잔기는 해당 비-사람 잔기에 의해 대체된다. 이러한 변형의 예는 하나 이상의 소위 역돌연변이 (back-mutation)의 도입이다.
게다가, 사람화된 항체는 수령체 항체 또는 기증체 항체에서 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이들 변형은 항체 성능을 더 개선하도록 만들어진다. 일반적으로, 사람화된 항체는 적어도 하나, 및 전형적으로 두 개의 가변 도메인 중 실질적으로 모두를 포함할 것이며, 여기에서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-사람 면역글로불린의 그것에 해당하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 잔기는 사람 면역글로불린 서열의 그것이다. 사람화된 항체는 또한 임의로 면역글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 사람 면역글로불린의 그것을 포함할 수 있다.
용어 "키메라 항체"는, 여기에 사용된 바와 같이, 경쇄 및 중쇄 유전자가 다른 종으로부터 기원한 면역글로불린 가변 및 불변 영역 유전자로부터, 전형적으로 유전자 조작에 의해 구성된 항체를 나타낸다. 예를 들어, 마우스 단클론성 항체의 유전자의 가변 세그먼트는 사람 불변 세그먼트에 결합될 수도 있다.
항체의 단편 결정화 가능 영역 ("Fc 영역"/"Fc 도메인")은 불변 CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 항체의 "꼬리" 영역이다. Fc 도메인은 Fc 수용체로 불리는 세포 표면 수용체, 뿐만 아니라 보체 시스템의 일부 단백질과 상호작용할 수도 있다. Fc 영역은 항체가 면역계를 활성화하는 것을 가능하게 한다. 본 발명의 한 양태에서, 항체는 Fc 영역 내에 변형을 포함하도록, 전형적으로 그것의 기능적 속성 중 하나 이상, 예를 들어, 혈청 반감기, 보체 고정, Fc-수용체 결합, 단백질 안정성 및/또는 항원-의존적 세포 독성, 또는 이들의 결핍을 변형하도록 조작될 수도 있다. 게다가, 본 발명의 항체는 화학적으로 변형될 수도 있거나 (예를 들어, 하나 이상의 화학적 모이어티가 항체에 부착될 수 있다) 항체의 하나 이상의 기능적 속성을 다시 변화시키기 위해 그것의 글리코실화를 변화시키도록 변형될 수도 있다. 바람직하게, 변형된 Fc 도메인은 각각 특정 Fc 수용체 (L234A, L235E, 및 G237A)에 대하여 감소한 친화도 및 감소한 C1q-매개된 보체 고정 (A330S 및 P331S)을 발생시키는 다음 돌연변이 중 하나 이상, 바람직하게 모두를 포함한다.
본 발명의 항체의 이소타입은 IgG, 예를 들어 IgG1, 예를 들어 IgG2, 예를 들어 IgG4일 수도 있다. 원하면, 항체의 등급은 알려진 기술에 의해 "스위치"될 수도 있다. 예를 들어, 원래 IgM 분자로서 생성된 항체는 IgG 항체로 등급 스위치될 수도 있다. 등급 스위치 기술은 또한 IgG 하위 등급을 또 다른 것으로, 예를 들어, IgG1에서 IgG2 또는 IgG4로; IgG2에서 IgG1 또는 IgG4로; 또는 IgG4에서 IgG1 또는 IgG2로 전환하기 위해 사용될 수도 있다. 다른 IgG 하위 등급의 영역의 조합에 의해 불변 영역 키메라 분자를 생성하기 위한 항체의 조작이 또한 수행될 수 있다.
용어 "에피토프"는, 여기에 사용된 바와 같이, 항체 (Ab), 및 그것의 해당 "항원" (Ag)과 같은 항원 결합 폴리펩티드 사이의 분자적 상호작용의 맥락에서 정의된다. 용어 항원 (Ag)은 Ag를 인식하는 항체 (Ab)를 생성하기 위해 면역능력이 있는 척추동물의 면역화에 사용된 분자적 실체물을 나타낸다. 여기에서, Ag는 더 광범위하게 불리고 일반적으로 Ab에 의해 특이적으로 인식된 표적 분자를 포함하기 위한 것이며, 따라서 Ab를 증가시키는 면역화 과정에 사용된 분자의 단편 또는 모방체를 포함한다.
일반적으로, "에피토프"는 Ab가 특이적으로 결합하는 Ag 상의 구역 또는 영역, 즉, Ab에 물리적으로 접촉된 구역 또는 영역을 나타낸다. 단백질 에피토프는 Ab (또한 에피토프의 면역 우성 성분으로 불림) 및 다른 아미노산 잔기에 결합에 직접적으로 수반된 Ag의 아미노산 잔기를 포함할 수도 있으며, 이것은 Ab에 의해 효과적으로 차단되는 Ab의 아미노산 잔기와 같이, 결합에 직접적으로 수반되지 않는다 (다시 말해서, 아미노산 잔기는 Ab의 "용매-제외 표면" 및/또는 "발자국" 내에 있다). 용어 에피토프는 여기에서 달리 진술되지 않으면, 항-NKG2A 항체, 또는 본 발명에 따르는 또 다른 NKG2A-특이적 약제에 특이적으로 결합하는 NKG2A의 어느 특정 영역에서 두 가지 타입의 결합 부위를 포함한다 (예를 들어, 일부 맥락에서, 본 발명은 특정 아미노산 잔기에 직접적으로 결합하는 항체에 관한 것이다). NKG2A는 많은 다른 에피토프를 좋아할 수도 있으며, 이것은 (1) 선형 펩티드 에피토프, (2) 성숙한 NKG2A 구조에서 서로 근처에 위치한 하나 이상의 비-인접한 아미노산으로 구성된 구조적 에피토프, 및 (3) 탄수화물 기와 같이, 전체 또는 일부가, NKG2A에 공유 결합에 의해 부착된 분자 구조로 구성된 번역 후 에피토프를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
특정 항체 (Ab)/항원 (Ag) 쌍에 대한 에피토프는 다양한 실험적 및 컴퓨터를 사용한 에피토프 매핑 (mapping) 방법을 사용하여 다른 세부 수준에서 정의되고 특성화될 수 있다. 실험적 방법은 돌연변이 유발, X-선 결정학, 핵 자기 공명 (Nuclear Magnetic Resonance; NMR) 분광학, 수소 중수소 교환 질량 분석 (HX-MS) 및 다양한 경쟁 결합 방법; 업계에 알려진 방법. 각각의 방법은 고유의 원칙에 의존하기 때문에, 에피토프의 설명은 그것이 결정된 방법에 밀접하게 연결된다. 따라서, 이용된 에피토프 매핑 방법에 의존하여, 특정 Ab/Ag 쌍에 대한 에피토프는 다르게 정의될 것이다.
그것의 가장 세부적인 수준에서, Ag 및 Ab 사이의 상호작용에 대한 에피토프는 Ag-Ab 상호작용에 존재하는 원자의 접촉, 뿐만 아니라 결합 열역학에 대한 그것들의 상대적인 기여에 대한 정보를 정의하는 공간 좌표에 의해 정의될 수 있다. 덜 세부적인 수준에서, 에피토프는 Ag 및 Ab 사이의 원자 접촉을 정의하는 공간 좌표에 의해 특성화될 수 있다. 덜 세부적인 수준에서, 에피토프는 Ab 및 Ag의 원자 사이의 거리와 같은 특정 기준에 의해 정의된 바와 같이 그것을 포함하는 아미노산 잔기에 의해 특성화될 수 있다. 추가로 덜 세부적인 수준에서, 에피토프는 기능을 통해, 예를 들어, 다른 Ab와 경쟁적 결합에 의해 특성화될 수 있다. 에피토프는 또한 더 일반적으로 또 다른 아미노산에 의한 치환이 Ab 및 Ag 사이의 상호작용의 특성을 변화시키는 아미노산 잔기를 포함하는 바와 같이 정의될 수 있다.
Ab, 예를 들어, Fab 단편, 및 그것의 Ag 사이의 복합체의 공간 좌표에 의해 정의된 X-선 유도된 결정 구조의 맥락에서, 용어 에피토프는 여기에서, 달리 명시되거나 문맥에 의해 부정되지 않으면, Ab의 중원자로부터 4Å의 거리 내에 중원자 (즉, 비-수소 원자)를 가짐으로써 특성화된 NKG2A 잔기로서 특이적으로 정의된다.
에피토프의 설명 및 정의가, 사용된 에피토프 매핑 방법에 의존하여, 다른 세부 수준으로 얻어진다는 사실로부터, 같은 Ag 상의 다른 Ab에 대한 에피토프의 비교가 다른 세부 수준으로 유사하게 실행될 수 있다는 것을 따른다.
예를 들어, X-선 구조로부터 결정된, 아미노산 수준에서 설명된 에피토프는 그것들이 같은 세트의 아미노산 잔기를 함유하면 동일한 것이라고 한다. 에피토프는 적어도 하나의 아미노산이 에피토프에 의해 공유되지 않으면 중복인 것이라고 한다. 에피토프는 아미노산 잔기가 에피토프에 의해 공유되지 않으면 별도인 (유일한) 것이라고 한다.
경쟁 결합에 의해 특성화된 에피토프는 해당 Ab의 결합이 서로 배타적이면 중복되는 것이라고 한다, 즉, 하나의 Ab의 결합이 다른 Ab의 동시 결합을 제외한다. 에피토프는 Ag가 해당 Ab 둘 다에 동시 결합을 제공할 수 있으면 별도인 (유일한) 것이라고 한다.
용어 "파라토프"의 정의는 "에피토프"의 상기 정의로부터 관점을 반전시킴으로써 유도된다. 따라서, 용어 "파라토프"는 Ag가 특이적으로 결합하는, 즉, 그것이 Ag에 물리적 접촉하는 Ab 상의 구역 또는 영역을 나타낸다.
Ab, 예를 들어, Fab 단편, 및 그것의 Ag 사이의 복합체의 공간 좌표에 의해 정의된, X-선 유도된 결정 구조의 맥락에서, 용어 파라토프는 여기에서, 달리 명시되거나 문맥에 의해 부정되지 않으면, NKG2A의 중원자로부터 4Å의 거리 내에 중원자 (즉, 비-수소 원자)를 가짐으로써 특성화된 aG 잔기로서 특이적으로 정의된다.
특정 항체 (Ab)/항원 (Ag) 쌍에 대한 에피토프 및 파라토프는 통상적인 방법에 의해 확인될 수도 있다. 예를 들어, 에피토프의 일반적인 위치는 다른 단편 또는 변이체 NKG2A 폴리펩티드에 결합하는 항체의 능력을 평가함으로써 결정될 수도 있다. 항체 (에피토프)와 접촉하는 NKG2A 내에 특이적 아미노산 및 NKG2A (파라토프)와 접촉하는 항체의 특이적 아미노산은 또한 통상적인 방법을 사용하여 결정될 수도 있다. 예를 들어, 항체 및 표적 분자는 결합될 수도 있고 Ab/Ag 복합체는 결정화될 수도 있다. 복합체의 결정 구조는 항체 및 그것의 표적 사이의 상호작용의 특정 부위를 확인하기 위해 결정되거나 사용될 수도 있다.
같은 항원에 결합하는 항체는 그것들의 공통 항원에 동시에 결합하는 능력에 관하여 특성화될 수 있고 "비닝 (binning)"을 받을 수도 있다. 본 맥락에서 용어 "비닝"은 같은 항원에 결합하는 항체를 그룹화하는 방법을 나타낸다. 항체의 "비닝"은 표면 플라스몬 공명 (Surface Plasmon Resonance; SPR), ELISA 또는 유동 세포분석법과 같은 표준 기술에 기초하는 검정에서 두 개의 항체의, 그것들의 공통 항원에 대한 경쟁 결합에 기초할 수도 있다.
"빈 (bin)"은 참조 항체로서 정의된다. 2차 항체가 참조 항체와 같은 시간에 항원에 결합할 수 없으면, 2차 항체는 참조 항체와 같은 "빈"에 속한다고 한다. 이 경우에 참조 및 2차 항체는 항원에 대한 결합에 대하여 경쟁하고, 따라서 항체의 짝은 "경쟁 항체"로 불린다. 2차 항체가 참조 항체와 같은 시간에 항원에 결합할 수 있으면, 2차 항체는 별도의 "빈"에 속한다고 한다. 이 경우에 참조 및 2차 항체는 항원에 대한 결합에 대하여 경쟁하지 않고, 따라서 항체의 쌍은 "비-경쟁 항체"로 불린다.
