CN107073116A - 使用抗nkg2a试剂治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及作为头颈癌中的肿瘤逃避机制的HLA‑E。本公开涉及使用特异性结合并且抑制人类NKG2A的抗体治疗头颈癌，特别是表达HLA‑E的头颈部鳞状细胞癌的方法。

Description

使用抗NKG2A试剂治疗癌症
相关申请的引证
本申请要求2014年10月23日提交的美国临时申请号62/067,642的权益，该申请通过引用以其全部内容(包括任何附图)结合在此。
序列表的引用
本申请是连同电子格式的序列表提交的。序列表被提供为题为“NKG2A-HN_ST25”的文件，创建于2015年10月20日，大小是27KB。将在电子格式的序列表中的信息通过引用以其全文结合在此。
技术领域
本发明涉及NKG2A靶向剂用于治疗癌症(特别是头颈癌)的用途。本发明还提供了与NKG2A靶向剂一起用于治疗癌症的有利组合方案。
背景技术
NK细胞的活性通过一种既包括活化信号又包括抑制信号的复杂机制进行调节。已经鉴定了多种不同的NK特异性受体，这些受体在NK细胞介导的缺乏HLA I类的靶细胞的识别和杀灭中起着重要的作用。自然细胞毒性受体(NCR)是指一类活化受体蛋白和表达它们的基因，这些基因在NK细胞中特异性表达。NCR的实例包括NKp30、NKp44和NKp46(参见例如兰妮尔(Lanier)(2001)自然免疫学(Nat Immunol)2:23-27，彭德(Pende)等人(1999)实验医学杂志(J Exp Med.)190:1505-1516，甘托尼(Cantoni)等人(1999)实验医学杂志(J ExpMed.)189:787-796，斯沃瑞(Sivori)等人(1997)实验医学杂志(J Exp Med.)186:1129-1136，裴妮思(Pessino)等人(1998)实验医学杂志(J Exp Med.)188(5):953-60；曼德勒鲍姆(Mandelboim)等人(2001)自然(Nature)409:1055-1060，将其全部披露内容通过引用结合在此)。这些受体是Ig超家族的成员，并且它们通过特异性mAb诱导的交联导致强的NK细胞活化以及针对许多类型的靶细胞的NK细胞毒性的活化，该强的NK细胞活化导致细胞内Ca++水平增加，触发细胞毒性和淋巴因子释放。
CD94/NKG2A是在自然杀伤细胞(NK细胞)、自然杀伤T细胞(NKT细胞)和T细胞(α/β和γ/δ)的亚群中发现的抑制性受体。CD94/NKG2A限制前述淋巴细胞对表达CD94/NKG2A-配体HLA-E的细胞的细胞因子释放和细胞毒性反应(参见例如WO 99/28748)。还已经发现HLA-E通过某些肿瘤细胞(德尔(Derre)等人，免疫学杂志(J Immunol)2006；177:3100-7)和活化的内皮细胞以可溶的形式分泌(库佩尔(Coupel)等人，血液(Blood)2007；109:2806-14)。抑制CD94/NKG2A信号传导的抗体可以增加淋巴细胞对HLA-E阳性靶细胞的细胞因子释放和细胞溶解活性，例如CD94/NKG2A阳性NK细胞对病毒感染细胞的应答。因此，抑制CD94/NKG2A但不引起杀死表达CD94/NKG2A的细胞的治疗性抗体(即非消耗性抗体)可以诱导对在癌症患者中的肿瘤生长的控制。
此外，某些淋巴瘤(例如如NK淋巴瘤)的特征在于CD94/NKG2A表达。在这些患者中，靶向并杀死表达CD94/NKG2A的细胞(即消耗性抗体)的治疗性抗体能够通过抗体依赖性细胞毒性(ADCC)或补体依赖性细胞毒性(CDC)来根除肿瘤细胞。抗NKG2A抗体也已被建议用于治疗自身免疫性或炎性疾病(参见例如US 20030095965、WO 2006070286)。
本领域已经描述了针对NKG2A的各种抗体。WO 2008/009545描述了人源化抗NKG2A抗体Z270，而WO 2009/092805描述了人源化抗NKG2A抗体Z199。万斯(Vance)等人(实验医学杂志(J Exp Med)1999；190:1801-12)提到大鼠抗鼠NKG2抗体20D5(现在可经由美国BD生物科学Pharmingen公司(BD Biosciences Pharmingen)，目录号550518商购获得)；并且美国专利申请公开20030095965描述了鼠抗体3S9，据称其与NKG2A、NKG2C和NKG2E结合。
头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)发病率为每年约600,000例且死亡率约为50％。HNSCC的主要危险因素是烟草使用、酒精消耗和人乳头状瘤病毒(HPV)感染。尽管在其流行病学和发病机理的知识方面取得了进展，但是许多类型的HNSCC的存活率在过去四十年中几乎没有改善。HNSCC患者的总体5年生存率仅为约50％。烟草、酒精消耗和病毒剂是HNSCC发展的主要危险因素。这些危险因素与遗传易感性共同导致在癌症发展的多步骤过程中多种遗传和外遗传改变的累积，并且对HNSCC的这种分子致癌作用的理解正被用于治疗HNSCC的靶向试剂的中。
将免疫治疗作为HNSCC治疗的想法已经存在了几十年，并且针对治疗HNSCC的尝试涉及肿瘤特异性抗原的靶向。尽管在对各种实体癌使用这种免疫刺激治疗策略方面已经进行了改进，但是对于患有头颈鳞状细胞癌(HNSCC)的患者，这些策略的使用滞后。HNSCC的免疫治疗方法特别复杂的是由HNSCC诱导的深度免疫抑制，其潜在地降低免疫刺激作用的有效性。HNSCC逃避抗肿瘤免疫应答(例如HLA I类的下调)的机制综述提供于戴瑞(Duray)等人(2010)临床综述免疫(Clin.Dev.Immunol.)文章编号701657；2010:1-15中。
因此，在本领域中存在着对于患有头颈癌的患者的改进益处的需要。
发明内容
本发明尤其源自诸位发明人的如下发现：使用抗NKG2A抗体阻断抑制性受体NKG2A能够使NK细胞有效地消除头颈癌细胞。特别地，在头颈癌中，HLA-E作为肿瘤逃避机制，即使当正在用其他治疗剂治疗癌症时，并且包括在HPV阳性患者中。本文显示，头颈癌细胞以引起NKG2A表达NK和/或T细胞抑制的水平表达HLA-E，并且抗NKG2A抗体可逆转这种抑制。此外，即使当用EGFR抑制剂处理头颈癌细胞时，肿瘤细胞表达的HLA-E继续抑制NK和/或T细胞的裂解，并且可以使用抗NKG2A抗体来逆转这种抑制。
因此，在一个实施例中，提供了用于治疗或预防个体中的头颈癌的方法，该方法包括向患有头颈癌的个体给予治疗活性量的化合物，该化合物中和人类NKG2A多肽的抑制活性。在一个方面，提供了一种组合物，该组合物包括中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物，其用于治疗或预防头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)。在一个方面，中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物是能够以二价方式结合NKG2A的抗体。在一个方面，中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物是非消耗性抗体(例如缺乏Fc结构域或具有对一种或多种Fcγ受体具有最小结合或无结合的Fc结构域的抗体)。在一个实施例中，提供了抑制NK和/或T细胞上的NKG2A多肽并且使这类NK和/或T细胞裂解表达HLA-E的HNSCC细胞的化合物，其用于在个人中治疗或预防HNSCC。任选地，该所述治疗或预防包括向患有HNSCC的个体给予抑制NKG2A多肽的化合物。
在一个实施例中，癌症是口咽肿瘤、喉肿瘤、口腔肿瘤或下咽肿瘤。在一个实施例中，HNSCC是口腔SCC(OCSCC)。OCSCC包括唇、舌的前2/3、口底、口腔粘膜、齿龈、硬腭和磨牙后三角的鳞状细胞癌。
在一个实施例中，HNSCC是转移性癌症。
在一个实施例中，个体是人乳头状瘤病毒(HPV)阳性的(例如，其特征在于存在人乳头瘤病毒，对于与高癌风险或不良癌症预后相关的HPV基因型是阳性的，对于HPV16基因型是阳性的和/或对于P16INKa表达是阳性的)。
在一个实施例中，个体患有特征在于在肿瘤环境中(例如在肿瘤组织内和/或在肿瘤邻近组织内)存在淋巴细胞的头颈癌。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体以导致人类患者(体内)中人类CD94/NKG2A的抑制活性得以中和的量给予，任选地其中抗NKG2A抗体以下述剂量给予：导致周围血液NK和T淋巴细胞上的NKG2A多肽饱和持续至少两周，任选地至少四周。在一个实施例中，抗NKG2A抗体以1mg/kg至10mg/kg之间(任选以约4mg/kg、任选以约10mg/kg)的剂量给予。
在一个实施例中，在手术前向患有头颈癌的个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物(例如抗体)的治疗方案或疗程(即作为术前治疗)，以除去癌细胞。
任选地，可以在用抗NKGA试剂治疗之前评估癌症的HLA-E状态。在一个实施例中，提供了一种方法，该方法结合了HLA-E检测步骤以鉴定患有HLA-E+HNSCC的患者；这些患者此后可以用中和NKG2A多肽的抑制活性的试剂进行治疗。
在一个方面，提供了一种方法，该方法用于评估患有HNSCC的个体是否适合用中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物进行治疗，该方法包括测定来自患有HNSCC的个体的恶性细胞的HLA-E多肽状态，其中确定患者HLA-E多肽在恶性细胞中表达(例如，显著地表达；以与参考水平相比增加的水平；以与来自健康个体的相关组织中的水平相比增加的水平，和/或以对应于(至少)从抗NKG2A试剂获益的患者的水平)表明这类个体适合用中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物进行治疗。
在此的任何治疗用途或HNSCC治疗或预防方法的一个实施例中，个体中HNSCC的治疗或预防包括：
a)确定来自患有HNSCC的个体的恶性细胞的HLA-E多肽状态，并且
b)在测定患者HLA-E多肽由恶性细胞(例如至少在肿瘤细胞的值或比例，至少中度或强染色等)表达时，向该个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
在此的任何治疗用途或HNSCC治疗或预防方法的一个实施例中，个体中HNSCC的治疗或预防包括：
a)确定患有HNSCC的个体内恶性细胞的HLA-E多肽状态，并且
b)在测定恶性细胞以处于参考水平的水平或相比于参考水平增加的水平(例如与健康个体的参考水平相比升高，或者是不从抗NKG2A试剂获益的个体的参考水平；至少以对应于从抗NKG2A试剂获益的患者的参考水平)表达HLA-E多肽时，向个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
在任何方法的一个实施例中，在步骤(a)中确定HLA-E多肽状态包括确定生物样品中恶性细胞的HLA-E多肽的表达水平，并将该水平与对应于健康个体或不从抗NKG2A试剂获益的个体的参考水平(例如值、HLA-E阳性恶性细胞的比例、和/或染色弱或不存在等)进行比较。生物样品以比参考水平更高的水平表达HLA-E多肽的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。
在任何方法的一个实施例中，在步骤(a)中确定HLA-E多肽状态包括确定生物样品中恶性细胞的HLA-E多肽的表达水平，并将该水平与参考水平(例如值、HLA-E阳性恶性细胞的比例、和/或中度或强细胞表面染色等)进行比较。生物样品以至少处于参考水平的水平表达HLA-E多肽的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。
在任何方法的一个实施例中，在步骤(a)中确定HLA-E多肽状态包括确定生物样品中恶性细胞的HLA-E多肽的表达水平，并将该水平与对应于从抗NKG2A试剂治疗获益的个体(例如患有癌症、头颈癌)的参考水平(例如值、HLA-E阳性恶性细胞的比例、和/或中度或强细胞表面染色等)进行比较。生物样品以至少等于参考水平的水平表达HLA-E多肽的测定，该参考水平对应于从用抗NKG2A试剂治疗获益的个体，该测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。
在任何实施例的一个方面，来自个体的恶性细胞具有中等或强的HLA-E多肽表达(例如在免疫组织化学检测测定中的中度或强染色)的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。在任何实施例的一个方面，来自个体的相当大比例(例如至少约25％，任选地至少50％)的恶性细胞具有HLA-E多肽表达(例如在免疫组织化学检测测定中的中度或强染色)的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。在任何实施例的一个方面，来自个体的相当大比例(例如至少约25％，任选地至少50％)的恶性细胞具有HLA-E多肽表达(例如在免疫组织化学检测测定中的中度或强染色)，并且个体具有不良癌症预后(例如，转移性疾病、HPV基因型、侵袭性或晚期疾病)的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。在任何实施例的一个方面，来自个体的恶性细胞具有高HLA-E表达(如通过在具有HLA-E多肽表达的细胞亚型中的所有细胞中扩散表达的强信号所证实的(例如在免疫组织化学检测测定中的中度或强染色))的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。
在一个实施例中，抗NKG2A试剂可以有利地用于人乳头瘤病毒(HPV)阳性的患者中(例如其特征在于患者中存在人乳头状瘤病毒，对于与高癌风险或不良癌症预后相关的HPV基因型是阳性的，对于HPV16基因型是阳性的和/或对于P16INKa表达是阳性的)。在一个实施例中，HPV感染导致配体的肿瘤细胞上的表达增加，该配体通过在NK细胞和/或T细胞上的活化受体识别(例如NKG2D配体(例如MICA或MICB)的上调)，以及在肿瘤细胞表面上HLA-E表达增加，使得NKG2A阻断疗法在HPV阳性个体中特别有效。
在一个实施例中，提供了用于治疗或预防HPV阳性的个体中的癌症的方法，该方法包括向患有癌症的HPV阳性个体给予治疗活性量的化合物，该化合物中和人类NKG2A多肽的抑制活性。在一个实施例中，该癌症是实体瘤(例如晚期实体瘤)。在一个实施例中，该癌症是头颈癌。
任选地，在治疗之前，可以用抗NKG2A试剂评价个体的HPV状态。在一个实施例中，提供了用于治疗患有头颈癌的个体的方法，该方法包括：
(a)确定患有头颈癌的个体是否是HPV阳性的；
(b)如果该个体是HPV阳性，用治疗活性量的化合物治疗该个体(例如给予该个体)，该化合物中和人类NKG2A多肽的抑制活性。
在一个实施例中，提供了用于治疗患有癌症的个体的方法(例如使用化合物治疗或预防个体中的癌症，该化合物中和人类NKG2A多肽的抑制活性)，该方法包括：
a)确定个体是否具有特征在于肿瘤环境(例如肿瘤组织内和/或肿瘤邻近组织内)中存在淋巴细胞的肿瘤；以及
b)当测定个体具有特征在于肿瘤环境中存在淋巴细胞的肿瘤时，向个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。任选地，该肿瘤是实体瘤；任选地该肿瘤是头颈癌。
