FI120721B - IL-6-antagonistin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi nivelreuman hoitamiseksi - Google Patents

Description

IL-6-antagonistin käyttö farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi nivelreuman hoitamiseksi - Användning av en IL-6-antagonist för att framstäila en farmaceutisk composition avsedd för att behandla ledgängsreumatism 5

Tekniikan ala

Esillä oleva keksintö kohdistuu interleukiini-6-antagonistin 10 käyttöön farmaseuttisen valmisteen valmistamiseksi, joka on tarkoitettu kroonisen nivelreuman hoitamiseksi ja synoviaalisolujen epänormaalin kasvun inhiboimiseksi nivelreumassa.

15 Tekniikan ala

Krooninen nivelreuma on systeeminen krooninen tulehdustauti, jossa nivelissä esiintyy sidekudoksen, mukaan lukien synoviaa-likudoksen, epänormaalia kasvua (Melnyk et ai.. Arthritis 20 Rheum. 33: 493-500, 1990). Kroonista nivelreumaa potevien potilaiden nivelissä on osoittautunut olevan synoviaalisolujen selvää kasvua, monikerroksisen rakenteen muodostumista, joka johtaa synoviaalisolujen epänormaaliin kasvuun (sidekudoskas-,,*·* vaman muodostuminen) , synoviaalisolujen tunkeutumista rustoin]: 25 kudokseen, synoviaalikudoksen vaskularisaatiota ja tulehdus- ··· solujen, kuten lymfosyyttien ja makrofagien, keräytymistä.

*··· •j..| Kroonisen nivelreuman alkumekanismin on raportoitu perustuvan :·, sellaisiin tekijöihin kuin perinnöllisyys, bakteeri-infektio • · · ,·;·. ja erilaisten sytokiinxen ja kasvutekijöiden osuuteen, mutta • · · 30 alkamisen kokonaismekanismi on jäänyt epäselväksi.

»·· • · · ‘l ’ Viime vuosina sytokiinejä ja kasvutekijöitä mukaan lukien in- *···* terleukiini-1 (IL-1) , interleukiini-8 (IL-8) , kasvainnekroo- sitekijä-alfa (TNFalfa), transformoiva tekijä-β (TGF&) , fibro- • · .*·*. 35 blastikasvutekijä (FGF) ja verihiutaleista johdettu kasvuteki- • * · •# jä (PDGF) on havaittu kroonista nivelreumaa potevien potilai- • · * ··· · den nivelvoidekalvossa ja synoviaalinesteessä (Nouri et ai., * · *.**: Clin. Exp. Immunol 55:295-302, 1984, Thornton et ai., Clin 2

Exp. Immunol. 86,-79.86, 1991, Saxne et al. , Arthritis Rheum. 31:1041-1045, 1988, Seitz et al., J. Clin. Invest. 87:463-469, 1991, Lafyatis et al., J. Immunol. 143:1142-1148, 1989, Melnyk et al., Arthritis Rheum. 33:493-500, 1990).

5 Uskotaan, että IL-1, TNFalfa ja PDGF ovat erityisen voimakkaita synoviaalisolukasvutekijoitä (Thornton et al., Clin. Exp. Immunol. 86:79-86, 1991, Lafyatis et al., J. Immunol.

143:1142-1148, Gitter et al., Immunology 66:196-200, 1989). On myös ehdotettu, että IL-l:llä ja TNF:llä stimulointi saa 10 aikaan sen, että synoviaalisolut tuottavat interleukiini-6:a (Ito et al., Arthritis Rheum. 35:1197-1201, 1992).

IL-6 on sytokiini, joka tunnetaan myös B-soluja stimuloivana tekijänä 2 tai interferoni-J52 :na. IL-6 löydettiin differenti-15 aatiotekijänä, joka osallistuu B-lymfoidisolujen aktivointiin (Hirano, T et al., Nature 324, 73.76, 1986) ja myöhemmin sen havaittiin olevan monitoiminen sytokiini, joka vaikuttaa useiden erilaisten solutyyppien toimintaan (Akira, S. et al.. Adv. in Immunology 54, 1-78, 1993). IL-6-aktiivisuuksien induktioon 20 tarvitaan kaksi funktionaalisesti erilaista kalvomolekyyliä. Toinen niistä on IL-6-reseptori (IL-6R), jonka molekyylipaino on suunnilleen 80 kD ja joka sitoutuu spesifisesti IL-6:een.

·· · * ···· :***: IL-6R on kalvoon sitoutuvassa muodossa, joka ilmentyy solukal- φ · t ··. 25 volla ja tunkeutuu solukalvoon, sekä liukenevan IL-6R:n muo- ···· dossa (sIL-6R), joka koostuu pääasiassa solunulkoisesta domee- • ;·, nista. Toinen proteiini on gpl30, jonka molekyylipaino on • ·♦ suunnilleen 130 kD ja joka on ei-ligandiin sitoutuva ja toimii • · · • · · * signaalin transduktion välittämisessä. IL-6 ja IL-6R muodos-30 tavat kompleksin IL-6/IL-6R, joka puolestaan sitoutuu toiseen • · · '·* * kalvoproteiiniin gpl3Q indusoiden IL-6:n biologisen aktiivi- • · · suuden soluun (Taga et al., J. Exp. Med. 196:967m 1987).

« · • · · • · · • m .···. On raportoitu, että kroonista nivelreumaa sairastavien poti- ♦ · *·* 35 laiden seerumi tai synoviaalineste sisältää liiallisia määriä • ♦ i interleukiini-6:a (IL-6) ja liukenevaa IL-6-reseptoria (sIL- • · *.*·· 6R) (Houssiau et al., Arthritis Rheum. 31:784-788, 1988, Hira- 3 no et ai., Eur. J. Immunol. 18:1797-1801, 1988, Yoshika et ai., Japn. J. Rheumatol, painossa), ja koska samanlaisia tuloksia on myös saatu kroonisen nivelreuman eläinmalleissa (Takai et ai., Arthritis Rheum. 32:594-600, 1989, Leisten et ai. 5 Clin Immunol. Immunopathol. 56:108-115, 1990), on ehdotettu, että IL-6 osallistuu jotenkin krooniseen nivelreumaan.

Kuitenkin japanilaisessa patenttihakemuksessa 4-89433 selostetaan, että peptidit, jotka edistävät voimakkaasti IL-6:n 10 tuotantoa, ovat tehokkaita kroonisen nivelreuman hoidossa.

Myös Higaki et ai. ovat ehdottaneet, että kroonista nivelreumaa potevien potilaiden synoviaalisoluissa on alhainen kasvu-reaktio IL-6:a vastaan ja että IL-6:lla on siten inhibitorinen 15 toiminta synoviaalisolujen kasvua vastaan (Clinical Immunology, 22:880-887, 1990), Täten on olemassa ristiriidassa olevia raportteja IL-6:n ja kroonisen nivelreuman suhteesta eikä suhde ole vielä selvä.

20 Äskettäin Wendling et ai. raportoivat, että anti-IL-6-vasta-aineiden antaminen kroonista nivelreumaa poteville potilaille lievittää tilapäisesti kliinisiä ja biologisia oireita samalla kun se nostaa IL-6:n tasoja seerumissa (J. Rheumatol. 20:259-I··· 262, 1993).

*·*:* 25 **'*. Näissä raporteissa ei ole mitään tietoja siitä, kiihdyttääkö * IL-6 kroonisen nivelreuman synoviaalisolujen kasvua tai onko • · • ** sillä inhibitorista vaikutusta ja siten ei vieläkään tiedetä, «·· *.* : onko IL-6:11a suoraa vaikutusta kroonista nivelreumaa potevien 30 potilaiden synoviaalisoluihin.

··· • · · • * ·

Keksinnön kuvaus • · • · · *,;* Anti-inflammatorisia steroidisia aineita, kuten kortikosteroi- • * *·;·* 35 deja, on käytetty nivelreuman hoitoon, mutta koska niiden jat- : kuva käyttö indusoi ei-toivottuja sivuvaikutuksia, kuten iho- *·« « ·*·,· kudoksen vaurioita ja lisämunuaiskuoren toiminnan inhibitiota,

• S

4 on etsitty lääkkeitä, joilla on vähemmän sivuvaikutuksia.

Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusi kroonisen nivelreuman hoito, jossa ei ole edellä kuvattuja 5 haittoja. Erityisemmin esillä oleva keksintö saa aikaan farmaseuttisen koostumuksen, joka on tarkoitettu synoviaalisolujen epänormaalin kasvun inhiboimiseksi nivelreumassa, jonka koostumuksen tehokas komponentti on interleukiini-6-antagonisti, sekä farmaseuttisen koostumuksen 10 kroonisen nivelreuman hoitamiseksi, jossa koostumuksessa on sama teho.

