KR20070070222A

KR20070070222A - 변형된 당쇄를 갖는 항-글리피칸 3 항체

Info

Publication number: KR20070070222A
Application number: KR1020077011403A
Authority: KR
Inventors: 기요타카 나카노; 이즈미 스고; 마사미키 스기모토; 다카히로 이시구로; 메구미 다나카; 시게우키 아이지마
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-10-26
Filing date: 2005-10-26
Publication date: 2007-07-03
Also published as: EP1816140A1; CA2585196C; TW200621980A; WO2006046751A1; CN101068836A; RU2007119579A; MX2007004593A; IL182662A; CR9151A; US20110033452A1; CN101068836B; CA2585196A1; TWI468514B; BRPI0518279A2; JPWO2006046751A1; ZA200703888B; US20080124330A1; AU2005297772A1; NO20072366L; AU2005297772B2

Abstract

당쇄가 변형된 항-글리피칸 3 항체, 보다 구체적으로는 푸코스가 결손된 항-글리피칸 3 항체가 개시된다. 본 발명의 당쇄가 변형된 항-글리피칸 3 항체는, YB2/0 세포와 같은, 푸코스를 부가하는 능력이 저하된 숙주세포와 푸코스 트랜스포터 결손세포에 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 핵산을 도입하는 것을 포함하는 방법으로 제조할 수 있다. 본 발명의 당쇄가 변형된 항-글리피칸 3 항체는, 높은 세포독성활성을 갖고, 그러므로 항암제와 같은 세포증식억제제로서 유용하다.

당쇄 변형, 항-글리피칸 항체, 푸코스

Description

변형된 당쇄를 갖는 항-글리피칸 3 항체 {ANTI-GLYPICAN 3 ANTIBODY HAVING MODIFIED SUGAR CHAIN}

본 발명은, 세포독성 활성, 특히 항체의존성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)이 증강된 글리피칸 3 항원에 대한 항체(항-글리피칸 3 항체) 및 그 제조방법에 관한 것이다.

글리피칸 3(GPC3)는, 세포 표면상에 존재하는 헤파란 황산 프로테오글리칸 류(proteoglycan family)의 하나로, 발생에서의 세포분열이나, 암세포의 증식에 관여하고 있을 가능성이 시사되어 있으나, 그 기능은 아직 잘 해명되어 있지 않은 상태다.

GPC3에 결합되는 어느 종류의 항체가, ADCC(항체의존성 세포독성) 활성 및 CDC(상보체 의존성 세포독성) 활성에 의한 세포증식을 억제한다는 것이 발견되었다(W02003/000883). 또, GPC3은 생체 내에서 절단되고 가용형 GPC3으로서 혈중에 분비되어, 이를 검출할 수 있는 항체를 이용해서 암의 진단이 가능하다는 것이 시사되어 있다(W02004/022739, W02003/100429, W02004/0 18667).

항체의 세포독성 활성(antibody cytotoxic activity)을 이용한 항암제를 개발하는 경우, 쓰이는 항체는 높은 ADCC 활성을 갖고 있을 것이 바람직하기 때문에, GPC3를 인식하는 항체에서도 높은 세포독성 활성을 가진 항-GPC3 항체가 요망되고 있다.

항체의 ADCC 활성을 증강하는 방법으로는, 항체의 당쇄를 변형하는 방법이 알려져 있다. 예를 들면, WO 99/54342에는, 항체의 글리코실화를 수식함으로써 ADCC 활성을 개량하는 것이 기재되어 있다. 또, WO 00/61739에는, 항체의 당쇄에서의 푸코스의 존부에 의해 ADCC 활성을 조절하는 것이 기재되어 있다. WO 02/31140에는, YB2/0 세포에서 항체를 생산함으로써, α-1,6 코어 푸코스를 함유하지 않은 당쇄를 가진 항체를 조제하는 것이 기재되어 있다. WO 02/79255에는, 이등분된 GlcNAc를 가진 당쇄를 가진 항체가 기재되어 있다. 그러나, 당쇄의 변경에 의해 ADCC 활성이 증강된 항-글리피칸 3 항체는 알려져 있지 않다.

따라서, 본 발명은 당쇄 조성의 변형에 의해 ADCC 활성이 증강된 항-글리피칸 3 항체 조성물 및 그 제조방법을 제공하려는 것이다.

본 발명자는 상기의 과제를 해결하기 위해 여러 가지로 검토한 결과, 글리피칸 3을 표적으로 한 경우에도, α-1,6 코어 푸코스(α-1,6 core fucose)가 결손된 당쇄를 갖는 항체가 높은 세포독성 활성을 가진 것을 알아내었다. 따라서, 본 발명은, 당쇄 조성이 변형된 항-글리피칸 3 항체 조성물, 보다 구체적으로는 푸코스가 결손된 항-글리피칸 3 항체의 비율이 증가한 항체 조성물을 제공한다. 본 발명의 당쇄변형 항-글리피칸 3 항체 조성물은, 높은 세포독성 활성을 가지므로, 항암제 등과 같은 세포증식 억제제로 유용하였다.

본 발명은 또, 상기의 당쇄가 변형된 항체의 제조방법에서, YB2/0 세포 등의 푸코스를 부가하는 능력이 저하된 숙주세포에 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 핵산을 도입해서, 당해 숙주세포를 배양함으로써 당해 항체를 취득하는 것을 특징으로 하는 항-글리피칸 3 항체 조성물의 제조방법을 제공한다. 바람직하기는, 당쇄에 푸코스를 부가하는 능력이 감소되어 있는 세포는 푸코스 트랜스포터 결손 세포이다.

도 1은 N-글리코실 결합 당쇄의 기본구조를 나타낸다.

도 2는 각 키메라 항체의, 인간 PBMC를 쓰고 HepG2를 표적세포로 한 경우의 ADCC 활성을 나타낸다.

도 3은 각 키메라 항체의, 인간 PBMC를 쓰고 HuH7를 표적세포로 한 경우의 ADCC 활성을 나타낸다.

도 4는 각 항체의, 인간 PBMC를 쓰고 HuH-7을 표적세포로 한 경우의 ADCC 활성을 나타낸다.

도 5는 FT-KO 세포생산항체(a. b. c) 및 CHO 세포생산의 항체로부터 조제한 아갈락토실 2-AB화 당쇄의 정상 HPLC 크로마토그램을 나타낸다.

도 6은 도 5에 나타내어진 피크 G(0) 및 G(0)-Fuc의 추정구조를 나타낸다.

도 7은 FT-KO 세포생산항체(a) 및 CHO 세포생산의 항체(b)에 대해 DSC(시차주사 열량계) 측정 차트를 나타낸다.

본 발명은, 당쇄 조성이 변형된 항-글리피칸 3 항체 조성물을 특징으로 한 다. 항체의 세포독성 활성의 발현에는, 항체에 결합된 당쇄의 구조가 큰 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 항체에 결합되는 당쇄에는, 항체 분자의 아스파라긴의 측쇄의 N 원자에 결합되는 N-글리코시드 결합 당쇄와, 항체 분자의 세린 또는 스레오닌의 측쇄 히드록실기에 결합되는 O-글리코실 결합 당쇄가 있는바, 본 발명에서 푸코스의 존부가 문제로 되는 것은 N-글리코시드 결합 당쇄이다.

항체에 결합되는 N-글리코시드 결합 당쇄의 기본구조를 도 1에 나타내었다. N-글리코실 결합 당쇄는 도 1의 IgG 기본당쇄 (1) 및 (3)에 도시된 것과 같이, 1개의 맨노스(Man)와 2개의 N-아세틸 글루코사민(GIcNAc)이 β1,4 결합으로 결합된 기본구조(코어) 「-Manβ1 - 4 GIcNACβ1 - 4 GIcNAc-」를 가지며, 여기서 구조의 우측의 GIcNAc를 환원말단으로 명칭하고, 좌측의 Man를 비환원말단으로 명칭한다. 푸코스(Fuc)가 환원말단에 결합되어 있는 경우, 이는 주로 환원말단의 N-아세틸 글루코사민의 6-위치와 푸코스의 1-위치 사이에 α-결합을 형성한다. 한편, 도 1의 IgG 기본당쇄 (2)에 도시된 당쇄에서는, 기본구조(코어)의 비환원말단에 상기 2개의 당쇄 외에 1개의 N-아세틸 글루코사민(GIcNAc)이 β1,4-결합으로 결합되어 있다. 이 N-아세틸 글루코사민(GIcNAc)은 「이등분 N-아세틸 글루코사민」이다. 이등분 N-아세틸 글루코사민을 가진 당쇄는, O-글리코시드-결합 당쇄 또는 N-글리코시드-결합 당쇄로서, N-아세틸 글루코사민 트란스퍼라제 III(GnTIII)에 의해 N-아세틸 글루코사민을 당쇄에 전이시킴으로써 형성된다. 이 효소를 코드하는 유전자는 이미 클로닝 되어 있고, 그 아미노산 서열 및 그를 코드하는 DNA의 뉴클레오티드 서열은 이미 기재되어 있다(NCBI 데이터베이스(ACCESSION D13789)).