항체 "비닝"은 에피토프에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않는다. 경쟁 항체, 즉, 같은 "빈"에 속하는 항체는 동일한 에피토프, 중복 에피토프 또는 별도의 에피토프를 가질 수도 있다. 후자는 2차 항체가 항원 상에서 그것의 에피토프에 접촉하기 위해 필요한 공간을 항원 상의 에피토프에 결합된 참조 항체가 흡수하는 경우이다 ("입체 장해 (steric hindrance)"). 비-경쟁 항체는 별도의 에피토프를 갖는다.
용어 "결합 친화도"는 여기에서 두 개의 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이들의 단편, 및 항원 사이의 비-공유 상호작용의 강도의 측정값으로서 사용된다. 용어 "결합 친화도"는 1가 상호작용 (고유한 활성)을 설명하기 위해 사용된다.
1가 상호작용을 통해, 두 개의 분자, 예를 들어, 항체, 또는 이들의 단편, 및 항원 사이의 결합 친화도는 해리 상수 (KD)의 결정에 의해 정량화될 수도 있다. 차례로, KD는 복합체 형성 및 해리의 동역학의 측정에 의해, 예를 들어, SPR 방법에 의해 결정될 수 있다.
1가 복합체의 결합 및 해리에 해당하는 속도 상수는 각각 결합 속도 상수 ka (또는 kon) 및 해리 속도 상수 kd (또는 koff)로서 나타난다. KD는 방정식 KD = kd / ka를 통해 ka 및 kd와 관련된다.
상기 정의에 따라, 다른 분자 상호작용에 연관된 결합 친화도, 예를 들어, 특정 항원에 대한 다른 항체의 결합 친화도의 비교는 개개의 항체/항원 복합체에 대한 KD 값의 비교에 의해 비교될 수도 있다.
유사하게, 상호작용의 특이성은 원하지 않는 상호작용의 KD 값을 가지고, 원하는 상호작용, 예를 들어, 항체 및 항원 사이의 특이적 상호작용에 대한 KD 값의 결정 및 비교에 의해 평가될 수도 있다.
전형적으로, 표적에 관한 항체에 대한 KD는 관련 없는 물질 또는 환경에서 동반된 물질과 같은 다른, 비-표적 분자에 관한 KD보다 2배, 바람직하게 5배, 더 바람직하게 10배 더 낮을 것이다. 더 바람직하게, KD는 50배 미만, 예를 들어, 100배 미만, 또는 200배 미만; 더 바람직하게 500배 미만, 예를 들어, 1,000배 미만, 또는 10,000배 미만일 것이다.
이 해리 상수의 값은 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 표적에 대한 항체와 같은 리간드의 결합 능력을 평가하기 위한 표준 검정에 의해 직접적으로 결정될 수 있으며, 이것은 업계에 잘 알려져 있고 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯, RIA, 및 유동 세포분석법을 포함한다.
경쟁 결합 검정이 실행될 수 있으며 여기에서 표적에 대한 항체의 결합은 상기 표적의 또 다른 리간드, 예를 들어, 또 다른 항체에 의한 표적의 결합과 비교된다.
본 발명의 항체는 1 x 10-7M 미만, 1 x 10-8M 미만, 또는 1 x 10-9M 미만, 또는 1 x 10-10M 미만, 1 x 10-11M 미만, 또는 1 x 10-12M 미만의, 그것의 표적에 대한 KD를 가질 수도 있다. 본 발명의 항체의 KD는 0.8 nM 미만, 예를 들어, 0.7 nM 미만, 예를 들어, 0.6 nM 미만, 예를 들어, 0.5 nM 미만, 예를 들어, 0.4 nM 미만, 예를 들어, 0.3 nM 미만, 예를 들어, 0.2 nM 미만, 예를 들어, 0.1 nM 미만, 예를 들어, 0.05 nM 미만, 예를 들어, 0.025 nM 미만, 예를 들어, 0.015 nM 미만, 예를 들어, 0.015 nM 및 0 nM 사이일 수도 있다.
업계에 알려진 바와 같이 용어 "동일성"은 서열을 비교함으로써 결정된, 둘 이상의 폴리펩티드의 서열 사이의 관계를 나타낸다. 업계에서, "동일성"은 또한 둘 이상의 아미노산 잔기의 스트링 (string) 사이의 일치의 수에 의해 결정된, 폴리펩티드 사이의 서열 관련성의 정도를 의미한다. "동일성"은 특정 수학 모델 또는 컴퓨터 프로그램 (즉, "알고리즘")에 의해 지시된 갭 정렬 (gap alignment)(있으면)을 갖는 둘 이상의 서열 중 더 작은 것들 사이의 동일한 일치의 퍼센트를 측정한다. 관련된 폴리펩티드의 동일성은 알려진 방법에 의해 쉽게 계산될 수 있다. 이러한 방법은 Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part 1, Griffin, A. M., and Griffin, H. G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. and Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; 및 Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988)에 설명된 것들을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
동일성을 결정하는 바람직한 방법은 테스트 된 서열 사이의 가장 큰 일치를 제공하도록 설계된다. 동일성을 결정하는 방법은 공개적으로 이용 가능한 컴퓨터 프로그램에서 설명된다. 두 개의 서열 사이에서 동일성을 결정하는 바람직한 컴퓨터 프로그램 방법은 GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, 및 FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990))를 포함하는 GCG 프로그램 패키지를 포함한다. BLASTX 프로그램은 국립 생물 정보 센터 (National Center for Biotechnology Information; NCBI) 및 다른 공급원 (BLAST Manual, Altschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., 상기)에서 공개적으로 이용 가능하다. 잘 알려진 Smith Waterman 알고리즘은 또한 동일성을 결정하기 위해 사용될 수도 있다.
예를 들어, 컴퓨터 알고리즘 GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)을 사용하여, 퍼센트 서열 동일성이 결정되는 두 개의 폴리펩티드는 그것들의 각각의 아미노산의 최적의 일치를 위해 정렬된다 (알고리즘에 의해 결정된, "일치 범위"). 갭 오프닝 패널티 (gap opening penalty) (이것은 3번의 평균 대각선으로서 계산된다; "평균 대각선"은 사용되는 비교 매트릭스의 대각선의 평균이다; "대각선"은 특정 비교 매트릭스에 의해 각각의 완벽한 아미노산 일치에 할당된 점수 또는 수이다) 및 갭 연장 패널티 (gap extension penalty) (이것은 보통 갭 오프닝 패널티의 1/10배이다), 뿐만 아니라 PAM 250 또는 BLOSUM 62와 같은 비교 매트릭스가 알고리즘과 함께 사용된다.
표준 비교 매트릭스 (PAM 250 비교 매트릭스에 대하여 Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supp.3 (1978); BLOSUM 62 비교 매트릭스에 대하여 Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992)를 참고하면 된다)는 또한 알고리즘에서 사용된다.
펩티드 서열 비교를 위한 바람직한 파라미터는 다음을 포함한다:
알고리즘: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); 비교 매트릭스: Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992)의 BLOSUM 62; 갭 패널티 (Gap Penalty): 12, 갭 길이 패널티 (Gap Length Penalty): 4, 유사성 임계값: 0.
GAP 프로그램은 상기 파라미터가 유용하다. 상기 언급된 파라미터는 GAP 알고리즘을 사용하여 펩티드 비교를 위한 디폴트 (default) 파라미터 (마지막 갭에 대한 패널티가 없음)이다.
용어 "유사성"은 관련된 개념이지만, "동일성"과 달리, 동일한 일치 및 보존적 치환 일치 둘 다를 포함하는 서열 관계를 나타낸다. 두 개의 폴리펩티드 서열이, 예를 들어, (분획 (10/20)) 동일한 아미노산을 가지고, 나머지가 모두 비-보존적 치환이면, 퍼센트 동일성 및 유사성은 둘 다 50%일 것이다. 같은 예에서, 보존적 치환인 5개 이상의 위치가 있으면, 퍼센트 동일성은 50%를 유지하지만, 퍼센트 유사성은 75%일 것이다 ((분획 (15/20))). 그러므로, 보존적 치환이 있는 경우에, 두 개의 폴리펩티드 사이의 유사성의 정도는 상기 두 개의 폴리펩티드 사이의 퍼센트 동일성보다 더 높을 것이다.
"수용체"는 세포의 표면상에 또는 내부에 존재하는 분자 구조로서 정의된다. 수용체는 리간드가 결합할 때, 특유의 세포 반응, 즉, 생물학적 활성을 생성한다. 수용체에 대한 "리간드"는 수용체에 선택적으로 결합할 수 있는 어떤 분자 (예를 들어, 펩티드, 폴리펩티드, 탄수화물, 저분자 또는 이온)로도 정의된다. 작용성 리간드 ("작용제")는 어느 정도 수용체에 결합시 수용체에 대한 특유의 반응을 유발할 수 있는 리간드이다. 길항적 리간드 ("길항제")는 수용체에 결합하는 능력을 갖고 작용제, 예를 들어, 수용체의 천연 리간드의 작용을 어느 정도 차단하는 리간드이다.
NKG2A (OMIM 161555, 이것의 전체 개시는 본원에 참고로 포함된다)는 전사물의 NKG2 그룹의 멤버이다 (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A는 25 KB에 걸친 7개의 엑손에 의해 암호화되며, 일부 차등적 스플라이싱 (splicing)을 나타낸다. CD94와 함께, NKG2A는 헤테로다이머 억제 수용체 CD94/NKG2A를 형성하며, NK 세포, α/β T 세포, γ/δ T 세포, 및 NKT 세포의 서브세트의 표면상에서 발견되었다. 억제 KIR 수용체와 유사하게, 그것은 그것의 세포질 도메인에 ITIM을 소유한다. 여기에 사용된 바와 같이, "NKG22A"는 NKG2A 유전자의 어떤 변이체, 유도체, 또는 이소폼 (isoform) 또는 암호화된 단백질을 나타낸다. 또한
야생형, 전체 길이 NKG2A와 하나 이상의 생물학적 속성 또는 기능을 공유하고, 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성을 공유하는 어떤 핵산 또는 단백질 서열도 포함된다. 사람 NKG2A는 3개의 도메인에서 233개의 아미노산을 포함하며, 세포질 도메인은 다음 서열의 잔기 1-70을 포함하고, 막관통 영역은 잔기 71-93을 포함하고, 세포외 영역은 잔기 94-233을 포함한다:
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO:1).
HLA-E (OMIM 143010, 이것의 전체 개시는 본원에 참고로 포함된다)는 세포 표면상에서 발현되는 비고전적 MHC 분자이고 다른 MHC 등급 I 분자의 신호 서열로부터 유도된 펩티드의 결합에 의해 조절된다. HLA-E는 자연 살해 (NK) 세포 및 일부 T 세포와 결합하며, CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, 및 CD94/NKG2C에 특이적으로 결합한다 (예를 들어, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799를 참고하면 되고, 이것의 전체 개시는 본원에 참고로 포함된다). HLA-E의 표면 발현은 CD94/NKG2A+ NK, T, 또는 NKT 세포 클론에 의한 용해로부터 표적 세포를 보호하기 위해 충분하다. 여기에 사용된 바와 같이, "HLA-E는 HLA-E 유전자 또는 암호화된 단백질의 어떤 변이체, 유도체, 또는 이소폼도 나타낸다. 또한 야생형, 전체 길이 HLA-E와 하나 이상의 생물학적 속성 또는 기능을 공유하고 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산 동일성을 공유하는 어떤 핵산 또는 단백질 서열도 포함한다.
본 발명의 맥락에서, "사람 CD94/NKG2A 수용체에 결합하는 약제" 또는 "항-NKG2A 항체" 또는 "NKG2A 결합 항체"는 약제 및/또는 항체가 CD94/NKG2A 또는 NKG2A의 존재시 배양되는 어떤 표준 검정을 사용하여 사람 CD94/NKG2A 수용체에 검출 가능하게 결합하는 어떤 약제 및/또는 항체도 나타내고 결합은, 예를 들어, 방사성 동위원소 표지, 질량 분석과 같은 물리학적 방법, 또는, 예를 들어, 혈구 형광계 분석 (cytofluorometric analysis) (예를 들어, FACScan)을 사용하여 검출된 직접적 또는 간접적 형광 표지를 통해 검출된다.
용어 사람화된 Z270 또는 humZ270 또는 hZ270은 여기에 사용된 바와 같이, 특허 출원 WO08009545에 개시된 항체 (SEQ ID NO 2 및 SEQ ID NO 3)를 포함하며, 이것은 본 출원에 참고로 포함된다. 용어 사람화된 Z199 또는 humZ199는 여기에 사용된 바와 같이, 특허 공개 WO09092805에 개시된 항체 (SEQ ID NO 4. 및 SEQ ID NO 5)를 포함하며, 이것은 본 특허 출원에 참고로 포함된다.
