NO346624B1

NO346624B1 - Monoklonale antistoff mot NKG2A

Info

Publication number: NO346624B1
Application number: NO20073063A
Authority: NO
Inventors: Pascale Andre; Alessandro Moretta; Emanuela Marcenaro; François Romagne
Original assignee: Univ Di Genova; Innate Pharma Sa
Priority date: 2004-12-28
Filing date: 2005-12-27
Publication date: 2022-11-07
Also published as: AU2005321017B2; US10160810B2; DK2476705T3; RU2481356C2; AU2005321017A2; CA2591059A1; EP2476705A1; US20090208416A1; US20110229486A1; HUE026688T2; FI1831258T4; ES2557587T3; IL184152A; CN102977213B; HUE026107T2; US8993319B2; RU2007129033A; US20150125464A1; CN102977213A; PT1831258E

Description

Område for oppfinnelsen

Den foreliggende beskrivelsen vedrører monoklonale antistoff og fragmenter derav rettet mot NK celleoverflatereseptor NKG2A, og likeledes fremgangsmåter for å produsere og evaluere slike antistoffer. De monoklonale antistoff og fragmenter derav er nyttige i behandling av immunforstyrrelser, spesielt autoimmune forstyrrelser, og likeledes andre sykdommer som krever modulert NK cellefunksjon.

Generelt, foreliggende fremgangsmåte involverer anvendelse av antistoffene og fragmentene derav for å hindre stimulering av NKG2A-reseptorer på NK-celler, som fører til lysering av HLA-E- eller Qa1- utrykkende celler, så som dendritiske celler eller aktiverte T-celler, som bidrar til patologien av forstyrrelsene som skal behandles.

Mer spesifikt angår foreliggende oppfinnelse en monoklonalt antistoff eller et fragment derav, en sammensetning som omfatter en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, en sammensetning som omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, en in vitro fremgangsmåte for å detektere binding av et antistoff til NKG2A, og en fremgangsmåte for å produsere et antistoff egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker

Bakgrunn

Å opprettholde effektiv immunoverlevelse uten å fremkalle autoimmune reaksjoner krever presis titrering av effektor T-celle responser. Autoimmune forstyrrelser oppstår idet immunsystemet setter opp en immunrespons mot selv-antigener (se for eksempel Ludewig et al. (1999) Immunol Rev. 169:45-54). Idet mekanismene som er involvert i utløsing og opprettholdelse av autoimmune reaksjoner er uklare, er det sannsynlig at fremkomst av tidligere immunologisk ignorerte antigener i sekundære lymfoide organer er involvert.

Dendritiske celler er benmargavledete antigenpresenterende celler (APCer) som spiller en nøkkelrolle i immunresponsen (se for eksempel O ́Neill et al. (2004) Blood 104:2235-2246). DCer internaliserer bakterier, virus, døende celler og forskjellige komplekse molekyler gjennom fagocytose, endocytose og pinocytose. Inkorporerte proteiner brytes ned i peptider, som deretter presenteres på DC-celleoverflaten sammen med MHC klasse I og klasse II molekyler. Antigener lastet på MHC klasse I er typisk avledet fra endogene proteiner og gjenkjennes av CD8+ T-celler, mens MHC klasse II lastete antigen er generelt avledet fra ytre proteiner og gjenkjennes av CD4 T-celler. Etter antigenfanging vil umodne DC-celler modne for å danne modne DC som viser redusert fagocytose, migrerer til lymfoid vev, og ha øket T-celle stimuleringskapasitet.

I lymfoide vev vil DCer påvirke naive T-celler, stimulere deres klonale ekspansjon og differensiering, og kan også interagere med B-celler og celler av det naturlige immunsystem, inkluderende NK-celler. Aktiverte NK-celler kan drepe umodne, men ikke modne, DC-celler. Idet antigentransport og primær sensitisering av T-lymfocytter hovedsakelig medieres av antigenpresenterende dendritiske celler er det sannsynlig at ikke hensiktsmessig presentering av selv-antigener av dendritiske celler bidrar i det minste delvis til autoimmune forstyrrelser.

Naturlige drepeceller (NK) er en subpopulasjon av lymfocytter involvert i ikkekonvensjonell immunitet. NK-celler tilveiebringer en effektiv immunoverlevelsesmekanisme hvorved uønskede celler så som tumor- eller virusinfiserte celler kan elimineres. NK celleaktivitet reguleres av en kompleks mekanisme som involverer både aktiverende og inhibitoriske signaler (se for eksempel Moretta et al.) (2001) Annu Rev Immunol 19:197-223; Moretta et al. (2003) EMBO J EPub Dec 18;

Ravetech et al. (2000) Science 290:84-89; Zambello et al. (2003) Blood 102:1797-805; Moretta et al. (1997) Curr Opin Immunol 9:694-701; hvis hele beskrivelser heri inkorporeres med henvisning).

Flere distinkte NK-spesifikke reseptorer har blitt identifisert som spiller viktige funksjoner i NK cellemediert gjenkjenning og dreping av HLA klasse I manglende målceller. Disse reseptorer, benevnt NKp30, NKp46, og NKp44 er medlemmer av Igsuperfamilien. Deres kryssbinding, indusert av spesifikke mAb-er fører til en sterk NK celleaktivering noe som resulterer i øket intracellulær Ca<++ >- nivåer, utløser cytotoksisitet og lymfokin frigivelse. Viktig, mAb-mediert aktivering av NKp30, NKp46 og/eller NKp44 resulterer i en aktivering av en NK-cytotoksisitet mot mange typer målceller. Disse funn tilveiebringer bevis for en sentral funksjon av disse reseptorer i naturlig cytotoksisitet.

NK- celler er negativt regulert av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I – spesifikke inhibitoriske reseptorer (Kärre et al. (1986) Nature 319:675-8; Ohlen et al, (1989) Science 246:666-8). Disse spesifikke reseptorer binder til polymorfe determinanter av hovedhistokompatibilitetskompleks (MHC) klasse I molekyler eller HLA og inhiberer naturlige drepe (NK) celle lysering. I mennesker kan visse medlemmer av en familie av reseptorer benevnt drepe Ig- lignende reseptorer (KIRer) gjenkjenne grupper av HLA klasse I alleler (se for eksempel Yawata et al. (2002) Crit Rev Immunol 22:463-82; Martin et al. (2000) Immunogenetics.51:268-80; Lanier (1998) Annu Rev Immunol.16:359-93; hvis fullstendige beskrivelse heri inkorporeres med henvisning

En annen viktig inhibitorisk reseptor på NK-celler er CD94-NKG2A, som interagerer med det ikke- klassiske MHC klasse I molekyl HLA-E (Se for eksempel Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (1999) Immunol 162:305-313; Miller et al. Immunol (2003) 171:1369-75; Brooks et al. (1997) J Exp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302-4311; U.S. patent søknad nr.20030095965; hvis hele beskrivelse inkorporerer seg med referanse). Noen av disse reseptorer har kapasitet til å modulere terskelverdier av T-celle antigen reseptoravhengig T- celle aktivering. I sjeldne fravær av inhibitoriske reseptorer kan de aktiverende isoformer øke T- celle effektorfunksjoner og bidra til autoimmun patologi. Aminosyresekvensen av NKG2A varierer blant pattedyr, inkluderende blant primater.

For eksempel, versjoner i menneske og rhesus ape av NKG2A- proteinet deler mindre enn 90 % identitet, inkluderende 86 % i ligandbindingsdomenet.

Anstrengelser mot terapeutika for å modulere NKG2A, i hovedsak for å hindre informasjon, har fokusert på studie av de ikke- klassiske MHC klasse I molekyler, HLA-E for human reseptor og Qa-1b for musereseptor. For celleoverflate ekspresjon binder disse MHC- molekyler fortrinnsvis peptider avledes fra signalpeptidene av andre MHC klasse I molekyler. Ekspresjonen av andre klasse I MHC molekyler kan regulere ekspresjon av HLA-E, og dermed muliggjøre at NK- celler kan monitorere tilstanden til MHC klasse I avhengig antigen presenterende reaksjonsvei i potensielle målceller. Nivået av celleoverflate HLA-E er kritisk for NK- cellecytotoksisiteten mot tumor og viralt infiserte celler. Terapeutiske strategier for å modulere HLA-E – ekspresjon eller funksjon har generelt vært rettet mot anvendelse av HLA-I eller HSP60- peptider for å indusere en beskyttende tilstand for å hindre informasjon slik at NK- celler ikkeaktiveres.

US Patent publikasjon 20030095965 beskriver et antistoff, 3S9, som binder til NKG2A, NKG2C og NKG2E. Det påstås at 3S9 forårsaker kryssbinding av disse reseptorer og ledsagende inhibering av NK cellemediert lysering. Felleseid PCT patent publikasjon WO 2005/105849 beskriver anvendelse av et antistoff som spesifikt binder til en NK- reseptor, inkluderende NKG2A, for å behandle en pasient som lider fra NK- type lymfoproliferativ sykdom av granulære lymfocytter (NK-LDGL). Slike antistoff inhiberer NK celleaktivitet.

Monoklonale antistoff har vist seg å være enormt nyttige for diagnose og behandling av forskjellige sykdommer. Terapeutiske monoklonale antistoff kan fungere gjennom forskjellige mekanismer. Noen antistoff, så som Rituxan, gjenkjenner antigenet (CD20 i tilfelle av Rituxan) foreliggende på overflaten av patologiske celler, som for eksempel tumorceller, og virker ved å dirigere immunsystemet til å ødelegge de gjenkjente celler. Andre antistoff, så som Bexxar, Oncolym, eller Zevalin er koblet til radioisotoper, kjemoterapeutiske midler eller toksiner, som fører til direkte dreping av celler som er bindet av antistoffene.

Ytterligere, så som Basiliximab og Daclizumab (som blokkerer IL-2), det IgE-blokkerende Omalizumab og Efaluzimab, fungerer ved blokkering av aktiviteten av spesifikke proteiner. Antistoffbaserte terapier er godt kjent innen fagfeltet og en oversikt er gitt for eksempel i Gatto (2004) Curr Med Chem ANti- Canc Agents 4(5):411-4, Casadevall et al. (2004) Nat Rev Microbiol.2(9):695-703, Hinoda et al. (2004) Cancer Sci.95(8):621-5, Olszewski et al. (2004) Sci STKE. Jul 06(241):pe30, Coiffier (2004) Hematol J. Suppl 3:S154-8, Roque et al. (2004) Biotechnol Prog.20(3):639-54, hvis hele beskrivelser av hver inkorporeres heri med henvisning.

Før antistoff kan anvendes som terapeutiske applikasjoner i mennesket, eller gå inn i kliniske forsøk, må de gjennom prekliniske forsøk i ikke- mennesker for å undersøke forskjellige parametere så som deres toksisitet, in vivo effektivitet, biotilgjengelighet, halveringstid og forskjellige andre farmakokinetiske og farmakodynamiske parameter. Slike analyser utføres typisk i pattedyr, og fortrinnsvis hvor de har biologisk aktivitet, det vil si hvor mAb reagerer med homologmolekylet i arten, det vil si der hvor man fant forventet den største fysiologiske likhet til mennesker. Imidlertid, studier av ikke humane primater kan svekkes dersom et antistoff rettet mot et humant protein ikke binder til det ikke- humane dyr homolog av målproteinet.

Dersom kryssreaktivitet foreligger, i motsetning, kan ikke bare in vivo effektivitet av antistoffet testes i dyret, men også andre forhold så som bieffekter, toksisitet eller konetiske egenskaper som er relatert til binding av antistoffet til målproteinet kan studeres. Eksempler på lett tilgjengelige primater inkluderer New World aper og Old World aper, så som Cynomolgus apen (Macaca mulatta), rhesus macaquen (Macacus mulatta), den afrikanske grønne ape (Chlorocebus aethiops), silkeapen (Callithrix jacchus), saïmiri (Saimiri sciuresus), alle tilgjengelig fra ”Centre de Primatoligie” (CDP : ULP; Fort Foch, 67207 Niederhausbergen, France), og bavianen (Papio hamadryas) tilgjengelig fra ”Station de Primatologie du CNRS”, CD56, 13790 Rousset/Arc, France).

Sjimpanser og aper generelt kan også anvendes for å teste et kandidatmedikament, selv om slike forhold er sjeldne og generelt kun idet ingen andre alternativ for testing eksisterer eller har blitt utviklet.

Idet antistoff binder til spesifikke tredimensjonale egenskaper i deres mål kan små forandringer i aminosyresekvens av et målprotein hindre total binding, noe som gjør at det ikke er predikerbart om et gitt antistoff rettet mot et protein fra en art også vil binde til homologe proteiner som deler noe men ikke fullstendig sekvensidentitet. Mange forhold har blitt beskrevet hvor antistoff rettet mot et humant protein, for eksempel ikke binder til homologer i også nært beslektete arter. For eksempel, noen antistoff mot humant CD4 protein binder ikke til apehomologer, selv om mennesker og rhesus aper CD4 proteiner deler nær opp til 94 % identitet (se for eksempel Genbank Ids GI:116013 og 20981680; Sharma et al). (2000) JPET 293:33-41, 2000, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning). Andre eksempler inkluderer noen antistoff mot human CD3, et bredt ettersøkt farmasøytisk mål mot antistoffutvikling; antistoff, for eksempel UCHT2, som ellers har egenskaper som er egnet for utvikling kryssreagerer ikke med ape CD3 protein.

I lys av betydningen og alvorligheten av mange autoimmune forstyrrelser, og funksjonen til modne dendritiske celler i å koordinere immunrespons mot selvantigener er det et stort behov innen fagfeltet for nye og effektive terapier som modulerer aktiviteten eller nivåer av dendritiske celler som undergår slike forstyrrelser. Videre, der er et behov for terapier mot forstyrrelser karakterisert av avvikende celler (for eksempel visse cancer- eller viralt infiserte celler) som er i stand til å skjerme seg selv fra distribusjon av immunsystemet. Til slutt er der et behov for å finne en gyldig in vivo testsystem for det terapeutiske potensialet i mennesker av monoklonale antistoff mot NKG2A. Foreliggende oppfinnelse undersøker disse og andre behov.

Sammendrag av oppfinnelsen

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer monoklonale antistoff og fragmenter derav rettet mot NKG2A- reseptoren. De monoklonale antistoff og fragmenter derav kan enten inhibere evnen av NK- celler til å lysere normalt mottagelige målceller (”NK- celle inhibitoriske antistoff”) eller rekonstituere evnen av NK- celler til å lysere ellers beskyttete målceller, (”NK- celleaktiverende antistoff”). Funksjonen av de monoklonale antistoff og fragmenter derav ifølge oppfinnelsen er avhengig av deres evne til å binde til en Fc- reseptor.

Fc- reseptorer, så som Fc gamma reseptorer uttrykkes på overflaten av leukocytter. Disse reseptorer binder til Fc- delen av immunoglobulin (Ig), for eksempel Fc gammareseptorer binder til Fc delen av IgG. Denne binding fungerer for å bidra til immunfunksjon ved å koble gjenkjenningen av antigenet av antistoff med cellebaserte effektormekanismer. Forskjellige immunoglobulin klasser utløser forskjellige effektormekanismer gjennom differensiel interaksjon av immunoglobulin Fc regioner med spesifikke Fc- reseptorer (FcRer) på immunceller. Aktivering av Fc gamma reseptorer inkluderer Fc gamma RII-A. Fc gamma RII-C og Fc gamma RIII-A. Fc gamma RII-B vurderes som en inhibitorisk Fc gamma reseptorer. (For en oversikt se for eksempel Woof et al. (2004) Nat Rev Immunol.4(2):89-99; Baumann et al. (2003) Arch Immunol Ther Exp (Warsz) 51(6):399-406; Pan et al. (2003) Chin Med J (Engl) 116(4):487-94; Takai et al. (1994) Cell 76:519-529; Ravetch et al. (2001) Annu Rev Immunol 19:275-290, hvor beskrivelsene av hver av disse inkorporeres heri med henvisning).

Uten å være bundet av teori antar oppfinnerne at nærvær av en Fc- reseptor bindingsregion i antistoffene og fragmentene ifølge oppfinnelsen forårsaker inhibering av NK- cellelysering i nærvær av en celle som bærer en Fc- reseptor. De antistoff og fragmenter som mangler en Fc- reseptorbindingsregion er i stand til rekonstituering av NK cellelysering av målceller som bærer HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate. Slike målceller er typisk beskyttet gjennom NK- cellelysering gjennom interaksjon av HLA-E eller Qa1med NKG2A- reseptoren.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sammensetninger som omfatter antistoffene og fragmentene ifølge oppfinnelsen, og likeledes terapeutiske fremgangsmåter som nytter slike sammensetninger for å behandle forskjellige sykdommer og forstyrrelser.

Oppfinnelsen tilveiebringer videre fremgangsmåter for anvendelse av ikke humane primater for å undersøke og karakterisere aktiviteten, toksisiteten og egnete doseringsregimer av et antistoff eller fragment derav mot human NKG2A.

Således, i et aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, karakterisert ved:

a. spesifikk binding til NKG2A, hvor antistoffet eller fragmentet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549; b. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

d. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angående et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, omfatter nevnte antistoff en mus eller human IgG1-region som har blitt modifisert for å hindre binding til en Fc-reseptor.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, omfatter nevnte antistoff en human IgG4 konstant region.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er IgG4 konstant region modifisert med erstatning av serin ved aminosyreposisjon 228 med prolin.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er målcellen en human celle valgt blant dendrittcelle, en cancercelle, en viralt infisert celle.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er nevnte monoklonalt antistoff eller et fragment derav et humant, kimerisk eller humanisert monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

Fortrinnsvis, det monoklonale antistoff eller fragment binder ikke til andre humane NKG2- reseptorer, spesifikt de aktiverende reseptorer NKG2C eller NKG2E. Enda mer foretrukket er at antistoffet eller fragmentet ifølge oppfinnelsen fullstendig konkurrerer med et anti NKG2 monoklonalt valgt blant Z119 eller Z270.

I en foretrukket utførelse er det monoklonale antistoff eller et fragment derav i stand til å binde til en ikke human primat NKG2A. Enda mer foretrukket er at ved binding til NKG2A på et ikke humant primat NK- celle har det monoklonale antistoff eller et fragment derav evne til å rekonstruere lysering av en målt ikke- human primat celle som bærer HLA-E på målcelle overflaten, idet nevnte målcelle settes i kontakt med nevnte NK- celle.

I en ytterligere foretrukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff eller et fragment derav aminosyresekvensen av den variable tungkjederegion av Z270 eller den variable lettkjederegion av Z270. I en alternativt foretrukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff eller et fragment derav aminosyresekvensen av den variable tungkjederegion av Z199 eller den variable lettkjederegion av Z199.

I en ytterligere foretrukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff eller et fragment derav en IgG1 konstant region fra mus eller menneske som har blitt modifisert for å hindre binding til en Fc- reseptor, eller en human IgG4 konstant region.

I en ytterligere utførelse er antistoffet eller fragmentet kimerisk eller humanisert. Mer foretrukket er et antistoff eller fragment derav som omfatter ch270VK eller ch270VH.

I en annen utførelse er antistoffet eller fragmentet derav derivatisert for å øke dets biotilgjengelighet eller stabilitet in vivo. I en annen utførelse er antistoffet derivatisert med PEG.

De aktiverende antistoff og fragmenter ifølge oppfinnelsen er nyttige for å rekonstituere lysering av visse målceller som normalt er resistente til NK celle mediert lysering. Således, i denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for rekonstituering av NK cellemediert lysering av en målcelle i en populasjon omfattende en NK- celle og nevnte målcelle, hvor nevnte NK- celle er karakterisert ved NKG2A på dets overflate, og nevnte målcelle er karakterisert ved nærvær av HLA-E eller Qa1på dets overflate, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnet å sette nevnte NK- celle i forbindelse med et monoklonalt antistoff eller et fragment beskrevet over. Fortrinnsvis, målcellen er en human celle. Mer fortrinnsvis, målcellen er en dendritt celle (”DC”), en cancer celle eller en viralt infisert celle. Mest fortrinnsvis, målet er en moden dendrittisk celle (”mDC”).

Det aktiverende antistoff og fragmenter derav kan formuleres i sammensetninger som ytterligere omfatter en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient. Slike sammensetninger kan formuleres slik at de er egnet for farmasøytisk administrering. De farmasøytiske sammensetninger kan valgfritt omfatte et andre terapeutisk middel som er nyttig for den bestemte sykdom eller tilstand som behandles. Alle slike sammensetninger er også del av foreliggende oppfinnelse.

De aktiverende antistoffs sammensetninger ifølge oppfinnelsen kan benyttes for å behandle eller hindre i en pasient en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse, eller en immunrespons; eller for å behandle i en pasient en cancer som er karakterisert med et nærvær av en cancercelle som uttrykker HLA-E eller Qa1på dets overflate, eller en viral sykdom karakterisert ved nærvær av en viral infisert celle som utrykker HLA-E eller Qa1på dets overflate.

Disse fremgangsmåter kan ytterligere omfatte trinnet å administrere til pasienten et andre terapeutisk middel som er nyttig for den bestemte sykdom eller tilstand som behandles. Det andre terapeutiske middel kan administreres enten som en separat doseringsform eller som del av nevnte sammensetning.

I en andre utførelse er det andre terapeutiske middel i sammensetningen omfattende fremgangsmåtene som anvender et aktiverende antistoff eller fragment ifølge oppfinnelsen en forbindelse som agoniserer en aktivering av en NK- celle reseptor så som NKp30, NKP44 og NKp46. I en annen utførelse er det andre terapeutiske middel en antagonist av en inhibitorisk NK- celle reseptor, så som en inhibitor KIR reseptor. I en ytterligere utførelse er det andre terapeutiske middel en antagonist av TGF- beta 1. I en ytterligere utførelse er det andre terapeutiske middel valgt blant gruppen omfattende en cytokin inhibitor, en hematopoetisk vekstfaktor, en smertelindrer, insulin, et antiinflammatorisk middel og en imunnosupressant. I en ytterligere utførelse er det andre terapeutiske middel en anti-cancer forbindelse eller et anti emetikum. I en ytterligere utførelse er det andre terapeutiske middel en antiviral forbindelse.

I en ytterligere utførelse er den autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelse som skal hindres eller behandles valgt blant gruppen omfattende autoimmun hemolytisk anemi, pernisiøs anemi, polyarteritt nodosa, systemisk lupus erytematøs, Wegeners granulomatose, Alzheimers sykdom, autoimmun hepatitt, Behçets sykdom, Crohns sykdom, primær bilar skrumplever, skleroderma, ulserøs kolitt, Sjögren ́s syndrom, Type I diabetes mellitus, uveitis, Graves ́ sykdom, thyroiditt, Type I diabetes mellitus, myokarditt, reumatisk feber, skleroderma, ankylosing spondilitt, reumatoid artritt, glomerulonefrititt, sarkoidose, dermatomyositt, myastenia gravis, polymyositt, Guillian-Barré syndrom, multippel sklerose, alopesi areata, pemfigus/pemfigoid, psoriasis og vitiligo.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet et inhibitorisk monoklonalt antistoff eller et inhibitorisk fragment derav karakterisert ved: a) spesifikk binding til NKG2A; b) spesifikk binding til en Fc- reseptor; c) ikke binding til NKG2C eller NKG2E; d) fullstendig konkurranse med X270 eller Z119; e) binding i stand til å inhibere NK cellelysering av en NK cellemottagelig målcelle, hvor nevnte kryssbindende monoklonale antistoff ikke er Z199. I en foretrukket utførelse er det inhibitoriske antistoff ytterligere karakterisert med binding til ikke human primat NKG2A.

I en mer foretrukket utførelse omfatter det inhibitoriske antistoff eller fragment derav en aminosyresekvens av variabel lettkjederegion av Z270 eller en aminosyresekvens av variabel tungkjederegion av Z270. I en mest foretrukket utførelse er antistoffet Z270.

I en ytterligere foretrukket utførelse er det inhibitoriske antistoff eller fragment kimerisk eller humanisert. Mer foretrukket er et inhibitorisk antistoff eller inhibitorisk fragment derav som omfatter ch270VK eller ch270VH. I en ytterligere mest foretrukket utførelse er antistoffet chZ270 eller Z270.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning, karakterisert ved at nevnte sammensetning omfatter en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, er nevnte sammensetning for anvendelse som et medikament.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient, er nevnte sammensetning for anvendelse i behandling av en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse i en pasient.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, karakterisert ved:

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

d. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle,

for anvendelse i behandling av en inflammatorisk eller autoimmun forstyrrelse.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er den autoimmune forstyrrelse reumatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt eller multiple sklerose.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, kombineres sammensetningen med et andre terapeutisk middel valgt blant: et immunundertrykkende middel, et kortikosteroid, en TNF-inhibitor, en inhibitor av TGF beta 1, en cytokin inhibitor, en hematopoietisk vekstfaktor, et smertelindrende middel, eller et anti-inflammatorisk middel, hvor nevnte andre terapeutiske middel administreres enten som en separat doseringsform eller som del av nevnte sammensetning.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er den effektive mengde mellom 0,5 mg/kg og 20 mg/kg.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, omfatter nevnte monoklonale antistoff eller fragment;

- en tungkjede omfattende komplementærbestemmende region 1 (CDR1), CDR2 og CDR3 av den variable tungkjederegion av antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549;

- en lettkjede omfattende komplementærbestemmende region 1 (CDR1), CDR2 og CDR3 av den variable lettkjederegion av antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549.

I en ytterligere utførelse av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, omfatter nevnte antistoff eller fragment derav en human IgG4 konstant region.

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

for anvendelse til å indusere toleranse til et antigen i en pasient, hvor sammensetningen anvendes i kombinasjon med et antigen.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er nevnte sammensetning for anvendelse i behandling av en autoimmun sykdom eller allergi.

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

for anvendelse i å forbedre innpodning av hematopoietiske celler i en pasient.

I en utførelsesform av oppfinnelsen angående en sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, er nevnte antistoff eller fragment derav et humant, kimerisk eller humanisert monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en in vitro fremgangsmåte for å detektere binding av et antistoff til NKG2A omfattende trinnene:

a. sette et konjugat i forbindelse med et NKG2A-inneholdende materiale, hvor konjugatet omfatter:

et antistoff eller et fragment derav karakterisert ved:

i. spesifikk binding til NKG2A, hvor antistoffet eller fragmentet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549; ii. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

iii. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor;

iv. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle, og en detekterbar markør og

b. kvantifisere mengden av detekterbar markør bundet til nevnte NKG2A-inneholdende materiale;

c. sette nevnte konjugat og nevnte antistoff i forbindelse med nevnte NKG2A-inneholdende materiale;

d. kvantifisere mengden av detekterbar markør bundet til nevnte NKG2A-inneholdende materiale i nærvær av nevnte antistoff;

e. sammenligne mengden av detekterbart materiale kvantifisert i trinn b med mengden kvantifisert i trinn d for å bestemme om nevnte antistoff binder til nevnte NKG2A-inneholdende materiale.

I et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å produsere et antistoff egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker, hvor fremgangsmåten omfatter:

a. immunisere et ikke-humant pattedyr med en sammensetning omfattende humant NKG2A;

b. velge et monoklonalt antistoff karakterisert ved;

i. spesifikt binder til NKG2A, hvor antistoffet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549; ii. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

iii. ikke binder, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor;

iv. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle,

c. gjøre nevnte antistoff egnet for bruk i mennesker;

d. administrere nevnte antistoff til en ikke-human primat; og

e. evaluere evnen av nevnte antistoff til å binde til NKG2A in vivo i nevnte primat, og toleransen av nevnte primat for nevnte antistoff;

hvor en bestemmelse av om nevnte antistoff binder til og tolereres av nevnte ikkehumane primat indikerer at nevnte antistoff er egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet en sammensetning omfattende en effektiv mengde av et inhibitorisk antistoff eller inhibitorisk fragment derav som beskrevet over, eller Z199; og en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient.

Disse inhibitoriske antistoffs sammensetninger er fortrinnsvis formulert for farmasøytisk anvendelse.

Det inhibitoriske antistoffs sammensetning omfatter valgfritt et andre terapeutisk middel nyttig for å behandle en sykdom eller tilstand karakterisert med uønsket NK cellemediert lysering av andre celler, hyperaktiv NK celleaktivitet, eller uønsket NK celleproliferasjon.

Slike andre terapeutiske midler kan velges fra, for eksempel, et cytokin, en anticancer forbindelse (så som en kjemoterapeutisk forbindelse, en anti-angiogenisk forbindelse, en apoptose fremmende forbindelse, et hormonmiddel, en forbindelse som interfererer med DNA- replikasjon, mitose og/eller kromosomal segregering, eller et middel som ødelegger syntese og presisjon av polynukleotid forløpere), en adjunkt forbindelse, en forbindelse i stand til å simulere en inhibitorisk NK celle reseptor, (så som naturlige ligander, antistoff eller småmolekyler som kan stimulere aktiviteten av CD94/NKG2A- reseptorer, eller en inhibitorisk KIR reseptor så som KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1 og KIR3DL2), eller en inhibitor av en aktiverende NK celle reseptor, (så som NKp30, NKp44 eller NKp46).

De inhibitoriske antistoff og fragmenter kan benyttes i en fremgangsmåte for å redusere NK cellemediert dosering av celler. Alternativt, det inhibitoriske antistoff og fragmenter kan benyttes i en fremgangsmåte for redusere antallet NK- celler i en cellepopulasjon. Begge disse fremgangsmåter omfater trinnet å sette nevnte NK-celle i kontakt med det inhibitoriske monoklonale antistoff eller fragment.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet farmasøytisk egnete sammensetningene som omfatter inhibitorisk antistoff og kan benyttes i en fremgangsmåte for å behandle eller hindre en pasient som lider av en tilstand eller forstyrrelse karakterisert ved uønsket NK cellemediært lysering av andre celler, hyperaktiv NK celleaktivitet, eller uønsket NK proliferasjon, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnet å administrere til pasienten nevnte sammensetning. En slik tilstand er NK-LDGL. NK-LDGL (NK type lymfoproliferativ sykdom av granulære lymfocytter; alternativt benevnt NK-LGK) refererer til en klasse proliferative forstyrrelser som forårsakes av klonal ekspansjon av NK- celler eller NK- lignende celler, det vil si store granulære lymfocytter som viser en karakteristisk kombinasjon av overflate antigen ekspresjon (for eksempel CD3-, CD56+, CD16+, etc, se for eksempel Loughran (1993) Blood 82:1).

