CZ296919B6

CZ296919B6 - Farmaceutický prípravek pro lécení chronické revmatické artritidy

Info

Publication number: CZ296919B6
Application number: CZ0103497A
Authority: CZ
Inventors: Kishimoto@Tadamitsu; Mihara@Masahiko; Moriya@Yoichiro; Ohsugi@Yoshiyuki
Original assignee: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2006-07-12
Also published as: EP2107070A1; HK1127497A1; NO2009009I2; EP2077120A3; WO1996011020A1; NO971546D0; HU223602B1; CN101361972A; DK0783893T3; FI971404A0; KR100306517B1; EP0783893A1; RU2147443C1; HUT77036A; EP0783893B1; JPH08208514A; EP2077120A2; NO2018017I1; LU92048I2; NO20055446L

Abstract

Je popsán farmaceutický prípravek pro lécení chronické revmatické artritidy, který jako úcinnou slozku obsahuje protilátku proti interleukinu-6 nebo protilátku proti receptoru interleukinu-6.

Description

Oblast techniky

Předložený vynález se týká farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatické artritidy.

Dosavadní stav techniky

Chronická revmatická artritida je systémové chronické zánětlivé onemocnění, při němž dochází v kloubech k abnormálnímu růstu pojivové tkáně včetně synoviální tkáně [Melnyk a spol.: Arthritis Rheum. 33, 493 (1990).]. Bylo ukázáno, že u kloubů pacientů s chronickou revmatickou artritidou dochází k růstu synoviálních buněk, k tvorbě vícevrstvé struktury díky abnormálnímu růstu synoviálních buněk (tvorba panusu), k invazi synoviálních buněk do chrupavkové tkáně a kostní tkáně, k vaskularizaci synoviální tkáně a k infiltraci zánětlivých buněk, jako jsou lymfocyty a makrofágy. Bylo popsáno, že mechanismy nástupu chronické revmatické artritidy jsou založeny na takových faktorech, jako je dědičnost, bakteriální infekce a příspěvek různých cytokinů a růstových regulátorů. Celkový mechanizmus nástupu však zůstávánejasný.

V nedávných letech byly cytokiny a růstové faktory, včetně interleukinu 1 (IL-1), interleukinu-8 (IL-8), nádorového nekrotického faktoru a (TNFa), transformujícího růstového faktoru β (ΤΟΡβ), fibroblastového růstového faktoru (FGF) a růstového faktoru odvozeného od destiček (PDGF), detekovány v synoviální membráně a synoviální kapalině pacientů s chronickou revmatickou artritidou [Nouri a spol.: Clin. Exp. Immunol. 55, 295 (1984), Thomton a spol.: Clin. Exp. Immunol. 86 79 (1991), Saxne a spol.: Arthritis Rheum. 31, 1041 (1988), Seitz a spol.: J. Clin Invest. 87, 463 (1991), Lafyatis a spol.: J. Immunol. 143, 1142 (1989) a Melnyk a spol.: Arthritis Rheum. 33, 493 (1990).].

Má se za to, že IL-1, TNFa a PDGF jsou zvláště silné růstové faktory synoviálních buněk [Thomton a spol.: Clin Exp. Immunol. 86, 79 (1991), Lafyatis a spol.: J. Immunol. 143, 1142 (1989), Gitter a spol.: Immunology 66, 186 (1989).]. Bylo také navrženo, že stimulace způsobená IL-1 a TNF vede k produkci interleukinu-6 (IL-6) synoviálními buňkami [Ito a spol.: Arthritis Rheum. 35, 1197(1992).].

IL-6 je cytokin, známý také jako faktor 2 stimulující B buňky nebo interferon β2. IL-6 byl objeven jako diferenciační faktor přispívající k aktivaci B lymfoidních buněk [Hirano T. a spol.: Nátuře 324, 73 (1986).]. Později bylo zjištěno, že jde o multifunkční cytokin, který ovlivňuje fungování rozmanitých buněčných typů [AkiraS. a spol.: Adv. in Immunology 54, 1 (1993).]. Pro indukci IL-6 aktivit jsou nutné dvě funkčně rozdílné membránové molekuly. Jednou z nich je IL-6 receptor (IL-6R) přibližně molekulové hmotnosti 80 000, který se specificky váže na IL-6.

IL-6R existuje ve formě navázání s membránou, která se exprimuje na buněčné membráně a proniká buněčnou membránou, a také ve formě rozpustného IL-6R (sIL-6R), který sestává hlavně z extracelulámí domény. Jiným proteinem je gpl30 s molekulovou hmotností přibližně 130 000, který je neligandově vázající, ale spíše funguje při zprostředkování signálu transdukce. IL-6 a IL-6R tvoří komplex IL-6/IL-6R, který se dále váže s jiným membránovým proteinem, gpl30, a indukuje se tak biologická aktivita IL-6 v buňce [Taga a spol.: J. Exp. Med. 196, 967 (1987).].

Bylo popsáno, že sérum synoviální kapaliny pacientů s chronickou revmatickou artritidou obsahuje nadměrná množství interleukinu-6 (IL-6) a rozpustného IL-6 receptoru (sIL-6R) [Houssiau a spol: Arthritis Rheum. 31, 784 (1988), Hirano a spol.: Eur. J. Immunol. 18, 1797 (1988), Yoshika a spol.: Japn. J. Rheumatol., v tisku). Jelikož byly podobné výsledky získány také u živočiš

-1 CZ 296919 B6 ných modelů revmatické artritidy [Takai a spol.: Arthritis Rheum. 32, 594 (1989), Leisten a spol.:

Clin. Immunol. Immunopathol. 56, 108 (1990).], bylo navrženo, že IL-6 je nějak zahrnut v chronické revmatické artritidě.

Japonská patentová publikace nepodrobená průzkumu 4-89433 popisuje, že peptidy, které silně podporují IL-6 produkci, jsou účinné jako léčivé přípravky pro chronickou revmatickou artritidu.

Také Higakai a spol. navrhli, že synoviální buňky od pacientů s chronickou revmatickou artritidou mají nízkou růstovou reakci na IL-6, a že ILz-6 má tedy inhibiční funkci na růst synoviálních buněk [Clinical Immunology 22, 880 (1990).]. Existují tedy odporující si zprávy týkající se vzájemného vztahu mezi IL-6 a chronickou revmatickou artritidou. Tento vzájemný vztah je stále ještě nejasný.

Nedávno Wendling a spol. popsali, že podávání anti-IL-6 protilátek pacientům s chronickou revmatickou artritidou dočasně zmírňuje klinické a biologické příznaky, přičemž zvyšuje hladiny IL-6 v séru [J. Rheumatol. 20, 259 (1993).].

