JP6048949B2 - 同種間での移植心臓、移植血管、または移植腎臓の生着を維持するために用いられる薬剤 - Google Patents
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Description
1)心臓、血管、腎臓の同種移植において、DNAM−1分子遺伝子欠損マウスをレシピエントとした際に、野生型マウスをレシピエントとした場合と比較すると、移植した心臓、血管、腎臓の生着期間が延長すること、
2)また野生型マウスにDNAM−1に対する中和抗体(TX42)を投与しておくと、心臓、血管の生着期間が延長すること、
3)CD8+細胞上のDNAM−1が臓器移植拒絶に働くこと、
4)さらにDNAM−1がメモリーCD8+T細胞の誘導を促進し、急性拒絶のみならず慢性拒絶にも働いていること。
[1]DNAM−1中和抗体を有効成分として含む、同種間での移植心臓、移植血管、または移植腎臓の生着を維持するために用いられる薬剤。
[2]前記DNAM−1中和抗体が、TX42である、[1]に記載の薬剤。
[3]さらに、免疫抑制剤を含む、[1]または[2]に記載の薬剤。
[4]前記免疫抑制剤が、FK506(タクロリムス)である、[3]に記載の薬剤。
1.本発明の薬剤
本発明に係る薬剤は、同種間での移植心臓、移植血管、または移植腎臓の生着を維持するために使用され、有効成分としてDNAM−1に対する中和抗体(a)を含み、必要に応じて、各種任意成分を含んでいてもよい。
本発明の薬剤は、必要に応じて、薬学的に許容され得る担体を含んでいてもよい。
本発明の薬剤は、同種間(すなわち、ドナーとレシピエントとが同種類の哺乳類)の心移植、血管移植、腎移植後に生じる拒絶反応を抑制させ、移植された心臓や血管、腎臓の生着期間を延長するために使用される。
[実施例で使用したマウス]
(i)C57BL/6(H−2b)野生型マウス(WTマウス)
(ii)C57BL/6(H−2b)DNAM−1ノックアウトマウス(DNAM−1 KOマウス)
なお、DNAM−1欠損マウスは、DNAM−1遺伝子の第エクソン2、3を欠損している。
(iii)CB6F1マウス
BALB/cマウスと上記C57BL/6(H−2b)野生型マウス(WTマウス)との交配で得られたマウスを、「CB6F1マウス」とした。
1.実施例A1
C57BL/6(H−2b)野生型マウス(野生型マウス、WTマウス)またはC57BL/6(H−2b)DNAM−1ノックアウトマウス(DNAM-1 KOマウス)をレシピエントとし、BALB/C(H−2d)野生型マウス(WTマウス)をドナーマウスとして用い、マウス心移植試験(異所性心移植試験)を実施した。
レシピエントマウスとしてC57BL/6(H−2b)WTマウス、ドナーマウスとしてBALB/C(H−2d)野生型マウス(WTマウス)の心臓を用いて、実施例A1と同様にして、マウス心移植試験(異所性心移植試験)を実施した。レシピエントマウスに、移植前(移植日数:0日)、移植日数3日目、6日目、9日目および12日目において、DNAM−1の中和抗体である「TX42」またはコントロール抗体(ラットIgG)を、0.25mg/レシピエントマウスの投与量になるように、腹腔内注射で投与し、実施例A1と同様にして移植心の生存率を評価した。
ドナーマウスとして、CB6F1マウス(雄または雌)を用い、抗体をレシピエントに腹腔内注射で投与した日時を、移植後0日(すなわち移植前)、3日目、6日目、9日目および12日目としたことを除いては、実施例A2と同様にして、マウス心移植(異所性心移植)および抗体を投与し、移植心の生存率を評価した。
免疫抑制剤である「FK506」(Sigma社製)を、移植後0日から6日目にかけて連続的に、0.1mg/マウス体重1kgの投与量になるように、腹腔内注射で投与したことを除いては、実施例A3と同様にして、マウス心移植(異所性心移植)を実施するとともに、抗体を投与し、移植心の生存率を評価した。
1.実施例B1
C57BL/6(H−2b)WTマウスまたはDNAM−1 KOマウスをレシピエントとし、BALB/c(H−2d)マウスをドナーマウスとして用い、マウス血管移植試験を実施した。
また、移植後0日目、12日目および20日目において、免疫抑制剤「FK506」を、0または0.1mg/マウス体重1kgの投与量で、皮下注射で投与した。
[病理解析]
