CN101068836B - 糖链改变的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及糖链被改变的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体,更具体而言,涉及岩藻糖缺失的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体。通过上述糖链被改变的抗体的制备方法,即通过向YB2/0细胞等岩藻糖增加能力降低的宿主细胞或岩藻糖转运蛋白缺失的细胞中导入编码抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的核酸,并培养该宿主细胞,从而制备本发明的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体。本发明的糖链被改变的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体具有高细胞毒活性,所以作为抗癌剂等细胞生长抑制剂是有用的。
Description
技术领域
本发明涉及细胞毒活性、特别是抗体依赖性细胞毒性(ADCC)增强的对应于磷脂酰肌醇聚糖3抗原的抗体(即,抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体)及其制备方法。
背景技术
磷脂酰肌醇聚糖3(GPC3)是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族中的一员。提示GPC3可能与发育和癌细胞增殖中的细胞分裂有关,但是其功能仍然不是很清楚。
已经发现与GPC3结合的各种抗体具有通过ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性以及CDC(补体依赖性细胞毒性)活性抑制细胞增殖的作用(WO2003/000883)。GPC3在生物体内被切割,以可溶性GPC3形式分泌到血液中,提示可以利用能检测出可溶性GPC3形式的抗体进行癌症的诊断。(WO2004/022739、WO2003/100429、WO2004/018667)。
开发利用抗体的细胞毒活性的抗癌剂时,优选使用的抗体具有高水平的ADCC活性,所以,需要具有高水平细胞毒活性的抗GPC3抗体。
已知抗体糖链的改变可以增强抗体的ADCC活性。例如,在WO99/54342中记载了通过改变抗体的糖基化提高ADCC活性。另外,在WO 00/61739中记载了通过控制抗体糖链中岩藻糖的存在与否来调节ADCC活性。在WO 02/31140中记载了通过使YB2/0细胞产生抗体,从而制备具有不含α-1,6核心岩藻糖的糖链的抗体。在WO 02/79255中记载了具有含有平分型(bisecting)GlcNAc的糖链的抗体。但是,目前还没有公开由于糖链的改变而增强ADCC活性的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体。
发明内容
本发明提供通过改变糖链组成增强ADCC活性的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体组合物以及制备该抗体的方法。
本发明人在进行了各种研究后,发现具有α-1,6核心岩藻糖缺失的糖链的抗GPC3抗体具有高水平的细胞毒活性。所以,本发明提供抗体的糖链组成发生改变的抗GPC3抗体组合物,更具体而言,提供岩藻糖缺失的抗GPC3抗体的比例较大的抗体组合物。本发明的糖链改变的抗GPC3抗体组合物具有高水平的细胞毒活性,因此作为抗癌剂等细胞生长抑制剂是有用的。
本发明还提供一种抗GPC3抗体组合物的制备方法,其特征在于,其中所述抗体的糖链发生改变,包括以下步骤:向YB2/0细胞等岩藻糖添加能力降低的宿主细胞中导入编码抗GPC3抗体的核酸,培养该宿主细胞,获得该抗体。向糖链上添加岩藻糖的能力降低的细胞优选是岩藻糖转运蛋白缺失的细胞。
附图说明
图1表示N-糖苷连接的糖链的基本结构。
图2表示在使用人外周血单核细胞(PBMC)、以HepG2细胞为靶细胞时嵌合抗体的ADCC活性。
图3表示在使用人PBMC、以HuH-7细胞为靶细胞时嵌合抗体的ADCC活性。
图4表示在使用人PBMC、以HuH-7细胞为靶细胞时抗体的ADCC活性。
图5表示由FT-KO细胞产生的抗体(a,b,c)以及CHO细胞产生的抗体制备的缺失半乳糖的2-AB修饰的糖链的正相HPLC色谱图。
图6表示图5中所示的峰G(0)以及G(0)-Fuc峰的推测结构。
图7表示FT-KO细胞产生的抗体(a)以及CHO细胞产生的抗体(b)的DSC(差示扫描量热法)测定图。
具体实施方式
本发明以提供抗体的糖链组成发生变化的抗GPC3抗体组合物为特征。已知与抗体连接的糖链的结构对抗体细胞毒活性的表达具有显著影响。与抗体连接的糖链包括与抗体分子的天冬酰胺残基侧链上的N原子连接的N-糖苷连接的糖链、与抗体分子的丝氨酸或苏氨酸残基侧链上的羟基连接的O-糖苷连接的糖链,本发明的重点在于N-糖苷连接的糖链中岩藻糖的存在与缺失。
图1表示与抗体连接的N-糖苷连接的糖链的基本结构。如图1的IgG基本糖链(1)以及(3)所示,N-糖苷连接的糖链具有1个甘露糖(Man)和2个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)部分以β-1,4键连接的基本结构(核心)[-Manβ1-4GlcNACβ1-4GlcNAc-]。该结构右侧的GlcNAc称为还原末端,左侧的Man称为非还原末端。当岩藻糖(Fuc)与还原末端连接时,通常采用在还原末端N-乙酰葡糖胺的6位与岩藻糖的1位之间以α键连接的形式。另一方面,在图1的IgG基本糖链(2)中所示的糖链中,在基本结构(核心)的非还原末端除了上述2个糖链以外,还通过β1,4键连接了1个N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)。该种类型的N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)被称为“平分型N-乙酰葡糖胺”。具有平分型N-乙酰葡糖胺的糖链可以是O-糖苷连接的糖链或N-糖苷连接的糖链,是通过N-乙酰葡糖胺基转移酶III(GnTIII)使N-乙酰葡糖胺转移到糖链上而形成的。编码该酶的基因已经被克隆,并公开了其氨基酸序列以及编码该酶的DNA的核苷酸序列(NCBI数据库(登录号Dl3789))。
在本发明中,糖链组成发生改变或变化的抗体组合物(糖链改变的抗体组合物)是指具有与由作为参照标准的宿主细胞产生的抗体组合物不同的糖链组成的抗体组合物。
在本发明中,糖链组成发生变化与否,是以由作为参照标准的宿主细胞产生的抗体组合物为参照标准进行判断。如果抗体组合物具有与作为参照标准的抗体组合物不同的糖链组成,则认为该抗体组合物是糖链组成发生变化的抗体组合物。
在本发明中,作为参照标准的宿主细胞是CHO DG44细胞。CHODG44细胞可以从例如Invitrogen公司购得。
糖链组成发生变化的抗体组合物的例子包括,例如,抗体组合物中岩藻糖(例如,α-1,6核心岩藻糖)缺失的抗体的比例增加的抗体组合物,和抗体组合物中具有连接的平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体的比例增加的抗体组合物。
作为本发明的一个优选方案,抗体组合物中岩藻糖缺失的抗体的比例高于作为参照标准的抗体组合物。
由于一些抗体具有多个N-糖苷糖链,所以本发明的岩藻糖缺失的抗体中不仅包括完全没有连接岩藻糖的抗体,也包括与抗体连接的岩藻糖部分的数目降低的抗体(至少在1个或1个以上的糖链中没有岩藻糖的抗体)。
利用宿主细胞制备糖链发生改变的抗体时,通常难以得到含有都具有相同糖链的均一抗体的组合物。所以,如果本发明的糖链组成发生变化的抗体组合物是,例如,岩藻糖缺失的抗体的比例增加的抗体组合物,则本发明的糖链组成发生变化的抗体组合物可含有岩藻糖缺失的抗体和岩藻糖不缺失的抗体,但岩藻糖缺失的抗体的总比例高于由作为参照标准的宿主细胞制备的抗体组合物中的比例。在本发明的岩藻糖缺失的抗体的比例高的抗体组合物中,岩藻糖缺失的抗体的比例没有特别限定,但优选为20%以上,较优选为50%以上,最优选为90%以上。
在本发明的添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗体比例高的抗体组合物中,添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗体的比例没有特别限定,但优选为20%以上,较优选为50%以上,最优选为90%以上。
本发明的糖链组成发生变化的抗GPC3抗体组合物可以利用本领域技术人员公知的方法得到。
例如,岩藻糖缺失的抗体可以通过在不具有添加α-1,6核心岩藻糖的能力或该能力降低的宿主细胞中表达抗GPC3抗体进行制备。
本发明对不具有添加岩藻糖的能力或该能力降低的宿主细胞没有特别限定,但是本发明可以使用岩藻糖转移酶活性缺失或降低的宿主细胞、高尔基体内的岩藻糖浓度降低的宿主细胞等。更具体而言,宿主细胞的例子包括大鼠骨髓瘤YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20细胞(简称为YB2/0细胞)(保藏为ATCC CRL 1662)、FTVIII敲除CHO细胞(WO02/31140)、Lec13细胞(WO03/035835)、岩藻糖转运蛋白缺失的细胞(WO 2005/017155)等。
本文使用的术语“岩藻糖转运蛋白缺失的细胞”是指细胞中岩藻糖转运蛋白的存在量少于正常细胞的细胞、或岩藻糖转运蛋白的结构异常而导致岩藻糖转运蛋白的功能下降的细胞。作为岩藻糖转运蛋白缺失的细胞的例子包括,例如,岩藻糖转运蛋白基因被敲除的细胞(以下称为“FT-KO细胞”)、岩藻糖转运蛋白基因的一部分缺失或突变的细胞、岩藻糖转运蛋白基因的表达系统具有缺陷的细胞等。编码中国仓鼠岩藻糖转运蛋白的基因的核苷酸序列及其氨基酸序列分别示于SEQ IDNO:126以及127。
另外,利用SEQ ID NO:126中所示的核苷酸序列,使用RNA干涉(RNAi)能得到本发明的岩藻糖转运蛋白缺失的细胞。RNAi是指如下现象:在向细胞内导入双链RNA(dsRNA)时,与该RNA序列匹配的细胞内mRNA特异性降解,无法表达为蛋白质。RNAi通常使用双链RNA,但本发明并不局限于此,例如,也可以使用由自身互补的单链RNA分子形成的双链RNA。对于形成双链分子的区域,该分子可以在所有的区域都是双链,也可以一部分区域(例如,两个末端或一个末端)为单链。本发明对于RNAi使用的寡聚RNA的长度没有特别限定。本发明的寡聚RNA的长度为,例如,5~1000个碱基(或者在双链分子中为5~1000bp),优选为10~100个碱基(或者在双链分子中为10~100bp),最优选为15~25个碱基(在双链分子中为15~25bp),特别优选19~23个碱基(在双链分子中为19~23bp)的长度。
