CN101330929B - 胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明人对于抗IL-6受体抗体在抑制胰岛移植中的移植胰岛障碍的效果进行了研究。结果，抗IL-6受体抗体减轻了移植胰岛障碍，改善胰岛存活，纠正受体的高血糖。另外，明确了通过给予本发明的抗IL-6受体抗体，移植后浸润细胞的炎症性细胞因子的生成受到抑制。即，本发明中，本发明人首次发现：通过抗IL-6受体抗体可以抑制胰岛移植时的移植胰岛障碍。

Description

胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂
技术领域
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的胰岛移植中的移植胰岛障碍(移植膵島障害)抑制剂及其应用。 
背景技术
已知胰岛素依赖性糖尿病的成因是由于降血糖激素—胰岛素生成细胞(胰岛β细胞)由于免疫学机理而被选择性破坏，结果，发病后产生高血糖，引起各种障碍。以往的治疗方法是给予(注射)不足的胰岛素制剂，矫正高血糖。但是，胰岛素治疗难以进行严密的血糖控制，时常过量给予，造成对生命有危险的低血糖。另外，糖尿病发病后，糖尿病血管并发症(视网膜病、肾症、神经症等)得以发展，胰岛素注射等以往的治疗方法无法阻止该发展，在治疗上成为重要的问题。在生理上主要是通过胰岛β细胞的调节机理来控制血糖，但是胰岛素依赖型糖尿病中，由于该缺失导致血糖值升降混乱，成为上述临床症状的原因。 
近年来在欧美，作为糖尿病治疗的方法，开始了移植langerhans岛(胰岛)的胰岛移植的临床应用。不采用给予胰岛素的治疗，而尝试移植胰岛素生成细胞。临床胰岛移植的实际操作手法是在局部麻痹下、在超声波引导下经皮经肺穿刺门静脉，留置导管，由该部位向肝内移植供体胰岛。胰岛移植物在门静脉末端存活，分泌胰岛素，调节血糖值。胰岛移植成功时，糖尿病受体恢复正常血糖，无需胰岛素治疗。但是，目前为止临床胰岛移植的成功例子有限，并且对于一名受体需要移植由2～3人的胰脏分离的胰岛。即，移植后立即产生胰岛功能障碍，移植物存活率降低，因此，由1人对1人的移植并不足够，需要有2至3人的供体向1人移植。有些学说认为，移植物只能存活20～30％。该功能障碍的详细情况尚未了解，对于临床胰岛移植的成绩提高来说是极为重要的课题。 
并且，除了以往的从脑死亡供体或心脏停止供体的胰脏中分离的胰岛的移植之外，最近，关于切除健康活体供体的胰脏的一部分，分离纯化胰岛，移植给糖尿病患者的活体胰岛移植也有成功例子的报道。活体胰岛移植中，对供体产生了侵袭或负担，因此，人们希望能够抑制移植 后的移植胰岛障碍，使用更少的供体胰岛即可进行治疗。 
IL-6是B细胞刺激因子2(BSF2)或被称为干扰素β2的细胞因子。IL-6作为与β淋巴细胞系的细胞活化有关的分化因子被发现(非专利文献1)，之后还了解到它是对各种细胞功能具有影响的多功能细胞因子(非专利文献2)。已报道IL-6可诱导T淋巴细胞系细胞的成熟(非专利文献3)。 
IL-6在细胞上经由两种蛋白质传导其生物学活性。一种是IL-6所结合的分子量为约80kD的配体结合性蛋白的IL-6受体(非专利文献4、5)。IL-6受体除了贯通细胞膜、在细胞膜上表达的膜结合型之外，主要还以含有胞外域的可溶性IL-6受体的形式存在。 
另一个是与非配体结合性信号传导有关的、分子量为约130kD的膜蛋白gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合物，接着与gp130结合，由此，IL-6的生物学活性在细胞内传导(非专利文献6)。 
IL-6抑制剂是抑制IL-6的生物学活性传导的物质。目前已知有IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。 
关于抗IL-6受体抗体，已有一些报道(非专利文献7、8、专利文献1～3)。已知其中之一是将小鼠抗体PM-1(非专利文献9)的互补决定区(CDR，complementarity determining region)移植到人抗体中得到的人源化PM-1抗体(专利文献4)。 
本申请的发明中相关的现有技术文献信息如下。 
非专利文献1：Hirano，T.等人.，Nature(1986)324，73-76 
非专利文献2：Akira，S.等人.，Adv.in Immunology(1993)54，1-78 
非专利文献3：Lotz，M.等人.，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258 
非专利文献4：Taga，T.等人.，J.Exp.Med.(1987)166，967-981 
非专利文献5：Yamasaki，K.等人.，Science(1988)241，825-828 
非专利文献6：Taga，T.等人.，Cell(1989)58，573-581 
非专利文献7：Novick，D.等人.，Hybridoma(1991)10，137-146 
非专利文献8：Huang，Y.W.等人.，Hybridoma(1993)12，621-630 
非专利文献9：Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906 
专利文献1：国际专利申请公开号WO 95-09873 
专利文献2：法国专利申请公开号FR 2694767 
专利文献3：美国专利号US 5216128 
专利文献4：国际专利申请公开号WO 92-19759 
发明内容
糖尿病治疗的胰岛移植中，在移植时抑制移植胰岛障碍、提高胰岛的存活是很重要的，目前尚未有显示显著效果的方法。另外，作为IL-6抑制剂之一的抗IL-6受体抗体在胰岛移植中是否显示抑制移植胰岛障碍的效果，目前尚未进行过研究。 
本发明是针对上述状况而进行的，其目的在于提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂。还提供抑制对象移植胰岛障碍的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予进行胰岛移植的对象的步骤。 
本发明人为解决上述课题，对于抗IL-6受体抗体抑制胰岛移植中的移植胰岛障碍的效果进行了研究。 
首先，本发明人对雄性C57BL/6小鼠静脉内给予链脲菌素，制作糖尿病受体小鼠。 
接着，将两只量(400个)或一只量(200个)的由小鼠胰脏分离的胰岛移植到该糖尿病受体小鼠中。结果，移植两只量的胰岛时，血糖值正常，表现了糖尿病的治疗效果，而移植一只量的胰岛时，则血糖值不正常，持续高血糖(图2、3)。 
移植一只量(200个)的小鼠的胰岛，移植后将500μg抗IL-6受体抗体(MR16-1)腹腔内给予三次，则所有受体的血糖值在移植后均恢复正常(图4)。而将同等量的抗IL-6受体抗体给予一次时，3/4恢复正常血糖(图5)。将200μg抗IL-6受体抗体给予一次时，1/3恢复正常血糖(图6)。 
并且可知，通过给予本发明的抗IL-6受体抗体，可以抑制移植后浸润细胞的炎症性细胞因子的生成。 
由以上结果表明，抗IL-6受体抗体可以减轻移植胰岛障碍，改善胰岛的存活，纠正受体的高血糖。 
即，本发明人通过本发明首次发现：通过抗IL-6受体抗体，可以抑制胰岛移植时的移植胰岛障碍，由此完成了本发明。 
本发明更具体地提供以下的[1]～[23]。 
胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。 
[1]的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。 
[1]的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。 
[2]或[3]的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，抗体是单克隆抗体。 
[2]～[4]中任一项的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，抗体是人IL-6的抗体或人IL-6受体的抗体。 
[2]～[5]中任一项的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，抗体是重组型抗体。 
[6]的移植胰岛障碍抑制剂，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。 
[1]～[7]中任一项的移植胰岛障碍抑制剂，该抑制剂用于糖尿病的治疗。 
抑制对象的移植胰岛障碍的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予进行胰岛移植的对象的步骤。 
