TWI441647B - 抑制細胞毒性ｔ細胞活化之藥劑 - Google Patents

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TWI441647B
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Masafumi Takahashi
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Masahiko Mihara
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Description

抑制細胞毒性T細胞活化之藥劑
本發明係有關於抑制細胞毒性T細胞(殺手T細胞)活化的藥劑，該藥劑包含作為有效成分(active ingredients)的介白素(IL)－6抑制劑以及其使用。本發明也有關於抑制移植後之排斥反應的方法，該方法包括投與介白素－6抑制劑至受者的步驟。
介白素－6(IL－6)係一種稱為B細胞刺激因子2(B－cell stimulating factor 2(BSF2))或干擾素β 2(interferon β 2)的細胞素(cytokine)。研究發現介白素－6係一種參與B細胞淋巴球(B－cell lymphocytes)活化作用的分化因子(Hirano,T.et al. ,Nature(1986)324,73－76)，而且後來證明它是一種多功能的細胞素，影響各種細胞的功能(Akira,S.et al. ,Adv.in Immunology(1993)54,1－78)。已有報告敘述介白素－6會誘發T淋巴細胞(T lymphocyte cells)的成熟(Lotz,M.et al. ,J.Exp.Med.(1988)167,1253－1258)。
介白素－6藉由二種細胞上的蛋白質傳送其生物活性。第一種蛋白質是介白素－6受體，其為一種介白素－6所結合的配位子結合蛋白(ligand binding protein)；介白素－6受體的分子量大約為80千道爾頓(kDa)(Taga,T.et al. ,J.Exp.Med.(1987)166,967－981；and Yamasaki,K.et al. ,Science(1988)241,825－828)。介白素－6受體以膜結合形式(membrane－bound form)存在，其穿透且表現在細胞膜上，同時它也是一種可溶性介白素－6受體(soluble IL－6 receptor)，主要由膜結合形式的細胞外區域(extracellular region)組成。
另一種蛋白質係膜蛋白gp130(membrane protein gp130)，其分子量大約為130千道爾頓並且參與非配位子結合訊息傳遞(non－ligand binding signal transduction)。經由介白素－6與介白素－6受體形成介白素－6/介白素－6受體複合物(IL－6/IL－6 receptor complex)，接著結合該複合物與pg130，介白素－6的生物活性可傳送至細胞內(Taga,T.et al. ,Cell(1989)58,573－581)。
介白素－6抑制劑係抑制介白素－6生物活性之傳送的物質。近來已知的介白素－6抑制劑可包括抵抗介白素－6的抗體(抗介白素－6抗體(anti－IL－6 antibodies))、抵抗介白素－6受體的抗體(抗介白素－6受體抗體(anti－IL－6 receptor antibodies))、抵抗pg130的抗體(抗pg130抗體(anti－gp130 antibodies))、介白素－6變異體(IL－6 variants)、介白素－6或介白素－6受體的部分肽(partial peptides)以及這類物質。
有數篇關於抗介白素－6受體抗體的報告(Novick,D.et al. ,Hybridoma(1991)10,137－146；Huang,Y.W.et al. ,Hybridoma(1993)12,621－630；國際專利申請公告號(International Patent Application Publication No.)WO 95/09873；法國專利申請案號(French Patent Application No.)FR 2694767；以及美國專利案號(U.S.Patent No.)5216128)。其中一篇報告詳述一種人化PM－1抗體(humanized PM－1 antibody)，該抗體係經由將小鼠抗體PM－1(其為一種抗介白素－6受體抗體)的互補決定區(complementarity determining region(CDR))(Hirata,Y.et al. ,J.Immunol.(1989)143,2900－2906)移植入人類抗體((WO 92/19759))而獲得。
已知介白素－6係參與細胞毒性T細胞活化的殺手細胞協助因子(killer cell helper factor(KHF))(Okada M.et al. ,J.Immunology 141：1543－1549,1988)。使用人類重組介白素－6(human rIL－6)的體外試驗顯示在介白素－2的存在下，重組介白素－6由人類周邊血液T細胞與CD4－/CD8－或CD4－/CD8＋胸腺T細胞(thymus T cells)中引發細胞毒性T細胞的活化。也已知介白素－6在體內的功能為細胞毒性T細胞分化誘導因子(cytotoxic T cell differentiation－inducing factor)(Kitahara M.et al ,Jpn.J.Cancer Res.81：1032－1038.1990)。
然而，除了介白素－6之外，也已知有其他不同的細胞素(cytokines)在體內的功能為殺手細胞協助因子(KHFs)，而迄今尚無研究報告釐清介白素－6抑制劑是否可抑制體內細胞毒性T細胞的活化。
本發明係於上述的情況下實行。本發明之目的係提供用以抑制細胞毒性T細胞活化的藥劑，該藥劑包含作為有效成分的介白素－6抑制劑。
本發明之另一目的係提供用以抑制移植後之排斥反應的方法，該方法包括投與介白素－6抑制劑至個體的步驟。
為了達到上述的目的，本發明測試抗介白素－6受體抗體對於抑制細胞毒性T細胞活化的效力。
首先，本發明之發明者經由腹膜內投與肥胖細胞瘤系P815(mastocytoma line P815)的細胞至C57BL/6小鼠體內。發明者也經由腹膜內投與EL4淋巴瘤細胞株(EL4 lymphoma cell line)的細胞至BALB/c小鼠體內作為免疫細胞(異體抗原(alloantigens))。分離出這些小鼠的脾臟，並在不同的效應細胞/目標細胞(effector cell/target cell(E/T))比例下培養該脾臟細胞(效應細胞)(上述的免疫細胞(immunizing cells)係作為目標細胞)，並且測量每一目標細胞的細胞毒性T淋巴球活性(CTL activity)(細胞毒性T細胞活性)。然後將抗介白素－6受體抗體或大鼠免疫球蛋白G(IgG)(對照抗體)投與至具有上述之異體抗原(alloantigens)的小鼠模式，並且在相同條件下分析細胞毒性T淋巴球活性。
上述的分析結果顯示相較於未投與的小鼠以及被投與對照抗體的小鼠，被投與抗介白素－6受體抗體之小鼠體內的細胞毒性T淋巴球對於同種抗原(alloantigens)的活性在統計學上係顯著地降低(第一至第四圖)。這些結果釐清抗介白素－6受體抗體具有抑制細胞毒性T細胞活化的功能。
發明者也評估投與抗介白素－6受體抗體至異體小鼠心臟移植模式(allogenic mouse heart transplantation model)的效果。其結果為投與抗介白素－6受體抗體會抑制急性移植排斥反應並且在統計學上顯著地延長移植之心臟的存活率。另外，在移植5天之後，發明者由組織病理學角度檢查取自受者的移植心臟。其結果顯示在投與抗介白素－6受體抗體(anti－IL－6 receptor antibodies)的組別當中，炎性細胞(inflammatory cells)滲透入移植之心臟組織的現象明顯地被抑制，因此心肌細胞(cardiomyocytes)便相對地受到保護。
本發明之發明者因此首次發現投與抗介白素－6受體抗體可抑制細胞毒性T細胞活化(cytotoxic T cell induction)以及抑制移植後的排斥反應，從而完成本發明。
更具體地來說，本發明提供以下的發明：[1]一種用以抑制細胞毒性T細胞活化的藥劑，該藥劑包含作為有效成分的介白素－6抑制劑(IL－6 inhibitor)；[2][1]所述的藥劑，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[3][1]所述的藥劑，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[4][2]或[3]所述的藥劑，其中之抗體係單株抗體；[5][2]或[3]所述的藥劑，其中之抗體識別人類介白素－6或人類介白素－6受體；[6][2]或[3]所述的藥劑，其中之抗體係重組抗體；[7][6]所述的藥劑，其中之抗體係嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibody)或人類抗體(human antibody)；[8][1]所述的藥劑，該藥劑係用以抑制移植後的排斥反應；[9]一種用以抑制心臟移植之排斥反應的藥劑，該藥劑包含作為有效成分的介白素－6抑制劑；[10][9]所述的藥劑，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[11][9]所述的藥劑，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[12][10]或[11]所述的藥劑，其中之抗體係單株抗體；[13][10]或[11]所述的藥劑，其中之抗體辨識人類介白素－6或人類介白素－6受體；[14][10]或[11]所述的藥劑，其中之抗體係重組抗體；[15][14]所述的藥劑，其中之抗體係嵌合抗體、人化抗體或人類抗體；[16][9]所述的藥劑，該藥劑係用以抑制心臟移植的急性排斥反應；[17]一種用以抑制細胞毒性T細胞活化的方法，該方法包括投與一介白素－6抑制劑至一個體的步驟；[18][17]所述的方法，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[19][17]所述的方法，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[20][18]或[19]所述的方法，其中之抗體係單株抗體；[21][18]或[19]所述的方法，其中之抗體係識別人類介白素－6或人類介白素－6受體的抗體；[22][18]或[19]所述的方法，其中之抗體係重組抗體；[23][22]所述的方法，其中之抗體係嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibody)或人類抗體(human antibody)；[24][17]所述的方法，該方法係用以抑制移植後的排斥反應；[25]製造用以抑制細胞毒性T細胞活化之藥劑時介白素－6抑制劑的使用；[26][25]所述的使用，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[27][25]所述的使用，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[28][26]或[27]所述的使用，其中之抗體係單株抗體；[29][26]或[27]所述的使用，其中之抗體識別人類介白素－6或人類介白素－6受體；[30][26]或[27]所述的使用，其中之抗體係重組抗體；[31][30]所述的使用，其中之抗體係嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibody)或人類抗體(human