CN104189907A - 伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药 - Google Patents

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Abstract

本发明人等着眼于黄斑部视网膜下的炎症可以促进脉络膜血管生成，开发抑制由VEGF等血管生成因子引起的血管生成的起始或发展的药物。具体而言，发现通过对施行激光凝固处置的小鼠给予抗IL-6受体单克隆抗体，脉络膜血管生成的发展得到抑制。

Description

伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药
本申请是原案申请日为2007年1月26日、原案申请号为200780002904.6(国际申请号为PCT/JP2007/051226)、发明名称为“伴有脉络膜血管生成的疾病的治疗药”的专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药及其应用。还涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的脉络膜血管生成抑制剂及其应用。
背景技术
老年性黄斑变性(age-related macular degeneration)是视网膜的黄斑部出现异常的疾病，在欧美该病是导致失明的首要原因，在日本近年来随着老年人口的急剧增加该病也在不断地增加。黄斑位于视网膜的中心，是视细胞中锥细胞的密度高的部位。来自外部的光线经角膜和晶状体折射可以集中在黄斑的特别中央凹，而解读文字的视力依赖于同一部位的功能。在老年性黄斑变性中，如此重要的部位-黄斑因年龄增加而变性，因此主要以变形视(斜视)·中心暗点的形式发生视力下降。
在老年性黄斑变性中，渗出型老年性黄斑变性是引发急速且严重的视力下降的预后不良的疾病，其中心病态为脉络膜血管生成(choroidal neovascularization：以下有时还简记作CNV)。CNV是指脉络膜的血管贯穿布鲁赫膜·视网膜色素上皮进行异位增殖。在渗出型老年黄斑变性中，来自该未成熟的血管网的出血或包含脂肪的血浆成分的渗出成为神经视网膜的功能急速下降的直接原因。认为CNV是由炎性细胞引起的，上述炎性细胞以为了吞噬蓄积在黄斑部视网膜下的玻璃疣而浸润的巨噬细胞为主。巨噬细胞等炎性细胞还是血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor：VEGF)等血管生成因子的产生源，发挥促进炎症部位的血管生成的功能，该过程称作炎症性血管生成。另外，玻璃疣中包含促进VEGF产生的物质-渐进性糖化终极产物(advanced glycation end-products：AGE)和淀粉状蛋白β，认为迁移并吞没玻璃疣的视网膜色素上皮细胞受其刺激而分泌VEGF也是CNV的发生机制之一。
除老年性黄斑变性症以外，伴有CNV的疾病还包括：近视性脉络膜血管生成、特发性脉络膜血管生成。有时还因视网膜血管样纹、外伤、葡萄膜炎等而引发伴有CNV的疾病。上述疾病中CNV的发病机制也和老年性黄斑变性中的CNV一样，暗示与以黄斑部视网膜下的布鲁赫膜·视网膜色素上皮为主的组织损伤和其后续发的炎症有关。
最近的研究证明：伴随炎症而产生的VEGF与CNV有关。人们使用抗VEGF适配子等VEGF拮抗剂治疗伴有CNV的疾病并取得了一定成果。但VEGF拮抗剂是在发生血管生成的发展期进行给药，一旦进入发展期后在治疗中存在不可逆地残留神经障碍的问题。
IL-6是被称作B细胞刺激因子2(BSF2)或干扰素β2的细胞因子。IL-6是作为参与B淋巴细胞的活化的分化因子而发现的(非专利文献1)，之后查明其是影响各种细胞的功能的多功能细胞因子(非专利文献2)。有报道称IL-6诱导T淋巴细胞的成熟(非专利文献3)。
在细胞上IL-6经由两种蛋白质来传递其生物活性。一种蛋白质是IL-6结合的分子量约80kD的配体结合蛋白的IL-6受体(非专利文献4、5)。IL-6受体除了贯穿细胞膜而在细胞膜上表达的膜结合型受体以外，主要还以包含其细胞外区的可溶性IL-6受体形式存在。
另一种蛋白质是参与非配体结合性信号传递的、分子量约130kD的膜蛋白质gp130。IL-6和IL-6受体形成IL-6/IL-6受体复合体，接着与gp130结合，从而将IL-6的生物活性传递到细胞内(非专利文献6)。
IL-6抑制剂是抑制传递IL-6的生物活性的物质。迄今为止已知有：抗IL-6的抗体(抗IL-6抗体)、抗IL-6受体的抗体(抗IL-6受体抗体)、抗gp130的抗体(抗gp130抗体)、IL-6变异体、IL-6或IL-6受体部分肽等。
关于抗IL-6受体抗体已有多篇报道(非专利文献7、8和专利文献1～3)。已知其中之一阐述了通过将小鼠抗体PM-1(非专利文献9)的互补决定区(CDR：complementarity determining region)移植到人抗体内而得到的人源化PM-1抗体(专利文献4)。
近年来，有报道称在老年性黄斑变性症患者中炎性细胞因子-IL-6亢进(非专利文献10)。但IL-6在伴有CNV的疾病中的作用尚不明确。
与本申请的发明相关的先行技术文献信息如下所示。
专利文献1：国际专利申请公开号WO95/09873
专利文献2：法国专利申请公开号FR2694767
专利文献3：美国专利号US5216128
专利文献4：国际专利申请公开号WO92/19759
非专利文献1：Hirano，T.等，Nature(1986)324，73-76
非专利文献2：Akira，S.等，Adv.in Immunology(1993)54，1-78
非专利文献3：Lotz，M.等，J.Exp.Med.(1988)167，1253-1258
非专利文献4：Taga，T.等，J.Exp.Med.(1987)166，967-981
非专利文献5：Yamasaki，K.等，Science(1988)241，825-828
非专利文献6：Taga，T.等，Cell(1989)58，573-581
非专利文献7：Novick，D.等，Hybridoma(1991)10，137-146
非专利文献8：Huang，Y.W.等，Hybridoma(1993)12，621-630
非专利文献9：Hirata，Y.等，J.Immunol.(1989)143，2900-2906
非专利文献10：Seddon JM，Arch Ophthalmol.2005Jun；123(6)：774-82
发明内容
发明所要解决的课题
本发明鉴于上述状况而设，目的在于提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药。本发明还提供含有IL-6抑制剂作为有效成分的脉络膜血管生成抑制剂。
本发明进一步提供治疗伴有脉络膜血管生成的疾病的方法，该方法包括：对患有伴有脉络膜血管生成的疾病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
解决课题的方法
本发明人等为了解决上述课题，着眼于黄斑部视网膜下的炎症可以促进CNV，进行抑制由VEGF等血管生成因子引起的血管生成的起始或发展的药物的开发。具体而言，发现通过对经激光凝固处置诱导了CNV的小鼠给予抗IL-6受体单克隆抗体，CNV的发展得到抑制。
即，本发明人等发现：通过给予IL-6抑制剂可以抑制CNV的发展，从而完成了本发明。
更具体而言，本发明提供以下[1]～[36]。
[1]伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药，该药物含有IL-6抑制剂作为有效成分。
[2][1]的预防和/或治疗药，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
[3][1]的预防和/或治疗药，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
[4][2]或[3]的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
[5][2]或[3]的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[6][2]或[3]的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为重组抗体。