Esillä olevan keksinnön keksijät ovat suorittaneet uutteran tutkimuksen IL-6:n vaikutuksesta nivelreumasta peräisin ole-15 viin synoviaalisoluihin, jonka tutkimuksen aikana ei havaittu mitään kroonisen nivelreuman synoviaalisolujen kasvua IL-6:n kanssa yksinään eikä mitään muuta tekijää kuin IL-6 tutkittu, ja tämä johti esillä olevaan keksintöön, joka perustuu havaintoon, että IL-6:11a yksinään ei ole oikeastaan mitään kasvu-20 vaikutusta synoviaalisoluihin, että voimakas synoviaalisolu-kasvuvaikutus esiintyy sekä IL-6:n että liukenevan IL-6R:n läsnä ollessa ja lisäksi että antagonistin, joka inhiboi IL-6-aktiivisuutta, kuten IL-6-vasta-aineen tai IL-6R-vasta-aineen 'V.'.' lisääminen tukahduttaa synoviaalisolukasvutehoa.

*·1:2 25 • · · ***', Toisin sanoen esillä oleva keksintö kohdistuu IL-6- *»1« antagonistin käyttöön kroonisen nivelreuman hoitoon • · ! " tarkoitetun farmaseuttisen koostumuksen valmistamiseksi • · · V : vaatimuksessa 1 määritellyn mukaisesti. Erityisemmin esillä 30 oleva keksintö kohdistuu IL-6 antagonistin käyttöön sellaisen kroonisen nivelreuman hoitoon tarkoitetun koostumuksen ;3· valmistamiseksi, joka käsittää IL-6-antagonistia tehokkaana ··· .1. komponenttina ja joka on tarkoitettu tukahduttamaan synovi- • · · *;]·1 aalisolujen epänormaalin kasvun. Esillä oleva keksintö kohdis- • · *···1 35 tuu myös synoviaalisolukasvun inhibiittoriin, jonka tehokas ;1· komponentti on IL-6-antagonisti.

2 ··· · • · • · · 3 • «· • ♦ 5

Kuvioiden lyhyt kuvaus

Kuvio 1 on käyrä, joka esittää 3H-tymidiinin ottoa synoviaa-lisoluihin joko IL-6:n tai sIL-6R:n läsnä ollessa tai sekä IL-5 6:n että sIL-6R:n läsnä ollessa.

Kuvio 2 on käyrä, joka osoittaa IL-6-vasta-aineen tai IL-6R-vasta-aineen vaikutusta 3H-tyrnidiinin ottoon synoviaalisolui-hin sekä IL-lfi:n ja sIL-6R:n läsnä ollessa.

10 Kuvio 3 on käyrä, joka osoittaa IL-6-vasta-aineen tai IL-6R-vasta-aineen vaikutusta 3H-tymidiinin ottoon synoviaalisolui-hin sekä IL-6:n ja sIL-6R:n läsnä ollessa.

Kuvio 4 on käyrä, joka osoittaa IL-6-vasta-aineen suppressii-15 vista vaikutusta hiiren kollageenilla indusoitujen nivelreuma-mallien syntyyn.

Kuvio 5 on käyrä, joka esittää seerumin antigeenikollageeni-vasta-ainetasoja nivelreumaisissa hiirissä.

20

Kuvio 6 on valokuva kollageeninivelreumaisen hiiren takatassun nivelen histopatologisesta tutkimuksesta, (a) on valokuva hii- .·. restä, joka on IL-6-reseptorivasta-ainetta annetussa ryhmässä "" ja (b) on hiirestä, joka on verrokkivasta-ainetta annetussa • · "I 25 ryhmässä. Ryhmässä, jolle on annettu IL-6-reseptorivasta-ai- aa a netta, vaimeni rakeiskudoksen tunkeutuminen rustoon ja luuhun merkittävästi (krooninen proliferatiivinen synovitis).

aa • a * ·· • a* V : Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 :*·*: Keksinnön mukaisesti aikaansaatu kroonisen nivelreuman hoitoon a ·***; tarkoitettu farmaseuttinen koostumus on lääke, joka, kun sitä ··· annetaan kroonista nivelreumaa poteville potilaille, a · a tukahduttaa synoviaalisolujen kasvun nivelissä ja jolla on a a *···* 35 oireita lievittäviä ja parantavia vaikutuksia.

a a a a a a a a a aa# a

Keksinnön mukaisesti käytetty IL-6-antagonisti voidaan johtaa a a 6 inistä tahansa lähteestä kunhan se vain on substanssi, joka estää IL-6-signaalin siirron ja inhiboi IL-6:n biologista aktiivisuutta. IL-6-antagonistit käsittävät IL-6-vasta-aineen, IL-6R-vasta-aineen, gpl30-vasta~aineen, modifioidun IL-6:n, 5 antisense-IL~6R:n ja IL-6:n tai IL-6R:n osittaiset peptidit.

Keksinnön mukaisesti antagonistina käytetty IL-6R-vasta-aine voi olla mikä tahansa johdos tai tyyppi (monoklonaalinen, polyklonaalinen), mutta nisäkäseläimistä johdetut 10 monoklonaaliset vasta-aineet ovat erityisen edullisia. Nämä vasta-aineet sitoutuvat IL-6:een, IL-6R:ään tai gpl30:een inhiboiden IL-6:n ja IL-6R:n tai IL-6R:n ja gpl30:n välistä sitoutumista ja estävät siten IL-6-signaalin siirtymisen inhiboiden IL-6:n biologisen aktiivisuuden.

15

Eläinlaji monoklonaalista vasta-ainetta tuottaviksi soluiksi ei ole erityisen rajoitettu kunhan vain se on nisäkäs ja ihmisen vasta-aineita tai vasta-aineita, jotka on johdettu jostain muusta nisäkkäästä kuin ihmisestä, voidaan käyttää. Muus-20 ta nisäkkäästä kuin ihmisestä johdetut monoklonaaliset vasta-aineet ovat edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on johdettu kaneista tai jyrsijöistä, koska ne ovat helpompia valmistaa. Jyrsijä ei ole mitenkään rajoitettu, mutta edulli- *111' siä esimerkkejä ovat hiiret, rotat ja hamsterit.

• * ·*: 25 ··*

Esimerkit sellaisista vasta-aineista, jotka ovat IL-6-vasta-aineita, käsittävät MHl66:n (Matsuda et ai., Eur. J. Immunol.

·· : *·* 18:951-956, 1988) ja SK2-vasta-aineen (Sato et ai., Journal ·· V * for the 21st General Meeting of the Japan Immunology Associa- 30 tion, 21:116, 1991). Esimerkit IL-6R-vasta-aineista käsittävät :*Γ: PM-l-vasta-aineen (Hirata et ai., J. Immunol. 143:2900-2906., ·***· 1989) , AUK12-20-vasta-aineen, AUK64-7-vasta-aineen ja AUK146- ·· .*. 15-vasta-aineen (kansainvälinen patenttihakemus W092-19759).

• · · *·[·* Esimerkki gpl30-vasta-aineesta on AM64-vasta-aine (japanilai- *···* 35 nen patenttihakemus 3-219894) .

• · • · · • · · ··· · .*. : Näistä PM-l-vasta-aine on edullisin.

» ·· • ♦ 7

Monoklonaalisia vasta-aineita voidaan valmistaa seuraavalla tavalla, joka perustuu tunnettuun tekniikkaan. IL-6:ä, IL-6R:ää tai gpl30:a käytetään herkistävänä antigeeninä immuni-5 sointiin konventionaalisen immunisointimenetelmän mukaisesti ja saadut immunosyytit fuusioidaan sitten tunnettuihin emoso-luihin konventionaalisella solunfuusiointimenetelmällä ja mo-noklonaalista vasta-ainetta tuottavat solut seulotaan konventionaalisella seulontamenetelmällä vasta-aineiden valmistami-10 seksi.

Erityisemmin monoklonaaliset vasta-aineet voidaan valmistaa seuraavalla tavalla. Esimerkiksi jos herkistävä antigeeni on ihmisen IL-6, vasta-aineet saadaan käyttämällä ihmisen IL-6:n geenisekvenssiä, jonka ovat selostaneet Hirano et ai., Nature, 15 324:73, 1986. Ihmisen IL-6-geenisekvenssi insertoidaan yleiseen ilmennysvektorijärjestelmän ja käytetään sopivien isäntäsolujen transformoimiseen, minkä jälkeen toivottu IL-6-proteiini puhdistetaan isäntäsoluista tai viljelysupernatan-tista ja puhdistettu IL-6-proteiini käytetään sitten herkistä-20 vänä antigeeninä.

Ihmisen IL-6R:n tapauksessa IL-6R-proteiini voidaan saada sa- •j· maila menetelmällä kuin edellä kuvattu ihmisen IL-6 käyttämäl- **·· lä geenisekvenssiä, joka on selostettu eurooppalaisessa pa- ··* 25 tenttihakemuksessa EP325474. Olemassa on kaksi IL-6R-tyyppiä, »··· joista toinen ilmentyy solukalvossa ja toinen on liukeneva • » muoto (sIL-6R) , joka erotetaan solukalvosta. sIL-6R koostuu • *· pääasiassa IL-6R:n solunulkoisesta domeenista, joka on kiin- • · * • * nittynyt solukalvoon ja se eroaa kalvoon sitoutuneesta IL- 30 6R:stä siinä, että siitä puuttuu transmenbraaninen domeeni tai ··· * · · *·* * transmembraaninen domeeni ja intrasellulaarinen domeeni.