在另一个实施例中，患有头颈癌的个体是HPV阴性的。在一个实施例中，提供了治疗患有头颈癌的HPV阴性患者的方法，该方法包括向该个体给予中和NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体作为单个试剂治疗给予。在一个实施例中，在与一种或多种其他抗癌剂的组合治疗中给予抗NKG2A抗体。
在一个实施例中，提供了用于治疗或预防个体中的癌症的方法，该方法包括向个体给予(a)治疗活性量的化合物，该化合物抑制人类NKG2A多肽和(b)治疗活性量的化合物，该化合物结合和/或抑制人类EGFR多肽。在一个实施例中，该癌症是HNSCC。在一个实施例中，该结合和/或抑制人类EGFR的化合物是抗EGFR抗体。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体以导致人类患者(体内)中人类CD94/NKG2A的抑制活性得以中和的有效量给予，任选地其中抗NKG2A抗体以下述剂量给予：导致周围血液NK和T淋巴细胞上的NKG2A多肽饱和持续至少两周，任选地至少四周。在一个实施例中，该抗EGFR抗体以有效量给予，该有效量引起针对人类患者(体内)中表达人EGFR的肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性。在一个实施例中，该抗EGFR抗体以有效量给予，该有效量导致人类患者(体内)中人类EGFR活性的中和。在一个方面，根据特定的临床剂量方案，特别是以特定的剂量量并根据特定的给药方案(例如剂量量和/或根据在此提供的具体给药方案)给予该组合(或用于给予)。
在一个实施例中，提供了用于在个体中治疗或预防癌症的方法，该方法包括：
a)确定患有癌症的个体内恶性细胞的HLA-E多肽状态，
b)确定患有癌症的个体内恶性细胞的EGFR多肽状态，并且
c)当测定HLA-E和EGFR多肽在来自个体的恶性细胞的表面以处于参考水平的水平或相比于参考水平增加的水平表达时，向个体给予治疗方案，该治疗方案包括中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物以及结合和/或抑制EGFR的试剂。
在此的任何治疗用途或HNSCC治疗或预防方法的一个实施例中，个体中HNSCC的治疗或预防包括：
a)确定患有HNSCC的个体内恶性细胞的HLA-E多肽状态，
b)确定患有HNSCC的个体内恶性细胞的EGFR多肽状态，并且
c)当测定HLA-E和EGFR多肽在来自个体的恶性细胞的表面以处于参考水平的水平或相比于参考水平增加的水平表达时，向个体给予治疗方案，该治疗方案包括中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物以及结合和/或抑制EGFR的试剂。
在本文的任何方法中，可以通过直接(通过检测多肽)或间接(例如通过检测编码多肽的核酸)进行确定多肽状态或表达(例如HLA-E、NKG2A或EGFR)。
中和NKG2A多肽的抑制活性的化合物(抗NKG2A试剂)是增加表达NKG2A的NK细胞和/或T细胞引起HLA-E表达细胞死亡的能力的化合物。任选地，中和NKG2A多肽的抑制活性的化合物是结合NKG2A多肽的多肽，任选是抗体(例如单克隆抗体)。
在一个实施例中，该抗NKG2A试剂通过阻断其配体HLA-E的结合来降低NKG2A的抑制活性，即抗NKG2A试剂干扰NKG2A与HLA-E的结合。分别具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体是此类抗体的实例。在一个实施例中，抗NKG2A试剂降低NKG2A的抑制活性而不阻断其配体HLA-E的结合，即抗NKG2A试剂是非竞争性拮抗剂，并且不干扰NKG2A与HLA-E的结合。具有SEQ ID NO:16和17的重链和轻链可变区的抗体分别是此类抗体的实例。
在一个实施例中，抗NKG2A试剂是以比对一种或多种激活性NKG2受体显著更高的亲和力结合NKG2A的抗体。例如，在一个实施例中，该试剂是以比对NKG2C显著更高的亲和力结合NKG2A的抗体。在另外的或可替代的实施例中，该试剂是以比NKG2E显著更高的亲和力结合NKG2A的抗体。在另外的或可替代的实施例中，该试剂是以比NKG2H显著更高的亲和力结合NKG2A的抗体。分别具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体结合NKG2A而基本上不结合NKG2C、NKG2E或NKG2H。
在另外的或可替代的实施例中，该抗NKG2A试剂与具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体，和/或具有SEQ ID NO:16和17的重链和轻链可变区的抗体分别竞争与CD94/NKG2A的结合。该试剂可以是例如人类或人源化抗NKG2A抗体。
在一个实施例中，该抗NKG2A抗体是具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ IDNO:7的轻链的人源化抗体。提供了这样的人源化抗体的框架区(FR)中的氨基酸取代的示例性互补决定区(CDR)残基或序列和/或位点，该人源化抗体具有改进的性质例如像更低的免疫原性、改善的抗原结合或其他功能特性、和/或改善的物理化学性质例如更好的稳定性。
在其他的实施例中，提供了药物组合物和试剂盒，以及使用它们的方法。
将这些方面更详细地披露于在此提供的本发明的说明书中，并且另外的方面、特征和优点将从该说明书中显而易见。
附图说明
图1A和1B显示抗NKG2A增强NK细胞对HNSCC细胞系的识别的能力。NKG2A-NK(左)或NKG2A+NK细胞(右)上的CD107(上)和CD137(下)FACS读数表明，在指定的靶标HNSCC细胞系的存在下和在存在或不存在抗NKG2A的情况下的饱和剂量为10μg/mL。细胞系根据HLA-E表面表达水平从左到右排序。每个点代表来自健康志愿者的PBMC。图1A显示具有低或高水平的表面HLA-E的对照和K562靶，并且图1B显示抗NKG2A可以恢复具有内源性HLA-E表达的HNSCC的裂解。该作用仅在NKG2A阳性NK细胞上观察到，并且依赖于HLA-E的表达水平。
图2显示了增强ADCC的抗NKG2A的饱和剂量，通过NK细胞对由次优剂量的抗EGFR、西妥昔单抗(ctx)诱导的HNSCC FaDu细胞的作用。
图3A和3B显示增加剂量的抗NKG2A和增加剂量的抗EGFR(西妥昔单抗)的效果。图3A显示在没有靶标并具有K562-HLA-E转染子的对照上的CD107读出。每个健康志愿者由不同的符号表示：正方形或圆形。交叉打开的符号对应于其中抗NKG2A被与0.1μg/ml西妥昔单抗共孵育的10μg/mL hIgG4同种型对照取代的情况。图3B显示了在HNSCC细胞系上的CD107读出。对于西妥昔单抗的每种浓度，抗NKG2A的每种浓度的符号(正方形或圆形)从左到右对应于0μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml和10μg/ml。
图4显示在不同肿瘤位置/类型的头颈部鳞状细胞癌中从1+到3+的HLA-E染色。有趣的是，在来自通常认为具有最差预后(扁桃体)的肿瘤类型的所有样品中染色为3+。
图5显示了不同肿瘤患者的HPV16和P16状态的细节。
图6显示了随HPV16和P16INKA而变化的肿瘤类型(转移性或原发性肿瘤)。
图7显示HPV-阳性肿瘤以强淋巴细胞浸润为特征。
具体实施方式
定义
如在说明书中使用的，“一种/一个(a/an)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。如在权利要求中使用的，当与词“包括(comprising)”结合使用时，这些词“一种/一个(a/an)”可以意指一种/一个或多于一种/一个。如在此所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
当使用“包括”时，这可以任选地被“基本上由......组成”或通过“由......组成”代替。
NKG2A(OMIM 161555，将其全部公开内容通过引用结合在此)是NKG2转录物组的成员(霍施因斯(Houchins)等人(1991)实验医学杂志173:1017-1020)。NKG2A由跨越25kb的7个外显子编码，显示一些差异剪接。与CD94一起，NKG2A形成在NK细胞、α/βT细胞、γ/δT细胞和NKT细胞的亚群的表面上发现的异二聚体抑制受体CD94/NKG2A。与抑制性KIR受体类似，它在其胞质结构域中具有ITIM。如本文所使用的，“NKG2A”是指NKG2A基因或编码蛋白的任何变体、衍生物或同种型。还涵盖的是与野生型、全长NKG2A共享一种或多种生物学性质或功能并且共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸一致性的任何核酸或蛋白质序列。人类NKG2A在3个结构域中包含233个氨基酸，其中包含残基1-70的胞质结构域、包含残基71-93的跨膜区和包含残基94-233的胞外区，具有以下序列：
MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(SEQ ID NO:1)。
NKG2C(OMIM 602891，将其全部公开内容通过引用并入本文)和NKG2E(OMIM602892，将其全部内容通过引用并入本文)是NKG2转录物组的另外两个成员(吉尔恩科(Gilenke)等人，(1998)免疫遗传学(Immunogenetics)48:163-173)。CD94/NKG2C和CD94/NKG2E受体是在淋巴细胞(例如NK细胞和T细胞)亚群表面上发现的活化受体。
HLA-E(OMIM 143010，将其全部公开内容通过引用并入本文)是在细胞表面上表达并受肽的结合调节的非经典MHC分子，例如衍生自其他MHC I类分子的信号序列的片段。也已经鉴定了HLA-E的可溶性形式。除了其T细胞受体结合性质，HLA-E通过特异性结合CD94/NKG2A、CD94/NKG2B、和CD94/NKG2C而结合自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)和T细胞(α/β和γ/δ)的亚组(参见例如布罗(Braud)等人(1998)自然(Nature)391:795-799，其全部披露内容通过引用在此结合)。HLA-E的表面表达保护靶细胞免受CD94/NKG2A+NK、T细胞或NKT细胞克隆的裂解。如在此所使用的,“HLA-E”是指HLA-E基因或编码的蛋白质的任何变体、衍生物或同种型。还涵盖的是与野生型、全长HLA-E共享一种或多种生物学性质或功能并且共享至少70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的核苷酸或氨基酸一致性的任何核酸或蛋白质序列。
在本披露的上下文中，“CD94/NKG2A阳性淋巴细胞”是指在细胞表面上表达CD94/NKG2A的淋巴谱系(例如NK细胞、NKT细胞和T细胞)的细胞，这些细胞可以通过例如使用特异性识别CD94和NKG2A上的组合表位或单独NKG2A上的表位的抗体的流式细胞术来检测。“CD94/NKG2A阳性淋巴细胞”还包括淋巴来源的无限增殖细胞系(例如NKL、NK-92)。
在本披露的上下文中，“降低NKG2A的抑制活性”、“中和NKG2A”或“中和NKG2A的抑制活性”是指这样的过程，其中CD94/NKG2A在其对造成淋巴细胞反应(如细胞因子释放和细胞毒反应)的细胞内过程产生负面影响的能力方面受到抑制。这可以例如在基于NK细胞或T细胞的细胞毒性测定中测量，其中测量治疗化合物刺激通过CD94/NKG2A阳性淋巴细胞杀死HLA-E阳性细胞的能力。在一个实施例中，抗体制品导致CD94/NKG2A限制性淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，优选地淋巴细胞细胞毒性增加至少40％或50％，或更优选地NK细胞毒性增加至少70％，并涉及所述的细胞毒性测定。如果抗NKG2A抗体减少或阻断CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用，则其可增加CD94/NKG2A限制性淋巴细胞的细胞毒性。这可以例如在标准的4小时体外细胞毒性测定中使用例如表达CD94/NKG2A的NK细胞和表达HLA-E的靶细胞进行评价。此类NK细胞不能有效地杀死表达HLA-E的靶标，因为CD94/NKG2A识别HLA-E，导致阻止淋巴细胞介导的细胞溶解的抑制性信号传导的启动和传播。此类体外细胞毒性测定可以通过本领域熟知的标准方法进行，例如描述在克里甘(Coligan)等人编辑，当代免疫学实验手册(Current Protocols in Immunology)，格林出版联盟和威力跨学科出版公司(GreenePublishing Assoc.and Wiley Interscience)，纽约，(1992，1993)。评估抗体刺激淋巴细胞杀死靶细胞(例如P815、K562细胞或合适的肿瘤细胞)的能力的铬释放和/或其他参数也披露于斯沃瑞(Sivori)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1997；186:1129-1136；维泰勒(Vitale)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1998；187:2065-2072；佩斯诺(Pessino)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1998；188:953-960；奈瑞(Neri)等人，临床诊断实验室免疫(Clin.Diag.Lab.Immun.)2001；8:1131-1135；佩德(Pende)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1999；190:1505-1516中，其每个的全部披露通过引用结合在此。在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，然后杀伤被估计为与从细胞到培养基的51Cr释放成比例，作为杀伤的结果。添加防止CD94/NKG2A与HLA-E结合的抗体导致经由CD94/NKG2A的抑制性信号传导的启动和传播的预防。因此，添加此类试剂导致淋巴细胞介导的靶细胞杀伤的增加。该步骤由此鉴定为试剂，该试剂通过例如阻断配体结合来阻止CD94/NKG2A诱导的负信号传导。在特别的51Cr释放细胞毒性测试中，表达CD94/NKG2A的NK效应细胞可杀死HLA-E阴性LCL721.221靶细胞，但较少能杀死表达HLA-E的LCL 721.221-Cw3对照细胞。相反地，缺乏CD94/NKG2A的YTS效应细胞有效杀死两种细胞系。因此，由于HLA-E诱导的经由CD94/NKG2A的抑制性信号，NK效应细胞更低效地杀死HLA-E+LCL 721.221-Cw3细胞。当在这此类51Cr释放细胞毒性测定中，NK细胞与根据本发明的封闭抗CD94/NKG2A抗体预孵育时，以抗体浓度依赖性方式更有效地杀死表达HLA-E的LCL 721.221-Cw3细胞。抗NKG2A抗体的抑制活性(即细胞毒性增强潜能)也能以任何其他方法中的任一种(例如通过其对细胞内游离钙的影响)来评估，例如描述在斯沃瑞(Sivori)等人，实验医学杂志(J.Exp.Med.)1997；186:1129-1136(将其披露内容通过引用结合在此)中。NK细胞细胞毒性的活化可以是例如通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标记物(例如CD107或CD137转移)的增加来评价的。在一个示例性方案中，通过细胞表面和细胞质内染色以及通过流式细胞术在培养4天后的分析来评估来自PBMC的IFN-γ产生。简而言之，在培养物的最后4小时以5μg/ml的最终浓度添加布雷非德菌素A(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))。然后在透化(IntraPrepTM；贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和用PE-抗IFN-γ或PE-IgG1(Pharmingen)染色之前用抗CD3和抗CD56mAb孵育细胞。使用ELISA(GM-CSF：DuoSet Elisa，R&D系统公司，明尼阿波里斯，明尼苏达州，IFN-γ：OptElA set，Pharmingen)在上清液中测量来自多克隆激活的NK细胞的GM-CSF和IFN-γ产生。