[7][6]的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[8][1]～[7]中任一项的预防和/或治疗药，其特征在于：伴有脉络膜血管生成的疾病为老年性黄斑变性症、近视性脉络膜血管生成、特发性脉络膜血管生成。
[9]脉络膜血管生成抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
[10][9]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
[11][9]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
[12][10]或[11]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
[13][10]或[11]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[14][10]或[11]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为重组抗体。
[15][14]的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[16]治疗对象中伴有脉络膜血管生成的疾病的方法，该方法包括：对患有伴有脉络膜血管生成的疾病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
[17][16]的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
[18][16]的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
[19][17]或[18]的方法，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
[20][17]或[18]的方法，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[21][17]或[18]的方法，其特征在于：抗体为重组抗体。
[22][21]的方法，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[23]IL-6抑制剂在制备伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药中的应用。
[24][23]的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
[25][23]的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
[26][24]或[25]的应用，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
[27][24]或[25]的应用，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[28][24]或[25]的应用，其特征在于：抗体为重组抗体。
[29][28]的应用，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
[30]IL-6抑制剂在制备脉络膜血管生成抑制剂中的应用。
[31][30]的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
[32][30]的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
[33][31]或[32]的应用，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
[34][31]或[32]的应用，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
[35][31]或[32]的应用，其特征在于：抗体为重组抗体。
[36][35]的应用，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
附图简述
图1是显示用共焦显微镜拍摄凝集素染色的脉络膜的伸展标本得到的CNV截面的照片。
图2是显示给予抗IL-6受体抗体后通过容积测定来评价CNV的体积的结果的图。
实施发明的最佳方式
本发明人等发现：通过给予抗IL-6受体抗体可以抑制CNV的发展。本发明基于上述发现而完成。
本发明涉及含有IL-6抑制剂作为有效成分的伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药以及脉络膜血管生成抑制剂。
在本发明中，“IL-6抑制剂”是指阻断IL-6介导的信号传递、抑制IL-6的生物活性的物质。IL-6抑制剂优选为对IL-6、IL-6受体和gp130中的任一种的结合具有抑制作用的物质。
本发明的IL-6抑制剂的例子有：抗IL-6抗体、抗IL-6受体抗体、抗gp130抗体、IL-6变异体、可溶性IL-6受体变异体、或者IL-6或IL-6受体的部分肽、和与它们显示相同活性的低分子物质，没有特别限定。本发明的IL-6抑制剂可以优选列举：识别IL-6受体的抗体。
本发明中对抗体的来源没有特别限定，优选为来源于哺乳动物的抗体，更优选为来源于人的抗体。
本发明中使用的抗IL-6抗体可以采用公知的方法作为多克隆抗体或单克隆抗体而得到。本发明中使用的抗IL-6抗体特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体包括：杂交瘤产生的抗体、和利用基因工程的方法以包括抗体基因的表达载体进行转化的宿主所产生的抗体。该抗体通过与IL-6结合来抑制IL-6与IL-6受体的结合，从而阻断向细胞内传递IL-6的生物活性。
上述抗体的例子有：MH166(Matsuda，T.等，Eur.J.Immunol.(1988)18，951-956)和SK2抗体(Sato，K.等，日本免疫学会总会，学术记录第21次(1991)21，166)等。
产生抗IL-6抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制作。即，使用IL-6作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，之后利用通常的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的母细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，从而可以制作产生抗IL-6抗体的杂交瘤。
具体而言，制作抗IL-6抗体可如下进行。例如，用作取得抗体的致敏抗原的人IL-6可以通过使用Eur.J.Biochem(1987)168，543-550、J.Immunol.(1988)140，1534-1541或Agr.Biol.Chem.(1990)54，2685-2688中所公开的IL-6基因/氨基酸序列而得到。
将IL-6的基因序列插入到公知的表达载体系统中使适当的宿主细胞转化，之后按照公知方法自该宿主细胞中或培养上清液中纯化目标IL-6蛋白质，可以将该纯化IL-6蛋白质用作致敏抗原。还可以将IL-6蛋白质与其他蛋白质的融合蛋白质用作致敏抗原。
本发明中使用的抗IL6受体抗体，可以使用公知的方法作为多克隆抗体或单克隆抗体而得到。本发明中使用的抗IL-6受体抗体特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体的例子有：杂交瘤产生的抗体、和利用基因工程的方法以包括抗体基因的表达载体进行转化的宿主所产生的抗体。该抗体通过与IL-6受体结合来阻碍IL-6与IL-6受体的结合，从而阻断向细胞内传递IL-6的生物活性。
上述抗体的例子有：MR16-1抗体(Tamura，T.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90，11924-11928)、PM-1抗体(Hirata，Y.等，J.Immunol.(1989)143，2900-2906)、AUK12-20抗体、AUK64-7抗体或AUK146-15抗体(国际专利申请公开号WO92/19759)等。其中，抗人IL-6受体的优选的单克隆抗体的例子有：PM-1抗体；抗小鼠IL-6受体的优选的单克隆抗体的例子有：MR16-1抗体。