본 발명에서, 당쇄 조성이 변형된 항체 조성물(당쇄 변형 항체 조성물)이라 함은, 기준이 되는 숙주세포에서 생산되는 항체 조성물과는 다른 당쇄 조성을 가진 항체 조성물을 말한다.

본 발명에서, 당쇄 조성이 변형되었는지 여부는, 기준이 되는 숙주세포에서 생산되는 항체 조성물을 기준으로 해서 판단할 수 있다. 기준이 되는 항체 조성물과 다른 당쇄 조성을 가진 항체 조성물인 경우, 그 항체 조성물은 당쇄 조성이 변형된 항체 조성물로 된다.

본 발명에서 기준이 되는 숙주세포는 CHO DG44 이다. CHO DG44는, 예를 들면 인비트로겐사(Invitrogen)로부터 입수할 수 있다.

당쇄 조성이 변형된 항체 조성물의 예로는 항체 조성물 중의 푸코스(예를 들면, α-1,6 코어 푸코스(α-1,6 core fucose) 결손 항체의 비율이 증가한 항체 조성물이나 항체 조성물 중의 이등분 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 부가 항체의 비율이 증가한 항체 조성물 등을 들 수 있다.

본 발명의 바람직한 태양으로서는, 푸코스 결손 항체의 비율이 기준이 되는 항체 조성물과 비교해서 높은 항체 조성물을 들 수 있다.

한편, 항체에는 복수개의 N-글리코실 당쇄를 가진 것도 있기 때문에, 본 발명의 푸코스 결손 항체에는, 푸코스가 전혀 부가되어 있지 않은 항체뿐 아니라, 부가되어 있는 푸코스의 수가 감소되어 있는 항체(적어도 1개 이상의 당쇄에서 푸코스가 부가되어 있지 않은 항체) 등도 포함된다.

숙주세포에서 당쇄가 변형된 항체를 제조하는 경우, 모두 동일한 당쇄를 가 진 균일한 항체를 함유하는 조성물을 얻는 데에는 곤란한 점이 많다. 따라서, 예를 들면, 당쇄 조성이 변형된 항체 조성물이 푸코스 결손 항체의 비율이 증가한 항체 조성물인 경우, 본 발명의 당쇄 조성이 변형된 항체 조성물에는 푸코스가 결손된 항체와 푸코스가 결손 되어 있지 않은 항체의 양쪽이 포함될 수가 있으나, 푸코스가 결손된 항체의 비율이, 기준으로 되는 숙주세포에서 만들어진 항체 조성물 보다도 높다. 본 발명의 푸코스 결손 항체의 비율이 높은 항체 조성물에서, 푸코스 결손 비율은 특히 한정되지 않는바, 바람직하기는 20% 이상, 보다 바람직하기는 50% 이상, 더 바람직하기는 90% 이상이다.

또, 본 발명의 이등분 N-아세틸 글루코사민 부가 항체의 비율이 높은 항체 조성물에서, 이등분 N-아세틸 글루코사민 부가 항체의 비율은 특별히 제한되지 않지만, 바람직하기는 20% 이상, 보다 바람직하기는 50% 이상, 더 바람직하기는 90% 이상이다.

본 발명의 당쇄 조성이 변형된 항-글리피칸 3 항체 조성물은, 당업자로서는 공지의 방법으로 얻을 수 있다.

예를 들면, 푸코스 결손 항체는, α-1,6 코어 푸코스를 부가하는 능력을 갖지 않거나 또는 그 능력이 낮은 숙주세포 중에서 항-글리피칸 3 항체를 발현시킴으로써 제조할 수 있다.

푸코스를 부가하는 능력을 갖지 않은 또는 그 능력이 낮은 숙주세포는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 푸코스 전이활성이 결손되거나 또는 낮아진 숙주세포, 골지체 내의 푸코스 농도가 낮아져 있는 숙주세포 등을 들 수 있다. 보다 구체 적으로는, 래트 골수종 YB2/3HL.P2.G11.16Ag.20 세포(YB2/0 세포로 약칭)(ATCC CRL 1662로서 보존되어 있는), FTVIII 녹아웃 CHO 세포(WO 02/31140), Lec13 세포(W0 03/035835), 푸코스 트랜스포터 결손 세포 (WO 2005/017155) 등을 들 수 있다.

푸코스 트랜스포터 결손 세포라 함은, 푸코스 트랜스포터의 존재량이 정상세포보다 적거나, 또는 푸코스 트랜스포터의 구조에 변이를 가짐으로써, 푸코스 트랜스포터의 기능이 저하되어 있는 세포이다. 푸코스 트랜스포터 결손 세포로는, 예를 들면 푸코스 트랜스포터 유전자가 녹아웃되어 있는 세포(이하, FT-KO 세포라 함), 푸코스 트랜스포터 유전자의 일부가 결손 또는 변형되어 있는 세포, 푸코스 트랜스포터 유전자의 발현계에 결함을 가진 세포 등을 들 수 있다. 차이니즈 햄스터의 푸코스 트랜스포터를 코드하는 유전자의 뉴클레오티드 서열 및 푸코스 트랜스포터의 아미노산 서열을 각각 SEQ ID NO: 126 및 127에 나타내었다.

또, SEQ ID NO: 126에 나타낸 뉴클레오티드 서열을 이용해서, RNAi 간섭(RNA interference: RNAi)을 이용하여도 본 발명의 푸코스 트랜스포터 결손 세포를 취득할 수 있다. RNAi는 이중가닥 RNA(dsRNA)를 세포 내로 도입했을 때에, 그 RNA 서열에 대응하는 세포 내의 mRNA가 특이적으로 분해되어, 단백질로서 발현되지 않게 되는 현상을 말한다. RNAi의 경우, 통상 이중가닥 RNA가 이용되지만, 특히 한정되지 않고, 예를 들면 자기-상보적인 단일가닥 RNA 중에서 형성되는 이중가닥을 이용할 수도 있다. 이중가닥을 형성하는 영역은, 모든 영역에서 이중가닥을 형성하고 있거나, 일부의 영역(예를 들면 양쪽 말단 또는 한쪽 말단)이 단일가닥으로 되어 있을 수 있다. RNAi에 사용되는 올리고 RNA는 그 길이가 한정되지 않는다. 본 발명의 올 리고 RNA의 길이로서는, 예를 들면, 5 ~ 1000 염기(3본쇄인 경우에는 5 ~ 1000bp)로서, 바람직하기는 10 ~ 100 염기(이중가닥의 경우에는 10 ~ 100bp)로서, 더 바람직하기는 15 ~ 25 염기(이중가닥의 경우에는 15 ~ 25bp)이고, 특히 바람직하기는 19 ~ 23 염기(이중가닥의 경우에는 19 ~ 23bp)이다.

앞에서 설명한 바와 같이 RNAi법은, 어느 유전자와 상동인, 센스 RNA와 안티센스 RNA로 된 이중가닥 RNA(double-strand RNA; dsRNA)이, 그 유전자의 전사 산물(mRNA)의 상동부분을 파괴하는 현상을 이용한 방법이다. 이용하는 푸코스 트랜스포터 유전자의 전장서열에 대응하는 이중가닥 RNA를 이용하여도 좋고, 일부의 서열에 대응하는 짧은(예를 들면, 21 ~23bp의) dsRNA(small interfering RNA; siRNA)를 이용할 수 있다. 당해 이중가닥 RNA는, 직접 세포에 취입할 수 있고, 3본쇄 RNA를 생산하는 벡터를 만들어 숙주세포에 도입해서 세포 내에서 이중가닥 RNA를 생산할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 푸코스 트랜스포터를 코드하는 DNA의 전부 또는 일부를 역방향의 반복서열로 되도록 벡터에 조립하고, 그리고 당해 벡터를 숙주세포에 도입할 수 있다. RNAi법은, Fire A. et al., Nature(1998), 391, 806-811, Montgomery M. K. et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA(1998), 95, 15502-15507; Timmons L. et al., Nature(1998), 395, 854; Sanchez A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1999), 96, 5049-5054; Misquitta L. et al., Proc. NatI. Acad. Sci. USA(1999), 96, 1451-1456, Kennerdell J. R. et al., Cell(1998), 95, 1017-1026, Waterhouse P. M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1998), 95, 13959- 13964, Wianny F. et al., Nature Cell Biol.(2000), 2, 70-75 등의 기재에 따라 실행할 수 있다.

RNAi법 등에 의해 취득되는 푸코스 트랜스포터 결손 세포의 스크리닝은 푸코스 트랜스포터의 활성을 지표로 실행될 수 있다. 스크리닝은 또한 웨스턴 블롯팅이나 노던 블롯팅에 의한 푸코스 트랜스포터 유전자의 전사, 발현을 지표로 해서 실행될 수 있다.

또, 당쇄에 이등분 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc)이 부가된 항체는, 당쇄에 이등분 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 구조를 형성하는 능력을 가진 숙주세포 중에서 항-글리피칸 3 항체를 발현시켜줌으로써 제조할 수 있다.

