KR20100085067A - 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체 - Google Patents

혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체 Download PDF

Info

Publication number
KR20100085067A
KR20100085067A KR1020107008895A KR20107008895A KR20100085067A KR 20100085067 A KR20100085067 A KR 20100085067A KR 1020107008895 A KR1020107008895 A KR 1020107008895A KR 20107008895 A KR20107008895 A KR 20107008895A KR 20100085067 A KR20100085067 A KR 20100085067A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
amino acid
acid residue
replacing
ser
Prior art date
Application number
KR1020107008895A
Other languages
English (en)
Inventor
토모유키 이가와
타이치 구라모치
히로타케 시라이와
히로유키 츠노다
타츠히코 타치바나
타카히로 이시구로
Original Assignee
추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=40510966&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=KR20100085067(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 filed Critical 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Publication of KR20100085067A publication Critical patent/KR20100085067A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C07K16/303—Liver or Pancreas
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8242—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits
    • C12N15/8257—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon
    • C12N15/8258—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with non-agronomic quality (output) traits, e.g. for industrial processing; Value added, non-agronomic traits for the production of primary gene products, e.g. pharmaceutical products, interferon for the production of oral vaccines (antigens) or immunoglobulins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/545—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the dose, timing or administration schedule
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
    • C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/94—Stability, e.g. half-life, pH, temperature or enzyme-resistance

Abstract

항-글리피칸 3 항체의 혈장 반감기의 제어 방법, 활성 성분으로서 혈장 반감기가 제어된 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 항-글리피칸 항체의 제조방법 및 활성성분으로서 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다. 항-글리피칸 3 항체의 표면에 노출된 아미노산 잔기를 개변함에 의해 항-글리피칸 3 항체의 혈장 반감기를 제어하는 방법; 및 아미노산 잔기 개변에 의해 혈장 반감기가 제어된 항-글리피칸 3 항체, 활성 성분으로서 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 항-글리피칸 3 항체의 제조방법과 활성성분으로서 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물의 생산방법이 제공된다.

