KR20080064154A - 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제 - Google Patents

췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 항 IL-6 수용체 항체의 췌도(膵島) 이식에 있어서의 이식 췌도 장애를 억제하는 효과에 대해서 검토를 행하였다. 그 결과, 항 IL-6 수용체 항체가 이식 췌도 장애를 경감하고, 췌도 생착의 개선을 가져와, 리시피언트의 고혈당을 시정하는 것이 명확해졌다. 또한, 본 발명의 항 IL-6 수용체 항체를 투여함으로써, 이식 후 침윤세포의 염증성 사이토카인의 생산이 억제되는 것이 명확해졌다. 즉, 본 발명자들은 본 발명에 의해 처음으로 항 IL-6 수용체 항체에 의해 췌도 이식시의 이식 췌도 장애를 억제하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다.

Description

췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제{Inhibitor of transplanted islet dysfunction in islet transplantation}
본 발명은 IL-6 저해제를 유효성분으로서 함유하는, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제, 및 그의 이용에 관한 것이다.
인슐린 의존 당뇨병의 성인(成因)은 혈당 강하 호르몬인 인슐린 생산세포(췌도 β세포)가 면역학적 메커니즘에 의해 선택적으로 파괴되는 것에 의한 것으로, 그 결과 발증 후에 고혈당이 되어, 각종 장애를 일으키는 것이 알려져 있다. 종래의 치료법은 부족한 인슐린 제제를 투여(주사)하여, 고혈당을 시정하고자 하는 것이었다. 그러나, 인슐린에 의한 치료로는 엄밀한 혈당관리는 곤란하여, 때로는 결과적으로 과잉투여가 되어, 생명에 위험한 저혈당이 되는 경우가 있다. 또한, 당뇨병에서는 발증 후에 당뇨병 혈관합병증(망막증, 신증, 신경증 등)이 진전되고, 인슐린 주사 등의 종래 치료법으로는 그 진전을 저지할 수 없어, 치료상 중요한 문제가 되고 있다. 생리적으로는 주로 췌도 β세포에 의한 조절기구에 의해 혈당은 제어되나, 인슐린 의존 당뇨병에서는 그 결락(缺落)에 의해 혈당치의 급격한 변동을 초래하여, 상기 임상증상의 원인이 된다.
최근, 유럽에서 당뇨병의 치료수단으로서 췌장의 랑게르한스섬(膵島-췌도)을 이식하는 췌도 이식의 임상응용이 개시되었다. 인슐린 투여에 의한 치료가 아닌 인슐린 생산세포를 이식하고자 하는 시험이다. 임상 췌도 이식의 실제 기술은 국소마취하, 초음파 가이드하에 경피경폐적으로 문맥(門脈)을 천자(穿刺)하여 카테터를 유치(留置)하고, 동부(同部)로부터 도너 췌도를 간내에 이식한다. 췌도 그래프트는 문맥 말단에 생착(生着), 인슐린을 분비하여 혈당치를 조절한다. 췌도 이식이 성공한 경우, 당뇨병 리시피언트(recipient)는 정상 혈당이 되어 인슐린 치료가 불요해진다. 그러나 현재까지 임상 췌도 이식의 성공예는 한정되고, 또한 1인의 리시피언트에 대해 2~3인의 췌장으로부터 단리된 췌도가 이식되고 있는 것이 현재 상황이다. 즉, 이식 직후, 췌도 기능장애가 발생하여, 그래프트 생착률이 저하하므로, 1인으로부터 1인으로의 이식으로는 충분하지 않아 2~3인의 도너로부터 1인으로의 이식이 행해지고 있다. 일설에는 이식 그래프트의 20~30%밖에 생착하지 않는다고 일컬어지고 있다. 이 기능장애의 상세는 미해명으로 임상 췌도 이식의 성적향상에 있어서 매우 중요한 과제가 되고 있다.
또한, 종래의 뇌사 도너 또는 심정지 도너의 췌장으로부터 분리한 췌도 이식에 더하여, 최근에는 건강한 정상 생체 도너의 췌장 일부를 절제하고, 췌도를 분리 정제하여 당뇨병 환자에게 이식하는 생체 췌도 이식에 대해서도 성공예가 보고되고 있다. 생체 췌도 이식에서는 도너로의 침습이나 부담이 있으므로, 이식 후의 이식 췌도 장애를 억제하고, 보다 소수의 도너 췌도를 사용하여 치료가 가능해지는 것이 요망된다.
IL-6는 B세포 자극인자2(BSF2) 또는 인터페론 β2라고도 호칭된 사이토카인 이다. IL-6는 B 림프구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되고(비특허문헌 1), 그 후, 각종 세포의 기능에 영향을 미치는 다기능 사이토카인인 것이 명확해졌다(비특허문헌 2). IL-6는 T 림프구계 세포의 성숙화를 유도하는 것이 보고되어 있다(비특허문헌 3).
IL-6는 세포 상에서 2종의 단백질을 매개로 하여 그 생물학적 활성을 전달한다. 하나는 IL-6가 결합하는 분자량 약 80 kDa의 리간드 결합성 단백질의 IL-6 수용체이다(비특허문헌 4, 5). IL-6 수용체는 세포막을 관통하여 세포막 상에 발현하는 막 결합형 외에, 주로 그 세포외 영역으로 되는 가용성 IL-6 수용체로서도 존재한다.
다른 하나는 비(非)리간드 결합성의 시그널 전달에 관여하는 분자량 약 130 kDa의 막 단백질 gp130이다. IL-6와 IL-6 수용체는 IL-6/IL-6 수용체 복합체를 형성하고, 이어서 gp130과 결합함으로써, IL-6의 생물학적 활성이 세포내에 전달된다(비특허문헌 6).
IL-6 저해제는 IL-6의 생물학적 활성의 전달을 저해하는 물질이다. 지금까지, IL-6에 대한 항체(항 IL-6 항체), IL-6 수용체에 대한 항체(항 IL-6 수용체 항체), gp130에 대한 항체(항 gp130 항체), IL-6 개변체, IL-6 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드 등이 알려져 있다.
항 IL-6 수용체 항체에 관해서는 몇가지의 보고가 있다(비특허문헌 7, 8, 특허문헌 1~3). 그 중 하나인 마우스 항체 PM-1(비특허문헌 9)의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간 항체로 이식함으로써 얻어진 인간화 PM-1 항체가 알려져 있다(특허문헌 4).
또한, 본 출원의 발명에 관련하는 선행기술문헌 정보를 이하에 나타낸다.
비특허문헌 1: Hirano, T. et al., Nature (1986) 324, 73-76
비특허문헌 2: Akira, S. et al., Adv. in Immunology (1993) 54, 1-78
비특허문헌 3: Lotz, M. et al., J. Exp. Med. (1988) 167, 1253-1258
비특허문헌 4: Taga, T. et al., J. Exp. Med. (1987) 166, 967-981
비특허문헌 5: Yamasaki, K. et al., Science (1988) 241, 825-828
비특허문헌 6: Taga, T. et al., Cell (1989) 58, 573-581
비특허문헌 7: Novick, D. et al., Hybridoma (1991) 10, 137-146
비특허문헌 8: Huang, Y. W. et al., Hybridoma (1993) 12, 621-630
비특허문헌 9: Hirata, Y. et al., J. Immunol. (1989) 143, 2900-2906
특허문헌 1: 국제 특허출원 공개번호 WO 95-09873
특허문헌 2: 프랑스 특허출원 공개번호 FR 2694767
특허문헌 3: 미국 특허번호 US 5216128
특허문헌 4: 국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759
발명의 개시
발명이 해결하고자 하는 과제
당뇨병 치료의 췌도 이식에 있어서는 이식시의 이식 췌도 장애를 억제하고, 췌도 생착을 향상시키는 것이 중요하나, 지금까지 유의(有意)한 효과를 나타내는 수법이 존재하지 않았다. 또한, IL-6 저해제 중 하나인 항 IL-6 수용체 항체가, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애를 억제하는 효과를 나타내는지의 여부에 대해서는, 지금까지 검토가 행해지지 않았다.
본 발명은 이와 같은 상황을 감안하여 이루어진 것으로, 그 목적은 IL-6 저해제를 유효성분으로서 함유하는, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제를 제공하는 것에 있다. 또한, IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 이식 췌도 장애를 억제하는 방법의 제공도 과제로 한다.