"지연 그룹"/"반감기 연장 모이어티"/"반감기 연장 모이어티"는 여기에서 -SH, -OH, -COOH, -CONH2, -NH2와 같이 하나 이상의 아미노산 부위 사슬 기능에 부착된 하나 이상의 화학기, 또는 하나 이상의 N- 및/또는 O-글리칸 구조로 및 이들 단백질/펩티드에 콘쥬게이트 될 때 치료적 단백질/펩티드의 생체 내 순환 반감기를 증가시킬 수 있다는 것으로 생각된다. "지연 그룹"의 예는 생체 적합성 지방산 및 이들의 유도체, 히드록시 알킬 전분 (HAS) 예를 들어, 히드록시 에틸 전분 (HES), 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG), 폴리 (Glyx-Sery)n (HAP), 히알루론산 (HA), 헤파로산 폴리머 (HEP), 포스포릴콜린-기반 폴리머 (PC 폴리머), 플렉시머, 덱스트란, 폴리시알산 (PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 펩티드, XTEN 폴리머, 알부민 결합 펩티드, CTP 펩티드, 및 이들의 어떤 조합도 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
용어 "NKG2A Fc 융합 단백질"은 여기에서 어떤 항체 이소타입으로부터 유도될 수 있는 Fc 도메인에 융합된 NKG2A를 포함한다는 것을 의미한다.
염증은 병원체, 손상된 세포, 또는 자극물을 포함하는, 다양한 자극에 대한 조직의 복합적 생물학적 반응이다. 염증은 유해한 자극을 제거하거나 분리하고 치유 과정을 시작하는, 유기체에 의한 보호적 반응이다. 염증은 감염과 동의어가 아니다 - 감염은 외인성 병원체에 의한 유기체의 침입인 한편, 염증은 병원체에 대한 면역계의 반응이다.
염증은 맥관구조 (예를 들어, 내피 세포, 혈관주위세포, 평활근 세포), 면역계의 세포 (예를 들어, T 및 B 림프구, 단핵구, 수지상세포, 호중구), 세포-유도된 가용성 매개자 (시토킨, 케모킨) 및 또한 표적화된 조직에 상주하는 세포 (예를 들어, 상피 세포, 활액 섬유아세포, 신경 세포)를 포함하는, 다수의 성분을 수반하는 이벤트의 캐스케이드이다. 급성 염증은 단기간 (시간 내지 일)의 것이고 주로 상주하는 세포, 염증의 부위로 백혈구의 이동 및 유체 및 혈장 단백질의 누출을 수반한다. 이것은 혈관 유속의 변화, 세포 활성화 및 순환에서 손상의 부위로 백혈구를 끌어들이는 세포 성분으로부터 발생한다. 만성 염증은 활성 염증, 조직 파괴 및 소리의 시도가 동시에 진행되는 연장된 기간의 것이다. 만성 염증은 지속적인 감염, 유독 물질에 연장되고 반복된 노출 또는 자가 면역으로 인한, 신체의 면역 세포가 그것들 자체의 조직을 공격함으로써, 손상을 유발하는 현상으로부터 발생할 수 있다.
정상적으로, 면역계는 신체의 정상 세포 (또는 "자체") 및 외부 병원체 또는 비정상 세포 ("비-자체")를 구별할 수 있다. 일부 경우에, 면역계는 "자체"를 정상으로 인식하는 능력을 상실하고 부적절하게 조직 또는 세포에 대한 반응을 개시한다. 이 반응은 자체에 대한 내성의 손실에서 생겨나고 "자가 면역성"으로 불린다. 자가 면역으로부터 발생한 병상은 종종 심각한 임상적 결론을 갖고 세계, 특히 선진국의 주요 건강 문제 중 하나이다. 이러한 자가 면역 질환의 예는 류머티스성 관절염 (RA), 건선 (psoriasis), 건선성 관절염 (psoriatic arthritis), 전신성 홍반성 루푸스 (systemic lupus erythematosos; SLE), 홍반성 신염 (lupus nephritis), 타입 I 당뇨병, 그레이브 병 (Grave's disease), 염증성 장 질환 (Inflammatory bowel disease; IBD), 크론병 (Crohns disease; CD), 궤양성 대장염 (ulcerative colitis; UC), 과민성 대장염 (irritable bowel syndrome), 다발성 경화증 (multiple sclerosis; MS), 자가 면역 심근염 (myocarditis), 가와사키 병 (Kawasaki disease), 관 질환, 만성 폐쇄성 폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease), 간질성 폐질환 (interstitial lung disease), 자가 면역 갑상선염 (autoimmune thyroiditis), 피부 경화증 (scleroderma), 전신성 경화증 (systemic sclerosis), 골관절염, 아토피성 피부염 (atoptic dermatitis), 백반증 (vitiligo), 이식편대숙주병 (graft vs. host disease), 쇼그렌 증후군 (Sjogrens's syndrome), 자가 면역 신염 (autoimmune nephritis), 구드패스튜어 증후군 (Goodpasture's syndrome), 만성 염증성 탈수성 다발성 신경장애 (chronic immflammatory demyelinating polyneutopathy), 알레르기 (allergy), 천식 (asthma) 및 급성 또는 만성 염증의 결과인 다른 자가 면역 질환을 포함한다.
면역계가 "자체"를 정상으로 인식하는 능력을 상실하는 과정 및 조직 또는 세포를 향하는 이후의 반응은 내성, "자가 면역"의 상태의 상실을 일으킨다. 자가 면역으로부터 발생한 병상은 종종 심각한 임상적 결론을 갖고 세계의 주요 건강 문제 중 하나이다.
표적화된 생물학적 치료제는 현재 특정 자가 면역 질환 및/또는 만성 염증성 질환의 치료에 이용 가능하다. 예를 들어, 류머티스성 관절염에 걸린 환자는
항-CD20, TNF 길항제 (가용성 TNFR 또는 항-TNF-α)로 치료될 수도 있고; 건선에 걸린 환자는 항-CD11A로 치료될 수도 있고; 다발성 경화증에 걸린 환자는 INF-베타로 치료될 수도 있고; 궤양성 대장염에 걸린 환자는 항-TNF-αFH 치료될 수도 있고 크론병에 걸린 환자는 항-TNF-α 또는 항-CD4 인테그린으로 치료될 수도 있다. 불행하게도, 이들 생물학적 제제 중 어느 하나로 치료를 받은 많은 환자는 다양한 부작용을 경험할 수 있고, 약물에 반응하는 데 실패할 수 있고, 및/또는 이에 대한 중화 항체를 개발할 수 있다. 병상을 특이적으로 표적화하지만, 건강한 세포/조직에 영향을 미치지 않고, 소수의 극심한 부작용을 일으키고, 장기간 사용될 수도 있고 및/또는 중화 항체의 발생을 일으키지 않는 대안의 생물학적 의약품이 여전히 필요하다. 본 발명은 자가 면역 및/또는 만성 염증성 질환에 걸린 환자 사이에서 이들 충족되지 않는 필요에 관한 것이며, 이러한 치료에 사용에 적합한 항체를 개시한다.
류머티스성 관절염 (RA)은 전신에 영향을 미치는 전신성 질환이고 가장 일반적인 형태의 관절염 중 하나이다. 그것은 관절의 염증을 특징으로 하며, 이것은 통증, 강직, 열기, 발적 및 붓기를 유발한다. 이 염증은 관절에 침투하는 염증성 세포의 결론이고 이들 염증성 세포는 뼈 및 연골을 소화시킬 수도 있는 효소를 방출한다. 결과로서 이 염증은 극심한 뼈 및 연골 손상으로 이어질 수 있고 다른 생리학적 효과 중에 관절 퇴화 및 극심한 통증으로 이어질 수 있다. 관련 관절은 그것의 모양 및 정렬을 상실할 수 있으며, 통증 및 이동성의 손실을 일으킨다.
업계에 알려진 류머티스성 관절염에 대한 여러 동물 모델이 있다. 예를 들어, 콜라겐-유발된 관절염 모델에서, 마우스는 사람 류머티스성 관절염과 유사한 염증성 관절염에 걸린다. CIA는 유사한 면역학적 및 병리학적 특징을 RA와 공유하기 때문에, 이것이 그것을 잠재적 사람 항-염증 화합물을 스크리닝하는데 적합한 모델로 만든다. 이 모델의 효능은 관절 붓기의 감소에 의해 측정된다. 병원에서 RA의 효능은 관절 붓기, 적혈구 침강 속도, C-반응성 단백질 수준 및 혈청 인자의 수준의 조합으로서 측정된, 환자의 증상을 감소시키는 능력에 의해 측정된다.
RA와 관련된 연골 침식 또는 연골 파괴는 활액 내막 내벽에 존재하는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)의 서브세트에 의해 주로 구동된다. 가끔 타입 B 활막 세포 또는 RA 활액 섬유아세포 (RASF)로도 불리는, FLS는 간엽성 기원 중 하나이고 염증을 영구화하는 시토킨을 생산함으로써 주요 역할을 하고 그것들은 연골 파괴에 기여하는 프로테아제의 주된 생산자이다. RS에서, FLS는 세포외 연골 매트릭스로 침투할 수 있고 관절 손상을 더 악화시키는 공격적인 표현형을 발달시킨다.
본 출원에 언급된 연골 침식 또는 연골 파괴는 연골 조직의 손실 또는 분해이다.
뼈 재흡수, 용골 세포에 의한 뼈 조직의 제거는 용골 세포의 고유한 기능이며, 단핵구 세포 계통으로부터 유도된 전문화된 다핵성 세포이다. 그들의 분화는 대식세포 콜로니-자극 인자, RANK 리간드, 및 오스테오프로테게린, 뿐만 아니라 그것들의 분화, 활성화, 및/또는 생손을 양성으로 또는 음성으로 조절할 수 있는 다양한 다른 매개자에 의해 조절된다. 용골 세포는 그것이 자체 및 뼈 사이의 분리된 미세환경을 확립하는 것을 허용하는 전문화된 세포골격을 발달시키며, 뼈 단백질 및 무기질의 분해는 양성자의 수송 및 효소 방출을 수반하는 과정에 의해 일어난다.
본 출원에 언급된 뼈 침식은 뼈 질량 또는 뼈 무기질 밀도의 손실을 나타내며, 뼈 형성 속도 이상의 뼈 재흡수 속도의 약간 (또는 약간 이상) 하지만 지속적인 증가가 있을 때 발생한다.
골관절염 (OA)은 특히, 65살 이상의 성인에서 가장 일반적인 타입의 관절염이다. 질환은 만성 통증 및 장애로 빈번하게 이어지는 만성 퇴행성 관절증 (chronic degenerative arthropathy)을 특징으로 한다. 특정 관절에서 보고된 OA의 발병률 및 유병률은 OA의 경우 정의의 차이로 인해, 매우 다양하다. 예를 들어, OA는 방사선 기준 단독 (방사선 OA)에 의해, 전형적인 증상 (증상성 OA)에 의해, 또는 둘 다에 의해 정의될 수도 있다. 방사선학적 기준을 사용하여, 손의 원위 및 근위 지절간 관절은 가장 일반적으로 영향을 받는 관절로 확인되었지만, 그것들은 증상성이 될 가능성이 작다. 반대로, 무릎 및 엉덩이는 각각 방사선 OA의 두 번째 및 세 번째 일반적인 위치가 되며, 거의 항상 증상성이다. 제1 중족지골 (the first metatarsal phalangeal) 및 수근중수골 (carpometacarpal) 관절이 또한 방사선 OA의 빈번한 부위이지만, 어깨, 팔꿈치, 손목 및 중수수지 (metacarpophalangeal) 관절은 거의 특발성 OA를 발달시키지 않는다.
나이는 OA에 대하여 가장 일관적으로 확인된 위험 인자이고 유병률은 남성 50살 및 여성 40살 이후에 급격히 증가한다. OA는 전형적인 증상, 신체적 소견 및 방사선학적 변화의 트리아드 (triad)에 의해 진단된다. American College of Rheumatology는 방사선학적 소견을 포함하지만, 전적으로 의존하지 않는, 증상성 OA에 걸린 환자의 확인을 돕는 분류 기준을 제시하였다. 초기 질환에 걸린 환자는 활성이면 악화되고 휴식에 의해 완화되는 국부화된 관절 통증을 경험하지만, 극심한 질환에 걸린 환자들은 휴식에도 통증을 느낄 수도 있다. 중량 함유 관절은 중증 질환의 결론인 관절 내 장애로 인해 "고정"되거나 "부러질" 수도 있다. 아침의 강직 또는 이후 불활성 ("겔 현상 (gel phenomonon)")은 거의 30분을 초과하지 않는다.
