BR112013032217B1 - uso de um anticorpo anti-nkg2a - Google Patents

Abstract

ANTICORPO ANTI-NKG2A, OU FRAGMENTO DE LIGAÇÃO DE ANTÍGENO DO MESMO, SEU USOS, E FORMULAÇÃO FARMACÊUTICA. A presente invenção refere-se ao tratamento de doenças caracterizadas por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea. Em particular a presente invenção refere-se ao tratamento de osteoartrite, osteoporose, artrite psoriática ou artrite reumática com um anticorpo de anti-NKG2A.

Description

CAMPO TÉCNICO

[001] A presente invenção diz respeito ao tratamento de erosão do osso e destruição da cartilagem. Em particular, tratamento de doenças de destruição do osso e da cartilagem usando fármacos biológicos tais como, por exemplo, anticorpos.

ANTECEDENTES

[002] Células assassinas naturais (NK) são linfócitos derivados da medula óssea essenciais para a defesa do hospedeiro contra certas infecções e tumores. Sob ativação, elas rapidamente produzem uma faixa de citocinas e podem mediar respostas citotóxicas contra as células infetadas, estressadas, ou tumorigênicas. O papel das células NK em doenças inflamatórias crônicas está emergindo, e é apreciado cada vez mais que as células NK podem representar um papel importante na modulação das respostas das células T e B através de sua capacidade de promover a diferenciação e a maturação das células dendríticas (DC) e a polarização subsequente das respostas das células T (vide por exemplo Cooper et al. (2004) Trends Immunol. 25: 4752; Zhang et al. (2007) Blood 1° de outubro;110(7):2484-93). Além disso, estudos mostraram que as células NK têm a capacidade para diretamente eliminar os subconjuntos de células T ativadas por meio das respostas citotóxicas mediadas pelas células (Lu et al. (2007) Immunity. 26: 593-604). A atividade das células NK é regulada por um mecanismo complexo que envolve ambos sinais de ativação e inibitórios (vide, por exemplo, Moretta et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:197223; Moretta et al. (2003) EMBO j EPub 18 de dezembro; Ravetch et al. (2000) Science 290:84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102:1797805; Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-

[003] Vários receptores NK-específicos diferentes foram identifi- cados que estão envolvidos em reconhecimento mediado por células NK e matança das células alvo deficientes de HLA da Classe I. Um inibidor do receptor de células NK de importação é CD94/NKG2A, que interage com a molécula de MHC da classe I não clássica HLA-E (vide, por exemplo, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (199) J Immunol 162:305-313; Miller et al. (2003) J Immunol 171:1369-75; Brooks et al. (1997) J Esp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311; pedido de patente US no. 20030095965).

[004] CD94/NKG2A é um receptor inibidor encontrado nos sub conjuntos de células NK, NKT e T, que restringe sua matança de células expressando os peptídeos pequenos carregando HLA-E de ligante de CD94/NKG2A tipicamente derivados da sequência líder de outras moléculas de MHC da classe I (vide, por exemplo, WO99/28748 e Braud et al. (1998) Nature 391:795-799).

[005] Vários anticorpos contra NKG2A foram descritos na técnica. Por exemplo, Sivori et al. (Eur j Immunol 1996;26:2487) refere-se ao anticorpo de anti-NKG2A murino Z270; Carretero et al. (J Exp Med 1999;190:1801-12) refere-se ao anticorpo de NKG2A antimurino de rato 20D5; pedido de patente US, publicado como US20030095965 descreve anticorpo murino 3S9, que liga a NKG2A, NKG2C e NKG2E, pedido de patente WO06070286 revela anticorpos monoclonais contra NKG2A e o pedido de patente WO2008/009545 descreve o anticorpo humanizado humZ270 e outros anticorpos de anti-NKG2A com cadeia pesada variável e/ou cadeia leve variável substancialmente idênticas às do Z270.

SUMÁRIO

[006] Artrite reumatoide (RA) é uma doença inflamatória crônica onde a ativação dos mediadores inflamatórios produzidos eventual- mente pelos múltiplos subconjuntos celulares resulta na destruição da cartilagem da articulação e do osso. Em geral aceita-se que os subconjuntos celulares principais responsáveis pela destruição da cartilagem e do osso em RA sejam os sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS) e os osteoclastos, respectivamente. Células T e células NK de expressão de CD94-NKG2A podem suprimir a inflamação matando as células pró-inflamatórias ativadas. Ativação destas células pode ser realizada por uma série de células e moléculas diferentes incluindo macrófagos, células T e células B de CD4+ ativadas/células plasmáticas. Porém, esta atividade reguladora, anti-inflamatória é inibida quando os receptores de CD94-NKG2A prendem-se a seu ligante de HLA-E na superfície das células pró-inflamatórias. Bloqueando os receptores de CD94- NKG2A e impedindo sua sinalização inibidora, NNC141-0100 intensifica as atividades anti-inflamatórias das células T e células NK de CD94-NKG2A+ reguladoras, ao mesmo tempo reforçando sua habilidade para eliminar, por exemplo, células T de CD4+ pró-inflamatórias ativadas, e sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS). Uma terapia que especificamente elimina FLS de erosão agressiva da cartilagem e suprime a formação de osteoclastos erosivos ósseos ao mesmo tempo deixando as células de repouso não afetadas pode ter uma vantagem significativa sobre as terapias de RA atuais e poderia potencialmente também com o benefício para os pacientes ser usada no tratamento de osteoartrite (OA) e artrite psoriática (PsA).

[007] Esta invenção revela como um anticorpo de anti-NKG2A atenua as duas vias patogênicas principais em RA, isto é, erosão do osso e da cartilagem, por sua capacidade para reduzir a formação de osteoclastos degradantes dos ossos e por seletivamente intensificar a eliminação de FLS degradante da cartilagem, respectivamente.

[008] As terapêuticas existentes que visam RA agem diretamente nos componentes individuais da cascata inflamatória, e sua eficácia com respeito à erosão óssea é secundária a seu efeito anti- inflamatório. mAbs de anti-NKG2A capazes de inibir a ligação de HLA- E ou que não competitivamente podem bloquear a função de CD94/NKG2A e estimular o mecanismo imune-regulador endógeno das células NK, resultando em eliminação seletiva das células que promovem a degradação da cartilagem, a erosão do osso e redução em IL-6, uma citocina conhecida promover a inflamação. Desse modo, tratamento terapêutico com um mAb de anti-NKG2A pode ter um efeito direto na patogênese em doenças caracterizadas por erosão óssea ou destruição da cartilagem.

[009] A presente invenção revela o uso de um anticorpo de anti- NKG2A, ou um fragmento do mesmo, capaz de tratar a destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[0010] A presente invenção revela o uso de um anticorpo de anti- NKG2A para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[0011] A presente invenção revela o uso de um anticorpo de anti- NKG2A para o tratamento de destruição da cartilagem e/ou erosão óssea em que o anticorpo de anti-NKG2A estimula a eliminação seletiva das células ativadas que promovem a degradação da cartilagem ou erosão óssea. Em uma modalidade da presente invenção, as células degradantes da cartilagem são sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS). Em uma modalidade, as células de erosão óssea são osteoclastos erosivos.

[0012] A presente invenção revela o uso de um anticorpo de anti- NKG2A para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea, em que o anticorpo de anti-NKG2A estimula a eliminação seletiva das células ativadas que promovem degradação da cartilagem ou erosão óssea. Em uma modalidade da presente invenção, as células degradantes da cartilagem são sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS). Em uma modalidade, as células de erosão óssea são osteoclastos erosivos.

[0013] Os anticorpos de NKG2A usados na presente invenção po dem por quaisquer anticorpos de anti-NKG2A adequados. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de anti-NKG2A monoclonal. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de anti-NKG2A humanizado. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de anti- NKG2A completamente humano. Em uma modalidade, o anticorpo é um anticorpo de anti-NKG2A como descrito em WO2008/009545. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-NKG2A monoclonal é humZ270 como descrito na publicação de patente WO2008/009545. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-NKG2A é um anticorpo de anti-NKG2A monoclonal como descrito na publicação de patente WO09092805. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-NKG2A é humZ199 como descrito na publicação de patente WO09092805.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS1

[0014] Fig. 1 ilustra o perfil de expressão de um painel de molécu las de superfície celular expressas por sinoviócitos do tipo fibroblastos gerados in vitro derivados do tecido sinovial de pacientes com artrite reumatoide (RA).

[0015] - Fig. 1A. mostra que os sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS) derivados de pacientes de RA expressam CD55 (superposição de histograma direito) mas carência CD68 (superposição de histograma esquerdo).

[0016] - Fig. 1B. mostra que a superfície celular de RA-FLS ex pressa vários ligantes para ativar os receptores de células NK (por exemplo MICA, ULBP1, ULBP2, ULBP3, ICAM1, CD155, CD48) como indicado abaixo em cada superposição de histograma. Como indicado, RA-FLS tingem efetivamente com fusão de NKp44-FC sugerindo que RA-FLS expressam um ligante putativo para NKp44.

[0017] - Fig. 1C. mostra que um anticorpo contra NKp44, de forma dependente da dose, impede a ligação de uma proteína de fusão de NKp44-FC solúvel em RA-FLS sugerindo que RA-FLS expressam um ligante capaz de interagir com o receptor de NKp44.

[0018] - Fig. 1D. mostra que RA-FLS expressam ligantes de MHC da classe I HLA-E e HLA-G, ligantes conhecidos ser reconhecidos pelos receptores das células NK (por exemplo CD94/NKG2A e LIR-1, respectivamente).

[0019] - Fig. 1E. mostra que RA-FLS expressam receptor 5 de morte (DR5) mas não DR4, receptores conhecidos que ligam TRAIL.

[0020] 1 Se relevante

[0021] Fig. 2 mostra que as células NK de expressão de NKG2A estão presentes na sinóvia de RA e podem ser encontradas em áreas contendo RA-FLS de expressão de HLA-E.

[0022] - Fig. 2A. mostra tecido sinovial de RA tingido com um anti corpo contra NKp46 humano. As áreas de cor escura são células de expressão de NKp46.

[0023] - Fig. 2B. mostra uma seção adjacente do mesmo tecido tingida com um anticorpo contra NKG2A humano. As áreas de cor escura são células de expressão de NKG2A.

[0024] - Fig. 2C. mostra uma seção de tecido adjacente tingida com um anticorpo de controle de isótopo.

[0025] - Fig. 2D. mostra a frequência de células de NKG2A+/mm2 de tecido sinovial representado em gráfico contra a frequência de células de NKp46+/mm2 de tecido sinovial quando avaliado por análise de imagem digital quantitativa. Os dados indicam que a maioria das células de NKG2A+ são células NK no tecido sinovial de RA inflamado.

[0026] - Fig. 2E. mostra tecido sinovial de RA tingido com anticor po de anti-HLA-E. As células no forro sinovial, incluindo RA-FLS, expressam HLA-E. A seta indica uma área de HLA-E fortemente tingida expressando as células FLS-símiles do forro sinovial.

[0027] - Fig. 2F. mostra que as células imunes infiltrantes no sub- forro sinovial expressam HLA-E.

[0028] - Fig. 2G. mostra tecido sinovial de RA tingido com anticor po de controle de isótipo.

[0029] - Fig. 2H. mostra que as células endoteliais vasculares ex pressam HLA-E.

[0030] Fig 3. mostra que as células NK, incluindo as células NK sinoviais derivadas de pacientes de RA, expressam um painel de receptores de ativação conhecidos ligar a ligantes que são expressados em RA-FLS

[0031] - Fig. 3A:

[0032] o Fig. 3A (i) mostra expressão do receptor de célula NK em células NK agrupadas derivadas de SFMC de um paciente de RA re-presentativo. As células NK sinoviais expressam NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, e TRAIL, mas nada, ou níveis muito baixos de NKG2C como indicado pelo superposições de histograma abertas.

[0033] o Fig. 3A. (ii) mostra células NK de CD56bright de repouso de PBMC derivado de um doador saudável representativo. As células NK de CD56bright expressam NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA-1, e TRAIL, mas nada, ou níveis muito baixos de NKG2C como indicado pelas superposições de histograma abertas.

[0034] o Fig. 3A. (iii) mostra células NK de Nishi. As células NK de Nishi expressam NKG2D, NKp30, NKp44, NKp46, DNAM1, 2B4, LFA- 1, e TRAIL, mas nada, ou níveis muito baixos de NKG2C como indicado pelas superposições de histograma abertas.

[0035] - Fig. 3B. mostra que as células NK eliminam RA-FLS ade rentes in vitro:

[0036] o Fig. 3B. (i) mostra que as células NK cocultivadas com RA-FLS durante a noite resultam na eliminação de RA-FLS aderentes em uma maneira dose-dependente.

[0037] o Fig. 3B (ii). mostra a área bem coberta por RA-FLS ade rentes quando cultivada sozinha, ou quando cocultivada com quantidade decrescente de células NK durante a noite, como analisado por análise de imagem Immunospot.

[0038] - Fig. 3C. mostra que as células NK desgranulam-se con forme medidas por expressão de superfície celular de CD107a/b quando cocultivadas com RA-FLS, mas não quando cultivadas sozinhas, indicando que as células NK matam RA-FLS ativamente.

[0039] - Fig. 3D mostra que mascarando NKG2D, NKp44, NKp46, DNAM-1, ou TRAIL expressados pelas células NK resulta em morte significativamente reduzida de RA-FLS conforme medido por expressão de superfície celular de CD107a/b em células NK efetoras.

[0040] - Fig. 4. mostra que RA-FLS são protegidos da citotoxicida- de mediada pelas células NK por expressão de HLA-E capaz de ligar aos receptores das células NK de CD94-NKG2A inibidor.

[0041] - Fig. 4A. mostra que as células NK sinoviais de RA (painel superior), células de PB-NK saudáveis de CD56bright (painel intermediário), e células NK de Nishi (painel inferior) todas expressam NKG2A de superfície celular (esquerda), mas são desprovidas de KIRs (direito). Além disso, as células de Nishi, mas não células NK sinoviais ou células NK de CD56bright, expressam LIR1 (painel intermediário)

[0042] - Fig. 4B. mostra desgranulação de células NK aumentada conforme medido por expressão de superfície celular de CD107a/b quando as células NK são cocultivadas com RA-FLS na presença de anti-NKG2A (painel direito), mas não na presença de anti-LIR1 (painel esquerdo).

[0043] - Fig. 4C. mostra depuração aumentada dependente de cé lulas NK de RA-FLS aderentes quando tratadas com anti-NKG2A (imagem à direita) quando comparadas ao tratamento com um controle de isótipo (imagem intermediária). RA-FLS cultivados na ausência de células NK são mostrados na imagem de micrógrafo à esquerda.

[0044] - Fig. 4D. mostra que as células NK sinoviais desgranulam- se quando cocultivadas com RA-FLS autólogos (14%, topo à esquerda) e que mascarar NKG2A resulta em desgranulação aumentada (44%, topo à direita). Células T de CD3+ CD8+ autólogas não desgra- nulam-se significativamente quando cocultivadas com RA-FLS autólo- gos na ausência (isto é, culturas tratadas com isótipo, fundo à esquerda) ou presença (fundo à direita) de anti-NKG2A.

[0045] - Fig. 4E. mostra que células de PB-NK de CD56bright re centemente isoladas e não estimuladas de doadores saudáveis des- granulam-se quando cocultivadas com RA-FLS na presença de anti- NKG2A mas minimamente assim quando tratadas com um anticorpo de controle de isótipo. O painel superior mostra um exemplo representativo e o gráfico do fundo mostra a % de expressão de CD107a/b em células NK de CD56bright de 5 doadores separados cocultivadas com RA-FLS na presença de um isótipo vs anti-NKG2A.

[0046] Fig. 5A. mostra que bloqueio de NKG2A usando NNC141- 0100 (humZ270) leva à eliminação aumentada mediada por célula NK de RA-FLS conforme medido por um ensaio de liberação de LDH. Células efetoras de NKL são mostradas à esquerda e células NK de Nishi à direita contra uma célula alvo de RA-FLS representativa.

[0047] Fig 5B. Mostra que bloqueio de NKG2A usando NNC141- 0100 (humZ270) leva à lise aumentada de uma RA-FLS representativa (RA-FLS2) mas não afeta a eliminação de uma linhagem celular de fibroblasto de prepúcio normal (FSK4).