이등분 N-아세틸 글루코사민이 부가된 당쇄를 가진 항체의 제조방법은 이미 공지되어 있다(WO 02179255). 당쇄에 이등분 N-아세틸 글루코사민(GlcNAc) 구조를 형성하는 능력을 가진 숙주세포는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, GnTIII을 코딩하는 DNA를 함유하는 발현벡터를 가진 숙주세포를 이용할 수 있다. 따라서, GnTIII을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터 및 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 발현벡터를 가진 숙주세포를 이용해서, 이등분 N-아세틸 글루코사민이 부가된 당쇄를 갖는 항-글리피칸 3 항체를 제조할 수 있다. GnTIII을 코드하는 DNA와 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 유전자는 동일한 벡터 상에 존재할 수 있고, 다른 벡터 상에 존재할 수도 있다.

또, 항체 조성물 중의 푸코스 결손 항체 또는 이등분 N-아세틸 글루코사민 부가 항체의 비율을 증가시키는 다른 방법으로서, 푸코스 결손 항체 또는 이등분 N-아세틸 글루코사민 부가 항체를 정제함으로써 조성물 중의 그들 항체의 비율을 증가시키는 방법을 들 수 있다.

당쇄의 해석은 당업자로서는 공지의 방법으로 실행할 수 있다. 예를 들면, 항체에 N-Glycosidase F(Roche) 등을 작용시켜 당쇄를 항체로부터 유리시킨다. 그 후, 셀룰로오스 카트리지를 이용한 고체상 추출(Shimizu Y. et al., Carbohydrate Research 332(2001), 381-388)에 의한 탈염 후에 농축시키고, 건조시켜, 2-아미노 피리딘에 의한 형광표지를 실행한다(Kondo A. et ak., Agricultural and Biological Chemistry 54:8(1990), 2169-2170). 얻어진 PA화 당쇄를 셀룰로오스 카트리지를 이용한 고체상 추출로 탈시약한 후 원심농축하여, 정제 PA화 당쇄로 한다. 그 후, ODS 칼럼에 의한 역상 HPLC 분석을 실행함으로써 측정할 수 있다. 또, PA화 당쇄의 조제를 실행한 후, ODS 칼럼에 의한 역상 HPLC 분석 및 아민 칼럼에 의한 정상 HPLC 분석을 조합시킨 2차원 매핑을 실시함으로써 실행할 수도 있다.

본 발명에서 당쇄가 개편되는 항-글리피칸 3 항체는, 글리피칸 3에 결합되는 항체이면 특히 한정되지 않는다. 글리피칸 3에의 결합은 특이적인 것이 바람직하다. 본 발명에서 바람직한 항-글리피칸 3 항체로는, 이하의 표 1에 나타나 있는 CDR 서열을 가진 항체를 들 수 있다.

표 1

표 1(계속)

표 1(계속)

표 1(계속)

상기 표 1에 기재된 CDR 서열을 가진 항체는 높은 세포독성 활성을 갖는다. 상기 표에 기재된 CDR 서열을 가진 항체는, 글리피칸 3 상의 아미노산 번호 524-563의 에피토프를 인식한다. 아미노산 번호 524-563의 에피토프를 인식하는 항체는 세포독성 활성이 높기 때문에, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체로서 바람직하다.

본 발명의 1가지 바람직한 태양에서는, 본 발명의 당쇄 조성이 변형된 항체 조성물은 ADCC 활성이 증강되어 있는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 ADCC 활성이 증강되어 있는지 여부는, 기준으로 되는 항체 조성물과 비교해서, 당해 기준보다도 높은 ADCC 활성을 나타낸 경우에는 ADCC 활성이 증강되어 있다고 판단하게 된다.

ADCC 활성의 측정은 당업자로서는 공지의 방법으로 실행할 수가 있고, 예를 들면, 이펙터 세포, 표적세포 및 항-글리피칸 3 항체를 혼합하고, ADCC의 정도를 조사함으로써 측정할 수 있다. 보다 구체적으로는, 예를 들면, 이펙터 세포로서 마우스 비장세포, 말초혈이나 골수로부터 분리한 인간 단핵구 등을 이용하고, 표적세포로는 인간 간세포성 암종 세포주 HuH-7 등의 글리피칸 3을 발현하는 인간 세포를 이용한다. 표적세포를 미리 ⁵¹Cr에 의해 표지하고, 이에 항-글리피칸 3 항체를 가해 서 인큐베이션을 실행하고, 그 후 표적세포에 대해 적절한 비율의 이펙터 세포를 가해서 인큐베이션을 실행한다. 인큐베이션 후 상청을 채취하고, 상청 중의 방사활성을 카운트함으로써 ADCC 활성을 측정할 수 있다.

항-글리피칸 3 항체

항-글리피칸 3 항체를 만드는 것은 당업자로서는 공지의 방법으로 실행할 수 있다. 즉, 글리피칸 3을 감작항원으로 사용해서 이를 통상적인 면역방법에 따라 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상적인 세포융합법으로 공지의 친세포(親細胞)와 융합시켜, 통상적인 스크리닝법으로 모노크로날 항체생산세포를 스크리닝함으로써 만들 수 있다. 구체적으로는, 모노크로날 항체는 다음과 같이 제조될 수 있다. 먼저, 항체취득의 감작항원으로 사용되는 인간 글리피칸 3을, Lage, H. et al., Gene 188(1997), 151-156에 개시된 글리피칸 3(MXR 7) 유전자/아미노산 서열을 발현함으로써 얻는다. 즉, 글리피칸 3을 코드하는(encoding) 유전자 서열을 공지의 발현벡터 계에 삽입해서 적당한 숙주세포를 형질변환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상청 중에서 목적하는 인간 글리피칸 3 단백질을 공지의 방법으로 정제한다. 다음에, 이 정제 글리피칸 3 단백질을 감작항원으로 이용한다. 또는, 글리피칸 3의 부분 펩티드를 감작항원으로 사용할 수도 있다. 이때, 부분 펩티드는 인간 글리피칸 3의 아미노산 서열보다 화학합성에 의해 얻을 수 있다. 항-글리피칸 3 항체가 ADCC의 작용, CDC에 의한 작용, 증식인자 활성의 저해에 의해 세포증식 억제 활성을 저해함으로써, 또 항-글리피칸 3 항체에 방사성 동위원소, 화학요법제, 세균 유래 톡신 등의 세포 독성 물질을 결합 시켜줌으로써 세포증식을 억제할 수 있기 때문에, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체의 인식하는 글리피칸 3 분자 상의 에피토프는 특정한 것에 한정되지 않고, 글리피칸 3 분자 상에 존재하는 에피토프라면 어느 에피토프를 인식하여도 좋다. 따라서, 본 발명의 항-글리피칸 3 항체를 만들기 위한 항원은, 글리피칸 3 분자 상에 존재하는 에피토프를 포함한 단편이라면 어떤 단편도 이용할 수 있다.

특히 바람직한 구현예에서, 글리피칸 3의 아미노산 번호 524-563의 에피토프를 인식하는 항체를 취득하기 위해, 감작항원으로서 아미노산 번호 524-563을 포함한 펩티드를 이용할 수 있다.

감작항원으로 면역되는 포유동물로는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려해서 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 래트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 사용된다. 감작항원을 동물에 면역하는 것은 공지의 방법에 따라 실행된다. 예를 들면, 일반적 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 실행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(phosphate-buffered saline)이나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석, 현탁한 것에 소망에 따라 통상적인 보조약, 예를 들면 후로인트 완전 보조약을 적당량 혼합하고, 유화시킨 후, 포유동물에 4-21일마다 수회 투여한다. 또, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이와 같이 포유동물을 면역하고, 혈청 중에 소망하는 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 채취하고, 세포융합에 붙이는바, 바람직한 면역세포로는 특히 비장세포를 들 수 있다. 상기 면역세포와 융합되는 다른 쪽의 친세포로서, 포유동물의 골수종 세포를 이용한다. 이 골수종 세포는, 공지의 여러 가지 세포주, 예를 들면 P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology(1978) 81, 1-7), NS-1(Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol.(1976) 6, 511-519), MPC-ll(Margulies. D.H. et al., Cell(1976) 8, 405-415), SP2/0(Shulman, M. et al., Nature(1978) 276, 269-270), FO(de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods(1980) 35, 1-21), S194(Trowbridge, I S. J. Exp. Med.(1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature(1979) 277, 131-133) 등이 적절히 사용될 수 있다. 상기 면역세포와 골수종 세포와의 세포융합은, 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 콜러와 밀스타인 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol.(1981) 73, 3-46) 등에 준해서 실행할 수 있다. 보다 구체적으로는, 상기 세포융합은, 예를 들면 세포융합 촉진제의 존재 하에 통상적인 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는, 예를 들면 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 다시 소망에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸 슬폭시드 등의 보조제를 첨가해서 사용할 수도 있다. 면역세포와 골수종 세포와의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 골수종 세포에 대해 면역세포를 1 ~ 10 배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 이용하는 배양액으로는, 예를 들면, 상기 골수종 세포주의 증식에 적합한 RPMI-1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포배양에 쓰이는 통상적인 배양액이 사용될 수 있고, 또 우태아 혈청(FCS) 등의 혈청 상보액을 병용할 수도 있다. 세포융합은, 상기 면역세포와 골수종 세포와 의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고서, 미리 37℃ 정도로 가열한 PEG 용액(예를 들면 평균분자량 1000 ~ 6000 정도)을 통상 30~60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순서대로 첨가하고, 원심으로 상청을 제거하는 조작을 되풀이함으로써 하이브리도마의 생육에 좋지 않은 세포융합제 등을 제거한다. 이와 같이 해서 얻어진 하이브리도마는, 통상적인 선택배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘을 함유한 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은, 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간(통상, 수일 ~ 수 주간) 계속한다. 그 다음에, 통상적인 한계희석법을 실시하여, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 실행한다. 또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역해서 상기 하이브리도마를 얻는 외에, 인간 임파구를 in vitro로 글리피칸 3에 감작하고, 감작 임파구를 인간 유래의 영구 분열능을 가진 골수종 세포와 융합시켜, 글리피칸 3에의 결합활성을 가진 소망하는 인간항체를 얻을 수도 있다(일본국 특공평 159878호 공보 참조). 그리고, 인간항체 유전자의 모든 레퍼터리를 가진 트랜스제닉(transgenic) 동물에 항원으로 되는 글리피칸 3을 투여해서 항-글리피칸 3 항체생산세포를 취득하고, 이를 불멸화시킨 세포로부터 글리피칸 3에 대한 인간항체를 취득할 수 있다(국제특허출원공개번호 WO 94/25585호 공보, WO 93/12227호 공보, WO 92/03918호 공보, WO 94/02602호 공보 참조). 이와 같이 해서 만들어지는 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마는, 통상적인 배양액 중에서 계대배양할 수 있고, 또 액체질소 중에서 장기보존 할 수 있다.

