WO2007116962A1 - 筋再生促進剤 - Google Patents

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muscle
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receptor
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Norihiro Nishimoto
Yoshinobu Ohira
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Osaka University
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    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies

Definitions

  • the present invention relates to a muscle regeneration promoter containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient, and use thereof.
  • Satellite cells are mobilized during the regeneration process after skeletal muscle injury. Satellite cells are tissue-specific stem cells that normally exist in skeletal muscle in a quiescent state, proliferate and differentiate on skeletal muscle fibers, fuse to muscle fibers, and promote muscle regeneration. However, the factors that promote the proliferation and differentiation of satellite cells in vivo have not been clarified so far.
  • IL-6 is a cytodynamic force called B cell stimulating factor 2 (BSF2) or interferon j3 2.
  • BSF2 B cell stimulating factor 2
  • IL-6 was discovered as a differentiation factor involved in the activation of B lymphocyte cells (Non-Patent Document 1), and it was later revealed that it is a multifunctional site force-in that affects the functions of various cells. (Non-Patent Document 2).
  • IL-6 has been reported to induce maturation of T lymphocyte cells (Non-patent Document 3).
  • IL-6 transmits its biological activity via two proteins on cells.
  • One is IL-6 receptor, a ligand-binding protein with a molecular weight of about 80 kD to which IL-6 binds (Non-patent Documents 4 and 5).
  • IL-6 receptor exists as a soluble IL-6 receptor mainly composed of an extracellular region in addition to a membrane-bound type that penetrates the cell membrane and is expressed on the cell membrane.
  • the other is a membrane protein gpl30 with a molecular weight of about 130 kD involved in non-ligand binding signaling.
  • IL-6 and IL-6 receptor form an IL-6 / IL-6 receptor complex and then bind to gpl30, thereby transmitting the biological activity of IL-6 into the cell (non- Patent Document 6).
  • An IL-6 inhibitor is a substance that inhibits the transmission of IL-6 biological activity. So far, IL Antibody to -6 (anti-IL-6 antibody), antibody to IL-6 receptor (anti-IL-6 receptor antibody), antibody to gpl 30 (anti-gpl30 antibody), IL-6 variant, IL-6 or IL -6 receptor partial peptides and the like are known.
  • Non-Patent Documents 7 and 8 There have been several reports on anti-IL-6 receptor antibodies (Non-Patent Documents 7 and 8, patent documents:! To 3).
  • Non-Patent Document 10 insulin-like growth factor-K Non-Patent Document 10
  • Non-Patent Document 11 anti-myostatin antibody
  • Patent Document 1 International Patent Application Publication Number WO 95-09873
  • Patent Document 2 French Patent Application Publication Number FR 2694767
  • Patent Document 3 US Patent No.US 5216128
  • Patent Document 4 International Patent Application Publication Number WO 92-19759
  • Non-patent literature l Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
  • Non-Patent Document 2 Akira, S. et al., Adv. In Immunology (1993) 54, 1-78
  • Non-Patent Document 3 Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
  • Non-Patent Document 4 Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
  • Non-Patent Document 5 Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
  • Non-Patent Document 6 Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
  • Non-Patent Document 7 Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
  • Non-Patent Document 8 Huang, Y. W. et al "Hybridoma (1993) 12, 621-630
  • Non-Patent Document 9 Hirata, Y. et al "J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
  • Non-Patent Document 10 Barton- Davis, E.R. et al "Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95, 15 603-15607
  • Non-patent literature ll Bogdanovich, S. et al "Nature (2002) 420, 418-421
  • Non-Patent Document 12 Dangott B. et al., Int J. Sports Med. (2000) 21, 13-16
  • Non-Patent Document 13 Darr KC. And Schultz E., J. Appl. Physiol. (1989) 67, 1827-1834
  • Non-Patent Document 14 Garry DJ. Et al., PNAS (2000) 97, 5416-5421
  • Non-Patent Document 15 Garry DJ. Et al., Dev. Biol. (1997) 188, 280-294
  • Non-Patent Document 16 Jejurikar SS. Et al, Plast Reconstr Surg (2002) 110, 160-168
  • Non-Patent Document 17 Mauro A "J. Biochem Cytol. (1961) 9, 493-498
  • Non-patent literature 18 McCormick KM and Schultz E., Dev. Dyn. (1994) 199, 52-63
  • Non-patent literature 19 Moss FP. And Leblond CP "Anat. Rec. (1971) 170, 421-435
  • Non-patent Reference 20 Mozdziak PE. Et al., Biotech. Histochem. (1994) 69, 249-252
  • Non-patent reference 21 Mozdziak PE. Et al., J. Appl. Physiol. (2000) 88, 158-164
  • Non-patent Reference 22 Mozdziak PE. Et al., J. Appl. Physiol. (2001) 91, 183-190
  • Non-patent reference 23 Mozdziak PE. Et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. 7
  • Non-Patent Document 24 Schultz ⁇ ⁇ , Dev. Biol. (1996) 175, 84-94
  • Non-Patent Document 25 Schultz E. et al., J. Appl. Physiol. (1994) 76, 266-270
  • Non-Patent Document 26 Schultz E. et al., Muscle Nerve. (1985) 8, 217-222
  • Non-Patent Document 27 Snow ⁇ ⁇ , Anat. Rec. (1977) 188, 181-199
  • Non-Patent Document 28 Snow ⁇ ⁇ , Anat. Rec. (1990) 227, 437-446
  • Non-Patent Document 29 Wang XD., Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2006) 290, C981- C989 Disclosure of the Invention
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object thereof is to provide a muscle regeneration promoter containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for promoting muscle regeneration in a subject, comprising the step of administering an IL-6 inhibitor to the subject undergoing muscle atrophy.
  • C2C12 cells are cultured in a differentiation medium containing various concentrations of MR16-1 (anti-mouse IL-6 receptor monoclonal antibody), and proteins involved in muscle regeneration: MyoD, myogenin, myogenin regulator protein, And myosin heavy chain was detected immunohistochemically. Furthermore, the expression of muscle differentiation markers M-cadherin, fluorophore-p38 and MyoD was confirmed by Western blot analysis.
  • MR16-1 anti-mouse IL-6 receptor monoclonal antibody
  • C2C12 cells were suppressed by the addition of MR16-1.
  • the percentage distribution of C2C 12 cells expressing MyoD, myogenin, myogenin regulator protein, and myosin heavy chain increased. It became.
  • the expression levels of M-cadherin and fluorophore-p38, as well as MyoD increased in cells treated with MR16-1.
  • MR16-1 treatment did not have a specific effect on fiber atrophy and decrease in the number of satellite cells under no load.
  • the number of satellite cells that proliferated and activated in response to reloading increased with MR16-1 treatment. Since satellite cells play an important role in regulating muscle fiber mass, it was suggested that inhibiting IL-6 could be a way to promote muscle regeneration.
  • the present inventors promote the adhesion / proliferation / differentiation of satellite cells and, as a result, promote muscle regeneration or muscle fiber hypertrophy by administering an IL-6 inhibitor. As a result, the present invention has been completed.
  • the present invention provides the following [1] to [23].
  • a muscle regeneration promoter containing an IL_6 inhibitor as an active ingredient [1] A muscle regeneration promoter containing an IL_6 inhibitor as an active ingredient.
  • a method of promoting muscle regeneration in a subject comprising a step of administering an IL-6 inhibitor to the subject.
  • Fig. 1 is a photograph showing the results of confirming protein expression in C2C12 cells by Western blotting. We examined the effect of MR16-1 addition on the growth of C2C12 cells cultured for 3 days in differentiation medium containing 2% horse serum.
  • FIG. 2A is a graph showing the effect of MR16-1 addition on the characteristics of satellite cells in all single muscle fibers of soleus muscle of male mice (C57BL / 6J Jcl), whether loading or unloading.
  • FIG. 2A shows the number of all BrdU positive (mitotically activated) satellite cells in the muscle fibers up to the tendon in each group.
  • each symbol indicates a group of the following states. Pre: group before hind limb suspension, C: age-matched control group, CMR: age-matched control group treated with MR16-1, S: hind-limb suspension group, SMR: hind-limb suspended group treated with MR16-1.
  • the four groups indicated by R + 0 indicate groups that have been unloaded for 7 days or just after caged cages, and the four groups indicated by R + 7 are those that are reloaded. The group after day is shown.
  • the data are average soil SEM. * and ⁇ P ⁇ 0.05, comparison with S and SMR at Pre and C, and R + 0.
  • FIG. 2B is a diagram showing the number of all M-cadherin positive (resting) satellite cells in muscle fibers from tendons to tendons in each group.
  • FIG. 2C is a graph showing the total number of satellite cells in muscle fibers up to the tendon in each group.
  • FIG. 2D is a diagram showing values (%) of BniU positive (mitotically activated) satellite cells and Z satellite cells.
  • the present inventors have found that muscle regeneration can be promoted by administering an anti-IL-6 receptor antibody.
  • the present invention is based on these findings.
  • the present invention relates to a muscle regeneration promoter containing an IL-6 inhibitor as an active ingredient.
  • the “IL_6 inhibitor” is a substance that blocks IL-6 signaling and inhibits IL-6 biological activity.
  • the IL-6 inhibitor is preferably a substance having an inhibitory action on binding of any of IL_6, IL-6 receptor and gpl30.
  • Examples of the IL-6 inhibitor of the present invention include an anti-IL-6 antibody, an anti-IL-6 receptor antibody, an anti-gpl30 antibody, an IL-6 variant, a soluble IL-6 receptor variant or an IL. -6 or IL-6 receptor partial peptides and low molecular weight substances exhibiting the same activity as these, but are not particularly limited.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention is preferably an antibody that recognizes IL-6 receptor.
  • the origin of the antibody in the present invention is not particularly limited, but it is preferably derived from a mammal, more preferably a human-derived antibody.
  • the anti-IL-6 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to IL-6, thereby inhibiting the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the intracellular transmission of IL-6 biological activity.
  • Such antibodies include MH166 (Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956) and SK2 antibody (Sato, K. et al., 21st Japan Immunization). Examples include general meetings of academic societies and academic records (1991) 21, 166).
  • the anti-IL-6 antibody-producing hyperpridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, using IL-6 as a sensitizing antigen and immunizing it according to the usual immunization method, the obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and by the usual screening method, It can be produced by screening monoclonal antibody-producing cells.
  • the anti-IL-6 antibody can be prepared as follows.
  • HI-6 used as a sensitizing antigen for antibody acquisition is Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Im munol. (1988) 140, 1534-1541, or Agr. Biol Chem. (1990) 54, 2685-2688 Obtained by using the indicated IL-6 gene / amino acid sequence.
  • the target IL-6 protein is known from the host cell or culture supernatant.
  • the purified IL-6 protein can be used as a sensitizing antigen.
  • a fusion protein of IL-6 protein and another protein may be used as a sensitizing antigen.
  • the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Monoclonal antibodies derived from mammals include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to the IL-6 receptor, thereby blocking the binding of IL-6 to the IL-6 receptor and blocking the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • Examples of such antibodies include MR16-1 antibody (Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), PM-1 antibody (Hirata, Y et al., J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906), AUK12-20 antibody, AUK64-7 antibody or AUK146-15 antibody (International Patent Application Publication No. WO 92-19759) .
  • PM-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against HL-6 receptor
  • MR16-1 antibody is exemplified as a preferred monoclonal antibody against mouse IL-6 receptor. .
  • the anti-IL-6 receptor monoclonal antibody-producing hyperidoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, IL-6 receptor is used as a sensitizing antigen and immunized according to a normal immunization method, and the resulting immune cells are fused with a known parent cell by a normal cell fusion method. Thus, a monoclonal antibody-producing cell can be screened.
  • an anti-IL-6 receptor antibody can be prepared as follows.
  • the human HL-6 receptor used as a sensitizing antigen for obtaining an antibody is disclosed in European Patent Application Publication No. EP 3 25474, and the mouse IL-6 receptor is disclosed in Japanese Patent Application Publication No. JP-A 3-155795. Obtained by using the prepared IL-6 receptor gene / amino acid sequence.
  • IL-6 receptor protein is expressed on the cell membrane and separated from the cell membrane (Soluble IL-6 receptor) (Yasukawa, K. et al "J. Biochem. (1990) 108, 673-676). Soluble IL-6 receptor binds to the cell membrane. -6 receptor is substantially composed of extracellular force, and differs from membrane-bound IL-6 receptor in that the transmembrane region or the transmembrane region and the intracellular region are deficient. As the IL-6 receptor protein, any IL-6 receptor may be used as long as it can be used as a sensitizing antigen for producing the anti-IL-6 receptor antibody used in the present invention.
  • the target IL-6 receptor protein After inserting the IL-6 receptor gene sequence into a known expression vector system and transforming an appropriate host cell, the target IL-6 receptor protein is transferred from the host cell or culture supernatant. Purified by a known method, and this purified IL-6 receptor protein can be used as a sensitizing antigen. In addition, cells expressing IL-6 receptor or fusion proteins of IL-6 receptor protein and other proteins may be used as sensitizing antigens.
  • the anti-gpl30 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • a monoclonal antibody derived from a mammal is particularly preferable.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hyperpridoma and those produced by a host transformed with an expression vector containing an antibody gene by genetic engineering techniques. This antibody binds to gpl30, thereby inhibiting the binding of IL-6 / IL-6 receptor complex to gpl30 and blocking the transmission of IL-6 biological activity into the cell.
  • Examples of such antibodies include AM64 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 3-219894), 4B11 antibody and 2H4 antibody (US 5571513) B-S12 antibody and B-P8 antibody (Japanese Patent Laid-Open No. 8-291199).
  • An anti-gpl30 monoclonal antibody-producing hybridoma can be basically produced using a known technique as follows. That is, gpl30 is used as a sensitizing antigen and immunized according to the usual immunization method. The obtained immune cells are fused with known parental cells by the usual cell fusion method, and then monoclonal by the usual screening method. It can be produced by screening antibody-producing cells.
  • gpl30 used as a sensitizing antigen for obtaining antibodies can be obtained by using the gpl30 gene / amino acid sequence disclosed in European Patent Application Publication No. EP 411946.
  • the target gpl30 protein is obtained from the host cell or culture supernatant by a known method.
  • the purified gpl30 protein may be purified and used as a sensitizing antigen.
  • cells expressing gpl30 or a fusion protein of gpl30 protein and other proteins may be used as the sensitizing antigen.
  • a mammal to be immunized with a sensitizing antigen it is not particularly limited, but it is generally preferable to select in consideration of compatibility with a parent cell used for cell fusion.