I en alternativ utførelse kan enhver av fremgangsmåtene benytte et inhibitorisk antistoff å omfatte det ytterligere trinn å administrere til nevnte pasient et andre terapeutisk middel. Det andre terapeutiske middel er et middel som normalt anvendes for å behandle en sykdom eller tilstand karakterisert med uønsket NK cellemediert lysering av andre celler, hyperaktiv NK celleaktivitet, eller uønsket NK celleproliferasjon. Eksempler på slike midler er angitt over. Det andre terapeutiske middel kan administreres som en separat doseringsform eller som en komponent av sammensetningen inneholdende inhibitorisk antistoff eller fragment.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet et kitt som omfatter en eller flere av de heri beskrevne antistoff eller fragmenter derav. Typisk omfatter kittet også instruksjoner for anvendelse av antistoffene i samsvar med foreliggende fremgangsmåter. I en beslektet utførelse omfatter kittet ytterligere, i et separat kar, et andre terapeutisk middel, så som ethvert av de som er beskrevet over for anvendelse sammen med enten aktiverende eller inhibitoriske antistoff eller fragmenter i behandling eller hindring av forskjellige sykdommer eller tilstander.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet en frengangsmåte for å evaluere et antistoff mot human NKG2A omfattende trinnene og: a) sette nevnte antistoff i forbindelse med en ikke human primat celle karakterisert av NKG2A på dets overflate, eller en ikke human primat NKG2A polypeptid; og b) undersøke evnen for nevnte antistoff til å binde seg til eller påvirke aktiviteten av nevnte celle eller polypeptid. I en beslektet utførelse anvendes fremgangsmåten for å evaluere et aktiverende antistoff, hvor nevnte antistoff settes i forbindelse med en cellepopulasjon omfattende en ikke human primat NK- celle og en målcelle, hvor nevnte NK- celle er karakterisert av NKG2A på dets overflate, og hvor nevnte målcelle er karakterisert ved nærvær av HLA-E på dets overflate; og hvor nevnte undersøkelsestrinn bestemmer om nevnte målcelle lyseres.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å produsere et antistoff som er egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter; a) immunisere et ikke humant pattedyr med en sammensetning omfattende human NKG2A; b) selektere et monoklonalt antistoff som binder NKG2A, men ikke NKG2C eller NKG2E; c) gjøre nevnte antistoff egnet for anvendelse i mennesker; d) administrere nevnte antistoff til et ikke humant primat; og e) evaluere evnen av nevnte antistoff til å bindes til NKG2A in vivo i nevnte primat og toleransen av nevnte primat til nevnte antistoff. Dersom antistoffet binder til og tolereres av nevnte ikke humane primat, indikerer dette at nevnte antistoff er egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker. I en foretrukket utførelse omfatter fremgangsmåten det ytterligere trinn å modifisere nevnte antistoff til ikke å binde en Fc- reseptor før trinn d.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet et antistoff produsert med denne fremgangsmåte.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet en fremgangsmåte for å identifisere et egnet administrerings regime for et terapeutisk antistoff rettet mot human NKG2A, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter; a) administrere nevnte antistoff til et ikke humant primat ved anvendelse av en serie administrasjonsregimer hvor dosering eller frekvens av nevnte antistoff varierer; b) bestemme aktiviteten av NKG2A-uttrykkende celler i et ikke- humant primat og toleransen av nevnte primat for hver av nevnte administrasjonsregime. Straks det er bestemt at et regime er tolerert av nevnte primat og fører til en detekterbar modulering i nevnte aktivitet av NKG2A-uttrykkende celler, så vurderes dette administrasjonsregime egnet for anvendelse i mennesker.

I samsvar med en alternativ utførelse er det også beskrevet et konjugat omfattende: a) et inhibitorisk eller aktiverende antistoff, og b) et cytotoksisk middel. Det resulterende konjugat anvendes for å drepe NK- celler.

Således, konjugering av et aktiverende antistoff med et cytotoksisk middel vil produsere et molekyl som vil drepe NK- celler i motsetning til aktivering av nevnte celle oppnådd med kun det aktiverende antistoff alene. Cytotoksin/antistoffkonjugater kan formuleres i sammensetninger og anvendes i fremgangsmåter på en måte som er lignende til de inhibitoriske antistoff ifølge oppfinnelsen.

Beskrivelse av figurene

Figur 1 avbilder effekten av tre forskjellige konsentrasjoner av Z270 på NK- cellelysering av HLA-E uttrykkende PHA blast ved varierende formål av NK- celler til PHA blast.

Figur 2 avbilder effekten ved tre forskjellige konsentrasjoner av Z199 p NK cellelysering av HLA-E uttrykkende PHA blast ved varierende forhold av NK- celler til PHA- blast

Figur 3 avbilder effekten av et F(ab ́)2- fragment av Z270 p NK cellelysering av HLA-E uttrykkende PHA- blast.

Figur 4 viser binding til cynomolgus ape NK- celler binding ble også vist for macaca mulatta og bavianer.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen.

Introduksjon.

Den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nye antistoff mot NKG2A som aktiverer NK cellemediert lysering av målceller karakterisert med nærvær av celler som uttrykker HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate, fremgangsmåter for å produsere, evaluere og karakterisere disse antistoff for terapeutisk anvendelse;

og sammensetninger omfattende, og fremgangsmåter for anvendelse av disse antistoff for behandling av autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser og andre tilstander karakterisert ved nærvær av celler som uttrykker HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate, så som dendritiske celler. Foreliggende oppfinnelse er basert på delvis, på det overraskende funn at NKG2A har en primær responsibilitet for inhibering av lysering av modne dendritiske celler av mange NK- celler. Modne dendritiske celler uttrykker signifikante nivåer av HLA-E, som fungerer gjennom NKG2A- reseptorer foreliggende på NK- celler for å inhibere målrettingen av de dendritiske celler. Således, uten å være bundet av følgende teori, antas det at blokkering av NKG2A- mediert inhibering av NK- celler fører til en økning i dendritisk celle målretting av NK- celler, og tilveiebringer dermed en effektiv behandling for autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser eller faktisk enhver tilstand som kan lindres eller helbredes ved å redusere aktiviteten av dendritiske celler, spesielt modne dendritiske celler. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således fremgangsmåter, mer generelt, for å inhibere eller redusere antallet dendritiske celler, fortrinnsvis modne dendritiske celler, i et pattedyr, og likeledes og generelt redusere en immunrespons, fortrinnsvis en autoreaktiv immunrespons. Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også nye antistoff mot NKG2A som inhiberer NK cellemediert lysering av målceller, fremgangsmåter for å lysere, evaluere ogkarakterisere disse antistoff for terapeutisk anvendelse; og sammensetninger som omfatter, og fremgangsmåter for anvendelse av disse antistoff for behandling av autoimmune forstyrrelser eller transplantat avvisning.

Definisjoner

Som anvendt heri har de følgende uttrykk de vanlige betydninger som tilskrives disse, med mindre annet er spesifisert.

Som anvendt heri ”NK”- celler til en subpopulasjon av lymfocytter som er involvert i ikke- konvensjonell immunitet. NK- celler kan identifiseres på grunn av visse karakteristika og biologiske egenskaper, så som uttrykking av spesifikke overflate antigener inkluderende CD16, CD56 og/eller CD 37, fravær av alfa/beta eller gamma/delta TCR kompleks på celleoverflaten, evnen til å binde til drepe celler som ikke uttrykker ”selv” MHS/HLA antigener ved aktivering av spesifikke cytolytiske enzymer, evnen til å drepe tumorceller eller andre sykdomsceller som uttrykker en ligand for NK- aktiverende reseptorer og evnen til å frigjøre proteinmolekyler benevnt cytokiner som stimulerer eller inhiberer immunrespons. Alle disse karakteristika og aktiviteter kan anvendes for å identifisere NK- celler, ved anvendelse av fremgangsmåter som er godt kjent innen fagfeltet.

Dendritt celler er en heterogen populasjon av immunceller produsert i benmargen (se for eksempel O ́Neill et al). (2004) Blood 104:2235-2246, Mohamadzadeh et al. (2004) J Immune Based Ther Vaccines.2004; 2:1; hvis hele beskrivelser inkorporeres heri med henvisning. Som angitt heri kan DCer inkludere DC- forløpere, umodne DCer, og modne DCer. DC- forløpere og umodne DCer er avstamningsnegative (CD3-CD14-CD56-) HLA-DR+ mononukleære celler. Disse celler kan ytterligere klassifiseres i to populasjoner, myeloid DCer og plasmacytoid DCer.

Myeloide DCer er CD11c+ og CD123 lav og har en monocytoid framkomst, og plasmacytiode DCer er CD11c- og CD123 høy, med morfologiske egenskaper lignende plasmaceller. Etter antigenfanging undergår DCer en fremgangsmåte for modning hvor de fangete antigener produseres til peptider og lastes på MHC klasse I eller II for presentasjon for celleoverflaten. Modne DCer viser lavere fagocytisk opptak, har cytoplasmiske ekstensjoner benevnt slør, migrerer til lymfoid vev, og uttrykker karakteristiske markører så som CD 83 og DC-LAMP. TLRer uttrykkes også i DCer, hvor forskjellige DC- typer uttrykker forskjellige TLR- markører (se for eksempel O ́Neill et al. (2004)).

NKG2A (OMIM 161555, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning) er et medlem av NKG2 – gruppen av transkripter (Houchins, et al. (1991) J. Exp. Med.

173:1017-1020). NKG2A kodes av 7 eksoner som strekker seg over 25 kb, som viser noe differensiel spleising. NKG2A er en inhibitorisk reseptor som finnes på overflaten av NK- celler. Så som inhibitoriske KIR reseptorer oppviser denne en ITIM på dets cytoplasmiske domene. Som anvendt heri, ”NKG2A” refererer til enhver variant, derivat eller isoform av NKG2A- genet eller kodet protein.

Også omfattet er enhver nukleinsyre eller proteinsekvens som deler en eller flere biologiske egenskaper eller funksjoner med villtype, fullengde NKG2A, og som deler minst 70 % , 80 % 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %; eller høyere nukleotid- eller aminosyreidentitet. NKG2A benevnes også som ”NKG2A- reseptor” gjennom denne beskrivelse.

NKG2C (OMIM 602891, hvis hele beskrivelse heri inkorporeres med henvisning) og NKG2E (OMIM 602892, hvis hele beskrivelse heri inkorporeres med henvisning) er to andre medlemmer av NKG2- gruppen av transkripter (Gilenke, et al. (1998) Immunogenetics 48:163-173). NKG2C og NKG2E er aktiverende reseptorer som finnes på overflaten av NK- celler. Som anvendt heri ”NKG2C” og ”NKG2E” refererer til enhver variant, derivat eller isoform av NKG2C eller NKG2E gen eller kodet protein, respektivt. Også omfattet er enhver nukleinsyre eller proteinsekvens som deler en eller flere biologiske egenskaper eller funksjoner med villtype, fullengde NKG2C eller NKG2E, og som deler minst 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller høyere nukleotid eller aminosyreidentitet med det beskrevne gen eller kodete protein.

CD94 (OMIM 602894, hvis fullstendige beskrivelse heri inkorporeres med henvisning). CD94, et antigen som fortrinnsvis uttrykkes på NK- celler (Chang et al. (1995) Europ. J. Immun.25:2433-2437). CD94 uttrykkes som tre hovedtranskripter på 0,8, 1,8 og 3,5 kb og et mindre transkript på 5,5 kb i NK cellelinjer, og koder for et protein med et 147 aminosyre ekstracellulært domene og flere motiver som er karakteristiske for C type lektiner. Aminosyresekvensen av CD94 er 27 til 32 % identisk til de av NKG2 familiemedlemmene NKG2A, NKG2C, NKG2D og NKG2E. På grunn av et i hovedsak fravær av et cytoplasmisk domene, krever CD94 assosiering med andre reseptorer for å danne disulfid bunnete heterodimerer med NKG2A, NKG2C, og NKG2E (Lazetic et al. (1996) J. Immun.157:4741-4745. Som anvendt heri”C94” refererer til enhver variant. Derivat eller isoform av CD96- genet eller kodet protein.

Også omfattet er enhver nukleinsyre eller proteinsekvens som deler en eller flere biologiske egenskaper eller funksjoner med villtype, fullengde CD94, og som deler minst 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % eller høyere nukleotid eller aminosyreidentitet.

HLA-E (OMIM 143010, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning) er et ikke klassisk MHC- molekyl som uttrykkes på celleoverflater og reguleres av binding av peptider avledet fra signalsekvens av andre MHC- klasse I molekyler. HLA-E binder naturlige drepeceller (NK), og noen T- celler, binder spesifikt til CD94/NKG2A, CD94/NKG2B og CD94/NKG2C, og ikke til de inhibitoriske KIR- reseptorer (Se for eksempel OMIM604936, hvis fullstendige beskrivelse heri inkorporeres med henvisning) (se for eksempel Braud et al. (1998) Nature 391:795-799), hvis fullstendige beskrivelse heri inkorporeres med henvisning. Overflate ekspresjon av HLA-E er tilstrekkelig til å beskytte målceller fra lysering av CD94/NKG2A NK- cellekloner. Som anvendt heri: HLA-E refererer til enhver variant, derivat eller isoform av HLA-E genet eller kodet protein. Også omfattet er enhver nukleinsyre eller proteinsekvens som deler en eller flere biologiske egenskaper eller funksjoner med villtype, fullengde HLA-E, og som deler minst 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller høyere nukleotid eller aminosyreidentitet.

Qa1er et musecelle overflateantigen som er den fysiologiske ligand for NKG2A. Som anvendt heri, ”Qa1” refererer til enhver variant, derivat eller isoform av Qa1– genet eller kodet protein. Også omfattet er enhver nukleinsyre eller proteinsekvens som deler en eller flere biologiske egenskaper eller funksjoner med villtypen, fullengde Qa1, og som deler minst 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, eller høyere nukleotid eller aminosyreidentitet.

”Autoimmune" forstyrrelser inkluderer enhver forstyrrelse, tilstand eller sykdom hvor immunsystemet bevirker en reaksjon mot selv- celler eller vev, på grunn av en nedbrytning i evnen til å skille selv fra ikke-selv, eller motsatt.

Eksempler på autoimmune forstyrrelser inkluderer Hashimotos thyroiditt, pernisiøs anemi, Addisons sykdom, type I diabetes, reumatoid artritt, systemisk lupus erytematøs, dermatomyositt, Sjøgren ́s syndrom, lupus erytematosøs, multippel sklerose, myestenia gravis, Reiter ́s syndrom, Grave ́s sykdom, polymyositt, Guillian Barré, Wegener ́s granulomatosøs, polyarteritt nodosa, polymyalgi reumatika, temporal arterititt, Bechet ́s sykdom, Churg- Strauss syndrom, Takayasu ́s aterititt og andre. En ”inflammatorisk forstyrrelse” inkluderer enhver forstyrrelse karakterisert ved en uønsket immunrespons. Autoimmune og inflammatoriske forstyrrelser kan involvere enhver komponent av immunsystemet, og kan målrette enhver celle eller vevstype i kroppen.

Termen ”inhibering”, ”redusering”, ”blokkering”, nedmodulering” og ”nedregulering” med hensyn til NKG2A- aktivitet refererer til enhver prosess, fremgangsmåte eller forbindelse som kan senke ned, redusere, reversere eller på enhver måte negativt påvirke stimuleringen eller uttrykkingen av NKG2A- reseptorer på celler, fortrinnsvis NK- celler. Disse termer kan referere til forbindelser som inhiberer stimuleringen av NKG2A av en ligand, som virker antagonistisk i fravær av en ligand for å redusere aktiviteten av reseptoren, som reduserer uttrykkingsnivået av reseptoren, som blokkerer NKG2A- utløste signaler eller genekspresjon, eller som blokkerer enhver annen aktivitet på cellen som resulterer fra NKG2A- aktivering. I en foretrukket utførelse hindrer den inhiberende forbindelse eller fremgangsmåte binding av reseptoren til en ligand, for eksempel HLA-E. Antallet NKG2A- reseptormolekyler eller enhver av de heri beskrevne aktiviteter kan måles på standard måte, for eksempel som beskrevet annet sted i foreliggende søknad.

Termen ”antistoff” som anvendt heri refererer til et polyklonalt eller monoklonalt antistoff. Avhengig av type konstant domene i tungkjedene tilordnes antistoffene en av fem hovedklasser: IgA, IgD, IgE, IgG og IgM. Flere av disse er ytterligere delt i subklasser eller isotyper, så som IgG1, IgG2, IgG3, IgG4 og lignende. En representativ immunoglobulin (antistoff strukturenhet)omfatter en tetramer. Hver tetramer er sammensatt av to identiske par av polypeptidkjeder, hvor hvert par har en ”lett” (ca 35 kDa) og en ”tung” kjede (ca 50-70 kDa).

N- terminus av hver kjede definerer en variabel region på ca 100 til 110 eller flere aminosyrer som primært er ansvarlig for antigen gjenkjenning. Termen ”variabel lettkjede (VL) ” og ”variabel tungkjede (VH)” refererer til disse lette og tunge kjeder respektivt. Tungkjede konstante domener som korresponderer til de forskjellige klasser immunoglobeliner benevnes ”alfa”, ”delta”, ”epsilon”, ”gamma” og ”my”, respektivt. Subenhetsstrukturene og tredimensjonale konfigurasjoner av forskjellige klasser immunoglobeliner er godt kjent. IgG og/eller IgM er de foretrukne klasser av antistoff som benyttes ifølge oppfinnelsen, hvor IgG er spesielt foretrukket, på grunn av at de er de mest vanlige antistoff i den fysiologiske situasjon og på grunn av at de enklest kan fremstilles i et laboratoriemiljø.

Fortrinnsvis er antistoffet ifølge oppfinnelsen et monoklonalt antistoff. Spesielt foretrukket er humaniserte, kimeriske, humane eller på annen måte human- egnete antistoff. Termen ”antistoff” inkluderer også fragmenter eller derivater av enhver av de heri beskrevne antistoff ved unntak i denne kontekst av foreliggende beskrivelse hvor slike induksjoner forårsaker en redundans (for eksempel en spesifikk referanse til ”et antistoff eller et fragment derav”). I en foretrukket utførelse er antistoffene ikkedepleterende antistoff, som betyr at de binder til NK- celler og inhiberer NKG2A-stimulering (som fører til lysering av celler som bærer HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate), men ikke fører til dreping av NKG2A- uttrykkende celler. Ikke depleterende antistoff eller antistoffragmenter er de som ikke gjenkjennes eller kun svakt gjenkjennes, av Fc- reseptorer, så som IgG4- antistoff, antistoffragmenter som mangler Fc- delen eller ethvert annet antistoff hvis Fc- hale har blitt modifisert for å redusere eller eliminere binding av Fc- reseptorer (se for eksempel WO03101485, hvis fullstendige beskrivelse inkorporeres heri med henvisning).

I en ytterligere foretrukket utførelse binder antistoffene eller antistoffragmentene til en Fc- reseptor. Slike antistoff og fragmenter forårsaker kryssbinding av NKG2A-molekyler som fører til inhibering av NK- celleaktivitet, og i noen tilfeller til NK celledød.

Termen ”spesifikk binder til ” angir at antistoffet kan binde, fortrinnsvis i en kompetitiv bindingsanalyse, til bindingspartner, for eksempel NKG2A, som undersøkt ved anvendelse enten av rekombinante former av proteinet, epitoper deri, eller native proteiner foreliggende på overflaten av isolerte NK eller andre celler. Kompetitive bindingsanalyser og andre fremgangsmåter for å bestemme spesifikk binding er ytterligere beskrevet nedenfor og er også godt kjent innen fagfeltet.

Et ”humant egnet” antistoff refererer til ethvert antistoff, derivatisert antistoff, eller antistoff fragment som sikkert kan anvendes i mennesker for eksempel for terapeutiske fremgangsmåter beskrevet heri. Human egnete antistoff inkluderer alle typer humaniserte, kimeriske eller fullstendige humane antistoff, eller ethvert antistoff hvor minst en del av antistoffene er avledet fra mennesker eller på annen måte modifisert for å unngå immunrespons som generelt frembringes idet native ikkehumane antistoff anvendes.

For formålene med foreliggende oppfinnelse refererer ”humanisert” antistoff til et antistoff hvor dets konstante og variable rammeverkregion av en eller flere humane immunoglobuliner anvendes med bindingsregionen, for eksempel CDR, av et animalsk immunoglobulin. Slike humaniserte antistoff er konstruert for å opprettholde bindingsspesifisitet av det ikke- humane antistoff hvorfra bindingsregionene er avledet, men for å unngå en immunreaksjon mot det ikke- humane antistoff.

Et ”kimerisk antistoff” er et antistoffmolekyl hvor a) den konstante region, eller en del derav er forandret, erstattet eller utbyttet slik at antigenbindingssetet (variabel region) er koblet til en konstant region av en forskjellig eller forandret klasse, effekt og funksjon og/eller form, eller et fullstendig forskjellig molekyl som gir nye egenskaper til det kimeriske antistoff, for eksempel et enzym, toksin, hormon, vekstfaktor, medikament etc.; eller b) den variable region, eller en del derav, er forandret, erstattet eller utbyttet med en variabel region som har en forskjellig eller forandret antigen spesifisitet.

Et ”humant” antistoff er et antistoff oppnådd fra transgene mus eller andre dyr som har blitt ”konstruert” for å produsere spesifikke humane antistoff i respons til antigenisk utfordring (se for eksempel Green et al. (1994) Nature Gent 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int Immun 6:579, hvis hele beskrivelse heri inkorporeres med henvisning). Et fullstendig humant antistoff kan også konstrueres med genetiske eller kromosomale transfeksjonsmetoder, og likeledes fagdisplay teknikk, og alle disse er kjent innen fagfeltet. (Se for eksempel McCafferty et al. (1990) Nature 348:552- 553). Humane antistoff kan også genereres ved in vitro aktiverte B celler (se for eksempel US. Pat. Nos.5,567, 610 og 5,229, 275, som inkorporeres heri fullstendig med henvisning).

Innen konteksten av foreliggende oppfinnelse angir ”aktiv” eller ”den aktiverte” NK-celler biologisk aktive NK- celler, nærmere bestemt NK- celler som har kapasitet til å lysere målceller. For eksempel, en aktiv NK- celle er i stand til å drepe celler som utrykker en NK- aktiverende reseptorligand og som mangler å uttrykke ”selv” MHC/HLA antigener (KIR- inkompatible celler). Slike celler benevnes også heri som ”NK celle- mottagelige målceller ”. Eksempler på slike målceller som er egnet for anvendelse i å redirigere drepeanalyser, er P815 og K562 celler. Imidlertid, enhver av en rekke celletyper kan anvendes og er godt kjent innen fagfeltet (se for eksempel Sivori et al. (1997) J. Exp. Med.186:1129-1136; Vitale et al. (1998) J. Exp. Med. 187:2065-2072; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med.188:953-960; Neri et al. (2001) Clin. Diag. Lab. Immun.8:1131-1135). ”Aktive” eller ”aktiverte” celler kan også identifiseres med en annen egenskap eller aktivitet kjent innen fagfeltet som assosiert med NK- aktivitet, så som cytokin (for eksempel IFN-� og TNF-α) produksjon øker i frie intracellulære kalsiumnivåer. For formålet med foreliggende oppfinnelse refererer aktiverte NK- celler ideelt til NK- celler hvor NKG2A-reseptorene ikke er stimulert, og hvor en NCR, fortrinnsvis NKp30 er stimulert, noe som dermed fører til cytotoksisitet av cellen mot modne dendritiske celler.

Termen ”NKG2A- stimulering”, som anvendt heri refererer til prosesser som foregår i en celle som bærer NKG2A, for eksempel en NK- celle, idet NKG2A binder til det naturlige ligand (for eksempel HLA-E eller Qa1) eller et funksjonelt fragment derav.

På grunn av at NKG2A er en inhibitorisk reseptor kan slik binding forårsake inhibering av NK- celleaktivitet. Således ”inhibering av NKG2A- stimulering” refererer til en prosess hvor binding av NKG2A til det naturlige ligand eller et funksjonelt fragment derav er enten redusert eller hindret, hvor bindingen forekommer, men ikke forårsaker inhibering av NK- celleaktivitet.

Således, termen ”aktiverende antistoff” som anvendt heri med henvisning til antistoff mot NKG2A er tiltenkt å bety et antistoff som, gjennom binding til NKG2A og en NC-celle hindrer assosiering av NKG2A med det naturlige ligand (for eksempel HLA-E eller Qa1på en målcelle), eller hindre NKG2A- avhengig signaltransduksjon normalt mediert av et HLA-E positivt mål, og således reverserer inhibering av lysering av målcellen av NK- cellen forårsaket av assosieringen av NKG2A med liganden.

Således, et aktiverende antistoff forårsaker inhibering av NKG2A- stimulering.

Termen ”inhibitorisk antistoff” som anvendt heri med henvisning til antistoff mot NKG2A, er tiltenkt å angi et antistoff som, gjennom binding til NKG2A på en NK-celle, forårsaker inhibering av en NK- celles evne til å lysere celler som ellers ville bli lysert. Inhiberende antistoff ifølge oppfinnelsen forårsaker typisk kryssbinding av NKG2A- molekylet i en NK- celle, som fører til inhibering, og noen ganger død, av denne NK- celle. Det skal noteres at et inhibitorisk antistoff mot NKG2A ifølge oppfinnelsen kan hindre assosiering av NKG2A med dets naturlige ligand eller et aktivt fragment derav, men vil ikke resultere i lysering av en celle som bærer det naturlige ligand på grunn av at NK- cellens evne til å lysere celler har blitt inhibert av antistoffer.

Termene ”isolert”, ”renset” eller ”biologisk ren” refererer til materiale som er i hovedsak eller essensielt fritt for komponenter som normalt finnes i dets native tilstand. Renhet og homogenitet bestemmes typisk ved anvendelse av analytiske kjemiteknikker så som polyakrylamidgel elektroforese eller høyytelsesvæskekromatografi. Et protein som er den dominerende form som foreligger i et preparat er i hovedsak renset.

Termen ”biologisk prøve” som anvendt heri inkluderer men er ikke begrenset til et biologisk fluid (for eksempel serum, lymfe, blod, celleprøve eller vevsprøve) for eksempel benmarg.

Termene” polypeptid”, ”peptid” og ”protein” anvendes om hverandre for å referere til et polymer av aminosyreenheter. Termene anvendes for aminosyrepolymerer hvor en eller flere aminosyreenheter er en artifisiell kjemisk etterligning av en korresponderende naturlig forekommende aminosyre, og likeledes til naturlig forekommende aminosyrepolymerer og ikke- naturlig forekommende aminosyrepolymerer.

Termen ”rekombinant” idet den anvendes med referanse, for eksempel til en celle, eller nukleinsyre, protein eller vektor, indikerer at cellen, nukleinsyren, proteinet eller vektoren har blitt modifisert ved introdusering av en heterolog nukleinsyre eller protein eller ved forandring av en nativ nukleinsyre eller protein, eller at cellene er avledet fra en celle som slik er modifisert. Således, for eksempel, rekombinante celler uttrykker gener som ikke finnes i den native (ikke- rekombinante) form av cellen, eller uttrykker native gener som ellers ville være avvikende uttrykt, underuttrykt eller ikke uttrykt i det hele.

Termen ”konkurrerer med” idet den refererer til et bestemt monoklonalt antistoff (for eksempel Z199 eller Z270) betyr at antistoffet eller fragmentet derav som testes reduserer binding av referanse monoklonalt antistoff (for eksempel Z199 eller Z270) til NKG2A (sammenlignet med en kontroll omfattende denne referanse monoklonale antistoff og NKG2A, men som mangler testantistoffet) i en bindingsanalyse som anvender enten rekombinant NKG2A- molekyler eller overflateuttrykte NKG2A-molekyler. For eksempel, dersom et antistoff reduserer binding av Z270 til et humant NKG2A molekyl i en bindingsanalyse ”konkurrerer” antistoffet med Z270 for binding til human NKG2A.

Termen ”fullstendig konkurrerer med”, som anvendt heri, angir at testantistoffet binder til i hovedsak eller essensielt den samme epitop som referanse monoklonalt.

Som anvendt heri en ”effektiv mengde” refererer til enhver mengde som er nødvendig eller tilstrekkelig for å oppnå eller fremme et ønsket utbytte. I noen tilfeller er en effektiv mengde en terapeutisk effektiv mengde. En terapeutisk effektiv mengde er en mengde som er nødvendig eller tilstrekkelig for å fremme eller oppnå en ønsket biologisk respons i et individ. Den effektive mengde for enhver bestemt applikasjon kan variere avhengig av slike faktorer som sykdommen eller tilstanden som behandles, det bestemte middel som administreres, størrelsen på individet, eller alvorlighetsgraden av sykdommen eller tilstanden. En fagkyndig innen fagfeltet kan empirisk bestemme den effektive mengde av et bestemt middel uten unødig eksperimentering.

Termen ikke- humane primater inkluderer ethvert pattedyr innen ordren primater, inkluderende aper, New World aper, Old World aper, prosimianer, Pongo pygmaeus pygmaeus (Borneo organgutang), Pongo pygmaeus abelii (Sumatran orangutang), Gorilla gorilla (western lowland gorilla), Pan paniscus (bonobo), Pan troglodytes (Sjimpanse), Pan troglodytes verus (sjimpanse), Lemur fulvus (brun lemur), Saguinus fuscicollis (hvitleppet tamarin), Saguinus labiatus (rød- maget tamarin), Callicebus molloch pallescens (paraguiansk titi), Samiri sciureus (ekornape), Ateles geoffroyi (svart hendt edderkoppape), Lagothrix lagotricha (ullen ape), Macaca arctoides (stumphala macaque), Macaca fascicularis (krabbe etende macaque), Macaca fuscata (japans macaque), Macaca mulatta (rhesus ape), Macaca nemestrina (grisehala macaque), Macaca nigra (celebes ape), Erythrocebus patas (patas ape), bavianer, silkeaper, capuchiner, cynomolgus, brølaper, edderkopp aper, mandriller, marekatter, patas aper, colobus ape, gibbon, lemurer, aya-ayas, loris, galago, og spøkelsesaper. I en foretrukket utførelse er det ikke- humane primat som anvendes i den foreliggende oppfinnelse ikke en ape, for eksempel er et ikkehumant primat andre enn en sjimpanse, gorilla, orangutang eller gibbon. For formålet med foreliggende oppfinnelse kan analyser som sies å utføres og anvendelse av ikke-humane primater inkludere in vivo analyser hvor antistoffene administreres til primatene, eks vivo analyse hvor for eksempel celler tas fra et primat behandles med antistoffene og returneres til primatet, og in vitro analyser som involverer celler, proteiner eller vev tatt fra et primat.

Dersom et pattedyr så som et ikke-humant primat sies å ”tolerere” et administreringsregime av et anti NKG2A antistoff, menes at administrering ikke er dødelig og ikke har noen alvorlige bieffekter i dyret, selv om bieffekter fremdeles kan foreligge så lenge de ikke er alvorlige, og generelt at de overveies av den terapeutiske fordel som tilveiebringes av administreringen.

Å oppnå forbindelser som spesifikt binder til NKG2A.

Foreliggende oppfinnelse involverer både aktiviserende og inhibitoriske antistoff som binder til NKG2A på immunceller, fortrinnsvis NK-celler, og likeledes identifikasjon, produksjon, evaluering og anvendelse av slike. En måte å identifisere slike antistoff på er å finne de som er i stand til å bindes til NKG2A. Straks antistoff med spesifikk binding er identifisert kan de testes for deres evne til å inhibere aller aktivere NKG2-A, for eksempel på NK- celler. Det vil imidlertid innses at å utføre slike bindingsanalyser på ingen måte er nødvendig for å praktisere foreliggende oppfinnelse.