[0048] Fig. 6. mostra que NNC141-0100 (humZ270) inibe a forma ção de osteoclastos multinucleados de TRAP+:

[0049] - Fig. 6A. mostra um exemplo representativo de RA-SFMC cultivado durante 7 dias na presença de isótipo de humIgG4. Várias células grandes de TRAP+ multinucleadas são visíveis.

[0050] - Fig 6B. mostra que o tratamento de humZ270 resulta em números drasticamente reduzidos de células grandes de TRAP+ multi- nucleadas.

[0051] - Fig. 6C. mostra a formação de osteoclastos em SFMC de rivados de pacientes com RA cultivados em meio ou IL-15 na presença de um controle de isótipo vs anti-NKG2A (humZ270, NNC141-0100) como indicado. Mascarar NKG2A nas culturas estimuladas com IL-15 resulta em número reduzido de células de TRAP+ multinucleadas.

[0052] - Fig. 6D. mostra que a formação de osteoclastos erosivos dos mineiros do osso em SFMC derivados de pacientes com RA é suprimida pelo tratamento com NNC141-0100. Mostrado é um exemplo representativo de erosão mineral óssea observada de uma cultura de SFMC de paciente de RA no. 2357. SFMC é crescido em discos osteo- lógicos na presença de IL-15 e mAb de isótipo (esquerda) vs anti- NKG2A (humZ270, direita). Os discos foram tingidos com von Kossa e as áreas erodidas foram analisadas usando Analisador Immunospot S5 e pareceram brancas contra o fundo mais escuro.

[0053] - Fig. 6E. SFMC derivada de pacientes de RA (n=5) foi cul tivada em meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15. No começo do ensaio, 20 micrograma/mL de isótipo de IgG4 humano (barra branca) ou 20 microgramas/mL de NNC141-0100 (humZ270, barra preta) foram acrescentados às culturas. A porcentagem média +/- SEM de área de disco erodida foi quantificada usando Analisador Immunospot S5.

[0054] - Fig. 6F mostra que HumZ270 suprimem a erosão mineral óssea em culturas de explante de tecido sinovial de RA. A figura mostra um exemplo onde raspagens de tecido sinovial de RA foram crescidas em triplicata em poços em discos minerais ósseos na presença de meio sozinho (controle, topo), controle de isótipo (segundo do ci- ma), infliximab (IFX, terceiro do topo), ou anti-NKG2A (humZ270, fundo). As áreas claras representam erosão mineral óssea.

[0055] - Fig. 6G. mostra a porcentagem de erosão mineral óssea observada como determinado por análise usando um Immunospot analisado.

[0056] Fig. 7:

[0057] - Fig. 7A. mostra modulação dos níveis de citocina quando medidos em 24 h em culturas de SFMC in vitro sob tratamento com humZ270 (NNC141-0100, barras cinza-escuras) quando comparado a um controle de isótipo (barras cinza-claras). Uma redução significativa nos níveis de IL6 é observada ao mascarar NKG2A. Além disso, um aumento leve em M-CSF é observado.

[0058] - Fig. 7B. mostra uma comparação em pares dos níveis de IL-6 produzidos na presença de anti-NKG2A (NNC141-0100, humZ270) vs controle de isótipo em culturas de RA-SFMC (n=11).

[0059] - Fig. 7C. mostra que anti-NKG2A inibe tanto produção de IL-6 de linha base (isto é, meio sozinho) como estimulada com IL-15 em culturas ex vivo de SFMC derivada de pacientes com RA. Média e SD de dois pacientes de RA representativos são mostrados.

[0060] - Fig. 8. mostra que as células NK presentes em tecido si- novial de RA expressam o receptor de NKG2A inibidor e estão localizadas predominantemente em agregados linfoides adjacentes aos si- noviócitos que expressam HLA-E, o ligante para CD94-NKG2A.

[0061] - 8A. mostra tecido sinovial de RA de ID 1144-09 tingido para células NK com um anticorpo de anti-NKp46.

[0062] - 8B. mostra tecido sinovial de RA de ID 1591-08 tingido para células NK com um anticorpo de anti-NKp46.

[0063] - 8C. mostra tecido sinovial de RA de ID 1144-09, tingido para NKG2A com o anticorpo de Z199 (um anticorpo de anti-NKG2A).

[0064] - 8D. mostra tecido sinovial de RA de ID 1591-08, tingido para NKG2A com o anticorpo de Z199 (um anticorpo de anti-NKG2A).

[0065] - 8E. mostra tecido sinovial de RA de ID 1144-09, tingido para HLA-E com o anticorpo de 3D12.

[0066] - 8F. mostra tecido sinovial de RA de ID 1591-08, tingido para HLA-E com o anticorpo de 3D12.

[0067] - 8G. mostra tecido sinovial de RA de ID 1144-09, tingido para células T com um anticorpo de anti-CD3.

[0068] - 8H. mostra tecido sinovial de RA de ID 1591-08, tingido para células T com um anticorpo de anti-CD3.

[0069] - 8I. mostra tecido sinovial de RA de ID 1144-09, tingido com um anticorpo de controle de isótipo de IgG2b.

[0070] - 8J. mostra tecido sinovial de RA de ID 1591-08, tingido com um anticorpo de controle de isótipo de IgG2b.

[0071] - 8K. mostra umas imagens de ampliação alta de células NK de NKp46+ de ID 1595-08.

[0072] - 8L. mostra umas imagens de ampliação alta de células de NKG2A+ de ID 1595-08.

[0073] - 8M. mostra uma análise de imagem digital para correlação do número de células de NKG2A+ na sinóvia de 15 pacientes de RA com o número de células NK de NKp46+.

[0074] - Fig. 9. mostra que NKG2A e seu ligante, HLA-E, são ex pressados na sinóvia de pacientes com osteoartrite (OA).

[0075] - 9A. descreve células de NKG2A+ (anticorpo de Z199) en tre linfócitos infiltrantes.

[0076] - 9B. descreve expressão de HLA-E (anticorpo de 3D12) me diante infiltração de células imunes, células endoteliais e sinoviócitos.

[0077] - 9C. mostra uma análise de imagem digital para correlação da frequência de células NKG2A+ com a de células NK na sinóvia de OA.

[0078] - Fig. 10. mostra que o ligante de CD94-NKG2A foi obser vado ser expressado na sinóvia inflamada de não só pacientes de RA e OA, mas também em pacientes de PsA.

[0079] - 10A. descreve tingimento de amostras de tecido sinovial de paciente de RA.

[0080] - 10B. descreve tingimento de amostras de tecido sinovial de paciente de PsA.

[0081] - 10C. descreve tingimento de amostras de tecido sinovial de paciente de RO (OA????)

[0082] - 10D. descreve tingimento de amostras de tecido sinovial de controle normal

[0083] - Fig. 11 mostra a sequência de aminoácido de:

[0084] - 11A.: SEQ. ID. NO. 1.; humNKG2A,

[0085] - 11B.: SEQ. ID. NO. 2.; domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo de humZ270,

[0086] - 11C.: SEQ. ID. NO. 3.; domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo de humZ270,

[0087] - 11D.; SEQ. ID. NO. 4.; domínio variável da cadeia pesada (VH) do anticorpo de humZ199,

[0088] - 11E. SEQ. ID. NO. 5.; domínio variável da cadeia leve (VL) do anticorpo de humZ199.

DESCRIÇÃO

[0089] O termo "anticorpo" como referido aqui refere-se ao poli- peptídeo derivado de uma sequência de imunoglobulina de linhagem germinal. O termo inclui anticorpos completos e qualquer fragmento de ligação de antígeno ou cadeias simples dos mesmos. Os termos "anticorpo", "anticorpo monoclonal" e "mAb", como aqui usados, são intencionados a referir-se às moléculas de imunoglobulina e fragmentos das mesmas que têm a habilidade para especificamente ligar a um an- tígeno. Uma subclasse das imunoglobulinas de interesse farmacêutico particular são aquelas pertencendo à família de IgG, que pode ser subdividida nos isótipos IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4. As moléculas de IgG são compostas de duas cadeias pesadas encadeadas por duas ou várias ligações de dissulfeto e duas cadeias leves, uma ligada a cada uma das cadeias pesadas por uma ligação de dissulfeto. A cadeia pesada de IgG é composta de quatro domínios de Ig, incluindo o domínio variável (VH) e três domínios constantes (CH1, CH2, e CH3). Cada cadeia leve é compreendida de uma região variável da cadeia leve (VL) e uma região constante da cadeia leve (CL). As regiões variáveis das cadeias pesadas e leves contêm um domínio de ligação que interage com um antígeno. As regiões VH e VL podem ser ainda subdivididas em regiões de hipervariabilidade, denominadas regiões de determinação de complementaridade (CDRs), entremeadas com regiões que são mais conservadas, denominadas regiões estruturais (FR). Cada VH e VL é composta de três CDRs e quatro FRs, dispostas do término amino ao término carbóxi na ordem seguinte: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4.

[0090] As regiões constantes dos anticorpos podem mediar a liga ção do anticorpo para hospedar tecidos ou fatores, incluindo várias células do sistema imune (por exemplo, células efetoras), receptores de Fc (FcRs) e o primeiro componente (C1q) do sistema de complemento clássico. Ligação a FcRs e C1q pode mediar efeitos tais como ADCC ou CDC.

[0091] Um anticorpo da invenção pode ser qualquer anticorpo de ligação de NKG2A, o anticorpo de humZ270 (SEQ. ID. NO. 2 e SEQ. ID. NO. 3) ou o anticorpo de humZ199 (SEQ. ID. NO. 4 e SEQ. ID. NO. 5) ou qualquer outro anticorpo da invenção, ou uma variante de qualquer um destes anticorpos.

[0092] Os termos Z270 humanizado ou humZ270 ou hZ270 como aqui usados, compreendem o anticorpo revelado no pedido de patente WO08009545 que é por este meio incorporado por referência neste pedido de patente. Os termos Z199 humanizado ou humZ199 como aqui usados compreendem o anticorpo revelado na publicação de patente WO09092805 que é por este meio incorporada por referência no pedido de patente atual.

[0093] Como aqui usado, o termo Ab compreende um anticorpo, ou um fragmento do mesmo, que especificamente liga seu Ag correspondente. Exemplos de fragmentos de ligação de antígeno incluem, mas não são restringidos a, Fab, Fab’, F(ab)2, F(ab’)2, Fv (tipicamente os domínios VL e VH de um braço simples de um anticorpo), Fv de cadeia simples (scFv; vide por exemplo, Bird et al., Science 1988; 242:42S-426; e Huston et al. PNAS 1988; 85:5879-5883), dsFv, Fd (tipicamente o domínio de VH e CHI), e fragmentos de dAb (tipicamente um domínio de VH); domínios de VH, VL, VhH, e V-NAR; moléculas monovalentes compreendendo uma cadeia de VH simples e uma de VL simples; minicorpos, diacor- pos, triacorpos, tetracorpos, e corpos capa (vide, por exemplo, Ill et al.. Protein Eng 1997;10:949-57); IgG de camelo; IgNAR; como também uma ou mais CDRs isoladas ou um paratopo funcional, onde as CDRs isoladas podem ser associadas ou os resíduos de ligação de antígeno ou po- lipeptídeos podem ser ligados para formar um fragmento de anticorpo funcional. Vários tipos de fragmentos de anticorpo foram descritos ou revisados, por exemplo, em Holliger e Hudson, Nat Biotechnol 2005;2S:1126-1136; WO2005040219, e Pedidos de Patente publicados U. S. 20050238646 e 20020161201.

[0094] O termo "fragmentos de ligação de antígeno" de um anti corpo refere-se a um ou mais fragmentos de um anticorpo que retém a habilidade para especificamente ligar a um antígeno, tal como NKG2A ou outra molécula alvo como descrita aqui. Foi mostrado que a função de ligação de antígeno de um anticorpo pode ser executada por fragmentos de um anticorpo completo. Exemplos de fragmentos de ligação abrangidos dentro do termo "fragmento de ligação de antígeno" de um anticorpo incluem um fragmento de Fab, um fragmento de F(ab’)2, um fragmento de Fab’, um fragmento de Fd, um fragmento de Fv, um fragmento de ScFv, um fragmento de dAb e uma região de determinação de complementaridade isolada (CDR). Anticorpos de cadeia simples tais como scFv e anticorpos de cadeia pesada tais como VHH e anticorpos de camelo de domínio simples são também intencionados ser abrangidos dentro do termo "porção de ligação de antígeno" de um anticorpo. Estes fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas convencionais conhecidas àqueles de habilidade na técnica, e os fragmentos podem ser triados para utilidade da mesma maneira como anticorpos intactos.

[0095] Um fragmento de "Fab" inclui um domínio variável e um domínio constante da cadeia leve e um domínio variável e o primeiro domínio constante (CH1) da cadeia pesada. Um fragmento de Fab’ inclui uma ou mais ligações terminais de cisteína carbóxi às cadeias pesadas ou leves. Fragmentos de anticorpo de F(ab’)2 compreendem um par de fragmentos de Fab que são em geral covalentemente ligados próximo a seus términos carbóxi através de cisteínas de dobradiça. Outros acoplamentos químicos de fragmentos de anticorpo são também conhecidos na técnica. Um fragmento de Fab retém a habilidade do anticorpo de origem de ligar a seu antígeno, potencialmente com uma afinidade inferior. Fragmentos de F(ab’)2 são capazes de ligação divalente, enquanto que os fragmentos de Fab podem ligar mo- novalentemente apenas. Em geral, os fragmentos de Fab carecem dos domínios constantes de CH2 e de CH3, isto é, a parte de Fc onde a interação com os receptores de Fc ocorreria. Desse modo, os fragmentos de Fab são em geral destituídos das funções efetoras.

[0096] Um fragmento de "Fv" é um fragmento de anticorpo que contém um sítio completo de reconhecimento e de ligação de antíge- no, e em geral compreende um dímero de um domínio variável da cadeia pesada e um da cadeia leve em associação estrita que pode ser covalente na natureza, por exemplo, em um fragmento de domínio variável de cadeia simples (scFv). É nesta configuração que as três regiões hipervariáveis de cada domínio variável interagem para definir um sítio de ligação de antígeno na superfície do dímero de VH-VL. Coletivamente, as seis regiões hipervariáveis ou um subconjunto das mesmas conferem especificidade de ligação de antígeno ao anticorpo. Porém, até mesmo um domínio variável simples compreendendo apenas três regiões hipervariáveis específicas para um antígeno tem a habilidade de reconhecer e ligar o antígeno, embora usualmente em uma afinidade inferior que o sítio de ligação inteiro (Cai & Garen, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 93: 6280-6285, 1996). Por exemplo, os anticorpos de camelídeo de ocorrência natural que apenas têm um domínio variável da cadeia pesada (VHH) podem ligar o antígeno (Desmyter et al., J. Biol. Chem., 277: 23645-23650, 2002; ligação et al., J. Mol. Biol. 2003; 332: 643-655).

[0097] Fragmentos de anticorpo de "Fv de cadeia simples" ou "scFv" compreendem os domínios VH e VL do anticorpo onde estes domínios estão presentes em uma cadeia polipeptídica simples. Em geral, o polipeptídeo de Fv ainda compreende um ligador de polipeptí- deo entre os domínios de VH e de VL que permitem o scFv formar a estrutura desejada para ligação do antígeno. Para uma revisão de scFv, vide Pluckthun, 1994, Em: The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Vol. 113, Rosenburg e Moore eds. Springer-Verlag, Nova Iorque, págs. 269-315.

[0098] O termo "diacorpo" refere-se a fragmentos de anticorpo pe quenos com dois sítios de ligação de antígeno em que os fragmentos compreendem um domínio variável da cadeia pesada (VH) conectado a um domínio variável da cadeia leve (VL) na mesma cadeia polipeptí- dica (VH e VL). Usando um ligador que é muito curto para permitir pa- reamento entre os dois domínios variáveis na mesma cadeia, os do- mínios variáveis são forçados a parear com os domínios complementares de outra cadeia, criando dois sítios de ligação de antígeno. Dia- corpos são descritos mais completamente, por exemplo, em EP 404,097; WO 93/11161; e Hollinger et al., 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448.

[0099] A expressão "anticorpos lineares" refere-se aos anticorpos como descritos em Zapata et al., 1995, Protein Eng., 8(10):1057- 1062. Brevemente, estes anticorpos contêm um par de segmentos de Fd em tandem (VH-CH1-VH-CH1) que, junto com os polipeptídeos de cadeia leve complementares, formam um par de regiões de ligação de antígeno. Anticorpos lineares podem ser biespecíficos ou mono- específicos.