  • Rodent animals such as mice, rats, hamsters and the like are used.
  • Immunization of animals with a sensitizing antigen is performed according to a known method.
  • a sensitizing antigen is injected intraperitoneally or subcutaneously into a mammal.
  • the sensitized antigen is diluted to an appropriate amount with PBS (Phosphate-Buffered Saline), physiological saline, etc., and suspended, and then mixed with an appropriate amount of a normal adjuvant, for example, Freund's complete adjuvant, if necessary. It is preferable to administer to mammals several times every 4-21 days.
  • an appropriate carrier can be used during immunization with the sensitizing antigen.
  • immune cells are removed from the mammal and subjected to cell fusion.
  • Preferred immune cells that are subjected to cell fusion include spleen cells.
  • Mammalian myeloma cells as other parental cells to be fused with the immune cells have already been known in various cell lines such as P3X63Ag8.653 (Kearney, JF et al. J. Imm unol. 1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (19 76) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M.
  • the cell fusion of the immune cells and myeloma cells is basically performed by a known method, for example, the method of Minorestein et al. (Kohler. G. and Milstein, C “Methods Enzymol. (1981) 73, 3_ 46) etc.
  • the cell fusion is performed, for example, in a normal culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ), or the like is used as the fusion promoter, and an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added and used to enhance the fusion efficiency as desired.
  • the usage ratio of immune cells to myeloma cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture medium used for the cell fusion for example, RPMI1640 culture medium suitable for the growth of the myeloma cell line, MEM culture medium, and other normal culture liquids used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • a predetermined amount of the immune cells and myeloma cells are mixed well in the culture solution and pre-warmed to about 37 ° C, for example, an average molecular weight of about 1000 to 6000.
  • PEG solution is usually added at a concentration of 30-60% (w / v) and mixed to form the desired fused cell (hypridoma).
  • cell fusion agents and the like unfavorable for the growth of hypridoma can be removed by repeating the operation of adding an appropriate culture solution successively, centrifuging and removing the supernatant.
  • the hyperidoma is selected by culturing in a normal selective culture solution, for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT medium is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the desired hyperpridoma to die. The usual limiting dilution method is then performed to screen and clone the hyperidoma that produces the desired antibody.
  • a normal selective culture solution for example, a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). Culturing with the HAT medium is continued for a period of time, usually several days to several weeks, sufficient for the cells (non-fusion cells) other than the desired hyperpridoma to die.
  • the usual limiting dilution method is then performed to screen and clone the hyperidoma that produces the desired antibody.
  • human lymphocytes are sensitized with a desired antigen protein or antigen-expressing cells in vitro, and sensitized B lymphocytes are human myeloma. It is also possible to obtain a desired human antibody having a binding activity to a desired antigen or antigen-expressing cell by fusing with a cell such as U266 (see Japanese Patent Publication No. 59878). Furthermore, a desired human antibody may be obtained by administering an antigen or an antigen-expressing cell to a transgenic animal having a repertoire of human antibody genes and according to the method described above (International Patent Application Publication No. WO). 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735).
  • the thus-prepared hyperpridoma producing monoclonal antibodies can be subcultured in a normal culture solution, and can be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • an anti-IL-6 receptor antibody-producing hybridoma can be performed by the method disclosed in JP-A-3-139293.
  • PM-1 antibody-producing hybridoma is injected into the abdominal cavity of BALB mice to obtain ascites, and PM-1 antibody is purified from this ascites, or this hybridoma is treated with an appropriate medium such as 10% urine fetal serum.
  • an appropriate medium such as 10% urine fetal serum.
  • an antibody gene is cloned from a hybridoma, incorporated into an appropriate vector, introduced into a host, and produced using a gene recombination technique.
  • a gene recombination technique See, for example, Borrebaeck CAK and Larrick JW THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990).
  • mRNA encoding the variable (V) region of an antibody is isolated from cells producing the antibody of interest, such as Hypridoma. Isolation of mRNA is performed by a known method such as guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, JM et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC method (Chomczynski, P. et al, Anal. Biochem. 1987) 162, 156-159) etc. to prepare total RNA, and mRNA is prepared using mRNA Purification Kit (Pharmacia). In addition, mRNA can be directly recovered using the QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia). Power to prepare S
  • cDNA of the antibody V region is synthesized from the obtained mRNA using reverse transcriptase.
  • cDNA synthesis f AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit, etc. can be used.
  • 5 Ampli FINDER RACE Kit (Clontech) and PCR are used.
  • 5'-RACE method used (Frohman, MA et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.
  • the desired DNA fragment is purified from the obtained PCR product and ligated with vector DNA, and a recombinant vector is prepared from this and introduced into E. coli. Select the colony to prepare the desired recombinant vector
  • the base sequence of the target DNA is confirmed by a known method such as the deoxy method.
  • DNA encoding the V region of the target antibody is obtained, it is ligated with DNA encoding the desired antibody constant region (C region) and incorporated into an expression vector.
  • DNA encoding the V region of the antibody may be incorporated into an expression vector containing DNA of the antibody C region.
  • the antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region, for example, an enhancer or promoter, as described below.
  • an expression control region for example, an enhancer or promoter, as described below.
  • the host cell can be transformed with this expression vector to express the antibody.
  • artificially modified recombinant antibodies such as chimeric antibodies, humanized antibodies, human antibodies, for the purpose of reducing the heterologous antigenicity to humans, etc.
  • modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody can be obtained by ligating the DNA encoding the antibody V region obtained as described above with the DNA encoding the human antibody C region, incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (See European Patent Application Publication No. EP 125023, International Patent Application Publication No. W ⁇ 92-19759). Using this known method, a chimeric antibody useful in the present invention can be obtained.
  • Human ⁇ antibody is also referred to as a reshaped human antibody or humanized antibody.
  • the complementarity determining region (CDR) of a mammal such as a mouse antibody is transplanted to the complementarity determining region of a human antibody, and its general gene recombination technique is also known (European Patent Application Publication No. EP 125023, see International Patent Application Publication Number WO 92-19759).
  • the number of DNA sequences designed to link mouse antibody CDRs and human antibody framework regions (FRs) with a portion that overlaps the terminal region is synthesized by PCR from individual oligonucleotides.
  • the obtained DNA is obtained by ligating with the DNA encoding the human antibody C region, then incorporating it into an expression vector, introducing it into a host and producing it (European Patent Application Publication Number EP 239400, International Patent Application Publication Number). See WO 92-19759).
  • the FR of the human antibody to be linked via CDR is selected such that the complementarity determining region forms a favorable antigen binding site. If necessary, the amino acid in the framework region of the variable region of the antibody may be substituted so that the complementarity-determining region of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
  • the human antibody C region is used for the chimeric antibody and the humanized antibody.
  • Examples of the human antibody C region include C ⁇ , and for example, C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, or C ⁇ 4 can be used.
  • the human antibody C region may be modified in order to improve the stability of the antibody or its production.
  • a chimeric antibody is composed of a variable region of a non-human mammal-derived antibody and a C region derived from a human antibody
  • a humanized antibody is a complementarity determining region of a non-human mammal-derived antibody and a frame derived from a human antibody. It consists of a work region and a C region, both of which are useful as antibodies used in the present invention because of their reduced antigenicity in the human body.
  • a preferred specific example of the humanized antibody used in the present invention is a humanized PM-1 antibody (see International Patent Application Publication No. WO 92-19759).
  • a technique for obtaining human antibodies by panning using a human antibody library is also known.
  • a variable region of a human antibody can be expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method, and a phage that binds to the antigen can be selected.
  • scFv single chain antibody
  • Appropriate expression vectors can be prepared to obtain human antibodies.
  • the antibody gene constructed as described above can be expressed by a known method. When mammalian cells are used, they can be expressed by commonly used useful promoters, expressed antibody genes, DNA 3 functionally linked to the 3 'downstream, or vectors containing them. it can. For example, as a promoter / enhancer, it is possible to enumerate the human cytomegalovirus lmmediate early promoter / enhancer;
  • promoter Z enhancers that can be used for expression of antibodies used in the present invention
  • virus promoters such as retrovirus, poliovirus, adenovirus, simian virus 40 (SV40), etc.
  • a promoter / enhancer derived from mammalian cells such as Factor 1 (HEF1 ⁇ ) may be used.
  • a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed can be functionally linked for expression.
  • examples of the promoter include lacZ promoter and ara B promoter.
  • the lacZ plug motor the method of Ward et al. (Ward, ES et al., Nature (1989) 341, 5 44-546; Ward, ES et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)
  • the araB promoter the method of Better et al. (Better, S. et al. Science (1988) 240, 1041-1043) may be followed.
  • a pelB signal sequence (Lei, SP et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. After separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is appropriately refolded and used (see, for example, WO96 / 30394).
  • the origin of replication can be derived from SV40, poliovirus, adenovirus, ushipapilloma winoles (BPV), etc., and the expression vector is selected for gene copy number amplification in the host cell system.
  • Markers can include aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, thymidine kinase (TK) gene, E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, dihydrofolate reductase (dhfr) gene and the like.
  • APH aminoglycoside phosphotransferase
  • TK thymidine kinase
  • Ecogpt E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase
  • dhfr dihydrofolate reductase
  • any production system can be used.
  • Production systems for antibody production include in vitro and in vivo production systems.
  • in vitro production systems include production systems that use eukaryotic cells and production systems that use prokaryotic cells.
  • eukaryotic cells When eukaryotic cells are used, there are production systems that use animal cells, plant cells, or fungal cells.
  • Animal cells include: (1) mammalian cells such as CHO, COS, myeloma, BHK (ba by hamster kidney), HeLa, Vero, etc., (2) amphibian cells such as Xenopus oocytes, or (3) Insect cells such as sf9, sf21, and Tn5 are known.
  • plant cells cells derived from Nicotiana tabacum are known, and these may be cultured in callus.
  • fungal cells examples include yeasts such as the genus Saccharomyces, such as Saccharomyces cerevisiae, and filamentous fungi such as the genus Aspergillus, such as Aspergillus niger. ing.
  • prokaryotic cells When prokaryotic cells are used, there are production systems using bacterial cells.
  • Known bacterial cells include E. coli and Bacillus subtilis.
  • An antibody can be obtained by introducing a desired antibody gene into these cells by transformation, and culturing the transformed cells in vitro. Culture is performed according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination. Alternatively, antibodies may be produced in vivo by transferring cells into which the antibody gene has been introduced to the abdominal cavity of animals.
  • examples of in vivo production systems include production systems using animals and production systems using plants.
  • animals When animals are used, there are production systems using mammals and insects.
  • mammals As mammals, goats, pigs, hidges, mice, mice, etc. can be used (Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993).
  • silkworms can be used as insects.
  • tobacco When using a plant, for example, tobacco can be used.
  • An antibody gene is introduced into these animals or plants, and the antibodies are produced and collected in the animals or plants.
  • an antibody gene is inserted in the middle of a gene encoding a protein inherently produced in milk such as goat casein to prepare a fusion gene.
  • a DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene is inserted is injected into a goat embryo, and the embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody is obtained from the milk produced by the transgenic goat born from the goat that received the embryo or its progeny.
  • hormones may be used as appropriate in the transgenic goat.
  • a silkworm is infected with a baculovirus inserted with the target antibody gene, and a desired antibody is obtained from the body fluid of the silkworm (Maeda, S. et al., Nature (1985) 315 , 592-594).
  • the desired antibody gene is inserted into a plant expression vector such as pMON530, and this vector is introduced into a bacterium such as Agrobacterium tumefaciens.
  • This bacterium is infected with tobacco, for example Nicotiana tabacum, and the desired antibody is obtained from the leaves of this tobacco (Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138) .
  • DNAs encoding the antibody heavy chain (H chain) or light chain (L chain) are separately incorporated into an expression vector and the host is simultaneously used.
  • the host may be transformed by incorporating DNAs encoding H and L chains into a single expression vector (see International Patent Application Publication No. WO94-11523).
  • the antibody used in the present invention may be an antibody fragment or a modified product thereof as long as it can be suitably used in the present invention.
  • antibody fragments include Fab, F (ab ′) 2, Fv, or single chain Fv (scFv) in which H chain and L chain Fv are linked by an appropriate linker.
  • the antibody is treated with an enzyme such as papain or pepsin to generate antibody fragments, or a gene encoding these antibody fragments is constructed and used as an expression vector. After introduction, expression in a suitable host cell (eg, Co, MS et al., J. Immunol. (19 94) 152, 2968-2976, Better, M.
  • a suitable host cell eg, Co, MS et al., J. Immunol. (19 94) 152, 2968-2976, Better, M.
  • scFv is obtained by linking the H chain V region and L chain V region of an antibody.
  • the H chain V region and the L chain V region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Pro Natl. Acad. Sci. USA (1988). 85, 5879—5883).
  • the H chain V region and L chain V region in scFv may be derived from any of those described as the above antibody.
  • the peptide linker that links the V regions for example, any single chain peptide consisting of amino acid residues 12-19 is used.
  • the scFv-encoding DNA is a DNA that encodes the H chain or H chain V region of the antibody, and a DNA that encodes the L chain or L chain V region.
  • a portion of the DNA encoding the amino acid sequence was amplified by PCR using a primer pair defining both ends, and then the DNA encoding a portion of the peptide linker and both ends thereof were combined with the H chain and L chain, respectively. Obtained by combining and amplifying primer pairs that are defined to be ligated.
  • an expression vector containing them and a host transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Can be used to obtain scFv according to conventional methods.
  • antibody fragments can be produced by the host by obtaining and expressing the gene in the same manner as described above.
  • the term “antibody” as used in the present invention encompasses these antibody fragments.
  • an antibody conjugated with various molecules such as polyethylene glycol (PEG) can also be used.
  • PEG polyethylene glycol
  • the “antibody” referred to in the present invention includes these modified antibodies. In order to obtain such a modified antibody, it can be obtained by chemically modifying the obtained antibody. These methods are already established in this field.
  • the antibody produced and expressed as described above is isolated from the inside and outside of the cell and from the host and purified to homogeneity.
  • Separation and purification of the antibody used in the present invention can be performed by affinity chromatography.
  • the column used for affinity chromatography include a protein A column and a protein G column.
  • the carrier used for the protein A column include HyperD, POROS, S-mark harose F.F.
  • the separation and purification methods used for ordinary proteins are not limited in any way.
  • the antibody used in the present invention can be separated and purified.
