WO2011108714A1 - 抗体定常領域改変体 - Google Patents

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WO2011108714A1
WO2011108714A1 PCT/JP2011/055101 JP2011055101W WO2011108714A1 WO 2011108714 A1 WO2011108714 A1 WO 2011108714A1 JP 2011055101 W JP2011055101 W JP 2011055101W WO 2011108714 A1 WO2011108714 A1 WO 2011108714A1
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numbering
substitution
amino acid
constant region
acid sequence
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PCT/JP2011/055101
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太一 倉持
智之 井川
敦彦 前田
風太 味元
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中外製薬株式会社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/522—CH1 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype
    • C07K2317/524—CH2 domain
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/71—Decreased effector function due to an Fc-modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/72—Increased effector function due to an Fc-modification

Definitions

  • the present invention provides an antibody constant region having an amino acid sequence modified from a naturally occurring antibody constant region, an antibody containing the constant region, a pharmaceutical composition containing the antibody, and a method for producing them.
  • Antibodies are attracting attention as pharmaceuticals because of their high stability in blood and few side effects. Among them, many IgG-type antibody drugs are on the market, and many antibody drugs have been developed (Non-patent Documents 1 and 2).
  • IgG1 subclass antibodies Most of the antibody drugs currently on the market are IgG1 subclass antibodies.
  • An IgG1-type antibody can bind to an Fc ⁇ receptor and can exhibit ADCC activity, and is considered useful in the case of an anti-cancer antibody drug.
  • the binding of Fc region to Fc ⁇ receptor which is important for effector functions such as ADCC, may be caused by unnecessary side effects. It is desirable to do (Non-patent Document 3).
  • Fc ⁇ receptor is expressed in antigen-presenting cells, molecules that bind to Fc ⁇ receptor are more likely to be presented with antigen, and antigenicity is enhanced by binding proteins and peptides to the Fc part of IgG1.
  • Non-Patent Document 4 Patent Document 1
  • Non-patent Document 5 As one of the causes of serious side effects observed in the Phase I clinical trial of TGN1412, interaction between the Fc portion of the antibody and the Fc ⁇ receptor is considered (Non-patent Document 5).
  • binding to Fc ⁇ receptor is not preferable in antibody drugs intended to neutralize the biological action of antigen.
  • Non-patent Document 6 As a method for reducing the binding to the Fc ⁇ receptor, although it cannot be completely eliminated, a method of changing the IgG antibody subtype from IgG1 to IgG2 or IgG4 is considered (Non-patent Document 6). However, IgG2 and IgG4 do not have no binding to Fc ⁇ receptor. As a method for eliminating the binding to the Fc ⁇ receptor, a method of introducing an artificial modification into the Fc region has been reported. For example, anti-CD3 antibody and anti-CD4 antibody cause side effects due to the effector function of the antibody.
  • Non-patent Documents 3 and 7 that do not exist in the wild-type sequence are introduced into the Fc ⁇ receptor-binding portion of the Fc region are currently being conducted.
  • Non-Patent Documents 5 and 8 it is possible to produce an Fc ⁇ receptor non-binding antibody by making the IgG1 Fc ⁇ R binding site (EU numbering: 233, 234, 235, 236, 327, 330, 331) an IgG2 and IgG4 sequence.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide an antibody constant region in which the binding activity to the Fc ⁇ receptor is reduced by modifying the amino acid of the antibody constant region. is there.
  • the present inventors have intensively studied to create an antibody constant region having a reduced binding activity to the Fc ⁇ receptor by modifying the amino acid sequence of the antibody constant region. As a result, the present inventors have succeeded in finding a novel constant region sequence that has a lower binding activity to the Fc ⁇ receptor than conventional antibody constant regions.
  • the present invention relates to an antibody constant region having improved safety, antigenic risk, physical properties (stability, uniformity), and superior blood retention by modifying the amino acid sequence of the antibody constant region.
  • the present invention provides an antibody comprising the antibody constant region, a pharmaceutical composition comprising the antibody, and a method for producing them.
  • the present invention provides the following [1] to [5].
  • Amino acid sequence including substitution of amino acid of EU numbering 327 with substitution of Ala to other amino acids, substitution of EU numbering 330 with other amino acids of Ala, and substitution of EU numbering 331 with other amino acids of Pro
  • An antibody constant region having, (d) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), substitution of EU numbering 234 with Leu to other amino acids, substitution of EU numbering 235 with other amino acids, EU numbering 327 other than Ala
  • Amino acid sequence including substitution of amino acid of EU numbering 330 with substitution of other amino acids of Ala, substitution of EU numbering 331 with other amino acids, and substitution of EU numbering 434 with Asn of other amino acids.
  • Antibody constant region (M225), (e) In the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), substitution of EU numbering 234 with Leu for other amino acids, substitution of EU numbering 235 with other amino acids, EU numbering 327 for other Ala, etc.
  • an antibody constant region (M112) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 11; (2) an antibody constant region (M174) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13; (3) an antibody constant region (M220) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14; (4) an antibody constant region (M225) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 15; (5) an antibody constant region (M226) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 16; (6) an antibody constant region (M228) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 17; (7) an antibody constant region (M213) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18; (8) an antibody constant region (M86) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20; (9) an antibody constant region (M221) comprising the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21; (10) an antibody constant region (M222) comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22
  • the present invention provides an antibody constant region having an amino acid sequence modified from a naturally occurring antibody constant region, an antibody containing the constant region, a pharmaceutical composition containing the antibody, and a method for producing them.
  • the IgG1, IgG2, IgG3, and IgG4 type constant regions exist in the heavy chain constant region of the antibody.
  • the heavy chain constant region is preferably a human heavy chain constant region.
  • human IgG1 or human IgG2 constant region is particularly preferable.
  • the human heavy chain constant region of the present invention may be a heavy chain constant region in which two or more different types of heavy chain constant regions are combined. Examples of heavy chain constant regions in which two or more types of heavy chain constant regions are combined are heavy chain constants in which the CH1 domain and hinge region are derived from human IgG1, and the CH2 domain and CH3 domain are derived from human IgG4. An area can be mentioned.
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region is known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequence of the human IgG1 constant region is shown in SEQ ID NO: 1
  • the amino acid sequence of the human IgG2 constant region is shown in SEQ ID NO: 2
  • the amino acid sequence of the human IgG4 constant region is shown in SEQ ID NO: 3.
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region in which the CH1 domain and hinge region are derived from human IgG1 and the CH2 domain and CH3 domain are derived from human IgG4 is shown in SEQ ID NO: 4.
  • a constant region lacking Cly terminal Gly and Lys may be used.
  • Human IgG1 constant region lacking C-terminal Gly and Lys is SEQ ID NO: 5
  • human IgG2 constant region lacking C-terminal Gly and Lys is SEQ ID NO: 6
  • human is lacking C-terminal Gly and Lys.
  • the IgG4 constant region is SEQ ID NO: 7, and the constant region in which C-terminal Gly and Lys are deleted and the CH1 domain and hinge region are derived from human IgG1 and the CH2 domain and CH3 domain are derived from human IgG4 is SEQ ID NO: 8. It describes. Accordingly, in the present invention, it is possible to replace the constant region lacking Cly terminal Gly and Lys with the constant region lacking C terminal Gly and Lys. Specifically, Cly terminal Gly and Lys can be replaced.
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 that is the constant region and the IgG2 constant region that is IgG2 constant region that does not lack C-terminal Gly and Lys, and the IgG4 constant region that is deleted of Gly and Lys of C-terminal
  • amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 which is an IgG1 / IgG4 constant region in which Gly and Lys are not deleted, can be replaced in the present specification.
  • the constant region used in the present invention may be a constant region lacking either C-terminal Gly or Lys.
  • a plurality of allotype sequences by gene polymorphism as human IgG2 constant regions are described in SequencesSof proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242, and any of them may be used in the present invention.
  • the constant regions other than the human IgG2 type (human IgG1, human IgG4, etc.) may be any allotype in the case where a plurality of allotypes exist.
  • the antibody constant region in which the amino acid of the present invention has been altered may contain other amino acid alterations and modifications as long as it contains the amino acid alteration of the present invention.
  • any of the constant regions containing the following modifications are included in the present invention.
  • a modification according to the present invention is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (human IgG1 constant region).
  • the modification based on the present invention is introduced into the amino acid sequence derived from the modified SEQ ID NO: 5 (human IgG1 constant region).
  • Modifications according to the present invention are introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 (human IgG1 constant region), and additional modifications are also introduced.
  • constant regions containing the following modifications are also included in the present invention.
  • a modification according to the present invention is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (human IgG2 constant region).
  • the modification based on the present invention is introduced into the amino acid sequence derived from the modified SEQ ID NO: 6 (human IgG2 constant region).
  • Modifications according to the present invention are introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (human IgG2 constant region), and additional modifications are also introduced.
  • constant regions containing the following modifications are also included in the present invention.
  • the modification based on the present invention is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (CH1 and Hinge are IgG1, CH2 and CH3 are IgG4 constant regions: human IgG1 / IgG4 constant regions).
  • the modification based on the present invention is introduced into the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CH1 and Hinge are IgG1, CH2 and CH3 are IgG4 constant regions: human IgG1 / IgG4 constant region).
  • the structure of the sugar chain to be bound may be any structure.
  • the 297th sugar chain of EU numbering may have any sugar chain structure (preferably a fucosylated sugar chain), or a sugar chain may not be bound (for example, by producing it in E. coli). Possible).
  • the present invention provides a heavy chain constant region with altered Fc ⁇ receptor (Fc ⁇ R) binding activity and / or FcRn binding activity compared to a human IgG1 constant region having a native amino acid sequence.
  • Fc ⁇ R Fc ⁇ receptor
  • the binding activity to Fc ⁇ R is preferably decreased.
  • the binding activity to FcRn is modified as compared with the human IgG1 constant region having a natural amino acid sequence, it is preferable that the binding activity to FcRn is increased.
  • the present invention relates to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), the substitution of EU numbering 234 with Leu to another amino acid, the substitution of EU numbering 235 to another amino acid, and the EU numbering 297 Asn.
  • Antibody constant regions are provided having amino acid sequences that include substitutions for other amino acids.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but it is preferable that Leu of EU numbering 234 is substituted with Ala, Leu of EU numbering 235 is substituted with Ala, and Asn of EU numbering 297 is substituted with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11 (M112).
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • the present invention replaces EU numbering 234 with Leu other amino acids, EU numbering 235 with Leu other amino acids, EU numbering 327 other than Ala
  • An antibody constant region having an amino acid sequence comprising a substitution of an amino acid with an amino acid, substitution of EU numbering 330 with another amino acid of Ala, and substitution of EU numbering 331 with another amino acid is provided.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but EU numbering 234 Leu is Ala, EU numbering 235 Leu is Ala or Asp, EU numbering 327 Ala is Gly, EU numbering 330 Ala is Ser, EU numbering Pro in 331 is preferably replaced with Ser.
  • Examples of such a heavy chain constant region include a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 13 (M174) or a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 18 (M213). . By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • Examples of the antibody constant region containing the amino acid modification described above include an antibody constant region containing a substitution of Asn in EU numbering 297 with another amino acid in addition to the modifications described above. Accordingly, the present invention relates to the substitution of EU numbering 234 with Leu in other amino acids, substitution of EU numbering 235 with Leu in other amino acids, EU numbering 297 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region). Substitution of Asn to other amino acids, substitution of EU numbering 327 to other amino acids of Ala, substitution of EU numbering 330 to other amino acids, and substitution of EU numbering 331 to other amino acids of Pro An antibody constant region having an amino acid sequence is provided.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Leu of EU numbering 234 is Ala, Leu of EU numbering 235 is Ala, Asn of EU numbering 297 is Ala, Ala of EU numbering 327 is Gly, EU numbering 330 of Preferably, Ala is replaced with Ser, and Pro of EU numbering 331 is replaced with Ser.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 14 (M220). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • an antibody constant region further comprising substitution of EU numbering 434 Asn with another amino acid can be mentioned.
  • the present invention relates to the substitution of EU numbering 234 with Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), substitution of EU numbering 235 with another amino acid in EU numbering 235, EU numbering 327 Substitution of Ala to other amino acids, substitution of EU numbering 330 to other amino acids of Ala, substitution of EU numbering 331 to other amino acids, and substitution of EU numbering 434 to other amino acids of Asn
  • An antibody constant region having an amino acid sequence is provided.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but EU numbering 234 Leu is Ala, EU numbering 235 Leu is Ala, EU numbering 327 Ala is Gly, EU numbering 330 Ala is Ser, EU numbering 331 Preferably, Pro is replaced with Ser, and Asn of EU numbering 434 is replaced with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 15 (M225). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R. In addition, by performing these substitutions, the binding activity to FcRn can be increased.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • antibody constant regions containing the amino acid modifications described above include, in addition to the above modifications, further substitution of EU numbering 268 with His for other amino acids, substitution of EU numbering 274 with Lys for other amino acids, EU numbering 355 Arg to other amino acids, EU numbering 356 Asp to other amino acids, EU numbering 358 Leu to other amino acids, and EU numbering 419 Gln to other amino acids
  • An antibody constant region containing the substitution of Accordingly, the present invention relates to the substitution of EU numbering 234 with Leu in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), substitution of EU numbering 235 with another amino acid in EU numbering 235, EU numbering 327 Substitution of Ala to other amino acids, substitution of EU numbering 330 to other amino acids, substitution of EU numbering 331 to other amino acids, substitution of EU numbering 268 to His other amino acids, EU numbering 274 Lys substitution with other amino acids, EU numbering 355 Arg substitution with other amino acids, EU numbering 3
  • the number of amino acids after substitution is not particularly limited, but Leu of EU numbering 234 is Ala, Leu of EU numbering 235 is Ala, Ala of EU numbering 327 is Gly, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Pro is Ser, EU numbering 268 His is Gln, EU numbering 274 Lys is Gln, EU numbering 355 Arg is Gln, EU numbering 356 Asp is Glu, EU numbering 358 Leu is Met, Gln in EU numbering 419 is preferably replaced with Glu.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 (M226).