回収された移植片を、10%ホルマリン緩衝液で固定し、パラフィンで包埋した後、切片を作成し、HE(ヘマトキシリン・エオシン)で染色した。染色された切片を顕微鏡観察に供し、血管内膜部分の面積(mm2)を算出して、肥厚の程度を比較した。
レシピエントから採血して得られた血漿を用いて抗アロ抗体価を測定した。
具体的には、BALB/cマウス由来の脾細胞(細胞数:1.5×105)に、PBS/2% FBSで希釈した血漿を全量25μlになるように加え、氷上で30分インキュベートした。次いで、PBS/2% FBSで洗浄した後、2次抗体として、FITC−結合型抗マウスIgG1、IgG2aまたはIgG2b(何れも、BD Biosciences社製)を用いて氷上で30分染色した。染色後、再度PBS/2% FBSで洗浄した後、2次抗体が細胞表面上に結合した細胞数をフローサイトメーター(FACSCalibur、日本BD社製)で測定した。そして、アロ抗原特異的抗体価を、異なる希釈率で上記血漿を加えたときの各2次抗体の陽性細胞の割合(%)として算出した。
[試験例C:同種抗原に対するメモリーT細胞の誘導におけるDNAM−1の役割]
1.実施例C1
C57BL/6(H−2b)WTマウスまたはDNAM−1 KOマウスをレシピエントとし、BALB/cマウス由来の皮膚を移植した。
実施例3Aで得られたBALB/cマウス由来の皮膚が移植されて6週間経過後のWTマウスまたはDNAM−1 KOマウスから、脾臓CD8+T細胞を調製した。調製されたCD8+T細胞を、免疫不全マウスであるRag1遺伝子欠損マウス移入して、レシピエントマウスを作製した。
DNAM−1 遺伝子欠損C57BL/6マウスまたは野生型C57BL/6マウスに、BALB/cマウス由来の皮膚を移植し、移植後6週間後に、各マウスの脾臓からCD4+T細胞およびCD8+T細胞を調製した。コントロールとして、皮膚移植をしなかった野生型C57BL/6マウスの脾臓CD4+T細胞およびCD8+T細胞を調製した。
図3−2(C)に示されるように、同系マウス(C57BL/6)の刺激ではCD4+T細胞およびCD8+T細胞の両方ともほとんど増殖しなかったが、BALB/cマウスの脾細胞で刺激した野生型CD4+T細胞およびCD8+T細胞では、二次刺激をしない野生型CD4+T細胞およびCD8+T細胞に比べて有意に増殖が亢進した。しかし、DNAM−1遺伝子欠損C57BL/6マウスからのCD4+T細胞およびCD8+T細胞は、BALB/cマウスの脾細胞で刺激しても増殖の亢進がみられなかった。以上の結果から、DNAM−1は同種抗原特異的メモリーCD8+T細胞の誘導に重要な役割を担うことが理解される。
1.実施例D1
C57BL/6(H−2b)WTマウスまたはDNAM−1 KOマウス、またはBALB/cマウスをレシピエントとし、BALB/cマウス由来の腎臓を移植した。具体的には、ドナーの右腎臓を摘出し、このとき、腎動脈、腎静脈と一緒に腹部大動脈、後大静脈の一部も含めて摘出し、大動脈、大静脈の端を吻合口とした。また尿管も一緒に摘出した。次に、レシピエントの右腎を腎動脈、腎静脈、尿管で結紮し取り除き、代わりに摘出したドナー腎を移植した。摘出腎の大動脈、大静脈をそれぞれレシピエントの腹部大動脈、下大静脈に端側吻合し、尿管はレシピエントの膀胱内に挿入固定した。血液を再潅流後、レシピエントの左腎を腎動脈、腎静脈、尿管で結紮して取り除き、移植腎のみとした。
図4−2(B)で示されるように、ナイーブC57BL/6(H−2b)WTマウス、および同系移植を受けたBALB/cマウスのアロ抗原特異的抗体に比較し、同種移植を受けたC57BL/6(H−2b)WTマウスまたはDNAM−1 KOマウスのドナー特異的抗体(DSA)は高値を示した。しかし、C57BL/6(H−2b)WTマウスとDNAM−1 KOマウスとで比較すると、WTマウスの方がKOマウスより、より高値を示す傾向がみられた。
Claims (4)
- DNAM−1中和抗体を有効成分として含む、同種間での心臓、血管または腎臓の移植後の急性拒絶および慢性拒絶を抑制し、移植された心臓、血管または腎臓の生着を維持するために用いられる薬剤。
- 前記DNAM−1中和抗体が、TX42である、請求項1に記載の薬剤。
- さらに、免疫抑制剤を含む、請求項1または2に記載の薬剤。
- 前記免疫抑制剤が、FK506(タクロリムス)である、請求項3に記載の薬剤。
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