과제를 해결하기 위한 수단
본 발명자들은 상기의 과제를 해결하기 위해, 항 IL-6 수용체 항체의 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애를 억제하는 효과에 대해서 검토를 행하였다.
먼저, 본 발명자들은 웅성(雄性) C57BL/6 마우스에 스트렙토조토신(streptozotocin)을 정맥내 투여하여 당뇨병 리시피언트 마우스를 제작하였다.
계속해서 이 당뇨병 리시피언트 마우스에 대해, 마우스 췌장으로부터 단리한 췌도를 2마리분(400개) 또는 1마리분(200개) 이식하였다. 이 결과, 2마리분의 췌도를 이식한 경우는 혈당치가 정상화되어 치료효과가 나타난 것에 비해, 1마리분의 췌도를 이식한 경우는 혈당치가 정상화되지 않고 고혈당인 채로 추이(推移)하였다(도 2, 3).
또한, 마우스 1마리분(200개)의 췌도를 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체(MR16-1) 500 ㎍을 이식 후 3회 복강내 투여하면, 모든 리시피언트의 혈당치는 이식 후에 정상이 되었다(도 4). 한편, 동량의 항 IL-6 수용체 항체를 1회 투여한 경우에서는 3/4이 정상 혈당이 되었다(도 5). 또한, 항 IL-6 수용체 항체 200 ㎍을 1회 투여한 경우에서는 1/3이 정상 혈당이 되었다(도 6).
추가적으로, 본 발명의 항 IL-6 수용체 항체를 투여함으로써, 이식 후 침윤세포의 염증성 사이토카인의 생산이 억제되는 것을 알 수 있었다.
이상의 결과로부터, 항 IL-6 수용체 항체가 이식 췌도 장애를 경감하고, 췌도 생착의 개선을 가져오며, 리시피언트의 고혈당을 시정하는 것이 명확해졌다.
즉, 본 발명자들은 본 발명에 의해 처음으로 항 IL-6 수용체 항체에 의해 췌도 이식시의 이식 췌도 장애를 억제하는 것이 가능하다는 것을 발견하고, 이것에 의해 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은, 보다 구체적으로는 이하의 [1]~[23]을 제공하는 것이다.
[1] IL-6 저해제를 유효성분으로서 함유하는, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제.
[2] IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[3] IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [1]에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[4] 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 [2] 또는 [3]에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[5] 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 [2] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[6] 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 [2] 내지 [5] 중 어느 하나에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[7] 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 [6]에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[8] 당뇨병의 치료에 사용되는 [1] 내지 [7] 중 어느 하나에 기재의 이식 췌도 장애 억제제.
[9] IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서의 이식 췌도 장애를 억제하는 방법.
[10] IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 췌도 생착을 향상시키는 방법.
[11] IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [9] 또는 [10]에 기재의 방법.
[12] IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [9] 또는 [10]에 기재의 방법.
[13] 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 [11] 또는 [12]에 기재의 방법.
[14] 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 [11] 내지 [13] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[15] 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 [11] 내지 [14] 중 어느 하나에 기재의 방법.
[16] 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 [15]에 기재의 방법.
[17] 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제를 제조하기 위한 IL-6 저해제의 사용.
[18] IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [17]에 기재의 사용.
[19] IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 [17]에 기재의 사용.
[20] 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 [18] 또는 [19]에 기재의 사용.
[21] 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 [18] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재의 사용.
[22] 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 [18] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재의 사용.
[23] 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 [22]에 기재의 사용.
도면의 간단한 설명
도 1은 췌도를 이식하지 않은 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 2는 마우스 2마리분의 췌도(400개)를 동종 동계 이식한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 3은 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 동계 이식한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 4는 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 동계 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체 500 ㎍을 이식 후 3회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 5는 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 동계 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체 500 ㎍을 이식 후 1회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 6은 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 동계 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체 200 ㎍을 이식 후 1회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 7은 항 IL-6 수용체 항체 투여에 의한, 이식 후 침윤세포의 염증성 사이토카인의 생산억제를 나타내는 도면이다.
도 8은 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 이계 이식하고, 랫트 IgG 200 ㎍을 이식 후 3회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 9는 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 이계 이식하고, 항 CD4 항체 200 ㎍을 이식 후 1회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
도 10은 마우스 1마리분의 췌도(200개)를 동종 이계 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체 500 ㎍을 이식 후 3회, 및 항 CD4 항체 200 ㎍을 이식 후 1회 복강내 투여한 당뇨병 리시피언트 마우스의 혈당치 변화를 나타내는 도면이다.
발명을 실시하기 위한 최선의 형태
본 발명자들은 항 IL-6 수용체 항체에 의해 췌도 이식 후의 이식 췌도 장애를 억제하는 것이 가능하다는 것을 발견하였다. 본 발명은 이들의 지견(知見)을 토대로 하는 것이다.
본 발명은 IL-6 저해제를 유효성분으로서 함유하는, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 「IL-6 저해제」란, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단하고, IL-6의 생물학적 활성을 저해하는 물질이다. IL-6 저해제는, 바람직하게는 IL-6, IL-6 수용체 및 gp130 중 어느 하나의 결합에 대한 저해작용을 갖는 물질이다.
본 발명의 IL-6 저해제로서는, 예를 들면 항 IL-6 항체, 항 IL-6 수용체 항체, 항 gp130 항체, IL-6 개변체, 가용성 IL-6 수용체 개변체 또는 IL-6 또는 IL-6 수용체의 부분 펩티드 및, 이들과 동일한 활성을 나타내는 저분자 물질을 들 수 있으나, 특별히 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 IL-6 저해제로서는, 바람직하게는 IL-6 수용체를 인식하는 항체를 들 수 있다.
본 발명에 있어서 항체의 유래는 특별히 한정되는 것은 아니나, 바람직하게는 포유동물 유래이고, 보다 바람직하게는 인간 유래의 항체를 들 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론항체 또는 단일클론항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 항체로서, 특히 포유동물 유래의 단일클론항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 단일클론항체로서는, 하이브리도마에 생산되는 것, 및 유전자공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는 MH166(Matsuda, T. et al., Eur. J. Immunol. (1988) 18, 951-956)나 SK2 항체(Sato, K. et al., 제21회 일본 면역학회 총회, 학술기록(1991) 21, 166) 등을 들 수 있다.
항 IL-6 항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용해서, 이하과 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, IL-6를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 생산세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 항 IL-6 항체를 제작하는데는 다음과 같이 하면 된다. 예를 들면, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 인간 IL-6는 Eur. J. Biochem (1987) 168, 543-550, J. Immunol. (1988) 140, 1534-1541, 또는 Agr. Biol. Chem. (1990) 54, 2685-2688에 개시된 IL-6 유전자/아미노산 서열을 사용함으로써 얻어진다.
IL-6의 유전자 서열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는, 배양상청 중으로부터 목적하는 IL-6 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 단백질을 감작항원으로서 사용하면 된다. 또한, IL-6 단백질과 다른 단백질의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용해도 된다.
본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론항체 또는 단일클론항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체로서, 특히 포유동물 유래의 단일클론항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 단일클론항체로서는, 하이브리도마에 생산되는 것, 및 유전자공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 생산되는 것이 있다. 이 항체는 IL-6 수용체와 결합함으로써, IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는 MR16-1 항체(Tamura, T. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1993) 90, 11924-11928), PM-1 항체(Hirata, Y. et al., J. Immmunol. (1989) 143, 2900-2906), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 또는 AUK146-15 항체(국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759) 등을 들 수 있다. 이들 중에서, 인간 IL-6 수용체에 대한 바람직한 단일클론항체로서는 PM-1 항체가 예시되고, 또한 마우스 IL-6 수용체에 대한 바람직한 단일클론항체로서는 MR16-1 항체를 들 수 있다.
항 IL-6 수용체 단일클론항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용해서, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, IL-6 수용체를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 생산세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 항 IL-6 수용체 항체를 제작하는데는 다음과 같이 하면 된다. 예를 들면, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 인간 IL-6 수용체는 유럽 특허출원 공개번호 EP 325474에, 마우스 IL-6 수용체는 일본 특허출원 공개번호 특개평3-155795에 개시된 IL-6 수용체 유전자/아미노산 서열을 사용함으로써 얻어진다.
