KR100306517B1

KR100306517B1 - 인터루킨-6안타고니스트를유효성분으로하는만성류마티스관절염치료제

Info

Publication number: KR100306517B1
Application number: KR1019970702209A
Authority: KR
Inventors: 다다미쓰 기시모토; 마사히코 미하라; 요이치로 모리야; 요시유키 오스기
Original assignee: 나가야마 오사무; 쥬가이 세이야쿠 가부시키가이샤; 다다미쓰 기시모토
Priority date: 1994-10-07
Filing date: 1995-06-07
Publication date: 2001-11-30
Also published as: LU92048I2; CA2201781C; NO321089B1; NO2018017I1; WO1996011020A1; FI971404A; EP2077120A3; JPH08208514A; CZ103497A3; PL319574A1; HU223602B1; CN101361972B; CN101361972A; CN101601861A; DK0783893T3; NO2009009I2; NO2009009I1; NO971546D0; RU2147443C1; FI971404A0

Abstract

본 발명은 활막 세포 증식 억제제, 또는 상기 활막 세포 증식 억제제를 함유하는 만성 류마티스 관절염 치료제에 관한 것이다.

본 발명에 따른 만성 류마티스 관절염 치료제 또는 활막 세포 증식 억제제는 유효성분으로서 인터루킨-6항체 또는 인터루킨-6 수용체 항체 등의 인터루킨-6 안타고니스트를 함유한다.

Description

[발명의 명칭]

인터루킨-6안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염 치료제

[발명의 분야]

본 발명은 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염 치료제 또는 활막 세포 증식 억제제에 관한 것이다.

[배경기술]

만성 류마티스 관점염은 관절 내에서 활막 조직 등의 결합 조직의 비정상적 인 증식이 일어나는 전신성 만성 염증 질환이다(Melnyk et al., Arthritis Rheum. 33: 493-500, 1990). 만성 류마티스 관절염 환자의 관절에서는 활막 세포의 현저한 증식, 활막 세포의 비정상적인 증식으로 인한 다층 구조의 생성(pannus 생성), 활막세포의 연골 조직 및 골 조직으로의 침윤, 활막조직으로의 혈관 신생, 및 임파구와 대식세포 등의 염증 세포의 침윤 등이 관찰된다. 만성 류마티스 관절염의 발병 메카니즘은 유전, 박테리아성 감염 및 다양한 사이토킨과 성장인자 관여 등의 인자에 기초하는 것으로 보고되어 있지만, 발병의 총체적인 메카니즘은 여전히 불분명하다.

최근, 만성 류마티스 관절염 환자의 활막과 활액에서 인터루킨-1(IL-1), 인터루킨-8(IL-8), 종양괴사인자 α(TNF α),형질전환 성장인자 β(TGF β),섬유아세포 성장인자(FGF)및 혈소판에서 유도된 성장인자(PDGF)등의 사이토킨과 성장인자가 검출되었다(Nouri et al., Clin. Exp. Immunol. 55: 275-372, 1984; Thornton et al., Clin. Exp. Immunol. 86: 79-86, 1991; Saxne, et al., Arthritis Rheum. 31: 1041-1045, 1988; Seitz et al., J. Clin. Invest. 87: 463-469, 1991; Lafyatis et al., J. Immunol. 143: 1142-1148, 1989; Melnyk et al., Arthrtis Rheum.33: 493-500, 1990).

특히 IL-1, TNFα및 PDGF는 강력한 활막 세포 성장인자인 것으로 여겨지고 있다(Thornton et al,, Clin. Exp. Immunol. 143: 1142-1148, 1989; Giller et al., Immunology 66: 196-200, 1989). 또한, 인터루킨-1과 종양괴사인자의 자극에 의해 활막 세포가 인터루킨-6를 생산하는 것으로 추측된다(Ito et al., Arthritis Rheum.35: 1197-1201, 1992).

인터루킨-6은 B-세포 자극인자 2 또는 인터페론 β2로 알려진 사이토킨이다. 인터루킨-6은 B 임파구계 세포의 활성화에 관여하는 분화인자로서 발견되었고(Hirano T. et al., Nature 324,73-76,1986), 그 후 다양한 세포의 작용에 영향을 미치는 다기능성 사이토킨인 것으로 밝혀졌다(Akira, S. et al., Adv. In Immunology 54, 1-78, 1993). 2개의 작용적으로 상이한 막 분자가 인터루킨-6 활성을 유도하는데 필요한데, 이들 중 하나는 인터루킨-6에 특이적으로 결합하는 분자량이 약 80KD인 인터루킨-6 수용체(IL-6R)이다.

인터루킨-6R은 세포막을 관통하여 세포막 상에 발현되는 막 결합형 이외에, 주로 그 세포외 영역으로 이루어진 가용성 인터루킨-6R(sIL-6R)로서도 존재한다. 또다른 단백질은 비리간드 결합성 이지만 시그널 전달에 관여하는 분자량이 약 130 KD인 gp130이다. 인터루킨-6과 인터루킨-6R은 IL-6/IL-6R 복합체를 형성한 다음, 다른 하나의 막 단백질 인 gp130과 결합함으로써 인터루킨-6의 생물학적 활성 이 세포로 전달된다(Taga et al., J. Exp. Med. 196:967, 1987).

만성 류마티스 관절염 환자의 혈청 또는 활액에는 과량의 인터루킨-6와 가용성 인터루킨-6 수용체가 존재하는 것으로 보고되었고(Houssiau et al., Arthritis Rheum. 31 : 784-788, 1988; Hirano et al., Eur. J. Immunol. 18: 1797-1801, 1988; Yoshioka et al,, Japn. J. Rheumatol. In press), 류마티스 관절염의 동물 모델에서도 유사한 결과가 얻어졌기 때문에(Takai et at., Arthritis Rheum. 32: 594-600, 1989; Leisten et al., Clin. Immunol. Immunopathol. 56: 108-115, 1990), 인터루킨-6가 어느 정도 만성 류마티스 관절염에 관련된 것으로 추측된다.

그러나, 일본 특허공개 제4-89433호에는 인터루킨-6 생성을 강력하게 촉진하는 펩티드가 만성 류마티스 관절염의 치료에 유효한 것으로 기재되어 있다.

또한, Higaki 등은 만성 류마티스 관절염 환자의 활막 세포가 인터루킨-6에 대하여 낮은 성장 반응을 가지므로, 인터루킨-6이 활막 세포의 성장에 대해 억제 작용을 가지는 것으로 추측하였다(Clinical Immunology,22:880-887, 1990). 그러므로, 인터루킨-6과 만성 류마티스 관절염 간의 연관성에 대한 상반되는 보고가 존재하여, 그 연관성은 여전히 불명확하다.