使对象中胰岛的存活提高的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予进行胰岛移植的对象的步骤。 
[9]或[10]的方法，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。 
[9]或[10]的方法，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。 
[11]或[12]的方法，其特征在于，抗体是单克隆抗体。 
[11]～[13]中任一项的方法，其特征在于，抗体是人IL-6的抗体或人IL-6受体的抗体。 
[11]～[14]中任一项的方法，其特征在于，抗体是重组型抗体。 
[15]的方法，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。 
IL-6抑制剂在制备胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂中的应用。 
[17]的应用，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6的抗体。 
[17]的应用，其特征在于，IL-6抑制剂是识别IL-6受体的抗体。 
[18]或[19]的应用，其特征在于，抗体是单克隆抗体。 
[18]～[20]中任一项的应用，其特征在于，抗体是人IL-6的抗体或人IL-6受体的抗体。 
[18]～[21]中任一项的应用，其特征在于，抗体是重组型抗体。 
[22]的应用，其特征在于，抗体是嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。 
附图说明
图1是未进行胰岛移植的糖尿病受体小鼠的血糖值变化图。 
图2是同种同体移植两只量的小鼠胰岛(400个)的糖尿病受体小鼠的血糖值变化图。 
图3是表示同种同体移植一只量的小鼠胰岛(200个)的糖尿病受体小鼠的血糖值变化图。 
图4是表示同种同体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将500μg抗IL-6受体抗体腹腔内给予三次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
图5是表示同种同体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将500μg抗IL-6受体抗体腹腔内给予一次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
图6是表示同种同体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将200μg抗IL-6受体抗体腹腔内给予一次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
图7是表示给予抗IL-6受体抗体抑制移植后浸润细胞炎症性细胞因子产生的图。 
图8是表示同种异体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将200μg大鼠IgG腹腔内给予三次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
图9是表示同种异体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将200μg抗CD4抗体腹腔内给予一次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
图10是表示同种异体移植一只量的小鼠胰岛(200个)，移植后将500μg抗IL-6受体抗体腹腔内给予三次、将200μg抗CD4抗体腹腔内给予一次的糖尿病受体小鼠的血糖值变化的图。 
具体实施方式
本发明人发现：抗IL-6受体抗体可抑制胰岛移植后的移植胰岛障碍。本发明是基于这些认识而完成的。 
本发明涉及胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。 
本发明中，“IL-6抑制剂”是指阻断利用IL-6的信号传导、抑制IL-6的生物学活性的物质。IL-6抑制剂优选为对IL-6、IL-6受体和gp130的结合具有抑制作用的物质。 
本发明的IL-6抑制剂例如有抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体或者IL-6或IL-6受体的部分肽、以及与它们显示同样活性的低分子物质，但并不限于此。本发明的IL-6抑制剂可优选列举识别IL-6受体的抗体。 
对本发明的抗体的来源没有特别限定，但优选来自哺乳动物，更优选来自人的抗体。 
本发明中使用的抗IL-6抗体可采用公知的方法，以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明中使用的抗IL-6抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。来自哺乳动物的单克隆抗体有：在杂交瘤中生成的抗体、以及通过遗传工程方法、在用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的抗体。该抗体与IL-6结合，可以抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传导。 
作为这样的抗体，可列举MH166(Matsuda，T.等人.，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)、SK2抗体(Sato，K等人.，第21回日本免疫学会总会、学术记录(1991)21，166)等。 
生成抗IL-6抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术如下制备。即，使用IL-6作为致敏抗原(感作抗原)，将其按照通常的免疫方法进行免疫，将所得免疫细胞通过通常的细胞融合法与公知的母细胞(親細胞)融合，通过通常的筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞。 
具体来说，制备抗IL-6抗体可如下进行。例如，作为取得抗体的致敏抗原使用的人IL-6可通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541、或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中公开的IL-6基因/氨基酸序列得到。 
将IL-6的基因序列插入到公知的表达载体体系中，转化适当的宿主细胞，然后通过公知的方法，从该宿主细胞中或者培养上清中纯化目标 IL-6蛋白质，可使用该纯化IL-6蛋白质作为致敏抗原。也可以使用IL-6蛋白质与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。 
本发明中使用的抗IL-6受体抗体可使用公知的方法，以多克隆抗体或单克隆的形式获得。本发明中使用的抗IL-6受体抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体有：在杂交瘤中生成的抗体，以及通过基因工程方法、在用含有抗体基因的表达载体转化的宿主中生成的抗体。该抗体与IL-6受体结合，可以抑制IL-6与IL-6受体的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内的传导。 
作为这样的抗体，可列举MR16-1抗体(Tamura，T.等人.Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等人.，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO 92-19759)等。其中，作为人IL-6受体的优选的单克隆抗体可列举PM-1抗体，另外作为小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体可列举MR16-1抗体。 
生成抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤基本上可采用公知技术如下制备。即，使用IL-6受体作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法进行免疫，通过通常的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的母细胞融合，通过通常的筛选法筛选单克隆的抗体生成细胞来制备。 