无论何时当提及抗NKG2A粘结剂(例如抗体)的整个说明书中提及“治疗HNSCC”等时，是指：(a)治疗HNSCC的方法，所述方法包括向需要此类治疗的个体、哺乳动物(特别是人类)给予(至少一种治疗)抗NKG2A粘结剂(优选地以药学上可接受的载体材料)的步骤，以其允许治疗HNSCC的剂量(治疗有效量)，优选以如本文所述的剂量(量)；(b)抗NKG2A粘结剂用于治疗HNSCC或抗NKG2A粘结剂用于所述治疗(特别是在人类中)的用途；(c)抗NKG2A粘结剂在制备用于治疗HNSCC的药物制剂中的用途，使用抗NKG2A粘结剂用于制备用于治疗HNSCC的药物制剂的方法，该方法包括：将抗NKG2A粘结剂与药学上可接受的载体、或包含有效剂量的适于治疗HNSCC的抗NKG2A结合剂的药物制剂混合；或(d)a)、b)和c)的任何组合，这是根据本主题，本主题允许在提交本申请的国家取得专利权。
如在此所使用的术语“活检样品”被定义为去除组织用于检查例如以建立诊断的目的。活组织检查的类型的实例包括通过施加抽吸(例如通过连接到注射器的针)；通过器械移除组织片段；通过内窥镜用适当的器械移除；通过手术切除(例如整个病变)；和类似物。
如在此所使用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。根据重链恒定区的类型，可将抗体归入以下五种主要类别之一：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。将这些类别中的几种进一步分为亚类或同种型，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4等。一种示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元包括一种四聚物。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一条“轻”链(约25kDa)和一条“重”链(约50-70kDa)。每个链的N端定义了具有约100至110个或更多个氨基酸的一个可变区，主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指这些轻链和重链。对应于不同类别的免疫球蛋白的重链恒定区被对应地称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”以及“μ”。不同类别的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是熟知的。IgG是在此使用的示例性抗体类别，因为它们是生理状况下最常见的抗体且在实验室条件下最容易制备。任选地，该抗体是单克隆抗体。抗体的具体实例是人源化的、嵌合的、人的或其他适合人的抗体。“抗体”还包括任何一种抗体的任何一种片段或衍生物。
术语“特异地结合到”意指优选地在竞争性结合测定中抗体可以结合到结合配偶体(例如NKG2A)上，正如使用重组体形式的蛋白、其中的表位、或存在于分离的靶细胞的表面上的天然蛋白所评估。用于确定特异性结合的竞争性结合测定法以及其他方法在本领域内是熟知的。例如，可以经由放射性标记、物理方法(如质谱法)、或使用例如细胞荧光分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记检测结合。结合高于用对照看到的量，非特异性试剂指示试剂结合靶。特异性结合NKG2A的试剂可以单独地结合NKG2A或作为与CD94的二聚体结合NKG2A。
当一种抗体被称为与一种具体的单克隆抗体竞争时，它意指在使用重组分子(例如NKG2A)或表面表达的分子(例如NKG2A)结合测定中，该抗体与该单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体在结合测定中降低具有SEQ ID NO:2中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体与NKG2A多肽或表达NKG2A的细胞的结合，则称该抗体分别与这样的抗体“竞争”。
如在此使用的术语“亲和力”意指一种抗体与一种表位结合的强度。一种抗体的亲和性通过解离常数Kd(定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag])给出，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合体的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka是由1/Kd定义的。用于确定mAb的亲和力的方法可以发现于哈洛(Harlow)等人，抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press)，冷泉港实验室(Cold Spring Harbor)，纽约(N.Y.)，1988)，科尔根(Coligan)等人编著，当代免疫学实验手册(Current Protocols in Immunology)，格林出版联盟和威力跨学科(Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience)，纽约，(1992，1993)，以及马勒(Muller)，酶学方法(Meth.Enzymol.)92:589-601(1983)，将这些文献通过引用完全结合在此。本领域中熟知的用于确定mAb亲和力的一种标准的方法是使用表面等离子体共振(SPR)筛选(例如通过用BIAcoreTM SPR分析装置分析)。
在本文的上下文中，“决定簇”指明多肽上相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指一种抗原决定簇，并且是在抗原上与抗体结合的面积或区域。一个蛋白质表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基连同通过特异性抗原结合的抗体或肽被有效地阻断的氨基酸残基，即，抗体“足迹”内的氨基酸残基。它是可以与例如一种抗体或一种受体组合的复杂抗原分子上的最简单形式或最小结构区域。表位可以是直链或构象性的/结构性的。术语“线性表位”被定义为一种由在氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基构成的表位。术语“构象或结构表位”被定义为一种由并非都是连续的氨基酸残基构成的表位，并且因此代表通过分子的折叠(二级、三级和/或四级结构)彼此进入接近状态的氨基酸的线性序列的分开的部分。构象表位依赖于三维结构。因此，术语‘构象的’经常与‘结构的’互换使用。
在此使用术语“试剂”来表示化合物、化合物混合物、生物大分子、或由生物学材料制备的提取物。术语“治疗剂”是指一种具有生物活性的试剂。
出于本文的目的，“人源化”或“人”抗体是指一种抗体，其中一种或多种人免疫球蛋白的恒定和可变框架区与动物免疫球蛋白的结合区(例如CDR)相融合。这类抗体被设计成保持衍生出这些结合区的非人类抗体的结合特异性，但是却要避免对抗非人类抗体的免疫反应。此类抗体可获自转基因小鼠或其他动物，所述动物已经被“工程化”以产生响应于抗原激发的特异性人类抗体(参见，例如，格林(Green)等人(1994)自然遗传学(NatureGenet)(7:13；朗伯格(Lonberg)等人(1994)自然(Nature)368:856；泰勒(Taylor)等人(1994)国际免疫学(Int Immun)6:579，将其全部传授内容通过引用结合在此)。完全的人抗体还可通过基因或染色体转染法连同噬菌体展示技术来构建，这些技术在本领域中已知(参见，例如麦卡弗蒂(McCafferty)等人(1990)自然(Nature)348:552-553)。人抗体还可以通过体外激活的B细胞生成(参见，例如美国专利号5,567,610和5,229,275，将其全部内容通过引用结合在此)。
一种“嵌合抗体”是一种抗体分子，其中(a)恒定区或其一部份被改变、替换或交换，这样使得抗原结合位点(可变区)被连接至不同的或改变的类别、效应子功能和/或种类的一个恒定区，或连接至赋予该嵌合抗体新特性的完全不同的分子，例如酶、毒素、激素、生长因子、药物等；或者(b)可变区或其一部份被具有不同的或改变的抗原特异性的可变区改变、替换或交换。
术语“Fc结构域”、“Fc部份”、以及“Fc区域”是指抗体重链的C-末端片段，例如人类γ(伽马)重链的从大约氨基酸(aa)230至约aa 450或其他类型的抗体重链(例如针对人类抗体的α、δ、ε和μ)中的其对应序列、或其一种天然存在的同种异型。除非另外指明，贯穿本披露使用普遍接受的免疫球蛋白卡巴特氨基酸编号(参见卡巴特(Kabat)等人(1991)免疫学上感兴趣的蛋白的序列(Sequences of Protein of Immunological Interest)，第5版，美国公共卫生署(United States Public Health Service)，美国国立卫生研究院(National Institute of Health)，贝塞斯达，马里兰州)。
术语“分离的”、“纯化的”或“生物学纯的”是指实质上或基本上不含在天然状态下发现的通常伴随其的组分的物质。纯度和均质性典型地是使用分析化学技术(例如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法)来确定的。制剂中存在的主要种类的蛋白实质上是纯化的。
术语“多肽”、“肽”以及“蛋白”在此可互换地使用，是指氨基酸残基的聚合物。这些术语应用到氨基酸聚合物上，其中一个或多个氨基酸残基是对应的天然发生氨基酸的一种人工化学模拟物，并且应用到天然发生的氨基酸聚合物以及非天然发生的氨基酸聚合物上。
术语“重组”当用于指例如一种细胞、核酸、蛋白或载体时表明该细胞、核酸、蛋白或载体已经通过导入异源核酸或蛋白或者改变天然的核酸或蛋白进行修饰，或者表明该细胞衍生自这样修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内部找不到的基因，或表达天然基因然而却异常表达、低表达或根本不表达。
在此上下文中，“结合”多肽的或表位的术语抗体指定一种结合所述具有特异性和/或亲和性决定簇的抗体。
术语“一致性”或“一致的”当用于两种或更多种多肽的序列之间的关系时，是指多肽之间的序列关联程度，如通过两个或更多个氨基酸残基链之间匹配的数目来确定的。“一致性”使用由一种具体数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决的空位比对(如果有的话)测量两种或更多种序列中较短序列之间的一致匹配的百分比。相关多肽的一致性可以通过已知方法容易地计算出。此类方法包括但不限于在以下文献中描述的那些：计算分子生物学(Computational Molecular Biology)，莱斯克(Lesk)，A.M.编辑，牛津大学出版社(Oxford University Press)，纽约，1988；生物计算：信息学与基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)，史密斯(Smith)，D.W.编辑，学术出版社(AcademicPress)，纽约，1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)，部分1，格里芬(Griffin)，A.M.和格里芬(Griffin.)，H.G.编辑，胡马纳出版社(HumanaPress)，新泽西州，1994；分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology)，冯·海因切(von Heinje)，G.编辑，学术出版社，1987；序列分析入门(SequenceAnalysis Primer)，哥博斯科夫(Gribskov)，M.和德弗罗(Devereux)，J.编辑，斯托克顿出版社(M.Stockton Press)，纽约，1991；以及卡里略(Carillo)，等人，工业和应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)48,1073(1988)。
用于确定一致性的方法被设计为在测试的序列之间给出最大的匹配。确定一致性的方法描述于可公开获得的计算机程序中。用于确定在两个序列之间的一致性的计算机程序方法包括GCG程序包，包括GAP(德弗罗(Devereux)等人，核酸研究(Nucl.Acid.Res.)12,387(1984)；遗传学电脑集团(Genetics Computer Group)，威斯康辛大学(University ofWisconsi)，麦迪逊(Madison)，威斯康辛(Wis.))、BLASTP、BLASTN、以及FASTA(阿特休尔(Altschul)等人，分子生物学杂志(J.Mol.Biol)，215:403-410(1990))。BLASTX程序可以公开地从美国国家生物技术信息中心(NCBI)以及其他来源(BLAST手册，阿尔丘尔(Altschul)等人NCB/NLM/NIH贝塞斯达(Bethesda)，马里兰州20894；阿尔丘尔等人，同上)得到。熟知的史密斯-沃特曼算法(Smith Waterman algorithm)也可以用来确定一致性。
抗体的产生
抗NKG2A试剂结合人类CD94/NKG2A受体的细胞外部分，并降低在CD94/NKG2A阳性淋巴细胞表面上表达的人类CD94/NKG2A受体的抑制活性。在一个实施例中，试剂与HLA-E竞争结合CD94/NKG2A，即该试剂阻断CD94/NKG2A与其配体HLA-E之间的相互作用。在另一个实施例中，试剂不与HLA-E竞争结合CD94/NKG2A；即该试剂能够与HLA-E同时结合CD94/NKG2A。抗体可以结合CD94和NKG2A上的组合表位或单独结合NKG2A上的表位。在一个实施例中，抗体结合NKG2A上的表位，其至少部分地与HLA-E结合位点重叠。
