BRPI0617378A2 - agente para a supressço de dano a uma ilhota transplantada depois do transplante de ilhota e usos de um inibidor de il-6 - Google Patents

Abstract

<B>AGENTE PARA A SUPRESSçO DE DANO A UMA ILHOTA TRANSPLANTADA DEPOIS DO TRANSPLANTE DE ILHOTA E USOS DE UM INIBIDOR DE IL-6 <D>Os presentes inventores investigaram anticorpos de receptor de anti-IL-6 para seu efeito na supressão de dano a ilhotas transplantadas depois do transplante de ilhota. Como um resultados eles demonstram que anticorpos de receptor de anti-IL-6 reduziam dano a ilhotas transplantadas, sobrevivência de ilhota aperfeiçoada e hipergilcemia corrigida em receptores. Além disso, e- les revelaram que a administração dos anticorpos de receptor de anti-IL-6 da presente invenção suprimiram a produção de citocinas inflamatórias por infiltração de células depois do transplante. Especificamente, os presentes inventores revelaram pela primeira vez que o dano a ilhotas transplantadas depois do transplante de ilhota pode ser suprimido por uso de anticorpos de receptor de anti-IL-6 de acordo com a presente invenção.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "AGENTEPARA A SUPRESSÃO DE DANO A UMA ILHOTA TRANSPLANTADADEPOIS DO TRANSPLANTE DE ILHOTA E USOS DE UM INIBIDOR DEIL-6".

Campo da Técnica

A presente invenção refere-se a agentes para supressão de da-no a ilhotas transplantes depois do transplante, que compreendem inibidoresde IL-6 como ingredientes ativos, e a seus usos.Antecedentes da Invenção

Insulina é um hormônio hipoglicêmico. Diabetes dependentes deinsulina é causada por destruição seletiva de células produtoras de insulina(célula beta da ilhota) através de mecanismos, e seu início é conhecido co-mo resultando em hiperglicemia, que causa várias distúrbios. Em terapiaconvencional, preparações de insulina infra-supridas são administradas (inje-tadas) para compensar a armazenagem de insulina para compensar hiper-glicemia. No entanto, controle de açúcar no sangue rigoroso é difícil em te-rapias à base de insulina, que pode levar a ultra-administração que podecausar hipoglicemia fatal. Depois do início da diabetes, complicações vascu-lares diabéticas progridem (tais como retinopatia, nefropatia e neuropatia).Métodos terapêuticos convencionais tais como injeções de insulina ao po-dem deter esse progresso, levando a problemas terapeuticamente sérios.Açúcar no sangue é fisiologicamente controlado principalmente pelo meca-nismo regulador de células beta de ilhota; no entanto, em diabetes depen-dentes de insulina, a deleção dessas ilhotas resulta em violentos altos e bai-xos no nível de açúcar, que causam sintomas clínicos acima descritos.

Em anos recentes, Europa e os Estados Unidos iniciaram apli-cação clínia de transplante de ilhota, onde ilhotas pancreáticas de Lange-rhans (ilhotas) são transplantadas como um meio para o tratamento de dia-betes. Isso tenta o tratamento não por administração de insulina, mas portransplante de células produtoras de insulina. O procedimento prático detransplante de ilhota clínica é como se segue: percutânea guiada por ultras-som, cateterização de veia porta do fígado transpulmonar é realizada sobanestesia local; e então ilhotas doadoras são transplantadas para o fígadovia o cateter. Os enxertos de ilhota sobrevivem no fim da veia porta do fíga-do, e controlam o nível de açúcar no sangue por secreção de insulina.Quando o bem-sucedido tranplante de restaura açúcar sangüíneo normal areceptores diabéticos, tal que o tratamento de insulina se torna desnecessá-rio. Até agora, no entanto, casos bem-sucedidos de transplante de ilhota clí-nica são limitados. Além disso, transplante para um único receptor exige i-Ihotas isoladas dos pâncreas de dois ou três doadores. Especificamente,uma vez que distúrbios de função de ilhota que aparecem imediatamenteapós o transplante reduzem viabilidade de enxerto, transplante de ilhota apartir de dois a três doadores para um único receptor é realizado. Algunsrelatos sugerem apenas de 20% a 30% de enxertos de transplante sobrevi-vem. Detalhes desses distúrbios funcionais permanecem não claras, maselas possuem um problema extramente sério em termos de aperfeiçoamentodos resultados de transplante de ilhota clínico.

Convencionalmente, o transplante de ilhota foi realizado usando-se ilhotas isoladas dos pâncreas de doadores com morte cerebral ou doado-res sob parada cardíaca. Relatos recentes também descrevem casos bem-sucedidos de transplante de ilhota de doador vivo, em que ilhotas são isoia-das e são purificadas de uma porção do pâncreas extirpada a partir de doa-dores saudáveis e são transplantadas para pacientes diabéticos. Tal trans-plante de ilhota de doador vivo é invasivo e uma carga para doadores. As-sim, é preferível permitir tratamentos que suprimem dano a ilhotas transplan-tadas exatamente depois do transplante e que usam menos ilhotas de doa-dor.

IL-6 é um fator 2 de estimulação de célula beta chamada citocina(BSF2) ou inteferon beta2. IL-6 foi descrito como um fator de diferenciaçãoenvolvido na ativação de linfócitos de célula beta (Documento 1 de não-patente), e foi mais tarde revelada ser uma citocina multifuncional que influ-encia a função de várias células (Documento 2 de não-patente). IL-6 foi rela-tada induzir maturação de células de linfócito T (Docuemento 3 de não-patente).IL-6 transmite sua atividade biológica via duas espécies de pro-teínas na célula. Uma das proteínas é o receptor de IL-6 que é uma proteínade ligação de Iigante à qual IL-6 liga e tem um peso molecular de cerca de80 kDa (Documentos 4 e 5 de não-patente). Além de uma forma ligada àmembrana que penetra e é expressa na membrana celular, o receptor de IL-6 está presente como um receptor de IL-6 solúvel que principalmente consis-te na região extracelular da forma ligada à membrana.

A outra é a proteína de membrana gp130, que tem um peso mo-lecular de cerca de 130 kDa e está envolvida em transdução de sinal de Ii-gação de não-ligante. A atividade biológica de IL-6 é transmitida da célulaatravés da formação do complexo de IL-6/receptor de IL-6 por IL-6 e recep-tor de IL-6 e ligação do complexo com gp130 aqui em seguida (Documento 6de não-patente).

Inibidores de IL-6 são substâncias que inibem a transmissão deatividade biológica de IL-6. Até agora, anticorpos contra IL-6 (anticorpos deanti-IL-6), anticorpos contra receptores de IL-6 (anticorpos de receptor deanti-IL-6), anticorpos contra gp130 (anticorpos anti-gp130), variantes de IL-6,peptídeos parciais de II-6 ou receptores de IL-6, e tais são conhecidos.

Há vários relatos referentes aos anticorpos de receptor de anti-IL-6 (Documentos 7 e 8 de não-patente, Documentos 1-3 de patente). Umanticorpo de PM-1 humanizado, que foi obtido por transplante em um anti-corpo humano, a região de determinação de complementaridade (CDR) deanticorpo de camundongo PM-1 (Documento 9 de não-patente), que é umdos anticorpos de receptor de anti-IL-6, é conhecido (Documento 4 de paten-te).

Informação nos documentos da técnica anterior referem-se àpresente invenção é descrita abaixo:

Documento 1 de não-patente: Hirano T. e outros, Nature (1986) 324, 73-76Documento 2 de não-patente: Akira: S. e outros, Adv. in Immunology (1993)54, 1-78

Documento 3 de não-patente: Lotz, M. e outros, J. Exp. Med. (1988) 167,1253-1258Documento 4 de não-patente: Taga., T. e outros, J. Exp. Med. (1987)166,967-981

Documento 5 de não-patente: Yamasaki, K. e outros, Science (1988)241,825-828.

Documento 6 de não-patente: 6 Taga, T. e outros, Cell (1989) 58, 573-581.Documento 7 de não-patente: Novick, D. e outros, Hybridoma (1991) 10,137-146

Documento 8 de não-patente: Huaag. y: W. e outros, Hybridoma (1993) 12.621-630

Documento 9 de não-patente: Hirata, Y. e outros., J. Immunol. (1989) 143,2900-2906

Documento 1 de patente: 1 Publicação Pedido de Patente: Internacional No.WO 95/09873

Documento 2 de patente: Pedido de Patente: Francês No. FR 2694767

Documento 3 de patente: patente: U.S. no. 5216128

Documento 4 de patente: WO 92/19759

Descrição da Invenção

Problemas a serem resolvidos pela invenção.

No transplante de ilhota para o tratamento de diabetes é impor-tante aperfeiçoar a viabilidade de ilhota por supressão de dano a ilhotastransplantadas na hora do transplante. No entanto, não há métodos eficazesaté agora. Além disso, não existe nenhuma avaliação anterior quanto ao fatodo anticorpo de receptor de anti-IL-6, que é um inibidor de IL-6, mostrar oefeito de supressão do dano de ilhotas transplantadas depois do transplantede ilhota.

A presente invenção foi concluída em virtude do que foi citadobase acima, e reivindica prover agentes de supressão de dano a ilhotastransplantadas, que compreendem inibidores de IL-6 como ingredientes ati-vos, e que são usados no transplante de ilhota. Um outro objetivo da presen-30 te invenção é prover métodos para a supressão de dano a ilhotas transplan-tadas a indivíduos, que compreendem a etapa de administração de inibido-res de IL-6 aos indivíduos.Meios para resolver os problemas

Para alcançar os objetivos descritos acima, os presentes inven-tores testaram se anticorpos de receptores de anti-IL-6 exerciam o efeito desupressão de dano a ilhotas transplantadas depois do transplante de ilhota.

Em primeiro lugar, os presentes inventores prepararam camun-dongos diabéticos como receptores por administração intravenosa de estro-zotocina a camundongos C57BL/6 machos.

Então, os camundongos receptores diabéticos foram transplan-tados com ilhotas isoladas do pâncreas de dois camundongos (400 ilhotas)ou de um único camundongo (200 ilhotas). Os resultados mostram que otransplante de ilhotas do pâncreas de dois camundongos restauraram níveisnormais de açúcar no sangue e assim mostraram efeitos terapêuticos paradiabetes, enquanto que oriundos de um único camundongo não restaurouníveis normais de açúcar no sangue e o estado hiperglicêmico foi mantido(Figuras 2 e 3).

Entretanto, quando 500 μg de um anticorpo de receptor de anti-IL-6 (MR16-1) foram intraperitonealmente administrados três vezes depoisde transplante de ilhotas de um único camundongo (200 ilhotas), níveis nor-mais de açúcar no sangue foram restaurados em todos os receptores depoisdo transplante (Figura 4). Alternativamente, quando uma dose igual de umanticorpo de receptor de anti-IL-6 foi administrado uma vez, níveis de açúcarno sangue nromais foram restaurados em três quartos dos receptores (Figu-ra 5). Quando 200 μg de anticorpo de receptor de anti-IL-6 foram adminis-trados uma vez, níveis normais de açúcar no sangue foram restaurados emum terço dos receptores (Figura 6).

Administração dos anticorpos de receptor de anti-IL-6 da presen-te invenção também demonstrou suprimir a produção de citocinas inflamató-rias em células de infiltração depois do transplante.