재조합 항체

본 발명에서는, 모노크로날 항체로서, 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 조립하고, 이를 숙주에 도입하고, 유전자 조합기술을 이용해서 생산시킨 재조합 항체를 사용한다(예를 들면, Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem.(1990) 192, 767-775, 1990 참조). 구체적으로는, 항-글리피칸 3 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, 항-글리피칸 3 항체의 가변 (V) 영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법인 예를 들면 구아니딘(guanidine) 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry(1979) 18, 5294-5299), AGPC 법(Chomczynski, P., et al., Anal. Biochem.(1987) 162, 156-159) 등으로 실시해서 전체 RNA를 조제하고, mRNA 정제 키트(Pharmacia 제) 등을 사용해서 목적하는 mRNA를 조제한다. 또, QuickPrep mRNA 정제 키트(Pharmacia 제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수도 있다. 얻어진 mRNA로부터 역전사 효소를 이용해서 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV 리버스 전사효소 제1-가닥 cDNA 합성 키트(일본국 생화학공업사 제) 등을 이용해서 실행한다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 실행하려면, 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech 제) 및 X PCR을 이용한 5'-RACE 법(Frohman, M. A.et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85,8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932) 등을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하여 벡터 DNA와 연결한다. 그리고, 이로부터 재조합 벡터를 만들어, 대장균 등에 도입 해서 코로니를 선택하여 소망하는 재조합 벡터를 조제한다. 그리고, 목적으로 하는 DNA의 뉴클레오티드 서열을 공지의 방법인 예를 들면 디데옥시뉴클레오티드 체인 터미네이션 법(dideoxynucleotide chain termination method) 등으로 확인한다. 목적으로 하는 항-글리피칸 3 항체의 V영역을 코드하는 DNA을 얻은 후, 이를 소망하는 항체 정상영역(C 영역)을 코드하는 DNA를 함유하는 발현벡터에 삽입한다.

본 발명에서 사용되는 항-글리피칸 3 항체를 제조함에는, 항체유전자를 발현제어영역, 예를 들면 인핸서, 프로모터의 제어하에서 발현되도록 발현벡터에 삽입한다. 다음에, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킨다. 항체유전자의 발현은, 항체 중쇄(重鎖; H쇄) 또는 경쇄(輕鎖; L쇄)를 코드하는 DNA를 개별적으로 발현벡터에 조립해서 숙주세포를 동시에 형질변경시키거나, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현벡터에 조립해서 숙주세포를 형질변경시킬 수 있다(WO 94/11523호 공보 참조). 또, 재조합 항체의 생산에는 상기 숙주세포뿐만 아니라 트랜스제닉 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체유전자를 유즙 중에서 고유하게 생산되는 단백질(염소 β카제인 등)을 코드하는 유전자의 도중에 삽입해서 융합유전자로서 조제한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 포함한 DNA 단편을 염소의 배(胚)에 주입하여, 이 배를 암염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉(transgenic) 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 소망하는 항체를 얻는다. 또, 트랜스제닉 염소에서 생산되는 소망하는 항체를 함유한 유즙량을 증가시키기 위해, 적절한 호르몬을 트랜스제닉 염소에 사용할 수 있다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology(1994) 12, 699-702).

변형 항체

본 발명에서는, 상기 항체 외에 인간에 대한 이종항원성(異種抗原性)을 저하시키는 것 등을 목적으로 인위적으로 변형한 유전자재조합 항체인, 예를 들면 키메라 항체(chimeric antibody), 인간형화(Humanized) 항체를 사용할 수 있다. 이들 변형된 항체는, 공지의 방법을 이용해서 제조할 수 있다. 키메라 항체는, 상기와 같이 해서 얻은 항체 V 영역을 코드하는 DNA를 인간항체 C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이를 발현벡터에 조립해서 숙주에 도입하여 생산시켜줌으로써 얻어진다. 이 기존의 방법을 이용해서 본 발명에 유용한 키메라 항체를 얻을 수 있다. 인간형화 항체는, 재구성(reshaped) 인간항체라고도 불려지는데, 이는 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간항체의 상보성 결정영역에 이식한 것이다. 인간형하 항체를 얻기 위한 일반적인 유전공학방법론은 본 분야에 알려져 있다(유럽 특허출원공개번호 EP 125023호, WO 96/02576호 참조). 구체적으로는, 마우스항체의 CDR과 인간항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계된 DNA 서열을, CDR 및 FR 양쪽의 말단 영역에 오버랩하는 부분을 갖도록 만든 수개의 올리고뉴클레오티드를 프라이머로 이용해서 PCR 법으로 합성한다(W098/13388 호 공보에 기재된 방법을 참조). CDR를 매개로 연결되는 인간항체의 프레임워크 영역은, 상보성 결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록, 항체의 가변영역에서의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환할 수 있다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851- 856). 키메라 항체 및 인간형화 항체의 C 영역에는 인간항체 C 영역이 사용된다. 예를 들면, H쇄에서는 Cyl, Cy2, Cy3, Cy4를 사용하고, L쇄에서는 C_K, Cλ를 사용할 수 있다. 또, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해, 인간항체 C 영역을 변형할 수 있다. 키메라 항체는, 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 정상영역으로 이루어진다. 한편, 인간형화 항체는, 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과, 인간항체 유래의 프레임워크 영역 및 C 영역으로 이루어진다. 인간형화 항체는 인체 내에서의 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로 이용하였다.

변형된 항체

본 발명에서 사용되는 항체는, 항체의 전 분자에 한하지 않고 글리피칸 3에 결합하여, 글리피칸 3의 활성을 저해하는 한, 항체의 단편 또는 그 변형물일 수 있고, 2가 항체뿐 아니라 1가 항체도 포함된다. 예를 들면, 항체의 단편으로는, Fab, F(ab') 2, Fv, 1개의 Fab와 완전한 fc를 가진 Fab/c, 또는 H쇄 또는 L쇄의 Fv를 적당한 리간드로 연결시킨 싱글 체인 Fv(scFv)를 들 수 있다. 구체적으로는, 항체를 효소, 예를 들면 파파인, 펩신으로 처리해서 항체 단편을 생성시키거나, 또는 이들 항체 단편을 코드하는 유전자를 구축하고, 이를 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol.(1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology(1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology(1989) 178,476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology(1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al, Methods in Enzymology(1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137 참조). scFv는, 항체의 H쇄 V 영역과 L쇄 V 영역을 연결함으로써 얻어진다. 이 scFv에서, H쇄 V 영역과 L쇄 V 영역은, 링커, 바람직하기는 펩티드 링커를 매개로 연결된다(Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.(1988) 85, 5879- 5883). scFv에서의 H쇄 V 영역 및 L쇄 V 영역은, 본 명세서에 항체로서 기재된 것의 어느 것에서 유래한 것이어도 좋다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예를 들면 아미노산 12-19 잔기로 된 임의의 단일가닥 펩티드가 쓰인다. scFv를 코드하는 DNA는, 상기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V 영역을 코드하는 DNA 및 L쇄 또는 L쇄 V 영역을 코드하는 DNA 중, 그들의 서열 중의 전부 또는 소망하는 아미노산 서열을 코드하는 DNA 부분을 주형(鑄型)으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머 쌍을 이용해서 PCR법으로 증폭하고, 이어 다시 펩티드 링커 부분을 코드하는 DNA 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머 쌍을 조합해서 증폭함으로써 얻어진다. 또, 일단 scFv를 코드하는 DNA가 만들어지면, 그들을 함유하는 발현벡터 및 당해 발현벡터에 의해 형질변환된 숙주를 통상적인 방법으로 얻을 수가 있고, 또 그 숙주를 이용함으로써, 통상적인 방법에 따라 scFv를 얻을 수 있다. 이들 항체의 단편은, 상기와 마찬가지로 해서 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주로부터 생산시킬 수 있다. 본 발명에서의 "항체"에는 이들 항체의 단편도 포함된다. 항체의 변형물로서, 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합된 항-글리피칸 항체 를 사용할 수도 있다. 본 발명에서의 "항체"에는 이들 항체 변형물도 포함된다. 이와 같은 항체 변형물은, 얻어진 항체에 화학적인 변형을 실시함으로써 얻을 수 있다. 한편, 항체의 변형방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

