CN101495146A - 肌肉再生促进剂 - Google Patents

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Abstract

本发明人研究了IL－6信号途径的抑制对肌肉细胞生长的效果。结果，通过给予IL－6抑制剂，可以促进卫星细胞的粘着、增殖、分化，以及该结果可以促进肌肉再生。

Description

肌肉再生促进剂
技术领域
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的肌肉再生促进剂及其应用。
背景技术
已知在微重力环境的宇宙环境中驻留后、长期卧床状态后、或者在绷带固定状态后，椎旁肌和下肢比目鱼肌等会发生肌肉萎缩。骨骼肌的损伤、坏死可通过再生补偿，肌肉萎缩中，肌纤维的坏死无法通过再生补偿。已知骨骼肌肉损伤后的再生过程有卫星细胞被动员。卫星细胞是在骨骼肌内通常以休止状态存在的组织特异性干细胞，在骨骼肌纤维上增殖、分化，与肌纤维融合，促进肌肉再生。但是，生物体内促进卫星细胞的动员、增殖、分化的因子目前尚未得知。
IL-6是被称为B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与B淋巴细胞系细胞的活化有关的分化因子而被发现(非专利文献1)，之后又了解到它是对各种细胞功能有影响的多功能细胞因子(非专利文献2)。有报道称IL-6诱导T淋巴细胞系细胞的成熟(非专利文献3)。
IL-6经由两种蛋白质介导，在细胞上转导其生物学活性。一种是IL-6受体，其是IL-6所结合的、分子量约80kD的配体结合性蛋白质(非专利文献4、5)。IL-6受体除在细胞膜上表达的、跨细胞膜的、膜结合型之外，主要以含有其胞外区域的可溶性IL-6受体的形式存在。
另一种是与非配体结合性的信号转导有关的、分子量约130kD的膜蛋白gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合体，接着与gp130结合，由此，IL-6的生物学活性转导到细胞内(非专利文献6)。
IL-6抑制剂是抑制IL-6的生物学活性转导的物质。目前已知有IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体的部分肽等。
抗IL-6受体抗体已经有多个报道(非专利文献7、8，专利文献1-3)。已知有将其中之一的小鼠抗体PM-1(非专利文献9)的互补决定区(CDR)移植到人抗体中得到的人源化PM-1抗体(专利文献4)。
目前，已知胰岛素样生长因子-I(非专利文献10)或抗肌肉生长抑制素抗体(非专利文献11)显示肌肉萎缩的抑制效果和肌肉再生的促进效果。但是，对于肌肉再生，IL-6等细胞因子是否有影响则目前完全未进行过研究。
本申请的发明相关先行技术文献信息如下所示。
专利文献1：WO 95-09873
专利文献2：FR 2694767
专利文献3：US 5216128
专利文献4：WO 92-19759
非专利文献1：Hirano，T.等人.，Nature(1986)324，73-76
非专利文献2：Akira，S.等人.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78
非专利文献3：Lotz，M.等人.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258
非专利文献4：Taga，T.等人.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981
非专利文献5：Yamasaki，K.等人.，Science(1988)241，825-828
非专利文献6：Taga，T.等人.，Cell(1989)58，573-581
非专利文献7：Novick，D.等人.，Hybridoma(1991)10，137-146
非专利文献8：Huang，Y.W.等人.，Hybridoma(1993)12，621-630
非专利文献9：Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906
非专利文献10：Barton-Davis，E.R.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998)95，15603-15607
非专利文献11：Bogdanovich，S.等人.，Nature(2002)420，418-421
非专利文献12：Dangott B.等人.，Int J.Sports Med.(2000)21，13-16
非专利文献13：Darr KC.和Schultz E.，J.Appl.Physiol.(1989)67，1827-1834
非专利文献14：Garry DJ.等人.，PNAS(2000)97，5416-5421
非专利文献15：Garry DJ.等人.，Dev.Biol.(1997)188，280-294
非专利文献16：Jejurikar SS.等人.，Plast Reconstr Surg(2002)110，160-168
非专利文献17：Mauro A.，J.Biochem Cytol.(1961)9，493-498
非专利文献18：McCormick KM和Schultz E.，Dev.Dyn.(1994)199，52-63
非专利文献19：Moss FP.和Leblond CP.，Anat.Rec.(1971)170，421-435
非专利文献20：Mozdziak PE.等人.，Biotech.Histochem.(1994)69，249-252
非专利文献21：Mozdziak PE.等人.，J.Appl.Physiol.(2000)88，158-164
非专利文献22：Mozdziak PE.等人.，J.Appl.Physiol.(2001)91，183-190
非专利文献23：Mozdziak PE.等人.，Eur.J.Appl.Physiol.Occup.Physiol.(1998)78，136-40
非专利文献24：Schultz E.，Dev.Biol.(1996)175，84-94
非专利文献25：Schultz E.等人.，J.Appl.Physiol.(1994)76，266-270
非专利文献26：Schultz E.等人.，Muscle Nerve.(1985)8，217-222
非专利文献27：Snow MH.，Anat.Rec.(1977)188，181-199
非专利文献28：Snow MH.，Anat.Rec.(1990)227，437-446
非专利文献29：Wang XD.，Am.J.Physiol.Cell Physiol.(2006)290，C981-C989
发明内容
本发明针对上述状况，其目的在于提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的肌肉再生促进剂。
本发明进一步提供促进对象的肌肉再生的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予发生肌肉萎缩的对象的步骤。
本发明人为解决上述课题，对于IL-6信号途径的抑制对肌肉细胞生长的效果进行了研究。
首先，在含有各种浓度MR16-1(抗小鼠IL-6受体单克隆抗体)的分化培养基中培养C2C12细胞，免疫组织化学法检测与肌肉再生相关的蛋白质：MyoD、肌细胞生成蛋白、生肌调节因子蛋白、以及肌球蛋白重链。进一步通过蛋白质印迹分析确认肌肉分化标志M-钙黏着蛋白、荧光体-p38和MyoD的表达。
结果表明，添加MR16-1使C2C12细胞的增殖受到抑制，表达MyoD、肌细胞生成蛋白、生肌调节因子蛋白、以及肌球蛋白重链的C2C12细胞的百分比分布增加。并且，在进行了MR16-1处理的细胞中M-钙黏着蛋白和荧光体-p38以及MyoD的表达水平增加。由该结果可知，免疫系统经由IL-6信号途径介导，对于肌肉纤维的发育和/或生长发挥了重要作用。
接着，在雄性小鼠(C57BL/6KJ Jcl)中，通过添加MR16-1，研究负载(負荷)或非负载(非負荷)的比目鱼肌完整单肌纤维中卫星细胞的反应发生了怎样的变化。
结果表明，进行MR16-1处理，对于非负载中的纤维萎缩和卫星细胞数目的减少并未表现特异性效果。但是对再负载(再負荷)的反应，增殖活化的卫星细胞的数目因进行MR16-1处理而增加。卫星细胞对于肌纤维量的调节发挥重要作用，由此显示抑制IL-6是促进肌肉再生的一个方法。
即，本发明人发现：通过给予IL-6抑制剂，可以促进卫星细胞的粘附、增殖、分化，继而可以促进肌肉再生或肌纤维的肥大，由此完成了本发明。
本发明更具体地提供以下[1]-[23]。
[1]肌肉再生促进剂，该肌肉再生促进剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