As constatações acima mostram que anticorpos de receptor deanti-IL-6 reduzem dano a ilhotas transplantadas, aperfeiçoam viabilidade deilhota, e corrigem hiperglicemia em receptores.

Especificamente, os presentes inventores revelaram pela primei-ra vez que dano a ilhotas transplantadas depois do transplante de ilhota po-deria ser suprimido por uso de anticorpos de receptor de anti-IL-6 de acordocom a presente invenção, e eles assim completaram a presente invenção.

Mais especificamente, a presente invenção provê os seguintes 1a 23:

1. Um agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada depoisdo transplante de ilhota, que comprende an inibidor de IL-6 como um ingre-diente ativo;

2. O agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de 1, emque o inibidor de IL-6 é um anticorpo que reconhece e IL-6;

3. O agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de 1, emque o inibidor de IL-6 é um anticorpo que reconhece um receptor de IL-6;

4. O agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de 2 ou 3,em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal;

5. O agente para a supressão de dano a a ilhota transplantada de qualquerum de 2 a 4, em que o anticorpo é um anticorpo IL-6 anti-humano ou um an-ticorpo de receptor de anticorpo de receptor IL-6 anti-humano;

6. Oe agent para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de qual-quer um de 2 a 5, em que o anticorpo é um anticorpo recombinante;

7. O agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de 6, emque o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano;

8. O agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantada de qual-quer um de 1 a 7, que é usado para tratar diabetes;

9. Um método para a supressão de dano a ilhotas transplantadas em umindivíduo de transplante de ilhota, que comprende a etapa de administraçãode um inibidor de IL-6 ao indivíduo;

10. Um método para o aperfeiçoamento de viabilidade de uma ilhota em umindivíduo de transplante de ilhota, que comprende a etapa de administraçãode um inibidor de IL-6 ao indivíduo;

11. O método de 9 ou 10, em que o inibidor de IL-6 é um anticorpo que re-conhece uma IL-6;

12. O método de 9 ou 10, em que o inibidor de IL-6 é um is anticorpo quereconhece um receptor de IL-6;

13. O método de 11 ou 12, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal;

14. O método de qualquer um de 11 a 13, em que o anticorpo é um anticor-po IL-6 anti-humano ou um anticorpo de IL-6 de anti-humano;

15. O método de qualquer um de 11 a 14, em que o anticorpo é um anticor-po recombinante;

16. O método de 15, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humani-zado ou humano;

17. Uso de um inibidor de IL-6 para produzir agentes para a supressão dedano a uma ilhota transplantada depois de transplante de ilhota;

18. O uso de 17, em que o inibidor de IL-6 é um anticorpo que reconheceuma IL-6;

19 O uso de 17, em que o inibidor de IL-6 é um anticorpo que reconhece umreceptor de IL-6;

20 O uso de 18 ou 19, em que o anticorpo é um anticorpo monoclonal;

21 O uso de qualquer um de 18 a 20, em que o anticorpo é um anticorpo IL-6 anti-humano ou anticorpo de receptor IL-6 anti-humano;

22 O de qualquer um de 18 a 21, em que o anticorpo é um anticorpo recom-binante; e

23 O uso de 22, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizadoou humano.

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que não sofremtransplante de ilhota.

A figura 2 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante isogênico de ilhotas oriudas dos pâncreas de dois camundongos(400 ilhotas).

A figura 3 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante isogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas).

A figura 4 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante isogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas), e foram intraperitonealmente administradas três vezescom 500 μg de anticorpo de receptor de anti-IL-6 depois do transplante.

A figura 5 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante isogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas), e foram intraperitonealmente administradas uma vezcom 500 μg de anticorpo de receptor de anti-IL-6 depois do transplante.

A figura 6 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante isogêmico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas), e foram intraperitonealmente administradas uma vezcom 200 μg de anticorpo de receptor de anti-IL-6 depois do transplante.

A figura 7 é um gráfico que mostra que a administração de anti-corpo de receptor de anti-IL-6 suprime produção de pós-transplante de cito-cinas inflamatórias por infiltração de células.

A figura 8 É um gráfico que mostra mudanças de níveis de açú-car no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberam trans-plante alogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camundongo(200 ilhotas), e foram intraperitonealmente administrados três vezes com200 μg de IgG de rato depois do transplante.

A figura 9 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis de a-çúcar no sangue em camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante alogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas), e foram intraperitonealmente administrados uma vezcom 200 μg de anticorpo de anti-CD4 depois do transplante.

A figura 10 é um gráfico que mostra mudanças nos níveis deaçúcar no sangue de camundongos receptores diabéticos que receberamtransplante alogênico de ilhotas oriundas do pâncreas de um único camun-dongo (200 ilhotas) e foram intraperitonealmente administrados três vezescom 500 μς de anticorpo de receptor de anti-1 L-6 e uma vez com 200 μς deanticorpo de anti-CD4 depois do transplante.Melhor Modo para Realização da Invenção

Os presentes inventores revelaram que o anticorpo de receptorde anti-IL-6 pode suprimir dano a ilhotas transplantadas depois do transplan-te de ilhota. A presente invenção é baseada nessas constatações.

A presente invenção refere-se a agentes para a supressão dedano a ilhotas transplantadas depois do transplante de ilhota, que compre-endem um inibidor de IL-6 como um ingrediente ativo.

Aqui, um "inibidor de IL-6" é uma substância que bloqueia trans-dução de sinal medidada por IL-6 e inibe atividade biológica de IL-6. De pre-ferência, o inibidor de IL-6 é uma substância que tem função inibitória contraa ligação de IL-6, receptor de IL-6, ou gp130.

Os inibidores de IL-6 da presente invenção incluem, mas nãosão limitados a, por exemplo, anticorpos de anti-IL-6, anticorpos de recepto-res de anti-IL-6, anticorpos de anti-gp130, variantes de IL-6, variantes dereceptor de IL-6 solúveis e peptídeos parciais de IL-6 ou receptores de IL-6 ecompostos de baixo peso molecular que mostram atividades similares. Inibi-dores de IL-6 preferíveis da presente invenção incluem anticorpos que reco-nhecem receptores de IL-6.

A fonte do anticorpo não é particularmente restrita na presenteinvenção; no entanto, o anticorpo é de preferência derivado de mamíferos ede mais preferência derivado de ser humano.

O anticorpo de anti-IL-6 usado na presente invenção pode serobitdio como um anticorpo monoclonal ou policlonal via meios conhecidos.Em particular, anticorpos monoclonais derivados de mamífero são preferidoscomo o anticorpo de anti-IL-6 usado na presente invenção. Os anticorposmonoclonais derivados de mamíferos incluem aqueles produzidos a partirdos hibridomas e aqueles produzidos a partir do hospedeiros transformadoscom um vetor de expressão que comprende um gene de anticorpo por mé-todos de engenharia. Por ligação a IL-6, o anticorpo inibe IL-6 a partir da Ii-gação a um receptor de IL-6 e bloqueia a transmissão da atividade biológicana célula.

Tais anticorpos incluem, MH166 (Matsu. T. e outros, Eur. J. Im-munol. (1988) 18, 951-956), anticorpo de SK2 (Sato, K. e outros, transactionof the 21 st Annual Meeting of the Japanese

Society for Immunology (1991) 21, 166), e assim por diante.

Basicamente, anticorpo de anti-IL-6 que produz hibridomas po-de ser preparado usando-se técnicas conhecidas como se segue. Especifi-camente, tais hibridomas podem ser preparados por uso de IL-6 como umantígeno de sensibilização para realizar imunização por um método de imu-nização convencional, fusão das células imunes obtidas com células de ori-gem conhecidas por um método de fusão de célula convencional, e triagemde células produtoras de anticorpo monoclonal por um método de triagemconvencional.

Mais especificamente, anticorpos de anti-IL-6 podem ser produ-zidos como se segue. Por exemplo, IL-6 usada como o antígeno de sensibi-lização para obtenção de anticorpo pode ser obtido usando-se o gene de IL-6 e/ou seqüências de aminoácidos revelados em Eur. J. Biochem. (1987)168,543-550; J. Immunol. (1988) 140, 1:34-1541; e/ou Agr. Biol. Chem.(1990)54,268.5-2688.

Depois da transformação de uma célula hospedeira apropriadacom um sistema de vetor de expressão conhecido com uma seqüência degenes de IL-6, a proteína de IL-5 desejada é purificada por um método co-nhecido do interior da célula hospedeira ou do sobrenadante de cultura. Es-sa proteína de IL-6 purificada pode ser usada como o antígeno de sensibili-zação. Alternativamente, uma proteína de fusão da proteína de IL-6 e umaoutra proteína pode ser usada como o antígeno de sensibilização.

Anticorpos de receptor de anti-IL-6 usados para a presente in-venção podem ser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais pormétodos conhecidos. Em particular, os anticorpos de receptores de anti-IL-6usados na presente invenção são de preferência anticorpos monoclonaisderivados de mamíferos. Os anticorpos monoclonais derivados de mamífe-ros incluem aqueles produzidos a partir de hibridomas e aqueles produzidosa partir de hospedeiros transformados com um vetor de expressão que com-prende um gene de anticorpo por métodos de engenharia. Por ligação a umreceptor de IL-6, o anticorpo inibe IL-6 de ligação ao receptor de IL-6 e blo-queia a transmissão de atividade biológica de IL-6 na célula.

Tais anticorpos incluem, anticorpo de MR16-1 (Tamura, T. e ou-tros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1993) 90,11924-11928); anticorpo de PM-1(Hirata, Y. e outros, J. Immunol. (1989) 43, 2900.2906); anticorpo de AUK12-20, anticorpo de AUK64-7 e anticorpo de AUK146-15 (WO 92/19759); e as-sim por diante. Entre eles, o anticorpo de PM-1 pode ser exemplificado comoum

anticorpo monoclonal preferido contra o receptor de IL-6 huma-no, e o anticorpo de MR16-1 como um anticorpo monoclonal preferido contrao receptor de IL-6.

Basicamente, hibridomas que produzem anticorpo monoclonalde receptor de anti-IL-6 pode ser preparado usando-se técnicas conhecidascomo se seguem. Especificamente, tais hibridomas podem ser preparadospor uso de um receptor de IL-6 como o antígeno de sensibilização para rea-lizar imunização por um método de imunização convencional.

Mais especificamente, anticorpos de receptor de IL-6 podem serproduzidos como se segue. Por exemplo, receptor de IL-6 de ser humano oureceptor de IL-6 de camundongo como o antígeno de sensibilização para aobtenção de anticorpo pode ser obtido usando-se os genes de receptor deIL-6 e/ou seqüências de aminoácidos revelados na publicação de pedido depatente europeu no. EP 325474 e Publicação KoKai de Pedido de PatenteJaponesa no. (JP-A) H03-155795 (pedido de patente japonês publicado,não-examinado), respectivamente.