产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制作。即，使用IL-6受体作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，之后利用通常的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的母细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，从而可以制作产生抗IL-6受体单克隆抗体的杂交瘤。
具体而言，制作抗IL-6受体抗体可如下进行。例如，用作取得抗体的致敏抗原的人IL-6受体和小鼠IL-6受体可分别通过使用欧洲专利申请公开号EP325474和日本专利申请公开号特开平3-155795中所公开的IL-6受体基因/氨基酸序列而得到。
IL-6受体蛋白质包括以下两种：在细胞膜上表达的蛋白质和从细胞膜上脱离的蛋白质(可溶性IL-6受体)(Yasukawa，K.等，J.Biochem.(1990)108，673-676)。可溶性IL-6受体实质上由结合在细胞膜上的IL-6受体的细胞外区构成，其在细胞膜贯通区或细胞膜贯通区与细胞内区欠缺，这一点不同于膜结合型IL-6受体。IL-6受体蛋白质只要能够用作制作本发明中使用的抗IL-6受体抗体的致敏抗原，可以使用任一种IL-6受体。
将IL-6受体的基因序列插入到公知的表达载体系统中使适当的宿主细胞转化，之后按照公知方法自该宿主细胞中或培养上清液中纯化目标IL-6受体蛋白质，可以将该纯化IL-6受体蛋白质用作致敏抗原。还可以将表达IL-6受体的细胞或IL-6受体蛋白质与其他蛋白质的融合蛋白质用作致敏抗原。
本发明中使用的抗gp130抗体可以使用公知的方法作为多克隆抗体或单克隆抗体而得到。本发明中使用的抗gp130抗体特别优选来源于哺乳动物的单克隆抗体。来源于哺乳动物的单克隆抗体的例子有：杂交瘤产生的抗体、和利用基因工程的方法以包括抗体基因的表达载体进行转化的宿主所产生的抗体。该抗体通过与gp130结合来阻碍IL-6/IL-6受体复合体与gp130的结合，从而阻断向细胞内传递IL-6的生物活性。
上述抗体的例子有：AM64抗体(日本特开平3-219894)、4B11抗体和2H4抗体(US5571513)、B-S12抗体和B-P8抗体(日本特开平8-291199)等。
产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤基本上可以采用公知技术如下制作。即，使用gp130作为致敏抗原，按照通常的免疫方法对其进行免疫，之后利用通常的细胞融合法将所得免疫细胞与公知的母细胞融合，利用通常的筛选方法筛选产生单克隆抗体的细胞，从而可以制作产生抗gp130单克隆抗体的杂交瘤。
具体而言，制作单克隆抗体时可如下进行。例如，用作取得抗体的致敏抗原的gp130可以通过使用欧洲专利申请公开号EP411946中所公开的gp130基因/氨基酸序列而得到。
将gp130的基因序列插入到公知的表达载体系统中使适当的宿主细胞转化，之后按照公知方法自该宿主细胞中或培养上清液中纯化目标gp130蛋白质，可以将该纯化gp130蛋白质用作致敏抗原。还可以将表达gp130的细胞或gp130蛋白质与其他蛋白质的融合蛋白质用作致敏抗原。
对用致敏抗原免疫的哺乳动物没有特别限定，但优选考虑其与用于细胞融合的母细胞的适合性来进行选择，通常使用啮齿类动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠等。
用致敏抗原对动物进行免疫时按照公知的方法来进行。例如，一般的方法是：向哺乳动物的腹腔内或皮下注射致敏抗原来进行免疫。具体而言，优选将致敏抗原用磷酸缓冲盐溶液(PBS)或生理盐水等稀释至适量并悬浮，根据需要将所得悬浮液与普通的佐剂例如弗氏完全佐剂适量混合、乳化，之后对哺乳动物每4～21天给药数次。用致敏抗原进行免疫时可以使用适当的载体。
如此进行免疫，确认血清中所需的抗体水平升高后自哺乳动物中取出免疫细胞，供给细胞融合。供给细胞融合的优选的免疫细胞特别可以列举出：脾细胞。
作为与上述免疫细胞融合的另一种母细胞的哺乳动物的骨髓瘤细胞，适当使用已经公知的各种细胞株，例如P3X63Ag8.653(Kearney，J.F.等，J.Immunol.(1979)123，1548-1550)、P3X63Ag8U.1(CurrentTopics in Microbiology and Immunology(1978)81，1-7)、NS-1(Kohler，G.和Milstein，C.，Eur.J.Immunol.(1976)6，511-519)、MPC-11(Margulies，D.H.等，Cell(1976)8，405-415)、SP2/0(Shulman，M.等，Nature(1978)276，269-270)、FO(de St.Groth，S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35，1-21)、S194(Trowbridge，I.S.，J.Exp.Med.(1978)148，313-323)、R210(Galfre，G.等，Nature(1979)277，131-133)等。
上述免疫细胞与骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以按照公知的方法(例如Milstein等人的方法(Kohler，G.和Milstein，C.，MethodsEnzymol.(1981)73，3-46))等来进行。
更具体而言，上述细胞融合例如在细胞融合促进剂的存在下在普通营养培养液中实施。融合促进剂例如使用：聚乙二醇(PEG)、仙台病毒(Sendai virus，HVJ)等。为了提高融合效率，根据需要可以进一步添加使用二甲基亚砜等助剂。
免疫细胞与骨髓瘤细胞的使用比例例如优选为：相对于骨髓瘤细胞，免疫细胞为1～10倍。用于上述细胞融合的培养液例如可以使用：适于上述骨髓瘤细胞株的增殖的RPMI1640培养液、MEM培养液。此外，可以使用用于该种的细胞培养的普通培养液，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液。
进行细胞融合时，将预定量的上述免疫细胞和骨髓瘤细胞在上述培养液中充分混合，之后通常按30～60％(w/v)的浓度添加、混合预先加热至约37℃的PEG溶液(例如平均分子量为1000～6000左右的PEG溶液)，从而形成目标融合细胞(杂交瘤)。接着，逐次添加适当的培养液，离心、除去上清液，通过重复进行上述操作，可以除去培育杂交瘤所不优选的细胞融合剂等。
该杂交瘤通过在普通的选择培养液(例如HAT培养液(包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷的培养液))中培养来进行选择。在该HAT培养液中的培养时间为杀灭除目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)所需的足够的时间，通常要持续数日～数周。然后施行通常的界限稀释法，筛选和克隆产生目标抗体的杂交瘤。
除用抗原对除人以外的动物进行免疫得到上述杂交瘤以外，在体外用所需的抗原蛋白质或抗原表达细胞致敏人淋巴细胞，使致敏B淋巴细胞与人骨髓瘤细胞(例如U266)融合，也可以得到与所需的抗原或抗原表达细胞具有结合活性的所需的人抗体(参照日本特公平1-59878)。并且，可以对具有人抗体基因库的转基因动物给予抗原或抗原表达细胞，按上述方法取得所需的人抗体(参照国际专利申请公开号WO93/12227、WO92/03918、WO94/02602、WO94/25585、WO96/34096、WO96/33735)。
如此制作的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在普通培养液中进行继代培养，还可以在液氮中长期保存。
由该杂交瘤取得单克隆抗体时采用以下方法：按照常规方法培养该杂交瘤，作为其培养上清液而得到的方法；或者将杂交瘤给予适合其的哺乳动物使其增殖，作为其腹水而得到的方法等。前一种方法适合得到高纯度的抗体，而后一种方法适合生产大量的抗体。
例如，产生抗IL-6受体抗体的杂交瘤的制作可以按照日本特开平3-139293中公开的方法来进行。可以按照以下方法来制作，即：向BALB/c小鼠的腹腔内注入产生PM-1抗体的杂交瘤得到腹水，从该腹水中纯化PM-1抗体的方法；或者用适当的培养基(例如含有10％胎牛血清、5％BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim制)的RPMI1640培养基；杂交瘤SFM培养基(GIBCO-BRL制)；PFHM-II培养基(GIBCO-BRL制)等)培养本杂交瘤，从其培养上清液中纯化PM-1抗体的方法。