IL-6 수용체 단백질은 세포막 상에 발현하고 있는 것과 세포막으로부터 이탈되어 있는 것(가용성 IL-6 수용체)(Yasukawa, K. et al., J. Biochem. (1990) 108, 673-676)의 2종류가 있다. 가용성 IL-6 수용체는 세포막에 결합하고 있는 IL-6 수용체의 실질적으로 세포외영역으로 구성되어 있고, 세포막 관통영역 또는 세포막 관통영역과 세포내영역이 결손되어 있는 점에서 막 결합형 IL-6 수용체와 상이하다. IL-6 수용체 단백질은 본 발명에서 사용되는 항 IL-6 수용체 항체 제작의 감작항원으로서 사용될 수 있는 한, 어느 IL-6 수용체를 사용해도 된다.
IL-6 수용체의 유전자 서열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는, 배양상청 중으로부터 목적하는 IL-6 수용체 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 IL-6 수용체 단백질을 감작항원으로서 사용하면 된다. 또한, IL-6 수용체를 발현하고 있는 세포나 IL-6 수용체 단백질과 다른 단백질의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용해도 된다.
본 발명에서 사용되는 항 gp130 항체는 공지의 수단을 사용하여 다중클론항체 또는 단일클론항체로서 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항 gp130 항체로서, 특히 포유동물 유래의 단일클론항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 단일클론항체로서는, 하이브리도마에 생산되는 것, 및 유전자공학적 수법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 생산되는 것이 있다. 이 항체는 gp130과 결합함으로써, IL-6/IL-6 수용체 복합체의 gp130으로의 결합을 저해하여 IL-6의 생물학적 활성의 세포내로의 전달을 차단한다.
이와 같은 항체로서는 AM64 항체(일본국 특허공개 평3-219894), 4B11 항체 및 2H4 항체(US 5571513) B-S12 항체 및 B-P8 항체(일본국 특허공개 평8-291199) 등을 들 수 있다.
항 gp130 단일클론항체 생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지 기술을 사용해서, 이하와 같이 하여 제작할 수 있다. 즉, gp130을 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하여, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 단일클론항체 생산세포를 스크리닝함으로써 제작할 수 있다.
구체적으로는, 단일클론항체를 제작하는데는 다음과 같이 하면 된다. 예를 들면, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 gp130은 유럽 특허출원 공개번호 EP 411946에 개시된 gp130 유전자/아미노산 서열을 사용함으로써 얻어진다.
gp130의 유전자 서열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는, 배양상청 중으로부터 목적하는 gp130 단백질을 공지의 방법으로 정제하고, 이 정제 gp130 단백질을 감작항원으로서 사용하면 된다. 또한, gp130을 발현하고 있는 세포나 gp130 단백질과 다른 단백질의 융합 단백질을 감작항원으로서 사용해도 된다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로서는 특별히 한정되는 것은 아니나, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 랫트, 햄스터 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역하는데는 공지의 방법에 따라 행해진다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는, 피하에 주사함으로써 행해진다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것을 목적에 따라 통상의 애쥬번트(adjuvant), 예를 들면 프로인트 완전 애쥬번트를 적량 혼합하고, 유화(乳化) 후, 포유동물에 4-21일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체(擔體)를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하고, 혈청 중에 목적하는 항체 레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포가 꺼내어져, 세포융합 처리된다. 세포융합 처리되는 바람직한 면역세포로서는, 특히 비장세포를 들 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 다른쪽 친세포로서의 포유동물의 골수종세포는 이미 공지의 각종 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8.653(Kearney, J. F. et al. J. Immunol.(1979) 123, 1548-1550), P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용된다.
상기 면역세포와 골수종세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인들의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면, 세포융합 촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 추가적으로 목적에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가 사용하는 것도 가능하다.
면역세포와 골수종세포의 사용비율은, 예를 들면 골수종세포에 대해 면역세포를 1~10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는, 예를 들면 상기 골수종세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 그 외에 이 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액이 사용 가능하고, 추가적으로 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액(serum supplement)을 병용하는 것도 가능하다.
세포융합은 상기 면역세포와 골수종세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 사전에 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1,000~6,000 정도의 PEG 용액을 통상, 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하여, 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)가 형성된다. 계속해서, 적당한 배양액을 축차 첨가하고, 원심하여 상청을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
당해 하이브리도마는 통상의 선택 배양액, 예를 들면 HAT 배양액(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 당해 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 수일~수주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 클로닝이 행해진다.
또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간 림프구를 인비트로(in vitro)에서 목적하는 항원 단백질 또는 항원 발현세포로 감작하고, 감작 B 림프구를 인간 골수종세포, 예를 들면 U266와 융합시켜, 목적하는 항원 또는 항원 발현세포로의 결합활성을 갖는 목적하는 인간 항체를 얻는 것도 가능하다(일본국 특허공고 평1-59878 참조). 또한, 인간 항체 유전자의 레퍼토리를 갖는 트랜스제닉 동물에 항원 또는 항원 발현세포를 투여하고, 전술의 방법에 따라 목적하는 인간 항체를 취득해도 된다(국제 특허출원 공개번호 WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO 96/34096, WO 96/33735 참조).
이와 같이 하여 제작되는 단일클론항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대(繼代) 배양하는 것이 가능하고, 또한, 액체 질소 중에서 장기간 보존하는 것이 가능하다.
당해 하이브리도마로부터 단일클론항체를 취득하는데는, 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그의 배양 상청으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하고 증식시켜, 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적합한 한편, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
예를 들면, 항 IL-6 수용체 항체 생산 하이브리도마의 제작은 일본국 특허공개 평3-139293에 개시된 방법에 의해 행할 수 있다. PM-1 항체 생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스의 복강내에 주입하여 복수를 얻고, 이 복수로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법이나, 본 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면 10% 소 태아 혈청, 5% BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim제) 함유 RPMI1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL제), PFHM-II 배지(GIBCO-BRL제) 등에서 배양하고, 그 배양 상청으로부터 PM-1 항체를 정제하는 방법으로 행할 수 있다.
본 발명에는, 단일클론항체로서, 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형 항체를 사용할 수 있다(예를 들면, Borrebaeck, C. A. K. and Larrick, J. W. THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD, 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 세포, 예를 들면 하이브리도마로부터, 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의해 전 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit (Pharmacia제) 등을 사용하여 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수 있다.
얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 사용하여 항체 V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용하여 행할 수 있다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는데는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR을 사용한 5'-RACE법(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 추가적으로, 이로부터 재조합 벡터를 제작하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니를 선택해 목적하는 재조합 벡터를 조제한다. 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예를 들면 데옥시법에 의해 확인한다.
목적으로 하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 목적하는 항체 정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터로 삽입한다. 또는, 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 포함하는 발현벡터로 삽입해도 된다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하는데는, 후술하는 바와 같이 항체 유전자를 발현 제어영역, 예를 들면 인핸서(enhancer), 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현벡터에 삽입한다. 다음으로, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하여, 항체를 발현시킬 수 있다.
본 발명에서는, 인간에 대한 이종 항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로서 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면 키메라(Chimeric) 항체, 인간화(Humanized) 항체, 인간(human) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변 항체는 기지의 방법을 사용하여 제조할 수 있다.
키메라 항체는 상기한 바와 같이 하여 얻은 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 삽입하여 숙주에 도입하고 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조). 이 기지의 방법을 사용하여, 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다.
인간화 항체는 재구성(reshaped) 인간 항체 또는 인간형화 항체라고도 불리우고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR)을 인간 항체의 상보성 결정영역으로 이식한 것으로, 그 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023, 국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
구체적으로는, 마우스 항체의 CDR과 인간 항체의 프레임워크영역(FR; framework region)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 오버랩하는 부분을 갖도록 제작한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법에 의해 합성한다. 얻어진 DNA를 인간 항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현벡터에 삽입하여, 이것을 숙주에 도입하고 생산시킴으로써 얻어진다(유럽 특허출원 공개번호 EP 239400, 국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
CDR을 매개로 하여 연결되는 인간 항체의 FR은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간 항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체 가변영역의 프레임워크영역의 아미노산을 치환해도 된다(Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).
키메라 항체, 인간화 항체에는 인간 항체 C영역이 사용된다. 인간 항체 C영역으로서는 Cγ를 들 수 있고, 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3 또는 Cγ4를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간 항체 C영역을 수식해도 된다.