  • chromatography include ion exchange chromatography, hydrophobic chromatography, gel filtration, and the like. These chromatograms can be applied to HPL (High Performance Liquid Chromatography). Alternatively, you can use reverse phase HPLC.
  • the concentration of the antibody obtained above can be measured by measuring absorbance or ELISA.
  • absorbance when measuring absorbance, after appropriately diluting with PBS (-), measure absorbance at 280 nm and calculate lmg / ml as 1.350D.
  • ELISA it can be measured as follows. That is, 100 ⁇ l of goat anti-human IgG (TAG) diluted to 0.1 Ag / ml with 0.1 M bicarbonate buffer (pH 9.6) was placed in a 96-well plate (Nunc) and placed at 4 ° C. Incubate and immobilize the antibody. After blocking, 100 ⁇ l of HHG (manufactured by CAPPEL) as an appropriately diluted antibody to be used in the present invention or a sample containing the antibody or a sample is added and incubated at room temperature for 1 hour.
  • TAG goat anti-human IgG
  • HHG manufactured by CAPPEL
  • the IL-6 variant used in the present invention is a substance that has a binding activity to the IL-6 receptor and does not transmit the biological activity of IL-6. That is, the IL-6 variant binds to the IL-6 receptor competitively with UL-6, but does not transmit the biological activity of IL-6 and therefore blocks signal transmission by IL-6.
  • IL-6 variants are produced by introducing mutations by substituting amino acid residues in the amino acid sequence of IL-6.
  • the origin of IL-6, which is a variant of IL-6 is not limited, but human IL-6 is preferable in consideration of antigenicity.
  • the secondary structure of the amino acid sequence of IL-6 can be determined using a known molecular modeling program such as W HATIF (Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56). This is done by predicting and evaluating the effect on the total number of amino acid residues to be substituted. After determining the appropriate replacement amino acid residue, by introducing a mutation that replaces the amino acid by the usual PCR method, using a vector containing the base sequence encoding the HL-6 gene as a saddle type, A gene encoding the IL-6 variant is obtained. This can be incorporated into an appropriate expression vector as necessary, and an IL-6 variant can be obtained according to the expression, production and purification methods of the recombinant antibody.
  • W HATIF Wide et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56.
  • IL-6 variants include Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93.
  • the IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide used in the present invention has a binding activity to IL-6 receptor or IL-6, respectively, and transmits the biological activity of IL-6.
  • Shina is a substance. That is, IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide binds to IL-6 receptor or IL-6, and captures these to specifically bind IL-6 to IL-6 receptor. Obstruct it. As a result, IL-6 does not transmit the biological activity of IL-6, thus blocking IL-6 signaling.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide is a part or all of the region related to the binding between IL-6 and IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor.
  • Such peptides usually consist of 10 to 80, preferably 20 to 50, more preferably 20 to 40 amino acid residues.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide specifies the region involved in the binding of IL-6 to IL-6 receptor in the amino acid sequence of IL-6 or IL-6 receptor
  • it can be prepared by a generally known method such as a genetic engineering technique or a peptide synthesis method based on the amino acid sequence of a part or all of the specified region.
  • a DNA sequence encoding the desired peptide is incorporated into an expression vector, and expression, production and purification of the recombinant antibody are performed. It can be obtained according to the method.
  • IL-6 partial peptide or IL-6 receptor partial peptide by peptide synthesis, methods commonly used in peptide synthesis, such as solid phase synthesis or liquid phase synthesis, can be used.
  • a deprotection reaction and a cleavage reaction from the peptide chain support are performed.
  • hydrogen fluoride or trifluoromethanesulfonic acid can usually be used for the Boc method
  • TFA can be used for the Fmoc method.
  • Boc method for example, the protected peptide resin is treated in the presence of anisole in hydrogen fluoride.
  • the peptide is recovered by removing the protecting group and cleaving from the support. This is freeze-dried to obtain a crude peptide.
  • the deprotection reaction and the cleavage reaction from the peptide chain support can be performed in TFA by the same operation as described above.
  • the obtained crude peptide can be separated and purified by application to HPLC.
  • a water-acetonitrile solvent usually used for protein purification may be used under optimum conditions.
  • the fraction corresponding to the peak of the obtained chromatographic profile is collected and lyophilized.
  • the peptide fraction thus purified is identified by molecular weight analysis by mass spectrum analysis, amino acid composition analysis, amino acid sequence analysis, or the like. Specific examples of the IL-6 partial peptide and IL-6 receptor partial peptide are disclosed in JP-A-2-188600, JP-A-7-324097, JP-A-8-311098 and US Pat.
  • the antibody used in the present invention may be a conjugated antibody bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG), radioactive substance, and toxin.
  • PEG polyethylene glycol
  • Such a conjugated antibody can be obtained by chemically modifying the obtained antibody.
  • Antibody modification methods have already been established in this field.
  • the “antibody” in the present invention includes these conjugated antibodies.
  • the IL-6 inhibitor of the present invention can be used for promoting muscle regeneration.
  • muscle regeneration means that a damaged muscle or a contracted muscle is restored to its original state.
  • muscle fiber volume, number of muscle fibers, or muscle tissue properties development tension 'endurance' metabolic properties 'stretch' flexibility
  • ⁇ muscle atrophy '' refers to muscle atrophy that occurs in the absence of gravity stimulation, disuse muscular atrophy (muscle atrophy due to the absence of muscle use), and muscular atrophy associated with chronic inflammatory diseases such as rheumatoid arthritis.
  • a preferred example is muscle atrophy in congenital muscular diseases, but is not limited thereto.
  • the “muscle / muscle tissue” may be any of skeletal muscle cells, cardiomyocytes, smooth muscle cells, and myoepithelial cells that are not particularly limited in kind.
  • Satellite cells in adult muscle tissue are usually thought to be either quiescent or slowly dividing. When muscles such as skeletal muscles are damaged, they are activated and start to proliferate. After proliferation, satellite cells that have passed through the basement membrane differentiate into progenitor cells called myoblasts, and migrate to the damaged site while actively repeating division and proliferation. Myoblasts are oriented along the basement membrane around the damaged myofiber, and eventually invade the basement membrane and fuse with each other or with the remaining muscle fibers to connect myotube cells (myotubes). Form. Myotubes undergo further structural maturation and become adult muscle tissue.
  • muscle regeneration may mean that adult muscle tissue is generated by the above process.
  • muscle regeneration is promoted means that the progress of the muscle regeneration is accelerated.
  • activation of satellite cells involved in muscle regeneration is promoted, it can be regarded as equivalent to the promotion of muscle regeneration.
  • Promoter activation of satellite cells means promoting mobilization, proliferation, or differentiation of satellite cells.
  • whether or not muscle regeneration is promoted can be confirmed by measuring the volume or number of muscle fibers.
  • the increase in the volume or number of muscle fibers is promoted by administering the agent of the present invention, it can be considered that muscle regeneration is promoted.
  • the measurement of the volume or number of muscle fibers can be performed by a known method, and can also be performed by the method described in the examples.
  • Whether or not muscle regeneration has been promoted can also be confirmed by measuring the amount of satellite cells activated (ratio of satellite cells activated in muscle tissue).
  • ratio of satellite cells activated in muscle tissue When the amount of satellite cells activated by administration of the agent of the present invention is increased (when the proportion of satellite cells activated in muscle tissue is increased), it can be considered that muscle regeneration is promoted. I can do it. Measurement of the amount of satellite cells activated can be performed by a known method, and can also be performed by the method described in the examples.
  • the IL-6 signal transduction inhibitory activity of the IL-6 inhibitor used in the present invention can be evaluated by a commonly used method. Specifically, an IL-6-dependent human myeloma line (S6B45, KPM M2), a human Rennelt T lymphoma cell line KT3, or an IL-6-dependent cell MH60.BSF2 is cultured, and IL-6 is added thereto. The 3H-thymidine uptake of IL-6-dependent cells can be measured by simultaneously coexisting an IL-6 inhibitor.
  • U266 an IL-6 receptor-expressing cell, is cultured, 1251 labeled IL-6 is added, and at the same time, an IL-6 inhibitor is added, thereby binding 1251 labeled IL- Measure 6.
  • a negative control group that does not contain an IL-6 inhibitor was established, and the results obtained from both were compared. Inhibitory activity can be evaluated.
  • the subject to which the muscle regeneration promoter of the present invention is administered is a mammal. Mammals are preferred Or human.
  • the muscle regeneration-promoting agent of the present invention can be administered in the form of a pharmaceutical, and can be administered systemically or locally orally or parenterally.
  • intravenous injection such as infusion, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, suppository, enema, oral enteric solvent, etc. can be selected, and the administration method should be selected appropriately depending on the age and symptoms of the patient.
  • Effective doses are selected in the range of O.Olmg to lOOmg per kg body weight.
  • a dose of 1-1000 mg, preferably 5-50 mg per patient can be selected.
  • an effective dose is an amount that is sufficient for the presence of a free antibody in the blood.
  • Per month (4 weeks) 0.5mg to 40mg, preferably lmg to 20mg divided into several times, eg 2 times / week, 1 time / week, 1 time Z2 week, 1 time Z4 week
  • Intravenous injection such as intravenous drip, subcutaneous injection, etc., etc. in the administration schedule such as.
  • Dosing schedule is 2 times / week or 1 time / week to 1 time / 2 weeks, 1 time / 3 weeks, 1 time / 4 weeks, etc. It is also possible to adjust the dose by extending the dosing interval.
  • the muscular regeneration promoter may be added with a pharmaceutically acceptable carrier such as a preservative and a stabilizer.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may itself be a material having the above-described muscle regeneration-promoting effect, or may be a material that does not have the muscle regeneration-promoting effect and can be administered together with the above-mentioned drug. Material. Moreover, even a material that does not have a muscle regeneration promoting effect or a material that has a synergistic or additive effect when used in combination with an IL-6 inhibitor.
  • Examples of materials that are acceptable for formulation include sterilized water and physiological saline, stabilizers, excipients, buffers, preservatives, surfactants, chelating agents (EDTA, etc.), binders, and the like.
  • examples of the surfactant include nonionic surfactants such as sorbitan fatty acid esters such as sorbitan monocaprylate, sorbitan monolaurate, sorbitan monopalmitate; glycerin monocaprylate, Glycerin fatty acid esters such as glycerol monomyristate and glycerol monostearate; decaglyceryl monostearate Polyglycerin fatty acid esters such as rate, decaglyceryl distearate, decaglyceryl monolinoleate; polyoxyethylene sorbitan monolaurate, polyoxyethylene sorbitan monooleate, polyoxyethylene sorbitan monostearate, polyoxyethylene sorbitan Monopalmitate, polyoxyethylene sorbitan trioleate, poly
  • Polyoxyethylene sorbite fatty acid ester such as polyoxyethylene sorbite tetrastearate and polyoxyethylene sorbite tetraoleate
  • Polyoxyethylene glyceryl fatty acid ester such as polyoxyethylene glyceryl monostearate
  • Polyethylene such as polyethylene glycol distearate Glycolic fatty acid ester
  • Polyoxyethylene alkyl ether such as polyoxyethylene lauryl ether
  • Polyoxyethylene polyoxypropylene such as polyoxyethylene polyoxypropylene glycol, polyoxyethylene polyoxypropylene propylene ether, polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether Alkyl etherol; polyoxyethylene nonylphenol ether, etc.
  • Polyoxyethylene hydrogenated castor oil such as polyoxyethylene castor oil and polyoxyethylene hydrogenated castor oil (polyoxyethylene hydrogen castor oil); polyoxyethylene beeswax derivatives such as polyoxyethylene sorbite beeswax; polyoxy Typical examples include polyoxyethylene lanolin derivatives such as ethylene lanolin; those having HLB6 to 18 such as polyoxyethylene fatty acid amide such as polyoxyethylene stearamide, and the like.
  • the surfactant examples include an anionic surfactant, for example, an alkyl sulfate having an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms, such as sodium cetyl sulfate, sodium lauryl sulfate, sodium oleyl sulfate; polyoxyethylene Polyoxyethylene alkyl ether sulfates having an average added mole number of ethylene oxide of 2 to 4 and an alkyl group having 10 to 18 carbon atoms, such as sodium lauryl sulfate; alkyl groups such as estanolic sodium lauryl sulfosuccinate Alkylsulfosuccinic acid ester salts having 8 to 18 carbon atoms; natural surfactants such as lecithin, glyce mouth phospholipids; sphingophospholipids such as sphingomyelin; sucrose with fatty acids having 12 to 18 carbon atoms Typical examples include fatty acid esters and the like.
  • surfactants can be added to the agent of the present invention in combination.
  • Preferred surfactants for use in the formulations of the present invention are polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters such as polysorbate 20, 40, 60 or 80, with polysorbates 20 and 80 being particularly preferred.
  • polyoxyethylene polyoxypropylene glycols such as poloxamers (such as Pull Knick F_68 (registered trademark)).
  • the amount of surfactant added varies depending on the type of surfactant used. In the case of polysorbate 20 or polysorbate 80, it is generally 0.001 to 100 mg / mL, preferably 0.003 to 50 mg / mL, and more preferably Is 0.005 to 2 mg / mL.
  • the buffering agent phosphoric acid, citrate buffer, acetic acid, malic acid, tartaric acid, succinic acid, lactic acid, potassium phosphate, dalconic acid, strong prillic acid, deoxycholic acid, salicylic acid, trimethyl
  • organic acids such as ethanolamine, fumaric acid, etc., or carbonate buffer, tris buffer, histidine buffer, imidazole buffer and the like can be mentioned.
  • a solution formulation may be prepared by dissolving in an aqueous buffer known in the field of solution formulation.
  • concentration of the buffer is generally 1 to 500 mM, preferably 5 to 100 mM, and more preferably 10 to 20 mM.
  • the drug of the present invention may also contain other low molecular weight polypeptides, proteins such as serum albumin, gelatin and immunoglobulins, saccharides such as amino acids, polysaccharides and monosaccharides, carbohydrates, and sugar alcohols.
  • amino acids include basic amino acids such as arginine, lysine, histidine, ornithine and the like, or inorganic salts of these amino acids (preferably in the form of hydrochloride, phosphate salt, that is, phosphate. Amino acid).
  • the preferred pH value is determined by appropriate physiologically acceptable buffer substances such as inorganic acids, especially hydrochloric acid, phosphoric acid, sulfuric acid, acetic acid, formic acid or their salts. Adjusted.
  • the use of phosphate is particularly advantageous in that a stable lyophilizate is obtained.