• M

• · • · ··♦

Ihmisen gpl30:n tapauksessa gpl30-proteiini voidaan saada sa- .···, maila menetelmällä kuin ihmisen IL-6, joka on kuvattu edellä, • **’ 35 käyttäen geenisekvenssiä, joka on selostettu eurooppalaisessa • · i.: : patenttihakemuksessa nro EP-411 946.

• · • · ·

• M

• * δ

Nisäkäseläimet, jotka on immunisoitu herkistävällä antigeenillä, eivät ole erityisen rajoitettuja, mutta ne valitaan edullisesti ottaen huomioon niiden yhteensopivuus solufuusioon käytettyjen emosolujen kanssa ja tavallisesti käytetään hii-5 riä, rottia, hamstereja ja kaneja.

Eläinten immunisointi herkistävällä antigeenillä voidaan suorittaa yleisesti tunnetulla menetelmällä. Esimerkiksi eräs konventionaalinen menetelmä käsittää sen, että nisäkäseläimel-10 le injektoidaan intraperitoneealisesti tai ihonalaisesti herkistävää antigeeniä. Erityisesti herkistävä antigeeni laimennetaan edullisesti ekvivalenttiin PBS:ää (fosfaatilla puskuroitu suolaliuos) tai fysiologiseen suolaliuokseen, joka on suspendoitu ja käytetään haluttaessa yhdessä sopivan määrän 15 konventionaalista apuainetta, kuten Freundin täydellistä apuainetta, kanssa, ja annetaan sitten nisäkäseläimelle muutamia kertoja joka 4-21. päivä. Herkistävällä antigeenillä immunisointiin voidaan myös käyttää sopivaa kantoainetta.

20 Tämän immunisoinnin ja halutun vasta-aineen lisääntyneiden seerumitasojen vahvistamisen jälkeen immunosyytit otetaan ni- säkäseläimistä ja viedään solufuusioon erityisesti edullisten ··· immuno syyt tien ollessa pernasoluja.

·*·« ··· • · • · 25 Emosolut, joita käytetään edellä mainittujen immuno syyt tien '***. fuusioon, voivat olla myeloomasoluja, jotka ovat peräisin ni~ ····· • · .. säkäseläimistä, ja voidaan käyttää lukuisia jo yleisesti tun- • nettuja solukantoja, mukaan lukien P3 (P3x53Ag8.653) (J. Im- *·* ' munol. 123:1548, 1978), p3-Ul (Current Topics in Microbiology 30 and Immunology 81:1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6:511- Ο'ϊ 519, 1976), MPC-11 (Cell, 8:405-415, 1976), SP2/0 (Nature, :***: 276:269-270, 1978), Of (J. Immunol. Meth. 35:1-21, 1980), S194 • · ® ,Λ (J. Exp. Med. 148:313-323, 1978), R210 (Nature, 277:131-133, • · » :.: 1979). Immunosyyttien solufuusio myeloomasoluihin voi perustua • « "·* 35 yleisesti tunnettuun menetelmään, esimerkiksi Milstein et al:n ·,· ! menetelmään (Milstein et ai., Methods Enzymol. 73:3-46, 1982).

• t • * · • ·· • t 9

Erityisemmin edellä mainittu solufuusio suoritetaan konventionaalisessa ravintoaineviljelmässä solufuusiopromoottorin läsnä ollessa. Käytetty fuusiopromoottori voi olla esimerkiksi polyetyleeniglykoli (PEG) tai Sendai-virus (HVJ) ja haluttaes-5 sa voidaan lisätä apuainetta, kuten dimetyylisulfoksidia fuusion tehokkuuden lisäämiseksi.

Käytettyjen immunosyyttien ja myeloomasolujen osuudet ovat edullisesti 1- - 10-kertainen immunosyyttimäärä suhteessa my-10 eloomasoluihin. Solufuusioon käytetty viljelyväliaine voi olla esimerkiksi RPMI1640-viljelyväliaine tai MEM-viljelyväliaine, jotka ovat sopivia myeloomasolukantojen viljelyyn, tai voidaan käyttää muita yleisiä viljelyvällaineita, joita käytetään tällaiseen soluviljelyyn, ja niiden kanssa voidaan myös käyttää 15 täydentäviä seerumiliuoksia, kuten fetaalista vasikan seerumia (FCS).

Solufuusio suoritetaan sekoittamalla kauttaaltaan ennalta määrätyt määrät immunosyyttejä ja myeloomasoluja edellä kuvattuun 20 viljelyväliaineeseen, lisäämällä PEG-liuos, joka on esikuumen-nettu noin 37 °C:een, esimerkiksi kun PEGin keskimääräisen molekyylipaino on noin 1000-6000 viljelyväliaineeseen taval-lisesti konsentraatiossa 30-60 % (paino/tilavuus) , ja sekoit- * • · · .···. tamalla sitten haluttujen fuusioituneiden solujen (hybridoo- • · *" 25 mat) muodostamiseksi. Seuraavaksi toistetaan menetelmä sopivan m **’*. viljelyväliaineen asteittaiseksi lisäämiseksi ja sentrifugoin- * ti supernantin poistamiseksi soluja fuusioivan aineen jne., • · ί ’ joka on epäedullista hybridoomien kasvulle, poistamiseksi.

··· • · · 9 9 9 9 30 Sopivat hybridoomat valitaan viljelemällä normaalissa selek-:T: tiivisessä viljelyväliaineessa, kuten HAT-viljelyväliaineessa (joka sisältää hypoksantiinia, aminopteriiniä ja tyrniiniä) .

• 99

Viljelemistä HAT-viljelyväliaineessa jatketaan annetun ajan, • · » tavallisesti muutamista päivistä muutamiin viikkoihin, ja joka • · *···* 35 on riittävä muiden solujen kuin hybridoomien (ei-fuusioitunei- : :*: den solujen) kuolemiseen. Seuraavaksi suoritetaan normaali ··· · rajoitettu laimennus ja haluttuja vasta-aineita tuottavat hyb- • · 10 ridoomat alistetaan maskaukseen ja monokloonaukseen.

Monoklonaalista vasta-ainetta tuottavat hybridoomat, jotka on valmistettu tällä tavalla, voidaan alaviljellä yleisessä vil-5 jelyliuoksessa ja ne voidaan myös sijoittaa nestemäiseen typ-peen pitkäaikaista varastointia varten.

Monoklonaalisten vasta-aineiden saamiseksi hydridoomista hyb-ridoomia viljellään konventionaalisen menetelmän mukaisesti, 10 minkä jälkeen viljelysupernatantti otetaan talteen, tai käytetään muuta menetelmää, jolloin hybridoomat injektoidaan yhteensopivaan nisäkäseläimeen, viljellään ja saadaan vesivat-saneste. Ensimmäinen menetelmä sopii erittäin puhtaiden vasta-aineiden valmistamiseen ja toinen menetelmä sopii vasta-ainei-15 den massatuotantoon.

Näillä menetelmillä saadut vasta-aineet voidaan sitten puhdistaa erittäin puhtaiksi käyttämällä konventionaalisia puhdistusmenetelmiä, kuten poissuolausta, geelisuodatusta, affini-20 teettikromatografiaa ja niiden kaltaisia.

Tällä tavalla valmistettujen monoklonaalisten vasta-aineiden korkea herkkyys ja korkea puhtaus voidaan sitten tarkastaa :***: tunnistamalla antigeeni yleisillä immunologisilla välineillä ··· 25 kuten radioimmuunitestillä (RIA), entsyymikytketyllä immuuni- ···· testillä (EIA, ELISA) , fluoresenssivasta-ainetekniikalla (im- :·, munofluorensenssianalyysi) jne.

• ·· ··♦ • ♦ · • · ·

Keksinnön mukaisesti käytetyt vasta-aineet eivät rajoitu hyb- ... 30 ridoomilla tuotettuihin monoklonaalisiin vasta-aineisiin ja ne # · ♦ voivat olla sellaisia, jotka on modifioitu keinotekoisesti ··· • · *·.·* hetoroantigeenisyyden ihmisiä vastaan alentamiseksi. Esimer- ;*;*· kiksi voidaan käyttää kimeeristä vasta-ainetta, joka koostuu • · .··*. jonkin muun nisäkkään kuin ihmisen, kuten hiiren, monoklonaa- • · · • 35 lisen vasta-aineen muuttuvasta alueesta ja ihmisen vasta-ai- • · * :·! : neen vakaasta alueesta ja tällainen kimeerinen vasta-aine voi- • · *. *: daan valmistaa tunnetulla kimeerisen vasta-aineen tuottavalla 11 menetelmällä, erityisesti geeniyhdistelmätekniikalla.