Enhver av et bredt spekter av analyser kan anvendes for å undersøke binding av et antistoff til NKG2A. Protokoller basert på ELISAer, radioimmunoanalyser, Western blotting, BIACORE og andre konkurrerende analyser, inter alia, er egnet for anvendelse og er godt kjent innen fagfeltet.

For eksempel, enkle bindingsanalyser kan anvendes hvor et testantistoff inkuberes i nærvær av et målprotein eller epitop (for eksempel NKG2A eller en del derav), ubundne antistoffer vaskes av, og nærvær av bundne antistoff undersøkes ved anvendelse for eksempel av radiomarkører, fysikalske metoder så som massespektrometri, eller direkte eller indirekte fluoriserende markører som detekteres ved anvendelse av for eksempel cytofluorometriske analyser (for eksempel FACScan). Slike metoder er godt kjent for fagkyndige innen feltet. Enhver mengde av binding over den mengde som fremkommer med en kontroll ikke- spesifikt antistoff indikerer at antistoffet binder spesifikt til målet.

I slike analyser kan evnen av testantistoffet til å binde til målcellen eller human NKG2A sammenlignes med evnen av et (negativt) kontrollprotein, for eksempel et antistoff rettet mot et strukturelt ikke relatert antigen, eller en ikke- Ig- peptid ellerprotein, for å binde til samme mål. Antistoff eller fragmenter som binder til målcellene eller NKG2A ved anvendelse av enhver egnet analyse med 25 %, 50 %, 100 %, 200 %, 1000 % eller høyere øket affinitet relativt til kontrollproteinet sies å ”spesifikt binde til” eller ”spesifikt interagere med ” målet, og er foretrukket for anvendelse i de terapeutiske fremgangsmåter beskrevet nedenfor.

I en utførelse er evnen av et testantistoff til å påvirke binding av et (positivt) kontrollantistoff mot NKG2A, for eksempel 3S9, 20d5, Z270 eller Z199, eller derivater derav, undersøkt. I et annet er evnen av et testantistoff til å påvise binding av en naturlig ligand for NKG2A, for eksempel HLA-E, målt.3S9 beskrives i U.S patent publikasjon 20030095965, og beskrivelsen av denne inkorporeres med henvisning.3S9 binder til NKG2C og NKG2E, og likeledes til NKG2A.20d5 er et kommersielt tilgjengelig antistoff (BD Biosciences Pharmingen, Catalog No.550518, USA).20d5 binder til mus NKG2A, NKG2E og NKG2C. Z199 er et kommersielt tilgjengelig antistoff (Beckman Coulter, Inc., Product No. IM2750, USA). Z270 er beskrevet fullstendig heri. Z270 binder spesifikt til human NKG2A, men ikke til human NKG2C eller NKG2E.

I tillegg vil enkle kompetitive analyser kunne benyttes hvor et kontrollantistoff (for eksempel 3S9, Z270 eller Z199) og testantistoff sammenblandes (eller preabsorberes) og appliseres til en prøve inneholdende NKG2A. I visse utførelser kan man premikse kontrollantistoffene med varierende mengder testantistoff (for eksempel 1:10 eller 1:100) for en periode før applisering til NKG2A- inneholdende prøve. I andre utførelser kan kontroll og varierende mengder testantistoff enkelt sammenblandes under eksponering til antigen/mål- prøve. Så lenge man kan skille bunnene fra frie antistoff (for eksempel ved anvendelse av separering eller vasketeknikker for å eliminere ubundne antistoff) og kontrollantistoffet fra testantistoffet (for eksempel ved anvendelse av arts- eller isotopspesifikke sekundære antistoff, ved spesifikt å merke kontrollantistoffet med en detekterbar markør, eller ved å anvende fysikalske metoder som masse- spektrometri for å skille mellom forskjellige forbindelser) vil man være i stand til å bestemme om test antistoffet reduserer binding av kontrollantistoffet til antigenet, noe som indikerer at testantistoffet gjenkjenner i hovedsak den samme epitop som kontrollen.

I de ovenfor beskrevne kompetitive analyser kan binding av den (merkete kontroll antistoff) i nærvær av en fullstendig irrelevant antistoff er kontroll høyverdi. Kontroll lavverdi oppnås ved å inkubere merket (positiv kontrollantistoff) for eksempel 3S9, Z270 eller Z199 med umerket antistoff av eksakt den samme type (for eksempel 3S9, Z270 eller Z199), hvor konkurranser vil forekomme og redusere binding av det merkete antistoff.

I en testanalyse er en signifikant reduksjon i merket antistoff reaktivitet i nærvær av et testantistoff indikerende for et testantistoff som gjenkjenner den samme epitop. Det vil si en som ”kryssreagerer” med det merkete kontrollantistoff. Ethvert test antistoff eller forbindelse som reduserer binding av den merkete kontroll til antigen/mål ved minst 50 % eller mer, fortrinnsvis 70 %, i ethvert forhold av kontrolltestantistoff eller forbindelse mellom ca 1:10 og ca 1:100 vurderes til å være et antistoff eller forbindelse som binder til i hovedsak den samme epitop eller determinant som kontrollen. Fortrinnsvis, slik testantistoff eller forbindelse vil redusere binding av kontrollen til antigenet/målet med minst 90 %. Imidlertid, enhver forbindelse eller antistoff som reduserer binding av et kontrollantistoff eller forbindelse i enhver målbar grad kan anvendes ifølge foreliggende oppfinnelse.

Identifiseringen av en eller flere antistoff som binder til i hovedsak den samme epitop som de monoklonale aktuelle antistoff kan enkelt bestemmes ved anvendelse av en rekke immunologiske screenings analyser hvor antistoffkonkurranse kan undersøkes. Slike analyser er rutinemessige innen fagfeltet (se for eksempel U. S. Patent Nr 5,660,827, som inkorporeres heri med henvisning).

Det skal forstås at å faktisk bestemme epitopen hvortil antistoffet binder ikke er nødvendig for å identifisere et antistoff som binder til den samme eller i hovedsak den samme epitop som det monoklonale aktuelle antistoff.

I en utførelse kan konkurranse undersøkes med flowcytometri test. For eksempel, celler som bærer en NKG2A/CD94- reseptor inkuberes først med et kontrollantistoff som er kjent å spesifikt binde til reseptoren (for eksempel 3S9, Z270 eller Z199), og deretter med testantistoffet som har blitt merket for eksempel med et fluorkrom eller biotin. Testantistoffet sies å konkurrere med kontrollen dersom bindingen som oppnås med pre- inkubering med metningsmengde av kontrollantistoff er 80 %, fortrinnsvis 50 %, 40 % eller mindre av bindingen (gjennomsnitt av fluoressens) oppnådd med antistoffet uten pre- inkubering med kontrollen. Alternativt, et testantistoff sies å konkurrere med kontrollen som bindingen som oppnås med en merket kontroll (med et fluorkrom eller biotin) på celler pre- inkubert med metningsmengde av antistoff til test er 80 %, fortrinnsvis 50 %, 40 %, eller mindre av bindingen som oppnås uten pre- inkubering med antistoffet.

I et foretrukket eksempel kan en enkel konkurranseanalyse benyttes hvor et test antistoff preabsorberes og appliseres ved metningskonsentrasjon ved en overflate hvorpå det er immobilisert substrat for antistoffbinding, for eksempel NKG2A/CD94-reseptor, eller epitop inneholdende del derav som er kjent til å bli bundet av for eksempel 3S9. Overflaten er fortrinnsvis en BIACORE chip. Kontrollantistoff (for eksempel 3S9, Z270 eller Z199) bringes deretter i kontakt med overflaten ved en substratmetningskonsentrasjon og substratoverflatebinding av kontrollantistoffet måles. Denne binding av kontrollantistoff, sammenlignes med binding av kontrollantistoff til substratinneholdende overflate i fravær av testantistoff. I en testanalyse er en signifikant reduksjon i binding av substratinneholdende overflate av kontrollantistoff i nærvær av et testantistoff indikerende på et testantistoff som gjenkjenner den samme epitop, det vil si en som ”kryssreagerer” med kontrollantistoffet.

Enhver testantistoff som reduserer binding av kontrollantistoff til antigeninneholdende substrat med minst 30 %, eller mer fortrinnsvis 40 % vurderes til å være et antistoff som binder i hovedsak til den samme epitop eller determinant som kontrollantistoffet. Fortrinnsvis vil slik testantistoff redusere binding av kontrollantistoffet til substratet med minst 50 %. Det skal anerkjennes at rekkefølgen av kontroll og testantistoff kan reverseres, det vil si kontrollantistoffet bindes først til overflaten og testantistoffet bringes i kontakt med overflaten deretter. Fortrinnsvis, antistoffet som er høyeste affinitet for substratantigenene bindes til substratinneholdende overflate først siden det forventes at reduksjon i binding som fremkommer for det andre antistoff (ved antagelse av at antistoffene kryssreagerer) vil være større. Ytterligere eksempler på slike analyser finnes i Saunal et al. (1995) J. Immunol. Meth 183:33-41, hvis hele beskrivelse inkorporeres her med henvisning.

Fortrinnsvis, monoklonale antistoff i samsvar med oppfinnelsen som gjenkjenner et NKG2A vil reagere med en epitop som foreligger på en vesentlig prosentandel av NK- celler i pasienter med en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse, men ved ikke signifikant reagerende andre celler, det vil si immune eller ikke- immune celler som ikke uttrykker NKG2A. Således, straks et antistoff som spesifikt gjenkjenner NKG2A på celler så som NK, fortrinnsvis humane NK- celler, identifiseres, kan det testes for dets evne til å binde til NK- celler tatt fra pasienter med autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser. Tilsvarende, det skal anerkjennes at foreliggende fremgangsmåter kan praktiseres ved anvendelse av multiple antistoff, for eksempel rettet mot forskjellige epitopesor isoformer av NKG2A på en måte som er konstruert for å maksimalt inhibere stimulering av NKG2A. I en utførelse tas NK- cellene og de dendritiske cellene, fra en pasient før administrering av antistoffene eller forbindelsene, og evnen av testantistoffene til å overvinne NKG2A- mediert inhibering av lysering av de dendritiske celler undersøkes.

I de utførelser ifølge oppfinnelsen hvor spesifikk binding eller mangel på spesifikk binding til andre antigener (for eksempel NKG2A fra andre arter, NKG2C, NKG2E, NC- reseptor) må måles,

kan analyser tilsvarende til de som er angitt over benyttes ved å erstatte det egnete antigen for NKG2A og benytte kontrollantistoff som er spesifikke for antigenet hvortil binding skal analyseres. Slike antigen og kontrollantistoff er godt kjent innen fagfeltet og mange er kommersielt tilgjengelige.

Undersøke evnen av antistoff til å inhibere NKG2A stimulering.

Identifiseringen av aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen som er i stand til å inhibere stimuleringen av NKG2A/CD94 med HLA-E eller Qa1, vil generelt involvere cellebaserte analyser for å undersøke NKG2A- aktivitet i nærvær av testantistoff. I noen utførelser vil kandidatantistoff først identifiseres basert på deres evne til å binde til NKG2A, som beskrevet supra. I andre utførelser vil cellebasert screening utføres for direkte å identifisere antistoff i stand til å inhibere NKG2A-stimulering, uavhengig av deres bindingsaffinitet. I en utførelse vil modulatorer av NKG2A identifiseres ved anvendelse av fremgangsmåter eller analyser beskrevet i U. S. Patent søknad Nr 20030171280, Braud et al. (1998) Nature 391:795-799; Lee et al. (1998) PNAS 95:5199-5204; Vance et al. (2002) PNAS 99:868-873; Brooks et al. (1999) J Immunol 162:305-313; Miller et al. J Immunol (2003) 171:1369-75;

Brooks et al. (1997) J Exp Med 185:795-800; Van Beneden et al. (2001) 4302.4311; U.S Patent søknad Nr 20030095965; og hele beskrivelsene av disse inkorporeres heri med henvisning.

I en utførelse undersøkes de aktiverende antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse for deres evne til å inhibere stimulering av NKG2A- reseptoren med ligander. Enhver av et stort antall analyser, både molekylære, cellebaserte, og dyremodellbaserte kan anvendes. I typiske utførelser vil cellebaserte analyser anvendes, hvor celler, for eksempel NK- celler som uttrykker NKG2A, eksponeres til en NKG2A- ligand (eller celler som uttrykker liganden), fortrinnsvis HLA-E, og evnen av antistoffet til å ødelegge stimulering av reseptoren undersøkes.

Enhver av et antall cellebaserte analyser kan anvendes for å undersøke NKG2-A aktivitet, inkluderende genekspresjonsbaserte aktiviteter, cytotoksisitetsbaserte analyser og proliferasjonsanalyser.

I visse utførelser vil in vitro analyser anvende celler, for eksempel NK- celler tatt fra pasienter med en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse, men generelt vil enhver NKG2A- uttrykkende celle kunne anvendes, inkluderende NK- cellelinjer så som YTS eller NK-92 (tilgjengelig fra ATCC). For eksempel kan cellelinjer transfektert med et NKG2A- kodende transgen anvendes i foreliggende analyser, så lenge stimuleringen av den uttrykte reseptor forandrer aktiviteten eller egenskapene til cellene på en detekterbar måte, for eksempel aktiverer signaltransduksjons reaksjonsveier, påvirker proliferasjon, eller forandrer cytotoksisiteten til cellene. Det skal anerkjennes at, for slike analyser, kan enhver isoform av NKG2A, CD94 eller HLA-E (se for eksempel OMIM referanser 161555, 602894, og 143010), hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning anvendes i slike analyser (eller enhver andre analyse eller metode som involverer NKG2A beskrevet heri).

I en foretrukket utførelse anvendes en cellulær analyse hvor NKG2A- uttrykkende celler, for eksempel NK- celler inkuberes med en NKG2 A- ligand så som HLA-E, eller en celle som uttrykker en NKG2A- ligand, fortrinnsvis en dendritisk celle, og evnen av en testforbindelse til å blokkere inhibering av NK- cellen undersøkes. I analyser vil lysering av de dendritiske celler i seg selv måles som en refleksjon av NK- celleaktivitet.

I en utførelse vil cellelinje etableres ved anvendelse av NK- celler fra pasienter med en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse. I et antall utførelser vil analyse anvendes med ikke- humane celler eller ikke- humane NKG2A/CD94 for eksempel ikke- humane primatceller som uttrykker NKG2A/CD94, eller en musecellelinje som uttrykker enten mus- eller human- NKG2A/CD94, med inkludering av egnet ligand (for eksempel i tilfeller av mus Qa1<).>

Binding av NKG2A til den egnete ligand forårsaker et antall fysiologiske forandringer i cellen som bærer NKG2A. Disse inkluderer forandringer i genekspresjon, cellevekst, celleproliferasjon, pH, intracellulære sekundære budbringere, for eksempel Ca<2+>, IP3, CGMP, eller cAMP, produksjon av cytokin eller aktivitet så som cytotoksisk aktivitet. Slike forandringer benevnes heri som ”NKG2A- aktivitet”. Enhver reversering av disse forandringer i nærvær av en NKG2A- ligand kan anvendes for å undersøke evnen til et testantistoff. Slik reversering benevnes heri som ”inhibering av NKG2A- aktivitet”. I en utførelse undersøkes NKG2A- aktivitet ved å detektere ekspresjon eller aktivitet av NKG2A- responsive gener eller –proteiner, for eksempel SHP-1 eller SHP2 p deres mål (se for eksempel Le Drean et al. (1998) Eur JImmunol 28:264-276, Augugliaro et al. (2003) Eur J Immunol 33:1235-141, hvis fullstendige beskrivelse inkorporeres heri med henvisning).

I enhver av de heri beskrevne analyser vil en reduksjon p 5 %, 10 %, 20 %, fortrinnsvis 30 %, 40 %, 50 %, mest fortrinnsvis 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 96 %, eller større reduksjon i ethvert detekterbart mål på NKG2A- aktivitet i cellene, indikerer at testantistoffet er en egnet kandidat for anvendelse i foreliggende fremgangsmåter.

I tillegg til binding vil evne av antistoffene eller forbindelsene til å forårsake at NK- celler inhiberer proliferasjon eller aktivering av, eller, fortrinnsvis dreper, NKG2A ligand bærende målceller, for eksempel dendritiske celler, visse cancer celler, eller visse viral infiserte celler, kan undersøkes. I en utførelse introduseres humane NK- celler som uttrykker NKG2A- reseptoren sammen med NKG2-A ligand bærende målceller i plater, for eksempel 96 brønns plater, og eksponeres til forskjellige mengder testantistoff. Ved å tilsette et vitalt fargestoff, for eksempel et som opptas av intakte celler, så som AlamarBlue (BioSource International, Camarillo, CA), og vaske for å fjerne overskudd av fargestoff, kan antallet levedyktige celler måles ved hjelp av optisk tetthet (jo flere celler som er drept av antistoffet, jo lavere er den optiske tetthet). (Se for eksempel Connolly et al. (2002) J Pharm Exp Ther 298:25-33, hvis beskrivelse heri inkorporeres med henvisning i sin helhet.

Mest fortrinnsvis, de aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen oppviser ikke vesentlig spesifikk binding til Fc- reseptorene. Slike antistoff kan omfatte konstante regioner av forskjellige tungkjeder som erkjent for å ikke binde Fc- reseptorer. Et slikt eksempel er en IgG4- konstant region.

Alternativt, antistoffragmentene som ikke omfatter konstante regioner, som Fab eller F(ab ́)2- fragmenter kan anvendes for å unngå Fc- reseptorbinding. Fc- reseptorbinding kan undersøkes i samsvar med fremgangsmåte kjent innen fagfeltet, inkluderende for eksempel testing av binding av et antistoff til Fc- reseptorprotein i et BIACORE analyse. Videre, enhver annen type antistoff kan anvendes hvor Fc- delen er modifisert for å minimere eller eliminere binding til Fc- reseptorer (se for eksempel WO03101485, hvis beskrivelse heri inkorporeres med henvisning). Analyser, for eksempel cellebaserte analyser, for å undersøke Fc- reseptorbinding er godt kjent innen fagfeltet, og beskrevet for eksempel i WO03101485.

Fortrinnsvis, det aktiverende monoklonale antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter en Fc- region, fortrinnsvis en Fc- region av IgG4-eller G2- subtype, eller en FC- region av IgG1- eller G3- subtype som har blitt modifisert for å redusere binding til Fc- reseptorer. Mest fortrinnsvis er G4- eller G2- Fc- regionen modifisert for ytterligere å minimere eller fullstendig hindre binding til Fc- reseptorene (se for eksempel Angal et al. (1003) Molecular Immunology 30:105-108, hvis fullstendige beskrivelse heri inkorporeres med henvisning).

IgG4- isotyp er ikke totalt i mangel av Fc- bindingsaktivitet, men viser noe binding til Fc- gamma (”Fcg”) reseptorer (Newman et al. (2001) Clin. Immunol.98(2):164-174). En ikke- modifisert IgG4 monoklonalt antistoff kan forårsake celleuttømming in vivo (Isaacs et al, (1996) Clin. Exp. Immunol.106, 427). Sekvensen rapportert å være hovedansvarlig for binding til Fcg- reseptorer har blitt definert som LLGPS (Burton et al, (1002) Adv. Immunol.51:1). Denne sekvens, lokalisert ved den N terminale ende (EU- nummerering 234-239) av tungkjede CH2 region, er konservert i menneske IgG1, IgG3, og murin IgG2a isotyper, og alle disse binder Fcg- reseptorer sterkt. Villtypesekvensen for IgG4 isotypen inneholder et fenylalanin ved posisjon 234, som gir motivet FLGGPS. Den murine IgG2b isotype, som også er en svak binder av Fcgreseptorer, inneholder sekvensen LEGGPS. Newman et al. (2001) inkorporerte glutaminsyreenheten assosiert med murin IgG2b inn i human villtype IgG4 CH2 domene for å gi sekvensen FEGGPS som reduserte ytterligere CDC- og ADCC-aktiviteter og i hovedsak eliminerte binding til FcgRI og FcgRII in vitro.

I tillegg til introduksjon av glutaminsyre ble erstatningen av serin 228 med prolin resulterte i et molekyl som var mer stabilt enn villtype IgG4. IgG4- molekylet syntes å vise ueffektiv dannelse av interkjede disulfidbindinger i hengselregionen. Introduksjon av et prolin ble sagt å tilveiebringe rigiditet til hengselet og fremme mer effektiv interkjedebinding, og at nærvær av et serin ved posisjon 228 kan fremme gunstig kobling av intrakjede i stedet for interkjede disulfidbindinger med nabo cysteinmolekyler. Enhver slik modifikasjon og andre kan enkelt utføres på antistoffene ifølge oppfinnelsen. I mange tilfeller kan et inhibitorisk antistoff ifølge oppfinnelsen omdannes til et aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen ved å oppheve det meste eller alt av tidligeres evne til å binde en Fc- reseptor.

Undersøking av evnen for antistoff mot NKG2A til å inhibere NK celleaktivitet.

Identifiseringen av inhibitorisk antistoff ifølge oppfinnelsen som er i stand til å binde NKG2A og inhibere NK celleaktivitet, fortrinnsvis NK cellelysering av celler undersøkes ved anvendelse av cellebaserte analyser. Typisk, en NKG2A- bærende celle, så som en NK- celle, vil settes i forbindelse med en NK- mottagende celle, så som RMA, en tapp 2 derivat av RMA, P815 og K562 i nærvær av varierende mengde av testantistoff. Prosentandel av NK- mottagelige celler som drepes i nærvær av testantistoff sammenlignes med dreping i fravær av antistoff.

I en annen analyse for et inhibitorisk antistoff ifølge oppfinnelsen inkuberes NK-celler i nærvær av varierende mengder testantistoff for å bestemme dette antistoffs direkte drepepåvirkning på NK- celler sammenlignet med NK- celledød i fravær av antistoff. NK- celledreping kan også bestemmes i en analyse som inkluderer nærvær av NK- mottagelige celler.

I enhver av de heri beskrevne analyser indikerer en reduksjon på 5 %, 10 %, 20 %, fortrinnsvis 30 %, 40 %, 50 %, mest fortrinnsvis 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % av NK- mottagelig celledreping og/eller en økning på 5 %, 10 %, 20 %, fortrinnsvis 30 %, 40 %, 50 %, mest fortrinnsvis 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 % av NK celledød at testantistoffet er et inhibitorisk antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse.

Kryssreaktivitet av NKG2A mellom primatarter.

Det har blitt oppdaget at der er en kryssreaktivitet mellom humane og ikke- humane primat NKG2A. Således, analyser for å undersøke effekten av et anti NKG2A antistoff på reseptoraktivtet kan utføres ved anvendelse av et NKG2A- polypeptid fra ethvert primat. For eksempel, slike analyser kan utføres ved anvendelse av ikkehuman primater NK- celler in vitro, eller antistoffene kan administreres til ikkehumane primater, og deres evne til å modulere NKG2A- aktivitet, for eksempel som reflektert i forandringer i NK celleaktivitet, kan måles.

Produksjon av antistoff.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan produseres med enhver av en rekke teknikker kjent innen fagfeltet. Typisk produseres de ved immunisering av et ikkehumant dyr, fortrinnsvis en mus, med et immunogen omfattende en NKG2A (eller, for alle utførelser beskrevet heri, for CD94, eller HLA-E) reseptor på overflaten av celler så som T- celler eller NK- celler eller dendritiske celler. Reseptoren kan omfatte hele celler eller cellemembraner, fullengdesekvensen av en NKG2A (eller CD94, etc.), eller et fragment eller derivat av enhver NKG2A, typisk et immunogenisk fragment, det vil si en del av polypeptidet som omfatter en epitop eksponert på overflaten av celler som uttrykker reseptoren. Enhver isoform eller spleisefragment av NKG2A kan anvendes (se for eksempel OMIM 161555, hvis beskrivelse heri inkorporeres med referanse). Slike fragmenter inneholder typisk minst 7 konsekutive aminosyrer av den modne polypeptidsekvens, enda mer foretrukket minst 10 konsekutive aminosyrer derav. De er i hovedsak avledet fra det ekstracellulære domene av reseptoren. I foretrukne utførelser er NKG2A- reseptoren som anvendes for å generere antistoff en human reseptor. I visse utførelser kan NKG2A foreligge i en heterodimer, for eksempel i assosiasjon med CD94 anvendes for å generere antistoff.

I en mest foretrukket utførelse omfatter immunogene en villtype human NKG2A reseptor polypeptid i et lipidmembran, typisk ved overflaten av en celle.

I en spesifikk utførelse omfatter immunogene intakte NK- celler, spesielt intakte humane NK- celler, valgfritt behandlet eller lysert. I en foretrukket utførelse er immunogene en NK- celle tatt fra en pasient med en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse.

I en utførelse er antistoffene avledet fra en eller flere allerede eksisterende monoklonale antistoff som gjenkjenner NKG2A, for eksempel Z199 (Della Chiesa et al, (2003) Eur. J. Immunol.33:1657-1666), Z270, 3S9 (se for eksempel U.S. patentsøknad Nr.0030095965), eller 20D5 (Vance et al, (1990) J. Exp. Med.

190(12):1801-1812), hvis hele beskrivelse heri inkorporeres med henvisning). For visse applikasjoner kan slike antistoff være direkte eller indirekte merket (det vil si ved anvendelse av et merket sekundært antistoff) for anvendelse som diagnostiske antistoff for å bestemme forekomst av NKG2A på celler, fortrinnsvis NK- celler fra pasienter med autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser. I tillegg, antistoffene kan gjøres egnet for human administrering som beskrevet heri for anvendelse i foreliggende terapeutiske fremgangsmåter.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være fullengde antistoff eller antistoffragmenter eller derivater. Eksempler på antistoffragmenter inkluderer Fab, Fab ́, Fab ́-SH, F(ab ́)2 , og Fv- fragmenter; diabodies; enkeltkjede Fv (scFv) molekyler, Enkeltkjede polypeptider inneholdende kun en lettkjede variabel domene, eller et fragment derav som inneholder de tre CDRer av lettkjede variabel domene, uten en assosiert tungkjede motiv; enkeltkjede polypeptider inneholdende kun en tungkjede variabel region, eller et fragment derav inneholdende de tre CDRer av tungkjede variabel region, uten en assosiert lettkjede motiv; og multispesifikke antistoff dannet fra antistoffragmenter Slike fragmenter og derivater og fremgangsmåter for å fremstille disse er godt kjent innen fagfeltet. For eksempel kan pepsid anvendes for å oppkutte et antistoff under disulfidkoblingene i hengselregionen for å produsere F(ab ́)2 , en dimer av Fab som i seg selv er en lettkjede koblet til VH- CH1 med en disulfid binding. F(ab ́)2 kan reduseres under milde betingelser for å bryte disulfidkoblingen i hengselregionen, og dermed omdanne F(ab ́)2 – dimeren til en Fab ́ - monomer.

Fab ́- monomeren er i hovedsak Fab med dimer av hengselregionen (se Fundamental Immunology (Paul ed., 3d ed.1993)). Idet forskjellige antistoff fragmenter defineres i termer av oppkuttingen av et inntakt antistoff, vil en fagkyndig innen feltet anerkjenne at slike fragmenter kan syntetiseres de novo enten kjemisk eller ved anvendelse av rekombinant DNA- metodologi.

I en foretrukket utførelse er de aktiverende antistoff ikke- depleterende antistoff, noe som betyr at de binder til NK- celler og inhiberer NKG2A- stimulering, men fører ikke til dreping av de NKg2A- uttrykkende celler. Evnen til å drepe NKG2A- uttrykkende celler kan undersøkes ved anvendelse av standard metoder, inkluderende in vitro analyser for å sikre at antistoffene ikke er cytotoksiske, og direkte dreper bundne celler, og likeledes in vivo analyser hvor antistoffene administreres og nivåer og aktivitet av NKG2A- uttrykkende celler undersøkes. I en bestemt foretrukket utførelse, som beskrevet supra, vil antistoff anvendes som ikke er gjenkjent (eller kun svakt gjenkjent) av Fc- reseptorer. Således, foretrukne antistoff inkluderer IgG4, fragmenter så som Fab eller F(ab ́)2 , eller ethvert annet IgG, IgE, IgM, etc hvor Fcdelen har blitt modifisert for å redusere eller eliminere binding av Fc- reseptorer (se for eksempel WO03101485, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvising).

Fremstilling av monoklonale eller polyklonale antistoff er godt kjent innen fagfeltet, og enhver av et stort antall tilgjengelige teknikker kan anvendes (se for eksempel Kohler & Milstein, Nature 256:495-497 (1975); Kozbor et al., Immunology Today 4: 72 (1983); Cole et al., pp.77-96 in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy (1985)). Teknikker for produksjon av enkeltkjede antistoff (U.S. patent Nr 4,946, 778) kan tilpasses for å produsere antistoff til ønskete polypeptider, for eksempel NKG2A. Videre, transgene mus, eller andre organismer så som andre pattedyr, kan anvendes for å uttrykke humaniserte, kimeriske, eller tilsvarende modifiserte antistoff. Alternativt kan fagdisplay teknologi anvendes for å identifisere antistoff og heteromeriske Fab- fragmenter som spesifikt binder til utvalgte antigen (se for eksempel McCafferty et al., Nature 348:552-554 (1990); Marks et al., Biotechnology 10:779-783 (1992)).

I en utførelse omfatter fremgangsmåten selektering, fra et bibliotek eller repertoar, av et monoklonalt antistoff eller et fragment eller derivat derav som kryssreagerer med et NKG2A reseptor polypeptid. For eksempel kan repertoaret være ethvert (rekombinant) repertoar av antistoff eller fragmenter derav, valgfritt fremvist med enhver egnet struktur (for eksempel fag, bakterier, syntetisk kompleks, etc.).

Trinnet å immunisere et ikke- humant pattedyr med et antigen kan utføres på mange måter godt kjent innen fagfeltet (se for eksempel E. Harlow and D. Lane, Antibodies: A Laboratory Manual., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY (1988)). Generelt, immunogene suspenderes eller oppløses i en buffer, valgfritt med en adjuvant, så som komplett Freund ́s adjuvant. Fremgangsmåter for bestemme mengden av immunogen, typer buffer og mengde adjuvant er godt kjent for fagkyndige innen feltet og skal ikke på noen måte begrense foreliggende oppfinnelse.

Tilsvarende, lokalisering og frekvens av immunisering tilstrekkelig til å stimulere produksjon av antistoff er også godt kjent innen fagfeltet. I en typisk immuniseringsprotokoll injiseres de ikke- humane dyr intraperitonalt med antigen på dag 1 og igjen ca en uke senere. Dette følges av recall- injeksjoner av antigen rundt dag 20, valgfritt med adjuvant så som ukomplett Freund ́s adjuvant. Recall- injeksjonene utføres intravenøst og kan repeteres flere påfølgende dager. Dette etterfølges av en booster injeksjon ved dag 40, enten intravenøst eller intraperitonealt, typisk uten adjuvant. Denne protokoll resulterer i produksjon av antigenspesifikke antistoffproduserende B- celler etter ca 40 dager. Andre protokoller kan også anvendes så lenge de resulterer i produksjon av B- celler som uttrykker et antistoff som er rettet mot antigenet som anvendes i immuniseringen.