  • the preparation is substantially free of organic acids such as malic acid, tartaric acid, succinic acid, succinic acid, fumaric acid, etc. or the corresponding anions (malate ion, tartaric acid ion, succinic acid ion, succinic acid ion, This is particularly advantageous when no fumaric acid ion or the like is present.
  • the amino acid is arginine, lysine, histidine, or ornithine.
  • acidic amino acids such as gnoretamic acid and aspartic acid, and their salt forms (preferably sodium salts) or neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine
  • neutral amino acids such as isoleucine, leucine, glycine, serine, threonine, valine, methionine, cysteine, or alanine
  • aromatic amino acids such as phenylalanine, tyrosine, tryptophan, or the derivative N-acetyl tryptophan can be used.
  • saccharides and carbohydrates such as polysaccharides and monosaccharides include dextran, gnolecose, fructose, ratatose, xylose, mannose, manolethose, sucrose, trehalose, and raffinose.
  • examples of the sugar alcohol include mannitol, sorbitol, inositol and the like.
  • the drug of the present invention when used as an aqueous solution for injection, it contains, for example, physiological saline, glucose and other adjuvants (for example, D-sonorebitonore, D-mannose, D-mannitol, sodium chloride). Can be mixed with an isotonic solution.
  • the aqueous solution may be used in combination with a suitable solubilizing agent (for example, alcoholic ethanol (such as ethanol), polyalcohol (propylene glycol, PEG, etc.), nonionic surfactant (polysorbate 80, HCO-50, etc.).
  • alcoholic ethanol such as ethanol
  • polyalcohol propylene glycol, PEG, etc.
  • nonionic surfactant polysorbate 80, HCO-50, etc.
  • it may further contain a diluent, a solubilizer, a pH adjuster, a soothing agent, a sulfur-containing reducing agent, an antioxidant and the like.
  • examples of the sulfur-containing reducing agent include N-acetyl cysteine, N-acetyl homocystine, thiotate, thiodiglycol, thioethanolamine, thioglycerol, thiosorbitol, thioglycol.
  • examples include acids and salts thereof, sodium thiosulfate, glutathione, and those having a sulfhydryl group such as thioalkanoic acid having 1 to 7 carbon atoms.
  • examples of the antioxidant include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butynole hydroxyanisonore, hitocoferonole, tocopheronol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid Palmitate, L-ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, propyl gallate or disodium ethylenediamin tetraacetate (EDTA), sodium triphosphate And chelating agents such as sodium and sodium metaphosphate.
  • erythorbic acid dibutylhydroxytoluene, butynole hydroxyanisonore, hitocoferonole, tocopheronol acetate, L-ascorbic acid and salts thereof, L-ascorbic acid Palmitate, L-ascorbic acid stearate, sodium bisulfite, sodium sulfite, triamyl gallate, prop
  • microcapsules such as hydroxymethylcellulose, gelatin, poly [methylmethacrylic acid]
  • colloid drug delivery systems ribosomes, albumin microspheres, microemulsions, Nanoparticles and nanoforces can also be used (see Remington's Pharmaceutical Science 1 edition, ⁇ slo Ed., 1980, etc.).
  • a method of making a drug a sustained-release drug is also known and can be applied to the present invention (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; U.S. Patent 3,773,919; European Patent Application Publication (EP) 58,481; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547_556; EP 133,988).
  • the pharmaceutically acceptable carrier to be used is selected appropriately or in combination according to the dosage form, but is not limited thereto.
  • the present invention relates to a method for promoting muscle regeneration in a subject, comprising the step of administering an IL-6 inhibitor to the subject.
  • the “subject” can include an organism having muscle atrophy, an organism having a damaged muscle, or a part of the organism.
  • Organisms include, but are not limited to, animals (eg, humans, domestic animal species, wild animals).
  • the “part of the body of the organism” is not particularly limited, but preferably includes muscular tissue, more preferably skeletal muscle or a peripheral region of skeletal muscle.
  • administering includes administering orally or parenterally.
  • Oral administration can include administration in the form of oral agents, and as oral agents, the dosage form such as granules, powders, tablets, capsules, solvents, emulsions or suspensions is selected. That power S.
  • Parenteral administration can include administration in the form of injections.
  • injections include intravenous injection such as infusion, subcutaneous injection, intramuscular injection, or intraperitoneal injection. Can do.
  • the effect of the method of the present invention can be achieved by introducing a gene containing an oligonucleotide to be administered into a living body using a gene therapy technique.
  • the agent of the present invention can be locally administered to an area where treatment is desired. For example, local injection during surgery, use of a catheter, or encodes an inhibitor of the invention It can also be administered by targeted gene delivery of DNA.
  • the agent of the present invention may be administered simultaneously with a known muscle regeneration therapy or at intervals.
  • MR16-1 anti-mouse IL-6 receptor monoclonal antibody
  • C2C12 cells were cultured in a differentiation medium containing a concentration of ⁇ g / ml phosphate-buffered saline (PBS). Control cells were cultured in a medium without MR16-1.
  • mice were injected intraperitoneally (Lp.) With MR16-1 or PBS at a concentration of 2 mg / mouse before 7-day hindlimb suspension and before 7-day reload.
  • the collected muscles were immersed in cellbanker (Nihon Zenyaku) and frozen at -80 ° C, and then thawed at 35 ° C. Then 20 M 5 -bromo-2 -deoxyundine (BrdU), 0.2% type I collagenase, 1% antibiotics,
  • MR16-1 treatment did not show a specific effect on muscle fiber atrophy and decrease in the number of satellite cells associated with non-load (Fig. 2).
  • the number of satellite cells that were mitotically activated in response to reloading increased with MR16-1 treatment (Fig. 2). Since satellite cells play an important role in regulating muscle fiber mass, it was suggested that inhibiting IL-6 could be a way to promote muscle regeneration.
  • Satellite cells grown in culture with MR16-1 administration are labeled with GFP and injected into muscle tissue or veins of animals with damaged or atrophied muscles.
  • the effect of recovery or regeneration of muscle tissue of the subject animal by administration of the cells is examined by a method known to those skilled in the art.
  • the present inventors specifically inhibit IL-6 using an IL-6 receptor antibody in muscle tissue that has undergone muscle atrophy or disuse muscle atrophy that occurs in the absence of gravity stimulation. And found that muscle regeneration can be promoted. That is, the muscle regeneration-promoting agent of the present invention is thought to be applicable to the prevention and regeneration of muscle atrophy when bedridden or casted, as well as muscle atrophy caused by space travel. In addition, chronic inflammatory diseases such as muscle damage and rheumatoid arthritis It may be applicable to muscle atrophy associated with the disease and muscle regeneration of congenital muscle diseases. Until now, there has been no therapeutic agent that promotes muscle regeneration. The knowledge of the present invention is thought to enable muscle regeneration to be promoted by a drug.

Abstract

　本発明者らは、IL-6シグナル経路の阻害による、筋肉細胞成長への効果を検討した。その結果、IL-6阻害剤を投与することにより、衛星細胞の接着・増殖・分化を促進させること、および、その結果として筋肉再生を促進させることが可能であることを見出した。

Description

明 細 書
筋再生促進剤
技術分野
[0001] 本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する筋再生促進剤、およびその利用 に関する。
背景技術
[0002] 微小重力環境である宇宙環境への滞在後、寝たきり状態後、またはギプス固定状 態後に、傍脊柱筋および下肢ヒラメ筋等において筋萎縮が起こることが知られている 。骨格筋の損傷 ·壊死は再生によって補われており、筋萎縮は筋繊維の壊死が再生 によって補いきれない場合に、健在化するものと考えられている。骨格筋損傷後の再 生過程には衛星細胞が動員されることがわかっている。衛星細胞は骨格筋内に通常 、休止状態で存在する組織特異的幹細胞であり、骨格筋繊維上で増殖'分化し、筋 繊維へ融合し、筋再生を促す。し力しながら、生体内において衛星細胞の動員'増 殖 ·分化を促す因子はこれまでに明らかにされてこなかった。
IL-6は B細胞刺激因子 2(BSF2)あるいはインターフェロン j3 2とも呼称されたサイト力 インである。 IL-6は、 Bリンパ球系細胞の活性化に関与する分化因子として発見され（ 非特許文献 1)、その後、種々の細胞の機能に影響を及ぼす多機能サイト力インであ ることが明らかになった（非特許文献 2)。 IL-6は、 Tリンパ球系細胞の成熟化を誘導 することが報告されてレ、る（非特許文献 3)。
[0003] IL-6は、細胞上で二種の蛋白質を介してその生物学的活性を伝達する。一つは、 I L-6が結合する分子量約 80kDのリガンド結合性蛋白質の IL-6受容体である (非特許 文献 4、 5)。 IL-6受容体は、細胞膜を貫通して細胞膜上に発現する膜結合型の他に 、主にその細胞外領域からなる可溶性 IL-6受容体としても存在する。
もう一つは、非リガンド結合性のシグナル伝達に係わる分子量約 130kDの膜蛋白質 gpl30である。 IL-6と IL-6受容体は IL-6/IL-6受容体複合体を形成し、次いで gpl30 と結合することにより、 IL-6の生物学的活性が細胞内に伝達される（非特許文献 6)。
[0004] IL-6阻害剤は、 IL-6の生物学的活性の伝達を阻害する物質である。これまでに、 IL -6に対する抗体 (抗 IL-6抗体）、 IL-6受容体に対する抗体 (抗 IL-6受容体抗体）、 gpl 30に対する抗体 (抗 gpl30抗体）、 IL-6改変体、 IL-6又は IL-6受容体部分ペプチド等 が知られている。
抗 IL-6受容体抗体に関しては、レ、くつかの報告がある (非特許文献 7、 8、特許文 献：！〜 3)。その一つであるマウス抗体 PM-1 (非特許文献 9)の相捕性決定領域（CDR ； complementarity determining region をヒト饥体へ移不 liすることにより得られたヒトイ匕 PM-1抗体が知られている（特許文献 4)。
これまでに、インスリン様成長因子- K非特許文献 10)や、抗マイォスタチン抗体（ 非特許文献 11)が、筋萎縮の抑制効果および筋再生の促進効果を示すことが知ら れている。し力 ながら、筋再生に対して、 IL-6等のサイト力インが影響を与えるか否 かにつレ、ては、これまで全く検討されてこなかった。
なお、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
特許文献 1：国際特許出願公開番号 WO 95-09873
特許文献 2:フランス特許出願公開番号 FR 2694767
特許文献 3:米国特許番号 US 5216128
特許文献 4:国際特許出願公開番号 WO 92-19759
非特許文献 l:Hirano， T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
非特許文献 2:Akira， S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
非特許文献 3:Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988)167， 1253-1258
非特許文献 4:Taga， T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