[00100] O termo "monocorpo", como aqui usado, refere-se a um antígeno que liga a molécula com um domínio variável da cadeia pesada e nenhum domínio variável da cadeia leve. Um monocorpo pode ligar-se a um antígeno na ausência das cadeias leves e tipicamente tem três regiões hipervariáveis, por exemplo, CDRs designadas CDRH1, CDRH2, e CDRH3. Um monocorpo de IgG de cadeia pesada tem duas moléculas de ligação de antígeno de cadeia pesada conectadas por uma ligação de dissulfeto. O domínio variável da cadeia pesada compreende uma ou mais regiões hipervariáveis, preferivelmente uma região de CDRH3 ou de HVL-H3.

[00101] O termo "região hipervariáveis", quando aqui usado, refere- se aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são responsáveis pela ligação de antígeno. A região hipervariável compreende resíduos de aminoácido de uma "região de determinação de complementaridade" ou "CDR" (definida pela sequência como resíduos 24-34 (L1), 5056 (L2) e 89-97 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 31-35 (H1), 50-65 (H2) e 95-102 (H3) no domínio variável da cadeia pesada; Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) e/ou aqueles resíduos de uma "alça hipervariável" (definida pela estrutura e diferindo para cada anticorpo; vide, por exemplo: Chothia e Lesk, 1987, J., Mol. Biol. 196:901-917). Em um exemplo, resíduos de HVL podem incluir 26-32 (L1), 50-52 (L2) e 91-96 (L3) no domínio variável da cadeia leve e 26-32 (H1), 53-55 (H2) e 96-101 (H3) no domínio variável da cadeia pesada.

[00102] Fragmentos de anticorpo podem ser obtidos usando técnicas de engenharia recombinante ou de proteína convencionais, e os fragmentos podem ser triados para ligação a NKG2A, ou outra função, da mesma maneira que os anticorpos intactos.

[00103] Os fragmentos de anticorpo da invenção podem ser feitos por truncamento, por exemplo, através de remoção de um ou mais aminoácidos das extremidades N e/ou C-terminais de um polipeptídeo. Os fragmentos podem também ser gerados por uma ou mais deleções internas.

[00104] Um anticorpo da invenção pode ser, ou pode compreender, um fragmento de qualquer anticorpo de anti-NKG2A, o anticorpo de humZ270 (SEQ. ID. NO. 2 e SEQ. ID. NO. 3) ou o anticorpo de humZ199 (SEQ. ID. NO. 4 e SEQ. ID. NO. 5) ou qualquer outro anticorpo da invenção, ou uma variante de qualquer um destes anticorpos. Um anticorpo da invenção pode ser, ou pode compreender, uma porção de ligação de antígeno de um destes anticorpos, ou suas variantes. Por exemplo, o anticorpo da invenção pode ser um fragmento de Fab de um destes anticorpos ou variantes dos mesmos, ou pode ser um anticorpo de cadeia simples derivado de um destes anticorpos, ou uma variante dos mesmos.

[00105] Um anticorpo da invenção pode ser um anticorpo humano ou um anticorpo humanizado. O termo "anticorpo humano", como aqui usado, é intencionado a incluir anticorpos tendo regiões variáveis em que a estrutura e as regiões de CDR são derivadas das sequências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Além disso, se o anticorpo contiver uma região constante, a região constante é também derivada das sequências de imunoglobulina de linhagem germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de aminoácido não codificados pelas sequências de imunoglobulina de linhagem germinal humana (por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese aleatória ou específica in vitro ou através de mutação somática in vivo). Por outro lado, o termo "anticorpo humano", como aqui usado, não é intencionado a incluir anticorpos em que as sequências de CDR derivada da linhagem germinal de outras espécies mamíferas, tais como um camundongo, foram enxertadas sobre as sequências de estruturas humanas.

[00106] Um tal anticorpo humano pode ser um anticorpo monoclonal humano. Um tal anticorpo monoclonal humano pode ser produzido por um hibridoma que inclui uma célula B obtida de um animal não humano transgênico, por exemplo, um camundongo transgênico, tendo um genoma compreendendo um transgene humano de cadeia pesada e um transgene de cadeia leve fundido a uma célula imortalizada.

[00107] Anticorpos humanos podem ser isolados de bibliotecas de sequência construídas nas seleções de sequências de linhagem germinal humana, também diversificada com a diversidade de sequência natural e sintética.

[00108] Anticorpos humanos podem ser preparados por imunização in vitro de linfócitos humanos seguido por transformação dos linfócitos com vírus Epstein-Barr.

[00109] O termo "derivados de anticorpo humano" refere-se a qualquer forma modificada do anticorpo humano, tal como um conjugado do anticorpo e outro agente ou anticorpo.

[00110] O termo "anticorpo humanizado", como aqui usado, refere- se a um anticorpo quimérico humano/não humano contendo uma sequência mínima (regiões de CDR) derivada de uma imunoglobulina não humana. Um anticorpo humanizado é, desse modo, uma imuno- globulina humana (anticorpo do recipiente) em que os resíduos de uma região hipervariável do recipiente são substituídos por resíduos de uma região hipervariável de uma espécie não humana (anticorpo do doador) tal como de um camundongo, rato, coelho, ou primata não humano tendo a especificidade, afinidade, e capacidade desejadas. Em algumas circunstâncias, os resíduos de FR da imunoglobulina humana são substituídos por resíduos não humanos correspondentes. Um exemplo de uma tal modificação é a introdução de uma ou mais assim-chamadas retromutações.

[00111] Além disso, os anticorpos humanizados podem compreender resíduos que não são encontrados no anticorpo do recipiente ou no anticorpo do doador. Estas modificações são feitas para adicionalmente refinar o desempenho do anticorpo. Em geral, um anticorpo humanizado compreenderá substancialmente todos, pelo menos um, e tipicamente dois, domínios variáveis em que todas ou substancialmente todas as alças hipervariáveis correspondem àquelas de uma imuno- globulina não humana e todos ou substancialmente todos os resíduos de FR são aqueles de uma sequência de imunoglobulina humana. O anticorpo humanizado pode opcionalmente também compreender pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente à de uma imunoglobulina humana.

[00112] O termo "anticorpo quimérico", como aqui usado, refere-se a um anticorpo cujos genes de cadeia leve e pesada foram construídos, tipicamente através de engenharia genética, dos genes de regiões variável e constante da imunoglobulina que originam de espécies diferentes. Por exemplo, os segmentos variáveis dos genes de um anticorpo monoclonal de camundongo podem ser unidos aos segmentos constantes humanos.

[00113] A região cristalizável de fragmento ("região de Fc"/"domínio de Fc") de um anticorpo é a região da "cauda" de um anticorpo compreendendo os domínios de CH2 e CH3 constantes. O domínio de Fc pode interagir com os receptores de superfície celular chamados receptores de Fc, como também algumas proteínas do sistema de complemento. A região de Fc permite os anticorpos a ativar o sistema imune. Em um aspecto da invenção, os anticorpos podem ser engenhei- rados para incluir modificações dentro da região de Fc, tipicamente para alterar uma ou mais de suas propriedades funcionais, tais como meia-vida em soro, fixação do complemento, ligação do Fc-receptor, estabilidade da proteína e/ou citotoxicidade celular antígeno- dependente, ou falta dos mesmos. Além disso, um anticorpo da invenção pode ser quimicamente modificado (por exemplo, uma ou mais metades químicas podem ser ligadas ao anticorpo) ou ser modificado para alterar sua glicosilação, novamente para alterar uma ou mais propriedades funcionais do anticorpo. Preferivelmente, um domínio de Fc modificado compreende uma ou mais, preferivelmente todas as mutações seguintes que resultarão em afinidade diminuída para certos receptores de Fc (L234A, L235E, e G237A) e em fixação reduzida do complemento mediada por C1q (A330S e P331S), respectivamente.

[00114] O isótipo de um anticorpo da invenção pode ser IgG, tal como IgG1, tal como IgG2, tal como IgG4. Se desejado, a classe de um anticorpo pode ser "trocada" por técnicas conhecidas. Por exemplo, um anticorpo que foi originalmente produzido como uma molécula de IgM pode ser trocado de classe para um anticorpo de IgG. As técnicas de troca de classe podem também ser usadas para converter uma subclasse de IgG para outra, por exemplo: de IgG1 para IgG2 ou IgG4; de IgG2 para IgG1 ou IgG4; ou de IgG4 para IgG1 ou IgG2. Engenharia dos anticorpos para gerar as moléculas quiméricas de região cons- tante, por combinação das regiões de subclasses de IgG diferentes, pode ser também executada.

[00115] O termo "epitopo", como aqui usado, é definido no contexto de uma interação molecular entre um "polipeptídeo de ligação de antí- geno", tal como um anticorpo (Ab), e seu "antígeno" correspondente (Ag). O termo antígeno (Ag) refere-se à entidade molecular usada para imunização de um vertebrado imunocompetente para produzir o anticorpo (Ab) que reconhece o Ag. Aqui, Ag é denominado mais amplamente e é em geral intencionado a incluir moléculas alvo que são especificamente reconhecidas pelo Ab, desse modo incluindo fragmentos ou miméticos da molécula usada no processo de imunização para elevar o Ab.

[00116] Em geral, "epitopo" refere-se à área ou região em um Ag ao qual um Ab especificamente se liga, isto é, a área ou região em contato físico com o Ab. Um epitopo de proteína pode compreender resíduos de aminoácido no Ag que estão diretamente envolvidos na ligação a um Ab (também chamado o componente imunodominante do epitopo) e outros resíduos de aminoácido que não são envolvidos diretamente na ligação tais como resíduos de aminoácido do Ag que são efetivamente bloqueados pelo Ab (em outras palavras, o resíduo de aminoácido está dentro da "superfície excluída de solvente" e/ou da "pegada" do Ab). O termo epitopo aqui inclui ambos os tipos de sítios de ligação em qualquer região particular de NKG2A que especificamente liga-se a um anticorpo de anti-NKG2A, ou outro agente NKG2A- específico de acordo com a invenção, a menos que do contrário declarado (por exemplo, em alguns contextos, a invenção refere-se a anticorpos que se ligam diretamente a resíduos de aminoácido particulares). NKG2A pode compreender vários epitopos diferentes que podem incluir, sem limitação, (1) epitopo de peptídeo linear, (2) epitopo con- formacional que consiste em um ou mais aminoácidos não contíguos localizados próximos uns dos outros na conformação de NKG2A madura; e (3) epitopo pós-translacional que consiste, ou todo ou em parte, em estruturas moleculares covalentemente ligadas a NKG2A, tais como grupos carboidrato.

[00117] O epitopo para um para dado de anticorpo (Ab)/antígeno (Ag) pode ser definido e caracterizado em níveis diferentes de detalhes usando uma variedade de métodos de mapeamento de epitopo experimentais e computacionais. Os métodos experimentais incluem mutagênese, cristalografia de Raios X, espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), Espectrometria de Massa da Troca de Hidrogênio-Deutério (HX-MS) e vários métodos de ligação de competição; métodos que são conhecidos na técnica. Como cada método conta com um único princípio, a descrição de um epitopo está ligada intimamente ao método pelo que foi determinado. Desse modo, dependendo do método de mapeamento de epitopo empregado, o epitopo para um par de Ab/Ag dado será definido de forma diferente.

[00118] Em seu nível mais detalhado, o epitopo para a interação entre o Ag e o Ab pode ser definido pelas coordenadas espaciais que definem os contatos atômicos presentes na interação de Ag-Ab, como também informação acerca de suas contribuições com relação à termodinâmica da ligação. Em um nível menos detalhado, o epitopo pode ser caracterizado pelas coordenadas espaciais que definem os contatos atômicos entre o Ag e o Ab. Em um nível até mesmo menos detalhado, o epitopo pode ser caracterizado pelos resíduos de aminoácido que ele compreende como definido por uns critérios específicos tal como a distância entre os átomos no Ab e no Ag. Em um nível ainda menos detalhado, o epitopo pode ser caracterizado pela função, por exemplo por ligação de competição com outros Abs. O epitopo pode também ser definido mais genericamente como compreendendo resíduos de aminoácido para os quais a substituição por outro aminoácido alterará as características da interação entre o Ab e o Ag.

[00119] No contexto de uma estrutura de cristal derivada de Raios X definida pelas coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, por exemplo, um fragmento Fab, e seu Ag, o termo epitopo é aqui, a menos que do contrário especificado ou contradito pelo contexto, especificamente definido como resíduos de NKG2A caracterizados tendo um átomo pesado (isto é, um átomo de não hidrogênio) dentro de uma distância de 4 Â de um átomo pesado no Ab.

[00120] Do fato que as descrições e definições de epitopos, dependente do método de mapeamento de epitopo usado, são obtidas em níveis diferentes de detalhe, segue que a comparação dos epitopos para Abs diferentes no mesmo Ag pode ser conduzida similarmente em níveis diferentes de detalhes.

[00121] Os epitopos descritos no nível de aminoácido, por exemplo determinados de uma estrutura de Raios X, são ditos ser idênticos se eles contiverem o mesmo conjunto de resíduos de aminoácido. Os epitopos são ditos sobrepor se pelo menos um aminoácido for compartilhado pelos epitopos. Os epitopos são ditos estar separados (únicos) se nenhum resíduo de aminoácido for compartilhado pelos epitopos.

[00122] Os epitopos caracterizados por ligação de competição são ditos ser sobrepostos se a ligação dos Abs correspondentes for mutuamente exclusiva, isto é, ligação de um Ab exclui a ligação simultânea do outro Ab. Os epitopos são ditos ser separados (únicos) se o Ag for capaz de acomodar a ligação de ambos os Abs correspondentes simultaneamente.

[00123] A definição do termo "paratopo" é derivada da definição acima de "epitopo" invertendo a perspectiva. Desse modo, o termo "paratopo" refere-se à área ou região no Ab ao qual um Ag especificamente se liga, isto é, com o qual estabelece contato físico com o Ag.

[00124] No contexto de uma estrutura de cristal derivada de Raios X, definida por coordenadas espaciais de um complexo entre um Ab, tal como um fragmento de Fab, e seu Ag, o termo paratopo é aqui, a menos que do contrário especificado ou contradito pelo contexto, especificamente definido como resíduos de Ag caracterizados tendo um átomo pesado (isto é, um átomo de não hidrogênio) dentro de uma distância de 4 Â de um átomo pesado em NKG2A.

[00125] O epitopo e o paratopo para um par de anticorpo (Ab)/antígeno (Ag) dado podem ser identificados por métodos rotineiros. Por exemplo, a localização geral de um epitopo pode ser determinada avaliando a habilidade de um anticorpo para ligar a fragmentos diferentes ou polipeptídeos de NKG2A variantes. Os aminoácidos específicos dentro de NKG2A que estabelece contato com um anticorpo (epitopo) e os aminoácidos específicos em um anticorpo que estabelece contato com NKG2A (paratopo) podem também ser determinados usando métodos rotineiros. Por exemplo, o anticorpo e a molécula alvo podem ser combinados e o complexo de Ab/Ag pode ser cristalizado. A estrutura de cristal do complexo pode ser determinada e usada para identificar sítios específicos de interação entre o anticorpo e seu alvo.

[00126] Anticorpos que ligam ao mesmo antígeno podem ser caracterizados com respeito à sua habilidade para ligar ao seu antígeno comum simultaneamente e podem ser submetidos ao "encaixotamen- to". No contexto presente, o termo "encaixotamento" refere-se a um método de agrupar anticorpos que ligam ao mesmo antígeno. "Armazenamento" de anticorpos pode ser com base em ligação de competição de dois anticorpos a seu antígeno comum em ensaios com base nas técnicas padrões tais como Ressonância de Plasmon de Superfície (SPR), ELISA ou citometria de fluxo.

[00127] Um "caixa" é definido por um anticorpo de referência. Se um segundo anticorpo não puder ligar-se ao antígeno ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, é dito que o segundo anticorpo per- tence à mesma "caixa" que o anticorpo de referência. Neste caso, o anticorpo de referência e o segundo anticorpo estão competindo por ligar ao antígeno, desse modo, o par de anticorpos é denominado "anticorpos competidores". Se um segundo anticorpo for capaz de ligar-se ao antígeno ao mesmo tempo que o anticorpo de referência, é dito que o segundo anticorpo pertence uma "caixa" separada. Neste caso, o anticorpo de referência e o segundo anticorpo não está competindo por ligar ao antígeno, desse modo o par de anticorpos é denominado "anticorpos não competidores".