[2][1]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[3][1]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[4][2]或[3]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
[5][2]或[3]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[6][2]或[3]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是重组型抗体。
[7][6]所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[8][1]-[7]中任一项所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：肌肉再生是源于肌肉萎缩的肌肉再生。
[9]促进对象中肌肉再生的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
[10][9]所述的方法，其特征在于：对象发生肌肉萎缩。
[11][9]或[10]所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[12][9]或[10]所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[13][11]或[12]所述的方法，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
[14][11]或[12]所述的方法，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[15][11]或[12]所述的方法，其特征在于：抗体是重组型抗体。
[16][15]所述的方法，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[17]IL-6抑制剂在制备肌肉再生促进剂中的应用。
[18][17]中所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
[19][17]中所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
[20][18]或[19]所述的应用，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
[21][18]或[19]所述的应用，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[22][18]或[19]所述的应用，其特征在于：抗体是重组型抗体。
[23][22]所述的应用，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
附图简述
图1是表示通过蛋白质印迹法确认C2C12细胞中蛋白质表达的结果的照片。研究添加MR16-1对于在含有2％马血清的分化培养基中培养3天的C2C12细胞生长的效果。
图2A是表示添加MR16-1对于负载或非负载的雄性小鼠(C57BL/6J Jcl)的比目鱼肌的完整单肌纤维中的卫星细胞特性的效果图。图2A是各组的由肌腱到肌腱的肌纤维中全部BrdU阳性(分裂活化)卫星细胞数目的图。以下图2的整个图中，各符号表示以下状态的组。Pre：后肢悬垂前的组，C：不同年龄对照组，CMR：对不同年龄对照组进行MR16-1处理的组，S：后肢悬垂组，SMR：对后肢悬垂进行MR16-1处理的组。以下图2的整个图中，以R+0表示的四个组中为7天非负载或在刚完成笼内饲养的组，R+7表示的四个组是再负载7天后的组。以下图2的整个图中，数据均为平均±SEM。*和
Figure A20078002097400091
表示P＜0.05，是Pre和C、R+0中的S和SMR的比较。
图2B是表示各组由肌腱到肌腱的肌纤维中全部M-钙黏着蛋白阳性(休止)卫星细胞数的图。
图2C是表示各组由肌腱到肌腱的肌纤维中总卫星细胞数的图。
图2D是表示BrdU阳性(分裂活化)卫星细胞/卫星细胞的值(％)的图。
实施发明的最佳方式
本发明人发现：通过给予抗IL-6受体抗体，可以促进肌肉的再生。本发明根据该认识完成。
本发明涉及肌肉再生促进剂，该肌肉再生促进剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
本发明中，“IL-6抑制剂”是指阻断IL-6的信号转导、抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6抑制剂优选对与IL-6、IL-6受体和gp130其中任意结合具有抑制作用的物质。
本发明的IL-6抑制剂例如有：抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp 130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体或IL-6或IL-6受体的部分肽、以及显示与它们同样的活性的低分子物质，但并不限于此。本发明的IL-6抑制剂优选，如识别IL-6受体的抗体。
本发明的抗体的由来没有特别限定，优选来自哺乳动物，更优选来自人的抗体。
本发明中使用的抗IL-6抗体可以采用公知方法，以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明使用的抗IL-6抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体有：在杂交瘤中生成的；以及在通过基因工程的方法，用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的。该抗体通过与IL-6结合，可以抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内转导。
上述抗体有MH166(Matsuda，T.等人.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)或SK2抗体(Sato，K.等人.，第21回日本免疫学会总会，学术记录(1991)21，166)等。
生成抗IL-6抗体的杂交瘤基本可采用公知技术，如下制备。即，使用IL-6作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，通过通常的细胞融合法使所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体生成细胞。
具体来说，制备抗IL-6抗体可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的人IL-6通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550；J.Immunol.(1988)140，1534-1541；或Agr.Biol，Chem.(1990)54，2685-2688所示的IL-6基因/氨基酸序列获得。
将IL-6的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞，然后从该宿主细胞中或者由培养上清中按照公知方法纯化目标IL-6蛋白质，使用该纯化IL-6蛋白质作为致敏抗原。还可以使用IL-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。
本发明中使用的抗IL-6受体抗体可使用公知方法、以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明使用的抗IL-6受体抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体可以是在杂交瘤中生成的；以及在通过基因工程的方法、用含有抗体基因的表达载体转化的宿主细胞中生成的。该抗体与IL-6受体结合，由此可以抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性在细胞内的转导。
上述抗体有：MR16-1抗体(Tamura，T等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(WO92/19759)。其中，人IL-6受体的优选的单克隆抗体有PM-1抗体，小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体有MR16-1抗体。
