CN114901689A - 用ilt-2抑制剂治疗癌症 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及NKG2A中和剂和抑制人ILT2的抗体用于治疗癌症，具体地是头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌，任选地NSCLC，肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌或卵巢癌的用途。

Description

用ILT-2抑制剂治疗癌症
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年10月14日提交的美国临时申请第62/914,595号的权益，所述美国临时申请通过引用整体并入本文，包含任何附图。
序列表的引用
本申请与电子格式的序列表一起提交。序列表以2020年10月12日创建的大小为147KB的以“LILRB1-NKG2A_ST25”命名的文件提供。序列表的电子格式中的信息通过引用以其整体并入本文。
技术领域
本发明涉及NKG2A中和剂和抑制人ILT2的抗体治疗癌症的用途。
背景技术
CD94/NKG2A是在淋巴细胞亚群(包含NK细胞和CD8 T细胞)上发现的抑制性受体。CD94/NKG2A限制某些淋巴细胞对表达CD94/NKG2A-配体HLA-E的细胞的细胞因子释放和细胞毒性应答。还发现某些肿瘤细胞和活化的内皮细胞以可溶形式分泌HLA-E。抑制CD94/NKG2A信号转导的抗体可能会增加淋巴细胞对HLA-E阳性靶细胞的细胞因子释放和溶细胞活性，如CD94/NKG2A阳性NK细胞对HLA-E表达性肿瘤细胞或病毒感染细胞的应答。因此，中和抗NKG2A抗体可以用于治疗癌症。
Ig样转录物(ILT)也被称为对应于CD85的淋巴细胞抑制受体或白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LIR/LILR)。这个蛋白质家族由位于19q13.4染色体中的多于10个基因进行编码，并且包含激活成员和抑制成员两者。抑制LILR通过其含有介于两个与四个之间的基于免疫受体酪氨酸的抑制结构域(ITIM)的长胞质尾区传输信号，所述抑制结构域在磷酸化后募集介导对各种细胞内信号通路的抑制的SHP-1和SHP-2磷酸酶。ILT-2是I类MHC抗原的受体并且识别广谱的HLA-A、HLA-B、HLA-C和HLA-G等位基因。ILT-2(LILRB1)也是H301/UL18(人巨细胞病毒I类MHC同源物)的受体。配体结合导致免疫应答的抑制信号和下调。据报道，除在树突状细胞(DC)上表达之外，ILT2蛋白还在NK细胞中被表达。
HLA I类分子与ILT蛋白的相互作用是复杂的。HLA-G不仅与ILT2结合，而且与ILT4和其它受体(例如，属于KIR家族)结合。此外，存在许多HLA-G同种型，并且只有与β-2-微球蛋白(和其可溶性/分泌形式HLA-G7)相关的型HLA-G1与ILT2相关，而所有型HLA-G1、-G2、-G3、-G4、-G5、-G6和-G7与ILT4相关。同样，ILT2和ILT4不仅结合HLA-G，还与其它MHC I类分子结合。ILT2和ILT4使用它们的两个膜远端结构域(D1和D2)来识别MHC分子的α3结构域和β2m亚基，这两者在典型和非典型MHC I类分子中都是保守的。
NK细胞是在来自淋巴样祖细胞的骨髓中发育的单核细胞，并且形态学特征和生物学性质通常包含决定簇(CD)CD16、CD56和/或CD57的表达；细胞表面上不存在α/β或γ/δTCR复合物；结合并杀伤不能表达“自身”主要组织相容性复合体(MHC)/人白细胞抗原(HLA)蛋白的靶细胞的能力；以及杀伤表达活化NK受体的配体的肿瘤细胞或其它患病细胞的能力。NK细胞的特征在于它们能够结合并杀伤几种类型的肿瘤细胞系，而无需事先免疫或活化。NK细胞还可以释放可溶蛋白和细胞因子，从而对免疫系统产生调节作用；并且可以经历多轮细胞分裂，并且产生具有与亲代细胞类似的生物学性质的子代细胞。正常、健康的细胞受到NK细胞的裂解保护。基于它们的生物学性质，本领域已经提出了依赖于NK细胞的调节的各种治疗策略。然而，NK细胞活性受到涉及刺激和抑制信号两者的复杂机制的调节。简而言之，NK细胞的裂解活性受到各种细胞表面受体的调节，所述表面受体在与靶细胞上的配体相互作用后转导阳性或阴性细胞内信号。通过这些受体传递的正信号与负信号之间的平衡决定了NK细胞是否裂解(杀伤)了靶细胞。已鉴定出几种不同的NK特异性受体，所述NK特异性受体在NK细胞介导的HLA I类缺陷靶细胞的识别和杀伤中起重要作用。NK细胞刺激信号可以由天然细胞毒性受体(NCR)，如NKp30、NKp44和NKp46；以及NKG2C受体、NKG2D受体、某些活化的杀伤性Ig样受体(KIR)和其它活化的NK受体介导(Lanier,《免疫学年度评审(Annual Review of Immunology》2005；23:225-74)。活化受体蛋白的交联导致NK细胞活化，导致细胞内Ca++水平升高，触发细胞毒性和淋巴因子释放，并且活化NK对许多类型的靶细胞的细胞毒性。
虽然免疫治疗剂最近在癌症治疗方面取得了重要进展，但许多患者并未经历完全和/或持久的应答。仍然需要改进免疫疗法，包含增强NK细胞介导消除癌细胞的能力的改进方法。
发明内容
本文研究了中和、非耗竭性和非FcγR结合的特异性抗ILT2抗体，所述抗体能够诱导来自人类供体的原代NK细胞的细胞毒活性增加。观察到中和抗NKG2A抗体和中和抗ILT2抗体的组合使用导致人NK细胞的抗肿瘤活性又进一步增强。所述组合在导致NK细胞裂解癌细胞方面特别有效和/或协同。尽管抗ILT2抗体(作为单一药剂)能够增强NK细胞对带有HLA-E和HLA-G两者的肿瘤靶细胞的细胞毒性，但添加NKG2A中和抗体会导致强烈加强抗ILT2抗体对NK细胞毒性的影响。
本文提供了包括NKG2A中和剂(例如NKG2A中和抗体)和ILT2中和剂(例如ILT2中和抗体)的组合治疗。此类组合治疗可以用于减轻对NK和CD8 T细胞毒性的抑制和/或加强和/或增强NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在一个实施例中，当进一步与增强NK和/或CD8 T细胞活性的药剂，例如中和PD-1的抗体，如结合PD-1的抗体或结合PD-L1的抗体，的施用组合时，本公开的组合治疗可能特别有利。一方面，在PD-1中和剂缺乏或具有有限的抗癌活性的情况下，所述组合在与PD-1中和剂组合治疗患者中可能特别有效，例如用于治疗在肿瘤细胞(例如，肿瘤细胞膜)上具有低或不可检测的PD-L1表达的个体，任选地其中少于10％、5％或1％的肿瘤细胞在细胞膜处表达可检测的PD-L1。
另一方面，当进一步与(例如，结合肿瘤相关抗原和介导ADCC的)抗体组合治疗时，包括中和NKG2A剂和ILT2中和剂的组合治疗可能特别有利。
一方面，本发明提供了治疗和/或预防癌症的方法、用于加强(或增强)NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的方法和/或用于在有需要的个体中引发抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括用中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)组合治疗个体。
在一个实施例中，提供了一种中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用作药物，其中中和NKG2A的药剂与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)组合施用。在一个实施例中，所述药物用于在有需要的个体中引发抗肿瘤免疫应答。在一个实施例中，所述药物用于加强(或增强)NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性。在一个实施例中，所述药物用于增加个体中肿瘤浸润性CD8+T细胞和/或NK细胞的活性和/或数量。
在一个实施例中，提供了一种中和ILT2的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用于治疗癌症，其中中和ILT-2的药剂与中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)组合使用。
在一个实施例中，提供了一种中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用于治疗癌症，其中中和NKG2A的药剂与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)组合使用。
在任何方面，中和ILT-2的抑制活性的药剂和中和NKG2A的抑制活性的药剂用于与中和PD-1抑制活性的药剂进一步组合来治疗个体，例如，抑制PD-1与PDL1之间相互作用的抗PD-1或抗PDL1抗体。在一个实施例中，提供了一种中和ILT2的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用于治疗癌症，其中中和ILT-2的药剂与中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)和中和PD-1的抑制活性的药剂(例如抗体)组合使用。在一个实施例中，提供了一种中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用于治疗癌症，其中中和NKG2A的药剂与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)和中和PD-1的抑制活性的药剂(例如抗体)组合使用。在一个实施例中，提供了一种中和PD-1的抑制活性的药剂(例如抗体)，所述药剂用于治疗癌症，其中中和PD-1的抑制活性的药剂与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)和中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)组合使用。在任何实施例中，个体患有特征在于肿瘤细胞(例如肿瘤细胞膜)上PD-L1表达低或没有可检测到的PD-L1表达的癌症。
在任何方面，中和ILT-2的抑制活性的药剂和中和NKG2A的抑制活性的药剂进一步与抗体组合使用，所述抗体与存在于肿瘤或肿瘤旁组织中的细胞(例如肿瘤细胞、免疫抑制细胞)上的抗原结合并且包括与人CD16A多肽结合的Fc结构域或其部分，其中此类抗体能够介导ADCC朝向表达抗原的细胞。
一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防癌症的方法、用于加强(或增强)NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的方法和/或用于在有需要的个体中引发抗肿瘤免疫应答的方法，其中所述个体具有特征在于存在HLA-E和/或HLA-G多肽的肿瘤环境(例如肿瘤组织、肿瘤旁组织、肿瘤细胞)，所述方法包括用中和NKG2A的抑制活性的药剂(例如抗体)与中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)组合治疗患有癌症的个体。
一方面，本发明提供了用于治疗和/或预防癌症的方法、用于加强(或增强)NK和CD8 T细胞对肿瘤细胞的细胞毒性的方法和/或用于在有需要的个体中引发抗肿瘤免疫应答的方法，所述方法包括：(i)鉴定患有癌症的个体，所述癌症的特征在于肿瘤细胞(例如肿瘤细胞膜)上PD-L1表达低或没有可检测到的PD-L1表达；以及(ii)向个体施用中和抑制性受体NKG2A的药剂、中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体或抗体片段)，以及任选地进一步中和PD-1的抑制活性的药剂。
在一个实施例中，提供了一种增加个体中肿瘤浸润性CD8+T细胞和/或NK细胞的活性和/或数量的方法，所述方法包括向个体施用有效量的中和抑制性受体NKG2A的药剂和有效量的中和ILT-2的抑制活性的药剂。
在中和ILT-2的抑制活性的药剂(例如抗体)中，尤其包含结合ILT-2的分子(例如抗体或抗体片段)。中和ILT2的药剂的特征可以在于其加强细胞毒性NK淋巴细胞和/或CD8T细胞活性的能力。另一方面，中和ILT2的药剂可以任选地表征为其促进适应性抗肿瘤免疫应答发展的能力，特别是通过CD8 T细胞分化和/或增殖为细胞毒性CD8 T细胞。
在一个实施例中，抗ILT2抗体(例如，抗体或抗体片段)包括与人ILT2蛋白特异性结合的免疫球蛋白抗原结合结构域(任选地，高变区)。所述抗体中和ILT2蛋白的抑制信号传导。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT1蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT4蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT5蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与人ILT6蛋白结合。在任何实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)可以被指定为不与ILT-1、ILT-3、ILT-5、ILT-6、ILT-7、ILT-8、ILT-9、ILT-10和/或IL-T11蛋白中的任何一个或多个结合(例如，缺乏与其中的每一个的结合)；在一个实施例中，所述抗原结合结构域(或抗体或包括此类的其它蛋白质)不与人ILT-1、-4、-5或-6蛋白(例如，野生型蛋白质、分别具有SEQ ID NO:3、5、6和7的氨基酸序列的蛋白质)中的任何一个结合。在本文中的任何实施例中，任何ILT蛋白(例如，ILT-2)可以被指定为在细胞(例如，原代或供体细胞、NK细胞、T细胞、DC、巨噬细胞、单核细胞、被制备成表达蛋白质的重组宿主细胞)的表面表达的蛋白质。在本文中的另一个实施例中，任何ILT蛋白(例如，ILT-2)可以被指定为分离的、重组的和/或膜结合的蛋白质。
任选地，抗ILT2抗体可以被指定为与人ILT2多肽特异性结合并且中和ILT2多肽的抑制活性的抗体片段、全长抗体、多特异性或双特异性抗体。任选地，ILT2多肽在细胞(任选地，效应淋巴细胞、NK细胞、T细胞，例如从人类个体获得、纯化或分离(例如，在没有对细胞进行进一步的修饰的情况下)的原代NK细胞、NK细胞或NK细胞群)的表面被表达。
一方面，特异性结合人ILT2的抗体增强NK细胞(例如，原代NK细胞)对在其表面带有ILT2的配体(例如，天然配体；HLA I类蛋白)的靶细胞的活性(例如，细胞毒性)，任选地，HLA-A蛋白、HLA-B蛋白、HLA-F蛋白、HLA-G蛋白。任选地，所述靶细胞在其表面另外地携带HLA-E蛋白。
在一个实施例中，中和ILT-2的抑制活性的抗体是特异性结合人ILT2并且增强和/或恢复标准4小时体外细胞毒性测定中的NK细胞(原代NK细胞)的细胞毒性的抗体(例如，抗体片段或包括此种片段的蛋白质)，在所述细胞毒性测定中，表达ILT2的NK细胞与表达ILT2的配体(例如，天然配体；HLA蛋白、HLA-G蛋白)的靶细胞一起温育。在一个实施例中，在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，并且然后将杀伤(细胞毒性)估计为与51Cr从细胞向培养基的释放成比例。在一个实施例中，所述抗体或抗体片段能够将表达ILT2的NK细胞的细胞毒性恢复到至少通过不表达ILT2的NK细胞观察到的水平(例如，如根据本文中的实例的方法测定的)。在一个实施例中，所述靶细胞是被制成表达HLA-G的K562细胞，任选地被制成表达HLA-G和HLA-E两者的另外的K562细胞。
在本文中的任何方面，NK细胞(例如，原代NK细胞)可以被指定为从人类供体纯化的新鲜NK细胞，任选地在使用之前在37℃下温育过夜。在本文中的任何方面，NK细胞或原代NK细胞可以被指定为ILT2表达，例如，用于细胞可以在ILT2上通过流式细胞术进行门控的测定中。
在另一个实施例中，特异性结合人ILT2的抗体或抗体片段(或包括此种片段的蛋白质)的特征可以在于中和人巨噬细胞中ILT2多肽的抑制活性的能力。在一个实施例中，所述抗体增加巨噬细胞介导的ADCC。在一个实施例中，所述抗体增加人巨噬细胞中的活化或信号传导。在一个实施例中，所述抗体在存在携带ILT2的天然配体(例如，HLA蛋白)的细胞的情况下中和ILT2多肽的抑制活性。
在本文中的任何实施例的另一方面，结合ILT2的所述抗体可以被表征为能够抑制(降低)ILT2与其一种或多种HLAI类配体(具体地，HLA-A、HLA-B、HLA-F和/或HLA-G蛋白)之间的相互作用。在一个实施例中，结合ILT2的所述抗体可以被表征为能够抑制(降低)ILT2与表达ILT-2的一种或多种HLA配体(具体地，HLA-A、HLA-B和/或HLA-G蛋白)的靶细胞(例如，肿瘤细胞)之间的相互作用。
在一个实施例中，中和人NKG2A多肽的活性的药剂是通过阻断其配体HLA-E的结合来降低NKG2A的抑制活性的抗体，即NKG2A中和抗体干扰HLA-E对NKG2A的结合。具有SEQ IDNO:68-72中的任何一个的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的抗NKG2A抗体是此类抗体的实例。在一个实施例中，抗体降低了NKG2A的抑制活性，而不阻断其配体HLA-E的结合，即，所述药剂是非竞争性拮抗剂，并且不干扰HLA-E对NKG2A的结合。分别具有SEQ IDNO:110和111的重链和轻链可变区的抗NKG2A抗体是此类抗体的实例。
在一个实施例中，抗NKG2A药剂是以比与一个或多个活化性NKG2受体结合显著更高的亲和力与NKG2A结合的抗体。例如，在一个实施例中，药剂是以比与NKG2C结合显著更高的亲和力与NKG2A结合的抗体。在另外的或替代性实施例中，药剂是以比与NKG2E结合显著更高的亲和力与NKG2A结合的抗体。在另外的或替代性实施例中，药剂是以比与NKG2H结合显著更高的亲和力与NKG2A结合的抗体。分别具有SEQ ID NO:68-72中的任何一个的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的抗体结合NKG2A而不与NKG2C、NKG2E或NKG2H结合。
在另外的或替代性实施例中，抗NKG2A药剂与具有SEQ ID NO:68-72中的任何一个的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的抗体和/或分别具有SEQ ID NO:110和111的重链和轻链可变区的抗体与CD94/NKG2A结合。药剂可以是例如人或人源化抗NKG2A抗体。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体是具有SEQ ID NO:68-72中的任何一个的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的人源化抗体。在一个实施例中，抗NKG2A抗体是莫那利珠单抗(monalizumab)。
在本文提供的本发明的描述中将更加充分地描述这些方面，并且另外的方面、特征和优点将是显而易见的。
附图说明
图1示出了健康个体中的表达ILT2的细胞的百分比。几乎所有B淋巴细胞和单核细胞表达ILT2，常规的CD4 T细胞和CD4 Treg细胞不表达ILT2，但很大一部分CD8 T细胞(约25％)、CD3+CD56+淋巴细胞(约50％)和NK细胞(约30％)表达ILT2。
图2A到2F示出了癌症患者相较于健康个体中的表达ILT2的细胞的百分比，其示出了单核细胞(图2A)、B细胞(图2B)、CD8 T细胞(图2C)、CD4γδT细胞(图2D)、CD16+NK细胞(图2E)和CD16-NK细胞(图2F)。如可以看出的，ILT2再一次在所有单核细胞和B细胞上被表达。然而，在NK细胞和CD8 T细胞亚群上，ILT2在来自三种类型的癌症(HNSCC、NSCLC和RCC)相较于健康个体的细胞上更加频繁地(具有统计学显著性)被表达。
图3示出了与同种型对照相比，在存在抗体的情况下，ILT2表达性NK细胞系对K562-HLA-G/HLA-E肿瘤靶细胞的裂解的增加％。抗体12D12、19F10a和商业292319在增强NK细胞毒性的能力方面比其它抗体更有效。
图4示出了如通过流式细胞术评估的三种示例性抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。12D12、18E1和26D8各自阻断ILT2与HLA-G或HLA-A2中的每一个的相互作用。
图5A是示出了使用原代NK细胞(来自两个人类供体)和制备成表达HLA-E和HLA-G的K562肿瘤靶细胞由抗ILT2抗体介导的表达CD137的总NK细胞的％的增加的代表性图。图5B是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和表达HLA-A2的B细胞系由抗ILT2抗体介导的表达CD137的ILT2阳性(左图)和ILT2阴性(右图)NK细胞的％的增加的代表性图。在用ILT2阳性NK细胞进行的每个测定中，12D12、18E1和26D8比抗体292319在更大程度上加强NK细胞毒性。图5A和5B中的每一个都示出了两个上图上的第一供体和两个下图上的第二供体。
图6A和6B从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了抗体增强原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性的能力。图6A示出了抗体使用来自5-12个不同供体的原代NK细胞对表达HLA-G和HLA-E的K562靶细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下增强NK细胞活化的能力。图6A示出了抗体增强使用来自3-14个不同供体的原代NK细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下针对表达HLA-A2的靶B细胞的NK细胞活化的能力。在每种情况下，12D12、18E1和26D8具有NK细胞毒性的较大增强。
图7示出了如通过流式细胞术评估的抗体与锚定到细胞表面的ILT2结构域片段蛋白质亚群的结合的代表性实例。
图8A示出了通过流式细胞术进行的抗体3H5、12D12和27H5与锚定到细胞的突变体ILT2蛋白(突变体1和2)的结合的滴定的代表性实例，其示出了这些抗体丧失了与突变体2的结合。图8B示出了通过流式细胞术进行的抗体26D8、18E1和27C10与D4结构域突变体4-1、4-1b、4-2、4-4和4-5的结合的滴定。抗体26D8和18E1丧失了与突变体4-1和4-2的结合，并且此外，26D8丧失了与突变体4-5的结合，而抗体18E1与突变体4-5的结合降低(但没有完全丧失结合)。相反，不加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体27C10丧失了与突变体4-5的结合，但保留了与4-1或4-2的结合。
图9A示出了表示包含结构域1(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域2(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图9B示出了表示包含结构域3(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域4(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。
图10示出了抗ILT2抗体对来自人类尿路上皮癌患者的ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞的活化的效应。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一个使得NK细胞毒性对靶细胞的细胞毒性增加多于2倍。
图11A示出了在两个人类供体中，在与抗ILT2抗体、抗NKG2A抗体或抗ILT2和抗NKG2A抗体的组合以及K562肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞活化的增加倍数(与培养基相比)。ILT2和NKG2A阻断的组合导致单独的抗ILT2或抗NKG2A药剂中的每种的NK细胞毒性显著更高。图11B示出了两个人类供体中LILRB1和NKG2A表达的NK细胞表型分析结果。图11C示出了在与抗ILT2抗体、抗NKG2A抗体或抗ILT2和抗NKG2A抗体的组合以及WIL-2NS肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞活化的增加倍数(与培养基相比)。抗ILT2和抗NKG2A的组合导致单独的抗ILT2或抗NKG2A药剂中的每种的NK细胞毒性的显著更高的NK细胞毒性。图11D示出了用于ILT2配体表达的WIL-2NS和K562肿瘤靶细胞的表型。
图12示出了在CCRCC患者中，肿瘤床中ILT2表达水平与存活率的相关性。CCRCC患者根据Cox回归的p值分为3组(高、中、低ILT2基因表达)(每组必须含有至少10％的患者)，并且为3组中的每组绘制存活概率曲线。较高ILT2与较低存活概率相关。
具体实施方式
如说明书中所用，“一”或“一个”可能表示一个或多个。如一个或多个权利要求中所用，当与单词“包括”结合使用时，单词“一”或“一个”可以表示一个或多于一个。如本文所使用的，“另一个”可以意指至少第二个或更多个。
当使用“包括”时，这可以任选地由“基本上由…组成”或“由…组成”替换。
NKG2A(OMIM 161555，其全部公开内容通过引用并入本文)是NKG2转录物组的成员(Houchins等人(1991)《实验医学期刊(J.Exp.Med.)》173:1017-1020)。NKG2A由跨越25kb的7个外显子编码，示出一些差异剪接。NKG2A与CD94一起形成异源二聚体抑制受体CD94/NKG2A，存在于NK细胞、α/βT细胞、γ/δT细胞和NKT细胞亚群的表面上。与抑制性KIR受体类似，它在其胞质结构域中具有ITIM。如本文所用，“NKG2A”是指NKG2A基因或编码的蛋白质的任何变体、衍生物或同种型。人NKG2A在3个结构域中包括233个氨基酸，胞质结构域包括以下序列的残基1-70，跨膜区域包括以下序列的残基71-93，并且胞外区域包括以下序列的残基94-233：MDNQGVIYSDLNLPPNPKRQQRKPKGNKSSILATEQEITYAELNLQKASQDFQGNDKTYHCKDLPSAPEKLIVGILGIICLILMASVVTIVVIPSTLIQRHNNSSLNTRTQKARHCGHCPEEWITYSNSCYYIGKERRTWEESLLACTSKNSSLLSIDNEEEMKFLSIISPSSWIGVFRNSSHHPWVTMNGLAFKHEIKDSDNAELNCAVLQVNRLKSAQCGSSIIYHCKHKL(SEQ ID NO:67)。
NKG2C(OMIM 602891，其全部公开内容通过引用并入本文)和NKG2E(OMIM 602892，其全部公开内容通过引用并入本文)是NKG2转录物组的两个其它成员(Gilenke等人(1998)《免疫遗传学(Immunogenetics)》48:163-173)。CD94/NKG2C和CD94/NKG2E受体是在如NK细胞和T细胞等淋巴细胞的亚群表面上发现的活化受体。
HLA-E(OMIM 143010，其全部公开内容通过引用并入本文)是非经典MHC分子，其在细胞表面上表达，并且受肽的结合所调节，例如，如衍生自其它MHC I类分子的信号序列的片段。还已经识别了HLA-E的可溶性版本。HLA-E除了其T细胞受体结合特性以外，还通过特异性结合CD94/NKG2A、CD94/NKG2B和CD94/NKG2C而结合自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T细胞(NKT)和T细胞(α/β和γ/δ)的亚群(参见，例如Braud等人(1998)《自然(Nature)》391:795-799，其全部公开内容通过引用并入本文)。HLA-E的表面表达保护靶细胞免受CD94/NKG2A+NK、T或NKT细胞克隆的裂解。如本文所用，“HLA-E”是指HLA-E基因或编码的蛋白质的任何变体、衍生物或同种型。
在本发明的上下文中，“NKG2A-”或“CD94/NKG2A-”、“阳性淋巴细胞”或“限制性淋巴细胞”是指在细胞表面上表达CD94/NKG2A的淋巴谱系的细胞(例如，NK细胞、NKT细胞和T细胞)，其可以通过例如使用特异性识别CD94和NKG2A上的组合表位或单独的NKG2A上的表位的抗体的流式细胞术来检测。“NKG2A阳性淋巴细胞”还包含淋巴来源(例如NKL、NK-92)的永生细胞系。
在本发明的上下文中，“降低NKG2A的抑制活性”、“中和NKG2A”或“中和NKG2A的抑制活性”是指CD94/NKG2A对细胞内过程产生负面影响的能力受到抑制，从而导致淋巴细胞应答如细胞因子释放和细胞毒性应答的过程。这可以例如在基于NK或T细胞的细胞毒性测定中测量，其中测量治疗性化合物刺激通过CD94/NKG2A阳性淋巴细胞杀死HLA-E阳性细胞的能力。在一个实施例中，NKG2A中和抗体制剂使CD94/NKG2A限制的淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，任选地使所述淋巴细胞的细胞毒性增加至少40％或50％，任选地使所述淋巴细胞的细胞毒性增加至少70％，任选地使NK细胞毒性增加至少70％，并且参考本文所描述的细胞毒性测定。如果抗NKG2A抗体减少或阻断CD94/NKG2A与HLA-E的相互作用，则可能增加CD94/NKG2A限制的淋巴细胞的细胞毒性。这可以例如在标准的4小时体外细胞毒性测定中，使用例如表达CD94/NKG2A的NK细胞和表达HLA-E的靶细胞进行评估。此类NK细胞不能有效地杀死表达HLA-E的靶标，因为CD94/NKG2A识别HLA-E，从而导致引发和传播阻止淋巴细胞介导的细胞溶解的抑制性信号传导。此类体外细胞毒性测定可以通过本领域众所周知的标准方法进行，如例如在Coligan等人编辑的《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》,格林出版协会和威立国际科学出版社(Greene Publishing Assoc.andWiley Interscience),纽约,(1992,1993)中所述。用于评估抗体刺激淋巴细胞杀死靶细胞，如P815、K562细胞或合适的肿瘤细胞的能力的铬释放和/或其它参数还公开于Sivori等人,《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》1997；186:1129-1136；Vitale等人,《实验医学杂志》1998；187:2065-2072；Pessino等人,《实验医学杂志》1998；188:953-960；Neri等人《临床和诊断实验室免疫学(Clin.Diag.Lab.Immun.)》2001；8:1131-1135；Pende等人,《实验医学杂志》1999；190:1505-1516，所述文献中的每一个的全部公开内容以引用的方式并入本文中。在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，并且然后由于杀伤，将杀伤估计为与51Cr从细胞向培养基的释放成比例。添加防止CD94/NKG2A与HLA-E结合的抗体导致阻止抑制信号通过CD94/NKG2A的引发和传播。因此，添加此类药剂导致淋巴细胞介导的靶细胞杀伤的增加。因此，此步骤识别了通过例如阻断配体结合来防止CD94/NKG2A诱导的负信号转导的药剂。在特定的51Cr释放细胞毒性测定中，CD94/NKG2A表达性NK效应细胞可以杀伤HLA-E阴性LCL721.221靶细胞，但不可以很好地杀伤HLA-E表达性LCL 721.221-Cw3对照细胞。相反，缺乏CD94/NKG2A的YTS效应细胞有效杀死两种细胞系。因此，由于HLA-E诱导的通过CD94/NKG2A的抑制信号传导，NK效应细胞对HLA-E+LCL 721.221-Cw3细胞的杀伤效率较低。在此种51Cr释放细胞毒性测定中，在将NK细胞与本文所描述的阻断性抗CD94/NKG2A抗体进行预温育时，可以以抗体浓度依赖性方式更有效地杀伤HLA-E表达性LCL 721.221-Cw3细胞。抗NKG2A抗体的抑制活性(即，提高细胞毒性的潜力)也可以以许多其它方式中的任一种来评估，例如，通过其对细胞内游离钙的作用，如所描述的，例如，在Sivori等人,《实验医学杂志》1997；186:1129-1136，所述文献的公开内容通过引用并入本文。例如，可以通过测量细胞因子产生(例如IFN-γ产生)或细胞毒性标记物(例如CD107或CD137动员)的增加来评估NK细胞毒性的活化。在示例性方案中，培养4天之后，通过细胞表面和胞浆内染色评估从PBMC产生的IFN-y，并且通过流式细胞术分析。简而言之，以5μg/ml的终浓度添加布雷菲德菌素A(Sigma Aldrich)，持续培养最后4小时。然后在透化(IntraPrepTM；贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter))和用PE-抗IFN-y或PE-IgG1(Pharmingen公司(Pharmingen))染色之前，将细胞与抗CD3和抗CD56单克隆抗体一起温育。使用ELISA(GM-CSF：DuoSet Elisa，明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司(R&DSystems,Minneapolis,MN)，IFN-y：OptElAset，Pharmingen公司)，在上清液中测量从多克隆活化的NK细胞产生的GM-CSF和IFN-y。
人ILT2是淋巴细胞抑制受体或白细胞免疫球蛋白(Ig)样受体(LIR/LILR)家族的成员。ILT-2包含6个同种型。Uniprot标识符编号Q8NHL6(其全部公开内容以引用方式并入本文中)被称为典型序列，包括650个氨基酸，并且具有以下氨基酸序列(包含残基1-23的信号序列)：
Figure BDA0003579061230000121
不具有前导序列的ILT2氨基酸序列示出如下：
Figure BDA0003579061230000122
在本发明的上下文中，“中和”或“中和ILT2的抑制活性”是指ILT2蛋白对导致免疫细胞应答(例如，细胞毒性应答)的细胞内过程产生负面影响的能力受到抑制的过程。例如，中和ILT-2可以在例如基于标准NK或T细胞的细胞毒性测定中测量，在所述细胞毒性测定中，测量治疗性化合物刺激通过ILT阳性淋巴细胞杀伤HLA阳性细胞的能力。在一个实施例中，抗体制剂使ILT-2限制的淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，任选地使淋巴细胞细胞毒性增加至少40％或50％，或任选地使NK细胞毒性增加至少70％，并且参考所描述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂通过ILT-2限制的淋巴细胞使细胞因子释放增加至少10％，任选地使细胞因子释放增加至少40％或50％，或任选地使细胞因子释放增加至少70％，并且参考所描述的细胞毒性测定。在一个实施例中，抗体制剂通过ILT-2限制的淋巴细胞使细胞毒性的标志物(例如，CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少10％，任选地增加至少40％或50％，或任选地使细胞毒性的标志物(例如，CD107和/或CD137)的细胞表面表达增加至少70％。
抗ILT2抗体“阻断”或“抑制”ILT2分子与其天然配体(例如，HLA分子)的结合的能力意指在使用可溶性或细胞表面相关的ILT2和天然配体(例如，HLA分子，例如HLA-A、HLA-B、HLA-F、HLA-G)的测定中，抗体可以以剂量依赖性方式可检测地降低ILT2分子与配体(例如，HLA分子)的结合，其中在不存在抗体的情况下，ILT2分子与配体(例如，HLA分子)可检测地结合。
术语“药剂”在本文中用于表示化学化合物，化学化合物、生物大分子或由生物材料制成的提取物的混合物。术语“治疗剂”是指具有生物活性的药剂。
术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是本领域熟知的术语，并且是指细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞识别靶细胞上的结合抗体并且随后引起靶细胞的裂解。介导ADCC的非特异性细胞毒性细胞包含自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。
如本文所使用的，“治疗(treatment)”和“治疗(treating)”等通常意指获得期望的药理学和生理学效果。就预防或部分预防疾病、其症状或病症而言，所述效果可以是预防性的和/或就归因于疾病的疾病、病症、症状或副作用的部分或完全治愈而言可以是治疗性的。如本文所使用的术语“治疗”涵盖对哺乳动物特别是人的疾病的任何治疗，并且包含：(a)预防疾病在可能易患疾病但尚未诊断患有所述疾病的受试者中发生，如预防性早期无症状干预；(b)抑制疾病，例如阻止其发展：或减轻疾病，例如导致疾病和/或其症状或病症的消退，如损伤的改善或补救，例如在已被诊断为患有疾病的受试者中。任选地，治疗可以引起(例如，可以表征为引起的方法)肿瘤负荷的减少、病变的大小和/或数量的减少、癌症进展的减少或延迟(例如，无进展生存期增加)、癌症转移的延缓或预防和/或增加生存期。任选地，治疗可以引起或提供(例如，可以表征为引起或提供的方法)受试者的稳定疾病、部分应答或完全应答，例如根据标准化标准，任选地RECIST标准。
应当理解，当参考ILT2中和剂和NKG2A中和剂(例如抗体)提及“治疗癌症”等时，实施例可以包含：(a)治疗癌症的方法，所述方法包括以下步骤：以允许治疗癌症的相应剂量(治疗有效量)，优选地如本文规定的剂量(量)向需要此治疗的个体、哺乳动物，尤其是人施用(用于至少一种治疗)ILT2中和剂和NKG2A中和剂(优选地药学上可接受的载体材料中)；(b)使用用于治疗癌症的ILT2中和剂和NKG2A中和剂或ILT2中和剂和NKG2A中和剂以用于所述治疗(特别是人)；(c)使用ILT2中和剂和NKG2A中和剂以制造用于治疗癌症的药物制剂，使用ILT2中和剂和NKG2A中和剂以制备用于治疗癌症的试剂盒或药物制剂的方法，包括将ILT2中和剂和NKG2A中和剂中的每个与药学上可接受的载体或包括有效剂量的ILT2中和剂的试剂盒或药物制剂和包括有效剂量的适用于治疗癌症的NKG2A中和剂的药物制剂混合；或(d)根据在本申请提交的国家允许申请专利的主题的a)、b)和c)的任何组合。
如本文所用，术语“抗原结合结构域”是指包括能够免疫特异性结合于表位的三维结构的结构域。因此，在一个实施例中，所述结构域可以包括高变区，任选地抗体链的VH和/或VL结构域，任选地至少VH结构域。在另一个实施例中，结合结构域可以包括抗体链的至少一个互补性决定区(CDR)。在另一个实施例中，结合结构域可以包括来自非免疫球蛋白支架的多肽结构域。
如本文所用，术语“抗体”是指多克隆和单克隆抗体。根据重链中恒定结构域的类型，将抗体指定为以下五大类中的一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。这些中的若干个进一步分为亚类或同种型，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4等。示例性免疫球蛋白(抗体)结构单元包括四聚体。每个四聚体由两对相同的多肽链构成，每对具有一个“轻”链(约25kDa)和一个“重”链(约50-70kDa)。每条链的N-末端限定了约100个到110个或更多个氨基酸的可变区，其主要负责抗原识别。术语可变轻链(VL)和可变重链(VH)分别指代这些轻链和重链。与不同类免疫球蛋白相对应的重链恒定结构域分别称为“α”、“δ”、“ε”、“γ”和“μ”。不同类免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。IgG是本文使用的示例性抗体类别，因为其是生理情况中最常见的抗体并且因为其最容易在实验室环境中制备。任选地，抗体是单克隆抗体。抗体的具体实例是人源化、嵌合、人或其它人类合适的抗体。“抗体”还包含任何本文所述抗体的任何片段或衍生物。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包括来自“互补性决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如，轻链可变结构域中的残基24-34(L1)、50-56(L2)和89-97(L3)以及重链可变结构域中的31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人1991)和/或来自“高变环”的那些残基(例如，轻链可变结构域中的残基26-32(L1)、50-52(L2)和91-96(L3)以及重链可变结构域中的26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)；Chothia和Lesk,《分子生物学杂志(J.Mol.Biol)》1987；196:901-917)，或用于确定负责抗原结合的必需氨基酸的类似系统。通常，此区域中氨基酸残基的编号通过Kabat等人，同上所述的方法进行。如“Kabat位置”、“如Kabat中的可变结构域残基编号”和“根据Kabat”等短语在本文中是指用于重链可变结构域或轻链可变结构域的此编号系统。使用Kabat编号系统，肽的实际线性氨基酸序列可以含有较少或另外的氨基酸，与可变结构域的FR或CDR的缩短或插入相对应。例如，重链可变结构域可以包含在CDR H2的残基52之后的单个氨基酸插入物(根据Kabat的残基52a)和在重链FR残基82之后的插入残基(例如，根据Kabat的残基82a、82b和82c等)。通过将抗体序列的同源区域与“标准”Kabat编号序列比对，可以确定给定抗体的Kabat残基编号。
如本文所用，“框架”或“FR”残基是指除了定义为CDR的那些区域之外的抗体可变结构域的区域。每个抗体可变结构域框架可以进一步细分为由CDR分开的连续区域(FR1、FR2、FR3和FR4)。
术语“特异性结合”意指抗体可以优选地在竞争性结合测定中与结合配偶体，例如用于抗NKG2A药剂或抗体的NKG2A、用于抗ILT-2抗体的ILT-2结合，如使用蛋白质、其中的表位的重组形式，或存在于隔离的靶细胞的表面上的天然蛋白质所评估的。用于确定特异性结合的竞争性结合测定和其它方法是本领域众所周知的。例如结合可以通过放射性标记、物理方法如质谱法或使用例如细胞荧光分析(例如FACScan)检测的直接或间接荧光标记来检测。结合高于对照非特异性药剂所见的量表明所述药剂与靶标结合。特异性结合NKG2A的药剂可以单独结合NKG2A或NKG2A作为与CD94的二聚体。
当抗体被称为与特定单克隆抗体“竞争”时，这意味着抗体在结合测定中使用重组分子(例如，NKG2A、ILT-2)或表面表达的分子(例如，NKG2A、ILT-2)与单克隆抗体竞争。例如，如果测试抗体降低具有SEQ ID NO:68-72中任一个的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的抗体与NKG2A多肽或NKG2A表达性细胞在结合测定中的结合，则抗体被称为分别与此类抗体“竞争”。抗体可以例如被称为与特定参考抗体竞争用于结合参考抗体所结合的抗原(例如，NKG2A或ILT-2)上的表位。