上述RNAi法利用了下述现象:与特定基因同源的、由有义RNA和反义RNA组成的dsRNA破坏该基因的转录物(mRNA)的同源部分。可以使用与岩藻糖转运蛋白基因的全部序列对应的双链RNA,也可以使用与一部分序列对应的较短dsRNA(例如,21~23bp)(小干扰dsRNA;siRNA)。该双链RNA可以直接被转移到细胞中,也可以在制成产生双链RNA的载体后导入宿主细胞中,从而在细胞内产生该双链RNA。例如,可以将编码岩藻糖转运蛋白的DNA的全部或一部分插入到载体中,使其形成反向重复序列,然后将该载体导入宿主细胞中。可以按照下述文献中的记载进行RNAi方法:Fire A.等,Nature(1998),391,806-811、Montgomery M.K.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998),95,15502-15507、Timmons L.等,Nature(1998),395,854、Sánchez A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96,5049-5054、Misquitta L.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96,1451-1456、Kennerdell J.R.等,Cell(1998),95,1017-1026、Waterhouse P.M.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998),95,13959-13964、Wianny F.等,Nature Cell Biol.(2000),2,70-75等。
利用RNAi法获得的岩藻糖转运蛋白缺失的细胞可以以岩藻糖转运蛋白的活性为指标进行筛选。也可以基于蛋白质印迹法或RNA印迹法所示的岩藻糖转运蛋白基因的转录和表达进行筛选。
糖链上添加了平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体可以通过在具有在糖链中形成平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)结构的能力的宿主细胞中表达抗GPC3抗体进行制备。
具有添加了平分型N-乙酰葡糖胺的糖链的抗体的一种制备方法已经是公知的(WO 02/79255)。本发明对于具有在糖链中形成平分型N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)结构的能力的宿主细胞没有特别限定,可以包括,例如,具有含有编码GnTIII的DNA的表达载体的宿主细胞。所以,可以使用具有含有编码GnTIII的DNA的表达载体以及编码抗GPC3抗体的表达载体的宿主细胞,制备具有添加了平分型N-乙酰葡糖胺的糖链的抗GPC3抗体。编码GnTIII的DNA和编码抗GPC3抗体的基因可以存在于同一载体上,也可以存在于不同的载体上。
提高抗体组合物中岩藻糖缺失的抗体或添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗体的比例的另外一种方法是通过纯化岩藻糖缺失的抗体或添加平分型N-乙酰葡糖胺的抗体来提高组合物中上述抗体的比例。
可以利用本领域技术人员公知的方法进行糖链的分析。例如,通过使N-糖苷酶F(Roche)等与抗体反应,可以使糖链从该抗体上释放出来。然后,可以利用使用纤维素柱的固相提取法(Shimizu Y.等,Carbohydrate Research 332(2001),381-388)将糖链脱盐,浓缩干燥,利用2-氨基吡啶进行荧光标记(Kondo A.等,Agricultural and BiologicalChemistry 54:8(1990),2169-2170)。利用使用纤维素柱的固相提取从吡啶基氨基糖链(PA-糖链)中除去试剂,然后离心浓缩该糖链,得到纯化的PA-糖链。然后,可以通过利用十八烷基硅烷(ODS)柱的反相HPLC分析测定该糖链。也可以使用利用ODS柱的反相HPLC分析和利用胺柱的正相HPLC分析的组合通过二维作图分析这样制备的PA-糖链。
本发明的糖链改变的抗GPC3抗体只要能与GPC3结合即可,没有特别限定。与GPC3的结合优选是特异性结合。本发明优选的抗GPC3抗体包括具有下面表1所示的互补决定区(CDR)序列的抗体。
表1
抗体 | CDR | 氨基酸序列 | SEQ ID NO: |
M13B3(H) | CDR1 | NYAMS | 5 |
CDR2 | AINNNGDDTYYLDTVKD | 6 | |
CDR3 | QGGAY | 7 | |
M3B8(H) | CDR1 | TYGMGVG | 8 |
CDR2 | NIWWYDAKYYNSDLKS | 9 | |
CDR3 | MGLAWFAY | 10 | |
M11F1(H) | CDR1 | IYGMGVG | 11 |
CDR2 | NIWWNDDKYYNSALKS | 12 | |
CDR3 | IGYFYFDY | 13 | |
M5B9(H) | CDR1 | GYWMH | 14 |
CDR2 | AIYPGNSDTNYNQKFKG | 15 | |
CDR3 | SGDLTGGLAY | 16 | |
M6B1(H) | CDR1 | SYAMS | 17 |
CDR2 | AINSNGGTTYYPDTMKD | 18 | |
CDR3 | HNGGYENYGWFAY | 19 | |
M10D2(H) | CDR1 | SYWMH | 20 |
CDR2 | EIDPSDSYTYYNQKFRG | 21 | |
CDR3 | SNLGDGHYRFPAFPY | 22 | |
L9G11(H) | CDR1 | SYWMH | 20 |
CDR2 | TIDPSDSETHYNLQFKD | 23 | |
CDR3 | GAFYSSYSYWAWFAY | 24 | |
GC33(H) | CDR1 | DYEMH | 25 |
CDR2 | ALDPKTGDTAYSQKFKG | 26 | |
CDR3 | FYSYTY | 27 | |
GC179(H) | CDR1 | INAMN | 28 |
CDR2 | RIRSESNNYATYYGDSVKD | 29 | |
CDR3 | EVTTSFAY | 30 | |
GC194(H) | CDR1 | ASAMN | 31 |
CDR2 | RIRSKSNNYAIYYADSVKD | 32 | |
CDR3 | DPGYYGNPWFAY | 33 | |
GC199(H) | CDR1 | DYSMH | 34 |
CDR2 | WINTETGEPTYADDFKG | 35 | |
CDR3 | LY | 36 |
表1(续)
GC202(H) | CDR1 | TYGMGVG | 8 |
CDR2 | NIWWHDDKYYNSALKS | 37 | |
CDR3 | IAPRYNKYEGFFAF | 38 | |
M13B3(L) | CDR1 | KSSQSLLDSDGKTYLN | 39 |
CDR2 | LVSKLDS | 40 | |
CDR3 | WQGTHFPLT | 41 | |
M3B8(L) | CDR1 | KASQDINNYLS | 42 |
CDR2 | RANRLVD | 43 | |
CDR3 | LQCDEFPPWT | 44 | |
M11F1(L) | CDR1 | RSSQSLVHSNGNTYLH | 45 |
CDR2 | KVSNRFS | 46 | |
CDR3 | SQSTHVPWT | 47 | |
M5B9(L) | CDR1 | RSSKSLLHSNGITYLY | 48 |
CDR2 | QMSNLAS | 49 | |
CDR3 | AQNLELPYT | 50 | |
M6B1(L) | CDR1 | KASQDINKNII | 51 |
CDR2 | YTSTLQP | 52 | |
CDR3 | LQYDNLPRT | 53 | |
M10D2(L) | CDR1 | RASHSISNFLH | 54 |
CDR2 | YASQSIS | 55 | |
CDR3 | QQSNIWSLT | 56 | |
L9G11(L) | CDR1 | RASESVEYYGTSLMQ | 57 |
CDR2 | GASNVES | 58 | |
CDR3 | QQSRKVPYT | 59 | |
GC33(L) | CDR1 | RSSQSLVHSNGNTYLH | 45 |
CDR2 | KVSNRFS | 46 | |
CDR3 | SQNTHVPPT | 60 | |
GC179(L) | CDR1 | KSSKSLLHSNGNTYLN | 61 |
CDR2 | WMSNLAS | 62 | |
CDR3 | MQHIEYPFT | 63 | |
GC194(L)1 | CDR1 | RSSKSLLHSYDITYLY | 64 |
CDR2 | QMSNLAS | 49 | |
CDR3 | AQNLELPPT | 65 | |
GC194(L)2 | CDR1 | SASSSVSYMY | 66 |
CDR2 | DTSNLAS | 67 | |
CDR3 | QQWSSYPLT | 68 | |
GC199(L) | CDR1 | KSSQSLLHSDGKTFLN | 69 |
CDR2 | LVSRLDS | 70 | |
CDR3 | CQGTHFPRT | 71 | |
GC202(L) | CDR1 | RSSQSIVHSNGNTYLE | 72 |
CDR2 | KVSNRFS | 46 | |
CDR3 | FQGSHVPWT | 73 |
具有上述表中列出的CDR序列的抗体具有高水平的细胞毒活性。具有上述表中列出的CDR序列的抗体识别GPC3上的氨基酸524-563的表位。由于识别氨基酸524-563的表位的抗体具有高水平的细胞毒活性,因此,优选作为本发明的抗GPC3抗体。
在本发明的一个优选方案中,本发明的糖链组成发生变化的抗体组合物以ADCC活性增强为特征。在本发明中,ADCC活性是否增强,可以与作为参照标准的抗体组合物进行比较来确定。如果本发明的抗体组合物显示高于该参照标准的ADCC活性,则ADCC活性被判断为增强。