Description

혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체{ANTI-GLYPICAN-3 ANTIBODY HAVING IMPROVED KINETICS IN PLASMA}
본 출원은 2007년 9월 28일자로 출원된 일본특허출원 제 2007-256063호를 우선권으로 주장하며, 그 내용은 본 명세서에 참조로서 병합된다.
본 발명은 항-글리피칸 3 항체의 혈장(혈액) 중 반응속도를 개선하는 방법, 활성 성분으로서 개선된 혈장 중 반응속도를 갖는 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 그것의 제조방법에 관한 것이다.
항체는 혈장에서 안정하고 거의 부작용을 나타내지 않고 이러한 이유로 약물로서의 그들의 용도가 관심을 받고 있다. 여러 항체 이소타입 중에서, 다수의 IgG 이소타입 치료적 항체가 시판되며 다수의 치료적 항체가 또한 개발 중에 있다 (Janice M. Reichert, Clark J. Rosensweig, Laura B. Faden, 및 Matthew C. Dewitz, 임상에서의 모노클로날 항체의 성공, Nature Biotechnology (2005) 23, 1073-8; Pavlou A. K. 및 Belsey M. J., 2008년까지의 치료항체 시장, Eur . J. Pharm. Biopharm . (2005) 59(3), 389-96; 및 Janice M. Reichert 및 Viia E. Valge-Archer, 암 치료용 모노클로날 항체의 개발 경향, Nat . Rev . Drug Disc . (2007) 6, 349-356). 항-글리피칸 3 항체는 예를 들면, 간암 세포 및 폐암 세포에 대한 세포독성을 발휘함으로써 항종양 활성을 나타낸다고 알려져 있다(WO 2003/000883). 세포독성 물질에 부착된 항-글리피칸 3 항체를 포함하는 항체-약물 컨주게이트는 또한 간암, 난소암, 흑색종, 등에 대한 항종양 활성을 나타낸다고 알려져 있다(Albina Nesterova, Paul J. Carter, 및 Leia M. Smith, 항체-약물 컨쥬게이트용 신규 표적으로서의 글리피칸 3, AACR Abstract No. 656 (2007), Los Angeles, CA, April, 4-18).
이에 더하여, 제2 세대 치료용 항체를 생산하기 위한 작동자 기능을 강화시키기 위한 기술이 개발되고 있다. 예를 들면, 항체-의존 세포의 세포독성 (ADCC)활성 및 상보성-의존 세포독성(CDC) 활성은 IgG 이소타입 항체(IgG 항체로 명명)의 Fc 영역을 구성하는 아미노산이 다른 아미노산으로 대체되는 아미노산 치환반응에 의해 강화된다는 것이 알려져 있다 (Kim S. J., Park Y., 및 Hong H. J., 치료항체 개발을 위한 항체 엔지니어링, Mol . Cells (2005) 20(1), 17-29). 항-글리피칸 3 항체가 푸코스 운송자-결실 CHO 세포에서 생산될 때, 푸코스는 항-글리피칸 3 항체에 부착된 분지된 당 사슬에 부착되지 않는다. 이와 같은 항-글리피칸 3 항체는 당 사슬의 분지된-사슬에 푸코스를 함유하는 항-글리피칸 3 항체보다 ADCC 항체가 상당히 더 높고, 이것은 치료용 항체로서 더 큰 항종양 활성을 발휘하는 것으로 생각된다 (WO 2006/067913).
작동자 기능을 강화하기 위한 이와 같은 기술에 더하여, 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산에서 아미노산 치환에 의해 항체의 혈장 반감기를 증가 또는 감소시키는 다른 기술들이 또한 알려져 있다 (Hinton P. R., Xiong J. M., Johlfs M. G., Tang M. T., Keller S., 및 Tsurushita N., 혈청 반감기가 늘어난 조작된 인간 IgG1 항체, J. Immunol . (2006) 176(1), 346-56; 및 Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R. J., 및 Ward E. S., 임의의 돌연변이에 의한 IgG 분획의 혈청 존속의 증가, Nat . Biotechnol . (1997) 15(7), 637-40). 항체의 혈장 반감기를 증가시키는 기술이 치료용 항체에 적용된다면, 투여된 치료용 항체의 투여량은 감소되고 투여 간격은 늘어날 것이 기대되며, 이것은 높은 편의 요소를 갖는 덜 비싼 치료용 항체의 제공을 가능하게 할 것이다.
특정 용어에서, 플라즈마 반감기는 IgG 항체의 Fc 영역의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환하여, IgG 항체에 대한 구제 수용체(salvage receptor)로 알려 져 있는 신생 Fc 수용체의 IgG 항체의 친화력을 개선시킴으로써 연장될 수 있다. 이에 더하여, 혈장 반감기가 항체의 불변영역을 구성하는 개개의 도메인 (CH1, CH2, CH3)을 뒤섞음에 의해 증가한다는 것이 또한 알려진다 (Zuckier L. S., Chang C. J., Scharff M. D., 및 Morrison S. L., 뒤섞인 불변영역 엑손을 갖는 키메릭 인간-마우스 IgG 항체 다중 도메인이 인비보 반감기에 기여하는 것을 증명함, Cancer Res . (1998) 58(17), 3905-8). 그러나, IgI 항체의 불변영역의 아미노산 서열은 인간에서 보존되므로, 상기와 같이 불변영역을 구성하는 아미노산에서 인공 아미노산 치환체를 갖는 항체는 인체에서 면역원성을 발휘함에 의해 부작용을 일으킬 수 있다. 그러므로, 오직 소수의 아미노산만이 치환되는 것이 바람직하다.
지금까지 보고된 IgG 항체의 가변영역 (또한 V 영역으로 명명)에서의 아미노산 치환을 포함하는 기술들은 인간화 기술 (Tsurushita N., Hinton P. R., 및 Kumar S., 인간 항체의 고안: 항-Tac부터 Zenapax까지, Methods (2005) 36(1), 69-83), 상보성 결정 영역(CDR)의 아미노산이 결합 활성을 증가시키기 위해 치환되는 친화력 성숙(Rajpal A., Beyaz N., Haber L., Cappuccilli G., Yee H., Bhatt R. R., Takeuchi T., Lerner R. A., 및 Crea R., 복합 라이브러리를 사용한 항체의 친화력을 크게 개선하기 위한 방법, Proc . Natl . Acad . Sci . USA (2005) 102(24), 8466-71) 및 물리화학적 안정성의 개선을 위한 골격 영역(FR)을 구성하는 아미노산 중의 아미노산 치환 (Ewert S., Honegger A., 및 Pluckthun A., 세포외 및 세포내 적용을 위한 항체의 안정성 개선: CDR grafting to stable frameworks and structure-based framework engineering, Methods (2004) 34(2), 184-99)을 포함한다. 불변영역 (또한 C 영역으로 명명)에서 아미노산 치환을 갖는 경우와 달리, 가변영역에서의 아미노산 치환은 일반적으로 항체의 특징(예를 들면, 안정성)을 개선하고 기능(예를 들면, 항원 결합 활성)을 강화하기 위해 사용된다. 인간화 항체의 CDR을 구성하는 아미노산 서열은 인간이 아닌 동물 종의 아미노산 서열로부터 유래되므로, 이 서열에 인공 아미노산 치환을 도입함에 의한 면원원성 발생의 위험은 다른 영역의 서열에서의 아미노산 치환보다 낮을 것으로 생각된다. 더욱이, 인간화 항체의 FR을 구성하는 아미노산 서열에서 인공 아미노산 서열에 있어서, 이와 같은 치환은 치환의 결과로서 얻어진 FR 아미노산 서열이 예를 들면, Kabat 데이타베이스 (http://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/), IMGT 데이타베이스 (http://imgt.cines.fr/), 등에 게시된 다수의 인간 항체 FR 아미노산 서열 중 어느 것과 동일하다면, 면역원성을 발생하는 위험을 거의 갖지 않는다고 생각된다. 더욱이, 면역원성은 Kabat 데이타베이스, IMGT 데이타베이스 등에 게시된 다수의 인간 항체 FR 아미노산 서열로부터 치환의 결과로서 얻은 FR 아미노산 서열과 매우 유사한 인간 항체 서열을 재선택함으로써 감소시킬 수 있다 (WO 1999/018212).
반대로, IgG 항체의 혈장 반감기를 개선하기 위해 알려진 유일한 방법은, 상기와 같이, 불변영역의 일부인 Fc 영역을 구성하는 아미노산의 아미노산 치환이고, 지금까지 면역원성을 발동하는 위험을 거의 가져오지 않는다고 믿어지는 가변영역을 구성하는 아미노산 서열의 아미노산 치환에 의해 IgG 항체의 혈장 반감기의 개선을 가져온다고 보고된 방법은 없다. 이것의 이유는 부분적으로 IgG 항체의 혈장 반감기는 항원-의존 결핍 및 IgG 항원에 대한 신생 Fc 수용체, 구제 수용체에 대한 결합에 크게 의존한다고 믿어지고 (Lobo E. D., Hansen R. J., 및 Balthasar J. P., 항체 약물동력학 및 약력학, J. Pharm . Sci . (2004) 93(11), 2645-68), 가변영역의 기능 및 성질은 혈장 반감기에 중요한 영향을 미치지 않을 것이기 때문이다.
또한 IgG 항체의 등전점 (pI)은 숙시닐화에 의한 IgG 항체의 음이온화에 의해 낮아지고 (Yamasaki Y., Sumimoto K., Nishikawa M., Yamashita F., Yamaoka K., Hashida M., 및 Takakura Y., 스캐빈저 수용체를 통해 간 비실질세포에 표적된 숙시닐화된 단백질의 인 비보 배열의 약물동력학적 분석: 수용체에 의한 인 비보 인식을 위한 분자 크기 및 음전하 밀도의 중요성, Pharmacol . Exp . Ther . (2002) 301(2), 467-77); IgG 항체의 pI가 폴리아민에 의한 변형에 의한 IgG 항체의 양이온화에 의해 상승한다 (Poduslo J. F. 및 Curran G. L., 폴리아민 개변이 혈액-신경 및 혈액-뇌 장벽에서 단백질의 투과성을 증가시킴, Neurochem . (1996) 66(4), 1599-609)는 것이 보고되었다. 그러나, 두 경우 모두 변형된 IgG 항체의 혈장 반감기는 증가되지 않았고, 오히려 혈장 반감기는 감소하였다. 그러므로, IgG 항체의 혈장 반감기의 증가는 상기의 IgG 항체의 화학적 변형에 의한 IgG 항체의 pI의 변형에 의해 실현될 수 없다.
본 발명은 상기 상황의 관점에서 추구되었다. 본 발명의 목적은 항-글리피칸 3 항체의 혈장 (혈액) 반감기를 제어하는 방법, 혈장 반감기가 제어된 항-글리피칸 3 항체 및 활성 성분으로서 본 항체를 갖는 약제학적 조성물, 뿐 아니라 상기 항-글리피칸 3 항체 및 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 세포독성을 갖는 항체의 혈장 반감기를 제어하여 항체의 세포독성을 조절하는 방법, 세포독성이 제어된 항체 및 그 항체를 갖는 약제학적 조성물, 뿐 아니라 그 항체 및 약제학적 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 항체(예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기를 제어하는 방법에 연구를 집중하였다. 그 결과, 본 발명자들은 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기를 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 가변영역과 불변영역을 구성하는 아미노산 잔기 중에서, 이 항체 분자의 표면에 노출된 아미노산 잔기를 개변시키고 그것에 의해 항체 분자의 표면 전하를 조절함으로써 제어할 수 있다는 것을 발견하였다. 특히 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 가변영역과 불변영역을 구성하는 아미노산 서열에서의 아미노산 잔기 중에서, 특정 아미노산 잔기가 항체의 구조 또는 기능, 예를 들면 항원 결합 활성에 영향을 미치지 않고 항체 분자의 표면 전하를 개변시킴으로써 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기를 제어할 수 있다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 이 방법으로 제어된 반감기를 갖는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)가 그것의 항원 결합 활성을 사실상 유지한다는 것을 확인하였다. 본 발명자들은 또한 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기의 제어이 항-글리피칸 3 항체와 같은 세포독성 항체에 의해 나타나는 암 세포 상의 종양 증식 억제 활성을 증가시킨다는 것을 발견하였다 .
본 발명은 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 표면상에 노출된 아미노산 잔기를 개변시킴으로써 혈장 반감기를 제어하는 방법, 아미노산 잔기 개변에 의해 제어된 혈장 반감기를 갖는 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체), 활성 성분으로서 이 항체를 포함하는 약제학적 조성물, 및 이와 같은 약제학적 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 더욱 특별히는 본 발명은 다음을 제공한다:
[1] 혈장 중 반응속도가 제어된 항-글리피칸 3 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
(a) 항-글리피칸 3 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서 항-글리피칸 3 항체는 항체의 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 전하의 개변을 야기하도록 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
(b) 항-글리피칸 3 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법;
[2] [1]에 있어서, 혈장 반응 속도의 제어는 혈장 반감기, 평균 혈장 체류시간, 및 혈장 제거로부터 선택되는 계수의 증가 또는 감소인 방법;
[3] [1]에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법;
[4] [1]에 있어서, 항-글리피칸 3 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는 FcRn 결합 영역 이외의 항-글리피칸 3 항체의 영역에 위치하는 것인 방법;
[5] [4]에 있어서, FcRn 결합 영역은 Fc 영역을 포함하는 것인 방법;
[6] [4]에 있어서, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기(numbering)에 따른 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법;
[7] [1]에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는 IgG 항체인 방법;
[8] [1]-[7]에 있어서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 중사슬 가변영역 또는 경사슬 가변영역에 존재하는 아미노산 잔기인 방법;
[9] [8]에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역 (FR), 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하고, 그리고 여기서 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 CDR 또는 FR에서 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 그 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 이루어지는 것인 방법;
[10] [9]에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
(1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1로 나타내는 중사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(a) 43번째 아미노산 잔기인 Q를 K로 치환,
(b) 52번째 아미노산 잔기인 D를 N으로 치환, 및
(c) 107번째 아니노산 잔기인 Q를 R로 치환;
및/또는
(2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(d) 17번째 아미노산 잔기인 E를 Q로 치환,
(e) 27번째 아미노산 잔기인 Q를 R로 치환, 및
(f) 105번째 아미노산 잔기인 Q를 R로 치환;
[11] [9]에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
(1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1로 나타내는 중사슬 영역에서의 적어도 하나의 치환:
(a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
(e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
(f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
및/또는
(2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
(k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환;
[12] [11]에 있어서, 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 31로 나타내는 중사슬 불변영역에서 적어도 하나의 개변을 더욱 포함하는 것인 방법:
(a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
(b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
(c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
(e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
(f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환;
[13] [9]-[12]에 있어서, 여기서 항-글리피칸 3 항체는 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 감소된 함량을 갖는 것인 방법;
[14] [1]-[13]에 따른 방법으로 제조된 항-글리피칸 3 항체;
[15] 제어된 혈장 중 반응속도를 갖는 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
(a) 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항체는 FcRn 결합 영역 이외의 항체의 불변영역에서 적어도 하나의 아미노산 잔기의 하전의 개변을 야기하기 위해 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
(b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 것인 제조방법;
[16] [15]에 있어서, 혈장 반응속조의 제어는 혈장 반감기, 평균 혈장 체류시간 및 혈장 제거로부터 선택되는 계수의 증가 또는 감소인 방법;
[17] [15]에 있어서, 아미노산 잔기의 하전의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법;
[18] [17]에 있어서, 항체는 IgG 항체인 방법;
[19] [18]에 있어서, 항체는 IgG1 항체인 방법;
[20] [17]에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 IgG 1 항체의 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 IgG4 항체의 상응하는 아미노산 잔기로 치환함으로써 이루어지는 것인 방법;
[21] [15]-[20]에 있어서, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기에 따른 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 및 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법;
[22] [20]에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 31 로 나타나는 중사슬 불변영역에서의 적어도 하나의 치환에 의해 이루어지는 것인 방법:
(a) 151번째 아미노산 H를 Q로 치환,
(b) 157번째 아미노산 K를 Q로 치환,
(c) 238번째 아미노산 R을 Q로 치환,
(d) 239번째 아미노산 D를 E로 치환,
(e) 241번째 아미노산 L을 M으로 치환, 및
(f) 302번째 아미노산 Q를 E로 치환;
[23] [15]-[22]에 있어서, 항체는 항-글리피칸 3 항체인 방법;
[24] 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역 (FR), 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 항-글리피칸 3 항체를 안정화시키는 방법으로, 상기 방법은:
(a) 항-글리피칸 3 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항-글리피칸 3 항체는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 개변에 의해 항체의 Tm값을 증가시키기 위해 변경된 아미노산을 갖는다); 및
(b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법;
[25] [24]에서, 아미노산 잔기는 중사슬 또는 경사슬의 FR1 영역 및/또는 FR2 영역에 존재하는 것인 방법;
[26] [25]에서, 중사슬의 FR2 영역의 아미노산 잔기는 VH4 서브클라스의 FR2 영역의 아미노산 잔기로 치환되는 것인 방법;
[27] [25]에서, 경사슬의 FR2 영역의 아미노산 잔기는 VK3 서브클라스의 아미노산 잔기로 치환되는 것인 방법;
[28] [24]-[27]에서, 아미노산 잔기의 치환은 다음으로부터 이루어지는 것인 방법:
(1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1에 나타나는 중사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(a) 37번째 아미노산 잔기 V를 I로 치환,
(b) 40번째 아미노산 잔기 A를 P로 치환,
(c) 48번째 아미노산 잔기 M을 I로 치환, 및
(d) 51번째 아미노산 잔기 L을 I로 치환
및/또는
(2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7에 나타나는 경사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(e) 42번째 아미노산 잔기 L을 Q로 치환,
(f) 48번째 아미노산 잔기 S를 A로 치환, 및
(g) 50번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환;
[29] 제어된 세포독성을 갖는 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
(a) 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항체는 세포독성 항체의 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 전하의 개변을 야기할 수 있도록 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
(b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법;
[30] [29]에서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법;
[31] [29]에서, 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는 FcRn 결합 영역을 제외한 항체의 영역에 위치하는 것인 방법;
[32] [31]에서, FcRn 결합 영역은 Fc 영역을 포함하는 것인 방법;
[33] [31]에, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기에 따라 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법;
[34] [29]에서, 항체는 IgG 항체인 방법;
[35] [29]-[34]에서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 항체의 불변영역의 아미노산 잔기인 방법;
[36] [29]-[34]에서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 항체의 중사슬 가변영역 또는 경사슬 가변영역에 존재하는 아미노산 잔기인 방법;
[37] [36]에서, 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역 (CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역, 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 항체이고, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 CDR 또는 FR에서 항체 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기의 적어도 하나를 그 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 이루어지는 것인 방법;
[38] [37]에서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
(1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1으로 나타내는 중사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
(e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
(f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
및/또는,
(2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7에 나타내는 경사슬 가변영역에서의 적어도 하나의 치환:
(g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
(k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환;
[39] [38]에서, 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 31로 나타내는 중사슬 불변영역에서의 적어도 하나의 치환을 더욱 포함하는 것인 방법:
(a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
(b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
(c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
(e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
(f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환;
[40] [36]에서, 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역(FR) 및 인간으로부터 유리된 불변영역을 포함하고, 그리고 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 불변영역의 항체 표면상에 노출될 수 있는 아미노산 중 적어도 하나를 아미노산의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함으로써 이루어지는 것인 방법;
[41] [40]에서, 치환은 다음으로부터 선택된 SEQ ID NO:31에 나타나는 중사슬 불변영역에서의 적어도 하나의 치환인 방법:
(a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
(b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
(c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
(e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
(f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환;
[42] [37]-[41]에서, 항체는 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 감소된 함량을 갖는 것인 방법;
[43] [29]-[42]에 따른 방법으로 제조된 항체;
[44] [43]에서, 항-글리피칸 3 항체인 항체;
[45] 다음을 포함하는 항체:
(1) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO;1에 나타나는 중사슬 가변영역:
(a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
(e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
(f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
및/또는
(2) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 7에 나타나는 경사슬 가변영역:
(g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
(i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
(j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
(k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환;
[46] [45]에서, SEQ ID NO: 3에 나타내는 중사슬 및 SEQ ID NO: 9에 나타내는 경사슬을 포함하는 항체;
[47] [45]에서, SEQ ID NO: 5에 나타낸 중사슬 및 SEQ ID NO: 11에 나타낸 경사슬을 포함하는 항체;
[48] [45]에서, SEQ ID NO: 27에 나타낸 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 28에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체;
[49] [45]에서, SEQ ID NO: 27에 나타낸 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 29에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체;
[50] [45]-[49]에서 인간 항체의 불변영역을 포함하는 항체;
[51] [50]에서, 불변영역은 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33에 나타낸 서열을 포함하는 것인 항체;
[52] 다음을 포함하는 항체:
(1) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO:1으로 나타내는 증사슬 가변영역:
(a) 43번째 아미노산 잔기 Q를 K로 치환,
(b) 52번째 아미노산 잔기 D를 N으로 치환, 및
(c) 107번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환;
및
(2) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역:
(d) 17번째 아미노산 잔기 E를 Q로 치환,
(e) 27번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환, 및
(f) 105번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환;
[53] [52]에 있어서, SEQ ID NO: 4에 나타낸 중사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 10에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 것인 항체;
[54] [52]에 있어서, SEQ ID NO: 6에 나타낸 중사슬 가변영역과 SEQ ID NO:12로 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체;
[55] [52]-[54]에서 인간 항체의 불변영역을 포함하는 항체;
[56] 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 31에 나타낸 중사슬 불변영역의 아미노산 서열에 적어도 하나의 치환을 포함하는 항체:
(a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
(b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
(c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
(d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
(e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
(f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환;
[57] SEQ ID NO: 33에 나타낸 중사슬 불변영역을 포함하는 항체;
[58] [45]-[57]에서, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 항체;
[59] [45]-[58]에 따른 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물;
[60] 활성 성분으로서 [45]-[58]에 따른 항체를 포함하는 항암제;
[61] [60]에서, 상기 암이 간암인 항암제;
[62] [45]-[58]에 따른 항체의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산;
[63] [62]에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포;
[64] [63]에서, 푸코스 운송자-결핍 동물 세포, 푸코실트란스퍼라제-결실 동물 세포, 또는 복합 분지된 당 사슬 변형이 변형된 동물 세포인 숙주세포;
[65] [63] 또는 [64]에 따른 숙주 세포를 배양하고 그리고 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 항체의 제조방법.
도 1은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 시차주사열량계 (DSC)측정에 의해 얻은 그래프이다.
도 2는 고 pI 등전압 전기영동에서 H0L0 항체와 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 전기영동사진으로, 여기서 레인 1 및 4는 pI 마커를 나타내고, 레인 2는 HOLO 항체를 나타내고, 그리고 레인 3은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체를 나타내고, 숫자값은 pI 마커 분자의 pI 값을 나타내고, 화살표는 상응하는 pI 마커 분자의 전기영동 이동도를 나타낸다;
도 3은 저 pI 등전압 전기영동에서 H0L0 항체와 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 전기영동사진으로, 여기서 레인 1 및 4는 pI 마커를 나타내고, 레인 2는 HOLO 항체를 나타내고, 그리고 레인 3은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체를 나타내고, 숫자값은 pI 마커 분자의 pI 값을 나타내고, 화살표는 상응하는 pI 마커 분자의 전기영동 이동도를 나타낸다;
도 4는 경쟁 ELISA에서 글리피칸 3 항원에 대한 H15L4 항체 및 H0L0 항체의 결합 친화도를 나타내고, 여기서 검은 다이아몬드는 HOLO 항체의 결합 친화도를 말하고 회색 사각형은 H15L4 항체의 결합 친화도를 말한다;
도 5는 경쟁 ELISA에서 글리피칸 3 항원에 대한 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체 및 H0L0 항체의 결합 친화도를 나타내고, 여기서 검은 다이아몬드는 HOLO 항체의 결합 친화도를 말하고 회색 사각형은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 결합 친화도를 말한다;
도 6은 경쟁 ELISA에서 글리피칸 3 항원에 대한 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체 및 H0L0 항체의 결합 친화도를 나타내고, 여기서 검은 다이아몬드는 HOLO 항체의 결합 친화도를 말하고 회색 사각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 결합 친화도를 말한다;
도 7은 인간 간 암-이식 마우스 모델에서의 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 항종양 활성을 나타낸다;
도 7A는 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체가 인간 간 암-이식 마우스 모델에 각각 투여량 5 mg/kg으로 투여되었을 때, 각 항체들의 상기 모델에서의 항종양 활성을 나타내고, 여기서 검은 다이아몬드는 비히클 투여에 대한 활성을 나타내고, 검은 삼각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체 투여에 대한 효과를 나타내고, 흰색 원은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체 투여에 대한 효과를 나타내고, 그리고 검은 사각형은 HOLO 항체 투여에 대한 효과를 나타낸다;
도 7B는 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체가 인간 간 암-이식 마우스 모델에 각각 투여량 1 mg/kg으로 투여되었을 때, 각 항체들의 상기 모델에서의 항종양 활성을 나타내고 , 여기서 검은 다이아몬드는 비히클 투여에 대한 활성을 나타내고, 검은 삼각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체 투여에 대한 효과를 나타내고, 흰색 원은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체 투여에 대한 효과를 나타내고, 그리고 검은 사각형은 HOLO 항체 투여에 대한 효과를 나타낸다;
도 8은 인간 간 암-이식 마우스 모델에서 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체에 대한 항체의 혈장 농도를 나타낸다;
도 8A는 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체가 인간 간 암-이식 마우스 모델에 투여량 5 mg/kg으로 투여되었을 때, 상기 모델에서의 각각의 시험 항체에 대한 항체의 혈장 농도를 나타내고, 여기서 검은 삼각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 혈장 농도를 나타내고, 흰색 원은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 혈장 농도를 나타내고, 그리고 검은 사각형은 HOLO 항체의 혈장 농도를 나타낸다;
도 8B는 H0L0 항체, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, 및 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체가 인간 간 암-이식 마우스 모델에 투여량 1 mg/kg으로 투여되었을 때, 상기 모델에서 각각의 시험 항체에 대한 항체의 혈장 농도를 나타내고, 여기서 검은 삼각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 혈장 농도를 나타내고, 흰색 원은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 혈장 농도를 나타내고, 그리고 검은 사각형은 HOLO 항체의 혈장 농도를 나타낸다; 그리고
도 9는 HepG2 세포, 인간 간 암 세포주에 대한 시험 항체의 ADCC 활성을 나타내고, 여기서 검은 삼각형은 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체에 의한 ADDC 활성을 나타내고, 흰색 원은 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체에 의한 ADDC 활성을 나타내고, 그리고 검은 사각형은 HOLO 항체의 의한 ADDC 활성을 나타낸다.
도 10은 상보적 ELISA에 의해 측정된 항원 글리피칸 3에 대한 H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 결합 친화성을 나타내고, 여기서 검은색 원은 HOLO 항체의 결합 활성을 나타내고, 흰색 원은 Hd1.8Ld1.6 항체의 결합 활성을 나타내고, 검은 사각형은 pH7pL14 항체의 결합 활성을 나타내고, 그리고 흰색 사각형은 pH7pL16 항체의 결합 활성을 나타낸다.
도 11은 인간 간암이 이식된 마우스 모델에서 H0L0 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 항종양 활성을 나타내고, 여기서 *는 HOLO 항체의 항종양 활성을 나타내고, 흰색 원은 Hd1.8Ld1.6 항체의 항종양 활성을 나타내고, 검은 사각형은 pH7pL14 항체의 항종양 활성을 나타내고, 흰색 사각형은 pH7pL16 항체의 항종양 활성을 나타낸다.
도 12는 마우스에서 H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체, pH7pL16 항체 및 pH7M85pL16 항체에 대한 항체의 혈장 농도를 나타내고, 여기서 *는 마우스에서의 HOLO 항체의 혈장 농도를 나타내고, 흰색 원은 마우스에서의 Hd1.8Ld1.6 항체의 혈장 농도를 나타내고, 검은 사각형은 마우스에서의 pH7pL14 항체의 혈장 농도를 나타내고, 흰색 사각형은 마우스에서의 pH7pL16 항체의 혈장 농도를 나타내고, 검은 삼각형은 마우스에서의 pH7M85pL16의 혈장 농도를 나타낸다.
도 13은 HepG2 세포, 인간 간 암 세포주에 대한 H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체, 및 pH7pL16 항체에 의한 ADCC 활성을 나타내고, 여기서 검은 원은 HOLO 항체에 의한 ADCC 활성을 나타내고, 흰색 원은 Hd1.8Ld1.6에 의한 ADCC 활성을 나타내고, 검은 사각형은 pH7pL14 항체에 의한 ADCC 활성을 나타내고, 흰색 사각형은 pH7pL16 항체에 의한 ADCC 활성을 나타낸다.
도 14는 경쟁적 ELISA에 의해 측정된 항원 글리피칸 3에 대한 H0L0 항체, H0M85L0 항체, pH7pL16 항체 및 pH7M85pL16 항체의 결합 친화성을 나타내고, 여기서 검은 삼각형은 HOLO 항체의 결합 활성을 나타내고, 검은 사각형은 H0M85L0 항체의 결합 활성을 나타내고, *는 pH7pL16 항체의 결합 활성을 나타내고, 흰색 다이아몬드는 pH7M85pL16 항체의 결합활성을 나타낸다.
도 15는 HepG2 세포, 인간 간 암 세포주에 대한 pH7pL16 항체 및 pH7M85pL16 항체에 의한 ADCC 활성을 나타내고, 여기서 흰색 사각형은 pH7pL16 항체에 의한 ADCC 활성을 나타내고 검은 삼각형은 pH7M85pL16 항체에 의한 ADCC 활성을 나타낸다.
본 발명은 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 중 반응속도를 제어하는 방법을 제공한다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 본 방법은 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기의 전하를 개변하는 것을 포함한다. 즉, 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 중 반응속도는 그것의 등전점 (pI)의 변화를 야기하도록 항체 중의 아미노산 잔기의 전하를 개변함으로써 제어할 수 있다. 제어된 혈장 중 반응속도를 갖는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 암 세포에 대해 제어되지 않은 항체보다 뛰어난 항종양 활성을 나타낼 수 있다.
여러 항체 이소타입 중에서, IgG 항체의 기본 대사 경로는 IgG 항체의 상당히 높은 분자량으로 인해 신장 배설을 통해 진행하지 않는다. 그 분자의 일부로서 Fc 영역을 함유하는 IgG 항체는 예를 들면, 혈관계의 내피세포에 의해 발현되는 신생 Fc 수용체 (FcRn)에 의해 중재된 구제 경로에 의한 재생으로 인해 긴 인 비보 반감기를 갖는 것으로 알려져 있다. IgG 항체는 내피세포에서 대사 경로에 의해 주로 대사된다고 생각된다 (He X. Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M. S., 및 Berg E. L., E- 및 P-셀렉틴 모두에 대해 선택성을 갖는 모노클로날 항체의 인간화 및 약물동력학, J. Immunol. (1998), 160(2), 1029-35). 즉, IgG 항체는 내피세포에 의해 비특이적으로 취해진 IgG 항체의 FGcRn에 결합을 통해 재생되고, 반면 결합할 수 없는 IgG 항체는 대사된다고 믿어진다. FcRn에 대한 결합 활성을 낮추도록 변형된 Fc 영역을 갖는 IgG 항체는 더 짧은 혈장 반감기를 나타낸다. 반대로, IgG 항체의 혈장 반감기는, FcRn에 대한 결합 활성이 증가되도록 IgG 항체의 Fc 영역을 구성하는 아미노산 잔기를 변형시킴으로써 증가될 수 있다 (He X. Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M. S., 및 Berg E. L., E- 및 P-셀렉틴 모두에 대해 선택성을 갖는 모노클로날 항체의 인간화 및 약물동력학, J. Immunol . (1998), 160(2), 1029-35; 및 LinksOber RJ, Radu CG, Ghetie V, Ward ES. 종들을 가로지르는 항체-FcRn 상호작용에 대한 비순수성의 차이: 치료 항체에 대한 함축. Int Immunol . (2001) 13(12), 1551-9). 상기에 따르면, IgG 항체의 혈장 중 반응속도를 제어하기 위한 공지의 방법은 Fc 영역을 구성하는 아미노산 잔기의 개변에 의한 FcRn에 대한 결합 활성의 개변을 포함한다. 상기 아미노산 잔기의 특정 예는, Kabat 번호표기에 따라, 아미노산 잔기 H250, H253, H310, H311, H314, H428, H435 및 H436를 포함한다. 이에 더하여, IgG 항체와 FcRn 사이의 상호작용을 직접 포함하는 아미노산 잔기 H254, H255, H257, H288, H296, H307, H309, H315, H415, H433는 개변을 위한 표적이라고 생각된다. 이들 아미노산 잔기는 각각 예를 들면, SEQ ID NO: 30의 130, 133, 190, 191, 194, 308, 315 및 316 번째 아미노산 잔기 및 134, 135, 137, 168, 176, 187, 189, 195, 295 및 313번째 아미노산 잔기 뿐 아니라, SEQ ID NO: 31의 133, 136, 193, 194, 197, 311, 318 및 319 번째 아미노산 잔기 및 137, 138, 140, 171, 179, 190, 192, 198, 298 및 316번째 아미노산 잔기에 상응한다. 그러나, 아래 제공된 실시예에 나타낸 바와 같이, 본 발명에 의해 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기는 높은 상관관계로 pI에 의존한다는 것이 발견되었다. 그러므로, 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기는, 개변이 특히 Kabat 번호표기에 따라 아미노산 잔기 H250, H253, H310, H311, H314, H428, H435 및 H436, 뿐 아니라 H254, H255, H257, H288, H296, H307, H309, H315, H415 및 H433에서 면역원성을 가져올 수 있는, FcRn 결합 영역을 구성하는 아미노산 잔기의 변형없이 제어될 수 있다는 것을 나타낸다. H250, H253, H310, H311, H314, H428, H435 및 H436, 뿐 아니라 H254, H255, H257, H288, H296, H307, H309, H315, H415 및 H433 이외의 아미노산 잔기에서의 개변은 pI 값의 감소 및 FcRn에 대한 결합 활성의 변화를 나타낸다는 것 또한 놀라운 결과였다.
특정 이론에 결부시킬 의도 없이, 본 발명자들은 현재 다음과 같은 의견을 갖는다. 내피 세포에 의한 IgG 항체의 비특이적 섭취 속도는 IgG 항체와 음성으로 하전된 세포 표면 사이의 물리화학적 쿨롱 상호작용에 의존하다고 생각된다. 그러므로, IgG 항체의 pI를 낮춤 (높임)에 의한 쿨롱 상호작용의 감소 (증가)는 내피 세포에 의한 비특이적 섭취의 감소 (증가)를 가져오고, 이것은 차례로 내피세포에서의 대사의 감소 (증가)를 야기하고 혈장 중 반응속도의 제어를 가져온다. 본 명세서에 사용되는 바에 따르면, "쿨롱 상호작용의 감소"는 반발력으로 표현될 때 쿨롱힘에서의 증가를 의미한다. 항체와 내피 세포의 세포 표면 음성 전하 사이의 쿨롱 상호작용은 물리화학적 상호작용이므로, 이 상호작용은 항체를 구성하는 아미노산 서열 그 자체에 주로 의존하지 않는다고 믿어진다. 그러므로, 본 발명에서 발견된 혈장 중 반응속도의 제어 방법은 어느 항체 또는 항-글리피칸 3 항체에 널리 적용될 수있고 특정 항체 또는 항-글리피칸 3 항체로만 제한되지 않는다.