Tyto zprávy neposkytují vůbec žádná data o tom, jestli IL-6 zrychluje růst synoviálních buněk chronické revmatické artritidy nebo jestli má inhibiční účinek. Tedy stále ještě není známo, jestli IL-6 má nebo jestli nemá přímý vliv na synoviální buňky pacientů s chronickou revmatickou artritidou.

Protizánětlivá steroidní činidla, jako jsou kortikosteroidy, byla používána jako léčení revmatické artritidy, ale jelikož jejich stálé použití indukuje nežádoucí vedlejší účinky, jako je poškození tkáně kůže a inhibice funkce kůry nadledvinek, byla hledána léčiva smenšími vedlejšími účinky.

Cílem předloženého vynálezu je získat nové farmaceutické přípravky k léčení chronické revmatické artritidy bez shora uvedených nevýhod.

Podstata vynálezu

Předložený vynález se týká použití protilátky proti interleukinu-6 nebo receptoru interleukinu-6 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatoidní artritidy.

Byl proveden vytrvalý výzkum úlohy IL-6 u synoviálních buněk revmatické artritidy. Při tom nebyl zjištěn žádný růst synoviálních buněk chronické revmatické artritidy se samotným IL-6. Byly proto zkoumány jiné faktory než IL-6. Toto zkoumání vedlo k dokončení předloženého vynálezu založeného na objevu, že zatímco IL-6 samotný vykazuje téměř nulový vliv na růst synoviálních buněk, k silnému vlivu na růst synoviálních buněk dochází v přítomnosti jak IL-6, tak rozpustného IL-6R a dále, že tento účinek na růst synoviálních buněk je potlačen přidáním antagonisty, který inhibuje IL-6 aktivitu, jako je IL-6 protilátka nebo IL-6R protilátka.

Jinými slovy se předložený vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatické artritidy obsahujícího jako účinnou složku IL-6 antagonistu. Podrobněji se předložený vynález týká farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatické artritidy, obsahujícího účinnou složku antagonistu IL—6 a potlačujícího abnormální růst synoviálních buněk.

Předložený vynález se týká také inhibitoru růstu synoviálních buněk, jehož účinnou složkou je antagonista IL-6.

V následující části spisu jsou stručně popsány obrázky.

Obrázek 1 je graf ukazující příjem ³H-thymidinu synoviálními buňkami v přítomnosti buď IL-6, nebo sIL-6R samotných a v přítomnosti jak IL—6 tak sIL-6R.

-2CZ 296919 B6

Obrázek 2 je graf ukazující účinek IL-6 protilátky nebo IL-6R protilátky na příjem ³H-thymidinu synoviálními buňkami v přítomnosti jak IL-Ιβ tak sIL-6R.

Obrázek 3 je graf ukazující účinek IL-6 protilátky nebo IL-6R protilátky na příjem ³H-thymidinu synoviálními buňkami v přítomnosti jak IL-6 tak sIL-6R.

Obrázek 4 je graf ukazující potlačující vliv IL-6R protilátky na nástup kolagenem indukované artritidy u myších modelů.

Obrázek 5 je graf ukazující hladiny sérové anti-kolagenové protilátky v artritických myších.

Obrázek 6 je fotografie histopatologického zkoumání kloubu zadní tlapky myši s artritidou vyvolanou kolagenem, (a) je fotografie myši ze skupiny, které byla podávána protilátka IL-6 receptoru, a (b) je fotografie myši ve skupině s podávanou kontrolní protilátkou. U skupiny, která byla podávána protilátka IL-6 receptoru, byla zřetelně potlačena invaze granulované tkáně do chrupavky a do kosti (chronická proliferační synovitida).

Farmaceutický přípravek pro léčení chronické revmatické artritidy podle vynálezu je léčivá látka, která, když se podává pacientovi s chronickou revmatickou artritidou, potlačuje růst synoviálních buněk v kloubech a má ulevující a terapeutický účinek na příznaky onemocnění.

IL-6 antagonista používaný podle tohoto vynálezu může být odvozen od jakéhokoliv zdroje, pokud jde o látku, která blokuje přenos signálu IL-6 a inhibuje biologickou aktivitu IL-6. Mezi IL-6 antagonisty patří IL-6 protilátka, IL-6R protilátka, gpl30 protilátka, modifikovaný IL-6, antimediátorový IL-6R a částečné peptidy IL-6 nebo IL-6R.

Protilátka, která se používá jako antagonista podle vynálezu, jako je IL-6 protilátka, IL-6R protilátka nebo gpl30 protilátka, může být odvozena od jakéhokoliv derivátu nebo typu (monoklonální, polyklonální), ale zvláště výhodné jsou monoklonální protilátky odvozené od savců. Tyto protilátky se vážou na IL-6, IL-6R nebo gpl30 a inhibují navázání mezi IL06 a IL-6 nebo IL6R a gpl30 a tak blokují IL-6 signál transdukce, což inhibuje IL-6 biologickou aktivitu.

Živočišné vzorky pro buňky produkující monoklonální protilátky nejsou zvlášť omezeny, pokud jde o savce. Mohou se použít lidské protilátky nebo protilátky odvozené od jiného savce, než je člověk. Monoklonální protilátky, odvozené od savce jiného než je člověk, jsou s výhodou monoklonální protilátky odvozené od králíků nebo hlodavců, protože se snadněji připravují. Neexistuje žádné zvláštní omezení, pokud jde o hlodavce, výhodnými příklady jsou však myši, krysy a křečci.

Mezi příklady protilátek, které jsou IL-6 protilátkami, patří MH166 [Matsuda a spol.: Eur. J. Immunol. 18, 951 (1988).] a SK2 protilátka [Sáto a spol.: Journal for the 21^st Generál Meeting of the Japan Immunology Association 21, 116 (1991).]. Mezi příklady IL-6R protilátek patří PM-1 protilátka [Hirata a spol.: J. Immunol. 143, 2900 (1989).], AUK12-20 protilátka, AUK64-7 protilátka a AUK146-15 protilátka [mezinárodní patentová přihláška bez průzkumu WO 92/19 759.). Příkladem gpl30 protilátky je AM64 protilátka (japonský patentový spis bez průzkumu 3-219894).

Z těchto protilátek je výhodnou protilátka PM-1.

Monoklonální protilátky se mohou připravovat následujícím způsobem, který je založen na způsobech známých z oblasti techniky. IL-6, IL-6R nebo gpl30 se používají jako senzibilizační činidlo pro imunizaci podle konvenčního způsobu imunizace. Výsledné imunocyty se pak napojí se známými rodičovskými buňkami konvenčním způsobem napojení buněk. Buňky, které produ

-3 CZ 296919 B6 kují monoklonální protilátku, se vyhodnocují konvenčními způsoby vyhodnocování pro přípravu protilátek.