ADCC活性的测定可以根据本领域技术人员公知的方法进行,例如,可以通过混合效应细胞、靶细胞以及抗GPC3抗体,然后检测ADCC的程度,从而进行测定。更具体而言,例如,可以利用小鼠脾细胞、从人外周血(PBMC)或骨髓中分离得到的单核细胞等作为效应细胞,可以使用人肝细胞癌细胞系HuH-7等表达GPC3的人类细胞作为靶细胞。预先用51Cr标记靶细胞,向其中加入抗GPC3抗体后进行培养,然后以相对于靶细胞的适当比例加入效应细胞,一起进行培养。培养后收集上清液,通过计数上清液中的放射性测定ADCC活性。
抗GPC3抗体
可以通过本领域技术人员公知的方法制备抗GPC3抗体。例如,使用GPC3作为敏化抗原,根据常规免疫方法进行免疫,然后,利用常规细胞融合法使得到的免疫细胞与公知的亲代细胞融合,再利用常规筛选方法筛选单克隆抗体产生细胞,从而制备上述抗体。具体而言,可以如下所述地制备单克隆抗体。首先,基于Lage,H.等,Gene 188(1997),151-156中公开的基因/氨基酸序列,通过表达GPC3(MXR7)得到用作获得抗体的敏化抗原的GPC3。即,将编码GPC3的基因序列插入公知的表达载体中,用该载体转化适当的宿主细胞后,利用公知的方法从该宿主细胞或培养上清液中纯化目标人磷脂酰肌醇聚糖3蛋白质。然后,使用该纯化的GPC3蛋白质作为敏化抗原。也可以以GPC3的部分肽作为敏化抗原。此时,可以根据人GPC3的氨基酸序列化学合成部分肽。被本发明的抗GPC3抗体识别的GPC3分子上的表位没有限制,只要本发明的抗GPC3抗体可以识别GPC3分子上存在的任何表位。这是因为抗GPC3抗体通过其ADCC活性、CDC活性、或抑制生长因子活性显示细胞生长抑制活性,而且,与抗GPC3抗体连接的诸如放射性同位素、化学治疗药物、细菌毒素等细胞毒性物质的作用也能抑制细胞生长。因此,用于制备本发明的抗GPC3抗体的抗原可以是GPC3的任何片段,只要它含有存在于GPC3分子上的表位。
在特别优选的实施方案中,为了得到识别GPC3的氨基酸524-563的表位的抗体,可以使用含有氨基酸524-563的肽作为敏化抗原。
本发明对于被敏化抗原免疫的哺乳动物没有特别限定,但考虑到与细胞融合中使用的亲代细胞的相容性,优选选择的动物包括啮齿类动物,例如,小鼠、大鼠或仓鼠,或家兔,猴等。根据公知的方法用敏化抗原免疫动物。例如,通常是对哺乳动物腹膜内或皮下注射敏化抗原。具体而言,以适量的磷酸缓冲液(PBS)或生理盐水等稀释或悬浮敏化抗原,根据需要混合适量的常规佐剂,例如,弗氏完全佐剂,乳化,对哺乳动物给药数次/每4-21天。另外,在用敏化抗原免疫时也可以使用适当的载体。
如上所述地免疫哺乳动物,并在血清中检测到期望的抗体水平后,从哺乳动物中收集免疫细胞,进行细胞融合。作为用于细胞融合的免疫细胞,特别优选脾细胞。作为与上述免疫细胞融合的亲代细胞,使用哺乳动物的骨髓瘤细胞。适合用作骨髓瘤细胞的公知的细胞株包括,例如,P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123,1548-1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7)、NS-1(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519)、MPC-11(Margulies.D.H.等,Cell(1976)8,405-415)、SP2/0(Shulman,M.等,Nature(1978)276,269-270)、FO(de St.Groth,S.F.等,J.Immunol.Methods(1980)35,1-21)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323)、R210(Galfre,G.等,Nature(1979)277,131-133)。上述免疫细胞和骨髓瘤细胞的细胞融合基本上可以根据公知的方法,例如Kohler和Milstein的方法(Kohler.G.and Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)进行。更具体而言,例如,在含有细胞融合促进剂的常规培养液中进行上述细胞融合。细胞融合促进化学物质的例子包括聚乙二醇(PEG)和仙台病毒(HVJ)等。还可以根据需要,添加诸如二甲基亚砜等辅助剂以提高融合效率。可以任意设定免疫细胞和骨髓瘤细胞的比例,例如,优选免疫细胞相对于骨髓瘤细胞的比例为1-10倍。作为上述细胞融合中使用的培养液,可以使用适用于培养这些细胞类型的常规液体培养基,例如,RPMI1640培养液、MEM培养液、以及适用于骨髓瘤细胞培养的其它培养液。还可以并用胎牛血清(FCS)等血清添加剂。在细胞融合程序中,在上述培养液中充分混合规定量的免疫细胞和骨髓瘤细胞,然后通常以浓度30-60%(w/v)加入预先升温至37℃的PEG溶液(例如,平均分子量为约1000-6000),混合,形成融合细胞(杂交瘤)。然后,添加适当的培养液,离心除去上清液。重复该步骤,由此除去不利于杂交瘤生长的所有细胞融合化学物质。由此得到的杂交瘤通过在常规选择培养液、例如HAT培养液(含有次黄嘌呤、氨基喋呤以及胸腺嘧啶核苷的培养液)中培养而进行选择。在上述HAT培养液中的培养持续充分的时间(通常数日~数周),直到杀灭目标杂交瘤以外的细胞(非融合细胞)。然后,进行常规的有限稀释,接着进行产生靶抗体的杂交瘤的筛选以及单克隆。除了用抗原免疫非人动物得到上述杂交瘤以外,还可以在体外用GPC3敏化人淋巴细胞,然后使敏化的淋巴细胞与无限增殖化人骨髓瘤细胞融合,得到具有GPC3结合活性的所希望的人抗体(参见特公平1-59878号公报)。而且,可以向具有人抗体基因的所有组成成分的转基因动物施用作为抗原的GPC3,得到产生抗GPC3抗体的细胞,并从无限增殖化细胞中收集抗GPC3的人抗体(参见国际专利申请公开号WO 94/25585号公报、WO 93/12227号公报、WO92/03918号公报、WO 94/02602号公报)。如此制备的产生单克隆抗体的杂交瘤可以在常规的培养液中进行传代培养,还可以长期保存在液氮中。
重组抗体
在本发明中使用的单克隆抗体可以是如下制备的重组单克隆抗体,即,从杂交瘤中克隆抗体基因,将该基因插入到适当的载体中,并导入宿主细胞中(例如,参见Vandamme,A.M.等,Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775,1990)。具体而言,从产生抗GPC3抗体的杂交瘤中分离编码抗GPC3抗体的可变(V)区的mRNA。可以通过公知的方法进行mRNA的分离,例如,胍超速离心法(Chirgwin,J.M.等,Biochemistry(1979)18,5294-5299)、AGPC法(Chomczynski,P.等,Anal.Biochem.(1987)162,156-159)等,以制备总RNA,然后使用mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)等制备靶mRNA。也可以通过使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia)直接制备mRNA。使用逆转录酶由这样得到的mRNA合成抗体V区的cDNA。可以利用AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(生化学工业社制)等进行cDNA的合成。在进行cDNA的合成以及扩增时,也可以使用利用5′-Ampli FINDER RACE试剂盒(Clontech)的5′-RACE法以及PCR(Frohman,M.A.等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002、Belyavsky,A.等,Nucleic AcidsRes.(1989)17,2919-2932)。从得到的PCR产物中纯化靶DNA片段,并将其与载体DNA连接。通过插入这些载体制备需要的重组载体。将该重组载体导入大肠杆菌中,选择希望的菌落,制备希望的重组载体。通过公知的方法证实靶DNA的核苷酸序列,例如,双脱氧核苷酸链终止法。得到编码靶抗GPC3抗体的V区的DNA后,将其整合到含有编码希望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体中。为了制备本发明中使用的抗GPC3抗体,将抗体基因整合到表达载体中,使其在表达控制区,例如增强子、启动子等的控制下表达。然后,利用该表达载体转化宿主细胞,表达抗体。抗体基因在宿主细胞中的表达,可以分别将编码抗体重链(H链)和轻链(L链)的DNA整合到不同的表达载体中,并同时转化宿主细胞,或将编码H链以及L链的DNA整合到单一表达载体中,并转化宿主细胞(参见WO 94/11523)。另外,重组抗体的制备不仅可以使用上述宿主细胞,还可以使用转基因动物。例如,将抗体基因插入编码乳汁中固有产生的蛋白质(例如山羊β酪蛋白)的基因的中部,制备融合基因。然后将含有包含抗体基因的融合基因的DNA片段注射入山羊胚胎中,并将该胚胎植入雌山羊。可以从由植入了胚胎的山羊生产的转基因山羊或其后代的乳汁中得到所希望的抗体。另外,为了增加由转基因山羊产生的含有所希望的抗体的乳汁量,可以对转基因山羊使用适当的激素(Ebert,K.M.等,Bio/Technology(1994)12,699-702)。
变化的抗体
在本发明中,除上述抗体以外,为了降低对人的异种抗原性,可以使用人工改变的基因重组抗体、例如嵌合抗体、人源化抗体等。可以使用已知的方法制备上述改变的抗体。可以如下得到嵌合抗体:将如上所述得到的编码抗体V区的DNA与编码人抗体C区的DNA连接,将该DNA插入到表达载体中。插入DNA的载体整合到宿主细胞中,产生抗体。使用这种常规的方法,能够得到适用于本发明的嵌合抗体。人源化抗体也称为重构(reshaped)人抗体,包括移植到人抗体CDR上的来源于非人哺乳动物、例如小鼠的抗体的CDR。用于获得人源化抗体的常用基因工程方法也是本领域已知的(参见欧州专利申请公开号EP125023号公报、WO 96/02576号公报)。具体而言,以为了使其具有重叠的CDR以及FR末端区而制备的数个寡核苷酸作为引物,通过PCR合成为连接小鼠抗体的CDR与人抗体的构架区(FR)而设计的DNA序列(参见WO98/13388号公报中记载的方法)。选择通过CDR连接的人抗体的构架区,使互补决定区能形成合适的抗原结合部位。根据需要,重构人抗体的互补决定区可以在抗体的可变区置换构架区的氨基酸,以使该CDR形成适当的抗原结合部位(Sato,K.等,Cancer Res.(1993)53,851-856)。嵌合抗体以及人源化抗体的C区可以使用人抗体的C区。例如,可以在H链中使用Cy1、Cy2、Cy3、Cy4,在L链中使用Cκ、Cλ。另外,为了改善抗体的稳定性或生产率,可以修饰人抗体C区。嵌合抗体包含来源于非人哺乳动物的抗体的可变区和来源于人抗体的恒定区。另一方面,人源化抗体包含来源于非人哺乳动物的抗体的互补决定区和来源于人抗体的构架区以及C区。由于人源化抗体在人体内的抗原性降低,所以作为本发明的治疗剂的有效成分是有用的。