최근, Wendling등은 만성 류마티스 관절염 환자에게 항인터루킨-6항체를 투여하여 임상적, 생물학적 증상이 일시적으로 완화되면서 혈청 중의 인터루킨-6의 농토가 증가하였음을 보고하였다(J. Rheumatol.20: 259-262, 1993).

상기한 보고에서는 인터루킨-6가 만성 류마티스 관절염 활막 세포의 성장을 촉진하는지 또는 억제효과를 가지는지에 대한 어떠한 데이타도. 제공하지 않고 있어서 인터루킨-6이 만성 류마티스 관절염 환자의 활막세포에 대하여 직접적인 영향을 미치는지는 여전히 불분명하다.

[발명의 요약]

류마티스 관절염 치료제로서는 코르티코스테로이드 등의 항염증성 스테로이드제가사용되어 왔으나, 이러한종류의 치료제를 장기적으로 사용하는 것은 피부 조직의 손상 및 부신 피질의 작용을 억제하는 등의 바람직하지 않은 부작용을 유발하기 때문에 부작용이 적은 약물이 연구되어 왔다.

본 발명의 목적은 상기한 단점을 가지지 않는 신규한 만성 류마티스 관절염 치료제를 제공하는 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염에서 활막 세포의 비정상적인 증식을 억제하는 제약 조성물과, 상기한 작용을 가지는 만성 류마히스 관절염의 처치를 위한 제약 조성물을 제공한다.

본 발명자들은 류마티스 관절염에서 유래한 활막 세포에 대한 인터루킨-6의 역할을 예의 연구하여 왔으나, 인터루킨-6 만으로는 만성 류마티스 관절염 유래의 활막세포의 증식이 확인되지 않으므로 인터루킨-6이외의 인자에 대하여 연구한 결과, 인터루킨-6단독으로는 활막세포의 증식 작용을 거의 나타내지 않는 반면, 인터루킨-6와 가용성 인터루킨-6 수용체의 공존 하에서는 강력한 활막세포 증식 작용이 발생하며,또한 이 활막세포 증식 작용이 인터루킨-6항체 또는 인터루킨-6수용체 항체 등의, 인터루킨-6활성을 억제하는 안타고니스트를 첨가하여 억제되는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되 었다.

본 발명은 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로 함유하는 활막 세포의 비정상적인 증식을 억제하는 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물에 관한 것이다. 본 발명은 또한 인터루킨-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 활막 세포 증식 억제제에 관한 것이다.

[도면의 간단한 설명]

제1도는 IL-6 만 또는 sIL-6R 만의 존재 하에서, 그리고 IL-6와 sIL-6R의 공존하에서 활막 세포 내로의³H-티미딘의 흡수를 나타낸 그래프이고,

제2도는 IL-1β와 sIL-6R의 공존 하에서 활막 세포 내로의³H-리미딘의 흡수에 대한 IL-6항체 또는 IL-6R항체의 효과를 나타낸 그래프이고,

제3도는 IL-6와 sIL-6R의 공존 하에서 활막 세포 내로의³H-티미딘의 흡수에 대한 IL-6 항체 또는 IL-6R항체의 효과를 나타낸 그래프이고,

제4도는 마우스의 콜라겐으로 유발된 관절염 모델의 발병에 대한 IL-6R항체의 억제 효과를 나타낸 그래프이고,

제5도는 관절염이 있는 마우스에서 혈청 항콜라겐 항체 농도를 나타낸 그래프이며,

제6도는 콜라겐성 관절염이 있는 마우스의 뒷발관절의 조직 병리학적 시험 사진이다. 상기에서

제6(a)도는 IL-6 수용체 항체가 투여된 군의 마우스에서 얻어진 사진이며,

제6(b)도는 대조용 항체가 투여된 군의 마우스로부터 얻어진 사진이다. IL-

6수용체 항체가 투여된 군에 있어서, 연골과 뼈 내로의 육아 조직의 침윤(만성증식성 활막염)이 분명히 억제되었다.

[발명의 상세한 설명]

본 발명에 따른 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물은 만성 류마티스 관절염 환자에게 투여하였을 때 관절 내의 활막 세포의 증식을 억제하며 그 증상에 대한 완화 효과 및 치료효과를 가지는 약제이다.

본 발명에 따라 사용되는 IL-6 안타고니스트는 IL-6 시그널 전이를 차단하고 IL-6의 생물학적 활성을 억제하는 어떠한 물질로부터도 유도될 수 있다. IL-6안타고니스트에는 IL-6 항체, IL-6R 항체, gp130 항체, 변성된 IL-6, 안티센스 IL-6a 및 IL-6 또는 IL-6R의 펩티드 일부 등이 포함된다.

IL-6항체, IL-6R항체 또는 gp130항체 등의 본 발명에 따른 안타고니스트로 사용되는 항체는 유래나 종류(모노클로날, 폴리클로날)가 제한되지 않지만, 포유동물에서 유도된 모노클로날 항체가 특히 바람직하다 이러한 항체들은 IL-6, IL-6R 또는 gp130과 결합하여 IL-6과 IL-6R, 또는 IL-6R과 gp130 간의 결합을 억제하여 IL-6 시그널의 전이를 차단하여 IL-6의 생물학적 활성온 억제한다.

모노클로날 항체를 생산하는 세포의 동물종은 포유동물이라면 특별히 제한되지는 않으며, 사람의 항체 또는 사람 이외의 포유동물로부터 유도된 항체가 사용될 수 있다. 사람 이외의 포유동물로부터 유도된 모노클로날항체는 제조가 용이한 토끼 또는 설치류로부터 유토된 모노클로날 항체가 바람직하다. 설치류에 대한 특별한 제한은 없으며, 예를들면 마우스, 래트 및 햄스터 등이 있다.

항체들 중 IL-6 항체로서는 MH166(Matsuda et al., Eur. J. Imrnunol. 18: 951-956, 1988) 및 SK2 항체(Sato et al., Journal for the 21st General Meeting of the Japan Immunology Association, 21 : 116, 1991)가 있다. IL-6R 항체의 예로는 PM-1 항체(Hirata et al., J, Immunol. 143: 2900-2906, 1989), AUK12-20 항체, AUK64-7 항체 및 AUK146-15 항체(국제 특허공개 제 WO92-19759호)가 있다. gp130 항체의 예로는 AM64 항체(일본 특허공개 제3-219894호)가 있다.

바람직하기로는 PM-1 항체 이다.

모노클로날항체는 종래 기술에 기초한다음 방법에 의해 제조될 수 있다. 즉, IL-6, IL-6R 또는 gp130을 감작 항원으로서 사용하여 통상의 면역 방법에 따라서 면역하고, 얻어진 면역 세포를 일반적인 세포융합법에 의해 이미 알려진 모세포와 융합시킨 다음, 일반적인 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체 생산 세포를 스크리 닝하여 항체를 제조한다.