具体来说，制备抗IL-6受体抗体可如下进行。例如，作为取得抗体的致敏抗原使用的人IL-6受体可使用欧洲专利申请公开号EP 325474、小鼠IL-6受体可使用日本特许出愿公开号特开平3-155795中公开的IL-6受体基因/氨基酸序列获得。 
IL-6受体蛋白有在细胞膜上表达的和与细胞膜脱离的(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等人.，J.Biochem.(1990)108，673-676)两种。可溶性IL-6受体由与细胞膜结合的IL-6受体的实质上的胞外域构成，贯通细胞膜区域或者贯通细胞膜区域和胞内域缺损，在该点上与膜结合型IL-6受体不同。IL-6受体蛋白只要在本发明中使用的抗IL-6受体抗体的制备中可用作致敏抗原即可，可以使用任何IL-6受体。 
将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体体系中，转化适当的宿主细胞，然后按照公知的方法，从该宿主细胞中或者培养上清中纯化目标IL-6受体蛋白，将该纯化IL-6受体蛋白用作致敏抗原即可。还可以使用表达IL-6受体的细胞、IL-6受体蛋白与其它蛋白的融合蛋白作为致 敏抗原。 
本发明中使用的抗gp130抗体可以使用公知的方法，以多克隆或单克隆抗体的形式获得。本发明中使用的抗gp130抗体特别优选来自哺乳动物的单克隆抗体。作为来自哺乳动物的单克隆抗体有：在杂交瘤中生成的抗体，和通过基因工程方法、在用含有抗体基因的表达载体转化的宿主细胞中生成的抗体。该抗体通过与gp130结合，可以抑制IL-6/IL-6受体复合物与gp130的结合，阻断IL-6的生物学活性向细胞内传导。 
作为这样的抗体，可列举AM64抗体(日本特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US 5571513)B-S12抗体和B-P8抗体(日本特开平8-291199)等。 
生成抗gp130单克隆抗体的杂交瘤基本上可使用公知的技术如下制备。即，使用gp130作为致敏抗原，将其按照通常的免疫方法免疫，按照通常的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的母细胞融合，通过通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞。 
具体来说，制备单克隆抗体可以如下进行。例如，用作取得抗体的致敏抗原的gp130可使用欧洲专利申请公开号EP 411946中公开的gp130基因/氨基酸序列获得。 
将gp130的基因序列插入到公知的表达载体体系中，转化适当的宿主细胞，然后通过公知的方法，从该宿主细胞中或者培养上清中纯化目标gp130蛋白，可使用该纯化gp130蛋白作为致敏抗原。还可以使用表达gp130的细胞、gp130蛋白与其它蛋白质的融合蛋白作为致敏抗原。 
作为用致敏抗原免疫的哺乳动物，没有特别限定，但优选考虑与在细胞融合中所使用的母细胞的适合性选择，通常可使用啮齿类的动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。 
用致敏抗原免疫动物可按照公知的方法进行。例如常规的方法是将致敏抗原向哺乳动物的腹腔内或皮下注射。具体来说，将致敏抗原用PBS(磷酸盐缓冲液)、生理食盐水等稀释、悬浮成适量，根据需要，将其与通常的佐剂例如弗氏完全佐剂适量混合，乳化后每隔4～21天多次给予哺乳动物。另外，致敏抗原免疫时可使用适当的载体。 
通过上述免疫，确认血清中所需抗体水平升高，然后从哺乳动物中获得免疫细胞，进行细胞融合。进行细胞融合的优选的免疫细胞特别例举脾细胞。 
作为与上述免疫细胞融合的其它母细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞可以适当使用公知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等人.J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics inMicrobiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler.G.andMilstein，C.Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等人.，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等人.，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等人.，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等人.，nature(1979)277，131-133)等。 
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可按照公知的方法、例如Milstein等人的方法(Kohler.G.and Milstein，C.、Methods Enzymol.(1981)73，3-46)等进行。 
更具体地说，上述细胞融合例如可在细胞融合促进剂存在下、在通常的营养培养液中实施。融合促进剂例如可使用聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(HVJ)等，为了提高融合效率，还可以进一步根据需要添加二甲基亚砜等辅助剂。 
对于免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例，例如相对于骨髓瘤细胞，优选使免疫细胞为1～10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液，例如可以使用适合于上述骨髓瘤细胞株增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液、其它在该种细胞培养中使用的通常的培养液，还可以并用胎牛血清(FCS)等血清补料(血清補液)。 
细胞融合是将规定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，将预先加温至37℃左右的PEG溶液、例如平均分子量为1000～6000左右的PEG溶液通常以30～60％(w/v)的浓度添加，混合，形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，依次添加适当的培养液，离心除去上清，将该操作反复进行，可以除去杂交瘤的生长发育中不优选的细胞融合剂等。 
该杂交瘤通过在通常的选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基蝶呤、胸苷的培养液)中培养而进行选择。该HAT培养液中的培养持续足以使目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)死亡的时间、通常持续数天～数周。接着，实施通常的极限稀释法，筛选和克隆产生目标抗体的杂交瘤。 
另外，除了对人以外的动物免疫抗原，获得上述杂交瘤之外，还可以将人淋巴细胞在体外用所需抗原蛋白或抗原表达细胞致敏，将致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞例如U266融合，获得具有与所需抗原或与抗原表达细胞的结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878)。并且，也可以将抗原或抗原表达细胞给予具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物，按照上述方法获得所需人抗体(参照国际专利申请公开号WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096、WO 96/33735)。 
这样制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可在通常的培养液中继代培养。还可以在液氮中长期保存。 
要由该杂交瘤取得单克隆抗体，可以采用下述方法：按照通常的方法培养该杂交瘤，以其培养上清的形式获得的方法；或者是将杂交瘤给予与其具有适合性的哺乳动物，进行增殖，以腹水的形式获得的方法等。前者的方法适合获得高纯度的抗体，而后者的方法适合于抗体的大量生产。 