antibody)；[32]一種用以抑制心臟移植之排斥反應的方法，該方法包括投與一介白素－6抑制劑至一個體的步驟；[33][32]所述的方法，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[34][32]所述的方法，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[35][33]或[34]所述的方法，其中之抗體係單株抗體；[36][33]或[34]所述的方法，其中之抗體識別人類介白素－6或人類介白素－6受體；[37][33]或[34]所述的方法，其中之抗體係重組抗體；[38][37]所述的方法，其中之抗體係嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibody)或人類抗體(human antibody)；[39][32]所述的方法，該方法係用以抑制心臟移植的急性排斥反應；[40]製造用以抑制心臟移植之排斥反應之藥劑時介白素－6抑制劑的使用；[41][40]所述的使用，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6的抗體；[42][40]所述的使用，其中之介白素－6抑制劑係識別介白素－6受體的抗體；[43][41]或[42]所述的使用，其中之抗體係單株抗體；[44][41]或[42]所述的使用，其中之抗體識別人類介白素－6或人類介白素－6受體；[45][41]或[42]所述的使用，其中之抗體係重組抗體；以及[46][45]所述的使用，其中之抗體係嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibody)或人類抗體(human antibody)。
本發明之發明者發現抗介白素－6受體抗體(anti－IL－6 receptor antibody)的投與可抑制細胞毒性T細胞的活化。本發明即以這些發現為基礎。
本發明係有關於用以抑制細胞毒性T細胞活化的藥劑，該藥劑包含作為有效成分的介白素－6抑制劑。
本文中的“介白素－6抑制劑(IL－6 inhibitor)”係一種阻斷介白素－6作用之訊息傳遞(IL－6－mediated signal transduction)並且抑制介白素－6生物活性的物質。該介白素－6抑制劑最好是具有抵抗介白素－6、介白素－6受體或gp130結合之抑制功能的物質。
本發明之介白素－6抑制劑的例子包括：抗介白素－6抗體、抗介白素－6受體抗體、抗gp130抗體(anti－gp130 antibodies)、介白素－6變異體(IL－6 variants)、可溶性介白素－6受體變異體(soluble IL－6 receptor variants)與介白素－6或介白素－6受體的部分肽(partial peptides)以及表現相似活性的低分子量化合物，但不只限於此類。本發明之較佳介白素－6抑制劑包括能識別介白素－6受體的抗體。
抗體的來源並未特別限定在本發明中；然而，該抗體最好衍生自哺乳動物，更佳的抗體係衍生自人類。
利用已知的方法可獲得本發明所使用之抗介白素－6抗體的單株或多株抗體。由哺乳動物衍生的單株抗體特別適合作為本發明所使用的抗介白素－6抗體。由哺乳動物衍生的單株抗體包括那些從雜種瘤(hybridomas)產生的抗體以及那些經由基因工程方法從表現載體(expression vector)(該表現載體包含抗體基因)所轉殖(transformed)之宿主而產生的抗體。抗體藉由與介白素－6結合來抑制介白素－6結合至介白素－6受體，並且因此阻斷介白素－6的生物活性傳送至細胞內。
該等抗體包括：MH166(Matsuda,T.et al. ,Eur.J.Immunol.(1988)18,951－956)、SK2抗體(Sato,K.et al. ,transaction of the 21s t Annual Meeting of the Japanese Society for Immunology(1991)21,166)等。
基本上，利用以下的習知技術可製備會產生雜種瘤的抗介白素－6抗體：具體地來說，利用傳統的免疫法(immunization method)將介白素－6作為致敏抗原(sensitizing antigen)可製備該等雜種瘤以進行免疫作用；利用傳統的細胞融合法(cell fusion method)將所得到的免疫細胞與已知的母細胞(parent cells)融合；並且利用傳統的篩選方法篩選產生單株抗體的細胞。
更具體地來說，抗介白素－6抗體可如下製備：例如，利用Eur.J.Biochem.(1987)168,543－550、J.Immunol.(1988)140,1534－1541和/或Agr.Biol.Chem.(1990)54,2685－2688所揭露的介白素－6和/或胺基酸序列可得到為了獲得抗體而用來作為致敏抗原的人類抗介白素－6。
以已知的表現載體(一介白素－6基因序列嵌入該表現載體)轉殖一適當的宿主細胞之後，利用已知的方法從宿主細胞內部或培養上清液純化所要的介白素－6蛋白質。該純化的介白素－6蛋白質可作為致敏抗原。或者，介白素－6蛋白質的融合蛋白與另一蛋白質也可作為致敏抗原。
利用習知方法可獲得本發明所使用之抗介白素－6受體抗體的單株或多株抗體。本發明所使用的抗介白素－6受體抗體最好為衍生自哺乳動物的單株抗體。由哺乳動物衍生的單株抗體包括那些從雜種瘤(hybridomas)產生的抗體以及那些利用基因工程方法從表現載體(該表現載體包含抗體基因)所轉殖(transformed)之宿主而產生的抗體。該抗體藉由與介白素－6受體結合來抑制介白素－6結合至介白素－6受體，因此阻斷介白素－6的生物活性傳送至細胞內。
該等抗體包括：MR16－1抗體(Tamura,T.et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1993)90,11924－11928)；PM－1抗體(Hirata,Y.et al. ,J.Immunol.(1989)143,2900－2906)；AUK12－20抗體、AUK64－7抗體與AUK146－15抗體(WO 92/19759)等。其中，PM－1抗體可當作一個抵抗人類介白素－6受體之較佳單株抗體的例子，而MR16－1抗體則是抵抗小鼠介白素－6受體的較佳單株抗體。
基本上，產生抗介白素－6受體單株抗體的雜種瘤可利用以下的習知技術來製備：具體地來說，利用傳統的免疫法(immunization method)將介白素－6作為致敏抗原(sensitizing antigen)可製備該等雜種瘤以進行免疫作用(immunization)；利用傳統的細胞融合法(cell fusion method)將所得到的免疫細胞與已知的母細胞(parent cells)融合；並且利用傳統的篩選方法篩選產生單株抗體的細胞。
更具體地來說，抗介白素－6受體抗體可如下製備：例如，利用歐洲專利申請公開號EP 325474與Japanese Patent Application Kokai Publication No.(JP－A)Hei 3－155795所揭露的介白素－6受體基因和/或胺基酸序列可分別得到為了獲得抗體而用來作為致敏抗原的人類抗介白素－6受體或小鼠介白素－6受體。
有二種介白素－6受體蛋白質：一種表現在細胞膜上，而另一種與細胞膜分離(可溶性介白素－6受體)(Yasukawa,K.et al. ,J.Biochem.(1990)108,673－676)。該可溶性介白素－6受體係由結合細胞膜之介白素－6受體(cell membrane－bound IL－6 receptor)的細胞外區域組成，與結合細胞膜之介白素－6受體不同的是該可溶性介白素－6受體缺乏細胞膜間區域(transmembrane region)或缺乏細胞膜間與細胞內的區域。只要介白素－6受體可作為產生本發明中所使用之抗介白素－6受體抗體時所需的致敏抗原，該介白素－6受體便可作為介白素－6受體蛋白質。
以已知的表現載體系統(一介白素－6受體基因序列嵌入該表現載體)轉殖一適當的宿主細胞之後，再利用習知方法從宿主細胞的內部或培養上清液中純化所要的介白素－6受體蛋白質。該純化的介白素－6受體蛋白質可作為致敏抗原。另外，介白素－6受體蛋白質的融合蛋白(fusion protein)與另一蛋白質也可作為致敏抗原。
利用習知方法可獲得本發明所使用之抗gp130抗體的單株或多株抗體。尤其本發明所使用的抗gp130抗體最好為衍生自哺乳動物的單株抗體。由哺乳動物衍生的單株抗體包括那些從雜種瘤(hybridomas)產生的抗體以及那些利用基因工程方法從表現載體(expression vector)(該表現載體包含抗體基因)所轉殖之宿主中所產生的抗體。該抗體藉由與gp130結合而抑制gp130結合至介白素－6/介白素－6受體複合物，因此阻斷介白素－6的生物活性傳送至細胞內。
該等抗體包括：AM64抗體(JP－A Hei 3－219894)；4B11抗體與2H4抗體(US 5571513)；B－S12抗體與B－P8抗體(JP－A Hei 8－291199)等。
基本上，產生抗gp130單株抗體的雜種瘤可利用以下的習知技術來製備：具體地來說，利用傳統的免疫法將gp130作為致敏抗原可製備該等雜種瘤以進行免疫作用；利用傳統的細胞融合法將所得到的免疫細胞與已知的母細胞(parent cells)融合；並且利用傳統的篩選方法篩選產生單株抗體的細胞。
更具體地來說，單株抗體可如下製備：例如，利用歐洲專利申請公告號(European Patent Application Publication No.)EP 411946所揭露的gp130基因和/或胺基酸序列可得到為了獲得抗體而用來作為致敏抗原的gp130。
以已知的表現載體系統(一gp130基因序列嵌入該系統)轉殖一適當的宿主細胞之後，利用習知方法從宿主細胞的內部或培養上清液中純化所要的gp130蛋白質。該純化的gp130蛋白質可作為致敏抗原。另外，細胞表現的gp130(cell expressing gp130)或gp130蛋白質的融合蛋白(fusion protein)與另一蛋白質也可作為致敏抗原。
以致敏抗原免疫的哺乳動物(mammals to be immunized with a sensitizing antigen)並未特別限定，但最好選擇與母細胞(該母細胞係用以作細胞融合)相容的動物。一般常使用小鼠、大鼠與倉鼠等齧齒目動物。
根據習知方法，利用致敏抗原(sensitizing antigens)使動物免疫。例如，一般係經由腹膜內或皮下注射致敏抗原使動物免疫。具體地來說，該致敏抗原最好以適量的磷酸鹽緩衝生理食鹽水(PBS)、生理食鹽水或同類物質稀釋或懸浮其中，並且與適量的一般佐劑(例如：傳氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant))混合，進行乳化，然後每4至21天投與數次至哺乳動物。另外，可使用適當的載體以及一致敏抗原進行免疫作用。
在該免疫作用之後，確定所要的抗體量在血清中增加，然後從哺乳動物得到免疫細胞以進行細胞融合。特別適用於進行細胞融合的免疫細胞包括脾臟細胞。