Existem duas espécies de proteínas de receptor de IL-6, isto é,proteína expressa na membrana de célula e proteína separada da membra-na celular (receptor de IL-6 solúvel) (Yasukawa, K. e outros, J. Biochem(1990) 108, 673-676). O receptor de IL-6 solúvel consiste essencialmente naregião extracelular do receptor de IL-6 ligado à membrana celular, e diferedo receptor de IL-6 ligado à membrana pelo fato de que ele carece da regiãode transmembrana ou tanto as regiões intracelular quanto transmembrana.Qualquer receptor de IL-6 pode ser empregado como a proteína de receptorde IL-6 contanto que possa ser usado como um antígeno de sensibilizaçãopara a produção do anticorpo de receptor de anti-IL-6 utilizado na presenteinvenção.

Depois da transformação de uma célula hospedeira apropriadacom um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma se-qüência de genes de receptor de IL-6, a proteína de receptor de IL-6 deseja-da é purificada por um método conhecido do interior da célula hospedeira oudo sobrenadante de cultura. Essa proteína de receptor de IL-6 puriricadapode ser usada como um antígeno de sensibilização. Alternativamente, umacélula que expressa o receptor de IL-6 ou uma proteína de fusão da proteínade receptor de IL-6 e uma outra proteína pode ser usada como um antígenode sensibilização.

Anticorpos de anti-gp130 usados na presente invenção podemser obtidos como anticorpos policlonais ou monoclonais por métodos conhe-cidos. Em particular, os anticorpos de anti-gp130 usados na presente inven-ção são de preferência anticorpos monoclonais derivados de mamíferos. Osanticorpos monoclonais derivados de mamíferos incluem aqueles produzidosa partir de hibridomas e e aqueles produzidos a partir de hospedeiros trans-formados com um vetor de expressão que compreende um gene de anticor-po por métodos de engenharia. Por ligação a gp130, o anticorpo inibe gp130da ligação ao complexo de IL-6/ receptor de IL-6 e bloqueia a transmissãoda atividade biológica de IL-6 na célula.

Tais anticorpos incluem, anticorpo de AM64 (JP-A (Kokai) H03-219894); anticorpo de 4B11 e anticorpo de 2H4 (patente U.S. no. 5571513);anticorpo de B-S12 e anticorpo de B-P8 (JP-A (Kokai) H08-291199); e assimpor diante.

Basicamente, hibridomas produtores de anticorpo monoclonalde anti-gp130 podem ser preparados usando-se técnicas conhecidas comose segue. Especificamente, tais hibridomas podem ser preparados por usode gp130 como um antígeno de sensiblização para realizar a imunização porum método de imunização convencional, fusão das células imunes obtidascom uma célula-mãe conhecida por um método de fusão de célula conven-cional, e triagem das células produtoras de anticorpo monoclonal por ummétodo de triagem convencional.

Mais especificamente, o anticorpo monoclonal pode ser produ-zido como se segue. Por exemplo, gp130 usdo como um antígeno de sensi-bilização para a obtenção de anticorpo pode ser obtido usando-se o gene degp130 e/ou seqüência de aminoácidos revelados na Publicação de Pedidode Patente Europeu no. EP 411946.

Depois da transformação de uma célula hospedeira apropriadacom um sistema de vetor de expressão conhecido inserido com uma se-qüência de genes de gp130, a proteína de gp130 desejada é purificada porum método conhecido do interior da célula hospedeira ou do sobrenadantede cultura. Essa proteína de gp130 purificada pode ser usada como um antí-geno de sensibilização. Alternativamente, uma célula que expressa gp130ou uma proteína de fusão da proteína de gp130 e uma outra proteína podeser usada como um antígeno de sensibilização.

Mamíferos a serem imunizados com um antígeno de sensibili-zação não são particularmente limitados, mas são de preferência seleciona-dos em consideração da compatibilidade com a célula-mãe usada para afusão de célula. Em geral, roedores tais como camundongos, ratos e hams-ters são usados.

Imunização de animais com um antígeno de sensibilização é re-alizada de acordo com os métodos conhecidos. Por exemplo, como um mé-todo geral, é realizado por injeção do antígeno de sensibilização intraperito-nealmente ou subcutaneamente para dentro de mamíferos. Especificamente,o antígeno de sensibilização é de preferência diluído ou é suspenso em umaquantidade apropriada de solução salina tamponada por fosfato (PBS), solu-ção salina fisiológica ou tal, misturada com uma quantidade apropriada deum auxiliar geral (por exemplo, auxiliar completo de Freund), é emulsificada,e então é administrada por várias vezes ao dia de 4 a 21 dias a um mamífe-ro. Além disso, um veículo apropriado pode ser usado para a imunizaçãocom um antígeno de sensibilização.

Após a tal imunização, um nível aumentado do anticorpo dese-jado no soro é confirmado e então células imunes são obtidas a partir domamífero para fusão de célula. Células imunes preferidas para fusão de cé-lula incluem, em particular, células de baço.

Para as células de mieloma de mamífero a serem usadas comouma célula-mãe, isto é, uma célula parceira a ser fundida com as célulasimunes acima, várias cepas de células conhecidas, por exemplo,P3X63Ag8.653 (Kearney, J. F. e outros J. Immunol (1979) 123, 1548-1550).P3X63Ag8U.I (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81.1-7), NS-I (Kobler. G. and Milstein1 C., Em. J. Immunol. (1976) 6, 511-519),MPC-11 (Margulies, D. H. e outros, Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shul-man, M. e outros, Nature (1978) 276, 269-270), F0 (de St. Groth, S. F. e ou-tros, J. ImmunoL. Methods (1980) 35, 1-21), 8194 (Trowbndge, I. S. J. Exp.Med. (1978) 148, 313-323), R210 (Galfre, G e outros, Nature (1979) 277,131-133), e tais são apropriadamente usados.

Basicamente, fusão de célula da célula imune e célula de mie-loma pode ser realizada usando-se métodos conhecidos, por exemplo, ométodo por Milstein e outros, (Kobler, G and ; Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) e semelhantes.

Mais especificamente, a fusão de célula acima mencionada é éconseguida em meio de cultura de nutriente geral sob a presença de um a-gente de aumento de fusão de célula. Por exemplo, polietileno glicol (PEG),vírus de Sendai (HVJ), e semelhantes são usados como um agente de au-mento de fusão. Além disso, para aumentar a eficácia de fusão, agentes au-xiliares tal como sulfóxido de dimetila pode ser adicionado para o uso de a-cordo com as necessidades.

A razão de células imunes e células de mieloma usadas é depreferência, por exemplo, de 1 a 10 células imunes para cada célula de mie-loma. O meio de cultura usado para a fusão de célula acima mencionado é,por exemplo, o meio de cultura de RPMI1640 ou de MEM, que são adequa-dos para a proliferação das células de mieloma acima mencionadas. Ummeio de cultura geral usado para o cultivo desse tipo de célula pode tambémser usado. Além do mais, suplementos de soro tal como soro de bezerro fe-tal (FCS) pode ser usado em combinação.

Para a fusão de célula, as células de fusão (hibridomas) de inte-resse são formadas por misturação de quantidades predeterminadas da cé-lula imune acima mencionada e célula de mieloma também no meio de cultu-ra acima mencionado, e então adição e misturação de uma concentração de30 a 60% (p/v) de solução de PEG (por exemplo, uma solução de PEG comum peso molecular médio de cerca de 1.000 a 6.000) pré-aquecida a cercade 37°C. Então, agentes de fusão de célula e tais que são inadequados parao crescimento de hibridoma podem ser removidos por repetição das etapasde adição sucessiva de um meio de cultura apropriado e remoção do sobre-nadante por centrifugação.

Os hibridomas acima são selecionados por cultura de célulasem um meio de cultura de seleção geral, por exemplo, meio de cultura deHAT (um meio de cultura contendo hipoxantina, aminipterina e timidina). Ocultivo no meio de cultura de HAT é continuado por um período de temposuficiente, em geral por vários dias até várias semanas, para matar célulasque não os hibridomas de interesse (células não-fundidas). Então, o métodode diluição limitado padrão é realizado para triar e clonar hibridomas queproduzem o anticorpo de interesse.

Além do método de imunização de um animal não-humano comum antígeno para obtenção dos hibridomas acima mencionados, um anticor-po humano desejado que tem a atividade de ligação a um antígeno ou célulade expressão de antígeno desejado pode ser obtido por sensibilização deum linfócito humano com uma proteína de antígeno ou célula de expressãode antígeno in vitro deseado, e fusão do linfócito B sensibilizado com umacélula de mieloma humana (por exemplo, U266) (vide, a publicação de Ko-koku de pedido de patente japonesa no. (JP-B) H01-59878 (pedido de pa-tente japonês, examinado publicado para oposição). Além do mais, um anti-corpo humano desejado pode ser obtido por adminitração da célula de ex-pressão de antígeno ou antígeno a um animal transgênico que tem um re-pertório de genes de anticorpo de ser humano e então seguindo o métodoacima mencionado (vide, Publicações Pedidos de Patentes Internacionaisnos. WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 94/25585, WO96/34096, e WO 96/33735).

Os hibridomas assim preparados que produzem anticorpos mo-noclonais podem ser subcultivados em meio de cultura convencional e ar-mazenados em nitrogênio líquido por um longo período.

Para obtenção de anticorpos monoclonais a partir dos hibrido-mas acima mencionados, os seguintes métodos podem ser empregados: (1)método onde os hibridomas são cultivados de acordo com os métodos con-vencionais e os anticorpos são obtidos como um sobrenadante de cultura;(2) método onde os hibridomas são proliferados por administração deles aum mamífero compatível e os anticorpos são obtidos como ascítes; e assimpor diante. O primeiro método é preferido por obtenção de anticorpos comalta pureza, e o último é preferido para produção em grande escala de anti-corpos.

Por exemplo, a preparação de hibridomas produtores de anticor-po de receptor de IL-6 pode ser preparada pelo método revelado na JP-A(Kokai) H03-139293. A preparação pode ser realizada pelo método de inje-ção de um hibridoma produtor de PM-1 para dentro da poço abdominal deum camundongo BALB/c, obtenção de ascíte, e então purificação de anti-corpo de PM-1 do ascíte, ou o método de cultivo do hibridoma em um meioapropriado (por exemplo, meio de RPM11640 contendo 10% de soro de bo-vino fetal, e 5% de BM-Condimed H1 (Boehringer Mannheim); meio de SMFde hibridoma (GIBCO-BRL); meio de PFHM-II (GIBCO-BRL), etc.) e entãoobtenção do anticorpo de PM-1 a partir do sobrenadante de cultura.

Um anticorpo recombinante pode ser usado como um anticorpomonoclonal da presente invenção, em que o anticorpo é produzido atravésde técnicas de recombinação genéticas por clonagem de um gene de anti-corpo de um hibridoma, inserção do gene para dentro de um vetor apropria-do, e então introdução do vetor para dentro de um hospedeiro (vide, por e-xemplo, Borrebaeck1 C. A. K. and Larrick, J. W., THERAPEUTIC MONO-CLONAL ANTIBODIES, publicado no Reino Unido por MACMILLAN PUBLI-SHERS LTD., 1990.

Mais especificamente, mRNA que codifica a região variável (V)de um anticorpo é isolado de uma célula que produz o anticorpo de interes-se, tal como um hibridoma. O isolamento de mRNA pode ser realizado porpreparação de RNA total de acordo com os métodos conhecidos, tais comométodo de ultracentrifugação de guanidina (C, J. M. e outros, Biochemistry(1979) 18, 5294-5299) e o método de AGPC (Chomczynski, P. e outros, A-nal. Biochem. (1987) 162, 156-159), e preparação de mRNA usando-se o kitde purificação de mRNA (Pharmacia) e semelhantes. Alternativamente, omRNA pode ser diretamente preparado usando-se o kit de purificação demRNA QuickPrep (pharmacia).