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 17 (M228). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • the present invention provides an antibody constant region having an amino acid sequence comprising a substitution of Asn in EU numbering 297 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Asn in EU numbering 297 is preferably substituted with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 20 (M86). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • antibody constant regions containing the amino acid modifications described above include, in addition to the modifications described above, antibodies further comprising substitution of EU numbering 234 Val with other amino acids and substitution of EU numbering 237 Gly with other amino acids
  • a stationary region can be mentioned. Therefore, the present invention relates to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region), substitution of EU numbering 234 with Val for other amino acids, substitution of EU numbering 237 with Gly for other amino acids, and EU numbering 297.
  • An antibody constant region having an amino acid sequence comprising a substitution of Asn with another amino acid is provided.
  • amino acid after substitution is not particularly limited, it is preferable that Val of EU numbering 234 is substituted with Ala, Gly of EU numbering 237 is substituted with Ala, and Asn of EU numbering 297 is substituted with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 21 (M221). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • the present invention replaces EU numbering 330 with other amino acids of Ala, EU numbering 331 with other amino acids, and EU numbering 339 with Thr.
  • Antibody constant regions having amino acid sequences comprising substitutions for other amino acids are provided.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but it is preferable that Ala in EU numbering 330 is substituted with Ser, Pro in EU numbering 331 is substituted with Ser, and Thr of EU numbering 339 is substituted with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 (M222).
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • antibody constant regions containing the amino acid modifications described above include, in addition to the modifications described above, antibodies further comprising substitution of EU numbering 234 Val with other amino acids and substitution of EU numbering 237 Gly with other amino acids
  • a stationary region can be mentioned. Therefore, in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region), the present invention replaces EU numbering 234 with Val to another amino acid, EU numbering 237 with Gly other amino acid, EU numbering 330
  • An antibody constant region is provided having an amino acid sequence comprising a substitution of Ala with another amino acid, a substitution of EU numbering 331 with another amino acid of Pro, and a substitution of EU numbering 339 with another amino acid of Thr.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Val of EU numbering 234 is Ala, Gly of EU numbering 237 is Ala, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Pro is Ser, EU numbering 339 Thr is preferably substituted with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 23 (M223). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • antibody constant regions containing the amino acid modifications described above include, in addition to the modifications described above, antibodies further comprising substitution of EU numbering 234 Val with other amino acids and substitution of EU numbering 237 Gly with other amino acids
  • a stationary region can be mentioned. Therefore, the present invention relates to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region), substitution of EU numbering 234 with Val for other amino acids, substitution of EU numbering 237 with Gly for other amino acids, EU numbering 297 Substitution of Asn to other amino acids, substitution of EU numbering 330 to other amino acids of Ala, substitution of EU numbering 331 to other amino acids, and substitution of EU numbering 339 to other amino acids of Thr An antibody constant region having an amino acid sequence is provided.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Val of EU numbering 234 is Ala, Gly of EU numbering 237 is Ala, Asn of EU numbering 297 is Ala, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Preferably, Pro is replaced with Ser, and Thr of EU numbering 339 is replaced with Ala.
  • An example of such a heavy chain constant region is a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 24 (M224). By performing these substitutions, it becomes possible to reduce the binding activity to Fc ⁇ R.
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • the present invention replaces EU numbering 268 with His other amino acids, EU numbering 355 Arg with other amino acids, EU numbering 419 Gln
  • An antibody constant region is provided having an amino acid sequence that includes substitutions for other amino acids and substitutions of EU numbering 434 for Asn to other amino acids.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but His in EU numbering 268 may be replaced with Gln, Arg in EU numbering 355 may be replaced with Gln, Gln in EU numbering 419 may be replaced with Glu, and Asn in EU numbering 434 may be replaced with Ala. preferable.
  • a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 25 (M211).
  • M211 amino acid sequence of SEQ ID NO: 25
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • antibody constant regions containing the amino acid modifications described above include, in addition to the above modifications, further substitution of Cys with EU numbering 131, substitution of Arg with other amino acids of EU numbering 133, EU numbering Mention may be made of antibody constant regions comprising substitution of 137 Glu with other amino acids, substitution of EU numbering 138 with Ser with other amino acids and substitution of EU numbering 220 with Cys with other amino acids.
  • the present invention relates to the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region), substitution of EU numbering 268 to His other amino acids, substitution of EU numbering 355 to Arg other amino acids, EU numbering 419 Substitution of Gln to other amino acids, substitution of EU numbering 434 to Asn to other amino acids, substitution of EU numbering 131 to Cys to other amino acids, substitution of EU numbering 133 to Arg to other amino acids, EU numbering An antibody constant region is provided having an amino acid sequence comprising a substitution of 137 Glu with another amino acid, a substitution of EU numbering 138 with a Ser other amino acid and a substitution of EU numbering 220 with a Cys amino acid.
  • the substitution of Cys in EU numbering 219 with another amino acid may be performed.
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but the His of EU numbering 268 is Gln, Arg of EU numbering 355 is Gln, Gln of EU numbering 419 is Glu, Asn of EU numbering 434 is Ala, EU numbering 131 Cys is Ser, EU numbering 133 Arg is Lys, EU numbering 137 Glu is Gly, EU numbering 138 Ser is Gly, EU numbering 220 Cys is Ser (EU numbering 219 instead of EU numbering 220 In the case of substitution, Cy in EU numbering 219 is preferably substituted with Ser).
  • a heavy chain constant region comprising the amino acid sequence of SEQ ID NO: 26 (M209).
  • M209 amino acid sequence of SEQ ID NO: 26
  • the heavy chain constant region provided by the present invention only needs to have at least the amino acid substitution described above, and at the same time, other amino acid alterations (substitution, deletion, addition and / or insertion, etc.) and modifications have been made. Good.
  • the present invention further provides an antibody comprising the heavy chain constant region described above.
  • the light chain constant region may be any light chain constant region.
  • a light chain constant region having a natural amino acid sequence may be used, or a variant in which one or more amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the amino acid sequence of the natural light chain constant region May be used.
  • An example of a modified light chain constant region is a light chain constant region having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 30 (k3).
  • the amino acid modifications of the present invention include post-translational modifications.
  • modification of pyroglutamic acid by pyroglutamylation of N-terminal glutamine of the variable region is a post-translational modification well known to those skilled in the art. Therefore, the antibody of the present invention comprises a variable region in which the heavy chain is modified with pyroglutamic acid when the N-terminus of the heavy chain is glutamine.
  • addition or deletion of sugar chains can also be shown as post-translational modifications.
  • the 297th amino acid residue of the EU numbering can be modified with a sugar chain.
  • the sugar chain structure to be modified is not limited.
  • antibodies expressed in eukaryotic cells contain glycosylation in the constant region. Therefore, antibodies expressed in the following cells are usually modified with some sugar chain.
  • Mammalian antibody-producing cells ⁇ Eukaryotic cells transformed with an expression vector containing DNA encoding the antibody
  • the eukaryotic cells shown here include yeast and animal cells.
  • CHO cells and HEK293H cells are representative animal cells for transformation with an expression vector containing DNA encoding an antibody.
  • those having no sugar chain modification at this position are also included in the constant region of the present invention.
  • An antibody whose constant region is not modified with a sugar chain can be obtained by expressing a gene encoding the antibody in a prokaryotic cell such as Escherichia coli. More specifically, for example, sialic acid may be added to the sugar chain of the Fc region (MAbs. 2010 Sep-Oct; 2 (5): 519-27.).
  • the type of antigen, the form of the antibody, the origin of the antibody, etc. are not limited, and any antibody may be used, including a monoclonal antibody (including a full-length monoclonal antibody) and a polyclonal antibody. Regardless, monoclonal antibodies are preferred.
  • the origin of the antibody is not particularly limited, and examples thereof include a human antibody, a mouse antibody, a rat antibody, and a rabbit antibody.
  • the form of the antibody of the present invention may be an antibody variant, an antibody fragment, a multispecific antibody (for example, a bispecific antibody), a chimeric antibody, a humanized antibody, a fully humanized antibody, or the like.
  • a preferred embodiment of the antibody of the present invention includes a humanized antibody or a human antibody.
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies.
  • non-human animals for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known.
  • General genetic recombination techniques for obtaining humanized antibodies are also known.
  • Overlap-Extension-PCR is known as a method for transplanting a mouse antibody CDR into a human FR.
  • FR amino acid residues can be substituted so that the CDR of the reshaped human antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • Transgenic animals having all repertoires of human antibody genes are used as immunized animals, and desired by DNA immunization. Human antibodies can be obtained.
  • the V region of a human antibody is expressed as a single chain antibody (scFv) on the surface of the phage by the phage display method.
  • Phages expressing scFv that bind to the antigen can be selected.
  • the DNA sequence encoding the V region of the human antibody that binds to the antigen can be determined.
  • the V region sequence is fused in-frame with the sequence of the desired human antibody C region, and then inserted into an appropriate expression vector, whereby an expression vector can be prepared.
  • the human antibody is obtained by introducing the expression vector into a suitable expression cell as described above and expressing the gene encoding the human antibody.
  • These methods are already known (see International Publications WO1992 / 001047, WO1992 / 020791, WO1993 / 006213, WO1993 / 011236, WO1993 / 019172, WO1995 / 001438, and WO1995 / 015388).
  • variable region constituting the antibody of the present invention can be a variable region that recognizes any antigen.
  • the antigen is not particularly limited, and any antigen may be used.
  • antigens include, for example, ligands (cytokines, chemokines, etc.), receptors, cancer antigens, MHC antigens, differentiation antigens, immunoglobulins and immune complexes that partially contain immunoglobulins.
  • cytokines examples include interleukins 1-18 such as IL-6, colony stimulating factors (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.) ), Growth factors (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF, etc.), tumor necrosis factors (TNF- ⁇ , TNF- ⁇ ), lymphotoxin, erythropoietin, leptin, SCF, TPO, MCAF, BMP Can do.
  • interleukins 1-18 such as IL-6, colony stimulating factors (G-CSF, M-CSF, GM-CSF, etc.), interferons (IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , IFN- ⁇ , etc.) ), Growth factors (EGF, FGF, IGF, NGF, PDGF, TGF, HGF, etc.), tumor necrosis factors (TNF- ⁇ , TNF- ⁇ ),
  • chemokines include CC chemokines such as CCL1 to CCL28, CXC chemokines such as CXCL1 to CXCL17, C chemokines such as XCL1 to XCL2, and CX3C chemokines such as CX3CL1.
  • receptors include, for example, hematopoietic factor receptor family, cytokine receptor family, tyrosine kinase type receptor family, serine / threonine kinase type receptor family, TNF receptor family, G protein coupled receptor family, GPI Examples include receptors belonging to the receptor family such as anchor type receptor family, tyrosine phosphatase type receptor family, adhesion factor family, hormone receptor family, and the like.
  • Specific receptors belonging to the above receptor family include, for example, human or mouse erythropoietin (EPO) receptors (Blood (1990) 76 (1), 31-35, Cell (1989) 57 (2), 277- 285), human or mouse granulocyte colony stimulating factor (G-CSF) receptor (Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706, mG-CSFR, Cell (1990) 61 (2), 341-350), human or mouse thrombopoietin (TPO) receptor (Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644, EMBO J.
  • EPO erythropoietin
  • human or mouse leptin receptor human or mouse growth hormone (GH) receptor, human or mouse Interleukin (IL) -6 receptor, human or mouse interleukin (IL) -10 receptor, human or mouse insulin-like growth factor (IGF) -I receptor, human or mouse leukemia inhibitory factor (LIF) receptor
  • GH growth hormone
  • IL Interleukin
  • IL interleukin
  • IGF insulin-like growth factor
  • LIF leukemia inhibitory factor
  • Preferred examples include human or mouse ciliary neurotrophic factor (CNTF) receptor, human or mouse chemokine receptor such as CXCR4, and the like.
  • Cancer antigens are antigens that are expressed as cells become malignant, and are also referred to as tumor-specific antigens.
  • abnormal sugar chains appearing on the cell surface and protein molecules when cells become cancerous are also cancer antigens and are also called cancer sugar chain antigens.
  • cancer antigens include, for example, GPC3 (Int J Cancer. (2003) 103 (4), which belongs to the GPI-anchored receptor family as the above receptor but is expressed in several cancers including liver cancer. , 455-65), EpCAM (Proc Natl Acad Sci US A. (1989) 86 (1), 27-31), CA19-9, CA15-3, serial SSEA- expressed in multiple cancers including lung cancer 1 (SLX) and the like are preferable.
  • MHC antigens are mainly classified into MHC class I antigens and MHC class II antigens.
  • MHC class I antigens include HLA-A, -B, -C, -E, -F, -G, and -H.
  • MHC class II antigens include HLA-DR, -DQ, and -DP.
  • Differentiation antigens include CD1, CD2, CD4, CD5, CD6, CD7, CD8, CD10, CD11a, CD11b, CD11c, CD13, CD14, CD15s, CD16, CD18, CD19, CD20, CD21, CD23, CD25, CD28, CD29 , CD30, CD32, CD33, CD34, CD35, CD38, CD40, CD41a, CD41b, CD42a, CD42b, CD43, CD44, CD45, CD45RO, CD48, CD49a, CD49b, CD49c, CD49d, CD49e, CD49f, CD51, CD54, CD55 , CD56, CD57, CD58, CD61, CD62E, CD62L, CD62P, CD64, CD69, CD71, CD73, CD95, CD102, CD106, CD122, CD126, CDw130.
  • Immunoglobulins include IgA, IgM, IgD, IgG, and IgE.
  • the immune complex includes at least any component of immunoglobulin.
  • the site to be modified and the number of amino acids to be modified are not particularly limited.