生成抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤可使用公知的技术如下制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法免疫，通过常规细胞融合法将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过通常的筛选法筛选生成单克隆抗体的细胞。
具体来说，制备抗IL-6受体抗体可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的人IL-6受体通过使用欧洲专利申请EP 325474中、小鼠IL-6受体通过使用日本专利申请特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列获得。
IL-6受体蛋白有在细胞膜上表达的和脱离细胞膜的(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人.，J.Biochem.(1990)108，673-676)两种。可溶性IL-6受体由与细胞膜结合的IL-6受体的实质上的胞外区构成，跨细胞膜区、或者跨细胞膜区域与胞内区缺失，因此与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白只要是可用作制备本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原即可，可以使用任何IL-6受体。
将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知方法，从该宿主细胞中、或培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，可以使用该纯化IL-6受体蛋白作为致敏抗原。也可以使用表达IL-6受体的细胞、或IL-6受体蛋白与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。
本发明中使用的抗gp130抗体可以使用公知的方法，以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明中使用的抗gp130抗体特别优选来自动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体可以是在杂交瘤中生成的；以及在通过基因工程的方法、用含有抗体基因的表达载体转化的宿主细胞中生成的。该抗体与gp130结合，由此可以抑制IL-6/IL-6受体复合体与gp130的结合，阻断IL-6的生物学活性在细胞内的转导。
上述抗体有AM64抗体(日本特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US5571513)、B-S12抗体和B-P8抗体(日本特开平8-291199)等。
生成抗gp130单克隆抗体的杂交瘤基本上可使用公知技术如下制备。即，使用gp130作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法免疫，通过常规细胞融合法将所得免疫细胞与公知的亲本细胞融合，通过通常的筛选法筛选生成单克隆抗体的细胞。
具体来说，制备单克隆抗体可如下进行。例如，作为获得抗体的致敏抗原使用的gp130通过使用欧洲专利申请EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列获得。
将gp130的基因序列插入到公知的表达载体系统中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知方法，从该宿主细胞中、或培养上清中纯化目标gp130蛋白，可以使用该纯化gp130蛋白作为致敏抗原。也可以使用表达gp130的细胞或gp130蛋白与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。
用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，考虑到与细胞融合中使用的亲本细胞的相容性，通常可使用啮齿类动物例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
将致敏抗原免疫动物时，可按照公知的方法进行。例如常规方法是将致敏抗原进行哺乳动物的腹腔内或皮下注射。具体来说，优选将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲液)或生理盐水等稀释为适当量，根据需要，将悬浮物与通常的佐剂，例如弗氏完全佐剂适量混合，乳化后每隔4-21天多次给予哺乳动物。致敏抗原免疫时可使用适当的载体。
进行上述免疫并确认血清中所需抗体水平升高，然后从哺乳动物中取出免疫细胞，进行细胞融合。优选用免疫细胞进行细胞融合，特别优选脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另一方亲本细胞的哺乳动物骨髓瘤细胞可适当使用已经公知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.et al.J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology andImmunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.et al.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.et al.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.et al.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.et al.，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可按照公知的方法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46)等进行。
更具体地说，上述细胞融合，例如在细胞融合促进剂的存在下、在常规营养培养液中实施。融合促进剂，例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，根据需要，为了进一步提高融合效率可以添加二甲基亚砜等助剂使用。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如优选免疫细胞相对于骨髓瘤细胞为1-10倍。上述细胞融合中使用的培养液，例如可使用适合上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、除此之外还可以使用该种细胞培养中所使用的常规培养液，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补液。
细胞融合可以将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，通常以30-60％(w/v)的浓度添加预先加温至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量1000-6000左右的PEG溶液，通过混合形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加适当的培养液，将离心除去上清的操作反复进行，由此可以除去杂交瘤生长所不优选的细胞融合剂等。
该杂交瘤通常在选择培养液，例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液)中培养，由此进行选择。该HAT培养液中的培养可以持续至目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡所需的足够的时间、通常为数天-数周进行。接着，实施通常的有限稀释法，进行生产目标抗体的杂交瘤的筛选和克隆。
用抗原免疫人以外的动物，获得上述杂交瘤，除此之外可以将人淋巴细胞在体外用所需抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏，将致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞，例如U266融合，可以获得与所需抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所需人抗体(参照日本特公平1-59878)。并且，对具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物给予抗原或抗原表达细胞，可按照上述方法获得所需人抗体(参照国际专利WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。