그리고, 본 발명에서 사용되는 항체는, 이중특이성 항체(bispecific antibody)일 수 있다. 이중특이성 항체는 글리피칸 3 분자 상의 다른 에피토프를 인식하는 항원결합부위를 가진 이중특이성 항체일 수 있고, 한쪽 항원결합부위가 글리피칸 3을 인식하고, 다른 쪽 항원결합부위가 화학요법제, 세포 유래 톡신 등의 세포 독성 물질을 인식할 수도 있다. 이 경우, 글리피칸 3을 발현하고 있는 세포에 직접 세포 독성 물질을 작용시켜 종료세포에 특이적으로 상해를 주어 종양세포(腫瘍稅布)의 증식을 억제할 수 있다. 이중특이성 항체는 2종류의 항체의 HL 쌍을 결합시켜 만들 수도 있고, 다른 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜 이중특이성 항체생산 융합세포를 만들어 얻을 수도 있다. 그리고, 유전자공학적 방법으로 이중특이성 항체를 만들 수도 있다.

재조합 항체 또는 변형 항체의 발현 및 생산

상기와 같이 구축한 항체유전자는, 공지의 방법으로 발현시켜 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현시키는 항체유전자, 그 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예를 들면 프로모터/인핸서로는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서( human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 들 수 있다. 또, 기타 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로 바이 러스, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 인간 신장 인자 1α(HEF-1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서 등을 들 수 있다. SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 Mulligan 등의 방법(Nature(1979) 277, 108)으로, 또, HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 Mizushima 등의 방법(Nucleic Acids Res.(1990) 18, 5322)으로, 용이하게 유전자 발현을 실행할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위해서는, 발현된 항체에 당쇄를 부가하는 기능을 가진 임의의 진핵세포 발현계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는, 예를 들면 수립된 포유류 세포계, 곤충 세포계, 진사상균 세포 및 효모 세포 등의 동물세포 등을 들 수 있다.

바람직하기는, 본 발명에서 사용되는 항체는, 포유류 세포, 예를 들면 CHO, COS, 골수종, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다. 다음에, 형질변환된 숙주세포를 in vitro 또는 in vivo에서 배양해서 목적으로 하는 항체를 생산시킨다. 숙주세포의 배양은 공지의 방법으로 실행한다. 예를 들면, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI-1640, IMDM를 사용할 수가 있고, 우태아 혈청(FCS) 등의 혈청 상보액을 병용할 수도 있다.

항체의 분리 및 정제

상기와 같이 발현, 생산된 항체는, 세포, 숙주동물로부터 분리해서 균일해질 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리, 정제는 친화성 칼럼(affinity column)을 이용해서 실행할 수 있다. 예를 들면, 단백질 A 칼럼을 이 용한 칼럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(Pharmacia 제) 등을 들 수 있다. 기타, 통상적인 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 되고, 어떤 한정이 있는 것은 아니다. 예를 들면, 상기 친화성 칼럼 이외의 크로마토그래피 칼럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적의 선택, 조합함으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). 렉틴(lectin) 칼럼을 이용한 소망하는 당쇄를 가진 항체의 분리는 당업자로서는 공지의 방법으로 실행할 수가 있고, 예를 들면 W0 02/30954에 기재된 방법으로 실행할 수 있다.

항체 활성의 확인

본 발명에서 사용되는 항체의 항원결합 활성(Antibodies: A Laboratory Manual.Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 리간드 리셉터 결합 억제(Harada, A. et al., International Immunology(1993) 5,681-690)를 공지의 방법을 사용하여 측정할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항-글리피칸 3 항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으로서, ELISA(효소결합 면역 흡착 검정법), EIA(효소면역측정법), RIA(방사면역 측정법) 또는 형광항체법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 효소면역측정법을 이용하는 경우, 글리피칸 3을 코팅한 플레이트에, 항-글리피칸 3 항체를 함유한 시료, 예를 들면, 항-글리피칸 3 항체생산세포의 배양상청이나 정제 항체를 첨가한다. 알칼리성 포스파타제 등의 효소로 표지된 2차 항체를 첨가하고, 플레이트를 인큐베이트 하고, 세정한 후, p-니트로페닐 인산 등의 효소기질을 첨가하여 흡광도를 측정함으로써 항원결합 활성을 평가할 수 있다.

약제학적 조성물

본 발명은, 본 발명의 당쇄 조성이 변형된 글리피칸 3 항체 조성물을 포함한 의약조성물을 제공한다.

본 발명의 항체 조성물을 함유하는 의약조성물은 암 등의 세포증식에 관련하는 질환의 치료 및/또는 예방에 유용하고, 특히 간암의 치료 및/또는 예방에 유용하다. 본 발명의 항체를 의약조성물로 이용하는 경우에는, 당업자로서는 공지의 방법으로 제제화할 수 있다. 예를 들면, 물 또는 그 이외의 약학적으로 허용할 수 있는 액과의 무균성 용액, 또는 현탁액제의 주사제의 형태로 비경구적으로 사용될 수 있다. 예를 들면, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 매체, 구체적으로는, 멸균수나 생리식염수, 식물유, 유화제, 현탁제, 계면활성제, 안정제, 향미제, 부형제, 비히클(vehecle), 방부제, 결합제 등과 적절히 조합하여, 일반적으로 인정된 제약 실시에 요구되는 단위 용량 형태로 혼화(混和)함으로써 제제화하는 것을 생각할 수 있다. 이들 제제에서의 유효성분량은, 지시된 범위의 적당한 용량이 얻어질 수 있도록 하는 것이다.

주사를 위한 무균 조성물은 주사용 증류수와 같은 비히클을 이용해서 통상적인 제제 실시에 따라 처방할 수 있다.

주사용의 수용액으로는, 예를 들면 생리식염수 또는 포도당이나 기타의 보조약을 포함한 등장액, 예를 들면 D-솔비톨, D-만노스, D-만니톨, 염화나트륨을 들 수 있고, 적당한 용해보조제, 예를 들면 알코올, 구체적으로는 에탄올, 폴리알콜, 예를 들면 플로피렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 비이온성 계면활성제, 예를 들면 폴 리솔베이트 80(TM), RCO-50과 병용할 수 있다.

유성액으로는 참기름, 대두유를 들 수 있고, 용해보조제로서 안식향산 벤질, 벤질알콜과 병용할 수 있다. 또, 완충제, 예를 들면 인산염 완충액, 아세트산나트륨 완충액, 무통화제, 예를 들면, 염산 프로카인, 안정제, 예를 들면 벤질알콜, 페놀, 산화방지제와 배합하여도 좋다. 조제된 주사액은 통상 적당한 앰플에 충전시킨다.

투여는 바람직하기는 비경구 투여로서, 구체적으로는, 주사제형, 경비투여제형, 경폐투여제형, 경피투여형 등을 들 수 있다. 주사제형의 예로는, 예를 들면 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사 등으로 전신 또는 국부적으로 투여할 수 있다.

또, 환자의 연령, 증상에 따라 적절한 투여방법을 선택할 수 있다. 항체 또는 항체를 코드하는 폴리뉴클레오티드를 함유하는 의약조성물의 투여량으로는, 예를 들면 1회에 대해 체중 1kg 당 0.001mg으로부터 1000mg의 범위에서 선택할 수 있다. 또는, 예를 들면, 환자당 0.001 ~ 100000mg/body의 범위에서 투여량을 선택할 수가 있지만, 이들 수치로 반드시 제한되는 것은 아니다. 투여량 및 투여방법은 환자의 체중이나 연령, 증상 등에 의해 변할 수 있고, 당업자라면 적절히 선택할 수 있다.

본 명세서에서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고문헌의 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다. 또, 본 출원이 가진 우선권주장의 기초로 되는 출원인 일본 특허출원 2004-311356호의 명세서 및 도면에 기재된 내용은 모두 본 명세서의 일부로서 여기에 인용한다.

실시예

본 발명은 이하 실시예에 의해 더욱 상세히 설명되고, 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

마우스 항인간 글리피칸 3 항체의 제조

항 GPCS 항체를 만들기 위한 면역 단백질로서, C 말단측의 소수성 영역(564-580 아미노산)을 결손시킨 가용성 GPC3 단백질을 만들고, 이를 이용해서 면역을 실행하였다. 자기면역질환 마우스인 MRL/MpJUmmCrj-lpr/lpr 마우스(이하, MRL/lpr 마우스, 일본 Charles River에서 구입)를 면역동물로 이용하였다. 7주령 또는 8주령부터 면역을 개시하여, 첫회 면역에는 가용성 GPC3을 100㎍/head로 되도록 조제하고, 후로인트 완전 보조액(FCA, Becton Dickinson사)를 이용해서 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 5회 면역의 후, 최종 면역으로서 50㎍/head로 되도록 PBS에 희석해서 꼬리 정맥내에 투여하였다. 최종 면역의 4일 후, 비장세포를 적출하여, 마우스 골수종 세포 PS-X63Ag8U1(P3U1, ATCC에서 구입)와 2:1이 되도록 혼합하고, PEG1500(로슈·다이아그노스틱사)를 서서히 가함으로써 세포융합을 실행하였다. 스크리닝은 가용형 GPCS 코어 단백질을 고형화한 면역플레이트를 이용한 ELISA에 의해 실행하였다. 양성 클론에 대해서는 한계희석법으로 모노클론화 하였다. 그 결과, GPCS에 대해 강한 결합활성을 가진 항체의 11개의 클론(MSC11, M13B3, M1E7, M3B8, M11F1, L9G11, M19B11, M6B1, M18D4, M5B9, M10D2)을 얻었다.