  • amino acids present in CDR and / or FR can be appropriately modified.
  • the amino acid of the variable region is modified, although not particularly limited, it is preferable that the binding activity is maintained, for example, 50% or more, preferably 80% or more, more preferably 100% or more compared to before modification. It preferably has binding activity. Further, the binding activity may be increased by amino acid modification. For example, the binding activity may be 2 times, 5 times, 10 times, etc., compared to before the modification.
  • the amino acid sequence alteration may be at least one of substitution, addition, deletion, and modification of amino acid residues.
  • variable region of the antibody of the present invention may be of any sequence, mouse antibody, rat antibody, rabbit antibody, goat antibody, camel antibody, humanized antibody obtained by humanizing these non-human antibodies, and human It may be a variable region of an antibody of any origin, such as an antibody.
  • “Humanized antibody” refers to an antibody derived from a mammal other than a human, also referred to as a reshaped human antibody, such as a complementarity determination region (CDR) of a mouse antibody to the CDR of a human antibody. It is transplanted.
  • CDR complementarity determination region
  • variable region of the antibody of the present invention has a pH dependence on the binding to the antigen, and may be able to repeatedly bind to the antigen (WO / 2009/125825).
  • the light chain constant region of an antibody has a ⁇ chain and ⁇ chain type constant region, but any light chain constant region may be used. Furthermore, in the present invention, the light chain constant region may be a light chain constant region that has been modified by amino acid substitution, deletion, addition, and / or insertion.
  • the above-mentioned antibody constant region can be combined with various molecules such as physiologically active peptides and antigen-binding peptides to form a fusion protein.
  • molecules such as bioactive peptides and antigen-binding peptides include receptors, adhesion molecules, ligands, and enzymes, but are not limited thereto.
  • the antibody of the present invention includes a modified product as long as the antibody includes any of the constant regions described above.
  • modified antibodies include, for example, antibodies bound to various molecules such as polyethylene glycol (PEG) and cytotoxic substances.
  • PEG polyethylene glycol
  • cytotoxic substances such as a modified antibody can be obtained by chemically modifying the antibody of the present invention. Methods for modifying antibodies have already been established in this field.
  • the antibody of the present invention may be a bispecific antibody.
  • Bispecific antibody refers to an antibody having variable regions that recognize different epitopes in the same antibody molecule, but the epitope may exist in different molecules or in the same molecule. It may be.
  • the above-described antibody constant region can be used as a constant region of an antibody against an arbitrary antigen, and the antigen is not particularly limited.
  • the antibody of the present invention can be prepared by methods known to those skilled in the art. For example, as a method of substituting one or more amino acid residues with another amino acid of interest or a method of deleting one or more amino acid residues, for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, 1983 Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol.
  • an antibody that binds to a target antigen is obtained by a method well known to those skilled in the art. If the obtained antibody is a non-human animal antibody, it can be humanized. The binding activity of the antibody can be measured by methods known to those skilled in the art. Then one or more amino acid residues in the constant region of the antibody are substituted or deleted with other amino acids of interest.
  • the present invention relates to a method for producing an antibody in which an amino acid residue in a heavy chain constant region is modified, comprising the following steps (a) and (b): (A) a step of expressing DNA encoding a heavy chain in which one or more amino acid residues in the constant region are replaced with other amino acids of interest; and (b) a step of recovering the expression product of step (a) .
  • the present invention also provides a polynucleotide encoding a heavy chain constant region having an amino acid modification of the present invention, a vector containing the polynucleotide, a host cell retaining the vector, and an antibody comprising a step of culturing the host cell.
  • a method of manufacturing is provided. More specifically, the present invention provides a method for producing a heavy chain constant region having the amino acid modification of the present invention, comprising the following steps. (A) culturing a host cell comprising a vector into which a polynucleotide encoding a heavy chain constant region having an amino acid modification of the present invention has been introduced; (B) A step of obtaining a heavy chain constant region encoded by the gene.
  • a polynucleotide eg, DNA
  • a polynucleotide encoding the heavy chain is expressed.
  • a DNA encoding a heavy chain constant region in which one or more amino acid residues in the constant region are substituted with other amino acids of interest for example, a constant region of a DNA encoding a wild type heavy chain and / or light chain It can be obtained by obtaining a moiety and introducing appropriate substitutions so that a codon encoding a specific amino acid in the constant region encodes another amino acid of interest.
  • amino acid substitution is not limited to this, but includes the substitution described in the present specification.
  • DNA encoding a heavy chain in which one or more amino acid residues are substituted with other amino acids of interest can be produced by dividing into partial DNAs.
  • Examples of combinations of partial DNAs include DNA encoding a variable region and DNA encoding a constant region, or DNA encoding a Fab region and DNA encoding an Fc region, but are not limited to these combinations. is not.
  • DNA encoding a heavy chain variable region is incorporated into an expression vector together with DNA encoding a heavy chain constant region to construct a heavy chain expression vector.
  • DNA encoding a light chain variable region is incorporated into an expression vector together with DNA encoding a light chain constant region to construct a light chain expression vector.
  • expression vectors include, but are not limited to, SV40 virus-based vectors, EB virus-based vectors, BPV (papilloma virus) based vectors, and the like.
  • the host cell is cotransformed with the antibody expression vector prepared by the above method.
  • cells such as CHO cells (Chinese hamster ovary), microorganisms such as E. coli, yeast and Bacillus subtilis, and animals and plants are used as host cells (Nature Biotechnology 25, 563-565 (2007), Nature Biotechnology 16). , 773-777 (1998), Biochemical and Biophysical Research Communications 255, 444-450 (1999), Nature Biotechnology 23, 1159-1169 (2005), Journal of Virology 75, 2803-2809 (2001), Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 94-100-100 (2003)).
  • human fetal kidney cancer cell-derived HEK298H cells are used.
  • the lipofectin method (RWMalone et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), PLFelgner et al., Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 ( 1987), electroporation method, calcium phosphate method (FL GrahamGra & AJvan der Eb, Virology 52,456-467 (1973)), DEAE-Dextran method and the like are preferably used.
  • the expression product is then collected.
  • the expression product can be collected, for example, by culturing the transformant and then separating and purifying the antibody from the cells of the transformant or from the culture solution.
  • methods such as centrifugation, ammonium sulfate fractionation, salting out, ultrafiltration, 1q, FcRn, protein A, protein G column, affinity chromatography, ion exchange chromatography, and gel filtration chromatography are used. It can carry out in combination as appropriate.
  • the present invention provides an antibody produced as described above. That is, the present invention relates to an antibody that can be produced by the following steps. (a) expressing a heavy chain of an antibody including a variable region and a constant region and DNA encoding the light chain in a host cell; and (b) recovering the antibody expressed in (a).
  • the amino acid sequence of the heavy chain constant region is the above-described constant region provided by the present invention.
  • the variable region constituting the antibody of the present invention can be a variable region that recognizes any antigen.
  • the present invention provides a gene encoding the constant region of an antibody having the amino acid modification of the present invention.
  • the gene encoding the constant region of the present invention may be any gene such as DNA or RNA.
  • the present invention provides a vector containing the gene.
  • the type of vector can be appropriately selected by those skilled in the art depending on the host cell into which the vector is introduced. For example, the above-described vectors can be used.
  • the present invention relates to a host cell transformed with the vector.
  • the host cell can be appropriately selected by those skilled in the art. For example, the above-described host cell can be used.
  • the present invention relates to a method for producing a constant region of the present invention, comprising the steps of culturing the host cell and recovering the expressed constant region of the present invention.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG1 constant region set forth in SEQ ID NO: 5 (M112). (a) substituting Leu of EU numbering 234 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), (b) substituting Leu of EU numbering 235 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region), and (c) A step of substituting Asn of EU numbering 297 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but it is preferable that Leu of EU numbering 234 is substituted with Ala, Leu of EU numbering 235 is substituted with Ala, and Asn of EU numbering 297 is substituted with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG1 constant region set forth in SEQ ID NO: 5 (M174).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but EU numbering 234 Leu is Ala, EU numbering 235 Leu is Ala or Asp, EU numbering 327 Ala is Gly, EU numbering 330 Ala is Ser, EU numbering Pro in 331 is preferably replaced with Ser.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG1 constant region set forth in SEQ ID NO: 5 (M220).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Leu of EU numbering 234 is Ala, Leu of EU numbering 235 is Ala, Asn of EU numbering 297 is Ala, Ala of EU numbering 327 is Gly, EU numbering 330 of Preferably, Ala is replaced with Ser, and Pro of EU numbering 331 is replaced with Ser.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R and / or the method for reducing the binding activity to FcRn, which comprises the following steps in the human IgG1 constant region set forth in SEQ ID NO: 5 (M225).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but EU numbering 234 Leu is Ala, EU numbering 235 Leu is Ala, EU numbering 327 Ala is Gly, EU numbering 330 Ala is Ser, EU numbering 331 Preferably, Pro is replaced with Ser, and Asn of EU numbering 434 is replaced with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG1 constant region set forth in SEQ ID NO: 5 (M226).
  • the number of amino acids after substitution is not particularly limited, but Leu of EU numbering 234 is Ala, Leu of EU numbering 235 is Ala, Ala of EU numbering 327 is Gly, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Pro is Ser, EU numbering 268 His is Gln, EU numbering 274 Lys is Gln, EU numbering 355 Arg is Gln, EU numbering 356 Asp is Glu, EU numbering 358 Leu is Met, Gln in EU numbering 419 is preferably replaced with Glu.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG1 / IgG4 constant region set forth in SEQ ID NO: 8 (M228).
  • the amino acid after the substitution is not particularly limited, but Leu in EU numbering 234 is preferably replaced with Ala, Leu in EU numbering 235 is replaced with Ala, and Arg in EU numbering 409 is preferably replaced with Lys.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R comprising the following steps in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6 (M86).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Asn in EU numbering 297 is preferably substituted with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG2 constant region described in SEQ ID NO: 6 (M221). (a) substituting Val of EU numbering 234 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region); (b) substituting Gly of EU numbering 237 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region), and (c) A step of substituting Asn of EU numbering 297 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region).
  • Val of EU numbering 234 is replaced with Ala
  • Gly of EU numbering 237 is replaced with Ala
  • Asn of EU numbering 297 is replaced with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6 (M222).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but it is preferable that Ala in EU numbering 330 is substituted with Ser, Pro in EU numbering 331 is substituted with Ser, and Thr of EU numbering 339 is substituted with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6 (M223).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Val of EU numbering 234 is Ala, Gly of EU numbering 237 is Ala, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Pro is Ser, EU numbering 339 Thr is preferably substituted with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, comprising the following steps, in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6 (M224).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but Val of EU numbering 234 is Ala, Gly of EU numbering 237 is Ala, Asn of EU numbering 297 is Ala, Ala of EU numbering 330 is Ser, EU numbering 331 Preferably, Pro is replaced with Ser, and Thr of EU numbering 339 is replaced with Ala.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also provides a method for reducing the binding activity to Fc ⁇ R, the method for reducing the isoelectric point, and / or the binding activity to FcRn, comprising the following steps in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6. On how to raise (M211).
  • the amino acid after substitution is not particularly limited, but His in EU numbering 268 may be replaced with Gln, Arg in EU numbering 355 may be replaced with Gln, Gln in EU numbering 419 may be replaced with Glu, and Asn in EU numbering 434 may be replaced with Ala. preferable.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention also relates to a method for reducing Fc ⁇ R binding activity, a method for reducing isoelectric point, and an increase in FcRn binding activity including the following steps in the human IgG2 constant region set forth in SEQ ID NO: 6.
  • the amino acid after the substitution is not particularly limited, but His of EU numbering 268 is Gln, Arg of EU numbering 355 is Gln, Gln of EU numbering 419 is Glu, Asn of EU numbering 434 is Ala, EU numbering 131 It is preferable that Cys is replaced with Ser, Arg of EU numbering 133 is replaced with Lys, Glu of EU numbering 137 is replaced with Gly, Ser of EU numbering 138 is replaced with Gly, and Cy of EU numbering 220 is replaced with Ser.
  • step (i) is replaced with the step (i) of substituting Cys of EU numbering 220 with another amino acid in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region)
  • step (i) SEQ ID NO:
  • the step of substituting Cys of EU numbering 219 with another amino acid in the amino acid sequence of 6 (IgG2 constant region) may be used.
  • Cy of EU numbering 219 is preferably replaced with Ser.
  • the method of the present invention may include other amino acid alterations (substitutions, deletions, additions and / or insertions), modifications, and other steps as long as the above steps are included.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising the antibody of the present invention or the constant region of the present invention.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated by a known method by introducing a pharmaceutically acceptable carrier in addition to the antibody or constant region. For example, it can be used parenterally in the form of a sterile solution with water or other pharmaceutically acceptable liquid, or an injection of suspension.
  • a pharmacologically acceptable carrier or medium specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oil, emulsifier, suspension, surfactant, stabilizer, flavoring agent, excipient, vehicle, preservative It is conceivable to formulate by combining with a binder or the like as appropriate and mixing in a unit dosage form generally required for pharmaceutical practice.
  • the amount of active ingredient in these preparations is such that an appropriate volume within the indicated range can be obtained.
  • Sterile compositions for injection can be formulated according to normal pharmaceutical practice using a vehicle such as distilled water for injection.
  • Aqueous solutions for injection include, for example, isotonic solutions containing physiological saline, glucose and other adjuvants such as D-sorbitol, D-mannose, D-mannitol and sodium chloride, and suitable solubilizers such as You may use together with alcohol, specifically ethanol, polyalcohol, for example, propylene glycol, polyethylene glycol, nonionic surfactant, for example, polysorbate 80 (TM), HCO-50.
  • the oily liquid include sesame oil and soybean oil, which may be used in combination with benzyl benzoate or benzyl alcohol as a solubilizing agent.