在本发明中，单克隆抗体可以使用以下重组抗体，即：从杂交瘤克隆抗体基因并插入到适当载体中，再将其导入到宿主中，采用基因重组技术产生的重组抗体(例如参照Borrebaeck，C.A.K.和Larrick，J.W.，Therapeutic Monoclonal Antibodies，published in the UnitedKingdom by Macmillan Publishers Ltd，1990)。
具体而言，从产生目标抗体的细胞(例如杂交瘤)中分离编码抗体可变(V)区的mRNA。分离mRNA时，利用公知的方法(例如胍超速离心法(Chirgwin，J.M.等，Biochemistry(1979)18，5294-5299)、AGPC法(Chomczynski，P.等，Anal.Biochem.(1987)162，156-159)等)制备全RNA，使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)等制备mRNA。另外，通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia制)可以直接制备mRNA。
使用逆转录酶由所得mRNA合成抗体V区的cDNA。合成cDNA时可以使用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(AMV ReverseTranscriptase First-strand cDNA Synthesis Kit)等进行合成。进行cDNA的合成和增幅时可以采用使用5’-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech制)和PCR的5’-RACE法(Frohman，M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，8998-9002；Belyavsky，A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17，2919-2932)。从所得PCR产物中纯化目标DNA片段，将其与载体DNA连接。再由此制作重组载体，将其导入到大肠杆菌等中选择菌落，制备所需的重组载体。利用公知的方法(例如脱氧法)来确认目标DNA的核苷酸序列。
当得到编码目标抗体V区的DNA时，将其与编码所需抗体恒定区(C区)的DNA连接，并插入到表达载体中。或者，将编码抗体V区的DNA插入到包括抗体C区的DNA的表达载体中。
制备本发明中使用的抗体时，如下所述，将抗体基因插入到表达载体中，使其在表达控制区例如增强子、启动子的控制下表达。然后，利用该表达载体来转化宿主细胞，可以使抗体表达。
在本发明中，为了降低对人的异种抗原性等，可以使用目标的人工修饰的基因重组抗体，例如嵌合(chimeric)抗体、人源化抗体、人抗体。上述修饰抗体可以采用已知的方法来制备。
嵌合抗体可如下得到：连接如上操作而得到的编码抗体V区的DNA和编码人抗体C区的DNA，将其插入到表达载体中，并导入到宿主中来产生嵌合抗体(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO92/19759)。采用该已知的方法可以得到对本发明有用的嵌合抗体。
人源化抗体也称作重构(reshaped)人抗体或人源化抗体，是将除人以外的哺乳动物(例如小鼠)的抗体的互补决定区(CDR)移植到人抗体的互补决定区的抗体。其一般的基因重组方法也已知(参照欧洲专利申请公开号EP125023、国际专利申请公开号WO92/19759)。
具体而言，利用PCR法由多个制作成末端部分具有重叠部分的寡核苷酸合成DNA序列，上述DNA序列设计成连接小鼠抗体的CDR和人抗体的构架区(FR)。将所得DNA与编码人抗体C区的DNA连接，之后插入到表达载体中，再将该表达载体导入到宿主中，产生人源化抗体(参照欧洲专利申请公开号EP239400、国际专利申请公开号WO92/19759)。
选择经由CDR连接的人抗体的FR，使互补决定区形成良好的抗原结合部位。根据需要，可以置换抗体可变区的构架区的氨基酸，使重构人抗体的互补决定区形成适当的抗原结合部位(Sato，K.等，CancerRes.(1993)53，851-856)。
在嵌合抗体、人源化抗体中使用人抗体C区。人抗体C区的例子有Cγ，例如可以使用Cγ1、Cγ2、Cγ3或Cγ4。为了改善抗体或其产生的稳定性，还可以修饰人抗体C区。
嵌合抗体包含来源于除人以外的哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的C区，而人源化抗体包含来源于除人以外的哺乳动物的抗体的互补决定区和来源于人抗体的构架区和C区，两者在人体内的抗原性低，因此可用作本发明中使用的抗体。
本发明中使用的人源化抗体的优选的具体例子有：人源化PM-1抗体(参照国际专利申请公开号WO92/19759)。
作为取得人抗体的方法，除上述方法外，还已知使用人抗体文库通过淘选取得人抗体的技术。例如，利用噬菌体展示法使人抗体的可变区在噬菌体表面作为单链抗体(scFv)来表达，可以选择与抗原结合的噬菌体。解析所选择的噬菌体的基因，可以决定编码与抗原结合的人抗体的可变区的DNA序列。清楚了与抗原结合的scFv的DNA序列，就可以制作包括该序列的适当的表达载体，取得人抗体。上述方法已经众所周知，可以参考WO92/01047、WO92/20791、WO93/06213、WO93/11236、WO93/19172、WO95/01438和WO95/15388。
上述构建的抗体基因可以利用公知的方法来表达。使用哺乳类细胞时，该抗体基因可以通过常用的有用的启动子、被表达的抗体基因、在其3’侧下游功能性结合有聚腺苷酸信号的DNA或包含该DNA的载体来表达。启动子/增强子的例子有：人巨细胞病毒即时早期启动子/增强子。
此外，作为本发明中使用的可用于抗体表达的启动子/增强子，可以使用逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴肾病毒40(SV40)等的病毒启动子/增强子和人延伸因子1α(HEF1α)等来源于哺乳类细胞的启动子/增强子。
例如，使用SV40启动子/增强子时，按照Mulligan等人的方法(Mulligan，R.C.等，Nature(1979)277，108-114)可以容易实施。而使用HEF1α启动子/增强子时，按照Mizushima等人的方法(Mizushima，S.和Nagata S.，Nucleic Acids Res.(1990)18，5322)可以容易实施。
使用大肠杆菌时，可以功能性地结合常用的有用的启动子、用于抗体分泌的信号序列、被表达的抗体基因来表达抗体基因。例如，启动子的例子有：lacZ启动子、araB启动子。使用lacZ启动子时，可以按照Ward等人的方法(Ward，E.S.等，Nature(1989)341，544-546；Ward，E.S.等，FASEB J.(1992)6，2422-2427)来表达基因。使用araB启动子时，可以按照Better等人的方法(Better，M.等，Science(1988)240，1041-1043)来表达基因。
当抗体在大肠杆菌的周质中产生时，可以使用pelB信号序列(Lei，S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169，4379-4383)作为用于抗体分泌的信号序列。分离周质中产生的抗体后，将抗体结构适当重折叠(refold)后再使用(例如参照WO96/30394)。
作为复制起源，可以使用来源于SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的复制起源。并且为了在宿主细胞系统中增殖基因拷贝数，表达载体可以包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、腺苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
可以使用任意的产生系统来制备本发明所使用的抗体。用于制备抗体的产生系统包括：体外和体内产生系统。体外产生系统的例子有：使用真核细胞的产生系统和使用原核细胞的产生系统。