上述制备的生成单克隆抗体的杂交瘤可在通常的培养液中继代培养，也可以在液氮中长期保存。
由该杂交瘤获得单克隆抗体时，可采用以下方法：按照通常的方法培养该杂交瘤，获得其培养上清的方法；或者将该杂交瘤给予与其具有相容性的哺乳动物，使其增殖，以其腹水的形式获得的方法等。前者的方法适合获得高纯度的抗体，而后者的方法适合于抗体的大量生产。
例如，生成抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备可按照日本特开平3-139293中公开的方法进行。可按照以下方法进行：将生成PM-1抗体的杂交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔内，获得腹水，由该腹水纯化PM-1抗体的方法；或者将该杂交瘤在适当的培养基、例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制备)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制备)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制备)等中培养，由该培养上清纯化PM-1抗体的方法。
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用从杂交瘤中克隆抗体基因，整合到适当的载体中，将其导入宿主，采用基因重组技术进行生产的重组型抗体(例如参照Borrebaeck C.A.K和Larrick J.W.THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES，Published in theUnited Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。
具体来说，从生成目标抗体的细胞、例如杂交瘤中分离编码抗体可变(V)区的mRNA。mRNA的分离可按照公知的方法，例如胍超离心法(Vhirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制备)等制备mRNA。还可以使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制备)，直接制备mRNA。
使用反转录酶，由所得mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可使用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒等进行。进行cDNA的合成和扩增时，可采用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制备)和使用PCR的5′-RACE法(Froman，M.A.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。由所得PCR产物纯化目标DNA片段，与载体DNA连接。并且，由此制备重组载体，导入到大肠杆菌等中，选择集落，制备所需重组载体。可按照公知的方法例如脱氧法确认目标DNA的碱基序列。
如果要可获得编码目标抗体V区的DNA，则可以将其与编码所需抗体恒定区(C)区的DNA连接，将其整合到表达载体中。或者将编码抗体V区的DNA整合到含有抗体C区的DNA的表达载体中。
为了制备本发明中使用的抗体，可以如后所述：将抗体基因整合到表达载体，使其在表达控制区、例如增强子、启动子的控制下表达。接着，通过该表达载体转化宿主细胞，可使抗体表达。
本发明中，还可以使用为了降低对人的异种抗原性等而进行人工变异的基因重组型抗体，例如嵌合抗体、人源化抗体、人抗体。这些变异抗体可采用已知的方法制备。
嵌合抗体可如下获得：如上所述，将得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入到宿主中进行生产(参照欧洲专利申请EP 125023、国际专利申请WO92-19759)。采用该已知方法可以获得对本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称为重构人抗体或人化抗体，是将人以外的哺乳动物，例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区所得，其通常的基因重组方法也是已知的(参照欧洲专利申请EP 125023，国际专利申请WO92-19759)。
具体如下获得：通过PCR法，由制备成末端具有重叠部分的多个寡核苷酸合成设计为小鼠抗体的CDR与人抗体的框架区(FR)连接而成的DNA序列。将所得DNA与编码人抗体C区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入宿主(参照欧洲专利申请EP 239400、国际专利申请WO92-19759)。
选用经由CDR连接的人抗体的FR，由此可形成良好的抗原结合部位。可以根据需要置换抗体可变区的框架区的氨基酸，使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位。
嵌合抗体、人源化抗体可以使用人抗体C区。人抗体C区有Cγ，例如可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。另外，为了改善抗体或其生产的稳定性，可以修饰人抗体C区。
嵌合抗体含有来自人以外的哺乳动物的抗体可变区和来自人抗体的C区，人源化抗体含有来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区和来自人抗体的框架区以及C区，两者均使得其在人体内的抗原性降低，因此可用作本发明中使用的抗体。
本发明中使用的人源化抗体的优选的具体例子有人源化PM-1抗体(参照国际专利申请WO92-19759)。
人抗体的获得方法除之前所述的方法之外，还已知有使用人抗体文库、通过淘选获得人抗体的技术。例如可以以人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。如果分析所选择的噬菌体的基因，则可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果了解了与抗原结合的scFv的DNA序列，则可以制备含有该序列的适当的表达载体，可以获得人抗体。这些方法是周知的，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438、WO95/15388。
上述构建的抗体基因可通过公知的方法表达。使用哺乳类细胞时，可以通过常用的有用的启动子、要表达的抗体基因、在其3′一侧下游功能性结合polyA信号的DNA、或者含有该DNA的载体来表达。例如启动子/增强子有：人巨细胞病毒早期启动子/增强子。
除此之外，可在本发明中使用的、用于抗体表达的启动子/增强子可使用反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等病毒启动子/增强子，或者人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如使用SV40启动子/增强子时，可按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人.，Nature(1979)277，108-114)容易地实施，而使用HEF1α启动子/增强子时，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.和Nagata，S.Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)容易地实施。
为大肠杆菌时，可以功能性结合常用的有用启动子、用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因进行表达。例如启动子有：lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人.，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等人.，FASEB J.(1992)6，2422-2427)；使用araB启动子时可以按照Better等人的方法(Better，M.等人.Science(1988)240，1041-1043)进行。