IgG 항체가 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)로서 사용된다면, IgG-타입 분자인 한 어느 서브타입도 사용될 수 있다. 이중특이 IgG 항체가 또한 사용될 수 있다. 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)가 이중특이 항체이면, 항체는 또한 상응하는 항체 (항-글리피칸 3 항체의 경우 글리피칸 3 분자) 및 그 항체 이외의 에피토프 둘 다에 특이적으로 결합할 수 있다. 예를 들면, NK 세포, 세포독성 T-세포, LAK 세포 등을 보충하기 위해, 이들 세포에 특이적으로 결합하는 표면 항원들이 다른 항원으로서 적절히 사용될 것이다. LAK 세포에 의한 세포독성은 MUC1 (an adenocarcinoma-related antigen)을 인식하는 MUSE11 항체, 및 LAK 세포 표면 항원을 인식하는 OKT3 항체로부터 생산되는 이중특이 항체를 사용하는 담관암에 대해 제시된다는 것이 나타났다 (Katayose Y., Kudo T., Suzuki M., Shinoda M., Saijyo S., Sakurai N., Saeki H., Fukuhara K., Imai K., 및 Matsuno S., 이중 특이 항체에 의한 MUC1-특이 표적화 면역치료법: 제노그래프트된 인간 담즙 덕트 종양성장의 억제, Cancer Res . (1996) 56(18), 4205-12). 본 발명의 혈장 중 반응속도가 개선된 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 MUC1을 인식하는 MUSE11 항체를 대신하여 적절히 사용될 수 있다. 이에 더하여, 항체가 결합하는 항원의 다양한 에피토프를 인식하는 항체 (항-글리피칸 3 항체의 경우 글리피칸 3 분자)는 또한 본 발명의 이중특이 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)로서 적절히 사용될 수 있다. scFv 및 Fab와 같은 신장 배설이 주요 대사 경로인 저분자량 항체의 경우, 이와 같은 항체의 혈장 중 반응속도는 상기와 같이 pI에 의해 제어될 수 없다. 그러나, 본 발명은 신장 배설이 주요 대사성 경로가 아닌 Fc-결합 단백질인 어느 항체 분자 유형에 적용될 수 있다. 이와 같은 분자의 예는 scFv-Fc, dAb-Fc 및 융합 단백질을 포함한다. 이들 분자들의 주요 대사 경로는 신장 배설에 의한 대사과정을 통하지 않으므로, 이들 분자들의 혈장 중 반응속도는 본 발명의 방법에 따른 pI를 교환함으로써 제어될 수 있다. 항체-유사 분자는 본 발명에 의해 예상된 항체 분자에 포함된다. 항체-유사 분자는 표적 분자에 결합함에 의해 작용하는 분자이고(Binz H. K., Amstutz P., 및 Pluckthun A., 비면역글로불린 도에인으로부터 신규 결합 단백질의 엔지니어링, Nat . Biotechnol . (2005) 23(10), 1257-68); 그리고 예를 들면 DARPins, Affibody, 및 Avimer를 포함한다
본 발명에 사용된 바에 따르면, 용어 "제어된 혈장 중 반응속도"는 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산의 개변 후 항체의 혈장 반응 속도가 개변에 앞서 항체의 혈장 중 반응속도와 비교했을 때 원하는 방향으로 변하는 것을 의미한다. 그러므로, 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기를 증가시키는 것이 요구될 때, "혈장 중 반응속도의 제어"은 항체의 혈장 반감기의 증가를 말한다. 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 반감기를 감소시키는 것이 요구될 때, "혈장 중 반응속도의 제어"은 항체의 혈장 반감기의 감소를 말한다.
본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 중 반응속도가 원하는 방향으로 개변되는지, 즉 혈장 중 반응속도가 원하는 바에 따라 제어되었는지는, 예를 들면, 마우스, 래트, 토끼, 개, 원숭이 등을 사용한 약동학적 시험에 의해 적절히 평가될 수 있다. 이에 더하여, 본 발명에 사용되는 바와 같은 "혈장 반감기의 증가" 또는 "혈장 반감기의 감소"는 또한 평균 혈장 잔류 시간 및 혈장 제거와 같은, 혈장 반감기 계수 이외의 계수를 통해 파악될 수 있다 (Pharmacokinetics Analysis by Practice, (Nanzando)). 예를 들면, 본 발명에 따른 "혈장 중 반응속도의 제어"은 WinNonlin (Pharsight) 인 비보 약물동력학적 분석 소프트웨어를 수반하는 명령에 따른 비구획 분석을 실행함에 의해 이들 계수로 적절히 평가될 것이다.
본 발명에 사용되는 바에 따는 구 "표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기"는 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 폴리펩티드의 표면상에 존재하는 아미노산 잔기를 지칭한다. "폴리펩티드의 표면상에 존재하는 아미노산 잔기"는 그 측쇄가 용매 분자 (특히 물 분자와 접촉될 수 있는 아미노산 잔기를 말한다. 이들의 측쇄 모두가 용매 분자와 접촉할 필요는 없다. 아미노산 잔기의 측쇄의 일부라도 용매 분자와 접촉하면, 이와 같은 아미노산 잔기는 표면상에 존재하는 아미노산 잘기로 간주된다. 본 분야의 당업자는 상업적으로 이용가능한 상동 모델링 소프트웨어를 사용하여 폴리펩티드 또는 항체의 상동성 모델을 구축할 수 있다. 이 상동성 모델을 근거로, 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 폴리펩티드의 표면상의 아미노산 잔기는 "폴리펩티드의 표면에 존재하는 아미노산 잔기"로서 적절히 선택될 수 있다.
"표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기"는 본 발명에서 특별히 제한되지 않고, 바람직하기는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 FcRn 결합 영역의 외부에 존재하는 아미노산 잔기이다. FcRn 결합 영역은 바람직하기는 Fc 영역이지만, 또한 예를 들면, 하나 이상의 아미노산 잔기 Kabat 번호표기에 따른 H250, H253, H310, H311, H314, H428, H435 및 H436로 구성된 영역을 포함할 수 있다. 이에 더하여, IgG 항체와 FcRn 사이의 상호작용을 간접적으로 포함하는 아미노산 잔기 H254, H255, H257, H288, H296, H307, H309, H315, H415, H433가 변형의 표적이라고 생각되었다. 이들 아미노산 잔기들은 예를 들면, 각각, SEQ ID NO:30의 130, 133, 190, 191, 194, 308, 315 및 316 번째 아미노산 잔기, 및 134, 135, 137, 168, 176, 187, 189, 195, 295 및 313 번째 아미노산 잔기, 뿐 아니라 SEQ ID NO: 31의 133, 136, 193, 194, 197, 311, 318 및 319 번째 아미노산 잔기 및 137, 138, 140, 171, 179, 190, 192, 198, 298 및 316 번째 아미노산 잔기에 상응한다.
본 발명에 따른 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)에서 전하가 개변될 아미노산 잔기는 바람직하기는 항체의 중사슬 (H 사슬) 가변영역 또는 경사슬(L 사슬) 가변영역을 구성하는 아미노산 잔기이다. 바람직하기는 이들 가변영역들의 특정 예는 상보성-결정 영역 (CDR) 및 골격 영역 (FR)이다.
본 분야의 당업자는 상동 모델링에 의해 구축된 상동 모델을 기준으로 항체의 가변영역에서 표면 아미노산 잔기를 적절히 선택할 수 있다. 그러므로, 항체의 가변영역에서의 표면 아미노산 잔기는 Kabat 번호표기에 따른 아미노산 잔기인, H1, H3, H5, H8, H10, H12, H13, H15, H16, H19, H23, H25, H26, H39, H42, H43, H44, H46, H68, H71, H72, H73, H75, H76, H81, H82b, H83, H85, H86, H105, H108, H110, 및 H112로부터 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, SEQ ID NO: 1에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체 중사슬의 FR에서, 표면 아미노산 잔기는 1, 3, 5, 8, 10, 12, 13, 15, 16, 19, 23, 25, 26, 39, 42, 43, 44, 46, 69, 72, 73, 74, 76, 77, 82, 85, 87, 89, 90, 107, 110, 112, 및 114 위치의 아미노산 잔기를 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 중사슬 CDR 중의 표면 아미노산 잔기는 또한 동일한 상동 모델을 사용하여 선택될 수 있다. 그러므로, Kabat 번호표기에 따른 아미노산 잔기 H97은 대부분의 항체의 경우 표면에 노출된다. 예를 들면, SEQ ID NO:1 에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체의 중사슬 CDR의 위치 101의 세린은 아미노산 잔기에 상응한다. SEQ ID NO:1에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체의 중사슬 CDR의 다른 아미노산 잔기들은 위치 52, 54, 62, 63, 65, 및 66의 아미노산 잔기들이다.
경사슬 FR과 관련하여, 항체의 가변영역의 표면 아미노산 잔기들은 Kabat 번호표기에 따른 아미노산 잔기의 L1, L3, L7, L8, L9, L11, L12, L16, L17, L18, L20, L22, L38, L39, L41, L42, L43, L45, L46, L49, L57, L60, L63, L65, L66, L68, L69, L70, L74, L76, L77, L79, L80, L81, L85, L100, L103, L105, L106, 및 L107로부터 적절히 선택될 수 있다. 예를 들면, 표면 아미노산은 SEQ ID NO: 7에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체의 1, 3, 7, 8, 9, 11, 12, 16, 17, 18, 20, 22, 43, 44, 45, 46, 48, 49, 50, 54, 62, 65, 68, 70, 71, 73, 74, 75, 79, 81, 82, 84, 85, 86, 90, 105, 108, 110, 111, 및 112을 포함하지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. 경사슬 CDR 중의 표면 아미노산 잔기들은 중사슬 CDR에서 표면 아미노산 잔기들을 결정한 동종 모델과 동일한 동종 모델을 사용하여 선택될 수 있다. SEQ ID NO: 7에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체의 CDR에서 아미노산 잔기의 적절한 예는 위치 24, 27, 33, 55 및 59의 아미노산 잔기이다.
본 발명의 방법에서 아미노산 잔기의 "개변"은 특별히, 그중에서도 특히 원 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환, 원 아미노산 잔기의 결실, 및 새로운 아미노산 잔기의 첨가를 표시하고, 바람직하기는 원 아미노산 잔기를 다른 아미노산 잔기로의 치환을 나타낸다. 그러므로, 본 발명의 "아미노산 잔기의 전하의 개변"은 바람직하기는 아미노산 치환이다.
본 발명의 항-글리피칸 3 항체의 "아미노산 잔기의 전하의 개변"을 수행하기 위해, 예를 들면, 전하는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 중 사슬 가변영역의 위치 19, 43, 52, 54, 62, 63, 65, 66, 및 107의 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 대해 개변되는 것이 바람직하다. 이에 더하여, 전하는 바람직하기는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 경사슬 가변영역의 위치 17, 24, 27, 33, 55, 59, 79, 82, 105 및 112의 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에 대해 개변된다. 상기 기술된 아미노산 잔기들 중에서, 그 전하가 개변된 것들 이외의 아미노산 잔기들은 혈장 중 반응속도에 대한 원하는 제어 효과가 얻어지는 한 개변될 필요는 없다; 그러나, 이와 같은 아미노산 잔기는 통상적으로 개변된 아미노산 잔기(들)과 동일한 유형의 전하를 갖도록 또는 전하를 갖지 않도록 개변된다.
전하-보유 아미노산이 존재한다고 알려진다. 일반적으로, 라이신(K), 아르기닌(R), 및 히스티딘 (H)은 양으로 하전된 아미노산으로 알려져 있다. 아스파르트산 (D) 및 글루타민산 (E)은 음으로 하전된 아미노산으로 알려져 있다. 이들 이외의 아미노산들은 하전되지 않은 아미노산으로 알려져 있다.
바람직하기는, 상기 "개변된 아미노산 잔기"는 통상적으로 다음의 군 (a) 및 (b) 중 어디에 존재하는 아미노산 잔기로부터 선택되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다.
(a) 글루타민산 (E), 아스파르트산 (D)
(b) 라이신 (K), 아르기닌 (R), 및 히스티딘 (H)
원래 (변형-전) 아미노산 잔기가 이미 전하를 갖는 경우, 비하전된 아미노산 잔기를 제공하기 위한 개변은 또한 본 발명의 바람직한 구현예이다. 그러므로, 본 발명에서 개변은 (1) 하전된 아미노산을 비하전된 아미노산으로 치환, (2) 하전된 아미노산을 반대 전하를 갖는 아미노산으로 치환, 및 (3)비하전된 아미노산을 하전된 아미노산으로 치환을 포함한다.
항체의 등전점 (pI)를 바꾸기 위해 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산 잔기의 개변은 본 발명의 경우 바람직하다. 이에 더하여, 다수의 아미노산 잔기가 개변될 경우, 변형될 아미노산 잔기들은 적은 수의 하전되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 것이다.
본 발명의 항-글리피칸 3 항체에서 "아미노산 잔기의 전하의 개변"의 적절한 예는 다음과 같다. pI 값을 증가시키는 개변에 있어서, 예를 들면, SEQ ID NO: 1에 나타난 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 중사슬 가변영역의 Q43K, D52N, 및 Q107R로부터 선택된 적어도 하나의 치환이 이루어질 수 있고, SEQ ID NO: 4 또는 SEQ ID NO: 6에 나타낸 아미노산 서열에 대한 개변이 특히 바람직하다. 이에 더하여, SEQ ID NO: 7에 나타난 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 경사슬 가변영역의 E17Q, Q27R, and Q105R로부터 선택된 적어도 하나의 치환이 이루어질 수 있고, SEQ ID NO: 10 또는 12에 나타난 아미노산 서열에 대한 개변이 특히 바람직하다. 한편 pI 값을 감소시키는 개변에 있어서, SEQ ID NO: 1에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 중사슬 가변영역의 K19T, Q43E, G62E, K63S, K65Q, 및 G66D으로부터 선택된 적어도 하나의 치환이 이루어질 수 있고, SEQ ID NO: 3, 5, 또는 27에 나타낸 아미노산의 변형이 특히 바람직하다. 이에 더하여, 예를 들면, SEQ ID NO: 7에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 경사슬 가변 여역의 R24Q, Q27E, K79T, R82S 및 K112E로 부터 선택되는 적어도 하나의 치환이 이루어질 수 있고, SEQ ID NO: 9, 11, 28 또는 29에 나타낸 아미노산 서열에 대한 개변이 특히 바람직하다. 이에 더하여, pI값을 감소시키는 개변은 또한 Kabat 번호표기에 따른 H268, H274, H355, H356, H358 및 H419로 지정된 중사슬 불변영역의 하나 이상의 아미노산 잔기의 치환을 또한 포함한다. 치환의 바람직한 예는 SEQ ID NO: 31에 나타낸 중사슬 불변영역에서의 적어도 하나의 변형이고, 예를 들면, 151번째 아미노산 잔기 H의 Q로의 치환, 157번째 아미노산 잔기 K의 Q로의 치환, 238번째 아미노산 잔기 R의 Q로의 치환, 239번째 아미노산 잔기 D의 E로의 치환, 241번째 아미노산 잔기 D의 E로의 치환, 241번째 아미노산 잔기 L의 M으로의 치환, 및 302번째 아미노산 잔기 Q의 E로의 치환을 포함한다. 상기 치환은 인간 항체의 IgG1의 불변영역과 IgG4의 불변영역의 키메라를 가져온다. 그러므로, 이와 같은 치환은 항체의 면역원성에 영향을 미치지 않고 원하는 pI 값을 갖는 변형 항체의 제조를 허용한다.
변형되는 아미노산 잔기의 수에 대한 본 발명의 특정 제한은 없다; 예를 들면, 항체의 가변영역이 개변될 때, 바람직하기는 항원에 대한 결합 활성이 낮아지는 것을 막고 면역원성의 상승을 피하기 위해, 원하는 제어된 혈장 중 반응속도를 얻는데 필요한 아미노산 잔기의 최소한의 수가 개변된다. 면역원성의 감소를 가져오는 아미노산 잔기 변형 및/또는 항원에 대한 결합 활성의 증가를 가져오는 아미노산 잔기의 개변과의 적절한 결합을 수행하는 것도 적합할 것이다.
공지의 기술이 항체에 대한 항원 결합 활성을 측정하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 효소-연결 면역흡착법(ELISA), 효소 면역분석 (EIA), 방사면역측정법 (RIA), 또는 형광면역측정법이 사용될 수 있다. 이들 방법은 일반 교과서 Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow 및 David Lane, Cold Spring Harbor laboratory, 1988.에 기재되어있다.
Antibodies : A Laboratory Manual (Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor laboratory, 1988)의 359 내지 420 쪽에 기재된 방법들은 세포에 대한 항체의 결합활성을 측정하는데 사용되는 방법의 예시이다. 결합 활성은 항원으로서 세포를 사용하는 FACS (fluorescence activated cell sorting) 또는 ELISA 원리를 근거로 평가된다. ELISA 포맷에서, 세포에 대한 항체의 결합 활성은 효소 반응에 의해 생성된 신호 수준들을 비교하여 정량적으로 평가된다. 그러므로, 시험 항체가 과-발현 세포가 고정화되어 있는 ELISA 플레이트에 첨가되고 세포에 결합된 항체는 시험 항체를 인식하는 효소-라벨된 항체에 의해 검출된다. FACS의 경우, 세포에 대한 결합 활성은 시험 항체에 의한 희석 시리즈를 구축하고 과-발현 세포에 대한 항체 결합 역가를 비교함으로써 비교될 수 있다. 완충액 중에 현탁되고 (ELISA 플레이트와 같은) 담체에 앵커되지 않은 세포의 표면에 발현된 항원과 이 항원에 대한 항체 간의 결합은 FACS 포맷에 의해 측정될 수 있다. 이와 같은 측정에 사용된 흐름세포분석기는 FACSCantoTM II, FACSAriaTM, FACSArrayTM, FACSVantageTM SE, 및 FACSCaliburTM (모두 BD Bioscience 제품) 및 EPICS ALTRA HyPerSort, Cytomics FC 500, EPICS XL-MCL ADC, EPICS XL ADC, 및 Cell Lab Quanta/Cell Lab Quanta SC (모두 Beckman Coulter 제품)을 포함한다.
항원에 대한 시험 항-글리피칸 3 항체의 결합 활성을 측정하는 적합한 방법의 예에서, 시험 항체는 글리피칸 3를 발현하는 세포와 반응하고; 세포는 시험 항체를 인식하는 FITC-라벨된 2차 항체로 염색되고; 형광 강도는 FACSCalibur (BD)로 측정되고 CELL QUEST 소프트웨어를 사용하여 분석된다 (BD). 이 방법에 따라, 글리피칸 3-발현 세포의 표면 위의 글리피칸 3에 결합된 시험 항체는 시험 항체, 그리고 FACSCalibur로 측정된다면 형광 강도를 특이적으로 인식하는 FITC-라벨된 2차 항체에 의해 염색되고, 그리고 나서 생성된 형광 강도의 분석으로 얻어진 입체-평균값(test geo-mean value)은 CELL QUESR 소프트웨어를 사용하는 대조 항체로부터 얻은 대조 입체-평균값과 비교된다. 입체-평균값 (입체적 평균)을 산출하는 컴퓨터 식을 CELL QUEST 소프트웨어 사용자 지침서에 기재된다(BD Biosciences).
항체를 수여받은 인산에 대한 인 비보 면역원성의 증가를 피하기 위해, 변형된 아미노산 서열이 바람직하기만, 인간 서열 (인간 기원의 천연 발생하는 항체에서 나타나는 서열)로 제한되는 것은 아니다. 이에 더하여, 돌연변형은 서열에 다수의 FR들(FR1, FR2, FR3, FR4) 각각을 인간 서열로 개변시키기 위해, 등전점을 변화시키기 위해 도입된 개변과 다른 위치에 도입되는 것이 적절하다. FR 각각을 이 방법으로 인간 서열로 전환시키는 방법은 Ono K., Ohtomo T., Yoshida K., Yoshimura Y., Kawai S., Koishihara Y., Ozaki S., Kosaka M., 및 Tsuchiya M., 인간화 항-HM1.24 항체가 인간 작동세포-매개 세포독성에 의해 다중 골수종 세포를 사멸시킴, Mol. Immunol . (1999) 36(6), 387-395에 의해 보고된다. 이에 더하여, 항체의 등전점을 바꾸기 위해, 각각의 FR 서열은 다른 인간 FR 서열로 전환되어 특정 FR의 전하를 교환할 수 있다 (예를 들면, FR3는 항체의 등전점을 낮추기 위해 또 다른 인간 FR과 교환될 수 있다). 이와 같은 인간화법은 Dall's Acqua W. F., Damschroder M. M., Zhang J., Woods R. M., Widjaja L., Yu J., 및 Wu H., 골격 셔플링에 의한 항체 인간화, Methods (2005) 36(1), 43-60에 보고된다..
바람직한 제어된 혈장 중 반응속도가 표면 전하의 적절한 개변에 의해 이루어지지 않는 경우, 원하는 제어된 혈중 반응속도를 나타내는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)가 표면 전하 개변의 반복적 실행 및 혈장 중 반응속도 평가에 의해 적절히 얻어질 수 있다.
키메릭 EP5C7.g4, 키메릭 항-E, P-셀렉틴 항체(IgG4)의 혈장 중 반응속도를 HuEP5C7.g4, 인간화 항체 (IgG4)의 혈장 중 반응속도와 비교하였고, 둘은 붉은털 원숭이에서 동일한 혈장 중 반응속도를 갖는다는 것을 나타낸다(He X. Y., Xu Z., Melrose J., Mullowney A., Vasquez M., Queen C., Vexler V., Klingbeil C., Co M. S., 및 Berg E. L., E- 및 P-셀렉틴 모두에 대한 선택성을 갖는 모노클로날 항체의 인간화 및 약물 동력학, J. Immunol . (1998), 160(2), 1029-35). 이에 더하여, ch5d8, 키메릭 anti-CD154 항체의 혈장 중 반응속도는 사이노몰거스 원숭이의 인간화 항체 Hu5c8 의 혈장 중 반응속도와 비교하였고, 둘은 동일한 혈장 중 반응속도를 갖는다는 것을 나타내었다 (Gobburu J. V., Tenhoor C., Rogge M. C., Frazier D. E. Jr., Thomas D., Benjamin C., Hess D. M., 및 Jusko W. J., Pharmacokinetics/dynamics of 5c8, a monoclonal antibody to CD154 (CD40 리간드) suppression of an immune response in monkeys, J. Pharmacol. Exp . Ther . (1998) 286(2), 925-30). 키메릭 항체 CC49의 혈장 중 반응속도는 마우스의 인간화 항체 HuCC49의 혈장 중 반응속도와 동일하다고 나타나 있다 (Kashmiri S. V., Shu L., Padlan E. A., Milenic D. E., Schlom J., 및 Hand P. H., 인간화된 항 종양 항체 CC49의 발생, 특성화 및 인 비보 연구, 융합세포 (1995) 14(5), 461-73). 마우스 항체와 인간화 항체의 혈장 중 반응속도 및 분포는 마우스에서의 평가와 동일하다는 것을 나타내었다 (Graves S. S., Goshorn S. C., Stone D. M., Axworthy D. B., Reno J. M., Bottino B., Searle S., Henry A., Pedersen J., Rees A. R., 및Libby R. T., 인간화 NR-LU-13 항체의 분자 모델링 및 잠복기 평가, Clin . Cancer Res. (1999) 5(4), 899-908; Couto J. R., Blank E. W., Peterson J. A., 및 Ceriani R. L., 항-BA46 모노클로날 항체 Mc3: 신규한 위치 컨센서스 및 인비고 및 인 비트로 특성화를 사용한 인간화, Cancer Res . (1995) 55(8) 1717-22). 키메릭 항체와 인간화 항체의 혈장 반응 속도 및 분포는 뮤린 Fc와 인간 Fc가 모두 뮤린 FcRn과 교차-반응성이라는 사실로 인해 동일하다고 생각된다. 이들 실시예에 나타난 바와 같이, 혈장 반응 속도는 동일한 CDR을 갖는 키메릭 항체와 인간화 항체 사이에 동일하다. 이것은 Ghetie V., Popov S., Borvak J., Radu C., Matesoi D., Medesan C., Ober R. J., 및 Ward E. S., 임의의 돌연변이 반응에 의한 IgG 분획의 혈청 지속의 증가, Nat . Biotechnol . (1997) 15(7), 637-40) 등에 의해 제공된 공지의 방법에 의한 인간화는 키메릭 항체와 동일한 혈장 중 반응속도를 제공할 것이고, 그러므로 제어된 혈장 중 반응속도를 갖는 인간화 항체는 공지의 방법으로 제조될 수 없다는 것을 의미한다.
반대로, 키메릭 항체 (예를 들면 키메릭 항-글리피칸 3 항체)가 본 발명의 방법에 따라 인간화되는 경우, 항체의 pI는 원 키메릭 항체와 비교하여 제어된 혈장 중 반응속도 (즉, 그것의 혈장 반감기의 증가 또는 감소)를 나타내는 항체 (예를 들면, 인간화 항-글리피칸 3 항체)를 구축하기 위해 키메릭 항체의 표면상에 노출될 수 있는 아미노산 잔기에 대한 개변에 의해 개변될 수 있다. 혈장 중 반응속도의 제어를 목적으로, 인간화 항체 (예를 들면, 인간화 항-글리피칸 3 항체)의 표면에 노출될 수 있는 아미노산의 개변은 항체의 인간화와 동시에 수행될 수 있고 또는 인간화 항체의 pI는 인간화 항체 (예를 들면 인간화 항-글리피칸 3 항체)로부터 출발한 표면-노출 아미노산의 개변에 의해 개변될 수 있다.
동일한 인간 항체 FR 서열을 이용하여 인간화된 3개의 인간화 항체인 트라스트주맙, 베바시주맙 및 페르투주맙은 거의 동일한 혈장 중 반응속도를 갖는다고 확정되었다 (Adams C. W., Allison D. E., Flagella K., Presta L., Clarke J., Dybdal N., McKeever K., 및 Sliwkowski M. X., 치료적 HER 이합체화 억제제, pertuzumab를 생산하기 위한 재조합 모노클로날 항체의 인간화, Cancer Immunol Immunother. (2006) 55(6), 717-27). 그러므로, 혈장 중 반응속도는 항체들이 동일한 FR 서열을 사용하여 인간화되는 경우 거의 동일하다. 본 발명의 방법에 따라, 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 혈장 중 반응속도는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 pI가 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기에 대한 개변을 추가함으로써 개변되는 인간화 단계에서 제어될 수 있다.
본 발명의 방법은 인간 항체에도 적용될 수 있다. 초기 준비된 인간 항체의 혈장 중 반응속도와 비교하여 제어된 혈장 중 반응속도 (즉, 이전의 혈장 반감기의 증가 또는 감소)를 갖는 인간 항체 (예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체)는 인간 항체 라이브러리, 인간 항체-생산 마우스 등으로부터 구성된 인간 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기에 변형을 추가함에 의해 인간 항체 (예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체)의 pI의 개변에 의해 구축될 수 있다.
항체의 혈장 반감기는 항체의 pI값을 낮춤으로써 증가된다. 반대로, 항체의 pI 값을 증가시킴에 의해 혈장 반감기는 감소되고 항체의 조직 전좌 특성은 개선된다고 알려진다 (Vaisitti T., Deaglio S., 및 Malavasi F., 모노클로날 항체의 양이온화: another step towards the "magic bullet"?, J. Biol . Regul Homoest . Agents (2005) 19(3-4), 105-12; Pardridge W. M., Buciak J., Yang J., 및 Wu D., 인간화 유방 암종 세포에서의 강화된 세포내 이입 및 단백질 양이온화 후 인간화된 모노클로날 항체의 래트에서의 배양된 인 비보 생물학적 분배, J Pharmacol Exp Ther. (1998) 286(1), 548-54). 그러나, 이와 같은 항체는 증가된 면역원성 및 세포로의 강화된 내재화를 나타낸다는 사실에 기인하여, 세포로의 내재화는 ADCC 활성, CDC 활성 등과 같은, 세포독성 활성의 발현을 방해하므로, 세포독성 활성과 같은 메카니즘을 거쳐 항-암 효과를 나타내는 항체로서 적용하기 위해 추가의 개선이 요구된다. 그러므로, 세포로의 내재화가 ADCC 활성, CDC 활성 등과 같은 세포독성 활성의 발현을 방해하는 세포독성 활성과 같은 메카니즘을 통해 항-암 효과를 나타내는 항체에 관하여, 항체의 pI 값의 증가 또는 항체의 pI 값의 감소가 종양-억제 효과의 강화를 일으키는가는 확인되지 않았다. 본 발명에서, pI 값이 감소된 변형 인간화 항-글리피칸 3 항체 및 pI값이 증가된 변형 인간화 항-글리피칸 3 항체를 구축하였고, 그리고 나서 두 항체를 모두 항종양 효과 비교 시험을 실시하여 어느 개변이 더 높은 종양-억제 활성을 갖는가에 대한 질문을 시험하였다. 그 결과, 놀랍게도 pI 값이 감소된 인간화 항-글리피칸 3 항체가 간암에 대해 더 나은 효과를 나타내는 것이 발견되었다.
본 명세서에 사용되는 바에 따르면 용어 "항-글리피칸 3 항체"는 상기와 같이 이미 아미노산 잔기 전하가 개변된 항-글리피칸 3 항체를 그것의 아미노산 서열을, 예를 들면, 이 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 아미노산 잔기를 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입에 의해 추가로 개변함으로써 얻어진 항-글리피칸 3 항체를 포함한다. 이에 더하여, 본 발명에 사용됨에 따른 용어 "항-글리피칸 3 항체"는 또한 이미 아미노산 잔기 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입, 또는 키메르화, 인간화 등에 의해 그것의 아미노산 서열이 개변되고, 그리고 부가적으로 상기 항-글리피칸 3 항체를 구성하는 아미노산 잔기의 전하가 개변된 항-글리피칸 3 항체로부터 얻은 항-글리피칸 3 항체를 포함한다.
개변 목적이 본 발명의 항체(예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 특성을 개선하는 것인 변형의 바람직한 예는 항체의 안정성을 상승시키는 것을 목적으로 하는 변형이다(이하 안정성 개변으로 표현). 수용액에서, 항체는 두 상태, 즉 자연 상태 및 비활성 변성 상태 사이에서 균형을 유지한다. 자연 상태의 안정성은, 열역학 제2법칙에 의해 나타나는 바와 같이(△G = △H -T△S), 시스템의 깁스 자유에너지 변화 △G와, △G의 성분들 사이의 균형, 즉 (예를 들면, 폴리펩티드 사슬에 결합된 수소 결합과 소수성 상호작용의 변화에 기인하는) 엔탈피 변화 △H 및 (용매화 및 3-차원 구조에서의 자유도에서의 변화에 기인하는) 엔트로피 변화 △S에 의존한다. △G의 양의 값은 단백질의 천연 상태가 단백질의 변성 상태보다 더 안정하다는 것을 의미하고, 단백질의 천연 상태의 안정성은 △G가 더 큰 양의 값을 갖는다고 가정함에 따라 증가한다. 이 안정성에 기여하는 힘은 단백질을 변성시키기 위해 파괴되어야 한다. 예를 들면, 단백질 용액을 높은 온도에 노출시키면 3-차원 구조의 자유도의 증가 및 단백질 안정화에 기여하는 인자들의 약화를 가져와, 단백질의 열적 변성을 일으킨다. 이경우, -T△S 항은 변성을 결정한다. 단백질의 열적 변성에 기인하는 펼쳐짐 (unfolding)의 △H는, 본 발명에서 제공되는 실시예에 특히 기재되는 바와 같이, 시차주사열량법 (DSC)으로 직접 측정할 수 있다. 단백질 열적 변성 과정에 대한 DSC 곡선은 시험 단백질의 특성인 변성 중점(Tm)으로 알려진 온도를 구상하는 흡열 피크 형태를 취한다. 변성 엔탈피 변화는 이 피크의 적분에 의해 얻어진다. Tm 값은 일반적으로 열적 안정성의 지표이다. 열용량(DC)의 변화는 또한 DSC에 의해 단백질의 열적 변성 중에 측정될 수 있다. 변성 중 일어나는 열용량의 변화는 아미노산이 천연 상태일 때 분자의 표면에 노출되지 않는 아미노산 잔기가 단백질 변형 과정 중 용매 분자에 노출될 때 일어나는 수화에 의해 주로 일어난다.
상기와 같이, 본 발명의 방법에서 아미노산 잔기 "개변"은 특히 원래 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환, 원래 아미노산 잔기의 결실, 및 새로운 아미노산 잔기의 첨가를 포함한다. 원래 아미노산 잔기의 다른 아미노산 잔기로의 치환이 바람직하다. 그러므로, 아미노산 치환에 의한 개변이 항체 안정성의 변화를 추구하는 경우 바람직하게 사용된다. 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 Tm값은 항체를 구성하는 아미노산 잔기에서 안정성 개변의 실행 결과 증가한다. 그러므로, Tm 값은 항체(예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 안정성 개변이 발생한 지표로서 적절히 사용된다.
본 발명의 항-글리피칸 3 항체로 상기 "안정성 개변"을 수행하기 위해, 개변은 바람직하기는, 예를 들면 SEQ ID NO: 1에 나타낸 인간화 항-글리피칸 3 항체 중사슬 가변영역의 위치 7, 40, 48, 및 51의 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 수행된다. 이에 더하여, 개변은 바람직하기는, SEQ ID NO: 7에 나타난 인간 항-글리피칸 3 항체 경사슬 가변영역의 위치 2, 25, 42, 48, 50, 83, 및 84의 아미노산 잔기로부터 선택되는 적어도 하나의 아미노산 잔기에서 수행된다. 안정성 개변이 수행되는 상기 아미노산 잔기 이외의 아미노산 잔기는 원하는 Tm 값이 얻어진 한 개변될 필요가 없다; 그러나, 개변되는 인간화 항-글리피칸 3 항체의 Tm 값과 거의 같거나 또는 더 높은 Tm값을 제공하기 위해 그 위에 적합한 개변이 수행될 수 있다.
안정성 개변은 개변될 항체 (예를 들면 인간화 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산 잔기를 임의로 개변시킴으로써 수행될 수 있다. 이에 더하여, 안정성 개변은 개변될 인간화 항체 (예를 들면, 항체 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산 서열의 일부를 이미 높은 Tm 값을 갖는 항체에서 발견되고 그리고 -항체 3차원 구조의 개변의 관점에서- 개변될 인간화 항체 (예를 들면 인간화 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산 사열의 상기 일부에 상응하는 아미노산 서열로 대체함으로써 수행될 수 있다. 치환될 아미노산 잔기 또는 잔기들의 위치에 대한 제한은 없다; 그러나 FR에 있는 아미노산 잔기 또는 잔기들이 개변되는 것이 바람직하다. 아미노산 잔기 개변은 항원에 대한 결합 활성과 관련된 감소가 없는 한, CDR 영역에서도 적절히 수행될 수 있다. 이에 더하여, 개변되는 아미노산 잔기들의 수는 특별히 제한되지 않고, 개변은 FR의 특정 분획을 원하는 분획으로 대체함에 의해서도 수행될 수 있다. 이와 같은 분획에 관하여, FR 내의 모든 분획 (FR1, FR2, FR3, FR4)이 개변될 수 있고, 또는 하나 이상의 분획 개변이 결합될 수 있다.
중사슬 또는 경사슬의 FR2는 FR의 분획이 개변되는 경우의 바람직한 예이다. 이와 관련하여 바람직한 특이 예는 (SEQ ID NO: 1에 나타낸) VH1b 서브클래스 중의 인간화 항-글리피칸 3 항체 중사슬 FR2가 VH4 서브클래스, 즉, V37I (37 위치의 발린이 이소 로이신으로 치환)로 개변된 아미노산 잔기의 개변 뿐만 아니라 A40P, M48I, 및 L51I 개변이다. 다른 바람직한 특이 실시예는 (SEQ ID NO: 7에 나타낸) VK2 서브클래스 내지 VK3 서브클래스의 인간화 항-글리피칸 3 항체 경사슬 FR2 영역의 개변, 즉, L42Q, S48A, 및 Q50R 개변이다. 또한 바람직하기는 V2I 개변로, 이것은 FR1의 배선 서열에 대한 개변에 상응한다.
항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)를 구성하는 아미노산 잔기에 대한 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입의 실행 및 예를 들면 키메르화 및 인간화에 의한 아미노산 서열의 개변은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법에 의해 적절히 수행될 수 있다. 항체의 가변영역과 불변영역을 구성하는 아미노산 잔기에 대해 치환, 결실, 첨가 및/또는 삽입의 실행은 재조합 항체로서 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 구성 중 적절히 유사하게 수행될 수 있다.
동물 기원의 어느 항체, 예를 들면, 마우스 항체, 인간 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 염소 항체, 낙타 항체는 본 발명의 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)로서 바람직하게 사용된다. 사용에 또한 바람직한 것은 키메르 항체 및 인간화 항체의 아미노산 서열의 치환에 의해 얻어지는 바와 같은 개변 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)이다. 사용에 알맞은 것은 다양한 분자가 부착된 항체 개변이다.
"키메릭 항체"는 다양한 동물로부터 기원하는 서열들을 결합하여 구성한 항체를 말한다. 적당한 예는 마우스 항체로부터의 중사슬 및 경사슬 가변영역과 인간 항체로부터의 중사슬 및 경사슬 불변영역으로부터 구성된 항체들이다. 키메릭 항체의 구성 방법은 알려져 있다. 예를 들면, 마우스 항체 가변영역을 암호화하는 DNA와 인간 불변영역을 암호화하는 DNA의 프레임-내 융합에 의해 생성되고 통상의 발현 벡터에 병합될 수 있다. 이 벡터로 트랜스펙트된 또는 변형된 숙주 세포가 배양되고 키메릭 항체는 적절한 수단에 의해 제조되거나 또는 배양 배지로부터 단리될 수 있다.
인간화 항체는 또한 새로운 형태의 인간 항체로 알려져 있다. 이들은 마우스와 같은 비인간 포유동물로부터 단리된 항체로부터의 상보성-결정 영역 (CDR)이 인간 항체로부터의 골격 영역 (FR)에 결찰된 항체이다. 인간화 항체를 암호화하는 DNA 서열은 프라이머로서 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하여 오버래핑 PCR 반응에 의해 합성될 수 있다. 오버래핑 PCR 반응의 출발물질과 방법은, 예를 들면, WO 98/13388 및 그밖에 기재되어 있다. 본 발명의 인간화 항체의 가변영역을 암호화하는 DNA는 서로 오버랩하는 뉴클레오티드 서열을 갖도록 구축된 다수의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR을 오버래핑하여 얻었고 이것은 이후 인-프레임 코돈 서열을 형성하도록 인간 항체 불변영역을 암호화하는 DNA로 결찰한다. 기재된 바와 같이 결찰된 DNA는 그리고 나서 발현 벡터에 기능적으로 삽입하고 이어서 숙주로 트랜스펙션된다.
CDR들을 동정하는 방법이 알려져 있다 (Kabat et al., 면역학적 관심물의 단백질 서열(1987), National Institute of Health, Bethesda, Md.; Chothia et al., Nature (1989) 342, 877). 일반적인 유전적 재조합 과정이 또한 알려져 있다 (EP 125023 A 및 WO 96/02576). 비인간 동물의 항체, 예를 들면 뮤린 항체로부터 CDR이 일단 결정되면, 이들 공지의 방법들을 사용하여, 인간 항체로부터 CDR과 FR이 결찰되는 재조합 항체를 암호화하는 DNA를 구축할 수 있다. CDR이 결찰된 인간 항체 FRs은 CDR이 고품질 항원 부위를 형성하는 방식으로 선택된다. 필요에 따라, 항체 가변영역 FR의 아미노산 잔기 또는 잔기들은 형태 조절된 인간 항체의 CDR이 적절한 항원 결합 부위를 형성하기에 적합하도록 개변될 것이다 (Sato et al., Cancer Res . (1993) 53, 851-6). 개변되는 FR에서 아미노산 잔기들은 비공유 결합에 의해 항원에 직접 결합하는 잔기들 (Amit et al., Science (1986) 233, 747-53), CDR 구조에 영향을 미치는 또는 작용하는 잔기들 (Chothia et al., J. Mol . Biol . (1987) 196, 901-17), 및 VH-VL (중사슬 가변영역-경사슬 가변영역) 상호작용과 관련된 잔기들을 포함할 것이다 (EP 239400 B).
DNA에 의해 암호화된 인간화 항체는 일반적으로 사용된 DNA가 삽입된 발현 벡터에 의해 변형되거나 또는 트랜스펙션된 숙주세포에 의해 생산되고 숙주 세포의 배양에 의해 산출된 배양 매질로부터 단리된다.
본 발명의 항체가 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체인 경우, 인간 항체 기원의 불변영역은 바람직하기는 항체의 불변영역으로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체가 키메릭 항-글리피칸 3 항체, 인간화 항-글리피칸 3 항체 또는 인간 항-글리피칸 3 항체인 경우, 인간 항체 기원의 불변영역은 바람직하기는 항-글리피칸 3 항체의 불변영역으로서 사용된다.
본 발명의 항-글리피칸 3 항체가 키메릭 항-글리피칸 3 항체, 인간화 항-글리피칸 3 항체 또는 인간 항-글리피칸 3 항체인 경우, 인간 항체 기원의 불변영역은 바람직하기는 항-글리피칸 3 항체의 불변영역으로서 사용된다. 예를 들면, Cγ1, Cγ2, Cγ3, 및 Cγ4는 각각 중사슬 불변영역으로서 사용하기에 적합하고, 반면, Cκ 및 Cλ는 각각 경사슬 불변영역으로 사용하기에 적합하다. 이에 더하여, 인간 항체 불변영역은 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 개선하기 위해 또는 그것의 생산 안정성을 개선하기 위해 적절히 개변될 수 있다. 본 발명의 키메릭 항체 (예를 들면, 키메릭 항-글리피칸 3 항체)는 비인간 포유동물의 항체로부터의 가변영역과 인간 항체로부터의 불변영역을 적당하게 포함한다. 한편, 인간화 항체는 바람직하기는 비인간 포유동물의 항체로부터의 CDR과 인간 항체로부터의 FR을 포함한다. 예를 들면 인간화 항-글리피칸 3 항체는 바람직하기는 비인간 포유동물의 항-글리피칸 3 항체로부터의 CDR 및 인간 항체로부터의 불변영역과 FR을 포함한다. 인간 항체는 인간 기원의 항체로부터의 CDR 및 인간 항체로부터의 FR을 적절히 포함한다. 예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체는 인간 기원의 항-글리피칸 3 항체로부터의 CDR 및 인간 항체로부터의 불변영역과 FR을 적절히 포함한다. 인간 항체 불변영역은 특정 이소타입, 즉 IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, IgA, IgD, 및 IgE의 특징인 아미노산으로 구성된다. 이들 이소타입 중 어느 것에 속하는 항체로부터의 불변영역은 본 발명의 인간화 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 불변영역으로서 적절히 사용된다. 인간 IgG로부터의 불변영역의 사용이 바람직하지만, 제한되는 것은 아니다. 또한 인간화 항체 (예를 들면, 인간화 항-글리피칸 3 항체) 또는 인간 항체 (예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체)의 FR로서 사용되는 인간 항체 FR에 대한 특정 제한은 없고, 그리고 어느 이소타입에 속하는 항체로부터의 FR이 적절히 사용된다.
면역원성을 낮추는 것을 목적으로, FR을 구성하는 아미노산 잔기 모두 또는 일부를 Ono K. et al., loc . cit ., 에 기재된 방법 또는 유사한 방법을 사용하여 생식세포주로 대체하는 것도 가능하다. 생식세포주 서열이 낮은 면역원성을 가질 것이라는 합리적 예측을 근거로, 인간화 항체의 FR을 구성하는 아미노산 서열을 생식세포주 아미노산 서열과 정렬에 의해 비교할 수 있다 (Abhinandan K. R. 및 Martin C. R., J. Mol . Biol . (2007) 369, 852-862). 이 비교에서 다른 인간화 항체 FR의 아미노산 잔기는 항원 결합 특성을 손상시키지 않는 범위 내에서 생식세포주 서열로부터의 아미노산 잔기로 대체될 수 있다. 다음은 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중사슬 가변영역을 구성하는 아미노산 잔기에 대한 특정 예이다: 위치 70의 L을 I로 대체한 개변, 위치 87의 T를 R로 대체한 개변, 및 위치 97의 S를 A로 대체한 개변. 이에 더하여, 위치 25의 S를 A로 대체한 개변은 SEQ ID NO: 7에 나타낸 경사슬 가변영역을 구성하는 아미노산 잔기의 예이다.
본 발명의 개변된 키메릭 항체, 인간화 항체 및 인간 항체의 가변영역 및 불변영역에 관하여, 결실, 치환, 삽입 및/또는 첨가는, 항원에 대한 결합 특이성이 나타나는 한, 개변된 항체의 가변영역 및/또는 불변영역을 구성하는 하나 이상의 아미노산에서 적절히 수행될 것이다. 특히, 본 발명의 개변된 키메릭 항-글리피칸 3 항체, 인간화 항-글리피칸 3 항체, 및 항-글리피칸 3 인간 항체의 가변영역 및 불변영역에서, 결실, 치환, 삽입 및/또는 첨가는, 항원 글리피칸 3 분자에 대한 결합 특이성이 나타나는 한, 개변된 항-글리피칸 3 항체의 가변영역 및/또는 불변영역을 구성하는 하나 이상의 아미노산에서 적절히 수행될 것이다.
인간-유래 서열을 이용하는 키메릭 항-글리피칸 3 항체, 인간화 항-글리피칸 3 항체, 및 인간 항-글리피칸 3 항체는 인체에서 감소된 면역원성을 가지므로, 이들은 예를 들면, 치료목적으로 인간에게 투여하는 치료 항체로서 적용하기에 적합하다고 믿어진다.
공지의 서열이 돌연변이 도입을 위한 항체 중사슬 및 경사슬을 암호화하는 서열로서 본 발명의 방법에 사용될 수 있다. 이에 더하여, 신규의 항체 유전자 서열을 본 분야의 당업자에게 알려진 방법으로 얻을 수 있다. 예를 들면, 유전자는 항체 라이브러리로부터 적절히 얻을 수 있다. 더욱이, 유전자들은 공지의 과정, 예를 들면, 모노클로날 항체-생산 융합세포로부터 적절히 얻을 수 있다.
수많은 항체 라이브러리들이 항체 라이브러리 범위 내에 이미 알려져 있다. 더욱이, 항체 라이브러리를 구축하는 방법에 따라, 본 분야의 당업자들은 관련 항체 라이브러리를 얻거나 또는 구축할 수 있을 것이다. 적절한 항체 라이브러리의 예는 문헌, 예를 들면, Clackson et al., Nature (1991) 352, 624-8; Marks et al., J. Mol . Biol . (1991) 222, 581-97; Waterhouses et al., Nucleic Acids Res . (1993) 21, 2265-6; Griffiths et al., EMBO J. (1994) 13, 3245-60; Vaughan et al., Nature Biotechnology (1996) 14, 309-14; 및 일본 특허 공개공보 제 2008-504970에 기재된 항체 파아지 라이브러리이다. 진핵 세포의 라이브러리를 구축하는 방법 (WO 95/15393) 및 리보솜 디스플레이와 같은 공지의 방법이 또한 적절히 사용된다. 출발물질로서 인간 항체 라이브러리를 사용하는 패닝기술(panning techniques)에 의해 인간 항체를 얻기 위한 기술이 본 분야의 당업자에게 알려져 있다. 그러므로, 프레임 내에 중합된 인간 중사슬 및 경사슬의 가변영역을 포함하는 단-사슬 항체 (scFv)는 파아지 디스플레이 기술을 사용하여 파아지 표면상에 발현된다. 항원-결합 scFv를 암호화하는 유전자들은 항원에 결합하는 파아지를 선택함에 의해 이 파아지로부터 단리된다. 이와 같은 유전자의 서열의 동정은 항원 글리피칸 3에 결합하는 인간 항-글리피칸 3 항체의 중사슬 및 경사슬 가변영역을 암호화하는 DNA 서열의 결정을 가능하게 한다. 인간 항-글리피칸 3 항체는 이 서열을 갖는 항체 유전자를 적절한 발현 벡터에 삽입하고 아래 기재된 바와 같이 적절한 숙주세포에서 발현되도록 함에 의해 적절히 제조된다. 이와 같은 방법은 본 분야에 잘 알려져 있고, WO 92/01047, WO 92/20791, WO 93/06213, WO 93/11236, WO 93/19172, WO 95/01438, 및 WO 95/15388에 기재된 방법들을 포함한다.
공지의 기술들이 항체를 생성하는 융합세포로부터 항체-암호화 유전자를 얻기 위해, 특히 항-글리피칸 모노클로날 항체를 생산하는 융합세포로부터 항-글리피칸 3 항체-암호화 유전자를 얻기 위해 사용될 수 있다. 즉, 동물은 표준 면역화 기술을 사용하는 글리피칸 3 (원하는 감작 항원)으로 면역화되고 동물로부터 얻은 면역세포가 표준 세포 융합술에 의해 공지의 부모 세포와 세포 융합되고, 이것은 하기에 상세히 설명된다. 표준 스크리닝 기술을 사용하여, 모노클로날 항체-생산 세포(융합세포)가 스크리닝되고, 항-글리피칸 3 항체의 가변영역(V 영역)의 cDNA가 주형으로서 선택된 융합세포로부터 단리된 mRNA를 사용하여 역전사효소와 합성될 수 있다. 항-글리피칸 3 항체 유전자는 이 cDNA와 바람직한 항체 불변영역 (C 영역)을 암호화하는 DNA의 프레임 내 융합에 의해 적절히 제조된다.