얻어진 항 GPCS 항체 중, 특히 M11F1, M3B8이 강한 CDC 활성을 나타내었기 때문에, M11F1, M3B8의 에피토프를 포함한 GST 융합단백질인 글리피칸 3의 524번째의 Ala로부터 563번째의 Lys까지의 펩티드와 GST의 융합단백질(GC-3)을 면역원으로 해서, Balb/c(일본 Charles River사) 3마리, MRL/lpr 3마리에 대해 면역을 실행하였다. 첫회 면역에는 GC-3을 100㎍/head로 되도록 조제하고, FCA을 이용해서 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 2주 후에, 50㎍/head로 제조한 것을 FIA로 에멀젼화하고 피하에 투여하였다. 5회 면역 후, 전체 마우스의 꼬리 정맥 내에 최종 면역(50㎍/head)을 실행하여 세포융합을 실행하였다. 스크리닝은, C 말단측의 소수성 영역(564-580 아미노산)을 결손시킨 가용형 GPC3 코어 단백질을 고형화한 면역플레이트를 이용한 ELISA에 의해 실행하였다. 양성 클론에 대해서는 한계희석법으로 모노클론화 하였다. 그 결과, GPC3에 대해 강한 결합활성을 가진 항체의 5개 클론 (GC199, GC202, GC33, GC179 및 GC194) 취득하였다.

이와 같이 얻어진 항체의 H쇄, L쇄의 가변영역을 표준 방법으로 클로닝하고, 서열을 결정하였다. 그리고, 기존의 항체의 아미노산 서열의 데이터 베이스와 비교해서 상동성을 조사함으로써, CDR 영역을 결정하였다. CDR 영역의 서열을 표 1 및 2에 나타내었다.

실시예 2

항- GPC3 항체 마우스-인간 키메라 항체의 제조

항-GPC3 항체 GC33 H쇄 및 L쇄 가변영역 서열을 인간 IgGl 및κ쇄 정상영역 서열에 연결시켰다. 항체의 H쇄 가변영역의 5' 말단측 뉴클레오티드 서열에 상보적 으로 코작크(Kozak) 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오티드 및 NheI 부위를 가진 3' 말단측 뉴클레오티드 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 이용해서 PCR를 실행하고, 얻어진 PCR 산물을 인간 IgGl 정상영역이 pBluescript KS + 벡터(Toyobo Co., Ltd.)에 삽입되어 있는 pB-CH 벡터에 클로닝하였다. NheI 부위에 의해, 마우스 H쇄 가변영역과 인간 H쇄(γ1쇄) 정상영역이 연결되어 있다. 만들어진 H쇄 유전자 단편을 발현벡터 pCXND3에 클로닝하였다. 또, 항체의 L쇄 가변영역의 5' 말단측 뉴클레오티드 서열에 상보적으로 코작크 서열을 가진 합성 올리고뉴클레오티드 및 BsiWI 부위를 가진 3' 말단측 뉴클레오티드 서열에 상보적인 합성 올리고뉴클레오티드를 이용해서 PCR를 실행하고, 얻어진 PCR 산물을 인간 κ쇄 정상영역이 pBluescript KS + 벡터(Toyobo Co., Ltd.)에 삽입되어 있는 pB-CL 벡터에 클로닝하였다. BsiWI 부위에 의해, 인간 L쇄 가변영역과 정상영역이 연결되어 있다. 만들어진 L쇄 유전자 단편을 발현벡터 pUCAG 클로닝하였다. 본 벡터 pUCAG는, pCXN(Niwa 등, Gene 1991;108:193-200)을 제한효소 BamHI로 소화시켜 얻어지는 2.6kbp의 단편을 pUC19 벡터(Toyobo Co., Ltd.)의 제한효소 BamHI 부위에 연결하고, 클로닝한 벡터이다.

항-GPC3 마우스-인간 키메라 항체 발현벡터를 만들기 위해, L쇄 유전자 단편이 삽입된 pUCAG 벡터를 제한효소 HindIII(Takara Shuzo Co., Ltd.)로 소화시켜 얻어지는 유전자 단편을 H쇄 유전자가 삽입된 pCXND3의 제한효소 HindIII 절단부위에 연결하고 클로닝하였다. 본 플라스미드는 동물세포 내에서 네오마이신 내성 유전자, DHFR 유전자, 항-GPC3 마우스-인간 키메라 항체 유전자(H쇄 가변영역의 아미노 산 서열은 SEQ ID NO: 3에, L쇄 가변영역의 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 4에 나타나 있다)를 발현시킨다.

실시예 3

저- 푸코스형 항- GPC3 키메라 항체의 제조

첫번째 YB2/0(ATCC, CRL-1662)를 10% FBS를 포함한 RPMI1640 배지에서 숙주세포로서 배양하였다. 실시예 2에서 제조된 항-GPC3 키메라 항체 발현벡터 25㎍을 7.5 x 10⁶/0.75mL PBS(-)의 YB2/0(ATCC CRT-1662)에, 일렉트로포레이션법으로 l.4 kV, 25μF의 조건으로 도입하였다. 실온에서 10분간의 회복기간의 후, 일렉트로포레이션 처리가 된 세포를, 10% FBS를 포함한 RPMI1640 배지 40mL에 현탁하였다. 동일한 배지에서 10배 희석용액을 만들어, 96웰 배양용 플레이트에 100μL/웰로 분주하였다. C0₂ 인큐베이터(5% C0₂)에서 24시간 배양 후, Geneticin(Invitrogen사)를 0.5mg/mL이 되도록 첨가해서 2주간 배양하였다. 항-인간 IgG 항체를 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 키메라 항체 고발현주의 스크리닝을 실시하여, 정상 발현주를 수립하였다. 각 항-GPC3 마우스-인간 키메라 항체를 Hi Trap ProteinG HP(Amersham 사)를 사용해서 정제하였다.

실시예 4

인간 말초혈 유래 PBMC 를 이용한 ADCC 활성의 측정

인간 PBMC 용액의 제조

건강한 사람으로부터 채혈한 헤파린-첨가 말초혈을 PBS(-)로 2배로 희석하 여, Ficoll-Paque^TMPLUS (Amersham 사)에 층상화하였다. 이것을 원심분리(500 ×g, 30분, 20℃)한 후, 단핵세포 분획인 중간층을 단리하였다. 3회 세정 후, 세포를 10% FBS/RPMI 중에 현탁시켜 인간 PBMC 용액을 제조하였다.

표적세포의 제조

10% FBS/RPMI-1640 배지에서 배양한 HepG2 세포(ATCC) 및 HuH-7 세포(Health Science Research Resources Bank)를, Cell Dissociation Buffer(Invitrogen 사)를 이용해서 디쉬로부터 박리하고, 96웰 U자 바닥 플레이트(Falcon)의 각 웰에 1 x 10⁴ 세포/웰로 분주하고, 1일간 배양하였다. 배양 후, 5.55 MBq의 ⁵¹Cr을 첨가하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중 37℃ 1시간 배양하고, 이 세포를 배지에서 1회 세정하고, 50μL의 10% FBS/RPMI-1640 배지를 첨가하여 표적세포를 제조하였다.

크롬 방출 시험( ADCC 활성)

표적세포에 각 농도로 조제한 항체용액 50μL를 첨가하고, 빙상에서 15분 반응시킨 후에, 인간 PBMC 용액 100μL(5 x 10⁵ 세포/웰)를 가하고, 5% CO₂ 인큐베이터 중 37℃ 4시간 배양하고, 배양 후 플레이트를 원심분리하고, 배양 상청 100μL 중의 방사활성을 감마 카운터로 측정하였다. 아래 식에 의해 특이적 크롬 방출률을 구하였다.

특이적 크롬 방출률(%) = (A-C) × 100/(B-C)

식에서, A는 각 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, B는 표적세포에 2% NP-40 수용액(Nonidet P-40, Code N0.252-23, Nacalai Tesque)을 100μL, 10% FBS/RPMI 배지를 50μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치, C는 표적세포에 10% FBS/RPMI 배지를 150μL 첨가한 웰에서의 방사활성(cpm)의 평균치를 나타낸다. 시험은 삼중으로 실행하여, ADCC 활성(%)에 대해 평균치 및 표준편차를 산출하였다.