非特許文献 5:Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
非特許文献 6:Taga， T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
非特許文献 7:Novick， D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
非特許文献 8 : Huang, Y. W. et al" Hybridoma (1993) 12, 621-630
非特許文献 9 : Hirata, Y. et al" J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
非特許文献 10: Barton- Davis, E. R. et al" Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1998) 95， 15 603-15607
非特許文献 ll:Bogdanovich, S. et al" Nature (2002) 420, 418-421 非特許文献 12:Dangott B. et al., Int J. Sports Med. (2000) 21, 13-16 非特許文献 13:Darr KC. and Schultz E.， J. Appl. Physiol. (1989) 67， 1827-1834 非特許文献 14: Garry DJ. et al., PNAS (2000) 97， 5416-5421
非特許文献 15: Garry DJ. et al., Dev. Biol. (1997) 188， 280-294
非特許文献 16:Jejurikar SS. et al, Plast Reconstr Surg (2002) 110, 160-168 非特許文献 17:Mauro A" J. Biochem Cytol. (1961) 9， 493-498
非特許文献 18:McCormick KM and Schultz E.， Dev. Dyn. (1994) 199， 52-63 非特許文献 19: Moss FP. and Leblond CP" Anat. Rec. (1971) 170， 421-435 非特許文献 20:Mozdziak PE. et al., Biotech. Histochem. (1994) 69， 249-252 非特許文献 21:Mozdziak PE. et al., J. Appl. Physiol. (2000) 88， 158-164 非特許文献 22:Mozdziak PE. et al., J. Appl. Physiol. (2001) 91， 183-190 非特許文献 23:Mozdziak PE. et al., Eur. J. Appl. Physiol. Occup. Physiol. (1998) 7
8， 136-40
非特許文献 24: Schultz Ε·， Dev. Biol. (1996) 175, 84-94
非特許文献 25 : Schultz E. et al., J. Appl. Physiol. (1994) 76， 266-270
非特許文献 26 : Schultz E. et al., Muscle Nerve. (1985) 8， 217-222
非特許文献 27: Snow ΜΗ·, Anat. Rec. (1977) 188, 181-199
非特許文献 28: Snow ΜΗ·, Anat. Rec. (1990) 227, 437-446
非特許文献 29: Wang XD.， Am. J. Physiol. Cell Physiol. (2006) 290， C981- C989 発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 本発明はこのような状況に鑑みてなされたものであり、その目的は、 IL-6阻害剤を 有効成分として含有する筋再生促進剤を提供することにある。
さらに本発明は、 IL-6阻害剤を、筋萎縮を起こしている対象に投与する工程を含む 、対象において筋肉の再生を促進させる方法の提供も課題とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記の課題を解決するために、 IL-6シグナル経路の阻害による、筋 肉細胞成長への効果を検討した。 まず、 MR16-1 (抗マウス IL-6受容体モノクローナル抗体）を様々な濃度で含有する 分化培地中で C2C12細胞を培養し、筋再生に関与するタンパク質: MyoD、ミオゲニ ン、ミオゲニン調節因子タンパク質、およびミオシン重鎖を免疫組織化学的に検出し た。さらに、筋肉分化マーカーである M—カドヘリン、蛍光体- p38および MyoDの発現 を、ウェスタンブロット分析により確認した。
[0008] その結果、 C2C12細胞の増殖は MR16-1の添加により抑制された力 MyoD,ミオゲ ニン、ミオゲニン調節因子タンパク質、およびミオシン重鎖を発現する C2C 12細胞の パーセント分布は増加することが明らかとなった。さらに、 M—カドヘリンおよび蛍光 体- p38、さらに MyoDの発現レベルは MR16-1処理を行った細胞において増加した。 これらの結果より、免疫系が IL-6シグナル経路を介して、筋肉繊維の発達および Zま たは成長に重要な役割を果たしていることが明らかとなった。
[0009] 次に、雄マウス (C57BL/6J Jcl)において、 MR16-1を添加することにより、負荷または 非負荷に対するヒラメ筋の全単一筋繊維における衛星細胞の反応に、どのような変 化が現れるかを検討した。
その結果、 MR16-1処理を行っても、非負荷における繊維萎縮および衛星細胞数 の減少に、特異的な効果は現れなかった。し力 ながら、再負荷に反応して増殖活 性化した衛星細胞の数は、 MR16-1処理を行うことにより増加することが明らかとなつ た。衛星細胞は筋肉繊維量の調節に重要な役割を果たすことから、 IL-6を阻害する ことは筋肉再生を促進する一つの手法になり得ることが示唆された。
即ち、本発明者らは、 IL-6阻害剤を投与することにより、衛星細胞の接着 ·増殖 ·分 化を促進させること、および、その結果として筋肉再生または筋繊維の肥大を促進さ せることが可能であることを見出し、これにより本発明を完成するに至った。
[0010] 本発明は、より具体的には以下の〔1〕〜〔23〕を提供するものである。
〔1〕IL_6阻害剤を有効成分として含有する、筋再生促進剤。
〔2〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の筋再生促 進剤。
〔3〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔1〕に記載の筋 再生促進剤。 〔4〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の筋再生 促進剤。
〔5〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔2〕 または〔3〕に記載の筋再生促進剤。
〔6〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔2〕または〔3〕に記載の筋再生促進 剤。
〔7〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔6〕に記載の 筋再生促進剤。
〔8〕筋再生が、筋萎縮からの筋再生であることを特徴とする〔1〕〜〔7〕のいずれかに 記載の筋再生促進剤。
〔9〕 IL-6阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象において筋肉の再生を促進さ せる方法。
〔10〕対象が筋萎縮を起こしていることを特徴とする、〔9〕に記載の方法。
〔11〕 IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕または〔10〕に記 載の方法。
〔12〕 IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔9〕または〔1 0〕に記載の方法。
〔13〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔11〕または〔12〕に記載の方 法。
〔14〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔11 〕または〔12〕に記載の方法。
〔15〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔11〕または〔12〕に記載の方法。 〔16〕抗体がキメラ抗体、ヒトイ匕抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔15〕に記 載の方法。
〔17〕筋再生促進剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
〔18〕IL_6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする〔17〕に記載の使用。 〔19〕IL_6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔17〕に記載 の使用。 〔20〕抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする〔18〕または〔19〕に記載の使 用。
〔21〕抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする〔18 〕または〔19〕に記載の使用。
〔22〕抗体が組換え型抗体であることを特徴とする〔18〕または〔19〕に記載の使用。 〔23〕抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする〔22〕に記 載の使用。
図面の簡単な説明
[0011] [図 1]C2C12細胞におけるタンパク質の発現をウェスタンブロッテイング法で確認した 結果を示す写真である。 2%のゥマ血清を含有する分化培地において 3日間培養し た C2C12細胞の成長に対する、 MR16-1添加の効果を検討した。
[図 2A]負荷または非負荷が、雄マウス (C57BL/6J Jcl)のヒラメ筋の全単一筋繊維にお ける衛星細胞の特性に対する、 MR16-1添加の効果を示す図である。図 2Aは、各群 の腱力も腱までの筋線維における全 BrdU陽性 (分裂活性化)衛星細胞数を示す図 である。 以下図 2の全ての図で、各記号は次の状態の群を示す。 Pre :後肢懸垂前 の群、 C :年齢適合対照群、 CMR:年齢適合対照群に MR16-1処理した群、 S :後肢懸 垂群、 SMR:後肢懸垂に MR16-1処理した群。また以下図 2の全ての図で、 R+0で示さ れた 4つの群は 7日間の非負荷またはケージ内飼育直後の群を示し、 R+7で示された 4つの群は再負荷 7日後の群を示す。以下図 2の全ての図で、データは平均土 SEM である。 * and†P < 0.05、 Preおよび C、および R+0における Sおよび SMRとの比較。
[図 2B]各群の腱から腱までの筋線維における全 M -カドヘリン陽性 (休止）衛星細胞 数を示す図である。
[図 2C]各群の腱力 腱までの筋線維における総衛星細胞数を示す図である。
[図 2D]BniU陽性 (分裂活性化)衛星細胞 Z衛星細胞の値 (％)を示す図である。 発明を実施するための最良の形態
[0012] 本発明者らは、抗 IL-6受容体抗体を投与することにより、筋肉の再生を促進させる ことが可能であることを見出した。本発明は、これらの知見に基づくものである。
本発明は、 IL-6阻害剤を有効成分として含有する、筋再生促進剤に関する。 本発明において「IL_6阻害剤」とは、 IL-6によるシグナル伝達を遮断し、 IL-6の生物 学的活性を阻害する物質である。 IL-6阻害剤は、好ましくは IL_6、 IL-6受容体及び g pl30のいずれかの結合に対する阻害作用を有する物質である。
[0013] 本発明の IL-6阻害剤としては、例えば抗 IL-6抗体、抗 IL-6受容体抗体、抗 gpl30抗 体、 IL-6改変体、可溶性 IL-6受容体改変体あるいは IL-6又は IL-6受容体の部分べ プチドおよび、これらと同様の活性を示す低分子物質が挙げられるが、特に限定され るものではない。本発明の IL-6阻害剤としては、好ましくは IL-6受容体を認識する抗 体を挙げることが出来る。
本発明における抗体の由来は特に限定されるものではないが、好ましくは哺乳動 物由来であり、より好ましくはヒト由来の抗体を挙げることが出来る。
[0014] 本発明で使用される抗 IL-6抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノク ローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6抗体として、特に哺 乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましレ、。哺乳動物由来のモノクローナル抗体 としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗体遺 伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗体は I L-6と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害して IL-6の生物学的活 性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 MH166(Matsuda, T. et al.， Eur. J. Immunol. (1988) 18, 95 1-956)や SK2抗体（Sato, K. et al.， 第 21回 日本免疫学会総会、学術記録 (1991)21 ， 166)等が挙げられる。
[0015] 抗 IL-6抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を使用し、以下のようにし て作製できる。すなわち、 IL-6を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法に したがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と 融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリー ユングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗体取得 の感作抗原として使用されるヒ HL-6は、 Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550、 J. Im munol.(1988)140, 1534-1541、あるいは Agr. Biol. Chem.(1990)54, 2685-2688に開 示された IL-6遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。
[0016] IL-6の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 IL-6蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 IL-6蛋白質 と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用いてもよい。
本発明で使用される抗 IL-6受容体抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又 はモノクローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 IL-6受容体抗 体として、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノ クローナル抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手 法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがあ る。この抗体は IL-6受容体と結合することにより、 IL-6の IL-6受容体への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
[0017] このような抗体としては、 MR16-1抗体（Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. US A (1993) 90， 11924-11928)、 PM- 1抗体 (Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2 900-2906)、 AUK12-20抗体、 AUK64-7抗体あるいは AUK146-15抗体（国際特許出 願公開番号 WO 92-19759)などが挙げられる。これらのうちで、ヒ HL-6受容体に対す る好ましレ、モノクローナル抗体としては PM-1抗体が例示され、またマウス IL-6受容体 に対する好ましいモノクローナル抗体としては MR16-1抗体が挙げられる。
[0018] 抗 IL-6受容体モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、基本的には公知技術を 使用し、以下のようにして作製できる。すなわち、 IL-6受容体を感作抗原として使用し て、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融 合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナ ルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、抗 IL-6受容体抗体を作製するには次のようにすればよい。例えば、抗 体取得の感作抗原として使用されるヒ HL-6受容体は、欧州特許出願公開番号 EP 3 25474に、マウス IL-6受容体は日本特許出願公開番号特開平 3-155795に開示され た IL-6受容体遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。
[0019] IL-6受容体蛋白質は、細胞膜上に発現しているものと細胞膜より離脱しているもの (可溶性 IL-6受容体) (Yasukawa, K. et al" J. Biochem. (1990) 108, 673-676)との二 種類がある。可溶性 IL-6受容体は細胞膜に結合している IL-6受容体の実質的に細 胞外領域力 構成されており、細胞膜貫通領域あるいは細胞膜貫通領域と細胞内領 域が欠損している点で膜結合型 IL-6受容体と異なっている。 IL-6受容体蛋白質は、 本発明で用いられる抗 IL-6受容体抗体の作製の感作抗原として使用され得る限り、 いずれの IL-6受容体を使用してもよい。
IL-6受容体の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を 形質転換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の IL-6受容体蛋白 質を公知の方法で精製し、この精製 IL-6受容体蛋白質を感作抗原として用いればよ レ、。また、 IL-6受容体を発現している細胞や IL-6受容体蛋白質と他の蛋白質との融 合蛋白質を感作抗原として用いてもょレ、。
[0020] 本発明で使用される抗 gpl30抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノ クローナル抗体として得ることができる。本発明で使用される抗 gpl30抗体として、特 に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましレ、。哺乳動物由来のモノクローナル 抗体としては、ハイプリドーマに産生されるもの、および遺伝子工学的手法により抗 体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主に産生されるものがある。この抗 体は gpl30と結合することにより、 IL-6/IL-6受容体複合体の gpl30への結合を阻害 して IL-6の生物学的活性の細胞内への伝達を遮断する。
このような抗体としては、 AM64抗体（特開平3-219894)、4B11抗体ぉょび2H4抗体（ US 5571513) B-S12抗体および B-P8抗体（特開平 8-291199)などが挙げられる。
[0021] 抗 gpl30モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、基本的には公知技術を使用し 、以下のようにして作製できる。すなわち、 gpl30を感作抗原として使用して、これを通 常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって 公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナル抗体産生 細胞をスクリーニングすることによって作製できる。