如本文所使用的，术语“亲和力”是指抗体与表位结合的强度。抗体的亲和力由解离常数Kd给出，定义为[Ab]x[Ag]/[Ab-Ag]，其中[Ab-Ag]是抗体-抗原复合物的摩尔浓度，[Ab]是未结合的抗体的摩尔浓度，并且[Ag]是未结合的抗原的摩尔浓度。亲和力常数Ka由1/Kd定义。用于确定单克隆抗体的亲和力的方法可以在以下中找到：Harlow等人,《抗体：实验室手册(Antibodies:A Laboratory Manual)》,冷泉港实验室出版社(Cold SpringHarbor Laboratory Press),冷泉港,纽约,1988)；Coligan等人编辑,《免疫学实验指南(Current Protocols in Immunology)》,格林出版协会和威立国际科学出版社,纽约,(1992,1993)以及Muller,《酶学方法(Meth.Enzymol.)》92:589-601(1983)，所述参考文献通过引用整体地并入本文。本领域众所周知的用于确定单克隆抗体的亲和力的一种标准方法是使用表面等离子共振(SPR)筛选(如通过用BIAcoreTMSPR分析装置进行分析)。
在本文上下文中，“决定簇”表示与多肽相互作用或结合的位点。
术语“表位”是指抗原决定簇，并且是抗体结合的抗原上的区域或区域。蛋白质表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基以及被特异性抗原结合抗体或肽有效阻断的氨基酸残基，即抗体的“足迹”内的氨基酸残基。其是复杂抗原分子上最简单的形式或最小的结构区域，其可以与例如抗体或受体组合。表位可以是线性的或构象的/结构的。术语“线性表位”定义为由氨基酸的线性序列(一级结构)上连续的氨基酸残基构成的表位。术语“构象或结构表位”定义为由不完全连续的氨基酸残基构成的表位，并且因此代表通过折叠分子而彼此接近的氨基酸的线性序列的分开部分(二级、三级和/或四级结构)。构象表位取决于3维结构。因此，术语‘构象’通常与‘结构’可互换使用。
术语“Fc结构域”、“Fc部分”和“Fc区”是指抗体重链的C末端片段，例如，来自人γ(γ)重链的约氨基酸(aa)230到约aa 450，或其在其它类型的抗体重链中的对应序列(例如，人抗体的α、δ、ε和μ)，或其天然存在的同种型。除非另有说明，否则在本公开全文中使用免疫球蛋白的普遍接受的Kabat氨基酸编号(参见Kabat等人(1991)《具有免疫学意义的蛋白质序列(Sequences of Protein of Immunological Interest)》,第5版,马里兰州贝塞斯达的美国国立卫生研究院美国公共卫生局(United States Public Health Service,National Institute of Health,Bethesda,MD)。
术语“隔离的”、“纯化的”或“生物学上纯的”是指基本上或基本上不含在其天然状态下发现的通常伴随其的组分的材料。纯度和均匀性通常使用分析化学技术，如聚丙烯酰胺凝胶电泳或高效液相色谱法确定。作为制剂中存在的主要物质的蛋白质是基本上纯化的。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。术语适用于氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和非天然存在的氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸残基是对应天然存在的氨基酸的人工化学模拟物。
当关于例如细胞或核酸、蛋白质或载体使用时，术语“重组”表示细胞、核酸、蛋白质或载体已经通过引入异源核酸或蛋白质或改变天然核酸或蛋白质而被修饰，或者细胞源自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在天然(非重组)形式的细胞内未发现的基因，或表达以其它方式异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因。
在本文的上下文中，术语“结合”多肽或表位的抗体表示以特异性和/或亲和力结合所述决定簇的抗体。
当在两个或更多个多肽的序列之间的关系中使用时，术语“同一性”或“相同的”是指多肽之间的序列相关性程度，如通过两个或更多个氨基酸残基的串之间的匹配数确定的。“同一性”测量两个或更多个序列中较小的序列之间相同匹配的百分比，其中间隙比对(如果有的话)由特定数学模型或计算机程序(即，“算法”)解决。通过已知方法可以容易地计算相关多肽的同一性。此类方法包含但不限于以下文献中描述的那些方法：《计算分子生物学(Computational Molecular Biology)》,Lesk,A.M.编辑,牛津大学出版社(OxfordUniversity Press),纽约,1988；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects)》,Smith,D.W.编辑，学术出版社(Academic Press),纽约,1993；《序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data)》,第1部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编辑,哈门那出版社(Humana Press),新泽西州,1994；《分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in Molecular Biology),von Heinje,G.,学术出版社,1987；《序列分析引物(Sequence Analysis Primer)》,Gribskov,M.和Devereux,J.编辑,米斯托克顿出版社(M.Stockton Press),纽约,1991；以及Carillo等人,《工业与应用数学学会应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.)》48,1073(1988)。
设计用于确定同一性的方法以给出测试序列之间的最大匹配。在公开可用的计算机程序中描述了确定同一性的方法。用于确定两个序列之间的同一性的计算机程序方法包含GCG程序包，包含GAP(Devereux等人,《核酸研究(Nucl.Acid.Res.)》12,387(1984)；遗传学计算机组，威斯康星大学，麦迪逊，威斯康星州)，BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul等人，《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215,403-410(1990))。BLASTX程序可从国家生物技术信息中心(NCBI)和其它来源公开获得(BLAST Manual，Altschul等人,NCB/NLM/NIH贝塞斯达,马里兰州(Bethesda,Md.)20894；Altschul等人，同上)。熟知的史密斯-沃特曼算法(SmithWaterman algorithm)也可以用来确定一致性。
NKG2A中和治疗剂
NKG2A中和剂的实例特别包含结合人CD94/NKG2A受体或其配体HLA-E的细胞外部分并且降低在CD94/NKG2A阳性淋巴细胞表面上表达的人CD94/NKG2A受体的抑制活性的蛋白质剂(例如，例如抗体和抗体片段，作为包括此类的蛋白质)。在一个实施例中，药剂与HLA-E竞争与CD94/NKG2A结合，即所述药剂阻断CD94/NKG2A与其配体HLA-E之间的相互作用。在另一个实施例中，药剂结合NKG2A，但不与HLA-E竞争与CD94/NKG2A结合，即所述药剂能够同时结合CD94/NKG2A和HLA-E。
在一个实施例中，药剂(例如，抗体或抗体片段)包括与NKG2A结合的抗原结合结构域。抗体可以结合CD94和NKG2A上的组合表位或单独结合NKG2A上的表位。在另一个实施例中，药剂(例如抗体或抗体片段)包括与HLA-E结合并且抑制人HLA-E与人NKG2A蛋白之间的相互作用的抗原结合结构域。
一方面，NKG2A中和剂包括选自完全人抗体、人源化抗体和嵌合抗体的抗体。一方面，药剂包括衍生自人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体的恒定结构域。一方面，药剂是选自IgA、IgD、IgG、IgE和IgM抗体的抗体的片段。一方面，药剂是选自以下的抗体片段：Fab片段、Fab'片段、Fab'-SH片段、F(ab)2片段、F(ab')2片段、Fv片段、重链Ig(美洲驼或骆驼Ig)、VHH片段、单结构域FV和单链抗体片段。一方面，药剂是合成或半合成抗体衍生的分子，其选自scFV、dsFV、微抗体、双功能抗体、三功能抗体、κ体、IgNAR和多特异性抗体。
通常，抗NKG2A抗体将不会表现出与人Fcγ受体，例如CD16的显著特异性结合(例如，通过它们的Fc结构域)。任选地，抗NKG2A抗体缺乏对人CD16、CD32A、CD32B或CD64中的一个或多个或全部的基本特异性结合或具有低或降低的特异性结合。示例性抗体可以包括已知不结合或与Fcγ受体具有低结合的各种重链的恒定区。一个此类实例是人IgG4恒定区。在一个实施例中，IgG4抗体包括修饰以防止体内形成半抗体(Fab臂交换)，例如，抗体包括IgG4重链，所述重链在残基241，对应于根据EU索引的位置228中包括脯氨酸突变的丝氨酸(Kabat等人,“具有免疫学意义的蛋白质的序列(Sequences of proteins ofimmunological interest)”,第5版,NIH,贝塞斯达,ML,1991)。此类经过修饰的IgG4抗体将在体内保持完整，并且保持与NKG2A的二价(高亲和力)结合，这与天然IgG4在体内进行fab臂交换而使其以可以改变结合亲和力的单价方式结合NKG2A相反。替代性地，不包括恒定区的抗体片段，如Fab或F(ab')2片段，可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包含例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，可以使用任何人抗体类型(IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，其中Fc部分被修饰，以最小化或消除与Fc受体的结合(参见，例如，WO03101485，其公开内容通过引用并入本文)。如例如基于细胞的测定等用于评估Fc受体结合的测定在本领域中是公知的，并且描述于，例如WO03101485中。
在本发明的一方面，通过例如干扰NKG2A与HLA-E的结合，预防或诱导CD94/NKG2A受体中的构象性变化和/或影响CD94/NKG2A受体的二聚化和/或聚集，药剂通过干扰CD94/NKG2A信号传导来降低CD94/NKG2A介导的CD94/NKG2A表达性淋巴细胞的抑制。
在一个实施例中，抗NKG2A抗体将不与人NKG2C、NKG2E和/或NKG2H结合(例如，当以10μg/ml的浓度进行测试时)或与结合NKG2A的能力相比，以显著降低的亲和力与NKG2C和E结合。一方面，抗体以比人NKG2C低至少100倍的KD与NKG2A结合。一方面，抗体以比人NKG2E低至少100倍的KD与NKG2A结合。
在本发明的一方面，药剂以比NKG2C低至少100倍的KD与NKG2A的细胞外部分结合。在另外优选的方面，药剂以比NKG2C低至少150倍、200倍、300倍、400倍、或10,000倍的KD与NKG2A的细胞外部分结合。在本发明的另一方面，药剂以比NKG2C、NKG2E和/或NKG2H分子低至少100倍的KD与NKG2A的细胞外部分结合。在另外优选的方面，药剂以比NKG2C、NKG2C和/或NKG2H分子低至少150倍、200倍、300倍、400倍或10,000倍的KD与NKG2A的细胞外部分结合。例如，这可以在BiaCore实验中进行测量，在所述实验中，测量了药剂结合固定的CD94/NKG2A(例如，从表达CD94/NKG2的细胞中纯化的或在生物系统中产生的)的细胞外部分的能力，并且在同一测定中，将药剂与类似产生的CD94/NKG2C和/或其它CD94/NKG2变体的结合进行比较。可替代地，可以测量药剂与天然表达或过表达(例如在瞬时或稳定转染之后)CD94/NKG2A的细胞的结合，并且将表达CD94/NKG2C和/或其它CD94/NKG2变体的细胞的结合进行比较。抗NKG2A抗体可以任选地结合NKG2B，所述NKG2B是与CD94一起形成抑制受体的NKG2A剪接变体。在一个实施例中，可以使用美国专利第8,206,709号中公开的方法来测量亲和力，例如通过评估Biacore与共价固定的NKG2A-CD94-Fc融合蛋白的结合，如美国专利第8,206,709号的实例8所示，所述专利的公开内容通过引用并入本文。
在任何方面，与NKG2A、NKG2C、NKG2E和/或NKG2H的比较结合在5-10μg/ml、任选地约10μg/ml的浓度下评估。
抗NKG2A抗体可以是人源化抗体，例如包括来自人受体序列的VH人受体框架，所述人受体序列选自例如VH1_18、VH5_a、VH5_51、VH1_f和VH1_46，以及JH6 J区段或本领域已知的其它人种系VH框架序列。VL区人受体序列可以是例如VKI_O2/JK4。
在一个实施例中，抗体是基于抗体Z270的人源化抗体。不同的人源化Z270重链可变区示出在SEQ ID NO:68-72中，任选地进一步包括C端丝氨酸(S)残基。SEQ ID NO:68的HumZ270VH6可变区基于人VH5_51基因；SEQ ID NO:69的HumZ270VH1可变区基于人VH1_18基因；SEQ ID NO:70的humZ270VH5可变区基于人VH5_a基因；SEQ ID NO:71的humZ270VH7可变区基于人VH1_f基因；并且SEQ ID NO:72的humZ270VH8可变区基于人VH1_46基因；都具有人JH6 J区段。这些抗体中的每一种均保留与NKG2A的高亲和力结合，针对抗体的宿主免疫应答的可能性较低，因为人源化构建体中的每一个的Kabat H-CDR2的6个C端氨基酸残基均与人受体框架相同。使用比对程序VectorNTI，获得humZ270VH1与humZ270VH5、-6、-7和-8之间的以下序列同一性：78,2％(VH1与VH5)、79,0％(VH1与VH6)、88,7％(VH1与VH7)和96,0％(VH1与VH8)。
一方面，药剂包括(i)SEQ ID NO:68-72的重链可变区氨基酸序列或与其至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:73的轻链可变区氨基酸序列或与其至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。一方面，药剂包括(i)SEQ ID NO:74-78的重链氨基酸序列或与其至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列；以及(ii)SEQ ID NO:79的轻链氨基酸序列或与其至少50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％或99％相同的氨基酸序列。
具有SEQ ID NO:68-72中任一个的重链可变区氨基酸序列和SEQ ID NO:73的轻链可变区氨基酸序列的抗体中和NKG2A的抑制活性，但基本上不结合活化的受体NKG2C、NKG2E或NKG2H。此抗体更进一步与HLA-E竞争结合细胞的表面上的NKG2A。一方面，药剂包括源自SEQ ID NO:68-72的重链可变区氨基酸序列的H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3序列。在本发明的一方面中，药剂包括源自SEQ ID NO:73的轻链可变区氨基酸序列的L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3序列。
重链可变区
VH6：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD
SETHYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY
WFFDVWGQGTTVTVS
(SEQ ID NO:68)
VH1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYA
QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS(SEQID NO:69)
VH5：
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYDSETHYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS(SEQ ID NO:70)
VH7：
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTSYWMNWVQQAPGKGLEWMGRIDPYDSETHY
AEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS(SEQID NO:71)
VH8：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHY
AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS
(SEQ ID NO:72)
轻链可变区
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRF SGS GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIK(SEQ ID NO:73)
重链(带下划线的可变区结构域氨基酸)
VH6：
EVQLVQSGAEVKKPGESLKISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD
SETHYSPSFQGQVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY
WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA
LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP
SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:74)
VH1：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHYA
QKLQGRVTMTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS
SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYS
LSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKD
TLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK(SEQ ID NO:75)
VH5：
EVQLVQSGAEVKKPGESLRISCKGSGYSFTSYWMNWVRQMPGKGLEWMGRIDPYD
SETHYSPSFQGHVTISADKSISTAYLQWSSLKASDTAMYYCARGGYDFDVGTLY
WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA
LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP
SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK(SEQ ID NO:76)
VH7：
EVQLVQSGAEVKKPGATVKISCKVSGYTFTSYWMNWVQQAPGKGLEWMGRIDPYDSETHY
AEKFQGRVTITADTSTDTAYMELSSLRSEDTAVYYCATGGYDFDVGTLY
WFFDVWGQGTTVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGA
LTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKP
SNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMIS
RTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDW
LNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV
EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS LSLGK(SEQ ID NO:77)
VH8：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTSYWMNWVRQAPGQGLEWMGRIDPYDSETHY
AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARGGYDFDVGTLYWFFDVWGQGTTVTVS
SASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHT
FPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVDKRVESKYGPPCPPCPAPE
FLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAK
TKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEK
TISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPEN
NYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSLGK
(SEQ ID NO:78)
轻链(带下划线的可变区结构域氨基酸)
DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASENIYSYLAWYQQKPGKAPKLLIYNAKTLAEGVPSRFSGS
GSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQHHYGTPRTFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVC
LLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC(SEQ ID NO:79)
莫那利珠单抗重链和轻链CDR
重链CDR，根据Kabat编号方案：
H-CDR1：SYWMN(SEQ ID NO:80)
H-CDR2：RIDPYDSETHYAQKLQG(SEQ ID NO:81)
H-CDR3：GGYDFDVGTLYWFFDV(SEQ ID NO:82)
轻链CDR，根据Kabat编号方案：
L-CDR1：RASENIYSYLA(SEQ ID NO:83)
L-CDR2：NAKTLAE(SEQ ID NO:84)
L-CDR3：QHHYGTPRT(SEQ ID NO:85)
一方面，抗NKG2A抗体是包括对应于SEQ ID NO:68-72(或SEQ ID NO:74-78)的残基31-35的H-CDR1、对应于SEQ ID NO:68-72(或SEQ ID NO:74-78)的残基50-60(当包含人类来源的氨基酸时，任选地50-66)的H-CDR2和对应于SEQ ID NO:68-72(或SEQ ID NO:74-78)的残基99-114(95-102，根据Kabat)的H-CDR3的抗体。在一个实施例中，H-CDR2对应于SEQ ID NO:68-72(或SEQ ID NO:74-78)的残基50-66。任选地，CDR可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。
一方面，抗NKG2A抗体是包括对应于SEQ ID NO:73或79的残基24-34的L-CDR1、对应于SEQ ID NO:73或79的残基50-56的L-CDR2以及对应于SEQ ID NO:73或79的残基89-97的L-CDR3的抗体。任选地，CDR可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。
一方面，抗NKG2A抗体是包括对应于SEQ ID NO:68-72的残基31-35的H-CDR1、对应于SEQ ID NO:68-72的残基50-60(任选地50-66)的H-CDR2和对应于SEQ ID NO:68-72的残基99-114(95-102，根据Kabat)的H-CDR3，对应于SEQ ID NO:73的残基24-34的L-CDR1、对应于SEQ ID NO:73的残基50-56的L-CDR2以及对应于SEQ ID NO:73的残基89-97的L-CDR3的抗体。
一方面，抗NKG2A抗体是包括以下的抗体：分别具有SEQ ID NO:80-82的氨基酸序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域以及具有SEQ ID NO:83-85的氨基酸序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域。
一方面，药剂是莫那利珠单抗，具有SEQ ID NO:69的重链可变区氨基酸序列和SEQID NO:73的轻链可变区氨基酸序列的抗NKG2A抗体。一方面，药剂是莫那利珠单抗，具有SEQID NO:75的重链氨基酸序列和SEQ ID NO:79的轻链氨基酸序列的抗NKG2A抗体。
一方面，药剂是BMS-986315(纽约州纽约的百时美施贵宝公司(Bristol MyersSquibb Corp.,New York,NY))或PCT公开号WO2020/102501中公开的抗体，即阻断NKG2A与HLA-E之间的相互作用的抗体，所述公开的公开内容通过引用并入本文。一方面，药剂包括BMS-986315的重链和轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。一方面，抗NKG2A抗体包括以下重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：SHSMN(SEQ ID NO:86)
HCDR2：AISSSSSYIYYADSVKG(SEQ ID NO:87)
HCDR3：EEWGLPFDY(SEQ ID NO:88)
LCDR1：RASQGISSALA(SEQ ID NO:89)、RASQGIPSALA(SEQ ID NO:90)或RASQGINSALA(SEQ ID NO:91)
LCDR2：DASSLKS(SEQ ID NO:92)
LCDR3：QQFNSYPLT(SEQ ID NO:93)。
一方面，药剂是在PCT公开号WO2020/094071中公开的抗体或包括其重链和轻链CDR的抗体，所述公开的公开内容通过引用并入本文。一方面，药剂包括M15-5、Mpb416、Mab031、Mab032或Mab033的重链和轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。
一方面，抗NKG2A抗体包括以下M15-5重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：NTYIH(SEQ ID NO:94)
HCDR2：IDPANADTKYAPTFQG(SEQ ID NO:95)
HCDR3：YRDYLFYYALGY(SEQ ID NO:96)
LCDR1：RSSKSLLHSNANTYLY(SEQ ID NO:97)
LCDR2：RMSNLAS(SEQ ID NO:98)
LCDR3：MQHLEYPYT(SEQ ID NO:99)。
一方面，抗NKG2A抗体包括以下Mpb416重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：NTYIH(SEQ ID NO:94)
HCDR2：IDPANGDTKYAPTFQG(SEQ ID NO:100)
HCDR3：YRDYLFYYALGY(SEQ ID NO:96)
LCDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:101)
LCDR2：RMSNLAS(SEQ ID NO:98)
LCDR3：MQHLEYPYT(SEQ ID NO:99)。
一方面，抗NKG2A抗体包括以下Mab031重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：NTYIH(SEQ ID NO:94)
HCDR2：IDPANGDTKYAPKFQG(SEQ ID NO:102)
HCDR3：YGNYLYYYSLDY(SEQ ID NO:103)
LCDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:101)
LCDR2：RMSNLAS(SEQ ID NO:98)
LCDR3：MQHLEYPYT(SEQ ID NO:99)。
一方面，抗NKG2A抗体包括以下Mab032重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：NTYMH(SEQ ID NO:104)
HCDR2：IDPADGDTQYAPKFQG(SEQ ID NO:105)
HCDR3：YGNYLFYYSMDY(SEQ ID NO:106)
LCDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:101)
LCDR2：RMSNLAS(SEQ ID NO:98)
LCDR3：MQHLEYPYT(SEQ ID NO:99)。
一方面，抗NKG2A抗体包括以下Mab033重链和轻链CDR氨基酸序列：
HCDR1：NTYIH(SEQ ID NO:94)
HCDR2：IDPANGDTQYDPKFQG(SEQ ID NO:107)
HCDR3：YGDYLFYYSLKY(SEQ ID NO:108)
LCDR1：RSSKSLLHSNGNTYLY(SEQ ID NO:101)
LCDR2：RMSNLAS(SEQ ID NO:98)
LCDR3：MQHLESPYT(SEQ ID NO:109)。
一方面，药剂是Z199，即在不阻断NKG2A与HLA-E之间相互作用的情况下中和NKG2A的抗体。一方面，药剂包括Z199的重链和轻链CDR1、CDR2和/或CDR3。
一方面，药剂包括衍生自具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的Z199 VH的H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3序列，例如根据Kabat编号(参见下文SEQ ID NO:110中带下划线的CDR)。在本发明的一方面，药剂包括衍生自具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的Z199 VL的L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3序列，例如根据Kabat编号(参见下文SEQ ID NO:111中带下划线的CDR)。一方面，药剂包括衍生自具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH的H-CDR1、H-CDR2和/或H-CDR3序列，以及衍生自具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL的L-CDR1、L-CDR2和/或L-CDR3序列。具有SEQ ID NO:110的重链可变区和SEQ ID NO:111的轻链可变区的抗体中和NKG2A的抑制活性，并且还结合活化受体NKG2C、NKG2E和NKG2H。此抗体不与HLA-E竞争与细胞表面上的NKG2A结合(即它是NKG2A的非竞争性拮抗剂)。
EVQLVESGGGLVKPGGSLKLSCAASGFTFSSYAMSWVRQSPEKRLEWVAEISSGGSYTYY PDTVTGRFTISRDNAKNTLYLEISSLRSEDTAMYYCTRHGDYPRFFDVWGAGTTVTVSS(SEQ ID NO:110)
QIVLTQSPALMSASPGEKVTMTCSASSSVSYIYWYQQKPRSSPKPWIYLTSNLASGVPAR FSGSGSGTSYSLTISSMEAEDAATYYCQQWSGNPYTFGGGTKLEIK(SEQ ID NO:111)
一方面，药剂包括SEQ ID NO:110的重可变(VH)结构域的氨基酸残基31-35、50-60、62、64、66和99-108和SEQ ID NO:111的轻可变(VL)结构域的氨基酸残基24-33、49-55和88-96，任选地具有一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸取代。一方面，药剂是人源化抗体，例如包括重链和轻链可变区的药剂，如PCT公开号WO2009/092805中公开的，所述公开的公开内容通过引用并入本文。
一方面，药剂是针对上述抗体中的任一个结合的CD94/NKG2A表位的完整人抗体。
可以理解，尽管可以使用前述抗体，但是其它抗体可以识别并且针对NKG2A多肽的任何部分产生抗体，只要抗体引起NKG2A的抑制活性的中和即可。例如，NKG2A，优选地但是非排他地人NKG2A的片段，或NKG2A片段的任何组合可以用作产生抗体的免疫原，并且抗体可以识别NKG2A多肽内任何位置处的表位，只要它们可以如本文所述对表达NKG2A的NK细胞进行此操作。任选地，表位是由具有SEQ ID NO:68-72的重链可变区和SEQ ID NO:73的轻链可变区的抗体特异性识别的表位。
一方面，药剂是这样一种抗体：它是humZ270或具有SEQ ID NO:75的重链和SEQ IDNO:79的轻链的抗体的功能保守变体。“功能保守变体”是其中蛋白质或酶中的给定氨基酸残基已经被改变而不更改多肽的整体构象和功能的变体，包含但不限于用具有类似特性(例如，极性、氢键电势、酸性、碱性、疏水性、芳香族等)的氨基酸替换氨基酸。除了那些被指示为保守的氨基酸之外的氨基酸在蛋白质中可以不同，使得类似功能的任何两种蛋白质之间的蛋白质或氨基酸序列相似度百分比可以变化并且可以是如根据比对方案，如通过聚类方法测定的例如70％到99％，其中相似度是基于MEGALIGN算法。“功能保守变体”还包含如通过BLAST或FASTA算法测定的具有至少60％氨基酸同一性，优选地至少75％，更优选地至少85％，仍优选地至少90％并且甚至更优选地至少95％，并且具有与其所比较的天然或亲本蛋白相同或基本上类似的特性或功能的多肽。
一方面，药剂与美国专利第8,206,709号(其公开内容通过引用并入本文)中公开的humZ270抗体竞争结合人CD94/NKG2A受体的细胞外部分。竞争性结合可以例如在BiaCore实验中进行测量，在所述实验中，测量了药剂结合用humZ270饱和的固定的CD94/NKG2A受体(例如，从表达CD94/NKG2的细胞中纯化的或在生物系统中产生的)的细胞外部分的能力。替代性地，测量药剂与细胞的结合，所述细胞天然表达或过表达(例如在瞬时或稳定转染之后)CD94/NKG2A受体，并且已经与饱和剂量的Z270预温育。在一个实施例中，可以使用美国专利第8,206,709号中公开的方法来测量竞争性结合，例如通过如美国专利第8,206,709号的实例15中所示的流式细胞术评估与Ba/F3-CD94-NKG2A细胞的结合，所述专利的公开内容通过引用并入本文。
抗ILT2抗体
中和ILT-2抑制活性的抗ILT-2抗体结合人ILT-2受体的细胞外部分并且降低在ILT2阳性细胞，例如NK细胞的表面上表达的人ILT2受体的抑制活性。在一个实施例中，药剂与HLA-G竞争与ILT-2结合，即药剂阻断ILT-2与其HLA配体(例如，HLA-G)之间的相互作用。
然后可以测试ILT-2中和活性的抗ILT2抗体的起点可以包含任何已知的抗体，例如GHI/75、292319、HP-F1、586326或292305或通过经典免疫方案(例如，在小鼠或大鼠中)产生或选自免疫球蛋白或免疫球蛋白序列文库的新抗体，例如，如在以下中公开的：(Ward等人《自然》341(1989)第544页)。可以在ILT2蛋白上滴定抗体，以获得实现与ILT2多肽最大结合所需的浓度。一旦鉴定出能够结合ILT2和/或具有其它期望性质的抗体，通常还将使用标准方法(包含本文中所描述的那些标准方法)评估所述抗体与其它多肽(包含其它ILT2多肽和/或无关多肽)结合的能力。理想地，抗体仅以实质亲和力与ILT2结合，并且不以显著水平与无关多肽或与其它ILT蛋白(值得注意的是ILT-1、-3、-4、-5、-6、-7和/或-8)。然而，应当了解，只要ILT2的亲和力(例如，如通过SPR测定的KD)比其它ILT和/或其它无关多肽的亲和力基本上大(例如，10倍、100倍、1000倍、10,000倍、或更多)，则抗体适用于本发明方法中。
理想地，抗体仅以实质亲和力与ILT2结合，并且不以显著水平与无关多肽或与其它ILT蛋白(值得注意的是ILT-1、-3、-4、-5、-6、-7和/或-8)。然而，应当了解，只要ILT2的亲和力(例如，如通过SPR测定的KD)比其它ILT和/或其它无关多肽的亲和力基本上大(例如，10倍、100倍、1000倍、10,000倍、或更多)，则抗体适用于本发明方法中。
在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于与人ILT2多肽的结合的结合亲和力的KD小于1×10-8M，任选地小于1×10-9M，或为约1×10-8M到约1×10-10M或约1×10-9M到约1×10-11M。在一个实施例中，亲和力是单价结合亲和力。在一个实施例中，亲和力是二价结合亲和力。
在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于结合亲和力的单价KD小于2nM，任选地小于1nM。
在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于如通过SPR测定的1:1结合拟合。在本文中的任何实施例中，抗体的特征可以在于解离或脱离速率(kd(1/s))小于约1E-2，任选地小于约1E-3。
抗ILT2抗体可以制备为非消耗性抗体，使得它们已经降低或基本上缺乏与人Fcγ受体的特异性结合。此类抗体可以包括已知不结合CD16和任选地另外的其它Fcγ受体或与其具有低结合亲和力的各种重链的恒定区。一个此类实例是已自然降低CD16结合、但保留与其它受体(如CD64)的显著结合的野生型人IgG4恒定区。替代性地，不包括恒定区的抗体片段，如Fab或F(ab')2片段，可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包含例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。此外，可以使用任何抗体同种型(例如，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4)，其中Fc部分被修饰成减少、最小化或消除与Fc受体的结合(参见例如WO03101485)。如例如基于细胞的测定等用于评估Fc受体结合的测定在本领域中是公知的，并且描述于，例如WO03101485中。
交叉阻断测定也可以用于评价测试抗体是否影响HLAI类配体与人ILT2的结合。例如，为了测定抗ILT2抗体制剂是否减少或阻断ILT2与HLA I类分子的相互作用，可以进行以下测试：将剂量范围的抗人ILT2 Fab与固定剂量的人ILT2-Fc在室温下共温育30分钟，然后添加到表达HLAI类配体的细胞系上持续1小时。在染色缓冲液中洗涤细胞两次之后，将在染色缓冲液中稀释的PE偶联的山羊抗小鼠IgG Fc片段二级抗体添加到细胞中，并且将平板在4℃下再温育30分钟。将细胞洗涤两次，并且在配备有HTFC酶标仪的Accury C6流式细胞仪上进行分析。在不存在测试抗体的情况下，ILT2-Fc与细胞结合。在存在与阻断ILT2与HLA I类的结合的ILT2-Fc预先温育的抗体制剂的情况下，ILT2-Fc与细胞的结合降低。
一方面，抗体缺乏与被修饰以缺乏D1结构域的ILT2蛋白的结合。一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但缺乏与被修饰以缺乏SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基24到121的区段的ILT2蛋白的结合。另一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但与被修饰以缺乏D4结构域的ILT2蛋白的结合降低。一方面，抗体结合全长野生型ILT2多肽，但缺乏与被修饰以缺乏SEQ ID NO:1的氨基酸序列的残基322到458的区段的ILT2蛋白的结合。
可以测量抗ILT2抗体与被转染以表达ILT2突变体的细胞的结合，并且将其与抗ILT2抗体结合表达野生型ILT2多肽(例如，SEQ ID NO:1)的细胞的能力进行比较。抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，如对表达特定突变体的细胞进行的FACS测试，或通过对与突变体多肽的结合进行的BiacoreTM(SPR)测试)和/或抗ILT抗体的总结合能力的降低(例如，如通过抗ILT2抗体浓度对多肽浓度的图中Bmax的降低所证明的)。结合的显著降低指示，当抗ILT2抗体与ILT2结合时，突变残基直接参与与抗ILT2抗体的结合或与结合蛋白紧密接近。
在一些实施例中，结合的显著降低意指相对于抗体与野生型ILT2多肽之间的结合，抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合减少到可检测限度以下。在一些实施例中，当抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽的结合小于抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。
一旦获得了具有ILT2所期望的结合的抗原结合化合物，就可以评估其抑制ILT2的能力。例如，如果抗ILT2抗体降低或阻断由HLA配体诱导的ILT2活化(例如，如存在于细胞上)，则其可以增加ILT2限制性淋巴细胞的细胞毒性。这可以通过典型的细胞毒性测定来评估，其实例如下所述。
可以使用例如表达ILT2的NK细胞和表达ILT2的HLA配体的靶细胞，在标准的4小时体外细胞毒性测定中测试抗体减少ILT2介导的信号传导的能力。此类NK细胞不能有效地杀伤表达配体的靶标，因为ILT2识别HLA配体，从而导致引发和传播阻止淋巴细胞介导的细胞溶解的抑制信号传导。可以使用在使用前在37℃下温育过夜的原代NK细胞(例如，从供体中纯化的新鲜NK细胞)进行此类测定。此类体外细胞毒性测定可以通过本领域众所周知的标准方法进行，如例如在Coligan等人编辑的《免疫学实验指南(Current Protocols inImmunology)》，格林出版协会和纽约州威利国际科学(1992，1993)中所述。在添加NK细胞之前，用51Cr标记靶细胞，并且然后由于杀伤，将杀伤估计为与51Cr从细胞向培养基的释放成比例。添加防止ILT2蛋白与HLA I类配体(例如，HLA-G)结合的抗体导致阻止抑制信号传导通过ILT2蛋白的引发和传播。因此，添加此类药剂导致淋巴细胞介导的靶细胞杀伤的增加。由此，这个步骤鉴定了通过例如阻断配体结合来防止ILT2介导的负信号传导的药剂。在特定的51Cr释放细胞毒性测定中，表达ILT2的NK效应细胞可以杀伤HLA配体阴性靶细胞，但是不能很好地杀伤表达HLA配体的对照细胞。因此，由于HLA诱导的通过ILT2的抑制信号传导，NK效应细胞对HLA配体阳性细胞的杀伤效率较低。在此种51Cr释放细胞毒性测定中，在将NK细胞与阻断性抗ILT2抗体进行预温育时，可以以抗体浓度依赖性方式更有效地杀伤表达HLA配体的细胞。