골관절염 관절에서 신체적 소견은 뼈 확대, 염발음 (crepitus), 차가운 유출, 및 감소된 운동 범위를 포함한다. 관절 선에서 촉진에 대한 유연함 및 수동적 운동에 대한 통증은 또한 일반적이지만, OA에 고유한 것은 아니다. OA에서 방사선학적 소견 (슬라이드)은 골증식체 형성, 관절 간격 협착 (joint space narrowing), 연골하골경화 (subchondral sclerosis) 및 낭종 (cyst)을 포함한다. 골증식체의 존재는 상대적으로 중증 질환으로 나타내는 가장 특이적인 방사선학적 마커이다.
방사선학은 OA의 진단을 위한 "금 표준" 테스트로 간주하지만, 방사선학적 변화는 질환의 상대적으로 후반에만 분명하다. OA의 초기 진단, 및 그것의 진행의 관찰을 가능하게 하는 민감성 및 특이적 생물학적 마커가 더 필요하다. 통상적인 실험실 연구, 예를 들어, 침강 속도 및 c-반응성 단백질은 OA에 대한 마커로서 유용하지 않지만, 현재 연구는 CRP의 증가가 더 신속한 진행성 질환을 예측한다는 것을 제안한다. 하지만, OA의 마커로서 일부 약속을 제안하는 연골 성분의 여러 에피토프가 설명되었다. 예를 들어, 태아 및 신생아 연골에서만 정상적으로 발현된 황산 콘드로이틴 에피토프 846은 OA에서 관찰되었고, 정상 성인, 연골 및 활액에서는 아니다. 유사한 정맥을 따라, 타입 II 콜라겐에 고유한 에피토프는 OA 연골에서 설명되었고, 정상 연골을 MMP에 노출함으로써 시험관 내에서 은폐되지 않을 수 있다. 이 에피토프는 혈액 및 소변에서 측정될 수 있고 OA 진행을 진단하거나 관찰하는데 있어서 유용함을 입증할 수도 있다. 증가된 혈청 수준은 또한 방사선 OA와 연관된 일부에 의해 나타났다. 외상성 관절 손상 후 활액에서 증가된 연골 올리고머 단백질 (COMP) 수준의 발견은 손상된 관절에서 OA의 발달을 예고할 수도 있다. OA의 다른 잠재적 마커가 나열되지만 쉽게 접근할 수 없고 그것들을 잠재적 OA 마커로서 고려하는데 필요한 민감도 및 특이성이 부족하다.
염증의 임상적 증상, OA 활막 조직에서 조직학적 염증 및 염증이 생긴 활막의 경계에 초기 연골 병변의 존재는 활액막염 (synovitis)이 OA의 발병에서 중심 인자라는 강력한 지표이다. 연골 유일 질환으로서 OA의 전통적인 관점은 더 이상 쓸모가 없다. OA는 현재 활막 조직을 포함하는 전체 관절 질환인 것으로 생각되어야 한다. 뼈, 연골 및 활막은 가용성 매개자의 방출을 통한 및 기계적 신호를 통한 세포-세포 상호작용의 방법에 의해 의사소통한다. 활액 염증은 OA의 발달에 대한 전제 조건이 아님에도, 연골 붕괴 및 따라서 질환의 진행에 분명하게 수반된다. 염증성 활막의 표적화는, 특히 초기 OA에서, 관절의 연골 손상 및 골증식체의 형성을 지연하거나 방지해야 한다.
건선성 관절염은 건선에 걸린 환자의 서브세트에서 발생하는 염증성 관절염의 타입이다. 이들 환자에게서, 피부 병상/증상은 류머티스성 관절염에서 나타난 것과 유사한, 관절 붓기를 동반한다. 그것은 스케일링 (scaling)으로 피부 염증의 곳곳에 발생한 붉은 면적을 나타낸다. 건선은 종종 팔꿈치 및 무릎의 끝, 두피, 배꼽, 및 음부 또는 항문에 영향을 미친다.
용어 "건선성 관절염"은 말초 단관절, 소수 관절 및 다관절 질환에서 축 골 침범 (axial skeletal involvement)의 범위의, 관절염증의 이질적 그룹을 나타낸다. 그러나, 이 명백한 임상적 이질성에도, 이들 다양한 설명은 건선의 피부 증상, 류머티스성 인자 혈청-음성도, 유사한 사람 백혈구 항원 (HLA) 결합 및 방사선학적 유사성을 갖는 개개에서 그것들의 발생으로 통일된다.
북 아메리카의 백인 집단 중 대략 2%는 건선을 갖고 있다. 이들 중, 5-7%는 어떤 형태로든 염증성 관절염에 의해 영향을 받는다. 전체적으로, 실제 남성:여성 비율이 문제의 서브세트에 의존적으로 다를 수도 있지만, 남성 및 여성은 같은 빈도로 영향을 받는다. 최대 발병률은 40 내지 60년에 있다. 건선성 피부 질환은 70%의 경우에 관절염의 발병보다 선행하고 15%의 경우에 관절염과 일치하고, 15%의 경우에 관절염의 발병에 뒤따른다.
건선성 관절염의 원인은 알려져 있지 않다. 건선성 관절염에서 말초 관절 활성은 1/3의 경우에 피부 활성과 유사한 반면에, 피부 및 축 방향 골 질환의 활성은 불일치될 가능성이 있다. 유전 인자는 중요한 역할을 하는 것으로 나타난다. 일란성 쌍둥이에서 건선에 대하여 70% 일치한다. 질환에 걸린 환자의 1차 친척에서 건선성 관절염에 걸릴 50배 증가된 위험이 있다. 영향을 받은 모체와 비교하여 영향을 받은 부체에 의해 질환 "전염"에 걸릴 2배 증가된 위험이 있다. 등급 I 및 등급 II HLA 대립 유전자를 발현하는 전염병학적 결합이 있다. 환경 인자가 연루되었다. 연쇄상 구균 감염은 적상 건선 (guttate psoriasis)의 발달을 촉발할 수 있다. HIV 감염은 건선 및 건선성 관절염 둘 다를 제공할 수 있을 뿐만 아니라, 기존의 질환을 악화시킬 수 있다. 육체적 외상은 관절염의 발달을 촉발하는 것으로 보고되었으며, 건선성 관절염은 "깊은 퀘브너 현상 (deep Koebner phenomenon)"의 징후라는 것을 제안한다. 질환의 염증 및 자가 면역 특성은 임상적 표현에 의해, 뿐만 아니라 T-세포 및 다양한 시토킨이 질환 활성의 시작 및 영구화 둘 다에서 역할을 하는 것을 입증된 역할에 의해 지지된다.
더 나쁜 예후를 예고할 수도 있는 인자는 대규모 피부 침투; 건선의 강력한 가족력; 여성 성별; 20살 미만에 질환 발생; HLA-B27, -DR3 또는 -DR4 대립유전자의 발현; 및 다관절 또는 침식성 질환을 포함한다.
골다공증 (Osteoporosis; OP)은 손상된 뼈 강도 및 골절될 증가된 위험으로 이어지는 뼈의 질환이다 (예를 들어, Theill et al. (2002) Annu Rev Immunol 20:795-23을 참고하면 된다). 골다공증에서 뼈 무기질 밀도 (BMD)는 감소되고 뼈 미세구조는 점점 악화된다. 세계 보건 기구 (World Health Organization; WHO)에 의해 정의된 바와 같이, 질환은 평균 피크 뼈 질량 (젊고, 건강한 성인의 평균)보다 낮은 2.5 이하의 표준 편차인 뼈 무기질 밀도에 의해 정의된다.
질환은 1차 타입 1, 1차 타입 2, 또는 2차 타입으로 분류될 수도 있다. 폐경기 이후의 여성에서 가장 흔한 골다공증의 형태는 1차 타입 1 또는 폐경기 후 골다공증으로 불린다. 1차 타입 2 골다공증 (또는 노인성 골다공증)은 75살 이후에 발생하고 여성 및 남성 둘 다에서 2:1의 비율로 나타난다. 마지막으로, 2차 골다공증은 어떤 나이에서도 발생할 수도 있고 남성 및 여성에게 똑같이 영향을 미친다. 이 형태의 골다공증은 만성 취약성 의료 문제 또는 질환, 또는 글루코코르티코이드와 같은 의약품의 장기적인 사용으로부터 발생한다. 뼈 재흡수는 폐경기 후 골다공증에서 주요 병리학적 인자이다. 뼈 질량/뼈 무기질 밀도의 신속한 또는 상대적으로 신속한 손실은 종종 많은 용골 세포의 증가에 의해 또는 과도한 용골 세포 활성에 의해 유발된다 (Walsh et al. (2005) Immunol Rev 208:228-251).
골다공증 위험은 생활 방식의 변화 (예를 들어, 식이요법, 운동, 낙상 예방) 및 일부 의약품 (예를 들어, 칼슘, 비타민 D, 비스포스포네이트 및 몇몇 다른 것들)으로 감소될 수 있다.
용어 "치료"는 여기에 사용된 바와 같이, 어떤 사람의 의학적 치료법도 나타낸다. 상기 대상체는 의사에 의해 신체검사를 경험할 것으로 예상되며, 상기 특정 치료의 사용이 상기 사람 대상체의 건강에 이롭다는 것을 나타내는 잠정적 또는 확정적 진단을 제공하였다.
상기 치료의 시기 및 목적은 대상체의 건강의 현상에 따라, 개인마다 다를 수도 있다. 따라서, 상기 치료는 예방적, 완화적, 증상성 및/또는 치료적일 수도 있다.
본 발명에 관하여, 예방적, 완화적, 증상성 및/또는 치료적 치료는 본 발명의 별도의 양태를 나타낼 수도 있다.
한 양태에서, 본 발명은 본 발명의 분자, 예를 들어, 여기에 설명된 항체, 항체의 항원 결합 단편, 폴리뉴클레오티드, 벡터 및 세포를 포함하는 조성물 및 조제물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명은 본 발명의 항체 중 하나 이상의 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하는 약학적 조성물을 제공하며, 약학적으로 허용 가능한 담체와 함께 조제된다.
따라서, 본 발명의 하나의 목적은 0.25 mg/ml 내지 250 mg/ml의 농도로 존재하는 이러한 항체를 포함하는 약학적 조제물을 제공하는 것이고, 여기에서 상기 조제물은 2.0 내지 10.0의 Ph를 갖는다. 조제물은 버퍼 시스템, 보존제(들), 등장화제(들), 킬레이트 시약(들), 안정화제 및 계면활성제를 더 포함할 수도 있다. 약학적 조성물에서 보존제, 등장화제, 킬레이트 시약, 안정화제 및 계면활성제의 사용은 당업자에게 잘 알려져 있다. 참고는 Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19th edition, 1995에 의해 이루어질 수도 있다.
한 구체예에서, 약학적 조제물은 수성 조제물이다. 이러한 조제물은 전형적으로 용액 또는 현탁액이다. 용어 "수성 조제물"은 적어도 50 중량% 물을 포함하는 조제물로서 정의된다. 유사하게, "수용액"은 적어도 50 중량% 물을 포함하는 용액으로서 정의되고, 용어 "수성 현탁액"은 적어도 50 중량% 물을 포함하는 현탁액으로 정의된다.
또 다른 구체예에서, 약학적 조제물은 동결-건조된 조제물이며, 의사 또는 환자가 사용 전에 이것에 용매 및/또는 희석제를 추가한다.
추가의 양태에서, 약학적 조제물은 이러한 항체의 수용액, 및 버퍼를 포함하며, 항체는 1 mg/ml 이상의 농도로 존재하고, 상기 조제물은 약 2.0 내지 약 10.0의 pH를 갖는다.
본 발명의 항체는 비경구로, 예를 들어, 정맥 내로, 예를 들어, 근육 내로, 예를 들어, 피하로 투여될 수도 있다. 대안으로, 본 발명의 항체는 비경구가 아닌 루트를 통해, 예를 들어, 경구로 또는 국부적으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 항체는 예방적으로 투여될 수도 있다. 본 발명의 항체는 치료적으로 (요구에 따라) 투여될 수도 있다.