O cDNA da região V de anticorpo é sintetizado a partir do mRNAobtido usando-se transcriptase reversa. A síntese de cDNA pode ser alcan-çada usando-se o kit de síntese de cDNA de primeiro fio de transcriptasereversa AMV e assim por diante. Além do mais, para sintetizar e ampliar ocDNA, o método de 5'-RACE (Frobman, M. A. e outros.) Proc. Natl. Acad.Sei. USA (1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A. e outros, Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932) usando-se o kit 5-Ampli FINDER RACE (CIontech) ePCR pode ser empregada. O fragmento de DNA de interesse é purificadodos produtos de PCR obtidos e então é ligado com o DNA de vetor. Então,um vetor recombinante é preparado üsando-se o DNA acima e é introduzidopara dentro de Escherichia coli ou semelhantes, e suas colônias são sele-cionadas para preparar o vetor recombinante desejado. A seqüência de nu-cleotídeos do DNA de interesse é confirmada por, por exemplo, o método dedideóxi.

Quando um DNA que codifica a região V de um anticorpo deinteresse é obtido, o DNA está ligado com um DNA que codifica uma regiãoconstante de anticorpo desejada (região C), e é inserido em um vetor de ex-pressão. Alternativamente, o DNA que codifica a região V de anticorpo podeser inserido em um vetor de expressão compreendendo o DNA de uma regi-ão C de anticorpo.

Para produzir um anticorpo a ser usado na presente invenção,como descrito abaixo, o gene de anticorpo é inserido em um vetor expressãode modo que ele seja expresso sob o controle da região regulação de ex-pressão, aumentador e promotor. Então, o anticorpo pode ser expresso portransformação de uma célula hospedeira com esse vetor de expressão.

Na presente invenção, para diminuir heteroantigenicidade contraser humano e semelhantes, anticorpos recombinantes genéticos artificial-mente modificados, ou anticorpos humanos, podem ser usados. Esses anti-corpos modificados podem ser preparados usando-se métodos conhecidos.

Um anticorpo quimérico pode ser obtido por ligação de DNA decodificação de região V de anticorpo obtido como acima com um DNA decodificação de região C de anticorpo de ser humano, inserção do DNA emum vetor de expressão e introdução dele para dentro de um hospedeiro paraa produção (vide, Publicação de Pedido de Patente Europeu no. EP 125023;Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 92/19759). Esse mé-todo conhecido pode ser usado para se obter anticorpos quiméricos úteispara a presente invenção.

Anticorpos humanizados são também chamados de anticorposhumanos remodelados, e são anticorpos em que as regiões de determina-ção de complementaridade (CDRs) do anticorpo oriundas de um mamíferoque não ser humano (por exemplo, anticorpo de camundongo) são transferi-das nas CDRs de um anticorpo humano. Métodos gerais para essa recombi-nação de gene são também conhecidos (vide, Publicação de pedido de pa-tente européia No. EP 125023, Publicação de pedido de patente internacio-nal No. WO 92/19759).

Mais especificamente, uma seqüência de DNA projetada de mo-do que as CDRs de um anticorpo de camundongo estejam ligadas com umaregião de estrutura (FRs) de um anticorpo humano seja sintetizada por PCRa partir de vários oligonucleotídeos que tinham sido produzidos para conterporções de sobreposição nos seus terminais. O DNA obtido é ligado com umDNA de codificação de região C de anticorpo humano e então é inserido emum vetor de expressão. O vetor de expressão é introduzido para dentro deum hospedeiro para produzir o anticorpo humanizado (vide, Publicação depedido de patente européia No. EP 239400, Publicação de pedido de paten-te internacional No. WO 92/19759).

As FRs de anticorpo de ser humano a serem ligadas via as C-DRs são selecionadas tal que CDRs oriundas de um sítio de ligação de antí-geno adequado. 0(s) aminoácido(s) dentro das FRs das regiões variáveis deanticorpo podem ser substituídas quando necessário de modo que as CDRsdo anticorpo humano remodelado oriundo de um sítio de antígeno apropria-do (Sato, K. e outros, Câncer Res. (1993) 53, 851-856).

Regiões C de anticorpo de ser humano são usadas para os anti-corpos quiméricos ou humanizados, e incluem Cy. Por exemplo, Cy1, Cy2,Cy3, ou Cy4 podem ser usados. Além do mais, para aperfeiçoar a estabilida-de do anticorpo ou sua produção, as regiões C de anticorpo de ser humanopodem ser modificadas.

Anticorpos quiméricos consistem na região variável de um anti-corpo derivado de mamíferos não-humanos e uma região C derivada de an-ticorpo de ser humano consistem das CDRs de um anticorpo derivado demamíferos não-humanos e as regiões de estrutura e regiões C derivados deum anticorpo humano. Ambas têm antigenicidade reduzida em corpo huma-no, e são, portanto, úteis como anticorpos a serem usados na presente in-venção.

Exemplos específicos preferidos de anticorpos humanizados napresente invenção incluem anticorpo de PM-1 humanizado (vide, Publicaçãode Pedido de Patente Internacional No. WO 92/19759).

Além do mais, além do método acima mencionado para a obten-ção de um anticorpo humano, técnicas para a obtenção de anticorpos hu-manos por garimpar usando-se uma biblioteca de anticorpo de ser humanosão também conhecidas. Por exemplo, é possível expressar as regiões vari-áveis de anticorpos humanos na superfície de fagos como anticorpos de ca-deia simples (scFv) pelo método de exibição de fago, e então selecionar fa-gos de ligação a antígeno. Por análise de genes dos fagos selecionados,seqüências de DNA que codificam as regiões variáveis de anticorpo de serhumano que se ligam ao antígeno podem ser determinadas. Uma vez que aseqüência de cDNA de um scFv que se liga ao antígeno é revelada, um ve-tor de expressão apropriado compreendendo a seqüência pode ser construí-do para se obter um anticorpo humano. Esses métodos são já conhecidos, eas publicações das WO 92/01047, WO 92/20791, WO93/06213, WO93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, e WO 95/15388 podem ser usadascomo referência.

O gene de anticorpo construído acima pode ser expresso de a-cordo com os métodos convencionais. Quando uma célula de mamífero éusada, o gene de anticorpo pode ser expresso usando-se um DNA em que ogene de anticorpo a ser expresso está funcionalmente ligado a um promotorútil comumente usado e um sinal poli A a jusante do gene de anticorpo, ouum vetor compreendendo o DNA. Exemplos de promotor/aumentador inclu-em promotor/aumentador imediatamente precoce de citomegalovírs humano.

Além do mais, outros promotores/aumentadores que podem serutilizados para a expressão do anticorpo a ser usado na presente invençãoincluem promotores/aumentadores virais oriundos de retrovírus, vírus polio-ma, adenovírus, vírus de símio (SV40), e semelhantes; e promoto-res/aumentadores derivados de célula de mamífero tal como fator 1 alfa dealongamento de ser humano (HEF1alfa).

Por exemplo, quando o promotor/aumentador de SV40 é usado,a expressão pode ser facilmente realizada pelo seguinte método por Mulli-gan e outros (Mulligan, R. C. e outros, Nature (1979) 277, 108-114). Alterna-tivamente, no caso de promotor/aumentador de HEFIalfa, o método por Mul-ligan e outros (Mizushima, S. e Nagata S., Nucleic Acids Res. (1990) 18,5322) pode ser usado.

Quando E. coli é usada, o gene de anticorpo pode ser expressopor ligação de funcional de um promotor útil convencional, uma seqüênciade sinal para a secreção de anticorpo, e o gene de anticorpo a ser expresso.Exemplos de um promotor incluem o promotor de LacZ, promotor de araB esemelhantes. Quando o promotor de lacZ é usado, a expressão pode serrealizada de acordo com o método por Ward e outros, (Ward. E. S. e outros,Nature (1989) 341, 544-546; Ward, E. S. e outros, FASEB J. (1992) 6, 2422-2427); e o promotor de araB pode ser usado de acordo com o método porBetler e outros (Better, M. e outros, Science (1988) 240,1041-1043).

Quando o anticorpo é produzido no periplasma de E. coli, a se-qüência de sinal de pel B (Lei, S. P. e outros J. Bacteriol, (1987) 169, 4379-4383) pode ser usada depois de redobramento apropriado da estrutura deanticorpo (vide, por exemplo, WO 96/30394).

Quando a origem de replicação, aqueles derivados de SV40,vírus de polioma, adenovírus, vírus de papiloma bovino (BPV) e semelhantespodem ser usados. Além disso, para aumentar o número de cópias de geneem um sistema de célula hospedeira, o vetor de expressão pode compreen-der gene de aminoglicosídeo fosfotransferase (ΑΡΗ), gene de cinase de ti-midina (TK), gene de xantina-guanina de fosforribosiltransferase de E. coli(Ecogpt), gene de redutase de di-hidrofolato (dhfr), ou tal como um marcadorde seleção.

Qualquer sistema de produção pode ser usado para a prepara-ção dos anticorpos a serem usados na presente invenção. Os sistemas deprodução para a prepração de anticorpo incluem produção de sistema in vi-tro e in vivo. Sistemas de produção in vitro incluem aqueles utilizando-secélulas eucarióticas ou células procarióticas.

Sistemas de produção usando-se células eucarióticas incluemaqueles que utilizam células de animal, células de planta ou células fúngicas.Tais células de animal incluem (1) células de mamífero, por exemplo, CHO,COS, rim de hamster bebê (BHK), HeLa1 Vero, e semelhantes; (2) células deanfíbio, por exemplo, ovócito de Xenopus; e (3) células de inseto, por exem-plo, sf9, sf21, Tn5, e semelhantes. Células de planta conhecidas incluemcélulas derivadas de Nicotiana tabacum, que podem ser cultivadas comocalo. Células fúngicas conhecidas incluem levedura tais como Saccharomy-ces (por exemplo, S. cerevisiae), fungos de mofo tal comoAspergillus (por exemplo, A. niger), e semelhantes.

Sistemas de produção usadando-se células procarióticas inclu-em aqueles utilizando-se células bacterianas. Células bacterianas conheci-das incluem E. coli e Bacillus subtilis.

Anticorpos podem ser obtidos por introdução de um gene de an-ticorpo de interesse para dentro dessas células por transformação, e cultivodas células transformadas in vitro. O cultivo é conduzido de acordo com osmétodos conhecidos. Por exemplo, DMEM, MEM, RPM1L-640, IMDM po-dem ser usados como o meio de cultura, e suplementos de soro, tal comoFCS, pode ser usado em combinação. Além do mais, uma célula introduzidacom um gene de anticorpo pode ser transferida na poço abdominal ou seme-Ihante de um animal para produzir um anticorpo in vivo.

Por outro lado, sistemas de produção in vivo incluem aquelesutilizando-se animais ou plantas. Sistemas de produção usando-se animaisincluem aqueles que utilizam mamíferos ou insetos.