使用真核细胞时，有使用动物细胞、植物细胞或真菌细胞的产生系统。动物细胞已知有：(1)哺乳类细胞，例如CHO、COS、骨髓瘤、幼仓鼠肾(BHK)、HeLa、Vero等；(2)两栖类细胞，例如爪蟾卵母细胞(Xenopus oocyte)；或(3)昆虫细胞，例如sf9、sf21、Tn5等。植物细胞已知有：来源于烟草(Nicotiana tabacum)的细胞，可对其进行愈伤组织培养。真菌细胞已知有：酵母(Yeast)，例如酵母菌(Saccharomyces)属(例如酿酒酵母)；丝状菌，例如曲霉(Aspergillus)属(例如黑曲霉)等。
使用原核细胞时，有使用细菌细胞的产生系统。细菌细胞已知有：大肠杆菌(E.coli)、枯草菌。
通过转化将目标抗体基因导入到上述细胞中，通过在体外培养被转化的细胞得到抗体。按照公知的方法进行培养。例如可以使用DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM作为培养液，还可以结合使用胎牛血清(FCS)等血清补充液。另外，可以通过将导入了抗体基因的细胞移植到动物的腹腔等中，在体内产生抗体。
另一方面，体内产生系统的例子有：使用动物的产生系统和使用植物的产生系统。使用动物时，有使用哺乳动物、昆虫的产生系统。
哺乳动物可以使用：山羊、猪、绵羊、小鼠、牛等(Vicki Glaser，SPECTRUM Biotechnology Applications，1993)。昆虫可以使用：蚕。植物例如可以使用：烟草。
将抗体基因导入到上述动物或植物中，在动物或植物体内产生抗体并回收。例如，在编码山羊β-酪素等乳汁中固有产生的蛋白质的基因的中途插入抗体基因，作为融合基因来制备。将包括插入了抗体基因的融合基因的DNA片段注入到山羊胚胎中，将该胚胎移植到雌山羊体内。接受了胚胎的山羊生出转基因山羊，从该转基因山羊或其后代产生的乳汁中可以得到目标抗体。为了使转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量增加，可以给予上述转基因山羊适当的激素(Ebert，K.M.等，Bio/Technology(1994)12，699-702)。
使用蚕时，使蚕感染插入有目标抗体基因的杆状病毒，从该蚕的体液中得到所需抗体(Maeda，S.等，Nature(1985)315，592-594)。并且，使用烟草时，将目标抗体基因插入到植物表达用载体例如pMON530中，将该载体导入到根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)等细菌中。用该细菌感染烟草例如烟草(Nicotiana tabacum)，从该烟草的叶中得到所需抗体(Julian，K.-C.Ma等，Eur.J.Immunol.(1994)24，131-138)。
如上所述，利用体外或体内产生系统产生抗体时，可以将编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别插入到表达载体中，使宿主同时转化；或者将编码H链和L链的DNA插入到单一的表达载体中，使宿主进行转化(参照国际专利申请公开号WO94/11523)。
本发明中使用的抗体只要可适用于本发明，可以是抗体片段或其修饰物。例如，抗体片段的例子有：Fab、F(ab’)2、Fv或将H链和L链的Fv经适当的接头连接而得到的单链Fv(scFv)。
具体而言，用酶(例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)处理抗体来生成抗体片段，或者构建编码上述抗体片段的基因，将该基因导入到表达载体中，之后使之在适当的宿主细胞中表达(例如参照Co，M.S.等，J.Immunol.(1994)152，2968-2976；Better，M.&Horwitz，A.H.，Methodsin Enzymology(1989)178，476-496；Plueckthun，A.&Skerra，A.，Methods in Enzymology(1989)178，497-515；Lamoyi，E.，Methods inEnzymology(1989)121，652-663；Rousseaux，J.等，Methods inEnzymology(1989)121，663-666；Bird，R.E.等，TIBTECH(1991)9，132-137)。
scFv可以通过连接抗体的H链V区和L链V区而得到。该scFv中H链V区和L链V区经由接头、优选肽接头进行连接(Huston，J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85，5879-5883)。scFv中的H链V区和L链V区可以来源于上述任何抗体。连接V区的肽接头例如使用包含12～19个氨基酸残基的任意的单链肽。
编码scFv的DNA可如下得到：以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA和编码L链或L链V区的DNA为模板，利用PCR法使用规定该部分的两端的引物对来扩增模板序列中编码所需氨基酸序列的DNA部分，接着再将编码肽接头部分的DNA和连接该接头的两端和H链、L链的规定引物对组合进行扩增，得到编码scFv的DNA。
一旦制作了编码scFv的DNA，则可以按照常规方法得到含有上述DNA的表达载体和利用该表达载体进行转化的宿主。另外，使用该宿主，按照常规方法可以得到scFv。
进行与上述相同的操作，取得并表达上述抗体片段的基因，利用宿主产生上述抗体片段。本发明中所说的“抗体”还包含上述抗体片段。
作为修饰抗体，还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子结合的抗体。本发明中所说的“抗体”还包含这些修饰抗体。上述修饰抗体可以通过对所得抗体施行化学修饰而得到。这些方法已经在该领域中确立。
象上述一样产生、表达的抗体可以自细胞内外或宿主中分离，并纯化至均匀。本发明中使用的抗体的分离、纯化可以利用亲和层析来进行。用于亲和层析的柱例如有：蛋白A柱、蛋白G柱。用于蛋白A柱的载体例如有：HyperD、POROS、SepharoseF.F.等。此外，可以使用普通蛋白质中使用的分离、纯化方法，没有任何限定。
例如，可以适当选择、组合除上述亲和层析以外的层析柱、过滤器、超滤、盐析、透析等来分离、纯化本发明中使用的抗体。层析例如有：离子交换层析、疏水层析、凝胶过滤等。上述层析可适用于高效液相层析(HPLC)。还可以使用反相HPLC。
上述所得抗体的浓度测定可以通过测定吸光度或ELISA等来进行。即，通过测定吸光度来测定浓度时，用PBS(-)适当稀释抗体溶液，之后在280nm下测定吸光度，以1.35OD＝1mg/ml算出浓度。另外，利用ELISA来测定浓度时可如下进行。即，将100μl经0.1M的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml的山羊抗人IgG(TAG制)加入96孔平板(Nunc制)中，在4℃下培育过夜，固定抗体。封闭后，添加100μl适当稀释的本发明中使用的抗体或包括抗体的样品或者作为标准品的人IgG(Cappel制)，在室温下培育1小时。
清洗后，加入100μl稀释5000倍的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(BIO SOURCE制)，在室温下培育1小时。清洗后，加入基质溶液进行培育，之后使用MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad制)在405nm下测定吸光度，算出目标抗体的浓度。
本发明中使用的IL-6变异体是具有与IL-6受体结合的活性、且不传递IL-6的生物活性的物质。即，IL-6变异体虽然与IL-6竞争性地与IL-6受体结合，但并不传递IL-6的生物活性，因此阻断了IL-6介导的信号传递。
IL-6变异体可以通过置换IL-6的氨基酸序列的氨基酸残基，导入变异来进行制作。作为IL-6变异体的来源的IL-6，其来源没有限定，但考虑抗原性等时优选为人IL-6。
具体而言，使用公知的分子模型制作程序例如WHATIF(Vriend等，J.Mol.Graphics(1990)8，52-56)预测IL-6氨基酸序列的二级结构，再评价对被置换的氨基酸残基整体的影响。决定适当的置换氨基酸残基后，以包括编码人IL-6基因的核苷酸序列的载体为模板，利用通常进行的PCR法导入变异使氨基酸被置换，得到编码IL-6变异体的基因。根据需要将其插入到适当的表达载体中，根据上述重组抗体的表达、产生和纯化方法可以得到IL-6变异体。