I en annen utførelse isoleres lymfocytter fra en ikke- immunisert ikke- human pattedyr, disse vokser in vitro, og eksponeres deretter til immunogenet i cellekultur. Lymfocyttene høstes deretter, og fusjonstrinnet beskrevet nedenfor utføres.

For monoklonale antistoff, som er foretrukket for formålene med foreliggende oppfinnelse, er neste trinn isolering av celler, for eksempel lymfocytter, splenocytter eller B- celler fra det immuniserte ikke- humane pattedyr og den påfølgende fusjon av disse splenocytter, eller B- celler, eller lymfocytter med en imortalisert celle for å danne en antistoffproduserende hybridom. Således, termen ”fremstille antistoff fra en immunisert dyr” som anvendt heri inkluderer å oppta B- celler/splenocytter/lymfocytter fra et immunisert dyr og anvendes disse celler for å produsere en hybridom som uttrykker antistoff, og likeledes å oppta antistoff direkte fra serum av et immunisert dyr. Isolering av splenocytter, for eksempel fra et ikke- humant pattedyr er godt kjent innen fagfeltet, for eksempel involverer det fjerning av milt fra et anestetisert ikke- humant pattedyr, kutte denne i små biter og skvise splenocyttene fra den spleniske kapsel og gjennom et nylongitter av et cellefilter til en egnet buffer for å produsere en enkeltcelle suspensjon. Cellene vaskes, sentrifugeres og resuspenderes i en buffer som lyserer alle røde blodceller. Løsningen sentrifugeres igjen, og resterende lymfocytter i pellet resuspenderes til slutt i fersk buffer.

Straks de er isolert og presentert i enkeltcellesuspensjon fusjoneres de antistoff produserende celler til en inmortal cellelinje. Dette er typisk en musemyelom cellelinje, selv om mange andre inmortale cellelinjer kan nyttes for å etablere hybridomer kjent innen fagfeltet. Foretrukket myrin myelom linje inkluderer, men er ikke begrenset til, de som er avledet fra MOPC-21 og MPC-11 musetumorer tilgjengelig fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. U.S.A, X62 Ag8653 og SP-2 celler tilgjengelig fra American Type Culture Collection, Rockville, Maryland U.S.A. Fusjonen effektueres ved anvendelse av polyetylenglykol eller lignende. De resulterende hybridomer får deretter vokse i selektivt medium som inneholder en eller flere substanser som inhiberer vekst eller overlevelse av de ikkefusjonerte parentale myelomceller. For eksempel, dersom de parentale myelomceller mangler enzymet hypoksantin guanin fosforibosyl transferase (HGPRT eller HPRT), vil dyrkningsmedium for hybridomer typisk inkludere hypoksantin, aminokterin, og tymidin (HAT medium), hvilke substanser hindrer vekst av HGPRT- manglende celler.

Hybridomaene kan vokse på et matesjikt av makrofager. Makrofangene er fortrinnsvis fra littermater av ikke- humant pattedyr anvendt for å isolere splenocytter og primes typisk med ukomplett Freunds adjuvant eller lignende flere dager før utsåing av hybridomaene. Fusjonsmetoder er beskrevet for eksempel i (Goding, “Monoclonal Antibodies: Principles and Practice,” pp.59-103 (Academic Press, 1986)), hvis beskrivelse inkorporeres heri med referanse.

Cellene tillates å vokse i seleksjonsmedium for tilstrekkelig tid til kolonidannelse og produksjon av antistoff. Dette tar vanligvis mellom 7 og 14 dager. Hybridomkoloniene undersøkes deretter for produksjon av antistoff som spesifikt gjenkjenner det ønskede substrat, for eksempel NKG2A. Analysen er typisk en kolirimetrisk ELISA-type analyse, selv om mange analyser kan benyttes som er tilpasset til brønner hvor hybridomer vokser. Andre analyser inkluderer immunpresipitering og radioimmunoanalyse. Brønnene som er positive for det ønskede antall antistoffproduksjon undersøkes for å bestemme om en eller flere distinkte kolonier foreligger. Dersom mer enn en koloni foreligger kan cellene reklones og vokse på nytt for å sikre at kun en enkelt celle har gitt opphav til den koloni som produserer det ønskede antistoff. Positive brønner med en enkelt koloni klones typisk og reundersøkes for å sikre at kun en monoklonalt antistoff detekteres og produseres.

Hybridomer som er bekreftet å produsere et monoklonalt antistoff ifølge oppfinnelsen oppskaleres deretter til større mengder i et egnet medium, så som DMEM eller RPMI- 1640. Alternativt kan hybridomcellene vokse in vivo i askites tumorer i et dyr.

Etter tilstrekkelig vekst for å produsere det ønskede monoklonale antistoff separeres vekstmedium som inneholder monoklonalt antistoff (eller askitesfluid) bort fra cellene, og det monoklonale antistoff som foreligger renses. Rensing utføres typisk med gelelektroforese, dialyse, kromatografi ved anvendelse av protein A eller protein G Sefarose, eller en antimus Ig koblet til et faststoff støttemedium så som agarose eller Sefarosekuler (alle beskrevet for eksempel i Antibody Purification Handbook, Amersham Biosciences, publication No.18-1037-46, utgave AC), hvis beskrivelse heri inkorporeres med henvisning.

Det bundne antistoff elueres typisk fra protein A/protein G kolonner ved anvendelse av lav pH buffere (glysin eller acetatbuffere av pH 3,0 eller mindre) med umiddelbar nøytralisering av antistoffinneholdende fraksjoner. Disse fraksjoner samles, dialyseres og konsentreres etter behov.

I foretrukne utførelse vil det DNA som koder for et antistoff som binder en determinant som foreliger på NKG2A- immunogenet bli isolert fra hybridom og plassert i en egnet ekspresjonsvektor for transfeksjon inn i en egnet vert. Verten anvendes deretter for den rekombinante produksjon av antistoffet, varianter derav, aktive fragmenter derav, eller humaniserte eller kimerisk antistoff som omfatter den atingen gjenkjennende del av antistoffet. Fortrinnsvis, DNA som anvendes i denne utførelse koder for et antistoff som gjenkjenner et determinant foreliggende på NKG2A- reseptorer på NK- celler, så som NK- celler som er tatt fra pasient med en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse.

DNA som koder for det monoklonale antistoff ifølge oppfinnelsen kan enkelt isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle prosedyrer (for eksempel ved anvendelse av oligonukleotid prober som er i stand til å bindes spesifikt til gener som koder for tungkjede og lettkjede av murine antistoff). Straks de er isolert kan DNA plasseres i ekspresjonsvektorer, som deretter transfekteres i vertsceller så som E-coli celler, simian COS celler, Kinesisk hamster eggstokk (CHO) celler, eller myelomceller som ikke på annen måte produserer immunoglobulinprotein, for å oppnå syntese av monoklonale antistoff i de rekombinante vertsceller. Rekombinant ekspresjon i bakterier av DNA som koder antistoff er godt kjent innen fagfeltet (se for eksempel Skerra et al. (1993) Curr. Op. Immunol.5:256; and Pluckthun (1992) Immunol. Revs. 130:151). Antistoff kan også produseres ved seleksjon av kombinatoriske bibliotek av immunoglobuliner, som beskrevet for eksempel i Ward et al. (1989) Nature 341:544.

I en utførelse binder antistoffet i hovedsak til samme epitop eller determinant som et av monoklonale antistoff Z199 eller Z270. I en foretrukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff Fab- eller F(ab ́)2 delen av Z270.

I samsvar med en annen foretrukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff tre CDRer av variabel tungkjederegion av Z270 (CDR1= aminosyre 31 til 35 i SEQ ID NO:2, CDR2= aminosyre 50 til 66 i SEQ ID NO:2, CDR3= aminosyre 99 til 108 i SEQ ID NO:2). Mer foretrukket er et monoklonalt antistoff som omfatter den variable tungkjederegion av Z270 (Z270VH; SEQ ID NO:2). Enda mer foretrukket er et monoklonalt antistoff som omfatter den variable tungkjederegion av Z270 og er transkribert og translatert fra en nukleotid sekvens omfattende chZ270VH (SEQ ID NO:3). I samsvar med en annen forerukket utførelse omfatter det monoklonale antistoff de tre CDRer av variabel lettkjederegion av Z270 (CDR1= aminosyre 24 til 34 av SEQ ID NO:6; CDR2= aminosyre 50 til 56 av SEQ ID NO:6; CDR3= aminosyre 89- 95 av SEQ ID NO:6). Mer foretrukket er et monoklonalt antistoff som omfatter den variable lettkjederegion av Z270 (SEQ ID NO:6). Enda mer foretrukket er et monoklonalt antistoff som omfatter den variable lettkjederegion av Z270 og et transkribert og translatert fra en nukleotid sekvens omfattende chZ270VK (SEQ ID NO:7). I en enda mer foretrukket utførelse er antistoffet Z270. Z270 ble deponert den 22 desember 2005 ved Collection Nationale de Culture de Microorganismes, Institute Pasteur, 25, Rue du Docteur Roux, F-75725 Paris, France, under katalognummer I-3549.

Både aktivering og inhibering av monoklonale antistoff mot NKG2A vil generelt bli modifisert slik at de er egnet for terapeutisk anvendelse i mennesker. For eksempel kan de humaniseres, kimeriseres eller selekteres fra et bibliotek av humane antistoff ved anvendelse av fremgangsmåter godt kjent inne fagfeltet. Slike human- egnete antistoff kan anvendes direkte i foreliggende terapeutiske fremgangsmåter, eller kan ytterligere derivatiseres til cytotoksiske antistoff, som beskrevet infra, for anvendelse i fremgangsmåtene.

I en foretrukket utførelse kan DNA av et hybridom som produserer et antistoff ifølge oppfinnelsen, for eksempel et antistoff som binder til hovedsak samme epitop som Z199 eller Z270, modifiseres før innsetting i en ekspresjonsvektor,

for eksempel ved å substituere kodesekvensen av human tung- og lettkjede konstante domener i stedet for de ikke homologe ikke- humane sekvenser (for eksempel Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851) eller ved kovalent å koble immunoglobulinkodene sekvens, hele eller deler av kodesekvensen, fra et ikkeimmunoglobulin polypeptid. PÅ denne måten kan ”kimeriske” eller ”hybrid” antistoff fremstilles som har bindingsspesifisiteten til det opprinnelige antistoff. Typisk er slike ikke immunoglobulin polypeptider substituert for konstant domener av et antistoff ifølge oppfinnelsen.

I en utførelse omfatter antistoffet den variable tungkjederegion av Z270 fusjonert (SEQ ID NO:2) til en human tungkjede konstant region. I en foretrukket utførelse er den humane tungkjede konstante region et IgG4 konstant region. I en annen foretrukket utførelse er den humane tungkjede konstante region en IgG1 konstant region, fortrinnsvis en human IgG1m (-1, -2, -1) konstant region. Fortrinnsvis, en slik human tungkjede konstant region- inneholdende antistoff transkriberes og translateres fra en nukleotidsekvens som omfatter chZ270VH (SEQ ID NO:3).

I en annen foretrukket utførelse omfatter antistoffet den variable lettkjederegion av Z270 fusjonert (SEQ ID NO:6) til en human lettkjede konstantregion. Mer foretrukket er et antistoff som omfatter den variable lettkjederegion av Z270 fusjonert til human kappa (k3) lettkjede konstantregion. Fortrinnsvis, en slik human lettkjede konstant region- inneholdende antistoff transkriberes og translateres fra en nukleotidsekvens omfattende chZ270VK (SEQ ID NO:7).

Enda mer foretrukket er et antistoff omfattende både 270 VK fusjonert til et humant lettkjede konstantregion og 270VK fusjonert til en human tungkjede konstantregion. Fortrinnsvis, den lettkjede konstante region er en kappa (k3) konstant region og tungkjede konstantregion er valgt blant IgG4 eller IgG1m (-1, -2, -3). Også foretrukket, hver av tungkjede og lettkjede av antistoffet transkriberes fra en nukleotid sekvens omfattende en nukleotidsekvens som omfatter chZ270VH (SEQ ID NO:3) og en nukleotid omfatende chZ270VK (SEQ ID NO:7), respektivt.

I en spesielt foretrukket utførelse er antistoffet ifølge oppfinnelsen humanisert.

”Humaniserte” former av antistoff i samsvar med oppfinnelsen er spesifikke kimeriske immunoglobuliner, immunoglobulinkjeder eller fragmenter derav (så som Fv, Fab, Fab ́, F(ab ́)2 , eller andre antigen bindende subsekvenser av antistoff) som inneholder minimal sekvens avledet fra det murine eller andre ikke- humane immunoglobelin. På den største del er humaniserte antistoff humane immunoglobuliner (mottaker antistoff) hvor enhetene har en komplementær- bestemmende region (CDR) av mottakeren erstattet av enheter fra en CDR av det opprinnelige antistoff (donorantistoff) mens man opprettholder ønsket spesifisitet, affinitet og kapasitet fra det opprinnelige antistoff. I noen tilfeller kan Fv rammeverkenhetene av det humane immunoglobulin erstattes med korresponderende ikke- humane enheter. Videre, humaniserte antistoff kan omfatte enheter som ikke finnes i enten mottakerantistoffet eller i det importerte CDR eller rammeverksekvensene. Disse modifiseringer er utført for ytterligere å raffinere og optimalisere antistoff ytelsen. Generelt, det humaniserte antistoff vil omfatte i hovedsak alle av minst en, og typisk to variable domener hvor alle eller i hovedsak alle av CDR- regionene korresponderer til de av det opprinnelige antistoff og alle eller i hovedsak alle av FR- regionene er de av en human immunoglobulin konsensussekvens. For ytterligere detaljer se Jones et al. (1986) Nature 321: 522; Reichmann et al. (1988) Nature 332: 323; Verhoeyen et al. (1988) Science 239:1534 (1988); Presta (1992) Curr. Op. Struct. Biol.2:593; som alle inkorporeres heri med henvisning I sine helheter.

Valg av humane variable domener, både lette og tunge, som kan anvendes i fremstilling av humaniserte antistoff er svært viktig for å redusere antigenisitet. I samsvar med såkalte ”beste tilpasning” metode, screenes sekvensen av det variable domene av et antistoff ifølge oppfinnelsen mot hele biblioteket av kjente humane variabel domene sekvenser. Den humane sekvens som er nærmest til den for mus blir deretter akseptert som det humane rammeverk (FR) for det humaniserte antistoff (Sims et al. (1993) J. Immun., 151:2296; Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol.

196:901).

En annen metode anvender et bestemt rammeverk fra konsensus sekvensen av alle humane antistoff av en bestemt undergruppe av lett- eller tungkjeder. Det samme rammeverk kan anvendes for flere forskjellige humaniserte antistoff (Carter et al. (1992) PNAS 89:4285; Presta et al. (1993) J. Immunol.51:1993).

Det er videre viktig av antistoffene humaniseres samtidig som de opprettholder deres høye affinitet for NKG2A, fortrinnsvis human og ikke- human primat NKG2A, og andre gunstige biologiske egenskaper. For å oppnå dette mål, i samsvar med foretrukket fremgangsmåte, fremstilles humanisert antistoff med en fremgangsmåte for analyse av parentalsekvensene og forskjellige konseptuelle humaniserte produkter som anvender tredimensjonale modeller av parental og humaniserte sekvenser. Tredimensjonale immunoglobulinmodeller er tilgjengelig og er kjente for fagkyndige innen feltet. Datamaskinprogrammer er tilgjengelige som illustrerer og fremviser mulige tredimensjonale konformasjonsstrukturer av utvalgte kandidat immunoglobulinsekvenser. Ved undersøkelse av disse fremvisninger muliggjør man analyse og den sannsynlige funksjon til enhetene i funksjonering av kandidat immunoglobulinsekvensen, det vil si analyse av enhetene som påvirker evnene av kandidat immunoglobuliner til å binde dets antigen. På denne måte kan FR- enheter selekteres og kombineres fra konsensus og importsekvenser slik at det ønskete antistoff karakteristika, så som øket affinitet for målantigen(er) oppnås. Generelt CDR- enhetene er direkte og mest vesentlig involvert i å påvirke antistoffbinding.

I foretrukne eksempler tilveiebringer oppfinnelsen humane eller humaniserte aktiverende anti NKG2A antistoff som har en halveringstid på minst 5, 6, 8, 9, 10, 15 eller 20 dager, som i vesentlig grad ikke binder human FcgammaRIIIa (CD16). Mer fortrinnsvis, det aktiverende anti NKG2A antistoff er et humanisert antistoff og fullstendig konkurrerer med et Z199 eller Z270 antistoff for binding til human NKG2A. For formålet å illustrere foretrukket antistoff egnet for anvendelse i samsvar med metodene beskrevet heri, kan et Z199 eller Z270 antistoff anvendes for å fremstille et humanisert antistoff.

Foretrukne humaniserte antistoff i samsvar med oppfinnelsen omfatter et humant rammeverk, minst en CDR fra et ikke- humant antistoff, og hvor enhver konstant region som foreligger i hovedsak identisk til en human immunoglobulin konstant region, for eksempel minst ca 60- 90 %, fortrinnsvis minst 95 % identisk. Således, alle deler av et humanisert antistoff, med unntak muligens for CDRene, er i hovedsak identiske til korresponderende deler av en eller flere native humane antistoffsekvenser. I noen tilfeller vil det humaniserte antistoff, i tillegg til CDRer fra en ikke- humant antistoff kunne inkludere ytterligere, ikke- humane enheter i den humane rammeverk regionen.

Konstruksjon av humanisert antistoff kan utføres som følger. Idet en aminosyre faller under følgende kategorier ka rammeverk aminosyre av et humant antistoff anvendes (akseptor antistoff) erstattes med et rammeverk aminosyre fra en CDR tilveiebringende ikke- humant antistoff (donorantistoff): a) aminosyren i den humane rammeverk region av akseptor antistoffet er uvanlig for humant antistoff ved denne posisjon, mens den korresponderende aminosyre i donor antistoffet er typisk for humant antistoff i denne posisjon; b) posisjonen av aminosyren umiddelbart tilgrensende til en av CDRene; eller c) aminosyren er i stand til å interagere med CDRene i en tertiær struktur antistoffmodell (se C. Queen et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86, 10029 (1989), og Co et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 2869 (1991)) hvis beskrivelser inkorporeres fullstendig med henvisning.

For ytterligere detaljert beskrivelse av produksjon av humanisert antistoff, se Queen et al., op. cit. and Co et al, op. cit. and U.S. Pat. Nos.5,585,089; 5,693,762, 5,693,761, og 5,530,101, hvis beskrivelser inkorporeres i helhet med referanser. Vanligvis, CDR- regionene i humanisert antistoff er i hovedsak identiske, og mer vanligvis, identiske til korresponderende CDR- regioner i museantistoff hvorfra de ble avledet. Selv om det ikke vanligvis er ønskelig, er det noen ganger mulig å fremstille en eller flere konservative aminosyresubstitueringer av CDR- enheter uten vesentlig å påvirke bindingsaffiniteten av det resulterende humaniserte antistoff. Noen ganger kan substitueringer av CDR- regioner forsterke bindingsaffinitet.

Med unntak av de spesifikke aminosyresubstitueringer beskrevet over, er rammeverkregionene av humanisert antistoff vanligvis i hovedsak identiske, og mer vanlig, identiske til rammeverkregionene av de humane antistoff hvorfra de ble avledet. Selvsagt, mange av aminosyrene i rammeverkregionen gir lite eller ingen direkte bidrag til spesifisiteten eller affiniteten av et antistoff. Således, mange individuelle konservative substitueringer av rammeverkenheter kan tolereres uten å betydelig forandre på spesifisiteten eller affiniteten av det resulterende humaniserte antistoff. Antigen bindingsregionen av det humaniserte antistoff, den ikke- humane del, kan avledes fra et antistoff av ikke- human opprinnelse, benevnt som donor antistoff, som har spesifisitet for NKG2A. For eksempel, et egnet antigen bindende region kan avledes fra en Z199 eller Z270 monoklonalt antistoff. Andre kilder inkluderer NKG2A- spesifikke (blokkerende) antistoff oppnådd fra ikke- humane kilder, så som gnagere (for eksempel mus eller rotte, kanin, gris, geit, eller ikkehumant primat (for eksempel ape) eller kamelid (for eksempel kameler og lama). Ytterligere, andre polyklonale eller monoklonale antistoff, så som antistoff som binder til den samme eller lignende epitop som en Z199 eller Z270 antistoff, kan fremstilles (for eksempel Kohler et al., Nature, 256:495-497 (1975); Harlow et al., 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor, N.Y.); and Current Protocols in Molecular Biology, Vol.2 (Supplement 27, Summer '94), Ausubel et al., Eds. (John Wiley & Sons: New York, N.Y.), Chapter 11 (1991)).

I en utførelse omfatter det humaniserte antistoff som har bindingsspesifisitet for human og ikke- human primat NKG2A minst en CDR av ikke- human opprinnelse. For eksempel, et humanisert antistoff som har en bindingsspesifisitet for human og ikke- human NKG2A omfatter en tungkjede og en lettkjede. Lettkjeden kan omfatte en CDR avledet fra et antistoff av ikke- human opprinnelse som binder NKG2A og en FA – avledet fra en lettkjede av human opprinnelse. For eksempel, lettkjeden kan omfatte CDR1, CDR2, og/eller CDR3 som har aminosyresekvensen lignende eller i hovedsak den samme som den respektive CDR av enhver av Z199 eller Z270 antistoff slik at antistoffet spesifikt binder til det humane og ikke- humane primat NKG2A.

Tungkjeden kan omfatte en CDR avledet fra et antistoff fra et ikke- human opprinnelse som binder NKG2A og en FR avledet fra en tungkjede av human opprinnelse. For eksempel, tungkjeden kan omfatte CDR1, CDR2 og CDR3 som har aminosyresekvensen angitt nedenfor eller en aminosyre tilsvarende eller i hovedsak samme som den respektive CDR av Z199 eller Z270 antistoffene slik at antistoffet spesifikt binder til det humane og ikke- humane primat NKG2A.

En utførelse ifølge oppfinnelsen er et humanisert antistoff som spesifikt binder til human og ikke- human primat NKG2A og omfatter en humanisert lettkjede omfattende tre lettkjede CDRer fra en Z199 eller Z270 antistoff og en lettkjede variabel region rammeverksekvens fra en human antistoff lettkjede. Oppfinnelsen omfatter videre en humanisert tungkjede som omfatter tre tungkjeder CDRer fra en Z199 eller Z270 antistoff og en tungkjede variabel region rammeverksekvens fra en human antistoff tungkjede.

Den del av det humaniserte antistoff eller antistoffkjede som er av human opprinnelse (den humane del) kan avledes fra enhver egnet humant antistoff eller antistoffkjede. For eksempel, en human konstant region eller del derav, dersom foreliggende, kan avledes fra kappa eller lambda lettkjeder, og/eller gamma (for eksempel gamma1, gamma2, gamma3, gamma4, μ, alfa, (for eksempel alfa1, alfa2), delta eller epsilon tungkjede av human antistoff, inkluderende alleliske varianter. En bestemt konstant region, så som IgG2b eller IgG4, varianter eller porsjoner derav kan utvelges for hale- effektor funksjon. De siste konstante regioner, eller deler derav er spesielt foretrukket idet de ikke i vesentlig grad binder FcgammaIIIa reseptor på NK- celler (CD16) og induserer derfor ikke i vesentlig grad ADCC-mediert lysering av NK- effektorer hvortil anti NKG2A antistoffene ifølge oppfinnelsen bindes. For eksempel, en mutert konstant region, også benevnt som en ”variant” kan inkorporeres i et fusjonsprotein for å minimere4 binding til Fc- reseptorer og/eller evne til å fange komplement (se for eksempel Winter et al., U.S. Pat. No.5,648,260; Morrison et al., WO 89/07142; Morgan et al., WO 94/29351).

I tillegg, et mutert IgG2 Fc domene kan etableres som reduserer den mytogene respons, som sammenlignet med naturlige Fc- regioner (se for eksempel et al., U.S. Pat. No.5,834,597, hvis beskrivelse inkorporeres med referanse heri i sin helhet). Dersom foreliggende er humane FRer fortrinnsvis avledet fra et humant antistoff variabel region som har sekvenslikhet med den homologe eller ekvivalente region av den antigenbindende region donor. Andre kilder av FRer for deler av human opprinnelse av et humanisert antistoff inkluderer humane variable konsensussekvenser (se Kettleborough, C. A. et al., Protein Engineering 4:773-783 (1991); Queen et al., U.S. Pat. Nos: 5,585,089, 5,693,762 and 5,693,761, hvis beskrivelse av alle inkorporeres i helhet med referanse). For eksempel, sekvensen av antistoffet eller variabel region anvendt for å oppnå den ikke- humane del kan sammenlignes til humane sekvenser som beskrevet i Kabat, E. A., et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, U.S. Government Printing Office (1991). I en foretrukket utførelse er FRene av et humanisert antistoffkjede avledet fra en human variabel region som har minst ca 60 % totalsekvens identitet, og fortrinnsvis minst ca 80 % totalsekvens identitet, med en variabel region av den ikke- humane donor (For eksempel Z199 eller Z270 antistoff).

Frasen ”i hovedsak identisk”, i konteksten av to nukleinsyrer eller polypeptider (for eksempel DNAer som koder et humanisert antistoff eller aminosyresekvensen av det humaniserte antistoff) refererer til to eller flere sekvenser eller subsekvenser som er minst ca 80 %, mer fortrinnsvis 90- 95 % eller høyere nukleotid- eller aminosyreenhet identitet, idet de er sammenlignet og alignet for maksimal samsvar, som målt ved anvendelse av følgende sekvens sammenligningsmetode og/eller ved visuell inspeksjon. Slike ”i hovedsak identiske” sekvenser er typisk vurdert å være homologe. Fortrinnsvis, ”i hovedsak identitet” eksisterer over en region av sekvensene som har minst ca 50 enheter i lengde, mer fortrinnsvis over en region av minst ca 100 enheter, og mest foretrukket er sekvensene i hovedsak identiske over minst ca 150 enheter, eller over fullengden av to sekvenser som sammenlignes.

Som beskrevet nedenfor, enhver av to antistoffsekvenser kan kun alignes en om gangen, ved anvendelse av det numeriske skjema i Kabat. Derfor, antistoffene, prosentidentitet har en unik og godt definert betydning.

Aminosyrer fra de variable regioner av modne tung og lettkjeder av antistoff er benevnt Hx og Lx, respektivt, hvor x er et tall som angir posisjonen av aminosyren i samsvar med skjemaet til Kabat, Sequences of Proteins of Immunological Interest (National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1987 and 1991). Kabat oppgir mange aminosyresekvenser for antistoff for hver undergruppe, og oppgir de mest vanlige forekommende aminosyrer for hver enhets posisjon i denne undergruppe. Kabat anvender en fremgangsmåte for å tilordne et enhet tall til hver aminosyre i en oppgitt sekvens, og denne fremgangsmåte for å tilordne enhetsnummer har blitt standard innen fagfeltet. Kabat skjema kan utvides til andre antistoff som ikke er inkludert i dette kompendium ved å tilordne det aktuelle antistoff med en av konsensussekvensene i Kabat. Anvendelse av Kabat nummereringssystem identifiserer enkelt aminosyrer ved ekvivalente posisjoner i forskjellige antistoff. For eksempel, en aminosyre ved L50- posisjonen av et humant antistoff okkuperer den ekvivalente posisjon til en aminosyreposisjon L50 av et museantistoff. Fra N- terminal til C-terminal, både lett- og tungkjede variable regioner omfatter alternerende rammeverk og (CDRer) , FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 og FR4. Tilordningen av aminosyre til hver region er i samsvar med definisjonene i Kabat (1987) og (1991), supra og/eller Chothia & Lesk, J. Mol. Biol.196:901-917 (1987); Chothia et al., Nature 342:878-883 (1989).

Bindings- og/eller addisjonsanalyser av andre egnete fremgangsmåter kan også anvendes i prosedyrene for identifisering og/eller isolering av humaniserte antistoff (for eksempel fra et bibliotek) med den nødvendige spesifisitet (kompetitive analyser, for eksempel).

Antistoffdelen av ikke- humane og av human opprinnelse for anvendelse ifølge oppfinnelsen inkludere lettkjeder, tungkjeder, og porsjoner av lett- og tungkjeder.

Disse antistoffporsjoner kan oppnås eller avledes fra antistoff (for eksempel med de novo syntese av en porsjon), eller nukleinsyrekoding av antistoff eller kjede derav som har den ønskete egenskap (for eksempel binder NKG2A, sekvenslikhet, for eksempel med Z199 eller Z270 antistoff) kan produseres og uttrykkes. Humaniserte antistoff omfattende de ønskete porsjoner (for eksempel antigenbindende region, CDR, FR, C- region) av humant og ikke- human opprinnelse kan produseres ved anvendelse av syntetiske og/eller rekombinante nukleinsyrer for å fremstille gener (for eksempel cDNA) som koder for det ønskete humaniserte kjede. For å fremstille en del av en kjede, kan en eller flere stoppkodon introduseres i ønskete posisjoner.

For eksempel, nukleinsyresekvenser som koder for nylig konstruerte humaniserte variable regioner kan konstrueres ved anvendelse av PCR mutagenesemetoder for å forandre eksisterende DNA- sekvenser (se for eksempel Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res. 17:5404 (1989) ). PCR- primerer som koder for de nye CDRer kan hybridiseres til et DNA- templat av en tidligere humanisert variabel region som er basert på samme, eller svært lik, human variabel region (Sato, K., et al., Cancer Research 53:851-856 (1993)). Dersom en lignende DNA- sekvens ikke er tilgjengelig for anvendelse som et templat, kan en nukleinsyre som omfatter en sekvens som koder for en variabel regionsekvens konstrueres fra syntetiske oligonukleotider (se for eksempel Kolbinger, F., Protein Engineering 8:971-980 (1993)). En sekvens som koder for et signalpeptid kan også inkorporeres i nukleinsyren (for eksempel på syntese, ved innsetting inn i en vektor). Dersom det naturlige signalpeptidsekvens ikke er tilgjengelig kan en signalpeptidsekvens fra et annet antistoff anvendes (se for eksempel Kettleborough, C. A., Protein Engineering 4:773-783 (1991)).

Ved anvendelse av disse metoder kan fremgangsmåter beskrevet heri eller andre egnete fremgangsmåter benyttes for å produsere varianter. I en utførelse kan de klonete variable regioner mutageniseres, og sekvenser som koder for varianter med den ønskete spesifisitet kan selekteres (for eksempel fra et fagbibliotek; se for eksempel Krebber et al., U.S. Pat. No.5,514,548; Hoogengoom et al., WO 93/06213, publisert 1 april 1993)).