본 발명의 콘테스트에서, "연골 파괴 세포의 선택적 제거"는 NKG2A에 대한 항체가 정상 섬유아세포, 예를 들어, 포피 섬유아세포 (FSK4 세포) 또는 다른 정상 섬유아세포 세포의 제거를 증가시키지 않으면서, 연골 파괴 세포, 예를 들어, 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS) 또는 다른 연골 파괴 세포의 제거를 매개하는 NK 세포를 증가시키는 과정을 나타낸다. 이 선택적 제거는 예를 들어, 표준 LDH 방출 검정에 의해 또는 다른 알려진 적합한 검정으로 측정될 수 있으며, 연골 파괴 세포를 제거하는 치료 화합물의 능력이 측정된다 (실시예 4 및 도 5B). 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 5% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 10% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 20% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 30% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 40% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 50% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 60% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 70% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 80% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 90% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 100% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 125% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 150% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 175% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 200% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 225% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 250% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 275% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 300% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 350% 증가를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 400% 증가, 또는 연골 파괴 세포에 대한 특이적 세포 독성의 적어도 500% 증가를 유발한다.
본 발명의 내용에서, "뼈 침식 세포의 형성을 감소시킨다"는 항-NKG2A 항체가 뼈 침식 세포, 예를 들어, 용골 세포, TRAP+ 다핵성 세포 또는 다른 뼈 침식 세포의 형성을 감소시키는 과정을 나타낸다.
뼈 침식 세포의 감소된 형성은 부착성 뼈 침식 세포의 시각적 계수 또는 뼈 침식 세포의 감소된 형성을 측정하는 어떤 다른 적합한 방법에 의해 시험관 내에서 측정될 수 있다 (실시예 6 및 도 6C를 참고하면 된다). 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 5% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 10% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 20% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 30% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 40% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 50% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 60% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 70% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 80% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 90% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 100% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 125% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 150% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 175% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 200% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 225% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 250% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 275% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 300% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 350% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 400% 감소 또는 뼈 침식 세포의 적어도 450% 감소를 유발한다. 한 구체예에서, 항-NKG2A 항체는 뼈 침식 세포의 적어도 500% 감소를 유발한다.
게다가 본 발명의 콘테스트에서 "뼈 침식 세포의 형성을 감소시킨다"는 시험관 내에서 감소된 뼈 무기질 침식을 나타낸다.
감소된 시험관 내 뼈 무기질 침식은 뼈 무기질 디스크 (즉, 골 해부학적 디스크)에서 세포 또는 조직을 배양함으로써 또는 다른 적합한 방법에 의해 측정될 수 있다 (실시예 6 및 도 6D, 6e, 6f 및 6g를 참고하면 된다). 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 10% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 20% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 30% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 40% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 50% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 60% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 70% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 80% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 90% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 100% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 125% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 150% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 175% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 200% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 250% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 300% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 350% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 400% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 450% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 500% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 550% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 600% 감소를 유발한다. 한 구체예에서 항-NKG2A는 뼈 무기질 침식의 650% 감소 또는 뼈 무기질 침식의 700% 감소를 유발한다.
실시예
실시예 1. RA 환자의 섬유아세포-유사 활막 세포 상에서 발현된 세포 표면 분자.
도 1A에서, RA 활막 조직으로부터 유도된 부착성 RA-FLS를 2 mM EDTA를 사용하여 분리하였고 표면을 섬유아세포-마커 CD55 (열린 막대그래프; 오른쪽 패널) 및 대식세포-마커 CD68 (열린 막대그래프; 왼쪽 패널)의 발현을 위해 염색하였다. 회색 막대그래프는 이소타입 대조군 항체를 사용하는 염색을 제공한다. 도 1A에 나타난 바와 같이, RA-FLS는 CD55의 균질한 발현 및 CD68의 결핍이 부착성 RA-FLS의 섬유아세포-유사 기원을 확인한다는 것을 나타낸다.
도 1B에 나타난 바와 같이, RA-FLS는 높은 수준의 ULBP-1, ULBP-2 및 ULBP3, 낮은 수준의 MIC-A을 발현하고, MIC-B를 발현하지 않으며, NK 세포 수용체 NKG2D를 활성화하는 모두 알려진 리간드이다. 게다가, RA-FLS는 CD155 (폴리오바이러스 (poliovirus) 수용체 PVR) 및 CD48을 각각 발현하며, DNAM-1 및 2B4에 대한 리간드이다. 우리는 CD112 (폴리오바이러스-관련 수용체 2, PRR2)의 어떤 발현도 검출하지 않았으며, DNAM-1에 의해 인식된 또 다른 리간드이다. NKp30, NKp44, 및 NKp46의 Fc 융합 단백질을 사용하여, 우리는 RA-FLS 상의 추정 상 NKp44 리간드의 상대적으로 높은 발현을 검출하는 한편, NKp30-Fc 및 NKp46-Fc는 이들 세포를 염색하는 데 실패하였다. 세포를 유동 세포분석법으로 분석하였다. 채워진 막대그래프는 관련 이소타입 대조군을 나타낸다. 막대그래프는 n = 3 기증체를 나타낸다.
도 1C는 RA-FLS에 대한 가용성 NKp44-Fc 융합 단백질의 결합이 특이적이고 항-NKp44 mAb의 증가하는 투여량의 추가에 의해 폐지되었다는 것을 설명한다. 부착성 RA-FLS를 2 mM EDTA를 사용하여 분리하였고, 표면을 10 ug/mL NKp44-Fc 융합 단백질 (열린 막대그래프) 또는 음성 대조군으로서 같은 Fc 단편 (사람 IgG1) (회색 막대그래프)로 염색하였다. 지시된 경우, NKp44-Fc를 항-NKp44 또는 항-NKp46 mAb와 함께 사전 배양하였다.
도 1D에 입증된 바와 같이, RA-FLS는 높은 수준의 HLA-E 및 HLA-G 둘 다를 각각 발현하며, 억제 NK 세포 수용체 CD94-NKG2A 및 LIR-1에 대한 리간드이다. 따라서, 대부분의 활액 NK 세포가 억제 CD94-NKG2A 수용체를 발현하기 때문에, HLA-E는 염증이 생긴 활막의 NK 세포-매개된 세포 독성으로부터 RA-FLS를 보호하는 중요한 분자일 수도 있다.
도 1E에서, RA-FLS가 사멸 수용체 5 (DR5)를 발현하지만 DR4는 아니라는 것을 입증한다. 이들 수용체는 TRAIL (TNF-관련 아폽토시스 (apoptosis)-유발 리간드)에 의한 인식에 대한 아폽토시스성 신호를 변환한다. 따라서, DR5는 염증이 생긴 활막 조직 내에서 RA-FLS 세포-사멸을 잠재적으로 매개할 수 있는 TRAIL 발현 세포에 의해 인식될 수 있는 RA-FLS 상에서 발현된 중요한 리간드일 수도 있다.
실시예 2. NKG2A 발현 NK 세포는 RA 활막에 존재하고 RA - FLS 를 발현하는 HLA-E를 함유하는 구역에서 발견될 수 있다.
도 2A, 2b, 및 2c는
마우스 항-NKp46 (NK 세포, 도 2A), 항-NKG2A (도 2B), 및 이소타입 대조군 항체 (도 2C)으로 염색된 RA에 걸린 환자로부터 유도된 일련의 활막 조직 섹션을 나타낸다. 면역-특이적 재활성을 디아미노벤지딘 (현미경 사진에서 어두운 점)으로 시각화하였고 핵을 헤마톡실린 (희미한 점)으로 대비염색하였다. 결과는 NKp46+ NK 세포가 하위내벽 구역에서 발견되고 RA 활막의 활막 내벽에 좀 더 가깝다는 것을 나타낸다 (도 2A를 참고하면 된다). NK 세포의 위치 및 빈도는 NKG2A+ 세포의 그것과 매우 유사한 것으로 발견되었다 (비교를 위해 도 2B를 참고하면 된다). 그리고 이소타입 대조군으로 염색된 섹션은 블랭크 (blank)였다 (도 2C를 참고하면 된다). 정량적 디지털 이미지 분석에 의해 평가될 때, NKG2A+ 세포의 빈도는, 도 2D에 나타난 바와 같이, NK 세포의 수와 밀접하게 연관되고 (r2 = 0.950, p < 0.0001) 이와 일치한다는 것이 발견되었다.
CD94-NKG2A에 대한 리간드인 HLA-E의 RA-FLS에서의 발현을 제자리에서 평가하였다 (도 2E-h). RA 활막 조직 섹션에 항-HLA-E 항체 3D12의 적용은 내막 내벽의 염색을 나타냈으며, 이것은, 도 2E에 입증된 바와 같이, 대식세포-유사 활막 세포 (MLS) 및 RA-FLS로 구성된다. 게다가, 도 2F에 나타난 침투성 면역 세포 및 도 2H에 나타난 혈관 내피 세포 둘 다는 상대적으로 높은 수준으로 HLA-E를 발현하였다.
동시에, 이들 데이터는 NK 세포가 RA 환자의 활막에서 침투성 림프구 집단 사이에서 확인될 수 있다는 것을 나타내고, 모두는 아니지만, 대두분의 NK 세포는 NKG2A를 발현한다. 게다가, NKG2A+ NK 세포의 서브세트는 HLA-E+ RA-FLS에 가까운 구역에서 발견된다. 따라서, 이것은 잠재적으로 NKG2A+ NK 세포가 RA-FLS 상의 HLA-E를 제자리에서 인식한다는 것을 의미할 수 있다.
실시예 3: NKG2D , DNAM -1, NKp44 , NKp46 , 및 TRAIL 은 RA - FLS 에 대한 NK 세포 독성에 수반된다.
도 3A에서, 하기 각각의 막대그래프에 지시된 바와 같이, 여러 NK 세포 수용체의 표면 발현을 위해 염색된 세 개의 다른 타입의 NK 세포가 나타나고 (열린 막대그래프로서), 관련 이소타입 대조군으로 염색 또한 각각의 패널 (채워진 회색 막대그래프)에 나타난다. 도 3A (i)은 대표적 RA 환자의 SFMC로부터 유도된 NK 세포를 나타내고, 도 3A (ii)는 대표적 건강한 기증체의 PBMC로부터 유도된 나머지 CD56 bright NK 세포를 나타내고 도 3A (iii)은 Nishi NK 세포를 나타낸다.
세포를 유동 세포분석법으로 분석하였다. NK 세포를 생존한 CD3-CD56bright로서 정의하였다. 데이터는 RA 환자로부터 유도된 활액 NK 세포가 여러 활성화 수용체를 발현하고, 그것들은 CD56bright NK 세포 및 Nishi NK 세포에 대한 활성화 수용체의 유사한 발현 패턴을 나타낸다는 것을 나타낸다.
도 3B (i)는 48-웰 플레이트에서 10,000 세포/웰로 분주되고, 72시간 동안 포화상태 (~ 48,000 세포/웰)로 성장한 RA-FLS를 설명하며, 이 시점에서 Nishi를 지시된 효과기:표적 (E:T) 비율로 추가하였다 (2배수 웰을 설정하였다). RA-FLS 및 Nishi를 37℃에서 하룻밤 동안 동시 배양하였고, 비-부착성 세포를 이후에 씻어냈고 부착성 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하였고 에오신으로 염색하였다. ImmunoSpot Image Analyzer를 이미지를 촬영하기 위해 사용하였고 커버된 % 웰 구역을 정량하였다 (도 3B (ii)에 나타난 바와 같이).
도 3B (i) 및 도 3B (ii)의 데이터는 NK 세포가 시험관 내에서 투여량 의존적 방식으로 플라스틱 (plastic) 부착성 RA-FLS를 제거한다는 것을 나타낸다.
도 3C 및 3d i에서 RA-FLS가 96-웰 플레이트에 30,000 세포/웰로 분주되었고, 다음날 90,000 Nishi/웰이 추가되었다는 것을 입증하였다. Nishi 및 FLS를 지시된 바와 같이, BD GolgiStop, FITC-콘쥬게이트된 항-CD107a/b 항체 및 10 ug/mL 차단 항체, 또는 관련 이소타입 대조군과 함께 37℃에서 5시간 동안 동시 배양하였고, 유동 세포분석법을 Nishi 탈과립화 를 결정하기 위해 수행하였다. ns = 유의하지 않음, * P < 0.05, ** P < 0.005, *** P < 0.001.
도 3C는 NK 세포가 FLS 표적 세포의 존재시에만 탈과립화 하고 단독으로 배양될 때는 아니라는 것을 나타낸다. 도 3D는 RA-FLS가 NK 세포-매개된 세포 독성에 민감하고, NKG2D, DNAM1, NKp44, NKp46 및 TRAIL이 이러한 수용체의 은폐시 CD107a/b 발현의 유의한 감소에 의해 지시된 바와 같이 NK 세포에 의한 RA-FLS의 특이적 인식에 모두 수반된다는 것을 나타낸다.
실시예 4: RA - FLS 는 NK 세포에 의해 발현된 억제 CD94 - NKG2A 수용체와 상호작용할 수 있는 HLA -E의 발현에 의한 NK 세포- 매개된 세포 독성으로부터 보호된다.