作為母細胞(即與上述免疫細胞融合的母細胞)的哺乳動物骨髓癌細胞(myeloma cells)包括各種已知的細胞株(cell strains)，例如：P3X63Ag8.653(Kearney,J.F.et al. ,J.Immunol(1979)123,1548－1550)、P3X63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1－7)、NS－1(Kohler,G.and Milstein,C.,Eur.J.Immunol.(1976)6,511－519)、MPC－11(Margulies,D.H.et al. ,Cell(1976)8,405－415)、SP2/0(Shulman,M.et al. ,Nature(1978)276,269－270)、F0(de St.Groth,S.F.et al. ,J.Immunol.Methods(1980)35,1－21)、S194(Trowbridge,I.S.,J.Exp.Med.(1978)148,313－323)、R210(Galfre,G.et al. ,Nature(1979)277,131－133)以及這類細胞株。
基本上，上述之免疫細胞與骨髓癌細胞的細胞融合可利用習知方法來進行，例如：Milstein等人的方法(Kohler,G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3－46)以及這類方法。
更具體地來說，在細胞融合增效劑(enhancing agent)的存在下可在一般的營養培養基中完成上述的細胞融合。例如，聚乙二醇(polyethylene glycol(PEG))、仙台病毒(Sendai virus(HVJ))與這類物質係作為融合增效劑。再者，為了提高融合效力，可依據需求添加輔助劑，例如：二甲亞碸(dimethyl sulfoxide)。
免疫細胞對骨髓癌細胞(myeloma cells)的比例最好為，例如：1至10個免疫細胞對一個骨髓癌細胞。用於上述之細胞融合的培養基為，例如：RPMI1640或MEM培養基，這些培養基適用於上述之骨髓癌細胞的增生。也可以使用培養這類細胞的常用培養基。此外，也可併用血清補充品(serum supplements)，例如：胎牛血清(fetal calf serum (FCS))。
在細胞融合方面，對於所要之融合細胞(雜種瘤(hybridomas))的形成步驟如下：將確定含量之上述免疫細胞與骨髓癌細胞混合於上述的培養基中，接著添加以及混合預先加熱至37℃之濃度30%至60%(重量/體積)的聚乙二醇(PEG)溶液(例如：平均分子量約1,000至6,000的聚乙二醇溶液)。然後，經由重覆添加適當之培養基並且離心移除上清液便可移除不適合雜種瘤生長的細胞融合劑以及這類物質。
吾人透過將細胞培養在一般選擇的培養基，例如：HAT培養基(含有次黃嘌呤(hypoxanthine)、胺蝶呤(aminopterin)與胸腺嘧啶(thymidine)的培養基)中來選擇以上的雜種瘤。為了殺死除了所要之雜種瘤之外的細胞(未融合的細胞)，要持續在HAT培養基中培養一段足夠的時間(通常為數天至數週)。然後，實行標準限制稀釋法(standard limited dilution method)以便篩選與克隆(clone)會產生所要抗體的雜種瘤。
為了獲得上述的雜種瘤，除了利用抗原使非人類動物免疫的方法外，透過以下方式可獲得具有結合至預期抗原(desired antigen)或抗原表現(antigen－expressing)細胞之活性的預期人類抗體(desired human antibodies)：在體外以預期抗原蛋白或抗原表現細胞敏化(sensitizing)人類淋巴球，並且以人類骨髓癌細胞(myeloma cells)(e.g. ,U266)融合敏化的B淋巴球(見Japanese Patent Application Kokoku Publication No.(JP－B)Hei 1－59878(為了聲明異議而公告之經審查、核准的日本專利申請)。另外，預期人類抗體可由以下的方式獲得：投與一抗體或抗體表現細胞至擁有一整套人類抗體基因的轉殖動物，然後再實行上述的方法(見國際專利申請公告號WO 93/12227、WO 92/03918、WO 94/02602、WO 94/25585、WO 96/34096以及WO 96/33735)。
如此製備的雜種瘤(其產生單株抗體)可在傳統的培養基中繼代培養(subcultured)並貯存在液態氮當中一段長時間。
從上述雜種瘤獲得單株抗體時，即可使用下列方法：(1)根據傳統方式培養雜種瘤並且所獲得之抗體為培養上清液形式的方法；(2)雜種瘤係藉由投與至相容哺乳動物而增生而且所獲得之抗體為腹水形式的方法等等。前者常被用來獲得高純度的抗體，後者則常用來製造大量的抗體。
例如，產生抗介白素－6受體抗體的雜種瘤可利用JP－A Hei 3－139293所揭露的方法製備。該等雜種瘤的製備如下：將產生PM－1抗體的雜種瘤(PM－1 antibody－producing hybridoma)注射入BALB/c小鼠的腹腔，取得腹水，然後從腹水中純化出PM－1抗體；或將雜種瘤培養在適當的培養基內(例如：含有10%胎牛血清(fetal bovine serum)與5% BM－Condimed H1(Boehringer Mannheim)的RPMI1640培養基；雜種瘤無血清培養基(hybridoma SFM medium)(GIBCO－BRL)；無蛋白質雜種瘤培養基(PFHM－II medium)(GIBCO－BRL)等)，然後從培養上清液中取得PM－1抗體。
重組抗體(recombinant antibodies)可作為本發明之單株抗體，其中之抗體係利用基因重組技術製造，其製造過程如下：從一雜種瘤當中複製(cloning)一抗體基因，將該基因插入一適當的載體，然後將該載體帶入一宿主(其例見Borrebaeck,C.A.K.and Larrick,J.W.,Therapeutic Monoclonal Antibodies,published in the United Kingdom by Macmillan Publishers Ltd,1990)。
更具體地來說，抗體可變(V)區(antibody variable(V)regions)的信使核醣核酸編碼(mRNAs coding)係從那些產生吾人所要抗體的細胞(例如：雜種瘤)中分離出來。根據習知方法，例如：以胍超高速離心法(guanidine ultracentrifugation method)(Chirgwin,J.M.et al. ,Biochemistry(1979)18,5294－5299)與AGPC法(Chomczynski,P.et al. ,Anal.Biochem.(1987)162,156－159)製備總核醣核酸(total RNAs)以及利用信使核醣核酸純化套組(mRNA Purification Kit(Pharmacia))與這類方法可分離出信使核醣核酸。另外，利用QuickPrep信使核醣核酸純化套組(QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia))可直接製備信使核醣核酸。
利用反轉錄酶(reverse transcriptase)可從所得到之信使核醣核酸合成抗體可變區(antibody V regions)的互補去氧核糖核酸(cDNAs)。利用禽成髓細胞瘤病毒反轉錄酶第一股互補去氧核糖核酸合成套組(AMV Reverse Transcriptase First－strand cDNA Synthesis Kit)與這類物質可合成互補去氧核糖核酸。另外，為了合成與擴增互補去氧核糖核酸，可實行使用5’－Ampli FINDER RACE Kit(Clontech)與聚合酶連鎖反應(PCR)的5端互補去氧核糖核酸末端的快速擴增法(5’－RACE method)(Frohman,M.A.et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998－9002；Belyavsky,A.et al. ,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919－2932)。從所得的聚合酶連鎖反應產物中純化出所要的去氧核糖核酸片段(DNA fragment)，然後再與一載體去氧核糖核酸連接。然後，利用上述的去氧核糖核酸製備一重組載體(recombinant vector)並且將該重組載體帶入大腸桿菌(Escherichia coli )或同類物，然後選取其菌落以製備預期的重組載體。經由例如雙去氧法(dideoxy method)的方法可確定所要之去氧核糖核酸的核苷酸(nucleotide)序列。
當獲得編碼所要之抗體可變區(V region)的去氧核糖核酸時，該去氧核糖核酸與一編碼預期抗體之不可變區(C region)的去氧核糖核酸連接(ligated)，並且嵌入一表現載體。另外，編碼抗體可變區的去氧核糖核酸可被嵌入表現載體，該表現載體含有抗體不可變區的去氧核糖核酸。
為了製造本發明所用的抗體，如以下所述地將一抗體基因嵌入一表現載體，如此該抗體基因在表現調節區(expression regulating region)例如，增強子(enhancer)或啟動子(promoter)的控制下表現。然後，以此表現載體轉殖一宿主細胞便可表現該抗體。
在本發明中，為了減少人類與動物的異抗原性(heteroantigenicity)，可使用人工修飾的基因重組抗體(artificially modified genetic recombinant antibodies)，例如，嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibodies)或人類抗體(human antibodies)。利用習知方法可製備這些修飾抗體。
獲得嵌合抗體的過程如下：連接以上所得之編碼抗體可變區的去氧核糖核酸(DNA encoding an antibody V region)與編碼人類抗體不可變區的去氧核糖核酸(DNA encoding a human antibody C region)，然後將去氧核糖核酸嵌入一表現載體並帶入一宿主以進行製造(見歐洲專利申請公告號EP 125023；國際專利申請公告號WO 92/19759)。該習知方法可用以獲得本發明所使用的嵌合抗體。
人化抗體也稱為人改型抗體(reshaped human antibodies)，而且該抗體係來自人類以外的哺乳動物(例如：小鼠抗體)，該抗體之互補決定區(complementarity determining regions(CDRs))係轉移入人類抗體的互補決定區。此基因重組也為一般習知的方法(見歐洲專利申請公告號EP 125023、國際專利申請公告號WO 92/19759)。
更具體地來說，被設計成小鼠抗體之互補決定區(CDRs)與人類抗體之骨架區(framework regions(FRs))連接的去氧核糖核酸序列係經由聚合酶連鎖反應從數個寡核苷酸，該寡核苷酸末端包含重疊部分(overlapping portion)。所得到的去氧核糖核酸與編碼人類抗體不可變區的去氧核糖核酸(human antibody C region－encoding DNA)連接，然後嵌入一表現載體。並將該表現載體帶入一宿主以產生人化抗體(歐洲專利申請公告號EP 239400、國際專利申請公告號WO 92/19759)。
選取藉由互補決定區來連接的人類抗體骨架區，如此互補決定區便形成一適當的抗原結合區域。有必要時，抗體可變區之骨架區內的胺基酸可被取代，如此人改型抗體(reshaped human antibody)的互補決定區便形成一適當的抗原結合區域(Sato,K.et al. ,Cancer Res.(1993)53,851－856)。