I denne beskrivelsen er det også beskrevet isolerte og/eller rekombinante (inkluderende for eksempel i hovedsak rene) nukleinsyrer som omfatter sekvenser som koder for et humanisert antistoff eller humanisert antistoff lett- eller tungkjede ifølge oppfinnelsen.

Humaniserte antistoff kan også produseres i samsvar med forskjellige andre teknikker så som ved anvendelse, for immunisering, andre transgene dyr som har blitt modifisert for å uttrykke et humant antistoffrepertoar. I denne teknikk blir elementer av den humane tung og lettkjede loci introdusert i mus eller andre dyr med målrettet ødeleggelse av den endogene tungkjede og lettkjede loci (se for eksempel Jakobovitz et al. (1993) Nature 362:255; Green et al. (1994) Nature Genet. 7:13; Lonberg et al. (1994) Nature 368:856; Taylor et al. (1994) Int. Immun.6:579, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning. Alternativt, humane antistoff kan konstrueres med genetiske eller kromosomale transfeksjonsmetoder, eller gjennom seleksjon av antistoff repertoar ved anvendelse av fagdisplay metoder. I denne teknikk kan antistoff variabel domenegener klones i – ramme i enten et hoved eller mindre kappaprotein-gen av en filamentøs bakteriofag, og fremvises som funksjonelle antistoffragmenter på overflaten av fagpartikkelen. På grunn av at den filamentøse partikkel inneholder en enkelttrådet DNA- kopi av faggenomet, kan seleksjoner basert på de funksjonelle egenskaper av antistoffet også resultere i seleksjon av genet som koder for antistoffet som oppviser disse egenskaper. På denne måte vil fagen etterligne noen av egenskapene til B- cellene (se for eksempel Johnson et al. (1993) Curr Op Struct Biol 3:5564-571; McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-553, the entire disclosures of which are herein incorporated by reference). Human antibodies may also be generated by in vitro activated B cells (see, e.g., U.S. Pat. Nos.5,567,610 and 5,229,275), hvis beskrivelse inkorporeres i helhet med henvisning).

I en utførelse fremstilles “humaniserte” monoklonale antistoff ved anvendelse av et dyr så som XenoMouse® (Abgenix, Fremont, CA) for immunisering. En XenoMouse er en murin vert som har dets immunoglobulingener erstattet med funksjonelle humane immunoglobulingener. Således, antistoff produsert av denne mus, eller i hybridomaer fremstilt av B- celler fra denne mus, er allerede humanisert.

XenoMouse er beskrevet i U. S. Patent Nr 6, 162, 963, som heri inkorporeres i sin helhet med henvisning. En analog metode kan oppnås ved anvendelse av HuMAb-Mouse™ (Medarex).

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også derivatiseres til ”kimeriske” antistoff (immunoglobuliner) hvor en del av tung- og/eller lettkjeden er identisk med en homolog til korresponderende sekvenser i det opprinnelige antistoff, mens det resterende av kjeden (e) er identisk med eller homolog til korresponderende sekvenser i antistoff avledet fra andre arter eller som tilhører andre antistoffklasser eller underklasser, og likeledes fragmenter av slike antistoff, så lenge de oppviser den ønskete biologiske aktivitet (se for eksempel Morrison et al. (1984) PNAS 81:6851; U.S. Pat. No.4,816,567)).

I en annen utførelse ifølge oppfinnelsen tilveiebringes antistoffene eller fragmentene derav beskrevet over (enten de aktiverer eller inhiberer) konjugert til et cytotoksisk middel. Termen ”cytotoksisk middel” som anvendt heri er et molekyl som er i stand til å drepe en celle som bærer en NKG2A- reseptor på dets celleoverflate. Termen ”konjugert” som anvendt heri betyr at de to midlene er enten bundet til hverandre gjennom en kovalent og/eller ikke- kovalent binding; eller tetherert eller på annen måte forbundet til hverandre direkte eller gjennom en bindingsenhet.

Ethvert av et stort antall toksiske enheter eller strategier kan anvendes for å produsere slike cytotoksiske antistoff konjugater. I visse foretrukne utførelser vil antistoffene være direkte derivatisert med radioisotoper eller andre toksiske forbindelser. I slike tilfeller kan den merkete monospesifikke anti NKG2A antistoff injiseres inn i pasienten, hvor den kan binde til å drepe celler som uttrykker måleantigen, fortrinnsvis NK- celler, der ubundet antistoff enkelt klarerer kroppen. Indirekte strategier kan også anvendes, så som "Affinity Enhancement System" (AES) ( se for eksempel U.S. Patent. Nr.5,256,395; Barbet et al. (1999) Cancer Biother Radiopharm 14:153-166; hvis hele beskrivelser heri inkorporeres med henvisning).

Denne bestemte løsning involverer anvendelse av et radiomerket hapten og et antistoff som gjenkjenner både NK- cellereseptoren og det radioaktive hapten. I dette tilfellet injiseres antistoffet først i pasienten og tillates og binde til målceller, og deretter, straks ubundet antistoff er klarert fra blodstrømmen, administreres den radiomerkete hapten. Haptenet binder til antistoff- antigen- komplekser på de overprolifirerende LGL (for eksempel NK eller T) celler, og dreper dermed disse, idet ubundet hapten klarner kroppen.

Enhver type enhet med en cytotoksisk eller cytoinhibitorisk effekt kan konjugeres til foreliggende antistoff for å danne et cytotoksisk konjugat og for å inhibere eller drepe spesifikke NK- reseptor uttrykkende celler, inkluderende radioisotoper, toksiske proteiner, toksiske småmolekyler, så som medikamenter, toksiner, immunomodulatorer, hormoner, hormonantagonister, enzymer, oligonukleotider, enzym inhibitorer, terapeutiske radionukleotider, angiogeniske inhibitorer, kjemoterapeutiske medikamenter, vinka alkaloider, antrasykliner, epidofyllotoksiner, taksaner, antimetabolitter, alkylerende midler, antibiotika, COX-2 inhibitorer, SN-38, antimitotiske midler, antiangiogeniske midler og apoptotiske midler, spesielt doksorubisin, metotreksat, taksol, CPT-11, Kamptotekaner, nitrogen senneper, gemsitabin, alkyl sulfonater, nitrosoureaer, triazener, folisk syreanaloger, pyrimidinanaloger, purinanaloger, platinum koordinerende komplekser, Psaudomonas eksotoksin, risin, abrin, 5. fluoridin, ribonuklease (RNase), DNase I, Stafylokokkal enterotoksin-A, kermesbær antiviralt protein, gelonin, difterin toksin, Pseudomonas eksotoksin, og Pseudomonas endotoksin og andre (se for eksempel Pharmaceutical Sciences, 19th Ed. (Mack Publishing Co.1995) Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics (McGraw Hill, 2001); Pastan et al. (1986) Cell 47:641; Goldenberg (1994) Cancer Journal for Clinicians 44:43; U.S. Pat. No.6,077,499; hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning). Det skal anerkjennes at et toksin kan være av animalt, plante, fungal eller mikrobiell opprinnelse, eller kan etableres de novo med kjemisk syntese.

Toksinene eller andre forbindelser kan kobles til antistoffet direkte eller indirekte, ved anvendelse av et stort antall tilgjengelige metoder. For eksempel kan et middel tilfestes til hengselregionen av det reduserte antistoffkomponent via disulfid bindingsdannelse, ved anvendelse av kryssbindere så som N-sukkinyl 3-(2-pyridylditio)proprionat (SPDP), eller via en karbohydratenhet i Fc- regionen av antistoffet (se for eksempel Yu et al. (1994) Int. J. Cancer 56: 244; Wong, Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking (CRC Press 1991); Upeslacis et al., "Modification of Antibodies by Chemical Methods," in Monoclonal antibodies: principles and applications, Birch et al. (eds.), pages 187-230 (Wiley-Liss, Inc.1995); Price, "Production and Characterization of Synthetic Peptide-Derived Antibodies," in Monoclonal antibodies: Production, engineering and clinical application, Ritter et al. (eds.), pages 60-84 (Cambridge University Press 1995), Cattel et al. (1989) Chemistry today 7:51-58, Delprino et al. (1993) J. Pharm. Sci 82:699-704; Arpicco et al. (1997) Bioconjugate Chernistry 8:3; Reisfeld et al. (1989) Antihody, Immunicon. Radiopharrn. 2:217; hvis hele beskrivelser av hver av disse inkorporeres heri med henvisning.

I en foretrukket utførelse derivatiseres antistoffet med en radioaktiv isotop så som I-131. Enhver av et bredt spekter av egnete radioaktive isotoper kan anvendes, inkluderende men ikke begrenset til, Indium-111, Lutetium-171, Bismuth-212, Bismuth-213, Astatin-211, Copper-62, Copper-64, Copper-67, Yttrium-90, Jod-125, Jod-131, Fosfor-32, Fosfor-33, Scandium-47, Sølv-111, Gallium-67, Praseodymium-142, Samarium-153, Terbium-161, Dysprosium-166, Holmium-166, Rhenium-186, Rhenium-188, Rhenium-189, Bly-212, Radium-223, Actinium-225, Jern-59, Selen-75, Arsenikk-77, Strontium-89, Molybdenum-99, Rhodium-105, Palladium-109, Praseodymium-143, Prometium-149, Erbium-169, Iridium-194, Gull-198, Gull-199, og Bly-211. Generelt, radionuklider har fortrinnsvis en disentegreringsenergi i området 20 til 6000 keV, fortrinnsvis i områdene 60 til 200 keV for en Auger- emitter, 100 til 2500 keV for en beta emitter, og 4000 til 6000 keV for en alfa emitter. Også foretrukket er radionuklider som i hovedsak disentegrerer med generering av alfapartikler.

Ved seleksjon av cytotoksisk enhet på konjugering til anti NKG2A antistoff i foreliggende cytotoksiske sammensetninger er det hensiktsmessig å sikre at enheten ikke i vesentlig grad vil utvise in vivo bieffekter mot livsbevarende normalt vev, så som en eller flere vev valgt blant hjerte, nyre, hjerne, lever, benmarg, tarm, bryst, prostata, tyroid, galleblære, lunge, nyrer, muskel, nervefibre, pankreas, hud, eller andre livsbevarende organer eller vev i menneskekroppen. Termen ”betydelige bieffekter” som anvendt heri refererer til et antistoff, ligand eller antistoff konjugat, som, idet det administreres in vivo, vil produsere kun neglisjerbare eller klinisk behandlingsbare bieffekter, så som de normalt som oppleves under kjemoterapi.

I denne beskrivelsen er det også beskrevet et antistoff konjugert til en detekterbar markør. Termen ”detekterbar markør” som anvendt heri refererer til ethvert molekyl som kan kvantitativt eller kvalitativt observeres eller måles. Eksempler på detekterbare markører som er nyttig i konjugerte antistoff ifølge oppfinnelsen er radioisotoper, fluoriserende fargestoff, eller et medlem av et komplementært bindingspar, så som et medlem av ethvert av: et antigen/antistoff (andre enn et antistoff til NKG2A), lektin/karbohydrat; avidin/biotin; reseptor/-ligand eller en molekylær trykt polymer/trykt molekylsystem. De detekterbare markørkonjugerte antistoff ifølge oppfinnelsen kan anvendes for å detektere binding av antistoff til NKG2A, enten in vitro eller in vivo. Slike konjugater kan også benyttes for å detektere binding av andre molekyler til NKG2A i et kompetitivt eksperiment. I en in vivo setting kan den detekterbare markørantistoff konjugat ifølge oppfinnelsen anvendes for å monitorere effektiviteten av en behandling i en pasient med en NKG2A antistoff sammensetning ifølge oppfinnelsen, eks vivo deteksjon av den detekterbare markør (for eksempel via helkroppscan eller lignende) eller ved deteksjon i et biologisk materiale (for eksempel blod, biopsivev, eller kroppsfluider, hudavskrapninger etc.) oppnådd fra pasienten. Deteksjon av markøren i forskjellige biologiske materialer vil korreleres med nærvær av terapeutisk antistoff i nevnte materiale.

I en beslektet utførelse ifølge oppfinnelsen tilveiebringes et kitt omfattende, i separate beholdere: et detekterbar markør- anti- NKG2A antistoff konjugat; og et NKG2A- inneholdende materiale. Et NKG2A- inneholdende materiale kan være isolerte NKG2A, et fragment av NKG2A omfattende en epitop hvortil et anti NKG2A antistoff ifølge oppfinnelsen binder, eller en celle som uttrykker NKG2A på dets celleoverflate.

Evaluering av antihumane NKG2A antistoff i ikke- humane primater.

I en foretrukket serie utførelser blir aktiviteten av anti NKG2A antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse undersøkt in vivo i en ikke- human primat. Slike utførelser kan utføres av et bredt spekter grunner. I lys av kryssreaktiviteten mellom human NKG2A og NKG2A fra ikke- humane primater, og i lys av de fysiologiske likheter mellom primater, muliggjør administrering av antistoff som gjenkjenner human NKG2A til ikke- humane primater at antistoffene kan undersøkes in vivo for mange aspekter, inkluderende men ikke begrenset til, det evne til å modulere aktiviteten av celler som uttrykker NKG2A (for eksempel NK- celler), bieffekter produsert, toksisitet, farmakodynamikk, farmakogenetikk, biotilgjengelighet, halveringstid, optimal dosering eller frekvens av administrering, optimale formuleringer inkluderende kombinasjoner med andre terapeutiske midler, eller enhver annen egenskap som kan måles for å bestemme effektivitet, sikkerhet eller optimal administrering av antistoffene. Fremgangsmåter for å undersøke terapeutiske forbindelser som kandidater in vivo er godt kjent innen fagfeltet, og er beskrevet i for eksempel The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17<th >edition, Remington's Pharmaceutical Sciences, 20<th >edition, hvis hele beskrivelse inkorporeres heri med henvisning.

Enhver ikke- human primat kan anvendes for de heri beskrevne fremgangsmåter, inkluderende hominoide dyr, aper og prosimianer. Foretrukne primater inkluderer rhesus ape (Macacus mulatta), Afrikans grønn ape (Chlorocebus aetiops), Marmoset (Cellitrhrix jacchus), Saïmiri (Saimiri sciureus), cynomolgus og bavian (Papio hamadryas). I andre foretrukne utførelser er primatet ikke en ape, for eksempel er et primat annet enn en sjimpanse.

Ikke- humane primater anvendes vanlig i sikkerhet og effektivitetsanalyser for kandidat humane terapeutiske midler, og deres helbred, administrering, biologi og andre relevante trekk er kjente for fagkyndige innen feltet. I en utførelse, før administrering av et antistoff til et ikke- humant primat (eller anvendelse av vev, celler, eller proteiner fra et ikke- humant primat i en analyse) blir kryssreaktiviteten av kandidat antihuman NKG2A- antistoffene med NKG2A fra det ikke- humane primat undersøkt.

I visse utførelser vil de ikke- humane primater fungere som en modell for en sykdom eller tilstand som kan behandles med NKG2A- modulerende forbindelse. For eksempel, modeller av autoimmune forstyrrelser, allergier, kreftformer eller infeksjonssykdommer kan anvendes for eksempel for å undersøke evner av antistoffene til å behandle eller lindre symptomer av sykdommer eller tilstander. På ingen måte å begrense praktiseringen av oppfinnelsen, kan det angis at visse ikkehumane primater er spesielt nyttige for å studere bestemte typer sykdommer eller tilstander. For eksempel har silkeaper fungert som modelldyr for studium av immunitet og av kardiovaskulære sykdommer, saimiri for studium av infeksiøse sykdommer, macaquer (inkluderende rhesus aper) for studium av farmakologi og toksikologi av spesifikke forbindelser, og bavianer som modell for kirurgiske studier, transplantater og biomaterialer.

I en utførelse administreres anti NKG2A antistoff til et ikke- humant primat for å undersøke effektiviteten av antistoffene i binding til og/eller modulering av NKG2A-aktivitet. I slike utførelser kan antistoffene administreres i enhver dosering, frekvens eller formulering, og faktisk kan slike faktorer varieres for å undersøke deres relative påvirkning over effektiviteten. Effektivitet av antistoffene kan undersøkes i et bredt spekter av måter. For eksempel, man kan undersøke in vivo binding av antistoffene til NKG2A eller til NKG2A- uttrykkende celler, in vivo effekten av antistoffene på ekspresjon av NKG2A i celler, for eksempel NK- celler, eller in vivo påvirkning av antistoffene på aktiviteten av NKG2A, for eksempel som målt ved anvendelse av heri beskrevne analyser for NK- celleaktivitet.

I slike utførelser administreres typisk et antistoff til et ikke- humant primat og dets effekter detekteres, eksempel på biologisk prøve opptatt fra det ikke- humane primat. Alternativt, visse metoder kan utføres in vitro, hvor effekten på antistoffene på for eksempel NKG2A- uttrykkende celler opptatt fra et ikke- humant primat undersøkes.

For å undersøke binding av antihumant NKH2A- antistoff kan antistoffene direkte eller indirekte merkes. For eksempel kan antistoffet merkes med et radioisotop før administrering, og dets lokalisering inne i dyret kan undersøkes ved å undersøke forskjellige biologiske prøver (for eksempel blod, forskjellige vev eller organer, immun- beslektete vev så som benmarg, milt, komponenter i lymfesystemet, eller andre) opptatt ved forskjellige tider etter administrering. I en foretrukket utførelse oppnås PBLer, og binding av antistoffene til NK- celler bestemmes ved anvendelse av for eksempel fluoriserende merkete sekundære antistoff, der bundne antistoffer detekteres for eksempel med FACS- analyse.

Tilsvarende kan antistoff administreres til et ikke- humant primat og deres effekt på NKG2A- aktivitet kan undersøkes. For eksempel kan NK- celler oppnås før og etter administrering av et anti NKG2A antistoff, og aktiviteten, ekspresjon av NKG2A, og/eller antall av to (eller flere) sett av celler ved å undersøke med enhver standard metode. Aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen som blokkerer NKG2A- stimulering (og dermed blokker inhibering av NK- celler gjennom reseptoren) vil forventes å øke NK- celleaktivitet. Inhibitoriske antistoff ifølge oppfinnelsen som kryssbinder NKG2A reseptorer vil forventes å redusere NK- celleaktivitet og redusere antallet levedyktige NK- celler. Begge typer antistoff som forårsaker endret NK- celleaktivitet i ikkehumant primat vil vurderes egnet for anvendelse i å behandle forstyrrelse i mennesker hvor en økning eller en nedgang i NK- celleaktivitet er hensiktsmessig.

I et annet sett av utførelser administreres anti NKG2A antistoff til et ikke-humant primat for å undersøke sikkerhet av antistoffene, og likeledes deres forskjellige farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaper. Sikkerhet kan undersøkes på mange måter.

For eksempel, den totale toksisitet av antistoffene kan undersøkes ved å bestemme median letal dosering (LD50), typisk uttrykt som milligram per kilogram (mg/kg), hvor verdien 50 refererer til prosentandelen død blant dyrene under forsøkene. I tillegg til å bestemme LD50 kan sikkerhet også undersøkes ved å monitorere dyrene for detekterbare responser til administrering, inkluderende atferd, kroppslig eller fysiologiske forandringer som vist med hjerterytme, blodtrykk, etc. Responser kan også involvere blod og andre laboratoriebaserte ester for å undersøke markører som indikerer organfunksjon så som kreatin eller BUN for nyrefunksjon, protrombin, bilirubin, albumin eller forskjellige enzymer for å bestemme leverfunksjon, og andre (se for eksempel The Merck Manual of Diagnosis and Therapy, 17<th >edition, heri inkorporert med henvisning).

Fremgangsmåter for in vivo farmakokinetikk og farmakodynamiske undersøkelser av antistoffene er standard og godt kjent inne fagfeltet (se for eksempel He et al. (1998) J. Immunol.160:1029-1035; Alyanakian et al. (2003) Vox Sanguinis 84:188–192, Sharma et al. (2000) JPET 293:33–41, hvis hele beskrivelser inkorporeres heri med henvisning). Slike analyser vil typisk involvere administrering av anti NKG2A antistoff til et ikke- humant primat og, ved forskjellige tider etter administrering, undersøke nivåer (i plasma og annet vev), fordeling, binding, stabilitet og andre egenskaper av antistoffene. Slike analyser er kritiske komponenter i prekliniske studier og, ved å bestemme in vivo halveringstid, fordeling, biotilgjengelighet, etc. av antistoffene, fungerer i å bestemme det terapeutiske vindu og således egnete administreringsregimer (for eksempel frekvens og dosering av administrering) som vil gi optimal tilpassing av NK- uttrykkende celler av de administrerte antistoff.

I forbindelse med studiene av effektivitet, sikkerhet, farmakodynamikk og farmakokinetikk av anti NKG2A antistoff kan et spekter av formuleringer og administreringsregimer systematisk testes for å oppnå optimal effektivitet og sikkerhet for antihumane NKG2A antistoff. For eksempel kan det terapeutiske vindu (område av plasmakonsentrasjoner av antistoffene som kan ha en høy sannsynlighet for terapeutisk suksess) bestemmes,

og likeledes de regimer og formuleringer som er optimalt sikre og effektive i å målrette NKG2A og modulere NK- celleaktivitet in vivo. For eksempel, et gitt antistoff kan administreres hver 1,2,3,4,5 eller 6 dager, eller hver 1,2,3 eller 4 uker, etc, og sikkerhet, effektivitet, kinetikk, etc. parametere undersøkes. Tilsvarende, doseringen av antistoff som administreres ved hvert tidspunkt kan varieres og samme parametere kan undersøkes, eller en kombinasjon av dosering og frekvens av administrering kan testes. Videre, forskjellige formuleringer, for eksempel sammensetninger som inkluderer forskjellige eksipienter, forskjellige kombinasjoner av anti NKG2A antistoff, eller forskjellige kombinasjoner av NKG2A antistoff med andre terapeutiske midler (avhengig av tilstand som skal behandles, for eksempel et kjemoterapeutisk middel for å behandle kreft) kan testes i ikke- humane primater. Videre, forskjellige administrasjonsruter, for eksempel intravenøs, pulmonær, topikal, etc. kan sammenlignes. Slike fremgangsmåter for å variere administrasjonsparametere er godt kjent for fagkyndige innen fagfeltet.

Farmasøytiske sammensetninger.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også sammensetninger, for eksempel farmasøytiske sammensetninger, som kan omfatte enhver av foreliggende antistoff, inkluderende fragmenter og derivater derav, i enhver egnet vehikkel i effektiv mengde og en farmasøytisk akseptabel bærer.

Farmasøytisk akseptable bærere som kan anvendes i disse sammensetninger inkluderer, men er ikke begrenset til, ionebyttere, aluminer, aluminiumstearat, lesitin, serum proteiner, så som humane serum albumin, buffersubstanser så som fosfater, glysin, sorbisk syre, kalium sorbat, partielle glyseridblandinger av mettete vegetabilske fettsyrer, vann, salter eller elektrolytter, så som protaminsulfat, dinatrium hydrogenfosfat, kalium hydrogenfosfat, natrium klorid, sinksalter, kolloidale silica, magnesium trisilikat, polyvinyl pyrrolidon, sellulose baserte substanser, polyetylenglukol, natrium karboksymetylsellulose, polyakrylater, vokser, polyetylenpolyoksypropylen-blokkpolymerer, polyetylenglukol og helfett.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan administreres oralt, parenteralt, ved inhalering, spray, topikalt, rektalt, nasalt, bukalt, vaginalt eller via implanterte reservoarer. Termen ”parenteral” som anvendt heri inkluderer subkutanøs, intravenøs, intramuskulær, intraartikulær, intrasynovial, instrasternal, intratekal, intrahepatisk, intralesional og intrakranial injeksjon eller infusjonsteknikker. For lokaliserte forstyrrelser så som RA, kan sammensetningene ofte administreres topikalt, for eksempel inflammaterte ledd.

Sterile injiserbare former av sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan være vandige eller en oljeaktig suspensjon. Disse suspensjoner kan formuleres i samsvar med kjente teknikker innen fagfeltet ved anvendelse av egnete dispergerings eller fuktmidler og suspenderende midler. Steril injiserbar preparat kan også være en steril injiserbar løsning eller suspensjon i en ikke toksisk parenteralt akseptabelt fortrynningsmiddel eller solvent, for eksempel en løsning av 1,3-butanediol. Blant de akseptable vehikler og oppløsningsmidler som kan benyttes er vann, Ringers løsning og isotonisk natriumklorid løsning. I tillegg, sterilt, faste oljer benyttes hensiktsmessig som oppløsningsmiddel eller suspenderende medium. For dette formål kan enhver blanding av faste oljer benyttes inkluderende syntetiske mono- eller diglyserider. Fettsyrer så som oleinsyre og dets glyserid derivater er nyttige i fremstilling av injiserbare løsninger, og likeledes er naturlige farmasøytisk akseptable oljer, så som olivenolje eller lakserolje, spesielt i deres polyoksyetylerte versjoner. Disse oljeløsninger eller suspensjoner kan også inneholde en langkjedet alkoholfortynningsmiddel eller dispergerende middel, så som karboksymetylsellulose eller tilsvarende dispergerende midler som vanligvis anvendes i formulering av farmasøytisk akseptable doseringsformer inkluderende emulsjoner og suspensjoner. Andre vanligvis anvendte surfaktanter så som Tween, Span og andre emulsifiserende midler eller biotilgjengelige forsterkere som vanligvis anvendes i fremstilling av farmasøytisk akseptable faststoff, væsker eller andre doseringsformer kan også benyttes for formuleringsformålene.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan oralt administreres i enhver oral akseptabel doseringsform inkluderende men ikke begrenset til kapsler, tabletter, vandige suspensjoner eller løsninger. I tilfelle tabletter for oralt bruk kan bærere som vanligvis anvendes inkludere laktose og maisstivelse. Smøremidler så som magnesiumstearat tilsettes også typisk. For oral administrering i en kapselform kan nyttige fortynningsmidler inkludere laktose og tørket maisstivelse. Idet vandige suspensjoner er nødvendig for oral bruk kan det aktive ingrediens kombineres med emulsifiserende og suspenderende midler. Dersom ønsket kan egnete søtningsmidler, smaksmidler eller fargemidler også tilsettes.

Alternativt kan sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i form av stikkpiller for rektal administrering. Disse kan fremstilles ved å blande middelet med en egnet ikke- irriterende eksipient som er i faststoffer ved romtemperatur men væskeformig ved rektal temperatur og derfor vil smelte i rektum for å frigi medikamentet. Slike materialer inkluderer kakaosmør, bivoks og polyetylenglukoser. Slike sammensetninger fremstilles i samsvar med teknikker godt kjent innen fagfeltet av farmasøytisk formulering.

Sammensetningene ifølge oppfinnelsen kan administreres topikalt, spesielt idet målet for behandlingen inkluderer områder eller organer som enkelt er aksessbare med topikal applisering, inkluderende sykdommer i øyet, hud, ledd eller lavere tarmkanal. Egnete topikale formuleringer fremstilles enkelt for hver av disse organer. Topikal applisering for lavere tarmkanal kan effektueres i en rektal stikkpilleformulering (se over) eller i en egnet klysterformulering. Topikale transdermale plastre kan også benyttes.

For topikale applikasjoner kan sammensetningene formuleres i en egnet salve inneholdende den aktive komponent suspendert eller oppløst i en eller flere bærere. Bærere for topikal administrering av forbindelsene ifølge oppfinnelsen inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, væskeformig petrolatum, hvitt petrolatum, propylenglykol, polyoksyetylen, polyoksypropylen forbindelse, emulsifiserende voks og vann.

Alternativt kan sammensetningene formuleres i en egnet lotion eller krem inneholdende de aktive komponenter suspendert eller oppløst i en eller flere farmasøytisk akseptable bærere. Egnete bærere inkluderer, men er ikke begrenset til, mineralolje, sorbitan monostearat, polysorbat 60, cetyl estervoks, cetearylalkohol, 2-oktyldodekanol, benzylalkohol og vann.

For oftalmisk bruk kan sammensetningene formuleres som mikroniserte suspensjoner i isoton pH justert steril saltløsning, eller fortrinnsvis som løsninger i isoton pH justert steril saltoppløsning, enten med eller uten et konserverende middel så som benzylalkoniumklorid. Alternativt, for oftalmisk bruk, kan sammensetningene formuleres i en salve så som petrolatum.

Sammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også administreres med nasal aerosol eller inhalering. Slike sammensetninger fremstilles i samsvar med teknikker godt kjent for fagkyndige innen fagfeltet eller farmasøytiske formuleringer og kan fremstilles som løsninger i saltløsning, benytte benzylalkohol eller andre egnete konserverende midler, absorpsjonsfremmere for å forbedre biotilgjengelighet, fluorkarboner og/eller andre konvensjonelle solubiliserende eller dispergerende midler.

I en utførelse kan antistoffene eller de terapeutiske forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse inkorporeres i liposomer (”immunoliposomer” i tilfelle antistoff), alene eller sammen med andre substanser for målrettet avgivelse til en pasient eller et dyr. Slike andre substanser kan inkludere nukleinsyrer for avgivelse av gener for genterapi eller for avgivelse av antisense RNA, RNAi eller siRNA for aktivering av NK-celler eller inhibering av modne dendritiske celler, eller toksiner eller medikamenter for aktivering av NK- celler (eller inhibering av dendritiske celler) gjennom andre midler, eller ethvert annet middel beskrevet heri som kan være nyttige for formål med foreliggende oppfinnelse.

I en annen utførelse kan antistoffene eller andre forbindelser ifølge oppfinnelsen modifiseres for å forbedre dets biotilgjengelighet,

levering, halveringstid in vivo, etc., for eksempel antistoff og andre forbindelser kan pegyleres, ved anvendelse av et antall former polyetylen glykol og metoder for tilfesting er kjent innen fagfeltet (se for eksempel Lee et al. (2003) Bioconjug Chem.

14(3):546-53; Harris et al. (2003) Nat Rev Drug Discov.2(3):214-21; Deckert et al. (2000) Int J Cancer.87(3):382-90).

Bestemme dosering og frekvens for administrering.