Uudelleen muotoiltuja ihmisen vasta-aineita voidaan myös käyttää keksinnön mukaisesti. Ne valmistetaan käyttämällä hiiren 5 tai muun ei-ihmisnisäkäseläimen vasta-aineen komplementaarista determinanttialuetta ihmisen vasta-aineen komplementaarisen determinanttialueen korvaamiseksi ja konventionaaliset geeni-yhdistelmätekniikat ovat siihen tunnettuja. Yhtä tunnetuista menetelmistä voidaan käyttää uudelleenmuotoillun ihmisen vas-10 ta-aineen saamiseksi, joka vasta-aine on käyttökelpoinen keksinnön mukaisesti. Edullinen esimerkki tällaista uudelleenmuo-toillusta ihmisen vasta-aineesta on hPM-1 (katso kansainvälinen patenttihakemus W092-19759).

15 Tarvittaessa voidaan vasta-aineen muuttuvan alueen runkoalueen (FR) aminohapot substituoida siten, että uudelleenmuotoillun ihmisen vasta-aineen komplementaarinen determinanttialue muodostaa sopivan vasta-ainetta sitovan kohdan (Sato et ai., Cancer Res. 53:851-856, 1993). Lisäksi edellä mainittu kohde voi-20 daan myös saavuittaa konstruoimalla geeni, joka koodaa vasta-ainefragmenttia, joka sitoutuu antigeeniin inhiboiden IL-6-aktiivisuuden, kuten Fab tai Fv, tai yksiketjuinen Fv (scFv) , ,,*·* jolloin H- ja L-ketjujen Fv:t ovat kiinnittyneet sopivan link- kerin kautta, ja käyttämällä sitä ilmentämiseen sopivissa • t* ··· 25 isäntäsoluissa (katso esimerkiksi Bird et ai., TIBTECH, 9:132- • · · 137, 1991, Huston et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 85:5879- ;·. 5883, 1988) .

• · * • · · * · · • · ·

Keksinnön mukaisesti käytetty modifioitu IL-6 voi olla sellai-... 30 nen, jonka ovat selostaneet Brakenhoff et ai., J. Biol. Chem.

’·* * 269:86-93, 1994, tai Savino et ai., EMBO J. 13:1357-1367, • · φ 1994.

• · • · · • · · • · .**·. Käytetty modifioitu IL-6 voidaan saada viemällä mutaatio, ku- 35 ten substituutio, deleetio tai insertio, IL-6-aminohapposek- • · i ··· ! venssiin sitoutumisaktiivisuuden lL-6R:n kanssa ylläpitämisek- • · :.**i si samalla kun eliminoidaan IL-6-signaalinsiirtotoiminto. IL6- 12 lähde voi olla peräisin mistä tahansa eläinlajista kunhan sillä on vain edellä mainitut ominaisuudet mutta antigeenisyyden osalta käytetään edullisesti ihmisestä johdettua.

5 Erityisesti IL-6-aminohapposekvenssin sekundaarinen rakenne voidaan ennustaa käyttämällä yleisesti tunnettua malliohjelmaa, kuten WHATIF (Virend et ai., J. Mol. Graphics, 8;52-56, 1990), jolloin mutatoitujen aminohappotähteiden vaikutus koko rakenteeseen voidaan myös arvioida. Sopivien mutatoitujen ami-10 nohappotähteiden määrittämisen jälkeen käytetään ihmisen IL-6-geeniä koodaavan sekvenssin sisältävää vektoria templaattina mutaation sisällyttämiseksi konventionaalisesti käytetyllä PCR-(polymeraasiketjureaktio)-menetelmällä modifioitua IL-6:a koodaavan geenin saamiseksi. Se sisällytetään sitten sopivaan 15 ilmennysvektoriin tarvittaessa ja ilmennetään E. coli -soluissa tai nisäkässoluissa, ja sitten sitä käytetään joko viljely supernatant is sa tai konventionaalisilla menetelmillä eristämisen ja puhdistamisen jälkeen IL-6R:ään sitoutumisaktiivisuu-den ja neutraloidun IL-6-signaalinsiirtoaktiivisuuden arvioi-20 miseksi.

IL-6-osittaisessa peptidissä tai IL-6R-osittaisessa peptidis- •I* sä, jota käytetään keksinnön mukaisesti, voi olla olla mikä • · · · ;***: tahansa sekvenssi kunhan se vain sitoutuu IL~6R:ään tai IL- *·· 25 6:een vastaavasti ja kun sillä ei ole mitään IL-6-aktiivisuu- ^ ·*·· den siirtotoimintaa. IL-6-osittaiset peptidit ja IL-6R-osit- • · j*# täiset peptidit on selostettu US-patenttijulkaisussa US-5 210 • ·· *... 075. IL-6-antisense-oligonukleotidi on kuvattu japanilaisessa • · * patenttihakemuksessa no 5-300338.

30 ··* t f < '·* * Farmaseuttinen koostumus, joka on tarkoitettu kroonisen nivel- ··« :...· reuman hoitoon ja jonka vaikuttava komponentti on keksinnön mukaisesti käytetty IL-6-antagonisti, on tehokas hoidettaessa • · .···. kroonista nivelreumaa, jos se estää IL-6-signaalin siirtymisen • · ’** 35 ja tukahduttaa IL-6:n indusoiman synoviaali solujen : epänormaalin kasvun, joka liittyy tähän sairauteen.

• · *,*·; Esimerkissä 1 esitetään in vitro kasvua tuhahduttava vaikutus 13 reumapotilaista johdettuihin synoviaalisoluihin. Esimerkissä 2 nivelreumaisille hiirimallikappaleille, jotka oli immunisoitu tyypin II kollageenilla, annettiin IL-6-reseptorivasta-ainetta ja relevantit tiedot osoittavat, että nivelreuman synty 5 tukahtui perustuen nivelreumaindeksiin (kuvio 4), (2) kollageenilla immunisoitujen hiirten veressä tuhahtui antityypin II kollageenivasta-aineen tuotanto (kuvio 5), ja (3) rakeiskudoksen tunkeutuminen rustoon ja luuhun (krooninen proliferatiivinen synoviitti) tuhahtui nivelreumaisten 10 hiirimallien takatassujen nivelissä, kun niille annettiin IL- 6-reseptorivasta-ainetta (kuvio 6).

Mitä tulee edellä mainittuihin esimerkkeihin (1) ja (2), tulokset vahvistivat IL-6-reseptorivasta-aineen aiheuttaman tu-15 kahdusvaikutuksen erityisesti alussa nivelreuman syntyyn hii-rimalleissa. Esimerkin (3) tulokset osoittivat, että rakeis-kudoksen tunkeutuminen rustoon ja luukudokseen tukahtui ja tämä tukee esimerkissä 1 saatuja tuloksia (synoviaalisolukas-vun in vitro -inhibitio).

20

Esimerkkien (1) ja (2) koetulokset osoittavat, että tässä kuvatulla kroonisen nivelreuman hoitoon tarkoitetulla ·:* farmaseuttisella koostumuksella on erinomainen alkuvaikutus ···« :**’· nivelreumaan.

25 *··· Tässä kuvatun mukaista kroonisen nivelreuman hoitoon • · .. tarkoitettua farmaseuttista koostumusta annetaan • · • «· parenteraalisesti, esimerkiksi suonensisäisesti, • · · lihaksensisäisesti, intraperitoneaalisesti tai ihonalaisesti 30 injektoimalla, joko systeemisesti tai lokaalisesti. Se voi ·· V * myös olla lääkevalmistevälinesarjan muodossa yhdessä vähintään ··· yhdentyyppisen lääkkeen kantoaineen tai laimentimen kanssa.

• · • · * • · · ,···, Kroonisen nivelreuman hoitoon tarkoitetun tässä kuvatun • « "* 35 koostumuksen annostus, kun sitä annetaan ihmisille, on erilai- • · : nen riippuen potilaan patologisesta tilasta ja iästä sekä an- • » !,*·· totavasta ja täten sopivat ja tarkoituksenmukaiset annokset 14 pitää valita. Voidaan valita esimerkiksi korkeintaan 4 erillistä annosta, jotka ovat alueella noin 1-100 mg/potilas. Kuitenkaan nivelreuman hoitoon tarkoitettu keksinnön mukainen farmaseuttinen koostumus ei rajoitu näihin annoksiin.

5 Tässä kuvattu nivelreuman hoitoon tarkoitettu farmaseuttinen koostumus voidaan formuloida konventionaalisilla menetelmillä. Esimerkiksi injektiovalmiste valmistetaan liuottamalla puhdistettua XL-6-antagonistia liuottimeen, kuten fysio- 10 logiseen suolaliuokseen tai puskuriliuokseen, ja lisäämällä sitten adsorboitumisen inhibiittoria, kuten Tween 80:a, gelatiinia, ihmisen seerumin albumiinia (HSA) tai niiden kaltaisia, seos voidaan lyofilisoida ennen liuoksen rekonstituutioon käyttöä. Lyofilisointiin käytetty täyteaine voi olla sokeri-15 alkoholi, kuten mannitoli tai glukoosi, tai sakkaridi.