抗体的抑制活性(即，提高细胞毒性的潜力)也可以以许多其它方式中的任一种来评估，例如，通过其对细胞内游离钙的作用，如所述，例如，在Sivori等人，《实验医学杂志》1997；186:1129-1136中，其公开内容通过引用并入本文，或通过对NK细胞毒性活化的标志物，如脱粒标志物CD107或CD137表达的作用。NK或CD8 T活性也可以使用任何基于细胞的细胞毒性测定进行评估，例如，测量任何其它参数以评估抗体刺激NK细胞杀伤靶细胞(如P815、K562细胞或合适的肿瘤细胞)的能力，如Sivori等人,《实验医学杂志》1997；186:1129-1136；Vitale等人,《实验医学杂志》1998；187:2065-2072；Pessino等人,《实验医学杂志》1998；188:953-960；Neri等人《临床和诊断实验室免疫学(Clin.Diag.Lab.Immun.)》2001；8:1131-1135；Pende等人,《实验医学杂志》1999；190:1505-1516，所述文献中的每一个的全部公开内容以引用的方式并入本文中。
在一个实施例中，抗体制剂使ILT2限制性淋巴细胞的细胞毒性增加至少10％，优选地使NK细胞毒性增加至少30％、40％或50％，或更优选地使NK细胞毒性增加至少60％70％。
细胞毒性淋巴细胞的活性也可以使用细胞因子释放测定来解决，其中将NK细胞与抗体一起温育，以刺激NK细胞的细胞因子产生(例如IFN-γ和TNF-α产生)。在示例性方案中，培养4天之后，通过细胞表面和胞浆内染色评估从PBMC产生的IFN-γ，并且通过流式细胞术分析。简而言之，以5μg/ml的终浓度添加布雷菲德菌素A(Sigma Aldrich)，持续培养最后4小时。然后在透化(IntraPrepTM；贝克曼库尔特公司)和用PE-抗IFN-γ或PE-IgG1(Pharmingen公司)染色之前，将细胞与抗CD3和抗CD56 mAb一起温育。使用ELISA(GM-CSF：DuoSet Elisa，明尼苏达州明尼阿波利斯的R&D系统公司，IFN-γ：OptElA set，Pharmingen公司)，在上清液中测量从多克隆活化的NK细胞产生的GM-CSF和IFN-y。
在一种方法中，抗体可以任选地基于与任何已知抗体，例如本文所描述的示例性抗体，例如48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1中的任何一个的相同的ILT2多肽表面上的区域或表位的结合来鉴定和选择抗体(例如表位或结合区域定向筛选)。一方面，抗体结合与抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1中的任一个基本上相同的表位。在一个实施例中，抗体与ILT2的表位结合，其至少部分地与抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1结合的表位重叠或包含其中的至少一个残基。由抗体结合的残基可以被指定为存在于ILT2多肽的表面上(例如，于在细胞的表面上表达的ILT2多肽上)。
抗ILT2抗体与ILT2上的位点的结合可以通过测量抗ILT2抗体与用ILT2突变体转染的细胞的结合来评估，如与抗ILT2抗体结合野生型ILT2多肽(例如，SEQ ID NO:1)的能力相比。抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽(例如，表5的突变体)之间的结合降低意味着结合亲和力降低(例如，如通过已知方法，如对表达特定突变体的细胞进行的FACS测试，或通过对与突变体多肽的结合进行的Biacore测试)和/或抗ILT2抗体的总结合能力的降低(例如，如通过抗ILT2抗体浓度对多肽浓度的图中Bmax的降低所证明的)。结合的显著降低指示，当抗ILT2抗体与ILT2结合时，突变残基直接参与与抗ILT2抗体的结合或与结合蛋白紧密接近。
在一些实施例中，结合的显著降低意指相对于抗体与野生型ILT2多肽之间的结合，抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽之间的结合亲和力和/或能力降低大于40％、大于50％、大于55％、大于60％、大于65％、大于70％、大于75％、大于80％、大于85％、大于90％或大于95％。在某些实施例中，结合减少到可检测限度以下。在一些实施例中，当抗ILT2抗体与突变体ILT2多肽的结合小于抗ILT2抗体与野生型ILT2多肽之间观察到的结合的50％(例如，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％或10％)时，证明结合显著降低。
在一些实施例中，提供了抗ILT2抗体，其对突变体ILT2多肽显示出显著更低的结合，其中与结合不包括此类取代的野生型ILT2多肽(例如SEQ ID NO:1的多肽)相比，包括示例性抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1中的任何一个所结合的氨基酸残基的区段中的残基被不同的氨基酸取代。
一方面，抗ILT2抗体结合位于人ILT2蛋白的D1结构域(结构域1)上或内的表位。一方面，抗ILT2抗体与抗体12D12竞争与人ILT2蛋白的D1结构域(结构域1)上的表位结合。
D1结构域可以被定义为对应的或具有如下氨基酸序列：
GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGA(SEQ ID NO:121)。
一方面，抗ILT2抗体与在选自由以下组成的组的残基处具有突变的ILT2多肽的结合降低(任选地，丧失与其的结合)：E34、R36、Y76、A82和R84(参考SEQ ID NO 2或121；上文在SEQ ID NO 55中以粗体表示)；任选地，突变体ILT2多肽具有突变：E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由G29、Q30、Q33、T32和D80(参考SEQ IDNO:2或121；上文在SEQ ID NO121中带下划线)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：G29S、Q30L、Q33A、T32A、D80H。在每种情况下，结合的降低或丧失可以被指定为相对于抗体与包括SEQID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合。
一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由E34、R36、Y76、A82和R84(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由G29、Q30、Q33、T32和D80(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由E34、R36、Y76、A82和R84组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(ii)选自由G29、Q30、Q33、T32和D80组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。
一方面，抗ILT2抗体结合位于人ILT2蛋白的D4结构域(结构域4)上或内的表位。一方面，抗ILT2抗体结合SEQ ID NO:122的残基1-83区段中的残基。一方面，抗ILT2抗体与抗体26D8和/或18E1竞争与人ILT2蛋白的D4结构域(结构域4)上的表位结合。
D4结构域可以被定义为对应的或具有如下氨基酸序列：
FYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRH(SEQ IDNO:122)。
一方面，抗ILT2抗体与在选自由以下组成的组的残基处具有突变的ILT2多肽的结合降低(任选地，丧失与其的结合)：F299、Y300、D301、W328、Q378和K381(参考SEQ ID NO:2；上文在SEQ ID NO 122中以粗体表示)；任选地，突变体ILT2多肽具有突变：F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355(参考SEQ ID NO:2)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A。在一个实施例中，此外，抗体与在选自由D341、D342、W344、R345和R347(参考SEQ ID NO:2)组成的组的一个或多个(或所有)残基处包括突变的突变体ILT2多肽的结合降低，任选地，所述突变体ILT2多肽具有突变：D341A、D342S、W344L、R345A、R347A。在每种情况下，结合的降低或丧失可以被指定为相对于抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合。
一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381(参考SEQID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括选自由D341、D342、W344、R345和R347(参考SEQ ID NO:2)组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。
一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(ii)选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。一方面，抗ILT2抗体结合包括(i)选自由F299、Y300、D301、W328、Q378和K381组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)，(ii)选自由W328、Q330、R347、T349、Y350和Y355组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)以及(iii)选自由D341、D342、W344、R345和R347组成的组的氨基酸残基(例如，残基中的一个、两个、三个、四个或五个残基)的ILT2上的表位。
抗体CDR序列
抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8和18E1
抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8和18E1的重链可变区和轻链可变区的氨基酸序列列于下表A中。在具体实施例中，提供了一种抗体，所述抗体结合与单克隆抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1实质上相同的表位或决定簇；任选地，所述抗体包括抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的高变区。在本文的任何实施例中，抗体48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1可以通过氨基酸序列和/或对其进行编码的核酸序列来表征。在一个实施例中，单克隆抗体包括48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的Fab或F(ab')2部分。还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体包括48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的重链可变区。根据一个实施例，单克隆抗体包括48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的重链可变区的三个CDR。还提供了一种单克隆抗体，所述单克隆抗体进一步包括48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的可变轻链可变区或48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8或18E1的轻链可变区的CDR中的一个、两个或三个。任选地，HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号系统的序列、IMGT编号系统或任何其它适合的编号系统的序列。任选地，所述轻链或重链CDR中的任何一个或多个可以含有一个、两个、三个、四个或五个或更多个氨基酸修饰(例如，取代、插入或缺失)。
一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体包括：26D8的HCDR1区，其包括氨基酸序列EHTIH(SEQ ID NO:14)或其至少3个、4个或5个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的HCDR2区，其包括氨基酸序列WFYPGSGSMKYNEKFKD(SEQ ID NO:15)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的HCDR3区，其包括氨基酸序列HTNWDFDY(SEQ ID NO:16)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR1区，其包括氨基酸序列KASQSVDYGGDSYMN(SEQ ID NO:17)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR2区，其包括氨基酸序列AASNLES(SEQID NO:18)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；26D8的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEEPWT(SEQID NO:19)或其至少4个、5个、6个、7个或8个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体包括：18E1的HCDR1区，其包括氨基酸序列AHTIH(SEQ ID NO:22)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的HCDR2区，其包括氨基酸序列WLYPGSGSIKYNEKFKD(SEQ ID NO:23)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的HCDR3区，其包括氨基酸序列HTNWDFDY(SEQ ID NO:24)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR1区，其包括氨基酸序列KASQSVDYGGASYMN(SEQ ID NO:25)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR2区，其包括氨基酸序列AASNLES(SEQID NO:26)或其至少4个、5个或6个10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；18E1的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEEPWT(SEQ ID NO:27)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
一方面，提供了一种抗体，其中所述抗体包括：12D12的HCDR1区，其包括氨基酸序列SYWVH(SEQ ID NO:30)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的HCDR2区，其包括氨基酸序列VIDPSDSYTSYNQNFKG(SEQ ID NO:31)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的HCDR3区，其包括氨基酸序列GERYDGDYFAMDY(SEQ ID NO:32)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASENIYSNLA(SEQ ID NO:33)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR2区，其包括氨基酸序列AATNLAD(SEQ ID NO:34)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；12D12的LCDR3区，其包括氨基酸序列QHFWNTPRT(SEQ ID NO:35)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
一方面，抗体或抗体片段包括：3F5的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYIQ(SEQ IDNO:48)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；3F5的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGNNETNYNEKFKG(SEQID NO:49)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；3F5的HCDR3区，其包括氨基酸序列SWNYDARWGY(SEQ ID NO:50)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；3F5的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASEIIDSYGISFMH(SEQ ID NO:51)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；3F5的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:52)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；3F5的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:53)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
一方面，抗体或抗体片段包括：48F12的HCDR1区，其包括氨基酸序列SYGVS(SEQ IDNO:54)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；48F12的HCDR2区，其包括氨基酸序列IIWGDGSTNYHSALVS(SEQID NO:55)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；48F12的HCDR3区，其包括氨基酸序列PNWDYYAMDY(SEQ ID NO:56)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；48F12的LCDR1区，其包括氨基酸序列RASQDISNYLN(SEQ ID NO:57)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；48F12的LCDR2区，其包括氨基酸序列YTSRLHS(SEQ ID NO:58)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；48F12的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQGITLPLT(SEQ ID NO:59)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
一方面，抗体或抗体片段包括：2H2A的HCDR1区，其包括氨基酸序列NYYMQ(SEQ IDNO:60)或其至少3个或4个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；2H2A的HCDR2区，其包括氨基酸序列WIFPGSGESNYNEKFKG(SEQID NO:61)或任选地WIFPGSGESSYNEKFKG(SEQ ID NO:62)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；2H2A的HCDR3区，其包括氨基酸序列TWNYDARWGY(SEQ ID NO:63)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；2H2A的LCDR1区，其包括氨基酸序列IPSESIDSYGISFMH(SEQ ID NO:64)或其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；2H2A的LCDR2区，其包括氨基酸序列RASNLES(SEQ ID NO:65)或其至少4个、5个或6个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以被不同的氨基酸取代；2H2A的LCDR3区，其包括氨基酸序列QQSNEDPFT(SEQ ID NO:66)或其至少4个、5个、6个或7个连续氨基酸的序列，任选地其中这些氨基酸中的一个或多个氨基酸可以缺失或被不同的氨基酸取代。
相应的VH和VL以及抗体3H5、27C10和27H5分别示出于SEQ ID NO:36-37、38-39和40-41中。任选地，抗体的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3序列可以被指定为所有(或各自独立地)是Kabat编号系统的序列、Chotia编号的序列、IMGT编号或任何其它适合的编号系统的序列。根据一个实施例，抗体可以包括抗体3H5的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3。根据一个实施例，抗体可以包括抗体27C10的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3。根据一个实施例，抗体可以包括抗体27H5的HCDR1、2、3和LCDR1、2、3。
在本文的任何实施例的另一方面，48F12、3F5、2H2A、12D12、26D8、18E1、3H5、27H5或27C10的重链和轻链的任何CDR1、2和3的特征可以在于其至少4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个连续氨基酸的序列，和/或具有与特定CDR或对应的SEQ ID NO中列出的CDR组共有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％或95％序列同一性的氨基酸序列。
表A
Figure BDA0003579061230000381
Figure BDA0003579061230000391
任选地，在任何实施例中，抗体可以被指定为具有与人IgG型(任选地，人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4同种型)的免疫球蛋白重链恒定区融合的包括相应抗体的抗原结合区的一部分或全部的重链(例如，重链CDR1、2和3)，任选地所述重链进一步包括氨基酸取代以降低效应功能(与人Fcγ受体的结合)。任选地，在任何实施例中，12D12、26D8、18E1或27C10抗体可以被指定为具有与人κ型的免疫球蛋白轻链恒定区融合的包括相应抗体的抗原结合区的一部分或全部的轻链(例如，轻链CDR1、2和3)。
在本发明的抗体中的任一个中，例如，26D8、18E1或27C10，指定的可变区和CDR序列可以包括序列修饰，例如，取代(1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个或更多个序列修饰)。在一个实施例中，重链和轻链的CDR 1、2和/或3包括一个、两个、三个或更多个氨基酸取代，其中被取代的残基是人源序列中存在的残基。在一个实施例中，取代是保守修饰。保守序列修饰是指不会显著影响或改变含有氨基酸序列的抗体的结合特性的氨基酸修饰。此类保守修饰包含氨基酸取代、添加和缺失。可以通过本领域已知的标准技术，将修饰引入到本发明的抗体中，如定点诱变和PCR介导的诱变。保守氨基酸取代通常是其中氨基酸残基被具有具有类似的理化性质的侧链的氨基酸残基替换的那些氨基酸取代。指定的可变区和CDR序列可以包括一个、两个、三个、四个或更多个氨基酸插入、缺失或取代。在进行取代的情况下，优选的取代将是保守修饰。在本领域中已经定义了具有类似侧链的氨基酸残基家族。这些家族包含具有碱性侧链的氨基酸(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、具有酸性侧链的氨基酸(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、具有不带电荷的极性侧链的氨基酸(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、具有非极性侧链的氨基酸(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸)、具有β支链侧链的氨基酸(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和具有芳香族侧链的氨基酸(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。因此，抗体的CDR区内的一个或多个氨基酸残基可以被来自相同侧链家族的其它氨基酸残基替换，并且可以使用本文中所描述的测定，测试改变的抗体的保留功能(即，本文中所列出的性质)。
任选地，在本文中的任何实施例中，抗ILT2抗体可以被表征为抗体中的任何抗体的功能保守变体、重和/或轻链、本文中所描述的其CDR或可变区。在一个实施例中，所述抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区是抗体12D12、26D8或18E1的重链可变区的功能保守变体，所述轻链可变区是相应的12D12、26D8或18E1抗体的功能保守变体。在一个实施例中，所述抗体包括重链和轻链，所述重链是与本文中所公开的人重链恒定区、任选地人IgG4恒定区、任选地SEQ ID NO:42-45中的任何一个的恒定区融合的抗体12D12、26D8或18E1的重链可变区的功能保守变体，所述轻链是与人Cκ轻链恒定区融合的相应的12D12、26D8或18E1抗体的轻链可变区的功能保守变体。
在一个实施例中，抗ILT2抗体可以制备成使得它们与人Fcγ受体不具有实质性的特异性结合，例如，CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和/或CD64中的任何一个或多个)。此类抗体可以包括已知缺乏或与Fcγ受体具有低结合的各种重链的恒定区。可替代地，不包括(或包括部分)恒定区的抗体片段，如F(ab')2片段，可以用于避免Fc受体结合。可以根据本领域已知的方法评估Fc受体结合，包含例如在BIACORE测定中测试抗体与Fc受体蛋白的结合。而且，通常可以使用任何抗体IgG同种型，其中Fc部分被修饰(例如，通过引入1个、2个、3个、4个、5个或更多个氨基酸取代)，以最小化或消除与Fc受体的结合(参见，例如，WO 03/101485，其公开内容通过引用并入本文)。如基于细胞的测定等用于评估Fc受体结合的测定在本领域中是公知的，并且描述于，例如WO 03/101485中。
在一个实施例中，抗体可以在Fc区中包括一个或多个特定突变，其导致与效应细胞具有最小相互作用的抗体。减少或消除的效应功能可以通过抗体的Fc区中的突变获得，并且已经在本领域中描述：N297A突变、LALA突变(Strohl,W.,2009,《生物技术当前述评(Curr.Opin.Biotechnol.)》第20卷(第6期):685-691)；和D265A(Baudino等人,2008,《免疫学杂志(J.Immunol.)》181:6664-69)还参见Heusser等人，WO2012/065950，其公开内容通过引用并入本文。在一个实施例中，抗体在铰链区中包括一个、两个、三个或更多个氨基酸取代。在一个实施例中，抗体是IgG1或IgG2，并且在残基233-236，任选地233-238(EU编号)处包括一个、两个或三个取代。在一个实施例中，抗体是IgG4，并且在残基327、330和/或331(EU编号)处包括一个、两个或三个取代。具有减少的FcγR相互作用的经修饰的Fc lgG1抗体的实例是在lgG1 Fc氨基酸序列中包括L234A和L235A突变的LALA突变体。Fc减少的突变的另一个实例是残基D265或D265和P329处的突变，例如在lgG1抗体中用作DAPA(D265A，P329A)突变(US 6,737,056)。另一种经修饰的lgG1抗体在残基N297处包括突变(例如，N297A、N297S突变)，其产生去糖基化/非糖基化抗体。其它突变包含：残基L234和G237处的取代(L234A/G237A)；残基S228、L235和R409(S228P/L235E/R409K、T、M、L)处的取代；残基H268、V309、A330和A331(H268Q/V309L/A330S/A331S)处的取代；残基C220、C226、C229和P238(C220S/C226S/C229S/P238S)处的取代；残基C226、C229、E233、L234和L235(C226S/C229S/E233P/L234V/L235A)处的取代；残基K322、L235和L235(K322A/L234A/L235A)处的取代；残基L234、L235和P331(L234F/L235E/P331S)处的取代；残基234、235和297处的取代；残基E318、K320和K322(L235E/E318A/K320A/K322A)处的取代；残基(V234A、G237A、P238S)处的取代；残基243和264处的取代；残基297和299处的取代；使得由EU编号系统定义的残基233、234、235、237和238包括选自PAAAP、PAAAS和SAAAS的序列(参见WO2011/066501)的取代。
在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E A E G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H ED P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T VL H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A S I E K T I S K A K G Q P R E P QV Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G QP E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S CS V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO:123)。
在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留Kabat位置234、235和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E F E G G P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H ED P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T VL H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A S I E K T I S K A K G Q P R E P QV Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G QP E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S CS V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO:124)。
在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留位于Kabat位置234、235、237、330和331处的氨基酸残基的氨基酸序列(下划线)：
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E A E G A P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H ED P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T VL H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P S S I E K T I S K A K G Q P R E P QV Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G QP E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S CS V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO:125)。
在一个实施例中，抗体包括重链恒定区，所述重链恒定区包括下文的氨基酸序列，或与其至少90％、95％或99％相同但保留位于Kabat位置234、235、237和331处的氨基酸残基的序列(下划线)：
A S T K G P S V F P L A P S S K S T S G G T A A L G C L V K D Y F P EP V T V S W N S G A L T S G V H T F P A V L Q S S G L Y S L S S V V T V P S SS L G T Q T Y I C N V N H K P S N T K V D K R V E P K S C D K T H T C P P C PA P E A E G A P S V F L F P P K P K D T L M I S R T P E V T C V V V D V S H ED P E V K F N W Y V D G V E V H N A K T K P R E E Q Y N S T Y R V V S V L T VL H Q D W L N G K E Y K C K V S N K A L P A S I E K T I S K A K G Q P R E P QV Y T L P P S R E E M T K N Q V S L T C L V K G F Y P S D I A V E W E S N G QP E N N Y K T T P P V L D S D G S F F L Y S K L T V D K S R W Q Q G N V F S CS V M H E A L H N H Y T Q K S L S L S P G K(SEQ ID NO:126)。
抗体的片段和衍生物(其被本申请中使用的术语“抗体(antibody)”或“抗体(antibodies)”涵盖，除非另有说明或上下文明显矛盾)可以通过本领域已知的技术产生。“片段”包括完整抗体的一部分，通常是抗原结合位点或可变区。抗体片段的实例包含Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2和Fv片段；双抗体；任何抗体片段是具有由一个不间断的连续氨基酸残基序列组成的一级结构的多肽(在本文中称为“单链抗体片段”或“单链多肽”)，包含但不限于(1)单链Fv分子(2)仅含有一个轻链可变结构域的单链多肽，或含有轻链可变结构域的三个CDR，无相关的重链部分的其片段和(3)仅含有一个重链可变区的单链多肽，或含有重链可变区的三个CDR，无相关的轻链部分的其片段；以及由抗体片段形成的多特异性(例如，双特异性)抗体。尤其包含纳米抗体、结构域抗体、单结构域抗体或“dAb”。
在某些实施例中，可以在插入到表达载体中之前，修饰产生抗体的杂交瘤的DNA，例如，通过用编码序列取代人重链和轻链恒定结构域代替同源非人类序列(例如，Morrison等人,《美国国家科学院院刊(PNAS)》pp.6851(1984))，或通过共价连接免疫球蛋白编码序列全部或部分非免疫球蛋白多肽的编码序列。以所述方式，制备具有原始抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。通常，此类非免疫球蛋白多肽取代抗体的恒定结构域。
任选地，抗体是人源化的。“人源化”形式的抗体是特异性嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段(如Fv、Fab、Fab'、F(ab')2或抗体的其它抗原结合子序列)，其含有衍生自鼠免疫球蛋白的最小序列。在大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被来自原始抗体(供体抗体)的CDR的残基替换，同时维持原始抗体所需的特异性、亲和力和能力。
在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架残基可以被对应的非人残基替换。此外，人源化抗体可以包括在受体抗体或导入的CDR或框架序列中未发现的残基。进行这些修饰以进一步改进和优化抗体性能。通常，人源化抗体将包括基本上全部至少一个、并且通常两个可变结构域，其中所有或基本上所有CDR区对应于原始抗体的那些，并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白共有序列中的那些。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人免疫球蛋白恒定区的至少一部分。另外的细节参见Jones等人,《自然》,321,第522页(1986)；Reichmann等人,《自然》,332,第323页(1988)；Presta，《结构生物学新见(Curr.Op.Struct.Biol.)》,2,第593页(1992)；Verhoeyen等人,《科学(Science)》,239,第1534页；以及美国专利第4,816,567号，其全部公开内容通过引用并入本文。)用于人源化抗体的方法是本领域熟知的。
用于制备人源化抗体的人可变结构域，轻链和重链两者的选择对于降低抗原性非常重要。根据所谓的“最佳拟合”方法，针对已知人可变结构域序列的整个文库，筛选抗体的可变结构域的序列。然后接受最接近小鼠的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,《免疫学杂志(J.Immunol.)》151,第2296页(1993)；Chothia和Lesk,《分子杂志(J.Mol.)》196,1987,第901页)。另一种方法使用来自特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。同一框架可以用于若干种不同的人源化抗体(Carter等人,《美国国家科学院院刊》89,第4285页,(1992)；Presta等人,《免疫学杂志》,151,第2623页(1993))。
更重要的是，抗体被人源化，保留对ILT-2或NKG2A受体的高亲和力和其它有利的生物学性质。为了实现此目标，根据一种方法，通过使用亲代和人源化序列的三维模型分析亲代序列和各种概念性人源化产物的过程，制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可获得的，并且是本领域的技术人员熟悉的。可获得计算机程序，其展示和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能的三维结构。检查这些显示允许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用，即，分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。以此方式，可以从共有序列和输入序列中选择并组合FR残基，从而实现所需的抗体特性，如对靶抗原的亲和力增加。通常，CDR残基直接且最实质地参与影响抗原结合。
制备“人源化”单克隆抗体的另一种方法是使用XenoMouse(Abgenix，Fremont，CA)作为用于免疫的小鼠。XenoMouse是一种小鼠宿主，根据其免疫球蛋白基因被功能性人免疫球蛋白基因替换。因此，由此小鼠或由此小鼠的B细胞制备的杂交瘤产生的抗体已经人源化。XenoMouse描述于美国专利第6,162,963号中，其通过引用以其整体并入本文。
人抗体也可以根据各种其它技术产生，如通过使用已经被工程化以表达人抗体库的其它转基因动物用于免疫(Jakobovitz等人，《自然(Nature)》362(1993)255)，或通过使用噬菌体展示方法从抗体库选择。此类技术是本领域的技术人员已知的，并且可以从本申请公开的单克隆抗体开始实施。
组合物和试剂盒
本文还提供了包括如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂和/或如抗ILT-2抗体等ILT-2中和剂的药物组合物。具体地，一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有中和抗NKG2A抗体和中和抗ILT-2抗体，以及任选地进一步的药学上可接受的载体。
NKG2A中和抗体和/或ILT-2中和抗体可以以1mg/ml到500mg/ml的浓度掺入在药物调配物中，其中所述调配物的pH为2.0到10.0。
NKG2A中和剂和抗ILT-2药剂可以包括在相同或分开的药物调配物中。
调配物可以进一步包括缓冲系统、一种或多种防腐剂、一种或多种张力剂、一种或多种螯合剂、稳定剂和表面活性剂。在一个实施例中，药物调配物是含水调配物，即包括水的调配物。此类调配物通常是溶液或悬浮液。在另外的实施例中，药物调配物是水溶液。术语“含水调配物”定义为包括至少50％w/w水的调配物。同样，术语“水溶液”定义为包括至少50％w/w水的溶液，并且术语“水性悬浮液”定义为包括至少50％w/w水的悬浮液。
在另一个实施例中，药物调配物是冻干调配物，医师或患者在使用之前加入溶剂和/或稀释剂。
在另一个实施例中，药物调配物是干燥调配物(例如，冷冻干燥或喷雾干燥)，无需任何预先溶解即可使用。
在另外的方面，药物调配物包括此类抗体的水溶液和缓冲液，其中抗体以1mg/ml或更高的浓度存在，并且其中所述调配物的pH为约2.0到约10.0。