특정 예들이 다음에 제공되지만, 본 발명이 이들 실시예로 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 항체를 생성하는데 사용된 감작 항원은 완전 면역원성 항원일 수 있고 또는 예를 들면 비면역원성 합텐을 포함하는 불완전 항원일 수 있다. 예를 들면, 전장 글리피칸 3 단백질 또는 그것의 부분 폴리펩티드 또는 펩티드가 적절히 사용될 수 있다. SEQ ID NO: 13에 나타낸 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드는 바람직한 예이다. 한편, 항원으로서 다당류, 핵산, 지질 등을 포함하는 물질의 사용이 또한 알려져 있다. 본 발명의 항-글리피칸 3 항체가 결합하는 항원은 상기 구현예로 특별히 제한되지 않는다. 항원 생산은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법으로 적절히 수행된다. 예를 들면, 바쿨로바이러스를 사용하는 방법 (예를 들면, WO 98/46777 등)이 적절히 사용된다. 항원이 낮은 면역원성을 가지는 경우, 동물은 알부민과 같은 매우 큰 면역원성 분자에 부착된 이와 같은 항원으로 적절히 면역화될 수 있다. 감작된 항원이 글리피칸 3와 같은 세포막을 넓히는 분자인 경우, 분자의 세포외 도메인으로부터의 폴리펩티드 분획은 감작 항원으로서 필요에 따라 적절히 사용된다. 또는 세포 표면 위에 이와 같은 분자를 발현하는 세포는 감작 항원으로서 적절히 사용된다. 이에 더하여, 감작 항원이 불용성 분자인 경우, 가용성화는 분자를 다른 수용성 분자에 부착시킴으로써 수행될 수 있고, 가용성화된 분자는 그리고 나서 감작 항원으로서 적절히 사용될 수 있다.
항체-생산 세포 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체-생산 세포)는 상기와 같은 적절한 감작 항원을 사용하여 동물을 면역화시킴에 의해 적절히 얻어진다. 또는 항체-생산 세포 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체-생산 세포)는 항체를 생산할 수 있는 림프구의 인 비트로 면역화에 의해 얻을 수 있다. 각종 척추동물 및 포유동물이 면역화되어질 동물로서 사용될 수 있다. 특히, 설치류, 토끼목, 및 영장류가 면역화되어질 동물로서 일반적으로 사용될 수 있다. 설치류는 마우스, 래트 및 햄스터를 포함하고; 토끼목은 토끼를 포함하고; 그리고 영장류는 필리핀원숭이, 붉은털 원숭이, 망토개코원숭이, 및 침팬지를 포함할 수 있다. 이에 더하여, 그들의 게놈에 인간 항체 유전자의 목록을 유지하는 유전자 도입 동물이 또한 알려져 있고, 인간 항체는 이와 같은 동물을 사용하여 적절히 얻어질 수 있다 (WO 96/34096; Mendez et al., Nat . Genet . (1997) 15, 146-56). 이와 같은 유전자 도입 동물을 사용하는 대신, 원하는 항체에 결합 활성을 나타내는 바람직한 인간 항체가, 예를 들면, 인간 림프구를 원하는 항원으로 또는 원하는 항원을 발현하는 세포로 인 비트로 감작시키고, 이어서 인간 골수종 세포, 예를 들면 U266으로 세포 융합함으로써 적절히 얻을 수 있다 (Japanese Patent Publication No. Hei 1-59878). 이에 더하여, 원하는 인간 항체 (예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체)는 그것의 게놈에 인간 항체 유전자의 전체 목록을 유지하는 유전자 도입 동물의 원하는 항원으로 감작시킴에 의해 적절히 얻을 수 있다(WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, WO 96/34096, 및 WO 96/33735).
동물의 면역화는 예를 들면, 감작 항원을 인산염-완충 식염수 (PBS), 생리적 식염수 등에 적절히 희석 및 현탁시키고; 필요에 따라 애주번트 혼합물로 에멀젼화하고; 그리고 나서 감작 항원을 복강내 또는 피하주사하여 수행된다. 이후 바람직하기는 4 내지 21일 간격으로 프로인트 불완전 애주번트와 혼합된 감작 항원을 수회 투여한다. 감작 항원에 대한 항체의 면역화 동물에서의 생산 공지의 분석 기술, 예를 들면, 효소-결합 면역흡착검사(ELISA) 및 세포흐름분석기(FACS)를 사용하여 측정될 수 있다.
융합세포는 동물로부터 얻은 항-글리피칸 3 항체-생산 세포 또는 관심의 감작 항원으로 면역화된 림프구를, 세포 융합을 위해 통상적으로 사용되는 융합제, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 골수종 세포와 융합함으로써 제조될 수 있다 (Goding, Monoclonal Antibodies : Principles and Practice, Academic Press (1986) 59-103). 융합세포 생산은, 예를 들면, Milstein et al.의 방법 (G. Kohler 및 C. Milstein, Methods Enzymol . (1981) 73, 3-46)에 따라 적절히 수행될 수 있다. 이 방법으로 제조된 융합 세포의 배양 및 증식은 융합세포에 의해 생산되고 특이적으로 글리피칸 3에 결합하는 모노클로날 항체를 생산한다. 이 모노클로날 항체에 의해 나타난 글리피칸 3에 대한 결합 특이성은 면역침강검사, 방사면역검정 (RIA), 효소-결합 면역흡착검사(ELISA), 세포흐름분석(FACS) 등의 공지의 분석법에 의해 적절히 측정될 수 있다. 필요에 따라, 원하는 특이성, 친화성 또는 활성을 갖는 항-글리피칸 3 항체를 생산하는 융합세포는 그 후, 예를 들면 한계 희석에 의해 적절히 서브클론되고, 이 융합세포에 의해 생산된 모노클로날 항체는 단리될 수 있다.
선택된 항체를 암호화하는 유전자는 그리고 나서 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프로브(예를 들면, 항체의 불변영역을 암호화하는 서열과 상보적인 올리고뉴클레오티드)를 사용하여 상기 융합세포 또는 항체-생성 세포 (예를 들면, 감작된 림프구)로부터 클론될 수 있다. 클로닝은 주형으로서 융합세포 또는 항체-생산 세포 (예를 들면, 감작된 세포)로부터 단리된 mRNA를 사용하는 RT-PCR에 의해서도 수행될 수 있다. 면역글로불린은 그들의 구조 및 기능에서의 차이를 근거로 하여 5개의 다른 클래스, 즉, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM로 나뉜다. 더욱이, 개개의 클래스는 여러 개의 서브클래스 (이소타입)로 나뉜다 (예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, 및 IgG4; IgA1 및 IgA2; 등). 본 발명의 항체는 이들 클래스 및 서브클래스 중 어느 것에 속한 항체로부터 기원될 수 있고 어느 클래스 또는 서브클래스로 특별히 제한되지 않는다; 그러나 IgG 클래스에 속한 항체가 특히 바람직하다.
항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 중사슬과 경사슬을 구성하는 아미노산 서열을 암호화하는 유전자는 유전공학적 기술에 의해 적절히 개변될 수 있다. 예를 들면, 인간에 대한 이종-면역원성(xeno-immunogenicity)의 감소를 목적으로 인공 개변된 재조합 항체 (예를 들면, 키메릭 항-글리피칸 3 항체와 같은 키메릭 항체, 인간화 항-글리피칸 3 항체와 같은 인간화 항체 등)는 항체, 예를 들면, 마우스 항체, 래트 항체, 토끼 항체, 햄스터 항체, 양 항체, 낙타 항체 등을 구성하는 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 잔기의 개변에 의해 적절히 생산될 수 있다. 키메릭 항체는 마우스와 같은 비인간 포유동물로부터 기원하는 항체의 중사슬 및 경사슬 가변영역, 및 인간 항체의 중사슬 및 경사슬 불변영역으로 구성된 항체이다. 키메릭 항체는 다음과 같이 얻을 수 있다: 마우스-기원 항체의 불변영역을 암호화하는 DAN는 인간 항체의 불변영역을 암호화하는 DNA로 결찰되고 발현 벡터로 삽입되고, 그리고 생성된 재조합 벡터는 숙주로 도입되고 발현된다. 인간화 항체는 또한 형태 조절된 인간 항체로도 알려지고 그리고 마우스와 같은 비인간 포유동물로부터 단리된 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 상보성-결정 영역 (CDR)이 프레임 내 코돈 서열을 형성하도록 인간 항체 골격 영역과 결찰되는 항체이다. 인간화 항체를 암호화하는 DNA 서열은 주형으로서 다수의 올리고뉴클레오티드를 사용하는 오버래핑 PCR 반응에 의해 합성될 수 있다. 오버래핑 PCR 반응을 위한 출발물질과 공정은 예를 들면, WO 98/13388 및 그 밖에 기재된다.
본 발명의 재조합 항체 (예를 들면, 재조합 항-글리피칸 3 항체)의 가변영역을 암호화하는 DNA는 서로 오버랩하는 뉴클레오티드 서열을 갖도록 하기 위해 구축된 다수의 올리고뉴클레오티드로부터 오버래핑 PCR에 의해 얻어지고, 이것은 프레임 내 코돈 서열을 형성하도록 인간 항체 불변영역을 암호화하는 DNA로 결찰된다. 이 방법으로 결찰된 DNA는 그리고 나서 작동가능한 방법으로 발현 벡터로 삽입되고, 숙주에 도입된다. DNA에 의해 암호화된 항체 (예를 들면, 항 글리피칸 3 항체)는 숙주세포를 배양함에 의해 발현된다. 발현된 항체 (예를 들면, 항 글리피칸 3 항체)는 숙주 배양 매질로부터 정제되어 단리된다 (EP 239400, WO 96/02576 등). CDR로 결찰된 인간화 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 FRs은 상보성-결정 영역이 항원에 대한 고품질 항원-결합 부위를 형성하는 방법으로 선택된다. 필요에 따라, 아미노산 서열은, 형태조절된 항체의 상보성-결정 영역이 항원에 대항 적합한 항원-결합 부위를 형성하도록 하기 위해, 항체 가변영역 FR을 구성하는 아미노산 잔기의 적절한 치환에 의해 개변될 수 있다 (K. Sato et al., Cancer Res . (1993) 53, 851-856).
상기와 같은 인간화와 관련된 개변에 더하여, 추가의 개변이, 예를 들면, 항체의 생화학적 특징, 예를 들면 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)에 의해 인식된 항원과의 결합 활성을 개선하기 위해 도입될 수 있다. 본 발명의 내용의 개변은 부위-특이적 돌연변이 생성 (예를 들면, Kunkel, Proc . Natl . Acad . Sci . USA (1985) 82, 488), PCR 돌연변이, 카세트 돌연변이 등과 같은 공지의 방법에 의해 적절히 수행될 수 있다. 생화학적 특징이 개선된 개변된 항체의 아미노산 서열은 일반적으로 개변된 항체 (즉, 개변된 항체가 기초로 하는 항체)를 구성하는 아미노산 서열과 적어도 70%, 더욱 바람직하기는 적어도 80%, 및 더욱 바람직하기는 적어도 90% (예를 들면, 적어도 95%, 97%, 98%, 99% 등)의 동일성 및/또는 유사성을 갖는다. 본 발명에 사용된 바에 따르면, 서열 동일성 및/또는 유사성은 서열 동일성을 최대로 가정하는 방법으로 서열을 정렬하고 필요에 따라 갭을 삽입한 후 동일 (동일한 잔기) 또는 유사한 (아미노산 측쇄의 일반적인 특성을 기준으로 동일한 군으로 분류된 아미노산 잔기) 아미노산 잔기의 비율을 말한다. 천연 발생하는 아미노산 잔기는 일반적으로 측쇄의 성질을 기준으로 다음과 같은 군으로 분류된다: (1) 소수성: 알라닌, 이소로이신, 발린, 메티오닌, 및 로이신; (2) 중립 친수성: 아스파라긴, 글루타민, 시스테인 트레오닌 및 세린; (3) 산성: 아스파르트산 및 글루타민산; (4) 염기성: 아르리긴, 히스티딘, 및 리신; (5) 사슬 배향에 영향을 미치는 기: 글리신 및 프롤린; 그리고 (6) 방향족: 티로신, 트립토판, 및 페닐알라닌.
항체 기능을 강화하기 위한 개변의 특이적으로 적합한 구현예는, 인간화 항-글리피칸 항체와 같은 항체에 의해 나타나는 세포독성의 개선을 포함한다. 세포독성의 바람직한 예는 항체-의존 세포-매개 세포독성 (ADCC) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)이다. 본 발명에서, CDC 활성은 보체 시스템에 기인한 세포독성을 상징하고, 반면 ADCC는 특이 항체가 표적 세포 상의 세포 표면 항체에 부착되고 Fc 수용체-보유 세포 (예를 들면, 면역세포)가 Fcg 수용체를 통해 항체의 Fc 부분에 결합할 때 표적 세포를 손상시키는 활성을 말한다. 시험 항체가 ADCC 활성을 갖는지 또는 CDC 활성을 갖는지는 공지의 방법으로 측정할 수 있다 (예를 들면, Current Protocols in Immunology, Chapter 7, Immunologic studies in humans. Editor, John E. Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
특정 조건에서, 작동세포, 보완용액 및 표적 세포는 우선 제조된다.
(1) 작동 세포의 제조
비장을 예를 들면, CBA/N 마우스로부터 단리하고, 비장 세포를 RPMI1640 매질 (Invitrogen) 위에 분리시킨다. 10% 소 태아 혈청 (FBS, HyClone)을 함유하는 동일한 매질로 세척 후, 세포 농도를 5 x 106 cells/mL로 조절하여 작도세포를 제조하였다.
(2) 보체 용액의 제조
보체 용액은 토끼 새끼 보체(CEDARLANE)를 10% FBS-함유 매질 (Invitrogen)으로 10배 희석하여 제조할 수 있다.
(3) 표적 세포의 제조
시험 항체가 결합하는 항원 단백질을 발현하는 세포들을 1시간 동안 37℃에서 10% FBS를 함유하는 DMEM 매질 중에서 0.2 mCi 51Cr 크롬산염 나트륨 (GE Healthcare Bioscience)으로 배양한다. 그 중에서도 특히 다음이 시험 항체가 결합하는 항원 단백질을 발현하는 세포로서 사용될 수 있다: 시험 항체가 결합하는 항원 단백질을 암호화하는 유전자로 변형된 세포, 난소암 세포, 전립선암 세포, 유방암 세포, 자궁암 세포, 간암 세포, 폐암 세포, 췌장암 세포, 신장암 세포, 방광암 세포, 및 결장암 세포. 방사능표지 후, 세포들을 10% FBS를 함유하는 RPMI1640로 3회 세척하고 세포 농도를 2 x 105 cells/mL로 조절하여 표적 세포를 제조한다.
ADCC 활성 및 CDC 활성은 다음 방법에 의해 측정할 수 있다. ADCC 활성을 측정하기 위해, 표적 세포 50 ㎕와 시험 항체 50 ㎕를 96-웰 U자 바닥 플레이트 (Becton Dickinson)에 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 작동세포 100 ㎕를 첨가하고 이산화탄소 인큐베이터에서 4시간 동안 인큐베이트 하였다. 시험 항체의 최종 농도는 바람직하기는 0 내지 10 ㎍/mL의 범위 내이다. 인큐베이션 후, 상등액 100 ㎕를 회수하고 상등액의 방사능을 감마 카운터 (COBRA II AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company)를 사용하여 측정하였다. 세포독성은 방사능을 이용하여 다음 식에 따라 산출될 수 있다:
(A - C)/(B - C) x 100
여기서 A는 특정 시험 항체를 이용한 샘플의 방사능 (cpm)이고; B는 1% NP-40 (Nacalai Tesque)을 첨가한 샘플의 방사능 (cpm)이고; C는 오직 표적 세포만을 함유하는 샘플의 방사능 (cpm)이다.
CDC 활성을 측정하기 위해, 표적 세포 50 ㎕와 시험 항체 50 ㎕를 96-웰 편평한 바닥 플레이트 (Becton Dickinson)에 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 반응시켰다. 반응 혼합물에 보체 용액 100 ㎕를 첨가하고, 4시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이트 하였다. 시험 항체의 최종 농도는 바람직하기는 0 내지 30 ㎍/mL이었다. 배양 후, 상등액 100 ㎕를 회수하고 상등액의 방사능을 감마 카운터를 사용하여 측정하였다. 세포독성은 ADCC 활성의 측정을 위해 사용된 것과 동일한 방법으로 산출될 수 있다.
항체 컨쥬게이트에 기인한 세포독성을 측정될 때, 표적 세포 50 ㎕와 시험 항체 컨쥬게이트 50 ㎕를 각각 96-웰 편평한 바닥 플레이트(Becton Dickinson)에 첨가하고 얼음 위에서 15분 동안 반응시켰다. 그리고 나서 플레이트를 1~4시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이트하였다. 최종 시험 항체 농도는 바람직하기는 0 내지 3 ㎍/mL의 범위 내였다. 배양 후, 상등액 100 ㎕를 회수하고 상등액의 방사능을 감마 카운터를 사용하여 측정하였다. 반사능은 ADCC 활성의 측정과 동일한 방법으로 산출될 수 있다.
항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 중사슬 및 경사슬 가변영역은, 상기와 같이, 일반적으로 3개의 CDR 및 4개의 FR로 구성된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 "개변"되는 아미노산 잔기들은 예를 들면, CDR들 또는 FR들로 구성된 아미노산 잔기들 중에서 적절히 선택된다. CDR들로 구성된 아미노산 잔기들의 개변은 몇몇 경우 개변에 포함된 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 항원 결합 활성의 감소를 일으킨다. 따라서, 본 발명의 "개변"되는 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체) 아미노산 잔기들은 바람직하기는 FR들로 구성되는 아미노산으로부터 선택되지만, 이것으로 제한되는 것은 아니다. CDR들에 위치하는 아미노산 잔기들의 개변이 개변에 포함된 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 항원 결합 활성의 감소를 일으키지 않는다는 것이 확실할 때, 그리고 나서 이와 같은 아미노산 잔기들이 개변을 위해 선택될 것이다.
본 발명의 당업자들은 마우스 또는 인간과 같은 유기체에 실제로 발생하는 항원 가변영역 FR을 구성하는 아미노산 서열을 Kabat 데이타 베이스와 같은 공공 자료에서 쉽게 찾을 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예는 본 발명의 방법에 의해 혈장 반응 속도가 개변된 인간화 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 제공한다. 예를 들면, 인간화 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 비인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역 (CDR), 인간 기원의 골격 영역 (FR), 및 인간 불변영역을 포함하는 인간화 항체이고, 여기서 CDR 또는 FR의 항체의 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 원래 항체의 CDR 또는 FR의 상응하는 위치의 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖고, 그리고 여기서 인간화 항체는 동일한 불변영역을 갖는 키메릭 항체와 비교하여 개변된 혈장 반응 속도를 갖는다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 본 발명의 방법에 의해 혈장 중 반응속도가 개변된 인간 항체 (예를 들면, 인간 항-글리피칸 3 항체)를 제공한다. 인간 항체는 예를 들면, 인간 기원의 상보성-결정 영역 (CDR), 인간 기원의 골격 영역 (FR), 및 인간 불변영역을 포함하는 인간 항체이고, 여기서 CDR 또는 FR에서 항체 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기는 원래 항체의 CDR 또는 FR의 상응하는 부분에서의 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖고, 그리고 여기서 인간 항체는 동일한 불변영역을 갖는 키메릭 항체와 비교하여 개변된 혈장 중 반응속도를 갖는다.
상기 인간 불변영역은 바람직하기는 야생형 인간 Fc 영역을 포함하는 영역을 의미하지만, 개변된 FC 또한 적절히 사용될 수 있다. 이와 같은 "개변된 Fc"는 Fc를 구성하는 아미노산 잔기의 개변에 의해 제조된 개변된 Fc 뿐 아니라, Fc 모이어티에서 이미 개변이 실행된 개변에 의해 제조되는 바에 따른 개변된 Fc를 포함할 수 있다. 이와 같은 개변의 바람직한 예는 Fc 부분에 부착된 당 사슬 수식 본질의 개변이다. 하나의 바람직한 특이예는 참조예로서 본 명세서에 특이적으로 기재되는 "Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 항체"이다.
용어 "Fc 영역에 부착된 푸코스 함량이 감소된 항체"는 대조 항체와 비교하여 결합된 푸코스의 양이 상당히 감소된 항체를 말하고, 바람직하기는 푸코스를 검출할 수 없다. 푸코스는 일반적으로 단일 항체 분자를 형성하는 두 개의 중사슬 분자의 Fc 영역에 존재하는 두 개의 당 사슬-결합 부위인 당 사슬에 연결된 N-글리코시드에 결합한다. 용어 "Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 항체"는 대조인 원래의 항체와 비교하여, 푸코스 함량이 대조 항체의 총 당사슬 함량의 50% 이하, 바람직하기는 25%이하, 더욱 바람직하기는 10% 이하, 그리고 가장 바람직하기는 0% 이하인 항체를 말한다. 푸코스 함량은 아래의 참조예에 제공된 분석 공정을 사용하여 측정할 수 있다. 이와 같은 푸코스-감소 항체의 제조방법은 본 발명의 참조예에 기재된 방법, 뿐 아니라 푸코실 트란스퍼라제-감소 동물 세포로 항체를 생산하는 방법 (Biotechnol . Bioeng . (2004) 87(5), 614-22) 및 복합 분지 당사슬 수식(modification)이 개변된 동물 세포로 항체를 제조하는 방법(Biotechnol . Bioeng. (2006) 93(5), 851-61)을 포함할 수 있다. 이에 더하여, 숙주 세포로서 비-동물 세포를 사용하는 제조방법의 적절한 예는 식물 세포(Nature Biotechnology (2006) 24, 1591-7) 및 이스트 세포(Nature Biotechnology (2006) 24, 210-5)로 항체를 생산하는 방법을 포함할 수 있다.
본 발명의 제조방법의 바람직한 구현예는 혈장 중 반응속도가 제어된 항체(예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 제조방법으로, (a) 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 표면에 노출될 수 있는 적어도 하나의 아미노산 잔기를 포함하는 폴리펩티드를 암호화하는 핵산을, 아미노산 잔기(들)의 전하가 변하도록 개변하는 단계; 숙주 세포를 단계 (a)에서 개변된 핵산이 발현되는 방법으로 배양하는 단계; 및 (c)숙주 세포 배양물로부터 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 회수하는 단계를 포함한다.
본 발명의 방법에서, 용어 "핵산의 개변"은 본 발명의 "개변"에 의해 도입된 아미노산 잔기에 상응하는 코돈을 제공하기 위한 핵산 서열의 개변을 말한다. 더욱 특별히, 이 용어는 개변될 코돈을 함유하는 핵산의 개변을 말하고, 여기서 상기 개변은 예비-개변 아미노산 잔기에 상응하는 코돈을 개변에 의해 도입되는 아미노산의 코돈으로 변화시킨다. 일반적으로 이 용어는 표적 아미노산 잔기를 암호화하는 코동을 제공하기 위해 코돈-포함 핵산의 적어도 하나의 염기를 대체하기 위한 유전 과정의 실행 또는 돌연변이 처리를 의미한다. 즉, 개변되는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈은 개변에 의해 도입되는 아미노산 잔기를 암호화하는 코돈으로 대체된다. 핵산 개변은 부위-특이 돌연변이 유발, PCR 돌연변이 유발 등과 같은 공지의 기술을 사용하여 당업자에 의해 적절히 수행될 수 있다.
본 발명에서 제조된 핵산은 일반적으로 적절한 벡터에 놓이고 (삽입되고) 그리고 숙주에 도입된다. 벡터는 삽입된 핵산을 안정하게 유지하는 능력을 갖는 한 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 숙주로서 E. coli의 사용을 참조로, 비록 다양한 상업적으로 이용가능한 벡터들을 사용할 수 있지만, pBluescript 벡터(Stratagene)가 클로닝 벡터로서 바람직하다. 발현 벡터는 특이 벡터가 본 발명의 폴리펩티드를 사용하는데 사용되는 경우에 유용하다. 발현 벡터는 폴리펩티드를 인 비트로, E. coli에서, 세포 배양물에서, 또는 유기체 내에서 발현될 수 있는 한 특별한 제한은 없다. 바람직한 예는 인 비트로 발현의 경우 pBEST 벡터 (Promega), E. coli의 경우 pET 벡터 (Invitrogen), 세포 배양물의 경우 pME18S-FL3 벡터 (GenBank Accession No. AB009864), 및 유기체의 경우 pME18S 벡터 (Mol . Cell Biol. (1988) 8, 466-472)를 포함한다. 본 발명에 따른 DNA는 표준법에 의해, 예를 들면, 제한 효소 부위를 이용한 리가아제 반응(Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al. (1987) Publish. John Wiley & Sons, sections 11.4-11.11)에 의해 벡터로 삽입될 수 있다.
상기 참조된 숙주 세포에 대한 특별한 제한은 없고 다양한 숙주 세포들이 목적에 따라 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 발현을 위한 세포의 예는 세균 세포 (예를 들면, 스트렙토코쿠스, 스타필로코쿠스, E. coli, 스트렙토마이세스, Bacillus subtilus), 진균 세포 (예를 들면, 이스트, 아스페르길루스), 곤충 세포 (예를 들들면, 초파리 S2, 밤나방 Sf9), 동물 세포 (예를 들면, CHO, COS, HeLa, C127, 3T3, BHK, HEK293, 보우스 흑색종 세포), 및 식물 세포를 포함한다. 벡터들은 숙주 세포 sby에 공지의 방법, 예를 들면, 인산칼슘 침전법, 전기파동 천공(Current Protocols in Molecular Biology, edited by Ausubel et al. (1987) John Wiley & Sons, sections 9.1-9.9), 리포펙션 및 현미주사법에 의해 도입될 수 있다.
적절한 분비 신호는 숙주 세포에서 발현된 항체의 분비를 소포체의 루멘, 원형질막 주위 공간, 또는 세포외 환경으로 가져오도록 항체(예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)에 적절히 병합될 수 있다. 이와 같은 신호는 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 천연 신호 서열 특성일 수 있고 또는 이종 기원의 신호 서열일 수 있다.
상기와 같이 생산된 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 본 발명의 항체가 배양 매질로 분비되는 경우 배양 매질을 수집함으로써 회수될 수 있다. 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)가 세포 내에서 생산되는 경우, 세포는 먼저 용해되고 그리고 나서 항체가 회수된다.
공지의 방법은 재조합 세포 배양물로부터 회수된 본 발명의 항체 (예를 들면 글리피칸 3 항체)를 정제하는데 적절히 사용될 수 있고, 예를 들면, 황산 암모늄 및 에탄올 침전법, 산 추출법, 음이온- 또는 양이온-교환 크로마토그래피, 포스포셀룰로스 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 하이드로아파타이트 크로마토그래피, 및 렉틴 크로마토그래피이다.
본 발명은 또한 약제학적으로 허용가능한 담체 및 본 발명에 의해 혈장 중 반응속도가 제어된 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체) (예를 들면 IgG 항체)를 포함하는 조성물 (약물)에 관한 것이다.
본 발명의 내용에서 약제학적 조성물은 일반적으로 질병의 치료 및 예방 또는 질병의 검출 또는 진단을 위한 시약을 말한다.
본 발명의 약제학적 조성물은 본 분야의 당업자에게 알려진 방법으로 제제화될 수 있다. 예를 들면, 제제는 주사가능 형태, 즉, 물 또는 다른 약제학적으로 허용가능한 액체의 현탁액 또는 무균액으로 비-경구 경로에 의해 사용될 수 있다. 예를 들면, 제제는 항체를 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 매질, 특히 멸균수 또는 생리적 식염수, 식물성 오일, 에멀젼화제, 현탁제, 계면활성제, 안정화제, 풍미제, 희석제, 담체, 보존제, 결합제 등과 결합하고, 일반적으로 설립되는 약제학적 실시에 의해 요구되는 단위 투여량 상태로 혼합하여 제조될 수 있다. 제제 중의 활성 성분의 양은 표시된 범위의 적절한 투여량을 얻는 방법으로 선택된다.
주사용 멸균 조성물은 주입용 증류수와 같은 담체를 사용하여 표준 약제학적 실행에 따라 적절히 제제화될 수 있다.
주입용 수용액은 예를 들면, 생리적 식염수, 덱스트로스, 및 다른 애쥬번트 (예를 들면, D-솔비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨)을 함유하는 등장액일 수 있다. 적절한 가용성 시약 (예를 들면, 에탄올과 같은 알콜 또는 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 폴리알콜) 및 비이온성 계면활성제 (예를 들면, Polysorbate 80TM, HCO-50)가 적절히 사용될 수 있다.
유성 액체는 참기름 또는 콩기름을 포함한다. 벤질 벤조에이트 및/또는 벤질 알콜이 가용성 시약으로 사용하기에 또한 적합하다. 완충액 (예를 들면, 인산염 완충액, 아세트산 나트륨 완충액), 진정제 (예를 들면, 염산 프로카인), 안정화제 (예를 들면, 벤질 알콜 및 페놀), 및 산화 억제제가 또한 적절히 사용될 수 있다. 상기와 같이 제조된 주사용액은 일반적으로 적절한 앰플에 채워진다.
본 발명의 약제학적 조성물은 바람직하기는 비-경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 예를 들면, 조성물은 주사용 조성물, 비내 조성물, 흡입 투여용 조성물 또는 경피 조성물로서 제제화될 수 있다. 이것은 예를 들면, 정맥내 주사, 근육내 주사, 복막내 주사 또는 피하 주사에 의해 국소적으로 또는 전신적으로 투여될 수 있다.
투여 방법은 환자의 연령 및 증상에 따라 적절히 선택될 수 있다. 항체 또는 항체를 암호화하는 폴리펩티드를 포함하는 약제학적 조성물의 투여량은 예를 들면, 0.0001 mg 내지 1000 mg/체중 1kg/단위 투여량의 범위로 선택된다. 또는 제형은 환자당 0.001 내지 100,000의 투여량으로 제제화되거나 또는 설정될 수 있다; 그러나, 본 발명은 이들 숫자 범위로 제한될 필요는 없다. 제형 및 투여 방법은 환자의 체중, 연령, 및 증상에 따라 변할 것이고, 적절한 제형 및 투여 방법은 이들 인자를 고려하여 본 분야의 당업자에 의해 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 방법에 의해 혈장 중 반응속도가 개변된 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체) (예를 들면, 인간화 항-글리피칸 3 항체)를 암호화하는 핵산을 제공한다. 이와 같은 핵산을 운반하는 벡터는 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명은 또한 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포의 유형은 특별히 제한되지 않고, 이것은 예를 들면, E. coli 와 같은 세균 세포 또는 어느 다양한 동물 세포일 수 있다. 숙주 세포는 또한 본 발명의 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)의 생산 또는 발현을 위한 생산 시스템에 적절히 사용될 수 있다. 그러므로, 본 발명은 또한 상기 숙주 세포를 이용한 항체 (또는 항-글리피칸 3 항체)의 생산에 사용될 수 있는 생산 시스템을 제공한다. 인 비트로 또는 인 비보 생산 시스템은 생산 시스템으로서 적절히 사용될 수 있다. 진핵 세포 또는 원핵 세포가 인 비트로 생산 시스템에서 사용되는 숙주 세포로서 적합하게 적용된다.
숙주 세포로서 사용되는 진핵세포는 동물 세포, 식물 세포, 및 진균 세포를 포함할 수 있다. 동물 세포는, CHO (J. Exp . Med . (1995) 108, 945), COS, HEK293, 3T3, myeloma, BHK (새끼 햄스터 신장), HeLa, Vero, 등과 같은 포유동물 유형 세포; Xenopus laevis 난모세포 (Valle et al., Nature (1981) 291, 338-340)와 같은 양서류 세포; 및 Sf9, Sf21, 및 Tn5와 같은 곤충세포를 포함할 것이다. 예를 들면, CHO-DG44, CHO-DX11B, COS7 세포, HEK293 세포, 및 BHK 세포가 본 발명의 항-글리피칸 3 항체의 발현에 적합하게 사용된다. 숙주 세포로서 CHO 세포의 용도는 특히 동물 세포에서 고수준의 발현이 의도될 때 바람직하다. 재조합 벡터의 숙주세포로의 트랜스펙션은 인산염 칼슘 기술, DEAE 덱스트린 기술, 양이온성 리포솜 DOTAP (Boehringer Mannheim)을 사용하는 기술, 전기천공술, 리포펙션술 등을 사용하여 적절히 수행된다.
식물 세포와 관련하여, Lemna minor 및 Nicotiana tabacum로부터 유래된 세포들이 단백질 생산 시스템으로서 알려져 있고, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체는 이들 세포를 이용한 유합 배양술에 의해 생산될 수 있다. 진균 세포와 관련하여, 이스트 세포, 예를 들면, 사카로미세스 (예를 들면, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe)을 사용한 단백질 발현 시스템, 및 사상체균, 예를 들면, 아스페르길루스 (예를 들면, Aspergillus niger)을 사용한 단백질 발현 시스템이 알려져 있고, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체를 생산하기 위한 숙주세포로서 사용될 수 있다.
원핵 세포의 사용과 관련하여, 세균 세포를 사용하는 어느 생산 시스템이 적절히 사용될 수 있다. 상기와 같이 E. coli 또는 B. subtilus 를 사용하는 생산 시스템이 세균 세포에 대해 알려져 있고, 이들 세균 중 어느 것은 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 생산에 적절히 사용될 수 있다.
본 발명의 숙주 세포를 사용한 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 생산하기 위해, 본 발명의 항체를 암호화하는 폴리펩티드를 포함하는 발현 벡터로 변형된 숙주 세포는 항원 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 코딩하는 폴리펩티드를 발현하기 위해 배양된다. 숙주 세포는 공지의 방법에 따라 배양될 수 있다. 동물 세포가 숙주세포로 사용될 때, 예를 들면 DMEM, MEM, RPMI1640, 또는 IMDM이 배양 매질로서 사용하기에 적합하다. 혈청 보조제, 예를 들면, FBS, 태아 송아지 혈청(FCS) 등이 첨가될 수 있다. 세포들은 또한 무-혈청 매질에서 배양될 수 있다. 세포는 숙주세포에 따라 약 6~8의 pH에서 배양될 수 있다. 배양물은 일반적으로 약 15 내지 200 시간 동안 약 30~40℃에서 필요에 따라 매질 교체, 통기, 및 교반 하면서 진행된다.
한편, 동물 또는 식물을 기준으로 하는 생산 시스템은 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 생산을 위한 인 비보 시스템으로서 이용가능하다. 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드가 동물 또는 식물에 도입되고 그리고 항체가 동물 또는 식물 내에서 생산되고 그리고 회수된다. 본 발명에 사용되는 용어 "숙주"는 이와 같은 동물과 식물을 포함한다.
동물이 숙주로서 사용될 때, 포유동물과 곤충을 기준으로 하는 생산 시스템을 이용할 수 있다. 염소, 돼지, 양, 마우스, 소 등이 포유동물로서 사용하기에 적합하다 (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications (1993)). 유전자 변이 동물도 또한 사용될 수 있다.
예를 들면, 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는, 특이적으로, 염소 β-카제인과 같은 젖에서 생산되는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자와의 융합 유전자의 형태로 생산될 수 있다. 융합 유전자를 포함하는 폴리뉴클레오티드 단편은 그리고 나서 염소 배로 삽입되고 암컷 염소로 이식된다. 관심의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 배로부터 받은 염소 이외에서 태어난 형질전환 염소에 의해 생산된 젖 또는 형질전환 염소의 자손에 의해 생산된 젖으로부터 얻어진다. 적합한 호르몬이 형질전환 염소로부터 생산된 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)-함유 젖의 양을 증가시키기 위해 형질전환 염소에 적절히 투여될 수 있다 (Ebert et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702).
누에는 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)의 생산에 사용될 수 있는 곤충의 예이다. 누에가 사용되는 경우, 누에는 그것의 바이러스성 게놈에 삽입된 원하는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 암호화하는 폴리펩티드를 갖는 바쿨로바이러스로 감염될 수 있다. 관심의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 감염된 누에의 체액으로부터 얻을 수 있다(Susumu et al., Nature (1985) 315, 592-4).
담배 식물은 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 생산하는데 사용될 수 있는 식물의 예이다. 담배 식물이 사용되는 경우, 관심의 항체 (항-글리피칸 3 항체)를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 pMON 530와 같은 식물 발현 벡터에 삽입되고, 생성된 재조합 벡터는 Agrobacterium tumefaciens과 같은 세균으로 감염된다. 이 세균은 그리고 나서 담배 식물 (예를 들면, Nicotiana tabacum) (Ma et al., Eur . J. Immunol . (1994) 24, 131-8)을 감염시키는데 사용되고, 그리고 원하는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)가 감염된 담배 식물의 잎으로부터 얻어진다. Lemna minor 은 이와 같은 세균으로 유사하게 감염될 수 있고 원하는 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 클론된 감염된 Lemna minor 의 세포로부터 얻을 수 있다(Cox K. M. et al., Nat . Biotechnol . (2006) 24(12), 1591-7).
상기의 방법으로 얻은 본 발명의 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)는 숙주 세포 (예를 들면 배양 매질 또는 젖)의 내부 또는 외부로부터 단리될 수 있고 실질적으로 순수한 균일한 항체로 정제될 수 있다. 분리 및 정제술은 일반적으로 본 발명에서 항체 분리 및 정제에 적절히 사용될 수 있고 제한되지 않는다. 예를 들면, 항체는 칼럼 크로마토그래피, 여과, 한외여과, 염석, 용매 침전, 용매 추출, 증류, 면역침전, SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동, 등전압 전기영동, 투석, 재결정 등의 적절한 선택 및 결합에 의해 적절히 분리되고 정제될 수 있다.
크로마토그래피 기술은 친화성 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 흡착 크로마토그래피 등을 포함한다 (Strategies for Protein Purification and Characterization: A Laboratory Course Manual. Ed. Daniel R. Marshak et al. (1996) Cold Spring Harbor Laboratory Press). 크로마토그래피는 액상 크로마토그래피, 예를 들면, HPLC, FPLC 등을 이용하여 수행할 수 있다. 친화성 크로마토그래피에 사용된 칼럼은, 예를 들면, 단백질 A 칼럼 또는 단백질 G 칼럼을 포함한다. 하이퍼 D, POROS, 및 세파로스 F. F. (Pharmacia)는 단백질 A 기재 칼럼의 예이다.
본 발명의 또 다른 바람직한 구현예는 본 발명의 혈장 중 반응속도가 제어된 항체 (예를 들면, 항-글리피칸 3 항체)를 제조하는 방법으로, 상기 방법은 상기와 같이 본 발명의 숙주 세포를 배양하는 단계 및 세포 배양물로부터 항체 (예를 들면 항-글리피칸 3 항체)를 회수하는 단계를 포함한다.
본 명세서에 인용된 모든 문헌은 참조로서 병합된다.
본 발명은 아래에 상세히 기술되지만, 본 발명이 아래 제공된 실시예들로 제한되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1
(1) 인간화 HOLO 항체의 포인트-돌연변이 유전자의 구축
다양한 포인트-돌연변이 유전자들을 WO 2006/046751에 기대된 인간화 GC33 항체의 CDR을 포함하는 항-글리피칸 3 항체를 암호화하는 유전자로부터 출발하여 암호화하였다. 개변 부위를 함유하는 센스 및 안티센스 사슬의 서열을 기준으로 고안된 올리고 DNA들을 합성하였다. 다수의 포인트-돌연변이 유전자를 시판 신속변경 위치-특이 돌연변이 키트 (Stratagene)를 이용하여 구축하였다. 포인트-돌연변이 유전자의 구축을 다음 조건하에서 PCR에 의해 수행하였다. 95℃에서 30초 동안 가열 후, 키트에 제공된 10ng 주형 플라스미드, 정사슬 및 역사슬 합성 올리고 DNA 및 10X 완충액 10 pmol, dNTP 믹스, 및 Pfu Turbo DNA 폴리머라제의 반응 혼합물을 95℃에서 30초, 55 ℃에서 1분 그리고 68 ℃에서 4분의 18회 순환시켰다. 키트에 제공된 DpnI를 반응 혼합물에 첨가하고, 제한 효소를 사용하여 제한 소화를 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. DH5a 적격세포(Toyobo)를 생성된 반응 용액으로 변형하여 돌연변이체를 얻었다. 포인트-돌연변이의 도입은 돌연변이체로부터 단리된 혈장 DNA의 뉴클레오티드 서열을 결정함에 의해 확인하였다. 각각의 포인트-돌연변이 유전자를 동물 세포에서 곤충 유전자를 발현할 수 있는 발현 벡터에 클론시켰다. 개변된 유전자들을 아래에 설명한 바와 같이 개변하여 제조하였다.
인간화 HOLO 항체와 그것의 포인트 돌연변이-개변된 항체의 일시적 발현을 폴리에틸렌이민(Polysciences Inc.)을 사용하여 수행하였다. HEK293 세포를 트립신 EDTA (Invitrogen)로 분리하고, 그리고 6 x 106 cells/10 mL로 10 cm2 배양 디쉬에 시드하였다. 다음날, SFMII 배양 매질과 폴리에틸렌이민을 제조자 지침에 따라 중사슬 발현 혈장 DNA 및 경사슬 발현 혈장 DNA와 혼합하였고, 그리고 생성된 혼합물을 실온에서 10분간 방치하였다. 전체 혼합물을 상기와 같이 시드된 HEK293 세포를 함유하는 배양 디쉬에 적가하였다. 배양 상등액을 약 72시간 후 회수하고 그리고 발현된 H0L0 항체 및 그것의 포인트 돌연변이-개변된 항체를 제조자 지침에 따라 rProteinA SepharoseTM Fast Flow (GE Healthcare)를 사용하여 정제하였다.
(1-1)인간화 HOLO 항체의 Tm 값의 개변
열변성 중간 온도(Tm)를 일정하게 프로그램된 가열 속도에서 샘플 용액을 가열한 후 얻어진 열기록도 (Cp 대 T)의 최상부에 의해 결정하였다. 인간화 HOLO 항체의 Tm 값은 다음에 기재된 바와 같이 제조된 DSC 측정용 샘플 용액을 사용하여 측정하였다. 투석막에 채워진 항체 용액 (50 내지 100 ㎍)을 염화나트륨 150 mmol/L을 함유하는 아세트산 나트륨 완충액 (pH 6.0) 20 mol/L의 투석 외부 용액에 대해 24시간 동안 우선 투석하였다. 이어서, 샘플 용액을 투석 외부 용액으로 그것의 항체 농도 50 내지 100 ㎍/mL로 맞추고 DSC 측정용 샘플 용액으로 사용하였다.
적합한 DSC 기구, 예를 들면, DSC-II (Calorimetry Sciences Corporation)를 실험을 위해 사용한다. 상기와 같이 제조된 샘플 용액과 참조 용액 (투석 외부 용액)을 완전히 탈기하고, 이들 시험 시편들의 각각을 칼로리메타 세포에 놓고 40℃에서 열평형시켰다. 그리고 나서 DSC 스캔을 40℃로부터 100℃까지 약 1 K/분의 스캔 속도로 작동하였다. 이 측정 결과를 온도의 함수로서 변성 피크의 최상부에 제공하였다. 인간화 HOLO 항체의 열변성 중간 온도를 Rodolfo et al., Immunology Letters (1999), 47-52에 따라 Fab 영역의 피크 할당에 의해 산출하였다. 특정 예로서, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체에 대한 시차주사열량계 (DSC)로부터 얻은 차트를 도 1에 나타내었다. SEQ ID NO:1에 나타낸 중사슬과 SEQ ID NO:7에 나타낸 경사슬을 포함하는, 인간화 HOLO 항체는 상기 방법에 의해 산출됨에 따라 Tm 값이 76.6℃였다. 기존 항체의 예로서 제공된 시나기스 및 헤르셉틴의 Tm값은 각각 85.4℃ 및 81.8℃에서 측정하였다. 그러므로 인간화 HOLO 항체의 Tm 값은 기존의 항체의 것보다 낮다.
그러므로 개변된 항체는 Tm값의 상승을 목표로 인간화 HOLO 항체로부터 제조하였다. V37I, A40P, M48I, 및 L51I의 개변은 항체 H15 (SEQ ID NO: 2)를 제조하기 위해 SEQ ID NO: 1에 나타낸 HOLO 항체 중사슬의 FR2에 도입되었고, 여기서 이것의 서브클래스는 VH1b에서 VH4로 변화되었다. Tm 값은 79.1℃로 상승하였다. 또한, SEQ ID NO: 7에 나타낸 HOLO 항체 경사슬은 L42Q, S48A, 및 Q50R 개변을 서브클래스가 VK2에서 VK3로 변화된 FR2로 도입시키고, 그리고 V2I 개변을 FR1의 V2를 I(생삭세포주 서열)로 대체하기 위해 도입함으로써 개변시켰고, 그것에 의해 L4 (SEQ ID NO: 8)를 제조하였다. 각각의 항체의 Tm 값을 상기와 같이 측정하였다. H15L0 및 H0L4의 Tm 값은 각각 79.2℃ 및 77.2℃였고, 이것은 HOLO의 Tm 값 76.6℃로부터 상승했음을 나타낸다. 이들 두 개변의 조합물을 포함하는 H15L4 항체의 Tm 값은 80.5℃로 상승하였다.
(1-2) 인간화 HOLO 항체의 pI 값의 개변
항체의 혈장 반감기는 항체에 의해 나타나는 pI값을 낮춤으로써 연장된다. 반대로 항체의 조직 전좌 특성은 항체의 pI값이 증가함에 따라 증가한다. 암 치료에 효과적인 항체의 pI값이 증가 또는 감소가 종양-억제 효과를 강화하는지는 알려져 있지 않다. 그러므로, pI가 낮아진 개변된 인간화 HOLO 항체와 pI가 증가한 개변된 인간화 HOLO 항체를 제조하였고 이들의 항종양 활성을 어느 개변이 더 높은 종양-억제 활성을 갖는가를 조사하기 위해 비교하였다.
각각의 항체의 pI값을 등전압 전기영동에 의한 분석을 기준으로 산출하였다. 전기영동을 다음과 같이 수행하였다. PhastSystem Cassette (Amersham Bioscience)를 사용하여, Phast-Gel Dry IEF (Amersham Bioscience) 겔을 아래에 주어진 조성의 팽윤액으로 약 60분 동안 팽윤시켰다.
(a) 높은 pI용 팽윤액의 조성:
10% 글리세롤 1.5 mL
IEF용 Pharmalyte 8-10.5 100 ㎕ (Amersham Bioscience)
(b) 낮은 pI용 팽윤액의 조성:
정제수 1.5 mL
IEF용 Pharmalyte 8-10.5 20 ㎕ (Amersham Bioscience)
IEF용 Pharmalyte 5-8 80 ㎕ (Amersham Bioscience)
항체 약 0.5 mg을 팽윤 겔 위에 장전하고 등전압 전기영동을 하기 프로그램에 의해 제어된 PhastSystem (Amersham Bioscience)을 사용하여 작동시켰다. 샘플을 이 프로그램의 단계 2에서 겔에 첨가하였다. pI용 보정 키트(Amersham Bioscience)를 pI 마커로서 사용하였다.
단계 1: 2000 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃, 75 Vh
단계 2: 200 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃, 15 Vh
단계 3: 2000 V, 2.5 mA, 3.5 W, 15℃ 410 Vh
전기영동 후, 겔을 20% TCA로 고정하고 은 오염을 키트와 함께 제공된 지침에 따라 은 오염 키트, 단백질 (Amersham Bioscience)을 사용하여 수행하였다. 오염 후, 각각의 항체 (시험 샘플)의 등전점을 pI 마커의 이미 알려진 등전점을 기준으로 산출하였다. 높은 pI 등전압 전기영동으로부터의 전기영동도를 도 2에 나타내었고 낮은 pI 등전압 전기영동으로부터의 전기영동도를 도 3에 나타내었다.
(a) pI가 상승된 개변
Hspu2.2 (Hu2.2) (SEQ ID NO: 6)를 제조하였고, 여기서 Q43K, D52N, 및 Q107R 개변을 H15에서 부가적으로 실행하였다. Lspu2.2 (Lu2.2) (SEQ ID NO: 12)를 또한 제조하였고, 여기서 E17Q, Q27R, Q105R 및 S25A 개변을 L4에서 수행하였고, 여기서 S25A 개변은 CDR2 중의 S25를 (생식세포 중에 풍부한)A로 대체하였다. Hspu2.2 (Hu2.2) 및 Lspu2.2 (Lu2.2)로 구성된 Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 Tm 값을 76.8℃에서 측정하였고 그 pI값을 9.6에서 측정하였다. HOLO 항체의 pI값은 8.9이므로, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 pI값은 0.7까지 증가하였다.
(b) pI가 낮아진 개변