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制备可按照日本特开平3-139293所公开的方法进行。可按照以下的方法进行：将产生PM-1抗体的杂交瘤注入到BALB/c小鼠的腹腔内，获得腹水，由该腹水纯化PM-1抗体的方法；或者是将该杂交瘤在适当的培养基、例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI1640培养基、杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)、PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等中培养，由该培养上清纯化PM-1抗体的方法。 
本发明中，作为单克隆抗体，可以使用将抗体基因从杂交瘤中克隆，整合到适当的载体中，将其导入宿主，使用基因重组技术生产的重组型抗体(例如参照Borrebaeck C.A.K.and larrick J.W.THERAPEUTICMONOCLONAL ANTIBODIES，Published in the United kingdom byMACMILLAN PUBLISHERS LTD，1990)。 
具体来说，从生产目标抗体的细胞、例如从杂交瘤中分离编码抗体的可变(V)区的mRNA。mRNA的分离可采用公知的方法、例如胍超离心法(Chirgwin，J.M.等人.，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等人.，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等制备总RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。还可使用 QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)直接制备mRNA。 
使用反转录酶由所得mRNA合成抗体V区的cDNA。cDNA的合成可使用AMV反转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等进行。进行cDNA的合成和扩增可采用使用5’-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech制)和使用PCR的5’-RACE法(Frohman，M，A.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等人.，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。由所得PCR产物纯化目标DNA片段，与载体DNA连接。再由此制备重组载体，导入到大肠杆菌等中，选择集落，制备所需重组载体。目标DNA碱基序列可按照公知的方法例如脱氧法(デオキシ法)确认。 
得到编码目标抗体的V区的DNA，将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，将其整合到表达载体中。或者将编码抗体V区的DNA整合到含有抗体C区的DNA的表达载体中。 
为了制备本发明中使用的抗体，如后所述，可以将抗体基因整合到表达载体中，使其在表达控制区、例如增强子、启动子的控制下表达。接着，可通过该表达载体转化宿主细胞，使抗体表达。 
本发明中，为了降低对人的异种抗原性等，可以使用人工变异的基因重组型抗体，例如嵌合(chimeric)抗体、人源化(humanized)抗体、人(human)抗体。这些变异抗体可采用已知的方法制备。 
嵌合抗体可如下获得：将上述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接，将其整合到表达载体中，导入宿主，使其生成(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。使用这些已知的方法可以获得本发明中有用的嵌合抗体。 
人源化抗体也称作重构人抗体或人型化抗体，是将人以外的哺乳动物、例如小鼠抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区所得，其通常的基因重组方法也已知(参照欧洲专利申请公开号EP 125023、国际专利申请公开号WO 92-19759)。 
具体来说，设计成小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR；framework region)连接的DNA序列，通过PCR法由制成末端部具有重叠部分的多个寡核苷酸合成。将所得DNA与编码人抗体C区的DNA连接，接着整合到表达载体中，将其导入到宿主中生成(参照欧洲专利申请公开号EP 239400、国际专利申请公开号WO 92-19759)。 
经由CDR连接的人抗体的FR选择互补决定区形成良好的抗原结合部位的FR。还可根据需要置换抗体可变区构架区的氨基酸，以使重构人抗体的互补决定区形成合适的抗原结合部位(Sato，K.等人.，Cancer Res.(1993)53，851-856)。 
嵌合抗体、人源化抗体中使用人抗体C区。作为人抗体C区，可列举Cγ，例如可使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。为了改善抗体或其生产稳定性，可以对人抗体C区进行修饰。 
嵌合抗体含有来自人以外的哺乳动物的抗体可变区和来自人抗体的C区，人源化抗体含有来自人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区、来自人抗体的构架区和C区，两者在人体内的抗原性低，因此可用作在本发明中使用的抗体。 
作为本发明中使用的人源化抗体的优选具体例子，可列举人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO 92-19759)。 
作为人抗体的取得方法，除了之前所述的方法之外，还已知使用人抗体文库、通过淘选得到人抗体的技术。例如，可将人抗体的可变区作为单链抗体(scFv)，通过噬菌体展示法在噬菌体的表面表达，选择与抗原结合的噬菌体。对被选择的噬菌体的基因进行分析，可以确定编码与抗原结合的人抗体可变区的DNA序列。如果与抗原结合的scFv的DNA序列得到明确，则可以制备含有该序列的适当的表达载体，获得人抗体。这些方法是公知的，可以以WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438、WO 95/15388作为参考。 
如上所述构建的抗体基因可通过公知的方法表达。使用哺乳类细胞时，可以通过常用的有用启动子、要表达的抗体基因、在其3’侧下游功能性结合有polyA信号的DNA、或者含有该DNA的载体来表达。例如作为启动子/增强子，可列举人巨细胞病毒即刻早期启动子/增强子(humancytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)。 
除此之外，本发明中使用的、可用于抗体表达的启动子/增强子还可以使用反转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子或人延伸因子1α(HEF1α)等来自哺乳类细胞的启动子/增强子。 
例如，使用SV40启动子/增强子时，可按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等人.，nature(1979)277，108-114)，使用HEF1α启动子/增 强子时，可按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.和Nagata，S.NucleicAcids Res.(1990)18，5322)容易地实施。 
为大肠杆菌时，可以使常用的有用启动子，用于抗体分泌的信号序列、要表达的抗体基因功能性结合，使其表达。例如作为启动子，可列举lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等人.Nature(1989)341，544-546，Ward，E.S.等人FASEB J.(1992)6，2422-2427)，使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(Better，M.等人.Science(1988)240，1041-1043)进行。 
作为用于抗体分泌的信号序列，在大肠杆菌的周质中生成时，可使用pelB信号序列(Lei，S.P.等人J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)。分离在周质中生成的抗体后，可以将抗体的结构适当地重折叠(refold)使用(例如参照WO 96/30394)。 