[00128] "Encaixotamento" de anticorpos não fornece informação direta acerca do epitopo. Anticorpos competidores, isto é, anticorpos que pertencem ao mesmo "encaixotamento" podem ter epitopos idênticos, epitopos sobrepostos ou até mesmo epitopos separados. O último é o caso se o anticorpo de referência ligado a seu epitopo no antí- geno tomar o espaço requerido para o segundo anticorpo contatar seu epitopo no antígeno ("obstáculo estérico"). Anticorpos não competidores têm epitopos separados.

[00129] O termo "afinidade de ligação" é aqui usado como uma medida da resistência de uma interação não covalente entre duas moléculas, por exemplo um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antí- geno. O termo "afinidade de ligação" é usado para descrever interações monovalentes (atividade intrínseca).

[00130] Afinidade de ligação entre duas moléculas, por exemplo, um anticorpo, ou fragmento do mesmo, e um antígeno, através de uma interação monovalente pode ser quantificada por determinação da constante de dissociação (KD). Por sua vez, KD pode ser determinada por medição da cinética de formação de complexo e dissociação, por exemplo, pelo método de SPR. As constantes de taxa que correspondem à associação e à dissociação de um complexo monovalente são referidas como a constante da taxa de associação ka (ou kon) e a cons- tante da taxa de dissociação KD (ou koff), respectivamente. KD está relacionada com ka e KD através da equação KD = KD / ka.

[00131] Seguindo a definição acima, as afinidades de ligação associadas com interações moleculares diferentes, tais como comparação da afinidade de ligação de anticorpos diferentes para um antígeno dado, podem ser comparadas por comparação dos valores de KD para os complexos de anticorpo/antígeno individuais.

[00132] Similarmente, a especificidade de uma interação pode ser avaliada por determinação e comparação do valor de KD para a interação de interesse, tal como uma interação específica entre um anticorpo e um antígeno, com o valor de KD de uma interação não de interesse.

[00133] Tipicamente, a KD para o anticorpo com respeito ao alvo será 2 vezes, preferivelmente 5 vezes, mais preferivelmente 10 vezes menos que a KD com respeito à outra molécula não alvo tal como material não relacionado ou material circunjacente no ambiente. Mais preferivelmente, a KD será 50 vezes menor, tal como 100 vezes menor, ou 200 vezes menor; até mesmo mais preferivelmente 500 vezes menor, tal como 1.000 vezes menor, ou 10.000 vezes menor.

[00134] O valor desta constante de dissociação pode ser determinado diretamente através de métodos bem conhecidos, tais como através de ensaios padrões para avaliar a habilidade de ligação dos ligantes tais como anticorpos para os alvos, são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, ELISAs, western blot, RIAs, e análise de cito- metria de fluxo. A cinética de ligação e afinidade de ligação do anticorpo podem também ser avaliadas por ensaios padrões conhecidos na técnica, tais como SPR.

[00135] Um ensaio de ligação competitivo pode ser conduzido em que a ligação do anticorpo ao alvo é comparada à ligação do alvo por outro ligante daquele alvo, tal como outro anticorpo.

[00136] Um anticorpo da invenção pode ter uma KD para seu alvo de 1 x 10-7M ou menos, 1 x 10-8M ou menos, ou 1 x 10-9M ou menos, ou 1 x 10-10M ou menos, 1 x 10-11M ou menos, ou 1 x 10-12M ou menos. A KD de um anticorpo da presente invenção pode ser menor que [0,8 nM, tal como menor que 0,7 nM, tal como menor que 0,6 nM, tal como menor que 0,5 nM, tal como menor que 0,4 nM, tal como menor que 0,3 nM, tal como menor que 0,2 nM, tal como menor que 0,1 nM, tal como menor que 0,05 nM, tal como menor que 0,025 nM, tal como menor que 0,015 nM, tal como entre 0,015 nM e 0 nM.

[00137] O termo "identidade" como conhecido na técnica, refere-se a uma relação entre as sequências de dois ou mais polipeptídeos, como determinada comparando as sequências. Na técnica, "identidade" também significa o grau de parentesco de sequência entre os polipep- tídeos, como determinado pelo número de parelhas entre as cadeias de dois ou mais resíduos de aminoácido. "Identidade" mede a porcentagem de parelhas idênticas entre a menor de duas ou mais sequências com alinhamentos de intervalo (se houver) tratada por um modelo matemático ou programa de computação particular (isto é, "algorit-mos"). Identidade de polipeptídeos relacionados pode ser facilmente calculada através de métodos conhecidos. Tais métodos incluem, mas não são limitados a, aqueles descritos em Computational Molecular Biology, Lesk, A. M., ed., Oxford University Press, Nova Iorque, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., ed., Academic Press, Nova Iorque, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Parte 1, Griffin, A. M., e Griffin, H. G., eds., Humana Press, Nova Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds., M. Stockton Press, Nova Iorque, 1991; e Carillo et al., SIAM J. Applied Math. 48, 1073 (1988).

[00138] Métodos preferidos para determinar a identidade são designados para dar a parelha maior entre as sequências testadas. Os métodos de determinar identidade são descritos em programas de computação publicamente disponíveis. Métodos de programa de computação preferidos para determinar a identidade entre duas sequências incluem o pacote de programa GCG, incluindo GAP (Devereux et al., Nucl. Acid. Res. 12, 387 (1984); Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), BLASTP, BLASTN, e FASTA (Altschul et al., J. Mol. Biol. 215, 403-410 (1990)). O programa BLASTX está publicamente disponível do National Center for Biotechnology Information (NCBI) e outras fontes (BLAST Manual, Al- tschul et al. NCB/NLM/NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul et al., supra). O algoritmo bem conhecido de Smith Waterman pode ser também usado para determinar a identidade.

[00139] Por exemplo, usando o algoritmo de computador GAP (Genetics Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.), dois polipeptídeos para os quais a porcentagem de identidade de sequência está por ser determinada são alinhados para emparelhamento ótimo de seus respectivos aminoácidos (a "extensão emparelhada", como determinado pelo algoritmo). Uma penalidade de abertura de intervalo (que é calculada como 3 vezes a diagonal média; a "diagonal média" é a média da diagonal da matriz de comparação sendo usada; a "diagonal" é a contagem ou número atribuído a cada parelha perfeita de aminoácidos pela matriz de comparação particular) e uma penalidade de extensão de intervalo (que é usualmente {fração (1/10)} vezes a penalidade de abertura de intervalo), como também uma matriz de comparação tal como PAM 250 ou BLOSUM 62 são usadas junto com o algoritmo. Uma matriz de comparação padrão (vide Dayhoff et al., Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, supl. 3 (1978) para a matriz de comparação PAM 250; Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 89, 10915-10919 (1992) para a matriz de comparação BLOSUM 62) é também usada pelo algoritmo.

[00140] Os parâmetros preferidos para uma comparação de se quência de peptídeo incluem os seguintes:

[00141] Algoritmo: Needleman et al., J. Mol. Biol. 48, 443-453 (1970); Matriz de comparação: BLOSUM 62 de Henikoff et al., PNAS USA 89, 10915-10919 (1992); Penalidade de Intervalo: 12, Penalidade de Comprimento de Intervalo: 4, Limiar de Similaridade: 0.

[00142] O programa GAP é útil com os parâmetros acima. Os parâmetros acima mencionados são os parâmetros predefinidos para comparações de peptídeo (junto com nenhuma penalidade para os intervalos finais) usando o algoritmo de GAP.

[00143] O termo "similaridade" é um conceito relacionado, mas em contraste com "identidade", refere-se a uma relação de sequência que inclui parelhas idênticas e parelhas de substituição conservadoras. Se duas sequências de polipeptídeo tiverem, por exemplo, (fração (10/20)) aminoácidos idênticos, e o restante forem todas substituições não conservadoras, então a porcentagem de identidade e similaridade ambas seriam 50%. Se, no mesmo exemplo, houver 5 mais posições onde há substituições conservadoras, então a porcentagem de identidade permanece 50%, mas a porcentagem de similaridade seria 75% ((fração (15/20))). Portanto, em casos onde há substituições conservadoras, o grau de similaridade entre dois polipeptídeos será mais alto que a porcentagem de identidade entre aqueles dois polipeptídeos.

[00144] Um "receptor" é definido como uma estrutura molecular presente na superfície ou dentro de uma célula. Um receptor produz uma resposta celular característica, isto é, atividade biológica, quando um ligante liga. Um "ligante" para um receptor é definido como qualquer molécula (por exemplo peptídeo, polipeptídeo, carboidrato, molécula pequena ou íon) que é seletivamente capaz de ligar-se ao receptor. Um ligante agonístico ("agonista") é um ligante que ao ligar-se ao receptor até certo ponto é capaz de suscitar a resposta característica para o re ceptor. Um ligante antagonístico ("antagonista") é um ligante tendo a habilidade para ligar-se ao receptor e até certo ponto bloquear a ação de um agonista, por exemplo, o ligante natural do receptor.

[00145] NKG2A (OMIM 161555, a revelação inteira desta é aqui incorporada por referência) é um membro do grupo de NKG2 de transcrições (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med. 173:1017-1020). NKG2A é codificado por 7 éxons que atravessam 25 kb, mostrando algum splicing diferencial. Junto com CD94, NKG2A forma o receptor inibidor hetero- dimérico CD94/NKG2A, encontrado na superfície dos subconjuntos de células NK, células T α/β, células T Y/β, e células NKT. Similar aos receptores de KIR inibidores, ele possui um ITIM em seu domínio cito- plásmico. Como aqui usado, "NKG2A" refere-se a qualquer variante, derivado, ou isoforma do gene de NKG2A ou proteína codificada. Também abrangido são quaisquer sequências de ácido nucleico ou de pro-teína que compartilham uma ou mais propriedades ou funções biológicas com NKG2A do tipo selvagem, de comprimento total e compartilhando pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais alto de identidade de nucleotídeo ou de aminoácido. NKG2A humano compreende 233 aminoácidos em 3 domínios, com um domínio citoplásmico compreendendo os resíduos 1-70, uma região de trans- membrana compreendendo os resíduos 71-93, e uma região extracelu- lar compreendendo os resíduos 94-233, da sequência seguinte: MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELN- LQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMAS- VVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNS- CYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIIS- PSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNR- LKSAQCGSSIIYHCKHKL (SEQ ID NO: 1).

[00146] HLA-E (OMIM 143010, a revelação inteira desta é aqui incorporada por referência) é um molécula de MHC não clássica que é expressada na superfície da célula e regulada pela ligação dos peptí- deos derivados da sequência sinal de outras moléculas de MHC da classe I. HLA-E liga as células assassinas naturais (NK) e algumas células T, especificamente ligando a CD94/NKG2A, CD94/NKG2B, e CD94/NKG2C (vide, por exemplo, Braud et al. (1998) Nature 391:795799, a revelação inteira desta é aqui incorporada por referência). Expressão de superfície de HLA-E é suficiente para proteger as células alvo da lise pelos clones de células NK, T, ou NKT de CD94/NKG2A+. Como aqui usado, "HLA-E" refere-se a qualquer variante, derivado, ou isoforma do gene de HLA-E ou proteína codificada. Também abrangido são quaisquer sequências de ácido nucleico ou de proteína que compartilham uma ou mais propriedades ou funções biológicas com HLA-E do tipo selvagem, de comprimento total, e compartilhando pelo menos 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou mais de identidade de nucleotídeo ou aminoácido.

[00147] No contexto da presente invenção, "um agente que liga ao receptor de CD94/NKG2A humano" ou "um anticorpo de anti-NKG2A" ou "anticorpo de ligação de NKG2A" refere-se a um qualquer agente e/ou anticorpo com ligação detectável ao receptor de CD94/NKG2A humano usando qualquer ensaio padrão onde o agente e/ou anticorpo é incubado na presença de CD94/NKG2A ou NKG2A e a ligação detectada, por exemplo, por meio de radiomarcações, métodos físicos tais como espectrometria de massa, ou marcações fluorescentes diretas ou indiretas detectadas usando, por exemplo, análise citofluoromé- trica (por exemplo FACScan). Qualquer quantidade de ligação acima da quantidade vista com um agente não específico de controle indica que o agente liga-se ao alvo.

[00148] Os termos Z270 humanizado ou humZ270 ou hZ270, como aqui usados, compreendem o anticorpo (SEQ. ID. NO. 2 e SEQ. ID. NO. 3) revelado no pedido de patente WO08009545 que é por este meio incorporado por referência neste pedido de patente. Os termos Z199 humanizado ou humZ199, como aqui usados, compreendem o anticorpo (SEQ. ID. NO. 4. e SEQ. ID. NO. 5) revelado na publicação de patente WO09092805 que é por este meio incorporada por referência no pedido de patente atual.

[00149] "Grupos protrativos"/"metades de extensão da meia-vida"/" metades de extensão da meia-vida" são aqui entendidos como um ou mais grupos químicos ligados a uma ou mais funcionalidades da cadeia do sítio de aminoácido tais como -SH, -OH, -COOH, -CONH2, - NH2, ou uma ou mais estruturas N e/ou O-glicano e que podem aumentar a meia-vida circulatória in vivo das proteínas/peptídeos terapêuticos quando conjugados com estas proteínas/peptídeos. Exemplos de "grupos protrativos" incluem mas não são limitados a: ácidos graxos biocompatíveis e derivados dos mesmos, Hidróxi Alquil Amido (TEM) por exemplo Hidróxi Etil Amido (HES), Poli Etielno Glicol (PEG), Poli (Glyx-Sery)n (HAP), Ácido Hialurônico (HA), polímeros de Hepa- rosan (HEP), polímeros com base em Fosforilcolina (polímero PC), Flexímeros, Dextrana, Ácidos poli-siálicos (PSA), um domínio de Fc, Transferrina, Albumina, Peptídeos elastina-símiiles, polímeros de XTEN, Peptídeos de ligação de albumina, um peptídeo de CTP, e qualquer combinação dos mesmos.

[00150] O termo "proteína de fusa do Fc de NKG2A" é aqui intencionado a abranger NKG2A fundido com um domínio Fc que pode ser derivado de qualquer isótipo de anticorpo.

[00151] Inflamação é a resposta biológica complexa de tecidos a uma variedade de estímulos, incluindo patógenos, células estragadas, ou irritantes. Inflamação é uma resposta protetora pelo organismo para remover ou isolar os estímulos prejudiciais e iniciar o processo curativo. Inflamação não é um sinônimo de infecção - infecção é invasão de um organismo por um patógeno exógeno, enquanto inflamação é a resposta do sistema imune ao patógeno.

[00152] Inflamação é uma cascata de eventos envolvendo componentes múltiplos, incluindo a vasculatura (por exemplo, células endote- liais, perícitos, células do músculo liso), células do sistema imune (por exemplo, linfócitos T e B, monócitos, células dendríticas, neutrófilos), mediadores solúveis derivados de células (citocinas, quimocina) e também células residentes no tecido visado (por exemplo, células epi- teliais, fibroblastos sinoviais, células neuronais). Inflamação aguda é de duração curta (horas a dias) e em grande parte envolve células residentes no tecido, migração de leucócitos e exsudação de fluido e proteínas plasmáticas para o local da inflamação. Isto resulta de alteração no fluxo vascular, ativação das células e componentes celulares que atraem os leucócitos da circulação para o local da lesão. Inflamação crônica é de duração prolongada em que inflamação ativa, des-truição de tecido e tentativa de reparo estão prosseguindo simultaneamente. Inflamação crônica pode ser o resultado de infecção persistente, exposição prolongada e repetida a agentes tóxicos ou devido à autoimunidade, um fenômeno pelo qual as células imunes do corpo atacam seus próprios tecidos, causando dano.