改变的抗体
本发明中使用的抗体并不限于抗体的整个分子,只要能与GPC3结合并抑制GPC3的活性,还可以是抗体的片段或抗体的改变形式。本发明也包括二价抗体和一价抗体。抗体片段的例子包括Fab、F(ab′)2、Fv、具有1个Fab和完整的Fc的Fab/c、或H链或L链的Fv通过适当的连接体连接的单链Fv(scFv)。具体而言,为了制备抗体片段,可以利用酶,例如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体,或构建编码上述抗体片段的基因,将该基因插入表达载体中后,由适当的宿主细胞表达(参见例如Co,M.S.等,J.Immunol.(1994)152,2968-2976、Better,M.&Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476-496,AcademicPress,Inc.,Plueckthun,A.&Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,476-496,Academic Press,Inc.、Lamoyi,E.,Methods inEnzymology(1989)121,652-663、Rousseaux,J.等,Methods inEnzymology(1989)121,663-669、Bird,R.E.等,TIBTECH(1991)9,132-137)。可以通过连接抗体的H链V区和L链V区得到scFv。在该scFv中,通过连接体,优选肽连接体,连接H链V区和L链V区(Huston,J.S.等、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。scFv中的H链V区以及L链V区可以来源于在本说明书中所述的任何抗体。作为连接V区的肽连接体,例如,可以使用含有12-19个氨基酸残基的任意的单链肽。可以如下得到编码scFv的DNA:以编码上述抗体的H链或H链V区的DNA、以及编码上述抗体的L链或L链V区的DNA序列的全部或所希望的氨基酸序列的DNA部分为模板,使用限定其两端的引物对,通过PCR法扩增一条片段。然后,用编码肽连接体部分的DNA以及限定将与H链和L链连接的两端的引物对的组合扩增该片段。一旦编码scFv的DNA被制备,可以通过常规方法得到含有上述DNA的表达载体、以及由该表达载体转化的宿主细胞。可以按照常规方法由该宿主得到scFv。通过与上述相同的方法得到基因并使其表达,可以在宿主中产生上述抗体片段。本发明中的术语“抗体”还包括抗体片段。作为修饰的抗体,还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种分子连接的GPC3抗体。本发明中的术语“抗体”还包括上述改变的抗体。上述改变的抗体可以通过对以上得到的抗体进行化学修饰而得到。修饰抗体的方法在本领域中已经建立。
此外,本发明中使用的抗体可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是具有识别GPC3分子上的不同表位的抗原结合位点的双特异性抗体,或者可以是这样一种抗体,其中一个抗原结合位点识别GPC3,另一个抗原结合位点识别诸如化学治疗剂、细胞衍生的毒素等细胞毒性物质。此种情况下,细胞毒性物质直接作用于表达GPC3的细胞,特异性损伤肿瘤细胞,抑制肿瘤细胞的生长。通过使2种类型的抗体的HL对连接,可以制备双特异性抗体。也可以使产生不同的单克隆抗体的杂交瘤融合,制备产生双特异性抗体的融合细胞,从而得到双特异性抗体。还可以利用基因工程方法制备双特异性抗体。
重组抗体或改变的抗体的表达以及制备
如上所述构建的抗体基因可以利用公知的方法进行表达,从而得到抗体。在哺乳动物细胞的情况下,可以使共同的有用的启动子、将要表达的基因、该基因3′端下游的poly-A信号序列功能性连接在一起,并进行表达。例如,可以使用人巨细胞病毒直接早期启动子/增强子作为启动子/增强子。另外,可以用于表达本发明的抗体的其它启动子/增强子包括逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒、猿猴病毒40(SV40)的启动子/增强子、或诸如人延伸因子1α(HEF-1α)等来源于哺乳动物细胞的启动子/增强子。使用SV40启动子/增强子时,通过Mulligan等的方法(Nature(1979)277,108)容易表达抗体,在使用HEFlα启动子/增强子时,通过Mizushima等的方法(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)容易表达。
制备本发明的抗体时可以使用具有向被表达的抗体上添加糖链的能力的真核细胞表达系统。真核细胞包括,例如,建株的哺乳动物细胞系、昆虫细胞系、动物细胞、真菌细胞以及酵母细胞。
本发明的抗体优选在哺乳动物细胞、例如CHO、COS、骨髓瘤细胞、BHK、Vero、HeLa细胞中表达。通过在体外或体内培养转化的宿主细胞制备靶抗体。可以使用公知的方法进行宿主细胞的培养。例如,可以使用DMEM、MEM、RPMI1640或IMDM作为培养基,还可以补充诸如胎牛血清(FCS)等血清补充物。
抗体的分离和纯化
从宿主细胞或宿主动物中分离以上述方法表达、制备的抗体,并纯化至均一。本发明的抗体可以使用亲和柱进行分离、纯化,例如蛋白A柱,如Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia)。此外,本发明可以使用任一种常规蛋白质分离、纯化方法。例如,可以适当选择、组合亲和柱如蛋白A柱与色谱柱、过滤器、超滤、盐析和透析方法,分离、纯化抗体(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。具有所希望的糖链的抗体可以通过本领域技术人员公知的方法使用凝集素柱进行分离,例如,可以按照WO 02/30954中记载的方法进行。
抗体活性的检测
可以使用公知的方法测定本发明中使用的抗体的抗原结合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold SpringHarbor Laboratory,1988)、配体-受体结合抑制活性(Harada,A.等,International Immunology(1993)5,681-690)。测定本发明的抗GPC3抗体的抗原结合活性可以使用ELISA(酶联免疫吸附试验)、EIA(酶免疫测定法)、RIA(放射免疫测定法)或荧光抗体法。例如,EIA如下进行:向GPC3包被的平板中加入含有抗GPC3抗体的样品、抗GPC3抗体产生细胞的培养上清液或纯化的抗体。添加用诸如碱性磷酸酯酶等酶标记的第二抗体,培养该平板,清洗后加入诸如磷酸对硝基苯酯等酶底物,测定吸光度,由此评价抗原结合活性。
药物组合物
本发明提供含有本发明的糖链组成发生变化的GPC3抗体的药物组合物。
含有本发明的抗体组合物的药物组合物对于治疗以及/或预防癌症等与细胞增殖相关的疾病是有用的,特别是对于肝癌的治疗以及/或预防是有用的。含有本发明的抗体的药物组合物可以利用本领域技术人员公知的方法配制。该药物组合物可以以包括在水或其它药学上可接受的液体中的无菌溶液或混悬液的注射剂的形式肠胃外给药。例如,可以适当组合抗体和药学上可接受的载体或介质,例如灭菌水或生理盐水、植物油、乳化剂、混悬剂、表面活性剂、稳定剂、香味剂、赋形剂、稀释剂、载体、防腐剂、粘合剂等,然后以通常被接受的制剂化所要求的单位剂量形式混合,由此配制药物组合物。设定药物制剂中的有效成分含量以得到指定范围的适当剂量。
用于注射的无菌组合物可以使用注射用蒸馏水作为载体,按照常规制药方法进行配制。
作为注射用水溶液,例如,可以使用生理盐水、或含有葡萄糖或例如D-山梨糖醇、D-甘露糖、D-甘露醇、氯化钠等其他辅药的等渗液,任选地还可以并用适当的助溶剂,例如醇,如乙醇;和多元醇,如丙二醇或聚乙二醇;和非离子型表面活性剂,如聚山梨醇酯80TM、HCO-50等。
油性液体的例子包括芝麻油、大豆油,还可以并用作为助溶剂的苯甲酸苄酯或苄醇。可以包含的其它成分有缓冲剂,例如磷酸盐缓冲液、乙酸钠缓冲液;安抚剂,例如盐酸普鲁卡因;稳定剂,例如苄醇或苯酚;抗氧化剂。通常将配制的注射液装入合适的安瓿。
给药途径优选非肠胃给药,例如注射给药、经鼻给药、经肺给药、经皮给药等。可以通过静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、皮下注射等进行全身或局部给药。
可以根据患者的年龄、状况选择适当的给药方法。作为含有抗体或编码抗体的寡核苷酸的药物组合物的一次剂量,可以在0.0001~1000mg/kg体重的范围内选择。另一方面,也可以在0.001~100000mg/kg体重的范围内选择剂量,但本发明并不限定于上述数值范围。根据患者的体重、年龄、状况等改变剂量和给药方法,本领域技术人员可以根据需要适当选择。
本申请说明书中明确引用的所有专利以及参考文献的内容全部作为本说明书的一部分。另外,作为本申请要求的优选权基础的日本专利申请2004-311356号说明书以及说明书附图中记载的内容全部作为本说明书的一部分。
实施例
下面利用实施例详细说明本发明,但本发明并不限定于这些实施例。
实施例1
小鼠抗GPC3抗体的制备
制备缺失C末端的疏水性区域(564-580位氨基酸)的可溶型GPC3蛋白质作为用于制备抗GPC3抗体的免疫蛋白质,进行免疫。使用自身免疫病小鼠MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr小鼠(以下称为MRL/lpr小鼠、购自日本Charles River)作为免疫动物。当小鼠为7周龄或8周龄时开始免疫,将用于初次免疫的制剂调节为100μg/只的可溶型GPC3的剂量。使用弗氏完全佐剂(FCA,Becton Dickinson)制备乳液,并皮下注射。免疫5次后,最后一次免疫剂量用PBS稀释至50μg/只,经由尾静脉静脉给药。在最终免疫后的第4天,取出脾细胞,与小鼠骨髓瘤细胞P3-X63Ag8U1(以下称为P3U1,购自ATCC)以2∶1的比例混合,通过缓慢加入PEG1500(Roche Diagnostics)进行细胞融合。使用固定有可溶型GPC3核心蛋白质的免疫板通过ELISA筛选杂交瘤。利用有限稀释法对阳性克隆进行单克隆化。从而得到11个对GPC3具有强结合活性的抗体克隆(M3C11、M13B3、M1E7、M3B8、M11F1、L9G11、M19B11、M6B1、M18D4、M5B9、M10D2)。