Esimerkit 20

Esillä olevaa keksintöä selostetaan nyt yksityiskohtaisemmin seuraavien esimerkkien, viite-esimerkkien ja koe-esimerkkien ·;· avulla ja on ymmärrettävä, että keksintö ei rajoitu millään

• ••I

tavalla niihin.

t·· 25 • · · · • · .. Viite-esimerkki 1: Ihmisen liukenevan IL-6-reseptorin valmis- • ·· *... tus · · *** Liukeneva IL-6R valmistettiin (Yasukawa et ai., J. Biochem.

30 1080:673-676, 1990) PCR(polymeraasiketjureaktio)menetelmällä • · * V : käyttäen plasmidia pBSF2R.236, joka sisältää cDNA:n, joka koo- * · · daa ihmisen lL-6-reseptoria (IL-6R) ja joka saatiin Yamasaki et al:n menetelmän mukaisesti (Science, 241:825-828, 1988).

• · · • i t · · • · "* 35 Edellä mainittu plasmidi pBSF2R.236 hajotettiin restriktioent- • · : syymillä Sphl IL-6 cDNA -fragmentin saamiseksi, joka sitten • · !.*·· insertoitiin mpl8:aan (Amersham co.) . Synteettistä oligopri- 15 meeriä ATATTCTCTAGAGAGATTCT, joka tehtiin lopetuskodonin viemiseksi IL-6R cDNA:hän, käytettiin mutaation viemiseksi IL-6R cDNA-.han PCR-menetelmällä käyttäen Invitro Mutagenesis Syste-miä (Amersham Co.). Tämän menetelmän tuloksena lopetuskodoni 5 vietiin aminohapon 345 asemaan liukenevaa lL-6R:ää (sIL-6R) koodaavan cDNA:n saamiseksi.

sXL-6R cDNA:n ilmentämiseksi CHO-soluissa edellä mainittu sIL-6R cDNA, joka leikattiin Hindlll-Sall:llä, insertoitiin plas-10 midiin pECDdhfr (Clauser et ai., Cell, 45:721-735, 1986), jossa oli cDNA, joka koodaa dihydrofolaattireduktaasia (dhfr) insertoitunma restriktioentsyymi PvuI -leikkauskohtaan CHO-soluilmennysplasmidin pECEdhfr344 saamiseksi.

15 10 μ9 plasmidia pECEdhfr344 käytettiin dhfrCHO-soluiinjän DXB

(Urland et ai., Proc. Natl. Acd. Sei. USA 77, 4216-4220, 1980) saamiseksi kalsiumfosfaattisaostusmenetelmällä (Chen et ai., Mol. Cell. Bio. 7:2745-2751, 1987).

20 Transfektoituja CHO-soluja viljeltiin 3 viikkoa nukleosidit-tomassa alfaMEM-selektiivisessä viljelyväliaineessa, joka sisälsi 1 mM glutamiimia, 10 % dialysoitua fetaalista vasikan- •j* seerumia (FCS), 100 U/ml penisilliiniä ja 100 ug/ml strepto- ···« :***: mysiiniä. Valikoidut CHO-solut seulottiin rajoittavalla lai- ··· ... 25 mennusmenetelmällä ja saatiin yksi monoklonaalinen CHO-solu- ···« linja. CHO-soluklooni amplifioitiin 20 nM - 200 nm konsentraa- • · tion metotreksaatissa (MTX) ihmisen sIL-6R:ää tuottavan CHO- • ·· solulinjan 5E27 saamiseksi.

• · · • · · m 30 CHO-solulinja 5E27 viljeltiin Iscoven modifioidussa Dulbeccon V * väliaineessa (IMDM, Gibco Co:n tuote), joka sisälsi 5 % FCS, ··· viljelysupernatantti otettiin talteen ja sIL-öR-konsentraatio viljelysupernatantissa mitattiin ELISA(entsyymikytketty immu- • · .···. nosorbenttikoe)menetelmällä yleisen menettelytavan mukaisesti.

V 35 • m • · · * · · • e· « • 9 viite-esimerkki 2i ihmisen IL-6-vasta-aineen valmistaminen 16

Ihmisen IL-6-vasta-aine valmistettiin Matsuda et al:n menetelmän mukaisesti (Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988).

5 BALB/C-hiiret immunisoitiin 10 μςιΐΐβ rekombinanttista IL-6:a (Hirano et ai., Immunol. Lett., 17:41, 1988) yhdessä Freundin täydellisen apuaineen kanssa, ja tätä jatkettiin viikko, kunnes veren seerumissa havaittiin anti-IL-6-vasta-aineita.

10 Immunosyytit uutettiin lokaalisista imusolmukkeista ja poly-etyleeniglykolia 1500 käytettiin myeloomasolulinjaan P3U1 fuusioimiseksi. Hybridoomat valittiin Oi et al:n menetelmän mukaisesti (Selective Methods in Cellular Immunology, W.H. Freeman and Co., San Fransisco, 351, 1980) käyttäen HAT-vil- 15 jelyväliainetta ja ihmisen IL-6-vasta-ainetta tuottava hybri-doomalinja perustettiin. Ihmisen IL-6-vasta-ainetta tuottava hybridooma alistettiin IL-6-sitoutumiskokeeseen seuraavalla tavalla.

20 Erityisesti pehmeä polyvinyylinen 96-koloinen mikrolevy (Dyna-tech Laboratories, Inc:n, Alexandria, VA, tuote) päällystettiin yön ajan 100 ul:lla vuohen antihiiri-lg-vasta-ainetta (10 ··· μΐ/ml, Cooper Biomedical, Inc:n, Malvern, PA, tuote) 0,1 M:ssa ·*·· ,*··, karbonaatti-vetykarbonaattipuskuriliuosta (pH 9,6) 4 °C:ssa.

• •f ,·, 25 Sitten levyä käsiteltiin 2 tuntia huoneenlämpötilassa PBS:llä, '***, joka sisälsi 100 μΐ 1-prosenttista naudan seerumin albumiinia • * .. (BSA). PBS:llä pesemisen jälkeen jokaiseen koloon lisättiin • ft •m " 100 μΐ hybridoomaviljelysupernatanttia ja inkuboitiin yön • · · • · · • ajan.

30 ··· V * Sitten levyt pestiin ja 125I-merkittyä rekombinanttista IL-6:a lisättiin kuhunkin koloon 2000 cpm:ään/0,5 ng/kolo ja pesemi- .·]·. sen jälkeen kunkin kolon radioaktiivisuus mitattiin gammalas- » « · !.! kijalla (Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, • · ft · "* 35 CA) . 216:sta hybridoomakloonista 32 hybridoomakloonia olivat « · · positiivisia IL-6-sitomistestissä. Näistä klooneista saatiin :\j lopuksi stabiili klooni MH166.BSF2, IL-6-vasta-aine MH166, 17 joka valmistettiin tällä hybridoomalla, on IgGIK-alatyyppiä.

IL-6:sta riippuvaista hiiren hybridoomasolulinjaa MH60.BSF2 (Matsuda et ai., Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988) käytettiin 5 sitten MHl66-vasta-aineen neutralisoivan vaikutuksen hybridoo-man kasvuun määrittämiseksi. MH60.SF2-solut levitettiin määränä 1 x 10V200 μΐ/kolo, näyte, joka sisälsi MH166-vasta-ainet-ta, lisättiin siihen, viljeltiin 48 tuntia ja 15,1 Ci/mmoolia 3H-tymidiiniä (New England Nuclear, Boston, MA) lisättiin, 10 minkä jälkeen viljelyä jatkettiin 6 tuntia.

Solut sijoitettiin lasisuodatuspaperille ja käsiteltiin automaattisella kerääjällä (Labo Mash Science Co., Tokio, Japani). Kanin anti-IL-6-vasta-ainetta käytettiin verrokkina. Tuloksena 15 MHl66-vasta-aine inhiboi MH60.BSF2-solujen 3H-tymidiinioton annoksesta riippuvalla tavalla. Tämä osoitti, että MH166-vas-ta-aine neutraloi IL-6-aktiivisuuden.

20

Viite-esimerkki 3: Ihmisen IL-6-reseptorivasta-aineen valmis- *:· taminen ··· ··» • ' · • · ·«· 25 Anti-IL-6-vasta-aine MT18, joka konstruoitiin Hirata et al:n menetelmällä (J. Immunol. 143:2900-2906, 1989), sidottiin Se- • t .. pharose 4B:hen (Pharmacia Fine Chemicalsin, Piscataway, NJ, t ·· *... tuote), aktivoitiin CBr:llä ja sitoutunutta kompleksia käytet- • · · *·* * tiin IL-6R:n puhdistamiseen (Yamasaki et ai., Science 241:825- 30 828, 1988).