作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中生成时，可使用pel B信号序列(Lei，S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。将在周质中生成的抗体进行分离后，可以使抗体的结构适当再折叠使用(例如参照WO96/30394)。
作为复制起点，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的起点，并且，为了在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志。
为了制备在本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产体系。用于抗体制备的生产体系有体外和体内的生产体系。体外的生产体系有使用真核细胞的生产体系和使用原核细胞的生产体系。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的生产体系。动物细胞已知有来自(1)哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾细胞)、HeLa、Vero等，(2)两栖类细胞、例如非洲爪蟾卵细胞，或(3)昆虫细胞例如sf9、sf21、Tn5等。植物细胞已知有来自烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可将其进行愈伤组织培养。真菌细胞已知有酵母，例如糖酵母属(Saccharomyces)，例如酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)；丝状菌例如曲霉属(Aspergillus)，例如黑曲霉(Aspergillus niger)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产体系。细菌细胞已知有大肠杆菌、枯草杆菌。
通过转化，将目标抗体基因导入到这些细胞中，将转化了的细胞在体外培养，可以得到抗体。培养可按照公知的方法进行。例如培养液可使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以结合胎牛血清(FCS)等血清补液使用。导入了抗体基因的细胞移入动物的腹腔等，由此可在体内生产抗体。
体内生产体系有：使用动物的生产体系或使用植物的生产体系。使用动物时，有使用哺乳类动物、昆虫的生产体系等。
哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications(1993))。昆虫可以使用蚕。使用植物时，可以使用烟草。
向这些动物或植物中导入抗体基因，在动物或植物的体内生产抗体，回收。例如将抗体基因插入到编码如山羊β酪蛋白等生产乳汁中特有的蛋白质的基因中间，制成融合基因。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊的胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。从接受了胚胎的山羊所生产的转基因山羊、或其子代所生产的乳汁中可以获得所需抗体。为了使含有由转基因山羊生产的抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊使用激素(Ebert，K.M.等人.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
使用蚕时，将插入了目标抗体基因的杆状病毒感染蚕，从蚕的体液中获得所需抗体(Maeda，S等人.，Nature(1985)315：592-594)。使用烟草时，将目标抗体基因插入到植物表达用的载体例如pMON 530中，将该载体导入到根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等的细菌中。将该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)，可由该烟叶获得所需抗体(Julian，K.-C.Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24：131-138)。
如上所述，通过体外或体内生产体系生产抗体时，可以将编码抗体重链(H)链或轻链(L)链的DNA分别整合到表达载体中，同时转化宿主，或者将编码H链和L链的DNA整合到同一的表达载体中，转化宿主(参照国际专利申请WO94/11523)。
本发明中使用的抗体只要适合本发明即可，可以是抗体片段或其修饰体。例如抗体的片段有Fab、F(ab’)2、Fv或者将H链和L链的Fv用适当的接头连接而成的单链Fv(scFv)。
具体来说，将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶处理，生成抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入到表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.et al.，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.& Horwitz，A.H.，Methods inEnzymology(1989)178，497-515；Plueckthun，A.& Skerra，A.，Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.et al.，Methods inEnzymology(1989)121，663-66；Bird，R.E.et al.，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可通过将抗体的H链V区和L链V区连接获得。该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85：5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自上述抗体中所记载的任意一种。连接V区的肽接头例如可使用含有12-19个氨基酸残基的任意的单链肽。
编码scFv的DNA可如下获得：以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码L链或L链V区的DNA为模板，用定义其两端的引物对，通过PCR法扩增这些序列中编码所需氨基酸序列的DNA部分，然后进一步将编码肽接头部分的DNA及其两端定义为与各H链、L链连接的引物对组合，进行扩增。
如果制备编码scFv的DNA，则可以按照常规方法获得含有它们的表达载体、以及由该表达载体转化的宿主，还可以使用该宿主，按照常规方法获得scFv。
这些抗体的片段可以与上述同样地获得基因、使其表达，通过宿主生成。本发明中所述的“抗体”也包含这些抗体的片段。
抗体的修饰物可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合得到的抗体。本发明中所述的“抗体”中也包含这些抗体修饰物。为了获得上述抗体修饰物，可通过对所得抗体实施化学修饰获得。这些方法在该领域中已经建立。
如上所述，生产并表达的抗体可以从细胞内外、宿主中分离并可纯化至均一。本发明中使用的抗体的分离、纯化可通过亲和层析进行。亲和层析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的载体例如有HyperD、POROS、Sepharose F.F.等。除此之外，也可以采用通常对蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。
例如，通过将上述亲和层析以外的层析、过滤、超滤、盐析、透析等适当选择并组合，可以分离并纯化本发明中使用的抗体。层析例如有离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。这些层析可适用于HPLC(高效液相色谱)。也可使用反相HPLC。
上述得到的抗体的浓度测定可通过吸光度的测定或ELISA等进行。即，通过吸光度测定时，用PBS(-)适当稀释，然后测定280nm的吸光度，以1mg/mL为1.35OD进行计算。通过ELISA测定时，可如下测定。即，将用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释为1μg/mL的100μL山羊抗人IgG(TAG制备)加入到96孔板(Nunc制备)中，在4℃下温育过夜，固定抗体。封闭后，添加100μL适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或者作为标准品的人IgG(CAPPEL制备)，在室温下温育1小时。