IL-6变异体的具体例子公开在Brakenhoff等，J.Biol.Chem.(1994)269，86-93和Savino等，EMBO J.(1994)13，1357-1367、WO96/18648、WO96/17869中。
本发明中使用的IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是具有与各IL-6受体或IL-6结合的活性、且不传递IL-6的生物活性的物质。即，IL-6部分肽或IL-6受体部分肽与IL-6受体或IL-6结合而将其捕获，从而特异性地阻碍IL-6与IL-6受体的结合。其结果，由于不传递IL-6的生物活性，因此阻断了IL-6介导的信号传递。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽是包括IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中参与IL-6和IL-6受体的结合的区的部分或全部氨基酸序列的肽。这种肽通常包括10～80个、优选20～50个、更优选20～40个氨基酸残基。
IL-6部分肽或IL-6受体部分肽可如下制作：在IL-6或IL-6受体的氨基酸序列中特定参与IL-6和IL-6受体的结合的区，基于该特定的区的部分或全部氨基酸序列利用通常已知的方法例如基因工程方法或肽合成法进行制作。
利用基因工程方法制作IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，将编码所需肽的DNA序列插入到表达载体中，按照上述重组抗体的表达、产生和纯化方法可以得到。
利用肽合成法制作IL-6部分肽或IL-6受体部分肽时，可以采用肽合成中通常使用的方法，例如固相合成法或液相合成法。
具体可以按照续医药品的开发第14卷肽合成(监修矢岛治明广川书店1991年)中记载的方法来合成。作为固相合成法，例如使用以下方法：使欲合成的肽的C末端所对应的氨基酸与不溶于有机溶剂的支撑体结合，然后通过交替重复进行将α-氨基和侧链官能团用适当的保护基保护的氨基酸按照从C末端到N末端方向的顺序使每一氨基酸缩合的反应、和使结合在树脂上的氨基酸或肽的α-氨基的该保护基脱离的反应来增长肽链的方法。根据所使用的保护基的种类，固相肽合成法大致分为：Boc法和Fmoc法。
如此操作合成目标肽后进行脱保护反应和自支撑体上切断肽链的反应。在肽链的切断反应中，Boc法通常使用氟化氢或三氟甲磺酸，而Fmoc法通常使用TFA。在Boc法中，例如在茴香醚的存在下用氟化氢处理上述保护肽树脂。之后，脱去保护基并自支撑体上切断肽链，回收肽。将回收的肽冷冻干燥得到粗肽。而在Fmoc法中，例如可以在TFA中进行与上述相同的操作来进行脱保护反应和自支撑体上切断肽链。
所得粗肽可以利用HPLC进行分离、纯化。其洗脱时可以使用蛋白质的纯化中通常使用的水-乙腈系溶剂在最佳条件下进行。分离收集对应于所得色谱图的蜂的组分，将其冷冻干燥。对于如此操作而纯化的肽组分，通过利用质谱分析进行的分子量解析、氨基酸组成解析或氨基酸序列解析等进行鉴定。
IL-6部分肽和IL-6受体部分肽的具体例子公开在日本特开平2-188600、日本特开平7-324097、日本特开平8-311098和美国专利公报US5210075中。
本发明中使用的抗体可以是与聚乙二醇(PEG)、放射性物质、毒素等各种分子结合的缀合抗体。这种缀合抗体可以通过对所得抗体进行化学修饰而得到。需要说明的是，抗体的修饰方法在该领域已经确立。本发明中的“抗体”还包括上述缀合抗体。
本发明的伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂可以在伴有CNV的疾病的预防和/或治疗中使用。
在本发明中，CNV是指脉络膜的血管贯穿布鲁赫膜和视网膜色素上皮进行异位增殖。在老年性黄斑变性中认为CNV是由炎性细胞引起的，上述炎性细胞以为了吞噬因加龄所产生的氧化应激而蓄积在视网膜色素上皮附近的玻璃疣而浸润的巨噬细胞为主。在慢性轻微炎症反应的持续中，由炎性细胞产生VEGF等血管生成因子，其结果，引起炎性血管生成。来自在CNV申增殖的未成熟的血管网的出血或包括脂肪的血浆成分的渗出使神经视网膜的功能急速下降，成为带来严重的视力障碍的疾病的原因。
伴有CNV的疾病的代表性的例子有：老年性黄斑变性症、近视性脉络膜血管生成、特发性脉络膜血管生成等。
老年性黄斑变性症是指，由于黄斑因年龄增加而发生变性，故主要以变形视(斜视)、中心暗点的形式导致视力下降的疾病。其中渗出型老年性黄斑变性症是导致急速且严重的视力下降的预后不良的疾病，其主要病态为CNV。检查眼睛时显示视网膜色素上皮剥离、浆液性视网膜剥离、视网膜下出血、硬性白斑等渗出性变化。
近视性脉络膜血管生成是引起具有病态近视的人的视力下降的最普通的疾病，在黄斑部重新形成血管时经常出现在视野中心产生暗点的纤维性色素性瘢痕。日本人中普遍的高度近视的实态是眼睛的前后长度(眼轴)异常延长，随之在眼底后极部出现CNV等各种近视特有的眼底病变，成为视力障碍的原因。
特发性脉络膜血管生成往往在年轻女性的一只眼睛中发生，在能够排除近视、葡萄膜炎、外伤、胶原病、感染等情况下可以诊断。在视网膜下确认到小型的新生血管组织和出血、浮肿等渗出性变化。用抗炎性类固醇治疗，数月后症状有所改善，这暗示与炎症有关。
本发明的伴有CNV的疾病并不限于上述疾病，还包括因后眼部葡萄膜炎、外伤性脉络膜破裂、视网膜血管样纹、眼组织胞浆菌病综合征等引发布鲁赫膜·视网膜色素上皮水平障碍和其后继发的炎性血管生成的其他疾病而引起的伴有CNV的疾病。
在本发明中，“伴有CNV的疾病的治疗”意思是指在伴有CNV的疾病中抑制或改善上述疾病所引起的症状。伴有CNV的疾病的治疗还指抑制发展中的CNV和抑制由来自异常的新生血管的出血和血浆成分的渗出所引起的神经视网膜的功能下降。“伴有CNV的疾病的预防”是指在血管生成进行之前的炎症阶段抑制CNV的发病。
在本发明中，“抑制CNV”除了指抑制血管生成以外，还指抑制视网膜内的炎性反应(抑制视网膜内的炎性细胞的增殖)和抑制由炎性细胞引起的血管生成因子的产生。视网膜内的炎性反应可源于玻璃疣等新陈代谢中产生的废物的蓄积，也可源于外伤。
在本发明中可以利用荧光眼底造影检查等检测血管生成的大小(体积)来确认是否抑制了CNV。当通过给予本发明的药物血管生成的体积减少时，可见CNV得到抑制。CNV的检测并不限于上述方法，可以按照公知的方法进行检测，还可以按照实施例中记载的方法进行检测。
另外，随着伴有CNV的疾病的发展会出现变形视、中心暗点等视力下降，但通过给予本发明的药物上述视力下降得到改善时，可见本发明的药物对伴有CNV的疾病的患者是有用的。
本发明所使用的IL-6抑制剂的抑制IL-6信号传递的活性可以利用通常使用的方法进行评价。具体而言，培养IL-6依赖性人骨髓瘤株(S6B45、KPMM2)、人Lennert T淋巴瘤细胞株KT3或IL-6依赖性细胞MH60.BSF2，向其中添加IL-6，同时加入IL-6抑制剂，测定IL-6依赖性细胞的3H-胸苷摄入率。另外，培养IL-6受体表达细胞U266，添加125I标记的IL-6，同时加入IL-6抑制剂，测定结合在IL-6受体表达细胞上的125I标记的IL-6。在上述分析系统中除了设置存在IL-6抑制剂的组以外，还设置不含IL-6抑制剂的阴性对照组，比较两组得到的结果，可以评价IL-6抑制剂的IL-6抑制活性。
如后述实施例所示，通过给予抗IL-6受体抗体，确认CNV的发展得到抑制，这表明：抗IL-6受体抗体等IL-6抑制剂作为伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂是有用的。
给予本发明的伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂的对象为哺乳动物。哺乳动物优选为人。
本发明的伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂可以以药物的形式进行给药，可以通过口服或非口服进行全身或局部给药。例如，可以选择点滴等静脉内注射、肌肉内注射、腹腔内注射、皮下注射、栓剂、灌肠剂、口服肠溶剂等，可以根据患者的年龄、症状选择适当的给药方法。有效给药量在0.01～100mg/kg体重/次的范围内选择。或者可以选择1～1000mg/患者、优选5～50mg/患者的给药量。关于优选的给药量和给药方法，例如给予抗IL-6受体抗体时，血中存在游离抗体的程度的量为有效给药量，具体例子有：一个月(4周)分一次～数次给予0.5～40mg/kg体重、优选1～20mg/kg体重，例如按照2次/周、1次/周、1次/2周、1次/4周等给药时间表以点滴等静脉内注射、皮下注射等方法进行给药等。可以边观察给药后的状态和血液检查值的动向边调整给药时间表，使给药间隔从2次/周或1次/周延长至1次/2周、1次/3周、1次/4周等。