在得到的抗GPC3抗体中,M11F1、M3B8显示特别强的CDC活性,所以用含有包含GPC3第524位Ala至第563位Lys的肽的M11F1、M3B8表位(GC-3)和GST的GST融合蛋白作为免疫原,免疫3只Balb/c小鼠(日本Charles River)、3只MRL/lpr小鼠。初次免疫时,用FCA乳化浓度为100μg/只的GC-3制剂,并皮下注射。2周后用弗氏不完全佐剂(FIA)乳化50μg/只的GC-3制剂,并皮下注射。免疫5次后,最终免疫(50μg/只)是对所有小鼠经尾静脉静脉注射,并进行细胞融合。使用固定有C末端疏水性区域(564-580位氨基酸)缺失的可溶型GPC3蛋白质核心蛋白质的免疫板通过ELISA筛选杂交瘤。利用有限稀释法对阳性克隆进行单克隆化。结果得到5个对GPC3具有强结合活性的抗体克隆(GC199、GC202、GC33、GC179、GC194)。
通过标准方法克隆H链、L链可变区,并对其测序。另外,通过与已知抗体的氨基酸序列数据库比较,并研究同源性,从而确定CDR区域。CDR区域的序列如表1以及2所示。
实施例2
抗GPC3抗体小鼠-人嵌合抗体的制备
将抗GPC3抗体GC33的H链以及L链可变区序列与人IgG1以及κ链的恒定区序列连接。使用与具有Kozak序列的抗体H链可变区的5’末端核苷酸序列互补的合成寡核苷酸以及具有NheI位点、与3’末端核苷酸序列互补的合成寡核苷酸进行PCR。将得到的PCR产物克隆到人IgG1恒定区被插入pBluescript KS+载体(东洋纺社)而得到的pB-CH载体中。通过NheI位点连接小鼠H链可变区和人H链(γ1链)恒定区。将制备的H链基因片段克隆到表达载体pCXND3中。此外,使用与具有Kozak序列的抗体L链可变区的5’末端核苷酸序列互补的合成寡核苷酸以及具有BsiWI位点、与3’末端核苷酸序列互补的合成寡核苷酸进行PCR。将得到的PCR产物克隆到在pBluescript KS+载体(东洋纺社)中插入人κ链恒定区的pB-CL载体中。通过BsiWI位点连接人L链可变区和恒定区。将制备的L链基因片段克隆到表达载体pUCAG中。该载体pUCAG是通过用限制酶BamHI消化pCXN(Niwa等,Gene 1991;108:193-200)得到2.6kbp的片段,并将该片段与pUC 19载体(东洋纺社)的限制酶BamHI位点连接而得到的载体。
为了制备抗GPC3小鼠-人嵌合抗体表达载体,通过用限制酶HindIII(宝酒造社)消化插入了L链基因片段的pUCAG载体获得基因片段。将该基因片段与含有H链基因的pCXND3的限制酶HindIII酶切位点连接,然后克隆。这样获得的质粒在动物细胞内表达新霉素抗性基因、DHFR基因、抗GPC3小鼠-人嵌合抗体基因(H链可变区的氨基酸序列示于SEQ ID NO:3,L链可变区的氨基酸序列示于SEQ IDNO:4)。
实施例3
低岩藻糖型抗GPC3嵌合抗体的制备
首先使用YB2/0(ATCC,CRL-1662)细胞作为宿主细胞,在含有10%FBS的RPMI1640培养基中培养。然后用电穿孔法,在1.4kV、25μF的条件下和7.5×106个细胞/0.75mL PBS(-)的浓度下,将25μg实施例2中制备的抗GPC3嵌合抗体表达载体导入YB2/0细胞(ATCCCRT-1662)中。在室温下进行10分钟的恢复期后,将用电穿孔处理过的细胞悬浮于40mL含有10%FBS的RPMI1640培养基中。用相同的培养基制备10倍稀释液,将细胞以100μL/孔分配到96孔培养板中。在CO2培养箱(5%CO2)中培养24小时后,添加遗传霉素(Invitrogen社),使浓度为0.5mg/mL,将细胞培养2周。利用使用了抗人IgG抗体的夹心ELISA筛选嵌合抗体高水平表达的细胞株,建立稳定表达该抗体的细胞株。用Hi Trap ProteinG HP(Amersham)纯化各抗GPC3小鼠-人嵌合抗体。
实施例4
使用来自人外周血的PBMC对ADCC活性的测定
人PBMC溶液的制备
用PBS(-)将采自健康成人的加有肝素的外周血稀释2倍,与Ficoll-PaqueTM PLUS(Amersham)分层。离心(500×g、30分、20℃)后,分离含有单核细胞的中间层。清洗该层3次后,将细胞悬浮于10%FBS/RPMI中,制备人PBMC溶液。
靶细胞的制备
使用细胞分离缓冲液(Invitrogen)从培养皿中分离在10%FBS/RPMI1640培养基中培养的HepG2细胞(ATCC)以及HuH-7细胞(健康科学研究资源库),以1×104细胞/孔的浓度分配到96孔U形底平板(Falcon)的各孔中,培养1天。培养后,加入5.55MBq的51Cr,细胞于37℃下在5%二氧化碳培养箱中培养1小时。用培养基清洗该细胞1次,加入50μL 10%FBS/RPMI1640培养基,制备靶细胞。
铬释放试验(ADCC活性)
向靶细胞中添加50μL以各种浓度制备的抗体溶液,在冰上反应15分钟。然后加入人PBMC溶液100μL(5×105细胞/孔),细胞在5%二氧化碳培养箱中于37℃下培养4小时,培养后,离心平板,利用γ计数器测定100μL培养上清液中的放射活性。根据下式计算比铬释放率。
比铬释放率(%)=(A-C)×100/(B-C)
在该式中,A表示各孔的放射活性(cpm)的平均值;B表示向靶细胞中加入了100μL2%NP-40水溶液(Nonidet P-40、Code No.252-23、Nacalai Tesque)和50μL 10%FBS/RPMI培养基的孔的放射活性(cpm)的平均值;C表示向靶细胞中加入了150μL 10%FBS/RPMI培养基的孔的放射活性(cpm)的平均值。该试验一式三份进行,计算出ADCC活性(%)的平均值以及标准偏差。
图2和图3显示了使用PBMC测定的抗GPC3嵌合抗体的ADCC活性。图中,纵轴表示细胞毒活性(%)、横轴表示添加的抗体浓度(μg/mL)。图2表示使用HepG2作为靶细胞时的结果,图3表示使用HuH-7作为靶细胞时的结果。空心圆表示CHO细胞产生的嵌合GC33抗体的活性、涂黑圆表示YB2/0细胞产生的嵌合GC33抗体的活性。YB2/0细胞产生的低岩藻糖型GC33嵌合抗体与CHO细胞产生的GC33嵌合抗体相比,显示较强的ADCC活性,清楚地表明通过糖链的改变能增强抗GPC3抗体的ADCC活性。
实施例5
抗体产生细胞的建株
向SFMII(+)培养基中加入潮霉素B至终浓度为1mg/ml,在培养基中传代培养岩藻糖转运蛋白缺陷细胞株(克隆3F2)。在Dulbecco磷酸盐缓冲液中制备3F2细胞的悬浮液(8×106个细胞/0.8mL)。向细胞悬浮液加入25μg抗体表达载体(参考实施例1和2),将细胞悬浮液移入Gene Pulser杯中。该杯在冰上放置10分钟后,利用GENE-PULSER II,在1.5kV、25μFD的条件下,用电穿孔法向细胞中导入载体。将细胞悬浮于40mL SFMII(+)培养基中,以100μl/孔转移到96孔平底板(Iwaki)中。将平板在CO2培养箱内于37℃培养24小时,然后加入遗传霉素(Invitrogen,目录号10131-027),使其最终浓度为0.5mg/mL。测定耐药性细胞产生的抗体量,建立人源化抗GPC3抗体产生细胞株。
实施例6
抗体的纯化
收集抗体表达株的上清液,使用P-1泵(Pharmacia)将样品加到HitrapTM rProtein A柱(Pharmacia,目录号17-5080-01)上。用结合缓冲液(20mM磷酸钠(pH7.0))洗柱后,用洗脱缓冲液(0.1M甘氨酸-HCl(pH2.7))洗脱。立即用中和缓冲液(1M Tris-HCl(pH9.0))中和洗脱液。利用DC蛋白测定法(BIO-RAD,目录号500-0111)选择抗体的洗脱级分,合并,用Centriprep-YM10(Millipore,目录号4304)浓缩至2mL左右。然后,使用用含150mM NaCl的20mM乙酸缓冲液(pH6.0)平衡化的Superdex20026/60柱(Pharmacia),通过凝胶过滤分离抗体。收集单体级分的峰,利用Centriprep-YM10浓缩,用MILLEX-GW 0.22μm过滤单元(Millipore,目录号SLGV 013SL)过滤后,保存于4℃下。测定被纯化的抗体在280nm处的吸光度,由摩尔吸光系数计算抗体的浓度。
实施例7
FT-KO细胞产生的人源化抗GPC3抗体在体外的ADCC活性
图4示出了当使用人PBMC时FT-KO细胞产生的抗GPC3抗体在体外的ADCC活性。方法如实施例4所述。图中纵轴表示细胞毒活性(%)、横轴表示添加的抗体的浓度(μg/mL)。使用HuH-7作为靶细胞。空心圆表示野生型CHO细胞产生的抗GPC3抗体的活性,涂黑圆表示FT-KO细胞产生的抗GPC3抗体的活性。FT-KO细胞产生的低岩藻糖型抗GPC3抗体与野生型CHO细胞产生的抗GPC3抗体相比,显示较强的ADCC活性,清楚地表明FT-KO细胞产生的抗GPC3抗体的ADCC活性增强。
实施例8
FT-KO细胞产生的人源化抗GPC3抗体的糖链的分析
1.2-氨基苯甲酰胺标记的糖链(2-AB标记的糖链)的制备
用N-糖苷酶F(Roche diagnostics)处理本发明的FT-KO细胞产生的抗体、以及作为对照样品的CHO细胞产生的抗体,使糖链从蛋白质上释放出来(Weitzhandler M.等,Journal of Pharmaceutical Sciences83:12(1994),1670-1675)。用乙醇除去蛋白质后(Schenk B.等,TheJournal of Clinical Investigation 108:11(2001),1687-1695),将糖链浓缩并干燥,用2-氨基吡啶进行荧光标记(Bigge J.C.等,AnalyticalBiochemistry 230:2(1995),229-238)。通过用纤维素柱进行固相提取从2-AB标记的糖链中除去试剂,在离心浓缩后,获得纯化的2-AB标记的糖链。然后,用β-半乳糖苷酶(生化学工业)处理纯化的2-AB标记的糖链,得到缺失半乳糖的2-AB标记的糖链。
2.利用正相HPLC分析缺失半乳糖的2-AB标记的糖链
通过上述方法,将本发明的FT-KO细胞产生的抗体、以及作为对照样品的CHO细胞产生的抗体制备为缺失半乳糖的2-AB标记的糖链,用酰胺柱(Tosoh制TSKgel Amide-80)进行正相HPLC分析,比较色谱图。在CHO细胞产生的抗体中,G(0)为主要成分,G(0)-Fuc占峰面积的4%左右。另一方面,在FT-KO细胞产生的抗体中,G(0)-Fuc为主要成分,在任一细胞株中都占峰面积的90%以上(图5以及表2)。图6示出了G(0)峰以及G(0)-Fuc峰的推测结构。
表2
根据缺失半乳糖的2-AB糖链的正相HPLC分析推断的糖链的相对比
糖链 | CHO | FT-KO-a | FT-KO-b | FT-KO-c |
G(0)-Fuc | 4.0% | 92.4% | 92.5% | 93.2% |
G(0) | 96.0% | 7.6% | 7.5% | 6.8% |