在另一个实施例中，调配物的pH处于选自由以下组成的列表的范围内：约2.0到约10.0、约3.0到约9.0、约4.0到约8.5、约5.0到约8.0、和约5.5到约7.5。
在另外的实施例中，缓冲剂选自由以下组成的组：乙酸钠、碳酸钠、柠檬酸盐、甘氨酰甘氨酸、组氨酸、甘氨酸、赖氨酸、精氨酸、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、磷酸钠和三(羟甲基)-氨基甲烷、二羟乙甘氨酸、三甲基甘氨酸、苹果酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、酒石酸、天冬氨酸或其混合体。这些特定缓冲液中的每一种构成本发明的替代性实施例。
在另外的实施例中，调配物进一步包括药学上可接受的防腐剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括等渗剂。在另外的实施例中，调配物还包括螯合剂。在本发明的另外的实施例中，调配物进一步包括稳定剂。在另外的实施例中，调配物进一步包括表面活性剂。为了方便起见，参考《雷明顿：药学科学与实践(Remington:The Science and Practiceof Pharmacy)》,第19版,1995。
本发明的药物调配物中可能存在其它成分。此类另外的成分可以包含润湿剂、乳化剂、抗氧化剂、填充剂、张力调节剂、螯合剂、金属离子、油质媒剂、蛋白质(例如，人血清白蛋白、明胶或蛋白质)和两性离子(例如，氨基酸，如甜菜碱、牛磺酸、精氨酸、甘氨酸、赖氨酸和组氨酸)。当然，此类额外的成分不应对本发明的药物调配物的总体稳定性产生不利影响。
根据本发明的药物组合物的施用可以通过任何合适的施用途径，例如静脉内施用。也可以通过检查其它已经开发的治疗性单克隆抗体的经验确定合适的抗体调配物。
还提供了试剂盒，例如包含以下的试剂盒：
(i)含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂和如抗ILT-2抗体等ILT-2中和剂的药物组合物；或者
(ii)含有如抗ILT-2抗体等ILT-2中和剂的第一药物组合物和含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂的第二药物组合物；或者
(iii)含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂的药物组合物和施用所述NKG2A中和剂与如抗ILT-2抗体等ILT-2中和剂的说明书；或者
(iv)含有如抗ILT-2抗体等ILT-2中和剂的药物组合物和施用所述ILT-2中和剂与如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂抗体的说明书。
药物组合物可以任选地被指定为包括药学上可接受的载体。抗NKG2A或抗ILT-2抗体可以任选地指定为以适用于本文的方法中的任何方法的治疗有效量存在。试剂盒任选地还可以包含说明书，例如包括施用方案，以允许从业者(例如，医师、护士或患者)向患有癌症的患者施用其中含有的组合物。在任何实施例中，试剂盒可以任选地包含同时、单独或依次施用所述NKG2A中和剂与所述抗ILT-2抗体的说明书。在任何实施例中，试剂盒可以任选地包含用于治疗癌症(例如本文进一步描述的癌症)的说明书。在任何实施例中，试剂盒可以任选地包含例如用于治疗结直肠癌的说明书。试剂盒还可以包含注射器。
任选地，试剂盒包含多个包装的单剂量药物组合物，所述多个包装的单剂量药物组合物各自含有有效量的NKG2A中和剂和/或抗ILT-2抗体，用于根据上文提供的方法进行单次施用。用于施用药物组合物所必需的仪器或装置也可以包含在试剂盒中。例如，试剂盒可以提供含有一定量的抗NKG2A或抗ILT-2抗体的一个或多个预充式注射器。
在一个实施例中，本发明提供了一种用于治疗人患者的癌症或肿瘤的试剂盒，任选地其中所述癌症或肿瘤是HLA-E和/或HLA-G-阳性肿瘤或癌症(并且任选地进一步是PD-L1阴性肿瘤或癌症)，所述试剂盒包括：
(a)一定剂量的抗NKG2A抗体，其包括本文所公开的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，任选地重链可变区的CDR和本文所公开的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域，任选地轻链可变区的CDR，所述重链可变区具有SEQ ID NO:68-72中的任一个所示的序列，所述轻链可变区具有SEQ ID NO:73中所示的序列；和/或
(b)一定剂量的抗ILT-2抗体，任选地其中抗ILT-2抗体能够加强原代NK细胞的细胞毒性，任选地其中抗ILT-2抗体包括重链可变区的H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域和相应轻链可变区的L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域，所述重链可变区具有SEQ ID NOS:12、20、28、36、38、40、42、44、46中的任一个所示的序列，所述相应轻链可变区具有SEQ ID NO:13、21、29、37、39、41、43、45、47中所示的序列；以及
(c)任选地，用于在本文所描述的方法中的任何方法中使用所述抗NKG2A抗体和/或所述抗ILT-2抗体的说明书。
恶性肿瘤的诊断、预后和治疗
描述了在个体癌症的诊断、预后、监测和治疗中有用的方法。所述方法可以用于增强和/或引发个体的抗肿瘤免疫应答。所述方法可以用于增强和/或加强个体的NK和/或CD8T细胞(任选地肿瘤浸润性NK和/或CD8 T细胞)的活性(例如对癌细胞的细胞毒活性)。任选地，抗肿瘤免疫应答至少部分地由NK和/或CD8 T细胞介导。在另一个实施例中，所述方法可以用于增强和/或加强由中和PD-1的抑制活性的抗体介导的抗肿瘤免疫应答。在另一个实施例中，所述方法可以用于使患有癌症的个体适合用中和PD-1的抑制活性的抗体进行治疗。所述方法特别用于治疗结直肠癌、肾细胞癌、肺癌(例如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、胰腺癌或头颈癌，例如头颈鳞状细胞癌(HNSCC)。进一步地，如本文所示，在透明细胞肾细胞癌中，肿瘤样品中升高的ILT-2表达与降低的存活率相关，并且又进一步地，头颈癌、肺癌、肾癌和卵巢癌可能与NK细胞上ILT-2的表达升高相关，并且因此根据本公开的方法和组合物也可以有利地治疗此类癌症。
在一些实施例中，提供了治疗个体的肿瘤例如肾细胞癌(例如透明细胞肾细胞癌)的方法，所述方法包括向个体施用有效量的中和NKG2A的抗体和中和ILT-2的抑制活性的抗体。在一些实施例中，提供了治疗个体的肿瘤例如肾细胞癌的方法，所述方法包括向个体施用有效量的中和NKG2A的抗体、中和ILT-2的抑制活性的抗体和中和PD-1的抑制活性的抗体。
在一个实施例中，已知癌症的特征在于存在HLA-A表达、HLA-B表达和/或HLA-G-表达，例如，如通过检测肿瘤或肿瘤环境中的HLA-A-、HLA-B-和/或HLA-G表达性细胞评估的。在一个实施例中，HLA-A-、HLA-B-和/或HLA-G-表达性细胞是肿瘤细胞。
在一个实施例中，提供了如本文所描述的ILT-2中和抗体与抗NKG2A抗体(任选地进一步与中和PD-1的抑制活性的抗体组合)组合的用途，以有利地治疗为HLA-G阳性，任选地为HLA-G1和/或HLA-G5阳性的癌症。因此，提供了一种用于治疗或预防患有HLA-G阳性肿瘤或癌症的个体的癌症或肿瘤的方法，所述方法包括向个体施用结合和中和NKG2A的药剂，例如与中和ILT-2的抑制活性的抗体组合。在一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防个体的HLA-G阳性癌症的方法，所述方法包括：向个体施用NKG2A中和剂。在一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防个体的HLA-G阳性癌症的方法，所述方法包括：向个体施用NKG2A中和剂和中和ILT-2的抑制剂活性的抗体。在一个实施例中，HLA-G是HLA-G1。在一个实施例中，HLA-G是HLA-G5。
一方面，HLA-G阳性癌症具有一种类型或具有已知通常或规律地特征在于存在HLA-G-表达(例如肿瘤细胞表面处的HLA-G表达)的特征。因此，不需要测试个体或来自个体的生物样品的步骤。另一方面，可以在肿瘤或肿瘤环境中检测HLA-G表达性细胞(例如肿瘤细胞)以确定肿瘤或癌症是否为HLA-G阳性。在一个实施例中，HLA-G阳性癌症的特征在于确定(例如通过在肿瘤活检中体外检测HLA-G)包括HLA-G表达性细胞的肿瘤。在一个实施例中，HLA-G阳性癌症的特征在于肿瘤组织，所述肿瘤组织包括表达HLA-G的恶性细胞，因此包括相应的HLA-E和/或HLA-G多肽。在一个实施例中，HLA-G阳性癌症的特征在于存在可溶性HLA-G多肽，任选地高或增加水平的可溶性HLA-G(与健康个体的水平相比)。任选地，可溶性HLA-G多肽存在于循环中。
在另一个实施例中，提供了一种用于确定患有癌症，任选地NSCLC的个体是否将从中和NKG2A的药剂和中和ILT-2的药剂中获得特别的益处、对其有应答和/或适用于用其治疗的方法，所述方法包括确定所述个体是否患有HLA-E和/或HLA-G阳性癌症，其中所述个体患有HLA-E和/或HLA-G阳性癌症的确定表明所述个体可以从中和抑制性受体NKG2A的药剂和中和ILT-2的抑制活性的药剂(任选地进一步与中和PD-1的抑制活性的抗体组合)获得特别强的益处、对其有应答和/或适用于用其治疗。
在一些实施例中，提供了一种治疗个体的肿瘤的方法，所述方法包括(i)鉴定患有HLA-G阳性肿瘤(例如HLA-G1阳性肿瘤、HLA-G5阳性肿瘤)的个体以及(ii)向个体施用NKG2A中和剂和中和ILT-2的抑制活性的抗体。在一些实施例中，提供了一种治疗个体的肿瘤的方法，所述方法包括(i)鉴定患有HLA-G阳性肿瘤(例如HLA-G1阳性肿瘤、HLA-G5阳性肿瘤)的个体以及(ii)向个体施用NKG2A中和剂、中和ILT-2的抑制活性的抗体和中和PD-1的抑制活性的抗体。
在一个实施例中，HLA-G阳性肿瘤或癌症是已知通常特征在于在肿瘤或肿瘤环境中存在HLA-G表达性细胞(HLA-G1表达性细胞)或高水平的可溶性HLA-G(例如HLA-G5)的肿瘤或癌症。因此，在有或没有用于评估肿瘤细胞上HLA-G表达的预先检测步骤的情况下，可以用ILT-2和/或NKG2A中和剂治疗患有癌症的个体。
在一个实施例中，治疗方法可以包括检测来自个体的生物样品中的HLA-G(例如HLA-G1和/或HLA-G5核酸或多肽)的步骤。膜结合的HLA-G多肽可以例如在癌组织或靠近癌症的组织或癌症外周处的组织，例如癌旁组织的样品中检测到。可以在血液衍生样品中检测可溶性HLA-G多肽(例如，HLA-G5)以评估循环中或癌症和/或癌旁组织中的HLA-G。生物样品包括HLA-G多肽，例如包括表达HLA-G(例如，与参照相比，任选地与健康个体或健康组织参照相比，显著表达HLA-G；以高水平、高强度表达用抗HLA-G抗体，即循环中高水平的可溶性HLA-G染色的HLA-G)的细胞，任选地癌细胞的确定表明患者患有可能从本公开的组合治疗中获得强烈益处的癌症。在一个实施例中，方法包括确定生物样品中HLA-G核酸或多肽的表达水平，并且将所述水平与对应于健康个体的参考水平进行比较。生物样品包括以与参考水平相比升高的水平表达HLA-G核酸或多肽的细胞的确定表明患者患有可以用本公开的组合治疗中的任何组合治疗来治疗的癌症。在一个实施例中，检测生物样品中的HLA-G多肽包括检测在恶性细胞表面上表达的HLA-G多肽。任选地，检测生物样品中的HLA-G多肽包括检测例如循环中的可溶性HLA-G。HLA-G多肽可以被指定为在取自给定个体的大量细胞中检测到，例如HLA-G多肽可以存在于至少5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或更多的肿瘤细胞或肿瘤组织中的细胞或取自个体的肿瘤旁组织样品(例如活检)上。
确定个体是否患有特征在于表达HLA-G多肽的细胞的癌症可以例如包括从包括来自癌症环境(例如，肿瘤或肿瘤邻近组织)的细胞的个体获得生物样品(例如，通过执行活检)，使所述细胞与结合HLA-G多肽的抗体接触，并且检测细胞是否在其表面上表达HLA-G。任选地，确定个体是否具有表达HLA-G的细胞包括执行免疫组织化学测定。
如本文所使用的，辅助或组合施用(共同施用)包含以相同或不同的剂型同时施用化合物或单独施用化合物(例如，顺序施用)。因此，NKG2A中和剂可以与ILT-2中和抗体组合使用。例如，抗NKG2A抗体和抗ILT2抗体可以在单一调配物中同时施用。可替代地，NKG2A中和剂和抗ILT-2抗体可以配制用于分开施用，并且同时或依次施用。
除非另有说明，否则本文所描述的治疗方案和方法中的任何一个可以与或不与检测获自个体的生物样品(例如，包括癌细胞、癌组织或癌旁组织的生物样品)中细胞上的HLA分子表达的先前步骤一起使用。在一个实施例中，用本文所公开的方法治疗的癌症是特征在于HLA-E，任选地高水平的HLA-E的癌症。在一个实施例中，癌症是已知通常特征在于存在HLA-E表达性细胞的肿瘤或癌症。有利地，治疗方法可以包括在来自个体的肿瘤(例如肿瘤细胞上)的生物样品中检测HLA-E核酸或多肽的步骤。生物样品表达HLA-E(例如，与参考相比，显著表达；以高水平、高强度表达用抗HLA-E抗体染色的HLA-E)的确定表明个体患有可能从使用本文所描述的治疗方案和方法的治疗中获得强烈益处的癌症。在一个实施例中，方法包括确定生物样品中HLA-E核酸或多肽的表达水平，并且将所述水平与参考水平(例如值、弱细胞表面染色等)进行比较。生物样品以与参考水平相比增加的水平表达HLA-E核酸或多肽的确定可以表明个体患有可以用本文所描述的治疗方案和方法有利地治疗的癌症。测定个体是否患有表达HLA-E多肽的细胞的癌症可以例如包括：从包括来自癌症细胞的个体获得生物样品(例如，通过进行活检)；使所述细胞与结合HLA-E多肽的抗体接触；以及检测细胞是否在其表面上表达HLA-E。任选地，确定个体是否具有表达HLA-E的癌细胞包括执行免疫组织化学测定。任选地，测定个体是否具有表达HLA-E的癌症细胞包括进行流式细胞术测定。
在一个实施例中，ILT2中和抗体和NKG2A中和抗体缺乏与人CD16A的结合，又加强CD16A表达性效应细胞(例如，NK细胞或效应T细胞)的活性。因此，在一个实施例中，本文所描述的组合ILT2中和抗体和NKG2A中和抗体的治疗方案和方法与含有Fc结构域的蛋白质进一步组合使用，所述蛋白质能够向与其结合的细胞诱导NK细胞介导的ADCC，例如，通过由NK细胞表达的CD16A。通常，此类含Fc结构域的蛋白质是与所关注抗原(例如，肿瘤细胞上存在的抗原(肿瘤抗原))结合的抗体，并且包括Fc结构域或其部分，并且将通过抗原结合结构域表现出与抗原的结合并且通过Fc结构域表现出与Fcγ受体(例如，CD16A)的结合。肿瘤抗原在本领域中是众所周知的，例如受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、B7-H3、B7-H4、B7-H6、Crypto、CD4、CD20、CD30、CD19、CD38、CD47、EGFR、Her2(ErbB2/Neu)、CD22、CD33、CD79、CD123、CD138、CD171、PSCA、PSMA、BCMA、B7H3、CD52、CD56、CD80、CD70。在一个实施例中，它的ADCC活性将至少部分由CD16介导。在一个实施例中，另外的治疗剂是具有天然或经过修饰的人Fc结构域的抗体，例如来自人IgG1或IgG3抗体的Fc结构域。诱导ADCC的FDA批准的抗体的实例包含利妥昔单抗(rituximab)(用于淋巴瘤、CLL的治疗)、曲妥单抗(trastuzumab)(用于乳腺癌的治疗)、阿仑单抗(alemtuzumab)(用于慢性淋巴细胞性白血病的治疗)、达雷木单抗(daratumumab)(用于多发性骨髓瘤的治疗)和西妥昔单抗(cetuximab)或帕尼单抗(panitumumab)(用于结直肠癌、头颈鳞状细胞癌的治疗)。实例还包含通过修饰以进一步提高ADCC的ADCC增强抗体，如：GA-101(低岩藻糖基化抗CD20)、玛格图单抗(margetuximab)(Fc增强抗HER2)、美泊利单抗(mepolizumab)、MEDI-551(Fc工程化抗CD19)、奥比努单抗(obinutuzumab)(糖工程化/低岩藻糖基化抗CD20)、奥卡拉单抗(ocaratuzumab)(Fc工程化抗CD20)、FPA150(Fc工程化抗B7H4)、
Figure BDA0003579061230000511
5574/MOR208(Fc工程化抗CD19)。在其它方面，治疗或用途可以任选地被指定为不与结合CD16和/或能够诱导对其结合的细胞的ADCC的抗体或其它药剂组合(或排除用其进行治疗)。
在另一个实施例中，本文所描述的组合ILT2中和抗体和NKG2A中和抗体的治疗方案和方法可以有利地与中和人PD-1的抑制活性(例如，抑制PD-1与PD-L1之间相互作用)的药剂进一步组合使用，任选地进一步地在(已确定为或预计为)对用中和人PD-1的抑制活性的药剂的进行治疗的不良应答者(或对所述治疗不敏感)的个体中。中和人PD-1的抑制活性的药剂或抗体的实例包含结合PD1或PD-L1的抗体。许多此类抗体是已知的，并且可以例如以通常使用此类药剂的示例性剂量和/或频率来使用。在一个实施例中，第二或另外的第二治疗剂是抑制PD-1轴(即，抑制PD-1或PD-L1)的药剂(例如，抗体)。
PD-1是CD28受体家族的抑制成员，所述CD28受体家族还包含CD28、CTLA-4、ICOS和BTLA。PD-1在活化的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达(Okazaki等人(2002)《当前免疫学观点(Curr.Opin.Immunol.)》14:391779-82；Bennett等人(2003)《免疫学杂志》170:711-8)。已经鉴定出PD-1的两个配体PD-L1和PD-L2，已经示出所述两个配体在与PD-1结合时下调T细胞活化(Freeman等人(2000)《实验医学杂志》192:1027-34；Latchman等人(2001)《自然-免疫学(Nat Immunol)》2:261-8；Carter等人(2002)《欧洲免疫学杂志(Eur J Immunol)》32:634-43)。PD-L1在多种人类癌症中是丰富的(Dong等人(2002)《自然-医学(Nat.Med.)》8:787-9)。PD-1与PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润淋巴细胞减少、T细胞受体介导的增殖减少以及癌细胞的免疫逃避。通过抑制PD-1与PD-L1的局部相互作用可以逆转免疫抑制，并且当PD-1与PD-L2的相互作用也被阻断时，这种效应是累加的。PD-1的阻断可以有利地涉及使用例如通过阻断与其天然配体PD-L1的相互作用来阻止PD-L1诱导的PD-1信号传导的抗体。一方面，抗体结合PD-1(抗PD-1抗体)；此种抗体可以阻断PD-1与PD-L1之间和/或PD-1与PD-L2之间的相互作用。另一方面，抗体结合PD-L1(抗PD-L1抗体)并且阻断PD-1与PD-L1之间的相互作用。
目前，市场上或临床评价中有至少六种阻断PD-1/PD-L1途径的药剂，这些药剂中的任何药剂都可以与本公开的抗ILT2抗体组合使用。一种药剂是BMS-936558(纳武单抗(Nivolumab)/ONO-4538，Bristol-Myers Squibb；以前的MDX-1106)。纳武单抗(商品名称
Figure BDA0003579061230000522
)是FDA批准的完全人IgG4抗PD-L1 mAb，其抑制PD-L1配体与PD-1和CD80两者的结合，并且在WO 2006/121168中被描述为抗体5C4，其公开内容通过引用并入本文。对于黑素瘤患者，在3mg/kg的剂量下观察到最显著的OR，而对于其它癌症类型，其可以在10mg/kg下观察到。纳武单抗通常以每3周10mg/kg给药，直到癌症进展。另一种药剂是度伐鲁单抗(durvalumab)(
Figure BDA0003579061230000521
MEDI-4736)，由阿斯利康公司(AstraZeneca)/医学免疫公司(Medimmune)开发并在WO2011/066389和US2013/034559中有所描述的抗PD-L1。另一种药剂是MK-3475(来自默克公司(Merck)的人IgG4抗PD1 mAb)，也被称为拉波力单抗(lambrolizumab)或派姆单抗(pembrolizumab)(商品名称
Figure BDA0003579061230000523
)已经被FDA批准用于治疗黑素瘤，并且正在其它癌症中测试。派姆单抗以每2周或3周2mg/kg或10mg/kg测试，直到疾病进展。另一种药剂是阿特珠单抗(atezolizumab)(
Figure BDA0003579061230000524
MPDL3280A/RG7446，罗氏公司(Roche)/基因科技公司(Genentech))，含有经工程化的Fc结构域的人抗PD-L1 mAb，其被设计成通过最小化FcγR结合和随之发生的抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)来优化功效和安全性。每3周施用≤1mg/kg、10mg/kg、15mg/kg和25mg/kg MPDL3280A的剂量，持续长达1年。在3期试验中，在NSCLC中，每三周静脉内输注施用1200mg MPDL3280A。在其它方面，治疗或用途可以任选地被指定为不与抑制PD-1轴的抗体或其它药剂组合(或排除用其进行治疗)。
本文所描述的治疗方案和方法可以用于增强中和PD-1的抗体的活性。例如，某些中和PD-1的抗体在肿瘤细胞上PD-L1表达低或没有不可检测的PD-L1表达的个体中示出活性降低或有限。因此，在一个实施例中，根据本公开治疗的个体的特征可以在于患有癌症，所述癌症的特征在于PD-L1表达性癌细胞低或没有(缺乏)。
在一个实施例中，本公开提供了一种用于治疗或预防个体的癌症(例如，NSCLC、HNSCC、结直肠癌(CRC)、卵巢癌、肾癌)的方法，所述方法包括：
(a)鉴定患有癌症的个体，所述癌症的特征在于PD-L1表达性癌细胞低或不可检测，任选地从个体获得包括肿瘤细胞的生物样品并且量化PD-L1表达性癌细胞；以及
(b)在确定个体患有特征在于PD-L1表达性癌细胞低或不可检测的癌症时，向个体施用中和ILT-2的抑制活性的药剂组合中和NKG2A的抑制活性的抗体和中和PD-1的抑制活性的抗体。
在某些实施例中，用NKG2A中和剂和PD-1中和剂的组合治疗的个体患有癌症其肿瘤细胞表达PD-L1的癌症(例如，肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌)。
在其它实施例中，用NKG2A中和剂和PD-1中和剂的组合治疗的个体患有癌症其肿瘤细胞不表达PD-L1的癌症(例如，肾细胞癌、透明细胞肾细胞癌)。
应当理解，本公开的治疗方法可以涉及或可以不涉及在治疗之前表征PD-L1的肿瘤细胞表达的步骤。一方面，本发明允许独立于其PD-L1状态对个体进行治疗，并且因此，提供了NKG2A中和剂、ILT-2中和剂和PD-1中和剂的组合用于治疗患有癌症(独立或不考虑肿瘤PD-L1表达水平)的个体群体的用途。一方面，个体可以是尚未测试肿瘤细胞PD-L1表达的个体。
在一些实施例中，本发明包含治疗患有癌症的个体的肿瘤的方法，所述方法包括(i)鉴定其肿瘤细胞表达PD-L1的个体以及(ii)向个体施用有效量的NKG2A中和剂、有效量的ILT2中和剂和有效量的PD-1中和剂。
在一些实施例中，本发明包含治疗患有癌症的个体的肿瘤的方法，所述方法包括(i)鉴定其肿瘤细胞不表达PD-L1的个体以及(ii)向个体施用有效量的NKG2A中和剂、有效量的ILT2中和剂和任选地进一步地有效量的PD-1中和剂。
在本文的任何实施例中，治疗(例如用ILT2中和剂和NKG2A中和剂治疗)可以任选地被指定为在不存在用结合和/或中和或降低(一个或多个)杀伤Ig样受体(KIR)的抑制活性的药物的组合治疗。
本公开还提供了一种药剂，所述药剂是与ILT-2结合并中和ILT-2在NK细胞中的抑制活性的抗体，所药剂用于治疗患有癌症的人个体，其中所述结合ILT-2的抗体与NKG2A中和剂组合施用。
例如，还提供了：
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述个体患有NSCLC、HNSCC、结直肠癌(CRC)、卵巢癌、肾癌(例如透明细胞肾细胞癌)；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂是结合人NKG2A蛋白的抗体，任选地人或人源化抗NKG2A抗体；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂是抑制NKG2A与HLA-E结合的抗体；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂包括具有SEQ ID NO:80-82的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:83-85的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂是莫那利珠单抗；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述ILT-2中和剂是结合人ILT-2蛋白的抗体，任选地人或人源化抗ILT-2抗体；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述ILT-2中和剂是抑制ILT-2与HLA-G1结合的抗体；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述ILT-2中和剂包括(a)具有SEQ ID NO:14-16的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:17-19的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；或(b)具有SEQ ID NO:22-24的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:25-27的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；(c)具有SEQ ID NO:30-32的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:33-35的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；(d)具有SEQ ID NO:48-50的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ IDNO:51-53的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；(e)具有SEQ ID NO:54-56的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:57-59的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；或(f)具有SEQ ID NO:60、61(或H-CDR2的62)和63的序列的重链H-CDR1、H-CDR2和H-CDR3结构域，以及分别具有SEQ ID NO:64-66的序列的轻链L-CDR1、L-CDR2和L-CDR3结构域；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂和所述结合ILT-2的抗体同时、单独或依次施用；
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂和所述结合ILT-2的抗体被配制用于分开施用并且同时或依次施用；和/或
如上文所描述的供使用的药剂，其中所述NKG2A中和剂以0.1到10mg/kg范围内的剂量施用，并且所述结合ILT-2的抗体以1到20mg/kg范围内的剂量施用。在一个实施例中，ILT-2中和抗体可以以诱导或增加免疫细胞(例如CD8 T细胞、NK细胞)浸润到肿瘤中的量施用。
在组合治疗方法中，当NKG2A中和剂与ILT-2中和抗体组合施用时，NKG2A中和剂和ILT-2中和抗体可以单独、一起或依次或混合施用。在一些实施例中，在施用ILT-2中和抗体前施用NKG2A中和剂。例如，NKG2A中和剂可以在施用ILT-2中和抗体前大约0到30天施用。在一些实施例中，抗体NKG2A中和剂在施用抗ILT-2抗体前约30分钟到约2周、约30分钟到约1周、约1小时到约2小时、约2小时到约4小时、约4小时到约6小时、约6小时到约8小时、约8小时到1天、或约1天到5天施用。在一些实施例中，在施用ILT-2中和抗体的同时施用NKG2A中和剂。在一些实施例中，在施用ILT-2中和抗体后施用NKG2A中和剂。例如，NKG2A中和剂可以在施用ILT-2中和抗体后大约0到30天施用。在一些实施例中，NKG2A中和剂在施用ILT-2中和抗体之后约30分钟到约2周、约30分钟到约1周、约1小时到约2小时、约2小时到约4小时、约4小时到约6小时、约6小时到约8小时、约8小时到1天、或约1天到5天施用。
实例
实例1：ILT2(LILRB1)在健康人类供体记忆CD8 T细胞和CD56暗淡NK细胞上被表达
通过对来自健康人类供体的新鲜全血进行流式细胞术来测定外周血单核细胞上的LILRB1表达。NK群被测定为CD3-CD56+细胞(抗CD3 AF700-生物传奇公司(BioLegend)#300424；抗CD56 BV421-BD生物科学公司(BD Biosciences)#740076)。在NK细胞中，CD56明亮亚群被鉴定为CD16-细胞，而CD56暗淡亚群被鉴定为CD16+细胞(抗CD16BV650-BD生物科学公司#563691)。CD4+和CD8+T细胞分别被鉴定为CD3+CD56-CD4+和CD3+CD56-CD8+细胞(CD3-参见上文；CD4 BV510-BD生物科学公司#740161；CD8BUV737-BD生物科学公司#564629)。在CD4+T细胞群中，Tconv和Treg分别被鉴定为CD127+CD25-/低和CD127低CD25高细胞(CD127 PE-Cy7-BD生物科学公司#560822；CD25VioBright-美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)#130-104-274)。在CD8+T细胞群中，原初细胞群、中枢记忆细胞群、效应记忆细胞群和效应记忆T细胞群分别被鉴定为CD45RA+CCR7+、CD45RA-CCR7+、CD45RA-CCR7-、CD45RA+CCR7-细胞(CD45RA BUV395-BD生物科学公司#740298；CCR7 PerCP-Cy5.5-生物传奇公司#353220)。命名为“CD3+CD56+ly”的群是包括NKT细胞和γδT细胞的异质细胞群。单核细胞被鉴定为CD3-CD56-CD14+细胞(CD14 BV786-BD生物科学公司#563691)，并且B细胞被鉴定为CD3-CD56-CD19+细胞(CD19 BUV496-BD生物科学公司#564655)。使用抗LILRB1抗体(克隆HP-F1-APC-生物传奇公司#17-5129-42)。将全血与染色Ab混合体在黑暗中在室温下一起温育20分钟，然后按照提供者TDS用Optilyse C(贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)#A11895)裂解红细胞。将细胞用PBS洗涤两次，并用Fortessa流式细胞仪(BD生物科学公司)显示荧光。
结果示出于图1中。虽然B淋巴细胞和单核细胞通常总是表达ILT2，常规CD4 T细胞和CD4 Treg细胞不表达ILT2，但是相当一部分CD8 T细胞(约25％)、CD3+CD56+淋巴细胞(约50％)和NK细胞(约30％)表达ILT2，这表明一定比例的此类CD8 T和NK细胞群中的每个细胞群可以根据HLA I类配体存在于例如肿瘤细胞上而被ILT2抑制。
在CD8 T细胞中，ILT2表达不存在于原初细胞上，但存在于CD8 T细胞的效应记忆部分，并且在较小程度上存在于中枢记忆CD8 T细胞上。在NK细胞中，ILT2表达基本上仅在CD16+亚群(CD56暗淡)上，并且在CD16-NK细胞(CD56明亮)上的频率低得多。
实例2：ILT2在多种人类癌症中被上调
通过对从人类癌症患者供体的全血中纯化的外周血单核细胞(PBMC)进行流式细胞术来测定单核细胞、B细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞以及CD16-和CD16+NK细胞两者上的ILT2表达。使用实例1中详述的相同抗体混合物鉴定细胞群并评估ILT2表达。将PBMC与抗体混合体在黑暗中在4℃下一起温育20分钟，在染色缓冲液中洗涤两次，并在Fortessa流式细胞仪上测量荧光。
来自癌症患者样品的结果示出在图2中。如可以看出的，ILT2再一次在所有单核细胞和B细胞上被表达。然而，在淋巴细胞亚群、NK细胞和CD8 T细胞上，ILT2在来自三种类型的癌症(HNSCC、NSCLC和RCC)的细胞上更加频繁地(具有统计学显著性)被表达。ILT2在卵巢癌中也被上调，尽管需要研究更大数量的患者样品。在头颈癌(HNSCC)、肺癌(NSCLC)和肾癌(RCC)中，在CD8 T细胞、γδT细胞(αβT细胞上无表达)和CD16+NK细胞中观察到癌症患者样品中的ILT2表达增加。
实例3：抗ILT2抗体的生成
材料和方法
ILT-2_6xHis重组蛋白的克隆和产生
ILT-2蛋白(Uniprot登录号Q8NHL6)在NruI限制性位点与BamHI限制性位点之间被克隆到pTT-5载体中。使用重链肽前导。用以下引物进行PCR：
ILT-2_正向_ACAGGCGTGCATTCGGGGCACCTCCCCAAGCCCAC(SEQ ID NO:127)，
ILT-2_反向_CGAGGTCGGGGGATCCTCAATGGTGGTGATGATGGTGGTGCCTTCCCAGACCACTCTG(SEQ ID NO:128)，
在蛋白质的C端部分处添加6xHis标签以进行纯化。用生成的载体转染EXPI293细胞系以进行瞬时生产。使用Ni-NTA珠从上清液中纯化蛋白质，并使用SEC纯化单体。
ILT-2_6xHis重组蛋白的氨基酸序列如下所示：
GHLPKPTLWAEPGSVITQGSPVTLRCQGGQETQEYRLYREKKTALWITRIPQELVKKGQFPIPSITWEHAGRYRCYYGSDTAGRSESSDPLELVVTGAYIKPTLSAQPSPVVNSGGNVILQCDSQVAFDGFSLCKEGEDEHPQCLNSQPHARGSSRAIFSVGPVSPSRRWWYRCYAYDSNSPYEWSLPSDLLELLVLGVSKKPSLSVQPGPIVAPEETLTLQCGSDAGYNRFVLYKDGERDFLQLAGAQPQAGLSQANFTLGPVSRSYGGQYRCYGAHNLSSEWSAPSDPLDILIAGQFYDRVSLSVQPGPTVASGENVTLLCQSQGWMQTFLLTKEGAADDPWRLRSTYQSQKYQAEFPMGPVTSAHAGTYRCYGSQSSKPYLLTHPSDPLELVVSGPSGGPSSPTTGPTSTSGPEDQPLTPTGSDPQSGLGRHHHHHHH(SEQ IDNO:129)
在细胞表面表达ILT家族成员的CHO和KHYG细胞系的生成
使用以下引物通过PCR扩增ILT-2的完整形式：ILT-2_For ACAGGCGTGCATTCGGGGCACCTCCCCAAGCCC(SEQ ID NO:130)和ILT-2_Rev_CCGCCCCGACTCTAGACTAGTGGATGGCCAGAGTGG(SEQ ID NO:131)。将PCR产物在合适的限制性位点处插入到表达载体中。使用重链肽前导。然后，将载体转染到CHO和KHYG细胞系中以获得在细胞表面表达ILT-2蛋白的稳定克隆。然后，使用这些细胞进行杂交瘤筛选。类似地制备表达其它ILT家族成员的CHO细胞，包含表达ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5、ILT-6、ILT7和ILT-8的细胞。用于制备表达ILT-1、ILT-3、ILT-4、ILT-5和ILT-6的细胞的ILT蛋白的氨基酸序列提供在下表1中。
表1：ILT序列
Figure BDA0003579061230000581
Figure BDA0003579061230000591
在细胞表面表达HLA-G的K562细胞系的生成
使用以下引物通过PCR扩增HLA-G的完整形式(基因库登录号NP_002118.1，序列如下所示)：HLA-G_For 5'CCAGAACACAGGATCCGCCGCCACCATGGTGGTCATGGCGCCC3'(SEQ ID NO:132)、HLA-G_Rev_5'TTTTCTAGGTCTCGAGTCAATCTGAGCTCTTCTTTC3'(SEQ ID NO:133)。将PCR产物在BamHI限制性位点与XhoI限制性位点之间插入到载体中，并用于转导不表达HLA-E或被工程化以稳定过表达HLA-E的K562细胞系。
HLA-G氨基酸序列：
Figure BDA0003579061230000601
HLA-E氨基酸序列(Uniprot P13747)：
Figure BDA0003579061230000602
免疫和筛选
通过用ILT-2_6xHis蛋白使balb/c小鼠产生免疫来进行免疫。在免疫方案之后，处死小鼠以进行融合并获得杂交瘤。使用杂交瘤上清液来染色CHO-ILT2和CHO-ILT4细胞系，以在流式细胞术实验中检查单克隆抗体反应性。简而言之，将细胞与50μl的上清液在4℃下一起温育1小时，洗涤三次，并使用与AF647偶联的二级抗体山羊抗小鼠IgG Fc特异性抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司(Jackson Immunoresearch)，JI115-606-071)。染色30分钟后，将细胞洗涤三次，并使用FACS CANTO II(贝迪公司(Becton Dickinson))进行分析。
筛选出约1500个杂交瘤上清液，以鉴定产生与ILT2结合并具有阻断ILT2与HLA-G相互作用的能力的抗体的那些杂交瘤上清液。简而言之，将重组的带6xHIS标签的ILT2在与105个表达HLA-G的K562细胞一起温育之前与50μl的杂交瘤上清液在室温下一起温育20分钟。然后，将细胞洗涤一次，并与由兔抗6xHIS(贝瑟尔实验室(Bethyl lab)，A190-214A)抗体和与PE偶联的抗兔IgG F(ab')2抗体(杰克逊实验室(Jackson lab)，111-116-114)制成的二级复合物一起温育。染色30分钟后，将细胞在PBS中洗涤一次，并用Cell Fix(贝迪公司，340181)固定。在FACS CANTO II流式细胞仪上进行分析。
这个测定允许鉴定一组在阻断ILT2与其HLA I类配体HLA-G相互作用方面极为有效的抗ILT2抗体。抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10被鉴定为具有良好的阻断活性，并且因此被选择进行进一步的研究。
所产生的抗体作为经修饰的人IgG1抗体产生，所述抗体具有带有Fc结构域突变L234A/L235E/G237A/A330S/P331S(Kabat EU编号)的重链，这导致缺乏N连接的糖基化，并且基本上缺乏与人Fcγ受体CD16A、CD16B、CD32A、CD32B和CD64的结合。简言之，将每种抗体的VH和Vk序列(本文中所示的VH和Vk可变区)克隆到含有huIgG1恒定结构域的表达载体中，所述恒定结构域分别具有上述突变和huCk恒定结构域。将获得的两种载体共转染到CHO细胞系中。建立的细胞池用于在CHO培养基中产生抗体。
实例4：经修饰的人IgG1 Fc结构域与FcγR的结合
先前已评价实例3中所采用的L234A/L235E/G237A/A330S/P331S Fc结构域以及其它Fc突变和野生型抗体，以如下评估与人Fcγ受体的结合。
在25℃下在Biacore T100设备(通用电气医疗集团(GE Healthcare)的Biacore)上进行SPR(表面等离子体共振)测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和10mM NaOH、500mM NaCl分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。克隆、产生和纯化重组人FcR的(CD64、CD32a、CD32b、CD16a和CD16b)。
所测试的抗体包含：具有野生型人IgG1结构域的抗体、具有带有S241P取代的人IgG4结构域的抗体、具有N297S取代的人IgG1抗体、具有L234F/L235E/P331S取代的人IgG1抗体、具有L234A/L235E/P331S取代的人IgG1抗体、具有L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代的人IgG1抗体和具有L234A/L235E/G237A/P331S取代的人IgG1抗体。
将抗体共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)中将抗体稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，800RU到900RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。
按照经典动力学向导(如制造商推荐的)评估单价亲和力研究。将CD64的范围为0.7到60nM和所有其它FcR的60到5000nM的可溶性分析物(FcR)的系列稀释液注射到固定的双特异性抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。使用CD64的1:1动力学结合模型和所有其它FcR的稳态亲和力模型拟合整个传感图集。
表6示出了结果。结果示出，虽然全长野生型人IgG1与所有人Fcγ受体结合，并且特别地，人IgG4与FcγRI(CD64)显著结合(表6中所示出的KD)，但是L234A/L235E/G237A/A330S/P331S取代和L234A/L235E/G237A/P331S取代消除了与CD64以及与CD16a的结合。
实例5：ILT2阻断抗体增强NK细胞裂解的能力
通过实例3中所描述的表达ILT2的KHYG细胞在存在抗体的情况下裂解靶细胞的能力来测定抗ILT2抗体控制ILT2介导的NK细胞活化抑制的能力。效应细胞是表达ILT2和GFP的KHYG细胞作为对照，并且靶细胞是表达HLA-G的装载51Cr的K562细胞系。将效应细胞和靶细胞以1:10的比率混合。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育4小时。用TopCount NXT(珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))通过将51Cr释放在共培养上清液中来计算靶细胞的特异性裂解。