作为复制起源，可以使用来自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的，进一步，为了在宿主细胞系内扩增基因拷贝数，表达载体可以含有氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标志。 
为了制备本发明中使用的抗体，可以使用任意的生产体系。抗体制备的生产体系有体外和体内生产体系。作为体外生产体系，可列举使用真核细胞的生产体系、使用原核细胞的生产体系。 
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的生产体系。动物细胞已知有(1)哺乳类细胞例如CHO、COS、骨髓瘤、BHK(幼仓鼠肾)、HeLa、Vero等，(2)两栖类细胞例如非洲爪蟾卵母细胞，或者(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。植物细胞已知有来自烟草(Nicotianatabacum)的细胞，将其进行愈伤组织培养即可。真菌细胞已知有：酵母例如酵母菌(Saccharomyces)属，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、丝状菌例如曲霉属(Aspergillus)属，例如黑曲霉(Aspergillusniger)等。 
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的生产体系。细菌细胞已知有大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌。 
通过转化，将目标抗体基因导入到这些细胞中，将转化的细胞在体外培养，由此可获得抗体。培养可按照公知的方法进行。例如培养液可 使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM，也可以并用胎牛血清(FCS)等血清补料。将导入了抗体基因的细胞转移到动物的腹腔内等，由此可以在体内生成抗体。 
另一方面，作为体内生产体系，可列举使用动物的生产体系、使用植物的生产体系。使用动物时，有使用哺乳动物、昆虫的生产体系等。 
哺乳类动物可以使用山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。昆虫可以使用蚕。使用植物时，例如可使用烟草。 
将抗体基因导入这些动物或植物，在动物或植物体内生成抗体并回收。例如，将抗体基因插入到编码如山羊β酪蛋白等在乳汁中特定产生的蛋白质的基因中途，以融合基因的形式制备。将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，将该胚胎导入到雌山羊。由接受了胚胎的山羊生的转基因山羊、或其子孙所生产的乳汁中获得所需抗体。为了使由转基因山羊产生的含所需抗体的乳汁量增加，可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert，K.M.等人.，Bio/Technology(1994)12，699-702)。 
使用蚕时，将插入了目标抗体基因的杆状病毒感染蚕，由该蚕的体液获得所需抗体(Maeda，S.等人.，Nature(1985)315，592-594)。使用烟草时，将目标抗体基因插入到植物表达用载体例如pMON530，将该载体导入到根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等细菌中。将该细菌感染烟草、例如烟草(Nicotiana tabacum)，可由该烟草的叶获得所需抗体(Julian，K.-C.Ma等人.，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。 
如上所述，在通过体外或体内生产体系生产抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合到表达载体中，同时转化宿主，或者是将编码H链和L链的DNA整合到单一的表达载体中，转化宿主(国际专利申请公开号WO 94-11523)。 
本发明中使用的抗体只要在本发明中可适宜使用即可，可以是抗体的片段或其修饰物。例如，抗体的片段有Fab、F(ab’)2、Fv、或H链与L链的Fv通过适当的接头连接而成的信号链Fv(scFv)。 
具体来说，将抗体用酶例如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶等进行处理，生成抗体片段，或者构建编码这些抗体片段的基因，将其导入到表达载体中，然后在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等人.，J.Immunol. (1994)152，2968-2976、Better，M.& Horwitz，A.H.Methods in Enzymology(1989)178，476-496、Plueckthun，A.& Skerra，A.Methods in Enzymology(1989)178，497-515、Lamoyi，E.，Methods in Enzymology(1989)121，652-663、Rousseaux，J.等人.，Methods in Enzymology(1989)121，663-66、Bird，R.E.等人.，TIBTECH(1991)9，132-137)。 
scFv可通过将抗体的H链V区和L链V区连接获得。在该scFv中，H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头连接(Huston，J.S.等人.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来自上述所记载的任何抗体。连接V区的肽接头例如可使用含有12～19个氨基酸残基的任意的单链肽。 
编码scFv的DNA如下获得：以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码L链或L链V区的DNA作为模板，将这些序列中编码所需氨基酸序列的DNA部分用规定了其两端的引物对、通过PCR法扩增，接着，再将编码肽接头部分的DNA和规定其两端分别与各H链、L链连接的引物对组合进行扩增。 
如果制备了编码scFv的DNA，则可以按照常规方法获得含有它们的表达载体、以及由该表达载体转化的宿主，还可以使用该宿主按照常规方法获得scFv。 
对于上述抗体的片段，可以与上述同样地取得其基因，并使其表达，通过宿主进行生产。本发明中所述“抗体”也包含这些抗体的片段。 
抗体的修饰物例如可使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中所述的“抗体”也包括这些抗体修饰物。为了获得上述抗体修饰物，可通过对所得抗体实施化学修饰获得。这些方法在本领域中已经得到确立。 
如上所述，生成并表达的抗体从细胞内外、宿主分离，纯化至均匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可通过亲和柱层析进行。亲和柱层析中使用的柱例如有蛋白A柱、蛋白G柱。蛋白A柱中使用的载体例如有HyperB、POROS、Sepharose F.F.等。除此之外还可以采用通常的蛋白质所使用的分离、纯化方法，没有任何限定。 
例如将上述亲和柱层析以外的色谱、过滤、超滤、盐析、透析等适当选择、组合，分离并纯化本发明中使用的抗体。色谱例如有离子交换色谱、疏水色谱、凝胶过滤等。这些色谱可采用HPLC(高效液相色谱)。 还可以使用反相HPLC(reverse phase HPLC)。 
上述得到的抗体的浓度测定可通过吸光度测定或ELISA等进行。即，通过吸光度测定时，用PBS(-)适当稀释，然后测定280nm下的吸光度，以1mg/ml作为1.35OD计算。通过ELISA进行时，可如下测定。即，将100μl用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH 9.6)稀释为1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)加入到96孔板(Nunc制)中，在4℃下温育过夜，使抗体固定。封闭后添加适当稀释的本发明中使用的抗体或含有抗体的样品、或者100μl作为标准品的人IgG(CAPPEL制)，在室温下温育1小时。 