在一方面中，该抗NKG2A试剂是选自完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体的抗体。在一个方面，该试剂包含衍生自人类IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定区。在一个方面，该试剂是选自以下抗体的片段：IgA、IgD、IgG、IgE和IgM抗体。在一个方面，该试剂是选自以下的抗体片段：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、VHH片段、单结构域FV和单链抗体片段。在一方面中，该试剂是选自以下各项的合成的或半合成的抗体衍生的分子：scFV、dsFV、微小抗体、双抗体、三抗体、κ体、IgNAR、以及多特异性抗体。
优选地，抗NKG2A抗体不显示与Fcγ受体(例如CD16)的实质性特异性结合。此类抗体可以包含已知不结合Fc受体的各种重链的恒定区。一个此类实例是IgG4恒定区。可替代地，不包含恒定区的IgG4抗体片段(例如Fab或F(ab')2片段)可用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包括例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。此外，可以使用任何人抗体类型(例如IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，其中Fc部分被修饰以最小化或消除与Fc受体的结合(参见例如WO 03101485，将其披露内容通过引用结合在此)。用于评估Fc受体结合的测定(例如基于细胞的测定)是本领域熟知的，并且描述于例如WO03101485中。
本披露因此涉及结合NKG2A的抗体或其他试剂。在一个方面，抗体以低于人类NKG2C和/或NKG2E至少100倍的KD结合NKG2A。
在本披露的一个方面，试剂通过干扰CD94/NKG2A信号传导来减少CD94/NKG2A介导的对表达CD94/NKG2A的淋巴细胞的抑制，例如通过干扰NKG2A与HLA-E的结合、阻止或诱导CD94/NKG2A受体的构象变化、和/或影响CD94/NKG2A受体的二聚化和/或聚集。
在本披露的一个方面，试剂以比NKG2C低至少100倍的KD结合NKG2A的细胞外部分。在另一个优选的方面，试剂以比NKG2C低至少150、200、300、400或10,000倍的KD结合NKG2A的细胞外部分。在披露的另一方面，试剂以比NKG2C、NKG2E和/或NKG2H分子低至少100倍的KD结合NKG2A的细胞外部分。在另一个优选的方面，试剂以比NKG2C、NKG2C和/或NKG2H分子低至少150、200、300、400或10,000倍的KD结合NKG2A的细胞外部分。这可以例如在BiaCore实验中测量，其中测量试剂结合固定化的CD94/NKG2A的细胞外部分(例如从表达CD94/NKG2的细胞中纯化的或在生物系统中产生的)的能力，并与同一测定中试剂与类似产生的CD94/NKG2C和/或其他CD94/NKG2变体的结合进行比较。可替代地，可测量试剂与天然表达或过表达(例如在瞬时或稳定转染后)CD94/NKG2A的细胞的结合，并与表达CD94/NKG2C和/或其他CD94/NKG2变体的细胞的结合进行比较。抗NKG2A抗体可以任选地结合NKG2B，该NKG2B是与CD94一起形成抑制性受体的NKG2A剪接变体。在一个实施例中，可以使用在美国专利号8,206,709中披露的方法测量亲和力，例如通过如在美国专利号8,206,709的实例8中所示的Biacore评估与共价固定的NKG2A-CD94-Fc融合蛋白的结合，将其披露内容通过引用结合在此。
抗体可以例如具有与表达NKG2A的细胞的结合(高亲和力)的EC50为0.5-10ng/ml之间，任选地1-5ng/ml，任选地1-10ng/ml，任选地1-20ng/ml，例如约4ng/ml。表达NKG2A的细胞可以是例如人类PBMC中表达NKG2A的细胞。在一个实施例中，表达NKG2A的细胞是表达CD94/NKG2A的细胞，例如如美国专利号8,206,709的实例13所示的稳定过表达CD94/NKG2A的Ba/F3细胞，将其披露内容通过引用结合在此。在一个实施例中，抗体对人类NKG2A多肽的结合亲和力(KD)，任选地其中结合亲和力是二价的，小于10-9M，任选地小于10-10M，或任选地小于10-11M，任选地介于10-10M和10-12M之间，任选介于10-10M和10-11M之间。可以评估亲和力，例如如美国专利号7,932,055中所述，结合单链NKG2A-CD94-mFc构建体，将其披露内容通过引用结合在此。
抗NKG2A抗体以是人类或人源化抗体，例如包含下表中所示的抗体的相应VH和VL区。
抗体 VH VL
VH6 SEQ ID NO:2 SEQ ID NO:7
VH1 SEQ ID NO:3 SEQ ID NO:7
VH5 SEQ ID NO:4 SEQ ID NO:7
VH7 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7
VH8 SEQ ID NO:6 SEQ ID NO:7
Z199 SEQ ID NO:16 SEQ ID NO:17
抗NKG2A抗体可以是人类或人源化抗体，例如包括来自选自例如VH1_18、VH5_a、VH5_51、VH1_f和VH1_46的人类受体序列的VH人类受体框架和JH6J-区段，或本领域已知的其他人类种系VH框架序列。VL区人类受体序列可以是例如VKI_O2/JK4。
在一个实施例中，抗体是基于抗体Z270的人源化抗体。不同的人源化Z270VH链示于SEQ ID NO:2-6(加下划线的可变区结构域氨基酸)中。人源化Z270VH轻链示于SEQ IDNO:7中。humZ270抗体也披露在美国专利号8,206,709(将其披露内容通过引用结合在此)中。humZ270VH6(SEQ ID NO:3)基于VH5_51；humZ270VH1(SEQ ID NO:2)基于VH1_18；humZ270VH5(SEQ ID NO:4)基于VH5_a；humZ270VH7(SEQ ID NO:5)基于VH1_f；并且humZ270VH8(SEQ ID NO:6)基于VH1_46；都具有JH6J-区段。这些抗体中的每一种保持与NKG2A结合的高亲和力，具有针对该抗体的宿主免疫应答的低可能性，因为每个人源化构建体的卡巴特CDR-H2的6个C-末端氨基酸残基与人受体框架相同。使用比对程序VectorNTI，获得humZ270VH1和humZ270VH5、-6、-7和-8之间的以下序列同一性：78.2％(VH1对VH5)、79.0％(VH1对VH6)、88.7％(VH1对VH7)和96.0％(VH1对VH8)。
在一个方面，该试剂包含(i)SEQ ID NO：2-6中任一个、或与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的重链可变区，和(ii)SEQ IDNO：7、或与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的轻链可变区。在一个方面，该试剂包含(i)含有SEQ ID NO：2-6中任一个的氨基酸序列、或与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的重链，和(ii)含有SEQ ID NO：7的氨基酸序列、或与其具有至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％一致的氨基酸序列的轻链。具有包含SEQ ID NO：2-6中任一个序列的重链和包含SEQ ID NO：7的序列的轻链的抗体中和NKG2A的抑制活性，但基本上不结合活化受体NKG2C、NKGE或NKG2H。此抗体还与HLA-E竞争结合细胞表面上的NKG2A。在一方面中，该试剂包含HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列，这些序列来源于具有SEQ ID NO：2-6中任一个的氨基酸序列的重链。在本发明的一方面中，该试剂包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列，这些序列来源于具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的轻链。
重链(可变区，加下划线的)
VH1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYA- QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSG LYS-LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：2)
VH6：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD- SETHYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGG-PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO：3)
VH5：
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD- SETHYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY- WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ ID NO：4)
VH7：
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTSYWMNWVQQAPGKGLEWMGRIDPYDSETHYAEKFQGRVTITADTSTD TAYMELSSLRSEDTAVYYCATGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：5)
VH8：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYAQKFQGRVTMTRDTSTS TVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVL DSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK(SEQ IDNO：6)
轻链
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO：7)
在一个方面，抗NKG2A抗体是包含对应于SEQ ID NO：2-6中任一个的残基31-35(氨基酸序列SYWMN(SEQ ID NO：8))的CDR-H1的抗体、对应于SEQ ID NO：2-6中任一个残基50-60(氨基酸序列RIDPYDSETHY(SEQ ID NO：9))(任选地50-66，当包括人起源的6个末端氨基酸时，即VH6重链的序列RIDPYDSETHYSPSFQG(SEQ ID NO：10)、VH1重链的序列RIDPYDSETHYAQKLQG(SEQ ID NO：11)等)的CDR-H2的抗体、以及对应于SEQ ID NO：2-6中任一个的残基99-114(95-102，根据卡巴特)的CDR-H3(氨基酸序列GGYDFDVGTLYWFFDV(SEQ IDNO：12))的抗体。在一个实施例中，CDR-H2对应于SEQ ID NO：2-6中任一个的残基50-66。任选地，CDR可以包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。
在一个方面，抗NKG2A抗体是包含对应于SEQ ID NO：7的残基24-34(氨基酸序列RASENIYSYLA(SEQ ID NO：13))的CDR-L1的抗体、对应于SEQ ID NO：7的残基50-56(氨基酸序列NAKTLAE(SEQ ID NO：14))的CDR-L2的抗体、以及对应于SEQ ID NO：7的残基89-97(氨基酸序列QHHYGTPRT(SEQ ID NO：15))的CDR-L3的抗体。任选地，CDR可以包含一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。
在一个方面，抗NKG2A抗体是包含以下各项的抗体：对应于SEQ ID NO：2-6中任一个的残基31-35的CDR-H1、对应于SEQ ID NO：2-6的残基50-60(任选地50-66)的CDR-H2、对应于SEQ ID NO：2-6中任一个的残基99-114(95-102，根据卡巴特)的残基CDR-H3、对应于SEQ ID NO：7的残基24-34的CDR-L1、对应于SEQ ID NO:7的残基50-56的CDR-L2、以及对应于SEQ ID NO:7残基89-97的CDR-L3。
在一个方面，试剂是针对任何上述抗体结合的CD94/NKG2A表位产生的完全人抗体。
应当理解地是，虽然可以使用上述抗体，但是可以制备其他抗体。例如，NKG2A的任何片段(优选但不排他地是人类NKG2A)或NKG2A片段的任何组合，可以用作免疫原以产生抗体，并且这些抗体可以识别在NKG2A多肽之内的任何位置的表位，只要它们能在如此处描述的表达NKG2A的NK细胞上这样做。最优选地，该表位是由具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体特异性识别的表位。
在一方面中，该试剂包含HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列，这些序列来源于具有SEQID NO:16的氨基酸序列的VH。在本披露的一方面中，该试剂包含LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列，这些序列来源于具有SEQ ID NO:17的氨基酸序列的VL。在一个方面，试剂包含衍生自具有SEQ ID NO:16的氨基酸序列的VH的HCDR1、HCDR2和/或HCDR3序列，以及衍生自具有SEQID NO:17的氨基酸序列的VH的LCDR1、LCDR2和/或LCDR3序列。具有SEQ ID NO:16的重链和包含SEQ ID NO:17的轻链的抗体中和NKG2A的抑制活性，并且还结合活化受体NKG2C，NKGE或NKG2H。抗体不与HLA-E竞争结合细胞表面上的NKG2A(即它是NKG2A的非竞争性拮抗剂)。
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYYPDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:16)
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPARFSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPYTFGGGTKLEIKR(SEQ ID NO:17)
在一个方面，试剂包括可变重链(VH)结构域(SEQ ID NO:16)的氨基酸残基31-35、50-60、62、64、66和99-108，以及可变轻链(VL)结构域(SEQ ID NO:17)的氨基酸残基24-33、49-55和88-96，任选地具有1、2、3、4或更多个氨基酸取代。
在一个方面，试剂是针对任何上述抗体结合的CD94/NKG2A表位产生的完全人抗体。