具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよレ、。例えば、 抗体取得の感作抗原として使用される gpl30は、欧州特許出願公開番号 EP 411946 に開示された gpl30遺伝子/アミノ酸配列を用いることによって得られる。 [0022] gpl30の遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転 換させた後、その宿主細胞中又は、培養上清中から目的の gpl30蛋白質を公知の方 法で精製し、この精製 gpl30蛋白質を感作抗原として用いればよい。また、 gpl30を発 現している細胞や gpl30蛋白質と他の蛋白質との融合蛋白質を感作抗原として用い てもよい。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではなレ、が、細胞融 合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましぐ一般的にはげっ 歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター等が使用される。
[0023] 感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一 般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内又は、皮下に注射することにより行 われる。具体的には、感作抗原を PBS (Phosphate-Buffered Saline )や生理食塩水等 で適当量に希釈、懸濁したものを所望により通常のアジュバント、例えば、フロイント 完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に 4-21日毎に数回投与するのが 好ましレ、。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することができる。
このように免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳 動物から免疫細胞が取り出され、細胞融合に付される。細胞融合に付される好ましい 免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。
[0024] 前記免疫細胞と融合される他方の親細胞としての哺乳動物のミエローマ細胞は、 すでに、公知の種々の細胞株、例えば、 P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. et al. J. Imm unol. (1979) 123， 1548—1550)、 P3X63Ag8U. l (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81， 1—7)、 NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(19 76) 6, 511-519 )、 MPC-11 (Margulies. D. H. et al. , Cell (1976) 8， 405-415 )、 SP2/ 0 (Shulman, M. et al, Nature (1978) 276, 269-270)、 F〇（de St. Groth, S. F. et al, J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21 )、 S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313- 323)、 R210 (Galfre, G. et al, Nature (1979) 277, 131-133 )等が適宜使 用される。
[0025] 前記免疫細胞とミエローマ細胞の細胞融合は基本的には公知の方法、たとえば、ミ ノレシュタインらの方法（Kohler. G. and Milstein, C" Methods Enzymol. (1981) 73, 3_ 46)等に準じて行うことができる。
より具体的には、前記細胞融合は例えば、細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施される。融合促進剤としては例えば、ポリエチレングリコール (PEG )、センダイウィルス（HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジ メチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は、例えば、ミエローマ細胞に対して免疫 細胞を 1〜10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば 、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適な RPMI1640培養液、 MEM培養液、その他、こ の種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。
[0026] 細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混 合し、予め、 37°C程度に加温した PEG溶液、例えば、平均分子量 1000〜6000程度の PEG溶液を通常、 30〜60% (w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする 融合細胞（ハイプリドーマ）が形成される。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心 して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイプリドーマの生育に好ましくない細 胞融合剤等を除去できる。
当該ハイプリドーマは、通常の選択培養液、例えば、 HAT培養液（ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。当該 H AT培養液での培養は、 目的とするハイプリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅 するのに十分な時間、通常数日〜数週間継続する。ついで、通常の限界希釈法を 実施し、 目的とする抗体を産生するハイプリドーマのスクリーニングおよびクローニン グが行われる。
[0027] また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイプリドーマを得る他に、ヒトリンパ球 を in vitroで所望の抗原蛋白質又は抗原発現細胞で感作し、感作 Bリンパ球をヒトミエ ローマ細胞、例えば U266と融合させ、所望の抗原又は抗原発現細胞への結合活性 を有する所望のヒト抗体を得ることもできる（特公平 59878参照）。さらに、ヒト抗体遺 伝子のレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原又は抗原発現細胞を投与 し、前述の方法に従い所望のヒト抗体を取得してもよい（国際特許出願公開番号 W〇 93/12227、 WO 92/03918、 WO 94/02602、 WO 94/25585、 WO 96/34096、 WO 96/ 33735参照）。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、通常の 培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが 可能である。
[0028] 当該ハイプリドーマからモノクローナル抗体を取得するには、当該ハイプリドーマを 通常の方法にしたがい培養し、その培養上清として得る方法、あるいはハイプリドー マをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水として得る方法など が採用される。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適しており、一方、後者の方 法は、抗体の大量生産に適している。
例えば、抗 IL-6受容体抗体産生ハイブリドーマの作製は、特開平 3-139293に開示 された方法により行うことができる。 PM-1抗体産生ハイブリドーマを BALBんマウスの 腹腔内に注入して腹水を得、この腹水から PM-1抗体を精製する方法や、本ハイプリ ドーマを適当な培地、例えば、 10%ゥシ胎児血清、 5%BM-Condimed HI (Boehringe r Mannheim製）含有 RPMI1640培地、ハイプリドーマ SFM培地（GIBCO-BRL製）、 PF ΗΜ-Π培地（GIBCO-BRL製）等で培養し、その培養上清から PM_1抗体を精製する 方法で行うことができる。
[0029] 本発明には、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクロー二 ングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用 いて産生させた組換え型抗体を用いることができる（例えば、 Borrebaeck C. A. K. an d Larrick J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the U nited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990参照）。
具体的には、 目的とする抗体を産生する細胞、例えばハイプリドーマから、抗体の 可変（V)領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、公知の方法、例えば 、グァニジン超遠心法（Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18， 5294-5299 ) 、 AGPC法（Chomczynski, P. et al, Anal. Biochem. (1987)162, 156-159)等により全 R NAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製）等を使用して mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製）を用いることにより mRNAを直 接調製すること力 Sできる。
[0030] 得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNAの 合成 f 、 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit等を用レヽ" 行 うことができる。また、 cDNAの合成および増幅を行うには 5し Ampli FINDER RACE Ki t (Clontech製）および PCRを用いた 5'-RACE法（Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. A cad. Sci. USA(1988)85, 8998- 9002 ; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989)1 7， 2919-2932)を使用することができる。得られた PCR産物から目的とする DNA断片を 精製し、ベクター DNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作成し、大腸菌 等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。 目的とする DNA の塩基配列を公知の方法、例えば、デォキシ法により確認する。
目的とする抗体の V領域をコードする DNAが得られれば、これを所望の抗体定常領 域 (C領域）をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターへ組み込む。又は、抗体 の V領域をコードする DNAを、抗体 C領域の DNAを含む発現ベクターへ組み込んで あよい。
[0031] 本発明で使用される抗体を製造するには、後述のように抗体遺伝子を発現制御領 域、例えば、ェンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに 組み込む。次に、この発現ベクターにより宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる こと力 Sできる。
本発明では、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改 変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ（Chimeric)抗体、ヒト化（Humanized)抗 体、ヒト (human)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造 すること力 Sできる。
キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体 V領域をコードする DNAをヒト抗体 C領域 をコードする DNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させ ることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 W 〇 92-19759参照）。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ること ができる。
[0032] ヒトイ匕抗体は、再構成 (reshaped)ヒト抗体またはヒト型化抗体とも称され、ヒト以外の 哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域 (CDR)をヒト抗体の相補性決定領域 へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている（欧州特許出 願公開番号 EP 125023、国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
具体的には、マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域（FR; framework reg ion)を連結するように設計した DNA配列を、末端部にオーバーラップする部分を有す るように作製した数個のオリゴヌクレオチドから PCR法により合成する。得られた DNA をヒト抗体 C領域をコードする DNAと連結し、次いで発現ベクターに組み込んで、これ を宿主に導入し産生させることにより得られる（欧州特許出願公開番号 EP 239400、 国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
[0033] CDRを介して連結されるヒト抗体の FRは、相補性決定領域が良好な抗原結合部位 を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適 切な抗原結合部位を形成するように抗体の可変領域のフレームワーク領域のァミノ 酸を置換してもよい（Sato, K.et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856)。
キメラ抗体、ヒト化抗体には、ヒト抗体 C領域が使用される。ヒト抗体 C領域としては、 C γが挙げられ、例えば、 C γ 1、 C γ 2、 C γ 3又は C γ 4を使用することができる。また 、抗体又はその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。
[0034] キメラ抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の C領域から なり、またヒト化抗体はヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域とヒト抗体由 来のフレームワーク領域および C領域からなり、両者はヒト体内における抗原性が低 下しているため、本発明に使用される抗体として有用である。
本発明に使用されるヒト化抗体の好ましい具体例としては、ヒト化 PM-1抗体が挙げ られる（国際特許出願公開番号 WO 92-19759参照）。
また、ヒト抗体の取得方法としては先に述べた方法のほか、ヒト抗体ライブラリーを用 いて、パンユングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体の可 変領域を一本鎖抗体（scFv)としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発 現させ、抗原に結合するファージを選択することもできる。選択されたファージの遺伝 子を解析すれば、抗原に結合するヒト抗体の可変領域をコードする DNA配列を決定 すること力 Sできる。抗原に結合する scFvの DNA配列が明らかになれば、当該配列を 含む適当な発現ベクターを作製し、ヒト抗体を取得することができる。これらの方法は 既に周知であり、 WO 92/01047, WO 92/20791， WO 93/06213, WO 93/11236， WO 93/19172， WO 95/01438, WO 95/15388を参考にすることができる。
[0035] 前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させることができる。哺 乳類細胞を用いた場合、常用される有用なプロモーター、発現される抗体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させた DNAあるいはそれを含むベクタ 一により発現させることができる。例えばプロモーター/ェンハンサ一としては、ヒトサ イトメカロウイノレス目 U期フロモ■ ~タ' ~ /ェンノヽンサ" ~ (human cytomegalovirus lmmedia te early promoter/ enhancer;を挙^ること力できる。
また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター Zェンハン サ一として、レトロウイルス、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、シミアンウィルス 40 (S V40)等のウィルスプロモーター/ェンハンサーゃヒトェロンゲーシヨンファクター 1ひ ( HEF1 α )などの哺乳類細胞由来のプロモーター/ェンハンサーを用いればよい。
[0036] 例えば、 SV40プロモーター/ェンハンサーを使用する場合、 Mulliganらの方法（Mu lligan, R. C. et al. , Nature (1979) 277, 108-114)、また、 HEF1 αプロモーター/ェ ンハンサーを使用する場合、 Mizushimaらの方法（Mizushima, S. and Nagata, S. Nucl eic Acids Res. (1990) 18, 5322 )に従えば容易に実施することができる。
大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列 、発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロ モーターとしては、 lacZプロモーター、 araBプロモーターを挙げることができる。 lacZプ 口モーターを使用する場合、 Wardらの方法（Ward, E. S. et al. , Nature (1989) 341 , 5 44-546 ; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427 )、 araBプロモーターを使 用する場合、 Betterらの方法（Better, Μ· et al. Science (1988) 240, 1041-1043 )に 従えばよい。
[0037] 抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリブラズムに産生させる場合 、 pelBシグナル配列（Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)を使用す ればよい。ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、抗体の構造を適切にリフォ 一ルド（refold)して使用する（例えば、 WO96/30394を参照）。 複製起源としては、 SV40、ポリオ一マウィルス、アデノウイルス、ゥシパピローマウイ ノレス（BPV)等の由来のものを用いることができ、さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー 数増幅のため、発現ベクターは選択マーカーとして、アミノグリコシドホスホトランスフ ヱラーゼ (APH)遺伝子、チミジンキナーゼ (TK)遺伝子、大腸菌キサンチングァニン ホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt)遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr)遺伝 子等を含むことができる。
[0038] 本発明で使用される抗体の製造のために、任意の産生系を使用することができる。