  • buffer for example, phosphate buffer, sodium acetate buffer, a soothing agent, for example, procaine hydrochloride, stabilizer, for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • a soothing agent for example, procaine hydrochloride
  • stabilizer for example, benzyl alcohol, phenol, antioxidant.
  • Administration is preferably parenteral administration, and specific examples include injection, nasal administration, pulmonary administration, and transdermal administration.
  • the injection form it can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection, or the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition containing the antibody or the polynucleotide encoding the antibody can be selected, for example, in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg / body per patient, but is not necessarily limited to these values.
  • the dose and administration method vary depending on the weight, age, symptoms, etc. of the patient, but can be appropriately selected by those skilled in the art.
  • Asn of EU numbering 434 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 Asn at position 317 of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region).
  • His at EU numbering 268 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 His at position 151 of SEQ ID NO: 5 (IgG1 constant region).
  • Phe of EU numbering 234 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CH1 and Hinge are IgG1, CH2 and CH3 are IgG4 constant region: IgG1 / IgG4 constant region): 117th position of SEQ ID NO: 8 (IgG1 / IgG4 constant region) Phe.
  • Leu of EU numbering 235 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CH1 and Hinge are IgG1, CH2 and CH3 are IgG4 constant region: IgG1 / IgG4 constant region) 118 of SEQ ID NO: 8 (IgG1 / IgG4 constant region) Leu.
  • Arg of EU numbering 409 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 8 (CH1 and Hinge are IgG1, CH2 and CH3 are IgG4 constant region: IgG1 / IgG4 constant region): 292nd of SEQ ID NO: 8 (IgG1 / IgG4 constant region) Arg.
  • Asn of EU numbering 434 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region) Asn at position 313 of SEQ ID NO: 6 (IgG2 constant region).
  • amino acid sites modified in the constant region are shown by the EU numbering system (see Sequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No. 91-3242).
  • Example 1 Evaluation of binding of constant regions IgG1, 2, and 4 to Fc ⁇ R
  • the amino acid sequence of anti-IL-6 receptor antibody tocilitumab, trade name: Actemra, antibody class: IgG1
  • an antibody having a sequence excluding GK which is the C-terminal amino acid sequence of the constant region was prepared.
  • H0-G1d / L0-k0 consisting of H0-G1d (SEQ ID NO: 31) as the H chain and L0-k0 (SEQ ID NO: 32) as the L chain was prepared.
  • H0-G2d (acid sequence number: 33) as H chain
  • H0-G2d / L0-k0 consisting of L0-k0 (SEQ ID NO: 32) as L chain
  • H0-G4d (as H chain) Acid SEQ ID NO: 34) and H0-G4d / L0-k0 consisting of L0-k0 (acid SEQ ID NO: 32) as the L chain
  • Expression and purification of each antibody were performed by the method described in Reference Example 1.
  • Affinity against Fc ⁇ receptor (Fc ⁇ R) was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. The binding of each subclass to Fc ⁇ R was almost correlated with the reported rank (References 6 and 7).
  • Example 2 Production and Evaluation of Constant Region IgG1 that Reduces Binding to Fc ⁇ R
  • Anti-CD3 antibody has been reported to release cytokines (Reference Documents 1 and 2).
  • One of the causes is thought to be that cells are activated and cytokines are released by association of constant regions with Fc ⁇ R.
  • Clinical trials of anti-CD3 antibodies having a constant region with reduced binding to Fc ⁇ R in the constant region have been conducted (Reference Documents 1 and 2).
  • Otelixizumab and Teplizumab are anti-CD3 antibodies having a constant region with reduced binding to Fc ⁇ R.
  • the constant region of Otelixizumab is modified to N297A (hereinafter referred to as Agly), and the constant region of Teplizumab is modified to L234A and L235A (hereinafter referred to as LALA). These modifications have been shown to reduce binding to Fc ⁇ R. Therefore, constant regions into which these modifications were introduced, M111 (SEQ ID NO: 10) and M119 (SEQ ID NO: 12) were prepared. An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1. When comparing the constant region of G1 and G4, the amino acids of 327, 330, and 331 are different, and these amino acids are important for ADCC (Reference 3).
  • a constant region M16 (SEQ ID NO: 9) into which these modifications were introduced was prepared.
  • An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1.
  • Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, M111 bound to Fc ⁇ I, M119 bound to Fc ⁇ I and III, and M16 bound to almost all Fc ⁇ Rs. This revealed that none of the prepared constant regions lost binding to Fc ⁇ R completely.
  • Example 3 Production and Evaluation of Novel Constant Region IgG1 that Reduces Binding to Fc ⁇ R
  • M112 SEQ ID NO: 11
  • M174 combined with these modifications
  • SEQ ID NO: 13 modifications
  • M220 SEQ ID NO: 14
  • An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1.
  • Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, the binding to Fc ⁇ R was greatly reduced in the constant regions of M112, M174, and M220.
  • M226 In order to reduce the binding to Fc ⁇ R, M226 has substituted the sequence of 327, 330, 331 from G1 to G4, and in order to reduce pI, some sequences were changed from the sequence of G1 to the sequence of G4. Has been replaced. Therefore, M228 (SEQ ID NO: 17) was prepared by changing the amino acid after 237 to G4 and modifying R409K to improve acid stability.
  • An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1. Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, the binding of any constant region to Fc ⁇ R was lower than that of IgG1.
  • Example 5 Production and evaluation of a novel constant region IgG1 that decreases the binding to Fc ⁇ R Compared with M112 and M220, M174 slightly binds to each Fc ⁇ R, and thus further optimization was performed.
  • M213 SEQ ID NO: 18 in which L235D was modified was prepared.
  • An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1.
  • Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, it was revealed that the binding of M213 to Fc ⁇ R was lower than that of M174.
  • Example 6 Production and evaluation of constant region IgG2 that decreases binding to Fc ⁇ R As described in Example 1, cytokine release has been reported for antibodies against CD3 (References 1 and 2). Visilizumab that has been optimized for IgG2 to reduce binding to the constant region Fc ⁇ R has been produced. (References 1, 2). Visilizumab has been modified V234A and G237A. Therefore, M120 (SEQ ID NO: 19) in which this modification was performed on IgG2 was prepared. Antibodies having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared were prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1. Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. It was clarified that the affinity of IgG2 was lower than the affinity of M120 for Fc ⁇ R, but not completely.
  • Example 7 Production and evaluation of novel constant region IgG2 that reduces binding to Fc ⁇ R To completely eliminate binding of constant region IgG2 to various Fc ⁇ Rs, M86 (SEQ ID NO: 20), M221 (SEQ ID NO: 21), M222 (SEQ ID NO: 22), M223 (SEQ ID NO: 23), and M224 (SEQ ID NO: 24) were prepared. An antibody having the variable region used in Example 1 and the constant region prepared was prepared, and each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1. Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, it was revealed that the binding of any constant region to Fc ⁇ R was lower than that of IgG2.
  • Example 8 Effect of binding to Fc ⁇ R by optimization of a new constant region M211 (SEQ ID NO: 25) in which the isoelectric point of the constant region was decreased and the binding to FcRn was increased in order to improve the half-life of M120. ) was produced.
  • M209 SEQ ID NO: 26
  • Cys was modified in order to reduce the hetero component of IgG2 relative to M211 was prepared.
  • M211 / k3 and M209 / k3 were prepared by combining the prepared constant region and k3 having a shorter L chain length.
  • Each antibody was prepared by the method described in Reference Example 1. Affinity against Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2 using the prepared antibody. The results are shown in FIG. As a result, it was revealed that the binding of M209 and M211 to Fc ⁇ R was lower than that of IgG2.
  • Example 9 Effect of binding of new constant region to Fc ⁇ R An antibody in which constant regions IgG1, IgG2, and IgG4 were bound to anti-human CXCR4 antibody was prepared.
  • the constant region IgG1 was modified as described above. That is, anti-CXCR4 constant region modified antibodies bound to the above-mentioned constant regions, M119, M111, M112, M16, M174, and M220 were prepared, and their affinity for Fc ⁇ R was measured by the method described in Reference Example 2. As a result, it was revealed that M112 and M220 completely lost the affinity for Fc ⁇ R, and that M174 also had a greatly reduced affinity for FcgR compared to IgG1.
  • the prepared plasmid was transiently introduced into human fetal kidney cancer cell-derived HEK293H strain (Invitrogen) or FreeStyle293 cells (Invitrogen) to express the antibody. After the obtained culture supernatant was collected, the culture supernatant was obtained through 0.22 ⁇ m or filter MILLEX®-GV (Millipore) or 0.45 ⁇ m filter MILLEX®-GV (Millipore). From the obtained culture supernatant, the antibody was purified by rProtein A Sepharose TM Fast Flow (GE Healthcare) by a method known to those skilled in the art. The purified antibody concentration was determined by measuring the absorbance at 280 nm using a spectrophotometer, and calculating the antibody concentration using the extinction coefficient calculated by the PACE method from the obtained value (Protein Science 1995; 4: 2411- 2423).
  • the binding amount of Fc ⁇ receptor depends on the amount of captured antibody
  • the binding amount of Fc ⁇ receptor was corrected so that the capture amount of each antibody was 2000 RU (resonance unit). Further, the antibody captured on the chip was washed by reacting 10 mM glycine-HCl, pH 1.5 at a flow rate of 30 ⁇ L / min for 30 seconds, and the chip was regenerated and used repeatedly.
  • Biacore T100 (GE Healthcare) was used to analyze the interaction between the antibody and the Fc ⁇ receptor.
  • HBS-EP + (GE Healthcare) was used as the running buffer, and the measurement temperature was 25 ° C.
  • Protein L (ACTIGEN) was immobilized by the amine coupling method, and the target antibody was captured there.
  • the Fc ⁇ receptor diluted with a running buffer was allowed to interact therefor at a flow rate of 5 ⁇ L / min for 3 minutes, and the binding amount to the antibody was measured and compared between the antibodies.
  • the binding amount of Fc ⁇ receptor depends on the amount of captured antibody, the binding amount of Fc ⁇ receptor was corrected so that the capture amount of each antibody was 100 RU.
  • 10 mM glycine-HCl, pH 1.5 was reacted at a flow rate of 30 ⁇ L / min for 30 seconds to wash the antibody captured on the chip, and the chip was regenerated and used repeatedly.
  • Non-patent literature Expert Rev. Clin. Innunol. 5, 499-521, 2009 2.
  • Non-patent literature Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 13,124-135,2010 3.Non-patent literature, Eur J Immunol, 23, 1098-1104,1993 4.
  • Non-patent literature Curr. Opin. 20, 1-7, 2009 5.
  • Patent literature PCT / JP2008 / 067534 (WO2009 / 041643) 6.Non-patent literature, Blood.113,3716-3725,2009 7.
  • Non-patent literature Trends Immunol. 22,510-6. 2001

Abstract

本発明者らは、抗体の定常領域のアミノ酸配列を改変することで、Fcγレセプターへの結合活性を低下させた抗体定常領域の創製に向けて、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、従来の抗体定常領域よりもFcγレセプターへの結合活性が低下している新規な定常領域配列を見出すことに成功した。

Description

抗体定常領域改変体
　本発明は、天然由来の抗体定常領域からアミノ酸配列が改変された抗体定常領域、該定常領域を含む抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに、それらの製造方法を提供する。
　抗体は血中での安定性が高く、副作用も少ないことから医薬品として注目されている。中でもIgG型の抗体医薬は多数上市されており、現在も数多くの抗体医薬が開発されている（非特許文献１、非特許文献２）。
　現在上市されている抗体医薬のほとんどがIgG1サブクラスの抗体である。IgG1タイプの抗体はFcγレセプターに結合可能であり、ADCC活性を発揮することが可能であり、抗ガン抗体医薬の場合は有用であると考えられている。しかし、抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においてはFc領域のADCC等のエフェクター機能に重要なFcγレセプターへの結合は不要な副作用を惹起する可能性があることから排除することが望ましい（非特許文献３）。さらに、Fcγレセプターは抗原提示細胞に発現していることから、Fcγレセプターに結合する分子は抗原提示されやすくなり、IgG1のFc部分にタンパク質やペプチドを結合することによって抗原性が増強する（させることが可能である）ことが報告されている（非特許文献４、特許文献１）。またTGN1412のPhaseI臨床試験で見られた重大な副作用の原因の一つとして、抗体のFc部分とFcγレセプターの相互作用が考えられている（非特許文献５）。このように、副作用や抗原性の点から考えると、抗原の生物学的作用を中和することが目的の抗体医薬においてはFcγレセプターへの結合は好ましくないと考えられる。
　Fcγレセプターへの結合を完全になくすことはできないが低下させる方法としては、IgG抗体のサブタイプをIgG1からIgG2あるいはIgG4に変える方法が考えられる（非特許文献６）。ただし、IgG2やIgG4においてもFcγレセプターへの結合が全くない訳ではない。Fcγレセプターへの結合をなくす方法としては、人工的な改変をFc領域に導入する方法が報告されている。例えば、抗CD3抗体や抗CD4抗体は抗体のエフェクター機能が副作用を惹起する。そこで、Fc領域のFcγレセプター結合部分に野生型配列には存在しないアミノ酸変異（非特許文献３、７）を導入したFcγレセプター非結合型の抗CD3抗体や抗CD4抗体の臨床試験が現在行われている（非特許文献５、８）。また、IgG1のFcγR結合部位（EUナンバリング：２３３、２３４、２３５、２３６、３２７、３３０、３３１番目）をIgG2およびIgG4の配列にすることでFcγレセプター非結合型抗体を作製することが可能である（非特許文献９、特許文献２）。しかしながら、全てのFcγR（FcγRI,FcγIIa, FcγRIIIa）に対して結合を完全になくした定常領域の報告はない。副作用の観点から考えると、全てのFcγRに対して結合を完全になくした定常領域の作製が臨まれる。
　尚、本出願の発明に関連する先行技術文献情報を以下に示す。
US 20050261229A1 WO 99/58572
Monoclonal antibody successes in the clinic, Janice M Reichert, Clark J Rosensweig, Laura B Faden & Matthew C Dewitz, Nature Biotechnology 23, 1073 - 1078 (2005) Pavlou AK, Belsey MJ., The therapeutic antibodies market to 2008., Eur J Pharm Biopharm. 2005 Apr;59(3):389-96. Reddy MP, Kinney CA, Chaikin MA, Payne A, Fishman-Lobell J, Tsui P, Dal Monte PR, Doyle ML, Brigham-Burke MR, Anderson D, Reff M, Newman R, Hanna N, Sweet RW, Truneh A. Elimination of Fc receptor-dependent effector functions of a modified IgG4 monoclonal antibody to human CD4. J Immunol. 2000 Feb 15;164(4):1925-33. Guyre PM, Graziano RF, Goldstein J, Wallace PK, Morganelli PM, Wardwell K, Howell AL. Increased potency of Fc-receptor-targeted antigens. Cancer Immunol Immunother. 1997 Nov-Dec;45(3-4):146-8. Strand V, Kimberly R, Isaacs JD. Biologic therapies in rheumatology: lessons learned, future directions. Nat Rev Drug Discov. 2007 Jan;6(1):75-92. Gessner JE, Heiken H, Tamm A, Schmidt RE. The IgG Fc receptor family. Ann Hematol. 1998 Jun;76(6):231-48. Cole MS, Anasetti C, Tso JY. Human IgG2 variants of chimeric anti-CD3 are nonmitogenic to T cells. J Immunol. 1997 Oct 1;159(7):3613-21. Chau LA, Tso JY, Melrose J, Madrenas J. Hu M291(Nuvion), a humanized Fc receptor-nonbinding antibody against CD3, anergizes peripheral blood T cells as partial agonist of the T cell receptor.Transplantation. 2001 Apr 15;71(7):941-50. Armour KL, Clark MR, Hadley AG, Williamson LM., Recombinant human IgG molecules lacking Fcgamma receptor I binding and monocyte triggering activities. Eur J Immunol. 1999 Aug;29(8):2613-24.