应当理解的是，尽管可以使用上述抗体，但是其他抗体可以识别并且针对NKG2A多肽的任何部分产生，只要该抗体导致NKG2A的抑制活性的中和。例如，NKG2A的任何片段(优选但不排他地是人类NKG2A)或NKG2A片段的任何组合，可以用作免疫原以产生抗体，并且这些抗体可以识别在NKG2A多肽之内的任何位置的表位，只要它们能在如此处描述的表达NKG2A的NK细胞上这样做。在一个实施例中，该表位是由具有SEQ ID NO:2-6中任一个的重链和SEQ ID NO:7的轻链的抗体特异性识别的表位。
在一个方面，试剂与美国专利号8,206,709(将其披露内容通过引用结合在此)中披露的humZ270抗体竞争结合人类CD94/NKG2A受体的细胞外部分。在一个方面，试剂与美国专利号8,796,427(将其披露内容通过引用结合在此)中披露的人源化Z199抗体竞争结合人类CD94/NKG2A受体的细胞外部分。竞争性结合可以例如在BiaCore实验中测量，其中测量试剂的能力，用于结合固定化的CD94/NKG2A受体的细胞外部分(例如从表达CD94/NKG2的细胞纯化，或在生物系统中产生)用humZ270饱和。可替代地，测量试剂与天然表达或过表达(例如在瞬时转染或稳定转染后)CD94/NKG2A受体并且已经用饱和剂量的Z270预孵育的细胞的结合。在一个实施例中，可以使用美国专利号8,206,709中披露的方法测量竞争性结合，例如通过如美国专利号8,206,709的实例15中所示的流式细胞术评估与Ba/F3-CD94-NKG2A细胞的结合，将其披露内容通过引用结合在此。
抗体配制品
可以将抗NKG2A试剂例如抗体掺入包含浓度从1mg/ml至500mg/ml的药物配制品中，其中所述配制品具有从2.0至10.0的pH。该配制品可以进一步包含缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张度基、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，该药物配制品是水性溶液，即包含水的配制品。此类配制品典型地是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，该药物配制品是水性溶液。术语“水性溶液”定义为包含至少50％w/w水的配制品。同样，术语“水性溶液”定义为包含至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”定义为包含至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施例中，该药物配制品是冷冻干燥的配制品，医生或患者在使用前添加溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施例中，该药物配制品是干燥配制品(例如冷冻干燥的或喷雾干燥的)，可立即使用而不经任何预先溶解。
在另外的方面，该药物配制品包含此类抗体的水性溶液和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或以上的浓度存在，并且其中所述配制品的pH从约2.0至约10.0。
在另一个实施例中，该配制品的pH在选自下列的范围，该列由以下各项组成：从约2.0至约10.0、约3.0至约9.0、约4.0至约8.5、约5.0至约8.0和约5.5至约7.5。
在一个另外的实施例中，缓冲液选自下组，该组由以下各项组成：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、N-二甘氨酸、两性离子缓冲剂、苹果酸、琥珀酸盐、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合物。这些特定缓冲液中的每一个构成替可替代的实施例。
在一个另外的实施例中，该配制品进一步包含要学上可接受的防腐剂。在一个另外的实施例中，该配制品进一步包含等渗剂。在一个另外的实施例中，该配制品也包含螯合剂。在一个另外的实施例中，该配制品进一步包含稳定剂。在一个另外的实施例中，该配制品进一步包含表面活性剂。为了方便起见，参考雷明顿(Remington)：药学科学与实践(TheScience and Practice of Pharmacy)，第19版，1995。
在肽药物配制品中存在其他成分是可能的。这些另外的成分包括润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、膨胀剂、张度调节级、螯合剂、金属离子、油性运载体、蛋白质(例如人血清蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如氨基酸如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，这些另外的成分不应不利地影响药物配制品的总体稳定性。
可以在以下若干个位点向需要此类治疗的患者给予包含抗体的药物组合物：例如在局部位点(例如皮肤)和粘膜位点、在避开吸收作用的位点(例如在动脉、血管、心脏给药)以及在涉及吸收的位点(例如在皮肤、皮下、肌肉或腹部给药)。可以通过以下若干个给药途径向需要此类治疗的患者给予药物组合物：例如皮下的、肌肉注射的、腹膜内的、静脉的、舌的、舌下的、颊的、口腔内的、口的、在胃和肠中、鼻的、肺的，例如通过细支气管和肺泡或其组合、表皮的、真皮的、经皮肤的、阴道的、直肠的、眼睛的，例如通过结膜、输尿管和胃肠外。
合适的抗体配制品也可以通过检查其他已经开发的治疗性单克隆抗体的经验来确定。在临床方面，数种单克隆抗体已经显示是有效的，例如美罗华(利妥昔单抗)、赫赛汀(曲妥珠单抗)、艾克斯莱尔(xolair)(奥巴佐单抗)、托西莫(托西莫单抗)、坎帕斯(阿伦单抗)、泽娃灵(Zevalin)、Oncolym，并且类似的配制品可以与该披露的化合物一起使用。例如，可以在100mg(10mL)或500mg(50mL)一次性使用的小瓶中以10mg/mL的浓度提供单克隆抗体，配制用于在9.0mg/mL氯化钠、7.35mg/mL柠檬酸钠二水合物、0.7mg/mL聚山梨酯80和无菌注射用水中的IV给药。将pH调节到6.5。在另一个实施例中，在约6.0的pH下，将抗体以包含约20mM柠檬酸钠、约150mM NaCl的配制品提供。
恶性肿瘤的诊断和治疗
描述了在个体中在诊断、预后、监测、治疗和预防头颈癌中有用的方法。HNSCC是在头部或颈部区域出现的鳞状上皮细胞或基底细胞样肿瘤，并且包括鼻腔、鼻窦、嘴唇、口和口腔、唾液腺、咽或喉的肿瘤。抗NKG2A试剂可特别地有用于例如口咽肿瘤、喉肿瘤、口腔肿瘤和下咽肿瘤的治疗。这些肿瘤由肿瘤学领域的从业者(例如医生、医学肿瘤学家、组织病理学家和肿瘤临床医生)常规鉴定。HNSCC的治疗也包括其恶化前的损害的治疗。HNSCC恶化前的损害可以包括例如发育异常、增生、粘膜白斑病、无核红细胞或毛舌。
可以将中和人类NKG2A多肽抑制活性的化合物(例如抗体)给予患有头颈癌的个体，这些个体没有接受外科手术以去除癌症细胞或这些患者没有在当前期间接受这种手术。然而，应当理解的是，也可以将该化合物给予接受了或正在接受外科手术以去除癌症细胞的患者。当将抗NKG2A化合物给予未接受外科手术以去除癌症细胞(例如以去除HNSCC细胞)的个体时，可例如在手术前约0至30天给予结合NKG2A的化合物。在一个实施例中，在手术前给予用抗NKG2A化合物治疗的至少一个(例如一个、两个、三个、四个或更多个)给药周期。在一个实施例中，该给药周期在2周和8周之间。
在有或没有预先检测步骤评估HLA-E在肿瘤细胞表面上的表达的情况下，患有头颈癌的患者可以用抗NKG2A药剂治疗。有利地，治疗方法可以包括检测来自个体的肿瘤的生物样品(例如肿瘤细胞)中的HLA-E核酸或多肽的步骤。生物样品表达HLA-E(例如突出表达；与参考相比以高水平表达HLA-E，用抗HLA-E抗体进行高强度染色)的测定表明患者患有从用抑制NKG2A的试剂治疗获得强的益处的头颈癌。在一个实施例中，该方法包括在一种生物样品中确定HLA-E核酸或多肽的表达水平并且将该水平与对应于健康个体或不从用抑制NKG2A的试剂治疗获益的个体的参考水平(例如一个值，弱的细胞表面染色，等)进行比较。生物样品以与参考水平相比增加的水平表达HLA-E核酸或多肽的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。任选地，在一种生物样品中检测HLA-E多肽包括检测在恶性HNSCC细胞的表面上表达的HLA-E多肽。在一个实施例中，生物样品显著地表达HLA-E核酸或多肽的测定表明患者患有可以用抑制NKG2A的试剂治疗的头颈癌。当提及一种HLA-E多肽时，“显著地表达”意指该HLA-E多肽被表达于一种相当多的取自给定病人的肿瘤细胞中。然而术语“显著地表达”的定义不限于精确的百分率值，在一些实例中，称为“显著地表达”的受体将存在于至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的取自患者的HNSCC细胞上。
确定个体是否具有表达HLA-E多肽的头颈癌细胞可以例如包括从包含头颈癌细胞的个体获得生物样品(例如通过进行活检)，使所述细胞与结合HLA-E多肽的抗体接触，并检测该细胞是否在其表面上表达HLA-E。任选地，确定个体是否具有表达HLA-E的头颈癌细胞，包括进行免疫组织化学测定。任选地，确定个体是否具有表达HLA-E的头颈癌细胞，包括进行流式细胞术测定。
可以在有或没有预先检测步骤评估患者(或患者的肿瘤)是否是HPV阳性，患有头颈癌的患者用抗NKG2A药剂来治疗。在一个方面，提供了一种方法，该方法预测患有肿瘤的患者是否将从抗NKG2A试剂的治疗获益。在一个实施例中，该方法包括确定患者是否是HPV阳性。
在一个实施例中，确定患有HNSCC的个体是否是HPV阳性的步骤包括检测或鉴定受试者中(例如来自受试者的样品中)的HPV分子。在一个实施例中，该HPV分子是受试者(例如样品中)的HPV核酸或HPV蛋白质。在一些实施例中，通过样品中的核酸的原位杂交(ISH)、PCR、RNA印迹分析或测序来鉴定HPV核酸。可以通过蛋白质印迹分析来鉴定HPV蛋白质，例如免疫组织化学(IHC)。在一个实施例中，通过IHC检测HPV以检测pI6蛋白(由CDKN2A编码)。来自受试者的样品可以是例如血液或血清样品、或尿液样品、或组织样品(例如肿瘤组织样品(例如来自活检))或口颊棉签。该样品可以是新鲜或冷冻的。在一个实施例中，是HPV阳性的个体对于类型16HPV，或任选地类型18、31和33HPV是阳性的。任选地，确定患有HNSCC的个体是否是HPV阳性的步骤包括检测类型16HPV，和/或类型18、31和/或33HPV
通常可以使用任何合适的HPV测定方法。FDA批准的HPV测定的实例包括双基因杂交捕获2高风险(Digene Hybrid Capture 2High-Risk)HPV DNA测试(Qiagen集团)，基于信号扩增的核酸杂交的体外微孔板测定，其使用化学发光定性检测在宫颈的18种类型的人乳头瘤病毒(HPV)DNA标本。另一个实例是来自第三波技术(Third Wave Technologies)的CervistaTM HPV测试。另一个实例是来自罗氏分子系统公司(Roche Molecular Systems,Inc.)，加利福尼亚州(CA.)的cobas HPV测试。另外的实例是来自基因探针公司(Gen-Probe,Inc.)的HPV测定。HPV阳性的患者然后可以例如被指定为适合用抗NKG2A试剂治疗的个体，或指定为用抗NKG2A试剂治疗的反应者，并任选地可以进一步用抗NKG2A试剂治疗。
任选地，评估个体是否存在一种或多种HNSCC相关的遗传标志物。HNSCC相关基因可能在那个基因或相关基因中具有异常的功能丧失或功能获得。抗NKG2A试剂可独立于HNSCC相关基因中的突变而有用，和/或可用于增强具有不良癌症预后的个体中的抗肿瘤反应，例如基于一个或多个遗传标记。因此，抗NKG2A试剂可用于治疗患有(或缺乏)HNSCC的患者，该HNSCC患有HNSCC相关基因中的突变，例如选自下组的基因，该组由一下各项组成：PI3激酶(PI3K)、PIK3CA、PIK3CG、TP63、CCND1、CCNE1、MYC、YAP1、HRAS、NOTCH1、NOTCH 2、NOTCH3、IRF6、CDKN2A、TP53、CASP8、PTEN、FAT1、RIPK4、EZH1、EZH2、MED1、MLL2、CDH1、FBXW7、PCLO、RIMS2、RBI、NSD1、EP300和NFE2L2。示例性异常功能获得HNSCC基因可以包括TP63、CCND1、CCNE1、MYC、YAP1、HRAS、PIK3CA、PIK3CG或NFE2L2。示例性异常功能丧失HNSCC基因可以包括NOTCH 1、NOTCH 2、NOTCH 3、IRF6、CDKN2A、TP53、CASP8、PTEN、FAT1、RIPK4、EZH1、EZH2、MED1、MLL2、CDH1、FBXW7、PCLO、RIMS2、RBI、NSD1或EP300。HNSCC相关的基因描述在斯特兰斯基(Stransky)等人，“头颈部鳞状细胞癌的突变景观”(“The Mutational Landscapeof Head and Neck Squamous Cell Carcinoma”)，科学(Science)，第333卷，2011年8月26日，该专利的内容通过引用以其整体结合在此。
在一个示例性方面中，提供了在具有可检测水平的癌细胞的哺乳动物宿主(例如，人类患者)中降低HNSCC进展的方法，该方法包括给予抗NKG2A试剂(例如抗NKG2A抗体)、抗NKG2A抗体组合物、或一种相关的组合物(例如，一种编码抗NKG2A抗体的核酸)，所给予的量足以可检测地降低宿主中HNSCC的进展。
用于治疗患有癌症的人类的合适的治疗方案包括例如向患者给予有效量的中和人类NKG2A的抑制活性的抗体，其中该方法包括至少一个给药周期，其中至少一个剂量的抗NKG2A抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予。在一个实施例中，该给药周期在2周和8周之间。
在一个实施例中，该方法包括至少一个给药周期，其中该周期是八周或更短的时间，其中对于该至少一个周期中的每一个，以1-10mg/kg体重的剂量给予两个、三个或四个剂量的抗NKG2A抗体。
在一个实施例中，抗NKG2A以有效使淋巴细胞上的NKG2A受体饱和的量给予至少一周、两周、三周或四周。在某些实施例中，抗NKG2A抗体以约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg的剂量(例如每个剂量)给予。
在此的任何实施例的一个方面中，约每2或4周给予一次抗NKG2A抗体。
将抗NKG2A抗体递送至受试者(通过直接给予，或从其中的核酸表达，例如从包括一个或多个抗NKG2A抗体-编码核酸序列的痘病毒基因转移载体)并且实践此处的其他方法可以用于降低、治疗、预防、或以其他方式改善癌症进展(特别HNSCC进展)的任何适合的方面。该方法可以特别用于降低和/或改善肿瘤生长(例如(肿瘤细胞相比于健康的T细胞)百分比、循环中的肿瘤细胞数目)、以及任何与其相关联的参数或症状(例如生物标记物)。独立地并且全面地降低、预防、或以其他方式改善癌症进展的这些方面的方法是有利的特征。
在另一个方面中，提供了这样一种方法，该方法降低癌症进展的风险，在已经经历起发的细胞群体中降低进一步癌症进展的风险，和/或在人类患者中提供用于降低癌症进展的治疗方案，该方法包括以一个足以实现反应(部分或完全反应)的量和方案向患者给予一种或多种第一治疗(例如，诱导疗法，如化学治疗剂)，并且然后向该患者给予一个量的抗NKG2A抗体或相关组合物(或施用组合给予方法)。