人類抗體不可變區係用於嵌合與人化抗體，並且包括C γ。例如，可使用C γ 1、C γ 2、C γ 3或C γ 4。此外，為了增加抗體的安定性或其產量，可修改人類抗體不可變區。
嵌合抗體係由衍生自非人類哺乳動物抗體的可變區以及衍生自人類抗體的不可變區所組成；人化抗體係由非人類哺乳動物抗體的互補決定區(CDRs)以及衍生自人類抗體的骨架區與不可變區所組成。這二種抗體皆降低人體內的抗原性(antigenicity)，因此作為本發明中所使用的抗體。
用於本發明之人化抗體的較佳特定例子包括人化的PM－1抗體(humanized PM－1 antibody)(見國際專利申請公告號WO 92/19759)。
此外，除了用來取得人類抗體的上述方法之外，利用人類抗體庫(human antibody library)篩選而得到人類抗體的技術也是習知技術。例如，利用噬菌體展示法(phage display method)可讓人類抗體的可變區成為單鏈抗體(scFv)而表現在噬菌體表面上，然後可選擇結合抗原的噬菌體。分析所選擇的噬菌體之後，便可確定編碼人類抗體可變區的去氧核糖核酸序列。只要結合至抗原之單鏈抗體(scFv)的去氧核糖核酸序列顯現，便可製造包含該序列的適當表現載體，以獲取人類抗體。這些方法皆為習知的方法，而WO 92/01047、WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236、WO 93/19172、WO 95/01438與WO 95/15388可作為參考文獻。
根據傳統的方法可表現以上製造的抗體基因。當使用哺乳動物細胞時，利用一去氧核糖核酸可表現抗體基因，其中，被表現的抗體基因功能性地連接至一有用且常用的啟動子以及該抗體基因的poly A訊息下游(poly A signal downstream)或包含該去氧核糖核酸的載體。促進劑/啟動子的例子包括人類細胞巨大病毒即興早期促進子/啟動子。
此外，可在本發明中用來表現抗體的其他促進子/啟動子包括來自反轉錄病毒(retroviruses)、多瘤病毒(polyoma viruses)、腺病毒(adenoviruses)、猴病毒40(simian virus 40(SV40))與此類病毒的病毒促進子/啟動子(viral promoters/enhancers)；也包括哺乳動物細胞衍生的促進子/啟動子(mammalian cell－derived promoters/enhancers)，例如：人類延長因子1 α(human elongation factor 1 α(HEF1 α))。
例如，當使用猴病毒40促進子/啟動子時，依照Mulligan等人的方法可輕易地進行其表現(Mulligan,R.C.et al. ,Nature(1979)277,108－114)。另外，在使用人類延長因子1 α促進子/啟動子時，可使用Mizushima等人的方法(Mizushima,S.and Nagata S.,Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)。
當使用大腸桿菌(E.coli )時，抗體基因可經由功能性地連接一傳統的啟動子、一用來作抗體分泌的訊息序列以及將被表現的抗體基因而表現。促進劑的例子包括lacZ促進劑、araB促進劑與這類促進劑。當使用lacZ促進劑時，可根據Ward等人的方法表現基因(Ward,E.S.et al. ,Nature(1989)341,544－546；Ward,E.S.et al. ,FASEB J.(1992)6,2422－2427)；以及根據Better等人的方法使用araB促進劑(Better,M.et al. ,Science(1988)240,1041－1043)。
當抗體在大腸桿菌的胞外質(periplasm)中產生時，pelB訊息序列(Lei,S.P.et al. ,J.Bacteriol.(1987)169,4379－4383)可作為抗體分泌時的訊息序列。將產生至胞外質內的抗體分離，然後在適當地再折疊(refolding)該抗體結構後使用該分離的抗體(其例可見WO 96/30394)。
可使用衍生自猴病毒40(SV40)、多瘤病毒(polyoma viruses)、腺病毒(adenoviruses)、牛乳頭狀瘤病毒(bovine papilloma virus(BPV))與這類病毒的複製起點(replication origin)。此外，為了增加宿主細胞系統中的基因複製數量，表現載體可包括胺基糖苷磷酸轉移基因(aminoglycoside phosphotransferase(APH)gene)、胸腺嘧啶激酶基因(thymidine kinase(TK)gene)、大腸桿菌黃嘌呤－鳥嘌呤磷酸核糖轉移酶基因(E.coli xanthine－guanine phosphoribosyltransferase(Ecogpt)gene)、二氫葉酸還原酶基因(dihydrofolate reductase(dhfr)gene)或這類基因，這些基因係作為篩選標誌(selection marker)。
任何製造系統皆可用來製備本發明中所使用的抗體。用來製備抗體的製造系統包括體外(in vitro )與體內(in vivo )的製造系統。體外的製造系統包括那些使用真核細胞或原核細胞的系統。
使用真核細胞的製造系統包括那些使用動物細胞、植物細胞或真菌細胞的系統。該等動物細胞包括：(1)哺乳動物細胞，例如：中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、COS、骨髓癌細胞(myeloma)、幼倉鼠腎細胞(baby hamster kidney(BHK))、HeLa、Vero與這類細胞；(2)兩棲動物細胞，例如：爪蟾卵母細胞(Xenopus oocyte )；以及(3)昆蟲細胞，例如：sf9、sf21、Tn5與這類細胞。已知的植物細胞包括衍生自煙草(Nicotiana tabacum )的細胞，該細胞可培養成癒合組織(callus)。已知的真菌細胞包括酵母菌－例如：酵母菌屬(Saccharomyces (例如：啤酒酵母菌(S.cerevisiae )))、黴菌(mold fungi)，例如：麴菌屬(Aspergillus (例如：黑色麴菌(A.niger )))以及類似的真菌。
使用真核細胞的製造系統包括那些使用細菌細胞的系統。已知的細菌細胞包括大腸桿菌與枯草桿菌(Bacillus subtilis )。
利用轉殖作用將所要的抗體基因帶入這些細胞便可獲得抗體，接著在體外培養這些轉殖的細胞。根據習知方法進行培養。例如，DMEM、MEM、RPMI1640、IMDM可作為培養基，並且可併用胎牛血清(FCS)等血清補充品。再者，為了在體內產生抗體，可將帶有抗體基因的細胞轉移至腹腔內或動物的體腔內。
另一方面，體內的製造系統包括那些使用動物或植物的系統。使用動物的製造系統包括那些使用哺乳動物或昆蟲的系統。
可使用的哺乳動物包括：山羊、豬、綿羊、小鼠、牛與這類動物(Vicki Glaser,SPECTRUM Biotechnology Applications,1993)。另外，可使用的昆蟲包括：蠶。當使用植物時，可使用如：煙草。
將抗體基因帶入這些動物或植物，抗體便在動物或植物體內產生，然後再重新取得該抗體。例如，將抗體基因嵌入一基因(該基因編碼一蛋白質－例如：羊β酪蛋白(goat β casein)(該羊β酪蛋白只產生於乳中))中央便可將抗體基因製備成一融合基因。將包含融合基因(其包含抗體基因)的去氧核糖核酸片段注射入羊胚胎，然後將該胚胎帶入雌羊體內。從接受該胚胎之轉殖動物(羊)所產生的乳中或從這些動物的子代取得所要的抗體。為了增加轉殖羊所產生之含有所要之抗體的乳量，可給予該轉殖羊荷爾蒙(Ebert,K.M.et al. ,Bio/Technology(1994)12,699－702)。
當使用蠶時，以一被嵌入所要之抗體基因的桿狀病毒(baculovirus)感染這些蠶，然後從這些蠶的體液中取得所要的抗體(Maeda,S.et al. ,Nature(1985)315,592－594)。此外，當使用煙草時，所要的抗體基因係嵌入植物表現載體(例如：pMON530)，而該載體則被帶入細菌－例如：根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefaciens )。以此細菌感染煙草(例如：Nicotiana tabacum )，如此便可從此煙草葉中獲得所要的抗體(Julian,K.－C.Maet al. ,Eur.J.Immunol.(1994)24,131－138)。
當如以上所述地利用體外或體內的製造系統製造抗體時，編碼抗體重鏈(heavy chain(H chain))與輕鏈(light chain(L chain))的去氧核糖核酸可被嵌入不同的表現載體，然後一宿主與該等載體共轉殖(co－transformed)。或者，為了轉殖一宿主，該等去氧核糖核酸也可被嵌入一單一表現載體(見國際專利申請公告號(International Patent Application Publication No.)WO 94/11523)。
本發明所用的抗體可為抗體片段或其修飾產物，只要它們可適當地用在本發明中。抗體的例子包括：Fab、F(ab’)2、Fv以及單鏈Fv(scFv)，其中，重鏈與輕鏈的Fvs係藉由適當的連接子(linker)連接。
具體地來說，該抗體片段係以酶(例如：木瓜酵素(papain)或胃蛋白酶(pepsin))處理抗體後而產生，或者，編碼這些片段的基因形成並且被帶入表現載體，並在適當的宿主細胞內表現(其例見Co,M.S.et al. ,J.Immunol.(1994)152,2968－2976；Better,M.& Horwitz,A.H.,Methods in Enzymology(1989)178,476－496；Plueckthun,A.& Skerra,A.,Methods in Enzymology(1989)178,497－515；Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652－663；Rousseaux,J.et al. ,Methods in Enzymology(1989)121,663－666；Bird,R.E.et al. ,TIBTECH(1991)9,132－137)。
連接抗體的重鏈可變區與輕鏈可變區可得到scFv。在scFv中，重鏈可變區與輕鏈可變區係藉由一連接器連接，該連接器最好為肽連接器(peptide linker)(Huston,J.S.et al. ,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,5879－5883)。scFv當中之重鏈與輕鏈的可變區可衍生自任何上述的抗體。連接可變區的肽連接器例子包括由12至19個胺基酸殘基(amino acid residues)組成的任何單鏈肽(single chain peptides)。
使用上述抗體之編碼重鏈或可變區的去氧核糖核酸以及編碼輕鏈或可變區的去氧核糖核酸為模板，再使用聚合酶連鎖反應(PCR)擴增去氧核糖核酸片段(DNA portion)，該去氧核糖核酸片段編碼模板序列中所要的胺基酸序列並且使用定義片段之末端的引子，然後以一去氧核糖核酸(該去氧核糖核酸編碼一肽連接體片段(peptide linker portion))與一引子對，該引子將該連接體的兩端連接至重鏈與輕鏈)進一步地擴增該已擴增的去氧核糖核酸即可得到編碼scFv的去氧核糖核酸(scFv－encoding DNA)。