항-GPC3 키메라 항체의 인간 PBMC를 이용한 ADCC 활성을 도 2 및 3에 나타내었다. 도면 중, 종축은 세포독성 활성(%)을, 횡축은 첨가한 항체의 농도(μg/mL)를 나타낸다. 도 2는 표적세포로서 HepG2를 이용한 경우의, 도 3은 HuH-7을 이용한 경우의 결과를 나타낸다. 백색은 CHO 세포생산 키메라 GC33 항체의 활성을, 흑색은 YB2/0 생산 키메라 GC33 항체의 활성을 각각 나타낸다. 저-푸코스인 YB2/0 생산 GC33 키메라 항체는, CHO 세포생산 GC33 키메라 항체에 비교해서 강한 ADCC 활성을 나타냄으로써, 당쇄의 변형에 의해 항-GPC3 항체의 ADCC 활성이 증강되는 것이 분명해졌다.

실시예 5

항체 생산세포의 확립

SFMII(+) 배지에 하이그로마이신 B의 최종 농도가 1mg/mL가 되도록 제조하여, 푸코스 트랜스포터 결손주(클론명 3F2)를 계대(繼代)하였다. 8×10⁶개의 3 F2를 0.8mL의 둘베코 인산염 완충액에 현탁하였다. 세포 현탁액에 25㎍의 항체발현 벡터(참고예 1 및 2)를 가하고, Gene Pulser Cuvette로 세포현탁액을 옮겼다. 얼음 위에서 10분간 방치한 후에, GENE-PULSER II에서 1.5 kV, 25μFD의 조건에서, 일렉 트로포레이션법으로 벡터를 세포에 도입하였다. 벡터를 도입한 후, 세포를 SFMII(+) 배지 40mL에 현탁해서 96-웰 평저 플레이트(Iwaki)에 100μl/웰로 세포를 파종하였다. 플레이트를 C0₂ 인큐베이터 내에서 24 시간, 37℃로 배양한 후, Geneticin(Invitrogen, Cat. No. 10131-027)을 최종농도 0.5mg/mL가 되도록 첨가하였다. 약제에 내성이 된 세포의 항체 생산량을 측정해서, 인간화 항-GPC3 항체 생산 세포주를 각각 수립하였다.

실시예 6

항체의 정제

항체 발현주로부터 배양 상청액을 회수하고, P-l 펌프(Pharmacia)을 이용해서 Hitrap^TM rProtein A(Pharmacia Cat No. 17-5080-01)에 장전하였다. 결합 버퍼(20mM 인산나트륨 (pH7.0))에서 세정 후, 용출 버퍼(0.lM 글리신-HCl(pH2.7))로 용출하였다. 용출액은 즉시 중화 버퍼(1M Tris-HCl(pH9.0))로 중화시켰다. DC 단백질 분석(BIO-RAD Cat No. 500-0111)에 의해 항체의 용출 분획(elution fraction)을 선택해서 풀(pool) 한 후, Centriprep-YM10 (Millipore Cat No. 4304)에서 2mL 정도까지 농축하였다. 그리고 나서, 20mM 아세트산 완충액, 150mM NaCl, (pH6.0)에서 평형화한 Superdex 200 26/60(Pharmacia)을 이용해서 겔 여과에 의해 분리하였다. 모노머 분획의 피크를 회수하여, Centriprep-YM 10에서 농축 후, MILLEX-GW 0.22μm Filter Unit(Millipore Cat No. SLGV 013SL)을 사용하여 여과한 후, 4℃에서 보관하였다. 280nm에서 흡광도를 측정하고, 정제된 항체의 농도를 몰 흡광계수로부터 산출하였다.

실시예 7

FT-KO 세포에 의해 생산된 인간화 항- GPC3 항체의 in vitro ADCC 활성

FT-KO 세포에 의해 생산된 항-GPC3 항체의 인간 PBMC를 이용한 in vitro ADCC 활성을 도 4에 나타내었다. 방법은 실시예 4에 기재한 방법으로 실행하였다. 도면 중, 종축은 세포독성 활성(%)을 나타내고, 횡축은 첨가한 항체의 농도(㎍/mL)를 나타낸다. 표적세포로는 HuH-7을 이용하였다. 백색은 Wild type의 CHO 세포생산 항-GPC3 항체의 활성을 나타내고, 흑색은 FT-KO 세포에 의해 생산된 항-GPC3 항체의 활성을 각각 나타낸다. 저-푸코스 몰드인 FT-KO 세포생산 항-GPC3 항체는, 야생형 CHO 세포에 의해 생산된 항-GPC3 항체와 비교해서 강한 ADCC 활성을 나타내었다. 이로부터 FT-KO 세포에 의해 생산된 항-GPC3 항체에서는 ADCC 활성이 증강되는 것이 분명해졌다.

실시예 8

FT-KO 세포에 의해 생산된 인간화 항- GPC3 항체 당쇄의 해석

1. 2- 아미노벤즈아미드 - 표지된 당쇄(2-AB 표지된 당쇄)의 제조

본 발명의 FT-KO 세포에 의해 생산된 항체 및 대조 시료로서 CHO 세포에 의해 생산된 항체에, N-글리코시다제 F(Roche Diagnostics)를 작용시켜, 당쇄를 단백질로부터 유리시켰다(Weitzhandler M. et al., Journal of Pharmaceutical Sciences 83:12(1994), 1670-1675). 에탄올을 이용하여 단백질을 제거한 후(Schenk B. et al, The Journal of Clinical Investigation 108:11(2001), 1687-1695), 당 쇄를 농축시키고 건조시키고, 그리고 2-아미노피리딘으로 형광표지를 실행하였다(Bigge J. C. et al., Analytical Biochemistry 230:2(1995), 229-238). 얻어진 2-AB 포지된 당쇄를 셀룰로오스 카트리지를 이용한 고체상 추출에 의해 시약을 제거한 후 원심 농축하여, 정제된 2-AB 표지 당쇄를 얻었다. 다음에, 정제된 2-AB 표지 당쇄를 β-갈락토시다아제(Seikagaku Corp.)로 처리하여, 아갈락토실 2-AB 표지 당쇄를 얻었다.

2. 아갈락토실 2-AB 표지 당쇄의 정상(normal phase) HPLC 에 의한 분석

상기 방법에 따라, 본 발명의 FT-KO 세포에 의해 생산된 항체와 대조시료로서 CHO 세포에 의해 생산된 항체에 대해 아가락토실 2-AB 표지 당쇄를 제조하고, 아미드 칼럼(Tosoh Corp. TSK gel Amide-80)에 의한 정상 HPLC 분석을 실행하고, 크로마토그램을 비교하였다. CHG 세포에 의해 생산된 항체에서는 G(0)이 주성분으로서 존재하였고, G(0)-Fuc는 피크면적의 약 4%였다. 한편, FT-KO 세포에 의해 생산된 항체에서는 G(0)-Fuc가 주성분이었고, 각각의 생산주에서 피크면적의 90% 이상으로 존재하고 있었다(도 5 및 표 2). 피크 G(0) 및 G(0)-Fuc의 추정 구조를 도 6에 나타내었다.

표 2

아갈락토실 2-AB 표지 당쇄의 정상 HPLC분석으로 추정된 각 당쇄의 상대비

당쇄명	CHO	FT-KO-a	FT-KO-b	FT-KO-c
G(0)-Fuc	4.0%	92.4%	92.5%	93.2%
G(0)	96.0%	7.6%	7.5%	6.8%

실시예 9

FT - KO 세포생산 인간화 항- GPC3 항체의 열안정성 분석

1. DSC 측정용 시료용액의 제조

200mmol/L의 염화나트륨을 포함한 20mo/L의 아세트산나트륨 완충용액(pH 6.0)을 투석외액으로 하고, 이에 700㎍ 상당량의 항체 용액이 채워진 투석막을 담그고 밤새도록 투석하여 시료용액을 제조하였다.

2. DSC 에 의한 열변성 온도 측정

시료용액 및 레퍼런스 용액(투석외액)을 충분히 탈기한 후, 이들을 각각 열량계 셀에 봉입하고 20℃에서 열적평형시켰다. 그리고 나서, DSC 측정을 20℃ ~ 100℃에서 약 1K/분 스캔 속도로 실행하였다. 결과를 온도의 함수로서의 변성 피크의 정점으로 나타내었다(도 7). 본 측정에 의해, CHO 세포에 의해 생산된 항체 및 FT-KO 세포에 의해 생산된 항체에서의 열변성 온도는 동등하다는 것을 확인하였다.

참조예 1

GC33 의 인간화

공개되어 있는 Kabat Database (ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases /kabat/) 및 ImMunoGeneTics Database(IMGT)로부터 항체의 서열 데이터를 입수하여, H쇄 가변영역, L쇄 가변영역으로 나누어 호모로지 검색을 실행하였다. 그 결과, H쇄 가변영역은 DN13(Smithson et al., Mol Immunol. 1999; 36: 113-124)와 높은 상동성을 가진 것을 알았다. 또, L쇄 가변영역은 면역글로불린 카파 경쇄 VLJ 영역, 부분 cds, 클론:K64에 대하여 수탁번호 AB064105의 Homo sapiens IGK mRNA와 높은 상동성을 가진 것을 알았다. 또, L쇄의 시그널 서열에 대해서는 AB064105와 상동성이 높은 수탁번호 840357의 시그널 서열을 이용하였다. 이들 항체의 프레임워크 영역(이하, FR)에 상보성 항원 결정영역(이하, CDR)을 이식하여 인간화 항체를 제조하였다.