키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간 항체 유래의 C영역으로 되고, 또한 인간화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간 항체 유래의 프레임워크영역 및 C영역으로 되며, 양자는 인간 체내에 있어서의 항원성이 저하되어 있으므로, 본 발명에 사용되는 항체로서 유용하다.
본 발명에 사용되는 인간화 항체의 바람직한 구체예로서는 인간화 PM-1 항체를 들 수 있다(국제 특허출원 공개번호 WO 92-19759 참조).
또한, 인간 항체의 취득방법으로서는 앞서 기술한 방법의 외에, 인간 항체 라이브러리를 사용하고, 패닝에 의해 인간 항체를 취득하는 기술도 알려져 있다. 예를 들면, 인간 항체의 가변영역을 단일 사슬 항체(scFv)로서 파지 디스플레이법에 의해 파지의 표면에 발현시키고, 항원에 결합하는 파지를 선택하는 것도 가능하다. 선택된 파지의 유전자를 해석하면, 항원에 결합하는 인간 항체의 가변영역을 코드하는 DNA 서열을 결정할 수 있다. 항원에 결합하는 scFv의 DNA 서열이 명확해지면, 당해 서열을 포함하는 적당한 발현벡터를 제작하여, 인간 항체를 취득할 수 있다. 이들 방법은 이미 주지이고, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, WO 95/15388을 참고로 할 수 있다.
상기한 바와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시킬 수 있다. 포유류 세포를 사용한 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그를 포함하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로서는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다.
또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체 발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 연장인자 1α(human elongation factor 1α; HEF 1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 된다.
예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 멀리건들의 방법(Mulligan, R. C. et al., Nature (1979) 277, 108-114), 또한, HEF 1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마들의 방법(Mizushima, S. and Nagata, S. Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체 분비를 위한 시그널 서열, 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터로서는 lacZ 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacZ 프로모터를 사용하는 경우, 워드들의 방법(Ward, E. S. et al., Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. et al. FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, 베터들의 방법(Better, M. et al. Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 된다.
항체 분비를 위한 시그널 서열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379-4383)을 사용하면 된다. 페리플라즘에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들면, WO 96/30394를 참조).
복제기원으로서는 SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스, 소 유두종 바이러스(BPV) 등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 추가적으로, 숙주세포계에서 유전자 복제수 증폭을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 포스포트랜스퍼라아제(APH) 유전자, 티미딘키나아제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실트랜스퍼라아제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산 환원효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체 제조를 위한 생산계는 인비트로 및 인비보 생산계가 있다. 인비트로의 생산계로서는, 진핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 또는 진균세포를 사용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는 (1) 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, 골수종, BHK(baby hamster kidney), HeLa, Vero 등, (2) 양서류 세포, 예를 들면 아프리카 발톱개구리 난모세포, 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로서는 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum) 유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 캘러스 배양하면 된다. 진균세포로서는 효모, 예를 들면 사카로마이세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로마이세스 세레비시에(Saccharomyces cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스페르길루스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스페르길루스 니거(Aspergillus niger) 등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는 대장균(E. coli), 고초균이 알려져 있다.
이들 세포에, 목적으로 하는 항체 유전자를 형진전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 인비트로로 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은 공지의 방법에 따라 행한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소 태아 혈청(FCS) 등의 혈청 보액을 병용하는 것도 가능하다. 또한, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강 등으로 옮김으로써, 인비보로 항체를 생산해도 된다.
한편, 인비보의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 사용하는 생산계 등이 있다.
포유류 동물로서는 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등을 사용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). 또한, 곤충으로서는 누에를 사용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 예를 들면 담배를 사용할 수 있다.
이들 동물 또는 식물에 항체 유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜, 회수한다. 예를 들면, 항체 유전자를 염소 β 카세인과 같은 유즙 중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 목적하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 목적하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해, 적절히 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 된다(Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).
또한, 누에를 사용하는 경우, 목적의 항체 유전자를 삽입한 베큘로바이러스(baculovirus)를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Maeda, S. et al., Nature (1985) 315, 592-594). 또한, 담배를 사용하는 경우, 목적하는 항체 유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 도입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바쿰(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 본 담배의 잎으로부터 목적하는 항체를 얻는다(Julian, K. -C. Ma et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24, 131-138).
전술한 바와 같이 인비트로 또는 인비보의 생산계로 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 개별적으로 발현벡터에 삽입하여 숙주를 동시 형질전환시켜도 되고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일 발현벡터에 삽입하여, 숙주를 형질전환시켜도 된다(국제 특허출원 공개번호 WO 94-11523 참조).
본 발명에서 사용되는 항체는, 본 발명에 적합하게 사용될 수 있는 한, 항체의 단편이나 그의 수식물이어도 된다. 예를 들면, 항체의 단편으로서는 Fab, F(ab')2, Fv 또는 H쇄와 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 싱글체인 Fv(scFV)를 들 수 있다.
구체적으로는 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신으로 처리하여 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M. S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 497-515, Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-66, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).
scFv는 항체의 H쇄 V영역과 L쇄 V영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V영역과 L쇄 V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 매개로 하여 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). scFv에 있어서 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역은 상기 항체로서 기재된 것 중 어느 유래여도 된다. V영역을 연결하는 펩티드 링커로서는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로 되는 임의의 단일 사슬 펩티드가 사용된다.
scFv를 코드하는 DNA는 상기 항체의 H쇄 또는, H쇄 V영역을 코드하는 DNA, 및 L쇄 또는, L쇄 V영역을 코드하는 DNA를 주형(鑄型)으로 하여, 그들의 서열 중 목적하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을, 그 양쪽 말단을 규정하는 프라이머쌍을 사용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서, 추가적으로 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양쪽 말단을 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머쌍을 조합하여 증폭함으로써 얻어진다.
또한, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 제작되면, 그들을 함유하는 발현벡터, 및 이 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상적인 방법에 따라 얻을 수 있고, 또한, 그 숙주를 사용하여 통상적인 방법에 따라, scFv를 얻을 수 있다.
이들 항체의 단편은 상기와 동일하게 하여 그 유전자를 취득하여 발현시키고, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.
항체의 수식물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항체를 사용하는 것도 가능하다. 본 발명에서 말하는 「항체」에는 이들 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물을 얻는데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 이들 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
상기한 바와 같이 생산, 발현된 항체는 세포내외, 숙주로부터 분리하여 균일하게까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography)에 의해 행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용하는 칼럼으로서는, 예를 들면 프로테인 A 칼럼, 프로테인 G 칼럼을 들 수 있다. 프로테인 A 칼럼에 사용하는 담체로서, 예를 들면 HyperD, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다. 그 외, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 조금도 한정되는 것은 아니다.
예를 들면, 상기 친화성 크로마토그래피 이외의 크로마토그래피, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합하면, 본 발명에서 사용되는 항체를 분리, 정제할 수 있다. 크로마토그래피로서는, 예를 들면 이온교환 크로마토그래피, 소수 크로마토그래피, 겔 여과 등을 들 수 있다. 이들 크로마토그래피는 HPLC(High performance liquid chromatography)에 적용할 수 있다. 또한, 역상 HPLC(reverse phase HPLC)를 사용해도 된다.
상기에서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도 측정 또는 ELISA 등에 의해 행할 수 있다. 즉, 흡광도 측정에 의한 경우에는, PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280 ㎚의 흡광도를 측정하고, 1 ㎎/㎖를 1.35 OD로서 산출한다. 또한, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1 M 중탄산 완충액(pH 9.6)으로 1 ㎍/㎖로 희석한 염소 항 인간 IgG(TAG제) 100 ㎕를 96 웰 플레이트(Nunc제)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 인큐베이션하여, 항체를 고상화한다. 블로킹 후, 적절히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 포함하는 샘플, 또는 표품(標品)으로서 인간 IgG(CAPPEL제) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이션한다.
세정 후, 5000배 희석한 알칼리 포스파타아제 표지 항 인간 IgG(BIO SOURCE제) 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 인큐베이트한다. 세정 후, 기질(基質)용액을 첨가하여 인큐베이션 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad제)을 사용하여 405 ㎚에서의 흡광도를 측정하고, 목적하는 항체의 농도를 산출한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 개변체는 IL-6 수용체와의 결합활성을 가지며, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 개변체는 IL-6 수용체에 대해 IL-6와 경합적으로 결합하지만, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않으므로, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.