在一个另外的方面中，提供了一种在哺乳动物宿主(例如人类患者)中促进HNSCC的缓解的方法，该方法包括向该宿主给予一种包括抗NKG2A抗体的组合物，从而促进在宿主中的HNSCC缓解。
在一个又另外的方面，提供了这样一种方法，该方法用于降低发展HNSCC的风险，减少癌性病状发作的时间，和/或降低在早期阶段诊断的HNSCC的严重性，该方法包括向宿主给予一个预防有效量的抗NKG2A抗体或相关组合物以实现所希望的一种或多种生理效果。
在一个另外的方面中，提供了一种在诊断患有HNSCC的人类患者中增加存活超过一个相关时期的可能性的方法。在另一个方面中，提供了一种用于改进HNSCC患者的生活质量的方法，该方法包括向该患者给予一个有效于改进其生活质量的量的组合物。在一个另外的方面中，可以施用在此描述的方法以显著减少一种脊椎动物宿主中HNSCC细胞的数目，使得例如HNSCC细胞的总数降低。在一种相关的意义上，提供了一种用于杀灭(例如，直接或间接引起死亡)脊椎动物(如人类癌症患者)中的HNSCC细胞的方法。
抗NKG2A试剂(例如抗NKG2A抗体)可以作为单一疗法或与第二治疗剂的辅助或联合给药(共给药)给予。辅助或联合给药包括呈相同或不同剂量形式的化合物的同时给药，或化合物的分开给药(例如，顺序给药)。因此，抗NKG2A和第二治疗剂可以在单个配制品中同时给予。可替代地，抗NKG2A和第二治疗剂可以配制用于单独给药以及同时或顺序给予。第二治疗剂将通常按照在用于正治疗的具体疾病或病状的单次疗法中针对该药剂典型使用的量和治疗方案来给予。
在一个实施例中，第二治疗剂是能够介导ADCC(例如经由其Fc结构域结合一种或多种人类Fcγ受体(例如CD16))的抗体。在一个实施例中，该抗体包含一种或多种抗原结合域(例如VH-VL对)，该抗原结合域结合由肿瘤细胞表达的多肽，和Fc结构域，该Fc结构域经由其Fc结构域结合一个或多个人类Fcγ受体(例如CD16)。在一个实施例中，介导ADCC的抗体以有效量给予，该有效量引起针对人类患者(体内)中的人肿瘤细胞的抗体依赖性细胞毒性，该人类肿瘤细胞表达第二抗癌剂所针对的多肽。
在一个实例中，第二治疗剂是结合和/或抑制表皮生长因子受体(EGFR)的试剂。
在一个实施例中，使用的抗EGFR抗体是如以下各项中描述的抗体：WO 2006/082515和WO 2008/017963、WO 2002/100348、WO 2004/056847、WO 2005/056606、WO 2005/012479、WO 2005/10151、美国专利号6,794,494、EP 1454917、WO 2003/14159、WO 2002/092771、WO 2003/12072、WO 2002/066058、WO 2001/88138、WO 98/50433、WO 98/36074、WO96/40210、WO 96/27010、US 2002065398、WO 95/20045、EP 586002、美国专利号5,459,061或美国专利号4,943,533。因此，结合和/或抑制的试剂可以是抗EGFR抗体(例如嵌合抗体、人类抗体或人源化抗体)。本披露的方法中使用的抗EGFR抗体可以具有对EGFR中包含的一个或多个表位的任何合适的亲和力和/或亲合力。优选地，所使用的抗体以至多10-8M(优选至多10-10M)的平衡解离常数(KD)结合至人类EGFR。在一个实施例中，抗EGFR抗体包含保留Fcγ结合的Fc结构域(例如CD16)。在一个实施例中，抗EGFR抗体包含人IgG1或IgG3同种型的Fc结构域。
c225抗体(西妥昔单抗，)是抗EGFR抗体的一个实例；西妥昔单抗以在体外抑制EGF介导的肿瘤细胞生长并在体内抑制人类结肠直肠肿瘤在2003年得到了显著地认可。它是靶向表皮生长因子受体(EGFR)的嵌合的人类/小鼠单克隆抗体。已知其他抗EGFR抗体共享西妥昔单抗的所有生物活性的一些或全部，例如阻止EGFR的配体结合，阻止EGFR受体的激活并阻断EGFR途径的下游信号传导，从而导致细胞生长破坏。用于本披露的抗体的其他实例包括：扎芦木单抗(2F8，描述在WO 02/100348和WO 04/056847中)、尼妥珠单抗(h-R3)，帕木单抗(ABX-EGF)和马妥珠单抗(EMD72000)、具有大鼠ICR62抗体的CDR的抗体((WO 2010/112413)、奈斯单抗(necitumumab)(IMC-11F8，Eli Lilly)或这些中的任一种的变体抗体，或能够与这些中的任一种竞争的抗体(例如识别与这些中的任一个相同的表位的抗体)。可以通过任何适合的技术确定竞争。在一个实施例中，可以通过ELISA测定确定竞争。通常，竞争的特征在于通过ELISA分析确定的显著大于5％、10％或25％的相对抑制。
抗EGFR抗体或介导ADCC的其他抗体这些抗体还可以采用修饰有利地制成，所述例如修饰增加了它们结合Fc受体的能力，这可以影响效应子功能例如抗体依赖性细胞毒性、肥大细胞脱颗粒、以及吞噬，连同免疫调节信号(如调节淋巴细胞增殖和抗体分泌)。典型的修饰包括修饰的人类恒定区，所述修饰的人类恒定区包含至少一个氨基酸修饰(例如取代、缺失、插入)、和/或改变类型的糖基化，例如低岩藻糖基化。此类修饰可以影响与以下Fc受体的相互作用：FcγRI(CD64)、FcγRII(CD32)、和FcγRIII(CD 16)。FcγRI(CD64)、FcγRIIA(CD32A)以及FcγRIII(CD16)是激活型(即，免疫系统增强型)受体，而FcγRIIB(CD32B)是一种抑制型(即，免疫系统阻滞型)受体。修饰可以例如增加Fc结构域与活化性Fcγ(例如FcγRIIIa)在效应子(例如NK)细胞上的结合，或者可以减少Fc结构域与抑制性Fcγ(例如FcγRIIB)的结合。可以制得Fc修饰的任何组合，例如在以下文献中披露的不同修饰的任何组合：美国专利号US,7,632,497；7,521,542；7,425,619；7,416,727；7,371,826；7,355,008；7,335,742；7,332,581；7,183,387；7,122,637；6,821,505和6,737,056；在PCT公开号WO 2011/109400；WO 2008/105886；WO 2008/002933；WO 2007/021841；WO 2007/106707；WO 06/088494；WO 05/115452；WO 05/110474；WO 04/1032269；WO 00/42072；WO06/088494；WO 07/024249；WO 05/047327；WO 04/099249和WO 04/063351；以及在普雷斯塔(Presta,L.G.)等人(2002)生物化学学会汇报(Biochem.Soc.Trans.)30(4):487-490；谢尔顿(Shields,R.L.)等人(2002)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)26；277(30):26733-26740和谢尔顿(Shields,R.L.)等人(2001)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)276(9):6591-6604)。
抗EGFR抗体或介导ADCC的其他抗体可以包含变体Fc区，其中相对于野生型Fc区，该变体Fc区包括至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，使得该分子相对于包含野生型Fc区的分子而言具有增强的效应子功能，可任选地其中该变体Fc区包括在以下位置的任何一个或多个处的取代：221、243、247、255、256、258、267、268、269、270、272、276、278、280、283、285、286、289、290、292、293、294、295、296、298、300、301、303、305、307、308、309、310、311、312、316、320、322、326、329、330、332、331、333、334、335、337、338、339、340、359、360、370、373、376、378、392、396、399、402、404、416、419、421、430、434、435、437、438和/或439。在一个实施例中，变体Fc区在以下任何一个或多个位置包含取代：329、298、330、332、333和/或334(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)。抗EGFR抗体可以包含变体Fc区，其中相对于野生型Fc区，该变体Fc区包含至少一个氨基酸修饰(例如，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、或更多个氨基酸修饰)，使得该分子相对于包含野生型Fc区的分子而言具有增强的效应子功能，可任选地其中该变体Fc区包括在以下位置的任何一个或多个处的取代：329、298、330、332、333和/或334(例如S239D、S298A、A330L、I332E、E333A和/或K334A取代)。
在一个实施例中，具有变体或野生型Fc区的抗体可以具有改变的糖基化模式，所述模式增加抗体的Fc受体结合能力。可以通过例如在具有改变的糖基化机构的宿主细胞中表达抗体完成此类糖类修饰。在本领域中已经说明了具有改变的糖基化机构的细胞，并且这些细胞可以用作宿主细胞，在这些宿主细胞中表达本公开的重组抗体从而由此产生具有改变的糖基化的抗体。参见例如谢尔顿(Shields,R.L.)等人(2002)生物化学杂志(J.Biol.Chem.)277:26733-26740；乌马纳(Umana)等人(1999)自然生物技术(Nat.Biotech.)17:176-1，以及欧洲专利号：EP 1,176,195；PCT公开WO 06/133148；WO 03/035835；WO 99/54342，这些文献中各自的内容通过引用以其整体结合在此。通常，具有改变的糖基化的此类抗体是“糖基化优化的”，使得抗体具有特定的N-多糖结构，其产生某些期望的性质，包括但不限于与以下抗体相比增强的ADCC和效应细胞受体结合活性，这些抗体是未修饰的抗体或具有天然存在的恒定区并由鼠骨髓瘤NSO和中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(朱(Chu)和罗宾逊(Robinson)，当前生物技术(Current Opinion Biotechnol.)2001,12:180-7)产生的抗体、HEK293T表达的抗体或通常用于产生重组治疗性抗体的其他哺乳动物宿主细胞系。
在哺乳动物宿主细胞中产生的单克隆抗体包括在每个重链的Asn297处的N-连接的糖基化位点。抗体上的聚糖典型地是复杂的双触角(biatennary)结构，具有非常低的或没有平分型N-乙酰葡糖胺(平分型GlcNAc)和高水平的核心岩藻糖基化作用。聚糖末端含有非常低的或不含末端唾液酸和可变量的半乳糖。关于糖基化对抗体功能的作用的综述，参见，例如赖特(Wright)和莫里森(Morrison),生物技术趋势(Trend Biotechnol.)15:26-31(1997)。大量的工作显示，抗体聚糖结构的糖组成的改变可以改变Fc效应子功能。对抗体活性有贡献的重要的碳水化合物结构被认为是经由α-I,6连键附接至Fc区N-连接的寡糖的最里面的N-乙酰葡糖胺(GlacNAc)残基上的岩藻糖残基(希尔兹(Shields)等人，2002)。
历史上，在CHO细胞中产生的抗体在群体中含有大约2％至6％是非岩藻糖基化的。已经报道YB2/0(大鼠骨髓瘤)和Lecl3细胞系(CHO系的凝集素突变体，该突变体具有有缺陷的GDP-甘露糖4,6-脱水酶，导致缺乏作为α6-岩藻糖基转移酶底物的GDP-岩藻糖或GDP糖中间体)可产生具有78％至98％非岩藻糖基化种类的抗体。在其他实例中，RNA干扰(RNAi)或敲除技术可以用来改造细胞，以便降低FUT8mRNA转录物水平或完全敲除基因表达完全，并且此类抗体已被报道为含有高达70％非岩藻糖基化的聚糖。
抗EGFR抗体或介导ADCC的其他抗体可以例如在Asn297处用糖链糖基化，所述抗体显示出经由其Fc部分对FcγRIII的增加的结合亲和力。在本发明的一个实施例中，抗体将包含恒定区，该恒定区在Fc区中包含改善抗体与FcγRIIIa和/或ADCC的结合的至少一个氨基酸改变。
如在此所使用，辅助或联合给药(共同给药)包括呈相同或不同剂量形式的化合物的同时给药，或化合物的分开给药(例如，顺序给药)。因此，抗NKG2A和该第二治疗剂可以在单个配制品中同时给予。可替代地，抗NKG2A和该第二治疗剂可以配制用于单独给药以及同时或顺序给予。
在治疗方法中，抗NKG2A抗体和该第二治疗剂可以分开、一起或顺序地给予，或在混合剂中给予。在一些实施例中，该抗原结合化合物是在给予该第二治疗剂之前给予。例如，该抗NKG2A抗体可以是在给予该第二治疗剂之前大约0至30天给予。在一些实施例中，抗NKG2A抗体是在给予该第二治疗剂之前从大约30分钟至大约2周、从大约30分钟至大约1周、从大约1小时至大约2小时、从大约2小时至大约4小时、从大约4小时至大约6小时、从大约6小时至大约8小时、从大约8小时至1天、或从大约1至5天来给予。在一些实施例中,抗NKG2A抗体是在给予该第二治疗剂同时给予的。在一些实施例中，抗NKG2A抗体是在给予该第二治疗剂之后给予的。例如，抗NKG2A抗体可以在给予该第二治疗剂之后大约0至30天来给予。在一些实施例中，抗NKG2A抗体是在给予该第二治疗剂之后从大约30分钟至大约2周、从大约30分钟至大约1周、从大约1小时至大约2小时、从大约2小时至大约4小时、从大约4小时至大约6小时、从大约6小时至大约8小时、从大约8小时至1天、或从大约1至5天来给予。
用于治疗患有癌症的人类的合适的治疗方案包括例如向患者给予有效量的每种抑制NKG2A的抗体和结合和/或抑制人类EGFR的抗体，其中该方法包括其中至少一个剂量的抗NKG2A抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予以及至少一个剂量的抗EGFR抗体以1-20mg/kg体重的剂量给予的至少一个给药周期。在一个实施例中，该给药周期在2周和8周之间。
在一个实施例中，当与抗EGFR抗体组合施用时，抗NKG2A以有效中和淋巴细胞上的NKG2A受体的量给予至少一周，两周，三周或四周。对在皮摩尔范围的单链NKG2A-CD94-mFc多肽具有亲和力(KD值)的抗NKG2A抗体，特别是具有SEQ ID NO:2和7的重链和轻链的抗体，分别对单链NKG2A-CD94-mFc多肽具有67pM的亲和力(KD值)，以1-10mg/kg的剂量，当每两周给予时导致外周血淋巴细胞上的NKG2A的中和。
在一个实施例中，该方法包括至少一个给药周期，其中该周期是八周(或至少)的时间，其中对于该至少一个周期中的每一个，以1-10mg/kg体重的剂量给予两个、三个或四个剂量的抗NKG2A抗体以及以0.1-20mg/kg体重的剂量给予两个、三个或四个剂量的抗EGFR抗体。
在某些实施例中，抗NKG2A抗体的剂量(例如每个剂量)以10mg/kg给予。在某些实施例中，抗EGFR抗体的剂量(例如每个剂量)以1-20mg/kg、任选地以1-10mg/kg、任选地以1-5mg/kg(例如约1、2、3、4或5mg/kg)给予。
在一个实施例中，以400mg/m2初始剂量，随后每周250mg/m2，任选每2周一次给予西妥昔单抗。在一个实施例中，以每2周6mg/kg的剂量给予帕木单抗(维克替比(Vectibix)，Amgen)。