这个实验评价了实例2中所鉴定的抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a、27G10以及可商购获得的抗体GHI/75(小鼠IgG2b，生物传奇公司#333720)、292319(小鼠IgG2b，生物技术公司(Bio-Techne)#MAB20172)、HP-F1(小鼠IgG1，e生物科学公司(eBioscience)#16-5129-82)、586326(小鼠IgG2b，生物技术公司#MAB30851)和292305(小鼠IgG1，生物技术公司#MAB20171)。
结果示出在图3中。大多数ILT2/HLA-G阻断抗体示出NK细胞系对K562-HLA-G肿瘤靶细胞的细胞毒性％显著增加。然而，某些抗体在增加NK细胞毒性方面特别有效。抗体12D12、19F10a和商业292319在增强NK细胞对靶细胞的细胞毒性的能力方面比其它抗体更有效。抗体18E1、26D8尽管不太有效，但显示出作为细胞毒性强化剂的活性，在较小程度上优于3H5和商业抗体HP-F1。在诱导对靶细胞的细胞毒性的能力方面，其它抗体(包含27C10、27H5、1C11、1D6、9G1和商业抗体292305、586326、GHI/75)的活性明显低于18E1、26D8。
实例6：阻断ILT2与HLA I类分子的结合
HLA/ILT2阻断测定
通过流式细胞术评估的抗ILT2抗体阻断在细胞系的表面表达的HLA-G或HLA-A2与重组ILT2蛋白之间的相互作用的能力。简而言之，将带有BirA标签的ILT2蛋白生物素化以获得每个ILT2蛋白1个生物素分子。将APC缀合的链霉亲和素(SA)与生物素化的ILT2蛋白(比例为1个链霉亲和素/4个ILT2蛋白)混合以形成四聚体。将抗ILT2 Ab(12D12、18E1、26D8)与ILT2-SA四聚体在染色缓冲液中在4℃下一起温育30分钟。将Ab-ILT2-SA复合物添加到表达HLA-G或HLA-A2的细胞上，并在4℃下温育1小时。在配备有HTFC板装载器的AccuryC6流式细胞仪上评价复合物在细胞上的结合，并使用FlowJo软件进行分析。
这个测定允许鉴定一组在阻断ILT2与其HLAI类配体HLA-G相互作用方面极为有效的抗ILT2抗体。抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10全部都阻断了ILT2与HLA-G和HLA-A2的结合。图4示出了抗体12D12、18E1和26D8的代表性结果。
实例7：通过流式细胞术在ILT2表达性细胞上进行抗体滴定
为了解释NK细胞毒性诱导的差异，在实验中测试了未经标记的抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10以及可商购获得的抗体GHI/75、292319、HP-F1、586326和292305与被修饰以表达人ILT-2的CHO细胞的结合。将细胞与30μg/ml到5×10-4μg/ml的各种浓度的未经标记的抗ILT2抗体在4℃下一起温育30分钟。用染色缓冲液洗涤后，将细胞与山羊抗人H+L AF488二级抗体(杰克逊免疫研究实验室有限公司#109-546-088)或山羊抗小鼠H+L AF488二级抗体(可商购获得的抗体)(杰克逊免疫研究实验室有限公司#115-545-146)在4℃下一起温育30分钟。在配备有HTFC板装载器的AccuryC6流式细胞仪上测量荧光。
结果示出在下表2中。除了其EC50比其它抗体高出的范围为1-log的抗体GHI/75之外，其余抗体全部示出相当的EC50值，这表明结合亲和力的差异不能解释观察到的增强NK细胞毒性的能力的差异。
表2
Figure BDA0003579061230000641
实例8：单价亲和力测定
测试了抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a和27G10以及可商购获得的抗体GHI/75、292319和HP-F1与人ILT2蛋白的结合亲和力。
使用SPR方法来测试抗体3H5、12D12、26D8、18E1、27C10、27H5、1C11、1D6、9G1、19F10a、27G10(所有人IgG1同种型)。在25℃下在Biacore T200 ap设备(通用电气医疗集团的Biacore)上进行测量。在所有Biacore实验中，HBS-EP+(通用电气医疗集团的Biacore)和NaOH 10mM分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。用Biacore T100评价软件对传感图进行分析。蛋白A购自(通用电气医疗集团)。在因内特制药公司(Innate Pharma)处克隆、产生和纯化人ILT2重组蛋白。将蛋白A蛋白质共价固定到传感器Chip CM5上的葡聚糖层中的羧基。用EDC/NHS(N-乙基-N'-(3-二甲基氨基丙基)碳二酰胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(通用电气医疗集团的Biacore)活化芯片表面。在偶联缓冲液(10mM乙酸盐，pH 5.6)将蛋白A稀释到10μg/ml，并且注射直至达到合适的固定水平(即，2000RU)。使用100mM乙醇胺pH 8(通用电气医疗集团的Biacore)进行剩余活化基团的失活。将1μg/mL的抗ILT2抗体捕获到蛋白A芯片上，并将重组人ILT2蛋白以5μg/mL注射到捕获到的双特异性抗体上。对于空白扣除，再次进行循环，从而用运行缓冲液替换ILT2蛋白。按照制造商推荐的常规捕获动力学方案(通用电气医疗集团的Biacore，动力学向导)进行单价亲和力分析。将范围为6.25到400nM的人ILT2蛋白的七个连续稀释液依次注射到捕获到的抗体上，并允许其在再生前解离10分钟。使用1:1动力学结合模型，拟合整个传感器图集。
使用OCTET分析来评价抗体GHI/75、292319和HP-F1(所有小鼠同种型)。在OctetRED96系统(颇尔富迪生物公司(Fortebio))上进行测量。在所有Biacore实验中，动力学缓冲液10X(颇尔富迪生物公司)和甘氨酸10mM pH 1.8分别用作运行缓冲液和再生缓冲液。使用数据分析9.0软件分析图。使用抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器。将5μg/mL的抗ILT2抗体被捕获到抗小鼠IgG Fc捕获(AMC)生物传感器上。注射重组人ILT2蛋白的七个稀释液(292319和HP-F1为1000nM到15.625nM并且GHI-75为100nM到1.5625nM)。使用模型1:1拟合曲线。
结果示出在下表3中。虽然抗体GHI/75和27H5的KD略高于其它抗体，但其余抗体均示出相当的亲和力和KD值，并且KD差异通常与增强NK细胞毒性能力的差异无关。因此，结合亲和力并不能解释抗体增强NK细胞毒性的能力的差异。
表3
Figure BDA0003579061230000651
实例9：鉴定增加原代人NK细胞中的细胞毒性的抗体
考虑了先前抗体无法中和NK细胞中的ILT2的可能性可能与原代NK细胞中的ILT2表达的差异(例如与在其表面表达较高水平的ILT2的经高度选择或修饰的NK细胞系相比)有关。研究并选择了来自许多健康人类供体的原代NK细胞中的抗体。通过评估NK细胞上的CD137表面表达通过活化测定来研究实例5的抗ILT2抗体的效应。在每种情况下，将原代NK细胞(作为从供体中纯化的新鲜NK细胞)用作效应细胞，并且将表达HLA-E/G的K562细胞(慢性髓性白血病(CML))用作靶标。因此，靶标不仅表达ILT2配体HLA-G，而且表达HLA-E，其是在一系列癌症细胞的表面上表达的HLA I类配体并且可以与NK和CD8 T细胞的表面上的抑制受体相互作用。
简而言之，通过对总NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。效应细胞是原代NK细胞(从供体中纯化的新鲜NK细胞，使用前在37℃下温育过夜)，并将靶细胞(K562 HLA-E/G细胞系)以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以500g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合物(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用SB重悬沉淀物；并用Canto II(HTS)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的K562-HLA-E/G。
图5A是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和制备成表达HLA-E和HLA-G的K562肿瘤靶细胞由抗ILT2抗体介导的表达CD137的总NK细胞的％的增加的代表性图。图5B是示出了使用来自两个人类供体的NK细胞和表达HLA-A2的B细胞系由抗ILT2抗体介导的表达CD137的ILT2阳性(左图)和ILT2阴性(右图)NK细胞的％的增加的代表性图。
令人惊讶地，观察到在增强NK细胞系的细胞毒性方面最为有效的抗体不一定能够活化原代人NK细胞。在增强NK细胞系的细胞毒性方面最为有效的抗体12D12、19F10a和292319中，与同种型对照抗体相比，19F10a和292319两者都基本上缺乏活化原代NK细胞的能力。
另一方面，抗体12D12、18E1和26D8示出对原代NK细胞的强活化。对ILT2阳性NK细胞的研究示出，这些抗体的介导使得NK细胞对靶细胞的活化增加两倍。作为对照，表达CD137的ILT2阴性NK细胞的％不受所述抗体的影响。类似地，阻断ILT2与HLA-G和HLA-A2结合的抗体2H2A、3F5和48F12也示出对原代NK细胞的强烈活化。
图6A和6B从细胞毒性标志物CD137的增加倍数的角度示出了抗体增强原代NK细胞对肿瘤靶细胞的细胞毒性的能力。图6A示出了抗体使用来自5-12个不同供体的原代NK细胞对表达HLA-G和HLA-E的K562靶细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下增强NK细胞活化的能力。图6A示出了抗体使用来自3-14个不同供体的原代NK细胞对表达HLA-A2的靶B细胞在存在表达HLA-G的靶细胞的情况下增强NK细胞活化的能力。在每种情况下，12D12、18E1和26D8具有与抗体之一(292319)相比更大的NK细胞毒性增强，所述抗体之一属于在使用实例5中的NK细胞系时示出最强的NK细胞毒性增强的抗体。
实例10：表位作图
锚定的ILT2结构域片段蛋白
ILT2蛋白的生成
使用下表中所描述的引物通过PCR扩增对不同的人ILT2结构域D1(对应于SEQ IDNO:1中所示的序列的残基24-121)、D2(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基122-222)、D3(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基223-321)、D4(对应于SEQ ID NO:1中所示的序列的残基322-458)及其组合进行编码的核酸序列。将PCR产物在合适的限制性位点处插入到表达载体中。使用重链肽前导序列，并在N端处添加V5标签，并通过流式细胞术确认细胞表面处的表达。对于所有没有D4结构域随后的结构域，添加CD24 GPI锚以允许锚定在细胞膜处。所产生的含有不同的人ILT2结构域片段的蛋白质的氨基酸序列示出在下表4中。然后，将载体转染到CHO细胞系中以获得在细胞表面表达不同的ILT2结构域蛋白的稳定克隆。
表4
Figure BDA0003579061230000671
Figure BDA0003579061230000681
结果
通过流式细胞术测试ILT2选择性抗体与不同的锚定的ILT2片段的结合。3H5、12D12和27H5全部都与ILT2的D1结构域结合。这些抗体与表达含有ILT2的D1结构域的蛋白质(SEQ ID NO:112、116和119的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D1结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:113-115、117、118和120的蛋白质)的任何细胞结合。因此，抗体3H5、12D12和27H5与由SEQ ID NO:1中所示的序列的残基24-121定义的ILT2的结构域(也被称为结构域D1)结合。抗体26D8、18E1和27C10全部都与ILT2的D4结构域结合。这些抗体与表达含有ILT2的D4结构域的蛋白质(SEQ ID NO:115、118和120的蛋白质)的所有细胞结合，而不与表达缺乏D4结构域的ILT2蛋白(SEQ ID NO:112-114、116、117或119的蛋白质)的任何细胞结合。因此，抗体26D8、18E1和27C10与由SEQ ID NO:1中所示的序列的残基322-458定义的ILT2的结构域结合。图7示出了抗体与SEQ ID NO:112的锚定的ILT2结构域D1片段蛋白(左图)、SEQ ID NO:114的D3结构域片段蛋白(中间图)和SEQ ID NO:115的D4结构域蛋白(右图)的代表性示例结合。
ILT2点突变研究
对结合ILT2而不与密切相关的ILT6结合的抗体的鉴定允许在暴露的氨基酸上设计ILT2突变并且ILT2与ILT6之间有所不同。然后，可以针对丧失与在ILT2的D1、D2或D4结构域中具有氨基酸取代的不同的ILT2突变体的结合对在ILT6上没有交叉反应的抗ILT2抗体进行作图。
ILT2突变体的生成
通过PCR生成ILT2突变体。扩增的序列在琼脂糖凝胶上运行，并且使用MachereyNagel PCR Clean-Up Gel Extraction试剂盒(参考740609)进行纯化。然后用ClonTechInFusion系统将为每种突变体生成的纯化的PCR产物连接到表达载体中。将含有突变序列的载体制备成Miniprep并且测序。测序之后，使用Promega PureYieldTM质粒Midiprep系统，将含有突变序列的载体制备成Midiprep。HEK293T细胞在DMEM培养基(Invitrogen)中生长，使用Invitrogen的Lipofectamine 2000用载体转染，并且在测试转基因表达之前，在37℃下在CO2培养箱中温育48小时。在Hek-293T细胞中转染突变体，如下表所示。靶向的氨基酸突变示出在下表5中，其列出了存在于野生型ILT2中的残基/残基位置/存在于突变体ILT2中的残基，其中位置参考是左列中的缺乏SEQ ID NO:2中所示的前导肽的ILT2蛋白或右列中的带有SEQ ID NO:1中所示的前导肽的ILT2蛋白。
表5
Figure BDA0003579061230000701
结果
通过流式细胞术测试ILT2选择性抗体与每个突变体的结合。进行第一实验，以测定在一个浓度下丧失与一个或几个突变体的结合的抗体。为了确认结合的丧失，对结合似乎受ILT2突变影响的抗体进行了抗体滴定。测试抗体的结合的丧失或降低指示特定突变体的一个或多个或全部残基对于抗体的核心表位是重要的，并且由此允许鉴定ILT2的结合区域。
抗体3H5、12D12和27H5结合ILT2的结构域D1中的表位，因为这三个抗体丧失与在ILT2的结构域1(D1结构域)中的残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的突变体2的结合。12D12和27H5没有丧失与任何其它突变体的结合，然而，3H5与在残基29、30、33、32、80处具有氨基酸取代(取代G29S、Q30L、Q33A、T32A、D80H)的突变体1的结合也降低(部分丧失)。
抗体2H2A、48F12和3F5结合ILT2的结构域D1中的表位，其中与在ILT2的结构域1(D1结构域)中的残基34、36、76、82和84处具有氨基酸取代(取代E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L)的突变体2的结合丧失。
图8A示出了通过流式细胞术进行的抗体3H5、12D12和27H5与突变体1和2的结合的滴定的代表性实例。图9A示出了表示包含结构域1(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域2(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图示出了如由突变体1(M1)和突变体2(M2)中被取代的氨基酸残基定义的抗体的结合位点。
抗体26D8、18E1和27C10全部都结合ILT2的结构域D4中的表位。抗体26D8和18E1丧失与突变体4-1和4-2的结合。突变体4-1在残基299、300、301、328、378和381处具有氨基酸取代(取代F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N)。突变体4-2在残基328、330、347、349、350和355处具有氨基酸取代(取代W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A)。此外，26D8丧失了与突变体4-5的结合，而抗体18E1与突变体4-5的结合降低(但没有完全丧失结合)。27C10也丧失了与突变体4-5的结合，但不与任何其它突变体结合。突变体4-5在残基341、342、344、345和347处具有氨基酸取代(取代D341A、D342S、W344L、R345A、R347A)。26D8和18E1没有丧失与任何其它突变体的结合。
图8B示出了通过流式细胞术进行的抗体26D8、18E1和27C10与D4结构域突变体4-1、4-1b、4-2、4-4和4-5的结合的滴定的代表性实例。
图9B示出了表示包含结构域3(顶部，用深灰色阴影表示)和结构域4(底部，用浅灰色阴影表示)的ILT2分子的一部分的模型。图示出了如由全部都位于ILT2的结构域4内的突变体4-1、4-2和4-5中被取代的氨基酸残基定义的抗体的结合位点。加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体26D8、18E1结合由突变体4-1和4-2定义的位点，而不与由突变体4-5定义的位点结合，而不加强原代NK细胞的细胞毒性的抗体27C10与由突变体4-5定义的位点结合。
实例11：尿路上皮癌中的ILT2
来自尿路上皮癌患者的原代NK细胞中对HLA-A2表达性细胞的细胞毒性的加强
通过对来自人类尿路上皮癌患者的总NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。
效应细胞是原代NK细胞(从人类尿路上皮癌供体中纯化的新鲜NK细胞，使用前在37℃下温育过夜)，并将靶细胞(HLA-A2表达性B细胞系参考B104)以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以500g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合物(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用SB重悬沉淀物；并用Canto II(HTS)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的靶细胞。
图10示出了来自尿路上皮癌患者的表达CD137的ILT2阳性(右图)和ILT2阴性(中间图)NK细胞与抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8和表达HLA-A2的B细胞一起温育后的％。抗ILT2抗体12D12、18E1和26D8中的每一个使得NK细胞毒性增加多于2倍。
实例12：抗ILT2与阻断NKG2A/HLA-E相互作用的抗体组合
抗NKG2A抗体和抗ILT2抗体一起强烈增强NK细胞对肿瘤细胞的细胞毒性
通过对来自人肿瘤细胞的NK细胞、ILT2阳性NK细胞和ILT2阴性NK细胞上的CD137表达进行流式细胞术通过分析来测定抗ILT2抗体对NK细胞活化的效应。
肿瘤靶细胞包含转染HLA-E和HLA-G1的K562细胞，以及未转染HLA-E或HLA-G的WIL2-NS肿瘤靶细胞，其中ILT-2被沉默。图11D示出了用于ILT2配体表达的WIL-2NS和K562肿瘤靶细胞的表型。将效应细胞(从人类健康供体中纯化的新鲜NK细胞)和肿瘤靶细胞以比率1:1混合。CD137测定是在96U孔板中以完整RPMI，200μL终/孔完成的。使用的抗体包含抗ILT-2抗体12D12、18E1和26D8、具有SEQ ID NO:65和69的重链和轻链氨基酸序列的抗NKG2A中和抗体IPH2201，以及同种型对照抗体。将抗体与效应细胞在37℃下预温育30分钟，并且然后将靶细胞在37℃下共温育过夜。以下步骤：以400g旋转3分钟；用染色缓冲液(SB)洗涤两次；添加50μL的染色Ab混合物(抗CD3太平洋蓝(Pacific blue)-BD生物科学公司；抗CD56-PE-Vio770-美天旎生物技术公司；抗CD137-APC-美天旎生物技术公司；抗ILT2-PE-克隆HP-F1，e生物科学公司)；在4℃下温育30分钟；用SB洗涤两次；用Cellfix(贝迪公司)重悬沉淀物；并用FACS Canto II流式细胞仪(贝迪公司)显示荧光。阴性对照是NK细胞对单独的和在存在同种型对照的情况下的靶细胞。
所述研究旨在比较抗ILT2抗体与抗NKG2A抗体的效果，并且将不同抗体与阴性对照以及不同样品组合进行测试。抗ILT2抗体能够介导NK细胞毒性的强烈增加，这与阻断抗NKG2A抗体所观察到的相当。令人惊讶地，抗ILT2抗体和抗NKG2A抗体的组合导致总NK细胞活化的活化比任一f种药剂本身能够介导的活化强得多。图11A示出了在两个人类供体中，在与抗ILT2抗体、抗NKG2A抗体或抗ILT2和抗NKG2A抗体的组合以及HLA-E/HLA-G表达性K562肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞活化的增加倍数(与培养基相比)。抗ILT2和抗NKG2A的组合导致NK细胞毒性显著高于单独的抗ILT2或抗NKG2A药剂中的每个的NK细胞毒性。与任一单独药剂相比，所述组合不仅在整个NK细胞群体中，而且在LILRB1+NK细胞群体中都增加了NK细胞毒性，这表明NKG2A在限制这些细胞的细胞毒性方面具有重要作用。图11B示出了两个人类供体的NK细胞表型，示出了LILRB1和NKG2A表达存在于约15％的NK细胞中，但也大部分不重叠，并且这些受体共同鉴定约四分之三的总NK细胞。
图11C示出了在四个人类供体中，在与抗ILT2抗体、抗NKG2A抗体或抗ILT2和抗NKG2A抗体的组合以及WIL-2NS肿瘤靶细胞一起温育后，NK细胞活化的增加倍数(与培养基相比)。同样，抗ILT2和抗NKG2A的组合导致NK细胞毒性显著高于单独的抗ILT2或抗NKG2A药剂中的每个的NK细胞毒性。
实例13：透明细胞肾癌中的ILT2
ILT2表达与人类CCRCC患者的存活率的相关性
基于不同类型癌症的关键基因组变化的多维图，使用癌症基因组图谱(CancerGenome Atlas，国家癌症研究所和国家人类基因组研究所之间的合作)对ILT2基因表达研究进行了研究。考虑到疾病阶段和时间，考虑了表达水平(指示为高或低)。对于ILT2和肾透明细胞肾细胞癌(CCRCC)患者根据Cox回归的p值分为3组(高、中和低ILT2基因表达)(每组必须含有至少10％的患者)。为3组中的每组绘制存活概率曲线。在CCRCC样品中观察到低、中和高ILT2表达之间的统计学存活率差异，其中高表达ILT2表现出较低的存活率。图12示出了低ILT2表达性样品(顶部线)、中ILT2表达性样品(中间线)和高ILT2表达性样品(底部线)。结果示出增加的ILT2表达与较低的存活概率相关。与中和低ILT2表达性样品相比，高ILT2表达性样品与较低的存活概率相关。
表6
Figure BDA0003579061230000741
本文引用的所有参考文献，包含公开、专利申请和专利均特此通过引用整体并入，并且其程度如同每个参考文献被单独地且具体地指示以通过引用并入并且在本文中整体阐述(在法律允许的最大范围内)一样，不论是否单独提供了本文其它地方参考的特定文件的并入。
除非另有说明，否则本文提供的所有精确值均代表对应的近似值(例如，关于特定因子或测量提供的所有确切示例性值可以被视为还提供对应的近似测量，由“约”修饰，在适当的情况下)。在“约”与数字结合使用的情况下，这可以指定为包含对应于指定数字的+/-10％的值。
本发明使用如“包括(comprising)”、“具有(having)”、“包含(including)”或“含有(containing)”等术语的本文对任何方面或实施例的描述旨在提供对本发明的“由所述一个或多个特定元素组成”、“基本上由所述一个或多个特定元素组成”或“基本上包括所述一个或多个特定元素”的类似方面或实施例的支持，除非另有说明或明确与上下文矛盾(例如，本文描述的包括特定元素的组合物应理解为还描述由所述元素组成的组合物，除非另有说明或明确与上下文矛盾)。
在此提供的任何和所有实例或示例性语言(例如，“诸如”)的使用仅旨在更好地描述本发明并且不对本发明的范围构成限制，除非另外指示。说明书中的任何语言都不应当解释为指示任何未要求保护的要素为实践本发明所必需的。
序列表
<110> 先天制药公司（INNATE PHARMA）
<120> 用ILT-2抑制剂治疗癌症
<130> LILRB1-NKG2A
<150> US 62/914,595
<151> 2019-10-14
<160> 133
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 650
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 1
Met Thr Pro Ile Leu Thr Val Leu Ile Cys Leu Gly Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Pro Arg Thr His Val Gln Ala Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp
20 25 30
Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg
35 40 45
Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys
50 55 60
Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys
65 70 75 80
Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr
85 90 95
Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp
100 105 110
Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser
115 120 125
Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln
130 135 140
Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly
145 150 155 160
Glu Asp Glu His Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly
165 170 175
Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg
180 185 190
Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp
195 200 205
Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys
210 215 220
Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu
225 230 235 240
Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val
245 250 255
Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln
260 265 270
Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser
275 280 285
Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser
290 295 300
Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly
305 310 315 320
Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val
325 330 335
Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met
340 345 350
Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg
355 360 365
Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met
370 375 380
Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser
385 390 395 400
Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu
405 410 415
Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly
420 425 430
Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly
435 440 445
Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly
450 455 460
Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe
465 470 475 480
Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln
485 490 495
Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro
500 505 510
Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln
515 520 525
Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly
530 535 540
Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val
545 550 555 560
Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser
565 570 575
Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln
580 585 590
Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala
595 600 605
Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg
610 615 620
Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val
625 630 635 640
Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His
645 650
<210> 2
<211> 627
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 2
Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr
35 40 45
Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser
50 55 60
Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr
85 90 95
Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val
100 105 110
Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe
115 120 125
Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser
145 150 155 160
Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala
165 170 175
Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu
180 185 190
Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln
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Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly
210 215 220
Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg
225 230 235 240
Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln
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Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr
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Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser
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Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser
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325 330 335
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340 345 350
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Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala
500 505 510
Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg Ser
515 520 525
Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Glu Val Lys His
530 535 540
Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly
545 550 555 560
Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met
565 570 575
Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala
580 585 590
Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro
595 600 605
Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu
610 615 620
Ala Ile His
625
<210> 3
<211> 435
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 3
Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Ile Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Ser Leu Gln Ala
20 25 30
Glu Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Asn Lys Ser Ala Ser Trp Val Arg
35 40 45
Arg Ile Gln Glu Pro Gly Lys Asn Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser Ile
50 55 60
Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr His Cys Gln Tyr Tyr Ser His Asn
65 70 75 80
His Ser Ser Glu Tyr Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Gly Ala
85 90 95
Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Val Val Thr Leu
100 105 110
Gly Gly Asn Val Thr Leu Gln Cys Val Ser Gln Val Ala Phe Asp Gly
115 120 125
Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Arg Leu Asn
130 135 140
Ser His Ser His Ala Arg Gly Trp Ser Trp Ala Ile Phe Ser Val Gly
145 150 155 160
Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Ser Tyr Arg Cys Tyr Ala Tyr Asp
165 170 175
Ser Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu Glu Leu
180 185 190
Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly
195 200 205
Pro Met Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys Val Ser Asp
210 215 220
Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp Phe
225 230 235 240
Leu Gln Arg Pro Gly Trp Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn
245 250 255
Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Pro Ser His Gly Gly Gln Tyr Arg Cys
260 265 270
Tyr Ser Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro
275 280 285
Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Pro Ser Leu Ser
290 295 300
Val Gln Pro Val Pro Thr Val Ala Pro Gly Lys Asn Val Thr Leu Leu
305 310 315 320
Cys Gln Ser Arg Gly Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly
325 330 335
Ala Gly His Pro Pro Leu His Leu Arg Ser Glu His Gln Ala Gln Gln
340 345 350
Asn Gln Ala Glu Phe Arg Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His Val Gly
355 360 365
Thr Tyr Arg Cys Tyr Ser Ser Leu Ser Ser Asn Pro Tyr Leu Leu Ser
370 375 380
Leu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Ala Ser Leu Gly Gln
385 390 395 400
His Pro Gln Asp Tyr Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Met Gly Val Ala
405 410 415
Gly Leu Val Leu Val Val Leu Gly Ile Leu Leu Phe Glu Ala Gln His
420 425 430
Ser Gln Arg
435
<210> 4
<211> 419
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 4
Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Ser Trp Gly Asn Ser Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala
20 25 30
Arg Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Glu Ser Pro Ala Pro Trp Asp Arg
35 40 45
Gln Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser Ile Pro Ser
50 55 60
Met Thr Glu Asp Tyr Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Arg Ser Pro
65 70 75 80
Val Gly Trp Ser Gln Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Met Thr Gly
85 90 95
Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Leu Val Thr
100 105 110
Ser Gly Lys Ser Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Arg Ser Pro Met Asp