IL-6 개변체는 IL-6의 아미노산 서열의 아미노산 잔기를 치환함으로써 변이를 도입하여 제작된다. IL-6 개변체의 기초가 되는 IL-6는 그 유래에 상관없으나, 항원성 등을 고려하면, 바람직하게는 인간 IL-6이다.
구체적으로는 IL-6의 아미노산 서열을 공지의 분자 모델링 프로그램, 예를 들면, WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics (1990) 8, 52-56)를 사용하여 그 2차 구조를 예측하고, 추가적으로 치환되는 아미노산 잔기의 전체에 미치는 영향을 평가함으로써 행해진다. 적절한 치환 아미노산 잔기를 결정한 후, 인간 IL-6 유전자를 코드하는 염기서열을 포함하는 벡터를 주형으로 하고, 통상 행해지는 PCR법으로 아미노산이 치환되도록 변이를 도입함으로써, IL-6 개변체를 코드하는 유전자가 얻어진다. 이것을 필요에 따라 적당한 발현벡터에 삽입하고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준하여 IL-6 개변체를 얻을 수 있다.
IL-6 개변체의 구체예로서는 Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, 및 Savino et al., EMBO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96-18648, WO 96-17869에 개시되어 있다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 각각 IL-6 수용체 또는 IL-6와의 결합활성을 갖고, 또한 IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않는 물질이다. 즉, IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는 IL-6 수용체 또는 IL-6에 결합하고, 이들을 포착함으로써 IL-6의 IL-6 수용체로의 결합을 특이적으로 저해한다. 그 결과, IL-6의 생물학적 활성을 전달하지 않으므로, IL-6에 의한 시그널 전달을 차단한다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에 있어서 IL-6와 IL-6 수용체의 결합에 관계되는 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 서열로 되는 펩티드이다. 이와 같은 펩티드는 통상 10~80, 바람직하게는 20~50, 보다 바람직하게는 20~40개의 아미노산 잔기로 된다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드는, IL-6 또는 IL-6 수용체의 아미노산 서열에 있어서 IL-6와 IL-6 수용체의 결합에 관계되는 영역을 특정하고, 그 특정한 영역의 일부 또는 전부의 아미노산 서열을 토대로 하여 통상 알려지는 방법, 예를 들면 유전자공학적 수법 또는 펩티드 합성법에 의해 제작할 수 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 유전자공학적 수법으로 제작하는데는, 목적하는 펩티드를 코드하는 DNA 서열을 발현벡터에 삽입하고, 상기 재조합형 항체의 발현, 생산 및 정제방법에 준하여 얻을 수 있다.
IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6 수용체 부분 펩티드를 펩티드 합성법으로 제작하는데는, 펩티드 합성에 있어서 통상 사용되고 있는 방법, 예를 들면 고상 합성법 또는 액상 합성법을 사용할 수 있다.
구체적으로는, 속(續)의약품의 개발 제14권 펩티드 합성, 감수 야지마 하루아키, 히로카와 쇼텐 1991년에 기재의 방법에 준하여 행하면 된다. 고상 합성법으로서는, 예를 들면 유기용매에 불용성인 지지체에 합성하고자 하는 펩티드의 C말단에 대응하는 아미노산을 결합시키고, α-아미노기 및 측쇄 관능기를 적절한 보호기로 보호한 아미노산을 C말단으로부터 N말단 방향의 순서로 1아미노산씩 축합시키는 반응과 수지 상에 결합한 아미노산 또는 펩티드의 α-아미노기의 상기 보호기를 이탈시키는 반응을 번갈아가며 반복함으로써, 펩티드 사슬을 신장시키는 방법이 사용된다. 고상 펩티드 합성법은 사용되는 보호기의 종류에 따라 Boc법과 Fmoc법으로 크게 나뉜다.
이와 같이 하여 목적으로 하는 펩티드를 합성한 후, 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터 절단반응을 한다. 펩티드 사슬과의 절단반응에는, Boc법에서는 플루오르화 수소 또는 트리플루오로메탄설폰산을, 또한 Fmoc법에서는 TFA를 통상 사용할 수 있다. Boc법에서는, 예를 들면 플루오르화 수소 중에서 상기 보호 펩티드 수지를 아니솔 존재하에서 처리한다. 이어서, 보호기의 이탈과 지지체로부터의 절단을 하여 펩티드를 회수한다. 이것을 동결건조함으로써, 조(粗) 펩티드가 얻어진다. 한편, Fmoc법에서는, 예를 들면 TFA 중에서 상기와 동일한 조작으로 탈보호반응 및 펩티드 사슬의 지지체로부터의 절단반응을 행할 수 있다.
얻어진 조 펩티드는 HPLC에 적용함으로써 분리, 정제할 수 있다. 그의 용출에 있어서, 단백질의 정제에 통상 사용되는 물-아세토니트릴계 용매를 사용하여 최적 조건하에서 행하면 된다. 얻어진 크로마토그래피의 프로파일의 피크에 해당하는 분획을 분취하고, 이것을 동결건조한다. 이와 같이 하여 정제한 펩티드 분획에 대해서, 질량 스펙트럼 분석(mass spectrum analysis)에 의한 분자량 해석, 아미노산 조성 분석, 또는 아미노산 서열 해석 등에 의해 동정(同定)한다.
IL-6 부분 펩티드 및 IL-6 수용체 부분 펩티드의 구체예는, 일본국 특허공개 평2-188600, 일본국 특허공개 평7-324097, 일본국 특허공개 평8-311098 및 미국 특허공보 US 5210075에 개시되어 있다.
본 발명에 사용하는 항체는 폴리에틸렌글리콜(PEG), 방사성 물질, 톡신 등의 각종 분자와 결합한 콘주게이트 항체여도 된다. 이와 같은 콘주게이트 항체는 얻어진 항체에 화학적인 수식을 행함으로써 얻을 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다. 본 발명에 있어서의 「항체」에는 이들 콘주게이트 항체도 포함된다.
본 발명의 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제는 당뇨병 치료에서 사용하는 것이 가능하다. 당뇨병에는 1형 당뇨병, 2형 당뇨병, 췌성(膵性) 당뇨병, 임신성 당뇨병 등이 포함된다. 또한, 췌장염이나 스테로이드제 사용 등에 의해 2차적으로 유발되는 경우나, 특정 유전자에 이상이 있는 경우 등의 특정 원인에 의한 당뇨병도, 상기 당뇨병에 포함되는 것으로 한다.
본 발명의 이식 췌도 장애 억제제는 췌도 이식에 있어서 사용 가능하다. 췌도 이식에는 뇌사 도너 췌도 이식, 심정지 도너 췌도 이식 및 생체 췌도 이식 등이 포함된다.
본 발명에 있어서의 췌도 이식은 동종 동계 이식(isograft)이어도 동종 이계 이식(allograft)이어도 된다. 동종 동계 이식이란, 동일한 균일계의 동물 사이에서 행해지는 이식으로, 인간에 있어서는 일란성 쌍생아 사이에서 행해지는 이식이다. 동종 이계 이식이란, 유전원 조성이 상이한 2개의 개체 사이에서 행해지는 이식으로, 인간에 있어서는 이란성 쌍생아 사이에서의 이식이나, 전혀 혈연관계가 없는 개체 사이에서의 이식이 이에 해당한다.
본 발명에서 사용되는 IL-6 저해제의 IL-6 시그널 전달 저해활성은 통상 사용되는 방법에 의해 평가할 수 있다. 구체적으로는 IL-6 의존성 인간 골수종주(S6B45, KPMM2), 인간 렌네르트 T 림프종 세포주(Lennert T lymphoma cell line) KT3, 또는 IL-6 의존성 세포 MH60.BSF2를 배양하여, 이것에 IL-6를 첨가하고, 동시에 IL-6 저해제를 공존시킴으로써 IL-6 의존성 세포의 3H-티미딘 흡수(3H-thymidine uptake)를 측정하면 된다. 또한, IL-6 수용체 발현세포인 U266를 배양하여, 125I 표지 IL-6를 첨가하고, 동시에 IL-6 저해제를 첨가함으로써, IL-6 수용체 발현세포에 결합한 125I 표지 IL-6를 측정한다. 상기 어세이계에 있어서, IL-6 저해제를 존재시키는 군에 더하여 IL-6 저해제를 포함하지 않는 음성 대조군을 두고, 양자에서 얻어진 결과를 비교하면 IL-6 저해제의 IL-6 저해활성을 평가할 수 있다.