• e* • · · • · · e ··

Ihmisen myeloomasolulinja U266 tehtiin liukoisaksi 1 iriM:sella p-para-aminofenyylimetaanisulfonyylifluoridihydrokloridilla #···, (Wako Chemicalsin tuote) , joka sisälsi 10 iriM trietanoliamiinia *!* 35 (pH 7,8) ja 0,15 M:lla NaCl (digitoniinipuskuriliuos) , sekoi- • ·

Ϊ.Ϊ : tettiin MT18-vasta-ainetta, joka oli sidottu Sepharose 4B

m e ϊ#*·ί -pallosiin. Palloset pestiin sitten 6 kertaa digitoniinipus- 18 kuriliuoksella osittain puhdistetun IL-6R:n saamiseksi immunisointiin.

BALB/c-hiiret immunisoitiin 4 kertaa päivässä joka 10. päivä 5 osittain puhdistetulla IL-6R:llä, joka oli saatu 3 x 109 U266-soluista ja sitten hybridoomat valmistettiin konventionaalisilla menetelmillä. Kasvupositiivisista koloista peräisin olevien hybridoomien viljelysupernatanteista tutkittiin IL-6-si-toutumisaktiivisuus seuraavalla menetelmällä. Sen jälkeen kun 10 5 x 107 U266-solua oli merkitty 3sS-metioniinilla (2,5 mCi) , ne tehtiin liuokoisaksi edellä mainitulla digitoniinipuskuri-liuoksella. Liuokoisaksi tehtyihin U266-soluihin sekoitettiin 0,04 ml MTl8-vasta-ainetta, joka oli sidottu Sepharose 4B -pallosiin ja 6 kertaa digitöniinipuskuriliuoksella pesemisen 15 jälkeen 3SS-metioniinilla merkitty IL-6R pestiin pois 0,25 ml :11a digitoniinipuskuriliuosta (pH 3,4) ja neutraloitiin 0,025 ml:11a 1 M Tris (pH 7,4).

0,05 ml:aan hybridoomaviljelysupematanttia sekoitettiin 0,01 20 ml Protein G Sepharosea (Pharmacian tuote). Pesemisen jälkeen

Sepharose inkuboitiin 0,005 ml:n 35S-merkittyä IL-6R-liuosta kanssa, joka oli valmistettu aiemmin. Immunosaostunut subs- •j. tanssi analysoitiin SDS-PAGElla ja hybridoomaviljelysuperna- • ·· · ,···. tantit, jotka reagoivat IL-6R:n kanssa tutkittiin. Tuloksena • · .·. 25 perustettiin reaktiopositiivinen hybridoomaklooni PM-1. IL-6R- vasta-aine PM-1, jonka tuotti hybridooma PM-1, on IgGlK-ala- .. * tyyppiä.

• ·

• M

··· • » · *·' * Vasta-aineen, jonka tuotti hybridooma PM-1, IL-6:n sitoutumis- 30 ta ihmisen IL-6R:ään vastaan, inhiboiva aktiivisuus tutkittiin II* V* käyttämällä ihmisen myeloomasolulinjaa U266. Ihmisen rekombi- nanttinen IL-6 valmistettiin E. colissa (Hirano et ai., Immu-,·]·, nol. Lett. 17:41, 1988) ja 12SI-merkittiin Bolton-Hunter-rea- • · i !.! gensilla (New England Nuclear, Boston, MA) (Taga et ai., J.

• · **:** 35 Exp. Med. 166:967, 1987).

• · • · · « I * ··· * 4 x 105 U266-solua viljeltiin huoneenlämpötilassa 100-kertai- 19 sen ylimäärän ei-merkittyä IL-6:a läsnä ollessa tunnin ajan yhdessä 70 % (til/til) hybridooma PM-1 -viljelysupernatanttia ja 14000 cpm lssI-merkittyä IL-6:a kanssa. 70 μΐ näytettä levitettiin 300 μ1:11θ PCS, joka oli sijoitettu 400 μ1:η mikro-5 fugipolyetyleeniputkeen ja sentrifugoinnin jälkeen solujen radioaktiivisuus mitattiin.

Tuloksena osoitettiin, että hybridooman PM-1 tuottamat vasta-aineet inhiboivat IL-6:n sitoutumista IL-6R:ään.

10

Viite-esimerkki 4: Hiiren IL-6-reseptorivasta-aineen valmistaminen 15 Hiiren IL-6-reseptorin vastaiset monoklonaaliset vasta-aineet valmistettiin menetelmällä, joka on kuvattu japanilaisessa patenttihakemuksessa nro 6-134617.

Seuraten Saito et al:n menetelmää (J. Immunol., 147, 168-173, 20 1993) viljeltiin CHO-soluja, jotka tuottavat hiiren liukenevaa IL-6-reseptoria, IMDM-väliaineessa, joka sisältää 10 % FCS, ja hiiren liukeneva IL-6-reseptori puhdistettiin viljelysuper- . natantista käyttämällä hiiren liukenevaa IL-6-reseptorivasta- ··· •"j ainetta RS12 (katso ibid. Saito et ai.) ja affiniteettipylväs- • · *···' 25 tä immobi li soivaa Affigel 10 geeliä (Biorad) .

• s« ···· *·*" 50 pg saatua hiiren liukenevaa IL-6-reseptoria sekoitettiin ·· • *·· Freundin täydelliseen apuaineeseen ja injektoitiin intraperi- toneaalisesti Wistar-rottiin (Nihon Charles River Co.). Tehos- s 30 teimmunisointeja annettiin Freundin epätäydellisellä apuai-neella 2 viikon kuluttua. 45. päivänä rotat teurastettiin ja .···, noin 2 x 10 niiden pernasolua käytettiin solufuusioon 1 x 10 • · *·* hiiren P3Ul-myeloomasolun kanssa konventionaalisella menetel- • · ·.*.* mällä käyttäen 50 % PEG1500 (Berlinger Mannheim), minkä jäi- s · s ‘.,.ϊ 35 keen hybridoomat seulottiin HAT-väliaineella.

s- s • · · • s* * .·. · Sen jälkeen kun hybridoomaviljelysupernatantit oli lisätty • ' ·· s s 20 iiranunolevylle, joka oli päällystetty kanin anti-rotta-IgG-vas-ta-aineella (Cappel Co.), hiiren liukeneva IL-6-reseptori rea-goitettiin sen kanssa ja hiiren liukenvan IL-6-reseptorin vastaisia vasta-aineita tuottavat hybridoomat seulottiin ELISA-5 menetelmällä käyttäen kanin anti-hiiri-IL-6-reseptorivasta-ai-netta ja alkalifosfataasilla merkittyä latinaan anti-kani-IgGi-tä. Hybridoomakloonit, joissa vahvistettiin vasta-aineen tuotanto, alistettiin alaseulontaan kahdesti yhden hybridooma-kloonin saamiseksi. Tämä klooni nimettiin MR16-l:ksi, 10 Tämän hybridooman vasten hiiren IL-6-signaalin siirtymistä tuottaman vasta-aineen neutraloiva aktiivisuus tutkittiin sisällyttämällä 3H-tyrnidiiniä käyttäen MH60.BSF2-soluja (Matsuda et ai., J. Immuno. 18, 951-956, 1988). MH60.BSF2-soluja lisät-15 tiin 96-koloiselle levylle 1 x 10* solua/200 μΐ/kolo ja sitten hiiren IL-6:a (10 pg/ml) ja MRl6-I-vasta-ainetta tai RS12-vas-ta-ainetta lisättiin 12,3-1000 ng:hen/ml ennen 37 °C:ssa viljelemistä, 5-prosenttisessa C02issa 44 tuntia, minkä jälkeen 3H-tymidiini (1 pCi/kolo) lisättiin ja otto mitattiin 4 tunnin 20 kuluttua. Tuloksena MR16-l-vasta-aineen havaittiin inhiboivan MH60.BSF2-solujen 3H-tymidiinin ottoa.

··· ««·· »M • · • · ··· ,·, 25 Koe 1t Kroonisesta nivelreumasta johdetun synoviaalisolulinjan '***. perustaminen a · • e • (1) Synoviaalisolujen valmistaminen • e · *** * Synoviaalikudos saatiin leikkaamalla kirurgisesti kroonista 30 nivelreumaa potevan potilaan nivel. Synoviaalikudos pilkottiin t·· V : saksilla ja sitten se alistettiin entsymaattiseen dissosiaa- • se tioon inkuboimalla yksi tunti 37 °Cissa 5 mg/ml tyypin I kol- ,·[·, lagenaasia kanssa (Sigma Chemical Coin tuote) ja ja 0,15 mg:n- * « · !,! /ml naudan haiman DNaasia kanssa (Sigma Chemical Coin tuote) • *1* 35 IMDMissä (Iscoven modifioitu Dulbeccon väliaine), ja vietiin • e ·,; · seulan läpi singulaaristen solujen saamiseksi. Sitten näitä !/.: soluja viljeltiin yön ajan viljelypullossa käyttämällä IMDMi- 21 ää, joka sisälsi 5 % FCS, minkä jälkeen ei-adherentit solut poistettiin synoviaalisolujen saamiseksi. Synoviaalisolut kierrätettiin 3-6 kertaa ja niitä käytettiin seuraavaan kokeeseen.