洗涤后，添加100μL稀释5000倍的碱性磷酸酶标记抗人IgG(BIOSOURCE制)，在室温下温育1小时。洗涤后加入底物溶液，温育后使用读板仪3550型(MICROPLATE READER Model 3550，Bio-Rad制)，测定405nm的吸光度，计算目标抗体的浓度。 
本发明中使用的IL-6变异体是具有与IL-6受体的结合活性、且不传导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6变异体与IL-6竞争性地与IL-6受体结合，但并不传导IL-6的生物学活性，因此阻断IL-6的信号传导。 
IL-6变异体是通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基导入变异而制备的。作为IL-6变异体基础的IL-6，其来源可以是任何来源，但考虑到抗原性等，优选使用人IL-6。 
具体来说，采用公知的分子建模程序(molecular modeling programs)例如WHATIF(Vriend等人.，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)，预测IL-6氨基酸序列的二级结构，通过评价置换的氨基酸残基对整体的影响而进行。确定了适当的取代氨基酸残基后，以含有编码人IL-6基因的碱基序列的载体作为模板，按照通常进行的PCR法，通过导入使氨基酸被置换的变异，由此可获得编码IL-6变异体的基因。可以将其根据需要整合到适当的表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、生产和纯化方法获得IL-6变异体。 
IL-6变异体的具体例子在Brakenhoff等人.，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93以及Savino等人.，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO 96-18648、WO 96-17869中有公开。 
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是分别具有与IL-6受体或IL-6的结合活性、且不传导IL-6的生物学活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合，通过捕获它们，可以特异性 抑制IL-6与IL-6受体的结合。结果，由于不传导IL-6的生物学活性，因此可以阻断IL-6介导的信号传导。 
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是含有IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中的IL-6和IL-6受体的与结合有关的区域的一部分或全部氨基酸序列的肽。上述肽通常含有10～80、优选20～50、更优选20～40个氨基酸残基。 
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽可如下制备：在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中，确定IL-6和IL-6受体的与结合有关的区域，根据该确定的区域的一部分或全部氨基酸序列、按照通常已知的方法例如基因工程方法或肽合成法制备。 
通过基因工程方法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以将编码所需肽的DNA序列整合到表达载体中，按照上述重组型抗体的表达、生产和纯化方法得到。 
通过肽合成法制备IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以采用肽合成中通常使用的方法、例如固相合成法或液相合成法。 
具体来说，可按照续医药品的开发第14卷肽合成监修矢岛治明广川书店1991年记载的方法进行。固相合成法例如可采用以下方法：将与要合成的肽的C末端对应的氨基酸与在有机溶剂中为不溶性的支持体结合，交替反复进行将α-氨基和支链官能团用适当的保护基保护的氨基酸由C末端向N末端方向依次一个氨基酸一个氨基酸地缩合的反应，和使结合在树脂上的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基离去的反应，使肽链延伸。固相肽合成法根据所使用的保护基团的种类而大致分为Boc法和Fmoc法。 
如此合成目标肽后，进行脱保护反应和将肽链从支持体上切断的反应。肽链的切断反应中，如果采用Boc法则通常可使用氟化氢或三氟甲磺酸，如采用Fmoc法则通常使用TFA。Boc法中，例如在茴香醚存在下、在氟化氢中对上述保护肽树脂进行处理。接着脱保护基团和从支持体上切断，回收肽。将其冷冻干燥，由此可得到粗制肽。另一方面，在Fmoc法中，例如可通过在TFA中、按照与上述同样的操作进行脱保护反应和将肽链从支持体上切断的反应。 
所得粗制肽可通过HPLC进行分离、纯化。在其洗脱时，可使用蛋白质纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂在最佳条件下进行。分离所得色谱峰所对应的组分，将其冷冻干燥。对于上述纯化的肽组分，通过质谱分 析进行分子量分析、氨基酸组成分析、或氨基酸序列分析等，由此进行鉴定。 
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽的具体例子在日本特开平2-188600、日本特开平7-324097、日本特开平8-311098和美国专利公报US5210075中有公开。 
本发明中使用的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的结合抗体(conjugated antibody)。上述结合抗体可通过对所得抗体实施化学修饰获得。抗体的修饰方法在本领域已经得到确立。本发明中“抗体”也包含这些结合抗体。 
本发明的胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂可以在糖尿病治疗中使用。糖尿病包括I型糖尿病、II型糖尿病、胰腺性糖尿病(膵性糖尿病)、妊娠糖尿病等。另外，胰腺炎或使用类固醇药等而二次发生时、或者是由于特定基因有异常时等的特定原因的糖尿病也包含在上述糖尿病中。 
本发明的移植胰岛障碍抑制剂可在胰岛移植中使用。胰岛移植包括脑死亡供体胰岛移植、心脏停止供体胰岛移植和活体胰岛移植等。 
本发明的胰岛移植可以是同种同体移植(isograft)，也可以是同种异体移植(allograft)。同种同体移植是指在相同的均一体系的动物之间进行的移植，对于人来说，是在同卵双生儿之间进行的移植。同种异体移植是指在基因原来组成不同的2个个体间进行的移植，例如对于人来说，有双卵双生儿之间的移植或完全没有血缘关系的个体间的移植。 
本发明中使用的IL-6抑制剂的IL-6信号传导抑制活性可通过通常所使用的方法评价。具体来说，培养IL-6依赖性人骨髓瘤细胞株(S6B45，KPMM2)、人LennertT淋巴瘤细胞株KT3、或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同时使IL-6抑制剂共存，由此测定IL-6依赖性细胞对3H-胸苷的摄取。还可以培养IL-6受体表达细胞U266，添加125I标记IL-6，同时加入IL-6抑制剂，由此测定与IL-6受体表达细胞结合的125I标记IL-6。上述测定体系中，除使IL-6抑制剂存在的组之外，也可以设置不含有IL-6抑制剂的阴性对照组，将两者所得结果进行比较，则可以评价IL-6抑制剂对IL-6的抑制活性。 
如后述实施例所示，确认通过给予抗IL-6受体抗体，可抑制胰岛移植中的移植胰岛障碍，由此显示：抗IL-6受体抗体等IL-6抑制剂可用作胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂。 
本发明的移植胰岛障碍抑制剂所给予的对象是哺乳动物。哺乳动物优选人。 
本发明的移植胰岛障碍抑制剂可以以药物的形式给予，可以是口服或非口服地全身或局部给予。例如可选择输液等静脉内注射、肌内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂、口服性肠溶剂等，可根据患者的年龄、症状等选择适当的给予方法。有效给予量可以是每次1公斤体重在0.01mg～100mg的范围选择。或者可选择每位患者1～1000mg、优选5～50mg的给予量。对于优选的给予量、给予方法，例如为抗IL-6受体抗体时，使血液中存在游离抗体程度的量为有效给予量，其具体例子是1kg体重1个月(4周)为0.5mg～40mg，优选1mg～20mg，分1次或多次、例如2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给予方案通过输液等静脉内注射、皮下注射等方法给予的方法等。给予方案可以在观察移植后状态以及观察血液检查值的动向的同时，以2次/周或1次/周至1次/2周、1次/3周、1次/4周这样逐渐延长给予间隔等的方式进行调节，。 