후술의 실시예에 나타내어지는 바와 같이, 항 IL-6 수용체 항체의 투여에 의해, 이식 췌도에 대한 이식 췌도 장애를 억제하는 것이 인정된 점으로부터, 항 IL-6 수용체 항체 등의 IL-6 저해제는 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제로서 유용하다는 것이 시사되었다.
본 발명의 이식 췌도 장애 억제제가 투여되는 대상은 포유동물이다. 포유동물은 바람직하게는 인간이다.
본 발명의 이식 췌도 장애 억제제는 의약품의 형태로 투여하는 것이 가능하고, 경구적 또는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하 주사, 좌약, 관장, 경구성 장용제 등을 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 따라 적절히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효 투여량은 1회당 체중 1 ㎏당 0.01 ㎎~100 ㎎의 범위에서 선택된다. 또는, 환자당 1~1000 ㎎, 바람직하게는 5~50 ㎎의 투여량을 선택할 수 있다. 바람직한 투여량, 투여방법은, 예를 들면 항 IL-6 수용체 항체의 경우에는, 혈중에 프리의 항체가 존재하는 정도의 양이 유효 투여량이고, 구체적인 예로서는, 체중 1 ㎏당 1개월(4주간)에 0.5 ㎎~40 ㎎, 바람직하게는 1 ㎎~20 ㎎을 1회에서 수회로 나누고, 예를 들면 2회/주, 1회/주, 1회/2주, 1회/4주 등의 투여 스케줄로 점적 등의 정맥내 주사, 피하 주사 등의 방법으로 투여하는 방법 등이다. 투여 스케줄은, 이식 후의 상태 관찰 및 혈액 검사치의 동향을 관찰하면서 2회/주 또는 1회/주로부터 1회/2주, 1회/3주, 1회/4주와 같이 투여간격을 늘려가는 등 조정하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 이식 췌도 장애 억제제에는 보존제나 안정제 등 제제상 허용 가능한 담체가 첨가되어 있어도 된다. 제제상 허용 가능한 담체란, 그 자체는 상기의 이식 췌도 장애 억제효과를 갖는 재료여도 되고, 이식 췌도 장애 억제효과를 갖지 않는 재료여도 되며, 상기의 억제제와 함께 투여 가능한 재료를 의미한다. 또한, 이식 췌도 장애 억제효과를 갖지 않는 재료여도, IL-6 저해제와 병용함으로써 상승적(相乘的) 또는 상가적(相加的)인 안정화 효과를 갖는 재료여도 된다.
제제상 허용되는 재료로서는, 예를 들면 멸균수나 생리식염수, 안정제, 부형제, 완충제, 방부제, 계면활성제, 킬레이트제(EDTA 등), 결합제 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 계면활성제로서는 비이온 계면활성제를 들 수 있고, 예를 들면 소르비탄 모노카프릴레이트, 소르비탄 모노라우레이트, 소르비탄 모노팔미테이트 등의 소르비탄 지방산 에스테르; 글리세린 모노카프릴레이트, 글리세린 모노미리스테이트, 글리세린 모노스테아레이트 등의 글리세린 지방산 에스테르; 데카글리세릴 모노스테아레이트, 데카글리세릴 디스테아레이트, 데카글리세릴 모노리놀레이트 등의 폴리글리세린 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노라우레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노팔미테이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리올레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 트리스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라스테아레이트, 폴리옥시에틸렌 소르비트 테트라올레이트 등의 폴리옥시에틸렌 소르비트 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 글리세릴 모노스테아레이트 등의 폴리옥시에틸렌 글리세린 지방산 에스테르; 폴리에틸렌글리콜 디스테아레이트 등의 폴리에틸렌글리콜 지방산 에스테르; 폴리옥시에틸렌 라우릴에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 프로필에테르, 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 세틸에테르 등의 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌 알킬에테르; 폴리옥시에틸렌 노닐페닐에테르 등의 폴리옥시에틸렌 알킬페닐에테르; 폴리옥시에틸렌 피마자유, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유(폴리옥시에틸렌 수소 피마자유) 등의 폴리옥시에틸렌 경화 피자마유; 폴리옥시에틸렌 소르비트 밀랍 등의 폴리옥시에틸렌 밀랍 유도체; 폴리옥시에틸렌 라놀린 등의 폴리옥시에틸렌 라놀린 유도체; 폴리옥시에틸렌 스테아르산 아미드 등의 폴리옥시에틸렌 지방산 아미드 등의 HLB6~18을 갖는 것 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
또한, 계면활성제로서는 음이온 계면활성제도 들 수 있고, 예를 들면 세틸황산나트륨, 라우릴황산나트륨, 올레일황산나트륨 등 탄소원자수 10~18의 알킬기를 갖는 알킬 황산염; 폴리옥시에틸렌 라우릴황산나트륨 등의, 에틸렌 옥시드의 평균 부가 몰수가 2~4이고 알킬기의 탄소원자수가 10~18인 폴리옥시에틸렌 알킬에테르황산염; 라우릴설포숙신산 에스테르나트륨 등의, 알킬기의 탄소원자수가 8~18인 알킬설포숙신산 에스테르염; 천연계의 계면활성제, 예를 들면 레시틴, 글리세로인지질; 스핑고미엘린 등의 스핑고 인지질; 탄소원자수 12~18의 지방산의 자당 지방산 에스테르 등을 전형적인 예로서 들 수 있다.
본 발명의 억제제에는, 이들 계면활성제의 1종 또는 2종 이상을 조합하여 첨가할 수 있다. 본 발명의 제제에서 사용하는 바람직한 계면활성제는 폴리소르베이트 20, 40, 60 또는 80 등의 폴리옥시에틸렌 소르비탄 지방산 에스테르이고, 폴리소르베이트 20 및 80이 특히 바람직하다. 또한, 폴록사머(플루로닉 F-68(등록상표) 등)로 대표되는 폴리옥시에틸렌 폴리옥시프로필렌글리콜도 바람직하다.
계면활성제의 첨가량은 사용하는 계면활성제의 종류에 따라 상이하나, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80의 경우에서는, 일반적으로는 0.001~100 ㎎/mL이고, 바람직하게는 0.003~50 ㎎/mL이며, 더욱 바람직하게는 0.005~2 ㎎/mL이다.
본 발명에 있어서 완충제로서는 인산, 구연산 완충액, 초산, 말산, 타르타르산, 숙신산, 젖산, 인산칼륨, 글루콘산, 카프르산, 데옥시콜산, 살리실산, 트리에탄올아민, 푸마르산 등, 기타 유기산 등, 또는 탄산 완충액, 트리스 완충액, 히스티딘 완충액, 이미다졸 완충액 등을 들 수 있다.
또한 용액 제제의 분야에서 공지의 수성 완충액에 용해함으로써 용액 제제를 조제해도 된다. 완충액의 농도는 일반적으로는 1~500 mM이고, 바람직하게는 5~100 mM이며, 더욱 바람직하게는 10~20 mM이다.
또한, 본 발명의 억제제는 그 외의 저분자량의 폴리펩티드, 혈청알부민, 젤라틴이나 면역글로불린 등의 단백질, 아미노산, 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물, 당 알코올을 포함하고 있어도 된다.
본 발명에 있어서 아미노산으로서는 염기성 아미노산, 예를 들면 아르기닌, 리신, 히스티딘, 오르니틴 등, 또는 이들 아미노산의 무기염(바람직하게는 염산염, 인산염의 형태, 즉 인산 아미노산)을 들 수 있다. 유리(free) 아미노산이 사용되는 경우 바람직한 pH 값은, 적당한 생리적으로 허용되는 완충물질, 예를 들면 무기산, 특히 염산, 인산, 황산, 초산, 포름산 또는 이들 염의 첨가에 의해 조정된다. 이 경우, 인산염의 사용은, 특히 안정한 동결건조물이 얻어지는 점에서 특히 유리하다. 조제물이 유기산, 예를 들면 말산, 타르타르산, 구연산, 숙신산, 푸마르산 등을 실질적으로 함유하지 않는 경우 또는 대응하는 음이온(말산 이온, 타르타르산 이온, 구연산 이온, 숙신산 이온, 푸마르산 이온 등)이 존재하지 않는 경우에 특히 유리하다. 바람직한 아미노산은 아르기닌, 리신, 히스티딘, 또는 오르니틴이다. 추가적으로 산성 아미노산, 예를 들면 글루타민산 및 아스파라긴산, 및 그의 염의 형태(바람직하게는 나트륨염) 또는 중성 아미노산, 예를 들면 이소류신, 류신, 글리신, 세린, 트레오닌, 발린, 메티오닌, 시스테인, 또는 알라닌, 또는 방향족 아미노산, 예를 들면 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 또는 유도체의 N-아세틸트립토판을 사용하는 것도 가능하다.