Podrobněji - monoklonální protilátky se mohou připravovat následujícím způsobem. Například, jestliže je senzibilizačním činidlem lidský IL-6, protilátky se získají použitím sekvence genu pro lidský IL-6 popsané Hiranem a spol.: Nátuře 324, 73 (1986). Sekvence genu lidského IL-6 se vloží do obecného expresního vektorového systému a použije se pro transformaci vhodných hostitelských buněk. Potom se žádaný IL-6 protein vyčistí od hostitelských buněk nebo od supernatantu kultury a vyčištěný IL-6 protein se pak použije jako senzibilizační antigen.

V případě lidského IL-6R se IL-6R protein může získat stejným způsobem, jako je shora popsáno pro lidský IL-6 s použitím sekvence genu popsané v evropské patentové přihlášce EP 325 474. Existují dva typy IL-6R, jeden exprimovaný na buněčné membráně a rozpustná forma (sIL-6R), která se oddělí od buněčné membrány. sIL-6R sestává hlavně z extracelulámí domény IL-6R, která je připojena na buněčnou membránu, a to ho odlišuje od IL-6R navázaného na membránu vtom, že mu chybí transmembránová doména nebo transmembránová doména a intracelulámí doména.

V případě lidského gpl30, se gpl30 protein může získat stejným způsobem jako shora popsaný lidský IL-6 s použitím sekvence genu popsané v evropské patentové přihlášce EP 411 946.

Savci imunizovaní senzibilizačním antigenem nejsou nijak zvlášť omezeni, ale jsou s výhodou vybráni tak, že se vezme v úvahu jejich slučitelnost s rodičovskými buňkami používanými pro napojení buněk. Obvykle se používají myši, krysí, křečci a králíci.

Imunizace živočichů senzibilizačním antigenem se může provádět obecně známým způsobem. Konvenční způsob například zahrnuje intraperitoneální nebo subkutánní injekci senzibilizačního antigenu savci. Senzibilizační činidlo je s výhodou zředěno ekvivalentem PBS (fosforečnanem pufrovaný solný roztok) nebo fyziologickým solným roztokem, suspendováno a použito společně s vhodným množstvím konvenčního adjuvans, jako je Freundovo kompletní adjuvans, jestliže je to žádoucí. Potom se podává savcům několikrát denně každých 4 až 21 dnů. Pro imunizaci senzibilizačním činidlem se může použít také příslušný nosič.

Po této imunizaci a potvrzení zvýšených hladin žádané protilátky v séru se od savců odeberou imunocyty pro napojení buněk, zvláště výhodnými imunocyty jsou buňky sleziny.

Rodičovské buňky použité k napojení se shora uvedenými imunocyty mohou znamenat myelomové buňky savců. Vhodně se mohou použít četné, obecně známé kmeny buněk, včetně kmene P3 (P2x63Ag8,653) [J. Immunol. 125, 1548 (1978).], p3-Ul [Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1 (1978).], NS-1 [Eur. J. Immunol. 6, 511 (1976).], MPC-11 [Cell 8, 405 (1976).], SP2/0 [Nátuře 276, 269 (1978).], Of [J. Immunol. Meth. 35, 1 (1980).], S194 [J. Exp. Med. 148, 313 (1978).] a R210 [Nátuře 277, 131 (1979).]. Napojení buněk imunocytů smyelomovými buňkami může být prováděno podle postupů známých z oblasti techniky, například postupem podle Milsteina a spol. [Milstein a spol.: Methods Enzymol. 73, 3 (1981).].

Podrobněji - shora uvedené napojení buněk se provádí v konvenční živné kultuře v přítomnosti promotoru napojení buněk. Promotorem napojení může být například polyethylenglykol (PEG) nebo Sendai virus (HVJ). Jestliže je to žádoucí, může se pro zvýšení účinnosti napojení používat pomocné činidlo, jako je dimethylsulfoxid.

Použité poměry imunocytů a myelomových buněk jsou s výhodou 1 až 10-násobek imunocytů k myelomovým buňkám. Kultivačním médiem použitým pro napojení buněk může být například RPMI1640 kultivační médium nebo kultivační médium MEM, která jsou vhodná pro růst kmenů myelomových buněk, nebo jiná obvyklá kultivační média používaná pro kultivaci buněk. Společ

-4CZ 296919 B6 ně s médiem se mohou používat také doplňkové sérové roztoky, jako je plodové telecí sérum (FCS).

Napojení buněk se provádí řádným promícháním předepsaných množství imunocytů a myelomových buněk ve shora popsaném kultivačním médiu, přidáním PEG roztoku předem zahřátého na 37 °C, například PEG s průměrnou molekulovou hmotností 1000 až 6000, ke kultivačnímu mediu obvykle na koncentraci 30 až 60 % (hmotn. k obj.) a následujícím mícháním za vzniku žádaných napojených buněk (hybridomů). Postup postupného přidávání vhodného kultivačního média a odstřeďování, aby se odstranil supematant, se opakuje, aby se dosáhlo odstranění činidla pro napojování buněk atd., které je nevýhodné pro růst hybridomů.

Vhodné hybridomy se vyberou kultivací v normálním selektivním kultivačním médiu, jako je HAT kultivační médium (obsahující hypoxanthin, aminopterin a thymin). Kultivace v HAT kultivačním médiu pokračuje po danou dobu, obvykle několik dnů až několik týdnů, která je dostatečná pro smrt buněk jiných než jsou hybridomy (nenapojených buněk). Potom se provádí normální omezené ředění a hybridomy, které produkují žádané protilátky, se podrobí maskování a monoklonování.

Monoklonální hybridomy produkující protilátku, které se připraví podle tohoto způsobu, se mohou kultivovat v obvyklém kultivačním roztoku. Mohou se také umístit do kapalného dusíku pro dlouhodobé skladování.

Aby se z hybridomů získaly monoklonální protilátky, kultivují se hybridomy podle konvenčního způsobu, potom se supematant z kultivace izoluje nebo se použije jiný způsob, při čemž se hybridomy injekčně podají slučitelnému savci, nechají se růst a získá se kapalina z ascitů. První způsob je vhodný pro získání protilátek o vysoké čistotě, zatímco pozdější způsob je vhodný pro masovou produkci protilátek.

Monoklonální protilátky, získané podle těchto způsobů, mohou pak být vyčištěny do vysokého stupně čistoty konvenčními způsoby čištění, jako je vysolení, gelová filtrace, afinitní chromatografie nebo podobné.

Monoklonální protilátky vyrobené tímto způsobem se pak mohou zkontrolovat na vysokou citlivost a vysokou čistotu rozpoznávání antigenu obvyklými imunologickými způsoby, jako je radbimunoanalýza (RLA), imunoanalýza s navázaným enzymem (EIA, ELISA), technika fluorescenční protilátky (imunofluorescenční analýza) atd.