本发明中，可以在伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂中添加保存剂或稳定剂等制剂上可接受的载体。制剂上可接受的载体是指可与上述药物同时进行给药的制剂上可接受的材料，其本身可以是具有或不具有上述CNV的增殖抑制效果的材料。即使是不具有CNV的增殖抑制效果的材料，但通过与IL-6抑制剂结合使用而具有协同或相加的稳定化效果的材料亦可。
制剂上可接受的材料的例子有：灭菌水或生理盐水、稳定剂、赋形剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂、螯合剂(EDTA等)、粘合剂等。
在本发明中，表面活性剂的例子有非离子表面活性剂，其典型的例子有：脱水山梨糖醇单辛酸酯、脱水山梨糖醇单月桂酸酯、脱水山梨糖醇单棕榈酸酯等脱水山梨糖醇脂肪酸酯；甘油单辛酸酯、甘油单肉豆蔻酸酯、甘油单硬脂酸酯等甘油脂肪酸酯；十甘油单硬脂酸酯、十甘油二硬脂酸酯、十甘油单亚油酸酯等聚甘油脂肪酸酯；聚氧乙烯脱水山梨糖醇单月桂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单硬脂酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇单棕榈酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三油酸酯、聚氧乙烯脱水山梨糖醇三硬脂酸酯等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯等聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯；聚氧乙烯甘油单硬脂酸酯等聚氧乙烯甘油脂肪酸酯；聚乙二醇二硬脂酸酯等聚乙二醇脂肪酸酯；聚氧乙烯十二烷基醚等聚氧乙烯烷基醚；聚氧乙烯聚氧丙烯二醇、聚氧乙烯聚氧丙烯丙醚、聚氧乙烯聚氧丙烯鲸蜡醚等聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚；聚氧乙烯壬基苯基醚等聚氧乙烯烷基苯基醚；聚氧乙烯蓖麻油、聚氧乙烯硬化蓖麻油(聚氧乙烯氢化蓖麻油)等聚氧乙烯硬化蓖麻油；聚氧乙烯山梨糖醇蜂蜡等聚氧乙烯蜂蜡衍生物；聚氧乙烯羊毛脂等聚氧乙烯羊毛脂衍生物；聚氧乙烯硬脂酸酰胺等聚氧乙烯脂肪酸酰胺等具有HLB6～18的非离子表面活性剂。
表面活性剂的例子还有阴离子表面活性剂。其典型例子有：十六烷基硫酸钠、十二烷基硫酸钠、油烯基硫酸钠等含有碳原子数为10～18的烷基的烷基硫酸盐；聚氧乙烯十二烷基硫酸钠等环氧乙烷的平均加成摩尔数为2～4且烷基的碳原子数为10～18的聚氧乙烯烷基醚硫酸盐；十二烷基磺基琥珀酸酯钠等烷基的碳原子数为8～18的烷基磺基琥珀酸酯盐；卵磷脂、甘油磷脂等天然表面活性剂；神经磷脂等鞘磷脂；碳原子数为12～18的脂肪酸的蔗糖脂肪酸酯等。
在本发明的药物中可以将上述表面活性剂的一种或两种以上组合、进行添加。本发明的制剂中使用的优选的表面活性剂为吐温20、吐温40、吐温60或吐温80等聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯，特别优选吐温20和吐温80。还优选泊洛沙姆(Pluronic等)所代表的聚氧乙烯聚氧丙烯二醇。
表面活性剂的添加量根据使用的表面活性剂的种类而异，使用吐温20或吐温80时，添加量通常为0.001～100mg/ml，优选为0.003～50mg/ml，进一步优选为0.005～2mg/ml。
本发明中，缓冲剂的例子有：磷酸、枸橼酸缓冲液、乙酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、磷酸钾、葡萄糖酸、癸酸、去氧胆酸、水杨酸、三乙醇胺、富马酸等、其他有机酸等；或碳酸缓冲液、Tris缓冲液、组氨酸缓冲液、咪唑缓冲液等。
还可以将药物溶解在溶液制剂领域所公知的水性缓冲液中制成溶液剂。缓冲液的浓度通常为1～500mM，优选为5～100mM，进一步优选为10～20mM。
另外，本发明的药物可以包括其他低分子量的多肽、血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白等蛋白质、氨基酸、多糖和单糖等糖类或碳水化合物、糖醇。
本发明中，氨基酸的例子有碱性氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、组氨酸、鸟氨酸等，或这些氨基酸的无机盐(优选盐酸盐、磷酸盐的形式，即磷酸氨基酸)。使用游离氨基酸时，通过添加适当的生理上可接受的缓冲物质例如无机酸、特别是盐酸、磷酸、硫酸、乙酸、甲酸或它们的盐来调节至优选的pH值。此时，使用磷酸盐可得到特别稳定的冷冻干燥物，因此特别有利。在制剂中实质上不含有机酸例如苹果酸、酒石酸、枸橼酸、琥珀酸、富马酸等的情况下或不存在对应的阴离子(苹果酸离子、酒石酸离子、枸橼酸离子、琥珀酸离子、富马酸离子等)的情况下磷酸盐特别有利。优选的氨基酸为：精氨酸、赖氨酸、组氨酸或鸟氨酸。还可以使用：酸性氨基酸，例如谷氨酸和天冬氨酸及其盐的形式(优选钠盐)；或者中性氨基酸，例如异亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸或丙氨酸；或者芳族氨基酸，例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸或衍生物的N-乙酰色氨酸。
本发明中，多糖和单糖等糖类或碳水化合物的例子有：葡聚糖、葡萄糖、果糖、乳糖、木糖、甘露糖、麦芽糖、蔗糖、海藻糖、棉子糖等。
本发明中，糖醇的例子有：甘露醇、山梨醇、肌醇等。
将本发明的药物制成注射用水溶液时，例如可以和生理盐水、包括葡萄糖或其他助剂(例如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠)的等渗溶液混合。该水溶液可以和适当的助溶剂(例如醇(乙醇等)、多元醇(丙二醇、PEG等)、非离子性表面活性剂(例如吐温80、HCO-50)等)结合使用。
根据需要可以进一步含有稀释剂、助溶剂、pH调节剂、无痛化剂、含硫还原剂、抗氧剂等。
本发明中，含硫还原剂的例子有：N-乙酰半胱氨酸、N-乙酰同型半胱氨酸、硫辛酸、硫二甘醇、硫代乙醇胺、硫代甘油、硫代山梨糖醇、巯基乙酸及其盐、硫代硫酸钠、谷胱甘肽以及碳原子数为1～7的硫代链烷酸等含有巯基的还原剂。
本发明中，抗氧剂的例子有：异抗坏血酸、二丁基羟基甲苯、丁基羟基茴香醚、α-生育酚、醋酸生育酚、L-抗坏血酸及其盐、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-抗坏血酸硬脂酸酯、亚硫酸氢钠、亚硫酸钠、没食子酸三戊酯、没食子酸丙酯或乙二胺四乙酸二钠(EDTA)、焦磷酸钠、偏磷酸钠等螯合剂。
根据需要，可以将药物装入微囊(羟甲基纤维素、明胶、聚[甲基甲基丙烯酸]等的微囊)内或者制成胶体释药系统(脂质体、白蛋白微球、微乳、纳米微粒和纳米囊等)(参照“Remington’s PharmaceuticalScience16版”Oslo Ed.，1980等)。并且，将药物制成缓释制剂的方法已公知，可应用于本发明(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.(1981)，15：167-277；Langer，Chem.Tech.(1982)，12：98-105；美国专利第3,773,919号；欧洲专利申请公开(EP)第58,481号；Sidman等，Biopolymers(1983)，22：547-556；EP第133,988号)。
所使用的制剂上可接受的载体根据剂型从上述载体中适当或组合选择，但并不限于这些。
本发明涉及治疗伴有脉络膜血管生成的疾病的方法，该方法包括：对患有伴有CNV的疾病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
本发明中，“对象”是指给予本发明的伴有CNV的疾病的预防和/或治疗药和CNV抑制剂的生物体、该生物体的体内的一部分。生物体没有特别限定，包括动物(例如人、家畜动物类、野生动物)。
对“生物体的体内一部分”没有特别限定，可以优选列举：脉络膜或脉络膜的周边部位。