实施例9
FT-KO细胞产生的人源化抗GPC3抗体的热稳定性分析
1.DSC测定用样品溶液的制备
外部透析液为含有200mmol/L氯化钠的20mol/L乙酸钠缓冲液(pH6.0)。将含有700μg当量的抗体溶液的透析膜浸渍在透析液中透析过夜,制备样品溶液。
2.用DSC测定热降解温度
将样品溶液以及参比溶液(外部透析液)充分脱气后,将其分别加入热量计中,在20℃进行热平衡化。然后在20℃~100℃以约1K/分钟的扫描速度进行DSC测定。结果以作为温度函数的降解峰的顶点表示(图7)。发现CHO细胞产生的抗体以及FT-KO细胞产生的抗体的热降解温度是相同的。
参考实施例1
GC33的人源化
从公开的Kabat数据库(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)以及ImMunoGeneTics数据库(IMGT)中得到抗体序列数据,分别对H链可变区、L链可变区进行同源性检索。结果发现H链可变区与DN13(Smithson等,Mol.Immunol.1999;36:113-124)具有高度同源性。还发现L链可变区与登录号为AB064105的人免疫球蛋白κ轻链VLJ区部分cds克隆K64的IGK mRNA具有高度同源性。利用与AB064105具有高度同源性的登录号S40357的信号序列作为L链的信号序列。将CDR移植到上述抗体的构架区中,制备人源化抗体。
具体而言,设计50个碱基左右的合成寡聚DNA,使约20个碱基彼此杂交,用PCR法使上述合成寡聚DNA装配,制备编码各可变区的基因。在插入到合成寡聚DNA的5’末端的HindIII序列处、以及在插入到合成寡聚DNA的3’末端的BamHI序列处进行酶切,将合成寡聚DNA克隆到已克隆有人IgG1恒定区的表达载体HEFgγ1中、或已克隆有人κ链恒定区的表达载体HEFgκ中(Sato等,Mol Immunol.1994;371-381)。将如上构建的人源化GC33的H链和L链分别命名为ver.a。H链和L链都是ver.a的人源化GC33(ver.a/ver.a)与具有小鼠GC33可变区的抗体(小鼠/小鼠)相比,结合活性降低。通过组合小鼠GC33序列和ver.a序列作为H链和L链,制备嵌合抗体(小鼠/ver.a、ver.a/小鼠),评价其结合活性。结果发现ver.a/小鼠抗体的结合活性下降,表明氨基酸置换导致的结合活性的降低原因在于H链。然后制备了修饰的H链,命名为ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.k。所有人源化GC33都显示了与具有小鼠GC33可变区的嵌合抗体同等的结合活性。人源化GC33H链可变区ver.a、ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.k的核苷酸序列在SEQ ID NO:74、75、76、77、78、79、80中示出,其氨基酸序列在SEQ ID NO:81、82、83、84、85、86、87中示出。人源化GC33L链可变区ver.a的核苷酸序列在SEQ ID NO:88中示出,其氨基酸序列在SEQ ID NO:89中示出。在人源化GC33 H链可变区ver.i、ver.j、ver.k中,第6个谷氨酸被置换成谷氨酰胺,上述抗体的热稳定性显著增加。
参考实施例2
人源化GC33L链的改变
关于蛋白质的脱酰胺化,已知依赖于一级序列的脱酰胺化反应速度常数。还已知Asn-Gly特别容易脱酰胺化(Rocinson等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001;98;944-949)。SEQ ID NO:88所示的人源化GC33L链ver.a可变区的CDR1内的Asn33含有一级序列Asn-Gly,推测该残基容易发生脱酰胺化。
为了评价Asn33的脱酰胺化对抗体的结合活性带来的影响,制备了将Asn33置换成Asp的改变抗体。使用Quick Change定点诱变试剂盒(Stratagene)导入点突变。具体而言,使含有125ng有义引物(CTTGTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT:SEQ ID NO:124)、125ng反义引物(ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG:SEQ IDNO:125)、5μL 10×反应缓冲液、1μL dNTP mix、10ng克隆了人源化GC33L链ver.a的HEFgκ、1μL Pfu Turbo DNA聚合酶的50μL反应液进行由95℃30秒、55℃1分钟、68℃9分钟构成的12次循环。反应产物用限制酶DpnI在37℃消化2小时,将其导入XL1-Blue感受态细胞中,得到转化体。从含有正确突变的克隆上切下可变区,再次克隆到表达载体HEFgκ中。使用Fugene 6(Roche)将含有人源化GC33H链ver.k的表达载体HEFgγ1导入COS7细胞中。收集瞬时表达修饰抗体的细胞的培养基上清液。利用使用了抗人IgG抗体的夹心ELISA定量抗体浓度,利用可溶型GPC3核心蛋白质包被的平板通过ELISA评价改变抗体的结合活性。将Asn33置换成Asp的改变抗体(N33D)的结合活性消失,提示在Asn33处发生脱酰胺化对结合活性产生很大影响。
报导了将Gly34置换成其他氨基酸残基将会抑制Asn33的脱酰胺化(WO 03057881A1)。根据上述方法,使用Quick Change定点诱变试剂盒将Gly34置换成除Cys、Met以外的其他17种氨基酸制备一系列改变抗体G34A、G34D、G34E、G34F、G34H、G34N、G34P、G34Q、G34I、G34K、G34L、G34V、G34W、G34Y、G34R、G34S、G34T。使用瞬时表达抗体的COS7细胞的培养上清液评价抗体的结合活性。结果发现即使G34被置换为除Pro(G34P)、Val(G34V)以外的另外一种氨基酸残基,仍能维持结合活性。
上述改变抗体的轻链CDR1的氨基酸序列分别记载于SEQ IDNO:90(G34A)、SEQ ID NO:91(G34D)、SEQ ID NO:92(G34E)、SEQ ID NO:93(G34F)、SEQ ID NO:94(G34H)、SEQ ID NO:95(G34N)、SEQ ID NO:96(G34T)、SEQ ID NO:97(G34Q)、SEQ ID NO:98(G34I)、SEQ ID NO:99(G34K)、SEQ ID NO:100(G34L)、SEQ ID NO:101(G34S)、SEQ IDNO:102(G34W)、SEQ ID NO:103(G34Y)、SEQ ID NO:104(G34R)、SEQ ID NO:105(G34V)、SEQ ID NO:106(G34P)。上述改变抗体轻链可变区的氨基酸序列分别记载于SEQ ID NO:107(G34A)、SEQ ID NO:108(G34D)、SEQ ID NO:109(G34E)、SEQ ID NO:110(G34F)、SEQ ID NO:111(G34H)、SEQ IDNO:112(G34N)、SEQ ID NO:113(G34T)、SEQ ID NO:114(G34Q)、SEQ ID NO:115(G34I)、SEQ ID NO:116(G34K)、SEQ ID NO:117(G34L)、SEQ ID NO:118(G34S)、SEQ IDNO:119(G34W)、SEQ ID NO:120(G34Y)、SEQ ID NO:121(G34R)、SEQ ID NO:122(G34V)、SEQ ID NO:123(G34P)。
参考实施例3
CHO细胞中岩藻糖转运蛋白基因的破坏
1.靶向载体的构建
(1)KO1载体的制备
使用Hyg5-BH和Hyg3-NT引物,由pcDNA3.1/Hygro(Invitrogen)进行PCR,构建潮霉素抗性基因(Hygr),其具有与岩藻糖转运蛋白基因的起始密码子的5’部分相同的序列,在该起始密码子的5’部分添加BamH I位点和TGCGC序列,在含有至SV40polyA添加信号的区域的3’部分添加Not I位点,并且切除Hygr片段。
正向引物
Hyg5-BH 5’-GGA TCC TGC GCA TGA AAA AGC CTG AAC TCACC-3’(SEQ ID NO:128)
反向引物
Hyg3-NT 5’-GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG-3’(SEQ ID NO:129)
岩藻糖转运蛋白的靶向载体ver.1(以下称为KO1载体)是通过在pMC1DT-A载体(Yagi T,Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.87,9918-9922,1990)内插入岩藻糖转运蛋白的5’部分(SEQ ID NO:126所示的核苷酸序列的碱基2,780处的SmaI至碱基4,232处的BamHI)、3’部分(碱基4,284至碱基10,934处的SacI)、以及Hygr片段而构建的载体。KO1载体的特征在于,由于Hygr没有连接启动子,所以发生同源重组时,利用岩藻糖转运蛋白的启动子表达Hygr。但是,如果通过同源重组只向细胞中导入1个拷贝的载体,Hygr的表达不一定获得对潮霉素B的抗性。用NotI切割KO1载体,将其导入细胞中。预期由于KO1载体的导入,岩藻糖转运蛋白将缺失包括起始密码子在内的外显子1的41个碱基对,从而丧失功能。
(2)pBSK-pgk-1-Hygr的制备
利用EcoRI-PstI从pKJ2载体(Popo H,Biochemical Genetics vol.28,p299-308,1990)中切除小鼠pgk-1基因的启动子,并将其克隆到pBluescript(Stratagene)的EcoRI-Pst I位点,由此制备pBSK-pgk-1载体。通过用Hyg5-AV和Hyg3-BH引物,由pcDNA3.1/Hygro进行PCR,在Hygr的5’部分添加EcoT22I位点和Kozak序列,在含有至SV40 polyA添加信号的区域的3’部分添加BamHI位点,然后切除Hygr。
正向引物
Hyg5-AV 5’-ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTCACC-3’(SEQ ID NO:130)
反向引物
Hyg3-BH 5’-GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C-3’(SEQ ID NO:131)
通过将该Hygr(EcoT22I-BamH I)片段插入pBSK-pgk-1的PstI-BamH I位点,制备pBSK-pgk-1-Hygr载体。
(3)KO2载体的制备