在某些实施例中，联合治疗允许以最大或批准剂量的较低剂量(例如作为单一药剂，或不存在抗NKG2A)给予抗EGFR抗体。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体和抗EGFR抗体按以下剂量给予：
(a)10mg/kg抗NKG2A抗体和1-10mg/kg(例如250mg/m2)的抗EGFR抗体；
(b)少于10mg/kg抗NKG2A抗体(例如至少1mg/kg)和1-10mg/kg(例如250mg/m2)的抗EGFR抗体；或
在此的任何实施例的一个方面中，约每2或4周给予一次抗NKG2A抗体。在此的任何实施例的一个方面中，约每一周给予一次抗EGFR抗体。在此的任何实施例的一个方面中，约每两周给予一次抗EGFR抗体。在此的任何实施例的一个方面中，约每四周给予一次抗EGFR抗体。
在一个实例中，一种方法包括至少一个给药周期，其中一剂量的抗NKG2A抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予，并且至少一剂量的抗EGFR抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予，其中抗NKG2A抗体每约两周给予一次(任选每四周给予一次)，并且抗EGFR抗体每约一周给予一次或每两周给予一次。在一个实施例中，该给药周期在2周和8周之间。在一个实施例中，该给药周期是2周。
在一个实例中，抗EGFR抗体是西妥昔单体并且没两周给予一次。例如，一种治疗包括至少一个给药周期，其中一剂量的抗NKG2A抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予，并且至少一剂量的抗EGFR抗体以1-10mg/kg体重的剂量给予(任选地对于第一次给药的抗EGFR的更高剂量的抗EGFR)，其中抗NKG2A抗体每约两周给予一次，并且抗EGFR抗体每约两周给予一次。
在一个实施例中，提供了测试个体是否适合用抑制NKG2A的试剂和结合(并且例如诱导ADCC朝向)和/或抑制人类EGFR的活性的试剂治疗的方法，该方法包括检测在来自个体的生物样品中表达HLA-E核酸或多肽和EGFR核酸或多肽的肿瘤细胞(例如HNSCC肿瘤细胞)。个体具有表达HLA-E核酸或多肽和EGFR核酸或多肽的肿瘤细胞(或肿瘤细胞群体)的测定表明患者患有癌症，其可以用抑制NKG2A的试剂与结合和/或抑制人类EGFR或活性的试剂组合治疗。
实例
实例1-抗NKG2A的剂量反应对NK细胞活化的影响
HNSCC的免疫治疗方法由于通过HNSCC诱导的深刻的免疫抑制特别复杂，其潜在地降低免疫刺激作用的有效性(参见例如杜瑞(Duray)等人(2010)免疫临床发展(Clin.Dev.Immunol)2010:1-15)。该实验的目的是探究靶向NKG2A的抗NKG2A抗体是否能够消除HNSCC细胞。
通过分析CD107和CD137表达来测定抗NKG2A对NK细胞活化的剂量反应的影响。4小时内的CD107转移是NK细胞释放裂解颗粒的标志(阿尔特(Alter)等人，(2004)免疫方法杂志(J Immunol Methods)294(1-2):15-22)。在24小时内CD137表达的增加与几种淋巴细胞(包括NK细胞)的活化相关(科赫瑞特(Kohrt)等人(2011)血液(Blood)117(8):2423-2432)。对表达或不表达NKG2A(分别为NKG2A+NK细胞或NKG2A-NK细胞)的NK细胞进行CD107和CD137表达的分析。由于抗体靶向NKG2A，预期其作用仅在NKG2A+NK细胞上可见，并且因此在实验中NKG2A-NK细胞可以被认为是内部对照。
使用的效应细胞是来自健康志愿者的新鲜分离的PBMC，并且靶细胞是HNSCC细胞系或用HLA-E转染的K562细胞系的克隆。计数细胞并在完全培养基中每两天传代。将它们保持在培养物中达12代。在实验的前一天，计数细胞并调节至100,000个细胞/孔。测量活力并且必须超过90％。
K562细胞系是K562克隆E6(HLA-E阳性，CD32低)和K562克隆F7(HLA-E阴性/低，CD32低)。通过流式细胞术筛选HLA-E表达的人类头颈癌细胞系(参见下表C)。选择三种细胞系进行功能测试：FaDu(ATCC#HTB-43)、H-N(DSMZ#ACC 417)和CAL-27(DSMZ#ACC 446)。
表C
使用的效应细胞是来自健康志愿者的新鲜分离的PBMC。靶细胞是HNSCC细胞系(FaDu、H-N和CAL-27)，以及用HLA-E(克隆E6＝HLA-E+，克隆F7＝HLA-E-)转染的K562细胞系的克隆，以E:T比为2.5/1。读出在4小时是CD107，在24小时是CD137。测试7个供体(FaDu和H-N)和2个供体(CAL-27)。使用其重链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2中且其轻链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:7中的抗NKG2A抗体，以10μg/mL的终浓度使用。
图1A和1B显示了在对照或指示的靶细胞系存在下和在以10μg/mL的饱和剂量存在或不存在抗NKG2A下，NKG2A-NK(左)或NKG2A+NK细胞(右)上的CD107(顶部)和CD137(底部)FACS读数。细胞系根据HLA-E表面表达水平从左到右排序。每个点代表来自健康志愿者的PBMC。图1B显示HNSCC细胞系并且证明抗NKG2A可以恢复具有内源性HLA-E表达的HNSCC或者用HLA-E转染的K562的裂解。该作用仅在NKG2A阳性NK细胞上观察到，并且依赖于HLA-E的表达水平。实际上，在具有中等至高HLA-E表达水平的细胞系上观察到抗NKG2A效应。
抗NKG2A可以通过阻断抑制性受体NKG2A与HLA-E的相互作用来诱导NK介导的HLA-E表达细胞系的裂解。这种效应在用HLA-E转染的K562细胞系上观察到，但更重要的是在具有内源HLA-E表达的HNSCC细胞系如FaDu和CAL-27细胞系上观察到。抗NKG2A效应的程度取决于靶细胞的细胞表面的HLA-E表达水平。
实例2-抗EGFR活性的HLA-E抑制可以通过抗NKG2A克服
表皮生长因子受体(EGFR)(还有ErbB-1；人类中的HER1)是受体酪氨酸激酶的ErbB/HER家族中普遍表达的跨膜糖蛋白。EGFR的高表达发生在大多数上皮恶性肿瘤(包括HNSCC)中并且与不良预后相关。其通过天然配体的激活导致细胞内信号通路的启动，这调节细胞增殖、侵入、血管生成和转移的激活，从而驱动肿瘤生长。
抗EGFR单克隆抗体西妥昔单抗被认为通过阻断EGF受体途径的致癌信号传导和通过诱导Fcγ受体介导的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)而起作用。然而，在HNSCC中，ADCC可以受诱导的深度免疫抑制的影响。同时，阻断EGF受体途径的致癌信号传导导致MICA/B和ULBP蛋白家族的主要组织相容性复合体(MHC)I类相关抗原在肿瘤细胞中的转录后调节，其被在NK细胞和T细胞亚群上的激活受体NKG2D识别。特别地，通过临床EGFR抑制剂降低了作为NKG2D的天然配体的这些应激相关抗原的肿瘤细胞的表达，因此潜在地降低了肿瘤细胞对NK和T细胞的可见性(万托瑞奥特(Vantourout)等人，科学转译医学(Sci Trans Med)6:231ra49(2014)。
设计本实验以探索EGFR抑制抗体对抗NKG2A抗体激活HNSCC中的NK细胞的能力的影响。使用从健康志愿者新鲜分离的PBMC作为效应细胞，以及作为靶细胞的HNSCC细胞系，通过分析CD107和CD137表达(参见实施例1的方法概述)来确定西妥昔单抗对NK细胞活化的剂量反应的作用(FaDu和H-N)，以E:T比为2.5/1。使用3个供体(在4小时内读出CD107)和4个供体(在24小时内读出CD137)读出在4小时为CD107，在24小时为CD137。西妥昔单抗以剂量反应，以10μg/mL开始的1/10系列稀释进行测试。对于一个健康志愿者，NK细胞被细分为NKG2A+和NKG2A-亚群。选择次优剂量的西妥昔单抗用于进一步测试以探索EGFR抑制抗体对抗NKG2A抗体激活HNSCC中的NK细胞的能力的影响。0.001μg/mL(1ng/mL)剂量是用CD107和CD137读数两者观察到的西妥昔单抗效应的起点。0.01μg/mL(10ng/mL)剂量大约在西妥昔单抗效应的EC 50。
使用新鲜分离的来自健康志愿者的PBMC作为效应细胞和作为靶细胞的HNSCC细胞系(FaDu、H-N和CAL-27)，用HLA-E(克隆E6＝HLA-E+，克隆F7＝HLA-E-)转染的K562细胞系的克隆，通过分析CD107和CD137表达(参见实例1的方法概述)评估抗NKG2A和亚最佳剂量的EGFR抑制剂的组合效应，以E:T比为2.5/1。使用7个供体(FaDu和H-N)和2个供体(CAL-27)读出在4小时为CD107，在24小时为CD137。
使用其重链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2中且其轻链氨基酸序列显示于SEQ IDNO:7中的抗NKG2A抗体，以对应于饱和剂量的10μg/mL的终浓度使用，并且EGFR抑制剂西妥昔单抗以0.001μg/mL或0.01μg/mL的两个次优剂量使用。
饱和剂量的抗NKG2A增强了由次优剂量的西妥昔单抗诱导的HNSCC细胞系的ADCC。在K562转染的细胞系上未观察到西妥昔单抗依赖性ADCC，因为它们不表达EGF-R。抗NKG2A作用仅在NKG2A阳性NK细胞上观察到，并且依赖于HLA-E的表达水平。实际上，在具有中等至高HLA-E表达水平的细胞系(FaDu、CAL-27和K562-HLA-E克隆E6)上观察到抗NKG2A效应。图2是对于FaDu细胞显示的代表性实例。可以在图2中看出饱和剂量的抗NKG2A增强了由次优剂量的西妥昔单抗(ctx)诱导的HNSCC细胞系的ADCC。
实例3-增加剂量的抗NKG2A与增加剂量的西妥昔单抗的联合作用
评估增加剂量的抗NKG2A与增加剂量的西妥昔单抗的联合作用的效果，以观察激活NK细胞对HNSCC靶细胞的能力。实验试图评估当以饱和剂量使用西妥昔单抗时抗NKG2A治疗是否仍能增强ADCC，以及抗NKG2A效应是否是剂量依赖性的。
简而言之，使用的效应细胞是来自健康志愿者的新鲜分离的PBMC，靶细胞是HNSCC细胞系(FaDu、H-N和CAL-27)，以及用HLA-E(克隆E6＝HLA-E+，克隆F7＝HLA-E-)转染的K562细胞系的克隆，以E:T比为2.5/1。使用2个供体，读出在4小时是CD107，在24小时是CD137。使用其重链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:2中且其轻链氨基酸序列显示于SEQ ID NO:7中的抗NKG2A抗体，以0.1和1μg/mL的两个次最佳剂量，以及以10μg/mL的饱和剂量使用。西妥昔单抗以0.001μg/mL和0.01μg/mL(约EC 50)的两个次优剂量和0.1μg/mL的饱和剂量在这些实验设置中使用。
结果在图3A和3B中示出。图3A显示CD107在没有靶标和K562-HLA-E转染子的对照上读出。每个健康志愿者由不同的符号表示：正方形或圆形。交叉打开的符号对应于其中抗NKG2A被10μg/mL hIgG4同种型对照取代的情况，其与0.1μg/mL西妥昔单抗共温育。可以看出，抗NKG2A抗体的效果是剂量依赖性的，取决于HLA-E表达水平，并且在以高水平表达HLA-E的克隆E6中0.1μg/mL的饱和剂量的西妥昔单抗仍观察到。在克隆F7(低HLA-E表达水平)中，抗NKG2A的作用有限，并且高剂量(例如饱和剂量)的抗NKG2A没有进一步增强该作用。
图3B显示了在HNSCC细胞系上的CD107读出。每个健康志愿者由不同的符号表示：正方形或圆形。交叉打开的符号对应于其中抗NKG2A被10μg/mL hIgG4同种型对照取代的情况，其与0.1μg/mL西妥昔单抗共温育。可以看出，抗NKG2A抗体的效果是剂量依赖性的，取决于HLA-E表达水平，并且在以高水平表达的HLA-E的FaDu或CAL-27中的0.1μg/mL的西妥昔单抗的饱和剂量下观察到。
抗NKG2A抗体的效果是剂量依赖性的，取决于HLA-E表达水平，并且在0.1μg/mL的西妥昔单抗的饱和剂量下仍然观察到。
实例4-HLA-E在HNSCC中(包括在HPV16基因型中)一致地表达
研究了HLA-E在HNSCC患者肿瘤上的表达。从患有临床阶段III、IV或IVA癌症鳞状细胞癌，NOS(16个原发性肿瘤和4个肿瘤等级为I至IV的转移性肿瘤(LN))疾病的20位患者中获得样品。分解为：口腔和/或底部(n＝3)、喉(n＝6)、咽(n＝1)、舌(n＝7)、扁桃体(n＝3)。HPV16基因型(14/20阳性)和HPV P16inka检测(7/14阳性)。
使用5μg/ml的鼠IgG1抗人类HLA-E(3D12)在冷冻组织切片上进行染色以染色5μg/ml的HLA-E和鼠IgG1抗NKG2A(Z270)以染色NKG2A，对照同种型：在5μg/ml的鼠的IgG1(DAKOA/S，Denmark)，使用EnvisionTM检测试剂盒(DAKO A/S，Denmark)进行检测。包括健康的人类阳性对照组织(胎盘、扁桃体和淋巴结)以及转染的细胞系。单独地，在肿瘤样品中评估肿瘤和基质淋巴细胞浸润。
使用的HLA-E和NKG2A染色方案如下：达到室温、用PBS再水化、在PBS中封闭内源性过氧化物酶0.3％H2O2、洗涤PBS 3X、用PBS饱和5％山羊血清、用稀释在PBS中的Ab 100μl孵育、洗涤PBS 3X、用Envision试剂盒孵育(2滴)、洗涤PBS 3X、与DAB孵育100μl、漂洗H2Od、用苏木精(2滴)孵育、漂洗H2Od、OTTIX成型浴、OTTIX加浴、并用Diamount滑动切割器和安装器安装。
除了染色水平0-3的评分之外，当存在时记录信号的细胞类型和细胞定位。它被归类为膜、细胞质或细胞外的细胞定位。
IHC评分是如下进行的：
0：负信号
1：在<25％-50％的细胞类型中微弱至弱信号
2：中间信号强度但表示为>50％的细胞类型，或强信号但表示为<25％-50％的细胞类型
3：强信号在细胞亚型内的所有细胞上扩散表达
结果显示从1+到3+的HLA-E的弥漫性细胞质染色。HLA-E染色跨越不同的肿瘤位置/类型，并且包括HPV阳性患者，包括HPV16基因型和以HPV P16INKA表达为特征的样品。
图4显示在不同肿瘤位置/类型中从1+到3+的HLA-E染色。有趣的是，在来自通常认为具有最差预后(扁桃体)的肿瘤类型的所有样品中染色为3+。
结果还显示HLA-E在HPV阳性患者中一致表达，包括HPV16基因型。图5显示了不同肿瘤患者的HPV16和P16状态的细节；通常认为具有最差预后的肿瘤类型(扁桃体)的所有样品都是HPV16阳性和P16INKA阳性。喉癌和舌肿瘤也主要是HPV16阳性，并且具有显著的P16INKA阳性样品的份额。图6显示作为HPV16和P16INKA的函数的肿瘤类型(转移性或原发性肿瘤)；所有转移性肿瘤均为HPV16阳性，且均为P16INKA阳性。结果进一步显示HLA-E表达以及HPV阳性肿瘤以强淋巴细胞浸润为特征，如图7所示。此外，肿瘤样品中的淋巴细胞表达NKG2A，在HPV16阳性和P16INKA阳性的患者中NKG2A的最强染色。
实例5-用于治疗癌症的人临床试验，其中重复注射人源化Z270作为单一试剂
该试验的主要目的是评估术前IPH2201(包含S241P突变的人源化抗NKG2A抗体Z270)在患有可操作的口腔鳞状细胞癌的患者中的抗肿瘤活性。次要目的是评估IPH2201的安全性、药代动力学、免疫原性和包括肿瘤内生物标志物的药效学