本发明中，移植胰岛障碍抑制剂中可以添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载体。制剂上可接受的载体可以是其本身具有上述移植胰岛障碍抑制效果的材料，也可以是不具有移植胰岛障碍抑制效果的材料，是可以与上述抑制剂一起给予的材料。还可以是虽然不具有移植胰岛障碍抑制效果，但是通过与IL-6抑制剂并用、具有协同性或相叠加性的稳定效果的材料。 
作为制剂上可接受的材料，可列举例如灭菌水、生理食盐水、稳定剂、赋型剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。 
本发明中，作为表面活性剂，可列举非离子表面活性剂，例如作为典型的例子，可列举失水山梨醇单辛酸酯、失水山梨醇单月桂酸酯、失水山梨醇单棕榈酸酯等失水山梨醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油基单硬脂酸酯、十甘油基二硬脂酸酯、十甘油单亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯失水山梨醇单月桂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三油酸酯、聚氧乙烯失水山梨醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨醇四油酸酯等聚氧 乙烯山梨醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯月桂基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡基醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酰胺等聚氧乙烯脂肪酰胺等具有HLB 6～18等的物质。 
表面活性剂还可以是阴离子表面活性剂，例如作为典型例子，可列举鲸蜡基硫酸钠、月桂基硫酸钠、油基硫酸钠等具有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯月桂基硫酸钠等氧化乙烯平均加成摩尔数为2～4、烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；月桂基磺基琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基磺基琥珀酸酯盐；天然系表面活性剂，例如卵磷脂、甘油磷脂(グリセロリン脂質)；神经鞘磷脂等鞘磷脂；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。 
本发明的抑制剂可以将这些表面活性剂的1种或2种以上组合添加。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂是聚山梨醇酯20、40、60或80等聚氧乙烯失水山梨醇脂肪酸酯，特别优选聚山梨醇酯20和80。还优选以泊洛沙姆(プルロニツクF-68(注册商标)等)为代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。 
表面活性剂的添加量根据所使用的表面活性剂的种类而不同，为聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80时，通常为0.001～100mg/ml，优选为0.003～50mg/ml，进一步优选为0.005～2mg/ml。 
本发明中，缓冲剂有磷酸、柠檬酸缓冲液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡糖酸、辛酸、脱氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等其它有机酸等，或者是碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。 
在溶液制剂领域中，可以通过溶解于公知的水性缓冲液中制备溶液制剂。缓冲液的浓度通常为1～500mM，优选5～100mM，进一步优选10～20mM。 
本发明的抑制剂可以含有其它低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶、免疫球蛋白等蛋白质、氨基酸、多糖和单糖等糖类或烃、糖醇。 
本发明中，作为氨基酸，可列举碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等，或者是它们这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式，即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，优选的pH值可通过添加适当的生理可接受的缓冲物质例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐来调节。这种情况下，应用磷酸盐可以获得稳定的冻干物，因此特别有利。制备物实质上不含有机酸例如苹果酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸、富马酸等时、或者是不存在对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、柠檬酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)时，特别有利。优选的氨基酸为精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。并且也可以使用酸性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸、及其盐的形式(优选钠盐)或中性氨基酸，例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、或丙氨酸，或者是芳族氨基酸例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物N-乙酰色氨酸。 
本发明中，作为多糖和单糖等的糖类、烃，可列举例如葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。 
本发明中，糖醇例如有甘露醇、山梨醇、肌醇等。 
将本发明的药物制成注射用的水溶液时，例如可以与含有生理食盐水、葡萄糖或其它辅助药物(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗液混合。该水溶液还可以与适当的溶解助剂(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(聚山梨醇酯80、HCO-50)等)并用。 
根据所需，可以进一步含有稀释剂、溶解助剂、pH调节剂、止痛剂(無痛化剤)、含硫还原剂、抗氧化剂等。 
本发明中，作为含硫还原剂，可列举：N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰高半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱苷肽、以及碳原子数为1～7的硫代烷酸等具有巯基的物质等。 
本发明中，作为抗氧化剂，例如可列举：异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、乙酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二氨四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。 