Mamíferos que podem ser usados incluem bodes, porcos, car-neiros, camundongos, bovinos e semelhantes (Vicki Glaser, SPECIRUM Bio-technology Applications 1993). Além disso, insetos que podem ser usadosincluem bichos-da-seda. Quando do uso de plantas, por exemplo, tabacopode ser usado.

Um gene de anticorpo é introduzido para dentro desses animaisou plantas, e um anticorpo é produzido no corpo dos animais ou plantas eentão é recuperado. Por exemplo, o gene de anticorpo é preparado comoum gene de fusão por inserção do gene no meio do gene que codifica umaproteína, tal como beta caseína de cabra, que é unicamente produzida noleite. Um fragmento de DNA compreendendo o gene de fusão inserido nogene de anticorpo é injetado para dentro de um embrião de cabra, e o em-brião é introduzido para dentro de uma cabra. O anticorpo desejado é obtidoa partir do leite produzido a partir do animal transgênico nascido da cabraque recebeu o embrião, ou produzido a partir de proles do animal. Para au-mentar a quantidade de leite que contém o anticorpo desejado produzido apartir da cabra transgênica, hormônios podem ser apropriadamente usadosna cabra transgênica (Ebert, Κ. M. e outros, Bio/technology (1994) 12) 699-702).Além do mais, quando bicho-da-seda é usado, ele é infectadocom baculovírus inserido com o gene de anticorpo desejado, e o anticorpodesejado é obtido a partir do fluido de corpo desse bicho-da-seda (Maeda, S.e outros, Nature (1985) 315, 592-594). Além do mais, quando o tabaco éusado, o gene de anticorpo desejado é inseridos em um vetor de expressãode planta (por exemplo, pMON53ü) e o vetor é introduzido nas bactérias talcomo Agrobacterium tumefaciens. Essa bactéria é usada para infectar taba-co (por exemplo, Nicotiana tabacum) para se obter um anticorpo desejado apartir das folhas desse tabaco (Julian, K. -C. Ma e outros, Eur. J. Immunol.(1994)24,131-138).

Quando da produção de um anticorpo nos sistemas de produçãoin vitro ou in vivo como descritos acima, DNAs que codificam a cadeia pesa-da (cadeia H) e a cadeia leve (cadeia L) de anticorpo podem ser inseridosnos vetores de expressão separados e um hospedeiro é então cotransfor-mado com os vetores. Alternativamente, os DNAs podem ser inserido em umvetor de expressão simples para a transformação de um hospedeiro (vide,Publicação de pedido de patente internacional No. WO 94/11523).

Os anticorpos usados na presente invenção podem ser fragmen-tos de anticorpo ou seus produtos modificados contanto que eles possamser adequadamente usados na presente invenção. Por exemplo, fragmentosde anticorpo incluem Fab, F(ab')2. Fv1 e Fv de cadeia simples (scFv) em queos Fvs das cadeias HeL estão ligadas via um Iigante apropriado.

Especificamente, os fragmentos de anticorpo são produzidos portratamento de um anticorpo com uma enzima, por exemplo, papaína ou pep-sina, ou alternativamente, genes que codificam esses fragmentos são cons-truídos, introduzidos dentro de vetores de expressão, e expressos em umacélula hospedeira apropriada (vide, por exemplo, Co, M. S. e outros, J. Im-munol. (1994) 152, 2968-2976; Better, M. & Horwitz, A. H., Methods in En-zymology (1989) 178, 476-496; Plueckthun, A. & Skerra, A., Methods in En-zymology (1989) 178,497-515; Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989)121, 652-663; Rousseaux, J. e outros, Methods in Enzymology (1989)121,663-666; Bird, R. E. e outros, TlBTECH (1991) 9, 132-137).Um scFv pode ser obtido por ligação da região V de cadeia H ea região V de cadeia L de um anticorpo. No scFv, a região V de cadeia Hearegião V de cadeia L estão ligadas via um ligante, de preferência via um Ii-gante de peptídeo (Huston, J. S. e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988)85, 5879-5883). As regiões V das cadeias de H e L em um scFv podem serderivadas de qualquer um dos anticorpos descritos acima. Ligantes de pep-tídeo para a ligação da região V incluem, por exemplo, um peptídeo de ca-deia simples arbitrário que consiste em 12 a 19 resíduos de aminoácido.

Um DNA de codificação de scFv pode ser obtido por uso doDNA que codifica a cadeia H ou sua região Veo DNA que codifica a cadeiaL ou sua região V dos anticorpos acima mencionados como modelos, ampli-ação de PCR da porção de DNA que codifica a seqüência de aminoácidosdesejada na seqüência de modelo usando-se iniciadores que definem osterminais da porção, e então ampliação ulterior da porção de DNA ampliadacom um DNA de codificação de porção de ligante de peptídeo e pares deiniciador que ligam ambas as extremidades do ligado à cadeia H e cadeia L.

Além do mais, uma vez que um DNA de codificação de scFv foiobtido, um vetor de expressão compreendendo o DNA e um hospedeirotransformado com o vetor podem ser obtidos de acordo com os métodosconvencionais. Além disso, o scFv pode ser obtido de acordo com os méto-dos convencionais usando-se o hospedeiro.

Similarmente como acima, esses fragmentos de anticorpo po-dem ser produzidos a partir do hospedeiro por obtenção ou expressão deseus genes. Aqui, "anticorpo" inclui esses fragmentos de anticorpo.

Como um anticorpo modificado, um anticorpo ligado a váriasmoléculas, tais como polietileno glicol (PEG) pode também ser usado. Aqui,"anticorpo" inclui esses anticorpos modificados. Esses anticorpos modifica-dos podem ser obtidos por modificação química dos anticorpos obtidos. Taismétodos já são estabelecidos na técnica.

Os anticorpos produzidos e processados como acima podem serisolados do interior ou exterior da célula ou de hospedeiro, e são purificadosaté homogeneidade. O isolamento e/ou purificação dos anticorpos usadospara a presente invenção podem ser realizados por cromatografia por afini-dade. Colunas a serem isoladas para a cromatografia por afinidade incluem,por exemplo, coluna de proteína A e coluna de proteína G. Veículos usadospara a coluna de proteína A incluem, por exemplo, Hyper D, POROS, Se-pharose F. F. e semelhantes. Além do exposto acima, outros métodos usa-dos para o isolamento e/ou purificação de proteínas comuns podem ser usa-dos, e não são limitados de maneira alguma.

Por exemplo, os anticorpos usados para a presente invençãopodem ser isolados e/ou purificados por seleção e combinação apropriadasde cromatografias além de cromatografia por afinidade, filtros, uItrafiItração,dessalinização, diálise, e semelhantes. Cromatografias incluem, por exem-plo, cromatografia de troca de íons, cromatografia hidrofóbica, filtração porgel, e semelhantes. Essas cromatografias podem ser aplicadas a cromato-grafia líquida de alto desempenho (HPLC). Alternativamente, HPLC de fasereversa podem ser usada.

Concentração dos anticorpos como obtida acima pode ser de-terminada por medição de absorbância, ELISA, ou semelhantes. Especifi-camente, a absorbância é determinada por cerca de diluição da solução deanticorpo com PBS (), medição da absorbância a 280 nm, e cálculo da con-centração (1,35 OD = 1 mg/ml). Alternativamente, quando do uso de ELISA,a medição pode ser realizada como se segue. Especificamente, 100 μΙ deIgG anti-humano de cabra (TAG) diluídos a 1 μg/ml com tampão de bicarbo-nato a 0,1 M (pH 9,6) são adicionados a uma placa de 96 poços (Nunc) e éincubada de um dia para o outro a 4°C para imobilizar o anticorpo. Depois dobloqueamento, 100 μΙ de um anticorpo apropriadamente diluído da presenteinvenção ou uma amostra apropriadamente diluída compreendendo o anti-corpo, e IgG de ser humano (CPPEL) são adicionados como um padrão, eincubação por uma hora à temperatura ambiente.

Depois da lavagem, 100 μΙ de 5.000 χ IgG de anti-humano mar-cada com fosfatase alcalina diluída (BIO SOURCE) são adicionados e sãoincubados por uma hora à temperatura ambiente. Depois de uma outra lava-gem, MICROPLATE READER modelo 3550 (Bio-Rad) para calcular a con-centração do anticorpo de interesse.

Variantes de IL-6 usadas na presente invenção são substânciasque têm a atividade de se ligar a um receptor de IL-6 e que não transmitematividade biológica de IL-6. Isto é, as variantes de IL-6 competem com IL-6para ligar receptores de IL-6, mas não conseguem transmitir atividade bioló-gica de IL-6, portanto, bloqueando transdução de sinal mediada por IL-6.

As variantes de IL-6 são produzidas por introdução de mutação(ões) através de substituição de resíduos de aminoácidos na seqüência deaminoácidos de IL-6. A origem de IL-6 usada como a base das variantes deIL-6 não é limitada; no entanto, é preferível a IL-6 humana quando da consi-deração de sua antigenicidade e semelhantes.

Mais especificamente, substituição de aminoácido é realizadapor previsão da estrutura secundária da seqüência de aminoácidos de IL-6usando-se programas de modelagem molecular conhecidos (por exemplo,WHATIF; Variend e outros, J. Mol. Graphies (1990) 8, 52-56), e avaliaçãoulterior da influência do(s) resíduo(s) de aminoácido(s) substituído(s) na mo-lécula inteira. Depois da determinação do resíduo de aminoácido apropriadoa ser substituído, métodos de PCR comumente realizados são realizadosusando-se a seqüência de nucleotídeos de codificação de gene de IL-6 deser humano como um modelo para introduzir mutações de modo que amino-ácido estejam substituídos, e desse modo um gene de codificação de varian-te de IL-6 é obtido. Se necessário, esse gene é inserido em um vetor de ex-pressão apropriado, e a variante de IL-6 pode ser obtida por aplicação dosmétodos acima mencionados para expressão, produção e purificação deanticorpos recombinantes.

Exemplos específicos das variantes de IL-6 são revelados emBrakenhoffe outros, J. Biol. Chem. (1994) 269, 86-93, Savino e outros, EM-BO J. (1994) 13, 1357-1367, WO 96/18648 e WO 96/17869.

Peptídeos parciais de IL-6 e peptídeos parciais de receptores deIL-6 a serem usados na presente invenção são substâncias que têm ativida-de de ligar a receptores de IL-6 e IL-6, respectivamente, e que não transmi-tem atividade biológica de IL-6. A saber, por ligação a e captura de um re-ceptor de IL-6 ou IL-6, o peptídeo parcial de IL-6 ou o peptídeo parcial dereceptor de IL-6 especificamente inibe IL-6 a partir da ligação ao receptor deIL-6. Como um resultado, a atividade biológica de IL-6 não é transmitida, e,portanto, transdução de sinal mediada por IL-6 é bloqueada.

Os peptídeos de IL-6 ou receptor de IL-6 são peptídeos que

compreendem parte ou a totalidade da seqüência de aminoácidos que estáenvolvida na ligação de IL-6 e receptor IL-6. Tais peptídeos usualmentecompreendem de 10 a 80, de preferência de 20 a 50, mais de preferência de20 a 40 resíduos de aminoácidos.Os peptídeos parciais de IL-6 ou peptídeos parciais de receptor

de IL-6 podem ser produzidos de acordo com métodos em geral conhecidos,por exemplo, técnica de engenharia ou método de síntese de peptídeo, porespecificação da região da seqüência de aminoácidos de receptor de IL-6 ouIL-6 que está envolvida na ligação de IL-6 e receptor de IL-6, usando-se umaporção ou a totalidade da seqüência de aminoácidos da região especificada.