清洗后，加入100μL稀释为5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIO SOURCE制备)，在室温下温育1小时。洗涤后加入底物溶液，温育，使用微量板读板仪Model 3550(Bio-Rad制造)测定405nm的吸光度，计算目标抗体浓度。
本发明中使用的IL-6变异体具有与IL-6受体具有结合活性、且不转导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6变异体和IL-6受体与IL-6竞争性结合，不转导IL-6的生物学活性，因此可以阻断IL-6的信号转导。
IL-6变异体通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基来导入突变制备。作为IL-6变异体的基础的IL-6无论其来由均可，如果考虑抗原性等，则优选人IL-6。
具体来说，使用公知的分子建模程序例如WHATIF(Vriend等人.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)，预测IL-6的氨基酸序列的二级结构，再评价对要置换的氨基酸残基总体的影响。确定了适当的置换氨基酸残基之后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，通过通常进行的PCR法导入突变，使氨基酸置换，由此可得到编码IL-6变异体的基因。将其根据需要整合到适当的表达载体中，按照上述重组抗体的表达、生产和纯化方法，可以得到IL-6变异体。
IL-6变异体的具体例子在Brakenhoff等人.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93；以及Savino等人.，EMBO J.(1994)13，1357-1367；WO 96-17869中有公开。
本发明中使用的IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽是与各IL-6受体或IL-6具有结合活性、且不转导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽与IL-6受体或IL-6结合，捕捉它们，由此可以特异性抑制IL-6与IL-6受体的结合。结果，由于不转导IL-6的生物学活性，因此可以阻断IL-6的信号转导。
IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽是含有在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中，包含与IL-6和IL-6受体之间的结合的相关区域的一部分或全部氨基酸序列的肽。上述肽通常含有10-80、优选20-50、更优选20-40个的氨基酸残基。
IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽可如下制备：在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中，确定与IL-6和IL-6受体之间的结合相关的区域，根据该确定的区域的一部分或全部氨基酸序列，按照通常已知的方法例如基因工程的方法或肽合成法制备。
将IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽通过基因工程方法制备时，可以将编码所需肽的DNA序列整合到表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、生产和纯化方法获得。
将IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽通过肽合成法制备时，可以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。
具体来说，可按照続医薬品の開発第14卷ペプチド合成監修矢島治明廣川書店1991年所述的方法进行。固相合成法可采用以下方法：例如是使要合成的肽的C末端所对应的氨基酸与不溶于有机溶剂的支撑体结合，将α-氨基和支链官能基团用适当的保护基团保护，将保护后的氨基酸按照由C末端向N末端的方向依次进行一个个氨基酸缩合反应，再进行使在树脂上结合的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基团脱离的反应，使上述两种反应交互反复进行，由此使肽链延伸。固相肽合成法根据所使用的保护基团的种类而大致分为Boc法和Fmoc法。
合成上述目标肽后，可以进行脱保护反应和将肽链从支撑体上切断的反应。与肽链进行的切断反应中，在Boc法中，使用氟化氢或三氟甲磺酸，在Fmoc法中通常使用TFA。在Boc法中，例如在氟化氢中、在茴香醚的存在下对上述保护肽树脂进行处理。接着进行保护基团的脱离和从支撑体上切断，回收肽。通过将其冷冻干燥可得到粗制肽。另一方面，在Fmoc法中，例如可在TFA中通过与上述同样的操作进行脱保护反应和肽链从支撑体上切断的反应。
所得粗制肽可采用HPLC进行分离、纯化。在其洗脱时，可使用通常在蛋白质纯化中使用的水-乙腈系溶剂、在最佳条件下进行。分取所得层析的图谱中相应于峰的组分，将其冷冻干燥。对于这样纯化得到的肽组分通过质谱分析的分子量分析、氨基酸组成分析或氨基酸序列分析等鉴定。
IL-6的部分肽或IL-6受体的部分肽的具体例子有：日本特开平2-188600、日本特开平7-324097、日本特开平8-311098和美国专利公报US5210075。
本发明中使用的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的螯合抗体。上述螯合抗体可通过对所得抗体进行化学修饰来获得。抗体的修饰方法在该领域中已经得到建立。本发明中的“抗体”也包含这些螯合抗体。
本发明的IL-6抑制剂可以在促进肌肉再生时使用。
本发明中，“肌肉再生”是指受损伤的肌肉或者萎缩的肌肉恢复成原来状态。肌肉恢复成原来状态是指肌纤维的容积、肌纤维的数目、或肌肉组织的性质(发挥张力、持久性、代谢特性、伸缩性、柔软性)恢复至受损伤前或者肌肉萎缩前的数值、状态。本发明中，“肌肉萎缩”的优选例子有：在无重力刺激的状态下产生的肌肉萎缩、废用性肌肉萎缩(不使用肌肉导致的肌肉萎缩)、类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病所伴随的肌肉萎缩、先天性肌肉疾病中的肌肉萎缩，但并不限于此。
本发明中，“肌肉、肌肉组织”对其种类并没有特别限定，可以是骨骼肌细胞、心肌细胞、平滑肌细胞、肌上皮细胞的任意一种。
以下对卫星细胞参与的肌肉再生的过程进行说明。可以认为成体肌肉组织中的卫星细胞通常细胞分裂停止、或者是缓慢分裂。骨骼肌等肌肉受损伤，则被激活，开始增殖。增殖后，穿过基底膜的卫星细胞分化为被称为成肌细胞的前体细胞，活跃地进行反复分裂、增殖，同时向损伤部位游走。成肌细胞沿着受损伤的肌纤维中周围的基底膜取向，不久侵入到基底膜的内侧，或者与残留的肌细胞互相细胞融合，形成肌管细胞。肌管细胞的结构进一步成熟，形成成体肌肉组织。
本发明中，“肌肉再生”也可以指通过上述步骤生成成体肌肉组织。
本发明中，“肌肉再生得到促进”是指使上述肌肉再生的进行加快。另外，与肌肉再生相关的卫星细胞的激活得到促进时，也可以视作与肌肉再生得到促进同等。“促进卫星细胞的活化”是指促进卫星细胞的动员、增殖或分化。
本发明中，对肌肉再生是否得到促进的确认可通过测定肌纤维的容积或数目来进行。通过给予本发明的药物，如果肌纤维的容积或数目增加得到促进，则可以视作肌肉再生得到促进。肌纤维的容积或数目的测定可通过公知的方法进行，也可以按照实施例所述的方法进行。
肌肉再生是否得到促进的确认可通过测定激活的卫星细胞的量(肌肉组织中激活的卫星细胞的比例)来进行。通过给予本发明的药物，如果激活的卫星细胞的量增加(肌肉组织中激活的卫星细胞的比例增加)，则可视为肌肉再生得到促进。激活的卫星细胞的量的测定可通过公知方法进行，也可按照实施例所述方法进行。
本发明中使用的IL-6抑制剂对IL-6信号转导的抑制活性可通过通常所采用的方法评价。具体来说，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45、KPMM2)、人Lennert’s T淋巴瘤细胞株KT3或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同时使IL-6抑制剂共存，可由此测定IL-6依赖性细胞对3H-胸苷的摄取。培养IL-6受体表达细胞U266，添加125I标记IL-6，同时加入IL-6抑制剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的、125I标记的IL-6。在上述测定体系中，除存在IL-6抑制剂的组之外，也设置不含有IL-6抑制剂的阴性对照组，将两组所得的结果进行比较，则可以评价IL-6抑制剂对IL-6的抑制活性。