另外，可以根据需要封装到微囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基丙烯酸甲酯]等微囊)中，或者是制成胶态给药系统(脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米颗粒以及纳米囊等)(参照“Remington’s PharmaceuticalScience 16th edition”，Oslo Ed.，1980等)。并且，将药物制成缓释性的药物的方法也是公知的。也可应用于本发明(Langer等人.，J.Biomed.Mater.Res.1981，15：167-277；Langer，Chem.Tech.1982，12：98-105；美国专利第3,773,919号；欧洲专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等人.，Biopolymers 1983，22：547-556；EP第133,988号)。 
所使用的制剂上可接受的载体可根据剂型从上述中适当或者组合选择，但并不限于此。 
本发明涉及抑制对象的移植胰岛障碍的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予进行胰岛移植的对象的步骤。本发明还涉及使对象中的胰岛的存活提高的方法，该方法包含将IL-6抑制剂给予进行胰岛移植的对象的步骤。 
本发明中，“对象”是指给予本发明的移植胰岛障碍抑制剂的生物体、该生物体的体内的一部分、或者由生物体摘除或排出的一部分。生物体没有特别限定，包括动物(例如人、家畜动物种类、野生动物)。 
对“生物体的体内的一部分”没有特别限定，优选可进行胰岛移植的器官、大网膜、肾包膜下、肠系膜。本发明中，作为移植胰岛的器官，例如可列举肝脏，更具体地说是肝脏的血管。 
本发明中，“给予”包含口服或非口服给予。口服给予可以是以口服制剂的形式给予，口服制剂可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、或混悬剂等剂型。 
作为非口服给予，可列举以注射剂的形式给予，注射剂可以是皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。另外，使用基因治疗的方法，将要给予的含有寡核苷酸的基因导入到生物体内，由此可实现本发明的方法的效果。还可以将本发明的抑制剂局部给予要实施处置的区域。例如，手术中的局部注入、导管的应用、或者编码本发明的肽的DNA通过靶基因传递而给予。 
对对象给予本发明的抑制剂，可以是在器官移植之前，也可以是器官移植的同时，或者是器官移植之后。给予抑制剂可以是一次，也可以是连续给予。 
对由生物体摘除或排出的生物体的一部分给予时，可以使本发明的抑制剂与生物体的一部分“接触”。 
本发明中，“接触”按照生物体的状态进行。例如，可以是将本抑制剂散布到生物体的一部分上、或者将本抑制剂添加到生物体的一部分的破碎物中，但并不限于这些方法。生物体的一部分为培养细胞时，通过将本抑制剂添加到该细胞的培养液中、或者将含有本发明的寡核苷酸的DNA导入到构成生物体的一部分的细胞中，由此可进行上述“接触”。 
实践本发明的方法时，本发明的抑制剂可以与至少一种已知的化学疗法制剂一起，作为药学组合物的一部分给予。或者是本发明的抑制剂与至少一种已知的免疫抑制剂同时给予。在一种方案中，可以将本发明的抑制剂和已知的化学疗法制剂实质上同时给予。 
本发明的抑制剂还可以在胰岛移植后对移植了胰岛的部位进行给予，也可以与胰岛同时对靶进行给予。还可以是对于移植前的胰岛进行体外给予。 
本发明中，“抑制移植胰岛障碍”是指抑制所移植的胰岛的障碍、提高存活率。另外，“抑制移植胰岛障碍”也包含抑制与移植相伴随的自然免疫应答(自然免疫応答)。 
是否抑制了移植胰岛障碍，这可按照实施例所述方法，通过测定生物体中的血糖值来进行。例如，血糖值的测定可以由眶静脉窦(orbitalsinus)采血，分离血浆后通过贝克曼葡萄糖分析仪(Beckman GlucoseAnalyzer)进行。 
通过给予本发明的移植胰岛障碍抑制剂而表现出血糖值持续降低时，可以视为移植胰岛障碍得到抑制。结果胰岛的存活提高时，也可以视为是在胰岛移植中“移植胰岛障碍得到抑制”。胰岛的存活可通过糖尿病受体的血糖值在移植后是否正常来判定。例如，在本发明的实施例的对照组中，移植了可由一只供体分离的200个胰岛时，持续维持高血糖，可将这种情况下的存活率视为0％。另外，在本发明的实施例的IL-6受体抗体给予组中，移植了与对照组同等数量的胰岛，但所有受体的血糖正常，这时的存活率可视为100％。 
本说明书中引用的所有现有技术文献可作为参照引用到本说明书中。 
实施例 
以下，通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不限于这些实施例。 
[实施例1]对于给予抗IL-6受体抗体的同种同体胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制效果的研究。 
将链脲菌素(180mg/kg)静脉内给予雄性C57BL/6小鼠，制作糖尿病受体小鼠。链脲菌素是选择性破坏langerhans岛的药物，给予一次即可以使大部分B细胞脱落，引发I型糖尿病。 
未移植胰岛时，所有的小鼠均持续高血糖(图1)。在给予链脲菌素3～5天后，将小鼠分离胰岛经门静脉移植到同种同体糖尿病小鼠的肝内。胰岛是通过胶原酶法从供体胰腺中分离的。 
可由一只小鼠胰腺分离的胰岛数是200个。以2只量的胰岛、即400个作为供体时，移植后糖尿病受体的血糖正常，可以治疗糖尿病(图2)。 
本实施例中，血糖值的测定是由眶静脉窦采血，血浆分离后通过贝克曼葡萄糖分析仪进行。 
但是，移植一只量的胰岛、即200个时，血糖值不正常，受体保持高血糖(图3)。 
移植200个胰岛，在移植后将500μg抗IL-6受体抗体(MR16-1)腹腔内给予三次(第1天、2天后、4天后)，所有的受体的血糖值在移植后恢复正常(图4)。给予一次等量的抗IL-6受体抗体时，3/4恢复正常血糖(图5)。给予一次200μg抗IL-6受体抗体时，1/3恢复正常血糖(图6)。 
由以上结果显示，抗IL-6受体抗体减轻了移植胰岛障碍，带来胰岛存活的改善，可以纠正受体的高血糖。即，抗IL-6受体抗体可用作同种同体胰岛移植(isografts)的移植胰岛障碍抑制剂。 
[实施例2]给予抗IL-6受体抗体的抑制炎症性细胞因子生成的效果的研究 
通过流式细胞仪评价法对通过给予本发明的抗IL-6受体抗体是否可抑制移植后浸润细胞的炎症性细胞因子的生成进行了研究。 
向链脲菌素糖尿病小鼠肝内移植200个同种同体胰岛，6小时后使动物死亡，摘除肝脏，分离肝单核细胞，通过流式细胞仪进行分析(图7)。 
未处置小鼠(naive)未见肝脏内单核细胞的IFN-γ、TNF-α的生成。在未给予IL-6受体抗体的对照组中，肝脏内单核细胞的IFN-γ和TNF-α的生成增强。移植时给予一次IL-6受体抗体(ip，200μg/注射/小鼠)的小鼠中，未见肝脏内单核细胞的IFN-γ和TNF-α的生成。由此可知，通过给予IL-6受体抗体，可抑制炎症性细胞因子的生成，可防止移植胰岛障碍。 
[实施例3]给予抗IL-6受体抗体的同种异体胰岛移植中移植胰岛障碍抑制效果的研究。 
将链脲菌素(180mg/kg)静脉内给予雄性C57BL/6小鼠，制作糖尿病受体小鼠。在给予链脲菌素3～5天后，将小鼠分离胰岛经门静脉移植到同种异体糖尿病小鼠(BALB/c)的肝内。胰岛是通过胶原酶法由供体胰脏分离的。血糖值的测定与实施例1同样进行。 
移植200个胰岛、将500μg抗IL-6受体抗体(MR16-1)在移植后给予3次(第1天、2天后、4天后)、以及在第1次给予抗IL-6受体抗体的同时腹腔内给予1次200μg抗CD4抗体，则所有受体的血糖值在移植后恢复正常(图10)。另一方面，只将500μg对照抗体(大鼠IgG)(图8)、或200μg抗CD4抗体(图9)给予同样的次数时，所有小鼠均持续高血糖。 
由以上结果显示，在同种异体移植中，抗IL-6受体抗体可以减径移植胰岛障碍，改善胰岛存活，纠正受体的高血糖。即，抗IL-6受体抗体可用作同种异体胰岛移植的移植胰岛障碍抑制剂。 
产业实用性 
通过本发明的移植胰岛障碍抑制剂和方法，可以使胰岛移植中胰岛的存活提高，使用更少的供体胰岛即可以有效地进行糖尿病治疗。 
目前为止，对由脑死亡供体或心脏停止供体的胰脏中分离的胰岛进行移植时，发生胰岛功能障碍，移植物存活率低，因此，对于1个受体必须有从2～3人的供体的胰脏中分离的胰岛。通过使用本发明的移植胰岛障碍抑制剂，可降低1个受体所需的胰岛数，可以使更多的受体接受胰岛移植治疗。 
最近，关于切除健康活体供体的胰脏的一部分、分离纯化胰岛、移植到糖尿病患者中的活体胰岛移植也有成功的例子报道，通过使用本发明的移植胰岛障碍抑制剂，可以建立对供体的更低侵袭的治疗方法。 

Claims (1)

1.MRl6-1抗体或PM-1抗体在制备胰岛移植中的移植胰岛障碍抑制剂中的应用，该MRl6-1抗体或PM-1抗体是识别IL-6受体的抗体。
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