구체적으로는, 모노클로날 항체는 이하의 방법으로 제조할 수 있다. 예를 들면, 상기 감작 항원이 사람의 IL-6일 경우, 항체는 Hirano et al.. Nature,324: 73, 1986에 기재된 사람의 IL-6의 유전자 서열을 이용하여 얻어진다. 사람의 IL-6 유전자 서열을 공지의 발현 벡터계에 삽입하고 적당한 숙주 세포를 형질전환시킨 다음, 목적하는 IL-6단백질을 상기 숙주 세포로부터 또는 배양 상징액으로부터 정제하고 정제된 IL-6 단백질을 감작 항원으로서 사용한다.

사람의 IL-6R의 경우, IL-6R단백질은 유럽 특허출원 제EP325474호에 기재된 유전자 서열을 이용하여 상기한 사람의 IL-6과 동일한 방법으로 얻을 수 있다. IL-6R은 세포막 상에 발현되는 것과 세포막으로부터 분리되는 가용성 형태(sIL-6R)의 2종류가 있다. sIL-6R은 세포막에 부착하여 있는 IL-6R의 세포외 영역으로 주로 이루어지며, 이것은 세포막투과 영역 또는 세포막투과 영역과 세포내 영역이 없다는 점에서 막 결합 IL-6R과 다르다.

사람의 gp130의 경우, gp130단백질은 유럽 특허출원 제EP411946호에 기재된 유전자 서열을 이용하여 상기한 사람의 IL-6와 동일한 방법으로 얻을 수 있다.

감작 항원으로 면역되는 포유동물은 특별히 제한되는 것은 아니나, 세포융합에 사용되는 모세포와의 적합성을 고려하여 선택되는 것이 바람직한데, 일반적으로 마우스, 래트, 햄스터 및 토끼 등이 사용될 수 있다.

감작 항원으로 동물을 면역하는 것은 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 예를들면, 공지된 방법에는 감작 항원을 포유동물의 복강내로 또는 피하로 주사하는 방법이 있다. 구체적으로는, 감작 항원을 바람직하게는 PBS(포스페이트 완충액 식염수) 또는 생리 식염수 등으로 희석하고 현탁하여, 필요하타면 프로인트(Freund)의 완전 보조제 등의 통상적인 보조제 적량과 함께 사용하여 포유동물에게 4 내지 21일 동안 매일 수회씩 투여한다. 감작 항원으로 면역하는 동안 적당한 담체를 사용할 수 있다.

이렇게 면역하고 목적하는 항체의 증가된 혈청 농도를 확인한 후, 면역세포를 포유동물로부터 취하여 세포 융합에 공급하는데, 특히 바람직한 면역세포로는 비장 세포가 있다.

상기한 면역 세포와의 융합을 위한 모세포로는 포유동물로부터 유래된 골수종 세포를 사용할 수 있고, 이미 알려진 다양한 세포주들이 적당하게 사용될 수 있는데, 예를들면 P3 (P3×63Ag8.653) (J. Immunol. 123:1548, 1978), p3-U1(Current Topics in Microbiology and Immunology 81 : 1-7, 1978), NS-1 (Eur. J. Immunol. 6: 511-519, 1976), MPC-11 (Cell, 8: 405-415, 1976). Sp2/0 (Nature, 276: 269-270, 1978), Of(J. Immunol. Meth. 35: 1-21, 1980), S194 (J. Exp. Med. 148:313-33), 1978), R120 (Nature, 277: 131-133, 1979). 골수종 세포와 면역세포의 세포 융합은, Milstein 등의 방법(Methods Enzymol. 73: 3-46, 1981)과 같은 공지의 방법으로 실시할 수 있다.

구체적으로는, 상기한 세포 융합은 세포 융합 프로모터의 존재 하에서 통상적인 영양 배양액 중에서 실시할 수 있다. 사용되는 융합 프로모터는, 예를들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 또는 Sendai 바이러스(HVJ) 등이며, 필요하다면 디메틸설폭시드 등의 보조제를 첨가하여 융합 효율을 증가시킬 수 있다.

면역 세포와 골수종 세포의 비율은 골수종 세포에 대하여 면역 세포를 1 내지 10배 사용하는 것이 바람직하다. 세포 융합에 사용되는 배양 배지로는, 예를 들면 골수종 세포주의 증식에 적당한 RPMI1640 배양 배지 또는 MEM 배양 배지나 또는, 상기한 세포를 배양하는데 이용되는 다른 통상적인 배양 배지가 사용될 수 있으며, 송아지 태아 혈청(FCS) 등의 보충 혈청을 함께 사용할 수 있다.

세포 융합은 상기한 배양 배지 중에서 미리 결정된 양의 면역 세포와 골수종 세포를 완전히 혼합하고, 예를들면 평균 분자량이 1000내지 6000인 PEG를 함유하는, 약 37℃로 예열된 PEG 용액을 일반적으로 30 내지 60% (w/v)의 농도로 배양 배지에 첨가한 다음, 혼합하여 목적하는 융합된 세포(하이브리도마)를 생성한다. 다음으로, 적당한 배양 배지를 단계적으로 첨가하고 상징액을 제거하기 위한 원심분리 과정을 반복하여 하이브리도마의 증식에 불리한 세포 융합제 등을 제거한다.

적당한 하이브리도마를 HAT 배양 배지(하이포크산틴, 아미노프테린 및 티민을 함유하는) 등의 통상의 선택 배양 배지에서 배양하여 선택한다. HAT 배양 배지에서의 배양은 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 제거되기에 충분한 주어진 시간 동안, 일반적으로는 수일 내지 수주 동안 계속한다. 다음으로 일반적인 한계희석법을 실시하고, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하여 모노클로닝한다.

상기 방법으로 제조된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 일반적인 배양액에서 계대배양할수 있고, 또한 이들은 액체 질소 하에서 잠기간 저장할 수 있다.

하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 얻기 위하여는 종래의 방법에 따라 하이브리도마를 배양한 후 배양 상징액을 회수하거나, 또는 하이브리도마를 적합성이 있는 포유동물에 주입하여 증식하고 그 복수액을 얻는 방법이 이용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 얻는데 적당하고, 후자의 방법은 항체의 대량 생산에 적당하다.

상기한 방법들로 얻어진 모노클로날 항체는 염 석출법, 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피 등의 일반적인 정제방법을 이용하여 고순도로 정제할수 있다.

상기 방법으로 제조된 모노클로날 항체는 방사면역에세이(RIA), 효소 결합 면멱에제이(EIA, ELISA), 형광 항체법(Immunofluorescence 분석) 등의 통상적인 면역학적 방법에 의해 항원에 대하여 고감도 및 고순도로 인지하는 것을 확인할 수 있다.