115 120 125
Thr Phe Leu Leu Ile Lys Glu Arg Ala Ala His Pro Leu Leu His Leu
130 135 140
Arg Ser Glu His Gly Ala Gln Gln His Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser
145 150 155 160
Pro Val Thr Ser Val His Gly Gly Thr Tyr Arg Cys Phe Ser Ser His
165 170 175
Gly Phe Ser His Tyr Leu Leu Ser His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu
180 185 190
Ile Val Ser Gly Ser Leu Glu Gly Pro Arg Pro Ser Pro Thr Arg Ser
195 200 205
Val Ser Thr Ala Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Met Pro Thr Gly Ser
210 215 220
Val Pro His Ser Gly Leu Arg Arg His Trp Glu Val Leu Ile Gly Val
225 230 235 240
Leu Val Val Ser Ile Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu
245 250 255
Gln His Trp Arg Gln Gly Lys His Arg Thr Leu Ala Gln Arg Gln Ala
260 265 270
Asp Phe Gln Arg Pro Pro Gly Ala Ala Glu Pro Glu Pro Lys Asp Gly
275 280 285
Gly Leu Gln Arg Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Val Gln Gly Glu Asn
290 295 300
Phe Cys Ala Ala Val Lys Asn Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met
305 310 315 320
Asp Thr Arg Gln Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr
325 330 335
Ala Lys Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro
340 345 350
Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu
355 360 365
Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln
370 375 380
Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Phe Thr Leu Arg Gln Lys Ala
385 390 395 400
Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Ala Ser Pro Ala Glu Pro Ser
405 410 415
Val Tyr Ala
<210> 5
<211> 574
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 5
Gly Thr Ile Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Asp Ser Val Ile
1 5 10 15
Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Ser Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala
20 25 30
Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Ser Ala Ser Trp Ile Thr
35 40 45
Arg Ile Arg Pro Glu Leu Val Lys Asn Gly Gln Phe His Ile Pro Ser
50 55 60
Ile Thr Trp Glu His Thr Gly Arg Tyr Gly Cys Gln Tyr Tyr Ser Arg
65 70 75 80
Ala Arg Trp Ser Glu Leu Ser Asp Pro Leu Val Leu Val Met Thr Gly
85 90 95
Ala Tyr Pro Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val Thr
100 105 110
Ser Gly Gly Arg Val Thr Leu Gln Cys Glu Ser Gln Val Ala Phe Gly
115 120 125
Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Glu Glu His Pro Gln Cys Leu
130 135 140
Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser Val
145 150 155 160
Gly Pro Val Ser Pro Asn Arg Arg Trp Ser His Arg Cys Tyr Gly Tyr
165 170 175
Asp Leu Asn Ser Pro Tyr Val Trp Ser Ser Pro Ser Asp Leu Leu Glu
180 185 190
Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro
195 200 205
Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Ser Leu Thr Leu Gln Cys Val Ser
210 215 220
Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Leu Arg Gln Leu Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala
245 250 255
Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg
260 265 270
Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Cys Ser Ala Pro Ser Asp
275 280 285
Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Gly Thr Pro Phe Ile
290 295 300
Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu
305 310 315 320
Leu Cys Gln Ser Trp Arg Gln Phe His Thr Phe Leu Leu Thr Lys Ala
325 330 335
Gly Ala Ala Asp Ala Pro Leu Arg Leu Arg Ser Ile His Glu Tyr Pro
340 345 350
Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala
355 360 365
Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Asn Ser Asp Pro Tyr Leu Leu
370 375 380
Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Met
385 390 395 400
Gly Ser Ser Pro Pro Pro Thr Gly Pro Ile Ser Thr Pro Gly Pro Glu
405 410 415
Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly
420 425 430
Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Val Leu Leu
435 440 445
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln
450 455 460
Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro
465 470 475 480
Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg
485 490 495
Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val
500 505 510
Lys Asp Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg Ala Ala
515 520 525
Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu
530 535 540
Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Arg Glu
545 550 555 560
Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His
565 570
<210> 6
<211> 603
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 6
Gly Pro Phe Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Ser Trp Gly Ser Pro Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala
20 25 30
Gln Glu Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Gly Ser Pro Glu Pro Leu Asp Arg
35 40 45
Asn Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser Ile Pro Ser
50 55 60
Met Thr Glu His His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys His Tyr Tyr Ser Ser
65 70 75 80
Ala Gly Trp Ser Glu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Met Thr Gly
85 90 95
Phe Tyr Asn Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Val Val Ala
100 105 110
Ser Gly Gly Asn Met Thr Leu Arg Cys Gly Ser Gln Lys Gly Tyr His
115 120 125
His Phe Val Leu Met Lys Glu Gly Glu His Gln Leu Pro Arg Thr Leu
130 135 140
Asp Ser Gln Gln Leu His Ser Gly Gly Phe Gln Ala Leu Phe Pro Val
145 150 155 160
Gly Pro Val Asn Pro Ser His Arg Trp Arg Phe Thr Cys Tyr Tyr Tyr
165 170 175
Tyr Met Asn Thr Pro Gln Val Trp Ser His Pro Ser Asp Pro Leu Glu
180 185 190
Ile Leu Pro Ser Gly Val Ser Arg Lys Pro Ser Leu Leu Thr Leu Gln
195 200 205
Gly Pro Val Leu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser
210 215 220
Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala
245 250 255
Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Pro Ser His Gly Gly Gln Tyr Arg
260 265 270
Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp
275 280 285
Pro Leu Asn Ile Leu Met Ala Gly Gln Ile Tyr Asp Thr Val Ser Leu
290 295 300
Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu
305 310 315 320
Leu Cys Gln Ser Trp Trp Gln Phe Asp Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu
325 330 335
Gly Ala Ala His Pro Pro Leu Arg Leu Arg Ser Met Tyr Gly Ala His
340 345 350
Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala
355 360 365
Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Asn Pro His Leu Leu
370 375 380
Ser His Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly His Ser Gly
385 390 395 400
Gly Ser Ser Leu Pro Pro Thr Gly Pro Pro Ser Thr Pro Gly Leu Gly
405 410 415
Arg Tyr Leu Glu Val Leu Ile Gly Val Ser Val Ala Phe Val Leu Leu
420 425 430
Leu Phe Leu Leu Leu Phe Leu Leu Leu Arg Arg Gln Arg His Ser Lys
435 440 445
His Arg Thr Ser Asp Gln Arg Lys Thr Asp Phe Gln Arg Pro Ala Gly
450 455 460
Ala Ala Glu Thr Glu Pro Lys Asp Arg Gly Leu Leu Arg Arg Ser Ser
465 470 475 480
Pro Ala Ala Asp Val Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys Asp
485 490 495
Thr Gln Ser Glu Asp Arg Val Glu Leu Asp Ser Gln Ser Pro His Asp
500 505 510
Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Pro Val Lys His Ser Ser Pro
515 520 525
Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Ser Leu Ser Gly Glu Phe Leu
530 535 540
Asp Thr Lys Asp Arg Gln Val Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu
545 550 555 560
Ala Ala Ala Ser Glu Ala Ser Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His
565 570 575
Ser Leu Thr Leu Arg Arg Lys Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu
580 585 590
Gly Glu Pro Pro Ala Glu Pro Ser Ile Tyr Ala
595 600
<210> 7
<211> 411
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 7
Gly Pro Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Ser Leu Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Tyr His Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr
35 40 45
Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Leu Ser
50 55 60
Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Cys Cys Ile Tyr Gly Ser His
65 70 75 80
Thr Ala Gly Leu Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr
85 90 95
Gly Ala Tyr Ser Lys Pro Thr Leu Ser Ala Leu Pro Ser Pro Val Val
100 105 110
Thr Ser Gly Gly Asn Val Thr Ile Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe
115 120 125
Asp Gly Phe Ile Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys
130 135 140
Leu Asn Ser His Ser His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser
145 150 155 160
Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Ser Tyr Arg Cys Tyr Gly
165 170 175
Tyr Asp Ser Arg Ala Pro Tyr Val Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu
180 185 190
Gly Leu Leu Val Pro Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln
195 200 205
Pro Gly Pro Val Val Ala Pro Gly Glu Lys Leu Thr Phe Gln Cys Gly
210 215 220
Ser Asp Ala Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Trp Gly Arg
225 230 235 240
Asp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln
245 250 255
Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr
260 265 270
Thr Cys Ser Gly Ala Tyr Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser
275 280 285
Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Thr Gly Gln Ile Arg Ala Arg Pro Phe
290 295 300
Leu Ser Val Arg Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr
305 310 315 320
Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Gly Met His Thr Phe Leu Leu Thr Lys
325 330 335
Glu Gly Ala Ala Asp Ser Pro Leu Arg Leu Lys Ser Lys Arg Gln Ser
340 345 350
His Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His
355 360 365
Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Leu Ser Ser Asn Pro Tyr Leu
370 375 380
Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Ala Ala
385 390 395 400
Glu Thr Leu Ser Pro Pro Gln Asn Lys Ser Asp
405 410
<210> 8
<211> 471
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 8
Glu Asn Leu Pro Lys Pro Ile Leu Trp Ala Glu Pro Gly Pro Val Ile
1 5 10 15
Thr Trp His Asn Pro Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Thr Leu Glu Ala
20 25 30
Gln Gly Tyr Arg Leu Asp Lys Glu Gly Asn Ser Met Ser Arg His Ile
35 40 45
Leu Lys Thr Leu Glu Ser Glu Asn Lys Val Lys Leu Ser Ile Pro Ser
50 55 60
Met Met Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr His Cys Tyr Tyr Gln Ser Pro
65 70 75 80
Ala Gly Trp Ser Glu Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr Ala
85 90 95
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100 105 110
Gly Val Asn Val Thr Leu Arg Cys Ala Ser Arg Leu Gly Leu Gly Arg
115 120 125
Phe Thr Leu Ile Glu Glu Gly Asp His Arg Leu Ser Trp Thr Leu Asn
130 135 140
Ser His Gln His Asn His Gly Lys Phe Gln Ala Leu Phe Pro Met Gly
145 150 155 160
Pro Leu Thr Phe Ser Asn Arg Gly Thr Phe Arg Cys Tyr Gly Tyr Glu
165 170 175
Asn Asn Thr Pro Tyr Val Trp Ser Glu Pro Ser Asp Pro Leu Gln Leu
180 185 190
Leu Val Ser Gly Val Ser Arg Lys Pro Ser Leu Leu Thr Leu Gln Gly
195 200 205
Pro Val Val Thr Pro Gly Glu Asn Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp
210 215 220
Val Gly Tyr Ile Arg Tyr Thr Leu Tyr Lys Glu Gly Ala Asp Gly Leu
225 230 235 240
Pro Gln Arg Pro Gly Arg Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn
245 250 255
Phe Thr Leu Ser Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys
260 265 270
Tyr Gly Ala His Asn Val Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro
275 280 285
Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Ile Ser Asp Arg Pro Ser Leu Ser
290 295 300
Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Thr Ser Gly Glu Lys Val Thr Leu Leu
305 310 315 320
Cys Gln Ser Trp Asp Pro Met Phe Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly
325 330 335
Ala Ala His Pro Pro Leu Arg Leu Arg Ser Met Tyr Gly Ala His Lys
340 345 350
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355 360 365
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Val Leu Leu Phe Leu Gly Ile Leu Leu Phe Glu Ala Gln His Ser Gln
435 440 445
Arg Ser Pro Pro Arg Cys Ser Gln Glu Ala Asn Ser Arg Lys Asp Asn
450 455 460
Ala Pro Phe Arg Val Val Glu
465 470
<210> 9
<211> 437
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 9
Gly Pro Phe Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Ser Trp Gly Ser Pro Val Thr Ile Trp Cys Gln Gly Ser Leu Glu Ala
20 25 30
Gln Glu Tyr Gln Leu Asp Lys Glu Gly Ser Pro Glu Pro Leu Asp Arg
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Asn Asn Pro Leu Glu Pro Lys Asn Lys Ala Arg Phe Ser Ile Pro Ser
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Met Thr Gln His His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys His Tyr Tyr Ser Ser
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Gly Pro Val Leu Ala Pro Gly Gln Ser Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser
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Asp Val Gly Tyr Asp Arg Phe Val Leu Tyr Lys Glu Gly Glu Arg Asp
225 230 235 240
Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala
245 250 255
Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Pro Ser His Gly Gly Gln Tyr Arg
260 265 270
Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp
275 280 285
Pro Leu Asn Ile Leu Met Ala Gly Gln Ile Tyr Asp Thr Val Ser Leu
290 295 300
Ser Ala Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu
305 310 315 320
Leu Cys Gln Ser Arg Gly Tyr Phe Asp Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu
325 330 335
Gly Ala Ala His Pro Pro Leu Arg Leu Arg Ser Met Tyr Gly Ala His
340 345 350
Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Ser Pro Val Thr Ser Ala His Ala
355 360 365
Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Tyr Ser Ser Asn Pro His Leu Leu
370 375 380
Ser Phe Pro Ser Glu Pro Leu Glu Leu Met Val Ser Ala Ser His Ala
385 390 395 400
Lys Asp Tyr Thr Val Glu Asn Leu Ile Arg Met Gly Met Ala Gly Leu
405 410 415
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420 425 430
Arg Asn Pro Gln Asp
435
<210> 10
<211> 338
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 10
Met Val Val Met Ala Pro Arg Thr Leu Phe Leu Leu Leu Ser Gly Ala
1 5 10 15
Leu Thr Leu Thr Glu Thr Trp Ala Gly Ser His Ser Met Arg Tyr Phe
20 25 30
Ser Ala Ala Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ala
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Ser Asp Gly Arg Leu Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Tyr Ala Tyr Asp Gly
130 135 140
Lys Asp Tyr Leu Ala Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Ala
145 150 155 160
Asp Thr Ala Ala Gln Ile Ser Lys Arg Lys Cys Glu Ala Ala Asn Val
165 170 175
Ala Glu Gln Arg Arg Ala Tyr Leu Glu Gly Thr Cys Val Glu Trp Leu
180 185 190
His Arg Tyr Leu Glu Asn Gly Lys Glu Met Leu Gln Arg Ala Asp Pro
195 200 205
Pro Lys Thr His Val Thr His His Pro Val Phe Asp Tyr Glu Ala Thr
210 215 220
Leu Arg Cys Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Ile Leu Thr
225 230 235 240
Trp Gln Arg Asp Gly Glu Asp Gln Thr Gln Asp Val Glu Leu Val Glu
245 250 255
Thr Arg Pro Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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Val Val Thr Gly Ala Ala Val Ala Ala Val Leu Trp Arg Lys Lys Ser
325 330 335
Ser Asp
<210> 11
<211> 358
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 11
Met Val Asp Gly Thr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Glu Ala Leu Ala Leu
1 5 10 15
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20 25 30
Val Ser Arg Pro Gly Arg Gly Glu Pro Arg Phe Ile Ser Val Gly Tyr
35 40 45
Val Asp Asp Thr Gln Phe Val Arg Phe Asp Asn Asp Ala Ala Ser Pro
50 55 60
Arg Met Val Pro Arg Ala Pro Trp Met Glu Gln Glu Gly Ser Glu Tyr
65 70 75 80
Trp Asp Arg Glu Thr Arg Ser Ala Arg Asp Thr Ala Gln Ile Phe Arg
85 90 95
Val Asn Leu Arg Thr Leu Arg Gly Tyr Tyr Asn Gln Ser Glu Ala Gly
100 105 110
Ser His Thr Leu Gln Trp Met His Gly Cys Glu Leu Gly Pro Asp Gly
115 120 125
Arg Phe Leu Arg Gly Tyr Glu Gln Phe Ala Tyr Asp Gly Lys Asp Tyr
130 135 140
Leu Thr Leu Asn Glu Asp Leu Arg Ser Trp Thr Ala Val Asp Thr Ala
145 150 155 160
Ala Gln Ile Ser Glu Gln Lys Ser Asn Asp Ala Ser Glu Ala Glu His
165 170 175
Gln Arg Ala Tyr Leu Glu Asp Thr Cys Val Glu Trp Leu His Lys Tyr
180 185 190
Leu Glu Lys Gly Lys Glu Thr Leu Leu His Leu Glu Pro Pro Lys Thr
195 200 205
His Val Thr His His Pro Ile Ser Asp His Glu Ala Thr Leu Arg Cys
210 215 220
Trp Ala Leu Gly Phe Tyr Pro Ala Glu Ile Thr Leu Thr Trp Gln Gln
225 230 235 240
Asp Gly Glu Gly His Thr Gln Asp Thr Glu Leu Val Glu Thr Arg Pro
245 250 255
Ala Gly Asp Gly Thr Phe Gln Lys Trp Ala Ala Val Val Val Pro Ser
260 265 270
Gly Glu Glu Gln Arg Tyr Thr Cys His Val Gln His Glu Gly Leu Pro
275 280 285
Glu Pro Val Thr Leu Arg Trp Lys Pro Ala Ser Gln Pro Thr Ile Pro
290 295 300
Ile Val Gly Ile Ile Ala Gly Leu Val Leu Leu Gly Ser Val Val Ser
305 310 315 320
Gly Ala Val Val Ala Ala Val Ile Trp Arg Lys Lys Ser Ser Gly Gly
325 330 335
Lys Gly Gly Ser Tyr Ser Lys Ala Glu Trp Ser Asp Ser Ala Gln Gly
340 345 350
Ser Glu Ser His Ser Leu
355
<210> 12
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 12
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Glu His
20 25 30
Thr Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Met Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 13
Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20 25 30
Gly Asp Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Asp Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 14
Glu His Thr Ile His
1 5
<210> 15
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 15
Trp Phe Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Met Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 16
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 16
His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 17
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 17
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Asp Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 18
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 18
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 19
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 19
Gln Gln Ser Asn Glu Glu Pro Trp Thr
1 5
<210> 20
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 20
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ala His
20 25 30
Thr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Ser Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr
100 105 110
Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 21
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 21
Asn Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly
20 25 30
Gly Ala Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Leu Thr Leu Asn Ile His
65 70 75 80
Pro Val Glu Glu Glu Asp Ala Ala Met Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Glu Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 22
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 22
Ala His Thr Ile His
1 5
<210> 23
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 23
Trp Leu Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Ile Lys Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Asp
<210> 24
<211> 8
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 24
His Thr Asn Trp Asp Phe Asp Tyr
1 5
<210> 25
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 25