Monoklonální protilátky použité podle vynálezu nejsou omezeny na monoklonální protilátky produkované hybridomy. Mohou jimi být takové protilátky, které byly uměle upraveny pro účely snížení heteroantigenicity proti člověku. Například se může použít chimérní protilátka, která sestává z proměnné oblasti monoklonální protilátky savce, jiného než člověk, jako je myš, a konstantní oblasti lidské protilátky. Taková chimérní protilátka se může vyrobit známým způsobem výroby chimérních protilátek, zvláště technikou rekombinace genů.

Mohou se používat také přetvařované lidské protilátky. Ty se připravují použitím doplňkové determinantní oblasti myší nebo jiné nelidské savčí protilátky, aby se nahradila doplňková determinantní oblast lidské protilátky. Konvenční způsoby rekombinace genů jsou dobře známy. Jeden ze známých způsobů může být použit k získání přetvařované lidské protilátky, která je užitečná podle tohoto vynálezu. Výhodným příkladem takové přetvařované lidské protilátky je hPM-1 [viz průzkumu nepodrobená mezinárodní patentová přihláška WO 92/19759].

Jestliže je to nutné, mohou být aminokyseliny základní oblasti (FR) různých oblastí protilátky substituovány tak, že doplňková determinantní oblast přetvořené lidské protilátky vytvoří vhodné vazebné místo protilátky [Sáto a spol.: Cancer Res. 53, 851 (1993).]. Shora uvedeného předmětu se může dosáhnout také tak, že se zkonstruuje gen, který kóduje fragment protilátky, který se

-5CZ 296919 B6 váže na antigen a inhibuje IL-6 aktivitu, jako je Fab nebo Fv, nebo jednoduchý řetězec Fv (scFv), přičemž Fv těžkého (H) a lehkého (L) řetězce je napojen příslušnou spojkou a použije se pro expresi v příslušných hostitelských buňkách [viz například Bird a spol.: Tibtech 9, 132 (1991) a Huston a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85, 5879 (1988).].

Modifikovaný IL-6 podle vynálezu může znamenat takový IL-6, který je popsán Brakenhoffem a spol.: J. Biol. Chem. 269, 86 (1994) nebo Savinoem a spol.: EMBO J. 13, 1357 (1994).

Používaný modifikovaný IL-6 může být získán zavedením mutace, jako je substituce, delece nebo inzerce, do aminokyselinové sekvence IL-6, aby se získala vazebná aktivita s IL-6R, zatímco se eliminuje IL-6 signální transferová funkce. Zdrojem IL-6 může být jakýkoliv živočišný druh, pokud má shora uvedené vlastnosti. Vzhledem k antigenicitě se s výhodou používá takový IL-6, který je odvozen od člověka.

Podrobně - druhá struktura IL-6 aminokyselinové sekvence může být předpovězena použitím obecně známého programu molekulového modelování, jako je WHATIF [Vriend a spol.: J. Mol. Graphics 8, 52 (1990).], při čemž lze vyhodnotit také vliv mutovaných aminokyselinových zbytků na úplnou strukturu. Po stanovení příslušných mutovaných aminokyselinových zbytků se vektor obsahující nukleotidovou sekvenci kódující lidský IL-6 gen použije jako templát pro zavedení mutace konvenčně používaným PCR způsobem (polymerázová řetězová reakce). Získá se tak gpn kódující modifikovaný IL-6. Ten se pak inkorporuje do vhodného expresního vektoru, jestliže je to nutné, a exprimuje se v E. coli buňkách nebo savčích buňkách. Potom se použije buď v kultuře supernatantu, nebo po izolaci a vyčištění konvenčními způsoby pro vyhodnocení vazebné aktivity na IL-6R a neutralizování IL-6 signální transferové aktivity.

IL-6 částečný peptid nebo IL-6R částečný peptid použitý podle předloženého vynálezu může mít jakoukoliv sekvenci tak dlouhou, že se váže na IL-6R nebo IL-6 a nemá žádnou transferovou funkci IL-6 aktivity. IL-6 částečné peptidy a IL-6R částečné peptidy jsou popsány v US patentové publikaci US5210 075. IL-6 antimediátorový oligonukleotid je popsán v japonské patentové přihlášce 5-300338.

Farmaceutický přípravek pro léčení chronické revmatické artritidy, jehož účinnou složkou je IL-6 antagonista podle vynálezu, je účinný pro léčení chronické revmatické artritidy, jestliže blokuje transdukci IL-6 signálu a potlačuje abnormální růst synoviálních buněk indukovaný IL-6, které jsou zahrnuty v onemocnění. Příklad 1 ukazuje účinek potlačení in vitro růstu synoviálních buněk od revmatického pacienta. V příkladu 2 byla protilátka IU~6 receptorů podávána modelům artritických myší imunizovaných kolagenem typu II. Relevantní data ukazují 1) potlačení nástupu artritidy na základě artritického indexu (obr. 4), 2) potlačení produkce protilátek anti-kolagenu typu II v krvi myší imunizovaných kolagenem (obr. 5) a 3) potlačení invaze granulační tkáně do chrupavky a kosti (chronická proliferační synovitida) v kloubech zadní tlapky modelů artritických myší, jimž byla podávána protilátka IL-6 receptorů (obr. 6).

Pokud jde o shora uvedené body 1 a 2, výsledky potvrdily potlačující účinek protilátkou IL-6 receptorů, zvláště na počátku, na nástup artritidy u myších modelů. Výsledky bodu 3 ukázaly, že invaze granulační tkáně do chrupavkové a kostní tkáně je potlačena. To podporuje výsledky získané v příkladu 1 (in vitro inhibice růstu synoviálních buněk).

Výsledky pokusů (1 a 2) ukazují, že farmaceutický přípravek pro léčení chronické revmatické artritidy podle předloženého vynálezu má vynikající počáteční účinek na revmatickou artritidu.

Farmaceutický přípravek pro léčení chronické revmatické artritidy podle vynálezuje s výhodou podáván parenterálně, například intravenosní, intramuskulární, intraperitoneální nebo subkutánní injekcí, buď systémově, nebo místně. Může existovat také ve formě sestavy lékařského přípravku společně s alespoň jedním typem lékařského nosiče nebo ředidla.

-6CZ 296919 B6

Dávkování farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatické artritidy podle vynálezu, jestliže se podává lidem, bude záviset na patologickém stavu a věku pacienta a na způsobu podávání. Musí být proto vybráno vhodné a příslušné dávkování. Jako příklad lze vybrat maximum 4 rozdělených dávek v rozmezí od 1 do 1000 mg/pacienta. Farmaceutický přípravek pro léčení revmatické artritidy podle vynálezu však není tímto dávkováním omezen.