본 발명에 따라 사용되는 모노클로날 항체는 하이브리도마에 의해 제조된 모노클로날 항체에 제한되지는 않으며, 이들은 사람에 대한 이종 항원성을 저하시키기 위해 인공적으로 변성된 것 일 수 있다. 예를들면, 마우스 등의 사람 이외의 포유동물의 모노클로날 항체의 가변 영역과 사람 항체의 정상 영역으로 이루어진 키메라 항체를 사용할 수 있고, 이러한 키메라 항체는 종래의 키메라항체 제조 기술, 특히 유전자 재조합 기술에 의해 제조될 수 있다.

재구성 사람 항체도 본 발명에서 사용될 수 있다. 이들은 마우스 또는 기타 사람 이외의 포유동물 항체의 상보성 결정 영역으로 사람 항체의 상보성 결정 영역을 대체하여 제조될 수 있는데, 이들에 대한 일반적인 유전자 재조합 방법은 잘 알려져 있다. 본 발명에 유용한 재구성 사람 항체를 얻기 위하여 종래의 방법 중 하나를 사용할 수 있다. 상기한 재구성 사람 항체 중 바람직한 일예로는 hPM-1(국제 특허공개 제WO92-19759호)이 있다.

필요한 경우, 재구성 사람항체의 상보성 결정 영역이 적당한 항체 결합부위를 형성하도록 항체의 가변 영역의 구조(FR) 영역의 아미노산을 치환할 수 있다(Sato et al., Cancer Res. 53: 851-856, 1993). 또한, 상기한 목적은 항원에 결합하여 IL-6의 활성을 억제하는 항체의 절편. 예를들면 Fab 또는 Fv. 또는 H 및 L 사슬의 Fv가 적절한 링커에 의해 결합되어 있는 단일 사슬 Fy(scFv)를 코드하는 유전자를 구성하고 이를 적당한 숙주 세포 내에서 발현하는데 사용하여 얻어 질 수 있다(e.g., Bird et al., TIBTECH, 9: 132-137, 1991; Huston et al.. Proc. Natl. Acad. Sci, USA,85:5879-5883, 1988).

본 발명에 따른 변성된 IL-6은 Brakenhoff et al., J. Biol. Chem. 269: 86-93, 1994또는 Savino et al., EMBO J. 13: 1357-1367, 1994에 기재된 것일 수 있다.

사용되는 변성된 IL-6은 IL-6R과의 결합 활성을 유지하고 IL-6 시그널 전이 작용을 제거하기 위해 IL-6아미노산 서열 내에 치환, 결실 또는 삽입 등의 변이를 일으켜 얻어질 수 있다. IL-6공급원으로는 상기한 특성을 가지는 한 어떠한 동물종도 가능하지만, 항원성 측면에서 사람에서 유도된 것이 바람직하다.

구체적으로, IL-6 아미노산 서열의 2차 구조는 WHATIF(Vriend et al., J. Mol. Graphics, 8: 52-56, 1990) 등의 공지의 분자 모델 프로그램을 이용하여 예측하여, 전체 구조에 대한 변이된 아미노산 잔기의 영향을 평가할 수 있다. 적절한 변이 아미노산 잔기를 결정한 후, 사람 IL-6 유전자를 코드하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 벡터를 일반적으로 사용되는 PCR(폴리머라제 체인 반응) 밥법에 의해 변이를 삽입하기 위한 템플레이트로서 사용하여 변성된 IL-6를 코드하는 유전자를 얻는다. 다음으로, 이것을 필요하다면 적당한 발현 벡터와 결합하여 E. coli 세포 또는 포유동물 세포에서 발현시키고, 배양 상징액 중에서 또는 통상의 방법으로 단리 및 정제한 후, IL-6R에 대한 결합 활성과 중화된 IL-6 시그널 전달 활성을 평가한다.

본 발명에 따라 사용되는 IL-6 부분 펩티드 또는 IL-6R 부분 펜티드로는 IL-6R또는 IL-6 각각과 결합하고 IL-6 활성 전이 작용을 가지지 않는 어떠한 서열도 가능하다. IL-6 부분 펩티드와 IL-6R 부분 펩티드는 미국 특허 제5210075호에 기재된 것이 있다. IL-6 안티센스 올리고뉴클레오티드는 일본 특허출원 제5-300338호에 기재되어 있다.

본 발명에 따른 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물은 IL-6 시그널 전달을 차단하고 IL-6에 의해 유도된 활막 세포의 비정상적인 증식을 억제한다면 그 질병에 관련된 만성 류마티스 관절염의 처치에 유효하다. 실시예 1에는 류마티스 환자에서 유도된 활막 세포에 대한 생체외 증식 억제 효과를 나타내었다. 실시예 2에서는 IL-6수용체 항체가 타입 II 콜라겐으로 면역된 마우스 관절염 모델에 투여되었고, 관련 데이타는 (1) 관절염 인덱스에 기초한 관절염의 발병 억제 (제4도), (2) 콜라겐으로 면역된 마우스의 혈액 중에서 항-타입 II 콜라겐 항체 생산의 억제 (제5도), 및 (3) IL-6 수용체 항체를 투여한 마우스 관절염 모델의 뒷발 관절의 연골과 뼈 내로의 육아 조직 침윤(만성 증식성 활막염)의 억제(제6도)를 나타낸다.

상기 (1)과 (2)와 관련하여, 이 결과로부터 IL-6 수용체 항체에 의한 억제 효과가 특히 초기에 마우스 모델에서 관절염의 발병에 대하여 확인된다. (3)의 결과는 연골과 뼈 조직으로의 육아 조직의 침윤이 억제되는 것을 증명하는 것으로, 이것은 실시예 1(활막 세포 증식의 생체 외 억제)에서 얻어진 결과를 뒷받침한다.

(1)과 (2)의 실험 결과는 본 발명의 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물이 류마티스 관절염에 대하여 우수한 초기 효과를 가지는 것을 나타낸다.

본 발명의 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물은 비경구적으로, 예를들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사 또는 피하 주사 등에 의해 전신 또는 국소적으로 투여되는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 제약 조성물은 1 종이상의 의약적 담체 또는 희석제와 함께 의약적 제형 키트의 형태로 제공될 수 있다.

본 발명에 따른 만성 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물의 투여량은 사람에게 투여할 경우 환자의 병리학적 상태와 연령, 투여 방법 등에 따라 변화시켜 적당한 투여량을 선택하여야 한다. 예를들면, 환자당 1 내지 1000 mg 범위에서 4회 까지의 분할량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 류마티스 관절염 치료제는 상기한 투여량에 제한되지 않는다.