　本発明はこのような状況に鑑みて為されたものであり、その目的は、抗体定常領域のアミノ酸を改変することにより、Fcγレセプターへの結合活性を低下させた抗体定常領域を提供することにある。
　本発明者らは、抗体の定常領域のアミノ酸配列を改変することで、Fcγレセプターへの結合活性を低下させた抗体定常領域の創製に向けて、鋭意研究を行った。その結果、本発明者らは、従来の抗体定常領域よりもFcγレセプターへの結合活性が低下している新規な定常領域配列を見出すことに成功した。
　本発明は、抗体の定常領域のアミノ酸配列の改変により、より改善された安全性・抗原性リスク・物性（安定性、均一性）を有し、より優れた血中滞留性を有する抗体定常領域、該抗体定常領域を含む抗体、該抗体を含む医薬組成物、並びに、それらの製造方法を提供するものである。
　本発明は、より具体的には、下記〔１〕～〔５〕を提供するものである。
〔１〕以下の(a)～(m)いずれかに記載の抗体定常領域。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M112）、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M174、M213）、
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M220）、
(d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M225）、
(e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング274のLysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング356のAspの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング358のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M226）、
(f)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のPheの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング409のArgの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M228）、
(g)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M86）、
(h)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M221）、
(i)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M222）、
(j)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M223）、
(k)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M224）、
(l)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M211）、または
(m)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング131のCysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング133のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング137のGluの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング138のSerの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング220のCysの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M209）
〔２〕以下の(A)～(M)いずれかに記載の抗体定常領域。
(A)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M112）、
(B)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaまたはAspへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、およびEUナンバリング331のProのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M174、M213）、
(C)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング297のAsnのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、およびEUナンバリング331のProのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M220）、
(D)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング434のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M225）、
(E)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング274のLysのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング356のAspのGluへの置換、EUナンバリング358のLeuのMetへの置換、およびEUナンバリング419のGlnのGluへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M226）、
(F)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のPheのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、およびEUナンバリング409のArgのLysへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M228）、
(G)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M86）、
(H)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyの他Alaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M221）、
(I)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング339のThrのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M222）、
(J)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyのAlaへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング339のThrのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M223）、
(K)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyのAlaへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、EUナンバリング339のThrのAlaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M224）、
(L)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング419のGlnのGluへの置換およびEUナンバリング434のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M211）、または
(M)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング419のGlnのGluへの置換、EUナンバリング434のAsnのAlaへの置換、EUナンバリング131のCysのSerへの置換、EUナンバリング133のArgのLysへの置換、EUナンバリング137のGluのGlyへの置換、EUナンバリング138のSerのGlyへの置換およびEUナンバリング220のCysのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M209）
〔３〕以下の(1)～(14)いずれかに記載の抗体定常領域。
(1)　配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M112）、
(2)　配列番号：１３に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M174）、
(3)　配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M220）、
(4)　配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M225）、
(5)　配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M226）、
(6)　配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M228）、
(7)　配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M213）、
(8)　配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M86）、
(9)　配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M221）、
(10) 配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M222）、
(11) 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M223）、
(12) 配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M224）、
(13) 配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M211）、または
(14) 配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M209）
〔４〕〔１〕～〔３〕いずれかに記載の抗体定常領域を含む抗体。
〔５〕〔４〕に記載の抗体を含む医薬組成物。
H0-G1d/L0-k0、H0-G2d/L0-k0、およびH0-G4d/L0-k0の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M111、M119、およびM16の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M112、M174、およびM220の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M225、M226、およびM228の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M174、およびM213の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 wt-IgG2、およびM120の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M86、M221、M222、M223およびM224の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。 M209、およびM211の FcγRに対する結合量の比較を示す図である。
　本発明は、天然由来の抗体定常領域からアミノ酸配列が改変された抗体定常領域、該定常領域を含む抗体、該抗体を含む医薬組成物、ならびに、それらの製造方法を提供する。
　抗体の重鎖定常領域にはIgG1、IgG2、IgG3、IgG4タイプの定常領域が存在している。本発明においては特に限定されないが、重鎖定常領域は好ましくはヒト重鎖定常領域である。又、本発明においては特にヒトIgG1またはヒトIgG2定常領域が好ましい。又、本発明のヒト重鎖定常領域は異なる2つ以上のタイプの重鎖定常領域が組み合わされた重鎖定常領域であってもよい。そのような２つ以上のタイプの重鎖定常領域が組み合わされた重鎖定常領域の例として、CH1ドメインおよびヒンジ領域がヒトIgG1由来でありCH2ドメインおよびCH3ドメインがヒトIgG4由来である重鎖定常領域を挙げることができる。
　重鎖定常領域のアミノ酸配列は当業者に公知である。ヒトIgG1定常領域のアミノ酸を配列番号：１に、ヒトIgG2定常領域のアミノ酸配列を配列番号：２に、ヒトIgG4定常領域のアミノ酸配列を配列番号：３に記載する。又、CH1ドメインおよびヒンジ領域がヒトIgG1由来でありCH2ドメインおよびCH3ドメインがヒトIgG4由来である重鎖定常領域のアミノ酸配列を配列番号：４に記載する。なお、本発明においてはC末端のGlyおよびLysが欠損した定常領域であってもよい。C末端のGlyおよびLysが欠損したヒトIgG1定常領域を配列番号：５に、C末端のGlyおよびLysが欠損したヒトIgG2定常領域を配列番号：６に、C末端のGlyおよびLysが欠損したヒトIgG4定常領域を配列番号：７に、C末端のGlyおよびLysが欠損し、かつCH1ドメインおよびヒンジ領域がヒトIgG1由来でありCH2ドメインおよびCH3ドメインがヒトIgG4由来である定常領域を配列番号：８に記載する。従って、本発明中ではC末端のGlyおよびLysが欠損した定常領域とC末端のGlyおよびLysが欠損していない定常領域は置き換えることが可能であり、具体的には、C末端のGlyおよびLysが欠損したIgG1定常領域である配列番号：５のアミノ酸配列とC末端のGlyおよびLysが欠損していないIgG1定常領域である配列番号：１のアミノ酸配列、C末端のGlyおよびLysが欠損したIgG2定常領域である配列番号：６のアミノ酸配列とC末端のGlyおよびLysが欠損していないIgG2定常領域である配列番号：２のアミノ酸配列、C末端のGlyおよびLysが欠損したIgG4定常領域である配列番号：７のアミノ酸配列とC末端のGlyおよびLysが欠損していないIgG4定常領域である配列番号：３のアミノ酸配列、C末端のGlyおよびLysが欠損したIgG1/IgG4定常領域である配列番号：８のアミノ酸配列とC末端のGlyおよびLysが欠損していないIgG1/IgG4定常領域である配列番号：４のアミノ酸配列はそれぞれ本明細書中において置き換えることができる。さらに、本発明において使用される定常領域はC末端のGlyまたはLysのどちらか一方が欠損した定常領域であってもよい。ヒトIgG2定常領域として遺伝子多形による複数のアロタイプ配列がSequences of proteins of immunological interest, NIH Publication No.91-3242に記載されているが、本発明においてはそのいずれであっても良い。又、ヒトIgG2タイプ以外の定常領域（ヒトIgG1、ヒトIgG4など）についても、複数のアロタイプが存在するものについては、そのいずれのアロタイプであってもよい。
　なお本発明のアミノ酸が改変（置換、欠損、付加および／または挿入）された抗体定常領域は、本発明のアミノ酸の改変を含むものである限り、他のアミノ酸の改変や修飾を含んでもよい。
　具体的には、次のような改変を含む定常領域は、いずれも本発明に含まれる。
　＊配列番号：１（ヒトIgG1定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊改変された配列番号：５（ヒトIgG1定常領域）由来のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊配列番号：１（ヒトIgG1定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
　同様に、次のような改変を含む定常領域も本発明に含まれる。
　＊配列番号：２（ヒトIgG2定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊改変された配列番号：６（ヒトIgG2定常領域）由来のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊配列番号：２（ヒトIgG2定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
　また同様に、次のような改変を含む定常領域も本発明に含まれる。
　＊配列番号：４（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：ヒトIgG1/IgG4定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊改変された配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：ヒトIgG1/IgG4定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入する。
　＊配列番号：４（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：ヒトIgG1/IgG4定常領域）のアミノ酸配列に対して本発明に基づく改変を導入し、更に付加的な改変も導入する。
　また定常領域に糖鎖が結合する場合、結合する糖鎖の構造は如何なる構造でもよい。例えば、EUナンバリングの297番目の糖鎖は如何なる糖鎖構造であってもよく（好ましくはフコシル化された糖鎖）、また糖鎖が結合していなくてもよい（例えば大腸菌で生産することで可能）。
<アミノ酸改変IgG1定常領域>
　本発明は、天然のアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域と比較して、Fcγレセプター（FcγR）への結合活性および／またはFcRnへの結合活性が改変された重鎖定常領域を提供する。天然のアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域と比較してFcγRへの結合活性が改変されている場合、FcγRへの結合活性が低下していることが好ましい。又、天然のアミノ酸配列を有するヒトIgG1定常領域と比較してFcRnへの結合活性が改変されている場合、FcRnへの結合活性が上昇していることが好ましい。
（M112）
　本発明は配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１１（M112）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M174、M213）
　本発明は配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAla又はAspに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１３（M174）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域または配列番号：１８（M213）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M220）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１４（M220）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M225）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の他の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング434のAsnはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１５（M225）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。又、これらの置換を行うことによりFcRnへの結合活性を上昇させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M226）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の他の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング274のLysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング356のAspの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング358のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング274のLysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング356のAspの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング358のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング274のLysはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング356のAspはGluに、EUナンバリング358のLeuはMetに、EUナンバリング419のGlnはGluに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１６（M226）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M228）
　本発明は、配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のPheの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング409のArgの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング409のArgはLysに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：１７（M228）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M86）
　本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２０（M86）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M221）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２１（M221）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M222）
　本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２２（M222）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M223）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２３（M223）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M224）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２４（M224）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M211）
　本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング419のGlnはGluに、EUナンバリング434のAsnはAlaに置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２５（M211）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。又、これらの置換を行うことにより等電点を低下させることが可能となる。又、これらの置換を行うことによりFcRnへの結合活性を上昇させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
（M209）