Hspd1.8 (Hd1.8) (SEQ ID NO: 5)을 제조하였고, 여기서 K19T, Q43E, K63S, K65Q, 및 G66D 개변을 H15에서 부가적으로 실행하였다. Lspd1.6 (Ld1.6) (SEQ ID NO: 11)을 다음 개변에 의해 제조하였다: L4에서 Q27E 개변; L4의 FR3의 79-84의 KISRVE를 TISSLQ로 개변; 그리고 Lspu2.2 (Lu2.2)에 대해 동일한 개변을 얻기 위한 S25A 개변. Hspd1.8 (Hd1.8) 및 Lspd1.6 (Ld1.6)로 구성된 Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 pI값을 7.4에서 측정하였다. HOLO 항체의 pI는 8.9이므로, Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 pI는 1.5로 감소하였다.
(2) HOLO 항체로부터 포인트-돌연변이 개변된 항체의 결합 활성의 경쟁 ELISA에 의한 평가
(1)에서 정제된 H0L0 항체 및 그것의 포인트 돌연변이-개변 항체를 경쟁 ELISA로 평가하였다. 1㎍/ml에서 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드 (SEQ ID NO: 13) 100 ㎕를 96-웰 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드를, 플레이트를 밤새도록 4℃에 방치함에 의해 플레이트 상에 고정화시켰다. 플레이트 상에 고정화된 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드를 Skan WASHER400 (Molecular Devices)를 이용한 세척 용액으로 3회 세척하고; 그리고 4℃에서 적어도 30분 동안 블록킹 완충액 200 ㎕로 블록하였다. 가용성 GPC3 코어 폴리펩티드가 고정화되어 있는 블록된 플레이트를 그 후 Skan WASHER400를 사용하는 세척 용액으로 3회 세척하였다. 이어서, 플레이트의 각각의 웰에 비오틴화된 HOLO 항체 (최종 농도 = 0.3 ㎍/mL) 100 ㎕와 HOLO 항체 또는 그것의 포인트 돌연변이-개변된 항체 (여러 농도) 100 ㎕를 함유하는 혼합물 200 ㎕를 넣었다. HOLO 항체를 키트와 함께 제공된 지침에 따라 Biotin Labeling Kit (Roche)를 사용하여 비오틴화하였다. 플레이트를 1시간 동안 실온에 방치하고, 그리고 나서 Skan WASHER400 (Molecular Devices)를 사용하는 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 기질 완충액으로 20,000X 희석된 염소 항-스트렙타비딘 알칼리성 포스파타제 (ZYMED) 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고, 그리고 생성된 플레이트를 1시간 동안 실온에서 방치시키고, 그리고 나서 Skan WASHER400을 사용하는 세척 용액으로 5회 세척하였다. 포스파타제 기판 (Sigma)을 기질 완충액 중에 1 mg/mL로 제조하고, 1시간 동안 웰당 100 ㎕로 첨가하였다. 각각의 웰에서 반응 용액의 405nm에서의 흡광도를 Benchmark Plus (BIO-RAD)를 사용하여 측정하였고, 대조 흡광도는 655 nm에서 측정하였다.
도 4에 나타낸 바와 같이, H15L4 항체의 항원 결합 활성은 개변된 HOLO 항체의 항원결합활성과 거의 동일한 것으로 나타났다. 이에 더하여, 도 5에 나타낸 바와같이, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체의 항원 결합 활성은 개변된 HOLO 항체의 것과 거의 동일하게 나타났다. 더욱이, 도 6에 나타낸 바와 같이, Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체의 항원 결합 활성은 개변된 HOLO 항체의 것과 거의 동일하다는 것이 나타났다.
참조예 2
CHO 세포에서 푸코스 전달 유전자의 붕괴
(1) 표적화 벡터의 구축
(1-1) KO1 벡터의 구축
푸코스 전달 유전자의 출발 코돈의 5' 측면과 동일한 서열을 얻기 위해 프라이머 Hyg5-BH 및 Hyg3-NT를 갖는 pcDNA3.1/Hygro (Invitrogen)을 이용한 PCR에 의해 BamHI 부위와 TGCGC 서열을 하이그로마이신 내성 유전자 (Hygr)의 출발 코돈의 5' 측면에 첨가하였다. 또한 NotI 부위를 SV40 폴리A 부가 신호까지의 영역을 포함하는 3' 측면에 첨가하였다.
전방 프라이머
Hyg5-BH 5'-GGATCCTGCGCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3'(SEQ ID NO: 14)
역방향 프라이머
Hyg3-NT 5'-GCGGCCGCCTATTCCTTTGCCCTCGGACG-3'(SEQ ID NO: 15)
푸코스 전달 표적화 벡터 ver. 1 (KO1 벡터로 명명)을 푸코스 전달자의 5 측면(SEQ ID NO: 16의 No. 2,780의 SmaI로부터 No. 4,232의 BamHI), 3 측면(No. 4,284로부터 No. 10,934의 SacI까지) 및 Hygr 분획을 pMC1DT-A 벡터 (Yagi T., Proc. Natl . Acad . Sci . USA (1990) 87, 9918-22)에 삽입하여 구축하였다. 이 벡터의 특징적 성질은, 상동성 재조합이 발생하였을 때, 프로모터는 Hygr 유전자에 부착하지 않기 때문에 Hygr이 푸코스 전달자의 프로모터 하에서 발현되는 것이다. 그러나 오직 벡터의 한 사본만이 상동성 재조합에 의해 세포에 도입되는 경우, Hygr은 하이그로마이신 B 제한을 나타내기에 충분한 정도로 항상 발현되는 것은 아니다. KO1 벡터는 Not1 부위에서 쪼개졌고 세포로 트랜스펙트 되었다. 출발 코돈을 포함하여, 엑손 1의 41개의 염기쌍은 KO1 벡터의 도입에 의해 푸코스 전달자로부터 결실될 것이고, 그 결과 기능이 손실된다.
(1-2) pBSK-pgk-1-Hygr의 구축
pBSK-pgk-1을 EcoRI-PstI를 갖는 pKJ2 벡터(Popo H., Biochemical Genetics (1990) 28, 299-308)로부터의 마우스 pgk-1 유전자 프로모터를 결실하고 그리고 이것을 pBluescript (Stratagene)의 EcoRI-PstI 부위로 클로닝하여 구축하였다. Hygr에 관하여, EcoT22I 부위와 Kozak 서열을 Hygr의 5' 측면에 첨가하고 BamHI 부위를Hyg5-AV 및 Hyg3-BH 프라이머를 갖는 pcDNA3.1/Hygro를 사용하는 PCR에 의해 최대 SV40 polyA 부가 신호 영역을 포함하는 3' 부위에 첨가하였다. 그리고 나서 Hygr 유전자를 결실하였다.
전방 프라이머
Hyg5-AV 5'-ATGCATGCCACCATGAAAAAGCCTGAACTCACC-3'(SEQ ID NO: 17)
역방향 프라이머
Hyg3-BH 5'-GGATCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTC-3'(SEQ ID NO: 18)
pBSK-pgk-1-Hygr는 Hygr 분획(EcoT22I-BamHI)을 pBSK-pgk-1의 PstI-BamHI 부위에 삽입하여 구축하였다.
(1-3) KO2 벡터의 구축
푸코스 전달 표적화 벡터 ver. 2 (이하 KO2 벡터로 명명)를 푸코스 전달자의 5' 측면( SEQ ID NO: 16의 No. 2,780의 SmaI 부위로부터 No. 4,232의 BamHI 까지), 3' 측면 (No. 4,284에서 No. 10,934의 SacI 부위까지), 및 pgk-1-Hygr 분획을 pMC1DT-A 벡터에 삽입하여 구축하였다. KO1 벡터의 경우와 달리, KO2 벡터는 Hygr에 부착된 pgk1 유전자 프로모터를 갖고, 그러므로 벡터의 오직 한 사본이 상동성 재조합에 의해 세포에 도입되는 경우에도 하이그로마이신 B 내성을 취득할 것이다. KO2 벡터를 도입함에 의해, 출발 코돈을 포함하는 엑손 1의 46개의 염기쌍들은 푸코스 운송자로부터 결실될 것이고, 그 결과 기능이 손실된다.
(1-4) pBSK-pgk-1-Puror의 구축
pPUR 벡터(BD Biosciences)를 PstI 및 BamHI로 분열시키고 결실된 분획(Puror)을 pBSK-pgk-1의 PstI-BamHI 부위에 삽입하여 pBSK-pgk-1-Puror를 구축하였다.
(1-5) KO3 벡터의 구축
푸코스 운송 표적화 벡터 ver. 3 (이하 KO3 벡터로 명명)를 푸코스 운송자의 5' 측면(SEQ ID NO: 16의 No. 2,780의 SmaI 부위로부터 No. 4,232의 BamHI 까지), 3' 측면(No. 4,284 로부터 No. 10,934의 SacI 부위), 및 pgk-1-Puror 단편을 pMC1DT-A 벡터에 삽입하여 구축하였다. 아래에 나타낸 스크리닝 프라이머에 결합하기 위한 서열은 우선 pgk-1-Puror의 3 말단에 부착하였다. KO3 벡터를 Not1로 분열시키고 세포로 트랜스펙션시켰다. KO3 벡터의 도입에 의해, 출발코돈을 포함하는 엑손 1의 46개의 염기쌍들이 푸코스 운송자로부터 결실될 것이고, 그 결과 기능을 손실한다.
역 프라이머
RSGR-A 5'-GCTGTCTGGAGTACTGTGCATCTGC-3'(SEQ ID NO: 19)
푸코스 운송자 유전자는 상기 3개의 표적화 벡터를 사용하여 녹아웃되었다.
(2) 벡터의 CHO 세포로의 도입
HT 보충물 (100x) (Invitrogen) 및 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen)을 CHO-S-SFMII HT- (Invitrogen)에, 각각 CHO-S-SFMII HT- 의 1/100 부피로 첨가하여 배양 매질을 제조하였다(이하 SFMII(+)로 명명). CHO DXB11 세포를 SFMII(+)에서 2 배양하였다. 8 x 106 CHO 세포를 0.8 mL 둘베코 인산염 완충액(Invitrogen) 중에 현탁시켰다 (이하 PBS로 명명). 표적화 벡터 30 mg을 세포 현탁물에 첨가하고 유전자 펄스 큐벳(Pulser cuvette) (4 mm) (BioRad)으로 옮겼다. 10분 동안 얼음 위에서 유지시킨 후, 벡터를 1.5 kV 및 25 μFD에서 GENE PULSER II (BioRad)으로 전기영동에 의해 세포로 트랜스펙션하였다. 벡터 트랜스펙션 후, 세포들을 200 mL SFMII(+) 매질에 현탁시키고 20개의 96-웰 편평한 바닥 플레이트(Iwaki)에 100㎕/웰로 시트하였다. 플레이트를 24시간 동안 37℃에서 CO2 인큐베이터 안에서 배양시키고, 그리고 나서, 시약을 첨가하였다.
(3) 녹아웃: 단계 1
KO1 벡터 또는 KO2 벡터를 CHO 세포로 트랜스펙션시키고, 벡터 트랜스펙션 24시간 후 하이그로마이신 B (Invitrogen)으로 선택하였다. 하이그로마이신 B를 SFMII(+) 중에 0.3 mg/mL로 용해시키고, 100 ㎕을 웰 당 첨가하였다.
(4) PCR에 의한 상동성 재조합을 위한 스크리닝
(4-1) PCR용 샘플의 제조
상동성 재조합형을 PCR로 스크리닝하였다. CHO 세포를 96-웰 편평한 바닥 플레이트 상에서 배양하였고, 배양 상등액을 제거하고 세포 용해 완충액을 50 ㎕/웰로 첨가하고, 55℃에서 2시간 동안 배양하였다. 그리고 나서 프로테이나제 K를 95℃에서 15분 동안 가열하여 불활성화시켜 PCR 주형을 제조하였다. 세포 용해 완충액은 웰 당 다음으로 구성되었다: 5 ㎕ 10x LA 완충액 II (Takara LA Taq), 2.5 ㎕ 10% NP-40 (Roche), 4 ㎕ 프로테이나제 K (20 mg/mL, Takara), 및 38.5 ㎕ 증류수 (Nacalai Tesque).
(4-2) PCR 조건
PCR 반응 혼합물은 상기와 같이 PCR 샘플 1㎕, 5 ㎕ 10x LA Buffer II, 5 ㎕ MgCl2 (25 mM), 5 ㎕ dNTP (2.5 mM), 2 ㎕ 프라이머 (각각 10 μM), 0.5 ㎕ LA Taq (5 IU/mL), 및 29.5 ㎕ 증류수 (총 50 ㎕)로 구성되었다. TP-F4 및 THygro-R1 프라이머를 PCR 프라이머로서 사용하여 KO1 벡터-트랜스펙트된 세포를 스크리닝하였고, TP-F4 및 THygro-F1 프라이머를 PCR 프라이머로 사용하여 KO2 벡터-트랜스펙트된 세포를 스크리닝하였다. KO1 벡터-트랜스펙션된 세포를 위한 PCR 스크리닝은 1분 동안 95℃에서 예열하고; 40회의 95℃/30초, 60℃/30초, 및 60℃/2분의 순환; 그리고 72℃에서 7분 동안 재가열하여 수행하였다. KO2 벡터-트랜스펙트된 세포의 PCR 스크리닝은 95℃에서 1분간 예열; 40회의 95℃/30초 및 70℃/3 분의 순환; 그리고 70℃에서 7분 동안 재가열하여 수행하였다.
프라이머를 아래에 제공하였다. 상동성 재조합이 일어난 세포 샘플에서, 대략 1.6 kb DNA를 KO1 벡터에 대해 증폭하였고 그리고 대략 2.0 kb DNA를 KO2 벡터에 대해 증폭하였다. TP-F4 프라이머를 벡터의 5' 측면 상에서 푸코스 운송자의 게놈 영역에 고안하였고, 그리고 THygro-FI 및 THygro-R1 프라이머를 벡터 내의 Hygr 에 고안하였다.
전방 프라이머 (KO1, KO2)
TP-F4 5'-GGAATGCAGCTTCCTCAAGGGACTCGC-3'(SEQ ID NO: 20)
역 프라이머 (KO1)
THygro-R1 5'-TGCATCAGGTCGGAGACGCTGTCGAAC-3'(SEQ ID NO: 21)
역 프라이머 (KO2)
THygro-F1 5'-gcactcgtccgagggcaaaggaatagc-3'(SEQ ID NO: 22)
(5) PCR 스크리닝의 결과
918개 KO1 벡터-트랜스펙트된 세포를 분석하였고, 1 세포가 상동성 재조합이라고 생각하였다 (상동성 재조합 효율 = 대략 0.1%). 537 KO2 벡터-트랜스펙트된 세포를 분석하였고 17개의 세포가 상동성 재조합이라고 생각하였다 (상동성 재조합 효율 = 대략 3.2%).
(6) 서던 블로팅 분석
추가의 확인은 서던 블로팅으로 수행하였다. 게놈성 DNA 10 mg을 표준법에 의해 배양 세포로부터 제조하였고 서던 블로팅을 수행하였다. 아래 제공된 두 개의 프라이머를 사용하여, SEQ ID NO: 16에 나타낸 뉴클레오티드 서열의 No. 2,113 부터 No. 2,500까지 영역에 걸친 PCR로 387 bp 프로브를 제조하였고 그리고 서던 블로팅에 사용하였다. 게놈성 DNA를 Bg1II로 분열시켰다.
전방 프라이머
Bgl-F 5'-TGTGCTGGGAATTGAACCCAGGAC-3'(SEQ ID NO: 23)
역 프라이머
Bgl-R 5'-CTACTTGTCTGTGCTTTCTTCC-3'(SEQ ID NO: 24)
BglII에 의한 쪼개짐은 푸코스 운송자 염색체로부터 대략 3.0 kb 밴드, KO1 벡터와 상동성 재조합이 발생된 염색체로부터 대략 4.6 kb 밴드, 그리고 KO2 벡터와 상동성 재조합이 발생된 염색체로부터 대략 5.0 kb를 제공한다. KO1 벡터와 상동성 재조합에 의해 얻어진 하나의 세포와 KO2와의 상동성 재조합에 의해 얻어진 7개의 세포를 실험에 사용하였다. KO1 벡터와 얻어진 오직 하나의 세포를 5C1로 지정하였고; 그러나, 이것은 이후의 분석으로 다중 세포 개체를 포함하는 것으로 나타났다. 그러므로, 제한 희석에 의한 클로닝을 이후의 시험에 사용하기 전에 수행하였다. KO2로부터 얻은 세포 중 하나를 6E2로 지정하였다.
(7) 녹아웃: 단계 2
완전한 결핍 푸코스 유전자를 갖는 세포주를 설립하기 위해, 3개의 벡터 중 하나를 KO1 또는 KO2 벡터에 의해 상동성 재조합이 이루어진 세포에 도입하였다. 벡터/세포 결합은 다음과 같다: 방법 1: KO2 벡터와 5C1 세포 (KO1); 방법 2: KO2 벡터와 6E2 세포 (KO2); 방법 3: KO3 벡터와 6E2 세포 (KO2). 벡터를 각각의 세포로 트랜스펙션하였고, 하이그로마이신 B와 퓨로마이신(Nacalai Tesque)에 의한 선택을 벡터 트랜스펙션 24시간 후에 개시하였다. 최종 하이그로마이신 B 농도는 방법 1에서 1mg/mL였고 방법 2에서 7 mg/mL였다. 방법 3에서, 하이그로마이신 B를 최종농도 0.15 mg/mL로 첨가하였고 푸로마이신을 최종농도 8 ㎍/mL로 첨가하였다.
(8) 상동성 재조합체의 PCR 스크리닝
샘플들을 상기와 같이 제조하였다. 방법 1의 스크리닝에서, 상동성 재조합이 KO1 벡터 및 KO2 벡터와 일어난 세포가 검출된 둘 다의 PCR을 수행하였다. 아래 나타낸 PCR 프라이머를 방법 2에 대해 고안하였다. TPS-F1는 SEQ ID NO: 16에 나타낸 뉴클레오티드 서열 중 No. 3,924로부터 No. 3,950의 영역에 상응하고, 반면, SHygro-R1는 No. 4,248로부터 4,274의 영역에 상응한다. 이들 PCR 프라이머들은 KO2 벡터에 의해 결실되는 푸코스 운송자 유전자 영역의 350 bp를 증폭시킬 것이다. 그러므로, 방법 2의 PCR 스크리닝에서, 350 bp 증폭 산물을 생산하지 않는 세포들은 푸코스 운송자 유전자가 완전히 부족한 세포라고 간주된다. PCR 조건은 다음과 같았다: 95℃에서 1분간 예열; 95℃/30초 및 70℃/1분의 증폭 사이클 35회; 및 70℃에서 7분 동안 재가열.
전방 프라이머
TPS-F1 5'-CTCGACTCGTCCCTATTAGGCAACAGC-3'(SEQ ID NO: 25)
역 프라이머
SHygro-R1 5'-TCAGAGGCAGTGGAGCCTCCAGTCAGC-3'(SEQ ID NO: 26)
방법 3의 경우, TP-F4를 전방 프라이머로 사용하였고 RSGR-A 를 역 프라이머로 사용하였다. PCR 조건은 다음과 같다: 95℃에서 1분간 예열; 95℃/30초, 60℃/30초 및 72℃/2분의 증폭 사이클 35회; 72℃에서 7분간 재가열. 대략 1.6 kb DNA가 KO3 벡터에 의한 상동성 재조합이 일어난 세포 샘플로부터 증폭될 것이다. 이 PCR에 의해, 상동성 재조합이 KO3 벡터에 의해 발생한 세포가 검출되었고, 이것은 또한 세포가 검출 동안 KO2 벡터에 의한 상동성 재조합을 보유한다는 것을 확인하였다.
(9) PCR 스크리닝의 결과
방법 1에 의해 분석된 616 세포 중 18개의 세포가 상동성 재조합체로 간주되었다 (상동성 재조합 효율 = 2.9%). 방법 2에 의해 분석된 524개의 세포 중 2 세포가 상동성 재조합체로 간주되었다 (상동성 재조합 효율 = 대략 0.4%). 방법 3에 의해 분석된 382개의 세포 중 7개의 세포가 상동성 재조합체로 간주되었다 (상동성 재조합 효율 = 대략 1.8%).
(10) 서던 블로팅 분석
서던 블로팅 분석을 상기 방법에 의해 수행하였고, 1개의 세포가 완전히 손실된 푸코스 운송자 유전자를 갖는 것으로 동정되었다. PCR 및 서던 블로팅에 의한 분석 결과는 녹아웃 단계 1과 일치하였지만 녹아웃 단계 2와는 일치하지 않았다.
(11) 푸코스 발현 분석
상동성 재조합체로 발견된 26개의 세포를 PCR에 의해 푸코스 발현에 관하여 분석하였다. 1 x 106 세포를, 5 ㎍/mL Lens culinaris 아글루티닌, FITC 컨쥬게이트 (Vector Laboratory), 2.5% FBS, 및 0.02% 소듐 아지드를 함유하는 PBS (이후 FACS 용액으로 명명) 100 ㎕으로 1시간 동안 빙냉하면서 염색하였다. 그리고 나서 세포들을 FACS 용액으로 3회 세척하고 FACSCalibur (Becton Dickinson)으로 분석하였다. 결과는 푸코스 발현이 오직 FTP-KO 세포에서만 감소되었다는 것을 나타내고, 이것은 서던 블롯 분석에서 푸코스 전달자 유전자의 완전 손실을 나타내기는 것으로 발견되었다.
참조예 3
FTP - KO 주로부터 유래된 항체-생산 세포의 설립 및 이들 세포로부터 생산된 항체의 정제
실시예 1에 얻은 푸코스 전달자-결핍 주 (FTP-KO 세포, 클론명: 3F2)를 최종 농도 1mg/mL의 하이크로마이신 B를 함유하는 SFMII(+) 중에서 2차 배양하였다. 8 x 106 3F2 세포를 0.8 mL 둘베코 인산염 완충액 중에 현탁시켰다. 인간화 항-글리피칸 3 항체 25 ㎍을 세포 현탁액에 첨가하고 Gene 펄스 큐벳으로 옮겼다. 10분간 얼음 위에서 유지시킨 후, 벡터를 1.5 kV and 25 μFD에서 GENE PULSER II로 전기영동하여 트랜스펙트시켰다. 트랜스펙션 후, 세포를 40 mL SFMII(+) 매질에 현탁시키고 96-웰 편평한 바닥 플레이트 (Iwaki)에 100 ㎕/웰로 시드하였다. 플레이트를 24 시간 동안 37℃에서 CO2 인큐베이터에서 배양하였고, 제네티신 (Invitrogen)을 최종 농도 0.5 mg/mL로 첨가하였다. 약물-내성 세포의 항체 생산을 측정하여 인간화 항-글리피칸 3 항체-생산 세포주를 얻었다.
항체-발현 주로부터의 배양 상등액을 수집하고 P-1 펌프를 사용하여 Hitrap rProtein A 칼럼(Pharmacia)에 적용하였다. 칼럼을 결합 완충액 (20 mM 인산 나트륨 (pH 7.0))으로 세척하고, 결합된 항체를 이어서 용출 완충액 (0.1 M glycine-HCl (pH 2.7))으로 용충시켰다. 용출물을 즉시 중화 완충액(1 M Tris-HCl (pH 9.0))으로 중화시켰다. 용출된 항체 분획을 DC 단백질 조사(BioRad)를 사용하여 선택하고 풀하고, Centriprep-YM10 (Millipore)로 약 2mL로 농축시켰다. 농축액을 150 mM NaCl을 함유하는 20 mM 아세트산 완충액(pH 6.0)으로 평형화시킨 Superdex200 26/60 (Pharmacia) 상에서 겔여과하였다. 용출물 중의 모노머 분획의 피크를 수집하고 Centriprep-YM10로 농축시켰다. 농측액을 MILLEX-GW 0.22 ㎛ 필터 유니트 (Millipore)을 사용하여 여과하고 4℃에서 보관하였다. 정제된 항체 농도를 280nm에서의 흡광도를 기준으로 몰흡광계수로부터 산출하여 측정하였다.
참조예 4
FTP - KO 세포에 의해 생산된 인간화 항- 글리피칸 3 항체에 부착된 당사슬의 분석
(1) 2-아미노벤즈아미드-라벨된 당사슬 (2-AB-라벨된 당사슬) 제조
FTP-KO 세포에 의해 생산된 본 발명의 항체 및 CHO 세포에 의해 생산된 항체 (대조)를 항체-결합 당 사슬을 방출하기 위해 N-글리코시다제 F(Roche Diagnostics)로 처리하였다(Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences (1994) 83(12), 1670-5). 에탄올로 탈단백질화 후 (Schenk B. et al., The Journal of Clinical Investigation (2001), 108(11), 1687-95), 방출된 당 사슬을 농축하여 건조시키고 2-아미노피리딘으로 형광-라벨하였다(Bigge J. C. et al., Analytical Biochemistry (1995) 230(2), 229-238). 생성된 2-AB-라벨 당 사슬을 셀룰로스 카트리지를 사용하는 고체상 추출에 의해 시약으로부터 분리하고, 원심분리로 농축시켜 순수한 2-AB-라벨된 당 사슬을 얻었다. 순수한 2-AB-라벨된 당 사슬을 β-갈락토시다제(Seikagaku Kogyo Co., Ltd.)로 처리하여 아갈락토실 2-AB-라벨된 당 사슬을 제조하였고 다음과 같이 분석하였다.
(2) 정상 HPLC에 의한 아칼락토실 2-AB-라벨된 당 사슬의 분석
상기 방법에 의해 제조된 아갈락토실 2-AB 라벨된 당 사슬, FTP-KO 세포에 의해 생산된 본 발명의 항체로부터 방출된 당 사슬 및 CHO 세포로부터 생산된 항체 (대조)를 TSKgel 아미드-80 아미드 칼럼 (TOSOH Corp.)을 갖는 정상 HPLC에 의해 분석하였고, 크로마토그램을 비교하였다. CHO 세포에 의해 생산된 항체와 비교하여 다음을 평가하였다: G(0)는 당 사슬의 주요 성분으로 존재하는 반면, 푸코스가 부족한 G(0)-Fuc는 피크 면적으로 산출하여 평가함에 따르면, 전체 당 사슬의 약 4%로 설명되었다. FTP-KO 세포에 의해 생산된 항체의 경우, G(0)-Fuc는 주요 성분이었다. 모든 항체 생산 세포주의 경우, 생산된 항체에서 전체 당 사슬의 적어도 90%는 피크 면적 비율로 산출하여 평가함에 따르면, 푸코스-프리 당 사슬이었다.
아갈락토실 2-AB-라벨된 당 사슬에 대한 정상 HPLC 분석으로부터 평가된 각각의 당 사슬의 상대적 비율
당사슬 CHO FTP-KO-a FTP-KO-b FTP-KO-c
G(0)-Fuc 4.0% 92.4% 92.5% 93.2%
G(0) 96.0% 7.6% 7.5% 6.8%
실시예 5
인간화 HOLO 항체 및 포인트 돌연변이- 개변 항체를 안정하게 발현하는 세포주의 확립
Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체, Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6) 항체 (실시예 1에 기재된 방법으로 생산된 H0L0 항체-소스된 변형된 항체) 또는 개변된 H0L0 항체를 암호화하는 유전자들을 발현 벡터에 클론하였다. 클로닝에서, 중사슬과 경사슬을 암호화하는 유전자들을 다양한 발현 벡터에 삽입하여 항체의 중사슬과 경사슬을 암호화하는 각각의 유전자를 발현시켰다. 두개의 발현 벡터를 상기와 같은 중사슬과 경사슬을 암호화하는 유전자의 원하는 결합을 제공하도록 선택하였고, PvuI로 소화시키고 참조예 2에서 생산된 FTP-KO 주에 전기영동으로 트랜스펙트시켰다.
HOLO 항체 또는 변형된 항체를 안정하게 생산하는 돌연변이를 Gene Pulser II (BioRad)를 사용하여 전기영동으로 제조하였다. PBS 중에 현탁된 0.75 mL CHO 세포 (1 x 107 cells/mL)를 중사슬과 경사슬의 원하는 결합을 제공하는 발현 플라즈마 DNA 각각 10㎍과 혼합하고, 혼합물을 얼음 위에서 10분간 방치하였다. 혼합물을 Gene Pulser II 큐벳에 옮기고 1.5 kV 전기 펄스를 25 μFD의 전기용량으로 적용하였다. 펄스된 혼합물을 10분 동안 실온에서 배양하고 CHO-S-SFMII/1% HT/1% PS 매질 중에 현탁시켰다. 희석된 현탁액 100 ㎕ (동일한 매질에서 제조된, 5배, 10 배, 및 50 배)를 96-웰 배양 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 24시간 동안 5% CO2를 유지하는 CO2 인큐베이터에서 인큐베이트 하였다. 그리고 나서, 제네티신 (Gibco)을 각각의 웰에 최종 농도가 500 ㎍/mL되도록 첨가하고 그리고 제오신(Invitrogen)을 최종 농도 600 ㎍/mL로 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트들을 2주 동안 인큐베이트 하였다. 제니티신과 제오신 내성을 나타내는 변형된 세포의 클로니들을 500 ㎍/mL 제네티신(Gibco) 및 600 ㎍/mL 제오신 (Invitrogen)을 함유하는 동일 매질 위에서 2차 배양하여 더욱 선택하였다. 이 방법으로 선택된 변형된 세포의 배양 상등액을 BiacoreQ (BIACORE)를 사용하여 항체 농도에 대해 평가하여 높은 수준으로 원하는 항체를 발현하는 형질전환체를 확립하였다. 배양 상등액에서 항체 농도를 BiacoreQ (BIACORE)로 제공된 지침에 따라 측정하였다. 이와 같이 확립된 세포주를 제네티신 500 ㎍/ml과 제오신 600 ㎍/ml을 함유하는 CHO-S-SFMII 매질 (Invitrogen)에서 배양하였다. 적절한 시간 동안 배양한 후, 배양 상등액을 수집하고, rProteinA-세파로스 칼럼(GE Healthcare)을 사용하여 정제하였다. 정제된 항체를 Amicon Ultra-4 (MILLIPORE)로 농축시키고 200 mM NaCl을 함유하는 20 mM 아세트산 완충액 (pH 6.0)으로 PD-10 탈염 칼럼 (Amersham Biosciences) 상에서 완충 이온 교환하였다. 정제된 항체를 ND-1000 스펙트로포토미터 (NanoDrop) 또는 DU-600 스펙트로포토미터(BECKMAN)에서 280 nm에서 흡착에 의해 평가하였다. 항체 농도는 RACE 법으로 산출하였다.
실시예 6
인간화 HOLO 항체 및 포인트 돌연변이- 개변된 항체의 인 비보 모델에서의 치료 효율
(1) 인 비보 모델로의 이식에 사용되는 세포주의 유지
HepG2 세포(ATCC)를 사용하였다. HepG2 세포를 소듐 피로부에이트 (Invitrogen) 1 mmol/L MEM 및 비-필수 아미노산 1 mmol/L MEM을 함유하는 이글스 최소 필수 매질(이 매질은 2차 배양 매질로 명명)에서 2차 배양하여 유지하였다.
(2) HwpG2 세포-이식된 마우스 모델의 제조
2차 배양 매질과 MATRIGEL Matrix (BD Bioscience)를 1:1로 함유하는 용액을 사용하여, HepG2 세포의 현탁액을 5 x 107 cells/mL로 제조하였다. 세포 현탁액 100 ㎕ (5 x 106 cells/mouse)를 SCID 마우스(수컷, 5 주령, CLEA Japan, Inc.)의 복막 영역에 피하이식하였다. 세포 이식 하루 전, 마우스에 복막 투여에 의해 100 ㎕ 항-아시알로 GM1 항체(1 바이알의 함량을 상기 용액 5ml에 용해시켰다, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 투여하였다. 종양 부피를 다음 식에 따라 산출하였다.
종양 부피 = 긴 직경 x 짧은 직경 x 짧은 직경/2
평균 종양 부피가 130 내지 330 mm3에 도달하면, 마우스를 모델로서 사용하였다.
(3) 시험 항체를 함유하는 투여 샘플의 제조
HOLO 항체, Hu2.2Lu2.2 항체, 또는 Hd1.8Ld1.6 항체를 0.5 mg/mL (5 mg/kg group) 또는 0.1 mg/mL (1 mg/kg group) 함유하는 투여 샘플을 투여 당일에 생리적 식염수를 사용하여 제조하였다.
(4) 항체-함유 투여 샘플의 투여
(3)에 따라 제조된 투여 샘플을 꼬리 정맥을 통하여 (2)에서 준비된 마우스 모델에 HepG2 세포 이식 후 27일에 시작하여 3주동안 주 1회 10 mL/kg의 투여량으로 투여하였다. 음성 대조로서, 생리적 식염수를 3주 동안 주 1회 10 ml/dose의 투여량으로 꼬리 정맥을 통해 투여하였다. 모든 그룹은 5마리 동물로 이루어졌고, 그리고 각각의 시험 항체-함유 투여 샘플을 각각의 그룹에 투여하였다. 투여와 거의 동시에, 정맥혈을 각 그룹에서 3마리 동물로부터 수집하여 항체의 뮤린 혈장 농도를 분석하였다. 특이적으로, 혈액은 2회 시점에서 족배 정맥으로부터 수집하였다: 초기 투여 후 0.5 시간 및 두번째 투여 후 즉시. 수집된 혈액 20 ㎕를 헤파린으로 처리하고 혈장을 원심분리를 통해 격리시켰다.
(5) 시험 항체의 항종양 활성의 평가
각각의 시험 항체의 항종양 활성을 인간 간암이 이식된 마우스 모델에서 평가하였다. 종양 부피를 샘플 투여 최종일로부터 1주 후 측정하였다. 그 결과를 도 7에 나타내었다. Hspd1.8Lspd1.6 (Hd1.8Ld1.6)항체는 강한 치료 효과를 나타낸 반면, Hspu2.2Lspu2.2 (Hu2.2Lu2.2) 항체는 약한 치료 효과를 나타내었다.
(6) 시험 항체의 혈장 농도
뮤린 혈장의 시험 항체의 농도를 실시예 1에 기재된 ELISA-기준 모델로 측정하였다. 표준 샘플들을 혈장 농도 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 및 0.2 ㎍/mL로 제조하였다. 표준 샘플들과 (적절히 원하는 농도로 희석된) 뮤린 플라즈마 시험 샘플들을 가용성 글리피칸 3 코어(Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha)가 고정화된 면역플레이트(Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International))에 첨가하고, 플레이트들을 실온에서 1시간 동안 인큐베이트 하였다. 염소 항-인간 IgG-BIOT ((Southern Biotechnology Associates) 및 그리고 나서 스트펩타비딘-알칼리성 포스파타아제 컨쥬게이트(Roche Diagnostics)를 첨가하고 기질로서 BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System (Kirkegaard & Perry Laboratories)를 사용하여 발색성 시험을 수행하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 각각의 웰의 반응 용액의 색을 650nm에서 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 뮤린 혈장 항체 농도를 표준 샘플로부터 얻은 흡광도 값으로 제조된 표준 곡선을 참조로 SOFTmax PRO analytical software (Molecular Devices)를 사용하여 산출하였다.
투여후 30분과 7일의 뮤린 혈장 농도를 도 8에 나타내었다. 시험된 둘 다의 투여량에 대해 낮은 pI 값을 갖는 시험 항체의 투여 7일 후 뮤린 혈장에서 더 높은 항체 농도가 관찰되었다.
실시예 7
작동세포로서 인간 말초 혈액 단핵구를 사용하여 측정된 시험 항체의 ADCC 활성
시험 항체의 ADCC 활성을 작동세포로서 인간 말초 혈액 단핵구(PBMC로 명명)를 사용하여 하기와 같이 시험하였다.
(1) 인간 PBMC 용액의 제조
1000 unit/mL 헤파린 용액 (Novo Heparin Injection 5000 Units, Novo Nordisk) 200 ㎕가 이미 장전된 주사기를 사용하여, 헤파린 혈액 50 mL를 추가이 세이야쿠 가부시키 가이샤의 건강한 자원자(성인 남성)로부터 수집하였다. 혈액을 PBS(-)로 2배 희석하고, 4개의 동일한 부분으로 나누고, Ficoll-Paque PLUS 15 mL가 이미 장전된 Leucosep 림프구 분리관 (Greiner Bio-one)에 넣고 원심분리하였다. 말초 혈액이 장전된 분리관을 10분 동안 실온에서 2150 rpm으로 원심분리하고, 단핵구 분획층을 수집하였다. 층에 함유된 세포들을 10% FBS를 함유하는 둘베코 개변 이글스 매질 (Sigma) (이하 10% FBS/D-MEM로 명명)로 1회 세척하고 10% FBS/D-MEM에 세포밀도 5 x 106/mL로 현탁시켰다. 세포 현탁물을 인간 PBMC 용액으로서 다음 실험에 사용하였다.
(2) 표적 세포의 제조
HepG2 세포를 디쉬로부터 분리시키고 96-웰 U-자형 바닥 플레이트에 1 x 104 cells/well로 시드하였다. 플레이트를 밤새도록 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이트 하였다. 다음날, 5.55 MBq Cr-51을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 3시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트에서 인큐베이트 하였다. 플레이트의 각 웰에 함유된 HepG2 세포를 하기와 같이 ADCC 활성 시험에서 표적 세포로 사용하였다.
(3) 크롬 방출 시험 (ADCC 활성)
ADCC 활성을 크롬 방출법에 의해 측정된 특이 크롬 방출률로부터 평가하였다. (2)에서와 같이 제조된 표적 세포를 매질로 세척하고, 각각의 항체 (HOLO 항체, Hu2.2Lu2.2 항체, 또는 Hd1.8Ld1.6 항체) 100 ㎕를 농도 0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, 또는 40 ㎍/mL으로 첨가하였다. 플레이트들을 실온에서 15 분 동안 반응시키고, 항체 용액을 제거하였다. 2차 배양 매질 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트 중에서 인큐베이트 하였다. (1)과 같이 제조된 인간 PBMC 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하고 (5 x 105 cells/well), 그리고 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트 중에서 인큐베이트 하고 원심분리하였다. 플레이트의 각 웰에서 세포 상등액 100㎕의 방사능활성을 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. 특정 크롬 방출률을 다음 식에 따라 측정하였다.
특정 크롬 방출률(%) = (A - C) x 100/(B - C)
여기서, A는 각각의 웰에서 배양 상등액 100㎕의 방사능활성의 평균값(cpm)을 나타내고; B는 2% NP-40 수용액 (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) 100㎕와 10% FBS/D-MEM 매질 50㎕이 표적 세포에 첨가된 웰에서 배양 상등액 100㎕의 방사능활성의 평균값(cpm)을 나타내고; 그리고 C는 10% FBS/D-MEM 매질 150 ㎕가 표적 세포에 첨가된 각 웰에서 배양 상등액 100 ㎕의 방사능활성의 평균값 (cpm)을 나타낸다. 시험을 3중으로 수행하였고, 시험 결과로부터 특정 클롬 방출률의 평균값과 표준편차를 산출하였고, 이것은 항체의 ADCC 활성을 반영한다.
(4) 시험 항체의 ADCC 활성의 평가
시험 항체를 통한 인간 PBMC에 의해 나타난 ADCC 활성의 평가 결과는 시험 항체 모두가 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 보인다. 이 결과를 도 9에 나타내었다. 유의차 검정은 시험 항체의 특정 크롬 방출률에서 시험된 농도 어디에서도 시험 항체들 간에 유의차가 관찰되지 않았다는 것을 보인다. 통계적 분석은 SAS 전임상 패키지(SAS Institute Inc.)를 사용하여 수행하였다. 시험 결과는 pI-개변 시험 항체의 ADCC 활성 간에 차이가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 8
포인트 돌연변이에 의한 pI 개변된 항체의 제조 및 특성화
(1) pI 감소를 위한 개변 부위 선택
Hd1.8Ld1.6 활성의 종양 억제 활성을 개선하기 위해, 가변영역의 pI값의 감소 능력에 관하여 개변 부위를 선택하였다. 가변영역의 pI 값의 감소를 포함하는 아미노산 잔기를 발견하였고, 이것을 표 2 (중사슬)와 표 3(경사슬)에 요약하였다. pI 값의 감소를 위한 이들 개변의 특이 예들은 pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체였다. 이들 pI 개변 항체를 다음과 같이 제조하였다.
개변 부위는 조립 PCR로 생성하였다. 개변을 함유하는 센스 및 안티센스 서열을 기재고 고안된 올리고 DNA를 합성하였다. 개변 부위를 함유하는 안티센스 올리고 DNA와 개변된 유전자를 갖는 벡터에 상응하는 센스 올리고 DNA의 쌍, 또는 개변 부위를 함유하는 센스 올리고 DNA와 개변되어질 유전자를 갖는 벡터에 상응하는 안티센스 올리고 DNA의 쌍을 개변 부위를 함유하는 5'-측면과 3'-측면 분획을 얻기 위해 PrimeSTAR (TAKARA)를 사용하는 PCR에 사용하였다. 각각의 돌연변이체를 제조하기 위해 두 개의 분획을 조립 PCR을 사용하여 연결하였다.
이와 같이 얻은 돌연변이체를 동물 세포에서 삽입된 유전자의 발현을 허용하는 발현 벡터에 삽입하였다. 발현 벡터의 뉴클레오티드 서열을 공지의 방법으로 결정하였다. 포인트 돌연변이의 도입은 혈장 DNA의 뉴클레오티드 서열에 의해 확인되었다. 포인트 돌연변이를 함유하는 유전자를 동물 세포에서 삽입된 유전자의 발현을 허용하는 발현 세포에 클론하였다. 항체의 발현 및 정제는 실시예 1에 기재된 방법 또는 유사한 방법에 따랐다.
Hd1.8로부터 출발하여, CDR1 of Hd1.8에 존재하는 (Kabat 번호표기에 따라) 61번째 글루타민 (Q)을 글루타민산 (E)로 대체하여 pH7 (SEQ ID NO:27)을 제조하였다. Ld1.6로부터 출발하여, 각각 FR2 및 FR3에 존재하는, (Kabat 번호표기에 따라) Ld1.6의 CDR1 에 존재하는 24번째 아르기닌(R)을 글루타민(Q)으로 대체하고, 37번째 글루타민(Q)을 로이신(L)으로 대체하고, 43번째 알라닌 (A)을 세린 (S)으로 대체하고, 45번째 아르기닌 (R)을 글루타민 (Q)으로 대체하고, 74번째 트레오닌 (T)을 리신 (K)으로 대체하고, 77번째 세린 (S)을 아르기닌 (R)으로 대체하고, 78번째 로이신 (L)을 발린 (V)으로 대체하고, 79번째 글루타민 (Q)을 글루타민산 (E)으로 대체하여, pL14 (SEQ ID NO:28)을 제조하였다.
pL14로부터 출발하여, (Kabat 번호표기에 따라) 104번째 로이신 (L)을 발린 (V)으로 대체하고, 107번째 리신 (K)을 글루타민산 (E)으로 대체하고, 각각은 pL14의 FR4에 존재하고, pL 16 (SEQ ID NO: 29)를 제조하였다.
(2) 포인트 돌연변이 pI 개변항체의 pI값의 측정
Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 pI값을 실시예 1에 기재된 방법 또는 유사한 방법으로 PhastGel IEF 4-6.5 (GE Healthcase)를 사용하는 전기영동으로 측정하였다. Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 pI값은 각각, 7.47, 7.07 및 6.52였고, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 pI값이 Hd1.8Ld1.6 항체의 값보다 각각 0.4 그리고 0.95 낮다는 것을 표시한다.
(3) 포인트 돌연변이 pI 개변 항체의 Tm 값 측정
Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체로부터 얻은 Fab 들의 Tm값들을 실시예 1과 유사한 방법을 사용하여 VP-DSC (Micro Cal)로 측정하였다. 이 실험에서, PBD를 투석용액으로 사용하였고, DSC 측정용 시험 용액에서의 항체 농도를 25-100 ㎍/ml으로 조절하였다. DSC 스캔을 20℃ 내지 115℃로, 약 4K/min의 스캔 속도로, 참조 용액 (투석 용액) 및 DSC 측정 시험 용액으로 맞추었다. Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체의 Fab들의 열적변성 중간온도는 각각 77.5, 78.0 및 74.7 ℃였다.
(4) 경쟁 ELISA에 의한 포인트 돌연변이 pI 개변 항체의 항원에 대한 결합 활성 평가
각각의 포인트 돌연변이 pI 개변 항체의 항원 글리피칸 3에 대한 결합 활성을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다(도 10). pH7pH14 항체 및 pH7pL16 항체의 글리피칸 3에 대한 결합 활성은 HOLO 항체의 것과 경쟁하는 것으로 나타났다.
실시예 9
FTP - KO 세포주를 사용한 포인트 돌연변이 pI 개변 항체의 제조
실시예 8에 제조된 각각의 포인트 돌연변이 pI 개변 항체에 대해 코딩하는 유전자를 운반하는 발현 벡터를 폴리에틸렌이민(Polysciences Inc.)을 이용하여 참조예 2에서 제조된 FTP-KO 세포주의 세포에 도입하였고, 항체를 발현시켰다. 개변된 항체를 rProtein A SepharoseTM Fast Flow (Amersham Biosciences)를 사용하여 세포 배양 상등액으로부터 정제하였다. 정제된 항체 용액을 실시예 5에 기재된 방법에 따라 제조하였고 항체 농도를 측정하였다.
실시예 10
인간화 GC33 항체 및 포인트 돌연변이 pI 개변항체의 인 비보 모델에서의 치료 효과
(1) 인 비보 모델에 이식하는데 사용된 세포주의 유지
Hep G2 세포(ATCC)를 사용하였다. Hep G2 세포를 10%FBS, 1 mmol/l MEM 소듐 피루베이트 (Invitrogen), 및 1 mmol/l MEM 비-필수 아미노산 (Invitrogen)이 보충된 최소 필수 매질 이글 매질 (SIGMA) (2차 배양 매질) 중에 2차 배양하여 유지하였다.
(2) HepG2 세포-이식된 마우스 모델의 제조
2차 배양 매질과 MATRIGEL Matrix (BD Bioscience)를 1:1로 함유하는 용액을 사용하여, HepG2 세포의 현탁액을 5 x 107 cells/mL로 제조하였다. 세포 현탁액 (5 x 106 cells/mouse) 100 ㎕ 를 SCID 마우스 (수컷, 5 주령, CLEA Japan, Inc.)의 복막 영역에 피하 이식하였다. 세포 이식 하루 전, 마우스에 100 ㎕ 항-아시알로 GM1 항체(1 바이알의 함량을 용액 5 mL에 용해시켰다. Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)를 복막내 투여하였다. 종양 부피를 다음 식에 따라 산출하였다.
종양 부피 = 긴 직경 x 짧은 직경 x 짧은 직경/2
종양 부피가 400 mm3에 달할 때, 마우스를 모델로 사용하였다.
(3) 시험 항체를 함유하는 투여 샘플의 제조
H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 또는 pH7pL16 항체를 0.1 mg/mL (1 mg/kg group)로 함유하는 투여 샘플을 투여 당일에 생리적 식염수로 제조하였다.
(4) 항체-함유 투여 샘플의 투여
(3)에 따라 제조된 투여 샘플을 (2)에서 제조된 마우스 모델에 꼬리정맥을 통해 10 mL/kg의 투여량으로 HepG2 세포 이식 후 34일로부터 시작하여 5주 동안 주 1회 투여하였다. 음성 대조로서, 생리적 식염수를 5주 동안 주 1회 꼬리 정맥을 통해 10 mL/kg의 투여량으로 투여하였다. 모든 그룹은 5마리로 구성되었고, 그리고 각각의 시험 항체-함유 투여 샘플을 각각의 군에 투여하였다. 투여와 거의 동시에, 정맥 혈액을 각각의 그룹에서 3마리 동물로부터 수집하였고 항체의 뮤린 혈청 농도에 대해 분석하였다. 특이적으로, 혈액은 2회 시점에서 족배 정맥으로부터 수집하였다: 초기 투여 후 0.5 시간 및 두번째 투여 후 즉시. 수집된 혈액 20 ㎕를 헤파린으로 처리하고 혈장을 원심분리를 통해 격리시켰다.
(5) 시험 항체의 항종양 활성의 평가
각각의 시험 항체의 항종양 활성을 인간 간암이 이식된 마우스 모델에서 평가하였다. 종양 부피를 샘플 투여 최종일로부터 1주 후 측정하였다. 도 11에 나타낸 바와 같이, H0L0 항체 및 Hd1.8Ld1.6 항체와 비교하여 pH7pL14 항체 및 pH7pL16 항체에서 더 강한 치료 효과를 발견하였다.
실시예 11
인 비보 모델에서 사용한 인간화 GC33 항체 및 포인트 돌연변이 항체의 PK 시험
(1) 시험 항체-함유 투여 샘플의 제조
H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체, pH7pL16 항체 또는 pH7M85pL16 항체를 0.5 mg/mL (5 mg/kg 그룹)으로 함유하는 투여 샘플을 투여 당일 생리적 식염수를 사용하여 제조하였다.
(2) 항체-함유 투여 샘플의 투여
(1)에 따라 제조된 투여 샘플을 C.B-17/Icr-scid 마우스에 꼬리 정맥을 통해 10 mL/kg의 투여량으로 투여하였다. 모든 그룹은 3마리 동물로 구성되었고, 각각의 시험 항체-함유 투여 샘플을 각각의 군에 투여하였다. 정맥 혈액을 동물로부터 수집하고 항체의 뮤린 혈장 농도에 대해 분석하였다. 특이적으로, 혈액은 7회 시점에서 족배 정맥으로부터 수집하였다: 초기 투여 후 0.5 시간, 2시간, 8시간, 24시간, 72 시간, 168시간. 수집된 혈액 20 ㎕를 헤파린으로 처리하고 혈장을 원심분리를 통해 격리시켰다.
(3) 시험 항체의 플라즈마 농도
뮤린 혈청 중의 시험 항체의 농도를 실시예 6에 기재된 ELISA-기재 방법을 사용하여 측정하였다. 표준 샘플을 12.8, 6.4, 3.2, 1.6, 0.8, 0.4, 그리고 0.2 ㎍/mL의 혈장 농도로 제조하였다. 표준 샘플과 뮤린 혈장 시험 샘플 (원하는 농도로 적절히 희석된)을 가용성 글리피칸 3 코어 (Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha)가 고정화되어 있는 면역플레이트 (Nunc-ImmunoPlate, MaxiSorp (Nalge Nunc International))에 첨가하고, 이 플레이트를 1시간 동안 실온에서 인큐베이트 하였다. 염소 항-인간 IgG-BIOT (Southern Biotechnology Associates) 및 그리고 스트렙타비딘-알칼리성 포스파타아제 컨주게이트(Roche Diagnostics)를 첨가하고, 기질로서 블루포스 마이크로웰 인산염 기질 시스템 (BluePhos Microwell Phosphatase Substrates System, Kirkegaard & Perry Laboratories)을 사용하여 발색 시험을 수행하였다. 마이크로플레이트 판독기를 사용하여, 각각의 웰의 반응 용액의 색을 650nm에서 반응 용액의 흡광도를 측정함으로써 결정하였다. 뮤린 혈장 항체 농도를 표준 샘플로부터 얻은 흡광도 값으로 제조된 표준 곡선을 참조로 SOFTmax PRO analytical software (Molecular Devices)를 사용하여 산출하였다. 투여후 뮤린 혈장 농도를 도 12에 나타내었다. 낮은 pI 값을 갖는 시험 항체가 투여된 마우스의 혈장에서 더 높은 항체 농도가 관찰되었다.
실시예 12
작동세포로서 인간 말포 혈액 단구체를 사용하는 시험 항체의 ADCC 활성
시험 항체의 ADCC 활성을 작동자 세포로서 인간 말초 혈액 단구체(PBMC)를 사용하여 아래와 같이 시험하였다
(1) 인간 PBMC 용액의 제조
1000 unit/mL 헤파린 용액 (Novo Heparin Injection 5000 Units, Novo Nordisk) 200 ㎕가 이미 장전된 주사기를 사용하여, 헤파린 혈액 50 mL를 추가이 세이야꾸 가부시키 가이샤의 건강한 자원자(성인 남성)로부터 수집하였다. 혈액을 PBS(-)로 2배 희석하고, 4개의 동일한 부분으로 나누고, Ficoll-Paque PLUS 15 mL가 이미 장전된 Leucosep 림프구 분리관 (Greiner Bio-one)에 넣고 원심분리하였다. 말초 혈액이 장전된 분리관을 10분 동안 실온에서 2150 rpm으로 원심분리하고, 단핵구 분획층을 수집하였다. 층에 함유된 세포들을 10% FBS를 함유하는 둘베코 개변 이글스 매질 (Sigma) (이하 10% FBS/D-MEM로 명명)로 1회 세척하고 10% FBS/D-MEM에 세포밀도 5 x 106/mL로 현탁시켰다. 세포 현탁물을 인간 PBMC 용액으로서 다음 실험에 사용하였다.
(2) 표적 세포의 제조
HepG2 세포를 디쉬로부터 분리시키고 96-웰 U-자형 바닥 플레이트에 1 x 104 cells/well로 시드하였다. 플레이트를 밤새도록 37℃에서 5% CO2 인큐베이터에서 인큐베이트 하였다. 다음날, 5.55 MBq Cr-51을 플레이트의 각 웰에 첨가하고 플레이트를 3시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트에서 인큐베이트 하였다. 플레이트의 각 웰에 함유된 HepG2 세포를 하기와 같이 ADCC 활성 시험에서 표적 세포로 사용하였다.
(3) 크롬 방출 시험 (ADCC 활성)
ADCC 활성을 크롬 방출법에 의해 측정된 특이 크롬 방출률로부터 평가하였다. (2)에서와 같이 제조된 표적 세포를 매질로 세척하고, 각각의 항체 (H0L0 항체, Hd1.8Ld1.6 항체, pH7pL14 항체 또는 pH7pL16 항체) 100 ㎕를 농도 0, 0.004, 0.04, 0.4, 4, or 40 ㎍/mL으로 첨가하였다. 플레이트들을 실온에서 15 분 동안 반응시키고, 항체 용액을 제거하였다. 2차 배양 매질 100 ㎕를 각각의 웰에 첨가하고 플레이트를 1 시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트 중에서 인큐베이트 하였다. (1)과 같이 제조된 인간 PBMC 용액 100㎕를 각각의 웰에 첨가하고 (5 x 105 cells/well), 그리고 플레이트를 4시간 동안 37℃에서 5% CO2 인큐베이트 중에서 인큐베이트 하고 원심분리하였다. 플레이트의 각 웰에서 세포 상등액 100㎕의 방사능활성을 감마 계수기를 사용하여 측정하였다. 특정 크롬 방출률을 다음 식에 따라 측정하였다.