抗体製造のための産生系は、 in vitroおよび in vivoの産生系がある。 in vitroの産生 系としては、真核細胞を使用する産生系や原核細胞を使用する産生系が挙げられる 真核細胞を使用する場合、動物細胞、植物細胞、又は真菌細胞を用いる産生系が ある。動物細胞としては、（1)哺乳類細胞、例えば、 CH〇、 COS,ミエローマ、 BHK (ba by hamster kidney), HeLa、 Veroなど、（2)両生類細胞、例えば、アフリカッメガエル卵 母細胞、あるいは (3)昆虫細胞、例えば、 sf9、 sf21、 Tn5などが知られている。植物細 胞としては、ニコチアナ 'タバクム (Nicotiana tabacum)由来の細胞が知られており、こ れをカルス培養すればよい。真菌細胞としては、酵母、例えば、サッカロミセス（Sacch aromyces)属、例えばサッカロミセス'セレビシェ (Saccharomyces cerevisiae)、糸状菌 、例えばァスペルギルス属（Aspergillus)属、例えばァスペルギルス'二ガー（Aspergill us niger)などが知られている。
[0039] 原核細胞を使用する場合、細菌細胞を用いる産生系がある。細菌細胞としては、大 腸菌（E.coli)、枯草菌が知られている。
これらの細胞に、 目的とする抗体遺伝子を形質転換により導入し、形質転換された 細胞を in vitroで培養することにより抗体が得られる。培養は、公知の方法に従い行う 。例えば、培養液として、 DMEM、 MEM, RPMI1640, IMDMを使用することができ、牛 胎児血清 (FCS)等の血清補液を併用することもできる。また、抗体遺伝子を導入した 細胞を動物の腹腔等へ移すことにより、 in vivoにて抗体を産生してもよい。
一方、 in vivoの産生系としては、動物を使用する産生系や植物を使用する産生系 が挙げられる。動物を使用する場合、哺乳類動物、昆虫を用いる産生系などがある。 [0040] 哺乳類動物としては、ャギ、ブタ、ヒッジ、マウス、ゥシなどを用いることができる（Vic ki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993)。また、昆虫としては、カイ コを用いることができる。植物を使用する場合、例えばタバコを用いることができる。 これらの動物又は植物に抗体遺伝子を導入し、動物又は植物の体内で抗体を産 生させ、回収する。例えば、抗体遺伝子をャギ カゼインのような乳汁中に固有に産 生される蛋白質をコードする遺伝子の途中に揷入して融合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が揷入された融合遺伝子を含む DNA断片をャギの胚へ注入し、この胚 を雌のャギへ導入する。胚を受容したャギから生まれるトランスジェニックャギ又はそ の子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。トランスジェニックャギから産生される 所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジヱニックャ ギに使用してもよい。 (Ebert, K.M. et al , Bio/Technology (1994) 12， 699-702 )。
[0041] また、カイコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を揷入したバキュロウィルスをカイコ に感染させ、このカイコの体液より所望の抗体を得る（Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594)。さらに、タバコを用いる場合、 目的の抗体遺伝子を植物発現用べク ター、例えば pMON530に挿入し、このベクターを Agrobacterium tumefaciensのような バクテリアに導入する。このバクテリアをタバコ、例えば Nicotiana tabacumに感染させ 、本タバコの葉より所望の抗体を得る（Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994 )24, 131-138)。
上述のように in vitro又は in vivoの産生系にて抗体を産生する場合、抗体重鎖（H 鎖）又は軽鎖（L鎖）をコードする DNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主を同 時形質転換させてもよいし、あるいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現 ベクターに組み込んで、宿主を形質転換させてもよい（国際特許出願公開番号 W〇 94-11523参照）。
[0042] 本発明で使用される抗体は、本発明に好適に使用され得るかぎり、抗体の断片や その修飾物であってよい。例えば、抗体の断片としては、 Fab, F(ab')2、 Fv又は H鎖と L鎖の Fvを適当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv)が挙げられる。 具体的には、抗体を酵素、例えば、パパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成さ せるか、又は、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに 導入した後、適当な宿主細胞で発現させる（例えば、 Co, M.S. et al., J. Immunol. (19 94) 152, 2968-2976、 Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 17 8， 497-515、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476- 496、 Lamoyi, E.， Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663、 Rousseaux, J. et al ·， Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9， 132-137参照）。
[0043] scFvは、抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域を連結することにより得られる。この scFvにお いて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域はリンカ一、好ましくは、ペプチドリンカ一を介して連結 される（Huston, J. S. et al.、 Pro Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879—5883)。 s cFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V領域は、上記抗体として記載されたもののいずれ の由来であってもよい。 V領域を連結するペプチドリンカ一としては、例えばアミノ酸 1 2-19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。
scFvをコードする DNAは、前記抗体の H鎖又は、 H鎖 V領域をコードする DNA、およ び L鎖又は、 L鎖 V領域をコードする DNAを铸型とし、それらの配列のうちの所望のァ ミノ酸配列をコードする DNA部分を、その両端を規定するプライマー対を用いて PCR 法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカ一部分をコードする DNAおよびその両 端を各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅するこ とにより得られる。
[0044] また、一旦 scFvをコードする DNAが作製されれば、それらを含有する発現ベクター 、および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、 また、その宿主を用いて常法に従って、 scFvを得ることができる。
これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により 産生させることができる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。 抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール (PEG)等の各種分子と結合した抗体を 使用することもできる。本発明でいう「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。こ のような抗体修飾物を得るには、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得 ること力 Sできる。これらの方法はこの分野においてすでに確立されている。
[0045] 前記のように産生、発現された抗体は、細胞内外、宿主から分離し均一にまで精製 すること力 Sできる。本発明で使用される抗体の分離、精製はァフィ二ティークロマトグ ラフィ一により行うことができる。ァフィ二ティークロマトグラフィーに用いるカラムとして は、例えば、プロテイン Aカラム、プロテイン Gカラムが挙げられる。プロテイン Aカラム に用いる担体として、例えば、 HyperD, POROS、 S印 haroseF.F.等が挙げられる。そ の他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよぐ何ら限 定されるものではない。
例えば、上記ァフィ二ティークロマトグラフィー以外のクロマトグラフィー、フィルター 、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせれば、本発明で使用される抗体 を分離、精製すること力 Sできる。クロマトグラフィーとしては、例えば、イオン交換クロマ トグラフィー、疎水クロマトグラフィー、ゲルろ過等が挙げられる。これらのクロマトダラ フィ" ~は HPLし (High performance liquid chromatography)に適用し得る。ま 7こ、 木目 HPLC (reverse phase HPLC)を用いてもよレヽ。
[0046] 上記で得られた抗体の濃度測定は吸光度の測定又は ELISA等により行うことができ る。すなわち、吸光度の測定による場合には、 PBS (-)で適当に希釈した後、 280nmの 吸光度を測定し、 lmg/mlを 1.350Dとして算出する。また、 ELISAによる場合は以下の ように測定することができる。すなわち、 0.1M重炭酸緩衝液（pH9.6)で 1 Ai g/mlに希 釈したャギ抗ヒト IgG(TAG製） 100 μ 1を 96穴プレート（Nunc製）にカロえ、 4°Cでー晚イン キュベーシヨンし、抗体を固相化する。ブロッキングの後、適宜希釈した本発明で使 用される抗体又は抗体を含むサンプル、あるいは標品としてヒ HgG (CAPPEL製) 100 μ 1を添加し、室温にて 1時間インキュベーションする。
洗浄後、 5000倍希釈したアルカリフォスファターゼ標識抗ヒ HgG (BIO SOURCE製） ΙΟΟ μ Ιをカ卩え、室温にて 1時間インキュベートする。洗浄後、基質溶液を加えインキュ ベーシヨンの後、 MICROPLATE READER Model 3550 (Bio-Rad製）を用いて 405nm での吸光度を測定し、 目的の抗体の濃度を算出する。
[0047] 本発明で使用される IL-6改変体は、 IL-6受容体との結合活性を有し、且つ IL-6の 生物学的活性を伝達しない物質である。即ち、 IL-6改変体は IL-6受容体に対 UL-6 と競合的に結合するが、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナ ル伝達を遮断する。 IL-6改変体は、 IL-6のアミノ酸配列のアミノ酸残基を置換することにより変異を導入 して作製される。 IL-6改変体のもととなる IL-6はその由来を問わないが、抗原性等を 考慮すれば、好ましくはヒト IL-6である。
具体的には、 IL-6のアミノ酸配列を公知の分子モデリングプログラム、たとえば、 W HATIF (Vriend et al.， J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56 )を用いてその二次構造を 予測し、さらに置換されるアミノ酸残基の全体に及ぼす影響を評価することにより行わ れる。適切な置換アミノ酸残基を決定した後、ヒ HL-6遺伝子をコードする塩基配列を 含むベクターを铸型として、通常行われる PCR法によりアミノ酸が置換されるように変 異を導入することにより、 IL-6改変体をコードする遺伝子が得られる。これを必要に応 じて適当な発現ベクターに組み込み、前記組換え型抗体の発現、産生及び精製方 法に準じて IL-6改変体を得ることができる。
[0048] IL-6改変体の具体例としては、 Brakenhoff et al.， J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93
、及び Savino et al" EMBO J. (1994) 13, 1357-1367、 WO 96-18648、 W096-1786 9に開示されている。
本発明で使用される IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、各々 IL-6 受容体あるいは IL-6との結合活性を有し、且つ IL-6の生物学的活性を伝達しなレ、物 質である。即ち、 IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは IL-6受容体又は I L-6に結合し、これらを捕捉することにより IL-6の IL-6受容体への結合を特異的に阻 害する。その結果、 IL-6の生物学的活性を伝達しないため、 IL-6によるシグナル伝達 を遮断する。
IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域の一部又は全部のアミノ酸 配列からなるペプチドである。このようなペプチドは、通常 10〜80、好ましくは 20〜5 0、より好ましくは 20〜40個のアミノ酸残基からなる。
[0049] IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドは、 IL-6又は IL-6受容体のアミノ 酸配列において、 IL-6と IL-6受容体との結合に係わる領域を特定し、その特定した 領域の一部又は全部のアミノ酸配列に基づいて通常知られる方法、例えば遺伝子 工学的手法又はペプチド合成法により作製することができる。 IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドを遺伝子工学的手法により作製す るには、所望のペプチドをコードする DNA配列を発現ベクターに組み込み、前記組 換え型抗体の発現、産生及び精製方法に準じて得ることができる。
IL-6部分ペプチド又は IL-6受容体部分ペプチドをペプチド合成法により作製する には、ペプチド合成において通常用いられている方法、例えば固相合成法又は液相 合成法を用いることができる。
[0050] 具体的には、続医薬品の開発第 14卷ペプチド合成 監修矢島治明廣川書店 1991 年に記載の方法に準じて行えばよい。固相合成法としては、例えば有機溶媒に不溶 性である支持体に合成しょうとするペプチドの C末端に対応するアミノ酸を結合させ、 ひ-アミノ基及び側鎖官能基を適切な保護基で保護したアミノ酸を C末端から N末端 方向の順番に 1アミノ酸ずつ縮合させる反応と樹脂上に結合したアミノ酸又はぺプチ ドのひ-アミノ基の該保護基を脱離させる反応を交互に繰り返すことにより、ペプチド 鎖を伸長させる方法が用いられる。固相ペプチド合成法は、用いられる保護基の種 類により Boc法と Fmoc法に大別される。
[0051] このようにして目的とするペプチドを合成した後、脱保護反応及びペプチド鎖の支 持体からの切断反応をする。ペプチド鎖との切断反応には、 Boc法ではフッ化水素又 はトリフルォロメタンスルホン酸を、又 Fmoc法では TFAを通常用いることができる。 Boc 法では、例えばフッ化水素中で上記保護ペプチド樹脂をァニソール存在下で処理す る。次いで、保護基の脱離と支持体からの切断をしペプチドを回収する。これを凍結 乾燥することにより、粗ペプチドが得られる。一方、 Fmoc法では、例えば TFA中で上 記と同様の操作で脱保護反応及びペプチド鎖の支持体からの切断反応を行うことが できる。
[0052] 得られた粗ペプチドは、 HPLCに適用することにより分離、精製することができる。そ の溶出にあたり、蛋白質の精製に通常用いられる水-ァセトニトリル系溶媒を使用して 最適条件下で行えばよい。得られたクロマトグラフィーのプロファイルのピークに該当 する画分を分取し、これを凍結乾燥する。このようにして精製したペプチド画分につ いて、マススペクトル分析による分子量解析、アミノ酸組成分析、又はアミノ酸配列解 析等により同定する。 IL-6部分ペプチド及び IL-6受容体部分ペプチドの具体例は、特開平 2-188600、特 開平 7-324097、特開平 8-311098及び米国特許公報 US5210075に開示されている。
[0053] 本発明に使用する抗体は、ポリエチレングリコール (PEG)、放射性物質、トキシン等 の各種分子と結合したコンジュゲート抗体でもよレ、。このようなコンジュゲート抗体は、 得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修 飾方法はこの分野においてすでに確立されている。本発明における「抗体」にはこれ らのコンジュゲート抗体も包含される。
[0054] 本発明の IL-6阻害剤は、筋再生を促進させる際に使用することが可能である。
本発明において「筋再生」とは、損傷を受けた筋肉、または萎縮した筋肉が元の状 態に回復ことを意味する。筋肉が元の状態に回復するとは、筋繊維の容積、筋繊維 の数、または筋組織の性質 (発揮張力'持久性'代謝特性 '伸縮性'柔軟性)が、損傷 を受ける前または筋萎縮する前の数値'状態に回復することを意味する。本発明にお いて「筋萎縮」としては、重力刺激が無い状態で生じる筋萎縮、廃用性筋萎縮 (筋肉 を使わないことによる筋萎縮)、関節リウマチなどの慢性炎症性疾患に伴う筋萎縮、 先天性筋疾患における筋萎縮を好ましい例として挙げることができるが、これらに限 定されるものではない。
本発明において、「筋肉 ·筋組織」とは特に種類が限定されるものではなぐ骨格筋 細胞、心筋細胞、平滑筋細胞、筋上皮細胞のいずれであっても良い。
[0055] 以下に衛星細胞が関与する筋再生の過程を説明する。成体筋組織中の衛星細胞 は、通常細胞分裂を休止しているか、またはゆっくり分裂しているものと考えられてい る。骨格筋等の筋肉が損傷を受けると活性化され、増殖を開始する。増殖後、基底 膜を通り抜けた衛星細胞は、筋芽細胞と呼ばれる前駆細胞に分化し、活発に分裂- 増殖を繰り返しながら、損傷部位へと遊走する。筋芽細胞は損傷を受けた筋繊維周 囲の基底膜に沿って配向し、やがて基底膜の内側へ侵入し、互いにあるいは残存す る筋繊維と細胞融合して、筋管細胞 (myotube)を形成する。筋管細胞はさらに構造 的成熟を遂げ、成体筋組織となる。
本発明において、「筋再生」とは、上記過程により成体筋組織が生成されることを意 味していてもよい。 本発明において「筋再生が促進される」とは、上記の筋再生の進行が早められるこ とを意味する。また、筋再生に関与する衛星細胞の賦活化が促進された場合にも、 筋再生が促進されたことと同等であるとみなすことが出来る。 「衛星細胞の賦活化を 促進させる」とは、衛星細胞の動員、増殖、または分化を促進させることを意味する。
[0056] 本発明において、筋再生が促進されたか否かの確認は、筋繊維の容積または数を 測定することにより行うことが出来る。本発明の薬剤を投与することにより、筋繊維の 容積または数の増加が促進された場合に、筋再生が促進されたとみなすことが出来 る。筋繊維の容積または数の計測は公知の方法により行うことが出来、実施例に記 載の方法によっても行うことができる。
また、筋再生が促進されたか否かの確認は、賦活化された衛星細胞の量 (筋組織 における賦活化された衛星細胞の割合）を測定することによつても行うことができる。 本発明の薬剤を投与することにより、賦活化された衛星細胞の量が増加した場合（筋 組織における賦活化された衛星細胞の割合が増加した場合）に、筋再生が促進され たとみなすことが出来る。賦活化された衛星細胞の量の測定は公知の方法により行う ことが出来、実施例に記載の方法によっても行うことができる。
[0057] 本発明で使用される IL-6阻害剤の IL-6シグナル伝達阻害活性は、通常用いられる 方法により評価することができる。具体的には、 IL-6依存性ヒト骨髄腫株（S6B45，KPM M2)、ヒトレンネルト Tリンパ腫細胞株 KT3、あるいは IL-6依存性細胞 MH60.BSF2を培 養し、これに IL-6を添カ卩し、同時に IL-6阻害剤を共存させることにより IL-6依存性細 胞の 3H-チミジン取込みを測定すればよい。また、 IL-6受容体発現細胞である U266 を培養し、 1251標識 IL-6を添加し、同時に IL-6阻害剤を加えることにより、 IL-6受容 体発現細胞に結合した 1251標識 IL-6を測定する。上記アツセィ系において、 IL-6阻 害剤を存在させる群に加え IL-6阻害剤を含まない陰性コントロール群をおき、両者で 得られた結果を比較すれば IL-6阻害剤の IL-6阻害活性を評価することができる。
[0058] 後述の実施例に示されるように、抗 IL-6受容体抗体の投与により、筋再生が促進さ れることが認められたことから、抗 IL-6受容体抗体等の IL-6阻害剤は筋再生促進剤 として有用であることが示唆された。
本発明の筋再生促進剤が投与される対象は哺乳動物である。哺乳動物は、好まし くはヒトである。