如后述实施例所示，通过给予抗IL-6受体抗体，可见肌肉再生得到促进，因此显示抗IL-6受体抗体等IL-6抑制剂可用作肌肉再生促进剂。
给予本发明的肌肉再生促进剂的对象是哺乳动物，哺乳动物优选为人。
本发明的肌肉再生促进剂可以以药物的形式给予，可以口服或非口服、全身或局部给予。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠、口服性肠溶剂等，可根据患者的年龄、症状选择适当给予方法。给予有效量可在每一次第1kg体重0.01mg-100mg的范围内选择。或者每位患者选择1-1000mg，优选5-50mg的给予量。作为优选的给予量、给予方法，例如为抗IL-6受体抗体时，血液中存在游离抗体的程度的量作为有效给予量，具体例子是1kg每个月(4周)分一次-多次给予0.5mg-40mg，优选1mg-20mg，例如可按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给予日程、通过点滴等静脉内注射、皮下注射等方法给予。给予日程的安排可以一边观察给予后的状态和血液检查值的动向，一边延长给予间隔如2次/周或者1次/2周、1次/3周、1次/4周等地调整。
本发明中，肌肉再生促进剂可以添加防腐剂或稳定剂等制剂可接受的载体。制剂可接受的载体可以是其本身具有上述肌肉再生促进效果的材料，也可以是不具有该肌肉再生促进效果的材料，其是指可以与上述药物一起给予的材料。即使是不具有肌肉再生促进效果的材料，但通过结合使用IL-6抑制剂而具有相乘或相加的效果的材料。
制剂可接受的材料例如有无菌水或生理盐水、稳定剂、赋型剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘结剂等。
本发明中，表面活性剂有非离子表面活性剂，例如典型的化合物有：脱水山梨醇单辛酸酯、脱水山梨醇单月桂酸酯、脱水山梨醇单棕榈酸酯等脱水山梨醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油单油酸酯等多甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯脱水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯氢化蓖麻油等聚氧乙烯氢化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜜蜡等聚氧乙烯蜜蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLD6-18的等。
表面活性剂还可以是阴离子表面活性剂，典型的例子例如有：鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数10-18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等环氧乙烷的平均加成摩尔数为2-4、烷基的碳原子数为10-18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8-18的烷磺基琥珀酸酯盐；天然系表面活性剂例如卵磷脂、甘油基磷脂；鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子数12-18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。
本发明的药物中可以将这些表面活性剂的一种或两种以上组合添加。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂是聚山梨醇20、40、60或80等聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯，特别优选聚山梨醇20和80。还优选以泊洛沙姆(poloxamer，Pluronic F-68(注册商标)等)为代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
表面活性剂的添加量根据所使用的表面活性剂的种类而不同，为聚山梨醇20和聚山梨醇80时，通常为0.001-100mg/mL，优选0.003-50mg/mL，进一步优选0.005-2mg/mL。
本发明中，缓冲剂有磷酸、柠檬酸缓冲液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡糖酸、辛酸、脱氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等其它有机酸等，或者碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。
可以通过溶解于溶液制剂领域中公知的水性缓冲液中来制备溶液制剂。缓冲液的浓度通常为1-500mM，优选5-100mM，进一步优选10-20mM。
本发明的药物还可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质、氨基酸、多糖和单糖等糖类，或碳水化合物、糖醇。
本发明中，氨基酸有碱性氨基酸例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等，或者这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式，即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，优选的pH值可通过添加适当的生理可接受的缓冲物质例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐来调节。此时，使用磷酸盐，特别可以获得稳定的冻干物，因此特别有利。制备物实质上不含有有机酸，例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等时，或者不存在对应的阴离子(例如苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时特别有利。优选的氨基酸有精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。也可以进一步使用酸性氨基酸、例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式(优选钠盐)，或者中性氨基酸例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、或丙氨酸，或者芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物N-乙酰基色氨酸。
本发明中，多糖和单糖等糖类或碳水化合物，例如有葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉籽糖等。
本发明中，糖醇可以使用甘露糖醇、山梨糖醇、肌醇等。
将本发明的药物制成注射用的水溶液时，例如可以与含有生理盐水、葡萄糖或其它辅助试剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇、氯化钠)的等渗液混合。该水溶液还可以结合使用适当的溶解助剂(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇80、HCO-50)等)。
可以根据需要进一步含有稀释剂、溶解助剂、pH调节剂、止痛剂、含硫还原剂、抗氧化剂等。
本发明中，含硫还原剂例如有：N-乙酰基半胱氨酸、N-乙酸基高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫甘油、硫山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽以及碳原子数1-7的硫代链烷酸等具有硫氢基的化合物。
本发明中，抗氧化剂例如有异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