Som beskrevet over, en viktig del av foreliggende oppfinnelse er testing av anti NKG2A antistoff i ikke-humane primater for å bestemme sikkerhet og effektive doseringer og frekvenser av administrering. Egnete utgangsadministreringsregimer kan bestemmes ved å undersøke erfaring med andre kjente utviklete terapeutiske monoklonale antistoff. Flere monoklonale antistoff har blitt vist å være effektive i kliniske situasjoner, så som Rituksan (Rituksimab), Herseptin (Trastuzumab) Xolair (Omalizumab), Bexxar (Tositumomab), Campaf (Alemtuzumab), Zevalin, Onkolym og tilsvarende administreringsregimer (det vil si formuleringer og/eller doseringer og/eller administreringsprotokoller) kan anvendes ved antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse. Tidsskjema og dosering for administrering kan bestemmes i samsvar med godt kjente metoder for disse produkter, for eksempel ved å anvende leverandørens instruksjoner. For eksempel kan et monoklonalt antistoff forsynes med en konsentrasjon av 10 mg/ml i enten 100 mg (10 ml) eller 500 mg (50 ml) enkelt dose ampuller. Produktet formuleres for IV administrering i 9,0 mg/ml natriumklorid, 7,35 mg/ml natriumcitratdihydrat, 0,7 mg/ml polysorbat 80 og sterilt vann for injeksjon, pH justeres til 6,5. Et representativt egnet doseringsområde for antistoff ifølge oppfinnelsen kan være mellom 10 mg/m2 og 500 mg/m2. Imidlertid, det skal anerkjennes at disse regimer er representative og at optimale tidsskjema og regime kan tilpasses ved å ta hensyn til affiniteten og anti NKG2A- aktiviteten av antistoffer og tolererbarheten av antistoffene som må bestemmes i kliniske forsøk. Kvantiteter og regimer for injeksjon av antistoff til NKG2Aer som metter celler i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller en uke eller en måned vil kunne bestemmes ved å vurdere affiniteten av antistoffet og dets farmakokinetiske parametere.

Imidlertid, det skal anerkjennes at disse regimer er representative og at optimale tidsskjema og regimer kan tilpasses ved å ta hensyn til affiniteten og anti NKG2A aktiviteten av antistoffet og tolererbarheten av antistoffene som må bestemmes i kliniske eller prekliniske forsøk. Kvantiteter og tidsskjema for injeksjon av antistoff av NKG2Aer som metter celler i 24 timer, 48 timer, 72 timer eller en uke eller en måned vil bestemmes ved å vurdere affiniteten av antistoffet og dets farmakokinetiske parametere.

Doseringen som administreres til en pasient i ikke- human primat i foreliggende fremgangsmåter bør være tilstrekkelig til å effektuere en nyttig respons i individet over tid. Doseringen vil bli bestemt av effektiviteten av de bestemte modulatorer som benyttes og tilstanden til individet, og likeledes av kroppsvekt eller overflateareal av arealet som skal behandles. Størrelsen av doseringen vil også bestemmes av eksistens, natur og grad av alvorlige bieffekter som kan ledsage administrering i et bestemt individ. Ved bestemmelse av effektiv mengde av forbindelsen som skal administreres til en bestemt pasient kan en lege evaluere sirkulerende plasmanivåer av forbindelsen, forbindelsens toksisitet, og produksjon av antiforbindelse antistoff. Generelt, dosering ekvivalent av en forbindelse er fra ca 1 ng/kg til 10 mg/kg for et typisk individ. Administrering kan utføres via enkelte eller oppdelte doseringer.

Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse som binder både humane og ikkehumane primat NKG2A- reseptorer kan hensiktsmessig anvendelse i å bestemme dosering i og frekvens av administrering. Seleksjon av et optimalt terapeutisk vindu for terapi med et anti NKG2A antistoff kan utføres basert på administrering av antistoffet til et ikke- humant primat. Idet NK- celleaktivering i kort tid (24 timer kokultur) har blitt antydet å unngå benmargscelle toksisitet (BMC) har det blitt vist at lengre (48 timers co- kultur av benmargsceller med aktiverte NK- celler) skadelig påvirker hematopioetisk rekonstituering (Koh et al. (2002) Biol. Blood Marrow Transplant. 8:17-25). Imidlertid, det vil være verdifullt å benytte administreringsregimer som muliggjør eksponering av NK- celler i et individ til en NK- celleaktivering anti NKG2A antistoff for en lengre periode, for eksempel lengre enn 24 timer eller 48timer.

Uten at man ønsker å være bundet av teori vil et slikt regime hvor en anti NKG2A antistoff foreligger i mer enn 24 timer muliggjøre at anti NKG2A antistoffet kommer i kontakt med og aktiverer et tilstrekkelig antall NK- celler i individet for en terapeutisk effekt mot målet (for eksempel cancer, infisert, inflammatoriske) celler. Oppfinnerne derfor tilveiebringer en fremgangsmåte for å behandle et individ med et anti NKG2A antistoff omfattende å bringe eksponering av nevnte individ til et anti NKG2A antistoff for en periode mer enn 24 timer, mer fortrinnsvis 48 timer. Mest fortrinnsvis omfatter oppfinnelsen administrering til nevnte individ av anti NKG2A antistoff som har en plasma halveringstid på mer enn 24 timer, eller 48 timer, eller mer foretrukket minst 5,6,7,10,14, eller 20 dager. Mer fortrinnsvis omfatter oppfinnelsen administrering til nevnte individ av et anti NKG2A antistoff omfattende en Fc- del, fortrinnsvis en Fcdel av G2 eller G4- type. Som videre beskrevet heri, ethvert egnet antistoff som blokkerer NKG2A- funksjon kan anvendes, for eksempel et antistoff som har bindings spesifisitet av Z199 eller Z270. I foretrukne utførelser administreres antistoffet i en andre eller ytterligere dosering og antistoffet vil være en kimerisk, CDR- innpodet, human eller humanisert antistoff.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å identifisere et egnet administreringsregime for et terapeutisk antistoff rettet mot humane NKG2A, og fremgangsmåten omfatter administrering av antistoffet til et ikke. Humant primat ved anvendelse av et administreringsregime, fortrinnsvis en serie regimer hvor dosering eller frekvens av antistoffet varieres, og bestemme aktiviteten av NKG2A- uttrykkende celler i det ikke- humane primat og effekten av terapien på benmargceller (BMC) og/eller hematopoetiske celler, fortrinnsvis myeloid cellerekonstituering, av primatet for det bestemte administrasjonsregime. Fortrinnsvis omfatter fremgangsmåten ytterligere å undersøke myeloid rekonstituering etter anti NKG2A antistoff administrering, generelt å involvere bestemmelse av antallet dager som er nødvendig for myeloid rekonstituering å normalisere seg, for eksempel til et nivå som når det som er observert før anti NKG2A terapi eller til et forutbestemt minimumsnivå. Det er deretter mulig å selektere eller identifisere et administreringsregime som vil muliggjøre at myeloid rekonstituering normaliserer seg.

Fremgangsmåten kan ytterligere omfatte å bestemme aktiviteten av NKG2A- uttrykkende celler i det ikke- humane primat og/eller identifisering eller selektering av et administrasjonsregime som fører til en detekterbar modulering i aktiviteten av NKG2A- uttrykkende celler.

Nevnte administrasjonsregime(er) kan uttrykkes for eksempel i termer av perioder av eksponering av et individ til et anti NKG2A antistoff som aktiverer en NK- celle, og frekvens av antistoff administrering. Basert på slike parametere kan administreringsfrekvens og -dosering tilpasses avhengig av den bestemte antistoff som benyttes for eksempel der man tar hensyn til antistoffets plasma halveringstid, affinitet, biotilgjengelighet (eller tid til topp serum konsentrasjon), etc.

En bestemmelse av at et regime muliggjør partiell eller fullstendig gjenvinning eller normalisering av myeloid rekonstituering av primatet og fører til detekterbar modulering i aktiviteten av NKG2A- uttrykkende celler indikerer at administreringsregimet er egnet for anvendelse i mennesker.

De katabolske hastigheter for endogent humant immunoglobulin er blitt godt karakterisert. Halveringstid for IgG varierer i samsvar med isotype, opp til tre uker for IgG1, IgG2 og IgG4, og ca en uke for IgG3. Med mindre farmakokinetikk forandres av antigenbinding eller immunogenisitet, vil intakte humane IgG monoklonale antistoff oppvise farmakokinetikk sammenlignbar med endogent IgG. Som diskutert tidligere, den ekstraordinære lange halveringstid for human IgG1, IgG2 og IgG4 isotyper skyldes kataboliske beskyttelse av FcRn. FcRn uttrykkes på hepatocytter, endotelceller og fagosytiske celler i det retikuloendotelasystem (RES). Idet IgG undergår endocytose vil lav pH i endosomet fremme binding av IgG- FC- domenet til FcRn, som resirkulerer IgG til celleoverflaten og berger IgG fra lysosomal degradering. Den korte halveringstid for IgG3 sammenlignet til de andre IgG isotyper skyldes en enkel aminosyreforskjell (et arginin i stedet for et histidin ved posisjon 435) i det FcRn- bindings domene.

Elimineringen av intakte murine IgG1 og IgG2 antistoff er mye hurtigere enn for korresponderende humane isotyper. Halveringstid for murine antistoff er i området fra 12 til 48 timer i mennesker. Den korte halveringstid for murine antistoff i mennesker skyldes lavaffinitetsbinding av det murine Fc- domene til human FcRn. Human FcRn binder til mennesket, kanin og marsvin IgG, men ikke betydelig til rotte, kveg, sau eller mus IgG; mus FcRn binder til IgG fra alle disse arter. Antistofffragmenter, inkluderende F(a ́)2, Fab og scFV, mangler Fc- domenet og binder ikke til FcRn. Derfor, halveringstid for disse fragmenter er betydelig kortere enn intakt IgG, med halveringstid bestemt i hovedsak av deres molekylvekter. Lavmolekylvekt Fab og scFv fragmenter underlegges nyreklaring, med akselerert eliminering.

Rapporterte halveringstid er i området fra 11 til 27 t for F(a ́)2 fragmenter og 0,5 til 21 t for Fab fragmenter. Halveringstid for monovalente og multivalente scFv konstrukter kan være i området fra minutter til flere timer.

Antigenbinding kan betydelig påvirke farmakokinetikken av antistoffet. Dersom antistoffet binder til en internalisert cellemembran antigen eller et immunkompleks formet med et utskilt antigen effektivt elimineres fra sirkulasjon kan antigenet fungere som en ”vask” for antistoffklaring. En antigenvask vil produsere doseavhengig farmakokinetikk. Dersom doseringsnivået er utilstrekkelig til å mette antigenpoolen vil antigenmediert klarning være dominerende og antistoff halveringstid vil bli kortere enn halveringstid for endogen IgG; ved doseringsnivåer som metter antigenet, vil RES- mediert klarning dominere og halveringstid vil være tilsvarende som for endogent IgG.

En foretrukket utførelse av foreliggende oppfinnelse beskriver et doseringsregime hvor anti NKG2A antistoff administreres i en første administrering. Den første dosering av anti NKG2A antistoff aktiverer NK- celler og kan indirekte ved å aktivere NK- celler inhibere myeloid cellerekonstituering i individet. Den andre dosering av anti NKg2A antistoff administreres for å falle sammen med den farmakodynamiske profil for myeloid cellerekonstituert gjenvinning, for eksempel administreres den ved en tid hvor et individs hastighet for myeloid cellerekonstituert forventes i det minste å ha delvis gjenvunnet seg.

Således, ved å anvende et anti NKG2A antistoff som kryssreagerer med reseptoren i mennesker og ikke- humane primater tilveiebringer oppfinnerne av foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte hvor NK- celler bringes i kontakt med et anti NKG2A antistoff for i en periode på mer enn 24 timer hvor under myeloid rekonstituering har blitt rapportert å ikke bli påvirket.

I foretrukne utførelser vil den andre dosering av anti NKG2A antistoff administreres minst 6,7,8,9 eller 10 dager etter den innledende dosering, og fortrinnsvis ved minst 14,15,16 eller 20 dager etter den innledende dosering. Mest fortrinnsvis administreres den andre dosering av anti NKG2A antistoff minst 2,3,4,5,6,7,8,9 eller 10 dager eller ved minst 14,15,16 eller 20 dager etter tiden (dag) hvorved anti NKG2A antistoff plasmakonsentrasjon i et individ er estimert å nå halvparten av den innledende (ved administrasjon) konsentrasjon, fortrinnsvis ved minst 6- 10 dager eller ved minst 15- 20 dager etter varigheten av minst en plasma halveringstid av anti NKG2A antistoffet. Alternativt kan fremgangsmåten uttrykkes i termer av topp serum konsentrasjon av anti NKG2A antistoff, hvor den andre dosering av anti NKG2A antistoff blir administrert ved minst 2,3,4,5,6,7,8,9, eller 10 dager eller ved minst 14,15,16 eller 20 dager etter tiden (dag) hvorved anti NKG2A antistoff plasma konsentrasjon i et individ er estimert å nå halvparten av topp serum konsentrasjon i individet.

I en ytterligere utførelse kan den andre dosering av anti NKG2A antistoff administreres minst 2,3,4,5,6,7,8,9 eller 10 dager eller ved minst 14,15,16 eller 20 dager etter tiden (dag) hvorved anti NKG2A antistoff plasma konsentrasjon i et individ er estimert å nå en ikke- detekterbar konsentrasjon, fortrinnsvis ved minst 2,3,4,5,6,7,8,9 eller 10 dager eller ved minst 14,15,16 eller 20 dager etter varigheten av minst 2,3,4 eller flere plasma halveringstider av anti NKG2A antistoff.

I en foretrukket utførelse beskrives et administreringsregime for et antistoff omfattende en Fc- region av G2b av fortrinnsvis G4 subtype (IgG2b eller IgG4, respektivt).

Fortrinnsvis har nevnte antistoff en plasma halveringstid på ca 5,6,7,8,9,10,12,15,18, 20,21 dager, eller fortrinnsvis til ca 10 til 15 dager, 15-21 dager. Fortrinnsvis omfatter antistoffet en Fc- region i hovedsak fri for binding til Fc- reseptorer for NK- celler (CD16). Nevnte antistoff administreres fortrinnsvis i en første dosering og en andre og/eller påfølgende dosering, hvor den andre og/eller påfølgende dosering administreres ved minst 6,7,8,9,10,14,15,16 eller 20 dager etter at antistoffet er estimert til å nå halvparten av sin innledende konsentrasjon. Nevnte andre og/eller påfølgende dosering kan også uttrykkes i absolutte antall dager eter administrering, for eksempel fortrinnsvis med minst 6,7,8,9 eller 10 dager etter den inneledende dosering, og fortrinnsvis ved minst 14,15,16,20,21,24,28,30 eller 35 dager etter den første administrering. Nevnte antistoff kan være et antistoff som omfatter en naturlig forekommende Fc- del, fortrinnsvis en naturlig forekommende human Fc- del, eller mer fortrinnsvis kan inneholde modifiseringer så som en eller flere aminosyresubstitueringer som øker plasma halveringstid for antistoffet og/eller som modifiserer binding til Fc- reseptorer, for eksempel øker binding til Fcn reseptorer for å øke plasma halveringstid eller redusere binding til FcgammaIIIa for å redusere uønsket toksisitet (ADCC) mot NK- cellen. Slike modifiseringer kan utføres i samsvar med fremgangsmåter godt kjent innen fagfeltet, og flere av disse modifiseringer blir ytterligere beskreivet heri.

I en ytterligere foretrukket utførelse beskrives et administreringsregime for et antistoff fragment, fortrinnsvis et F(a ́)2 fragment modifisert for eksempel med polyetylenglykol som beskrevet heri, til å ha en plasma halveringstid på ca 5,6,7,8,9,10,12, 15,18,20,21 dager. Nevnte antistoff administreres fortrinnsvis i en første dosering, og en andre og/eller påfølgende dosering, hvor den andre og/eller påfølgende dosering administreres ved minst 6,7,8,9,10,14,15,16, eller 20 dager etter at antistoffet er estimert til å nå dets innledende konsentrasjon. Nevnte andre og/eller påfølgende dosering kan også uttrykkes i absolutte antall dager etter administrering, fortrinnsvis ved minst 6,7,8,9 eller 10 dager etter den innledende dosering, og fortrinnsvis ved minst 14,15,16,20,21,24,28,30,eller 35 dager etter den første administrering.

Farmasøytiske kombinasjoner.

I samsvar med en ytterligere viktig utførelse av foreliggende oppfinnelse kan anti NKG2A antistoff og/eller andre forbindelser formuleres sammen med en eller flere ytterligere terapeutiske midler, inkluderende midler som normalt benyttes for det bestemte terapeutiske formål som antistoffet eller forbindelsen administreres for. Det ytterligere terapeutiske middel vil generelt administreres med en dosering som typisk anvendes for dette middel i en monoterapi for den bestemte sykdom eller tilstand som behandles. Slike terapeutiske midler inkluderer, men er ikke begrenset til, terapeutiske midler anvendt i behandling av kreftformer (anticancer forbindelser); inkluderende kjemoterapeutiske forbindelser, hormoner, angiogenese inhibitorer, apototisk middel, etc.; terapeutiske midler anvendt for å behandle infeksiøse sykdommer (inkluderende antivirale forbindelser); terapeutiske midler anvendt i andre immunoterapier som behandling av autoimmun sykdom, inflammatoriske forstyrrelser, og transplantatavvisning; cytokiner; immunomodulator midler; adjunkt forbindelser; eller andre antistoff og fragmenter av andre antistoff mot både aktiverende og inhiberende NK- cellereseptorer. Med mindre annet er spesifikt angitt kan kombinasjonssammensetningene angitt nedenfor omfatte enten et aktiverende antistoff, et inhiberende antistoff, eller et cytotoksin antistoff kunjugat ifølge oppfinnelsen.

Terapeutiske midler for behandling av cancer inkluderer kjemoterapeutiske midler (inkluderende midler som påvirker DNA- replikasjon, mitose og kromosomal segregering, og midler som ødelegger syntese og nøyaktighet av polynukleotid forløpere), hormonterapi midler, antiangiogenetiske midler og midler som induserer apoptose.

Kjemoterapeutiske midler som vurderes som representative inkluderer, men er ikke begrenset til, alkylerende midler, antimetabolitter, cytotoksisk antibiotika, vinka alkaolider, for eksempel adriamysin, daktinomysin, mitomysin, karminomysin, daunomysin, doksorubisin, tamoksifen, taksol, taksoter, vinkristin, vinblastin, vinorelbin, etoposid (VP-16), 5-fluorurasil (5FU), cytosin arabinosid, syklofosfamid, tiotepa, metotreksat, kamptotesin, aktinomycin- D, mitomycin C, sisplatin (CDDP), aminoefterin, kombretastin(s) og derivater og prodrug derav.

Hormonmidler inkluderer, men er ikke begrenset til, for eksempel LHRH- agonister så som leuprorelin, goserelin, triptorelin og buserilin; antiøstrogene midler så som tamoksifen og toremifen; antiandrogene midler så som flutamid, nilutamid, syproteron og bikalutamid; aromatase inhibitorere så som anastrozol, eksemestan, letrozol og fadtrozol; og progestagener så som medroksy, klormadinon og megestrol.

Et antall representative kjemoterapeutiske midler for kombinert terapi er angitt i tabell C i U. S. Patent Nr 6,524,583, hvis beskrivelse av midlene og indikasjonene spesifikt inkorporeres heri med henvisning. Hvert av midlene angitt er representative og ikke begrensete. Den fagkyndige ledes videre oppmerksom mot "Remington's Pharmaceutical Sciences" 15th Edition, chapter 33, in particular pages 624-652. Variasjon I dosering vil likeledes forekomme avhengig av tilstanden som skal behandles. Legen som administrerer behandlingen vil være i stand til å bestemme den egnete dosering for det bestemte individ.

Antiangiogeniske midler inkluderer nøytraliserende antistoff, antisense RNA, siRNA, RNAi, RNA aptamerer og ribozymer hver rettet mot VEGF eller VEGF reseptorer (US Patent Nr 6,524, 583, hvis beskrivelse inkorporeres heri med henvisning).

Varianter av VEGF med antagonistiske egenskaper kan også benyttes, som beskrevet i WO 98/16551, som spesifikt inkorporeres heri med henvisning.

Ytterligere representative antiangiogeniske midler som er nyttige i forbindelse med kombinert terapi er oppgitt i tabell D av U. S. Patent Nr 6,524, 583, hvis beskrivelse av midler og indikasjoner spesifikt inkorporeres heri med henvisning.

Representative apoptotiske midler inkluderer, men er ikke begrenset til, bcr- abl, bcl-2 (distinkt fra bcl-1, syklin D1; GenBank katalog numre M14745, X06487; U. S.

Patent Nr 5,650, 491; og 5,539, 094; som hver inkorporeres heri med henvisning) og familiemedlemmer inkluderende Bcl-x1, Mcl-1, Bak, A1, og A20. Overuttrykking av bcl-2 ble først oppdaget i T- celle lymfomer.

Onkogenet bcl-2 fungerer med binding og inaktivering av Bax, et protein i den apoptotiske reaksjonsvei. Inhibering av bcl-2 funksjon hindrer inaktivering av Bax, og muliggjør at den apoptotiske reaksjonsvei får fortsette. Inhibering av denne klasse av onkogener, for eksempel ved anvendelse av antisense nukleotidsekvenser, RNAi, siRNA eller småmolekyl kjemiske forbindelser, vurderes for anvendelse i foreliggende oppfinnelse for å gi forsterking av apoptose (U. S. Patent Nr 5,650, 491; 5,539, 094 og 5,583, 034; som hver inkorporeres heri med henvisning).

Nyttige antivirale midler som kan anvendes i kombinasjon med molekylene ifølge oppfinnelsen inkluderer men er ikke begrenset til protease inhibitorer, nukleosid revers transkriptase inhibitorer, ikke- nukleosid revers transkriptase inhibitorer og nukleosid analoger. Eksempler på antivirale midler inkluderer men er ikke begrenset til zidovudin, asyklovir, gangsyklovir, vidarabin, idoksuridin, trifluridin, og ribavirin, og likeledes foskarnet, amantadin, rimantadin, saquinavir, indinavir, amprenavir, lopinavir, ritonavir, alfa interferoner; adefovir, klevadin, entesavir, og plesonaril.

For autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser kan andre forbindelser kjent som effektive for en eller flere typer autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser, eller et symptom eller trekk av autoimmune eller inflammatoriske forstyrrelser, inkluderende inter alia, immunundertrykkende midler for eksempel azatioprin (for eksempel Imuran), klorambisil (for eksempel Leukeran), syklofosfamid (for eksempel Cytoksan), syklosporin (for eksempel Sandimun, Neoral), metotreksat (for eksempel Reumatrex), kortikosteroider, prednison (for eksempel Deltason, Metikorten), Etanersept (for eksempel Enbrel), infliksimab (for eksempel Remikac), inhibitorer av TNF, FK-506, rapamysin, mykofenolat mofetil, leflunomid, anti- lymfosytt globulin, deoksyspergualin eller OKT.

Foretrukne eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer cytokiner. Andre eksempler inkluderer forbindelser som har en effekt, fortrinnsvis en effekt på aktivering eller potensering av NK- celleaktivitet, eller på indusering eller for å støtte proliferasjon av NK- celler.

Eksempler på immunmodulerende forbindelser inkluderer men er ikke begrenset til ligander av NOD- og PKR- reseptorer, agonister av TLRer (Toll- lignende reseptor) så som agonister av TLR3 (dsRNA, poly I:C og poly A.U), TLR4 (ANA 380, isatoribin, LPS og etterligninger så som MPL), TLR7 (oligonukleotider, ssRNA), TLR9 (oligonukleotider så som CpGs), et antall eksempler som er beskrevet i Akira and Takeda ((2004) Nature Reviews 4: 499), og antistoff som blokkerer inhibitoriske reseptorer på NK- celler (som for eksempel inhiberer KIR2DL1 og KIR2DL2/3 aktivitet) eller virker som agonister ved NK- celleaktivieringsreseptorer (for eksempel antistoff som kryssbinder NCR- reseptorer NKp30, NKp44 eller NK046). Forskjellige cytokiner kan benyttes i kombinerte løsninger i samsvar med oppfinnelsen.

Eksempler på cytokiner som er nyttige i kombinasjoner vurdert med foreliggende oppfinnelse inkluderer IL-1alpha IL-1beta, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-21, TGF-beta, GM-CSF, M-CSF, G-CSF, TNF-alfa, TNF-beta, LAF, TCGF, BCGF, TRF, BAF, BDG, MP, LIF, OSM, TMF, PDGF, IFN-alfa, IFN-beta, IFN-gamma. Cytokiner anvendt i kombinasjonsbehandling eller sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse administreres i samsvar med standard regimer, i samsvar med kliniske indikasjoner så som tilstanden til pasienten og den relative toksisitet av cytokinet.

Adjunkt forbindelser kan inkludere for eksempel antiemetiske midler så som serotonin antagonister og terapier så som fenitiaziner, substituerte benzamider, antihistaminer, butyrofenoner, kortikosteroider, benzodiazepiner og kannabinoider; bifosfonater så som zoledronisk syre og pamidronisk syre; og hematopoietiske vekstfaktorer så som erytropoietin og G-CSF, for eksempel filgrastim, lenograstim og darbepoietin.

Andre terapeutiske midler som kan formuleres med de aktiverende anti NKG2A antistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer andre forbindelser som kan aktivere NK-celler. For eksempel, forbindelser som stimulerer NCRer, for eksempel NKp30, NKp44 og NKp46 kan anvendes (se for eksempel PCT WO 01/36630, Vitale et al. (1998) J. Exp. Med.187:2065-2072, Sivori et al. (1997) J. Exp. Med.186:1129-1136; Pessino et al. (1998) J. Exp. Med.188:953-960;

Pessino et al. (1998) J. Exp Med.188:953-960; hvis fullstendige beskrivelser heri inkorporeres med henvisning), og likeledes inhibitorer av KIR inhibitoriske reseptorer (se for eksempel Yawata et al. (2002) Crit Rev Immunol 22:463-82; Martin et al. (2000) Immunogenetics. 51:268-80; Lanier (1998) Annu Rev Immunol.16:359-93; hvis beskrivelser heri inkorporeres fullstendig med henvisning. Fortrinnsvis, en aktivator, for eksempel naturlig ligand eller aktiverende antistoff av NKp30 kan anvendes. I en utførelse anvendes en inhibitor av TGF-beta 1, idet TGF-beta 1 kan nedregulere NKp30 (se for eksempel Castriconi et al. (2004) C.R. Biologies 327:533-537, hvis fullstendige beskrivelse inkorporeres heri i sin helhet.

Terapeutiske forbindelser som kan formuleres med de inhibitoriske anti NKG2A antistoff ifølge oppfinnelsen er forbindelser som kan inhibere NK- celler. Slike forbindelser inkluderer inhibitorer av NCRer, for eksempel NKp30, NKp44 og NKp46, inhibitorer av aktiverende NKG2 reseptorer (for eksempel NKG2C); aktivatorer av inhibitoriske KIR- reseptorer, eller aktivatorer av en inhibitorisk Ly49 reseptor.

De aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen kan også formuleres sammen med et antigen hvortil toleranse er ønsket. Det antas at den forsterkete dreping av dendritiske celler forårsaket av de aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen vil forårsake tolerisering av antigener som presenteres til immunsystemet ved denne tid. Slike sammensetninger er nyttige i å behandle autoimmune sykdommer, og likeledes allergier. Eksempler på antigener som kan formuleres med de aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen inkluderer myeloin basisprotein, ragweed og andre pollen og planteallergener, allergener ansvarlige for allergier i kjæledyr, allergener ansvarlige for næringsallergier (så som peanøtt og andre nøtteallergier, melkeproduktallergener, sesam og andre frøallergener) eller insektsallergen.

Relasjonene mellom doseringer for dyr og mennesker (basert på milligram per kvadratmeter kroppsoverflate) er beskrevet i Freireich et al., (1966) Cancer Chemother Rep 50: 219. Kroppsoverflateareal kan tilnærmingsvis bestemmes fra høyde og vekt av pasienten. Se for eksempel Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardley, N.Y., 1970, 537.

En effektiv mengde av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan være I området fra ca 0,001 mg/kg til ca 1000 mg/kg, mer fortrinnsvis 0,01 mg/kg til ca 100 mg/kg, mer foretrukket 0,1 mg/kg til ca 10 mg/kg; eller ethvert område hvor den nedre grense i området er enhver mengde mellom 0,001 mg/kg og 900 mg/kg og den øvre grense i området er enhver grense mellom 0,1 mg/kg og 1000 mg/kg (for eksempel 0,005 mg/kg og 200 mg/kg, 0,5 mg/kg og 20 mg/kg). Effektive doseringer vil også variere som anerkjent av fagkyndige innen fagfeltet, avhengig av sykdom som behandles, administrasjonsrute, eksipient dosering, og muligheten for sambruk med andre terapeutiske behandlinger så som anvendelse av andre midler.

For farmasøytiske sammensetninger som omfatter ytterligere terapeutiske midler, vil en effektiv mengde av det ytterligere terapeutiske middel mellom ca 20 % og 100 % av doseringen som normalt benyttes i et monoterapiregime ved anvendelse av akkurat det ytterligere middel. Fortrinnsvis, en effektiv dosering mellom ca 70 % og 100 % av den normale monoterapeutiske dosering. De normale monoterapeutiske doseringer av disse ytterligere terapeutiske midler er godt kjent innen fagfeltet. Se for eksempel Wells et al., eds., Pharmacotherapy Handbook, 2.sup.nd Edition, Appleton and Lange, Stamford, Conn. (2000); PDR Pharmacopoeia, Tarascon Pocket Pharmacopoeia 2000, Deluxe Edition, Tarascon Publishing, Loma Linda, Calif. (2000), og hver av disse referanser inkorporeres fullstendig med henvisning.

Det er forventet at noen av de ytterligere terapeutiske midler angitt over vil fungere synergistisk med forbindelsene ifølge oppfinnelsen. Dersom dette forekommer, vil det muliggjøre effektive doseringer av det ytterligere terapeutiske middel og/eller av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan reduseres fra det som er nødvendig i en monoterapi. Dette har den fordel at det minimerer toksiske bieffekter av enten det ytterligere terapeutiske middel av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, synergistisk forbedret effektivitet, forbedre enkelhet i administrering eller anvendelse og/eller reduserer tital kostnad av forbindelsespreparatet eller formulering.

Det skal anerkjennes av fagkyndige innen feltet at visse terapeutiske midler angitt over faller inn i to eller flere av kategoriene beskrevet over.

For formålet med denne oppfinnelse vurderes slike terapeutiske midler til å være medlemmer av hver av de kategorier av terapeutika og karakteriseringen av ethvert terapeutisk middel som i en viss spesifisert kategori hindrer ikke at det også kan vurderes til å være inkludert i en annen spesifisert kategori.

I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en sammensetning av materiale omfattende et antistoff ifølge oppfinnelsen og et andre terapeutisk middel eller et allergen, valgt blant enhver av midlene eller allergenene angitt over, hvor antistoffet og det andre middel er i separate doseringskammer, men assosiert med hverandre. Termen ”assosiert med hverandre” som anvendt heri betyr at de separate doseringsformer er pakket sammen eller på annen måte festes til hverandre slik at det enkelt fremgår at de separate doseringsformer er tiltenkt til å kunne selges og administreres som del av det samme regime. Midler og antistoffer er fortrinnsvis pakket sammen i en blisterpakke eller andre multipakkerkammer, eller som forbundene, separate forseglete beholdere (så som folieposer eller lignende) som kan separeres av brukeren (for eksempel ved å dra i revnelinjene mellom de to beholdere).