도 4A는 상단 열에 RA-SFMC의 NK 세포, 중간 열에 건강한 PBMC의 나머지 CD56bright NK 세포 및 하단 열에 Nishi NK 세포의 대표적인 막대그래프를 나타낸다. 해당 이소타입 대조군 (회색 채워진 막대그래프)와 비교하여 NKG2A (왼쪽 컬럼), LIR-1 (중간 컬럼) 및 KIR (오른쪽 컬럼)의 발현이 나타난다. NK 세포를 항-NKG2A, 항-LIR1, 및 항-KIR mAb의 칵테일을 사용하여 표면 발현을 위해 염색하였고 이후에 유동 세포분석법으로 분석하였다. NK 세포는 생존한 CD3 음성 CD56bright 양성 세포에서 게이티드된다.
데이터는 대부분의 활액 NK 세포 및 CD56bright PB-NK 세포는 NKG2A를 발현하지만 KIR이 없다. 반대로 활액 NK 세포, Nishi NK 세포는 또한 LIR-1을 발현한다.
도 4B는 96-웰 플레이트에 3·104 세포/웰로 분주되고, 다음날 Nishi가 3:1 (항-LIR-1 실험, 왼쪽 패널) 또는 6:1 (항-NKG2A 실험, 오른쪽 패널)의 비율로 추가된 RA-FLS를 설명한다. Nishi 및 FLS를 지시된 바와 같이, BD GolgiStop, FITC-콘쥬게이트된 항-CD107a/b 항체 및 10 ug/mL 차단 항체, 또는 관련 이소타입 대조군과 함께 37℃에서 5시간 동안 동시 배양하였다. 유동 세포분석법을 Nishi 탈과립화 를 결정하기 위해 수행하였다. 도 4B에 나타난 바와 같이, ns = 유의하지 않음, ** P < 0.005.
데이터는 항체를 가진 은폐 NKG2A는 RA-FLS에 대한 많이 증가된 NK 세포 탈과립화 를 일으키는 한편 (오른쪽 패널), 은폐 LIR-1은 RA-FLS의 증가된 용해를 일으키는 것으로 나타나지 않는다 (왼쪽 패널). 따라서, NK 세포의 항-NKG2A 처리가 RA-FLS의 증가된 용해를 일으킨다는 사실은 적절한 펩티드에 존재하는 RA-FLS에서 발현된 HLA-E 분자가 CD94-NKG2A 억제 수용체와 상호작용에 중요하다는 것을 나타낸다.
도 4C는 96-웰 플레이트에 2.4·104 세포/웰로 분주되고, 다음날 6·103 Nishi NK 세포/웰이 추가된 (즉, 1:4의 E:T) RA-FLS를 입증한다. FLS 및 Nishi를 동시 배양하였다는 것을 RA-FLS를 입증한다. 항-NKG2A 또는 사람 IgG4 이소타입 대조군의 추가로 하룻밤 동안 동시배양하였다. 다음날, 비-부착성 세포를 씻어냈고, 부착성 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정하였고 에오신으로 염색하였다. 웰을 분석하였고, 도 4C에 나타난 바와 같이, ImmunoSpot Image Analyzer를 사용하여 커버된 % 웰 구역을 정량하였다. 따라서, 데이터는 은폐 NKG2A가 부착성 RA-FLS의 많이 증가된 제거를 일으킨다는 것을 나타낸다.
RA-FLS를 96-웰 플레이트에 1.5·104 세포/웰로 분주하였고, 다음날 4.5·104 자가 SFMC를 웰 마다 추가하였다 (즉 E:T 3:1). SFMC 및 RA-FLS를 도 4D에 나타난 바와 같이, BD GolgiStop, FITC-콘쥬게이트된 항-CD107a/b 항체 및 10 ug/mL 차단 항체, 또는 사람 IgG4 이소타입 대조군과 함께 37℃에서 5시간 동안 동시 배양하였다.
따라서, mAb를 갖는 은폐 NKG2A는 시험관 내에서 자가 RA-FLS의 많이 증가된 제거를 일으키며, 항-NKG2A mAb의 치료적 투여는 생체 내에서 RA-FLS의 증가된 제거를 일으킨다는 것을 제안한다.
도 4E는 96-웰 플레이트에 분주된 3·104 FLS/웰을 나타낸다. 다음날, 동종이계 CD56brightCD16dim NK 세포를 자기 분리에 의해 건강한 기증체 혈액으로부터 분리하였고
BD GolgiStop, FITC-콘쥬게이트된 항-CD107a/b 항체 and 10 ug/mL 차단 항체, 또는 관련 이소타입 대조군과 함께 37℃에서 5시간 동안 RA-FLS와 함께 (E:T 3:1) 즉시 동시 배양하였다. 유동 세포분석법을 탈과립화 를 결정하기 위해 수행하였다. NK 세포를 생존한 CD3-CD16dimCD56brightht로서 정의하였다. 하단 그래프는 다섯 명의 다른 환자의 RA-FLS와 별도로 동시 배양된, 단일 건강한 기증체의 CD56bright NK 세포를 나타낸다. * P < 0.05.
따라서, 나머지, 새롭게 분리된 PB-NK 세포에서 mAb를 갖는 은폐 NKG2A는 시험관 내에서 동종이계 RA-FLS의 많이 증가된 제거를 일으키며, 다시 항-NKG2A mAb의 치료적 투여가 생체 내에서 RA-FLS의 증가된 제거를 일으킨다는 것을 제안한다. 따라서, 혈류를 통해 다른 관절로 이동할 수도 있는 RA-FLS를 분산시키는 공격적 질환은 그것들의 CD94-NKG2A 억제 수용체의 은폐시 CD56bright PB-NK 세포를 순환시킴으로써 제거될 수도 있다.
도 5A는 NNC141-0100 (HumZ270, 검은색 막대), 이소타입 대조군 (흰색 막대), 또는 배지 단독 (회색 막대)의 존재시 두 개의 다른 NK 세포주 (NKL, 왼쪽; 및 Nishi, 오른쪽)을 사용하여 FLS의 NK 세포-매개된 세포 독성을 평가하기 위해 이용된 LDH 방출 검정을 나타낸다. 표적 비율에 대한 NK 세포 효과기는 1:1이었다. 도 5B는 NNC141-0100 (humZ270)을 사용하는 차단 NKG2A가 대표적 RA-FLS (RA-FLS2, 왼쪽 패널)의 증가된 용해로 이어지지만 정상 포피 섬유아세포 세포주 (FSK4, 오른쪽 패널)의 제거에 영향을 미치지 않는다. 따라서, 종합해보면 도 3, 도 4, 및 도 5에서 제공된 데이터는 항-NKG2A 처리가 RA-FLS의 증가된 NK 세포-매개된 제거를 일으키는 한편 정상 섬유아세포 세포주 (FSK4)의 NK 세포-매개된 제거는 NKG2A에 대한 차단 항체 (즉 HumZ270)의 존재시 영향을 받지 않는다는 것을 분명하게 제안한다.
실시예 6: humZ270 (항- NKG2A )의 처리는 TRAP + 다핵성 용골 세포의 형성을 억제한다.
도 6A는 RA 환자로부터 유도된 106 SFMC/웰을 10 ng/mL IL-15가 보충된 배지에서 7일 동안 배양하였다는 대표적인 실시예를 나타낸다. 검정의 초기에 배양물에 20 미크로그램/ml 사람 IgG4 이소타입 대조군 (도 6A) 또는 20 미크로그램/ml humZ270 (도 6B)을 처리하였다. 도 6B에서 항-NKG2A 처리는 TRAP를 발현하는 큰 플라스틱 부착성 다핵성 세포 (즉, 용골 세포로 정의됨)의 큰 제거를 일으킨다는 것으로 인정될 수 있다.
도 6C는 배지 단독 (n=6) 또는 10　ng/mL IL-15로 보충된 배지 (n=14)에서 7일 동안 배양된 RA 환자로부터 유도된 SFMC로부터 얻은 데이터를 입증한다. 검정의 초기에 (베이스라인으로 정의됨), 20 미크로그램/mL 사람 IgG4 이소타입 (흰색 및 어두운 회색 막대) 또는 20　미크로그램/mL NNC141-0100 (humZ270, 밝은 회색 및 검은색 막대)을 배양물에 추가하였다. 용골 세포를 TRAP+ 다핵성 세포의 수/웰로서 정량하였다. 따라서, 종합해보면 도 6A, 도 6B, 및 도 6C는
시험관 내 배양에서 SFMC의 NKG2A에 대한 항체의 처리는 큰 다핵성 TRAP+ 세포 (즉 용골 세포)의 형성에 의해 측정된 바와 같이 용골 세포의 형성의 큰 감소를 일으킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 소견은 RA 환자에서 항-NKG2a mAb의 치료적 처리가 RA의 주요 임상적 홀마크 (hallmark)인 뼈 침식의 약화를 일으킨다는 것을 제안한다.
도 6D에서 RA 환자 번호 2357의 SFMC 배양물로부터 관찰된 뼈 무기질 침식의 대표적인 실시예가 나타난다. 여기에서 SFMC를 IL-15 및 이소타입 mAb (왼쪽) 대 항-NKG2A (humZ270, 오른쪽)의 존재시 뼈 무기질의 얇은 층으로 코팅된 디스크 (즉 골 해부학적 디스크)에서 성장시켰다. 디스크를 이후에 본 코사로 염색하였고 침식된 구역을 Immunospot S5 Analyzer를 사용하여 분석하였고 더 어두운 배경에 대하여 밝은/흰색 구역으로서 나타난다.
도 6E에서 총 5명의 RA 환자로부터 얻은 데이터가 입증된다. SFMC를 10　ng/mL IL-15로 보충된 배지에서 배양하였다. 검정의 초기에, 20 미크로그램/mL 사람 IgG4 이소타입 (흰색 막대) 또는 20　미크로그램/mL NNC141-0100 (humZ270, 검은색 막대)을 배양물에 추가하였다. 평균 퍼센트 +/- SEM 침식된 디스크 구역을 Immunospot S5 Analyzer를 사용하여 정량하였다.
종합해보면, 도 6D 및 도 6E는 항-NKG2A 처리가 활성 뼈 무기질 침식 용골 세포의 형성의 큰 감소를 일으킨다는 것을 나타낸다. 따라서, 소견은 RA 환자에서 항-NKG2a mAb의 치료적 처리가 RA의 주요 임상적 홀마크인 뼈 침식의 약화를 일으킨다는 것을 제안한다.
도 6F는 HumZ270 (항-NKG2A)이 생체 외에서 직접 배양된 RA 활막 조직 섹션 배양물에서 뼈 침식을 저해한다는 것을 설명한다. RA 활막 조직 부스러기를 mAb (대조군)를 추가하지 않거나 배양의 초기에 추가된 10 미크로그램/mL으로 이소타입, 인플릭시맙 (IFX), 또는 항-NKG2A (humZ270)를 추가한, 10% FBS, 2% HuS, P/S, L-glut로 보충된 IMDM 배지에서 7일 동안 성장시켰다. 실험을 3배수 웰로 설정하였다. 제7 일에, 배지 및 세포를 200 uL Milli-Q™ 물로 웰을 3번 헹굼으로써 제거하였다. 디스크를 이후에 200 uL 표백제 (~6% NaOCl, ~5.2% NaCl)으로 5분 동안 헹군 후 이어서 일부 남은 세포를 제거하기 위해 부드럽게 피펫팅 (pipetting)하였다. 마지막으로, 디스크를 Milli-Q™ 물로 3번 세척하였고, 공기 건조하였고 본 코사 방법으로 염색하였다. 3배수 배양물의 이 실시예로부터 RA 활막 조직 절편의 humZ270의 처리가 대조군 또는 이소타입 처리된 배양물과 비교하여 감소된 침식 (밝은/흰색 구역)을 일으킨다는 것이 인정될 수 있다.