5 (2) 11-6:n tuottaminen synoviaalisoluilla

Edellä kuvatusti saadut synoviaalisolut suspendoitiin IMDM-viljelyväliaineeseen, joka sisälsi 5 % FCS (Hyclone Laboratories Inc:n tuote), 10 U/ml penisilliini G ja 100 pg/ml strep-10 tomysiiniä, määrään 3 x 103 solua/kolo ja niitä viljeltiin sitten 96-koloisella mikrotitterilevyllä (Falcon Co:n tuote), jolle lisättiin ihmisen interleukiini-l£:a (IL-Ιβ), ihmisen kasvainnekroositekijää alfa (TNFalfa), ihmisen verihiutaleista johdettua kasvutekijää (PDGF)AB ja ihmisen baasista fibroblas-15 tikasvutekijää (bFGF) konsentraatioihin 0,01 tai 0,1, o,l tai 1, 1 tai 10 ja 1 tai 10 ng/ml vastaavasti ja 37 °C:ssa 72 tuntia viljelemisen jälkeen viljelysupematantit kerättiin.

100 μΐ anti-ihmisen IL-6-vasta-ainetta MH166 (1 μg/ml) lisät- 20 tiin 96-koloiselle ELISA-levylle (Immunolevy: Nunc Co:n tuote) ja inkuboitiin 4 °C:ssa 24 tuntia. Jokainen kolo pestiin seu- raavaksi PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20, ja suojattiin ··· 4 °C:ssa yön ajan PBS:llä, joka sisälsi 1 % BSA. Aiemmin saa- * · · · ·"*. dut viljelysupematantit laimennettiin sitten PBSrllä, joka i·· 25 sisälsi 1 % BSA ja joka lisättiin koloihin ja inkuboitiin sit-ten huoneenlämpötilassa 2 tuntia. Sen jälkeen kun oli pesty • · .. PBS:llä, joka sisälsi 0,05 % Tween 20, 2,5 μg/ml kanin poly- • · • · · klonaalista anti-ihmisen IL-6-vasta-ainetta, jotka oli puhdis- • · · *·* ’ tettu 100 μ1:η proteiini A -pylväällä (Pharmacian tuote), li- 30 sättiin.

* ·· * · · • · · • * · 2 tuntia huoneenlämpötilassa inkuboinnin jälkeen kanin polyk- .·]·, lonaalinen anti-IL-6-vasta-aine, joka sitoutui IL-6:een vil- • · · U’,' jelysupernatanteissa, reagoitettiin alkalifosfataasiin sitou- • · ”* 35 tuneen anti-kanin-IgG-vasta-aineen (Tago Co:n tuote) kanssa.

• · ·.· · Ja sitten 1 mg/kl Sigmal04 alkalifosfataasisubstraattia (Sig- man tuote) lisättiin siihen liitettyjen ohjeiden mukaisesti ja 22 absorbanssi 405-600 rutussa mitattiin MPR-mikrolevylukijalla (Tosoh Co:n tuote).

Rekombinanttiselle IL-6:lle valmistettiin kalibrointikäyrät 5 kunkin testin aikana, jolloin tutkittiin absorbanssi-OD-arvo-jen konversiota ihmisen IL-6-konsentraatioiksi. Tulokset on annettu taulukossa 1.

Taulukko 1 10 Lisääntynyt IL-6-tuotanto synoviaalisoluista Käsittely (ng/ml) IL-6- (ng/ml) Käsittelemätön 0,096 ±0,012 IL-lfi 0,01 6,743 ±0,178 0,1 17,707 ±0,259 TNFalfa 0,1 0,575 ±0,008 1 1,688 ±0,034 FDGF-AB 1 0,163 ±0,035 10 0,165 ±0,016 bFGF 1 0,181 ±0,009 10 0,230 ±0,019

Huomaa: Synoviaalisoluja viljeltiin 3 päivää IL-lfi:n, TNFal-fan, PDGF-AB:n tai vFGF:n kanssa. Viljelemisen jälkeen super- • · *" natanttien IL-6-konsentraatiot mitattiin ELISAlla.

• · · •**:p 15

Tulokset osoittavat, että IL-1 tehostaa voimakkaasti synoviaa- ·· : ** lisolujen IL-6-tuotantoa.

• · · · * · *

Esimerkki 1 20 (1) Kokeessa 1 saadut synoviaalisolut (34 x 103/kolo) suspen- ;***· doitiin IMDM-viljelyvällaineeseen, joka sisälsi 5 % FCS (Hy- *·· .*, clone Laboratories lnc:n tuote), 10 U/ml penisilliini G:ta ja • · · *·];* 100 pg/ml streptomysiiniä, ja sitten ne lisättiin 96-koloisel- • · *···* le mikrotitterilevylle (#3072, Falcon Com tuote) ja niitä • 25 viljeltiin 5 päivää erilaisten konsentraatioiden IL-6:a tai • ·· · : sIL-6:ä läsnä ollessa tai sekä IL-6:n että sIL-6R:n läsnä • · · • · 23 ollessa. 72 tuntia viljelemisen aloittamisen jälkeen 3H-tymidiiniä (Amersham International plc:n tuote) lisättiin jokaiseen koloon 1 pCi:hen/kolo ja sen jälkeen kun viljely oli päättynyt, solujen radioaktiivisuus mitattiin tuikelaskijalla. 5 Tulokset on esitetty kuviossa 1.

Tuloksena synoviaalisolujen 3H-tymidiiniotto oli alhainen IL-6: tai sIL-6R:n yhteydessä eikä mitään synoviaalisolujen kasvua havaittu. Sen sijaan vähintään 10 ng/ml:n konsentraatiotan 10 IL-6:a ja 100 ng/ml:n konsentraation sIL-6R:ä läsnä ollessa havaittiin merkittävä 3H-tymidiinin otto verrattuna verrokki-ryhmään. Täten samalla kuin pelkän IL-6:n yhteydessä ei ilmennyt virtuaalisesti mitään kasvuvaikutusta, tuotettiin selvästi sekä IL-6:n että sIL-6R:n läsnä ollessa voimakas synoviaaliso-15 lukasvuvaikutus.

(2) Synoviaalisoluja (3 x 103/kolo) viljeltiin riittävän määrän IL-J5 läsnä ollessa IL-6:n (0,1 ng/ml), 100 ng/ml SIL-6R ja 25 pg/ml IL-6-vasta-ainetta tai 25 μg/ml IL-6R-vasta-ainetta 20 tuottamiseksi. 72 tuntia viljelemisen aloittamisen jälkeen 3H-tymidiiniä lisättiin jokaiseen koloon 1 μΟϊ:1ιβη/^ο1ο ja sen jälkeen kun viljely oli päättynyt, solujen radioaktiivisuus mitattiin tuikelaskijalla. Tulokset on esitetty kuviossa 2.

* IL-6-vasta-aineen tai IL-6R-vasta-aineen lisääminen tukahdutti * 1 *" 25 täydellisesti sIl-6R:n lisäämän synoviaalisolujen kasvun.

·« · • · · · * ] (3) Synoviaalisoluja (3 x 103/kolo) viljeltiin 100 ng/ml:n IL- i 1" 6, (Genzyme Co:n tuote), 100 ng/ml SIL-6R ja 25 μg/ml IL-6- • · 1 \· · vasta-ainetta tai lL-6R-vasta-ainetta, jotka saatiin edellä 30 mainituissa viite-esimerkeissä, läsnä ollessa. 72 tuntia vil-:T: jelemisen aloittamisen jälkeen 3H-tymidiiniä lisättiin jokai- .2. seen koloon 1 μΟΐιίίθη^οΙο ja sen jälkeen kun viljely oli • · a ,1. päättynyt, solujen radioaktiivisuus mitattiin tuikelaskijalla.

• 1 1 *;[;1 Tulokset on esitetty kuviossa 3. IL-6-vasta-aineen tai IL-6R- • 1 *···1 35 vasta-aineen lisääminen tukahdutti täydellisesti sll-6R:n li- ·1; säämän synoviaalisolujen kasvun.

··· ♦ « · • · 2 • · · • · 5 24

Esimerkki 2 IL-6-reseptorivasta-aineen yllättävää vaikutusta nivelreuman syntyyn tutkittiin käyttäen hiiren nivelreumamallia.