[00153] Normalmente, o sistema imune é capaz de distinguir entre as células normais do corpo (ou "auto") e patógenos estranhos ou células anormais ("não auto"). Em algumas circunstâncias, o sistema imune perde a habilidade de reconhecer "auto" como normal e inapro- priadamente inicia uma resposta contra o tecido ou células. Esta resposta origina-se de uma perda de tolerância para auto e é denominada "autoimunidade". As patologias resultantes da autoimunidade frequentemente têm consequências clínicas sérias e são um dos problemas de saúde principais no mundo, especialmente em nações desenvolvidas. Exemplos de tais doenças autoimunes incluem artrite reumatoide (RA), psoríase, artrite psoriática, lúpus sistêmico eritematoso (SLE), nefrite lúpica, diabetes do tipo I, doença de Graves, doença inflamatória do intestino (IBD), doença de Crohns (CD), colite ulcerativa (UC), síndrome do intestino irritável, esclerose múltipla (MS), miocardite au- toimune, doença de Kawasaki, doença de artéria coronária, doença pulmonar obstrutiva crônica, doença pulmonar intersticial, tiroidite au- toimune, escleroderma, esclerose sistêmica, osteoartrite, dermatite atópica, vitiligo, doença de enxerto vs. hospedeiro, síndrome de Sjo- grens, nefrite autoimune, síndrome de Goodpasture, polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica, alergia, asma e outras doenças autoimunes resultantes de inflamação aguda ou crônica.

[00154] O processo pelo qual o sistema imune perde a habilidade para reconhecer "auto" como normal e a resposta subsequente direcionada contra o tecido ou células, resulta em perda de tolerância, um estado de "autoimunidade". As patologias resultantes da autoimunida- de frequentemente têm consequências clínicas sérias e é um dos problemas de saúde principais no mundo.

[00155] Terapêuticas biológicas visadas estão agora disponíveis para o tratamento de certas doenças autoimunes e/ou doenças inflamatórias crônicas. Por exemplo, pacientes com artrite reumatoide podem ser tratados com anti-CD20, antagonista de TNF (TNFR solúvel ou anti-TNF-α); pacientes com psoríase podem ser tratados com anti- CD11a; pacientes com esclerose múltipla podem ser tratados com INF-beta; pacientes com colite ulcerativa podem ser tratados com anti- TNF-α e pacientes com doença de Crohn podem ser tratados com an- ti-TNF-α ou anti-CD4 integrina. Infelizmente, um número grande de pacientes que recebem tratamento com qualquer um destes agentes biológicos pode sofrer uma variedade de efeitos colaterais, poderia falhar em responder, e/ou pode desenvolver anticorpos neutralizantes contra o fármaco. Ainda há uma necessidade por medicamentos biológicos alternativos que especificamente alvejam patologias, mas que não afetem as células/tecidos saudáveis, resultando em menos efeitos colaterais, ou menos severos, que possam ser usados a longo prazo e/ou que não resultem na geração de anticorpos neutralizantes. A presente invenção diz respeito a estas necessidades insatisfeitas entre pacientes com doenças autoimunes e/ou inflamatórias crônicas, revelando anticorpos que são adequados para o uso em tal tratamento.

[00156] Artrite reumatoide (RA) é uma doença sistêmica que afeta o corpo inteiro e é uma das formas mais comuns de artrite. É caracterizada por inflamação das juntas causando dor, rigidez, calor, vermelhidão e inchação. Esta inflamação é uma consequência das células inflamatórias que invadem as juntas e estas células inflamatórias liberam enzimas que podem digerir o osso e a cartilagem. Como resultado, esta inflamação pode levar a dano ósseo e dano de cartilagem severos e à deterioração e dor severa da junta entre outros efeitos fisiológicos. A junta envolvida pode perder sua forma e alinhamento, resultando em dor e perda de movimento.

[00157] Há vários modelos animais para artrite reumatoide conhecida na técnica. Por exemplo, no modelo de artrite induzida por coláge- no (CIA), os camundongos desenvolvem uma artrite inflamatória que se assemelha à artrite reumatoide humana. Uma vez que a CIA compartilha características imunológicas e patológicas similares com RA, torna-se um modelo adequado para triar os compostos anti-inflama- tórios humanos potenciais. Eficácia neste modelo é medida pela diminuição na inchação da junta. Eficácia em RA na clínica é medida pela habilidade de reduzir os sintomas em pacientes que são medidos como uma combinação de inchação da junta, taxa de sedimentação de eritrócitos, níveis de proteína reativa C e níveis de fatores do soro.

[00158] Erosão da cartilagem ou destruição da cartilagem associadas com RA são principalmente dirigidas por subconjuntos de sinovió- citos semelhantes a Fibroblasto (FLS) presentes no forro íntimo sino- vial. Os FLS, às vezes também referidos como sinoviócitos Tipo B ou fibroblastos sinoviais de RA (RASF), são de origem mesenquimal e representam um papel fundamental na produção de citocinas que perpetuam a inflamação e eles são os produtores principais das proteases que contribuem para a destruição da cartilagem. Em RS, FLS desenvolvem um fenótipo agressivo capaz de invadir a matriz de cartilagem extracelular e ainda exacerbar o dano da junta.

[00159] Erosão da cartilagem ou destruição da cartilagem como referidas neste pedido de patente, é a perda ou degradação do tecido da cartilagem.

[00160] Ressorção óssea, a remoção do tecido ósseo através dos osteoclastos, é a única função dos osteoclastos, que são células mul- tinucleadas especializadas derivadas da linhagem celular de monóci- tos. Sua diferenciação é regulada pelo fator estimulante de colônia de macrófagos, ligante de RANK, e osteoprotegerina como também outros mediadores múltiplos que podem positiva ou negativamente regular sua diferenciação, ativação, e/ou sobrevivência. O osteoclasto desenvolve um citoesqueleto especializado que permite estabelecer um microambiente isolado entre ele e o osso, em que a degradação da proteína óssea e minerais ocorre por um processo que envolve transporte de prótons e liberação de enzimas.

[00161] Erosão óssea, como referida neste pedido de patente, é a perda de massa óssea ou densidade mineral óssea que ocorre quando houver uma elevação suave (ou mais que suave) mas persistente na taxa de ressorção óssea na taxa de formação óssea.

[00162] Osteoartrite (OA) é o tipo mais prevalecente de artrite, particularmente em adultos de 65 anos e mais velhos. A doença é caracterizada por artropatia degenerativa crônica que frequentemente leva à dor crônica e inaptidão. As taxas relatadas de incidência e prevalência de OA em juntas específicas variam amplamente, devido às diferenças no caso definição de OA. Por exemplo, OA pode ser definida sozinha por critérios radiográficos (OA radiográfica), através de sintomas típicos (OA sintomática), ou por ambas. Usando critérios radiográficos, as juntas interfalangianas distais e proximais da mão comumente foram identificadas como as juntas afetadas, mas elas são menos prováveis de ser sintomáticas. Em contraste, o joelho e o quadril, que constituem as segunda e terceira localizações mais comuns de OA radiográfica respectivamente, quase sempre são sintomáticos. As primeiras juntas falangianas metatarsais e carpometacarpais são também locais frequentes de OA radiográfica, enquanto o ombro, cotovelo, pulso e juntas metacarpofalangianas raramente desenvolvem OA idiopática.

[00163] Idade é o fator de risco mais consistentemente identificado para OA e as taxas de prevalência sobem abruptamente após a idade de 50 anos nos homens e de 40 anos nas mulheres. OA é diagnosticada por uma tríade de sintomas típicos, achados físicos e alterações radiográficas. The American College of Rheumatology tem critérios de classificação expostos para auxiliar na identificação de pacientes com OA sintomática que inclui, mas não contam somente, com os achados radiográficos. Pacientes com doença precoce experimentam dor localizada da junta que piora com a atividade e é aliviada pelo repouso, enquanto aqueles com doença severa podem ter dor sob repouso. As juntas carregando peso podem "travar" ou "ceder" devido ao distúrbio interno, que é uma consequência de doença avançada. Dureza na inatividade matutina ou seguinte ("fenômeno de gel") raramente excede 30 minutos.

[00164] Achados físicos nas juntas osteoartríticas incluem alargamento ósseo, crepito, efusões de frio, e faixa de movimento diminuída. Ternura na palpação na linha da junta e dor no movimento passivo são também comuns, embora não únicos para OA. Achados radiográficos em OA (lâmina) incluem formação de osteófito, estreitamento do espa- ço da junta, esclerose subcondral e cistos. A presença de um osteófito é o marcador radiográfico mais específico embora seja indicativo de doença relativamente avançada.

[00165] Radiografias são consideradas o teste "padrão-ouro" para a diagnose de OA, mas alterações radiográficas são evidentes apenas relativamente tarde na doença. A necessidade é grande por um marcador biológico sensível e específico que permitiria diagnose prematura de OA, e monitoramento de sua progressão. Estudos laboratoriais rotineiros, tais como taxas de sedimentação e proteína reativa C, não são úteis como marcadores para OA, embora um recente estudo sugira que elevação de CRP prognostica doença progressiva mais rapidamente. Porém, vários epitopos de componentes de cartilagem oferecem alguma promessa como marcadores de OA. Por exemplo, epi- topo de sulfato de condroitina 846, normalmente expressado apenas na cartilagem fetal e neonatal, foi observado em OA, mas não em car-tilagem e fluido sinovial normal de adultos. Ao longo de uma veia similar, um epitopo único para colágeno do tipo II foi descrito em cartilagem de OA, e pode ser desmascarado in vitro expondo a cartilagem normal a MMPs. Este epitopo pode ser medido no sangue e urina e pode provar-se útil em diagnosticar ou monitorar a progressão de OA. Níveis séricos de hialuronan elevados foram também mostrados por alguns correlatar com OA radiográfica. A descoberta de níveis elevados de proteína oligomérica da cartilagem (COMP) no fluido sinovial após lesão traumática da junta pode prognosticar desenvolvimento de OA na junta lesada. Outros marcadores potenciais de OA são listados, mas não são nem facilmente acessíveis nem carecem da sensibilidade e especificidade requeridas para os considerar como marcadores de OA potenciais.

[00166] Sintomas clínicos de inflamação, a presença de inflamação histológica em tecido sinovial de OA e lesões prematuras da cartila- gem na borda da sinóvia inflamada são indicadores fortes que sinovite é um fator pivotante na patogênese de OA. A vista tradicional de OA como uma doença apenas de cartilagem está obsoleta. OA deve ser agora considerada ser uma doença da junta inteira que inclui o tecido sinovial. Osso, cartilagem e sinóvia se comunicam por via das interações de célula-célula, através da liberação de mediadores solúveis e por meio de sinais mecânicos. Inflamação sinovial, apesar de não ser uma condição prévia para o desenvolvimento de OA, está claramente envolvida no desarranjo de cartilagem e desse modo na progressão da doença. Visamento da sinóvia inflamatória deveria tardar ou impedir dano de cartilagem articular e a formação de osteófitos, especialmente em OA prematura.

[00167] Artrite psoriática é um tipo de artrite inflamatória que ocorre em um subconjunto de pacientes com psoríase. Nestes pacientes, a patologia/sintomas da pele são acompanhados por inchação da junta, similar àquela vista em artrite reumatoide. Isto caracteriza áreas em tiras, elevadas, vermelhas de inflamação da pele com descamação. Psoríase frequentemente afeta as pontas dos cotovelos e joelhos, o couro cabeludo, o umbigo, e ao redor das áreas genitais ou ânus.

[00168] O termo "artrite psoriática" denota um grupo heterogêneo de artrites que variam de doença monoarticular periférica oligoarticular e poliarticular, para envolvimento do esqueleto axial. Ainda, apesar desta heterogeneidade clínica evidente, estes várias apresentações são unificadas em sua ocorrência em indivíduos com manifestações cutâneas de psoríase, soro-negatividade de fator reumatoide, associações de antígenos de leucócitos humanos similares (HLA) e similaridades radiográficas.

[00169] Aproximadamente 2% da população Caucasiana na América do Norte têm psoríase. Destes, 5-7% são afetados por uma artrite inflamatória em alguma forma. No geral, os homens e mulheres são afetados com frequência igual, entretanto a razão de macho:fêmea atual pode variar, dependendo do subconjunto em questão. A incidência de pico é na 4a a 6a década. Doença cutânea psoriática antedata o princípio de artrite em 70% de casos, apresenta coincidência com artrite em 15% de casos, e segue o princípio de artrite em 15% de casos.

[00170] A causa de artrite psoriática é desconhecida. Atividade da junta periférica em artrite psoriática assemelha-se à atividade cutânea em 1/3 dos casos, enquanto que a atividade da pele e doença do esqueleto axial são prováveis ser discordantes. Fatores genéticos parecem representar um papel importante. Há uma concordância de 70% para psoríase em gêmeos monozigóticos. Há um risco aumentado em 50 vezes de desenvolver artrite psoriática em parentes de primeiro grau de pacientes com a doença. Há um risco aumentado de 2 vezes de "transmissão" da doença por um pai afetado quando comparado a uma mãe afetada. Há associações epidemiológicas com a expressão de alelos de HLA tanto da classe I como da classe II. Fatores ambientais foram implicados. Infecção estreptocócica pode precipitar o de-senvolvimento de psoríase de gutato. Infecção por HIV pode apresentar psoríase e artrite psoriática, como também piora da doença existente. Trauma físico foi relatado precipitar o desenvolvimento de artrite, sugerindo que artrite psoriática é a manifestação de um "fenômeno de Koebner profundo". O caractere inflamatório e autoimune da doença não só é confirmado pela apresentação clínica, mas também pelo papel que as células R e várias citocinas foram demonstradas representar na iniciação e perpetuação de atividade de doença.

[00171] Fatores que podem prognosticar um prognóstico pior incluem envolvimento de pele extensivo; uma história familiar forte de pso- ríase; gênero feminino; princípio da doença em < 20 anos de idade; expressão de HLA-B27, -DR3 ou DR4; e doença poliarticular ou erosiva.

[00172] Osteoporose (OP) é uma doença óssea que leva a uma resistência óssea prejudicada e risco aumentado de fratura (vide por exemplo Theill et al. (2002) Rev de Annu Immunol 20:795-23). Em os- teoporose, a densidade mineral óssea (BMD) é reduzido e a microar- quitetura do osso deteriora-se gradualmente. Como definido pela World Health Organization (WHO), a doença é definida por uma densidade mineral óssea que é 2,5 de desvio-padrão ou mais abaixo da massa óssea de pico média (média de adultos jovens, saudáveis). A doença pode ser classificada como tipo 1 primário, tipo 2 primário, ou secundário. A forma de osteoporose mais comum em mulheres após a menopausa é referida como osteoporose do tipo 1 primária ou pós- menopausal. Osteoporose do tipo primário 2 (ou osteoporose senil) ocorre após a idade 75 anos e é vista em fêmeas e machos a uma razão de 2:1. Por fim, osteoporose secundária pode surgir em qualquer idade e pode afetar homens e mulheres igualmente. Esta forma de os- teoporose resulta de problemas médicos ou doença predispostos crônicos, ou uso prolongado de medicações tais como glicocorticoides. Ressorção óssea é um fator patológico principal em osteoporose pós- menopausal. Perda rápida ou relativamente rápida de massa ós- sea/densidade mineral óssea é frequentemente causada por um aumento no número de osteoclastos ou por atividade excessiva de oste- oclastos (Walsh et al. (2005) Immunol Rev 208:228-251).

[00173] Os riscos de osteoporose podem ser reduzidos com alterações do estilo de vida (por exemplo, dieta, exercício, prevenção de queda) e às vezes medicação (por exemplo, cálcio, vitamina D, bisfos- fonatos e vários outros).

[00174] O termo "tratamento", como aqui usado, refere-se à terapia médica de qualquer ser humano. Espera-se que o dito sujeito tenha passado por exame físico por um médico que deu uma diagnose tentativa ou definitiva que indicaria que o uso do dito tratamento específico ser benéfico à saúde do dito sujeito humano. A regulação e propósito do dito tratamento podem variar de um indivíduo para o outro, de acordo com o estado da saúde do sujeito. Desse modo, o dito tratamento pode ser profiláctico, paliativo, sintomático e/ou curativo.

[00175] Em termos da presente invenção, tratamentos profilácticos, paliativos, sintomáticos e/ou curativos podem representar aspectos separados da invenção.

[00176] Em um aspecto, a presente invenção fornece composições e formulações compreendendo moléculas da invenção, tais como os anticorpos, fragmentos de ligação de antígeno de anticorpos, polinucleotí- deos, vetores e células descritos aqui. Por exemplo, a invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um ou mais fragmentos de ligação de anticorpo e antígeno dos anticorpos da invenção, formulados junto com um veículo farmaceuticamente aceitável.