Quando da preparação de um peptídeo parcial de IL-6 ou peptí-deo parcial de receptor de IL-16 por um método de engenharia, uma se-qüência de DNA que codifica o peptídeo desejado é inserido em um vetor deexpressão, e então o peptídeo pode ser obtido por aplicação dos métodosacima mencionados para a expressão, produção e purificação de anticorposrecombinantes.

Para produzir um peptídeo parcial de IL-6 ou peptídeo parcial dereceptor de IL-6 por métodos de síntese de peptídeo, em geral métodos depeptídeo usados, por exemplo, métodos de síntese de fase sólida ou méto- dos de síntese de fase líquida podem ser usados.

Especificamente, a síntese pode ser realizada após o métododescrito em "Continuation of Develovement of Phaml aceuticals, Vol. 14,Peptide Sythesis (em Japonês) (ed. Haruaki Yajima, 1991, Hirokawa Sho-ten)". Como um método de síntese de fase sólida, por exemplo, o seguinte método pode ser empregado: o aminoácido que corresponde ao terminal Cdo peptídeo a ser sintetizado está ligado a um suporte que é insolúvel emsolventes orgânicos, então alongando o fio de peptídeo por reptição alterna-tiva (1) a reação de aminoácidos de condensação cujos grupos de alfa-amino e grupos funcionais de cadeia de ramificação são protegidos comgrupos de proteção apropriados de uma só vez em uma direção CaN-terminais; e (2) a reação de remoção de grupos de proteção contra os gru-pos de alfa-amino do peptídeo ou aminoácido ligado à resina. Síntese depeptídeo de fase sólida é amplamente classificada no método de Boc e ométodo de Fmoc com base no tipo de grupo de proteção usado.

Depois da proteína de interesse é sintetizado como acima, rea-ção de desproteção e reação para clivar o fio de peptídeo do suporte sãorealizadas. Para a reação de clivagem do fio de peptídeo, em geral, fluoretode hidrogênio ou ácido trifluorometano sulfônico é usado para o método deBoc, e TFA para o método de Fmoc. De acordo com o método de Boc, porexemplo, a resina de peptídeo protegida mencionada acima é tratada emfluoreto de hidrogênio sob a presença de anisol. Então, o peptídeo é recupe-rado por remoção do grupo de proteção e clivagem do peptídeo do suporte.Por secagem por congelamento do peptídeo recuperado, um peptídeo brutopode ser obtido. Por outro lado, no método de Fmoc, por exemplo, a reaçãode desproteção e a reação para clivar o fio de peptídeo do suporte podemser realizadas em TFA por um método similar como descrito acima.

O peptídeo bruto obtido pode ser separado e/ou purificado poraplicação de HPLC. Eluição pode ser realizada sob ótimas condições usan-do-se um sistema de solvente de água-acetonitrila, que é em geral usadopara a purificação de proteína. As frações que correspondem aos picos doperfil cromatográfico obtido são coletadas e são secas por congelamento.Assim, frações de peptídeo purificadas são identificadas por análise de pesomolecular via análise de espectro de massa, análise de composição de ami-noácido, análise de seqüência de aminoácidos, ou semelhantes.

Exemplos específicos de peptídeos parciais de IL-6 e peptídeosparciais de receptor de IL-6 são revelados na JP-A (Kokai) H02-188600, JP-(Kokai) H07-324097, JP-A (Kokai) H08-311098, e publicação de patenteU.S. No. US 5210075.

Os anticorpos usados na presente invenção podem também seranticorpos conjugados que estão ligados a várias moléculas, tais como polie-tileno glicol (PEG)1 substâncias radioativas e toxinas. Tais anticorpos conju-gados podem ser obtidos por modificação química dos anticorpos obtidos.Métodos para a modificação de anticorpos são já estabelecidos na técnica.

Os "anticorpos" da presente invenção incluem esses anticorpos conjugados.

Os agentes da presente invenção para a supressão de dano ailhotas transplantadas depois do transplante da ilhota podem ser usados pa-ra tratar diabetes. Diabetes inclui diabetes de tipo 1, diabetes de tipo 2, dia-betes pancreática, diabetes gestacional e semelhantes. A diabetes descritaacima também inclui diabetes secundária causada por pancreatite e induzidapelo uso de fármacos esteroidais e diabetes devido a causas específicas, talcomo diabetes causada por anormalidades em genes particulares.

Os agentes da presente invenção para a supressão de dano ailhotas transplantadas podem ser usados no transplante de ilustrar. O trans-plante de ilhota inclui transplante de ilhota a partir de doador com morte ce-rebral, a partir de doadores com parada cardíaca, e a partir de doadores vi-vos.

O transplante de ilhota de acordo com a presente invenção podeser tanto isoenxertos quanto aloenxertos. Isoenxertos são transplantes entreanimais de um sistema homogêneo, que em ser humano é tranplante entregêmeos idênticos. Aloenxertos são transplantes entre indivíduos da mesmaespécie que são geneticamente diferentes, que em seres humano é trans-plante entre indivíduos não totalmente relacionados ou entre gêmeos diovu-lares. Na presente invenção, a atividade de inibidores de IL-6 na inibição datransdução de sinal de IL-6 pode ser avaliada por métodos convencionais.Especificamente, IL-6 é adicionado a culturas de linhas de células de mielo-ma de ser humano dependentes de IL-6 (S6B45 e KPMM2), linha de célulade Iinfoma T de Lennert de ser humano KT3 ou linha de célula dependentede IL-6 MH60.BSF2; e a captação de 3H-timidina pelas células dependentesde IL-6 é medida na presença de um inibidor de IL-6. Alternativamente, célu-las de U266 de expressão de receptor de IL-6 são cultivadas, e inibidor deIL-6 e IL-6 125l-marcado são adicionados à cultura na mesma hora; e entãoIL-6 125l-marcado ligado às células de expressão de receptor de IL-6 é quan-tificada. Além do grupo de inibidor de IL-6, um grupo de controle negativoque não contém o inibidor de IL-6 é incluído no sistema de ensaio descritoacima. A atividade do inibidor de IL-6 para inibir IL-6 pode ser avaliada porcomparação dos resultados de ambos os grupos.

Como mostrado abaixo nos exemplos, administração de um an-ticorpo de receptor de anti-IL-6 demonstrou suprimir dano a ilhotas trans-plantadas depois do transplante de ilhota. Esta constatação sugere que ini-bidores de IL-6 tais como anticorpos de receptor de anti-IL-6 são úteis comoagentes de supressão do dano a ilhotas transplantadas depois do transplan-te de ilhota.

Indivíduos a serem administrados com os agentes da presenteinvenção para a supressão do dano a ilhotas transplantadas são mamíferos.Os mamíferos são de preferência seres humanos.

Os agentes da presente invenção para supressão de dano a i-Ihotas transplantadas podem ser administrados como produtos farmacêuti-cos, e podem ser administrados sistemática ou localmente via administraçãooral ou parenteral. Por exemplo, injeção intravenosa tais como infusão porgotejamento, injeção intramuscular, injeção subcutânea, supositório, enema,comprimidos entéricos orais, ou similares podem ser selecionados. Um mé-todo de administração apropriado pode ser selecionado dependendo dossintomas e da idade do paciente. A dose eficaz para a administração é sele-cionada na faixa de 0,01 a 100 mg/kg de peso de corpo. Alternativamente, adose pode ser selecionada de 1 a 1000 mg/paciente, de preferência na faixade 5 a 50 mg/paciente. Uma dose preferida e método de administração sãocomo se segue: por exemplo, qunado um anticorpo de receptor de anti-IL-6é usado, a dose eficaz é uma quantidade tal que o anticorpo livre está pre-sente no sangue. Especificamente, uma dose de 0,5 a 40 mg/kg de peso decorpo/mês (quatro semanas), de preferência 1 a 20 mg/kg de peso de corpo/mês é administrada via injeção intravenosa tal como infusão por gotejamen-to, injeção subcutânea ou similares, uma vez a várias vezes por mês, porexemplo, duas vezes ao mês, uma vez ao mês, uma vez a cada dois meses,ou uma vez a cada quatro meses. A escala de administração pode ser ajus-tada por, por exemplo, prolongamento do intervalo de administração de duasvezes ao mês ou uma vez ao mês, uma vez a cada dois meses, uma vez acada três meses, ou uma vez a cada quatro meses, enquanto monitoraçãoda condição depois do transplante e mudanças nos valores de teste de san-gue.

Na presente invenção, os agentes de supressão de dano a ilho-tas transplantadas podem conter veículos farmaceuticamente aceitáveis, taiscomo conservantes e estabilizadores. Os "veículos farmaceuticamente acei-táveis" referem-se a materiais que podem ser coadministrados com um a-gente descrito acima; e podem ou não produzir por si só o efeito descritoacima da supressão de dano a ilhotas transplantadas. Alternativamente, osveículos podem ser materiais que não têm o efeito de supressão de dano ailhotas transplantadas, mas produzir um aditivo ou efeito de estabilziaçãosinérgica quando usado em combinação com um inibidor de IL-6.

Tais materiais farmaceuticamente aceitáveis incluem, por exem-plo, água estéril, solução salina fisiológica, estabilizadores, excipientes, tam-pões, conservantes, detergentes, agentes de quelação (EDTA e semelhan-tes), e aglutinantes.

Na presente invenção, detergentes incluem detergentes não-iônicos e exemplos típicos de tais incluem ésteres de ácido graxo de sorbita-no tais como monocaprilato de sorbitano, monolaurato de sorbitano, e mo-nopalmitato de sorbitano; ésteres de ácido graxo de glicerina tais como mo-nocaprilato de glicerina, monomiristato de glicerila e monoestearato de glice-rina; ésteres de ácido graxo de poliglicerina tais como monoestearato de de-caglicerila, diestearato de decaglicerila e monolinoleato de decaglicerila; és-teres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano tais como monolaurato depolioxietileno sorbitano, mono-oleato de polioxietileno sorbitano, monoestea-rato de polioxietileno sorbitano, monopalmitato de polioxietileno sorbitano,trioleato de polioxietileno sorbitano, e triestearato de polioxietileno sorbitano;ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitol tais como tetraestearato depolioxietileno sorbitol e tetraoleato de polioxietileno sorbitol; ésteres de ácidograxo polioxietileno glicerina tais como monoestearato de polioxietileno glice-rila; ésteres de ácido graxo de polietileno glicol tais como diestearato polieti-leno glicol; ésteres polioxietileno alquila de tais como éter de polioxietilenolaurila; éster de polioxietileno polioxipropileno alquila tal como polioxietilenopolioxipropileno glicol, éter de polioxietileno polioxipropileno propila e éter depolioxietileno polioxipropileno cetila; éteres de polioxietileno fenila de alquilade tais como éter de polioxietileno nonilfenila; óleos de rícino endurecido depolioxietileno tais como óleo de rícino de polioxietileno e óleo de rícino endu-recido de polioxietileno (óleo de rícino hidrogenado depolioxietileno); deriva-dos de cera de abelha de polioxietileno tal como cera de abelha de polioxieti-leno sorbitol; derivados de polioxietileno Ianolina tal como de polioxietilenolanolina; e amidas de ácido graxo de e similar com um HLB de 6 a 18, talcomo amida de ácido polioxietileno esteárico.