一旦得到編碼scFv的去氧核糖核酸(scFv－encoding DNA)，即可根據傳統的方法得到包含該去氧核糖核酸的表現載體以及以該載體轉殖的宿主。此外，根據傳統的方法使用該宿主便可得到scFv。
如上所述，經由獲取與表現宿主的基因可產生這些抗體片段。本文所述之“抗體”包含該等抗體片段。
結合至不同分子(例如：聚乙二醇(polyethylene glycol(PEG)))的抗體也可作為修飾抗體(modified antibodies)。本文所述之“抗體”包含該等修飾抗體。經由化學上修飾所得之抗體可得到這些修飾抗體。該等方法係已建立的技術。
如上所產生與表現的抗體可從細胞內或細胞外或從宿主分離出來，然後純化至均質(homogeneity)。利用親和層析法(affinity chromatography)可分離和/或純化出本發明中所使用的抗體。用於親和層析法的管柱(columns)例子包括：蛋白質A管柱(protein A columns)與蛋白質G管柱。用於蛋白質A管柱的載體(carriers)例子包括：HyperD、POROS、Sepharose FF與這類載體。除了上述方法之外，也可使用其他用來分離和/或純化一般蛋白質的方法，並且不以任何方式限定。
例如，除了親和層析法、過濾器(filters)、超濾(ultrafiltration)、鹽析(salting－out)、透析(dialysis)與這類方法之外，適當地選擇以及結合層析術可分離和/或純化本發明所使用的抗體。層析術(chromatographies)的例子包括：離子交換層析術(ion－exchange chromatography)、疏水層析術(hydrophobic chromatography)、凝膠過濾法(gel filtration)以及這類層析術。這些層析術可應用於高效液相層析法(high performance liquid chromatography(HPLC))，或者可使用逆相高效液相層析法(reverse phase HPLC)。
利用吸光值測定(absorbance measurement)、酵素結合免疫吸附測定(ELISA)與這類方法可確定以上所獲得之抗體的濃度。具體地來說，確定吸光值的步驟如下：以磷酸鹽緩衝生理食鹽水(－)(PBS(－))適當地稀釋抗體溶液，在280奈米(nm)值下測定吸光值，並且計算其濃度(1.35光通量(OD)＝1毫克/毫升。或者，當使用酵素結合免疫吸附測定時，其測量過程如下：以0.1摩爾(M)之重碳酸鹽緩衝緩衝液(bicarbonate buffer)(pH 9.6)將羊抗人G型球蛋白(goat anti－human IgG(TAG))稀釋至1微克/毫升，再將100微升(μ l)之該稀釋液加入96孔盤(Nunc)中，並且將其培養於4℃下一整夜使該抗體固定化。在封阻之後，將100微升之適當稀釋之本發明的抗體或適當稀釋之含有該抗體的樣品以及人類G型球蛋白(human IgG)(CAPPEL)加入作為一標準品，並且在室溫下靜置1小時。
沖洗之後，加入100微升之稀釋5,000倍的鹼性磷酸酶標記抗人G型球蛋白(alkaline phosphatase－labeled anti－human IgG)(BIO SOURCE)並且在室溫下靜置1小時。再一次沖洗之後，加入基質溶液(substrate solution)並且靜置之，然後利用Microplate Reader Model 3550(Bio－Rad)在405奈米下測量吸光值以計算所要抗體的濃度。
本發明所使用的介白素－6變異體(IL－6 variants)係具有結合至介白素－6受體之活性並且未轉移介白素－6生物活性的物質。即該介白素－6變異體會與介白素－6互相競爭與介白素－6受體的結合，但不會轉移介白素－6的生物活性，因此會阻斷介白素－6作用的訊息傳遞。
經由引發突變來取代介白素－6之胺基酸序列中的胺基酸殘基而製造介白素－6變異體。作為介白素－6變異體之基礎(base)的介白素－6起點並未限制，但考慮到抗原性與相關問題最好是使用人類介白素－6。
更具體地來說，胺基酸取代的過程如下：利用習知的分子模型程式(molecular modeling programs)來預測介白素－6胺基酸序列的第二結構(secondary structure)並且進一步地評估取代之胺基酸殘基對於整個分子的影響(例如：WHATIF；Vriendet al. ,J.Mol.Graphics(1990)8,52－56)。在確定將被取代的適當胺基酸殘基之後，將編碼人類介白素－6基因的核苷酸作為模板，進行常用的聚合酶連鎖反應，然後引發突變進而引起胺基酸胺基酸取代，如此便可獲得編碼介白素－6變異體的基因。如果有需要，可將此基因嵌入適當的表現載體，然後進行上述之重組抗體的表現、製造與純化方法便可獲得介白素－6變異體。
Brakenhoffet al. ,J.Biol.Chem.(1994)269,86－93、Savinoet al. ,EMBO J.(1994)13,1357－1367、WO 96/18648與WO 96/17869揭露介白素－6變異體的特定例子。
本發明中所使用之介白素－6的部分肽與介白素－6受體的部分肽係分別具有結合至介白素－6受體與介白素－6之活性並且不會轉移介白素－6生物活性的物質。即經由結合並且捕捉介白素－6受體或介白素－6，該介白素－6部分肽或介白素－6受體部分肽可專一地抑制介白素－6結合至介白素－6受體。因此，介白素－6的生物活性未被轉移，而介白素－6作用的訊息傳遞(IL－6－mediated signal transduction)則被阻斷。
介白素－6或介白素－6受體的部分肽係包含介白素－6或介白素－6受體胺基酸序列區之部分或全部胺基酸序列(該胺基酸序列參與介白素－6與介白素－6受體之間的結合)的肽。該等肽通常包含10至80個胺基酸殘基，最好包含20至50個胺基酸殘基，更好的是包含20至40個胺基酸殘基。
根據一般的習知方法(例如：基因工程方法(genetic engineering techniques)或肽合成法(peptide synthesis methods))明確指定參與介白素－6與介白素－6受體間之結合的介白素－6或介白素－6受體胺基酸序列區，而使用指定區域的胺基酸序列片段或全部便可製造介白素－6部分肽或介白素－6受體部分肽。
當利用基因工程方法製備介白素－6部分肽或介白素－6受體部分肽時，編碼所要之肽(desired peptide)的去氧核糖核酸序列被嵌入一表現載體，然後使用前述方法表現、製造與純化重組抗體便可獲得該肽。
當利用肽合成法製備介白素－6部分肽或介白素－6受體部分肽時，可使用一般常用的肽合成法－例如：固相合成法(solid phase synthesis methods)或液相合成法(liquid phase synthesis methods)。
具體地來說，根據“Continuation of Development of Pharmaceuticals,Vol.14,Peptide Synthesis(in Japanese)(ed.Haruaki Yajima,1991,Hirokawa Shoten)”所述的方法可合成該等肽。若使用固相合成法，可進行下列例子中的方法：將相當於將被合成之肽之C末端(C terminus)的胺基酸結合至一不溶於有機溶劑的支持物(support)，然後重覆以下反應來延長該肽股(peptide strand)：(1)濃縮胺基酸的反應，這些胺基酸的α－胺基(α－amino groups)與支鏈官能基(branch chain functional groups)從C至N末端方向每次都有一個被適當的保護基保護；以及(2)從結合樹脂之胺基酸或肽(resin－bound amino acids or peptides)的α－胺基中移除保護基的反應。根據使用的保護基形式，固相肽合成係廣泛地分類為Boc法與Fmoc法。
如上所述地合成所要的片段之後，進行去保護反應(deprotection reactions)，然後該肽股便從其支持物分離(cleaved)。在Boc法中通常使用氟化氫(hydrogen fluoride)或三氟甲磺酸(trifluoromethane sulfonic acid)進行肽股的分裂反應(cleavage reaction)，Fmoc法則常使用三氟醋酸(TFA)。例如，Boc法係於苯甲醚(anisole)存在下以氟化氫處理上述之被保護的肽樹脂(protected peptide resin)。接著，移除保護基並且從肽的支持物上將肽分離即可重新獲得該肽。將該重新獲得的肽冷凍乾燥後便可得到粗肽(crude peptide)。另一方面，Fmoc法利用相似於上述例子的方法進行去保護反應以及將肽股與其支持物分離的反應。
利用高效液相層析法可分離和/或純化所得的粗肽。利用水－乙氰(acetonitrile)溶劑系統在最佳條件下進行沖提(elution)－該沖提通常用於蛋白質純化。收集與所獲得之層析圖(chromatographic profile)相符的分液(fractions)並將其冷凍乾燥。如此再經由質譜分析(mass spectrum analysis)、胺基酸組成分析、胺基酸序列分析或這類方法分析分子量，進而確定純化的肽分液。
介白素－6部分體與介白素－6受體部分體的特定例子係揭露於JP－A Hei 2－188600、JP－A Hei 7－324097、JP－A Hei 8－311098與美國專利公告號(United States Patent Publication No.)US 5210075。
本發明所使用的抗體也可為結合抗體(conjugated antibodies)，其結合至各種分子－例如：聚乙二醇、放射性物質與毒素。經過化學修飾所獲得的抗體可得到該等結合抗體。修飾抗體的方法係已建立的技術。本發明中的“抗體”包含這些結合抗體。
本發明中用來抑制細胞毒性T細胞活化(cytotoxic T cell induction)的藥劑(其中含有有效成分介白素－6抑制劑)可用以抑制移植後的排斥反應。
本發明也提供抑制心臟移植之排斥反應的藥劑，該藥劑含有作為有效成分的介白素－6抑制劑。
本發明之抑制劑所抑制的形式並未特別限制，但最好為急性排斥反應－此反應係實際的移植醫學所遇到的問題。這些排斥反應為病理狀態，其中，由於確認組織相容性之主要組織相容性複合體(major histocompatibility complex(MHC))的不同使得異體移植(allografts)被認為是外來抗原(foreign antigens)，因此該異體移植經由受者之細胞毒性T細胞與輔助性T細胞(helper T cells)的活化而被攻擊。排斥反應通常在移植後3個月內發生。然而，移植後3個月或以上所發生之細胞滲透入異體移植組織現象也可視為排斥反應。
本文所述之“抑制移植後的排斥反應(suppressing rejection after transplantation)”係指經由抑制對移植器官的危害而增加移植器官的生存力(viability)。
可使用本發明之抑制劑的器官移植形式並未特別限定，本發明之器官移植中的較佳器官包括實質器官(parenchymal organs)－例如：心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肺臟與小腸。本發明也可應用於組織的移植，例如：心瓣膜(cardiac vales)、血管、皮膚、骨與角膜。