[00177] Consequentemente, um objetivo da invenção é fornecer uma formulação farmacêutica compreendendo um tal anticorpo que está presente em uma concentração de 0,25 mg/ml a 250 mg/ml, e em que a dita formulação tem um pH de 2,0 a 10,0. A formulação pode ainda compreender um sistema de tampão, conservante(s), agente(s) de tonicidade, agente(s) quelante(s), estabilizantes e tensoativos. O uso de conservantes, agentes isotônicos, agentes quelantes, estabili- zantes e tensoativos has composições farmacêuticas é bem conhecido à pessoa versada. Referência pode ser feita a Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a edição, 1995.

[00178] Em uma modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação aquosa. Uma tal formulação é tipicamente uma solução ou uma suspensão. Os termos "formulação aquosa" são definidos como uma formulação compreendendo pelo menos 50% p/p de água. Igualmente, o termo "solução aquosa" é definido como uma solução compreendendo pelo menos 50% p/p de água, e o termo "suspensão aquosa" é definido como uma suspensão compreendendo pelo menos 50% p/p de água.

[00179] Em outra modalidade, a formulação farmacêutica é uma formulação secada por congelação à qual o médico ou o paciente adiciona solventes e/ou diluentes antes do uso.

[00180] Em um outro aspecto, a formulação farmacêutica compreende uma solução aquosa de um tal anticorpo, e um tampão, em que o anticorpo está presente em uma concentração de 1 mg/ml ou acima, e em que a dita formulação tem um pH de cerca de 2,0 a cerca de 10,0.

[00181] Um anticorpo da invenção pode ser administrado parente- ralmente, tal como intravenosamente, tal como intramuscularmente, tal como subcutaneamente. Alternativamente, um anticorpo da invenção pode ser administrado por meio de uma rota não parenteral, tal como peroral ou topicamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado profilaticamente. Um anticorpo da invenção pode ser administrado terapeuticamente (sob demanda).

[00182] Na competição da presente invenção "eliminação seletiva das células destrutivas de cartilagem" refere-se a um processo em que um anticorpo contra NKG2A aumenta a eliminação mediada por células NK das células destrutivas de cartilagem, tais como por exemplo sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS) ou outras células destrutivas de cartilagem, não aumentando a eliminação dos fibroblastos normais, tais como por exemplo fibroblastos de prepúcio (células de FSK4) ou outras células de fi- broblastos normais. Esta eliminação seletiva pode ser medida por exemplo por um ensaio de liberação de LDH padrão ou em outros ensaios adequados conhecidos em que a capacidade do composto terapêutico para eliminar a células destrutivas de cartilagem é medida (vide Exemplo 4 e Fig. 5B). Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 5% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 10% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 20% de aumento na cito- toxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 30% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 40% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 50% de aumento na citotoxici- dade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 60% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 70% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 80% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 90% de aumento na cito- toxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 100% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 125% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti- NKG2A causa pelo menos 150% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 175% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 200% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 225% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 250% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 275% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo me- nos 300% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 350% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 400% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem, ou pelo menos 500% de aumento na citotoxicidade específica das células destrutivas de cartilagem.

[00183] No conteúdo da presente invenção "reduz a formação de células erosivas ósseas" refere-se a um processo em que um anticorpo de anti-NKG2A reduz a formação de células erosivas ósseas, tais como por exemplo osteoclastos, células de TRAP+ multinucleadas ou outras células erosivas ósseas.

[00184] A formação reduzida de células erosivas ósseas pode ser medida in vitro por contato visual das células erosivas ósseas aderentes (vide Exemplo 6. e Fig. 6C.) ou qualquer outro método adequado de medir a formação reduzida do células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 5% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 10% de redução de células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de an- ti-NKG2A causa pelo menos 20% de redução de células erosivas ósseas ou pelo menos 30% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 40% de redução de células erosivas ósseas ou pelo menos 50% de redução de células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 60% de redução de células erosivas ósseas ou pelo menos 70% de redução de células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 80% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 90% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 100% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 125% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 150% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 175% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 200% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 225% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 250% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 275% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 300% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 350% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 400% de redução das células erosivas ósseas ou pelo menos 450% de redução das células erosivas ósseas. Em uma modalidade, um anticorpo de anti-NKG2A causa pelo menos 500% de redução das células erosivas ósseas.

[00185] Além disso, "reduz a formação de células erosivas ósseas" na competição da presente invenção refere-se à erosão mineral óssea reduzida in vitro.

[00186] A erosão mineral óssea reduzida in vitro pode ser medida cultivando as células ou tecido em discos minerais ósseos (isto é, discos osteológicos) ou através de outros métodos adequados. (Vide Exemplo 6 e Figs. 6D, 6E, 6F e 6G). Um anti-NKG2A causa uma redução de 10% em erosão mineral óssea ou 20% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 30% em erosão mineral óssea ou 40% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 50% em erosão mineral óssea ou 60% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redu-ção de 70% em erosão mineral óssea ou 80% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 90% em erosão mineral óssea ou 100% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 125% em erosão mineral óssea ou 150% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 175% em erosão mineral óssea ou 200% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 250% em erosão mineral óssea ou 300% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 350% em erosão mineral óssea ou 400% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 450% em erosão mineral óssea ou 500% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 550% em erosão mineral óssea ou 600% de redução em erosão mineral óssea. Em uma modalidade, um anti-NKG2A causa uma redução de 650% em erosão mineral óssea ou 700% de redução em erosão mineral óssea. EXEMPLOS EXEMPLO 1. Moléculas de superfície de célula expressadas em sino- viócitos do tipo fibroblastos de pacientes de RA.

[00187] Na Fig 1A. RA-FLS aderentes derivados de tecido sinovial de RA foram destacados usando 2 mM de EDTA e tingidos na superfície para expressão de marcador de fibroblastos CD55 (histograma aberto; painel direito) e marcador de macrófagos CD68 (histograma aberto; painel esquerdo). O histograma cinza representa o tingimento usando um anticorpo de controle de isótipo. Como visto na Fig. 1A, RA-FLS mostram expressão homogênea de CD55 e a falta de CD68 confirma a origem semelhante ao fibroblasto dos RA-FLS aderentes.

[00188] Como mostrado na Fig. 1B. RA-FLS expressam níveis altos de ULBP-1, ULBP-2 e ULBP3, níveis baixos de MIC-A, e nenhum MIC- B, todos os ligantes conhecidos para o receptor de célula NK de ativação NKG2D. Além disso, RA-FLS expressam CD155 (receptor de poli- ovírus PVR) e CD48, ligantes para DNAM-1 e 2B4, respectivamente. Nós não detectamos qualquer expressão de CD112 (receptor 2 relacionado ao poliovírus, PRR2), outro ligante reconhecido por DNAM-1. Usando Proteínas de fusão de Fc de NKp30, NKp44, e NKp46, detectou-se expressão relativamente alta de um ligante de NKp44 putativo em RA-FLS, enquanto NKp30-Fc e NKp46-Fc falharam em tingir estas células. As células foram analisadas através de citometria de fluxo. Histogramas cheios representam controle de isótipo relevante. Histogramas são representativos para n > 3 doadores.

[00189] Fig 1C. ilustra que a ligação da proteína de fusão de NKp44-Fc solúvel aos RA-FLS foi específica e abolida pela adição de doses crescentes de RA-FLS de mAb aderente de anti-NKp44 que foi destacado usando 2 mM de EDTA, e tingido na superfície com 10 ug/mL de proteína de fusão de NKp44-Fc (histograma aberto) ou o mesmo fragmento de Fc (IgG1 humano) como um controle negativo (histograma cinza). Onde indicado, NKp44-Fc foi pré-incubado com mAbs de anti-NKp44 ou de anti-NKp46.

[00190] Como demonstrado na Fig 1D., RA-FLS expressam níveis altos de HLA-E e HLA-G, ligantes para os receptores de células NK inibidores CD94-NKG2A e LIR-1, respectivamente. Desse modo, HLA-E pode ser uma molécula importante que protege RA-FLS da citotoxicidade mediada por células NK na sinóvia inflamada, como a maioria das células NK sinoviais expressa o receptor de CD94-NKG2A inibidor.

[00191] Na Fig. 1E. é demonstrado que RA-FLS expressam o receptor de morte 5 (DR5) mas não DR4. Estes receptores transduzem sinais apoptóticos em reconhecimento através de TRAIL (ligante indutor de apoptose relacionado ao TNF). Desse modo, DR5 pode ser um ligante importante expresso em RA-FLS que podem ser reconhecidos por células de expressão de TRAIL que potencialmente podem mediar a morte celular de RA-FLS dentro do tecido sinovial inflamado. EXEMPLO 2. Células NK de expressão de NKG2A estão presentes na sinóvia de RA e podem ser encontradas em áreas contendo RA-FLS de expressão de HLA-E.

[00192] Fig. 2A, 2B e 2C mostram seções de tecido sinovial seriais derivadas de um paciente com RA tingida com anti-NKp46 de camundongo (células NK, Fig. 2A), anti-NKG2A (Fig. 2B) e anticorpo de controle de isótipo (Fig 2C). Reatividade imune-específica foi visualizada com diaminobenzidina (manchas escuras no micrógrafo) e os núcleos foram contratingidos com hematoxilina (manchas fracas). Os resultados mostram que as células NK de NKp46+ são encontradas na área de subforro e algumas mais próximas ao forro sinovial da sinóvia de RA (vide Fig. 2A). A localização e frequência das células NK foram observadas ser bem parecidas às das células NKG2A+ (vide Fig. 2B para comparação). E as seções tingidas com controle de isótipo ficaram em branco (vide Fig. 2C.). Quando avaliada por análise de imagem digital quantitativa, a frequência das células NKG2A+ foi observada correlatar fortemente (r2 = 0,950, p < 0,0001) e emparelhar pelo número que das células NK, como mostrado na Fig. 2D.

[00193] A expressão de HLA-E, o ligante para CD94-NKG2A, em RA-FLS foi avaliada in situ (Fig 2E-H). Aplicação do anticorpo de anti- HLA-E 3D12 nas seções de tecido sinovial de RA revelaram tingimento do forro íntimo que é feito para os sinoviócitos macrófago-símiles (MLS) e RA-FLS, como é mostrado na Fig. 2E. Nenhum tingimento é observado usando um controle de isótipo, como demonstrado na Fig 2G. Além disso, ambas as células imunes infiltrantes, mostradas na Fig 2F. e células endoteliais vasculares como mostradas na Fig 2H. expresssam HLA-E em níveis relativamente altos.

[00194] Juntos, estes dados mostram que as células NK podem ser identificadas entre a população de linfócito infiltrante na sinóvia de pacientes de RA, e sugere que a maioria, se não todas as células NK expressem NKG2A. Além disso, os subconjuntos de células NK de NKG2A+ são encontrados em áreas perto de RA-FLS de HLA-E+. Desse modo, isto poderia significar potencialmente que as células NK de NKG2A+ reconhecem HLA-E em RA-FLS in situ. EXEMPLO 3: NKG2D, DNAM-1, NKp44, NKp46, E TRAIL ESTÃO EN-VOLVIDOS EM CITOTOXICIDADE DE CÉLULA DE NK PARA RA-FLS.

[00195] Na Fig. 3A. três tipos diferentes de células NK que foram tingidas para expressão de superfície de vários receptores de células NK são mostrados (como histograma aberto), como indicado abaixo em cada histograma, e tingimento com um controle de isótipo relevante é também mostrado em cada painel (histograma cinza cheio). Fig. 3A. (i) mostra as células NK derivadas de SFMC de um paciente de RA representativo, Fig. 3A. (ii) mostra células NK de CD56 em repouso derivadas de PBMC de um doador saudável representativo e Fig. 3A. (iii) mostra células NK de Nishi.

[00196] As células foram analisadas através de citometria de fluxo. Células NK foram definidas como CD3-CD56bright viável. Os dados mostram que as células NK sinoviais derivadas de pacientes de RA expressam vários receptores de ativação, e que elas mostram um padrão de expressão similar de ativar os receptores para as células NK de CD56bright e células NK de Nishi

[00197] Fig. 3B. (i) ilustra RA-FLS que foram semeados a 10 000 células/poço em placas de 48 poços, e crescidas para confluenciar (~ 48 000 células/poço) por 72 horas em cujo ponto foram adicionados Nishi nas razoes de efetor:alvo indicadas (E:T) (poços duplicados foram estabelecidos). RA-FLS e Nishi foram cocultivados durante a noite a 37° C, as células não aderentes subsequentemente removidas lavando e células aderentes foram fixadas com 4% de paraformaldeído e tingidas com Eosina. Um Analisador de Imagem ImmunoSpot foi usado para tirar as imagens e quantificar a % de área bem abrangida (como mostrado na Fig. 3B. (ii)).

[00198] Os dados na Fig. 3B (i) e 3B(ii) mostram que as células NK eliminam RA-FLS aderentes plásticos em uma maneira dose- dependente in vitro.

[00199] Nas Fig. 3C. e Fig. 3D i RA-FLS que foram semeados a 30 000 células/poço em placas de 96 poços, e no dia seguinte foram adicionados 90 000 Nishi/poço são demonstrados. Nishi e FLS foram co- cultivados por 5 horas a 37° C com BD GolgiStop, anticorpos de anti- CD107a/b conjugado com FITC e 10 ug/mL de anticorpos de bloqueio, ou controle de isótipo relevante, como indicado. Citometria de fluxo foi executada para determinar a desgranulação de Nishi. ns = não significativo, * P < 0,05, ** P < 0,005, *** P < 0,001.

[00200] Fig. 3C mostra que as células NK apenas desgranulam-se na presença de células alvos de FLS e não quando cultivadas sozinhas. Fig. 3D mostra que RA-FLS são sensíveis à citotoxicidade mediada por células NK, e que NKG2D, DNAM1, NKp44, NKp46 e TRAIL estão todos envolvidos no reconhecimento específico de RA-FLS através de células NK como indicado por uma redução significativa na expressão de CD107a/b ao mascarar tais receptores. EXEMPLO 4: RA-FLS SÃO PROTEGIDOS DAS CITOTOXICIDADE MEDIADA POR CÉLULA NK ATRAVÉS DA EXPRESSÃO DE HLA-E CAPAZ DE INTERAGIR COM OS RECEPTORES DE CD94-NKG2A INIBIDORES EXPRESSOS PELAS CÉLULAS NK

[00201] A Fig 4A mostra histogramas representativos com células NK de RA-SFMC na fileira do topo, NK de CD56bright em repouso de PBMC saudável na fileira mediana e células NK de Nishi na fileira do fundo. Expressão de NKG2A (coluna esquerda), LIR-1 (coluna mediana) e KIRs (coluna direita) é mostrada (histogramas abertos) compa- rada com controle de isótipo correspondente (histogramas cheios cinzas). Células NK foram tingidas para expressão de superfície usando anti-NKG2A, anti-LIR1, e um coquetel de mAbs de anti-KIR e subsequentemente analisadas por citometria de fluxo. Células NK são agrupadas em células positivas de CD56bright e negativas de CD3 viáveis.

[00202] Os dados mostram que as células NK de fluido mais sinovi- al similares às células NK de Nishi e células de PB-NK de CD56bright expressam NKG2A mas são desprovidas de KIRs. Em contraste com as células NK de fluido sinovial, as células NK de Nishi também expressam LIR-1.

[00203] A Fig 4B ilustram RA-FLS que era semeados a 3.104 célu- las/poço em placas de 96 poços, no dia seguinte Nishi foram adicionados a uma razão de E:T de 3:1 (experimentos de anti-LIR-1, painel esquerdo) ou 6:1 (experimentos de anti-NKG2A, painel direito). Nishi e FLS foram cocultivados por 5 horas a 37° C com BD GolgiStop, anticorpos de anti-CD107a/b conjugado com FITC e 10 ug/mL de anticorpos de bloqueio, ou controle de isótipo relevante, como indicado. Ci- tometria de fluxo foi executada para determinar a desgranulação de Nishi. ns = não significativo, ** P < 0,005, como mostrado na Fig. 4B.

[00204] Os dados mostram que mascarando NKG2A com um anticorpo resulta em uma desgranulação de células NK significativamente aumentada para RA-FLS (painel direito), enquanto mascarando LIR-1 não parece resultar em qualquer lise aumentada de RA-FLS (painel esquerdo). Desse modo, o fato que o tratamento de anti-NKG2A das células NK resulta em lise aumentada de RA-FLS indica que as moléculas de HLA-E expressas em RA-FLS apresentam peptídeos apropriados importantes para interagir com os receptores inibidores de CD94-NKG2A.