Farmaceutický přípravek pro léčení revmatické artritidy podle vynálezu se může připravovat podle konvenčních způsobů. Například přípravek ve formě injekce se připraví rozpuštěním vyčištěného IL-6 antagonisty v rozpouštědle, jako je fyziologický solný roztok nebo pufrovací roztok, a potom přidáním inhibitoru absorpce, jako je Tween 80, želatina, lidský sérový albumin (HSA) nebo podobných. Směs se může před použitím pro rekonstituci roztoku lyofilozovat. Excipientem (ředidlem), které se používá pro lyofilizaci, může být cukerný alkohol, jako je mannitol neboglukóza, nebo sacharid.

Příklady provedení vynálezu

Předložený vynález bude nyní vysvětlen podrobněji pomocí následujících příkladů, referenčních příkladů a experimentálních příkladů, s tím, že tento vynález není jimi nijak omezen.

Referenční příklad 1

Příprava lidského rozpustného IL-6 receptoru

Rozpustný IL-6R byl připraven [Yasukawa a spol.: J. Biochem. 108, 673 (1990).] způsobem PCR (polymerázová řetězová reakce) použitím plazmidu pBSF2R.236 obsahujícího cDNA kódující lidský IL-6 receptor (IL-6R) získaný způsobem podle Yamasakiho a spol. [Science 241, 825 (1988).].

Shora uvedený plazmid pBSF2R.236 byl rozštěpen restrikčním enzymem Sphl. Byl získán IL6R cDNA fragment, který byl pak vložen do mpl8 (Američan Co.). Syntetický oligoprimer ATATTCTCTAGAGAGATTCT byl použit pro zavedení mutace do IL-6R cDNA způsobem PCR použitím Invitro Mutagenesis Systému (Amersham Co.). Tento postup vede k zavedení stop kodonu v poloze aminokyseliny 345. Získá se cDNA kódující rozpustný IL-6R (sIL-6R).

Aby došlo k expresi sIL-6R cDNA v CHO buňkách, byla shora uvedená sIL-6R cDNA rozštěpená HindlII—Sall vložena do plazmidu pECEdhfr [Clauser a spol.: Cell 45, 721 (1986).], který měl cDNA kódující dihydrofolát-reduktázu (dhfr) vloženu v místě štěpení restrikčním enzymem Pvul. Získá se tak expresní plazmid pECEdhfr344 CHO buňky.

Pro transfekci dhfr“CHO buněčné linie DXB-11 [Urland a spol.: Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 4216 (1980).] způsobem srážení fosforečnanem vápenatým [Chen a spol.: Mol. Cell. Biol. 7, 2745 (1987).] se použije 10 pg plazmidu pECEdhfř344.

Transfektované CHO buňky byly kultivovány 3 týdny v aMEM selektivním kultivačním médiu bez nukleosidů obsahujícím lmM glutamin, 10% (hmotn.) (dialyzované plodové telecí sérum (FCS), 100 j./ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu. Vybrané CHO buňky byly analyzovány omezujícím zřeďovacím způsobem. Byla získána jediná monoklonální CHO buněčná linie. CHO buněčný klon byl amplifikován ve 20nM až 200nM methotrexátu (MTX). Získá se tak lidská sIL-6R-produkující CHO buněčná linie 5E27.

CHO buněčná linie 5E27 byla kultivována v Iscovem modifikovaném Dulbeccově médiu (IMDM, produkt firmy Gibco Co.) obsahujícím 5% (hmotn.) FCS. Supematant kultury byl izolo-7CZ 296919 B6 ván. Koncentrace sIL-6R v supematantu kultury byla změřena způsobem ELISA obvyklým postupem.

Referenční příklad 2

Příprava lidské ID-6 protilátky

Lidská IL-6 protilátka byla připravena způsobem podle Matsuda a spol. [Eur. J. Immunol. 18, 951 (1988).].

BALB/c myši byly imunizovány 10 pg rekombinantního IL-6 [Hirano a spol.: Immunol. Lett. 17, 41 (1988).] společně s Freundovým úplným adjuvans. V imunizaci bylo pokračováno jednou týdně, dokud nebyly anti-IL-6 protilátky detekovány v krevním séru.

Imunocyty byly extrahovány z lokálních mízních uzlin. Pro napojení s myelomovou buněčnou linií P3U1 byl použit polyethylenglykol 1500. Hybridomy byly vybrány způsobem podle Oiho a spol. [Selective Methods in Cellular Immunology, W. H. Freeman and Co., San Francisko, 315, 1980.] použitím kultivačního média HAT. Byla získána lidská hybridomová linie produkující IL-6 protilátku. Lidský hybridom produkující IL-6 protilátku byl podroben testu navázání IL-6 následujícím způsobem.

Mikrodestička o 96 jamkách z měkkého polyvinylu (produkt firmy Dynatech Laboratories, lne., Alexandria, Va.) byla potahována přes noc 100 1 kozí anti-myší Ig protilátky (10 μΐ/ml, produkt firmy Cooper Biomedical, lne., Malvern, Pa.) v 0,lM roztoku pufru uhličitan/hydrogenuhličitan (pH 9,6) při 4 °C. Deska byla pak 2 h při teplotě místnosti podrobena působení PBS obsahujícího 100 μΐ 1% (hmotn.) hovězího sérového albuminu (BSA). Po promytí PBS bylo do každé jamky přidáno 100 μΐ supematantu hybridomové kultury. Inkubace byla prováděna přes noc při 4°C.

Destičky byly pak promyty. Do každé jamky byl přidán ^I25I označený rekombinantní IL-6 v množství 2000 cpm (impulzů za minutu/0,5 ng/jamku. Po promytí byla radioaktivita každé jamky změřena gama počítačem (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, Ka.). Z 216 hybridomových klonů bylo 32 hybridomových klonů pozitivních na test navázání IL-6. Z těchto klonů byl konečně získán stabilní klon MH166.BSF2. IL-6 protilátka MH166 produkovaná tímto hybridomem byla podtypu IgGIK.

Myší hybridomová buněčná linie MH60.BSF2 [Matsuda a spol.: Eur. J. Immunol. 18, 951 (1988).] závislá na IL-6 byla pak použita pro stanovení neutralizující aktivity MH166 protilátky na růst hybridomu. Buňky MH60.BSF2 byly umístěny v jamkách v množství 1.10⁴/200 μΐ/jamku. Byl přidán vzorek obsahující mH166 protilátku, 48 hodin byla nechána probíhat kultivace, bylo přidáno 15,1 Ci/mmol ³H-thymidinu (New England Nuclear, Boston, Ma.) a v kultivaci bylo pokračováno 6 h.