Detergentes também incluem detergentes aniônicos, e exemplostípicos de tais incluem, por exemplo, alquilsulfatos tendo um grupo alquilacom 10 a 18 átomos de carbono, tais como cetilsulfato de sódio, Iaurilsulfatode sódio, oleilsulfato de sódio; sulfatos de éter de polioxietileno alquila emque o grupo aquila tem de 10 a 18 átomos de carbono e o número molarmédio de óxido de etileno é de 2 a 4, tal como Iauril sulfato de polioxietilenode sódio; sais de éster de alquil sulfossuccinato de tendo um grupo alquilacom 8 a 18 átomos de carbono, tal como éster de Iaurila sulfossuccinato desódio; detergentes naturais, por exemplo, lecitina; glicerofosfolipídios; esfin-go-fosfolipídios tal como esfingomielina; e ésteres de ácido graxo de sacaro-se em que os ácidos graxos têm de 12 a 18 átomos de carbono.

Um, dois ou mais dos detergentes descritos acima podem sercombinados e adicionados aos agentes da presente invenção. Detergentesque são de preferência usados nas preparações da presente invenção inclu-em ésteres de ácido graxo de polioxietileno sorbitano, tais como polissorba-tos 20, 40, 60, e 80. Polissorbatos 20 e 80 são particularmente preferidos.Polioxietileno plioxipropileno glicóis são poloxâmero (pluronic F-68®) e se-melhantes), são também preferidos.

A quantidade de detergente adicionada varia dependendo dotipo de detergente usado. Quando polissorbato 20 ou 80 é usado, a quanti-dade está em geral na faixa de 0,001 a 100 mg/m1, de preferência na faixade 0,003 a 50 mg/ml, mais de preferência na faixa de 0,005 a 2 mg/ml.

Na presente invenção, tampões incluem fosfato, tampão de citra-to, ácido acético, ácido málico, ácido tartárico, ácido succínico, ácido láctico,fosfato de potássio, ácido glucônico, ácido cáprico, ácido desoxicólico, ácidosalicílico, trietanolamina, ácido fumárico, e outros ácidos orgânicos; e tam-pão de ácido carbônico, tampão de Tris, tampão de histidina, e tampão deimidazol.

Preparações líquidas podem ser formuladas por dissolução dosagentes em tampões aquosos conhecidos no campo de preparações líqui-das. A concentração de tampão está em geral na faixa de 1 a 500 mM, depreferência na faixa de 5 a 100 mM, mais de preferência na faixa de 0 a 20mM.

Os agentes da presente invenção podem também compreenderoutros polipeptídeos de baixo peso molecular tais como albumina de soro,gelatina, e imunoglobulina; aminoácidos; açúcares e carboidratos tais comopolissacarídeos e monossacarídeos, álcoois de acucar, e semelhantes.

Aqui, aminoácidos incluem aminoácidos básicos, por exemplo,arginina, lisina, bistidina, e ornitina, e sais inorgânicos desses aminoácidos(de preferência sais de cloridrato, e sais de fosfato, a saber fosfato aminoá-cidos). Quando aminoácidos livres são usados, opHé ajustado para um va-lor preferido por adição de tamponamento fisiologicamente aceitável apropri-ado, por exemplo, ácidos inorgânicos, em particular ácido clorídrico, ácidofosfórico, ácido sulfúrico e ácido acético e ácido fórmico, e seus sais. Nessecaso, o uso de fosfato é particularmente benéfico uma vez que ele dá produ-tos totalmente secos por congelamento. Fosfato é particularmente vantajosoquando as preparações não substancialmente contêm ácidos orgânicos taiscomo ácido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido succínico, e ácido fu-márico, ou não contêm ânions correspondentes (íon de malato, íon de tartra-to, íon de citrato, íon de succinato, íon de fumarato e semelhantes). Aminoá-cidos preferidos são arginina, lisina, histidina e ornitina. Além do mais, épossível usar aminoácidos ácidos, por exemplo, ácido glutâmico e ácido as-pártico e seus sais (de preferência sais de sódio); aminoácidos neutros, porexemplo, isoleucina, leucina, glicina, serina, treonina, valina, metionina, cis-teína, e alanina e aminoácidos aromáticos, por exemplo, fenilalanina, tirosi-na, triptofano, e seu derivado, N-acetil triptofano.

Aqui, açúcares e carboidratos tais como polissacarídeos e mo-nossacarídeos incluem, por exemplo, dextrano, glicose, frutose, lactose, xi-Iose1 manose, maltose, sucrose, trealase, e rafinose.

Aqui, álcoois de açúcar incluem, por exemplo, manitol, sorbitol, einositol.

Quando os agentes da presente invenção são preparados comosoluções aquosas para a injeção, os agentes podem ser misturados com,por exemplo, solução salina fisiológica, e/ou solução isotônica contendo gli-cose ou outros agentes auxiliares (tais como D-sorbitol, D-manose, D-manitol, e cloreto de sódio). As soluções aquosas podem ser usadas emcombinação com agentes de solubilização tais como álcoois (etanol e seme-lhantes), paliálcoois (propileno glicol, PEG, e semelhantes), ou detergentesnão-iônicos (polissorbato 80 e HC0-50).

Os agentes podem ulteriormente compreender, se necessário di-luentes, solubilizadores, ajustadores de pH, agentes suavizantes, agentes deredução contendo enxofre, antioxidantes, e semelhantes.

Aqui, os agentes de redução contendo enxofre incluem, por e-xemplo, compostos compreendendo grupos de sulfidrila, tais como N-acetilcisteína, N-acetil-homocisteína, ácido tióctico, tiodiglicol, tioetanolami-na, tioglicerol, tiosorbitol, ácido tioglicólico e seus sais, tiossulfato de sódio,glutationa, e ácidos tioalcanóicos tendo de 1 a 7 átomos de carbono.

Além do mais, os antioxidantes na presente invenção incluem,por exemplo, ácido eritórbico, dibutil-hidróxi tolueno, butil-hidróxi anisol, alfa-tocoferol, acetato de tocoferol, ácido L-ascórbico e seus sais, palmitato deácido L-ascórbico, estearato de ácido L-ascórbico, sulfito de hidrogênio desódio, sulfito de sódio, triamil gaiato, propil gaiato e agentes de quelação taiscomo tetra-acetato de etilenodiamina de sódio (EDTA), pirofosfato de sódio,e metafosfato de sódio, se necessário, os agentes podem ser encapsuladosem microcápsulas (microcápsulas de hidroximetilcelulose, gelatina, po-li[ácido metilmetacrílico] ou semelhantes) ou preparados como sistemas defornecimento de fármaco coloidal (lipossoma, microesferas de albumina, mi-croemulssão, nano-partículas, nano-cápsulas, e semelhantes)(vide "Reming-ton's Pharmaceutical Science 16a ed", Oslo Ed., 1980, e similares). Além domais, métodos para a preparação de agentes como agentes de liberaçãosustentada são também conhecidos, e são aplicáveis à presente invenção(Langer e outros, J. Biomed. Mater. Res. 1981, 15: 167-277; Langer. Chem.Tech. 1982. 12: 98-105; a patente U.S. no. 3.773.919; Pedido de PatenteEuropeu No. (EP) 58,481; Sidman e outros, Biopolimers 1983, 22: 547-556;e EP 133.988).

Veículos farmaceuticamente aceitáveis usados são apropriada-mente selecionados daqueles descritos acima ou combinados dependendodo tipo da forma de dosagem, mas não são limitados aos mesmos.

A presente invenção refere-se a métodos para supressão de da-no a ilhotas transplantadas que compreendem a etapa de administração deum inibidor de IL-6 a indivíduos de transplante de ilhota. Além disso, a pre-sente invenção refere-se a métodos para o aperfeiçoamento da sobrevivên-cia de ilhotas transplantadas no indivíduo, que compreende a etapa de ad-ministração de um inibidor de IL-6 a indivíduos de transplante de ilhota.

Aqui, o "indivíduo" refere-se a organismos, partes de corpo dosorganismos, ou uma parte extirpada ou fornecida dos organismos a seremadministrados com um agente da presente invenção para supressão de da-no a ilhotas transplantadas. Os organismos incluem animais (por exemplo,ser humano, espécie de animal doméstico e animais de tipo selvagem) masnão são particularmente limitados.

As "partes de corpo do organismo" não são particularmente limi-tadas, mas de preferência incluem órgãos a serem tansplantados com asilhotas, omento maior, cápsula sub-renal, e mesentério. Na presente inven-ção, órgãos a serem transplantados com as ilhotas incluem, e mais especifi-camente, os vasos sangüíneos no fígado.Aqui, "administração" inclui administrações parenterais e orais.Adminitração oral inclui, por exemplo, administração de agentes orais. Taisagentes orais incluem, por exemplo, grânulo, pó, comprimido, cápsula, solu-ção, emulsão e suspensão.

Administração oral inclui, por exemplo, administração de inje-ções. Tais injeções incluem, por exemplo, injeção subcutânea, injeção intra-muscular, e injeção parenteral. Entretanto, os efeitos dos métodos da pre-sente invenção podem ser alcançados por introdução de genes compreen-dendo oligonucleotídeos a serem administrados a corpos vivos usando-setécnica de terapia genética. Alternativamente, os agentes da presente inven-ção podem ser administrados localmente a áreas pretendidas de tratamento.Por exemplo, os agentes podem ser administrados por injeção local durantea cirurgia, uso de cateteres, ou fornecimento de gene direcionado de DNAque codifica um peptídeo da presente invenção.

Os agentes supressores da presente invenção podem ser admi-nistrados a indivíduos antes do transplante de órgão, na hora do transplantede órgão, ou depois do transplante de órgão. Além disso, os agentes de su-pressão podem ser administrados uma vez ou repetidamente.

Alternativamente, quando administrado a uma parte extirpada oufornecida de um organismo, os agentes supressores da presente invençãopodem ser "postos em contato" com a parte do organismo.

Na presente invenção, "contato" é realizado de acordo com acondição do organismo. Exemplos incluem borrifamento dos agentes su-pressores da presente invenção sobre as partes de organismo, e adição dosagentes supressores da presente invenção a partes de organismos tritura-das, mas são limitados aos mesmos. Quando a parte do organismo são cé-lulas cultivadas, o "contato" mencionado acima pode ser alcançado por adi-ção dos agentes supressores da presente invenção a meio de cultura des-sas células, ou por introdução de DNAs compreendendo oligonucleotídeosda presente invenção para dentro das células que constituem a parte de or-ganismo.

Quando da condução dos métodos da presente invenção, osagentes supressores da presente invenção podem ser administrados comopartes de composições farmacêuticas em combinação com pelo menos umquimioterapêutico conhecido. Alternativamente, os agentes supressores dapresente invenção podem ser administrados simultaneamente com pelo me-nos um imunossupressor conhecido. Em uma concretização, os quimiotera-pêuticos conhecidos e os agentes supressores da presente invenção podemser administrados virtual e simultaneamente.