본 발명의 류마티스 관절염 처치용 제약 조성물은 일반적인 방법에 따라 제형화될 수 있다. 예를들면, 주사제는 생리 식염수 또는 완충액 등의 용매에 정제된 인터루킨-6 안타고니스트를 용해하고, 트윈 80, 젤라틴, 사람 혈청 알부민(HSA)등의 흡착방지제를 첨가하여 제조하고, 사용하기 전에 용해 재구성하기 위해 상기 혼합물을 동결건조할 수 있다. 동결건조에 사용되는 부형제로는 만니톨 또는 글루코스 등의 슈거 알코올, 또는 사카라이드가 있다.

[실시예]

이하에서는 실시예, 참고예 및 실험예에 의하여 본 발명을 디욱 상세히 설명하였으나, 본 발명이 다음에 제한되지는 않는다.

[참고예 1]

[사람의 가용성 IL-6 수용체의 제조]

Yamasaki등의 방법(Scienece, 241 :825-828. 1988)에 따라 얻어진 사람의 IL-6 수용체(IL-6R)을 코드하는 cDNA를 함유한 플라스미드 pBSF2R.236을 사용하여 PCR(폴리머라제 체인 반응) 방법에 의해 가용성 IL-6R을 제조하였다(Yasukawa et al., J. Biochem. 108:673-676, 1990).

상기 플라스미드 pBSF2R.236을 제한효소 SphI로 소화시켜 IL-6R cDNA 절편을 얻고, 이것을 mp18(Amersham Co.)에 삽입하였다. IL-6R cDNA에 종료 코돈을 도입하기위해 고안된 합성 올리고프라이머 ATATTCTCTAGAGAGATTCT를 사용하여 시험관내 돌연변이 유발 시스템(Amersham Co.)에 의해 PCR 방법으로 IL-6R cDNA내에 돌연변이를 유도하였다. 이 방법에 의해 종료 코돈이 아미노산 345의 위치에 도입되고, 가용성 IL-6R(sIL-6R)을 코드하는 cDNA를 얻었다.

CHO 세포내에서 sIL-6R cDNA를 발현하기 위해, 디히드로폴레이트 환원 효소(dhfr)를 코드하는 cDNA를 제한효소 PvuI 절단 부위에 삽입시킨 플라스미드 pECEdhfr(Clauser et al., Cell, 45:721-735, 1986)에 HindIII-SalI로 절단한 상기 sIL-6R cDNA를 삽입하여 CHO세포 발현 플라스미드 pECEdhfr344를 얻었다.

10㎍의 플라스미드 pECEdhfr344를 dhfr-CHO 세포 라인 DXB-11(Urland et al., Proc. Natl. Acad. Sci, USA 77.4216-4220. 1980)으로 칼슘 포스페이트 침전법(Chen et al., Mol. Cell. Biol. 7:2745-2751, 1987)에 의해 트랜스팩트(transfection)하였다.

트랜스팩트된 CHO 세포들을 1mM 글루타민, 10% 투석 된 송아지 태아 혈청(FCS), 100U/㎖의 페니실린 및 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유한 뉴클레오시드가 없는 αMEM선택성 배양액에서 3주간 배양하였다. 선택된 CHO 세포들을 한계 희석법으로 선별하여 1개의 모노클로날 CHO세포 라인을 얻었다. CHO 세포 클론을 20nM 내지 200nM 농도의 메토트렉세이트(methotrexate)(MTX)로 증폭하여, 사람 sIL-6R을 생산하는 CHO 세포 라인 5E27을 얻었다.

CHO 세포 라인 5E27을 5% FCS를 함유한 이스코브(Iscove)의 개선된 둘베코 배양액(IMDM, Gibco Co. 제조)내에서 배양하고, 배양 상징액을 회수하고, 배양 상징액에서의 sIL-6R의 농도를 ELISA(Ellzynle-Linked Immunosorbent Assay) 방법에 의해 통상적인 방법에 따라 측정하였다.

[참고예 2]

[사람 IL-6 항체의 제조]

Matsuda 등의 방법(Eur, J. Immunol. 18:951-956, 1988)에 따라 사람의 IL-6 항체를 제조하였다.

10㎍의 재조합 IL-6(Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988)을 프로인트 완전 보조액과 함께 BALB/c 마우스를 면역시키고, 혈청에서 항-IL-6항체가 검출될 때까지 1주 간격으로 이것을 계속하였다.

국부 림프절에서 면역세포를 추출하고, 폴리에틸렌 글리콜 1500을 사용하여 골수종 세포 라인 P3U1과 융합하였다. 하이브리도마(hybridorma)를 HAT 배양액을 사용한 Oi등의 방법(세포 면역학에서 선택적 방법, W. H. Freeman and Co., San Francisco, 351, 1980)에 따라 선택하고, 사람 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마 라인을 설치하였다. 사람 IL-6 항체를 생산하는 하이브리도마를 다음의 방법으로 IL-6 결합 분석하였다.

특히, 연성 폴리비닐 96-웰 마이크로플레이트(Dynatech Lboratories, Inc. 제조, Alexandria, VA)를 4℃에서 0.1M 탄산염-수소 탄산염 완충용액(pH 9.6) 내에서 100㎕의 염소 항-마우스 Is 항체(10㎕/㎖, Cooper Biomedical, Inc. 제조, Malvern, PA)로 밤새 코팅하였다. 상기 플레이트를 100㎕의 1% 소혈청 알부민(BSA)을 함유한 PBS로 실온에서 2시간 처리하였다. 이것을 PBS로 세정한 뒤, 100㎕의 하이브리도마 배양 상징액을 각 웰에 첨가하고, 4℃에서 밤새 배양하였다.

플레이트를 세정하고 125_I로 표지한 재조합 IL-6을 각 웰에 2000cpu/0.5ng/웰이 되도록 첨가하고, 세정한 후에 각 웰의 방사활성을 감마 카운터(Beckman Gamma 9000, Beckman Instruments, Fullerton, CA)로 측정하였다. 216개의 하이브리도마 클론중에, 32개의 하이브리도마 클론이 IL-6 결합 분석에 대해서 양성이었다. 이들 클론 중에서 최종적으로 안정한 클론 MH166.BSF2를 얻었다. 상기 하이브리도마에 의해 생성되는 IL-6 항체 MH166은 IgGIK 서브타입을 갖는다.

IL-6-의존성 마우스 하이브리도마 세포 라인 MH60.BSF2(Matsuda et al., Eur. J. Immunol. 18:951-956, 1988)을 사용하여 MH166 항체에 의한 하이브리도마의 증식에 대한 중화 활성을 측정하였다. MH60.BSF2 세포를 1×10⁴/200㎕/웰의 양으로 분배하였고, MH166항체를 함유한 샘플을 여기에 첨가하고, 48시간 배양하고, 15.1 Ci/mmol의³H-티미딘(New England Nuclear, Boston MA)을 첨가한 뒤, 6시간 동안 계속 배양하였다.