　上述のアミノ酸改変を含む抗体定常領域の例としては、上述の改変に加えて、さらにEUナンバリング131のCysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング133のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング137のGluの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング138のSerの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング220のCysの他のアミノ酸への置換を含む抗体定常領域を挙げることができる。従って、本発明は、配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング131のCysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング133のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング137のGluの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング138のSerの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング220のCysの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域を提供する。なお、EUナンバリング220のCysの他のアミノ酸への置換に換えて、EUナンバリング219のCysの他のアミノ酸への置換を行ってもよい。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング419のGlnはGluに、EUナンバリング434のAsnはAlaに、EUナンバリング131のCysはSerに、EUナンバリング133のArgはLysに、EUナンバリング137のGluはGlyに、EUナンバリング138のSerはGlyに、EUナンバリング220のCysはSer（EUナンバリング220の換わりにEUナンバリング219を置換する場合には、EUナンバリング219のCysはSer）に置換されることが好ましい。このような重鎖定常領域の例としては、配列番号：２６（M209）のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域を挙げることができる。
　これらの置換を行うことにより、FcγRへの結合活性を低下させることが可能となる。又、これらの置換を行うことにより等電点を低下させることが可能となる。又、これらの置換を行うことによりFcRnへの結合活性を上昇させることが可能となる。又、これらの置換を行うことによりヘテロ成分を低下させることが可能となる。
　本発明により提供される重鎖定常領域は少なくとも上述のアミノ酸置換が行われていればよく、同時に他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入など）や修飾がおこなわれていてもよい。
　本発明はさらに、上述のいずれかに記載の重鎖定常領域を含む抗体を提供する。本発明の抗体に軽鎖定常領域が含まれる場合、その軽鎖定常領域は如何なる軽鎖定常領域であってもよい。例えば、天然のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域が使用されてもよいし、天然の軽鎖定常領域のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が置換、欠失、付加および／または挿入された改変体が使用されてもよい。
　軽鎖定常領域の改変体の例としては、配列番号：３０（ｋ３）のアミノ酸配列を有する軽鎖定常領域を挙げることができる。
　本発明のアミノ酸の修飾には、翻訳後修飾が含まれる。例えば、可変領域のN末端のグルタミンのピログルタミル化によるピログルタミン酸への修飾は当業者によく知られた翻訳後修飾である。したがって、本発明の抗体は、その重鎖のN末端がグルタミンの場合には、それがピログルタミン酸に修飾された可変領域を含む。
　その他、翻訳後修飾として、糖鎖の付加あるいは欠損も示すことができる。たとえば、配列番号：１１に記載のアミノ酸配列からなるIgG1定常領域において、EUナンバリングの297番目のアミノ酸残基は、糖鎖で修飾されたものであることができる。修飾される糖鎖構造は限定されない。一般的に、真核細胞で発現される抗体は、定常領域に糖鎖修飾を含む。したがって、以下のような細胞で発現される抗体は、通常、何らかの糖鎖で修飾される。
　・哺乳動物の抗体産生細胞
　・抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換された真核細胞
　ここに示した真核細胞には、酵母や動物細胞が含まれる。たとえばCHO細胞やHEK293H細胞は、抗体をコードするDNAを含む発現ベクターで形質転換するための代表的な動物細胞である。他方、当該位置に糖鎖修飾が無いものも本発明の定常領域に含まれる。定常領域が糖鎖で修飾されていない抗体は、抗体をコードする遺伝子を大腸菌などの原核細胞で発現させて得ることができる。
　より具体的には、例えばFc領域の糖鎖にシアル酸を付加したものであってもよい（MAbs. 2010 Sep-Oct;2(5):519-27.）。
　本発明の抗体は上述の重鎖定常領域を有する限り、抗原の種類、抗体の形態、抗体の由来などは限定されず、いかなる抗体でもよく、モノクローナル抗体（全長モノクローナル抗体を含む）、ポリクローナル抗体を問わないが、モノクローナル抗体が好ましい。抗体の由来としては、特に限定されないが、ヒト抗体、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体などを挙げることができる。又、本発明の抗体の形態は抗体変異体、抗体断片、多重特異性抗体（例えば、二重特異性抗体）、キメラ抗体、ヒト化抗体、完全ヒト化抗体等であってもよい。本発明の抗体の好ましい態様として、ヒト化抗体またはヒト抗体を挙げることができる。
　ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえば、Overlap Extension PCRが公知である。
　３つのCDRと４つのFRが連結された抗体可変領域をコードするDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作製できる。該組込みベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、該組換え細胞を培養し、該ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、該ヒト化抗体が該培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP 239400、国際公開WO1996/002576参照）。
　必要に応じ、再構成ヒト抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。
　ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物（国際公開WO1993/012227、WO1992/003918、WO1994/002602、WO1994/025585、WO1996/034096、WO1996/033735参照）を免疫動物とし、DNA免疫により所望のヒト抗体が取得され得る。
　さらに、ヒト抗体ライブラリーを用いて、パンニングによりヒト抗体を取得する技術も知られている。例えば、ヒト抗体のV領域が一本鎖抗体（scFv）としてファージディスプレイ法によりファージの表面に発現される。抗原に結合するscFvを発現するファージが選択され得る。選択されたファージの遺伝子を解析することにより、抗原に結合するヒト抗体のV領域をコードするDNA配列が決定できる。抗原に結合するscFvのDNA配列を決定した後、当該V領域配列を所望のヒト抗体C領域の配列とインフレームで融合させた後に適当な発現ベクターに挿入することによって発現ベクターが作製され得る。当該発現ベクターを上記に挙げたような好適な発現細胞中に導入し、該ヒト抗体をコードする遺伝子を発現させることにより当該ヒト抗体が取得される。これらの方法は既に公知である（国際公開WO1992/001047、WO1992/020791、WO1993/006213、WO1993/011236、WO1993/019172、WO1995/001438、WO1995/015388参照）。
　本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。
　本明細書において抗原は特に限定されず、どのような抗原でもよい。抗原の例としては、例えば、リガンド（サイトカイン、ケモカインなど）、受容体、癌抗原、MHC抗原、分化抗原、免疫グロブリンおよび免疫グロブリンを一部に含む免疫複合体が好適に挙げられる。
　サイトカインの例としては、IL-6等のインターロイキン１～１８、コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ、Ｍ－ＣＳＦ、ＧＭ－ＣＳＦなど）、インターフェロン（ＩＦＮ－α、ＩＦＮ－β、ＩＦＮ－γ、など）、成長因子（ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＩＧＦ、ＮＧＦ、ＰＤＧＦ、ＴＧＦ、ＨＧＦなど）、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ－α、ＴＮＦ－β）、リンホトキシン、エリスロポエチン、レプチン、ＳＣＦ、ＴＰＯ、ＭＣＡＦ、ＢＭＰを挙げることができる。
　ケモカインの例としては、ＣＣＬ１～ＣＣＬ２８などのＣＣケモカイン、ＣＸＣＬ１～ＣＸＣＬ１７などのＣＸＣケモカイン、ＸＣＬ１～ＸＣＬ２などのＣケモカイン、ＣＸ３ＣＬ１などのＣＸ３Ｃケモカインを挙げることができる。
　受容体の例としては、例えば、造血因子受容体ファミリー、サイトカイン受容体ファミリー、チロシンキナーゼ型受容体ファミリー、セリン／スレオニンキナーゼ型受容体ファミリー、TNF受容体ファミリー、Gタンパク質共役型受容体ファミリー、GPIアンカー型受容体ファミリー、チロシンホスファターゼ型受容体ファミリー、接着因子ファミリー、ホルモン受容体ファミリー、等の受容体ファミリーに属する受容体などを挙げることができる。これら受容体ファミリーに属する受容体、及びその特徴に関しては、多数の文献、例えば、Cooke BA., King RJB., van der Molen HJ. ed. New Comprehesive Biochemistry Vol.18B "Hormones and their Actions Part II"pp.1-46 (1988) Elsevier Science Publishers BV.、Patthy（Cell (1990) 61 (1), 13-14）、Ullrichら（Cell (1990) 61 (2), 203-212）、Massague（eにはアキュート・アクセント記号が付く）（Cell (1992) 69 (6), 1067-1070）、Miyajimaら（Annu. Rev. Immunol. (1992) 10, 295-331）、Tagaら（FASEB J. (1992) 6, 3387-3396）、Fantlら（Annu. Rev. Biochem. (1993), 62, 453-481）、Smithら（Cell (1994) 76 (6) 959-962）、Flower DR. Biochim. Biophys. Acta, Flower（Biochim. Biophys. Acta (1999) 1422 (3) 207-234等に記載されている。
　上記受容体ファミリーに属する具体的な受容体としては、例えば、ヒト又はマウスエリスロポエチン（EPO）受容体（Blood (1990) 76 (1), 31-35、Cell (1989) 57 (2), 277-285）、ヒト又はマウス顆粒球コロニー刺激因子（G-CSF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1990) 87 (22), 8702-8706、mG-CSFR、Cell (1990) 61 (2), 341-350）、ヒト又はマウストロンボポイエチン（TPO）受容体（Proc Natl Acad Sci U S A. (1992) 89 (12), 5640-5644、EMBO J. (1993) 12(7), 2645-53）、ヒト又はマウスインスリン受容体（Nature (1985) 313 (6005), 756-761）、ヒト又はマウスFlt-3リガンド受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1994) 91 (2), 459-463）、ヒト又はマウス血小板由来増殖因子（PDGF）受容体（Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (1988) 85 (10) 3435-3439）、ヒト又はマウスインターフェロン（IFN）-α、β受容体（Cell (1990) 60 (2), 225-234.及びCell (1994) 77 (3), 391-400）、ヒト又はマウスレプチン受容体、ヒト又はマウス成長ホルモン（GH）受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-6受容体、ヒト又はマウスインターロイキン（IL）-10受容体、ヒト又はマウスインスリン様増殖因子（IGF）-I受容体、ヒト又はマウス白血病抑制因子（LIF）受容体、ヒト又はマウス毛様体神経栄養因子（CNTF）受容体、CXCR4等のヒト又はマウスケモカイン受容体等が好適に例示される。
　癌抗原は細胞の悪性化に伴って発現する抗原であり、腫瘍特異性抗原とも呼ばれる。又、細胞が癌化した際に細胞表面やタンパク質分子上に現れる異常な糖鎖も癌抗原であり、癌糖鎖抗原とも呼ばれる。癌抗原の例としては、例えば、上記の受容体としてGPIアンカー型受容体ファミリーに属するが肝癌を初めとする幾つかの癌において発現しているGPC3（Int J Cancer. (2003) 103 (4), 455-65）、肺癌を初めとする複数の癌で発現するEpCAM（Proc Natl Acad Sci U S A. (1989) 86 (1), 27-31）、CA19-9、CA15-3、シリアルSSEA-1（SLX）等が好適に挙げられる。
　MHC抗原は、主にMHC class I抗原とMHC class II抗原に分類され、MHC class I抗原には、HLA-A、-B、-C、-E、-F、-G、-Hが含まれ、MHC class II抗原には、HLA-DR、-DQ、-DPが含まれる。
　分化抗原には、CD1、CD2、CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD13、CD14、CD15s、CD16、CD18、CD19、CD20、CD21、CD23、CD25、CD28、CD29、CD30、CD32、CD33、CD34、CD35、CD38、CD40、CD41a、CD41b、CD42a、CD42b、CD43、CD44、CD45、CD45RO、CD48、CD49a、CD49b、CD49c、CD49d、CD49e、CD49f、CD51、CD54、CD55、CD56、CD57、CD58、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD64、CD69、CD71、CD73、CD95、CD102、CD106、CD122、CD126、CDw130が含まれ得る。
　免疫グロブリンにはIgA、IgM、IgD、IgG、IgEが含まれる。また免疫複合体は少なくとも免疫グロブリンのいずれかの成分を含む。
　可変領域を構成するアミノ酸配列は、その抗原結合活性が維持される限り、１または複数のアミノ酸残基の改変が許容される。可変領域のアミノ酸配列を改変する場合、改変される部位や改変されるアミノ酸の数は特に限定されない。例えば、CDRおよび／またはFRに存在するアミノ酸を適宜、改変することができる。可変領域のアミノ酸を改変する場合、特に限定されないが、結合活性が維持されていることが好ましく、例えば、改変前と比較して50%以上、好ましくは80%以上、さらに好ましくは100%以上の結合活性を有していることが好ましい。又、アミノ酸改変により結合活性が上昇していてもよく、例えば結合活性が改変前と比較して2倍、5倍、10倍等になっていてもよい。本発明の抗体において、アミノ酸配列の改変とは、アミノ酸残基の置換、付加、欠損、および修飾の少なくとも１つであることができる。
　本発明の抗体の可変領域は、任意の配列であってよく、マウス抗体、ラット抗体、ウサギ抗体、ヤギ抗体、ラクダ抗体、および、これらの非ヒト抗体をヒト化したヒト化抗体、および、ヒト抗体など、どのような由来の抗体の可変領域でもよい。「ヒト化抗体」とは、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される、ヒト以外の哺乳動物由来の抗体、例えばマウス抗体の相補性決定領域（CDR;complementarity determining region）をヒト抗体のCDRへ移植したものである。CDRを同定するための方法は公知である（Kabat et al., Sequence of Proteins of Immunological Interest (1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342: 877）。また、その一般的な遺伝子組換え手法も公知である（欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576 号公報参照）。また、これらの抗体の可変領域に対して、抗原への結合、薬物動態、安定性、抗原性を改善するために、様々なアミノ酸置換を導入したものであってもよい。本発明の抗体の可変領域は抗原に対する結合にpH依存性を有することで、抗原に対して繰り返し結合することができてもよい（WO/2009/125825）。
　抗体の軽鎖定常領域にはκ鎖とλ鎖タイプの定常領域が存在しているが、いずれの軽鎖定常領域であってもよい。さらに、本発明において軽鎖定常領域は、アミノ酸の置換、欠損、付加および／または挿入などの改変が行われた軽鎖定常領域であってもよい。
　また、上述の抗体定常領域は生理活性ペプチド、抗原結合ペプチド等の様々な分子と結合させて、融合蛋白質とすることも可能である。これらの生理活性ペプチド、抗原結合ペプチド等の分子としては、例えば受容体、接着分子、リガンド、酵素が挙げられるが、これらに限定されるものではない。
　また本発明の抗体には、上述のいずれかに記載の定常領域を含む抗体であればその修飾物も含まれる。　
　抗体の修飾物の例としては、例えば、ポリエチレングリコール（PEG）や細胞障害性物質等の各種分子と結合させた抗体を挙げることができる。このような抗体修飾物は、本発明の抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
　さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体をいうが、当該エピトープは異なる分子中に存在していてもよいし、同一の分子中に存在していてもよい。
　上述の抗体定常領域は任意の抗原に対する抗体の定常領域として使用することが可能であり、抗原は特に限定されない。
　本発明の抗体は当業者に公知の方法で作製することが可能である。例えば、１又は複数のアミノ酸残基を目的の他のアミノ酸に置換する方法、または、１又は複数のアミノ酸残基を欠損される方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh, T, Mizuno, T, Ogasahara, Y, and Nakagawa, M. (1995) An oligodeoxyribonucleotide-directed dual amber method for site-directed mutagenesis. Gene 152, 271-275、Zoller, MJ, and Smith, M.(1983) Oligonucleotide-directed mutagenesis of DNA fragments cloned into M13 vectors.Methods Enzymol. 100, 468-500、Kramer,W, Drutsa,V, Jansen,HW, Kramer,B, Pflugfelder,M, and Fritz,HJ(1984) The gapped duplex DNA approach to oligonucleotide-directed mutation construction. Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456、Kramer W, and Fritz HJ(1987) Oligonucleotide-directed construction of mutations via gapped duplex DNA Methods. Enzymol. 154, 350-367、Kunkel,TA(1985) Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection.Proc Natl Acad Sci U S A. 82, 488-492）が挙げられる。該方法を用いて、抗体の定常領域の所望のアミノ酸を目的の他のアミノ酸に置換することができる。また１又は複数のアミノ酸残基を欠損させることが出来る。
　抗体を取得する為の別の態様としては、まず、当業者に周知な方法によって、目的の抗原に結合する抗体を得る。取得された抗体が非ヒト動物抗体であれば、ヒト化することもできる。抗体の結合活性は当業者に公知の方法で測定することができる。次いで、抗体の定常領域中の１又は複数のアミノ酸残基を、目的の他のアミノ酸に置換または欠損する。
　本発明は、以下の（ａ）および（ｂ）の工程を含む、重鎖定常領域のアミノ酸残基が改変された抗体の製造方法に関する。
　（ａ）定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAを発現させる工程、および
　（ｂ）工程（ａ）の発現産物を回収する工程。
　また本発明は、本発明のアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチド、当該ポリヌクレオチドを含むベクター、当該ベクターを保持する宿主細胞、および当該宿主細胞を培養する工程を含む抗体を製造する方法を提供する。
　より具体的には、以下の工程を含む、本発明のアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域の製造方法を提供する。
　（ａ）本発明のアミノ酸の改変を有する重鎖定常領域をコードするポリヌクレオチドが導入されたベクターを含む宿主細胞を培養する工程、
　（ｂ）当該遺伝子によりコードされる重鎖定常領域を取得する工程。
　本発明の抗体の製造方法においては、まず、抗体の重鎖をコードするポリヌクレオチド（例えば、DNA）であって、定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするポリヌクレオチドを発現させる。
　定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖定常領域をコードするDNAは、例えば、野生型の重鎖および／または軽鎖をコードするDNAの定常領域部分を取得し、該定常領域中の特定のアミノ酸をコードするコドンが目的の他のアミノ酸をコードするよう、適宜置換を導入することによって得ることが出来る。
　また、あらかじめ、野生型重鎖の定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換されたタンパク質をコードするDNAを設計し、該DNAを化学的に合成することによって、定常領域中の1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAを得ることも可能である。
　アミノ酸置換の種類としては、これに限定されるものではないが、本明細書に記載の置換が挙げられる。
　また、定常領域中において、1又は複数のアミノ酸残基が目的の他のアミノ酸に置換された重鎖をコードするDNAは、部分DNAに分けて製造することができる。部分DNAの組み合わせとしては、例えば、可変領域をコードするDNAと定常領域をコードするDNA、あるいはFab領域をコードするDNAとFc領域をコードするDNAなどが挙げられるが、これら組み合わせに限定されるものではない。
　上記DNAを発現させる方法としては、以下の方法が挙げられる。例えば、重鎖可変領域をコードするDNAを、重鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み重鎖発現ベクターを構築する。重鎖および軽鎖を含む抗体を製造する場合には同様に、軽鎖可変領域をコードするDNAを、軽鎖定常領域をコードするDNAとともに発現ベクターに組み込み軽鎖発現ベクターを構築する。これらの重鎖、軽鎖の遺伝子を単一のベクターに組み込むことも出来る。発現ベクターとしては例えばSV40 virus basedベクター、EB virus basedベクター、BPV（パピローマウイルス）basedベクターなどを用いることができるが、これらに限定されるものではない。
　以上の方法で作製された抗体発現ベクターにより宿主細胞を共形質転換する。宿主細胞としてはCHO細胞(チャイニーズハムスター卵巣)等上述の細胞の他にも大腸菌、酵母や枯草菌などの微生物や動植物の個体が用いられる（Nature Biotechnology 25, 563 - 565 (2007)、Nature Biotechnology 16, 773 - 777 (1998)、Biochemical and Biophysical Research Communications 255, 444-450 (1999)、Nature Biotechnology 23, 1159 - 1169 (2005)、Journal of Virology 75, 2803-2809 (2001)、Biochemical and Biophysical Research Communications 308, 94-100 (2003)）。またヒト胎児腎癌細胞由来HEK298H細胞が用いられる。また、形質転換にはリポフェクチン法(R.W.Malone et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86,6077 (1989), P.L.Felgner et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84,7413 (1987)、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法(F.L.Graham & A.J.van der Eb,Virology 52,456-467(1973))、DEAE-Dextran法等が好適に用いられる。