[00205] A Fig 4C demonstra RA-FLS que foram semeados a 2,4.104 células/poço em placas de 96 poços, no dia seguinte 6.103 células NK de Nishi /poço foram adicionadas (isto é, E:T de 1:4). FLS e Nishi fo- ram cocultivados durante a noite com a adição de controle de isótipo de anti-NKG2A ou de IgG4 humano. No próximo dia, as células não aderentes foram removidas lavando, as células aderentes foram fixadas com 4% de paraformaldeído e tingidas com Eosina. Os poços foram analisados, e a % de área bem coberta foi quantificada, usando um Analisador de Imagem ImmunoSpot, como mostrado na Fig. 4C. Desse modo, os dados mostram que mascarando NKG2A resulta em uma eliminação significativamente aumentada de RA-FLS aderentes.

[00206] RA-FLS foram semeados a 1,5.104 células/poço em placas de 96 poços, no dia seguinte foram adicionados 4,5.104 SFMC autólo- go por poço (isto é, E:T 3:1). SFMC e RA-FLS foram cocultivados por 5 horas a 37° C com BD GolgiStop, anticorpos de anti-CD107a/b conjugado com FITC e 10 ug/mL de anticorpos de bloqueio, ou controle de isótipo de IgG4 humano, como mostra na Fig. 4D.

[00207] Desse modo, mascarando NKG2A com mAb resulta n eliminação significativamente aumentada de RA-FLS autólogos in vitro, sugerindo que a administração terapêutica de um mAb de anti-NKG2A resultaria em eliminação aumentada de RA-FLS in vivo.

[00208] A Fig. 4E. mostra 3.104 FLS/poço que foram semeados em placas de 96 poços. No dia seguinte, células NK de CD56brightCD16dim alogênicas foram isoladas do sangue de doador saudável através de separação magnética e imediatamente cocultivadas com RA-FLS (E:T 3:1) por 5 horas a 37° C com BD GolgiStop, anticorpos de anti-CD107a/b conjugados com FITC e 10 ug/mL anticorpos de bloqueio, ou controle de isó- tipo relevante. Citometria de fluxo foi executada para determinar a des- granulação. Células NK foram definidas como CD3-CD16dimCD56bright viáveis. O gráfico do fundo mostra células NK de CD56bright de um doador saudável simples separadamente cocultivadas com RA-FLS de cinco pacientes diferentes. * P < 0,05.

[00209] Desse modo, mascarando NKG2A com mAb em células PB-NK em repouso, recentemente isoladas resultados em eliminação significativamente aumentada de RA-FLS alogênicos in vitro, sugerindo novamente que administração terapêutica de um mAb de anti- NKG2A resultaria em eliminação aumentada de RA-FLS in vivo. Desse modo, doença agressiva que esparrama RA-FLS que podem migrar através do fluxo sanguíneo para outras juntas pode ser eliminada circulando células de PB-NK de CD56bright ao mascarar seu receptor inibidor de CD94-NKG2A.

[00210] A Fig. 5A mostra um ensaio de liberação de LDH que foi empregado para avaliar citoxicidade mediada por células NK de FLS usando duas linhagens celulares de NK diferentes (NKL, esquerda; e Nishi, direita) na presença de NNC141-0100 (HumZ270, barras pretas), controle de isótipo (barras brancas), ou meio sozinho (barras cinza). A razão de efetor de célula NK para alvo foi 1:1. Fig 5B mostra que bloqueando NKG2A usando NNC141-0100 (humZ270) leva à lise aumentada de um RA-FLS representativo (RA-FLS2, painel esquerdo) mas não afeta a eliminação de uma linhagem celular de fibroblastos de prepúcio normal (FSK4, painel direito). Desse modo, considerados juntos os dados apresentados na Fig. 3, Fig. 4 e Fig.5 sugerem claramente que o tratamento de anti-NKG2A resulta em eliminação aumentada mediada por células NK de RA-FLS enquanto a eliminação mediada por células NK de uma linhagem celular de fibroblastos normal (FSK4) não é afetada na presença de um anticorpo de bloqueio (isto é, HumZ270) direcionado contra NKG2A. EXEMPLO 6: TRATAMENTO COM humZ270 (ANTI-NKG2A) INIBE FORMAÇÃO DE OSTEOCLASTOS MULTI NUCLEADOS DE TRAP+

[00211] A Fig. 6A mostra um exemplo representativo onde 106 SFMC/poço derivadas de um paciente de RA foram cultivadas durante 7 dias em meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15. As culturas foram tratadas com 20 micrograma/ml de controle de isótipo de IgG4 humano (Fig. 6A.) ou 20 micrograma/ml de humZ270 (Fig. 6B.) no começo do ensaio. Pode ser apreciado que o tratamento de anti-NKG2A na Fig. 6B resulta em eliminação significativa de células multinuclea- das aderentes plásticas grandes que expressam TRAP (isto é, definidas como osteoclasto).

[00212] A FIG. 6C. demonstra os dados obtidos de SFMC derivadas de pacientes de RA que foram sozinhas cultivadas durante 7 dias em meio (n=6) ou meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15 (n=14). No começo do ensaio (definido como linha base), 20 micrograma/mL de isótipo de IgG4 humano (barras cinza brancas e escuras) ou 20 micrograma/mL de NNC141-0100 (humZ270, barras cinza-claras e pretas) foram acrescentados às culturas. Os osteoclastos foram quantificados como números de células multinucleadas de TRAP+/poço. Desse modo, Fig. 6A, Fig. 6B, e Fig. 6C consideradas juntas mostram que o tratamento com um anticorpo contra NKG2A em culturas de SFMC in vitro resulta em uma redução significativa de formação de osteoclastos como medido pela formação de células TRAP+ multinu- cleadas grandes (isto é, osteoclastos). Desse modo, os achados sugerem que tratamento terapêutico em pacientes de RA com mAb de anti- NKG2A resultasse em abrandamento da erosão óssea, um referencial clínico principal de RA.

[00213] Na Fig. 6D um exemplo representativo de erosão mineral óssea observado de uma cultura de SFMC de paciente de RA no. 2357 é mostrado. Aqui, SFMC foram crescidas em discos revestidos com uma camada fina de substrato mineral ósseo (isto é, discos osteo- lógicos) na presença de IL-15 e mAb de isótipo (esquerda) vs anti- NKG2A (humZ270, direito). Os discos foram subsequentemente tingidos com von Kossa e as áreas erosivas foram analisadas usando Analisador Immunospot S5 e aparecem como áreas claras/brancas contra o fundo mais escuro.

[00214] Na Fig. 6E, os dados obtidos de um total de 5 pacientes de RA são demonstrados. SFMC foram cultivadas em meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15. No começo do ensaio, 20 micrograma/mL de isótipo de IgG4 humano (barra branca) ou 20 micrograma/mL de NNC141-0100 (humZ270, barra preta) foram acrescentados às culturas. A porcentagem média +/- SEM da área de disco foi quantificada usando Analisador Immunospot S5. Considerada juntamente com a Fig. 6D e Fig. 6E mostram que o tratamento de anti-NKG2A resulta em uma redução significativa na formação de osteoclastos corrosivos de mineral de osso ativo. Desse modo, os achados sugerem que o tratamento terapêutico em pacientes de RA com mAb de anti-NKG2A resultasse em abrandamento da erosão óssea, um referencial clínico principal de RA.

[00215] A Fig. 6F ilustra que HumZ270 (anti-NKG2A) suprime erosão óssea em culturas de explante de tecido sinovial de RA cultivadas diretamente ex vivo. Raspagens de tecido sinovial de RA foram crescidas durante 7 dias em meio de IMDM suplementado com 10% de FBS, 2% de HuS, P/S, L-glut sem adição de mAbs (controle) ou com adição de isótipo, infliximab (IFX), ou anti-NKG2A (humZ270) todos os mAbs a 10 micograma/mL adicionados no princípio da cultura. O experimento foi estabelecido em triplicata nos poços. No dia 7, o meio e as células foram removidos enxaguando os poços 3x com 200 uL de água Milli-Q™. Os discos foram subsequentemente enxaguados com 200 uL de solução de alvejamento (~6% de NaOCl, ~5,2% de NaCl) durante 5 minutos seguidos por pipetação suave para desalojar quaisquer células restantes. Por fim, os discos foram lavados 3x com água Milli- Q™, secados ao ar e tingidos com o método de von Kossa. Pode ser apreciado deste exemplo de culturas em triplicata que o tratamento de humZ270 de RA de explantes de tecido sinovial resulta em erosão diminuída (áreas claras/brancas) quando comparada às culturas de con- trole ou tratadas com isótipo.

[00216] Na Fig. 6G, os resultados calculados (média +/- SEM) de culturas em triplicata de raspagens de tecido sinovial de RA foram crescidos durante 7 dias em meio de IMDM suplementado com 10% de FBS, 2% de HuS, P/S, L-glut sem adição de mAbs (controle) ou com adição de isótipo, infliximab (IFX), ou anti-NKG2A (humZ270) todos os mAbs a 10 micograma/mL adicionados no princípio da cultura, são ilustrados. No dia 7, o meio e células foram removidos enxaguando os poços 3x com 200 uL de água Milli-Q™. Os discos foram subsequentemente enxaguados com 200 uL de solução de alvejamento (~6% de NaOCl, ~5,2% de NaCl) durante 5 minutos seguidos por pipe- tação suave para desalojar quaisquer células restantes. Por fim, os discos foram lavados 3x com água Milli-Q™, secados ao ar e tingidos com método de von Kossa. Tratamento de HumZ270 de RA de explantes de tecido sinovial resulta em erosão significativamente diminuída (p=0,005, teste Students T) quando comparada às culturas de controle ou tratadas com isótipo. Desse modo, o tecido de RA que cresce diretamente ex vivo em disco revestido com minerais ósseos (isto é, discos osteológicos) mostram capacidade erosiva significativa e tal atividade é inibida drasticamente por tratamento com anti-NKG2A sugerindo claramente que o tratamento terapêutico em pacientes de RA com anti-NKG2A suprimiria erosão óssea, um referencial clínico principal de RA. EXEMPLO 7: MODULAÇÃO DOS NÍVEIS DE CITOCINA EM CULTURAS DE SFMC IN VITRO SOB TRATAMENTO COM HumZ270 (NNC141-0100)

[00217] Na Fig 7A, modulação de níveis de citocina (média +/- SEM) em culturas in vitro de SFMC derivadas de pacientes com RA (n=11), é demonstrada. SFMC foram cultivadas durante 7 dias em meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15. As culturas foram tratadas com 20 micograma/mL de isótipo de IgG4 humano (barras cinza- claras) ou 20 micrograma/mL de NNC141-0100 (humZ270, barras cinzas escuras) no começo do ensaio. O sobrenadante foi colhido em 24 horas e os níveis de citocinas foram medidos por BioPlex. O níveis de IL-6 foram significativamente reduzidos sob tratamento com anti- NKG2A, enquanto a produção de outras citocinas não é afetada significativamente, com exceção de um aumento pequeno em M-CSF em 24 horas.

[00218] A Fig. 7B mostra uma comparação em pares entre os níveis de IL-6 medidos em culturas de RA-SFMC in vitro estimuladas com IL- 15 e tratadas com isótipo vs HumZ270 (anti-NKG2A). O níveis de IL-6 são significativamente reduzidos ao mascarar NKG2A em todas as culturas de SFMC in vitro.

[00219] Na Fig. 7C, é demonstrado que NNC141-0100 (humZ270) inibe produção IL-6 de linha base e estimulada por IL-15 em culturas in vitro de SFMC derivadas de pacientes com RA. Os níveis de IL-6 produzidos por SFMC derivados de 2 pacientes com RA foram medidos em culturas estabelecidas sozinhas em meio ou meio suplementado com 10 ng/mL de IL-15 como indicado. As culturas foram tratadas com 20 micograma/mL de isótipo de IgG4 humano (barras pretas) ou 20 micrograma/mL de NNC141-0100 (humZ270, barras brancas) no começo do ensaio. Sobrenadante foi colhido em 24, 48 e 72 horas e os níveis de IL-6 foram medidos por BioPlex. Consideradas juntas, as Figuras 7A, 7B, e 7C mostram que anti-NKG2A suprime os níveis de IL-6 de linha base e estimulados em culturas de SFMC in vitro. IL-6 é uma citocina pró-inflamatória importante envolvida na patogênese de RA. Potencialmente, a redução em IL-6 representa um papel na redução observada na formação de osteoclastos. EXEMPLO 8: NKG2A E/OU SEU LIGANTE HLA-E SÃO EXPRESSADOS NA SINÓVIA INFLAMADA DE PACIENTES DE RA, OSTEOAR- TRITE (OA) E ARTRITE PSORIÁTICA (PSA)

[00220] Células NK presentes em tecido sinovial de RA expressam o receptor de NKG2A inibidor e estão localizadas predominantemente em agregados linfoides adjacentes aos sinoviócitos que expressam HLA-E, o ligante para CD94-NKG2A. Isto é mostrado na Fig. 8. onde quadros representativos de tecido sinovial de RA de dois entre 15 doadores são descritos (ID 1144-09: A, C, E, G, I e ID 1591-08: B, D, F, H, J). Seções seriais de sinóvia de RA foram tingidas para células NK com um anticorpo de anti-NKp46 (Fig. 8A. e 8B.), para NKG2A com o anticorpo de Z199 (Fig. 8C. e 8D.), para HLA-E com o anticorpo 3D12 (Fig. 8E. e 8F.) e para células T com um anticorpo de anti-CD3 (Fig. 8G. e 8H.). Nenhum tingimento foi observado usando um anticorpo de controle de isótipo de IgG2b (Fig. 8I. e 8J.). Reatividade imunoespecí- fica foi visualizada com diaminobenzidina (DAB) e os núcleos foram contratingidos com hematoxilina (barras = 100 μm). Setas-cabeças indicam agregados linfoides em tecido de subforro com NKp46, NKG2A, HLA-E e CD3 expressando subconjuntos de células. As setas indicam sinoviócitos de HLA-E+ em camada de forro sinovial hiperplás- tica adjacente aos agregados linfoides com células NK. Asteriscos indicam células endoteliais vasculares de HLA-E+.

[00221] Imagens de ampliação alta de células NK de NKp46+ (Fig. 8K.) e células NKG2A+ (Fig. 8L.) em seções seriais de sinóvia de RA de um 3° doador (ID 1595-08) são mostradas para enfatizar que a localização e a frequência das células NK foram bem parecidas com às das células NKG2A+. Análise de imagem digital foi usada para correlatar o número de células NKG2A+ na sinóvia de 15 pacientes de RA com o número de células NK de NKp46+ (Fig. 8M.). Os resultados estão expressados como número de células por mm2 e mostram que a frequência das células NKG2A+ correlata fortemente com (r2 = 0,950, p < 0,0001) e parelham por número daquela das células NK. Células NKG2A+ estavam presentes na sinóvia de 13/15 pacientes de RA.

[00222] Juntos, estes dados mostram que as células NK podem ser identificadas entre a população de linfócitos infiltrantes na sinóvia de pacientes de RA, e sugere que a maioria, se não todas as células NK expressam NKG2A. O ligante para CD94-NKG2A, HLA-E, é expressado por muitos células imunes infiltrantes, células endoteliais vasculares e sinoviócitos (sinoviócitos semelhantes aos macrófagos (MLS) e RA- FLS). Subconjuntos de células NK de NKG2A+ são encontrados em áreas perto dos sinoviócitos de HLA-E+. Desse modo, isso poderia significar potencialmente que as células NK de NKG2A+ reconhecem HLA-E em RA-FLS in situ. Além disso, as células imunes infiltrantes de HLA-E+ e o endotélio vascular podem ser também reconhecidos pelas células NK de NKG2A+.

[00223] NKG2A e seu ligante, HLA-E, são expressados na sinóvia de pacientes com osteoartrite (OA). Isto é mostrado na Fig. 9. que descreve células NKG2A+ (anticorpo de Z199) entre linfócitos infiltran- tes (Fig. 9A.) e expressão de HLA-E (3D12 anticorpo) por células imunes infiltrantes, células endoteliais e sinoviócitos (Fig. 9B.). Células NKG2A+ estavam presentes na sinóvia de 6/9 pacientes de OA. Em contraste com os pacientes de RA, a frequência das células NKG2A+ não parece correlatar com à das células NK na sinóvia de OA, quando quantificadas por análise de imagem digital (r2 = 0,136, p = 0,3295; Fig. 9C.), indicando que algumas das células NK que infiltram a sinóvia de OA podem não expressar NKG2A.