본 발명에 있어서 다당 및 단당 등의 당류나 탄수화물로서는, 예를 들면 덱스트란, 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 크실로오스, 만노오스, 말토오스, 수크로오스, 트레할로오스, 라피노오스 등을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 당 알코올로서는, 예를 들면 만니톨, 소르비톨, 이노시톨 등을 들 수 있다.
본 발명의 약제를 주사용 수용액으로 하는 경우에는, 예를 들면 생리식염수, 포도당이나 그 외의 보조제(예를 들면 D-소르비톨, D-만노오스, D-만니톨, 염화나트륨)를 포함하는 등장액과 혼합할 수 있다. 또한 이 수용액은 적당한 용해 보조제(예를 들면 알코올(에탄올 등), 폴리알코올(프로필렌글리콜, PEG 등), 비이온성 계면활성제(폴리소르베이트 80, HCO-50) 등)와 병용해도 된다.
목적에 따라 추가적으로 희석제, 용해 보조제, pH 조정제, 무통화제, 황 함유 환원제, 산화방지제 등을 함유해도 된다.
본 발명에 있어서 황 함유 환원제로서는, 예를 들면 N-아세틸시스테인, N-아세틸호모시스테인, 티옥트산, 티오디글리콜, 티오에탄올아민, 티오글리세롤, 티오소르비톨, 티오글리콜산 및 그의 염, 티오황산나트륨, 글루타티온, 및 탄소원자수 1~7의 티오알칸산 등의 설프히드릴기를 갖는 것 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 산화방지제로서는, 예를 들면 에리소르빈산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, α-토코페롤, 초산토코페롤, L-아스코르브산 및 그의 염, L-아스코르브산 팔미테이트, L-아스코르브산 스테아레이트, 아황산 수소나트륨, 아황산나트륨, 몰식자산 트리아밀, 몰식자산 프로필 또는 에틸렌디아민 사초산 이나트륨(EDTA), 피로인산나트륨, 메타인산나트륨 등의 킬레이트제를 들 수 있다.
또한, 필요에 따라 마이크로캡슐(히드록시메틸셀룰로오스, 젤라틴, 폴리[메틸메타크릴산] 등의 마이크로캡슐)에 봉입하거나, 콜로이드 드러그 딜리버리 시스템(리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로에멀젼, 나노입자 및 나노캡슐 등)으로 하는 것도 가능하다("Remington's Pharmaceutical Science 16th edition", Oslo Ed., 1980 등 참조). 추가적으로, 약제를 서방성(徐放性) 약제로 하는 방법도 공지로, 본 발명에 적용할 수 있다(Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer, Chem. Tech. 1982, 12: 98-105; 미국 특허 제3,773,919호; 유럽 특허출원 공개(EP) 제58,481호; Sidman et al., Biopolymers 1983, 22: 547-556; EP 제133,988호).
사용되는 제제상 허용 가능한 담체는 제형에 따라 상기 중에서 적절히 또는 조합해서 선택되나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명은, IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 이식 췌도 장애를 억제하는 방법에 관한 것이다. 또한, IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 췌도 생착을 향상시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 「대상」이란, 본 발명의 이식 췌도 장애 억제제를 투여하는 생물체, 이 생물체의 체내 일부분, 또는 생물체로부터 적출 또는 배출된 그 일부분을 말한다. 생물체는 특별히 한정되는 것은 아니나, 동물(예를 들면 인간, 가축동물종, 야생동물)을 포함한다.
또한, 「생물체의 체내 일부분」에 대해서는 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는 췌도가 이식되는 장기, 대망(大網), 신장 피막하, 장간막을 들 수 있다. 본 발명에 있어서 췌도가 이식되는 장기로서는 간장, 보다 구체적으로는 간장의 혈관을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 「투여한다」라는 것은 경구적, 또는 비경구적으로 투여하는 것이 포함된다. 경구적인 투여로서는 경구제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 경구제로서는 과립제, 산제, 정제, 캡슐제, 용제, 유제, 또는 현탁제 등의 제형을 선택할 수 있다.
비경구적인 투여로서는 주사제라는 형태로의 투여를 들 수 있고, 주사제로서는 피하 주사제, 근육 주사제, 또는 복강내 주사제 등을 들 수 있다. 또한, 투여해야 할 올리고뉴클레오티드를 포함하는 유전자를 유전자 치료의 수법을 사용하여 생체에 도입함으로써, 본 발명 방법의 효과를 달성할 수 있다. 또한, 본 발명의 억제제를 처치를 실시하고자 하는 영역에 국소적으로 투여하는 것도 가능하다. 예를 들면, 수술 중의 국소주입, 카테터의 사용, 또는 본 발명의 펩티드를 코드하는 DNA의 표적화 유전자 송달에 의해 투여하는 것도 가능하다.
본 발명 억제제의 대상으로의 투여는 장기이식 전이어도 되고, 장기이식과 동시에, 또는 장기이식 후여도 된다. 또한 억제제의 투여는 1회여도 되고, 연속해서 투여하는 것도 가능하다.
또한, 생물체로부터 적출 또는 배출된 생물체의 일부분에 투여를 행할 때에는 본 발명의 억제제를 생물체의 일부에 「접촉」시켜도 된다.
또한, 본 발명에 있어서 「접촉」은, 생물체의 상태에 따라서 행한다. 예를 들면, 생물체 일부로의 본 억제제의 살포, 또는 생물체 일부의 파쇄물로의 본 억제제의 첨가 등을 들 수 있으나, 이들 방법에 제한되지 않는다. 생물체의 일부가 배양세포인 경우에는, 이 세포의 배양액으로의 본 억제제의 첨가, 또는 본 발명의 올리고뉴클레오티드를 포함하는 DNA를, 생물체의 일부를 구성하는 세포로 도입함으로써, 상기 「접촉」을 행하는 것도 가능하다.
본 발명의 방법을 실천할 때에, 본 발명의 억제제는 1개 이상의 기지의 화학요법제와 함께 약학적 조성물의 일부로서 투여되어도 된다. 또한, 본 발명의 억제제는 1개 이상의 기지의 면역억제제와 동시에 투여되어도 된다. 하나의 태양에 있어서, 본 발명의 억제제 및 기지의 화학요법제에는 실질적으로 동시에 투여되어도 된다.
또한, 본 발명의 억제제는 췌도 이식 후, 췌도가 이식된 부위에 대해서 투여되어도 되고, 췌도와 동시에 표적에 대해서 투여되어도 된다. 또한, 이식을 행하기 전의 췌도에 대해서, 인비트로에 있어서 투여되어도 된다.
본 발명에 있어서 「이식 췌도 장애 억제」란, 이식된 췌도의 장애를 억제하여 생착률을 향상시키는 것을 의미한다. 또한 「이식 췌도 장애 억제」에는 이식에 수반하는 자연면역응답의 억제도 포함된다.
이식 췌도 장애가 억제되었는지 여부의 확인은 실시예에 기재의 방법대로, 생체 중의 혈당치를 측정함으로써 행할 수 있다. 예를 들면, 혈당치의 측정은 orbital sinus로부터 채혈하고, 혈장 분리 후에 베크만 글루코오스 애널라이저(Beckman Glucose Analyzer)에 의해 행하는 것도 가능하다.
본 발명의 이식 췌도 장애 억제제를 투여함으로써, 혈당치의 계속적인 저하가 나타난 경우에, 이식 췌도 장애가 억제되었다고 간주할 수 있다. 또한, 결과적으로 췌도 생착이 향상한 경우에도, 췌도 이식에 있어서 「이식 췌도 장애가 억제되었다」고 간주할 수 있다. 췌도 생착은 당뇨병 리시피언트의 혈당치가 이식 후에 정상이 되는지의 여부로 판정할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 실시예에 있어서의 대조군에서는 1마리의 도너로부터 단리 가능한 200개의 췌도를 이식한 경우, 고혈당인채로 추이하여, 이 경우의 생착률은 0%라고 간주할 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예에 있어서의 IL-6 수용체 항체 투여군에서는, 대조군과 동 수의 췌도 이식임에도 불구하고, 모든 리시피언트의 혈당은 정상화되어, 이 경우에는 생착률은 100%라고 간주할 수 있다.