利用實施例中敘述的方法可確定移植後排斥反應的抑制作用，進而確定個體在被投與本發明之抑制劑之後其體內的細胞毒性T淋巴球活性(CTL activity)。當受者針對供者之人類白血球抗原(HLA antigen)而產生的細胞毒性T淋巴球活性因為投與本發明之抑制劑而下降時，即說明該藥劑可抑制移植失敗(suppress transplant failures)。當器官生存力因此而增加時，即說明該藥劑可在器官移植中“抑制移植失敗”。在移植之後檢查器官功能是否恢復正常便可評估每一器官的存活率。
在本發明中，用傳統的方法可評估介白素－6抑制劑在抑制介白素－6訊息傳遞時的活性。具體地來說，將介白素－6加入介白素－6依賴人類骨髓癌細胞株(IL－6－dependent human myeloma cell lines)(S6B45 and KPMM2))、人類Lennert T淋巴瘤細胞株KT3(human Len nert T lymphoma cell line KT3)或介白素－6依賴細胞株MH60.BSF2(IL－6－dependent cell line MH60.BSF2)培養基中；並且在介白素－6抑制劑的存在下測量被介白素－6依賴細胞攝入的3 H－胸腺嘧啶(3 H－thymidine)。或是培養介白素－6受體表現的U266細胞(IL－6 receptor－expressing U266 cells)，同時將1 2 5 I－標記的介白素－6(1 2 5 I－labeled IL－6)與介白素－6抑制劑加入該培養基中；然後定量結合至該介白素－6受體表現細胞之1 2 5 I－標記的介白素－6。除了介白素－6抑制劑組之外，上述的分析系統中也包括一組不含介白素－6抑制劑的陰性對照組(negative control group)。比較兩組的結果之後可評估介白素－6抑制劑抑制介白素－6的活性。
本發明之抑制劑所投與的個體為哺乳動物。該哺乳動物最好為人類。
本發明之抑制劑可用藥物形式投與，並且可經由口服或非腸道(parenteral)方式進行全身性或局部投與。例如，可選擇靜脈注射(例如：點滴輸注)、肌內注射、腹膜內注射、皮下注射、栓劑、灌腸劑(enemas)、口服腸溶片(oral enteric tablets)或類似物。可根據病患的年紀與症狀選擇適當的投與方式。每次投與的有效劑量範圍為0.01－100毫克/每公斤體重。或者，所選擇的劑量範圍可為1－1000毫克/每位病患，最好的劑量範圍是5－50毫克/每位病患。較佳的劑量與投與方法如下：例如，當使用抗介白素－6受體抗體(anti－IL－6 receptor antibody)時，其有效劑量係游離抗體(free antibody)存在於血液中的量。具體地來說係經由靜脈注射(例如：點滴輸注)、皮下注射或這類方式投與0.5－40毫克/每公斤體重/每個月(四週)的劑量－最好是投與1－20毫克/每公斤體重/每個月的劑量，每個月投與1次至4次－例如：一週2次、一週1次、每二週1次或每四週1次。在檢視移植後的狀況與血液測試值的改變之後，可調整投與時程，例如：投與間隔從每週2次或每週1次延長至每二週1次、每三週1次或每四週1次。
本發明之抑制劑可包含藥學上可接受的載體(pharmaceutically acceptable carriers)，例如：防腐劑與安定劑。“藥學上可接受的載體”係指可與上述藥劑共同投與的原料；而其本身可能會產生或不會產生上述之抑制細胞毒性T細胞活化的作用。或者，該載體可為不具抑制細胞毒性T細胞活化之作用的原料，但是當其與介白素－6抑制劑併用時，會產生附加的或加乘的安定作用(additive or synergistic stabilizing effect)。
該等藥學上可接受的原料包括：無菌水、生理食鹽水、安定劑、賦形劑、緩衝劑、防腐劑、清潔劑、螯合劑(chelating agents)(乙烯二胺四醋酸二鈉(EDTA)與這類物質)以及黏合劑(binders)。
本發明中的清潔劑(detergents)包括非離子清潔劑(non－ionic detergents)，其典型例子包括：去水山梨醇脂肪酸酯(sorbitan fatty acid esters)－例如：去水山梨醇單辛酸酯(sorbitan monocaprylate)、去水山梨醇單月桂酸酯(sorbitan monolaurate)與去水山梨醇單棕櫚酸酯(sorbitan monopalmitate)；甘油脂肪酸酯(glycerin fatty acid esters)－例如：甘油單辛酸酯(glycerin monocaprylate)、甘油單肉豆蔻酸酯(glycerin monomyristate)與甘油單硬脂酸酯(glycerin monostearate)；聚甘油脂肪酸酯(polyglycerin fatty acid esters)，例如：單硬脂酸十甘油酯(decaglyceryl monostearate)、二硬脂酸十甘油酯(decaglyceryl distearate)與單亞麻油酸十甘油酯(decaglyceryl monolinoleate)；聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)－例如：聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monolaurate)、聚氧乙烯去水山梨醇單油酸酯(polyoxyethylene sorbitan monooleate)、聚氧乙烯去水山梨醇單硬脂酸酯(polyoxyethylene sorbitan monostearate)、聚氧乙烯去水山梨醇單棕櫚酸酯(polyoxyethylene sorbitan monopalmitate)、聚氧乙烯去水山梨醇三油酸酯(polyoxyethylene sorbitan trioleate)與聚氧乙烯去水山梨醇三硬脂酸酯(polyoxyethylene sorbitan tristearate)；聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbit fatty acid esters)，例如：聚氧乙烯山梨糖醇四硬脂酸酯(polyoxyethylene sorbit tetrastearate)與聚氧乙烯山梨糖醇四油酸酯(polyoxyethylene sorbit tetraoleate)；聚氧乙烯甘油脂肪酸酯(polyoxyethylene glycerin fatty acid esters)－例如：聚氧乙烯甘油單硬脂酸酯(polyoxyethylene glyceryl monostearate)；聚乙二醇脂肪酸酯(polyethylene glycol fatty acid esters)，例如：聚乙二醇二硬脂酸酯(polyethylene glycol distearate)；聚氧乙烯烷基醚(polyoxyethylene alkyl ethers)，例如：聚氧乙烯月桂醚(polyoxyethylene lauryl ether)；聚氧乙烯聚氧丙烯烷基醚(polyoxyethylene polyoxypropylene alkyl ethers)，例如：聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇(polyoxyethylene polyoxypropylene glycol)、聚氧乙烯聚氧丙烯丙基醚(polyoxyethylene polyoxypropylene propyl ether)與聚氧乙烯聚氧丙烯十六醚(polyoxyethylene polyoxypropylene cetyl ether)；聚氧乙烯烷基苯基醚(polyoxyethylene alkyl phenyl ethers)，例如：聚氧乙烯壬基苯基醚(polyoxyethylene nonylphenyl ether)；聚氧乙烯硬化蓖麻油(polyoxyethylene hardened castor oils)，例如：聚氧乙烯蓖麻油(polyoxyethylene castor oil)與聚氧乙烯硬化蓖麻油(polyoxyethylene hardened castor oil)(聚氧乙烯氫化蓖麻油(polyoxyethylene hydrogenated castor oil))；聚氧乙烯蜂蠟衍生物(polyoxyethylene beeswax derivatives)－例如：聚氧乙烯山梨糖醇蜂蠟(polyoxyethylene sorbit beeswax)；聚氧乙烯羊毛脂衍生物(polyoxyethylene lanolin derivatives)－例如：聚氧乙烯羊毛脂(polyoxyethylene lanolin)；以及聚氧乙烯脂肪酸醯胺(polyoxyethylene fatty acid amides)與親水親油平衡值(HLB)在6至18之間的同類物質，例如：聚氧乙烯硬脂酸醯胺(polyoxyethylene stearic acid amide)。
清潔劑也包括陰離子清潔劑(anionic detergents)，其典型的例子包括：具有一10至18個碳原子之烷基的烷基硫酸鹽(alkylsulfates)，例如：十六烷基硫酸鈉(sodium cetylsulfate)、月桂基硫酸鈉(sodium laurylsulfate)與油基硫酸鈉(sodium oleylsulfate)；聚氧乙烯烷基醚硫酸鹽(polyoxyethylene alkyl ether sulfates)，其中之烷基具有10至18個碳原子，所添加之環氧乙烷(ethylene oxide)的平均摩爾數(molar number)為2至4，其例子包括：聚氧乙烯月桂基硫酸鈉(sodium polyoxyethylene lauryl sulfate)；具有一8至18個碳原子之烷基的烷基磺基琥珀酸酯鹽類(alkyl sulfosuccinate ester salts)，如月桂基磺基琥珀酸酯鈉(sodium lauryl sulfosuccinate ester)；天然清潔劑，例如：卵磷脂(lecithin)；甘油磷脂(glycerophospholipids)；神經鞘磷脂類(sphingo－phospholipids)，例如：神經鞘磷脂(sphingomyelin)；以及蔗糖脂肪酸酯(sucrose fatty acid esters)，其中之脂肪酸具有12至18個碳原子。
上述之一個、二個或以上的清潔劑可與本發明之藥劑併用或添加至該藥劑中。用於製備本發明的較佳清潔劑包括聚氧乙烯去水山梨醇脂肪酸酯(polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)，例如：聚山梨糖醇酯(polysorbates)20、40、60與80。聚山梨糖醇酯20與80尤佳。聚氧乙烯聚氧丙烯乙二醇(Polyoxyethylene polyoxypropylene glycols)，例如：泊洛沙姆(poloxamer)(Pluronic F－68and such)也是較佳選擇。
所添加的清潔劑量當根據所用清潔劑的形式而改變。當使用聚山梨糖醇酯20與80時，其一般用量範圍為0.001至100毫克/毫升，最好是在0.003至50毫克/毫升之間，更好的是在0.005至2毫克/毫升之間。
本發明中的緩衝劑(buffers)包括磷酸鹽、檸檬酸鹽緩衝劑、醋酸、蘋果酸(malic acid)、酒石酸(tartaric acid)、琥珀酸(succinic acid)、乳酸(lactic acid)、磷酸鉀(potassium phosphate)、葡萄糖酸(gluconic acid)、癸酸(capric acid)、去氧膽酸(deoxycholic acid)、水楊酸(salicylic acid)、三乙醇胺(triethanolamine)、反丁烯二酸(fumaric acid)與其他的有機酸；以及碳酸緩衝劑(carbonic acid buffer)、Tris緩衝液(Tris buffer)、組胺酸緩衝劑(histidine buffer)與咪唑緩衝劑(imidazole buffer)。