세포를 글래스 필터지에 놓고 자동 하베스터(Labo Mash Science Co., Tokyo, Japan)로 처리하였다. 토끼 항-IL-6 항체를 대조로 사용하였다. 그 결과, MH166 항체는 MH60.BSF2 세포에 의한³H-티미딘 흡수를 투여량 제한적으로 억제하였다. 이것은 MH166 항체가 IL-6의 활성을 중화한다는 것을 나타낸다.

[참고예 3]

[사람의 IL-6 수용체 항체의 제조]

Hirata 등의 방법(J. Immunol., 143:2900-2906, 1989)에 의해 작성된 항-IL-6R 항체 MT18을 수반되는 지시에 따라, CNBr로 활성화된 세파로스 4B에 결합시키고, 결합된 착물을 IL-6R(Yamasaki et al., Science 241 :825-828, 1988)을 정제하기 위해 사용하였다.

사람의 골수종 세포 라인 U266을 1% 디기토닌(Wako Chemicals 제조), 10mM 트리에탄올아민(pH 7.8) 및 0.15M NaCl을 함유한 1mM p-파라아미노페닐메탄 설포닐플루오라이드 히드로클로라이드(Wako Chemicals 제조)(디기토닌 완충 용액)로 용해하고, 세파로스 4B 비드(bead)에 결합된 MT18 항체와 혼합하였다. 디기토닌 완충 용액으로 비드를 6번 세정하고, 면역에 사용하기 위한 부분적으로 정제된 IL-6R을 얻었다.

3×10⁹개의 U266세포로부터 얻은 상기 부분적으로 정제된 IL-6R로 BALB/c마우스를 10일마다 4번 면역시키고, 통상의 방법으로 하이브리도마를 작성하였다. 다음의 방법으로 IL-6결합 활성에 대해서 성장-양실 웰로부터 하이브리도마의 배양 상징액을 시험하였다. 5×10⁷개의 U266 세포를 35S-메티오닌(2.5mCi)으로 표지한 후, 상기 디기토닌 완충용액으로 용해하였다. 용해된 U266 세포를 세파로스 4B 비드에 결합된 MT18 항체 0.04㎖와 혼한하고, 디기토닌 완충용액으로 6번 세정한 후, 35S-메티오닌이 표시된 IL-6R을 디기토닌 완충 용액(pH 3.4) 0.25㎖로 유출시키고 0.025㎖의 1M 트리스(pH 7.4)로 중화하였다.

하이브리도마 배양 상징액 0.05㎖를 프로테인 G 세파로스(Pharmacia제조) 0.01㎖와 혼합하였다. 세정한 후에, 세파로스를 상기 제조한 35S로 표지된 IL-6R 0.005㎖로 배양하였다. 면역침강 물질을 SDS-PAGE로 분석하고, IL-6R과 반응한 하이브리도마 배양 상징액을 시험하였다. 그 결과, 반응-양성 하이브리도마클론 PM-1이 생성되었다. 하이브리도마PM-1에 의해 생성된 IL-6R항체 PM-1은 IgGIK 서브타입을 갖는다.

하이브리도마 PM-1이 생산하는 항체의 사람 IL-6R에 대한 IL-6의 결합 억제활성을 사람 골수종 세포 라인 U266을 사용하여 조사하였다. 사람 재조합 IL-6을 대장균으로(E. Coli)(Hirano et al., Immunol. Lett., 17:41, 1988) 제조하였고 볼톤-헌터 시약(New England Nuclear, Boston, MA)에 의해 125_I표지하였다(Taga et al., J. Exp. Med. 166:967, 1987).

4× 10⁵개의 U266 세포를 100배 과량의 표지되지 않은 IL-6의 존재하에서 1 시간 동안 실온에서 70% (v/v)의 하이브리도마 PM-1의 배양 상징액 및 14000cpm의 125_I가 표지된 IL-6과 함께 배양하였다. 70㎕의 샘플을 400㎕의 마이크로 퓨즈 폴리에틸렌 튜브 내에 넣어진 300㎕의 FCS에 덮어 씌우고, 원심분리한 후에 세포의 방사활성을 측정하였다.

그 결과, 하이브리도마 PM-1에 의해 생산되는 항체가 IL-6이 IL-6R에 결합하는 것을 억제하는 것이 증명되었다.

[참고예 4]

[사람의 IL-6 수용체 항체의 제조]

마우스 IL-6 수용체에 대한 모노클로날 항체를 일본 특허출원 제6-134617호에 기재된 방법에 의해 제조하였다.

Saito 등의 방법(J. Immunol.. 147. 168-173, 1993)에 따라, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 생성하는 CHO 세포를 10% FCS를 함유하는 IMDM 배양액 내에서 배양하고, 마우스 가용성 IL-6 수용체를 마우스 가용성 IL-6 수용체 항체 RS12(ibid. Saito et al. 참조)와 친화성 컬럼 고정 아피겔(Affigel) 10겔(Biorad)을 사용하여 배양 상징액으로부터 정제하였다.

얻은 마우스 가용성 IL-6 수용체 50㎍을 프로인트 완전 보조액과 혼합하고 위스타 래트(Nihon Charles River Co.)의 복막내로 주사하였다. 2주 후에 프로인트 완전 보조액과 함께 증강 면역법을 실시하였다. 45일째에 래트를 치사하여 이들의 약 2× 10⁸개의 비장 세포를 50% PEG1500(Berlinger Mannheim)를 사용하여 통상의 방법으로 1×10⁷개의 마우스 P3U1 골수종 세포와 함께 세포 융해에 사용하고, 이 후에 하이브리도마를 HAT 배양액으로 선별하였다.

하이브리도마 배양 상청을 토끼 항-래트 IgG 항체(Cappel Co.)로 코팅된 면역플레이트에 첨가한 후. 마우스 가용성 IL-6 수용체가 여기서 반응하였고, 마우스 가용성 IL-6 수용체에 대한 항체를 생성하는 하이브리도마를 토끼 항-마우스 IL-6 수용체 항체와 알칼리 포스페이트가 표시된 양 항-토끼 IgG를 사용하여 ELISA 방법으로 선별하였다. 항체 생성이 확인된 하이브리도마 클론을 단일한 하이브리도마 클론을 얻기위해 2번 서브스크린하였다. 상기 클론을 MR16-1로 명명하였다.