Naudan tyypin II kollageeniliuosta (Collagen Technology Research Group) (4 mg/ml) liuotettiin 0,1 N etikan vesiliuokseen ja täydellistä apuainetta H37Ra (DIFCO) sekoitettiin ekviva-lenttisina määrinä apuaineen valmistamiseksi. 100 μΐ apuai-10 netta injektoitiin ihonalaisesti 8-9-viikkoisen naaras-DBA/1J-hiiren (Charles River Japan) hännän juureen. Toiset 100 μΐ injektoitiin 20 päivää myöhemmin dorsaali-ihon alle nivelreuman indusoimiseksi.

15 Hiiren IL-6-reseptorivasta-ainetta MR16-1 annettiin suonensisäisesti 2 mg per hiiri ensimmäisen kollageeniherkistyksen jälkeen ja kuhunkin hiireen injektoitiin sen jälkeen ihonalaisesti toiset 0,5 mg (n=5) joka viikko 7 viikon ajan. Verrokkina käytettiin samaa isotyyppiä olevaa anti-DNP-vasta-ainetta KH-5 20 (Chugai Seiyaku) (n=5).

Nivelreuman vakavuus arvioitiin perustuen nivelreumaindeksiin. Arviointi perustui 4 pisteskaalan kunkin raajan osalta, kaik- • · · · ,···, kiaan 16 kohtaan per yksilö. Arviointi standardi oli seuraava.

• · • · * „ . 25 • · · ***', 0,5: Eryteema havaittiin yhdessä kohtaa nivelessä.

1: Erytema havaittiin kahdessa kohtaa nivelessä tai havaittiin • · • *' jalkaterän punoittumista, mutta ei turpoamista.

• · · *.* * 2. Kohtalainen turvotus havaittiin.

30 3. Jalkaterän vakava turvotus havaittiin, mutta se ei yltänyt ί#ϊ : kaikkiin varpaisiin.

4: Havaittiin jalkaterän ja varpaiden vakava turpoaminen.

··· • · • · • · ·

Tulokset on esitetty taulukossa 4. Nivelreuman synty varhaisen • · *···* 35 vaiheen nivelreumasta tukahtui selvästi ryhmässä, jolle annet- jj*: tiin IL-6-reseptorivasta-ainetta, verrattuna ryhmään, jolle :**,· annettiin verrokki vasta-ainetta.

• · 25

Toisaalta tulokset antityypiin II kollageenivasta-ainetitterin mittauksesta hiiren veressä osoittivat merkittävää vähenemistä varhaisen vaiheen nivelreumassa ryhmässä, jolle oli annettu 5 IL-6-reseptorivasta-ainetta, verrattuna ryhmään, jolle annettiin verrokkivasta-ainetta (kuvio 5).

Hiiret tapettiin päivänä 35 kollageeni-immunisoinnin jälkeen ja takajalat kiinnitettiin 20-prosenttisella formaliinilla. 10 Sitten ne alistettiin demineralisäätiöön EDTA-liuoksessa (pH 7,6) ja vedenpoistoon alkoholilla. Sitten ne kiedottiin parafiiniin ja leikattiin 2 pm paksuiksi sektioiksi. Sektiot värjättiin hematoksyliinillä ja esoiinilla ja niitä havainnoitiin 125x-suurennoksella (kuvio 6) . Tuloksena rakeiskudoksen tun-15 keutuminen kudokseen ja luuhun, so. krooninen proliferatiinen synovitis, tukahtui ryhmässä, jolle annettiin IL-6-reseptori-vasta-ainetta verrattuna ryhmään, jolle annettiin verrokkivasta-ainetta.

20 IL-6 on sytokiini, joka indusoi b-solujen diffrentiaatiota vasta-ainetta tuottaviksi soluiksi. IL-6 myös edistää synovi-aalisolujen proliferaatiota IL-6-reseptorin läsnä ollessa. Koska anti-IL-6-reseptorivasta-aine tukahduttaa merkittävästi · · · ,···, hiiren kollageeninivelreumamalleissa anti-tyypin II kollagee- • · "I, 25 nivasta-ainetta päivinä 21 ja 35 kollageeniherkistyksen jäi- ***'. keen verrattuna ryhmään, jolle on annettu verrokkivasta-ai- * netta, uskotaan, että anti-IL-6-reseptorivasta-aineen aiheut- • · • ** tama vasta-aineen tuotannon inhibitio on yksi tekijä, joka on ··· • · *.* * vastuussa nivelreumaa tukahduttavasta vaikutuksesta. Lisäksi 30 vaikka mitään vasta-aineen tuotannon tukahtumista ei havaittu «·« ϊ#ί ί päivänä 49 kollageeniherkistyksen jälkeen, se seikka, että jopa tänä aikana ilmeni nivelreuman synnyn sopivaa tukah- ·♦· duttavaa vaikutusta ja että nilkkaluuta ympäröivän kudoksen • · · HE-värjäys osoitti tukahtunutta rakeiskudoksen invaasiota rus- • · *···* 35 toon ja luuhun ryhmässä, jolle oli annettu anti-IL-6-resepto- • · jj : rivasta-ametta, verrattuna verrokkiryhmään, synovi aa li kasvua :*·.· tukahduttavan vaikutuksen uskotaan myös osallistuvan nivelreu- • t 26 maa inhiboivaan vaikutukseen.

Teollinen käyttö 5 Kroonista nivelreumaa sairastavista potilaista peräisin olevat synoviaalisolut proliferoivat sekä IL-6:n että sIL-6R:n läsnä ollessa. Se seikka, että kroonista nivelreumaa sairastavien potilaiden synoviaalineste sisältää riittävän määrän IL-6 ja SIL-6R synoviaalisolujen kasvun indusoimiseksi, osoittaa, että 10 IL-6:n aiheuttama signaalin siirto liittyy synoviaalisolujen epänormaaliin kasvuun kroonisessa nivelreumassa.

Täten on osoitettu vakuuttavasti, että kroonisen nivelreuman hoito, jonka vaikuttavana komponenttina on esillä olevan kek-15 sinnön mukainen IL-6-antagonisti, tukahduttaa synoviaalisolujen kasvun potilaissa, joilla on krooninen nivelreuma, IL-6:n ja sIL-6R:n läsnä ollessa ja siten sillä on terapeuttista vaikutusta kroonista nivelreumaa vastaan. Näin ollen keksinnön mukainen IL-6-antagonisti on käyttökelpoinen terapeuttisena 20 aineen kroonisessa nivelreumassa, jossa esiintyy synoviaalisolujen epänormaalia kasvua.

·· · »··· »·· • · • · • « 1 #··· • t • · • · • · · • · · • · t • < · • ·· « · · • · · • 1 • · ··« * • 1 • · · • · · • · ·2 • · • · ··» • · • · · f « · *·· · « • · « • · 2 • 1

Claims (13)

1. Interleukiini-6-antagonistin käyttö farmaseuttisen 5 koostumuksen valmistamiseksi, joka koostumus on tarkoitettu nivelreuman hoitamiseksi, tunnettu siitä, että interleukiini-6-antagonisti on interleukiini-6-reseptorin vastainen vasta-aine.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että koostumuksen sisältämä interleukiini-6-antagonisti on tarkoitettu tukahduttamaan kroonisessa nivelreumassa esiintyvän synoviaalisolujen epänormaalin kasvun.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu interleukiini-6-reseptori on ihmisen interleu-kiini-6-reseptori.

4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 20 että mainittu vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.

5. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, ,·. että mainittu vasta-aine on PM-1 vasta-aine, joka on viite- *“1 esimerkissä 3 kuvattu PM-1 vasta-aine. V 25 ·#· ··1· 6. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, * 1 että mainittu vasta-aine on kimeerinen vasta-aine. ·· • · • e· ··· !,·' ! 7. Patenttivaatimuksen 1 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 30 että mainittu vasta-aine on modifioitu ihmisen PM-1 vasta- :1·1: aine, joka on viite-esimerkissä 3 kuvattu PM-1 vasta-aine. * e·· ♦ » * · ··· .·. 8. Interleukiini-6-antagonistin käyttö koostumuksen • · · *·1·1 valmistamiseksi, joka koostumus on tarkoitettu e1· 35 synoviaali solujen epänormaalin kasvun inhiboimiseksi ;1· nivelreumassa, tunnettu siitä, että interleukiini-6-anta- • · · 1 : gonisti on interleukiini-6-reseptorin vastainen vasta-aine. • S

9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu interleukiini-6-reseptori on ihmisen interleu-kiini-6-reseptori. 5

10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on monoklonaalinen vasta-aine.

11. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, 10 että mainittu vasta-aine on PM-1 vasta-aine, joka on viite- esimerkissä 3 kuvattu PM-1 vasta-aine.

12. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on kimeerinen vasta-aine. 15

13. Patenttivaatimuksen 9 mukainen käyttö, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aine on modifioitu ihmisen PM-1 vasta-aine, joka on viite-esimerkissä 3 kuvattu PM-1 vasta-aine.

2. Patentkrav