將藥劑溶解在液體製劑(liquid preparations)領域所使用的水性緩衝液當中可配製液體製劑。緩衝液的濃度範圍通常在1至500毫摩爾(mM)之間，最好是在5至100毫摩爾之間，更好的是在10至20毫摩爾之間。
本發明之藥劑也可包含其他低分子量的多肽(polypeptides)；蛋白質－例如：血清白蛋白(serum albumin)、白明膠(gelatin)與免疫球蛋白(immunoglobulin)；胺基酸；糖與碳水化合物，例如：多醣(polysaccharides)與單醣(monosaccharides)、糖醇(sugar alcohols)與這類物質。
本文中的胺基酸包括鹼性胺基酸(basic amino acids)，例如：精胺酸(arginine)、離胺酸(lysine)、組胺酸(histidine)與鳥胺酸(ornithine)，以及這些胺基酸的無機鹽類(最好是鹽酸鹽與磷酸鹽，即胺基酸磷酸鹽(phosphate amino acids))。當使用游離胺基酸時，透過添加適當之生理上可接受的緩衝物質(例如：無機酸，特別是鹽酸、磷酸、硫酸、醋酸與甲酸，以及其鹽類)將其pH調整至較佳值。在此例中，使用磷酸鹽特別有利，因為磷酸鹽可給予相當安定的冷凍乾燥產物。當製劑大體上未含有機酸(例如：蘋果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸與反丁烯二酸)或對應的陰離子(蘋果酸鹽離子(malate ion)、酒石酸鹽離子(tartrate ion)、檸檬酸鹽離子(citrate ion)、琥珀酸鹽離子(succinate ion)、反丁烯二酸鹽離子(fumarate ion)以及這類離子)時，磷酸鹽便特別有益。較佳的胺基酸為精胺酸(arginine)、離胺酸(lysine)、組胺酸(histidine)與鳥胺酸(ornithine)。也可使用酸性胺基酸(acidic amino acids)－例如：麩胺酸(glutamic acid)與天門冬胺酸(aspartic acid)及其鹽類(最好為鈉鹽)；中性胺基酸，例如：異白胺酸(isoleucine)、白胺酸(leucine)、甘胺酸(glycine)、絲胺酸(serine)、羥丁胺酸(threonine)、纈胺酸(valine)、甲硫胺酸(methionine)、半胱胺酸(cysteine)與丙胺酸(alanine)；以及芳香族胺基酸(aromatic amino acids)，例如：苯丙胺酸(phenylalanine)、酪胺酸(tyrosine)、色胺酸(tryptophan)及其衍生物，N－乙醯色胺酸(N－acetyl tryptophan)。
本文之糖與碳水化合物(例如：多醣與單醣)的例子包括：聚葡萄醣(dextran)、葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、木糖(xylose)、甘露糖(mannose)、麥芽糖(maltose)、蔗糖(sucrose)、海藻糖(trehalose)以及棉子糖(raffinose)。
本文中的糖醇(sugar alcohols)包括：甘露糖醇(mannitol)、山梨聚糖醇(sorbitol)與肌醇(inositol)等。
當本發明之藥劑係配製成水性的注射溶液時，該藥劑可與生理食鹽水和/或含有葡萄糖或其他輔助劑(例如：D－山梨聚糖醇(D－sorbitol)、D－甘露糖(D－mannose)、D－甘露糖醇(D－mannitol)與氯化鈉)的等張溶液等混合。該水性溶液可與適當的助溶劑併用，該等助溶劑的例子包括：醇(乙醇與同類物質)、多元醇(polyalcohols)(丙二醇(propylene glycol)、聚乙二醇(PEG)與同類物質)或非離子清潔劑(聚山梨糖醇酯80(polysorbate 80)與氫化乙氧基化蓖麻油(HCO－50))。
如果有需要，該藥劑可另外包含稀釋劑、助溶劑、pH調節劑、鎮靜劑(soothing agents)、含硫的還原劑(sulfur－containing reducing agents)、抗氧化劑(antioxidants)與這類試劑。
本文中的含硫還原劑(sulfur－containing reducing agents)例子包括含有硫氫基(sulfhydryl groups)的化合物，例如：N－乙醯半胱胺酸(N－acetylcysteine)、N－乙醯高半胱胺酸(N－acetylhomocysteine)、類脂酸(thioctic acid)、硫二乙二醇(thiodiglycol)、硫乙醇胺(thioethanolamine)、硫甘油(thioglycerol)、硫山梨聚糖醇(thiosorbitol)、硫乙醇酸(thioglycolic acid)及其鹽類、硫代硫酸鈉(sodium thiosulfate)、麩胺硫(glutathione)以及具有1至7個碳原子的硫烷酸(thioalkanoic acids)。
此外，本發明中之抗氧化劑的例子包括：異抗壞血酸(erythorbic acid)、羥基甲苯二丁酯(dibutylhydroxy toluene)、丁基羥基茴香醚(butylhydroxy anisole)、α－生育酚(α－tocopherol)、維他命E(tocopherol acetate)、L－抗壞血酸(L－ascorbic acid)及其鹽類、L－抗壞血酸棕櫚酸酯(L－ascorbic acid palmitate)、L－抗壞血酸硬脂酸鹽(L－ascorbic acid stearate)、亞硫酸氫鈉(sodium hydrogen sulfite)、亞硫酸鈉(sodium sulfite)、沒食子酸三戊酯(triamyl gallate)、沒食子酸丙酯(propyl gallate)與螯合劑(chelating agents)，例如：乙烯二胺四醋酸二鈉(disodium ethylenediamine tetraacetate(EDTA))、焦磷酸鈉(sodium pyrophosphate)與偏磷酸鈉(sodium metaphosphate)。
如果有需要可將該藥劑充填至微膠囊(microcapsules)(羥甲基纖維素(hydroxymethylcellulose)、白明膠(gelatin)、聚[甲基異丁烯酸](poly[methylmethacrylic acid])或這類材質的微膠囊)內，或是製備成膠質藥物傳輸系統(colloidal drug delivery systems)(脂質體(liposome)、白蛋白微球(albumin microspheres)、微乳液(microemulsion)、奈米粒子(nano－particles)、奈米膠囊(nano－capsules)與這類傳輸系統)(見“Remington’s Pharmaceutical Science 16t h edition”,Oslo Ed.,1980以及這類參考文獻)。此外，將藥劑製備成緩釋藥劑(sustained－release agents)的方法也是習知方法，該等方法可應用於本發明中(Langeret al. ,J.Biomed.Mater.Res.1981,15：167－277；Langer,Chem.Tech.1982,12：98－105；美國專利案號(U.S.Patent No.)3,773,919；歐洲專利申請案號(European Patent Application No.)(EP)58,481；Sidmanet al. ,Biopolymers 1983,22：547－556；and EP 133,988)。
所使用之藥學上可接受的載體係根據劑型而適當地選自上述載體或併用，但並未限定。
本發明係有關於抑制移植後之排斥反應的方法，該方法包括投與介白素－6抑制劑至個體的步驟。
本發明也有關於抑制心臟移植之排斥反應的方法，該方法包括投與介白素－6抑制劑至個體的步驟。
本發明之方法所抑制的排斥反應形式並未特別限定，其較佳的抑制形式為急性排斥反應。可使用本發明之抑制劑的器官移植形式並未特別限定，本發明中較佳的移植器官包括：實質器官(parenchymal organs)－例如：心臟、肝臟、腎臟、胰臟、肺臟與小腸。本發明也可應用於組織的移植，例如：心瓣膜(cardiac valves)、血管、皮膚、骨與角膜。
本文中的“個體(subject)”係指被投與本發明之介白素－6抑制劑之生物或生物體的部位(organism body parts)。該等生物包括動物(例如：人類、家畜動物與野生動物)，但並未特別限定。該“生物體的部位”並未特別限定。
本文中的“投與(administration)”包括口服與非腸道的投與。口服投與的例子包括口服藥劑的投與。該等口服藥劑的例子包括：顆粒(granules)、粉末(powders)、錠劑(tablets)、膠囊(capsules)、溶液、乳劑(emulsions)以及懸浮液(suspensions)。
非腸道投與的例子包括注射投與。該等注射的例子包括：皮下注射、肌內注射以及腹膜內注射(intraperitoneal injection)。同時，利用基因治療技術(gene therapy techniques)將含有欲投與之寡核苷酸(oligonucleotides)的基因帶入活體，便可達到本發明之方法的效果。或者，本發明之藥劑可局部地投與至欲治療區域。例如，該藥劑在手術期間可經由局部注射而投與、透過使用導管而投與或經由去氧核糖核酸(該去氧核糖核酸編碼本發明之肽)之目標基因傳送(targeted gene delivery of DNAs encoding peptides of the present invention.)而投與。
本發明之抑制劑可在器官移植之前、器官移植時或器官移植之後投與至個體。另外，該等抑制劑可投與一次或重覆投與。
或者，當本發明之抑制劑投與至一生物被切除或被傳送的部位時，該抑制劑可“接觸”該部位。
在本發明中，“接觸(contacting)”係根據生物的狀況而進行。其例子包括噴塗本發明之抑制劑在生物體的部位，以及添加本發明之抑制劑至毀壞的生物體部位(crushed organism parts)，此外並無其他限制。當該生物體部位(organism part)為培養的細胞時，經由添加本發明之抑制劑至這些細胞的培養基或將含有本發明之寡核苷酸(oligonucleotides)的去氧核糖核酸帶入組成該生物體部位的細胞，便可達到上述的“接觸”。
當執行本發明之方法時，本發明之藥劑可為與至少一種已知化療劑(chemotherapeutant)組合使用之藥學組合物的一部分。或者，本發明之藥劑可與至少一種已知的免疫抑制劑(immunosuppressant)同時投與。在一實施例中，該已知的化療劑與本發明之抑制劑事實上可同時投與。
本發明之抑制細胞毒性T細胞活化的藥劑可在器官移植之後投與至器官移植的部位，或可在器官移植到目標區域之時同時投與。
所有在此引用的先前技術文件係以引用的方式併入本文中。
實施例
在下文中將具體地以實施例描述本發明，但該實施例並非用以限定本發明。
實施例1：分析抗介白素－6受體抗體之投與對於抗肥胖細胞瘤系P815細胞之細胞毒性T淋巴球活性的效力(Analysis of the effect of anti－IL－6 receptor antibody administration on CTL activity against cells of the mastocytoma line P815)