[00224] Juntos, estes dados mostram a expressão de NKG2A e HLA-E nos subconjuntos de células sinoviais de OA similar àquela da sinóvia de RA. Desse modo, células NK de NKG2A+ podem reconhecer sinoviócitos de HLA-E+, endotélio vascular e células imunes infil- trantes na sinóvia inflamada de pacientes de OA.

[00225] O ligante para CD94-NKG2A, HLA-E, foi observado ser ex- pressado na sinóvia inflamada de não só RA e OA, mas também pacientes com artrite psoriática (PsA). Isto é mostrado na Fig. 10. que descreve tingimento das amostras de tecido sinovial de pacientes de RA, OA e PsA (como indicado) com o mAb de anticorpo de anti-HLA-E MEM-E/02. Na sinóvia de controles normais, a expressão de HLA-E é observada no endotélio vascular e, mais fraca, em subconjuntos dos sinoviócitos localizados no forro sinovial, como indicado na Fig. 10.

[00226] Estes dados mostram a expressão de HLA-E por sinovióci- tos, endotélio vascular e células imunes infiltrantes na sinóvia inflamada de pacientes de PsA, significando que as células NKG2A+ podem reconhecer tais subconjuntos de células HLA-E+ nestes pacientes.

[00227] Embora certas características da invenção tenha sido ilustradas e descritas aqui, muitas modificações, substituições, alterações, e equivalentes ocorrerão agora àqueles de habilidade usual na técnica. Portanto, é para ser entendido que as reivindicações em anexo são intencionadas a abranger todas tais modificações e alterações que caiam dentro do verdadeiro espírito da invenção.

MODALIDADES:

[00228] 1. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, para o tratamento de destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[00229] 2. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 1, para o tratamento de uma doença ou distúrbio onde redução da destruição da cartilagem e/ou erosão óssea é benéfica ao paciente.

[00230] 3. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 1 ou 2, em que o dito anticorpo de anti-NKG2A estimula eliminação seletiva das células destrutivas de cartilagem e/ou reduz a formação de células erosivas ósseas.

[00231] 4. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a eliminação seletiva das células destrutivas de cartilagem e/ou redução das células erosivas ósseas, são benéficos ao paciente.

[00232] 5. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que as células destrutivas de cartilagem são sinoviócitos do tipo fibroblastos (FLS).

[00233] 6. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer da modalidade 15, em que as células erosivas ósseas são osteoclastos.

[00234] 7. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 6, em que o osteoclasto de erosão óssea são células de TRAP+ multinucleadas.

[00235] 8. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[00236] 9. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 8, em que a doença ou distúrbio é osteoartrite.

[00237] 10. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 8, em que a doença de distúrbio é osteoporose.

[00238] 11. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 8, em que a doença de distúrbio é artrite psoriática.

[00239] 12. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 8, em que a doença de distúrbio é artrite reumática.

[00240] 13. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é um fragmento de ligação de antígeno do mesmo.

[00241] 14. Um anticorpo de Anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 13, em que o fragmento de anticorpo é selecionado de um Fab, um Fab’, um F(ab)2, um F(ab’)2, um F(ab)3, um Fv, um Fv de cadeia simples, um dsFv, um fragmento de Fd, um fragmento de dAb, um minicorpo, um diacorpo, um triacorpo, um tetracorpo, um corpo capa; uma IgG de camelo; uma IgNAR; e um fragmento de anticorpo multispecífico.

[00242] 15. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é um fragmento de Fab.

[00243] 16. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é um anticorpo biespecífico.

[00244] 17. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é conjugado com uma metade de extensão da meia-vida.

[00245] 18. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que a dita metade de extensão da meia-vida compreende uma ou mais metades de extensão da meia-vida selecionadas de uma ou mais da lista que consiste em: ácidos graxos e derivados dos mesmos, Hidróxi Etil Amido (HES), Poli Etileno Glicol (PEG), Ácido Hialurônico (HA), Polímeros de Heparosan, Polímeros à base de Fosforilcolina, flexímeros, dextrana, poli-ácidos siálicos (PSA), um domínio de Fc, transferrina, albumina, peptídeos Elastina-símiles, polímeros de XTEN, peptídeos ligadores de albumina, e qualquer combinação dos mesmos.

[00246] 19. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 18, em que o anticorpo pode ser conjugado com dois ou mais tipos diferentes de metades de extensão da meia-vida.

[00247] 20. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo compreende um domínio de Fc mutado, em que as ditas mutações resultam em funções de ligação de receptor de FCY reduzidas.

[00248] 21. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 20, em que o dito domínio de Fc compreende uma ou mais das mutações seguintes: L234A, L235E, e G237A, A330S e P331S (de acordo com o esquema de numeração de Kabat).

[00249] 22. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo compreende um domínio de Fc de IgG4.

[00250] 23. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 22, em que o dito domínio de Fc de IgG4 compreende a mutação de S241P/S228P.

[00251] 24. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades precedentes, em que o dito anticorpo é um anticorpo de IgG4 completo ou fragmento do mesmo.

[00252] 25. Um anticorpo de anti-NKGA, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modali- dades precedentes, em que o dito anticorpo é um anticorpo humanizado ou humano.

[00253] 26. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 25, em que o dito anticorpo é humZ270 ou humZ199.

[00254] 27. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 25 ou 26, em que o dito anticorpo é humZ270.

[00255] 28. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-27, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00256] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYWMN) da SEQ. ID. NO: 2, em que um ou dois destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente; e/ou

[00257] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-59 (RID- PYDSETH) da SEQ. ID. NO: 2, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de ami- noácido diferente; e/ou

[00258] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCAR- GGYD) da SEQ. ID. NO: 2, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente.

[00259] 29. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-28, em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00260] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (RASENIYSYLA) da SEQ. ID. NO: 3, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoáci- do diferente; e/ou

[00261] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50- 56 (NAKTLAE) da SEQ. ID. NO: 3, em que um ou dois destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoácido diferente; e/ou

[00262] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido 89 97 (QHHYGTPRT) da SEQ. ID. NO: 3, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoácido diferente.

[00263] 30. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-29, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00264] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYWMN) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00265] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-59 (RID- PYDSETH) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00266] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCAR- GGYD) da SEQ. ID. NO: 2.

[00267] 31. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-30, em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00268] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (RASENIYSYLA) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00269] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50 56 (NAKTLAE) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00270] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido 89 97 (QHHYGTPRT) da SEQ. ID. NO: 3.

[00271] 32. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-31, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00272] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYWMN) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00273] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-59 (RID- PYDSETH) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00274] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCAR- GGYD) da SEQ. ID. NO: 2;

[00275] e em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00276] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (RASENIYSYLA) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00277] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50 56 (NAKTLAE) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00278] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido 89 97 (QHHYGTPRT) da SEQ. ID. NO: 3.

[00279] 33. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-32, em que cadeia pesada do dito compreende SEQ. ID. NO: 2 e a cadeia leve do dito anticorpo compreende SEQ. ID. NO: 3.

[00280] 34. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de li gação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-24, que compete com o anticorpo de qualquer uma das modalidades 25-33, para ligar a NKG2A.

[00281] 35. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com a modalidade 25 ou 26, em que o dito anticorpo é humZ199.

[00282] 36. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou modalidade 35, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00283] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYAMS) da SEQ. ID. NO: 4, em que um ou dois destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente; e/ou

[00284] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-65 (EIS- SGGSYTYYADSVK) da SEQ. ID. NO: 4, em que um, dois, três ou quatro destes resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido diferente; e/ou

[00285] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos 99-108 (HGDYPRFFDV) da SEQ. ID. NO: 4, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácidos podem ser substituídos por um aminoácido diferente.

[00286] 37. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou 35-36, em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00287] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (SASSSVSSYIY) da SEQ. ID. NO: 5, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoáci- do diferente; e/ou

[00288] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50 56 (LTSNLAS) da SEQ. ID. NO: 5, em que um ou dois destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoácido diferente; e/ou

[00289] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido 89 97 (QQWSGNPYT) da SEQ. ID. NO: 5, em que um, dois ou três destes resíduos de aminoácido podem ser substituídos com um aminoáci- do diferente.

[00290] 38. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou 35-37, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00291] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYAMS) da SEQ. ID. NO: 4; e/ou

[00292] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-65 (EIS- SGGSYTYYADSVK) da SEQ. ID. NO: 4; e/ou

[00293] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos -108 (HGDYPRFFDV) da SEQ. ID. NO: 4.

[00294] 39. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou 35-38, em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00295] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (SASSSVSSYIY) da SEQ. ID. NO: 5; e/ou

[00296] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50 56 (LTSNLAS) da SEQ. ID. NO: 5; e/ou

[00297] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido -97 (QQWSGNPYT) da SEQ. ID. NO: 5.

[00298] 40. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou 35-39, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende:

[00299] - uma sequência de CRD1 de resíduos de aminoácido 31 a 35 (SYWMN) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00300] - uma sequência de CRD2 de aminoácidos 50-59 (RID- PYDSETH) da SEQ. ID. NO: 2; e/ou

[00301] - uma sequência de CDR3 de aminoácidos 95-102 (YCAR- GGYD) da SEQ. ID. NO: 2;

[00302] e em que a cadeia leve do dito anticorpo compreende:

[00303] - uma sequência de CDR1 de resíduos de aminoácido 24 34 (RASENIYSYLA) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00304] - uma sequência de CDR2 de resíduos de aminoácido 50 56 (NAKTLAE) da SEQ. ID. NO: 3; e/ou

[00305] - uma sequência de CDR3 de resíduos de aminoácido 89- 97 (QHHYGTPRT) da SEQ. ID. NO: 3.

[00306] 41. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 25-26 ou 35-40, em que a cadeia pesada do dito anticorpo compreende SEQ. ID. NO: 4 e a cadeia leve do dito anticorpo compreende SEQ. ID. NO: 5.

[00307] 42. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-25, que compete com o anticorpo de qualquer uma das modalidades 35-41, para ligar a NKG2A.

[00308] 43. O uso do anticorpo de anti-NKG2A, de qualquer uma das modalidades 1-7 ou 13-42 para o tratamento de uma destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[00309] 44. O uso do anticorpo de anti-NKG2A da modalidade 43, para o tratamento de uma doença ou distúrbio caracterizado por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea.

[00310] 45. O uso do anticorpo de anti-NKG2A da modalidade 44, em que a doença ou distúrbio é osteoartrite.

[00311] 46. O uso do anticorpo de anti-NKG2A da modalidade 44, em que a doença ou distúrbio é osteoporose.

[00312] 47. O uso do anticorpo de anti-NKG2A da modalidade 44, em que a doença ou distúrbio é artrite psoriática.

[00313] 48. O uso do anticorpo de anti-NKG2A da modalidade 44, em que a doença ou distúrbio é artrite reumática.

[00314] 49. Método de tratar umas doenças ou distúrbio caracteri zados por destruição da cartilagem e/ou erosão óssea compreendendo administrar o anticorpo de anti-NKG2A de qualquer uma das modalidades precedentes a um paciente.

[00315] 50. Método de tratar uma doença ou distúrbio caracteriza dos por destruição da cartilagem compreendendo administrar o anti- corpo de anti-NKG2A de qualquer uma das modalidades 1-49 a um paciente.

[00316] 51. Método de tratar uma doença ou distúrbio caracteriza dos por erosão óssea compreendendo administrar o anticorpo de anti- NKG2A de qualquer uma das modalidades 1-49 a um paciente.

[00317] 52. Método de tratar uma doença ou distúrbio caracteriza dos por destruição da cartilagem e erosão óssea compreendendo administrar o anticorpo de anti-NKG2A de qualquer uma das modalidades 1-49 a um paciente.

[00318] 53. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-49 para o uso como um medicamento.

[00319] 54. Um anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de liga ção de antígeno do mesmo, a formulação farmacêutica compreendendo o anticorpo de acordo com qualquer uma das modalidades 1-49.

[00320] 55. Uso do anticorpo de anti-NKG2A, ou um fragmento de ligação de antígeno do mesmo, de acordo com qualquer uma das modalidades 1-49 para a fabricação de um medicamento.

[00321] Todas as referências, incluindo publicações, pedidos de patente e patentes, citadas aqui são por este meio incorporadas por referência na mesma extensão como se cada referência fosse individual e especificamente indicada ser incorporada por referência e fosse exposta em sua totalidade aqui.

[00322] Todos os títulos e subtítulos são aqui usados para conveniência apenas e não devem ser interpretados como limitando a invenção de maneira nenhuma.

[00323] Qualquer combinação dos elementos acima descritos em todas as possíveis variações dos mesmos é abrangida pela invenção a menos que do contrário indicado aqui ou do contrário claramente contradito pelo contexto.

[00324] A menos que do contrário expressamente indicado ou claramente contradito pelo contexto, o termo "ou" aqui é usado no sentido inclusivo de "e/ou", e, consequentemente, como fornecendo implicitamente suporte a uma modalidade ou aspecto em que o termo é para ser interpretado no sentido exclusivo de ou disso ou daquilo.

[00325] Os termos "um(a)" e "o/a" e referentes similares como usados no contexto de descrever a invenção são para ser interpretados para abranger tanto o singular como o plural, a menos que do contrário indicado aqui ou claramente contradito pelo contexto.

[00326] Recitação de faixas de valores aqui é meramente intencionada para servir como um método de abreviação de referir-se individualmente a cada valor separado que caia dentro da faixa, a menos que do contrário indicado aqui, e cada valor separado é incorporado no relatório descritivo como se fosse citado individualmente aqui. A menos que do contrário declarado, todos os valores exatos fornecidos aqui são representativos de valores aproximados correspondentes (por exemplo, todos os valores exemplares exatos fornecidos com respeito a um fator ou medição particular podem ser considerados também fornecer uma medição aproximada correspondente, modificada por "cerca de," onde apropriado).

[00327] Todos os métodos descritos aqui podem ser executados em qualquer ordem adequada a menos que do contrário indicado aqui ou do contrário claramente contradito pelo contexto.

[00328] O uso de qualquer um e todos os exemplos, ou linguagem exemplar (por exemplo, "tal como") fornecidos aqui, é intencionado meramente para melhor elucidar a invenção e não impõem uma limitação no escopo da invenção a menos que do contrário indicado. Nenhuma linguagem no relatório descritivo deveria ser interpretada como indicando qualquer elemento é essencial para a prática da invenção a menos que for muito explicitamente declarado.

[00329] A citação e incorporação de documentos de patente aqui são feitas por conveniência apenas e não refletem qualquer concepção da validez, patentabilidade e/ou exequibilidade de tais documentos de patente.

[00330] A descrição aqui de qualquer aspecto ou modalidade da invenção usando termos tais como "compreendendo", "tendo", "incluindo" ou "contendo" com referência a um elemento ou elementos é intencionada a fornecer suporte para um aspecto ou modalidade similar da invenção que "consiste em", "consiste essencialmente em", ou "substancialmente compreende" aquele elemento ou elementos particulares, a menos que do contrário declarado ou claramente contradito pelo contexto (por exemplo, uma composição descrita aqui como compreendendo um elemento particular deveria ser entendida como também descrevendo uma composição que consiste naquele elemento, a menos que do contrário declarado ou claramente contradito pelo contexto).

[00331] Esta invenção inclui todas as modificações e equivalentes do assunto recitado nos aspectos ou reivindicações apresentadas aqui à extensão máxima permitida por lei aplicável.

Claims (3)

1. Uso de um anticorpo anti-NKG2A, caracterizado pelo fato de que é para fabricação de um medicamento para tratamento de des-truição da cartilagem e/ou erosão óssea em um indivíduo com osteoar- trite, em que o referido anticorpo compreende uma cadeia pesada tendo a sequência da SEQ ID NO: 2 ou 4 e uma cadeia leve tendo a sequência da SED ID NO: 3 ou 5.

2. Uso de um anticorpo de anti-NKG2A, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo é um anticorpo humanizado ou humano.

3. Uso de um anticorpo anti-NKG2A, de acordo com a rei-vindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o referido anticorpo anti-NKG2A é compreendido em uma formulação farmacêutica.

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