还可以根据需要封入到微胶囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等微胶囊)中，或者制成胶体型药物输送系统(脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米颗粒和纳米胶囊等)(参照“Remington’sPharmaceutical Science 16th edition”，Oslo Ed.，1980等)。并且还已知将药物制成缓释性药物的方法，也可用于本发明(Langer等人.，J.Biomed.Mater.Res.1981，15：167-277；Langer，chem.Tech.1982，12：98-105；美国专利第3773919号；欧洲专利申请公开(EP)第58481号；Sidman等人.，Biopolymers 1983，22：547-556；EP第133988号)。
所使用的制剂可接受的载体可根据剂型从上述中适当或者组合选择，但并不限于此。
本发明还涉及促进对象的肌肉再生的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
本发明中，“对象”有发生肌肉萎缩的生物体、肌肉受到损伤的生物体、或者这些生物体的体内的一部分。生物体没有特别限定，包含动物(例如人、家畜动物、野生动物)。另外，“生物体的体内一部分”没有特别限定，优选肌肉组织，更优选骨骼肌或骨骼肌的周边部位。
本发明中，“给予”包含口服或非口服给予。口服给予有：以口服制剂的形式的给予，口服制剂可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶剂、乳剂或混悬剂等剂型。
非口服给予有：以注射剂的形式的给予，注射剂有点滴等静脉注射、皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。使用基因治疗的方法将含有要给予的寡核苷酸的基因导入到生物体内，可实现本发明的方法的效果。另外，可以将本发明的药物局部给予希望处置的区域。例如，可以是手术中的局部注入、通过导管给予或者通过输送编码本发明的抑制剂的DNA的靶基因来给予。可以与公知的肌肉再生治疗法同时或者间隔时间给予本发明的药物。
本发明中所引用的所有现有技术文献均作为参照援引到本说明书中。
实施例
以下通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限定。
[实施例1]
曝露在宇宙环境中时，免疫机能被调节至低水平，这对于宇航员来说是一个很严峻的问题。为了研究IL-6信号途径的抑制对肌肉细胞生长的效果，在以含有15、150ng/mL、1.5、15、150μg/mL磷酸盐缓冲液(PBS)的浓度的MR16-1(抗小鼠IL-6受体单克隆抗体)的分化培养基中培养C2C12细胞。对照组细胞是在除去MR16-1的培养基中培养。
培养3天后，将半数细胞用10％甲醛固定，免疫组织化学检测肌肉再生相关的蛋白质：MyoD、肌细胞生成蛋白、生肌调节因子蛋白、以及肌球蛋白重链。将其余的细胞溶解于含有1％Triton的溶解缓冲液中，通过蛋白质印迹分析确认作为肌肉分化标志的M-钙黏着蛋白、荧光体-p38和MyoD的表达。
结果，添加MR16-1使C2C12细胞的增殖受到抑制。用150ng/mL以上浓度的MR16-1对细胞进行处理时，与用PBS处理的细胞相比，表达MyoD、肌细胞生成蛋白、生肌调节因子蛋白、以及肌球蛋白重链的C2C12细胞百分比分布增加。并且，在进行了MR16-1处理的细胞中，作为肌肉分化标志的M-钙黏着蛋白和荧光体-p38、以及MyoD的表达水平增加(图1)。由这些结果表明，免疫系统经由IL-6信号途径介导，对于肌肉纤维的发育和/或生长发挥重要作用。
[实施例2]
接着，在雄性小鼠(C57BL/6J Jcl)中，研究添加MR16-1对于负载或非负载下的比目鱼肌由肌腱到肌腱的完整单肌纤维中，卫星细胞的特性出现了怎样的变化。
在后肢悬垂7天之前、7天的再负载之前的时期，以2mg/小鼠的浓度向小鼠腹腔内(i.p.)注射MR16-1或PBS。将采集的肌肉浸泡在Cellbanker(Nihon Zenyaku制备)中，在-80℃下冷冻，然后在35℃下解冻。然后在20μM 5′-溴-2′-脱氧尿苷(BrdU)、0.2％I型胶原酶、1％抗生素、以及含有10％新生牛血清的Dulbecco’s改性Eagle’s培养基中(35℃)培养4小时，用胶原酶消化，采集单肌纤维。将该肌纤维用M-钙黏着蛋白或BrdU特异性抗体进行温育，分别用荧光素或罗丹明进行荧光染色。使用FV-300共焦点激光显微镜(奥林巴斯)，分析M-钙黏着蛋白阳性[休止期]或BrdU阳性(分裂期)卫星细胞。
结果，进行MR16-1处理，对于非负载相关的肌纤维萎缩和卫星细胞数目的减少并未表现特异性的效果(图2)。但是，对再负载的反应，通过进行MR16-1处理后分裂活化的卫星细胞数目增加(图2)。
卫星细胞对于肌纤维量的调节发挥重要效果，由此显示，抑制IL-6可以成为促进肌肉再生的方法。
[实施例3]
将通过给予MR16-1培养而增殖的卫星细胞用GFC标记，将该细胞注入到损伤的、或具有萎缩肌肉的动物的肌肉组织或静脉中。按照本领域所公知的方法研究该细胞的给予对于对象动物的肌肉组织的恢复或再生的效果。
产业实用性
本发明人发现：在无重力刺激状态下发生的肌肉萎缩或发生废用性肌肉萎缩的肌肉组织中，通过使用IL-6受体抗体特异性地抑制IL-6，可以促进肌肉再生。即，本发明的肌肉再生促进剂可适用于在长期卧床状态或绷带固定时的肌肉萎缩、以及宇宙飞行中发生的肌肉萎缩的预防或再生。另外，也可适用于肌损伤、类风湿性关节炎等慢性炎症性疾病所伴随的肌肉萎缩或先天性肌肉疾病的肌肉再生。
目前尚未有促进肌肉再生的治疗药，但根据本发明，可以通过药物促进肌肉再生。

Claims (23)

1.肌肉再生促进剂，该肌肉再生促进剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
2.权利要求1所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
3.权利要求1所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
4.权利要求2或3所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
5.权利要求2或3所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
6.权利要求2或3所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是重组型抗体。
7.权利要求6所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
8.权利要求1-7中任一项所述的肌肉再生促进剂，其特征在于：肌肉再生是源于肌肉萎缩的肌肉再生。
9.促进对象中肌肉再生的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予对象的步骤。
10.权利要求9所述的方法，其特征在于：对象发生肌肉萎缩。
11.权利要求9或10所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
12.权利要求9或10所述的方法，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
13.权利要求11或12所述的方法，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
14.权利要求11或12所述的方法，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
15.权利要求11或12所述的方法，其特征在于：抗体是重组型抗体。
16.权利要求15所述的方法，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
17.IL-6抑制剂在制备肌肉再生促进剂中的应用。
18.权利要求17所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。
19.权利要求17所述的应用，其特征在于：IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。
20.权利要求18或19所述的应用，其特征在于：抗体是单克隆抗体。
21.权利要求18或19所述的应用，其特征在于：抗体是识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
22.权利要求18或19所述的应用，其特征在于：抗体是重组型抗体。
23.权利要求22所述的应用，其特征在于：抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
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