마우스 IL-6 시그널 인공적 항원변환에 대해 상기 하이브리도마에 의해 생성된 항체의 활성을 중화하는 것은 MH60.BSF2 세포(Matsuda et al., J. Immunol. 18,951-956, 1988)을 사용한³H-티미딘의 결합에 의해 조사되었고, MH60.BSF2 세포를 96-웰 플레이트에 1x10⁴세포/200㎕/웰로 첨가하고, 이어서 마우스 IL-6(10pg/㎖)과 MR16-I 항체 또는 RS12항체를 12.3 내지 1000ng/㎖로 첨가하고, 37℃에서 44시간 5% CO₂내에서 배양하고, 그 후에³H-티미딘(1μCi/웰)을 첨가하고 4시간후에 취하여 측정하였다. 그 결과, MR16-1 항체가 MH60.BSF2 세포에 의한³H-티미딘의 흡수를 억제하는 것을 함을 알게 되었다.

[실험예 1]

[만성 류마티스 관절염으로 유도된 활막 세포 라인의 구성]

(1) 활막 세포의 제조

만성 류마티스 관절염 환자의 관절을 외과 수술하는 중에 활막 조직을 얻었다. 활막 조직을 가위로 자르고 IMDM(Iscone의 개조된 Dulbecco 배지) 내에서 타입 I 콜라게나제(Sigma Chemical Co. 제조) 5mg/㎖와 소 췌장 DNase(Sigma Chemical Co.) 0.15mg/㎖로 37℃에서 1시간 동안 배양하여 효소적으로 분해하고, 체로 걸러 단일한 세포를 얻었다. 이렇게 얻은 세포들을 5% FCS를 함유하는 IMDM을 사용하여 배양 플라스크 내에서 밤새 배양한 후에, 비결합성 세포를 제거하여 활막세포를 얻었다. 활막세포를 3내지 6번 체질하고 다음의 실험에 사용하였다.

(2) 활막 세포에 의한 IL-6 제조

상기와 같이 하여 얻은 활막 세포를 5% FCS(Hyclone Laboratories Inc. 제조), 페니실린 G 10 U/㎖ 및 스트렙토마이신 100㎍/㎖를 함유하는 IMDM 배양액 내에서 3×10³세포/웰의 양으로 현탁시키고. 96-웰 마이크로타이터 플레이트(Falcon Co. 제조)내에서 배양하였으며, 여기에 사람 인터루킨-1 β(IL-1β), 사람 종양괴사인자 α(TNFα), 사람 혈소판-유도 성장 인자(PDGF) AB 및 사람 염기성 결합조직 형성세포 성장 인자(bFGF)를 0.01 또는 0.1, 0.1 또는 1, 1 또는 10 및 1 또는 10ng/㎖의 농도로 각각 첨가하고, 37℃에서 72시간 동안 배양하고,배양 상청을 회수하였다.

항-사람 IL-6 항체 MH166(1 ㎍/㎖) 100㎕을 96-웰 ELISA 플레이트(면역플레이트: Nunc Co. 제조)에 첨가하고 24시간 동안 4℃에서 배양하였다. 각 웰을 0.05% Tween20을 함유하는 PBS로 차례로 세정하고, 1% BSA를 함유하는 PBS로 밤새 4℃에서 블로킹하였다. 상기에서 얻은 배양 상징액을 1% BSA를 함유하는 PBS로 희석하고, 각 웰에 첨가한 후, 2시간 동안 실온에서 배양하였다.

0.05% Tween20을 함유하는 PBS로 세정한 후, 단백질 A 칼럼(Pharmacia 제조) 100㎕로 정제된 토끼 폴리클로날 항-사람 IL-6 항체 2.5 ㎍/㎖를 첨가하였다.

2시간 동안 실온에서 배양한 후, 배양 상청 내에서 IL-6에 결합한 토끼 폴리클로날 항-lL-6 항체를 알칼리 포스파타제-결합 항-토끼 IgG항체(Tago Co. 제조)와 반응시켰다. 이어서 시그마104 알칼리 포스파타제 기 질(Sigma Co. 제조) 1mg/㎖을 첨부된 지시에 따라 첨가하고 흡광도를 405 내지 600 nm에서 MPR A4마이크로플레이트 판독기(Tosoh Co. 제조)로 측정하였다.

사람 IL-6 농도에 대한 흡광 OD 수치의 변환에 대해 각각 분석하는 동안 재조합 IL-6에 대한 검정 곡선을 준비하였다. 결과를 표 1에 나타내었다.

[표 1]

주 : 활막 세포를 IL-1β, TNFα, PDGF-AB 또는 bFGF와 함께 3일간 배양하였다. 배양 후에, 상청의 IL-6 농도를 ELISA로 측정하였다.

그 결과, IL-1β는, 활막세포의 IL-6생성을 강하게 촉진하는 것이 명확해졌다.

[실시예 1]

(1) 실험예 1에서 얻은 활막 세포 (3× 10³/웰)를 5% FCS (Hyclone Laboratories 제조), 10 U/㎖의 페니실린 G와 100㎍/㎖의 스트렙토마이신을 함유하는 IMDM 배양액 내에서 현탁시키고, 96-웰 마이크로타이터 플레이트(#3072, Falcon Co. 제조)에 첨가하고, 5일간 다양한 농도의 IL-6 또는 sIL-6R 각기 단독 존재하에서, 또는 IL-6과 sIL-6R의 공존하에서 배양하였다. 배양 배양개시후 72시간 후에,³H-티미딘(Amersham International plc 제조)을 각 웰에 1μCi/웰로 첨가하고, 배양 종료후에 신틸레이션 카운터로 세포내의 방사활성을 측정하쳤다. 결과를 제1도에 나타내었다.

그 결과, IL-6 또는 sIL-6R 단독에서는 활막 세포의³H 티미딘 흡수가 적고, 활막세포의 증식이 관찰되지 않았다. 반대로 10ng/㎖ 이상의 농도의 IL-6과 100ng/㎖ 농도의 sIL-6R의 공존하에서는 대조군에 비해서 현저한³H 티미딘 흡수가 확인되었다. 따라서, IL-6R 단독에서는 활막세포의 증식작용을 거의 나타내지 않는데 비해서, IL-6과 sIL-6R의 공존하에서는 강력한 활막세포 증식 작용을 갖는 것이 확인되었다.

(2) 활막세포(3× 10³/웰)를, IL-6을 생산하기 위해 충분량의 IL-1β(0.1ng/㎖), 100ng/㎖의 sIL-6R 및 25㎍/㎖의 IL-6 항체 또는 257㎍/㎖의 IL-6R 항체존재 하에서 배양하였다. 배양 개시 72시간 후에 1μCi/웰이 되도록³H 티미딘을 첨가하고, 배양종료후에 신틸레이션 카운터로 세포내의 방사활성을 측정하였다. 결과를 제2도에 나타내었다. IL-6 항체 또는 IL-6R 항체의 첨가에 의해, sIL-6R에 의해 증강된 활막세포의 증식을 완전히 억제하였다.