Lys Ala Ser Gln Ser Val Asp Tyr Gly Gly Ala Ser Tyr Met Asn
1 5 10 15
<210> 26
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 26
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 27
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 27
Gln Gln Ser Asn Glu Glu Pro Trp Thr
1 5
<210> 28
<211> 122
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Arg Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Val His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Thr Ser Ser Lys Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Ile His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Glu Arg Tyr Asp Gly Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 29
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 29
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly
1 5 10 15
Glu Thr Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Gln Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Val
35 40 45
Tyr Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Arg Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Asn Ser Leu Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Phe Gly Thr Tyr Tyr Cys Gln His Phe Trp Asn Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 30
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 30
Ser Tyr Trp Val His
1 5
<210> 31
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 31
Val Ile Asp Pro Ser Asp Ser Tyr Thr Ser Tyr Asn Gln Asn Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 32
<211> 13
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 32
Gly Glu Arg Tyr Asp Gly Asp Tyr Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 33
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 33
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Asn Leu Ala
1 5 10
<210> 34
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 34
Ala Ala Thr Asn Leu Ala Asp
1 5
<210> 35
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 35
Gln His Phe Trp Asn Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 36
<211> 118
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 36
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Lys Pro Arg Trp Asp Asp Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 37
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 37
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 38
<211> 120
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 38
Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Leu Thr Cys Ser Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Gly
20 25 30
Tyr Tyr Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Glu Asn Lys Leu Glu Trp
35 40 45
Met Gly Tyr Ile Arg Tyr Asp Gly Ser Asn Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Asn Asn Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Ala Ser Lys Asn Gln Phe Phe
65 70 75 80
Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Trp Leu Leu Trp Phe Tyr Ala Val Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 39
<211> 112
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 39
Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Ile Val His Thr
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Ser Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Leu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly
85 90 95
Ser His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 40
<211> 117
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 40
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln
1 5 10 15
Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Ser Tyr
20 25 30
Gly Val Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu
35 40 45
Gly Val Ile Trp Gly Asp Gly Asn Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Ile
50 55 60
Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu
65 70 75 80
Lys Leu Asn Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg Thr Asn Trp Asp Gly Trp Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
100 105 110
Val Thr Val Ser Ala
115
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 41
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Asp Val Gly Thr Ala
20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asn Val Gln Ser
65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Asp Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Arg Ser Tyr Pro Leu
85 90 95
Gly Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 42
Asp Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Phe
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Asp Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Thr Gly Glu Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Val Lys Ala Ala Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Thr Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Ile Thr Val Ser Ser
115
<210> 43
<211> 107
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 43
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Val Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Ser Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105
<210> 44
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 44
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Ile His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Thr Asn Tyr Ser Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Glu Ala Ile Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 45
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 45
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 46
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 46
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr
20 25 30
Tyr Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Ser Ala Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Thr Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
115
<210> 47
<211> 111
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 47
Asp Ile Leu Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Ile Pro Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr
20 25 30
Gly Ile Ser Phe Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro
35 40 45
Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Ile Pro Ala
50 55 60
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn
65 70 75 80
Pro Val Glu Ala Asp Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn
85 90 95
Glu Asp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
100 105 110
<210> 48
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 48
Asn Tyr Tyr Ile Gln
1 5
<210> 49
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 49
Trp Ile Phe Pro Gly Asn Asn Glu Thr Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 50
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 50
Ser Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr
1 5 10
<210> 51
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 51
Arg Ala Ser Glu Ile Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 52
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 52
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 53
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 53
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
<210> 54
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 54
Ser Tyr Gly Val Ser
1 5
<210> 55
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 55
Ile Ile Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asn Tyr His Ser Ala Leu Val Ser
1 5 10 15
<210> 56
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 56
Pro Asn Trp Asp Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 57
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 57
Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn
1 5 10
<210> 58
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 58
Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser
1 5
<210> 59
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 59
Gln Gln Gly Ile Thr Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 60
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 60
Asn Tyr Tyr Met Gln
1 5
<210> 61
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 61
Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Ser Asn Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 62
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 62
Trp Ile Phe Pro Gly Ser Gly Glu Ser Ser Tyr Asn Glu Lys Phe Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 63
<211> 10
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 63
Thr Trp Asn Tyr Asp Ala Arg Trp Gly Tyr
1 5 10
<210> 64
<211> 15
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 64
Ile Pro Ser Glu Ser Ile Asp Ser Tyr Gly Ile Ser Phe Met His
1 5 10 15
<210> 65
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 65
Arg Ala Ser Asn Leu Glu Ser
1 5
<210> 66
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 66
Gln Gln Ser Asn Glu Asp Pro Phe Thr
1 5
<210> 67
<211> 233
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 67
Met Asp Asn Gln Gly Val Ile Tyr Ser Asp Leu Asn Leu Pro Pro Asn
1 5 10 15
Pro Lys Arg Gln Gln Arg Lys Pro Lys Gly Asn Lys Ser Ser Ile Leu
20 25 30
Ala Thr Glu Gln Glu Ile Thr Tyr Ala Glu Leu Asn Leu Gln Lys Ala
35 40 45
Ser Gln Asp Phe Gln Gly Asn Asp Lys Thr Tyr His Cys Lys Asp Leu
50 55 60
Pro Ser Ala Pro Glu Lys Leu Ile Val Gly Ile Leu Gly Ile Ile Cys
65 70 75 80
Leu Ile Leu Met Ala Ser Val Val Thr Ile Val Val Ile Pro Ser Thr
85 90 95
Leu Ile Gln Arg His Asn Asn Ser Ser Leu Asn Thr Arg Thr Gln Lys
100 105 110
Ala Arg His Cys Gly His Cys Pro Glu Glu Trp Ile Thr Tyr Ser Asn
115 120 125
Ser Cys Tyr Tyr Ile Gly Lys Glu Arg Arg Thr Trp Glu Glu Ser Leu
130 135 140
Leu Ala Cys Thr Ser Lys Asn Ser Ser Leu Leu Ser Ile Asp Asn Glu
145 150 155 160
Glu Glu Met Lys Phe Leu Ser Ile Ile Ser Pro Ser Ser Trp Ile Gly
165 170 175
Val Phe Arg Asn Ser Ser His His Pro Trp Val Thr Met Asn Gly Leu
180 185 190
Ala Phe Lys His Glu Ile Lys Asp Ser Asp Asn Ala Glu Leu Asn Cys
195 200 205
Ala Val Leu Gln Val Asn Arg Leu Lys Ser Ala Gln Cys Gly Ser Ser
210 215 220
Ile Ile Tyr His Cys Lys His Lys Leu
225 230
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 68
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 69
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 69
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 70
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 70
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 71
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 72
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 72
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser
115 120
<210> 73
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 73
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 74
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 74
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 75
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 75
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 76
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 76
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1 5 10 15
Ser Leu Arg Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ser Pro Ser Phe
50 55 60
Gln Gly His Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 77
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 77
Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Val Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Gln Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Glu Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr Asp Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Thr Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 78
<211> 452
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 78
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Thr Ser Thr Val Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe
100 105 110
Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr
115 120 125
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser
130 135 140
Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu
145 150 155 160
Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His
165 170 175
Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser
180 185 190
Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys
195 200 205
Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Arg Val Glu
210 215 220
Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu
225 230 235 240
Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu
245 250 255
Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser
260 265 270
Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu
275 280 285
Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
290 295 300
Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn
305 310 315 320
Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser
325 330 335
Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln
340 345 350
Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val
355 360 365
Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val
370 375 380
Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro
385 390 395 400
Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr
405 410 415
Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val
420 425 430
Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu
435 440 445
Ser Leu Gly Lys
450
<210> 79
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 79
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr
20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala
100 105 110
Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly
115 120 125
Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala
130 135 140
Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln
145 150 155 160
Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser
165 170 175
Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr
180 185 190
Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser
195 200 205
Phe Asn Arg Gly Glu Cys
210
<210> 80
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 80
Ser Tyr Trp Met Asn
1 5
<210> 81
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 81
Arg Ile Asp Pro Tyr Asp Ser Glu Thr His Tyr Ala Gln Lys Leu Gln
1 5 10 15
Gly
<210> 82
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 82
Gly Gly Tyr Asp Phe Asp Val Gly Thr Leu Tyr Trp Phe Phe Asp Val
1 5 10 15
<210> 83
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 83
Arg Ala Ser Glu Asn Ile Tyr Ser Tyr Leu Ala
1 5 10
<210> 84
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 84
Asn Ala Lys Thr Leu Ala Glu
1 5
<210> 85
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 85
Gln His His Tyr Gly Thr Pro Arg Thr
1 5
<210> 86
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 86
Ser His Ser Met Asn
1 5
<210> 87
<211> 17
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 87
Ala Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
1 5 10 15
Gly
<210> 88
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 88
Glu Glu Trp Gly Leu Pro Phe Asp Tyr
1 5
<210> 89
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 89
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 90
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 90
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Pro Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 91
<211> 11
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 91
Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asn Ser Ala Leu Ala
1 5 10
<210> 92
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 92
Asp Ala Ser Ser Leu Lys Ser
1 5
<210> 93
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 93
Gln Gln Phe Asn Ser Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 94
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 94
Asn Thr Tyr Ile His
1 5
<210> 95
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 95
Ile Asp Pro Ala Asn Ala Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 96
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 96
Tyr Arg Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ala Leu Gly Tyr
1 5 10
<210> 97
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 97
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Ala Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 98
<211> 7
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 98
Arg Met Ser Asn Leu Ala Ser
1 5
<210> 99
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 99
Met Gln His Leu Glu Tyr Pro Tyr Thr
1 5
<210> 100
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 100
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Thr Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 101
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 101
Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Tyr
1 5 10 15
<210> 102
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 102
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Lys Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 103
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 103
Tyr Gly Asn Tyr Leu Tyr Tyr Tyr Ser Leu Asp Tyr
1 5 10
<210> 104
<211> 5
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 104
Asn Thr Tyr Met His
1 5
<210> 105
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 105
Ile Asp Pro Ala Asp Gly Asp Thr Gln Tyr Ala Pro Lys Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 106
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 106
Tyr Gly Asn Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ser Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 107
<211> 16
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 107
Ile Asp Pro Ala Asn Gly Asp Thr Gln Tyr Asp Pro Lys Phe Gln Gly
1 5 10 15
<210> 108
<211> 12
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 108
Tyr Gly Asp Tyr Leu Phe Tyr Tyr Ser Leu Lys Tyr
1 5 10
<210> 109
<211> 9
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 109
Met Gln His Leu Glu Ser Pro Tyr Thr
1 5
<210> 110
<211> 119
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 110
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly
1 5 10 15
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
20 25 30
Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ser Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val
35 40 45
Ala Glu Ile Ser Ser Gly Gly Ser Tyr Thr Tyr Tyr Pro Asp Thr Val
50 55 60
Thr Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr
65 70 75 80
Leu Glu Ile Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg His Gly Asp Tyr Pro Arg Phe Phe Asp Val Trp Gly Ala Gly
100 105 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 111
<211> 106
<212> PRT
<213> 小家鼠（mus musculus）
<400> 111
Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Met Ser Ala Ser Pro Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Ile
20 25 30
Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Arg Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Gly Asn Pro Tyr Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 112
<211> 138
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 112
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly
20 25 30
Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly
35 40 45
Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu
50 55 60
Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro
65 70 75 80
Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr
85 90 95
Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu
100 105 110