특정 크롬 방출률(%) = (A - C) x 100/(B - C)
여기서, A는 각각의 웰에서 배양 상등액 100㎕의 방사능활성의 평균값(cpm)을 나타내고; B는 2% NP-40 수용액 (Nonidet P-40, Nacalai Tesque) 100 ㎕와 10% FBS/D-MEM 매질 50 ㎕이 표적 세포에 첨가된 웰에서 배양 상등액 100 ㎕의 방사능 활성의 평균값(cpm)을 나타내고; 그리고 C는 10% FBS/D-MEM 매질 150 ㎕가 표적 세포에 첨가된 각 웰에서 배양 상등액 100 ㎕의 방사능활성의 평균값 (cpm)을 나타낸다. 시험을 3중으로 수행하였고, 시험 결과로부터 특정 클롬 방출률의 평균값과 표준편차를 산출하였고, 이것은 항체의 ADCC 활성을 반영한다.
(4) 시험 항체의 ADCC 활성의 평가
시험 항체를 통한 인간 PBMC에 의해 나타난 ADCC 활성의 평가 결과는 시험 항체 모두가 ADCC 활성을 나타낸다는 것을 보인다. 이 결과를 도 13에 나타내었다. 유의차 검정은 항체의 특정 크롬 방출률에서 시험된 항체와 대조 HOLO 항체 사이에 시험된 어느 농도에서 유의차가 관찰되지 않았다는 것을 보인다. 통계적 분석은 SAS 전임상 패키지(SAS Institute Inc.)를 사용하여 수행하였다. 시험 결과는 pI-개변 시험 항체의 ADCC 활성 간에 차이가 없다는 것을 나타낸다.
실시예 13
불변영역의 pI 값에서 감소 능력이 있는 개변 항체의 제조 및 평가
(1) 불변영역의 pI 값의 감소를 위한 개변 부위의 선택
IgG1△GK (SEQ ID NO:32)는 SEQ ID NO:31에 나타낸 바와 같은 아미노산을 갖는 IgG1 불변영역이고, 이것은 IgG1 불변영역의 (EU 번호표기에 따라) 446번째 Gly 및 447번째 Lys가 부족하다. 이들 두 아미노산 잔기의 부족은 항체의 중사슬 터미날 불변영역에 기인한 이질성의 감소를 가져온다.
항체는 불변영역에서 감소된 pI 값을 갖도록, IgG1△GK의 아미노산 잔기의 몇몇을 EU 번호표기에 따른 인간 IgG4 불변영역의 서열에서의 상응하는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 개변되었다.
특히, (EU 번호표기에 따른) IgG1△GK의 68번째 히스티딘 (H)은 IgG4 서열의 글루타민 (Q)으로 대체되었고, 274 번째 리신(K)은 글구타민 (Q)으로 대체되었고, 355 번째 아르기닌(R)은 글루타민 (Q)으로 대체되었고, 356 번째 아스파르트산 (D)는 글루타민산 (E)으로 대체되었고, 358번째 로이신 (L)은 메티오닌 (M)으로 대체되었고, 그리고 419 번째 글루타민 (Q)은 글루타민산 (E)으로 대체되었다. 이들 치환물들은 인간 불변영역으로부터만 유래되는 T-세포로서 작용할 수 있는 9~12 아미노산의 서열을 함유하고, 그러므로 낮은 면역원성 위험을 가질 것으로 예측된다. 이들 6개의 개변을 IgG1△GK에 도입하여 M85 (SEQ ID NO:33)을 얻었다.
불변영역 M85을 가변영역 pH7 및 H0와 결합하여 각각 pH7M85 (SEQ ID NO:34) 및 H0M85 (SEQ ID NO:35)을 제조하였다. H0M85L0 항체는 중사슬로서 H0M85 및 경사슬로서 L0 로부터 제조하였고, pH7M85pL16 항체는 중사슬로서 pH7M85 및 경사슬로서 pL16로부터 제조하였다. 또한, IgG1의 불변영역을 갖는 H0L0 항체 및 pH7pL16 항체를 실시예 1 및 실시예 8과 같이 제조하였다. 항체 H0M85L0, pH7M85pL16,H0L0, 및 pH7pL16를 FTP-KO 세포주 또는 HEK293 세포에서 발현하였고, 실시예 1 또는 9에 기재된 바와 같이 정제하였다.
(2) 불변영역 pI 개변항체의 pI 값의 측정
H0L0 항체, H0M85L0 항체, pH7pL16 항체, 및 pH7M85pL16 항체의 pI 값을, 실시예 1에 기재된 것과 유사한 방법을 사용하는 동일한 전기영동 조건하에서 PhastGel IEF 4-6.5 (GE Healthcase)을 사용하는 전기영동에 의해 평가하였다. H0L0 항체, H0M85L0 항체, pH7pL16 항체 및 pH7M85pL16 항체의 pI 값은 각각 8.85, 8.16, 6.52 및 5.78이었고, 이것은 불변영역에서의 개변이 항체의 면역원성에 대한 영향없이 pI값의 추가의 감소에 기여한다는 것을 나타낸다.
(3) 경쟁 ELIS에 의한 불변영역 pI 개변 항체의 결합 활성의 평가
각각의 불변영역 pI 개변 항체의 항원에 대한 결합 활성을 실시예 1에 기재된 방법을 사용하여 측정하였다(도 14). H0L0 항체, H0M85L0 항체, pH7pL16 항체, pH7M85pL16 항체의 글리피칸 3에 대한 결합 활성은 거의 동일한 것으로 나타났다.
실시예 14
작동세포로서 인간 말초 혈액 단구체를 사용하는 불변영역 pI 개변 항체의 ADCC 활성
pH7pL16 항체 및 pH7M85pL16 항체의 ADCC 활성을 실시예 12에 기재된 방법을 사용하여 시험하였다. 그 결과를 도 15에 나타내었다. 유의차 검정은 시험 항체의 특정 크롬 방출률에서 시험된 어느 농도에서 시험 항체들 간에 유의차가 관찰되지 않았다는 것을 보인다. 통계적 분석은 SAS 전임상 패키지(SAS Institute Inc.)를 사용하여 수행하였다. 시험 결과는 pH7pL16 항체와 pH7M85pL16 항체의 ADCC 활성 간에 차이가 없다는 것을 나타낸다.
SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> ANTI-GLYPICAN-3 ANTIBODY HAVING IMPROVED KINETICS IN PLASMA <130> PCG-9023WO <150> JP 2007-256063 <151> 2007-09-28 <160> 35 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 1 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 2 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 3 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 4 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 4 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asn Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 5 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 5 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 6 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody H chain <400> 6 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asn Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 7 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 7 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 8 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 8 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 9 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 9 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 10 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 10 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 11 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 11 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 12 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Humanized antibody L chain <400> 12 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 13 <211> 545 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 13 Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser 1 5 10 15 Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro 20 25 30 Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys 35 40 45 Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn 50 55 60 Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile 65 70 75 80 Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg 85 90 95 His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser 100 105 110 Leu Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val 115 120 125 Ser Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn 130 135 140 Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn 145 150 155 160 Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly 165 170 175 Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met 180 185 190 Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala 195 200 205 Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe 210 215 220 Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr 225 230 235 240 Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val 245 250 255 Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp 260 265 270 Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg 275 280 285 Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His 290 295 300 Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr 305 310 315 320 Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala 325 330 335 Tyr Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala 340 345 350 His Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile 355 360 365 Gln Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr 370 375 380 Ile Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn 385 390 395 400 Gly Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly 405 410 415 Met Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu 420 425 430 Pro Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu 435 440 445 Leu Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu 450 455 460 Asp Glu Glu Gly Phe Glu Ala Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu 465 470 475 480 Cys Ile Gly Gly Ala Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu 485 490 495 Arg Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro 500 505 510 Gly Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp Asn Glu Ile Ser Thr Phe 515 520 525 His Asn Leu Gly Asn Val His Ser Pro Leu Lys His His His His His 530 535 540 His 545 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 ggatcctgcg catgaaaaag cctgaactca cc 32 <210> 15 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 gcggccgcct attcctttgc cctcggacg 29 <210> 16 <211> 10939 <212> DNA <213> Cricetulus griseus <400> 16 gagctcaatt aaccctcact aaagggagtc gactcgatcc tttacagaaa acttgcaaac 60 cctcttggag tagaaaagta gtagtatctg acacaagtat cagcaaaatg caaacttctc 120 cccatcccca gaaaaccatt ataaaaaccc ccatatctta tgcccaactg tagtgatata 180 ttatttatga tttattaaaa cttgcttaag gattcagaaa gcaaagtcag ccttaagcta 240 tagagaccag gcagtcagtg gtggtacaca cctttaatcc caggactcag gattaagaag 300 tagacggacc tctgttagtt caagtctacc attacctaca caagagtgaa gagtaaccga 360 tctcatgcct ttgatcccag cagctgggat catgtgcatt caatcccagc attcgggagt 420 tatataagac aggagcaagg tctcagagct ggcattcatt ctccagccac attgaggata 480 ggaaaacatt gaagtgtcag gatgctgagg agaggcagca gtttgaggtt tggtagaacc 540 aggatcacct tttggtctga ggtagagtaa gaactgtggc tggctgcttt gcttttctga 600 tcttcagctt gaagcttgaa ctccaatatt tgtctctggg tctattatta tcatgttaca 660 cctaacttta aagctgattt acgcaagaca gttgtaggtg gacctttctt tcctgcccac 720 cagttcccaa ataactgaca cggagactca atattaatta taaatgattg gttaatagct 780 cagtcttgtt actggctaac tcttacattt taaattaact catttccatc cctttacttg 840 ctgccatgtg gttcatggct tgttcaagtc ctgcttcttc tgtctctggc tggtgatgcc 900 tctggttctg ccctttatcc cagaattctc ctagtctggc tctcctgccc agctataggc 960 cagtcagctg tttattaacc aatgagaata atacatattt atagtgtaca aagattgctc 1020 ctcaacaccc aattttttat gtgcaacctg agaatctgga ctcattgccc tcatgcttgc 1080 agaggcggca cccttaccca ctaagccacc tttctagccc tgttgctttt gttttttgag 1140 acaggttcca ctatgtagcc caggctggcc tcaaactgac cattctcctg cctaaacctc 1200 ccgaacactg gaattatagt caaggcctac ctgccctggc attttcacac ttttatttcc 1260 tggctgagtc cattgacttt acactcatca aggttgaacc agttggagtt taattacagt 1320 gccaatcgca ctgaatccca cataatcaaa caacttcaag gaagcaaaaa accagttttt 1380 cctgaagatc aatgtcagct tgcctgattc agaatagacc cccgaaaaaa ggcaaatgct 1440 tgataaccaa tttcttctta ttgttcaatc ccctgctgct gtgtgtaagc tcctgagaaa 1500 ggacagtaag gggacattca tgatcagaga aagagcccca actccccccc cagccccacc 1560 cccaccctgt ccacagtctg ttggtttggt ttccccctgg ctgacaccca gaaatcacaa 1620 cataatcacc taggtcactg taacaagttc ctttctggaa aatgctacaa atgatattgg 1680 taacatgagt aatgaataat gcctggagtc caactccctt gtgacccagc aatgttttcc 1740 gtgggtgctc ccttccccag ctgcaggcct gacatgtacc ttaaaaagcc tcccctggag 1800 gacagaattt tgtgggtact atagtgttct cacaaatact tcccctaata cccttactta 1860 gttaccataa ataacatgca gcccctggtg aggcacacag ggctccaatg tacagcttct 1920 cagacactgc aggaaccttc ctctcctaat gcagcactgg tctcttcagg ctggacagca 1980 ggaacccata ccactccaat cctagtgtgg agtagagctg tctacgaaaa ccagcagatc 2040 tatagctaaa tgtgtttcaa ttttatgctt tgacaaattg tactgacccc acccccaccc 2100 cttccccctt gctgtgctgg gaattgaacc caggaccttg tgcatgccag gcaagtactc 2160 taacactgag ctatagcccc aatctttcat ccaagtctct atgtgtgccc acactcgctt 2220 tttattttga gacaaaaggt tcttattttg agataaggtc tcactatgtt gccttgactt 2280 tttttttttt ttttttttga acttttgacc ttcctacctc agctgagact acaagtcttt 2340 taccatcagg cccggctgat ggtaaaataa cagtatttga aatagtttaa acacatcatc 2400 ttaatggtca accacacaat ttccgaaatg ttgctggctc agtctggggc aaacctgtcc 2460 gccccaacat tggtgctagg aagaaagcac agacaagtag ccctcccagc tcaggagtaa 2520 aagacctgga gggggtggcc cacttcggtc aagttcacgg gatggggagg ggtaccctcc 2580 tccagtagtg gtggtatttg gcagttcctc caccgacgcc ctctggaagc acctgcttgg 2640 acccgcaaag ccaggaatgc agcttcctca agggactcgc cagcgagggt aacaggacag 2700 aggcgtccca agagggctgg ggcggaaggg ggaagacagg gtcggcctta gatagggcaa 2760 agggccttct ggctgtgttc ccggggtaac cgccccacca cgcctggagc ccgacgtggc 2820 gagcgatggg gacagcgagc aggaagtcgt actggggagg gccgcgtagc agatgcagcc 2880 gagggcggcg ctgccaggta cacccgaggg caccgcgggg gtgagcgcca ggtccctgaa 2940 ccagccaggc ctccagagcc gagtccggcg gaccgacggt acgttctgga atgggaaggg 3000 atccgggaca ccgaattgct gcattgaggg gctcagaggt tctgatgtgg gagtccagaa 3060 agggttttat ctaccggagg tgatgtgact tccggcctct ggaagtgctg ttggagtctc 3120 tgggaccttg ggtcctctcg actaggtttg gaaggggtga aataggggta gggagaaagg 3180 agaggactgc agcaatgtct tcccgaacga cctgggttcg ggaggggtcg aaggacaagg 3240 ggctgttgtg gggggtcttc agacgcggag gggtggtatt ctattttctg ggaagatggt 3300 gtcgatgcac ttgaccaagt ctagtcgatc tgaagaggct aggggaacag acagtgagag 3360 aggatggtgg agggagtggc agaacccttc cagaaactgg gagaggctct agcacctgca 3420 accccttccc tggcctccgg ggagtcccag aagagggcag gaccatggac acaggtgcat 3480 tcgtgccggc gcgctccggc ctggcgaagg tgcgcgctct tggaggccgc gggagggcca 3540 gacgcgcgcc cggagagctg gccctttaag gctacccgga ggcgtgtcag gaaatgcgcc 3600 ctgagcccgc ccctcccgga acgcggcccg agacctggca agctgagacg gaactcggaa 3660 ctagcactcg gctcgcggcc tcggtgaggc cttgcgcccg ccatgcctct gtcattgccc 3720 ctcgggccgc ctccctgaac ctccgtgacc gccctgcagt cctccctccc ccccttcgac 3780 tcggcgggcg cttccgggcg ctcccgcagc ccgccctcca cgtagcccac acctccctct 3840 cggcgctccg cttcccacgc ggtccccgac ctgttctttc ctcctccacc ctgcccttct 3900 gtccctctcc cttcctttct cccctcgact cgtccctatt aggcaacagc ccctgtggtc 3960 cagccggcca tggctgtcaa ggctcacacc cttagctagg ccccttctcc cttccctggg 4020 tcttgtctca tgaccccctg ccccgcccgg gagcgagcgc gatgtggagc agtgcctctg 4080 gcaagcagaa cttcacccaa gccatgtgac aattgaaggc tgtaccccca gaccctaaca 4140 tcttggagcc ctgtagacca gggagtgctt ctggccgtgg ggtgacctag ctcttctacc 4200 accatgaaca gggcccctct gaagcggtcc aggatcctgc gcatggcgct gactggaggc 4260 tccactgcct ctgaggaggc agatgaagac agcaggaaca agccgtttct gctgcgggcg 4320 ctgcagatcg cgctggtcgt ctctctctac tgggtcacct ccatctccat ggtattcctc 4380 aacaagtacc tgctggacag cccctccctg cagctggata cccctatctt cgtcactttc 4440 taccaatgcc tggtgacctc tctgctgtgc aagggcctca gcactctggc cacctgctgc 4500 cctggcaccg ttgacttccc caccctgaac ctggacctta aggtggcccg cagcgtgctg 4560 ccactgtcgg tagtcttcat tggcatgata agtttcaata acctctgcct caagtacgta 4620 ggggtggcct tctacaacgt ggggcgctcg ctcaccaccg tgttcaatgt gcttctgtcc 4680 tacctgctgc tcaaacagac cacttccttc tatgccctgc tcacatgtgg catcatcatt 4740 ggtgagtggg gcccgggggc tgtgggagca ggatgggcat cgaactgaag ccctaaaggt 4800 caacactgta ggtaccttta cttactgtcc caggtccctt gcatcagcag ttacaggaag 4860 agccctgtag aaaacaaata acttccttat ggtcattcaa caagttaggg acccagccag 4920 ggtgaaaata atgttagcag caactacagc aaagatggct ctcgccactt gcatgattaa 4980 aatgtgccag gtactcagat ctaagcattg gatccacatt aactcaacta atccctatta 5040 caaggtaaaa tatatccgaa ttttacagag ggaaaaccaa ggcacagaga ggctaagtag 5100 cttgaccagg atcacacagc taataatcac tgacatagct gggatttaaa cataagcagt 5160 tacctccata gatcacacta tgaccaccat gccactgttc cttctcaaga gttccaggat 5220 cctgtctgtc cagttctctt taaagaggac aacacatctg acattgctac cttgaggtaa 5280 catttgaaat agtgggtaga catatgtttt aagttttatt cttacttttt atgtgtgtgt 5340 gtttgggggg ccaccacagt gtatgggtgg agataagggg acaacttaag aattggtcct 5400 ttctcccacc acatgggtgc tgaggtctga actcaggtca tcaggattgg cacaaatccc 5460 tttacccact gagccatttc actggtccaa tatatgtgtg cttttaagag gctttaacta 5520 ttttcccaga tgtgaatgtc ctgctgatca ttatcccctt ttacccggaa gccctctggg 5580 aggtgccatc cctgtggtcg tctgcataca aatggggaaa ctgcaactca gagaaacaag 5640 gctacttgcc agggccccac aagtaagata ggctgggatg ccatcccaga ctggccacac 5700 tccctggcct gtgcttcaag ccagtttact ttgttcctgc ccattggaag ttagcatgtt 5760 gcagtcaaac acaataacta caggccaaaa gtgcttttaa attaaagtca gatgaacttt 5820 taaacatcca gagctcctca actgcaggag ttacaacctg attctgcaac catctttgca 5880 gtgcccggta gtcatatgta gctagaggct cttggctagg acagcatgtg ttaggaaaca 5940 tctggccctg agatcattga attgagtgac tgctgggtga caaagaccaa ggcatccgtt 6000 ccctgagagt cctgggcaag cagcaatgtg accttcattt gtacctactc aggttcttta 6060 tctgtcctgt ttgacctact tagtctcctc tggtgtctca gaggcccagg ctgggtactc 6120 tggatgtcag gatcaggcca atgcgcacat ctgccctaga aatgtccccc tggttgagca 6180 gctcctgaat ccatcggtaa agggtctgga ccagggagga gtcagataaa aagctgacag 6240 cactggggga ctccatgggg aactcccacc tgcccccaca catccatcct aagagaactg 6300 gtattccttg tttcctcttt gtcctacaag gcaccctggg atcccacttc agtctcccag 6360 ccttgccagg gttagagggc atgagcctcc ttgtggggaa tttagatgca agaaggtaca 6420 gtcactagag aacctgagct cagatcccca aagtaaccag tacctgatag tgaggcagct 6480 gagaaccgca gcagcctgcc tgagtggctg aactctgcgg cctccggaac tggccccaac 6540 tgttgggtct cctcttcctt cctcctgtga gggagggccc atctctgata agtgctgtgg 6600 ggactctaga gtagggagga ggaggagcaa tctaagcagg ccttactgag aagtccttgc 6660 tggcatgtgg ctgcctgagg agtacagact gggaacaccc atttgaatga gtaaggtttt 6720 tcctgaaggc catggggagc cacggaggaa aatcatttta gttacaagac aaagagtaga 6780 ttggttaaca tgggagcaag gacatggccc caattttcat agatgaagga aattggaact 6840 cagagaggtt aagtaacttc tcccaaatag ctcagcttca aaatcacaga acagtcagag 6900 tctagatctc tctgatgcct gtgatggtcc tgccattcca tgttgctgat ccctgtggca 6960 tcagtaagcc tctaccttgt gggaatgcag gatctaaatg aagagaggaa gtgctggccc 7020 catgctgtgg tctggaaagc tatgcaggct ctttgagcag agagtgaccc acaagtgaat 7080 agagtcctat gagactcaaa gcaacatcca cccttaagca gctctaacca aatgctcaca 7140 ctgagggagc caaagccaag ttagagtcct gtgcttgccc aaggtcactt tgcctggccc 7200 tcctcctata gcacccgtgt tatcttatag ccctcattac agtgattaca attataatta 7260 gagaggtaac agggccacac tgtccttaca cattcccctg ctagattgta gctgggagag 7320 ggggagatgt aggtggctgg gggagtggga gggaagatgc agattttcat tctgggctct 7380 actccctcag ccattttttg gtgtgggagt tagactttgg atatgttgat gatgaggtaa 7440 gggccacaga acagtctgaa ctgtggtatc agaatcctgt ccctctccct ctctcctcat 7500 ccctcttcac cttgtcactc ctctgtctgc tacaggtggt ttctggctgg gtatagacca 7560 agagggagct gagggcaccc tgtccctcat aggcaccatc ttcggggtgc tggccagcct 7620 ctgcgtctcc ctcaatgcca tctataccaa gaaggtgctc ccagcagtgg acaacagcat 7680 ctggcgccta accttctata acaatgtcaa tgcctgtgtg ctcttcttgc ccctgatggt 7740 tctgctgggt gagctccgtg ccctccttga ctttgctcat ctgtacagtg cccacttctg 7800 gctcatgatg acgctgggtg gcctcttcgg ctttgccatt ggctatgtga caggactgca 7860 gatcaaattc accagtcccc tgacccacaa tgtatcaggc acagccaagg cctgtgcgca 7920 gacagtgctg gccgtgctct actatgaaga gactaagagc ttcctgtggt ggacaagcaa 7980 cctgatggtg ctgggtggct cctcagccta tacctgggtc aggggctggg agatgcagaa 8040 gacccaagag gaccccagct ccaaagaggg tgagaagagt gctattgggg tgtgagcttc 8100 ttcagggacc tgggactgaa cccaagtggg gcctacacag cactgaaggc ttcccatgga 8160 gctagccagt gtggccctga gcaatactgt ttacatcctc cttggaatat gatctaagag 8220 gagccagggt ctttcctggt aatgtcagaa agctgccaaa tctcctgtct gccccatctt 8280 gttttgggaa aaccctacca ggaatggcac ccctacctgc ctcctcctag agcctgtcta 8340 cctccatatc atctctgggg ttgggaccag ctgcagcctt aaggggctgg attgatgaag 8400 tgatgtcttc tacacaaggg agatgggttg tgatcccact aattgaaggg atttgggtga 8460 ccccacacct ctgggatcca gggcaggtag agtagtagct taggtgctat taacatcagg 8520 aacacctcag cctgcctttg aagggaagtg ggagcttggc caagggagga aatggccatt 8580 ctgccctctt cagtgtggat gagtatggca gacctgttca tggcagctgc accctggggt 8640 ggctgataag aaaacattca cctctgcatt tcatatttgc agctctagaa cgggggagag 8700 ccacacatct tttacgggtt aagtagggtg atgagctcct ccgcagtccc taaccccagc 8760 tttacctgcc tggcttccct tggcccagct acctagctgt actccctttc tgtactcttc 8820 tcttctccgt catggcctcc cccaacacct ccatctgcag gcaggaagtg gagtccactt 8880 gtaacctctg ttcccatgac agagcccttt gaatacctga acccctcatg acagtaagag 8940 acatttatgt tctctggggc tggggctgaa ggagcccact ggttctcact tagcctatct 9000 ggctcctgtc acaaaaaaaa aaaaagaaaa aaaaaaagca taaaccaagt tactaagaac 9060 agaagttggt ttataacgtt ctggggcagc aaagcccaga tgaagggacc catcgaccct 9120 ctctgtccat atcctcatgc tgcagaagta caggcaagct cctttaagcc tcatatagga 9180 acactagcct cactcatgag ggttttactc catgacctgt caacctcaaa gccttcaaca 9240 tgaggactcc aacgtaaatt tggggacaga agcactcaga ccatacccca gcaccacacc 9300 ctcctaacct cagggtagct gtcattctcc tagtctcctc tcttgggcct ttagaacccc 9360 catttccttg gggtaatgtc tgatgttttt gtccctgtca taaaaagatg gagagactgt 9420 gtccagcctt tgattcctac ttcctacaat cccaggttct aatgaagttt gtggggcctg 9480 atgccctgag ttgtatgtga tttaataata aaaaagcaag atacagcatg tgtgtggact 9540 gagtgagggc cacagggatc taaaagccaa gtgtgagggg acccagctac agcaggcagc 9600 atcctgagcc tggaatctct tcaggacaag aattctccat atacctacct actctgggga 9660 gtaggtggcc agagttcaag cttcccttag taccaactac cactggctgt gctcttactg 9720 aaggcagaca tggcactgag tgctgtccat ctgtcactca tctccacagc cattcctaat 9780 gtgtggggtg ggagccatca ccaaacccca ttttcagata aggacacagg ctcagagagg 9840 cttgtgtgga gaaaagtagc agcagaattc agagagctgg gtctcctgca gcaccttgga 9900 ctgccagcag ccacagtgct tgtcacacag cacatactca aaagaatgcc agccccctca 9960 gcctagagtg cctggccttt ctttcagatg aggaagaggg tcaaagctgt tagcttgccc 10020 accatatgac cacatacatg accaacagct tgagggaggg aggattactg tggctcccag 10080 cctgagaggt gggacaccca aatgtattag gtccttgaat cagggctgac cttgtgattc 10140 agtcactcct accagaatgc tggggaatgg ggatgccaaa ggcaaaggag gctttctaag 10200 gtgtggtgta agataggcat ttctgcttcc atgtacacct gtgagcagag taggaaggcc 10260 ctgtggagaa tatatcccac aaaccagtag cccttcctgg cagtgggtga atactgccac 10320 cctatacccc tatgcaaggc cagtagaacc acccaaccca caacatctag agaaattaca 10380 ggtcatctta agcctctaaa ttgtggagaa actcgacatg cgcacgattc ctaacctgct 10440 agcctagggt gcggggtgga taatttaagg aaactggggt ttcttataga atcggaggct 10500 ccatgaagtc accctgacaa gaggtcagca atagccagca gcagtggcta ctcctaagcc 10560 tccagacaga gcaccctgtg aatgtacctt attctcacat ctgggtgtct ataggtgtga 10620 ctgggtcaga tgtcacccag gccattgcaa tgggccctta gccccatggg gtgttgggat 10680 agcagccaag cagctcccat gctgagatac tgcctgcagt agactgatgg ataagaaaac 10740 aaggcccaaa atgttttctt tccagacttg atctttcttt gttcaaaaat gctgttttcc 10800 cttaaacttg cccaaaccca ttgttttgca gttgaggaaa ataaggcata gaaagattaa 10860 aggaagtttc tgaggttaca gagcaaagta ctggcttcac ctgaaataga caggtgtgcc 10920 ctgatcctga tttgagctc 10939 <210> 17 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 atgcatgcca ccatgaaaaa gcctgaactc acc 33 <210> 18 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 ggatcccagg ctttacactt tatgcttc 28 <210> 19 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gctgtctgga gtactgtgca tctgc 25 <210> 20 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggaatgcagc ttcctcaagg gactcgc 27 <210> 21 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 tgcatcaggt cggagacgct gtcgaac 27 <210> 22 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 gcactcgtcc gagggcaaag gaatagc 27 <210> 23 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 tgtgctggga attgaaccca ggac 24 <210> 24 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 ctacttgtct gtgctttctt cc 22 <210> 25 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ctcgactcgt ccctattagg caacagc 27 <210> 26 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 tcagaggcag tggagcctcc agtcagc 27 <210> 27 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 27 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 28 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 29 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 29 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15 Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Gln Ala Ser Glu Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asn Arg Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Glu 100 105 110 <210> 30 <211> 327 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 30 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg 1 5 10 15 Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr 65 70 75 80 Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Ser Cys Pro Ala Pro 100 105 110 Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys 115 120 125 Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val 130 135 140 Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp 145 150 155 160 Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe 165 170 175 Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp 180 185 190 Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu 195 200 205 Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg 210 215 220 Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys 225 230 235 240 Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp 245 250 255 Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys 260 265 270 Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser 275 280 285 Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser 290 295 300 Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser 305 310 315 320 Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys 325 <210> 31 <211> 330 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 31 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 32 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 32 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 225 230 235 240 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 33 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 33 Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15 Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30 Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45 Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60 Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140 Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp 145 150 155 160 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu 225 230 235 240 Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255 Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn 260 265 270 Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285 Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn 290 295 300 Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr 305 310 315 320 Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 325 <210> 34 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 34 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Thr Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Glu Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Glu Ser Phe 50 55 60 Gln Asp Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440 <210> 35 <211> 443 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Modified antibody <400> 35 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 115 120 125 Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val 130 135 140 Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala 145 150 155 160 Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly 165 170 175 Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly 180 185 190 Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys 195 200 205 Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys 210 215 220 Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu 225 230 235 240 Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu 245 250 255 Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln 260 265 270 Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys 275 280 285 Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu 290 295 300 Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys 305 310 315 320 Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys 325 330 335 Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser 340 345 350 Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 355 360 365 Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln 370 375 380 Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln 405 410 415 Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn 420 425 430 His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro 435 440