(3) 활막세포(3×10³/웰)를, 100ng/㎖의 IL-6(Genzyme Co. 제조), 상기 참고예에서 얻은 100ng/㎖의 sIL-6R 및 25㎍/㎖의 IL-6 항체 또는 IL-6R 항체의 존재 하에서 배양하였다. 배양 개시후 72시간에 1μCi/웰이 되도록³H 티미딘을 첨가하고, 배양종료 후에 신틸레이션 카운터로 세포내의 방사활성을 측정하였다. 결과를 제3도에 나타내었다. IL-6 항체 또는 IL-6R 항체의 첨가에 의해, sIL-6R에 의해 증강된 활막세포의 증식이 완전하게 억제되었다.

[실시예 2]

관절염 시작시 IL-6 수용체 항체의 억제 효과를 마우스 관절염 모델을 사용하여 조사하였다.

소의 타입 II 콜라겐 용액(콜라겐 테크놀러지 연구 그룹)(4mg/㎖)를 0.1N 수용성 아세트산 용액 내에 용해하고 완전 보조액 H37Ra(DIFCO)을 동량으로 혼합하여, 보조액을 준비하였다. 보조액 100㎕를 8 내지 9주된 DBA/1J 암쥐(Charles River Japan)의 꼬리 밑에 피하주사하였다. 관절염을 유발하기 위해서 20일 후에 추가의 100㎕를 등쪽 피부 밑에 주사하였다.

마우스 IL-6 수용체 항체 MR16-1을 첫번째 콜라겐 감작시에 마우스당 2mg으로 정맥내로 투여하고, 각 마우스를 그 후 7주간 매주 추가로 0.5mg(n=5)을 피하주사하였다. 대조군으로, 동일한 이소타입의 항-DNP 항체 KH-5(Chugai Seiyaku)를 사용하였다(n=5).

관절염의 격렬한 정도를 관절염 인덱스에 기초하여 측정하였다. 측정은 각 손발에 대한 4포인트 스케일을 토대로 하여 각 마우스마다 총 16포인트로 측정하였다. 측정기준은 다음과 같다.

0.5 : 관절의 1 부위에서 홍반이 관찰됨.

1 : 관절의 2부위에서 홍반관찰, 또는 등은 붉지만 부풀지 않음.

2 : 약간의 부풀음이 관찰됨.

3 : 발등이 심하게 부풀지만, 손가락, 발가락은 모두 부풀지 않음.

4 : 발등과 손가락, 발가락이 심하게 부풀음

결과는 제4도에 나타내었다. 초기 단계의 관절염에서 관절염의 발병은 대조군 항체를 투여한 그룹에 비해서 IL-6 수용체 항체를 투여한 그룹에서 명확하게 억제되었다.

반면에, 마우스 혈액내에서 항-타입 II 콜라겐 항체 역가의 측정 결과는 대조 항체를 투여한 그룹에 비해서 IL-6 수용체 항체를 투여한 그룹에서 초기 단계 관절염에서 중대한 감소를 나타내었다(제5도).

콜라겐 면역후 35일째에 마우스를 치사시켜서 뒷다리를 20% 포르말린으로 고정하였다. 이어서 EDTA 용액(pH 7.6) 내에서 탈광화(demineralization)시키고 알코올로 탈수하였다. 이들을 파라핀으로 싸서 2㎛ 두께 단위로 잘랐다. 자른 부분들을 헤마톡실린과 에오신으로 착색하고 125 배율하에서 관찰하였다(제6도). 그 결과, 연골과 뼈 내로 육아 조직의 침윤, 즉 만성 증식 황막염이 대조 항체를 투여한 그룹에 비해서 IL-6 수용체 항체를 투여한 그룹에서 억제되었다.

IL-6은 B 세포를 항체를 생산하는 세포에서 분화시키는 사이토킨이다. IL-6은 또한 IL-6 수용체의 존재에서 활막 세포의 증식을 촉진시킨다. 마우스 콜라겐 관절염 모델에서, 항-IL-6 수용체 항체가 대조 항체를 투여한 그릅과 비교해서 콜라겐 감작 후 21일째와 35일째에 항-타입 II 콜라겐 항체 역가를 상당히 억제하므로, 항-IL-6 수용체 항체에 의한 항체 생산 억제가 관절염에 대한 억제 효과에 반응하는 하나의 요인이라고 생각된다. 또한, 콜라겐 감작후 49일부터 항체 생산의 억제가 관찰되지 않았다 하더라도, 관절염의 발병 시에 적당한 억제 효과가 이 기간 동안에도 나타났다는 사실과, 족근골 주위 조직의 HE 착색이 육아 조직이 대조군과 비교해서 항-IL-6 수용체 항체를 투여한 그룹의 연골과 뼈로 침입하는 것을 억제하는 것을 나타내었다는 사실로, 활막 증식 억제 효과는 또한 관절염 억제 효과에 기여한다고 생각된다.

[산업상이용가능성]

만성 류마티스 관절염 환자로부터의 활막 세포는 IL-6과 sIL-6R의 공존 하에서 증식한다. 만성 류마티스 관절염 환자의 활액이 활막세포의 성장을 유도하기 위해 충분한 양의 IL-6과 sIL-6R을 함유한다는 사실은 IL-67에 의한 시그널 변환이 만성 류마티스 관절염에서 활막 세포의 비정상적 증식에 관련되어 있는 것을 나타낸다.

결과적으로, 본 발명에 따른 IL-6 안타고니스트를 유효성분으로 하는 만성 류마티스 관절염 치료제는 IL-6과 sIL-6R의 존재하에서 만성 류마티스 관절염 환자에서 활막 세포의 증식을 억제하고, 따라서 만성 류마티스 관절염에 대한 치료 효과를 가지는 것이 증명되었다. 그러므로, 본 발명의 IL-6안타고니스트는 활막 세포가 비정상적으로 증식하는 만성 류마티스 관절염의 치료제로서 유용하다.

Claims

항-인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로 함유하여서 된 만성 류마티스 관절염의 치료를 위한 제약조성물.
제1항에 있어서, 상기 항-인터루킨-6 수용체 항체가 만성 류마티스 관절염으로 발생하는 활막 세포의 비정상적인 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는 제약조성물.
항-인터루킨-6 수용체 항체를 유효성분으로 하는 활막 세포 증식 억제제.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-인터루킨-6 수용체 항체가 모노클로날 항체인 제약조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항-인터루킨-6 수용체 항체가 항-인간 인터루킨-6 수용체 항체인 제약조성물.
제3항에 있어서, 상기 항-인터루킨-6 수용체 항체가 모노클로날 항체인 활막 세포 증식 억제제.
제3항에 있어서, 항-인터루킨 6 수용체 항체가 항-인간 인터루킨-6 수용체 항체인 활막 세포 증식 억제제.