Val Val Thr Gly Ala Gly Ala Leu Gln Ser Thr Ala Ser Leu Phe Val
115 120 125
Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser
130 135
<210> 113
<211> 141
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 113
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val
20 25 30
Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala
35 40 45
Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln
50 55 60
Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr
85 90 95
Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu
100 105 110
Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Gly Ala Leu Gln Ser Thr Ala Ser
115 120 125
Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser
130 135 140
<210> 114
<211> 139
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 114
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile
20 25 30
Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly
35 40 45
Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln
50 55 60
Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr
65 70 75 80
Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly
85 90 95
Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp
100 105 110
Ile Leu Ile Ala Gly Gln Gly Ala Leu Gln Ser Thr Ala Ser Leu Phe
115 120 125
Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser
130 135
<210> 115
<211> 348
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 115
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro
20 25 30
Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly
35 40 45
Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro
50 55 60
Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe
65 70 75 80
Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr
85 90 95
Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro
100 105 110
Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr
115 120 125
Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro
130 135 140
Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val
145 150 155 160
Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu
165 170 175
Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser
180 185 190
Thr Gln Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro
195 200 205
Glu Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp
210 215 220
Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu
225 230 235 240
Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln
245 250 255
Ala Val Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met
260 265 270
Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp
275 280 285
Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser
290 295 300
Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu
305 310 315 320
Arg Arg Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro
325 330 335
Ala Val Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His
340 345
<210> 116
<211> 239
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 116
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly
20 25 30
Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly
35 40 45
Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu
50 55 60
Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro
65 70 75 80
Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr
85 90 95
Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu
100 105 110
Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser
115 120 125
Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln
130 135 140
Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His
145 150 155 160
Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala
165 170 175
Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg
180 185 190
Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Gly Ala Leu Gln Ser Thr
210 215 220
Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser
225 230 235
<210> 117
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 117
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val
20 25 30
Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala
35 40 45
Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln
50 55 60
Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr
85 90 95
Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu
100 105 110
Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val
115 120 125
Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys
130 135 140
Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu
145 150 155 160
Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser
165 170 175
Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln
180 185 190
Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro
195 200 205
Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Gly Ala Leu Gln Ser
210 215 220
Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu Tyr Ser
225 230 235 240
<210> 118
<211> 447
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 118
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile
20 25 30
Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly
35 40 45
Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln
50 55 60
Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr
65 70 75 80
Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly
85 90 95
Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp
100 105 110
Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln
115 120 125
Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln
130 135 140
Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala
145 150 155 160
Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln
165 170 175
Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr
180 185 190
Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro
195 200 205
Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser
210 215 220
Ser Pro Thr Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro
225 230 235 240
Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His Leu
245 250 255
Gly Val Val Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Ile Leu Leu Leu Leu Leu
260 265 270
Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Arg Arg Gln Gly Lys His
275 280 285
Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys Ala Asp Phe Gln His Pro Ala Gly Ala
290 295 300
Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gln Trp Arg Ser Ser Pro
305 310 315 320
Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala Ala Val Lys His Thr
325 330 335
Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg Ser Pro His Asp Glu
340 345 350
Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Glu Val Lys His Ser Arg Pro Arg
355 360 365
Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser Gly Glu Phe Leu Asp
370 375 380
Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln Met Asp Thr Glu Ala
385 390 395 400
Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr Ala Gln Leu His Ser
405 410 415
Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala Thr Glu Pro Pro Pro Ser Gln Glu Gly
420 425 430
Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser Ile Tyr Ala Thr Leu Ala Ile His
435 440 445
<210> 119
<211> 338
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 119
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly
20 25 30
Ser Val Ile Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly
35 40 45
Gln Glu Thr Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu
50 55 60
Trp Ile Thr Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro
65 70 75 80
Ile Pro Ser Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr
85 90 95
Gly Ser Asp Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu
100 105 110
Val Val Thr Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser
115 120 125
Pro Val Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln
130 135 140
Val Ala Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His
145 150 155 160
Pro Gln Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala
165 170 175
Ile Phe Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg
180 185 190
Cys Tyr Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser
195 200 205
Asp Leu Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu
210 215 220
Ser Val Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu
225 230 235 240
Gln Cys Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp
245 250 255
Gly Glu Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly
260 265 270
Leu Ser Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly
275 280 285
Gly Gln Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser
290 295 300
Ala Pro Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Gly Ala Leu
305 310 315 320
Gln Ser Thr Ala Ser Leu Phe Val Val Ser Leu Ser Leu Leu His Leu
325 330 335
Tyr Ser
<210> 120
<211> 548
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 120
Thr Gly Val His Ser Gly Lys Pro Ile Pro Asn Pro Leu Leu Gly Leu
1 5 10 15
Asp Ser Thr Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val
20 25 30
Val Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala
35 40 45
Phe Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln
50 55 60
Cys Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe
65 70 75 80
Ser Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr
85 90 95
Ala Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu
100 105 110
Leu Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val
115 120 125
Gln Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys
130 135 140
Gly Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu
145 150 155 160
Arg Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser
165 170 175
Gln Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln
180 185 190
Tyr Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro
195 200 205
Ser Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val
210 215 220
Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val
225 230 235 240
Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr
245 250 255
Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln
260 265 270
Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala
275 280 285
His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr
290 295 300
Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro
305 310 315 320
Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly
325 330 335
Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly
340 345 350
Leu Gly Arg His Leu Gly Val Val Ile Gly Ile Leu Val Ala Val Ile
355 360 365
Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu Phe Leu Ile Leu Arg His Arg
370 375 380
Arg Gln Gly Lys His Trp Thr Ser Thr Gln Arg Lys Ala Asp Phe Gln
385 390 395 400
His Pro Ala Gly Ala Val Gly Pro Glu Pro Thr Asp Arg Gly Leu Gln
405 410 415
Trp Arg Ser Ser Pro Ala Ala Asp Ala Gln Glu Glu Asn Leu Tyr Ala
420 425 430
Ala Val Lys His Thr Gln Pro Glu Asp Gly Val Glu Met Asp Thr Arg
435 440 445
Ser Pro His Asp Glu Asp Pro Gln Ala Val Thr Tyr Ala Glu Val Lys
450 455 460
His Ser Arg Pro Arg Arg Glu Met Ala Ser Pro Pro Ser Pro Leu Ser
465 470 475 480
Gly Glu Phe Leu Asp Thr Lys Asp Arg Gln Ala Glu Glu Asp Arg Gln
485 490 495
Met Asp Thr Glu Ala Ala Ala Ser Glu Ala Pro Gln Asp Val Thr Tyr
500 505 510
Ala Gln Leu His Ser Leu Thr Leu Arg Arg Glu Ala Thr Glu Pro Pro
515 520 525
Pro Ser Gln Glu Gly Pro Ser Pro Ala Val Pro Ser Ile Tyr Ala Thr
530 535 540
Leu Ala Ile His
545
<210> 121
<211> 98
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 121
Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr
35 40 45
Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser
50 55 60
Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr
85 90 95
Gly Ala
<210> 122
<211> 137
<212> PRT
<213> 智人（Homo sapiens）
<400> 122
Phe Tyr Asp Arg Val Ser Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala
1 5 10 15
Ser Gly Glu Asn Val Thr Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln
20 25 30
Thr Phe Leu Leu Thr Lys Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu
35 40 45
Arg Ser Thr Tyr Gln Ser Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly
50 55 60
Pro Val Thr Ser Ala His Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln
65 70 75 80
Ser Ser Lys Pro Tyr Leu Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu
85 90 95
Val Val Ser Gly Pro Ser Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly Pro
100 105 110
Thr Ser Thr Ser Gly Pro Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser
115 120 125
Asp Pro Gln Ser Gly Leu Gly Arg His
130 135
<210> 123
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 123
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 124
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 124
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Phe Glu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 125
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 125
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 126
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 126
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Arg Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
180 185 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305 310 315 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
325 330
<210> 127
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 127
acaggcgtgc attcggggca cctccccaag cccac 35
<210> 128
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 128
cgaggtcggg ggatcctcaa tggtggtgat gatggtggtg ccttcccaga ccactctg 58
<210> 129
<211> 441
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 129
Gly His Leu Pro Lys Pro Thr Leu Trp Ala Glu Pro Gly Ser Val Ile
1 5 10 15
Thr Gln Gly Ser Pro Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly Gly Gln Glu Thr
20 25 30
Gln Glu Tyr Arg Leu Tyr Arg Glu Lys Lys Thr Ala Leu Trp Ile Thr
35 40 45
Arg Ile Pro Gln Glu Leu Val Lys Lys Gly Gln Phe Pro Ile Pro Ser
50 55 60
Ile Thr Trp Glu His Ala Gly Arg Tyr Arg Cys Tyr Tyr Gly Ser Asp
65 70 75 80
Thr Ala Gly Arg Ser Glu Ser Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Thr
85 90 95
Gly Ala Tyr Ile Lys Pro Thr Leu Ser Ala Gln Pro Ser Pro Val Val
100 105 110
Asn Ser Gly Gly Asn Val Ile Leu Gln Cys Asp Ser Gln Val Ala Phe
115 120 125
Asp Gly Phe Ser Leu Cys Lys Glu Gly Glu Asp Glu His Pro Gln Cys
130 135 140
Leu Asn Ser Gln Pro His Ala Arg Gly Ser Ser Arg Ala Ile Phe Ser
145 150 155 160
Val Gly Pro Val Ser Pro Ser Arg Arg Trp Trp Tyr Arg Cys Tyr Ala
165 170 175
Tyr Asp Ser Asn Ser Pro Tyr Glu Trp Ser Leu Pro Ser Asp Leu Leu
180 185 190
Glu Leu Leu Val Leu Gly Val Ser Lys Lys Pro Ser Leu Ser Val Gln
195 200 205
Pro Gly Pro Ile Val Ala Pro Glu Glu Thr Leu Thr Leu Gln Cys Gly
210 215 220
Ser Asp Ala Gly Tyr Asn Arg Phe Val Leu Tyr Lys Asp Gly Glu Arg
225 230 235 240
Asp Phe Leu Gln Leu Ala Gly Ala Gln Pro Gln Ala Gly Leu Ser Gln
245 250 255
Ala Asn Phe Thr Leu Gly Pro Val Ser Arg Ser Tyr Gly Gly Gln Tyr
260 265 270
Arg Cys Tyr Gly Ala His Asn Leu Ser Ser Glu Trp Ser Ala Pro Ser
275 280 285
Asp Pro Leu Asp Ile Leu Ile Ala Gly Gln Phe Tyr Asp Arg Val Ser
290 295 300
Leu Ser Val Gln Pro Gly Pro Thr Val Ala Ser Gly Glu Asn Val Thr
305 310 315 320
Leu Leu Cys Gln Ser Gln Gly Trp Met Gln Thr Phe Leu Leu Thr Lys
325 330 335
Glu Gly Ala Ala Asp Asp Pro Trp Arg Leu Arg Ser Thr Tyr Gln Ser
340 345 350
Gln Lys Tyr Gln Ala Glu Phe Pro Met Gly Pro Val Thr Ser Ala His
355 360 365
Ala Gly Thr Tyr Arg Cys Tyr Gly Ser Gln Ser Ser Lys Pro Tyr Leu
370 375 380
Leu Thr His Pro Ser Asp Pro Leu Glu Leu Val Val Ser Gly Pro Ser
385 390 395 400
Gly Gly Pro Ser Ser Pro Thr Thr Gly Pro Thr Ser Thr Ser Gly Pro
405 410 415
Glu Asp Gln Pro Leu Thr Pro Thr Gly Ser Asp Pro Gln Ser Gly Leu
420 425 430
Gly Arg His His His His His His His
435 440
<210> 130
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 130
acaggcgtgc attcggggca cctccccaag ccc 33
<210> 131
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 131
Cys Cys Gly Cys Cys Cys Cys Gly Ala Cys Thr Cys Thr Ala Gly Ala
1 5 10 15
Cys Thr Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Gly Gly Cys Cys Ala Gly Ala
20 25 30
Gly Thr Gly Gly
35
<210> 132
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 132
ccagaacaca ggatccgccg ccaccatggt ggtcatggcg ccc 43
<210> 133
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工（Artificial）
<220>
<223> 合成
<400> 133
ttttctaggt ctcgagtcaa tctgagctct tctttc 36

Claims (20)

1.一种结合人ILT-2多肽并中和ILT-2的抑制活性的抗体，所述抗体用于治疗癌症，其中所述治疗与中和人NKG2A多肽的抑制活性的抗体组合。
2.根据权利要求1所述的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体能够抑制ILT2多肽与在细胞的表面处表达的HLA-G和/或HLA-A2多肽之间的相互作用。
3.根据权利要求1或2所述的供使用的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体能够增强4小时体外51Cr释放细胞毒性测定中NK细胞的细胞毒性，在所述细胞毒性测定中，表达ILT2的NK细胞从人类供体纯化并且与在其表面处表达HLA-G多肽的靶细胞一起温育。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的供使用的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体不与野生型人ILT1、ILT4、ILT5或ILT6蛋白中的任何一种结合。
5.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述抗体结合以下：(i)由SEQ ID NO:110中所示的序列定义的所述ILT2多肽的氨基酸残基的区段内的表位；或(ii)由SEQ ID NO:111中所示的序列定义的所述ILT2多肽的氨基酸残基的区段内的表位。
6.根据前述权利要求中任一项所述的抗体，其中在每种情况下，相对于所述抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合，所述抗体与包括突变E34A、R36A、Y76I、A82S、R84L(参考SEQ ID NO:2)的突变体ILT2多肽的结合降低。
7.根据权利要求6所述的抗体，其中在每种情况下，相对于所述抗体与包括SEQ ID NO:2的氨基酸序列的野生型ILT2多肽之间的结合，所述抗体此外与以下的结合降低：
(a)包括突变G29S、Q30L、Q33A、T32A、D80H(参考SEQ ID NO:2)的突变体ILT2多肽；
(b)包括突变F299I、Y300R、D301A、W328G、Q378A、K381N(参考SEQ ID NO:2)的突变体ILT2多肽；
(c)包括突变W328G、Q330H、R347A、T349A、Y350S、Y355A(参考SEQ ID NO:2)的突变体ILT2多肽；和/或
(d)包括突变D341A、D342S、W344L、R345A、R347A(参考SEQ ID NO:2)的突变体ILT2多肽。
8.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中任选地与所述中和所述NKG2A多肽的抗体组合的所述结合ILT-2的抗体能够恢复NK细胞对被修饰成在其表面处表达HLA-G或HLA-A2多肽的靶细胞的细胞毒性，其中所述细胞毒性恢复到所述NK细胞对不表达所述HLA-G或HLA-A2多肽的亲本靶细胞的观察到的水平的至少60％、70％、80％或90％，如在4小时体外51Cr释放细胞毒性测定中确定的，在所述细胞毒性测定中，表达ILT2的NK细胞从人类供体中纯化并且与靶细胞一起温育。
9.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体包括抗体2H2A、48F12、3F5、26D8、18E1或27C10的重链和轻链CDR1、2和3。
10.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体是抗体2H2A、48F12、3F5、26D8、18E1和27C10或其功能保守变体。
11.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述结合ILT-2的抗体是具有IgG4同种型的人Fc结构域或Fc结构域的抗体，所述Fc结构域被修饰成降低所述Fc结构域与Fcγ受体之间的结合。
12.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述NKG2A中和剂是结合人NKG2A蛋白的抗体。
13.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述NKG2A中和剂是抑制HLA-E与NKG2A结合的抗体。
14.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述NKG2A中和剂是莫那利珠单抗或其功能保守变体。
15.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述抗体用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌，任选地NSCLC，肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌或卵巢癌。
16.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中所述治疗进一步与中和PD-1的抑制活性的抗体组合。
17.根据前述权利要求中任一项所述的供使用的抗体，其中治疗是针对患有特征在于在肿瘤细胞膜处没有PD-L1表达或PD-L1表达低的肿瘤的个体的。
18.一种药物组合物，其包括结合ILT-2的抗体和中和NKG2A的抑制活性的抗体。
19.一种用于增加对癌症患者的肿瘤的抗肿瘤活性的试剂盒，所述试剂盒包括：
(i)含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂和结合ILT-2的抗体的药物组合物；或者
(ii)含有结合ILT-2的抗体的第一药物组合物和含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂的第二药物组合物；或者
(iii)含有如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂的药物组合物和施用所述NKG2A中和剂与结合ILT-2的抗体的说明书；或者
(iv)含有结合ILT-2的抗体的药物组合物和施用所述结合ILT-2的抗体与如抗NKG2A抗体等NKG2A中和剂的说明书，
所述试剂盒适用于治疗有需要的患者的癌症。
20.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述试剂盒进一步包括用于治疗头颈鳞状细胞癌(HNSCC)、肺癌，任选地NSCLC，肾细胞癌、结直肠癌、尿路上皮癌或卵巢癌的说明书。
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