Os agentes supressores da presente invenção podem ser admi-nistrados a sítios de transplante de ilhota depois que as ilhotas foram trans-plantadas, ou podem ser administradas a alvos ao mesmo tempo que asilhotas. Alternativamente, os agentes podem ser adicionados a ilhotas in vi-tro, antes do transplante.

Aqui, a frase "supressão de dano a ilhotas transplantadas" signi-fica que dano a ilhotas transplantadas é suprimido e viabilidade é aperfeiço-ada. A frase "supressão de dano a ilhotas transplantadas" também compre-ende supressão de respostas imunes naturais que acompanham o trans-plante.

Supressão de dano a ilhotas transplantadas pode ser confirmadapor medição de níveis de açúcar no sangue em corpos vivos, de acordo comos métodos descritos nos exemplos. Níveis de açúcar no sangue podem sermedidos, por exemplo, por coleta de sangue a partir do seio orbital, e deter-minação de níveis de açúcar no sangue usando-se analisador glicose Beck-man depois da desnatação de plasma.

Quando a administração dos agentes da presente invençãopara supressão de dano a ilhotas transplantadas causa uma diminuição sus-tentada no nível de açúcar no sangue, dano a ilhotas transplantadas é con-siderado como suprimido. Alternativamente, quando a sobrevivência da ilho-ta é aperfeiçoada como um resultado de tal administração, é também seguroconcluir que os agentes "sumprimem dano a ilhotas transplantadas" depoisdo transplante de ilhota. Sobrevivência de ilhota pode ser avaliada por de-terminação de se ou não níveis normais de açúcar no sangue são restaura-dos após o transplante para receptores diabéticos. Por exemplo, quando 200ilhotas, que podem ser isoladas de um único doador, são transplantadas aogrupo de controle descrito nos exemplos aqui, o estado hiperglicêmico émantido e assim viabilidade pode ser conferida como 9%. No entanto, quan-do o mesmo número de ilhotas como usado para o grupo de controle étransplantado ao grupo administrado com anticorpo de receptor de anti-IL-6descrito nos exemplos aqui, níveis de açúcar no sangue normal são restau-rados para todos os receptores, e assim a viabilidade é considerada como100%.

Todos os documentos na técnica anterior citados aqui são incor-porados aqui por referência.

[Exemplo]

Aqui mais abaixo, a presente invenção será especificamentedescrita com referência aos exemplos, mas não deve ser interpretada comosendo Iimitante aos mesmos.

Exemplo 1

Investigação na supressão de dano a ilhotas transplantadas de-pois do transplante de ilhotas isogênicas, onde o efeito é devido à adminis-tração de anticorpos de receptor de IL-6.

Camundongos receptores diabéticos foram preparados por ad-ministração intravenosamente estreptozotocina (180 mg/kg) a camundongosC57BL/6 machos. Estreptozotocina é um agente que seletivamente destróiilhotas de Langerhans pancreáticas. Uma única administração de estrepto-zotocina elimina a maioria das células B, e assim induz diabetes de tipo 1.

Sem transplante de ilhota, todos os camundongos mantinhamestados hiperglicêmicos (figura 1). Três a cinco dias depois da administraçãode estreptozotocina, ilhotas de camundongo isogênicas isoladas foramtransplantadas para os fígados de camundongos diabéticos via a veia portal.As ilhotas foram isoladas das pâncreas doadoras usando-se os métodos àbase de colagenase.

200 llhotas podem ser isoladas de um único pâncreas de ca-mundongo. No caso de 400 ilhotas doadoras de dois camundongos, níveisde açúcar no sangue normais foram restaurados depois do transplante parareceptores diabéticos, e a diabete poderia ser tratada (figura 2).

Nesse exemplo, sangue foi coletado a partir do seio orbital eníveis de açúcar no sangue foram determinados usando-se analisador deglicose Beckman depois da desnatação de plasma.

No entanto, transplante de 200 ilhotas de um camundongo nãorestaurou níveis normais de açúcar no sangue e os receptores mantinhamestados hiperglicêmicos (figura 3).

Quando 500 μg de anticorpo de receptor de anti-IL-6 (MR16-1)foram intraperitonealmente administrados em três vezes depois do trans-plante de 200 ilhotas (dias 0, 2 e 4), níveis normais de açúcar no sangueforam restaurados em todos os receptores depois do transplante (figura 4).Quando uma dose igual de anticorpo de receptor de anti-IL-6 foi administra-da uma vez, níveis normais de açúcar no sangue foram restaurados trêsquarto de receptores (figura 5). Alternativamente, quando 200 μg de anticor-po de receptor de anti-IL-6 foram administrados uma vez, níveis normais deaçúcar no sangue foram restaurados em um terço de receptores (figura 6).

Os resultados acima mostram que anticorpos de receptor de an-ti-IL-6 reduziram dano às ilhotas transplantadas, aperfeiçoaram sobrevivên-cia de ilhota corrigiram hiperglicemia em receptores. Especificamente, de-monstrou que anticorpos de receptor de anti-IL-6 podem ser usados comoagentes para a supressão de dano a ilhotas transplantadas depois do trans-plante de ilhota isogênica (isoenxertos).

Exemplo 2

Investigação na supressão de produção de citocina inflamatória,onde o efeito é devido à administração de anticorpos de receptor de IL-6.

Métodos de ensaio de citometria de fluxo foram usados para in-vestigar se administração dos anticorpos de receptor de anti-IL-6 da presen-te invenção suprimiram a produção de pós-transplante de citocinas inflama-tórias por células de infiltração.

200 Ilhotas isogênicas foram transplantadas para os fígados decamundongos diabéticos com estreptozotocina, e depois de seis horas osanimais foram sacrificados, seus fígados foram extirpados, e células mono-nucleares hepáticas foram isoladas e foram analisadas por citometria de flu-xo (figura 7).

Produção de IFN-γ e TNF-alfa não foi observada em células mo-nonucleares hepáticas oriundas de camundongos não-tratados (nativos).Produção de IFN-γ e TNF-alfa foi aumentada em células mononucleares he-páticas oriundas do grupo de controle, que não foi administrada com anticor-pos de receptor de anti-IL-6. Produção de IFN-γ e TNF-alfa não foi observa-da nas células mononucleares hepáticas de camundongos para os quaisanticorpos de receptor de anti-IL-6 foram administrados uma vez (ip; 200μg/injeção/camundongo) na hora do transplante. Essas constatações suge-rem que a administração de anticorpos de receptor de anti-IL-6 previne danoa ilhotas transplantadas por supressão da produção de citocinas inflamató-rias.

Exemplo 3

Investigação na supressão de dano a ilhotas transplantadas emtransplante de ilhota alogênica, onde o efeito é devido à administração deanticorpos de receptor de IL-6.

Camundongos receptores diabéticos foram preparados por es-treptozotocina de administração intravenosa (180 mg/kg) a camundongos deC57BL/6 machos. Três a cinco dias depois da administração de estreptozo-tocina, ilhotas de camundongo alogênicas isoladas foram transplantadaspara os fígados de camundongos diabéticos (BALB/c) via a veia porta dofígado. Ilhotas foram isoladas do pâncreas do doador usando-se método àbase de colagenase. Níveis de açúcar no sangue foram determinados pelomesmo método como descrito no exemplo 1.

Depois do transplante de 200 ilhotas, 500 μg de anticorpo dereceptor de anti-IL-6 (MR16-1) foram intraperitonealmente administrados trêsvezes (dias 0, 2 e 4), e 200 μg de anticorpo de anti-CD4 foram intraperitone-almente administrados uma vez ao mesmo tempo que a primeira administra-ção do anticorpo de receptor de anti-IL-6, e níveis normais de açúcar nosangue foram restaurados em todos os receptores depois do transplante(figura 10). Por outro lado, quando 500 μg de um anticorpo de controle (IgGde rato) (Figura 8), ou 200 μ9 de anticorpo de anti-CD4 sozinho (figura 9),foram administrados o mesmo número de vezes, todos os camundongosmantinham estados hiperglicêmicos.

Os resultados acima mostram que nos receptores que recebemaloenxertos, os anticorpos de receptor de anti-IL-6 também reduziu dano ailhotas transplantadas, sobrevivência de ilhota aperfeiçoada e hiperglicemiacorrigida. Especificamente, verificou-se que os anticorpos de receptor deanti-IL-6 podem ser usados como agentes para supressão de dano a ilhotastransplantadas depois dos transplantes de ilhota algogênicas.Aplicabilidadelndustrial

Os métodos e agentes da presente invenção para supressão dedano a ilhotas transplantadas aperfeiçoam sobrevivência de ilhota depois dotransplante de ilhota, e são esperadas permitir tratamento de diabetes eficazusando-se menos ilhotas de doador.15 Anteriormente, quando do transplante de ilhotas isoladas do

pâncreas de doador de morte cerebral ou doadores com parada cardíaca,um único receptor exigia ilhotas isoladas do pâncreas de dois a três doado-res, uma vez que a falha funcional de ilhotas foi induzida, a qual reduziu via-bilidade de enxerto. Por uso dos agentes da presente invenção para a su-pressão de dano a ilhotas transplantadas, o número de ilhotas exigido porum único receptor é reduzido, e como um resultado, mais receptores sãoesperados serem capazes de receber transplantes de ilhota.

Relatórios recentes descrevem casos com sucesso de transplan-te de ilhota de doador vivo, em que ilhotas são isoladas e são purificadas deuma porção de pâncreas extirpado de doadores saudáveis e transplantadosa pacientes diabéticos; no entanto, uso dos agentes da presente invençãopara a supressão de dano a ilhotas transplantadas é pensado permitir o es-tabelecimento de métodos terapêuticos que são menos invasivos para osdoadores.

Claims (16)

1. Agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantadadepois do transplante de ilhota, caracterizado pelo fato de que compreendeum inibidor de IL-6 como um ingrediente ativo.

2. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor deIL-6 é um anticorpo que reconhece uma IL-6.

3. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o inibidor deIL-6 é um anticorpo que reconhece um receptor de IL-6.

4. Agente para a supressão de dano a uma ilhota transplantadade acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o anti-corpo é um anticorpo monoclonal.

5. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo de IL-6 de anti-humano ou um anti-corpo de receptor de IL-6 de anti-humano.

6. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 5, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

7. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o anticorpoé um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

8. Agente para a supressão de dano a um ilhota transplantadade acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelofato de que é usado para tratar diabetes.

9. Uso de um inibidor de IL-6, caracterizado pelo fato de que épara a produção de agentes para supressão de dano a um ilhota transplan-tada depois do transplante da ilhota.

10. Uso de um inibidor de IL-6, caracterizado pelo fato de que épara a produção de agentes para melhorar a viabilidade de uma ilhota de-pois do transplante da ilhota.

11. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizadopelo fato de que o inibidor de IL-6 é um inibidor que reconhece um IL-6.

12. Uso de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizadopelo fato de que o inibidor de IL-6 é um inibidor que reconhece um receptorde IL-6.

13. Uso de acordo com a reivindicação 11 ou 12, caracterizadopelo fato de que o anticorpo é um anticorpo monoclonal.

14. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 13, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de IL-6 de anti-humano ou um anticorpo de receptor de IL-6 de anti-humano.

15. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 11a 14, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo recombinante.

16. Uso de acordo com a reivindicação 15, caracterizado pelofato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.