实验设计：
该试验是一个开放标签单臂阶段Ib-II研究，该研究包括一个进入部分。用具有可测量的、临床中期或高风险、III期或IVa口腔鳞状细胞癌的先前未治疗的患者将用单剂IPH2201i.v.每2周(q2w)给药4次，通过静脉内(i.v.)途径经1小时。前6名患者将以4mg/kgq2w x 4的剂量接受IPH2201。在以4mg/kg治疗的3名第一患者中，观察到IPH2201的第一次给予之间的最小间隔为一周。随后的患者将以10mg/kg q2w x 4的剂量治疗，在以4mg/kg治疗的最后一个患者中第一次给予后4周的最小随访后，安全委员会允许剂量增加。在最后一次给予IPH2201后，根据组织病理学危险因素进行标准局部区域性手术治疗，随后辅助治疗(放射治疗(RT)或放射化学治疗(RCT))。在肿瘤进展的情况下，将立即开始局部-区域治疗。
在第三次给予IPH2201之前和在最后一次给予IPH2201之后2周，在手术前临床和放射学评价抗肿瘤活性。根据RECIST 1.1标准在靶损伤上获得肿瘤测量。相同的成像技术用于在基线和术前期间，用于评价主要终点和/或手术后的功效评估，用于监测潜在的复发。在所有患者中进行通过适当的成像技术，在研究者的判断(计算机断层摄影(CT)扫描和/或磁共振成像(MRI))的评估，以及可及的肿瘤损伤的照片。
通过在基线时的活组织检查获得新鲜肿瘤样品，并在手术时收集切除的标本。患者将在第一次给药周期后跟踪一年。在研究访视结束后，复发和存活将根据当地做法在研究后记录另外2年。
在此所引用的所有文献(包括出版物、专利申请、以及专利)均通过引用以其全部内容特此结合，并且引用的程度如同每个文献被个别地并且明确地指示通过引用结合并且以其全部内容在此阐述(至法律允许的最大程度)，而不考虑在此其他地方做出的特定文件的任何单独提供的结合。
除非在此另外指示或与上下文明显矛盾，否则在描述本发明的上下文中，术语“一个/种”和“该”以及类似指称对象的使用应解释为包括单数和复数二者。
除非另有说明，所有在此提供的精确值均代表相应的近似值(例如，所有精确的示例值是相对于具体因子提供的，或者测量可以视为还包括提供相应的近似测量，在适当时由“大约”修饰)。其中“约”与数字结合使用，这可以被指定为包括对应于指定数字的+/-10％的值。
除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此对于使用了涉及一种或多种要素的术语如“包含”、“具有”、“包括”或“含有”的本发明的任何方面或实施例的描述，旨在提供对“由那一种或多种特定要素组成”、“基本上由那一种或多种特定要素组成”或“基本上包含那一种或多种特定要素”的本发明的类似方面或实施例的支持(例如，除非另外陈述或与上下文明显矛盾，否则在此所述的包含特定要素的组合物应理解为也描述由那个要素组成的组合物)。
本文提供的任何和所有实例或示例性语言(例如“例如”)的应用仅旨在更好地说明本发明，而不对另外要求保护的本发明范围做出限制。说明书中的语言不应当被解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
序列表
<110> 依奈特制药公司
<120> 使用抗NKG2A试剂治疗癌症
<130> NKG2A HN
<150> 62/067,642
<151> 2014-10-23
<160> 17
<170> PatentIn版本3.5
<210> 1
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人
<400> 1
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130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
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355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
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Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
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450
<210> 6
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 小鼠/人嵌合的
<400> 6
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
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Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
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Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
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355 360 365
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Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
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405 410 415
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435 440 445
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<212> PRT
<213> 人工的
<220>
<223> 小鼠/人嵌合的
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1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
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Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
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180 185 190
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210
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 8
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<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 9
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<210> 10
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工的
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<223> 小鼠/人嵌合的
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Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe Gln
1 5 10 15
Gly
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<223> 小鼠/人嵌合的
<400> 11
Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 12
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<212> PRT
<213> 小家鼠
<400> 12
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<213> 小家鼠
<400> 14
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<213> 小家鼠
<400> 16
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Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
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<213> 小家鼠
<400> 17
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
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Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
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65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg
100 105

Claims (29)

1.一种结合人类NKG2A多肽并且中和NKG2A的抑制活性的化合物，用于在个体中治疗或预防HNSCC中使用。
2.如权利要求1所述的方法，其中该HNSCC是OCSCC。
3.如权利要求1所述的方法，其中该HNSCC是口咽肿瘤。
4.如权利要求1所述的方法，其中该HNSCC是喉肿瘤。
5.如权利要求1所述的方法，其中该HNSCC是下咽肿瘤。
6.如以上权利要求中任一项所述的方法，其中该个体是HPV阳性的。
7.如以上权利要求中任一项所述的使用的化合物，其中在个体中治疗或预防HNSCC包括：
a)确定患有HNSCC的个体是否是HPV阳性的，并且
b)当测定该个体是HPV阳性的时，向该个体给予所述结合NKG2A多肽的化合物。
8.如以上权利要求中任一项所述的使用的化合物，其中在个体中治疗或预防HNSCC包括：
a)确定HLA-E多肽是否由来自患有HNSCC的个体的恶性细胞表达，并且
b)在测定恶性细胞以参考水平或高于参考水平表达HLA-E多肽时，向该个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
9.如权利要求8所述的使用的化合物，其中确定HLA-E多肽是否由恶性细胞表达包含从个体获得包含HNSCC细胞的生物样品，使所述细胞与结合HLA-E多肽的抗体接触，并且检测表达HLA-E的细胞。
10.一种结合人类NKG2A多肽并且中和NKG2A的抑制活性的化合物，用于在个体中治疗或预防癌症的方法中使用，其中该方法包括：
a)确定来自患有癌症的个体的恶性细胞的HLA-E多肽状态，
b)确定来自患有癌症的个体的恶性细胞的EGFR多肽状态，并且
c)当测定HLA-E和EGFR多肽由来自个体的恶性细胞以参考水平或高于参考水平的水平表达时，向该个体给予治疗方案，该治疗方案包括中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物、结合EGFR的试剂。
11.如权利要求10所述的使用的化合物，其中该个体患有晚期HNSCC。
12.如权利要求8-11中任一项所述的使用的化合物，其中当测定来自个体的恶性细胞与对应于健康个体的参考水平相比具有增加的HLA-E多肽表达时，向该个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
13.一种结合人类NKG2A多肽并且中和NKG2A的抑制活性的化合物，用于在个体中治疗或预防癌症的方法中使用，其中该方法包括：
a)确定个体是否患有特征在于肿瘤环境中存在淋巴细胞的癌症；以及
b)当测定该个体患有特征在于肿瘤环境中存在淋巴细胞的癌症时，向该个体给予中和人类NKG2A多肽的抑制活性的化合物。
14.如以上权利要求中任一项所述的使用的化合物，其中结合NKG2A多肽的化合物是抗NKG2A抗体。
15.如权利要求14所述的使用的化合物，其中该抗体包含人类IgG4恒定区。
16.如权利要求14-15中任一项所述的使用的化合物，其中该抗体包含Fc工程化的恒定区，该恒定区包含降低与人类Fcγ受体结合的氨基酸修饰。
17.如权利要求14-15中任一项所述的使用的化合物，其中该抗NKG2A抗体与具有分别包含SEQ ID NO:2和7的重链和轻链的抗体竞争结合人类NKG2A。
18.如权利要求14-17中任一项所述的使用的化合物，其中该化合物或NKG2A抗体包含具有SEQ ID NO:2所示序列的重链的CDR1、CDR2和CDR3结构域，以及具有SEQ ID NO:7所示序列的轻链的CDR1、CDR2和CDR3结构域。
19.如权利要求14-18中任一项所述的使用的化合物，其中该抗NKG2A抗体是作为药学上可接受的组合物给予的，该组合物包括治疗有效量的抗NKG2A抗体。
20.如权利要求19所述的使用的化合物，其中该组合物不含任何其他药学活性试剂。
21.如以上权利要求中任一项所述的使用的化合物，其中将该抗NKG2A抗体以从大约每周一次到大约每月一次的给药频率给予若干次。
22.一种结合人类NKG2A多肽并且中和NKG2A的抑制活性的化合物，用于在人类患者中治疗癌症的方法中使用，该方法包括向该患者给予有效量的以下各项中的每一种：(a)中和人类NKG2A的抑制活性的抗体，和(b)结合EGFR的试剂。
23.如权利要求22所述的使用的化合物，其中结合EGFR的试剂抑制EGFR的生物活性。
24.如权利要求22或23所述的使用的化合物，其中结合EGFR的试剂是抗体，该抗体诱导针对表达EGFR的肿瘤细胞的ADCC。
25.如权利要求22或24所述的使用的化合物，其中结合EGFR的试剂是西妥昔单抗。
26.如权利要求22-25中任一项所述的使用的化合物，其中该癌症是HNSCC。
27.如权利要求26所述的使用的化合物，其中该HNSCC是OCSCC。
28.如权利要求22-27中任一项所述的使用的化合物，其中该方法包括至少一个给药周期，其中该周期是两周的时间，其中对该至少一个周期的每一个，给予一个剂量的中和人类NKG2A的抑制活性的抗体并且给予两个剂量的结合EGFR的抗体。
29.如权利要求22-28中任一项所述的使用的化合物，其中该方法包括至少一个给药周期，其中该周期是两周的时间，其中对该至少一个周期的每一个，以1-10mg/kg的剂量给予一个剂量的中和人类NKG2A的抑制活性的抗体并且以1-10mg/kg的剂量给予两个剂量的结合EGFR的抗体。
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