[0059] 本発明の筋再生促進剤は、医薬品の形態で投与することが可能であり、経口的ま たは非経口的に全身あるいは局所的に投与することができる。例えば、点滴などの 静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、坐薬、注腸、経口性腸溶剤など を選択することができ、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができ る。有効投与量は、一回につき体重 lkgあたり O.Olmgから lOOmgの範囲で選ばれる。 あるいは、患者あたり l〜1000mg、好ましくは 5〜50mgの投与量を選ぶことができる。 好ましい投与量、投与方法は、たとえば抗 IL-6受容体抗体の場合には、血中にフリ 一の抗体が存在する程度の量が有効投与量であり、具体的な例としては、体重 lkg あたり 1ヶ月（4週間）に 0.5mgから 40mg、好ましくは lmgから 20mgを 1回力、ら数回に分 けて、例えば 2回/週、 1回/週、 1回 Z2週、 1回 Z4週などの投与スケジュールで 点滴などの静脈内注射、皮下注射などの方法で、投与する方法などである。投与ス ケジュールは、投与後状態の観察および血液検査値の動向を観察しながら 2回/週 あるいは 1回/週から 1回 /2週、 1回 /3週、 1回 /4週のように投与間隔を延ばして レ、くなど調整することも可能である。
[0060] 本発明において筋再生促進剤には、保存剤や安定剤等の製剤上許容し得る担体 が添加されていてもよい。製剤上許容しうる担体とは、それ自体は上記の筋再生促進 効果を有する材料であってもよいし、当該筋再生促進効果を有さない材料であって もよぐ上記の薬剤とともに投与可能な材料を意味する。また、筋再生促進効果を有 さない材料であっても、 IL-6阻害剤と併用することによって相乗的もしくは相加的な 効果を有する材料であってもよレ、。
製剤上許容される材料としては、例えば、滅菌水や生理食塩水、安定剤、賦形剤、 緩衝剤、防腐剤、界面活性剤、キレート剤 (EDTA等)、結合剤等を挙げることができる
[0061] 本発明において、界面活性剤としては非イオン界面活性剤を挙げることができ、例 えばソルビタンモノカプリレート、ソルビタンモノラウレート、ソルビタンモノパルミテート 等のソルビタン脂肪酸エステル；グリセリンモノカプリレート、グリセリンモノミリステート 、グリセリンモノステアレート等のグリセリン脂肪酸エステル；デカグリセリルモノステア レート、デカグリセリルジステアレート、デカグリセリルモノリノレート等のポリグリセリン 脂肪酸エステル；ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート、ポリオキシエチレンソ ノレビタンモノォレエート、ポリオキシエチレンソルビタンモノステアレート、ポリオキシェ チレンソルビタンモノパルミテート、ポリオキシエチレンソルビタントリオレエート、ポリ
ステル；ポリオキシエチレンソルビットテトラステアレート、ポリオキシエチレンソルビット テトラオレエート等のポリオキシエチレンソルビット脂肪酸エステル；ポリオキシェチレ ングリセリルモノステアレート等のポリオキシエチレングリセリン脂肪酸エステル；ポリエ チレングリコールジステアレート等のポリエチレングリコール脂肪酸エステル；ポリオキ シエチレンラウリルエーテル等のポリオキシエチレンアルキルエーテル；ポリオキシェ チレンポリオキシプロピレングリコール、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンプロ ピルエーテル、ポリオキシエチレンポリオキシプロピレンセチルエーテル等のポリオキ シエチレンポリオキシプロピレンアルキルエーテノレ；ポリオキシエチレンノニルフエ二 ノレエーテル等のポリオキシエチレンアルキルフエニルエーテル；ポリオキシエチレンヒ マシ油、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油（ポリオキシエチレン水素ヒマシ油）等のポリ ォキシエチレン硬化ヒマシ油；ポリオキシエチレンソルビットミツロウ等のポリオキシェ チレンミツロウ誘導体；ポリオキシエチレンラノリン等のポリオキシエチレンラノリン誘導 体；ポリオキシエチレンステアリン酸アミド等のポリオキシエチレン脂肪酸アミド等の H LB6〜： 18を有するもの、等を典型的例として挙げることができる。
また、界面活性剤としては陰イオン界面活性剤も挙げることができ、例えばセチル 硫酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ォレイル硫酸ナトリウム等の炭素原子数 10〜 18のアルキル基を有するアルキル硫酸塩;ポリオキシエチレンラウリル硫酸ナトリウム 等の、エチレンォキシドの平均付加モル数が 2〜4でアルキル基の炭素原子数が 10 〜 18であるポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩；ラウリルスルホコハク酸エス テノレナトリウム等の、アルキル基の炭素原子数が 8〜 18のアルキルスルホコハク酸ェ ステル塩；天然系の界面活性剤、例えばレシチン、グリセ口リン脂質;スフインゴミエリ ン等のスフインゴリン脂質;炭素原子数 12〜： 18の脂肪酸のショ糖脂肪酸エステル等 を典型的例として挙げることができる。 [0063] 本発明の薬剤には、これらの界面活性剤の 1種または 2種以上を組み合わせて添 加することができる。本発明の製剤で使用する好ましい界面活性剤は、ポリソルベー ト 20, 40, 60又は 80などのポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステルであり、ポリ ソルベート 20及び 80が特に好ましレ、。また、ポロキサマー（プル口ニック F_ 68 (登録 商標）など）に代表されるポリオキシエチレンポリオキシプロピレングリコールも好まし レ、。
界面活性剤の添力卩量は使用する界面活性剤の種類により異なる力 ポリソルベート 20又はポリソルベート 80の場合では、一般には 0.001〜100mg/mLであり、好ましくは 0.003〜50mg/mLであり、さらに好ましくは 0.005〜2mg/mLである。
[0064] 本発明において緩衝剤としては、リン酸、クェン酸緩衝液、酢酸、リンゴ酸、酒石酸 、コハク酸、乳酸、リン酸カリウム、ダルコン酸、力プリル酸、デォキシコール酸、サリチ ル酸、トリエタノールァミン、フマル酸等 他の有機酸等、あるいは、炭酸緩衝液、トリ ス緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液等を挙げることが出来る。
また溶液製剤の分野で公知の水性緩衝液に溶解することによって溶液製剤を調製 してもよレ、。緩衝液の濃度は一般には l〜500mMであり、好ましくは 5〜100mMであり 、さらに好ましくは 10〜20mMである。
また、本発明の薬剤は、その他の低分子量のポリペプチド、血清アルブミン、ゼラチ ンゃ免疫グロブリン等の蛋白質、アミノ酸、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物、糖ァ ルコールを含んでレ、てもよレ、。
[0065] 本発明においてアミノ酸としては、塩基性アミノ酸、例えばアルギニン、リジン、ヒス チジン、オル二チン等、またはこれらのアミノ酸の無機塩 (好ましくは、塩酸塩、リン酸 塩の形、すなわちリン酸アミノ酸）を挙げることが出来る。遊離アミノ酸が使用される場 合、好ましい pH値は、適当な生理的に許容される緩衝物質、例えば無機酸、特に塩 酸、リン酸、硫酸、酢酸、蟻酸又はこれらの塩の添カ卩により調整される。この場合、リン 酸塩の使用は、特に安定な凍結乾燥物が得られる点で特に有利である。調製物が 有機酸、例えばリンゴ酸、酒石酸、クェン酸、コハク酸、フマル酸等を実質的に含有し ない場合あるいは対応する陰イオン (リンゴ酸イオン、酒石酸イオン、クェン酸イオン、 コハク酸イオン、フマル酸イオン等）が存在しない場合に、特に有利である。好ましレヽ アミノ酸はアルギニン、リジン、ヒスチジン、またはオル二チンである。さらに、酸性アミ ノ酸、例えばグノレタミン酸及びァスパラギン酸、及びその塩の形（好ましくはナトリウム 塩）あるいは中性アミノ酸、例えばイソロイシン、ロイシン、グリシン、セリン、スレオニン 、バリン、メチォニン、システィン、またはァラニン、あるいは芳香族アミノ酸、例えばフ ヱ二ルァラニン、チロシン、トリプトファン、または誘導体の N-ァセチルトリプトファンを 使用することちできる。
[0066] 本発明において、多糖及び単糖等の糖類や炭水化物としては、例えばデキストラン 、グノレコース、フラクトース、ラタトース、キシロース、マンノース、マノレトース、スクロー ス， トレハロース、ラフイノース等を挙げること力 Sできる。
本発明において、糖アルコールとしては、例えばマンニトール、ソルビトール、イノシ トール等を挙げることができる。
[0067] 本発明の薬剤を注射用の水溶液とする場合には、例えば生理食塩水、ブドウ糖や その他の補助薬（例えば、 D-ソノレビトーノレ、 D-マンノース、 D-マンニトール、塩化ナト リウム）を含む等張液と混合することができる。また、該水溶液は適当な溶解補助剤（ 例えばアルコーノレ (エタノール等)、ポリアルコール (プロピレングリコール、 PEG等)、非 イオン性界面活性剤 (ポリソルベート 80、 HCO-50)等）と併用してもよい。
所望によりさらに希釈剤、溶解補助剤、 pH調整剤、無痛化剤、含硫還元剤、酸化 防止剤等を含有してもよい。
[0068] 本発明において、含硫還元剤としては、例えば、 N—ァセチルシスティン、 N—ァセ チルホモシスティン、チォタト酸、チォジグリコール、チォエタノールァミン、チォグリ セロール、チォソルビトール、チォグリコール酸及びその塩、チォ硫酸ナトリウム、グ ルタチオン、並びに炭素原子数 1〜7のチオアルカン酸等のスルフヒドリル基を有す るもの等を挙げること力 Sできる。
また、本発明において酸化防止剤としては、例えば、エリソルビン酸、ジブチルヒド ロキシトルエン、ブチノレヒドロキシァニソーノレ、 ひ一トコフェローノレ、酢酸トコフェローノレ 、 L—ァスコルビン酸及びその塩、 L—ァスコルビン酸パルミテート、 L—ァスコルビン 酸ステアレート、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、没食子酸トリァミル、没食 子酸プロピルあるいはエチレンジァミン四酢酸ニナトリウム（EDTA)、ピロリン酸ナトリ ゥム、メタリン酸ナトリウム等のキレート剤を挙げることが出来る。
[0069] また、必要に応じ、マイクロカプセル (ヒドロキシメチルセルロース、ゼラチン、ポリ [メ チルメタクリル酸]等のマイクロカプセル)に封入したり、コロイドドラッグデリバリーシス テム (リボソーム、アルブミンミクロスフエア、マイクロエマルジヨン、ナノ粒子及びナノ力 プでノレ等)とすることもできる ( Remington s Pharmaceutical Science 1り edition , 〇sl o Ed., 1980等参照)。さらに、薬剤を徐放性の薬剤とする方法も公知であり、本発明 に適用し得る (Langer et al.， J.Biomed.Mater.Res. 1981， 15: 167-277; Langer, Chem . Tech. 1982, 12: 98-105;米国特許第 3,773,919号;欧州特許出願公開 (EP)第 58,481 号； Sidman et al., Biopolymers 1983， 22: 547_556;EP第 133,988号)。
使用される製剤上許容しうる担体は、剤型に応じて上記の中力 適宜あるいは組合 せて選択されるが、これらに限定されるものではない。
[0070] 本発明は、 IL-6阻害剤を、対象に投与する工程を含む、対象において筋肉の再生 を促進させる方法に関する。
本発明において「対象」としては、筋肉の萎縮を起こしている生物体、筋肉に損傷を 受けた生物体、またはこれらの生物体の体内の一部分を挙げることが出来る。生物 体は、特に限定されるものではないが、動物（例えば、ヒト、家畜動物種、野生動物） を含む。また、「生物体の体内の一部分」については特に限定されないが、好ましくは 筋肉組織、より好ましくは骨格筋または骨格筋の周辺部位を挙げることが出来る。
[0071] 本発明において、「投与する」とは、経口的、あるいは非経口的に投与することが含 まれる。経口的な投与としては、経口剤という形での投与を挙げることができ、経口剤 としては、顆粒剤、散剤、錠剤、カプセル剤、溶剤、乳剤、あるいは懸濁剤等の剤型 を選択すること力 Sできる。
非経口的な投与としては、注射剤という形での投与を挙げることができ、注射剤とし ては、点滴などの静脈注射、皮下注射剤、筋肉注射剤、あるいは腹腔内注射剤等を 挙げることができる。また、投与すべきオリゴヌクレオチドを含む遺伝子を遺伝子治療 の手法を用いて生体に導入することにより、本発明の方法の効果を達成することがで きる。また、本発明の薬剤を、処置を施したい領域に局所的に投与することもできる。 例えば、手術中の局所注入、カテーテルの使用、または本発明の阻害剤をコードす る DNAの標的化遺伝子送達により投与することも可能である。公知の筋再生治療法 と同時に又は時間を隔てて本発明の薬剤が投与されてもよい。
なお本明細書において引用されたすベての先行技術文献は、参照として本明細書 に組み入れられる。
実施例
[0072] 以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に 制限されるものではない。
〔実施例 1〕
宇宙環境への曝露中に免疫機構が低下調節されることは、宇宙飛行士にとって深 亥 IJな問題である。 IL-6シグナル経路の阻害による、筋肉細胞成長への効果を検討す るために、 MR16-1 (抗マウス IL-6受容体モノクローナル抗体）を、 15, 150 ng/ml, 1.5, 15， 150 μ g/ml phosphate-buffered saline (PBS)の濃度で含有する分化培地中で C 2C12細胞を培養した。対照となる細胞は、 MR16-1抜きの培地で培養した。
培養 3日後に、半数の細胞を 10%のホルマリンにより固定化し、筋再生に関与する タンパク質： MyoD、ミオゲニン（myogenin)、ミオゲニン調節因子タンパク質（the myog enic regulatory factor proteins)、およびミオシン（myosin)重鎖を免疫組織化学的に 検出した。残りの細胞を l% tritonを含む溶解バッファーに溶かし、筋肉分化マーカー である M—カドヘリン（cadherin)、蛍光体 _p38および MyoDのの発現を、ウェスタンブ ロット分析により確認した。
[0073] その結果、 C2C12細胞の増殖は MR16-1の添加により抑制された。一方、 150 ng/ml 以上の濃度の MR16-1により細胞を処理した場合、 PBSにより処理した細胞と比較し て、 MyoD、ミオゲニン、ミオゲニン調節因子タンパク質、およびミオシン重鎖を発現す る C2C12細胞のパーセント分布は増加した。さらに、筋肉分化マーカーである M—力 ドヘリンおよび蛍光体- p38、さらに MyoDの発現レベルは MR16-1処理を行った細胞 において増加した（図 1)。これらの結果より、免疫系が IL-6シグナル経路を介して、 筋肉繊維の発達および/または成長に重要な役割を果たしていることが明らかとな つに。
[0074] 〔実施例 2〕 次に、雄マウス (C57BL/6J Jcl)において、 MR16-1を添加することにより、負荷または 非負荷に対するヒラメ筋の腱力 腱の全単一筋繊維における衛星細胞の特性に、ど のような変化が現れるかを検討した。
7日間の後肢懸垂の前、 7日間の再負荷の前それぞれの時期に、 MR16-1または PB Sを 2 mg/mouseの濃度で、マウスに腹腔内（Lp.)注射した。採取した筋を cellbanker ( Nihon Zenyaku)に浸けて- 80°Cに凍結した後、 35°C下で解凍した。その後、 20 M 5 -bromo-2 -deoxyundine (BrdU), 0.2 % type I collagenase, 1 % antibiotics,てれに
10 % new-born calf serumを fDulbecco ' s Modified Eagle' s Medium中 (3o C)で 4時間、コラゲナーゼを消化し、単一筋線維を採取した。これらの筋線維を M -カドヘリ ンまたは BrdU特異的な抗体でインキュベートし、それぞれ fluoresceinまたは rhodamin で蛍光染色した。 FV-300共焦点レーザー顕微鏡 (ォリンパス）を使って、 M-カドヘリ ン陽性〔休止期〕または BrdU陽性 (分裂期)衛星細胞を分析した。
[0075] その結果、 MR16-1処理を行っても、非負荷に関連する筋繊維萎縮および衛星細 胞数の減少に、特異的な効果は現れなかった（図 2)。し力 ながら、再負荷に反応し て分裂活性化した衛星細胞の数は、 MR16-1処理を行うことにより増加した（図 2)。 衛星細胞は筋肉繊維量の調節に重要な役割を果たすことから、 IL-6を阻害するこ とは筋肉再生を促進する一つの手法になり得ることが示唆された。
[0076] 〔実施例 3〕
MR16-1投与による培養で増殖させた衛星細胞を GFPにより標識し、該細胞を損傷 または萎縮筋を有する動物の筋組織または静脈中に注入する。当業者に公知の方 法により、該細胞の投与による、対象動物の筋組織の回復または再生の効果を検討 する。
産業上の利用可能性
[0077] 本発明者らは、重力刺激が無い状態で生じる筋萎縮あるいは廃用性筋萎縮を起こ した筋組織において、 IL-6受容体抗体を用い IL-6を特異的に阻害することで、筋肉 再生を促進させることが出来ることを見出した。すなわち本発明の筋再生促進剤は、 寝たきり状態やギプス固定時の筋萎縮、さらには宇宙旅行で生じる筋萎縮の予防や 再生に適用できるものと思われる。また、筋損傷、関節リウマチなどの慢性炎症性疾 患に伴う筋萎縮や先天性筋疾患の筋の再生にも適用できるものと思われる。 これまで、筋肉再生を促す治療剤は存在していなかった力 本発明の知見により 薬剤により筋再生促進が可能になるものと思われる。

Claims

請求の範囲
[I] IL-6阻害剤を有効成分として含有する、筋再生促進剤。
[2] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の筋再生 促進剤。
[3] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1に記載の 筋再生促進剤。
[4] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の筋再生 促進剤。
[5] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 2 または 3に記載の筋再生促進剤。
[6] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 2または 3に記載の筋再生促進 剤。
[7] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 6に記載 の筋再生促進剤。
[8] 筋再生が、筋萎縮からの筋再生であることを特徴とする請求項：!〜 7のいずれかに記 載の筋再生促進剤。
[9] IL-6阻害剤を対象に投与する工程を含む、対象において筋肉の再生を促進させる 方法。
[10] 対象が筋萎縮を起こしていることを特徴とする、請求項 9に記載の方法。
[II] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9または 10に記載 の方法。
[12] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 9または 10 に記載の方法。
[13] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 11または 12に記載の方法
[14] 抗体がヒ HL-6またはヒ HL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
1または 12に記載の方法。
[15] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 11または 12に記載の方法。
[16] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 15に記載 の方法。
[17] 筋再生促進剤を製造するための、 IL-6阻害剤の使用。
[18] IL-6阻害剤が IL-6を認識する抗体であることを特徴とする請求項 17に記載の使用。
[19] IL-6阻害剤が IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 17に記載の 使用。
[20] 抗体がモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項 18または 19に記載の使用
[21] 抗体がヒト IL-6またはヒト IL-6受容体を認識する抗体であることを特徴とする請求項 1
8または 19に記載の使用。
[22] 抗体が組換え型抗体であることを特徴とする請求項 18または 19に記載の使用。
[23] 抗体がキメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体であることを特徴とする請求項 22に記載 の使用。
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