岩藻糖转运蛋白的靶向载体ver.2(以下称为KO2载体)是通过在pMC1DT-A载体内插入岩藻糖转运蛋白的5’部分(SEQ ID NO:126所示核苷酸序列的碱基2,780处的SmaI至碱基4,232处的BamHI)、3’部分(碱基4,284至碱基10,934处的SacI)以及pgk-1-Hygr片段而构建的。与KO1载体不同,由于KO2载体中pgk-1基因启动子与Hygr连接,因此,即使通过同源重组只向细胞中导入1个拷贝的载体,也能获得对潮霉素B的抗性。用NotI切割KO2载体并将其导入细胞。预期由于KO2载体的导入,岩藻糖转运蛋白将缺失包括起始密码子在内的外显子1的46个碱基对,从而丧失功能。
(4)pBSK-pgk-1-Puror的制备
用PstI和BamHI切割pPUR载体(BD Biosciences),并将消化的片段(Puror)插入pBSK-pgk-1的PstI-BamHI位点,由此制备pBSK-pgk-1-Puror。
(5)KO3载体的制备
岩藻糖转运蛋白的靶向载体ver.3(以下称为KO3载体)是通过在pMC1DT-A载体中插入岩藻糖转运蛋白的5’部分(SEQ ID NO:126所示核苷酸序列的碱基2,780处的SmaI至碱基4,232处的BamHI)、3’部分(碱基4,284至碱基10,934处的SacI)以及pgk-1-Puror片段而构建的。另外,在pgk-1-Puror的3’末端连接与用于以下所示筛选的引物结合的序列。用NotI切割KO3载体并将其导入细胞。预期由于KO3载体的导入,岩藻糖转运蛋白将缺失包括起始密码子在内的外显子1的46个碱基对,从而丧失功能。
反向引物
RSGR-A 5’-GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C-3’(SEQID NO:132)
利用以上3种靶向载体敲除岩藻糖转运蛋白基因。
2.载体向CHO细胞内的导入
在CHO-S-SFMII HT(Invitrogen,目录号12052-098)中加入相对于CHO-S-SFMII HT的体积分别为1/100的量的HT补充物(100×)(Invitrogen,目录号11067-030)和青霉素-链霉素(Invitrogen,目录号15140-122)。CHO DXB11细胞在该培养基(以下称为SFMII(+))中传代培养,该SFMII(+)培养基也用于在基因转移后培养细胞。以8×106个细胞/0.8mL的浓度,使CHO细胞悬浮于Dulbecco磷酸盐缓冲液(以下简称为PBS。Invitrogen,目录号14190-144)中。向细胞悬浮液中加入30μg靶向载体,将细胞悬浮液移入Gene Pulser杯(4mm)(Bio-Rad,目录号1652088)。该杯在冰上放置10分钟后,用GENE-PULSER II(Bio-Rad,编号340BR)在1.5kV、25μFD的条件下,通过电穿孔法将载体导入细胞。导入载体后,将细胞悬浮于200ml SFMII(+)培养基中,以100μl/孔转移到20块96孔平底平板(Iwaki,目录号1860-096)上。将平板在CO2培养箱内于37℃培养24小时后,添加试剂。
3.敲除的第一阶段
将KO1载体或KO2载体导入CHO细胞,24小时后利用潮霉素B(Invitrogen,目录号10687-010)筛选细胞。潮霉素B溶解于SFMII(+)中,浓度可达0.3mg/ml,以100μl/孔添加。
4.利用PCR进行的同源重组体的筛选
(1)PCR用样品的制备
利用PCR法对同源重组体进行了筛选。在96孔板中培养在筛选中使用的CHO细胞。除去培养上清液除后以50μl/孔加入细胞溶解用缓冲液,将细胞首先在55℃下加热2小时,然后在95℃下加热15分钟,使蛋白酶K失活,制备PCR的模板。每个孔中的细胞溶解用缓冲液包括5μl 10×LA缓冲液II(Takara Bio Inc.,添加有LA Taq)、2.5μl10%NP-40(Roche,目录号1332473)、4μl蛋白酶K(20mg/ml,Takara BioInc.,目录号9033)以及38.5μl蒸馏水(Nacalai Tesque,目录号36421-35)。
(2)PCR的条件
PCR反应混合物含有上述PCR样品1μl、10×LA缓冲液II 5μl、MgCl2(2.5mM)5μl、dNTP(2.5mM)5μl、引物(各10μM)2μl、LATaq(5IU/μl目录号RR002B)0.5μl、以及蒸馏水29.5μl(共计50μl)。在导入了KO1载体的细胞的筛选中,使用TP-F4和THygro-R1作为PCR引物,在导入了KO2载体的细胞的筛选中,使用TP-F4和THygro-F1作为PCR引物。
导入了KO1载体的细胞的PCR条件是在95℃进行1分钟的预加热,将95℃30秒钟、60℃30秒钟、以及60℃2分钟的扩增循环进行40次循环,并在72℃下进行7分钟的再加热。导入了KO2载体的细胞的PCR条件包括:在95℃下进行1分钟的预加热,将95℃30秒钟、以及70℃3分钟的扩增循环进行40次循环,并在70℃下进行7分钟的再加热。
使用的引物如下所示。在与KO1载体或KO2载体发生了同源重组的细胞样品中,分别约1.6kb或2.0kb的DNA将被扩增。引物TP-F4针对载体外侧岩藻糖转运蛋白5’基因组区域进行设计、THygro-F1以及THygro-R1针对该载体内的Hygr基因进行设计。
正向引物(KO1,KO2)
TP-F45’-GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACTCGC-3’(SEQ ID NO:133)
反向引物(KO1)
THygro-R1 5’-TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC-3’(SEQ ID NO:134)
反向引物(KO2)
THygro-F 15’-GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGGAAT AGC-3’(SEQ ID NO:135)
5.PCR筛选结果
对总共918个导入了KO1载体的细胞进行分析,其中,1个细胞被认为是同源重组体(同源重组率约0.1%)。对总共537个导入了KO2载体的细胞进行分析,其中,17个细胞被认为是同源重组体(同源重组率约3.2%)。
6.Southern印迹分析
进一步通过Southern印迹法确认同源重组。根据标准方法由培养的细胞制备总共10μg基因组DNA,以在Southern印迹中分析。使用以下二种引物进行PCR,制备387bp的探针,该探针对应于SEQ ID NO:126所示核苷酸序列的碱基2,113至2,500的区域,用于Southern印迹法。用BglII切割基因组DNA。
正向引物
Bgl-F:5’-TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC-3’(SEQ IDNO:136)
反向引物
Bgl-R:5’-CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C-3’(SEQ ID NO:137)
通过用Bgl II切割,印迹显示出来自岩藻糖转运蛋白染色体的约3.0kb的带、来自与KO1载体发生同源重组的染色体的约4.6kb的带、来自与KO2载体发生同源重组的染色体的约5.0kb的带。实验包括1种与KO1载体发生同源重组的细胞以及7种与KO2载体发生同源重组的细胞。与KO1载体同源重组获得的唯一细胞被命名为5C1,以后的分析表明该细胞包括多个细胞群体。因此在用于实验前通过有限稀释对该细胞进行克隆。与KO2载体同源重组得到的细胞之一被命名为6E2。
7.敲除的第二阶段
使用3种载体,由与KO1载体以及KO2载体发生同源重组的细胞建立岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞株。如下进行载体和细胞的组合。方法1组合KO2载体和5C1细胞(KO1)、方法2组合KO2载体和6E2细胞(KO2)、方法3组合KO3载体和6E2细胞(KO2)。将每种载体导入合适的细胞中,24小时后利用潮霉素B、嘌呤霉素(NacalaiTesque,目录号29455-12)开始筛选。潮霉素B在方法1中的最终浓度为1mg/ml、在方法2中的最终浓度为7mg/ml。在方法3中,潮霉素B的最终浓度是0.15mg/ml、嘌呤霉素的最终浓度是8μg/ml。
8.利用PCR进行的同源重组体的筛选
为了筛选来自方法1的细胞,进行PCR,以检测与KO1载体以及KO2载体都发生同源重组的细胞。为了筛选来自方法2的细胞,设计下述PCR引物:TPS-F1设计在SEQ ID NO:126的碱基3,924-3,950的区域中,SHygro-RI设计在碱基4,248-4,274的区域中。该PCR引物将扩增具有因KO2载体而引起的缺失的岩藻糖转运蛋白基因区域的350bp。所以,在方法2中的PCR筛选中,不产生350bp的扩增产物的细胞被认为是岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞。PCR的条件是在95℃下预加热1分钟,将95℃30秒钟、70℃1分钟的扩增循环进行35次循环,并在70℃下进行7分钟的再加热。
正向引物
TPS-F1:5’-CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC-3’(SEQ ID NO:138)
反向引物
SHygro-RI:5’-TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC-3’(SEQ ID NO:139)
方法3中,正向引物使用TP-F4、反向引物使用RSGR-A。PCR的条件是在95℃预加热1分钟,将95℃30秒钟、60℃30秒钟、72℃2分钟的扩增循环进行35次循环,并在72℃下再加热7分钟。在与KO3载体发生同源重组的细胞的样品中,扩增约1.6kb的DNA。通过该PCR程序检测与KO3载体发生同源重组的细胞,以及与KO2载体发生同源重组的细胞。
9.PCR筛选结果
在方法1中,总共分析了616个细胞,其中同源重组体细胞有18个(同源重组率为2.9%)。在方法2中,总共分析了524个细胞,其中同源重组体细胞有2个(同源重组率约为0.4%)。在方法3中,总共分析了382个细胞,其中同源重组体细胞有7个(同源重组率约为1.8%)。
10.Southern印迹分析
根据上述方法进行Southern印迹分析。结果在被分析的细胞中发现1个岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞。在第一阶段的敲除中,PCR与Southern印迹的分析结果是一致的,但在第二阶段的敲除中,结果不一致。其可能的原因在于:1.在方法1中与KO1或KO2独立发生同源重组的细胞混合在一起;2.岩藻糖转运蛋白基因不是一对(2个基因),而是数对(或3个基因以上);3.在敲除第一阶段建立的细胞株的培养过程中,残留在传代培养的细胞中的岩藻糖转运蛋白基因的拷贝数增加。