首先，將3 x 107 個肥胖細胞瘤系P815細胞(免疫細胞(immunizing cells))由腹膜內投與至C57BL/6小鼠體內。13天之後，分離該小鼠的脾臟，並且在不同的效應細胞/目標細胞(E/T)比例下以5 1 鉻－標記的P815細胞(目標細胞(target cells))聯合培養(co－cultured)脾臟細胞(效應細胞)，進而分析抗5 1 鉻－標記的P815的細胞毒性T淋巴球活性(CTL activity against5 1 Cr－labeled P815)。
經由確定每一細胞樣本的細胞溶解速率(cell lysis rate)便可分析細胞毒性T淋巴球活性。細胞溶解速率以下式表示：[(一實驗中所釋放的5 1 Cr量－自然釋放的5 1 Cr量)/(5 1 Cr的總釋放量－自然釋放的5 1 Cr量)]x 100
接下來，在投與自體抗原(isoantigen)之前的4天與1天，由腹膜內分別投與2000毫克與500毫克的抗介白素－6受體抗體(MR16－1)。然後在投與自體抗原之後的4天與9天投與500毫克的抗體。以上述的方法確定細胞毒性T淋巴球活性(CTL activity)。同時，在相同條件下，以大鼠G型球蛋白(rat IgG)作為對照抗體(取代抗介白素－6受體抗體)注射至對照小鼠。以上述的相同方法確定細胞毒性T淋巴球活性。
上述分析所得的結果顯示相較於未給與任何抗體的小鼠以及給與對照抗體的小鼠，投與抗介白素－6受體抗體之小鼠抗異體抗原(alloantigens)(肥胖細胞瘤系P815(mastocytoma line P815))的細胞毒性T淋巴球活性在統計學上明顯地降低(第一與第二圖)(p<0.01)。
當P815細胞被帶入介白素－6缺陷的C57BL/6小鼠(IL－6－deficient C57BL/6 mice)時，體內(in－vivo )細胞毒性T淋巴球活化的程度明顯地下降(未顯示數據)。實施例2：分析抗介白素－6受體抗體之投與對於抗EL4淋巴瘤細胞株之細胞毒性T淋巴球活性的效力(Analysis of the effect of anti－IL－6 receptor antibody administration on CTL activity against cells of the EL4 lymphoma cell line
利用上述的相同步驟將3 x 107 個EL4淋巴瘤細胞株的細胞(免疫細胞(immunizing cells))由腹膜內投與至BALB/c小鼠體內。13天之後，分離該小鼠的脾臟，並且在不同的效應細胞/目標細胞(E/T)比例下以5 1 鉻－標記的EL4細胞(目標細胞)聯合培養(co－cultured)脾臟細胞(效應細胞)。利用實施例1的方法分析抗5 1 鉻－標記的EL4的細胞毒性T淋巴球活性。
接下來，利用實施例1的相同步驟，在投與自體抗原(isoantigen)之前的4天與1天，由腹膜內分別投與2000毫克與500毫克的抗介白素－6受體抗體。然後在投與自體抗原之後的4天與9天投與500毫克的抗體。以上述的方法確定細胞毒性T淋巴球活性(CTL activity)。另外，在相同條件下，以大鼠G型球蛋白(rat IgG)作為對照抗體(取代抗介白素－6受體抗體)注射至對照小鼠。以上述的方法確定細胞毒性T淋巴球活性。
上述分析所得的結果顯示相較於未投與任何抗體的小鼠以及投與對照抗體的小鼠，投與抗介白素－6受體抗體之小鼠抗異體抗原(alloantigens)(EL4淋巴瘤細胞株(EL4 lymphoma line))的細胞毒性T淋巴球活性在統計學上明顯地降低(第三與第四圖)(p<0.01)。
上述的結果顯示該抗介白素－6受體抗體具有抑制細胞毒性T細胞活化的功能。
實施例3：評估小鼠模式中抗介白素－6受體抗體之投與對於急性心臟移植排斥反應的效力(Assessment of the effect of anti－IL－6 receptor antibody administration in a mouse model for acute heart transplant rejection)
利用小鼠的心臟移植模式評估抗介白素－6受體抗體(MR16－1)之投與對於移植後之急性排斥反應的作用。
本實驗所使用的小鼠係購自Japan SLC Inc.，並且飼養於Division of Laboratory Animal Research,Department of Life Science,Research Center for Human and Environmental Sciences,Shinshu University且遵循該中心的動物實驗計劃書飼養。異位心臟移植(heterotopic hearttransplantation)的小鼠模式係使用異體的(allogenic)BALB/c小鼠為供者(donors)，C57BL/6小鼠為受者(recipients)，而該小鼠模式係使用下述的步驟以顯微手術(microsurgery)完成。所使用的供者與受者係4至8週大的雄性小鼠。
經由腹膜內注射70毫克/公斤劑量的戊巴比妥鈉(pentobarbital sodium)(Nenbutal(R))以麻醉供者與受者小鼠。在結紮血管(除了將進行吻合術(anastomosis)的升主動脈(ascending aorta)與肺動脈(pulmonary artery)之外的血管)之後，分離將被移植的心臟。將該分離的心臟移植物保存在含有7.5%肝素(heparin)且置於冰上的冷生理食鹽水中。從受者小鼠腹部中央剖開，將腸外翻使腹主動脈(abdominal aorta)與後腔靜脈(inferior vena cava)露出。利用微鉗夾(microclips)夾住微血管使血流停止之後，在每一面作出1毫米的切口作為接合處(anastomotic sites)。利用10－0尼龍縫合線連續地縫合，使移植之心臟的主動脈與肺動脈分別與受者的腹主動脈與後腔靜脈接合。慢慢地鬆開該微鉗夾，使血流恢復。確定該移植之心臟再度跳動。在確定停止出血之後，縫合腹壁與皮膚，使腹部閉合。
每次的手術大約費時45分鐘。手術的成功率為95%或以上。
投與組在移植後立即投與以及在移植後3天與6天經由腹膜內注射投與2毫克/小鼠/每次投與(mg/mouse/administration)劑量的抗介白素－6受體抗體。每天以腹部觸診確定移植之心臟的跳動。當心臟完全停止跳動時，便斷定該心臟被排斥。此時，將受者小鼠麻醉並剖腹，以目視檢查確定心臟已停止跳動。排斥反應之前的時間係定義為心臟異體移植(cardiac allograft)的存活期。比較該存活期。
該結果顯示投與抗介白素－6受體抗體會抑制心臟異體移植物(cardiac allografts)的急性排斥反應並且在統計學上顯著地延長異體移植的存活(第五圖)(p＝0.0001)。
未投與組：7、7、7、7、7、7、8、9、9、9與10(天)。(11例，中間存活期(Median survival time)：7天)。
抗介白素－6受體抗體投與組：11、13、16、17、20與21(天)。(6例，中間存活期：16.5天)。
此外，在移植之後5天，從受者小鼠分離出心臟移植物，進行組織學檢查。
以移植後5天之心臟異體移植物的冷凍組織樣本製作病理組織切片，並且以蘇木素－伊紅(hematoxylin－eosin)染色。在未投與組可發現炎性細胞的瀰漫浸潤(diffuse infiltration)與心肌壞死(myocardial necrosis)現象。在投與抗介白素－6受體抗體的組中，炎性細胞的浸潤現象輕微，相對地心肌細胞便受到保護(cardiomyocytes)(第六圖)。
以“0：無排斥反應”至“4：嚴重排斥反應”的5種標準計算組織分析結果的分數(Rodriguez,E.R.The pathology of heart transplant biopsy specimens：revisiting the 1990 ISHLT working formulation.J Heart Lung Transplant.(2003)22,3－15、Billingham,M.E.et al. ,A working formulation for the standardization of nomenclature in the diagnosis of heart and lung rejection：Heart Rejection Study Group.The International Society for Heart Transplantation.J Heart Transplant.(1990)9,587－93)。當抗介白素－6受體抗體投與組的排斥分數與未投與組的分數互相比較時，投與組表現明顯的抑制作用(第七圖7)(p＝0.0006)。
上述的結果顯示在心臟移植的小鼠模式中，投與抗介白素－6受體抗體至受者小鼠可抑制心臟異體移植的急性排斥反應並且在統計學上明顯地延長異體移植的存活率。
本發明證明經由投與抗介白素－6受體抗體可抑制細胞毒性T細胞的活化。
本發明也證明經由投與抗介白素－6受體抗體可抑制移植後的免疫排斥反應(immunorejections)。
第一圖係顯示當每一小鼠皆被投與肥胖細胞瘤系P815(mastocytoma line P815)細胞時，未投與抗體、投與抗介白素－6受體抗體以及投與對照抗體之小鼠在每一種效應細胞/目標細胞比例(E/T ratio)下的特定細胞毒性活性(specific cytotoxic activity)(細胞毒性T淋巴球活性(cytotoxic T lymphocyte activity；CTL activity))。
第二圖係顯示當每一小鼠皆被投與肥胖細胞瘤系P815(mastocytoma line P815)細胞時，未投與抗體、投與抗介白素－6受體抗體以及投與對照抗體之小鼠在效應細胞/目標細胞比例(E/T ratio)為100時的特定細胞毒性活性(細胞毒性T淋巴球活性)。
第三圖係顯示當每一小鼠皆被投與EL4淋巴瘤細胞(EL4 lymphoma cells)時，未投與抗體、投與抗介白素－6受體抗體以及投與對照抗體之小鼠在每一種效應細胞/目標細胞比例(E/T ratio)下的特定細胞毒性活性(細胞毒性T淋巴球活性)。
第四圖係顯示當每一小鼠皆被投與EL4淋巴瘤細胞(EL4 lymphoma cells)時，未投與抗體、投與抗介白素－6受體抗體以及投與對照抗體之小鼠在效應細胞/目標細胞比例(E/T ratio)為400時的特定細胞毒性活性(細胞毒性T淋巴球活性)。
第五圖係顯示在心臟移植之小鼠模式中，投與抗介白素－6受體抗體組與未投與組之移植心臟的生存力。
第六圖係顯示在心臟移植之小鼠模式中，投與抗介白素－6受體抗體組與未投與組之小鼠在移植5天後所移植之心臟的組織病理影像照片。
第七圖係顯示在心臟移植之小鼠模式中，投與抗介白素－6受體抗體組與未投與組在移植5天後所移植之心臟之排斥分數(rejection scores)的比較結果。

Claims (3)

  1. 一種一識別介白素-6受體的抗體於製造用以抑制心臟移植排斥反應之藥劑中的用途，其中該抗體係擇自由PM-1抗體與MR16-1抗體所組成之群組。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的用途，其中該抗體為一重組抗體。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的用途，其中該抗體為一嵌合抗體(chimeric antibody)、人化抗體(humanized antibodies)或人類抗體(human antibodies)。
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