Claims (65)

  1. 혈장 중 반응속도가 제어된 항-글리피칸 3 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항-글리피칸 3 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서 항-글리피칸 3 항체는 항체의 표면에 노출될 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기의 전하가 개변되도록 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
    (b) 항-글리피칸 3 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 혈장 반응 속도의 제어는 혈장 반감기, 평균 혈장 체류시간, 및 혈장 제거로부터 선택되는 계수의 증가 또는 감소인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항-글리피칸 3 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는 FcRn 결합 영역 이외의 항-글리피칸 3 항체의 영역에 위치하는 것인 방법.
  5. 제4항에 있어서, FcRn 결합 영역은 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  6. 제4항에 있어서, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기에 따른 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는 IgG 항체인 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 중사슬 가변영역 또는 경사슬 가변영역에 존재하는 아미노산 잔기인 방법.
  9. 제8항에 있어서, 항-글리피칸 3 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역 (FR), 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하고, 여기서 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 CDR 또는 FR에서 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 중 하나 이상을 그 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 이루어지는 것인 방법.
  10. 제9항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
    (1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중사슬 가변영역의 하나 이상의 치환:
    (a) 43번째 아미노산 잔기인 Q를 K로 치환,
    (b) 52번째 아미노산 잔기인 D를 N으로 치환, 및
    (c) 107번째 아미노산 잔기인 Q를 R로 치환;
    및/또는
    (2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7에 나타낸 경사슬 가변영역의 하나 이상의 치환:
    (d) 17번째 아미노산 잔기인 E를 Q로 치환,
    (e) 27번째 아미노산 잔기인 Q를 R로 치환, 및
    (f) 105번째 아미노산 잔기인 Q를 R로 치환.
  11. 제9항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
    (1) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 1에 나타낸 중사슬 가변영역의 하나 이상의 치환:
    (a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
    (e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
    (f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
    및/또는
    (2) 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역의 하나 이상의 치환:
    (g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
    (k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환.
  12. 제11항에 있어서, SEQ ID NO: 31로 나타내는 중사슬 불변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 개변을 더욱 포함하는 것인 방법:
    (a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
    (b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
    (c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
    (e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
    (f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환.
  13. 제9항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 여기서 항-글리피칸 3 항체는 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 것인 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 항-글리피칸 3 항체.
  15. 혈장 중 반응속도가 제어된 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항체는 FcRn 결합 영역 이외의 항체의 불변영역에서 하나 이상의 아미노산 잔기의 전하가 개변되도록 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
    (b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 것인 제조방법.
  16. 제15항에 있어서, 혈장 중 반응속도의 제어는 혈장 반감기, 평균 혈장 체류시간 및 혈장 제거로부터 선택되는 계수의 증가 또는 감소인 방법.
  17. 제15항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법.
  18. 제17항에 있어서, 항체는 IgG 항체인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 항체는 IgG1 항체인 방법.
  20. 제17항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 IgG1 항체의 아미노산 잔기 중 하나 이상을 IgG4 항체의 상응하는 아미노산 잔기로 치환함으로써 이루어지는 것인 방법.
  21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기에 따른 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 및 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
  22. 제20항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음으로부터 선택되는 SEQ ID NO: 31로 나타나는 중사슬 불변영역에서의 하나 이상의 치환에 의해 이루어지는 것인 방법:
    (a) 151번째 아미노산 H를 Q로 치환,
    (b) 157번째 아미노산 K를 Q로 치환,
    (c) 238번째 아미노산 R을 Q로 치환,
    (d) 239번째 아미노산 D를 E로 치환,
    (e) 241번째 아미노산 L을 M으로 치환, 및
    (f) 302번째 아미노산 Q를 E로 치환.
  23. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항-글리피칸 3 항체인 방법.
  24. 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역 (FR), 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 항-글리피칸 3 항체를 안정화시키는 방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항-글리피칸 3 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주 세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항-글리피칸 3 항체는 하나 이상의 아미노산 잔기의 개변에 의해 항체의 Tm값이 증가하도록 변경된 아미노산을 갖는다); 및
    (b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 방법
  25. 제24항에 있어서, 아미노산 잔기는 중사슬 또는 경사슬의 FR1 영역 및/또는 FR2 영역에 존재하는 것인 방법.
  26. 제25항에 있어서, 중사슬의 FR2 영역의 아미노산 잔기는 VH4 서브클라스의 FR2 영역의 아미노산 잔기로 치환되는 것인 방법.
  27. 제25항에 있어서, 경사슬의 FR2 영역의 아미노산 잔기는 VK3 서브클라스의 아미노산 잔기로 치환되는 것인 방법.
  28. 제24항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 아미노산 잔기의 치환은 다음으로부터 이루어지는 것인 방법:
    (1) SEQ ID NO: 1에 나타나는 중사슬 가변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환:
    (a) 37번째 아미노산 잔기 V를 I로 치환,
    (b) 40번째 아미노산 잔기 A를 P로 치환,
    (c) 48번째 아미노산 잔기 M을 I로 치환, 및
    (d) 51번째 아미노산 잔기 L을 I로 치환
    및/또는
    (2) SEQ ID NO: 7에 나타나는 경사슬 가변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환:
    (e) 42번째 아미노산 잔기 L을 Q로 치환,
    (f) 48번째 아미노산 잔기 S를 A로 치환, 및
    (g) 50번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환.
  29. 세포독성이 제어된 항체의 제조방법으로, 상기 방법은:
    (a) 항체를 암호화하는 핵산을 갖는 숙주세포를 핵산의 발현을 허용하는 조건하에서 배양하는 단계 (여기서, 항체는 세포독성 항체의 표면에 노출될 수 있는 하나 이상의 아미노산 잔기의 전하가 개변되도록 변경된 아미노산 서열을 갖는다); 및
    (b) 항체를 숙주 세포 배양물로부터 회수하는 단계를 포함하는 것인 방법.
  30. 제29항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 아미노산 치환에 의해 이루어지는 것인 방법.
  31. 제29항에 있어서, 항체의 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기는 FcRn 결합 영역 이외의 항체 영역에 위치하는 것인 방법.
  32. 제31항에 있어서, FcRn 결합 영역은 Fc 영역을 포함하는 것인 방법.
  33. 제31항에 있어서, FcRn 결합 영역은 Kabat 번호표기에 따라 EU 번호 250, 253, 310, 311, 314, 428, 435, 436의 아미노산 잔기를 포함하는 것인 방법.
  34. 제29항에 있어서, 항체는 IgG 항체인 방법.
  35. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 항체의 불변영역의 아미노산 잔기인 방법.
  36. 제29항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 전하가 개변된 아미노산 잔기는 항체의 중사슬 가변영역 또는 경사슬 가변영역에 존재하는 아미노산 잔기인 방법.
  37. 제36항에 있어서, 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역 (CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역, 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하는 항체이고, 여기서 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 CDR 또는 FR에서 항체 표면에 노출될 수 있는 아미노산 잔기의 하나 이상을 그 아미노산 잔기의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 이루어지는 것인 방법.
  38. 제37항에 있어서, 아미노산 잔기의 전하의 개변은 다음에 의해 이루어지는 것인 방법:
    (1) SEQ ID NO: 1로 나타내는 중사슬 가변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환:
    (a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
    (e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
    (f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
    및/또는,
    (2) SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환:
    (g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
    (k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환.
  39. 제38항에 있어서, SEQ ID NO: 31로 나타내는 중사슬 불변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 더욱 포함하는 것인 방법:
    (a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
    (b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
    (c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
    (e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
    (f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환.
  40. 제36항에 있어서, 항체는 비-인간 동물로부터 유래된 상보성-결정 영역(CDR), 인간으로부터 유래된 골격 영역(FR) 및 인간으로부터 유래된 불변영역을 포함하고, 그리고 여기서 아미노산 잔기의 전하의 개변은 항체의 불변영역에서 항체 표면상에 노출될 수 있는 아미노산 중 하나 이상을 그 아미노산의 전하와 다른 전하를 갖는 아미노산 잔기로 치환함에 의해 이루어지는 것인 방법.
  41. 제40항에 있어서, 치환은 SEQ ID NO:31로 나타내는 중사슬 불변영역에서 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환인 방법:
    (a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
    (b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
    (c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
    (e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
    (f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환.
  42. 제37항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 항체는 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 것인 방법.
  43. 제29항 내지 제42항 중 어느 한 항에 따른 방법으로 제조된 항체.
  44. 제43항에 있어서, 상기 항체는 항-글리피칸 3 항체인 항체.
  45. 다음을 포함하는 항체:
    (1) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO:1에 나타나는 중사슬 가변영역:
    (a) 19번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (b) 43번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (c) 62번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (d) 63번째 아미노산 잔기 K를 S로 치환,
    (e) 65번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환, 및
    (f) 66번째 아미노산 잔기 G를 D로 치환;
    및/또는
    (2) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 적어도 하나의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 7에 나타나는 경사슬 가변영역:
    (g) 24번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (h) 27번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환,
    (i) 79번째 아미노산 잔기 K를 T로 치환,
    (j) 82번째 아미노산 잔기 R을 S로 치환, 및
    (k) 112번째 아미노산 잔기 K를 E로 치환.
  46. 제45항에 있어서, SEQ ID NO: 3에 나타내는 중사슬 및 SEQ ID NO: 9에 나타내는 경사슬을 포함하는 항체.
  47. 제45항에 있어서, SEQ ID NO: 5에 나타내는 중사슬 및 SEQ ID NO: 11에 나타내는 경사슬을 포함하는 항체.
  48. 제45항에 있어서, SEQ ID NO: 27에 나타낸 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 28에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체.
  49. 제45항에 있어서, SEQ ID NO: 27에 나타낸 중사슬 가변영역 및 SEQ ID NO: 29에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체.
  50. 제45항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체의 불변영역을 포함하는 항체.
  51. 제50항에 있어서, 불변영역은 SEQ ID NO: 32 또는 SEQ ID NO: 33에 나타낸 서열을 포함하는 것인 항체.
  52. 다음을 포함하는 항체:
    (1) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 SEQ ID NO:1으로 나타내는 중사슬 가변영역:
    (a) 43번째 아미노산 잔기 Q를 K로 치환,
    (b) 52번째 아미노산 잔기 D를 N으로 치환, 및
    (c) 107번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환;
    및
    (2) 아미노산 서열이 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 SEQ ID NO: 7로 나타내는 경사슬 가변영역:
    (d) 17번째 아미노산 잔기 E를 Q로 치환,
    (e) 27번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환, 및
    (f) 105번째 아미노산 잔기 Q를 R로 치환.
  53. 제52항에 있어서, SEQ ID NO: 4에 나타낸 중사슬 가변영역과 SEQ ID NO: 10에 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 것인 항체.
  54. 제52항에 있어서, SEQ ID NO: 6에 나타낸 중사슬 가변영역과 SEQ ID NO:12로 나타낸 경사슬 가변영역을 포함하는 항체.
  55. 제 52항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 항체의 불변영역을 포함하는 항체.
  56. SEQ ID NO: 31에 나타낸 중사슬 불변영역의 아미노산 서열에 다음으로부터 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 항체:
    (a) 151번째 아미노산 잔기 H를 Q로 치환,
    (b) 157번째 아미노산 잔기 K를 Q로 치환,
    (c) 238번째 아미노산 잔기 R을 Q로 치환,
    (d) 239번째 아미노산 잔기 D를 E로 치환,
    (e) 241번째 아미노산 잔기 L을 M으로 치환, 및
    (f) 302번째 아미노산 잔기 Q를 E로 치환.
  57. SEQ ID NO: 33에 나타낸 중사슬 불변영역을 포함하는 항체.
  58. 제45항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 항체의 Fc 영역에 부착된 푸코스의 함량이 감소된 항체.
  59. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 항체 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 조성물.
  60. 활성 성분으로서 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 항체를 포함하는 항암제.
  61. 제60항에 있어서, 상기 암이 간암인 항암제.
  62. 제45항 내지 제58항 중 어느 한 항에 따른 항체의 폴리펩티드를 암호화하는 핵산.
  63. 제62항에 따른 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  64. 제63항에 있어서, 상기 숙주 세포는 푸코스 운송자-결핍 동물 세포, 푸코실트란스퍼라제-결실 동물 세포, 또는 복합 분지 당사슬 수식이 개변된 동물 세포인 숙주세포.
  65. 제63항 또는 제64항에 따른 숙주 세포를 배양하고 그리고 세포 배양물로부터 폴리펩티드를 회수하는 것을 포함하는 항체의 제조방법.
KR1020107008895A 2007-09-28 2008-09-26 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체 KR20100085067A (ko)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JPJP-P-2007-256063 2007-09-28
JP2007256063 2007-09-28