11.岩藻糖表达的分析
通过PCR分析被判断为同源重组体的26个细胞中的岩藻糖表达。用100ul含有5μg/mL小扁豆凝集素、FITC偶联物(VectorLaboratories,目录号FL-1041)、2.5%FBS、0.02%叠氮钠的PBS(以下称为FACS溶液),在冰浴中将总计1×106个细胞染色1小时。然后,用FACS溶液清洗细胞3次,用FACSCalibur(Becton Dickinson)进行分析。结果表明只有在Southern印迹分析中被判断为岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞的岩藻糖表达下降。
通过以上结果,可以做出如下判断。
根据在被筛选的616个细胞中只有1个岩藻糖转运蛋白基因完全缺失的细胞这一事实,同源重组的频率约为0.16%,很低。如上所述,在敲除第二阶段中PCR与Southern印迹分析的结果不一致有几个可能的原因。但在方法3中得到的细胞株可能不含与KO2载体和KO3载体独立发生同源重组的细胞的混合物,因为使用了2种试剂进行筛选。另外,通过PCR判断为发生同源重组的其他细胞株都包括多个细胞群体也是不可能的。如上所述,如果存在3个或3个以上的岩藻糖转运蛋白基因,则该基因在细胞中的寻靶将非常困难。只有使用KO1载体之类的难以表达Hygr的载体,并筛选大量的细胞,才能得到同源重组体。
Claims (11)
1.一种抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体组合物,其包含具有重链可变区和轻链可变区的抗体,该重链可变区包含其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的CDR1、其氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的CDR2和其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示的CDR3,该轻链可变区包含其氨基酸序列如SEQ ID NO:45所示的CDR1、其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3,其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为20%以上。
2.一种抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体组合物,其包含具有以下(1)-(7)中任一项的重链可变区和其氨基酸序列如SEQ ID NO:89所示的轻链可变区的抗体:
(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO:81所示的重链可变区;
(2)其氨基酸序列如SEQ ID NO:82所示的重链可变区;
(3)其氨基酸序列如SEQ ID NO:83所示的重链可变区;
(4)其氨基酸序列如SEQ ID NO:84所示的重链可变区;
(5)其氨基酸序列如SEQ ID NO:85所示的重链可变区;
(6)其氨基酸序列如SEQ ID NO:86所示的重链可变区;或
(7)其氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示的重链可变区,
其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为20%以上。
3.一种抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体组合物,其包含具有重链可变区和轻链可变区的抗体,该重链可变区包含其氨基酸序列如SEQ ID NO:25所示的CDR1、其氨基酸序列如SEQ ID NO:26所示的CDR2和其氨基酸序列如SEQ ID NO:27所示的CDR3,该轻链可变区包含以下(1)-(15)中任一项的CDR1、CDR2和CDR3:
(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO:90所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(2)其氨基酸序列如SEQ ID NO:91所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(3)其氨基酸序列如SEQ ID NO:92所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(4)其氨基酸序列如SEQ ID NO:93所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(5)其氨基酸序列如SEQ ID NO:94所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(6)其氨基酸序列如SEQ ID NO:95所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(7)其氨基酸序列如SEQ ID NO:96所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(8)其氨基酸序列如SEQ ID NO:97所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(9)其氨基酸序列如SEQ ID NO:98所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(10)其氨基酸序列如SEQ ID NO:99所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(11)其氨基酸序列如SEQ ID NO:100所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(12)其氨基酸序列如SEQ ID NO:101所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(13)其氨基酸序列如SEQ ID NO:102所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(14)其氨基酸序列如SEQ ID NO:103所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3;
(15)其氨基酸序列如SEQ ID NO:104所示的CDR1,其氨基酸序列如SEQ ID NO:46所示的CDR2,和其氨基酸序列如SEQ ID NO:60所示的CDR3,
其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为20%以上。
4.一种抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体组合物,其包含具有其氨基酸序列如SEQ ID NO:87所示的重链可变区和选自以下(1)-(15)的轻链可变区的抗体:
(1)其氨基酸序列如SEQ ID NO:107所示的轻链可变区;
(2)其氨基酸序列如SEQ ID NO:108所示的轻链可变区;
(3)其氨基酸序列如SEQ ID NO:109所示的轻链可变区;
(4)其氨基酸序列如SEQ ID NO:110所示的轻链可变区;
(5)其氨基酸序列如SEQ ID NO:111所示的轻链可变区;
(6)其氨基酸序列如SEQ ID NO:112所示的轻链可变区;
(7)其氨基酸序列如SEQ ID NO:113所示的轻链可变区;
(8)其氨基酸序列如SEQ ID NO:114所示的轻链可变区;
(9)其氨基酸序列如SEQ ID NO:115所示的轻链可变区;
(10)其氨基酸序列如SEQ ID NO:116所示的轻链可变区;
(11)其氨基酸序列如SEQ ID NO:117所示的轻链可变区;
(12)其氨基酸序列如SEQ ID NO:118所示的轻链可变区;
(13)其氨基酸序列如SEQ ID NO:119所示的轻链可变区;
(14)其氨基酸序列如SEQ ID NO:120所示的轻链可变区;和
(15)其氨基酸序列如SEQ ID NO:121所示的轻链可变区,
其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为20%以上。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体组合物,其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为50%以上。
6.如权利要求1-4中任一项所述的抗体组合物,其特征在于,其糖链组成发生变化,使得岩藻糖缺失的抗体的比例为90%以上。
7.一种使用细胞制备抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的方法,其特征在于,将编码如权利要求1~6中任一项所述的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的基因导入向糖链上添加岩藻糖的能力降低的所述细胞内。
8.如权利要求7所述的制备抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的方法,其中,向糖链上添加岩藻糖的能力降低的细胞是岩藻糖转运蛋白缺失的细胞。
9.如权利要求7所述的制备抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的方法,其中,所述细胞具有在糖链上形成平分型N-乙酰葡糖胺结构的能力。
10.如权利要求8所述的制备抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的方法,其中,所述细胞具有含有编码N-乙酰葡糖胺转移酶III的DNA的表达载体。
11.一种抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的制备方法,该方法包括以下步骤:
(a)将编码如权利要求1-4中任一项所述的抗磷脂酰肌醇聚糖3抗体的基因导入向糖链上添加岩藻糖的能力降低的细胞内,和
(b)培养该细胞。
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