　抗体の製造においては、次に、発現産物を回収する。発現産物の回収は、例えば、形質転換体を培養した後、形質転換体の細胞内又は培養液より抗体を分離、精製することによって行うことが出来る。抗体の分離、精製には、遠心分離、硫安分画、塩析、限外濾過、１ｑ、ＦｃＲｎ、プロテインA、プロテインGカラム、アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィーなどの方法を適宜組み合わせて行うことができる。
　本発明は上記のようにして製造された抗体を提供する。すなわち本発明は、次の工程によって製造することができる抗体に関する。
　(a)可変領域と定常領域を含む抗体の重鎖と、軽鎖をコードするDNAを宿主細胞で発現させる工程；、および
　(b)(a)において発現された抗体を回収する工程。
　上記方法において、重鎖定常領域のアミノ酸配列は、本発明によって提供された上記の定常領域であることを特徴とする。
　上述のとおり、本発明の抗体を構成する可変領域は、任意の抗原を認識する可変領域であることが出来る。
　さらに、本発明は本発明のアミノ酸の改変を有する抗体の定常領域をコードする遺伝子を提供する。本発明の定常領域をコードする遺伝子はDNA、RNAなど、如何なる遺伝子でもよい。
　さらに、本発明は当該遺伝子を含むベクターを提供する。ベクターの種類はベクターが導入される宿主細胞に応じて当業者が適宜選択することができ、例えば上述のベクターを用いることができる。
　さらに、本発明は当該ベクターにより形質転換された宿主細胞に関する。宿主細胞は当業者が適宜選択することができ、例えば上述の宿主細胞を用いることができる。
　さらに、本発明は当該宿主細胞を培養し、発現した本発明の定常領域を回収する工程を含む、本発明の定常領域の製造方法に関する。
<IgG1定常領域の改変方法>
　また本発明は、配列番号：５に記載のヒトIgG1定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M112）。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、および
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング297のAsnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：５に記載のヒトIgG1定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M174）。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング327のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、および
(e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAla又はAspに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：５に記載のヒトIgG1定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M220）。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング297のAsnを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング327のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、および
(f)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：５に記載のヒトIgG1定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法および／またはFcRnへの結合活性を低下させる方法に関する（M225）。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング327のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程、および
(f)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング434のAsnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング434のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：５に記載のヒトIgG1定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M226）。
(a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング327のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程、
(f)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング268のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(g)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング274のLysを他のアミノ酸に置換する工程、
(h)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング355のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(i)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング356のAspを他のアミノ酸に置換する工程、
(j)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング358のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、および
(k)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング419のGlnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング327のAlaはGlyに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング274のLysはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング356のAspはGluに、EUナンバリング358のLeuはMetに、EUナンバリング419のGlnはGluに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：８に記載のヒトIgG1／IgG4定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M228）。
(a)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のPheを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング235のLeuを他のアミノ酸に置換する工程、および
(c)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング409のArgを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のLeuはAlaに、EUナンバリング235のLeuはAlaに、EUナンバリング409のArgはLysに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M86）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング297のAsnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M221）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のValを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング237のGlyを他のアミノ酸に置換する工程、および
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング297のAsnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M222）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程、および
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング339のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M223）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のValを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング237のGlyを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程、および
(e)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング339のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法に関する（M224）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング234のValを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング237のGlyを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング297のAsnを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング330のAlaを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング331のProを他のアミノ酸に置換する工程、および
(f)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング339のThrを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング234のValはAlaに、EUナンバリング237のGlyはAlaに、EUナンバリング297のAsnはAlaに、EUナンバリング330のAlaはSerに、EUナンバリング331のProはSerに、EUナンバリング339のThrはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法、等電点を低下させる方法、および／またはFcRnへの結合活性を上昇させる方法に関する（M211）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング268のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング355のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング419のGlnを他のアミノ酸に置換する工程、および
(d)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング434のAsnを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング419のGlnはGluに、EUナンバリング434のAsnはAlaに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
　また本発明は、配列番号：６に記載のヒトIgG2定常領域において、下記の工程を含む、FcγRへの結合活性を低下させる方法、等電点を低下させる方法、FcRnへの結合活性を上昇させる方法、および／またはヘテロジェニティを低減させる方法に関する（M209）。
(a)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング268のHisを他のアミノ酸に置換する工程、
(b)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング355のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(c)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング419のGlnを他のアミノ酸に置換する工程、
(d)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング434のAsnを他のアミノ酸に置換する工程、
(e)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング131のCysを他のアミノ酸に置換する工程、
(f)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング133のArgを他のアミノ酸に置換する工程、
(g)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング137のGluを他のアミノ酸に置換する工程、
(h)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング138のSerを他のアミノ酸に置換する工程、および
(i)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング220のCysを他のアミノ酸に置換する工程。
　置換後のアミノ酸は特に限定されないが、EUナンバリング268のHisはGlnに、EUナンバリング355のArgはGlnに、EUナンバリング419のGlnはGluに、EUナンバリング434のAsnはAlaに、EUナンバリング131のCysはSerに、EUナンバリング133のArgはLysに、EUナンバリング137のGluはGlyに、EUナンバリング138のSerはGlyに、EUナンバリング220のCysはSerに置換されることが好ましい。
　なお、上述の(i)の工程は、(i) 配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング220のCysを他のアミノ酸に置換する工程、に換えて(i) 配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列においてEUナンバリング219のCysを他のアミノ酸に置換する工程、としてもよい。この場合、EUナンバリング219のCysはSerに置換されることが好ましい。
　本発明の方法は、上記工程を含む限り、他のアミノ酸の改変（置換、欠損、付加および／または挿入）や修飾、その他工程を含むものであってもよい。
<抗体を含む医薬組成物>
　本発明は、本発明の抗体または本発明の定常領域を含む、医薬組成物を提供する。
　本発明の医薬組成物は、抗体または定常領域に加えて医薬的に許容し得る担体を導入し、公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、又は懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
　注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
　注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD-ソルビトール、D-マンノース、D-マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80（TM）、HCO-50と併用してもよい。
　油性液としてはゴマ油、大豆油が挙げられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
　投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
　また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
　EUナンバリングにおけるアミノ酸位置と配列表に記載のアミノ酸配列のアミノ酸位置との対応は以下の通りである。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング234のLeu ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の117番目のLeu。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング235のLeu ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の118番目のLeu。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング297のAsn ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の180番目のAsn。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング327のAla ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の210番目のAla。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング330のAla ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の213番目のAla。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング331のPro ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の214番目のPro。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング434のAsn ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の317番目のAsn。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング268のHis ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の151番目のHis。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング274のLys ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の157番目のLys。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング355のArg ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の238番目のArg。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング356のAsp ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の239番目のAsp。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング358のLeu ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の241番目のLeu。
　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング419のGln ： 配列番号：５（IgG１定常領域）の302番目のGln。
　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング234のPhe ： 配列番号：８（IgG１/IgG4定常領域）の117番目のPhe。
　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング235のLeu ： 配列番号：８（IgG１/IgG4定常領域）の118目のLeu。
　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域：IgG１/IgG4定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング409のArg ： 配列番号：８（IgG１/IgG4定常領域）の292番目のArg。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング297のAsn ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の176番目のAsn。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング234のVal ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の114番目のVal。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング237のGly ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の116番目のGly。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング330のAla ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の209番目のAla。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング331のPro ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の210番目のPro。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング268のHis ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の147番目のHis。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング355のArg ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の234番目のArg。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング419のGln ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の298番目のGln。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング434のAsn ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の313番目のAsn。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング131のCys ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の14番目のCys。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング133のArg ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の16番目のArg。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング137のGlu ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の20番目のGlu。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング138のSer ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の21番目のSer。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング220のCys ： 配列番号：６（IgG2定常領域）の103番目のCys。
　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列のEUナンバリング339のThr ： 配列番号：６（IgG2定常慮領域）の218番目のThr。
　本明細書で用いられているアミノ酸の3文字表記と1文字表記の対応は以下の通りである。
アラニン：Ala：A
アルギニン：Arg：R
アスパラギン：Asn：N
アスパラギン酸：Asp：D
システイン：Cys：C
グルタミン：Gln：Q
グルタミン酸：Glu：E
グリシン：Gly：G
ヒスチジン：His：H
イソロイシン：Ile：I
ロイシン：Leu：L
リジン：Lys：K
メチオニン：Met：M
フェニルアラニン：Phe：F
プロリン：Pro：P
セリン：Ser：S
スレオニン：Thr：T
トリプトファン：Trp：W
チロシン：Tyr：Y
バリン：Val：V
　なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