도 6G에서 mAb (대조군)를 추가하지 않거나 배양의 초기에 추가된 10 미크로그램/mL로 이소타입, 인플릭시맙 (IFX), 또는 항-NKG2A (humZ270) mAb 모두를 추가한 10% FBS, 2% HuS, P/S, L-glut로 보충된 IMDM 배지에서 7일 동안 성장시킨 RA 활막 조직 부스러기의 3배수 배양물로부터 계산된 결과 (평균 +/- SEM)를 설명한다. 제7 일에, 배지 및 세포를 200 uL Milli-Q™ 물로 3번 헹굼으로써 제거하였다. 디스크를 이후에 200 uL 표백제 (~6% NaOCl, ~5.2% NaCl)로 5분 동안 헹군 후 이어서 어떤 남은 세포도 제거하기 위해 부드럽게 피펫팅하였다. 마지막으로, Milli-Q™ 물로 3번 세척하였고, 공기 건조하였고 본 코사 방법으로 염색하였다. RA 활막 조직 절편의 HumZ270 처리는 대조군 또는 이소타입 처리된 배양물과 비교하여 많이 감소된 침식 (p=0.005, Students T test)을 일으킨다. 따라서, 뼈 무기질로 코팅된 디스크 (즉 골 해부학적 디스크)에서 생체 외에서 직접 성장한 RA 조직은 큰 침식 용량을 나타내고 이러한 활성은 항-NKG2A의 처리에 의해 철저히 억제되며 RA 환자에서 항-NKG2A가 처리된 치료적 처리는 RA의 주요 임상적 홀마크인 뼈 침식을 저해한다는 것을 분명하게 제안한다.
실시예 7: HumZ270 ( NNC141 -0100)의 처리시 SFMC 시험관 내 배양에서 시토킨 수준의 조절
도 7A에서 RA에 걸린 환자 (n=11)로부터 유도된 SFMC의 시험관 내 배양에서 시토킨 수준 (평균 +/- SEM)의 조절을 입증한다. SFMC를 10 ng/mL IL-15가 보충된 배지에서 7일 동안 배양하였다. 검정의 초기에 배양물에 20 미크로그램/mL 사람 IgG4 이소타입 (밝은 회색 막대) 또는 20　미크로그램/mL NNC141-0100 (humZ270, 어두운 회색 막대)을 처리하였다. 상층액을 24시간에 수거하였고 시토킨의 수준을 BioPlex로 측정하였다. IL-6 수준은 항-NKG2A의 처리시 많이 감소하는 한편, 다른 시토킨의 생성은 24시간에 M-CSF의 소량의 증가를 제외하고, 크게 영향을 받지 않았다.
도 7B는 IL-15로 자극되고 이소타입 대 HumZ270 (항-NKG2A)이 처리된 RA-SFMC 시험관 내 배양물에서 측정된 IL-6 수준 사이의 쌍 별 비교를 나타낸다. IL-6 수준은 모든 SFMC 시험관 내 배양물의 은폐 NKG2A에서 많이 감소하였다.
도 7C에서 NNC141-0100 (humZ270)은 RA에 걸린 환자로부터 유도된 SFMC의 시험관 내 배양물에서 베이스라인 및 IL-15 자극된 IL-6 생성 둘 다를 억제한다. 2명의 RA에 걸린 환자로부터 유도된 SFMC에 의해 생성된 IL-6 수준을 지시된 바와 같이 배지 단독 또는 10 ng/mL IL-15가 보충된 배지에서 확립된 배양물에서 측정하였다. 검정의 초기에 배양물에 20 미크로그램/mL 사람 IgG4 이소타입 (검은 막대) 또는 20　미크로그램/mL NNC141-0100 (humZ270, 흰색 막대)을 처리하였다. 상층액을 24, 48 및 72시간에 수확하였고 IL-6의 수준을 BioPlex로 측정하였다. 종합해보면, 도 7A, 7b, 및 7c는 항-NKG2A가 SFMC 시험관 내 배양물에서 베이스라인 및 자극된 IL-6 수준을 저해한다는 것을 나타낸다. IL-6은 RA 발병에 수반되는 중요한 전염증성 시토킨이다. 잠재적으로, IL-6의 감소는 용골 세포 형성에서 관찰된 감소에 중요한 역할을 한다.
실시예 8: NKG2A 및/또는 그것의 리간드 HLA -E는 RA , 골관절염 ( OA ) 및 건선성 관절염 ( PsA ) 환자의 염증이 생긴 활막에서 발현된다
RA 활막 조직에 존재하는 NK 세포는 억제 NKG2A 수용체를 발현하고 HLA-E, CD94-NKG2A에 대한 리간드를 발현하는 활막 세포에 인접한 림프성 응집체에 주로 위치한다. 이것은 도 8에 나타나며, 15개의 기증체 중 둘의 RA 활막 조직의 대표적인 도면을 기술한다 (ID 1144-09: A, C, E, G, I 및 ID 1591-08: B, D, F, H, J). RA 활막의 일련의 섹션을 NK 세포에 대하여 항-NKp46 항체로 (도 8A 및 8B), NKG2A에 대하여 Z199 항체로 (도 8C 및 8D), HLA-E에 대하여 3D12 항체로 (도 8E 및 8F) 그리고 T 세포에 대하여 항-CD3 항체로 (도 8G 및 8H) 염색하였다. IgG2b 이소타입 대조군 항체를 사용해서는 염색이 관찰되지 않았다 (도 8I 및 8J). 면역-특이적 재활성을 디아미노벤지딘 (DAB)로 시각화하였고 핵을 헤마톡실린으로 대비염색하였다 (막대=100 μm). 화살표는 NKp46, NKG2A, HLA-E 및 CD3 발현 세포 서브세트의 하위내벽 조직의 림프성 응집체를 나타낸다. 화살표는 NK 세포의 림프성 응집체에 인접한 과형성 활막 내벽 층의 HLA-E+ 활막 세포를 나타낸다. 별표는 HLA-E+ 혈관 내피 세포를 나타낸다.
세 번째 기증체 (ID 1595-08)의 RA 활막의 일련의 섹션에서 NKp46+ NK 세포 (도 8K) 및 NKG2A+ 세포 (도 8L)의 고해상도 사진은 NK 세포의 위치 및 빈도가 NKG2A+ 세포의 그것과 매우 유사하다는 것을 강조하기 위해 나타난다. 디지털 이미지 분석을 15명의 RA 환자의 활막의 NKG2A+ 세포의 수를 NKp46+ NK 세포의 수와 연관시키기 위해 사용하였다 (도 8M). 결과는 mm2 당 세포의 수로서 표현되고 NKG2A+ 세포의 빈도는 NK 세포의 수와 밀접하게 연관되고 (r2=0.950, p<0.0001) 이와 일치한다. NKG2A+ 세포는 15명의 RA 환자 중 13명의 활막에 존재하였다.
종합해보면, 이들 데이터는 NK 세포가 RA 환자의 활막에서 침투성 림프구 집단 사이에서 확인될 수 있다는 것을 나타내고, 모두는 아니지만, 대부분의 NK 세포가 NKG2A를 발현한다는 것을 제안한다. CD94-NKG2A에 대한 리간드, HLA-E는 많은 침투성 면역 세포, 혈관 내피 세포 및 활막 세포 (대식세포-유사 활막 세포 (MLS) 및 RA-FLS)에 의해 발현된다. NKG2A+ NK 세포의 서브세트는 HLA-E+ 활막 세포에 가까운 구역에서 발견된다. 따라서, 이것은 잠재적으로 NKG2A+ NK 세포가 RA-FLS 상의 HLA-E를 제자리에서 인식한다는 것을 의미한다. 게다가, HLA-E+ 침투성 면역 세포 및 혈관 내피 세포는 또한 NKG2A+ NK 세포에 의해 인식될 수도 있다.
NKG2A 및 그것의 리간드, HLA-E는 골관절염 (OA)에 걸린 환자의 활막에서 발현된다. 이것은 도 9에서 나타나며, 침투성 림프구 사이의 NKG2A+ 세포 (Z199 항체) (도 9A) 및 침투성 면역 세포, 내피 세포 및 활막 세포에 의한 HLA-E 발현 (3D12 항체) (도 9B)을 기술한다. NKG2A+ 세포는 9명의 OA 환자 중 6명의 활막에 존재하였다. RA 환자와 반대로, NKG2A+ 세포의 빈도는 디지털 이미지 분석으로 정량될 때, OA 활막에서 NK 세포의 그것과 상관 관계를 보이지 않으며 (r2=0.136, p=0.3295; 도 9C), OA 활막을 침투하는 NK 세포 중 일부는 NKG2A를 발현하지 않을 수도 있다는 것을 나타낸다.
종합해보면, 이들 데이터는 RA 활막의 그것과 유사한 OA 활액 세포 서브세트에서 NKG2A 및 HLA-E의 발현을 나타낸다. 따라서, NKG2A+ NK 세포는 OA 환자의 염증이 생긴 활막에서 HLA-E+ 활막 세포, 혈관 내피 세포 및 침투성 면역 세포를 인식할 수도 있다.
CD94-NKG2A에 대한 리간드, HLA-E는 RA 및 OA, 뿐만 아니라 건선성 관절염 (PsA) 환자의 염증이 생긴 활막에서 발현되는 것으로 발견되었다. 이것은 도 10에 나타나며, 항-HLA-E 항체 mAb MEM-E/02로 RA, OA 및 PsA 환자의 활막 조직 샘플의 염색을 기술한다 (지시된 바와 같이). 정상 대조군의 활막에서, HLA-E 발현은 도 10에 나타난 바와 같이, 혈관 내피 세포에서, 및 더 약하게 활막 내벽에 위치한 활막 세포의 서브세트에서 관찰된다.
이들 데이터는 PsA 환자의 염증이 생긴 활막에서 활막 세포, 혈관 내피 세포 및 침투성 면역 세포의 발현을 나타내며, NKG2A+ 세포는 이들 환자에서 이러한 HLA-E+ 세포 서브세트를 인식할 수도 있다.
본 발명의 특징이 여기에 도식되고 설명되는 한편, 많은 변형, 치환, 변화, 및 동등물이 이제 당업자에게 발생할 것이다. 그러므로, 첨부된 청구항은 본 발명의 진정한 사상 내에 속하는 이러한 모든 변형 및 변화를 커버하기 위한 것으로 생각되어야 한다.
구체예 :
1. 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 치료하기 위한 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
2. 구체예 1에 있어서, 연골 파괴 및/또는 뼈 침식의 감소가 환자에게 이로운 경우 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 치료하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
3. 구체예 1 또는 구체예 2에 있어서, 상기 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포의 선택적 제거를 자극하고 및/또는 뼈 침식 세포의 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
4. 구체예 1 내지 구체예 3 중 어느 하나에 있어서, 연골 파괴 세포의 선택적 제거 및/또는 뼈 침식성 세포의 감소는 환자에게 이로운 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
5. 구체예 1 내지 구체예 4 중 어느 하나에 있어서, 연골 파괴 세포는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
6. 구체예 1 내지 구체예 5 중 어느 하나에 있어서, 뼈 침식 세포는 용골 세포인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
7. 구체예 6에 있어서, 뼈 침식 용골 세포는 TRAP+ 다핵성 세포인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
8. 구체예 1 내지 구체예 7 중 어느 하나에 있어서, 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
9. 구체예 8에 있어서, 질환 또는 장애는 골관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
10. 구체예 8에 있어서, 질환 또는 장애는 골다공증인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
11. 구체예 8에 있어서, 질환 또는 장애는 건선성 관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
12. 구체예 8에 있어서, 질환 또는 장애는 류머티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
13. 구체예 1 내지 구체예 12 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 이들의 항원 결합 단편인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
14. 구체예 13에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', F(ab)2, F(ab')2, F(ab)3, Fv, 단일 사슬 Fv, dsFv, Fd 단편, dAb 단편, 미니바디, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디, 카파 바디; 낙타 IgG; IgNAR; 및 다중 특이적 항체 단편으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
15. 구체예 1 내지 구체예 14 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 Fab 단편인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
16. 구체예 1 내지 구체예 15 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 이중 특이적 항체인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
17. 구체예 1 내지 구체예 16 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 반감기 연장 모이어티에 콘쥬게이트되는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
18. 구체예 1 내지 구체예 17 중 어느 하나에 있어서, 상기 반감기 연장 모이어티는 하나 이상의 지방산 및 이들의 유도체, 히드록시 에틸 전분 (HES), 폴리 에틸렌 글리콜 (PEG), 히알루론산 (HA), 헤파로산 폴리머, 포스포릴콜린-기반 폴리머, 플렉시머, 덱스트란, 폴리시알산 (PSA), Fc 도메인, 트랜스페린, 알부민, 엘라스틴 유사 펩티드, XTEN 폴리머, 알부민 결합 펩티드, 및 이들의 어떤 조합으로 구성된 목록 중 하나 이상으로부터 선택된 반감기 연장 모이어티를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
19. 구체예 18에 있어서, 항체는 둘 이상의 다른 타입의 반감기 연장 모이어티에 콘쥬게이트될 수 있는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
20. 구체예 1 내지 구체예 19 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 돌연변이된 Fc 도메인을 포함하고, 상기 돌연변이는 감소된 Fcγ 수용체 결합 기능을 발생시키는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
21. 구체예 20에 있어서, 상기 Fc 도메인은 다음 돌연변이 중 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편: L234A, L235E, 및 G237A, A330S 및 P331S (카바트 번호 붙이기 계획에 따라).