本发明中，“给药”包括口服或非口服给药。口服给药的例子有：以口服制剂的形式进行给药。口服制剂可以选择颗粒剂、散剂、片剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂或悬浮剂等剂型。
非口服给药的例子有：以注射剂的形式进行给药。注射剂的例子有：点滴等静脉注射剂、皮下注射剂、肌肉注射剂或腹腔内注射剂等。另外，通过采用基因治疗的方法将应该给予的包括寡核苷酸的基因导入到机体内，可以达到本发明的方法的效果。还可以将本发明的药物对欲施行处置的范围进行局部给药。例如，还可以通过手术中的局部注入、导管的使用或将本发明的编码肽的DNA进行靶基因送达来进行给药。可以和伴有CNV的疾病的公知的治疗方法例如激光凝固、黄斑下手术、中央凹转移术、光线力学疗法、药物疗法等同时或间隔给予本发明的制剂。
需要说明的是，本说明书中引用的所有先行技术文献均作为参照而纳入本说明书中。
实施例
以下，通过实施例来进一步具体说明本发明，但本发明并不受这些实施例的限制。
[实施例1]
使用CNV模型小鼠，研究在CNV的发展中有关IL-6受体的信号传递的作用。
首先，用激光凝固处置C57BL/6小鼠以诱导CNV。对于激光凝固处置3天后的小鼠分别通过ELISA和RT-PCR研究脉络膜中IL-6的蛋白质水平和mRNA水平。其结果，CNV小鼠的脉络膜中的IL-6蛋白质水平和mRNA水平显著高于相同年龄的正常对照小鼠(p＜0.05)。
接下来，将大鼠抗小鼠IL-6受体单克隆抗体MR16-1进行光凝固，之后立即按10μg/g体重(BW)或100μg/g(BW)进行腹腔内给药。光凝固一周后制作将脉络膜进行了凝集素染色的伸展标本，使用共焦显微镜算出每1μm的CNV的面积和，评价CNV的体积(图1、2)。
其结果，通过用MR16-1进行处置(以10μg/g BW的浓度处置的小鼠：400427+95917μm3；以100μg/g BW的浓度处置的小鼠：290256+74982μm3)，与仅用赋形剂进行处置的小鼠(496216+81286μm3)相比，CNV的体积依赖于用量得到显著抑制(图1、2)。
由以上结果可知：抑制有关IL-6受体的信号传递的结果是抑制了CNV的发展。上述结果表明：可以将抑制IL-6受体作为用于抑制与AMD相关的CNV的治疗方针。
产业实用性
本发明的治疗药，其目的在于抑制伴随CNV的炎症，可以在VEGF诱发的血管生成发展之前的炎症阶段使用，认为此时不会象进入血管生成发展期之后的治疗那样不可逆地残留神经障碍，可以抑制来自异常新生血管的出血或血浆成分的渗出所引起的神经视网膜的功能下降。
目前，抗VEGF适配子已在世界上多个国家(美国、加拿大、巴西等)授权销售并正在日本进行临床试验，用抗VEGF适配子进行治疗时虽然确认具有使血管生成退化的效果，并且与对照组相比视力下降为轻度，但还没有达到改善视力的效果。这意味着当神经视网膜因出血或浮肿而受到伤害时残留有不可逆的变性，暗示一旦血管生成发展后进行抗血管生成疗法存在局限。在日本得到厚生劳动省唯一认可的治疗老年性黄斑变性的CNV的疗法-光线力学疗法是在新生血管中局部性地促进凝固系统使形成血栓，从而阻塞新生血管，但该疗法也和抗VEGF适配子的治疗一样，无法满足视力预后。
如上所述，在老年性黄斑变性的临床治疗中希望开发以在神经视网膜出现功能障碍前的更早期的病态为目标的疗法。从这个角度考虑，本发明的治疗药瞄准更好的视力预后，期待其成为在现有治疗中没有充分达到视力改善的老年性黄斑变性患者的一大福音。

Claims (36)

1. 伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药，该药物含有IL-6抑制剂作为有效成分。
2. 权利要求1的预防和/或治疗药，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
3. 权利要求1的预防和/或治疗药，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
4. 权利要求2或3的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
5. 权利要求2或3的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
6. 权利要求2或3的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为重组抗体。
7. 权利要求6的预防和/或治疗药，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
8. 权利要求1~7中任一项的预防和/或治疗药，其特征在于：伴有脉络膜血管生成的疾病为老年性黄斑变性症、近视性脉络膜血管生成、特发性脉络膜血管生成。
9. 脉络膜血管生成抑制剂，该抑制剂含有IL-6抑制剂作为有效成分。
10. 权利要求9的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
11. 权利要求9的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
12. 权利要求10或11的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
13. 权利要求10或11的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
14. 权利要求10或11的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为重组抗体。
15. 权利要求14的脉络膜血管生成抑制剂，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
16. 治疗对象中伴有脉络膜血管生成的疾病的方法，该方法包括：对患有伴有脉络膜血管生成的疾病的对象给予IL-6抑制剂的步骤。
17. 权利要求16的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
18. 权利要求16的方法，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
19. 权利要求17或18的方法，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
20. 权利要求17或18的方法，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
21. 权利要求17或18的方法，其特征在于：抗体为重组抗体。
22. 权利要求21的方法，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
23. IL-6抑制剂在制备伴有脉络膜血管生成的疾病的预防和/或治疗药中的应用。
24. 权利要求23的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
25. 权利要求23的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
26. 权利要求24或25的应用，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
27. 权利要求24或25的应用，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
28. 权利要求24或25的应用，其特征在于：抗体为重组抗体。
29. 权利要求28的应用，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
30. IL-6抑制剂在制备脉络膜血管生成抑制剂中的应用。
31. 权利要求30的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6的抗体。
32. 权利要求30的应用，其特征在于：IL-6抑制剂为识别IL-6受体的抗体。
33. 权利要求31或32的应用，其特征在于：抗体为单克隆抗体。
34. 权利要求31或32的应用，其特征在于：抗体为识别人IL-6或人IL-6受体的抗体。
35. 权利要求31或32的应用，其特征在于：抗体为重组抗体。
36. 权利要求35的应用，其特征在于：抗体为嵌合抗体、人源化抗体或人抗体。
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