Buňky byly umístěny na skleněný filtrační papír a izolovány automatickým zařízením pro izolaci (Labo Mash Science Co., Tokyo, Japonsko). Jako kontrola byla použita králičí anti-IL-6 protilátka. Výsledkem bylo, že protilátka MH166 inhibovala příjem ³H-thymidinu buňkami MH60.BSF2 způsobem závisejícím na dávce. To ukazuje, že MH166 protilátka neutralizuje IL-6 aktivitu.

-8CZ 296919 B6

Referenční příklad 3

Příprava lidské protilátky IL-6 receptoru

Anti-IL-6R protilátka MT18 zkonstruovaná podle Hiraty a spol. [J. Immunol. 143, 2900 (1989).] byla navázána na Sepharosu 4B (produkt firmy Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, N.J.) aktivovanou bromkyanem podle pokynů výrobce. Navázaný komplex byl použit pro vyčištění IL-6R [Yamasaki a spol.: Science 241, 825 (1988).].

Lidská myelomová buněčná linie U266 byla solubilizována lmM hydrochloridem p-aminofenylmethansulfonylchloridu (produkt Wako Chemicals) obsahujícím 1% (hmotn.) digitonin (produkt Wako Chemicals), lOmM triethanolamin (pH 7,8) a 0,15M NaCl (digitoninový pufrovaný roztok) a smíchán s MT18 protilátkou navázanou na perličkách Sepharosy 4B. Perličky byly pak šestkrát promyty digitoninovým pufrovacím roztokem. Získá se částečně vyčištěný IL-6R pro imunizaci.

BALB/c myši byly imunizovány čtyřikrát každých deset dnů částečně vyčištěným IL-6R získaným z 3.10⁹ buněk U266. Potom byl konvenčními způsoby připraveny hybridomy. Supernatanty kultury hybridomů z růstově pozitivních jamek byly zkoumány na IL-6 vazebnou aktivitu následujícím způsobem. Po označení 5.10⁷ buněk U266 ³⁵S-methioninem (2,5 mCi) byly tyto buňky solubilizovány shora uvedeným digitoninovým pufrovacím roztokem. Solubilizované U266 buňky byly smíchány s 0,04 ml MT18 protilátky navázané na perličky Sepharosy 4B a po šesteronásobném promytí digitoninovým pufrovacím roztokem byl ³⁵S-methioninem označený IL-6R1 vymyt 0,25 ml digitoninového pufrovacího roztoku (pH 3,4) a zneutralizován 0,025 1M Tris (pH 7,4).

0,05 ml supematantu hybridomové kultury bylo smícháno s 0,01 ml Protein G Sepharosy (výrobek firmy Pharmacia). Po promytí byla Sepharosa inkubována s 0,005 ml shora připraveného ³⁵S-označeného IL-6R roztoku. Imunologicky vysrážená látka byla analyzována SDS-PAGE. Byly zkoumány supernatanty hybridomové kultury reagující s IL-6R. Výsledkem bylo získání hybridomového klonu PM-1 s pozitivní reakcí. IL-6R protilátka PM-1 produkovaná hybridomem PM-1 byla podtypu IgGIK.

Inhibiční aktivita protilátky produkované hybridomem PM-1 proti navázání IL-6 na lidský IL6R byla zkoumána použitím lidské myelomové buněčné linie U266. Lidský rekombinantní IL-6 byl připraven z E. coli [Hirano a spol.: Immunol. Lett. 17, 41 (1988).] označen ¹²⁵I BoltonHunterovým reakčním činidlem (New England Nuclear, Boston, Ma.) [Taga a spol.: J. Exp. Med. 166, 967(1987).].

4.10⁵ buněk U266 bylo kultivováno 1 h za teploty místnosti v přítomnosti lOOnásobného nadbytku neoznačeného IL·—6 spolu se 70% (obj.) supematantem hybridomové PM-1 kultury a 14 000 cpm ¹²⁵I-označeného IL-6. 70 μΐ vzorku bylo převrstveno na 300 μΐ FCS umístěného ve 400 μΐ polyethylenové mikrozkumavce. Po odstřeďování byla změřena radioaktivita buněk.

Z výsledků je vidět, že protilátky produkované hybridomem PM-1 inhibovaly navázání IL-6 na IL-6R.

-9CZ 296919 B6

Referenční příklad 4

Příprava myší protilátky IL-6 receptoru

Monoklonální protilátky proti myšímu IL-6 receptoru byly připraveny způsobem popsaným v japonské patentové přihlášce 6-134617.

Způsobem podle Saitoa a spol. [J. Immunol. 147, 168 (1993).] byly CHO buňky produkující myší rozpustný IL-6 receptor kultivovány vIMDM médiu obsahujícím 10 % (hmotn.) FCS. Myší rozpustný IL-6 receptor byl vyčištěn ze supernatantu kultury použitím protilátky RS12 myšího rozpustného IL-6 receptoru [viz shora Saito a spol.] a afinitní kolony s imobilizujícím gelem Affigel 10 (Biorad).

μg získaného myšího rozpustného IL-6 receptoru se smíchá s Freundovým úplným adjuvans a intraperitoneální injekcí se podá krysám Wistar (Nihon Charles River Co.). Druhá imunizace se provede Freundovým neúplným adjuvans po 2 týdnech. 45. den se krysy usmrtí. Asi 2.10⁸ buněk jejich slezin se použije pro napojení buněk s 1.10⁷ myších P3U1 myelomových buněk konvenčním způsobem použitím 50% (hmotn.) PEG1500 (Berlinger Mannheim). Potom se hybridomy analyzují médiem HAT.

Po přidání supernatantů kultury hybridomů k imunologickým destičkám potažených králičí antikrysí IgG protilátkou (Cappel Co.) s nimi myší rozpustný IL-6 receptor zreagoval. Hybridomy produkované protilátkami proti myšímu rozpustnému IL-6 receptoru byly analyzovány způsobem ELISA použitím králičí protilátky anti-myšího IL-6 receptoru a alkalickou fosfatázou označeného ovčího anti-králičího IgG. Hybridomové klony, v nichž byla potvrzena produkce protilátek, byly dvakrát přetestovány, aby se získal jediný hybridomový klon. Tento klon byl označen MR16-1.

Neutralizující aktivita protilátky produkované tímto hybridomem proti transdukci myším IL-6 signálem byla zkoumána inkorporací ³H-thymidinu použitím buněk MH60.BSF2 [Matsuda a spol.: J. Immunol. 18, 951 (1988).]. Buňky MH60.BSF2 byly dány na destičku o 96 jamkách v množství 1.10⁴ buněk/200 μΐ/jamku. Potom byl přidán myší IL-6 (10 pg/ml) a MR16-I protilátka nebo RS12 protilátka v množství 12,3 až 1000 ng/ml před kultivací při 37 °C v 5% 9hmotn.) CO₂ po dobu 44 hodin. Potom byl přidán ³H-thymidin (1 pCi/jamku) a po 4 h byl změřen příjem. Výsledkem bylo zjištění, že protilátka MR16-1 inhibuje příjem ³H-thymidinu buňkami MH60.BSF2.