　以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが本発明はこれら実施例に制限されるものではない。本実施例においては、定常領域において改変を行ったアミノ酸部位をＥＵナンバリングシステム（Sequences of proteins of immunological interest，NIH Publication No.91-3242を参照）にて示している。
〔実施例１〕　定常領域IgG1、2、4のFcγRに対する結合の評価
　本実施例において、まず、抗IL-6受容体抗体（トシリツマブ、商標名：アクテムラ、抗体クラス：IgG1）のアミノ酸配列をもとに、その定常領域のC末端アミノ酸配列であるGKを除いた配列を有する抗体を作製した。具体的には、H鎖としてH0-G1d（配列番号：３１）、L鎖としてL0-k0 （配列番号：３２）からなるH0-G1d/L0-k0を作製した。定常領域の異なる抗体として、H鎖としてH0-G2d（酸配列番号：３３）、L鎖としてL0-k0 （配列番号：３２）からなるH0-G2d/L0-k0、H鎖としてH0-G4d（酸配列番号：３４）、L鎖としてL0-k0 （酸配列番号：３２）からなるH0-G4d/L0-k0、を作製した。各抗体の発現と精製は参考例１で記した方法で実施した。
　調製した抗体を用いて、Fcγレセプター（FcγR）に対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図１に示した。
　各サブクラスのFcγRに対する結合は、報告されている順位とほぼ相関していた(参考文献６、７)。
〔実施例２〕　FcγRに対する結合を低下させる定常領域IgG1の作製と評価
　Anti-CD3抗体はサイトカインリリースが報告されえている(参考文献１、２)。その原因の一つとして、FcγRによる定常領域の会合化により、細胞が活性化し、サイトカインを放出していると考えられている。Anti-CD3抗体の投与によるサイトカインの放出を低減するために、定常領域のFcγRに対する結合を低下させた定常領域をもつanti-CD3抗体の臨床試験が行われている(参考文献１、２)。
　FcγRに対する結合を低下させた定常領域をもつanti-CD3抗体として、OtelixizumabとTeplizumabがある。Otelixizumabの定常領域は、N297A(以下Aglyと記載)に改変しており、Teplizumabの定常領域はL234A、L235A(以下LALAと記載)に改変している。これらの改変はFcγRに対する結合を低下させることがしられている。　そこで、これらの改変を導入した定常領域、M111(配列番号：１０)、M119(配列番号：１２)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。
　またG1とG4の定常領域を比較すると、327、330、331のアミノ酸が異なり、これらのアミノ酸がADCCには重要である(参考文献３)。そこで、これらの改変を導入した定常領域、M16(配列番号：９)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。
　調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図２に示した。
　その結果、M111はFcγIに、M119はFcγIとIIIに、M16はほとんどすべてのFcγRに結合していた。このことから、作製した定常領域の中で、FcγRに対する結合が完全になくなったものはないことが明らかになった。
〔実施例３〕　FcγRに対する結合を低下させる新規定常領域IgG1の作製と評価
　FcγRに対する結合を完全になくした定常領域を作製するために、これらの改変を組み合わせたM112(配列番号：１１)、M174(配列番号：１３)、M220(配列番号：１４)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図３に示した。
　その結果、M112、M174、およびM220いずれの定常領域も、FcγRに対する結合が大きく減少していた。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
〔実施例４〕　新規定常領域の最適化によるFcγRに対する結合の影響
　抗体の特徴である長いHalf-lifeを、さらに向上させるために様々な定常領域の最適化がなされている。その一つにFcRnに対する結合を向上させる最適化が行われている(参考文献４)。また、等電点を低下させることにより血中半減期が向上することも報告されている(参考文献５)。そこで、M174に対してHalf-lifeを向上させるN434Aの改変を導入したM225（配列番号：１５)、定常領域のpIを低下させる改変を加えたM226（配列番号：１６)を作製した。M226はFcγRに対する結合を低下させるために、327、330、331の配列をG1からG4に置換しており、また、pIを低下させるために、一部の配列をG1の配列からG4の配列に置換している。そこで、237以降のアミノ酸はG4にし、かつ酸安定性を向上させるためにR409Kの改変を加えたM228（配列番号：１７)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図４に示した。
　その結果、どの定常領域のFcγRに対する結合も、IgG1よりも低下していた。
〔実施例５〕　FcγRに対する結合を低下させる新規定常領域IgG1の作製と評価
　M112およびM220と比較すると、M174は各FcγRに対してわずかに結合することから、更なる最適化を行った。L235Dの改変を行ったM213(配列番号：１８)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図５に示した。その結果、M213のFcγRに対する結合はM174のそれと比較して、低下していることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例６〕　FcγRに対する結合を低下させる定常領域IgG2の作製と評価
　実施例１で記載したように、CD3に対する抗体はサイトカインリリースが報告されている(参考文献１、２)。定常領域のFcγRに対する結合を低下させるためにIgG2に対して最適化をおこなったVisilizumabが作製されている。(参考文献１、２)。VisilizumabはV234A、G237Aの改変が行われている。そこで、IgG2に対して、この改変をおこなったM120(配列番号：１９)を作製した。実施例1で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図６に示した。
　M120のFcγRに対するAffinityよりは、IgG2のそれは低下していたが、完全にはなくなっていないことが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
〔実施例７〕　FcγRに対する結合を低下させる新規定常領域IgG2の作製と評価
　定常領域IgG2の各種FcγRに対する結合を完全になくすために、M86(配列番号：２０)、M221(配列番号：２１)、M222(配列番号：２２)、M223(配列番号：２３)、およびM224(配列番号：２４)を作製した。実施例１で使用した可変領域と作製した定常領域をもった抗体を作製し、参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図７に示した。
　その結果、いずれの定常領域のFcγRに対する結合も、IgG2のそれよりも低下していることが明らかとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
〔実施例８〕　新規定常領域の最適化によるFcγRに対する結合の影響
　M120のHalf-lifeを改善するために、定常領域の等電点の低下、FcRnへの結合を高めたM211(配列番号：２５)を作製した。M211に対して、IgG2のヘテロ成分を低下させるため、Cysを改変したM209(配列番号：２６)を作製した。作製した定常領域と、L鎖の長さを短くしたk3を組み合わせたM211/k3、M209/k3を作製した。参考例１で記した方法で各抗体を調製した。調製した抗体を用いて、FcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。その結果を図８に示した。
　その結果、M209およびM211のFcγRに対する結合は、IgG2のそれよりも低下していることが明らかとなった。
〔実施例９〕　新規定常領域のFcγRに対する結合の影響
　抗ヒトCXCR4抗体に対して定常領域IgG1, IgG2, IgG4を結合した抗体を作製した。定常領域IgG1について、上記で行った改変を実施した。すなわち、上述の定常領域、M119, M111, M112, M16, M174, M220と結合させた、抗CXCR4定常領域改変抗体を作製し、それらのFcγRに対するAffinityを参考例２に記した方法で測定した。
　その結果、M112,M220がすべてのFcγRに対するAffinityを完全に消失しており、M174もIgG1と比較してFcgRに対するAffinityが大幅に低下していることが明らかとなった。
〔参考例１〕抗体の発現ベクターの作製および抗体の発現と精製
　抗体の可変領域のH鎖およびL鎖の塩基配列をコードする全長の遺伝子の合成は、Assemble PCR等を用いて、当業者公知の方法で作製した。アミノ酸置換の導入はQuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit（Stratagene）あるいはPCR等を用いて当業者公知の方法で行った。得られたプラスミド断片を動物細胞発現ベクターに挿入し、H鎖発現ベクターおよびL鎖発現ベクターを作製した。得られた発現ベクターの塩基配列は当業者公知の方法で決定した。作製したプラスミドをヒト胎児腎癌細胞由来HEK293H株（Invitrogen）、またはFreeStyle293細胞(Invitrogen社)に、一過性に導入し、抗体の発現を行った。得られた培養上清を回収した後、0.22 μmまたはフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）、または0.45 μmフィルターMILLEX(R)-GV（Millipore）を通して培養上清を得た。得られた培養上清から、rProtein A SepharoseTM Fast Flow（GEヘルスケア）を用いて当業者公知の方法で、抗体を精製した。精製抗体濃度は、分光光度計を用いて280 nmでの吸光度を測定し、得られた値からPACE法により算出された吸光係数を用いて抗体濃度を算出した（Protein Science 1995 ; 4 : 2411-2423）。
〔参考例２〕FcγRに対する結合の評価
　FcγRに対する結合は以下のいずれかの方法を用いて測定した。
proteinAを用いた方法
　Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、抗体とFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は20℃とした。アミンカップリング法によりProtein A (Invitrogen) を固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。抗体をキャプチャーさせたところへ、ランニングバッファーで希釈したFcγレセプターを流速10 μL/minで2分間相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、Fcγレセプターの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量が2000 RU (resonance unit) となるように、Fcγレセプターの結合量を補正した。また、10 mM glycine-HCl、pH1.5を流速30 μL/minで30秒間反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
proteinLを用いた方法
　Biacore T100 (GE Healthcare) を用いて、抗体とFcγレセプターとの相互作用解析を行った。ランニングバッファーにはHBS-EP+ (GE Healthcare)を用い、測定温度は25℃とした。アミンカップリング法によりProtein L (ACTIGEN) を固定化し、そこへ目的の抗体をキャプチャーさせた。そこへランニングバッファーで希釈したFcγレセプターを流速5 μL/minで3分間相互作用させ、抗体に対する結合量を測定し、抗体間で比較した。ただし、Fcγレセプターの結合量はキャプチャーした抗体の量に依存するため、各抗体のキャプチャー量が100 RUとなるように、Fcγレセプターの結合量を補正した。また、10 mM glycine-HCl、 pH1.5を流速30 μL/minで30秒間反応させることで、チップにキャプチャーした抗体を洗浄し、チップを再生して繰り返し用いた。
　本発明により、抗体の定常領域のアミノ酸配列を改変することで物性（安定性および均一性）、抗原性、安全性、且つ、血中滞留性が改善された、医薬品として適した抗体定常領域が提供される。
参考文献
1.非特許文献、Expert Rev. Clin. Innunol.5, 499-521,2009
2.非特許文献、Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 13,124-135,2010
3.非特許文献、Eur J Immunol, 23, 1098-1104,1993
4.非特許文献、Curr. Opin.20,1-7,2009
5.特許文献、PCT/JP2008/067534（WO2009/041643）
6.非特許文献、Blood.113,3716-3725,2009
7.非特許文献、Trends Immunol. 22,510-6. 2001

Claims (5)

  1. 　以下の(a)～(m)いずれかに記載の抗体定常領域。
    (a)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M112）、
    (b)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M174、M213）、
    (c)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M220）、
    (d)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M225）、
    (e)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング327のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング274のLysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング356のAspの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング358のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M226）、
    (f)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のPheの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング235のLeuの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング409のArgの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M228）、
    (g)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M86）、
    (h)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M221）、
    (i)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M222）、
    (j)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M223）、
    (k)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング237のGlyの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング330のAlaの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング331のProの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング339のThrの他のアミノ酸への置換、およびEUナンバリング297のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M224）、
    (l)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M211）、又は
    (m)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング355のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング419のGlnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング434のAsnの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング131のCysの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング133のArgの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング137のGluの他のアミノ酸への置換、EUナンバリング138のSerの他のアミノ酸への置換およびEUナンバリング220のCysの他のアミノ酸への置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M209）
  2. 　以下の(A)～(M)いずれかに記載の抗体定常領域。
    (A)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M112）、
    (B)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAla又はAspへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、およびEUナンバリング331のProのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M174、M213）、
    (C)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング297のAsnのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、およびEUナンバリング331のProのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M220）、
    (D)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング434のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M225）、
    (E)　配列番号：５（IgG１定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、EUナンバリング327のAlaのGlyへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング274のLysのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング356のAspのGluへの置換、EUナンバリング358のLeuのMetへの置換、およびEUナンバリング419のGlnのGluへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M226）、
    (F)　配列番号：８（CH1およびHingeがIgG1、CH2およびCH3がIgG4の定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のPheのAlaへの置換、EUナンバリング235のLeuのAlaへの置換、およびEUナンバリング409のArgのLysへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M228）、
    (G)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M86）、
    (H)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyの他Alaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M221）、
    (I)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング339のThrのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M222）、
    (J)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyのAlaへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、およびEUナンバリング339のThrのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M223）、
    (K)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング234のValのAlaへの置換、EUナンバリング237のGlyのAlaへの置換、EUナンバリング330のAlaのSerへの置換、EUナンバリング331のProのSerへの置換、EUナンバリング339のThrのAlaへの置換、およびEUナンバリング297のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M224）、
    (L)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング419のGlnのGluへの置換およびEUナンバリング434のAsnのAlaへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M211）、又は
    (M)　配列番号：６（IgG2定常領域）のアミノ酸配列において、EUナンバリング268のHisのGlnへの置換、EUナンバリング355のArgのGlnへの置換、EUナンバリング419のGlnのGluへの置換、EUナンバリング434のAsnのAlaへの置換、EUナンバリング131のCysのSerへの置換、EUナンバリング133のArgのLysへの置換、EUナンバリング137のGluのGlyへの置換、EUナンバリング138のSerのGlyへの置換およびEUナンバリング220のCysのSerへの置換を含むアミノ酸配列を有する抗体定常領域（M209）
  3. 　以下の(1)～(14)いずれかに記載の抗体定常領域。
    (1)　配列番号：１１に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M112）、
    (2)　配列番号：１３に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M174）、
    (3)　配列番号：１４に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M220）、
    (4)　配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M225）、
    (5)　配列番号：１６に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M226）、
    (6)　配列番号：１７に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M228）、
    (7)　配列番号：１８に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M213）、
    (8)　配列番号：２０に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M86）、
    (9)　配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M221）、
    (10) 配列番号：２２に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M222）、
    (11) 配列番号：２３に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M223）、
    (12) 配列番号：２４に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M224）、
    (13) 配列番号：２５に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M211）、又は
    (14) 配列番号：２６に記載のアミノ酸配列を含む抗体定常領域（M209）
  4. 　請求項１～３いずれかに記載の抗体定常領域を含む抗体。
  5. 　請求項４に記載の抗体を含む医薬組成物。
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