또한, 본 명세서에 있어서 인용된 모든 선행기술문헌은 참조로서 본 명세서에 포함된다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하나 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 항 IL-6 수용체 항체 투여의 동종 동계 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제효과의 검토
웅성 C57BL/6 마우스에 스트렙토조토신(180 ㎎/㎏)을 정맥내 투여하여 당뇨병 리시피언트 마우스를 제작하였다. 스트렙토조토신은 췌장 랑게르한스섬을 선택적으로 파괴하는 약물로, 1회 투여에 의해 대부분의 B세포가 탈락되어, 1형 당뇨병을 유발한다.
췌도를 이식하지 않은 경우는 모든 마우스는 고혈당으로 추이하였다(도 1). 스트렙토조토신의 투여 3-5일 후, 마우스 단리 췌도를 동종 동계 당뇨병 마우스의 간내에 경문맥적으로 이식하였다. 췌도는 도너 췌도로부터 콜라게나아제법에 의해 단리하였다.
1마리의 마우스 췌장으로부터 단리 가능한 췌도수는 200개이다. 2마리분의 췌도, 400개를 도너로 한 경우, 이식 후 당뇨병 리시피언트의 혈당은 정상이 되어, 당뇨병을 치료할 수 있었다(도 2).
본 실시예에 있어서 혈당치의 측정은 orbital sinus로부터 채혈하고, 혈장 분리 후에 베크만 글루코오스 애널라이저에 의해 행하였다.
그러나, 1마리분의 췌도, 200개의 이식에서는 혈당치는 정상화되지 않고, 리시피언트는 고혈당으로 추이하였다(도 3).
200개의 췌도를 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체(MR16-1) 500 ㎍을 이식 후 3회(초일, 2일 후, 4일 후) 복강내 투여하면 모든 리시피언트의 혈당치는 이식 후에 정상이 되었다(도 4). 동량의 항 IL-6 수용체 항체를 1회 투여한 경우에서는 3/4이 정상 혈당이 되었다(도 5). 또한, IL-6 수용체 항체 200 ㎍을 1회 투여한 경우에서는 1/3이 정상 혈당이 되었다(도 6).
이상의 결과로부터, 항 IL-6 수용체 항체가 이식 췌도 장애를 경감하고, 췌도 생착의 개선을 가져와, 리시피언트의 고혈당을 시정하는 것이 나타내어졌다. 즉, 항 IL-6 수용체 항체가 동종 동계 췌도 이식(isografts)에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제로서 사용 가능한 것이 나타내어졌다.
[실시예 2] 항 IL-6 수용체 항체 투여의 염증성 사이토카인 생산 억제효과의 검토
본 발명의 항 IL-6 수용체 항체 투여에 의해, 이식 후 침윤세포의 염증성 사이토카인의 생산이 억제되는지의 여부에 대해서, 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 평가법으로 검토를 행하였다.
스트렙토조토신 당뇨병 마우스 간내에 동종 동계 췌도 200개를 이식 6시간 후에 동물을 희생사(犧牲死)시키고, 간장을 적출하여, 간 단핵구를 단리하고, 플로 우 사이토메트리로 해석하였다(도 7).
무처치 마우스(naive)는 간장내 단핵구의 IFN-γ, TNF-α의 생산은 인정되지 않았다. IL-6 수용체 항체를 투여하지 않는 대조군에서는 간장내 단핵구의 IFN-γ 및 TNF-α의 생산이 증강하고 있었다. IL-6 수용체 항체를 이식시 1회 투여(ip, 200 ㎍/injection/mouse)한 마우스에서는 간내 단핵구의 IFN-γ, TNF-α의 생산은 인정되지 않았다. 이들의 지견은 IL-6 수용체 항체의 투여에 의해, 염증성 사이토카인의 생산이 억제되어, 이식 췌도 장애를 방지하고 있는 것이 시사되었다.
[실시예 3] 항 IL-6 수용체 항체 투여의 동종 이계 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제효과의 검토
웅성 C57BL/6 마우스에 스트렙토조토신(180 ㎎/㎏)을 정맥내 투여하여 당뇨병 리시피언트 마우스를 제작하였다. 스트렙토조토신의 투여 3-5일 후, 마우스 단리 췌도를 동종 이계 당뇨병 마우스(BALB/c)의 간내에 경문맥적으로 이식하였다. 췌도는 도너 췌장으로부터 콜라게나아제법에 의해 단리하였다. 혈당치의 측정은 실시예 1과 동일하게 행하였다.
200개의 췌도를 이식하고, 항 IL-6 수용체 항체(MR16-1) 500 ㎍을 이식 후 3회(초일, 2일 후, 4일 후), 및 항 CD4 항체 200 ㎍을 1회, 항 IL-6 수용체 항체의 1회째 투여와 동시에 복강내 투여하면 모든 리시피언트의 혈당치는 이식 후에 정상이 되었다(도 10). 한편, 대조 항체(랫트 IgG) 500 ㎍(도 8), 또는 항 CD4 항체 200 ㎍만(도 9)을 동일 횟수 투여한 경우에는, 모든 마우스는 고혈당으로 추이하였다.
이상의 결과로부터, 동종 이계 이식에 있어서도, 항 IL-6 수용체 항체가 이식 췌도 장애를 경감하고, 췌도 생착의 개선을 가져와, 리시피언트의 고혈당을 시정하는 것이 나타내어졌다. 즉, 항 IL-6 수용체 항체가 동종 이계 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제로서 사용 가능한 것이 나타내어졌다.
본 발명의 이식 췌도 장애 억제제 및 방법에 의해, 췌도 이식에 있어서의 췌도 생착이 향상되어, 보다 소수의 도너 췌도를 사용하여 효율적인 당뇨병 치료가 행할 수 있게 될 것으로 생각된다.
지금까지 뇌사 도너 또는 심정지 도너의 췌장으로부터 분리한 췌도를 이식하는 경우에는, 췌도 기능 장애가 발생하고, 그래프트 생착률이 저하하므로, 1인의 리시피언트에 대해 2~3인 도너의 췌장으로부터 단리된 췌도가 필요했었다. 본 발명의 이식 췌도 장애 억제제를 사용함으로써, 1인의 리시피언트에 필요한 췌도수가 경감되어, 보다 많은 리시피언트가 췌도 이식치료를 받을 수 있는 것이 가능해질 것으로 생각된다.
또한, 최근에 와서, 건강한 정상 생체 도너의 췌장 일부를 절제하고, 췌도를 분리 정제하여 당뇨병 환자에게 이식하는 생체 췌도 이식에 대해서도 성공예가 보고되고 있으나, 본 발명의 이식 췌도 장애 억제제를 사용함으로써, 도너에 대해 보다 저침습의 치료방법을 확립할 수 있을 것으로 생각된다.

Claims (23)

  1. IL-6 저해제를 유효성분으로서 함유하는, 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제.
  2. 제1항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  3. 제1항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  4. 제2항 또는 제3항에 있어서, 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  5. 제2항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  7. 제6항에 있어서, 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 이식 췌도 장애 억제제.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병의 치료에 사용되는 이식 췌도 장애 억제제.
  9. IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 이식 췌도 장애를 억제하는 방법.
  10. IL-6 저해제를 췌도 이식을 행하는 대상에 투여하는 공정을 포함하는, 대상에 있어서 췌도 생착을 향상시키는 방법.
  11. 제9항 또는 제10항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항 또는 제10항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서, 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제11항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제11항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 췌도 이식에 있어서의 이식 췌도 장애 억제제를 제조하기 위한 IL-6 저해제의 사용.
  18. 제17항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
  19. 제17항에 있어서, IL-6 저해제가 IL-6 수용체를 인식하는 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서, 항체가 단일클론항체인 것을 특징으로 하는 사용.
  21. 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 인간 IL-6에 대한 항체 또는 인간 IL-6 수용체에 대한 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
  22. 제18항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 항체가 재조합형 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
  23. 제22항에 있어서, 항체가 키메라 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 것을 특징으로 하는 사용.
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