Pokus 1

Stanovení synoviální buněčné linie odvozené od chronické revmatické artritidy

1. Příprava synoviálních buněk

Synoviální tkáň byla získána při chirurgické operaci kloubu pacienta s chronickou revmatickou artritidou. Synoviální tkáň byla nastříhána nůžkami a potom podrobena enzymatické disociaci inkubací 1 h při 37 °C s 5 mg/ml kolagenázy typu I (produkt Sigma Chemical Co.) a 0,15 mg/ml hovězí pankreatické DNAsy (produkt Sigma Chemical Co.) v IMDM (Iscovem modifikovaném Dulbeccově médiu). Potom byla směs nechána projít sítem, aby se získaly jednotlivé buňky. Takto získané buňky byly pak kultivovány přes noc v kultivační baňce použitím IMDM obsahujícího 5 % (hmotn.) FCS. Potom byly neulpělé buňky odstraněny. Získaly se tak synoviální buňky. Synoviální buňky byly pasážovány 3 až 6krát a použity pro následující pokus.

-10CZ 296919 B6

2. Produkce IL-6 synoviálními buňkami

Synoviální buňky, získané jak shora popsáno, byly suspendovány v IMDM kultivačním médiu obsahujícím 5 % (hmotn.) FCS (produkt Hyclone Laboratories lne.), 10 j./ml penicilinu G a 100 pg/ml streptomycinu v množství 3.10³ buněk/jamku. Potom byly kultivovány na mikrotitrovací desce o 96 jamkách (výrobek firmy Falcon a Co.), k níž byl přidán lidský interleukin-ΐβ (IL-1 β), lidský nádorový nekrotický faktor a(TNFa), růstový faktor z lidských destiček (PDGF)AB a lidský základní fibroblastový růstový faktor (bFGF) v koncentracích 0,01 nebo 0,1, 0,1 nebo 1,1 nebo 10 a 1 nebo 10 ng/ml. Směs se kultivuje při 37 °C 72 h. Supematanty kultury se izolují.

Na ELISA desku s 96 jamkami (výrobek firmy Nunc Co.) se přidá 100 μΐ anti-lidské IL-6 protilátky MH166 (1 pg/ml). Směs se inkubuje 24 h při 4 °C. Každá jamka se pak promyje PBS obsahujícím 0,05 % (hmotn.) Tweenu 20, blokuje se při 4 °C přes noc s PBS obsahujícím 1 % (hmotn.) BSA. Dříve získané supematanty kultury se pak zředí PBS obsahujícím 1 % hmotn. BSA, přidají se k jamkám a inkubují se 2 h za teploty místnosti. Po promytí PBS obsahujícím 0,05 % (hmotn.) Tweenu 20 se přidá 2,5 pg/ml králičí polyklonální anti-lidské IL-6 protilátky vyčištěné na koloně se 100 pl proteinu A (výrobek firmy Pharmacia).

Po 2 h inkubaci za teploty místnosti se králičí polyklonální anti-IL-6 protilátka navázaná na IL-6 v supematantech kultury zreaguje s anti-králičí IgG protilátkou navázanou na alkalickou fosfatázu (výrobek Tágo Co.). Potom se podle připojených pokynů přidá 1 mg/ml substrátu alkalické fosfatázy Sigmal04 (výrobek Sigma Co.). Ctečkou mikrodesek MPR A4 (výrobek firmy Tosoh Co.) se změří absorbance při 405 až 600 nm.

Kalibrační křivky byly připraveny pro rekombinantní IL-6 během každé analýzy pro konverzi hodnot absorbance OD na koncentrace lidského IL-6. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Zvýšená produkce IL-6 ze synoviální buňky

ošetření	(ng/ml)	IL-6 (ng/ml)
neošetřeno		0,096 ±0,012
IL-Ιβ	0,01	6,743 ±0,178
	0,1	17,707 ±0,259
TNFa	0,1	0,575 ± 0,008
	1	1,688 ±0,034
PDGF-AB	1	0,163 ± 0,035
	10	0,165 ±0,016
bFGF	1	0,181 ±0,009
	10	0,230 ±0,019

Poznámka: Synovinální buňky byly kultivovány 3 dny s IL-Ιβ, TNFa, PDGF-AB nebo bFGF. Po kultivaci byly koncentrace IL-6 v supematantech měřeny testem ELISA.

Výsledky ukázaly, že IL—1 β silně podporuje produkci IL-6 synoviální buňkami.

-11 CZ 296919 B6

Příklad 1

1) Synoviální buňky, které byly získány v pokusu 1 (3.10³/jamku), byly suspendovány v IMDM kultivačním médiu, které obsahuje 5 % (hmotn.) FCS (výrobek Hyclone Laboratories, lne.), lOj./ml penicilinu G a 100pg/ml streptomycinu a přidají se na mikrotitrovací desku s 96 jamkami (č. 3072, výrobek Falcon Co.). Desky se kultivují 5 dnů v přítomnosti různých koncentrací IL-6 nebo sIL-6 samotných nebo v přítomnosti jak IL-6 tak sIL-6R. 72 h po počátku kultivace se do každé jamky přidá 1 pCi/jamku ³H-thymidinu (výrobek Amersham Intemational plc). Po ukončení kultivace se radioaktivita v buňkách měří počítačem scintilací. Výsledky jsou uvedeny na obr. 1.

Výsledkem je, že příjem ³H-thymidinu synoviálními buňkami byl nízký s IL-6 nebo sIL-6R samotnými a nebyl pozorován žádný růst synoviálních buněk. Naproti tomu v přítomnosti alespoň lOng/ml IL-6 a lOOng/ml sIL-6R byl pozorován významný příjem ³H-thymidinu při srovnání s kontrolní skupinou. Zatímco tedy ve skutečnosti nebyl pozorován žádný růstový efekt synoviálních buněk samotným IL-6, v přítomnosti jak IL-6 tak sIL-6 byl získán jasný silný růst synoviálních buněk.

2) Synoviální buňky (3.10³/jamku) byly kultivovány v přítomnosti dostatečného množství ILβ, aby se produkoval IL-6 (0,1 ng/ml), 100 ng/ml sIL-6R nebo 25 pg/ml IL-6 protilátka. 72 h po počátku kultivace byl do každé jamky přidán ³H-thymidin v množství 1 pCi/jamku. Po ukončení kultivace byla radioaktivita v buňkách změřena počítačem scintilací. Výsledky jsou uvedeny na obr. 2. Přidání IL-6 protilátky nebo IL-6R protilátky úplně potlačilo růst synoviálních buněk zvýšený působením sIL-6R.