I et ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et kitt omfattende i separate beholdere, a) et antistoff ifølge oppfinnelsen; og b) et andre terapeutisk middel eller et allergen. Igjen, enhver av de terapeutiske midler eller allergener anvendt over kan være tilstede i et slikt kitt.

Terapeutisk anvendelse av anti NKG2A antistoff og sammensetninger.

De aktiverende antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse gjør NK- celler i stand til å lysere målceller som bærer HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate idet NK- cellene kommer i kontakt med målcellen. Således, i samsvar med en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å rekonstituere NK- cellemediert lysering av en målcelle i en populasjon omfattende en NK- celle og nevnte målcelle, hvor nevnte NK- celle er karakterisert med NKG2A på dets overflate, og nevnte målcelle er karakterisert ved nærvær av HLA-E eller Qa1på dets overflate, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnet og sette nevnte NK- celle i forbindelse med et overfor beskrevet aktiverende monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

Denne aktivitet er spesielt nyttig i behandling av tilstander og forstyrrelser karakterisert ved skadelig celleuttrykking av HLA-E eller Qa1på deres celleoverflate. En slik celletype er dendritiske celler, fortrinnsvis en moden dendritt celle. Således, foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for å behandle en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse eller enhver annen forstyrrelse forårsaket idet minste delvis av et overskudd av dendritiske celler, eller hyperaktiv dendritisk celleaktivitet. Fremgangsmåten for behandling av slike forstyrrelser omfatter trinnet å administrere til en pasient en ikke- cytotoksisk sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter et aktiverende antistoff.

Representative autoimmune forstyrrelser som kan behandles med foreliggende fremgangsmåter inkluderer inter alia hemolytisk anemi, perniciøs anemi, polyarteritt nodosa, systemisk lupus erytematøsis, Wegeners granulomatose, autoimmun hepatitt, Behçets sykdom, Crohns sykdom, primær bilary cirrhosis, scleroderma, ulcerøs kolitt, Sjögrens syndrom, Type 1 diabetes mellitus, uveitis, Graves sukdom, Alzheimers sykdom, thyroidit, myocarditt, rheumatisk feber, scleroderma, ankylosing spondylitt, reumatoid artritt, glomerulonefritt, sarcoidose, dermatomyositt, myastenia gravis, polymyosit, Guillain-Barré syndrom, multippel sklerose, alopecia areata, pemphigus/pemphigoid, Bullous pemphigoid, Hashimoto's thyroiditis, psoriasis og vitiligo.

Eksempler på inflammatroriske forstyrrelser som kan behandles med disse metoder inkluderer, men er ikke begrenset til, adrenalitt, alveolitt, angiocholecystitt, appendicitt, balanitt, blepharitt, bronkitt, bursitt, carditt, cellulitis, cervicitt, cholecystitt, chorditis, cochlitis, colitis, conjunctivitis, cystitt, dermatitt, diverticulitt, encefalit, endocarditt, esofagitt, eustachitt, fibrositt, folliculitt, gastritt, gastroenteritt, gingivitis, glossitt, hepatosplenitt, keratitt, labyrinthitt, laryngitt, lymfangitt, mastitt media otitt, meningitt, metritis, mucitt, myocarditt, myosititt, myringitt, nefritt, neuritt, orchitt, osteochondritt, otitt, pericarditt, peritendonitt, peritonitt, pharyngitt, phlebitt, poliomyelitt, prostatitt, pulpitt, retinitt, rhinitt, salpingitt, scleritt, selerochoroiditt, scrotitt, sinusitt, spondylitt, steatitt, stomatitt, synovitis, syringitt, tendonitt, tonsillitt, uretritt, and vaginitt.

Det har også blitt vist at alloreaktiv NK celledrepig av dendritiske celler forbedrer innpoding av hematopoetiske celler i benbargtransplatasjoner (L. Ruggeri et al., Science, 2002, 295:2097-2100). Således, i en annen utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å forbedre innpoding av hematopoetisk celler i an pasient, omfattende trinnene å administrere til nevnte pasien en sammensetning ifølge oppfinnelsen omfattende et aktiverende antistoff. Forbedring i innpoding manifesteres av en redusert hyppighet eller alvorlighet av graft versus vært sykdom, forlenget overlevelse av graften, eller en reduksjon I eller eliminering av symptomer av sykdommen som behandles av graften (for eksempel en hematopoetisk cancer). Denne fremgangsmåte anvendes fortrinnsvis i behandlingen av leukemi.

Cancerceller har også blitt vist å unnvike dreping gjennom nærvær av HLA-E på deres overflate. HLA-E har blitt detektert på kirurgisk fjernet glioblastomprøver, i gliomacellelinjer og glioblastomcellekulturer (J. Wischhusen et al., J Neuropathol Exp Neurol. 2005; 64(6):523-8); og i leukemiavledete cellelinjer, melanomer, melanomavledete cellelinjer og cervicale tumorer (R Marin et al., Immunogenetics. 2003; 54(11):767-75). Således, i en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangmeåte forå behandle en pasisent som lider av cancer, hvor nevnte cancer er karakterisert av en celle som utrykker HLA-E, hvor nevnte fremgangmåte omfatter trinnet å administrere til nevnte pasient en sammensetning ifølge foreliggende oppfinnelse omfattende et aktiverende antistoff.

Eksemper på cancere som kan behandles I samsvar med denne fremgangsmåte inkluderer, men er ikke begrenset til, carcinom, inkluderende I blære, bryst, tarm, nyre, lever, lunge, eggstokk, prostate, bukspyttkjertel, mage, cervix, tyroid og hud, inkluderende skamøs celle carcinom; hematopoetiske tumorer av lymfoid linje, inkluderende leukemi, akutt lymfocytisk leukemi, akutt lymfoblastisk leukemi, B-celle lymfom, T-celle lymfom, Hodgkins lymfom, non-Hodgkins lymfom, haårcelle lymfom and Burketts lymfom; hematopoetiske tumorer av myeloid linje, inkluderende akutt og kronisk myelogenøse leukemier and promyelocytisk leukemi; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkluderende fibrosarkom og rhabdomyosarkom; andre tumorer, inkluderende melanom, seminom, teratocarcinom, neuroblastom and gliom; tumorer av det sentrale og perifere nervesystem, inkluderende astrocytom, neuroblastom, gliom, and schwannomaer; tumorer av mesenchymal opprinnelse, inkluderende fibrosarcom, rhabdomyoscarom og osteosarcom; og andre tumorer, inkluderende melanom, xeroderma pigmentosum, keratoacantom, seminom, thyroid follikulær cancer and teratocarcinom.

Foretrukne cancer som kan behandles i samsvar med oppfinnelsen inkluderer gliomer, glioblastomaer, leukemier, melanomer, and cervicale tumorer.

Viralt infiserte celler anvender også HLA-E ekspresjon som en mekanisme for å unngå NK celledreping. HLA-E ekspresjon har blitt assosiert med hepatitt C virus infiserte celler (J. Mattermann et al, American Journal of Pathology.2005;166:443-453); og cytomegalovirus infiserte celler (C. Cerboni et al., Eur J Immunol.2001; 31(10):2926-35). Således, I en ytterligere utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å behandle en pasient som lider av en viral infeksjon, hvor nevnte virale infeksjon er karakterisert ved en viralt infisert celle som uttrykker HLA-E, hvor nevnte fremgangsmåte omfatter trinnet å administrere til nevnte pasient en sammensetning ifølge oppfinnelsen omfattende et aktiverende antistofff.

Eksempler på virale infeksjoner som kan behandles med denne metode inkluderer, men er ikke begrenset til, infeksjoner forårsaket av virus av familien Retroviridae (for eksempel humane immunsviktvirus, så som HIV-1 (også benevnt HTLV-III, LAV eller HTLV-III/LAV, eller HIV-III; og andre isolater, så som HIV-LP)); Picornaviridae (for eksempel poliovirus, hepatit A virus; enterovirus, human Coxsackie virus, rhinovirus, echovirus); Calciviridae (for eksempel stammer som forårsaker gastroenteritt);

Togaviridae (for eksempel equin encefalitt virus, rubella virus); Flaviviridae (for eksempel dengue virus, encefalitt virus, gulfebervirus); Coronaviridae (for eksempel , coronavirus); Rhabdoviridae (for eksempel vesiculær stomatitt virus, rabies virus); Filoviridae (for eksempel ebola virus); Paramyxoviridae (for eksempel parainfluenza virus, mumps virus, meslingvirus, respiratorisk syncytial virus); Orthomyxoviridae (e.g., influenza viruses) or avian influenza viruses (e.g. H5N1 or related viruses); Bungaviridae (for eksempel Hantaan virus, bunga virus, phlebovirus and Nairo virus); Arenaviridae (hemorrshr febervirus); Reoviridae (for eksempel reovirus, orbiviurs and rotavirus); Birnaviridae; Hepadnaviridae (Hepatitis B virus);

Parvoviridae (parvovirus); Papovaviridae (papillomavirus, polyoma virus);

Adenoviridae (de fleste adenovirus); Herpesviridae (herpes simpleks virus (HSV) 1 og 2, varicella zoster virus, cytomegalovirus (CMV)); Poxviridae (variola virus, vaccinia virus, pox virus); Iridoviridae (for eksempel Afrikank svinefeber virus); og uklassifiserte virus (for eksempel de etiologiske midler av spongiform encefalofatier, midlene av delta hepatitt (tenkt å være en defektiv satellitt av hepatitt B virus), midlene av ikke-A, ikke-B hepatitt (klasse 1=internt overført; klasse 2=parenteralt smittet (dvs. Hepatitt C); Norwalk og beslektede virus, og astrovirus).

Mest fortrinnsvis, den virale infeksjon som kan behandles er valgt blant hepatitt C-virus infeksjon eller en cytomegalovirusinfeksjon.

De aktiverende antistoff ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for å indusere toleranse til et antigen. Således, i samsvar med en annen utførelse, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å indusere toleranse til et antigen i en pasient omfattende trinnene å administrere til nevnte pasient en sammensetning ifølge oppfinnelsen omfattende et aktiverende antistoff; og administrere til nevnte pasient et antigen hvortil toleranse er ønsket. Fremgangsmåten anvendes fortrinnsvis for å behandle en allergi, hvor antigenet er et allergen. Valg av antigen kan gjøres fra det som er angitt over for kombinasjonssammensetninger omfattende et aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen og et antigen.

Sammensetninger som omfatter de inhibitoriske antistoff ifølge oppfinnelsen eller cytotoksin antistoff kunjugater er nyttig for å drepe NK- celler, redusere aktiviteten av NK- celler, redusere proliferasjon av NK- cellene, hindre lysering av celler som er mottagelig for NK- cellelysering, eller redusere antallet NK- celler i en populasjon. Således, i en utførelse, tilveiebringer foreliggende oppfinnelse fremgangsmåte for å redusere aktiviteten av NK- celler, redusere proliferasjon av NK- cellene, hundre lysering av celler som er mottagelig for NK- cellelysering, eller redusere antallet NK-celler i en populasjon omfattende trinnet å sette en NK- celle i forbindelse med en sammensetning ifølge oppfinnelsen omfattende et inhibitorisk antistoff eller et cytotoksin antistoff konjugat. Disse fremgangsmåter er spesielt nyttige i sykdommer karakterisert med NK- hyperaktivitet og/eller hyperproliferasjon.

For eksempel, felleseid PCT søknad WO2005/105849 beskriver generelt anvendelse av antistoff mot forskjellige NK- cellereseptorer for behandling av NK type LDGL. PCT publikasjon WO 2005/115517 beskriver at NK- cellehyperaktivitet er assosiert med nærvær, progresjon, fase og/eller aggressivitet av pankreatiske øyer autoimmunitet og spiller således en funksjon i type I diabetes. Således, i samsvar med en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for å behandle en pasient som lider av en tilstand karakterisert med NK- celle hyperaktivitet eller NK- celle hyperproliferasjon omfattende trinnet å administrere til nevnte pasient en sammensetning i samsvar med foreliggende oppfinnelse som omfatter et inhibitorisk antistoff eller et cytotoksin antistoff konjugat. I en foretrukket utførelse er tilstanden valgt blant NK type LDGL eller type I diabetes.

Enhver av de terapeutiske fremgangsmåter beskrevet over kan omfatte det ytterligere trinn å administrere til en pasient et middel egnet for tilstand som behandles. Eksempler på typer av andre terapeutiske midler som kan administreres til pasienten inkluderer et cytokin, en cytokin inhibitor, en hematopoetisk vekstfaktor, insulin, et antiinflammatorisk middel, en immunsupresant, en anticancerforbindelse (så som en kjemoterapeutisk forbindelse, en antiangiogenisk forbindelse, en apoptosefremmende forbindelse, et hormonmiddel, en forbindelse som interfererer med DNA- replikasjon, mitose og/eller kromosomal segresjon eller et middel som ødelegger syntese og presisjon av polynukleotid forløpere), en adjunktforbindelse (så som en smertelindrer eller et antiemetisk forbindelse), en forbindelse som agoniserer en aktivering av en Nk cellereseptor, (så som NKp30, NKp44 og NKp46, en antagonist av en inhibitorisk NK cellereseptor, (så som en inhibitor KIR reseptor), en antagonist av TGF- beta 1, en forbindelse i stand til å stimulere en inhibitorisk NK cellereseptor, (så som naturlige ligander, antistoff eller små molekyler som kan stimulere aktiviteten av CD94/NKG2A reseptorer, eller en inhibitorisk KIR- reseptor så som KIR2DL1, KIR2DL2, KIR2DL3, KIR3DL1, og KIR3DL2) eller en inhibitor av en aktiverende NK cellereseptor (så som NKp30, NKp44, eller NKp46).

Spesifikke eksempler av ovenfor beskrevne klaser av forbindelser er angitt i seksjonen av farmasøytiske sammensetninger og enhver av slike spesifikke forbindelser, og likeledes andre medlemmer av enhver av disse klaser av terapeutiske midler kan administreres til en pasient ifølge fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen. Valg av terapeutisk middel som kan anvendes kan enkelt utvelges av fagkyndige innenfor det medisinske fagfelt og er avhengig av naturen til tilstanden som skal behandles eller hindres, alvorlighetsgraden av tilstanden, den generelle totale helse til pasienten som skal behandles, og vurderingen av den legen som forestår behandlingen. Det andre terapeutiske middel kan administreres samtidig med, før, eller etter det anti NKG2A materiale ifølge oppfinnelsen. Ved administrering samtidig kan det andre terapeutiske middel administreres som enten en separat formulert sammensetning (det vil si som en multippel doseringsform, eller som del av det antistoff inneholdende sammensetning).

I noen utførelser, før administrering av en NKG2A antistoffsammensetning ifølge oppfinnelsen, vil uttrykking av NKG2A, og muligens andre proteiner, på NK- celler undersøkes, og/eller aktiviteten eller antallet dendritiske celler (fortrinnsvis modne dendritiske celler) og/eller nærvær av en NKG2A- ligand (for eksempel HLA-E eller Qa1på andre celler vil bli målt). Dette kan utføres ved å oppta en prøve av NK eller dendritiske celler fra pasienten, og for NK- celler, teste for eksempel ved anvendelse av immunoanalyse for å bestemme den relative prominens av markører så som KIR-reseptorer, andre NKG2- reseptorer eller NCRer (for eksempel NKp30, NKp44, NKp46, på cellene). Andre metoder kan også anvendes for å detektere ekspresjon av disse proteiner, så som RNA- baserte metoder, for eksempel RT-PCR eller Northern blotting. Deteksjon av NK- celler som uttrykker NKG2A i pasienten indikerer at foreliggende fremgangsmåte er godt egnet for anvendelse for behandling av pasienten.

Behandlingen kan involvere multiple runder av antistoff. For eksempel, etter en innledende runde med administrering kan nivået og/eller aktiviteten av NKG2A-uttrykkende NK- celler og/eller dendritiske celler eller andre celler som uttrykker NKG2A eller HLA-E, eller Qa1på deres overflate, måles på nytt, og dersom hensiktsmessig kan en ytterligere runde med administrering utføres. På denne måte kan multiple runder av reseptor/celle/liganddeteksjon og antistoffsammensetning administreres, inntil forstyrrelsen er brakt under kontroll.

Det skal også anerkjennes at mer enn et antistoff kan produseres og/eller anvendes i foreliggende fremgangsmåter. For eksempel, kombinasjoner av antistoff rettet mot forskjellige epitoper påNKG2A, mot forskjellige kombinasjoner av NKG2A, CD94 eller HLA-E, eller mot forskjellige isoformer av enhver av de tre proteiner som kan eksistere i ethvert individ kan anvendes, som hensiktsmessig for å oppnå det ideelle nivå av inhibering av NKG2A- stimulering eller inhibering av NK- celleaktivitet, enten generelt eller i ethvert individ (for eksempel etter en analyse av NKG2A- uttrykkende celler i pasienten for å bestemme et egnet behandlingsregime).

Så lenge en bestemt terapeutisk løsning ikke er kjent å være skadelig for pasientens tilstand i seg selv, og ikke signifikant motvirker NKG2A antistoff behandlingen, vurderes denne kombinasjon ifølge foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse kan også anvendes i kombinasjon med klassiske løsninger, så som kirurgi og lignende. Idet en eller flere andre terapeutiske midler eller løsninger anvendes i kombinasjon med foreliggende terapi, er der ikke noe krav for at de kombinerte resultater skal være additive av effekten observert med hver behandling utført separat. Selv om minst additive effekter generelt er hensiktsmessig, så lenge antistoffsammensetningene ifølge foreliggende oppfinnelse forblir effektive i å inhibere eller aktivere NK- celler, kan fremgangsmåtene ifølge oppfinnelsen ytterligere omfatte anvendelse av andre terapeutiske midler og andre løsninger. Videre, der er ikke noe bestemt krav for den kombinerte behandling og oppvise synergistiske effekter, selv om dette selvsagt er mulig og fordelaktig.

NKG2A antistoffbasert behandling kan komme foran eller følge etter den andre behandling, for eksempel med intervaller i områder fra minutter til uker og måneder. Det vurderes også at mer enn en administrering av et anti NKG2A sammensetning ifølge oppfinnelsen vil bli benyttet. Det andre terapeutiske middel eller andre løsning kan administreres om hverandre med NKG2A antistoffsammensetningen ifølge oppfinnelsen, eller alternere dager eller uker; eller en syklus av anti NKG2A-behandling kan gis, etterfulgt av en syklus av det andre middel eller terapi eller løsning. I ethvert tilfelle, for fremgangsmåter som omfatter det ytterligere trinn å administrere et andre terapeutisk middel til en pasient, så er alt som kreves å avgi både det andre terapeutiske middel og antistoffet ifølge oppfinnelsen i en kombinert mengde som er effektiv til å oppvise en terapeutisk nyttig effekt, uavhengig av tidspunkt for administrering.

Det skal anerkjennes at foreliggende fremgangsmåter for administrering av antistoff og sammensetninger til pasienter som kan anvendes for å behandle dyr, eller for å teste effektiviteten av enhver av de heri beskrevne fremgangsmåter eller sammensetninger i dyremodeller for humane sykdommer. Således, termen ”pasient” som anvendt heri angir ethvert varmblodet dyr, fortrinnsvis et pattedyr, mer fortrinnsvis et primat og mest fortrinnsvis et menneske.

Ytterligere aspekter og fordeler med foreliggende oppfinnelse er beskrevet i den påfølgende eksperimentelle seksjon, som skal vurderes som illustrerende og ikke for å begrense rammen av foreliggende oppfinnelse.

Eksempler.

Eksempel 1. Dreping av autologe iDC medieres av en undergruppe av CD94/NKG2A+KIR-NK-celler.

Polyklonale NK- celler dyrket i nærvær av eksogent IL-2 har tidligere vært vist å oppvise sterkt cytolytisk aktivitet mot iDC. Således, i foreliggende studium, polyklonal NK cellepopulasjoner isolert fra donor AM, AC og DB drepte effektivt både autologe og allogeniske iDC. Imidlertid, den cytolytiske aktivitet mot autologi DC kunne økes i nærvær av egnet anti HLA klasse ImAb.

Disse data kan være konsekvens av ødeleggelse av inhibitoriske interaksjoner som foregår mellom selv HLA klasse I på DC og inhibitoriske reseptorer på NK- celler. På basis av disse resultater formulerte vi hypotesen om at kun en fraksjon av den totale NK cellepool oppviser spontant cytotoksisitet mot iDC mens de andre NK- celler ikke gjør dette på grunn av effektive inhibitoriske interaksjoner mellom deres reseptorer og HLA klasse I molekyler. For å analysere denne mulighet ble et panel av NK-cellekloner isolert fra donorer AM, AC og DB undersøkt for cytotoksisk aktivitet mot autologe (og allogeniske) iDC. I samsvar med vår hypotese lyserte kun en fraksjon av NK- celleklonene autologi iDC. De andre kloner oppviser enten liten eller ingen cytotoksisitet. Videre, prosentandelen av cytolytiske kloner var noe øket idet målcellene ble representert av allogenisk iDC (se nedenfor).

For å verifisere om manglende evne av visse NK cellekloner til å lysere iDC reflekterte interaksjonen av deres inhibitoriske NKR med HLA klasse I molekyler, ble disse kloner analysert for evnene til å lysere autologe iDC enten i fravær eller i nærvær av anti HLA klasse I mAb (det vil si under betingelser som ødelegger de inhibitoriske interaksjoner). På basis av resultatene i disse eksperimenter ble NK cellekloner gruppert i tre forskjellige funksjonelle kategorier og ytterligere analysert for ekspresjon av HLA klasse I spesifikke inhibitoriske reseptorer, inkluderende drepe IgG- lignende reseptor KIR)2DL, KIR3DL1 og CD94/NKG2A (det vil si hoved MHC klasse I- spesifikke inhibitoriske reseptorer i mennesker).

Den første gruppen (gruppe A) av NK- kloner var karakterisert med høy spontan cytolytisk aktivitet mot iDC. Størrelsen på deres cytolytiske aktivitet kunne ikke, eller kunne kun minimalt økes i nærvær av anti HLA klasse I mAb. Disse kloner ble i stedet homogene i termer av uttrykking av inhibitoriske reseptorer idet de uttrykte CD94/NKG2A men manglet KIR2DL og KIR3DL1, som reagerer med selv- HLA klasse I alener. Den andre gruppe av NK- cellekloner (gruppe B) var også karakterisert av evne til spontant å drepe iDC. Imidlertid, en varians med gruppe A kloner, deres cytotoksisitet økte i nærvær av anti HLA klasse I mAb. Dette antyder forekomst av inhibitoriske interaksjoner som begrenset, men ikke opphevet NK cellemediert cytolyse. Denne gruppen var også sammensatt av CD94/NKG2A+ klonet og manglet KIR- reaktive med selv-HLA klasse I alleler. Bemerkelsesverdig, den cytolytiske aktivitet av gruppe B NK- kloner kunne ikke økes i nærvær av anti CD94 mAb noe som indikerer at den (partielle) inhibering av cytotoksisitet faktisk var mediert av CD94/NKG2A.

NK- kloner som tilhører den tredje gruppe (gruppe C) oppviser ikke cytotoksisitet mot autologi iDC, imidlertid i nærvær av anti HLA klasse I mAb, ble iDC effektivt lysert, noe som antyder forekomst av potente inhibitoriske interaksjoner. Disse NK- kloner var mer heterogen med hensyn til ekspresjon av inhibitoriske reseptorer.

Bemerkelsesverdig, i hovedsak alle NK- kloner som uttrykker KIR2DL eller KIR3DL1 spesifikke for selv- HLA- alleler var inkludert i denne gruppe. Videre, noen av disse kloner var karakterisert av uttrykking av en enkelt KIR mens andre uttrykte multiple KIR med forskjellige spesifisiteter. Rekonstituering av cytolytisk aktivitet mot iDC kan ikke kun oppnås med anti HLA klasse I mAb, men også med anti KIR mAb (se nedenfor).

Til slutt, en mindre fraksjon av gruppe C- NK- cellekloner var KIR-CD94/NKG2A+. Deres cytotoksisitet kan rekonstitueres med mAb- mediert blokkering av CD94 eller med anti HLA klasse I mAb. Disse data indikerer at: a) ikke alle NK- celler er i stand til å drepe autologi DC ( selv om alle NK- celler kan lysere iDC i nærvær av anti HLA klasse I mAB); b) kloner som oppviser spontan cytolytisk aktivitet mot iDC er begrenset til en NK- undergruppe karakterisert med CD94/NKG2A+KIR- overflate fenotype (gruppe A og B); c) kloner som uttrykker KIR2DL eller KIR3DL, som er spesifikke for selv- HLA klasse I alleler, dreper ikke autolog iDC (gruppe C).

Noen NK- kloner uttrykker både selv- reaktive KIR og CD94/NKG2A. Under alle forhold blir disse bekreftet til gruppe C, og deres cytolytiske aktivitet kan rekonstitueres både med anti HLA klasse I og anti KIR mAb, mens anti CD94 mAb har liten eller ingen effekt. Til slutt skal det nevnes at KIR+NKG2A- kloner ble funnet å oppvise cytolytisk aktivitet mot iDC kun i eksperimenter hvor iDC var avledet fra allogenisk (KIR mismatched) individer.

I dette tilfellet oppviser KIR+NKG2A- celler alloreaktivitet på grunn av at det uttrykte KIR ikke gjenkjenner HLA klasse I allener på allogenisk DC. Den representative NK-klon AM4 (KIR3DL1+) var ikke i stand til å drepe autologe iDC (BW4+BW6-) mens den lyserte allogenisk, KIR mismatched (BW4-BW6+) iDC. Dreping av autologi iDC kan rekonstitueres i nærvær av anti HLA klasse I mAb, mens dreping av allogenisk iDC ikke signifikant var modifisert.

Et annet eksempel som indikerer evner av KIR til å skille mellom autologe og allogenisk KIR- mismatch, iDC er tilveiebrakt av klon DB3, som ko-uttrykker KIR2DL1 og KIR2DL2. Denne klon kan defineres som ”ikke- alloreaktiv” på grunn av at, på basis av dets KIR- fenotype, skulle gjenkjenne alle forskjellige HLA-C celler (både gruppe 1 og gruppe 2). Faktisk drepte denne klon ikke autologe eller allogenisk iDC mens lysering av begge mål effektivt kunne rekonstitueres med anti HLA klasse I mAb. Videre, rekonstituering av lysering ble oppnådd med anti KIR2DL2 mAb mot autolog (CW1/CW3) iDC og med anti KIR2DL1 mAb mot allogenisk (CW2/CW4) iDC. Til slutt, som forventet, i tilfelle NKG2A+KIR-kloner eksiterte ingen vesentlig forskjell i evnen til å drepe autolog eller allogenisk iDC.

Eksempel 2.- Disposisjon av iDC til NK- mediert cytotoksisitet reflekterer nedmodulering av HLA-E klasse I molekyler.

Tidligere forsøk har vist at iDC og mDC oppviser betydelige forskjeller med hensyn til HLA klasse I overflateekspresjon. Således, ved anvendelse av mAb som er spesifikke for en monomorf determinant av HLA-A, B, C og E molekyler, har det blitt vist at DC som undergår modning i stor grad oppregulerer deres HLA klasse I ekspresjon ved celleoverflaten. Videre, oppreguleringen av HLA klasse I representerte en avgjørende mekanisme hvorved mDC blir resistent til NK cellemediert lysering.

For å direkte undersøke ekspresjon av forskjellige HLA klasse I molekyler på celler som er representative for forskjellige trinn i DC- modning analyserte vi sammenlignende ekspresjon av HLA-A, B, C og E på monocytter, iDC og mDC avledet fra det samme individ.

Alle HLA klasse I molekyler var sterkt oppregulert i mDC sammenlignet med iDC. Bemerkelsesverdig, de var klart nedregulert i iDC sammenlignet med monocytter (det vil si forløpere av iDC). Således, det syntes som om generering av iDC fra monocytter resulterer ikke kun i ervervelse (eller oppregulering) av nye overflatemolekyler (for eksempel CD1a) og funksjonelle egenskaper, men også i tap (eller nedregulering) av ekspresjon av forskjellige molekyler inkluderende CD14, og HLA-A, B, C og E molekyler. Dette vil antyde at graden av HLA klasse I nedregulering innstilles til nivåer som muliggjør at iDC blir sensitiv til lysering mediert av bestemt undergruppe av NK- celler (CD94/NKG2A+KIR-).

I samsvar med dette, på grunn av at KIR+NK- celler ikke er i stand til å drepe iDC, vurderes det at mengden av HLA-B eller HLA-C molekyler som uttrykkes av iDC er tilstrekkelig til å generere KIR kryssbinding og avgivelse av inhibitoriske signaler. På den andre side, nedreguleringen av HLA-E vil være tilstrekklig til å muliggjøre at en fraksjon av KIR-NKG2A+NK- celler dreper iDC. Faktisk sees det at HLA-E (som detektert med HLA-E spesifikt 3D12 mAb) var omtrent udetekterbar i iDC, mens der var kun partielt reuttrykt må mDC. Imidlertid, under alle forhold, HLA-E ekspresjon i mDC var lavere sammenlignet med monocytter eller PBL avledet fra det samme individ. Overraskende, selv om HLA-A, B og C molekyler var uttrykt av mDC i høyere nivåer enn av PHA- blast, var overflateekspresjon av HLA-E konsistent lavere i mDC enn i PHA- blast. I denne sammenheng tilveiebringer tidligere forsøk klare bevis på at autolog PHA- blast er sterkt resistent til NK- lysering uavhengig av KIR/NKG2A-fenotype på effektor NK- cellene.

Eksempel 3 - En liten fraksjon av NK- kloner kan mediere dreping av mDC.

I samsvar med tidligere rapporter om at polyklonale NK- celler ikke effektivt dreper mDC, viste vi at de fleste NK- cellekloner som lyserte iDC ikke dreper mDC.

Interessant, imidlertid, mDC ble lysert av en mindre fraksjon av NK- kloner tilhørende til gruppe A (det vil si de som oppviser spontan anti iDC cytolytisk aktivitet som ikke an økes med anti HLA klasse I mAb). Lysering av autologe mDC var lavere sammenlignet med det for iDC, og kan økes i nærvær av anti HLA klasse I mAb.

Dette antyder at den høyere ekspresjon av HLA-E i mDC sammenlignet med iDC resulterer i en mer effektiv signalering via CD94/NKG2A (dette er også antydet ut fra evnen av anti CD94 mAb til å øke deres lysering). Vedrørende gruppe B NK- kloner (det vil si de som er i stand til å drepe iDC og hvis lysering ble øket med anti HLA klasse I mAb), så oppviste de ingen cytolytisk aktivitet mot mDC; imidlertid kunne cytolytisk aktivitet påvises i nærvær av anti HLA klasse I eller anti CD94 mAb. Til slutt, kloner som tilhører gruppe C ( i de fleste tilfeller KIR+) som ikke er i stand til å drepe iDC, feilet også i å drepe mDC. Cytotoksisitet mot mDC kunne kun detekteres ved mAb- mediert ødeleggelse av interaksjonen mellom HLA klasse I og KIR.