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157030933A Division KR20150126724A (ko) 2007-09-28 2008-09-26 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20100085067A true KR20100085067A (ko) 2010-07-28

Family

ID=40510966

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020107008895A KR20100085067A (ko) 2007-09-28 2008-09-26 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체
KR1020157030933A KR20150126724A (ko) 2007-09-28 2008-09-26 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157030933A KR20150126724A (ko) 2007-09-28 2008-09-26 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체

Country Status (26)

Country Link
US (3) US8497355B2 (ko)
EP (3) EP2584043A3 (ko)
JP (3) JP4535406B2 (ko)
KR (2) KR20100085067A (ko)
CN (1) CN101809162B (ko)
AR (1) AR066172A1 (ko)
AU (1) AU2008305851B2 (ko)
BR (1) BRPI0817637A2 (ko)
CA (1) CA2700986A1 (ko)
CL (1) CL2008002873A1 (ko)
CO (1) CO6270266A2 (ko)
CR (1) CR11369A (ko)
DK (1) DK2196541T3 (ko)
EC (1) ECSP10010135A (ko)
ES (1) ES2394471T3 (ko)
HK (1) HK1144702A1 (ko)
IL (1) IL204754A0 (ko)
MA (1) MA31780B1 (ko)
MX (1) MX2010003158A (ko)
MY (1) MY148637A (ko)
NZ (1) NZ584769A (ko)
PE (1) PE20091218A1 (ko)
RU (2) RU2445366C2 (ko)
TW (1) TWI418363B (ko)
WO (1) WO2009041062A1 (ko)
ZA (1) ZA201002741B (ko)

Families Citing this family (74)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU2006232287B2 (en) 2005-03-31 2011-10-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for producing polypeptides by regulating polypeptide association
US20070087005A1 (en) 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4342995A2 (en) 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
MX2010003450A (es) 2007-09-26 2010-04-27 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Region constante de anticuerpo modificada.
EP3127921A1 (en) 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
MX337081B (es) * 2007-12-05 2016-02-10 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticuerpo anti-nr10 y su uso.
US8937047B2 (en) 2007-12-19 2015-01-20 General Electric Company Biokinetics of fast-clearing polypeptides
US8124725B2 (en) 2007-12-19 2012-02-28 General Electric Company PDGF-Rβ binders
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
KR102269708B1 (ko) 2008-04-11 2021-06-25 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 복수 분자의 항원에 반복 결합하는 항원 결합 분자
TWI440469B (zh) 2008-09-26 2014-06-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Improved antibody molecules
TWI646193B (zh) 2009-03-19 2019-01-01 中外製藥股份有限公司 抗體恆定區域改變體
WO2010107110A1 (ja) 2009-03-19 2010-09-23 中外製薬株式会社 抗体定常領域改変体
JP5669732B2 (ja) 2009-05-15 2015-02-12 中外製薬株式会社 抗ａｘｌ抗体
GB0914691D0 (en) 2009-08-21 2009-09-30 Lonza Biologics Plc Immunoglobulin variants
US10150808B2 (en) 2009-09-24 2018-12-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Modified antibody constant regions
US10435458B2 (en) 2010-03-04 2019-10-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody constant region variants with reduced Fcgammar binding
KR20120138241A (ko) * 2010-03-11 2012-12-24 화이자 인코포레이티드 ｐＨ 의존성 항원 결합을 갖는 항체
DK3029066T3 (da) * 2010-07-29 2019-05-20 Xencor Inc Antistoffer med modificerede isoelektriske punkter
MX355060B (es) 2010-11-17 2018-04-03 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Molecula multiespecifica de union a antigeno que tiene funcion alternativa a la funcion del factor viii de coagulacion sanguinea.
AU2011337704B2 (en) 2010-11-30 2017-06-15 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule capable of binding to plurality of antigen molecules repeatedly
WO2012132067A1 (ja) * 2011-03-30 2012-10-04 中外製薬株式会社 抗原結合分子の血漿中滞留性と免疫原性を改変する方法
KR102147548B1 (ko) 2011-02-25 2020-08-24 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 ＦｃγＲＩＩｂ 특이적 Ｆｃ 항체
KR102639563B1 (ko) * 2011-03-30 2024-02-21 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항원 결합 분자의 혈장 체류성과 면역원성을 개변하는 방법
EP3825325A3 (en) 2011-03-30 2021-10-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Retention of antigen-binding molecules in blood plasma and method for modifying immunogenicity
CN103827300A (zh) 2011-06-30 2014-05-28 中外制药株式会社 异源二聚化多肽
TW201817744A (zh) 2011-09-30 2018-05-16 日商中外製藥股份有限公司 具有促進抗原清除之ＦｃＲｎ結合域的治療性抗原結合分子
BR112014007353B1 (pt) 2011-09-30 2022-09-13 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Biblioteca de anticorpos dependentes de concentração de íon
EP3939996A1 (en) 2011-09-30 2022-01-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antigen-binding molecule promoting disappearance of antigens having plurality of biological activities
CN113416256A (zh) * 2011-11-30 2021-09-21 中外制药株式会社 包含进入细胞内以形成免疫复合体的搬运体(载体)的药物
TWI593705B (zh) 2011-12-28 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Humanized anti-epiregulin antibody and cancer therapeutic agent containing the antibody as an active ingredient
WO2013181543A1 (en) * 2012-06-01 2013-12-05 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Dept. Of Health And Human Services High-affinity monoclonal antibodies to glypican-3 and use thereof
WO2013187495A1 (ja) 2012-06-14 2013-12-19 中外製薬株式会社 改変されたFc領域を含む抗原結合分子
HRP20211641T1 (hr) 2012-07-13 2022-02-04 Roche Glycart Ag Bispecifična protutijela anti-vegf/anti-ang-2 i njihova primjena u liječenju vaskularnih očnih bolesti
TWI717591B (zh) 2012-08-24 2021-02-01 日商中外製藥股份有限公司 ＦｃγＲＩＩｂ特異性Ｆｃ區域變異體
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
EP3557260B1 (en) 2012-12-21 2022-05-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeting drug which is administered to patient responsive to gpc3-targeting drug therapy
JP6433297B2 (ja) 2012-12-27 2018-12-05 中外製薬株式会社 ヘテロ二量化ポリペプチド
KR20210130260A (ko) 2013-04-02 2021-10-29 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 Ｆｃ영역 개변체
MX2015017852A (es) 2013-06-24 2016-08-11 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agente terapeutico que comprende el anticuerpo anti-epirregulina humanizado con ingrediente activo contra el carcinoma de pulmon de celulas no pequeñas excluyendo el adenocarcinoma.
JP6534615B2 (ja) 2013-09-27 2019-06-26 中外製薬株式会社 ポリペプチド異種多量体の製造方法
MX2016006571A (es) * 2013-11-29 2016-08-05 Genentech Inc Aparatos y metodos de seleccion de anticuerpo.
US11760807B2 (en) 2014-05-08 2023-09-19 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting drug which is administered to patient responsive to GPC3-targeting drug therapy
US9926377B2 (en) 2014-05-22 2018-03-27 Genentech, Inc. Anti-GPC3 antibodies and immunoconjugates
CN106414499A (zh) * 2014-05-22 2017-02-15 基因泰克公司 抗gpc3抗体和免疫偶联物
WO2016036973A1 (en) * 2014-09-04 2016-03-10 The Trustees Of The University Of Pennsylvania Glypican-3 antibody and uses thereof
MA40764A (fr) 2014-09-26 2017-08-01 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Agent thérapeutique induisant une cytotoxicité
MY189836A (en) 2014-11-21 2022-03-11 Bristol Myers Squibb Co Antibodies against cd73 and uses thereof
EP3224341B1 (en) 2014-11-25 2021-05-19 Corning Incorporated Cell culture media extending materials and methods
EP3233921B1 (en) 2014-12-19 2021-09-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-c5 antibodies and methods of use
MA41294A (fr) 2014-12-19 2017-11-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anticorps anti-myostatine, polypeptides contenant des variants de régions fc, et procédés d'utilisation
CN114773470A (zh) 2015-02-05 2022-07-22 中外制药株式会社 包含离子浓度依赖性的抗原结合结构域的抗体，fc区变体，il-8-结合抗体及其应用
CA2972393A1 (en) 2015-02-27 2016-09-01 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Composition for treating il-6-related diseases
US11142587B2 (en) 2015-04-01 2021-10-12 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for producing polypeptide hetero-oligomer
WO2017002934A1 (ja) 2015-07-01 2017-01-05 中外製薬株式会社 Ｇｐｃ３標的治療剤が有効である患者に投与されるｇｐｃ３標的治療剤
JP7141336B2 (ja) 2015-12-25 2022-09-22 中外製薬株式会社 抗ミオスタチン抗体および使用方法
SG11201803989WA (en) 2015-12-28 2018-06-28 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Method for promoting efficiency of purification of fc region-containing polypeptide
US11072666B2 (en) 2016-03-14 2021-07-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell injury inducing therapeutic drug for use in cancer therapy
BR112018067923A2 (pt) 2016-03-15 2019-02-05 Chugai Pharmaceutical Co Ltd métodos de tratamento de cânceres usando antagonistas de ligação de eixo pd-1 e anticorpos anti-gpc3
CN105820250B (zh) * 2016-04-29 2019-04-30 中国人民解放军第四军医大学 一种抗basigin人源化抗体及其应用
CN116271014A (zh) 2016-08-05 2023-06-23 中外制药株式会社 用于预防或治疗il-8相关疾病的组合物
US11793180B2 (en) 2016-08-22 2023-10-24 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gene-modified mouse expressing human GPC3 polypeptide
MX2019006448A (es) 2016-12-01 2020-02-05 Regeneron Pharma Anticuerpos anti-pd-l1 radiomarcados para imagenes de inmuno-pet.
WO2018139623A1 (en) 2017-01-30 2018-08-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-sclerostin antibodies and methods of use
JPWO2018155611A1 (ja) 2017-02-24 2019-12-12 中外製薬株式会社 薬学的組成物、抗原結合分子、治療方法、およびスクリーニング方法
US11851486B2 (en) 2017-05-02 2023-12-26 National Center Of Neurology And Psychiatry Method for predicting and evaluating therapeutic effect in diseases related to IL-6 and neutrophils
US20200216542A1 (en) 2017-09-20 2020-07-09 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Dosage regimen for combination therapy using pd-1 axis binding antagonists and gpc3 targeting agent
EP4153630A1 (en) * 2020-05-18 2023-03-29 Bristol-Myers Squibb Company Antibody variants with improved pharmacokinetic properties
TW202220694A (zh) 2020-07-28 2022-06-01 日商中外製藥股份有限公司 含有新穎之改變型抗體、具有針套的帶針頭預填充注射器製劑
WO2023030539A1 (en) * 2021-09-06 2023-03-09 Nanjing Legend Biotech Co., Ltd. Anti-gpc3 chimeric antigen receptor and methods of use thereof
WO2023091909A1 (en) 2021-11-16 2023-05-25 Sotio Biotech Inc. Treatment of myxoid/round cell liposarcoma patients
WO2024011186A2 (en) * 2022-07-08 2024-01-11 Imaginab, Inc. Antibodies and methods of making and using same
GB202212077D0 (en) 2022-08-18 2022-10-05 Tribune Therapeutics Ab Agents that inhibit ccn ligand-induced signalling for treating disease

Family Cites Families (52)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
JPS6459878A (en) 1987-08-31 1989-03-07 Matsushita Electric Ind Co Ltd Semiconductor laser protective circuit
US5322678A (en) * 1988-02-17 1994-06-21 Neorx Corporation Alteration of pharmacokinetics of proteins by charge modification
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
ATE185601T1 (de) 1990-07-10 1999-10-15 Cambridge Antibody Tech Verfahren zur herstellung von spezifischen bindungspaargliedern
DK0814159T3 (da) 1990-08-29 2005-10-24 Genpharm Int Transgene, ikke-humane dyr, der er i stand til at danne heterologe antistoffer
DK0605522T3 (da) 1991-09-23 2000-01-17 Medical Res Council Fremgangsmåde til fremstilling af humaniserede antistoffer
ATE463573T1 (de) 1991-12-02 2010-04-15 Medimmune Ltd Herstellung von autoantikörpern auf phagenoberflächen ausgehend von antikörpersegmentbibliotheken
JPH07503132A (ja) 1991-12-17 1995-04-06 ジェンファーム　インターナショナル，インコーポレイティド 異種抗体を産生することができるトランスジェニック非ヒト動物
CA2131151A1 (en) 1992-03-24 1994-09-30 Kevin S. Johnson Methods for producing members of specific binding pairs
ES2301158T3 (es) 1992-07-24 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Produccion de anticuerpos xenogenicos.
GB9313509D0 (en) 1993-06-30 1993-08-11 Medical Res Council Chemisynthetic libraries
WO1995015388A1 (en) 1993-12-03 1995-06-08 Medical Research Council Recombinant binding proteins and peptides
US6214613B1 (en) 1993-12-03 2001-04-10 Ashai Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Expression screening vector
CA2194907A1 (en) 1994-07-13 1996-02-01 Kouji Matsushima Reshaped human antibody against human interleukin-8
EP0822830B1 (en) 1995-04-27 2008-04-02 Amgen Fremont Inc. Human anti-IL-8 antibodies, derived from immunized xenomice
AU2466895A (en) 1995-04-28 1996-11-18 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CZ399A3 (cs) * 1996-07-19 1999-06-16 Amgen Inc. Polypeptidová analoga kationaktivních polypeptidů
KR100847441B1 (ko) 1996-09-26 2008-07-21 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤 인간의 부갑상선 호르몬 관련 펩티드에 대한 항체
FR2761994B1 (fr) 1997-04-11 1999-06-18 Centre Nat Rech Scient Preparation de recepteurs membranaires a partir de baculovirus extracellulaires
RU2221809C2 (ru) 1997-10-03 2004-01-20 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Способ получения природного гуманизированного антитела
EP2270148A3 (en) * 1999-04-09 2011-06-08 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method for controlling the activity of immunologically functional molecule
GB0017635D0 (en) 2000-07-18 2000-09-06 Pharmacia & Upjohn Spa Antitumor combined therapy
US20040236080A1 (en) 2001-06-22 2004-11-25 Hiroyuki Aburatani Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
US20060088899A1 (en) * 2002-05-31 2006-04-27 Alvarez Vernon L Combination chemotherapy with chlorotoxin
WO2004023145A1 (ja) * 2002-09-04 2004-03-18 Perseus Proteomics Inc. Ｇｐｃ3の検出による癌の診断方法
ES2562177T3 (es) * 2002-09-27 2016-03-02 Xencor Inc. Variantes de Fc optimizadas y métodos para su generación
CA2502904C (en) 2002-10-15 2013-05-28 Protein Design Labs, Inc. Alteration of fcrn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US7217797B2 (en) * 2002-10-15 2007-05-15 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
WO2005117980A1 (en) 2004-06-04 2005-12-15 Pfizer Products Inc. Method for treating abnormal cell growth
DE102004032634A1 (de) 2004-07-06 2006-02-16 Sms Demag Ag Verfahren und Einrichtung zum Messen und Regeln der Planheit und/oder der Bandspannungen eines Edelstahlbandes oder einer Edelstahlfolie beim Kaltwalzen in einem Vielwalzengerüst, insbesondere in einem 20-Walzen-Sendizimir-Walzwerk
PL1674111T3 (pl) 2004-07-09 2011-04-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Przeciwciała anty-glipikan 3
JP4733042B2 (ja) 2004-08-24 2011-07-27 中外製薬株式会社 抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法
JP4455236B2 (ja) * 2004-09-02 2010-04-21 本田技研工業株式会社 芝刈機
CN101068836B (zh) 2004-10-26 2013-08-14 中外制药株式会社 糖链改变的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体
EP1829961A4 (en) 2004-12-22 2008-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd PROCESS FOR PREPARING ANTIBODY USING A CELL WHOSE FUCOSE CARRIER FUNCTION IS INHIBITED
JP2009500344A (ja) 2005-07-01 2009-01-08 メディミューン，エルエルシー マルチドメインタンパク質治療薬を製造するための統合的手法
US20070087005A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody
CA2627873A1 (en) 2005-10-31 2007-05-10 Scott Wilhelm Treatment of cancer with sorafenib
WO2007059111A2 (en) * 2005-11-14 2007-05-24 Entremed, Inc. Anti-angiogenic activity of 2-methoxyestradiol in combination with anti-cancer agents
US10155816B2 (en) * 2005-11-28 2018-12-18 Genmab A/S Recombinant monovalent antibodies and methods for production thereof
EP1982718A4 (en) 2006-02-09 2010-05-12 Daiichi Sankyo Co Ltd ANTICANCER PHARMACEUTICAL COMPOSITION
WO2007099988A1 (ja) 2006-02-28 2007-09-07 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. α-1,6-フコシルトランスフェラーゼ変異体とその用途
JP2007256063A (ja) 2006-03-23 2007-10-04 Seiko Epson Corp 表示装置、および、電子機器
JP5144499B2 (ja) 2006-03-31 2013-02-13 中外製薬株式会社 二重特異性抗体を精製するための抗体改変方法
EP4342995A2 (en) * 2006-03-31 2024-03-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
WO2007137170A2 (en) 2006-05-20 2007-11-29 Seattle Genetics, Inc. Anti-glypican-3 antibody drug conjugates
SI2178921T1 (sl) * 2007-07-17 2016-05-31 E.R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoklonska protitelesa proti glipikan-3
EP3127921A1 (en) * 2007-09-26 2017-02-08 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method of modifying isoelectric point of antibody via amino acid substition in cdr
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.

Also Published As

Publication number Publication date
CL2008002873A1 (es) 2010-02-19
IL204754A0 (en) 2010-11-30
DK2196541T3 (da) 2012-11-26
JP6101611B2 (ja) 2017-03-22
JP2014005292A (ja) 2014-01-16
EP2584043A3 (en) 2013-10-02
CN101809162A (zh) 2010-08-18
JP4535406B2 (ja) 2010-09-01
NZ584769A (en) 2011-09-30
HK1144702A1 (en) 2011-03-04
JP5382873B2 (ja) 2014-01-08
MY148637A (en) 2013-05-15
CN101809162B (zh) 2013-06-05
BRPI0817637A2 (pt) 2015-09-08
EP2196541A4 (en) 2010-11-03
US8497355B2 (en) 2013-07-30
JPWO2009041062A1 (ja) 2011-01-20
US20130295612A1 (en) 2013-11-07
RU2010125605A (ru) 2011-12-20
CO6270266A2 (es) 2011-04-20
US20150315278A1 (en) 2015-11-05
TW200930406A (en) 2009-07-16
MA31780B1 (fr) 2010-10-01
EP2584043A2 (en) 2013-04-24
TWI418363B (zh) 2013-12-11
US20100239577A1 (en) 2010-09-23
AR066172A1 (es) 2009-07-29
EP2617736A1 (en) 2013-07-24
KR20150126724A (ko) 2015-11-12
CA2700986A1 (en) 2009-04-02
ECSP10010135A (es) 2010-07-30
JP2010200768A (ja) 2010-09-16
AU2008305851B2 (en) 2014-12-18
RU2010116756A (ru) 2011-11-10
EP2196541A1 (en) 2010-06-16
WO2009041062A1 (ja) 2009-04-02
PE20091218A1 (es) 2009-08-14
ZA201002741B (en) 2011-10-26
CR11369A (es) 2010-08-12
RU2445366C2 (ru) 2012-03-20
MX2010003158A (es) 2010-04-14
EP2196541B1 (en) 2012-11-07
AU2008305851A1 (en) 2009-04-02
ES2394471T3 (es) 2013-02-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR20100085067A (ko) 혈장 중 반응속도가 개선된 항-글리피칸-3 항체
US20210324109A1 (en) Methods for controlling blood pharmacokinetics of antibodies
JP6605435B2 (ja) Ｃｄｒのアミノ酸置換により抗体の等電点を改変する方法
BRPI0707289A2 (pt) composições e métodos para humanização e otimização de n-glicanas em plantas

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
AMND Amendment
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
B701 Decision to grant