3) Synoviální buňky (3.10³/jamku) byly kultivovány v přítomnosti 100 ng/ml IL-6 (produkt firmy Genzyme Co.), 100 ng/ml sIL-6R a 25 pg/ml IL-6 protilátky nebo IL-6R protilátky, které byly získány ve shora uvedených referenčních příkladech. Po 72 h od počátku kultivace se do každé jamky přidá 1 pCi/jamku ³H-thymidinu. Po ukončení kultivace se počítačem scintilací měří radioaktivita v buňkách. Výsledky jsou uvedeny na obr. 3. Přidání IL-6 protilátky nebo IL-6R protilátky úplně potlačilo růst synoviálních buněk zvýšený působením sIL-6R.

Příklad 2

Potlačující efekt protilátky IL-6 receptorů na nástup artritidy byl zkoumán pomocí myšího artritického modelu.

Roztok hovězího kolagenu typu II (Collagen Technology Research Group) (4 mg/ml) rozpuštěný v 0,lN vodném roztoku kyseliny octové a úplné adjuvans H37Ra (DIFCO) se smíchají v ekvivalentních množstvích. Připraví se tak adjuvans. 100 μΐ tohoto adjuvans se podá subkutánní injekcí do kořene ocasu 8 až 9 týdnům starým myším samičkám DBA/1J (Charles River Japan). Po 20 dnech se pod dorsální kůži injekčně podá dalších 100 μΐ, aby se vyvolala artritida.

Protilátka MR16-1 myšího IL-6 receptorů se intravenózně podá v množství 2 mg na myši po první senzibilizaci kolagenem. Každé myši bylo podáno každý týden po dobu 7 týdnů dalších 0,5 mg (n=5). Jako kontrola byla použita anti-DNP protilátka KH-5 (Chugaki Seiyaku) stejného izotypu (n=5).

Průběh artritidy byl vyhodnocen na základě artritického indexu. Vyhodnocení bylo děláno na stupnici se 4 body pro každou končetinu, celkem tedy 16 bodů na jednotlivce. Standardní hodnocení bylo následující:

-12CZ 296919 B6

0,5: erytém pozorovaný v jednom místě kloubu,

1: erytém pozorovaný ve dvou místech kloubu nebo zčervenání, ale bez otoku dorsy,

2: pozorován mírný otok,

3: mírný otok dorsy pedál, ale nedosahuje všech prstů,

4: silný otok dorsy pedál a prstů.

Výsledky jsou uvedeny na obrázku 4. Nástup artritidy z časného stadia artritidy byl zřetelně potlačen u skupiny, které byla podávána protilátka IL-6 receptoru, při srovnání se skupinou, které byla podávána kontrolní protilátka.

Na druhé straně výsledky měření titru protilátky anti-kolagenu typu Π v myší krvi ukazovaly významné snížení z časného stavu artritidy u skupiny, které byla podávána protilátka IL-6 receptoru, při srovnání se skupinou, které byla podávána kontrolní protilátka (obr. 5).

Myši byly usmrceny 35. den po imunizaci kolagenem. Zadní tlapky byly fixovány 20% (hmotn.) formalinem. Potom byly podrobeny demineralizaci v roztoku EDTA (pH 7,6) a odvodnění alkoholem. Nakonec byly obaleny parafinem a rozřezány na sekce tlusté 2 mm. Tyto sekce byly obarveny hematoxylinem a eozinem a pozorovány při 125násobném zvětšení (obr. 6). Výsledkem je, že invaze granulační tkáně do chrupavky a kosti, tj. chronická proliferační synovitida, byla potlačena U skupiny, které byla podávána protilátka IL-6 receptoru, při srovnání se skupinou, které byla podávána kontrolní protilátka.

IL-6 je cytokin, který indukuje diferenciaci B buněk na buňky produkující protilátky. IL-6 také podporuje proliferaci synoviálních buněk v přítomnosti IL-6 receptoru. Jelikož u myšího modelu protilátka anti-IL-6 receptoru významně potlačuje titry protilátky kolagenu anti-typu Π 21. a 35. den po senzibilizaci kolagenem při srovnání se skupinou, které byla podávána kontrolní protilátka, předpokládá se, že inhibice produkce protilátky protilátkou anti-IL-6 receptoru je jedním z faktorů, které jsou zodpovědný za potlačení artritidy. Navíc, i když žádné potlačení produkce protilátek nebylo pozorováno od 49. dne po senzibilizaci kolagenem, skutečnost, že příslušný potlačovací efekt na nástup artritidy byl vykazován i během této doby a že HA obarvení tkáně obklopující tarzální kost vykazovalo potlačenou invazi granulační tkáně do chrupavky a kosti u skupiny, které byla podávána protilátka IL-6 receptoru při srovnání s kontrolní skupinou, předpokládá se, že efekt potlačující synoviální růst také přispívá k inhibici artritidy.

Průmyslová využitelnost

Synoviální buňky od pacientů s chronickou revmatickou artritidou proliferují v přítomnosti jak IL-6 tak sIL-6. Skutečnost, že synoviální kapalina pacientů s chronickou revmatickou artritidou obsahuje dostatečná množství IL-6 a sIL-6R pro indukci růstu synoviálních buněk, ukazuje, že transdukce signálu způsobená IL-6 je zapojena v abnormálním růstu buněk u chronické revmatické artritidy.

Bylo tedy nezvratně prokázáno, že léčení chronické revmatické artritidy, jejímž účinnou složkou je antagonista IL-6 podle předloženého vynálezu, potlačuje růst synoviálních buněk u pacientů s chronickou revmatickou artritidou v přítomnosti IL-6 a sIL-6R a že má tedy léčivý účinek na chronickou revmatickou artritidu. IL-6 antagonista podle vynálezu je tedy užitečný jako léčivé činidlo pro chronickou revmatickou artritidu, při níž dochází k abnormálnímu růstu synoviálních buněk.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Použití protilátky proti interleukinu-6 nebo receptorů interleukinu-6 pro přípravu farmaceutického přípravku pro léčení chronické revmatické artritidy.
2. Použití protilátky podle nároku 1, kde protilátka proti interleukinu-6 nebo receptorů interleukinu-6 potlačuje růst synoviálních buněk, které se vyskytují při chronické revmatoidní artritidě.
3. Použití protilátky podle nároku 1 nebo 2, kde interleukinem-6 je lidský interleukin-6 a receptorem interleukinu-6 je lidský receptor interleukinu-6.
4. Použití protilátky podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde protilátkou je přetvařovaná lidská protilátka.