Eksempel 4- heterogenisitet av KIR-NKG2A+NK- celler i evnen til å drepe DC.

Som illustrert over, NK- cellekloner som tilhører gruppe A og B er karakterisert av en homogen KIR-NKG2A+ overflate fenotype mens gruppe C inkluder enten KIR+NKG2A- eller KIR-NKG2A+ kloner, (eller mindre hyppig, KIR+MKG2A+kloner). Ved å anta at den negative signalering via KIR er mer effektiv enn en via NKG2A, (enten på grunn av en indre forskjell i signaleringsevnen eller på grunn av forskjellig tilgjengelighet av spesifikke HLA klasse I ligander på DC) bør det oppklares hvorfor KIR-NKG2A+ celler kan detekteres i alle tre grupper av NK- kloner. Siden den cytolytiske aktivitet av en gitt NK- celleklon er resultatet av en balanse mellom inhibitorisk (KIR, NKG2A) og utløsende (NCD, NKG2D) reseptorer, analyserte vi nivået av ekspresjon av disse molekyler i forskjellige grupper av NK- kloner. Spesielt fokuserte vi på ekspresjon av NKG2A og på NKp30 (det vil si utløsningen av NCR som spiller en hovedfunksjon ved induksjon av NK- cellemediert lysering av iDC og mDC).

Først ble NKG2A+KIR- kloner tilhørende gruppe A, B og C evaluert for nivå av NKG2A overflateekspresjon. NK- kloner tilhørende gruppe C uttrykte svært høye nivåer av NKG2A sammenlignet med gruppe A og B. Videre, gruppe A kloner ble karakterisert med en lavere ekspresjon av NKG2A sammenlignet med gruppe B kloner. Disse data antyder eksistens av en invers korrelasjon mellom nivået av NKG2A ekspresjon og evne til å drepe iDC og mDC.

De lave mengder av HLA-E molekyler uttrykt i iDC kan differensielt senses av NK-celler som uttrykker høye eller lave nivåer av NKG2A, mens mDC (som uttrykker høye nivåer av HLA-E) er mottakelig til lysering kun av NK- karakterisert med svært lav NKG2A overflatetetthet. Med hensyn til ekspresjon av NKp30 var denne sammenlignbar ide fleste NKG2A+ kloner som ble analysert. I samsvar med disse data viste deres evne til å drepe iDC i nærvær av anti HLA klasse I mAb (det vil si i fravær av inhibitoriske interaksjoner) ikke signifikante forskjeller.

Diskusjon.

Heterogenisitet eksisterer også blant NKG2A+KIR- celler med hensyn til størrelse på cytolytiske responser. Dette syntes å være invers korrelert med overflatetetthet av NKG2A. Således, NK- kloner som uttrykker lave nivåer av NKG2A (gruppe A) lyserte både iDC og mDC, mens de som uttrykker høyere nivåer av NKG2A drepte kun iDC, eller i noen få tilfeller (NKG2A lys) drepte verken iDC og mDC.

Bemerkelsesverdig, vi har også vist at overflateekspresjon av HLA-E er skarpt redusert i iDC sammenlignet med monocytter mens den er partielt gjenvunnet i mDC. I motsetning, de reduserte celleoverflatenivåer av HLA-B og HLA-C i iDC er fremdeles tilstekkelig til effektivt å engasjere KIR3DL1 eller KIR2Dl.

Et uventet funn av identifiseringen av en mindre undergruppe av NK- cellekloner som tilhører gruppe A (5-10 %) som var i stand til å drepe cytolog mDC. Disse NK-kloner uttrykker ikke selv- reaktiv KIR og er karakterisert med lave nivåer av NKG2A. Dette muliggjør at disse NK- celler enkelt kan sense nedregulering av HLA-E på målceller sammenlignet med NK- celler som uttrykker høyere nivå av NKG2A.

Således, ingen økning av cytolytisk aktivitet av NKG2A lav NK- celler mot iDC forekom i nærvær av anti HLA klasse I mAb. På den andre side, i tilfelle av mDC (som uttrykker høyere nivåer av HLA-E), resulterte tilsetning av anti HLA klasse I mAb en økning av cytolytisk aktivitet, noe som indikerer at, gitt et tilstrekkelig nivå av reseptor- ligand- interaksjon, kan NKG2A molekyler uttrykt av gruppe A kloner inhibere lysering. Det er således mulig at i mDC så kan noen grad av heterogenisitet eksistere i uttrykkingen av HLA-E og, muligens, av ligand(er) av NKp30.

Gitt evnen til en fraksjon av NK- celler til å diskriminere mellom celler som uttrykker forskjellige mengder av HLA-E, er det mulig at blant mDC kan kun noen uttrykke en overflatetetthet av HLA-E tilstrekkelig til å bevirke resistens mot denne bestemte undergruppe av NK- celler.

Eksempel 5- Z270 anti NKG2A mAb øker lytisk aktivitet av NK- cellelinjer mot umodne dendritiske celler.

Z270 er et muse IgG1 monoklonalt antistoff mot NKG2A. Aminosyresekvensen av Z270 er gitt SEQ ID NO: .På grunn av at Z270 er et museantistoff binder det ikke til humane Fc- reseptorer og virker således som et aktiverende antistoff ifølge oppfinnelsen i humane cellesystemer eller i et vekstsystem som mangler celler som bærer muse Fc reseptorer. I motsetning, i et system som omfatter celler som bærer en muse Fc reseptor, er Z270 et inhibitorisk antistoff ifølge oppfinnelsen, på grunn av det faktum at dets IgG1 konstante region binder til slike Fc reseptorer.

Humane NK- cellekloner som uttrykker NKG2A og umodne dendritiske celler (plasmacytoide dendritiske celler eller myeloide dendritiske celler) ble generert ved anvendelse av standard metoder. Den lytiske aktivitet av de resulterende humane NK cellekloner BH3, BH18 og BH34 ble testet for autologe umodne dendritiske celler. Lytisk aktivitet av hver av disse kloner mot iDC ble testet parallelt i fravær eller nærvær av monoklonale antistoff til CD94 (IgM) og NKG2A (Z270, IgG1). Til sammenligning, lytisk aktivitet i nærvær av en anti HLA klasse I antistoff og en kontroll IgG1 (anti B4 antistoff) ble også testet.

Som vist i tabell 1 nedenfor, NK- kloner viste liten lysering av iDC i fravær av antistoff eller i nærvær av kontrollantistoff anti 2B4 mAb. Imidlertid, dreping av autologi DC kunne rekonstitueres i nærvær av enten anti CD94, anti NKG2A mAb Z270 eller anti HLA klasse I mAb. Disse resultater demonstrerer at interferens med NKG2A funksjon rekonstituerer NK cellelysering av iDC. De viser også at NKG2A bindingsregion av monoklonalt Z270 er i stand til å blokkere NKG2A ́s inhibitoriske funksjon.

Tabell 1: lysering av autolog iDC

Eksempel 6- Rekonstituering av autologe målcellelyseringer ved anvendelse av anti NKG2A antistoff.

Den cytolytiske aktivitet av humane NK bulk celler mot autologe PHA blast målceller som uttrykker HLA-E i fravær av antistoff eller nærvær av mAb Z199 eller mAb Z270, ble testet. Cytologisk aktivitet ble undersøkt med en standard 4 timers <51>Cr frigivelsesanalyse. Alle målceller ble anvendt ved 3000 celler per brønn i mikrotitreringsplate. Antallet NK- cellene ble variert for å produsere effektor/målforhold på mellom 0,01-100, som angitt i figur 1.

I fravær av antistoff oppvist NK- celler liten, om noen cytolytisk aktivitet mot målceller som uttrykker HLA-E. Imidlertid, i nærvær av anti NKG2A antistoff Z270 (som har en mIgG1 konstant region) eller Z199 (som har en mIgG2b konstant region) ble NK-kloner ikke i stand til å gjenkjenne deres HLA-E ligander, og oppviste sterk cytolytisk aktivitet mot PHA blast mål. Z270 har en murin IgG1 konstant region og Z199 har en murin IgG2b konstant region. Ingen av disse antistoff kan signifikant binde til humane Fc reseptorer.

Tilsvarende, inhibering av NK bulk celledreping av HLA-E positive autologer PHA blast celler kunne effektivt reverseres ved anvendelse av Z270 F(ab ́)2 fragment (Figur 2), en anti KIR mAb DF200 eller pan2D som blokkerer signalering gjennom KIR2DL1 og KIR2DL2,3, eller med antistoff W6/32. Videre, under betingelsene som ble testet (E/T forhold =1, 50 μg/ml mAb) ble PHA- blast celler ikke drept med NK bulk celler, men denne inhibering kunne reverseres ved anvendelse av enten Z270 mAb eller Z270 Fab fragment.

Eksempel 7- Materialer og metoder.

mAb. De følgende mAb, produsert i vårt laboratorium, ble anvendt i dette forsøk: JT3A (IgG2a, anti-CD3), AZ20 og F252 (IgG1 og IgM, respektivt, anti-NKp30), c127 (IgG1, anti-CD16), c218 (IgG1, anti-CD56), EB6b (IgG1, anti-KIR2DL1 and KIR2DS1), GL183 (IgG1, anti-KIR2DL2 KIR2DL3 and KIR2DS2), FES172 (IgG2a, anti-KIR2DS4), Z27 (IgG1, anti-KIR3DL1), XA185 (IgG1, anti-CD94), Z199, Z270 (IgG2b, anti-NKG2A), A6–136 (IgM, anti-HLA klasse I), 131 (IgG1, anti-HLA-A alleler inkluderende A3, A11 og A24) og E59/53 (IgG2a, anti-HLA-A) [Ciccone et al, (1990) PNAS USA 87:9794-9797; Pende et al, (1998) J Immunol.28:2384-2394]. mAb F4/326 (IgG, anti-HLA-C) [Marsh et al, (1990) Tissue Antigens 36: 180-186], 116-5-28 (IgG2a, anti-HLA-Bw4 alleler) og 126–39 (IgG3, anti-HLA-Bw6 alleler) ble gitt av Dr K. Gelsthorpe (Sheffield, GB) (XII International HLA Workshop) og 3D12 (IgG1, anti-HLA-E) [Lee et al. (1998) J. Immunol.160:4951-4960] ble gitt av Dr. Daniel Geraghty (Fred Hutchinson Cancer Research Center, Seattle, WA).

Anti-CD1a (IgG1–PE), anti-CD14 (IgG2a), anti-CD83 (IgG2b) and anti-CD86 (IgG2b–PE) ble innkjøpt fra Immunotech (Marseille, France). D1.12 (IgG2a, anti-HLA-DR) mAb ble tilveiebrakt av Dr R. S. Accolla (Pavia, Italy). HP2.6 (IgG2a, anti-CD4) mAb ble tilveiebrakt av Dr P. Sanchez-Madrid (Madrid, Spain).

Generering av polyklonale og klonale NK celle populasjoner. For å oppnå PBL ble PBMC isolert på Ficoll- Hypaque gradienter og depletert av plastisk adherente celler. Anrikete NK- celler ble isolert ved inkubering av PBL med anti CD3 (JT3A), anti CD4 (HP2.6) og Anti HLA-DR (D1.12) mAb (30 min ved 4 ° C) etterfulgt av geit anti- mus belagte Dynabeads (Dynal, Oslo, Norge) (30 min ved 4 ° C) og immunomagnetisk depletering.

CD3- CD4- HLA- DR- celler ble dyrket på bestrålte materceller i nærvær av 100 U/ml rIL-2 (Proleukin, Chiron Corp., Emeryville, CA) og 1,5 ng/ml PHA (Gibco Ltd, Paisley, GB) for å oppnå polyklonale NK cellepopulasjoner, eller, etter begrenset fortynning, NK cellekloner som tidligere beskrevet.

Generering av DC. PBMC ble avledet fra friske donorer og plastiske adherente celler ble dyrket i nærvær av IL-4 og GMCSF (Peprotech, London, GB) ved en final konsentrasjon på 20 ng/ml og 50 mg/ml, respektivt. Etter 6 dagers dyrkning ble cellene karakterisert med CD14- CD1a+CD83- fenotype korresponderende til iDC. For å generere CD14–CD1a CD83+CD86+ mDC, ble iDC stimulert i to dager med LPS (Sigma-Aldrich, St. Louis, MI) ved en final konsentrasjon på 1 μg/ml.

Flow cytofluorimetriske analyser og cytolytisk aktivitet. For en- eller to farge cytofluorimetriske analyser (FACSCalibur, Becton Dickinson and Co., Mountain View, CA), ble celler farget med egnet mAb etterfulgt av PE- eller FITC- konjugert isotyp- spesifikk geit anti- mus andre reagens(Southern Biotechnology Associated, Birmingham). Polyklonale og klonale NK cellepopulasjoner ble testet for cytolytisk aktivitet i et 4 t [51Cr]- frigivelsesanalyse mot enten autolog eller heterolog DC. Konsentrasjonene av forskjellige mAb tilsatt var 10 μg/ml for maskeringseksperimenter. E:T forholdene er indikert i teksten.

Eksempel 8- Kimerisering av Z270 tung og lettkjede variable regioner.

Frosne cellepellet av musehybridomalinje, Z270, ble tint og prosessert ved anvendelse av RNeasy Midi Kit (Qiagen cat. No.75142) for å isolere 71 μg av total RNA. Ca 5 μg Z270 RNA ble underlagt revers transkripsjon for å produsere Z270 cDNA ved anvendelse av Amersham Biosciens første tråd syntese kit (Amersham Biosciences, Cat. No.27-9261-01). Immunoglobulin tungkjede variabel region (VH) cDNA ble mangfoldiggjort med PCR ved anvendelse av et antall forskjellige IgH primere i kombinasjon med en konstant region primer for å bestemme hvilke primerpar som var mest egnet for PCR. Tilsvarende, immunoglobulin kappa kjede variabel region (VK) ble mangfoldiggjort ved anvendelse av flere IgK primere i kombinasjon med en kappa konstant region primer. Egnete primerer for hver av tung og lettkjede variable regioner ble identifisert og ligert separat inn i .pCR2.1®-TOPO vectors® for transformasjon inn i E. coli TPO10 bakterier, mangfoldiggjøring og sekvensering (ved anvendelse av BigDye® Terminator 3.0 Cycle Sequencing Ready Reaction Kit (ABI). DNA- sekvensen av tungkjede variabel region (Z279 VH) og den korresponderende aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NO 1 og SEQ ID NO 2, respektivt. DNA- sekvensen av lettkjede variabel region (Z270 VK) og den korresponderende aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NO 3 og SEQ ID NO 4, respektivt.

Kimerisering av Z270 VK involverte introdusering via de egnete primere og PCR, et Hind III restriksjons sete, et Kozak translasjons initierings sete og K2A/RFT2 kappa ledersekvens ved 5 ́- enden og en spleisedonorsete og Bam HI restriksjonssete ved 3'- enden av Z270 VK DNA- sekvensen. Det resulterende PCR produkt ble klonet inn i en vektor som koder for konstant region av human kappa lettkjede for å kode for et fullengde kimerisk lettkjede inneholdende den variable region av Z270 lettkjede. DNA- sekvensen av den resulterende chZ270 VK og den korresponderende aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NO 5 og SEQ ID NO 6, respektivt.

Kimerisering av Z270 VH involverte introdusering via de egnete primere og PCR, et Hind III restriksjonssete, et Kozak translasjons initierings sete og A003 ledersekvensen ved 5' enden og 5' enden av gamma 1 C region inkluderende et nøytralt Apa I restriksjons sete ved 3' enden av Z270 VH DNA- sekvensen. Det resulterende PCR- produkt ble klonet inn i en vektor som koder for den konstante region av human IgG1 tungkjede slik at det koder for et fullengde kimerisk IgG1 tungkjede inneholdende den variable region av Z270 tungkjede. DNA- sekvensen av den resulterende chZ270 VH og korresponderende aminosyresekvens er angitt i SEQ ID NO 7 og SEQ ID NO 8, respektivt.

Den resulterende tung og lettkjede inneholdende plasmider ble samtidig elektroporert inn i COS 7 celler som uttrykte det resulterende humane IgG1 kappa kimeriserings konstrukt av Z270.

Eksempel 9- Generering av nye mAb.

mAber ble generert ved immunisering av 5 ukers gamle Balb C mus NK klon SA260 (CD94bright). Etter forskjellige cellefusjoner ble mAber Z199 og Z270 først selektert som beskrevet i(Moretta et al., (1994) J. Exp. Med.180:545. Analyser av hvilende eller aktiverte NK cellepopulasjoner for distribusjon av CD94 molekyler ble utført ved anvendelse av en eller tofarge fluorescens cytofluorimetriske analyser som beskrevet i Moretta et al. (1994).

Positive monoklonale antistoff ble videre screenet for deres evne til å rekonstituere lysering av NK- kloner. Den cytolytiske aktivitet av NK- kloner ble undersøkt med en standard 4 timers <51>Cr frigivelsesanalyse hvor effektor NK- celler ble testet mot P815 musecellelinje eller C1R humancellelinje transfektert eller ikke med forskjellige HLA klasse I gener. Andre målceller anvendt i disse forsøk ble representert av human HLA klasse I LCL 721.221 cellelinje enten utransfektert eller transfektert med forskjellige HLA- klasser, som beskrevet i Sivori et al. (1996) Eur. J. Immunol.26: 2487-2492.

Eksempel 10- Rensing av PBLer, og generering av polyklonale og klonale NK cellelinjer.

PBLEer opptas fra friske donorer med Ficoll Hypaque gradienter og depletering av plastyiske adherente celler. For å oppnå anrikete NK- celler inkuberes PBLer med anti CD3, anti CD4 og anti HLA-DR mAb-er (30 minutter ved 4 ° C), etterfulgt av geit anti- mus magnetiske kuler (Dynal) (30 minutter ved 4 ° C), og immunomagnetisk seleksjon med fremgangsmåter kjent innen fagfeltet (Pende et al., 1999). CD3-, CD4-DR- celler dyrkes på bestrålte mateceller 100 U/ml Interleukin 2 (Proleukin, Chiron Corporation) og 1,5 ng/ml fotohemaglutinin A (Gibco BRL) for å oppnå polyklonale NK cellepopulasjoner. NK- celler klones ved begrenset fortynning, og kloner av NK-celler karakteriseres med flow cytometri for ekspresjon av celleoverflate reseptorer.

Eksempel 11- Farging av helblod fra aper for å identifisere individuell ekspresjon av reseptorer som binder anti NKG2A mAb.

Materialer.

Apeblod: Blod fra rhesus og cynomolgusaper ble innkjøpt ved Centre de Primatologie, ULP, Strasbourg. Apeblod fra bavianer ble innkjøpt ved Centre de Primatologie, CNRS, Station Rousset. Apeblod ble samlet i ”vacutainer” rør inneholdende EDTA eller natriumsitrat. Blod ble prosessert innen 24 timer etter samling, og holdt ved romtemperatur.

Antistoff: FITC-CD3, -CD4, -CD14,-CD20, og CyCr-CD45 er fra BD Pharmingen, PC7- CD16 var tilgjengelig fra Beckman Coulter; alle disse kloner er kryssreagerende med ape PBMCer. PE-GaM (Geit F(ab ́)2 fragment antimus IgG (H+L)- PE), og OptiLyse<® >C ble innkjøpt fra Beckman Coulter. Anti NKG2A mAb (klon Z270, mus IgG1) ble anvendt ved 1 μg/ml.

Andre reagenser: PBS (1X) tilgjengelig fra Gibco Intrivitrogen; museserum fra NMRI mus fra Janvier; Formaldehyd 37 % fra Sigma.

Fremgangsmåter:

Cellefarging ble utført i samsvar med følgende protokoll:

100 μl blod 10 μl 10X renset mAb

Inkuber med agitering 30 min ved RT

Vask med 3 ml PBS (1400 RPM 10 min RT)

Tilsett 100 μl PE-GaM eller PE-GaH, 1: 200 final, vorteks Inkuber med agitering 30 min ved RT

Vask med 3 ml PBS (1400 RPM 10 min RT)

Tilsett 50 μl 20 % museserum, vorteks og inkuber 10 min Tilsett 30 μl til 60 μl av FITC-CD3,(-CD4,-CD14,-CD20), PC7-CD16, CyCr-CD45 blanding eller 10 μl av hver korresponderende isotypiske kontroll

Inkuber med agitering 30 min ved RT

Tilsett 500 μl Optilyse <®>C, vorteks og inkuber 10 min

Tilsett 500 μl PBS, vorteks og inkuber 10 min

Vask med 3 ml PBS (1400 RPM 10 min RT)

Resuspender cellepellet i 300 μl PBS 0,2 % formaldehyd.

Flow cytometri ble utført i samsvar med følgende protokoll:

Prøvene kjøres på en XL/MCL cytometer (Beckman Coulter). Opptak og analyser utføres med EXPO<TM >32 v1.2 programvare (Beckman Coulter).

Analyser fokuseres på lymfocytter identifisert med deres FSC og SSC egenskaper.

Analyser av T- cellene eller NK- celle kompartments:

T celler = CD3<+ >lymfocytter definert som positive celler av anti CD3 fargete histogram gated på Ly.

NK- celler = CD3-CD56<+>. Lymfocytter korresponderende til CD3-CD56<+ >gate i CD3/CD56 dot plot (øvre venstre del av kvadranten).

Resultater.

Binding av NKG2A monoklonalt antistoff Z270 til resusaper, cynomolgus aper og bavianer ble undersøkt. Cynomolgusaper bulk NK- celler (dag 16), 300 uml ble inkubert 30 min ved 4° C med mAb (1 μg/ml), vasket og merket i 20 min ved 4° C med PE-Gam. Fig 1 viser binding til cynomolgus ape NK- celler, og likeledes IgG1 og anti CD16 binding som viser at Z270 binder til cynomolgus ape NK- celler.

Macaca mulatta (rhesus ape) NK- celle (fra helblod) ble inkubert med mAb, vasket og merket med PE-GaM. Resultater, vist i Tabell 2, viser binding av klon Z270 til resusape NK- celler. Til slutt, bavian NK- celler (fra helblod) ble inkubert med mAb, vasket og merket med PE-GaM. Resultater, vist i Tabell 3, viser binding av klon Z270 til bavian NK- celler.

Eksempel 12: Farging av helblod fra aper for å identifisere individuell ekspresjon av reseptorer som binder anti NKG2A mAb.

Materialer.

Apeblod fra rhesus og cynomolgus aper ble samlet i et rør inneholdende EDTA eller natriumsitrat. Antistoff: FITC- CD3, CD4, CD14, CD20 og CyCr- CD45 er fra BD Pharmington, PC7-CD16 var tigjengelig fra Beckman Coulter; alle disse kloner kryssreagerer med ape PBMCer. PE-GaM ( geit F(ab')2 fragment anti mus IgG (H+L)PE), og OptiLyse <® >C ble innkjøpt fra Beckman Coulter. Andre reagenser: PBS (1X) tilgjengelig fra Gibco INvitrogen; Formaldehyd 37 % fra Sigma.

Fremgangsmåter:

Cellefarging ble utført i samsvar med følgende protokoll:

100 μl helblod (EDTA) 11 μl mAb løsning, Z270 eller Z199 (10 μg/ml) eller isotyp kontroll, ble inkubert i 30 min ved RT.

Vask med PBS, tilsett 100 μl PE eller FITC GaM (1/200 final) og la stå i 30 min ved romtemp.

Vask med PBS, tilsett 50 μl museserum 20 %, tilsett 60 μl inneholdende FITC anti CD3, CD4, CD14, CD20, CyCr CD45, PC7-Cd16, og la stå i 30 min ved RT.

Tilsett 500 μl optilyse C, la stå i 10 min ved RT.

Tilsett 500 μl PBS, og la stå i 10 min ved RT.

Vask med PBS og med 0,2 % formaldehyd.

Analysene fokuserer på CD45 klare småceller (CD45/SSC), deretter på CD16+ CD3-CD4- CD14- CD20- celler.

Resultater.

Binding av NKG2A monoklonale antistoff Z270 og Z299 til resusape NK- celler og cynomolgus ape NK- celler ble undersøkt og sammenlignet. Cynomolgus ape bulk NK- celler (dag 16), 300 μl ble inkubert ved 30 min ved 4° C med mAb (1 μg/ml), vasket og merket i 20 min ved 4° C med PE-GaM. Tabell 4 viser binding av både Z199 og Z270 til cynomolgus ape NK- celler, og likeledes IgG1 og anti CD16 binding som viser at både Z199 og Z270 binder til cynomolgus ape NK- celler. Macaca mulatta (rhesus ape) NK- celler (fra helblod) ble inkubert med mAb, vasket og merket med PE-GaM. Resultater, vist i Tabell 5 viser binding av begge kloner Z199 og Z270 til resusape NK- celler.

Det har videre blitt observert (Biassoni et al, (2005) J. Immunol. 174: 5695-5705, se figurer 5 og 6) at Z199 binder cynomolgus ape NKG2C i tillegg til NKG2A, og videre at denne mAb resulterer i økning i lysering av P815 målceller i re-dirigert drepeanalyse. Den siste økning i lysering er det motsatte av det som observeres med humane NK- celler og det motsatte av det som ville forventes for en inhibitor reseptor NKG2A. Således, uten å ønske å være bundet av teori, foreslår foreliggende oppfinnere at Z199 fungerer gjennom den aktiverende reseptor NKG2C i cynomolgus aper. Z270 binder også cynomolgus ape celler og resulterer i en økning i lysering av P815 målceller i en re- rettet drepeanalyse noe som antyder at Z270 også gjenkjenner NKG2C i cynomolgus ape.

Nivå av binding er av de to mAb på samme spesies (cynomolgus for eksempel) imidlertid svært forskjellig både med hensyn til prosentandel celler som farges og intensitet av fluorescens. Dette betyr at de to antistoff binder forskjellig til NKG2A epitoper.

Tabell 2

Tabell 3

Alle publikasjoner og patentsøknader angitt i beskrivelsen inkorporeres heri med henvisning i sine helheter som om hver individuell publikasjon eller patentsøknad spesifikt og individuelt var indikert til å være inkorporert med henvisning.

Selv om foregående oppfinnelse har blitt beskrevet i noe detalj med illustrasjon og eksempel med formål å forstå oppfinnelsen, vil det være åpenbart for en fagkyndig innen feltet at visse forandringer og modifikasjoner kan utføres uten å avvike fra oppfinnelsens ramme som er angitt i de medfølgende krav.

Claims

Patentkrav P A T E N T K R A V

1. Monoklonalt antistoff eller et fragment derav, k a r a k t e r i s e r t v e d: a. spesifikk binding til NKG2A, hvor antistoffet eller fragmentet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549; b. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

2. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte antistoff omfatter en mus eller human IgG1-region som har blitt modifisert for å hindre binding til en Fc-reseptor.

3. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med ethvert av kravene 1-2, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte antistoff omfatter en human IgG4 konstant region.

4. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med krav 3, k a r a k t e r i s e r t v e d a t IgG4 konstant region er modifisert med erstatning av serin ved aminosyreposisjon 228 med prolin.

5. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med krav 1,

k a r a k t e r i s e r t v e d at målcellen er en human celle valgt blant dendrittcelle, en cancercelle, en viralt infisert celle.

6. Monoklonalt antistoff eller fragment derav i samsvar med ethvert av kravene 1-5, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte monoklonalt antistoff eller et fragment derav er et humant, kimerisk eller humanisert monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

7. Sammensetning, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte omfatter:

a. en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav i samsvar med ethvert av kravene 1-6; og

b. en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient.

8. Sammensetning i samsvar med krav 7, for anvendelse som et medikament.

9. Sammensetning i samsvar med krav 7, for anvendelse i behandling av en autoimmun eller inflammatorisk forstyrrelse i en pasient.

10. Sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, k a r a k t e r i s e r t v e d:

a. spesifikk binding til NKG2A, hvor antistoffet eller fragmentet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549;

b. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

d. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle, for anvendelse i behandling av en inflammatorisk eller autoimmun forstyrrelse.

11. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 10, k a r a k t e r i s e r t v e d at den autoimmune forstyrrelse er reumatoid artritt, Crohns sykdom, ulcerøs kolitt eller multiple sklerose.

12. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 10, k a r a k t e r i s e r t v e d at sammensetningen kombineres med et andre terapeutisk middel valgt blant: et immunundertrykkende middel, et kortikosteroid, en TNF-inhibitor, en inhibitor av TGF beta 1, en cytokin inhibitor, en hematopoietisk vekstfaktor, et smertelindrende middel, eller et anti-inflammatorisk middel, hvor nevnte andre terapeutiske middel administreres enten som en separat doseringsform eller som del av nevnte sammensetning.

13. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 10, k a r a k t e r i s e r t v e d at den effektive mengde er mellom 0,5 mg/kg og 20 mg/kg.

14. Sammensetning for anvendelse i samsvar med krav 10, hvor det monoklonale antistoff eller fragment omfatter;

15. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 10-14, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte antistoff eller fragment derav omfatter en human IgG4 konstant region.

16. Sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, k a r a k t e r i s e r t v e d:

b. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

d. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle, for anvendelse til å indusere toleranse til et antigen i en pasient, hvor sammensetningen anvendes i kombinasjon med et antigen.

17. Sammensetning i samsvar med krav 16, for anvendelse i behandling av en autoimmun sykdom eller allergi.

18. Sammensetning omfattende en farmasøytisk akseptabel bærer eller eksipient og en effektiv mengde av et monoklonalt antistoff eller et fragment derav, k a r a k t e r i s e r t v e d:

b. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

c. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor; og

d. idet det er bundet til NKG2A på en human NK-celle, forårsaker at nevnte NK-celle lyserer en human målcelle som bærer HLA-E eller Qa1på målcelleoverflaten, idet nevnte målcelle kommer i kontakt med nevnte NK-celle, for anvendelse i å forbedre innpodning av hematopoietiske celler i en pasient.

19. Sammensetning for anvendelse i samsvar med ethvert av kravene 10-18, k a r a k t e r i s e r t v e d a t nevnte antistoff eller fragment derav er et humant, kimerisk eller humanisert monoklonalt antistoff eller et fragment derav.

20. En in vitro fremgangsmåte for å detektere binding av et antistoff til NKG2A omfattende trinnene:

et antistoff eller et fragment derav karakterisert ved:

i. spesifikk binding til NKG2A, hvor antistoffet eller fragmentet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549;

ii. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

iii. ikke binding, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor;

21. Fremgangsmåte for å produsere et antistoff egnet for anvendelse i sykdomsbehandling i mennesker, hvor fremgangsmåten omfatter:

b. velge et monoklonalt antistoff karakterisert ved;

i. spesifikt binder til NKG2A, hvor antistoffet er karakterisert ved binding til den samme epitop på NKG2A som antistoffet produsert av cellen deponert ved CNCM under katalognummer I-3549;

ii. ikke-spesifikk binding til NKG2C eller NKG2E;

iii. ikke binder, via dets Fc-region, til en Fc-reseptor;

c. gjøre nevnte antistoff egnet for bruk i mennesker;

d. administrere nevnte antistoff til en ikke-human primat; og