22. 구체예 1 내지 구체예 21 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 IgG4 Fc 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
23. 구체예 22에 있어서, 상기 IgG4 Fc 도메인은 S241P/S228P 돌연변이를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
24. 구체예 1 내지 구체예 23 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 전체-길이 IgG4 항체 또는 이들의 단편인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
25. 구체예 1 내지 구체예 24 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체는 사람화된 또는 사람 항체인 것을 특징으로 하는 항-NKGA 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
26. 구체예 25에 있어서, 상기 항체는 humZ270 또는 humZ199인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
27. 구체예 25 또는 구체예 26에 있어서, 상기 항체는 humZ270인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
28. 구체예 25 내지 구체예 27 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYWMN)의 CRD1 서열 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 50-59 (RIDPYDSETH)의 CRD2 서열 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 95-102 (YCARGGYD)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
29. 구체예 25 내지 구체예 28 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 24-34 (RASENIYSYLA)의 CRD1 서열 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 50-56 (NAKTLAE)의 CDR2 서열
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산으로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 89-97 (QHHYGTPRT)의 CRD3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
30. 구체예 25 내지 구체예 29 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYWMN)의 CRD1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 50-59 (RIDPYDSETH)의 CRD2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산s 95-102 (YCARGGYD)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
31. 구체예 25 내지 구체예 30 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 24-34 (RASENIYSYLA)의 CDR1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 50-56 (NAKTLAE)의 CDR2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 89-97 (QHHYGTPRT)의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
32. 구체예 25 내지 구체예 31 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYWMN)의 CRD1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 50-59 (RIDPYDSETH)의 CRD2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 95-102 (YCARGGYD)의 CDR3을 포함하며
상기 항체의 경쇄는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 24-34 (RASENIYSYLA)의 CDR1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 50-56 (NAKTLAE)의 CDR1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 89-97 (QHHYGTPRT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
33. 구체예 25 내지 구체예 32 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 2를 포함하고 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
34. 구체예 1 내지 구체예 24 중 어느 하나에 있어서, NKG2A에 대한 결합에 대하여 구체예 25 내지 구체예 33 중 어느 하나의 항체와 경쟁하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
35. 구체예 25 또는 구체예 26에 있어서, 상기 항체는 humZ199인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
36. 구체예 25 또는 구체예 26에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYAMS)의 CRD1 서열 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)의 CRD2 서열 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 99-108 (HGDYPRFFDV)의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
37. 구체예 25 또는 구체예 26 또는 구체예 35 또는 구체예 36에 있어서, 상기 항체의 경쇄는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 24-34 (SASSSVSSYIY)의 CDR1 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 50-56 (LTSNLAS)의 CDR2 및/또는
- 이들 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 89-97 (QQWSGNPYT)의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
38. 구체예 25 또는 구체예 26 또는 구체예 35 내지 구체예 37 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYAMS)의 CRD1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)의 CRD2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 -108 (HGDYPRFFDV)의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
39. 구체예 25 또는 구체예 26 또는 구체예 35 내지 구체예 38 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 경쇄는
- SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 24-34 (SASSSVSSYIY)의 CDR1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 50-56 (LTSNLAS)의 CDR2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 -97 (QQWSGNPYT)의 CDR3을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
40. 구체예 25 또는 구체예 26 또는 구체예 35 내지 구체예 39 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYWMN)의 CRD1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 50-59 (RIDPYDSETH)의 CRD2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 2의 아미노산 95-102 (YCARGGYD)의 CRD3을 포함하고
상기 항체의 경쇄는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 24-34 (RASENIYSYLA)의 CDR1 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 50-56 (NAKTLAE)의 CDR2 서열 및/또는
- SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 89-97 (QHHYGTPRT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
41. 구체예 25 또는 구체예 26 또는 구체예 35 내지 구체예 40 중 어느 하나에 있어서, 상기 항체의 중쇄는 SEQ ID NO: 4를 포함하고 상기 항체의 경쇄는 SEQ ID NO: 5를 포함하는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
42. 구체예 1 내지 구체예 25 중 어느 하나에 있어서, NKG2A에 대한 결합에 대하여 구체예 35 내지 구체예 41 중 어느 하나의 항체와 경쟁하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
43. 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 치료하기 위한, 구체예 1 내지 구체예 7 또는 구체예 13 내지 구체예 42 중 어느 하나의 항-NKG2A 항체의 사용.
44. 구체예 43에 있어서, 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체의 사용.
45. 구체예 44에 있어서, 질환 또는 장애는 골관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체의 사용.
46. 구체예 44에 있어서, 질환 또는 장애는 골다공증인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체의 사용.
47. 구체예 44에 있어서, 질환 또는 장애는 건선성 관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체의 사용.
48. 구체예 44에 있어서, 질환 또는 장애는 류머티스성 관절염인 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체의 사용.
49. 구체예 1 내지 구체예 48 중 어느 하나의 항-NKG2A 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
50. 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나의 항-NKG2A 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 연골 파괴를 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
51. 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나의 항-NKG2A 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
52. 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나의 항-NKG2A 항체를 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 연골 파괴 및 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애를 치료하는 방법.
53. 구체예 1 내지 구체예 49에 있어서, 약으로 사용되는 것을 특징으로 하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
54. 약학적 조제물이 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나의 항체를 포함하는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편 약학적 조제물.
55. 구체예 1 내지 구체예 49 중 어느 하나에 있어서, 약의 제조를 위한 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편의 사용.
간행물, 특허 출원 및 특허를 포함하는, 여기에 인용된 모든 참고문헌은 각 참고문헌이 개별적으로 및 특이적으로 참고로 포함되는 것으로 나타나고 전문이 본원에서 제시되는 바와 같은 정도로 본원에 참고로 포함된다.
모든 주제 및 부제는 여기에서 편의를 위해서만 사용되었고 어떤 방법으로도 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
이들의 모든 가능한 변이체에서 상기-설명된 요소의 어떤 조합도 여기에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 분명하게 부인되지 않으면 본 발명에 포함된다.
달리 명확히 지시되지 않거나 문맥에 의해 분명히 부인되지 않으면, 용어 또는"은 여기에서
"및/또는"을 포함하는 의미로 사용되고, 따라서, 함축적으로 용어가 이것 또는 저것을 포함하는 의미로 이해되기 위한 구체예 또는 양태에 대한 지지를 제공한다.
본 발명을 설명할 맥락에서 사용된 용어 "하나" 및 "하나" 및 "그" 및 유사한 지시체는 여기에 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 분명히 부인되지 않으면, 단수형 및 복수형 둘 다를 커버하는 것으로 이해되어야 한다.
여기에서 값의 범위의 서술은 달리 지시되지 않으면, 단지 범위 내에 속한 각각의 별개의 값을 개별적으로 나타내는 속기 방법의 역할을 하기 위한 것이고, 그것이 개별적으로 여기에서 재인용된 것처럼 각각의 별개의 값은 명세서에 포함된다. 달리 진술되지 않으면, 여기에서 제공된 모든 정확한 값은 해당하는 근사값을 대표한다 (예를 들어, 특정 인자 또는 측정값에 관하여 제공된 모든 정확한 전형적인 값은 해당하는 대략적인 측정값을 제공하는 것으로도 생각될 수 있고, 적절한 경우, "약"으로 변형된다).
여기에 설명된 모든 방법은 여기에서 달리 지시되지 않거나 문맥에 의해 분명히 부인되지 않으면 어떤 적합한 순서로도 수행될 수 있다.
여기에 제공된 모든 예, 또는 예시적 언어 (예를 들어, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 분명히 하기 위한 것이고 달리 지시되지 않으면 본 발명의 범위에 대한 제한을 제기하지 않는다. 명세서의 언어는 어떤 요소도 많은 것이 명시적으로 진술되지 않는 한 본 발명의 실행에 필수적인 것으로 이해되어서는 안 된다.
여기에서 특허 문서의 인용 및 포함은 편의를 위해서만 실행되고 이러한 특허 문서의 타당성, 특허 자격 및/또는 시행 가능성의 어떤 관점도 반영하지 않는다.
요소 또는 요소들에 관하여 "포함하는", "갖는", "포함하는" 또는 "함유하는"과 같은 용어를 사용하는 본 발명의 어떤 양태 또는 구체예의 설명도 여기에서 달리 진술되거나 문맥에 의해 분명히 부인되지 않으면, 상기 특정 요소 또는 요소들로 "구성되거나", "본질적으로 구성되거나", 이를 "실질적으로 포함하는" 본 발명의 유사한 양태 또는 구체예에 대한 지지를 제공하기 위한 것이다 (예를 들어, 특정 요소를 포함하는 것으로 여기에 설명된 조성물은 달리 진술되거나 문맥에 의해 분명히 부인되지 않으면, 상기 요소로 구성된 조성물을 또한 설명하는 것으로 이해되어야 한다).
본 발명은 관련 법률에 의해 허용되는 최대의 범위로 여기에서 제공된 양태 또는 청구항에 인용된 주제의 모든 변형 및 동등물을 포함한다.
SEQUENCE LISTING <110> Novo Nordisk A/S <120> SELECTIVE ELIMINATION OF EROSIVE CELLS <130> 8277 <160> 5 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 233 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn 1 5 10 15 Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu 20 25 30 Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala 35 40 45 Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu 50 55 60 Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys 65 70 75 80 Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr 85 90 95 Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys 100 105 110 Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn 115 120 125 Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu 130 135 140 Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu 145 150 155 160 Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly 165 170 175 Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu 180 185 190 Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys 195 200 205 Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser 210 215 220 Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu 225 230 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> humanized sequence <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu 50 55 60 Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe 100 105 110 Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser 115 120 <210> 3 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 4 <211> 119 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 4 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Humanized sequence <400> 5 Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Tyr 20 25 30 Ile Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105

Claims (15)

  1. 연골 파괴 및/또는 뼈 침식의 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  2. 상기 항-NKG2A 항체는 연골 파괴 세포의 선택적 제거를 자극하고 및/또는 뼈 침식 세포의 형성을 감소시키는 것을 특징으로 하는, 제1 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  3. 연골 파괴 세포는 섬유아세포-유사 활막 세포 (FLS)인 것을 특징으로 하는, 제1 항 또는 제2 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  4. 뼈 침식 세포는 용골 세포인 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제3 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  5. 연골 파괴 및/또는 뼈 침식을 특징으로 하는 질환 또는 장애의 치료를 위한 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제4 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  6. 질환 또는 장애는 골관절염인 것을 특징으로 하는, 제5 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  7. 질환 또는 장애는 골다공증인 것을 특징으로 하는, 제5 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  8. 질환 또는 장애는 건선성 관절염인 것을 특징으로 하는, 제5 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  9. 질환 또는 장애는 류머티스성 관절염인 것을 특징으로 하는, 제5 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  10. 상기 항체는 사람화된 또는 사람 항체인 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제9 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  11. 상기 항체는 humZ270 또는 humZ199인 것을 특징으로 하는, 구체예 25에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  12. 상기 항체의 중쇄는
    - 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYWMN)의 CRD1 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 50-59 (RIDPYDSETH)의 CRD2 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 2의 아미노산 95-102 (YCARGGYD)의 CRD3 서열을 포함하고,
    상기 항체의 경쇄는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 24-34 (RASENIYSYLA)의 CDR1 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 50-56 (NAKTLAE)의 CDR2 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 3의 아미노산 잔기 89-97 (QHHYGTPRT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  13. 상기 항체의 중쇄는
    - 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 잔기 31 내지 35 (SYAMS)의 CRD1 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 50-65 (EISSGGSYTYYADSVK)의 CRD2 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 4의 아미노산 99-108 (HGDYPRFFDV)의 CDR3 서열을 포함하고,
    상기 항체의 경쇄는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 24-34 (SASSSVSSYIY)의 CDR1 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나 또는 둘이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 50-56 (LTSNLAS)의 CDR2 서열 및/또는
    - 아미노산 잔기 중 하나, 둘 또는 셋이 다른 아미노산 잔기로 치환될 수도 있는, SEQ ID NO: 5의 아미노산 잔기 89-97 (QQWSGNPYT)의 CDR3 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  14. 제12 항의 항체 및/또는 제13 항의 항체와 경쟁하는 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제11 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
  15. 약학적 조제물로서 사용되는 것을 특징으로 하는, 제1 항 내지 제14 항 중 어느 한 항에 따른, 치료에 사용되는 항-NKG2A 항체, 또는 이들의 항원 결합 단편.
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