구체적으로는, 약 50 염기의 합성 올리고-DNA를 그들의 약 20 염기가 서로 혼성화되도록 설계하여, 이들 합성 올리고 DNA를 PCR법으로 어셈블리시켜 각 가변영역을 코드하는 유전자를 만들었다. 합성 올리고-DNA의 5' 말단의 터미날에 삽입한 HindIII 서열 및 합성 올리고 DNA의 3' 말단의 터미날에 삽입한 BamHI 서열로 절단하여, 인간 IgG1 정상영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgγ1, 또는 인간 κ쇄 정상영역이 클로닝된 발현벡터 HEFgκ에 클로닝하였다(Sato et al., Mol Immunol. 1994; 371-381). 이와 같이 구성된 인간화 GC33의 H쇄, L쇄는 각각 ver.a로 명명하였다. H쇄, L쇄가 모두 ver.a인 인간화 GC33(ver.a/ver.a)는 마우스 GC33 가변영역의 항체(mouse/mouse)와 비교해서 결합활성이 낮았다. H쇄와 L쇄에 대해 마우스 GC33 서열과 ver.a 서열을 조합하여 키메릭 항체를 제조하였고(mouse/ver.a, ver.a/mouse), 결합활성을 평가하였다. ver.a/mouse에서 결합활성의 저하가 발견되었고, 이것은 아미노산 치환에 의한 결합활성의 저하가 H쇄에 기인한다는 것을 나타낸다. 그리하여, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k로 명명된 변형 H쇄를 제조하였다. 모든 인간화 GC33은 마우스 GC33 가변영역을 가진 키메라 항체와 동등한 결합활성을 나타내었다. 인간화 GC33 H쇄 가변영역 ver.a, ver.c, ver.f, ver.h, ver.i, ver.j, ver.k의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO: 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80으로, 그들의 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87 로 나타내었다. 인간화 GC33 L쇄 가변영역 ver.a의 뉴클레오티드 서열을 SEQ ID NO:88로, 아미노산 서열을 SEQ ID NO: 89로 나타내었다. 인간화 GC33 H쇄 가변영역 ver.i, ver.j, ver.k에서는, 6번째의 글루타민산은 글루타민으로 치환되었다. 이들 항체는 열안정성이 현저히 증가해 있었다.

참조예 2

인간화 GC33 L쇄의 변형

단백질의 탈아미드화에 관하여, 탈아미드화의 반응속도 상수는 1차 서열 의존이라고 알려져 있다. 또한, Asn-Gly는 특히 탈아미드화하기 쉬운 서열로 알려져 있다(Rocinson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001 ; 98: 944-949). SEQ ID NO: 88에 나타나 있는 인간화 GC33 L쇄 ver.a 가변영역의 CDR1 내에 있는 Asn 33은1차 서열 Asn-Gly을 가지므로, 이 잔기는 탈아미드화가 용이하게 일어나기 쉬운 서열인 것으로 예상되었다.

항체의 결합활성에 대한 Asn33의 탈아미드화에 의한 영향을 평가하기 위해, Asn33을 Asp로 치환한 변형된 항체를 제조하였다. 점변이(point mutation)의 도입을 위해 Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene)를 사용하였다. 즉, 125ng의 센스 플라이머(CTT GTA CAC AGT GAC GGA AAC ACC TAT: SEQ ID NO: 124), 125ng의 안티센스 프라이머(ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG: SEQ ID NO: 125), 5μL의 lO×반응 버퍼, lμL의 dNTP mix, l0ng의 인간화 GC33 L쇄 ver.a가 클로닝된 HEFgκ, 1μL의 Pfu Turbo DNA 폴리머라제가 함유된 50μL의 반응액을, 95℃에서 30초, 55℃에서 1분, 68℃에서 9분으로 이루어진 싸이클을 12회 실행 하였다. 그 후 제한효소 DpnI를 가하고 37℃에서 2시간 소화시킨 것을 첨부의 XLI-Blue 콤피텐트 세포에 도입해서 형질변환체를 얻었다. 바르게 변이가 도입된 클론에 대해 가변영역을 잘라내고 재차 HEFgκ에 다시 클로닝하였다. 인간화 GC33 H쇄 ver.k를 함유하는 발현벡터 HEFgγ1을 Fugene 6 (Roche)을 사용하여 COS 7 세포에 도입하였다. 배양상청을 변형된 항체를 일시적으로 발현하는 세포로부터 회수하였다. 항-인간 IgG 항체를 사용한 샌드위치 ELISA에 의해 항체 농도를 정량하고, 가용형 GPC3 코어 단백질을 고형화한 ELISA에 의해 변형된 항체의 결합활성을 평가하였다. Asn33를 Asp으로 치환한 변형된 항체(N33D)에서는 결합활성이 소실되었고, 이것은 결합활성이 Asn33에서의 탈아미드화에 의해 상당히 영향을 받았다는 것을 제안한다.

Asn33의 탈아미드화를 억제하는 방법으로서, Gly34를 다른 아미노산으로 변형하는 방법이 보고되어 있다(W003057881A1). 상기 방법에 따라, Quick Change Site-Directed Mutagenesis Kit을 이용해서 Cys, Met를 제외한 다른 17 아미노산 잔기로 치환한 변형된 항체 G34A, G34D, G34E, G34F, G34H, G34N, G34P, G34Q, G34I, G34K, G34L, G34V, G34W, G34Y, G34R, G34S, G34T를 제조하였다. 항체의 결합활성을 항체를 일시적으로 발현하는 COS7 세포의 배양상청을 사용하여 평가하였다. 그 결과, G34가 Pro(G34P), Val(G34V) 이외에의 아미노산 잔기로 치환된 경우, 결합활성을 유지하고 있는 것이 판명되었다.

앞에서 설명한 변형된 항체의 경쇄 CDR1의 아미노산 서열을, 각각 SEQ ID NO: 90(G34A), SEQ ID NO: 91(G34D), SEQ ID NO: 92(G34E), SEQ ID NO: 93(G34F), SEQ ID NO: 94(G34H), SEQ ID NO: 95(G34N), SEQ ID NO: 96(G34T), SEQ ID NO: 97(G34Q), SEQ ID NO: 98(G34I), SEQ ID NO: 99(G34K), SEQ ID NO: 100(G34L), SEQ ID NO: 101(G34S), SEQ ID NO: 102(G34W), SEQ ID NO: 103(G34Y), SEQ ID NO: 104(G34R), SEQ ID NO: 105(G34V), SEQ ID NO: 106(G34P)으로 나타낸다. 또, 앞에서 설명한 변형된 항체의 경쇄 가변영역의 아미노산 서열을, 각각 SEQ ID NO: 107(G34A), SEQ ID NO: 108(G34D), SEQ ID NO: 109(G34E), SEQ ID NO: 110(G34F), SEQ ID NO: 111(G34H), SEQ ID NO: 112(G34N), SEQ ID NO: 113(G34T), SEQ ID NO: 114(G34Q), SEQ ID NO: 115(G34I), SEQ ID NO: 116(G34K), SEQ ID NO: 117(G34L), SEQ ID NO: 118(G34S), SEQ ID NO: 119(G34W), SEQ ID NO: 120(G34Y), SEQ ID NO: l21(G34R), SEQ ID NO: 122(G34V), SEQ ID NO: 123(G34P)으로 나타낸다.

참조예 3

CHO 세포에서의 푸코스 트랜스포터 유전자의 파괴

1. 표적화 벡터의 구축

(1) K01 벡터의 제조

pcDNA3.l/Hygro(Invitrogen)으로부터 Hyg5-BH와 Hyg3-NT 프라이머를 사용한PCR에 의해, Hygromycin 내성 유전자(Hygr)의 개시 코돈의 5'측에 BamHI 사이트와 TGCGC의 서열을 부가함으로써, 푸코스 트랜스포터 유전자의 개시 코돈의 5' 측과 같은 서열로 하고, SV40 polyA 부가 시그널까지의 영역을 포함한 3' 측에는 Not I 사이트를 부가해서 Hygr를 절단하였다.

포워드 프라이머

Hyg5-BH 5'- GGA TCC TGC GCA TGA AAA AGC CTG AAC TCA CC-3' (SEQ ID NO: 128)

리버스 프라이머

Hyg3-NT 5'-GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG-3' (SEQ ID NO: 129)

푸코스 트랜스포터의 표적화 벡터 ver.1(이하, K01 벡터라 함)은 푸코스 트랜스포터의 5'측(SEQ ID NO: 126에 나타내어진 뉴클레오티드 서열의 염기 No. 2,780의 Sma I로부터 No. 4,232의 BamHI), 3'측(No. 4,284로부터 No.10,934의 SacI 까지), 및 Hygr 단편을 각각 pMC1DT-A 벡터(Yagi T, Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vo1.87, p. 9918-9922, 1990)에 삽입하여 구축하였다. 벡터의 특징으로는, Hygr 단편에 프로모터가 부착되어 있지 않기 때문에, 상동 재조합이 일어났을 때 푸코스 트랜스포터의 프로모터로부터 Hygr이 발현하는 것이다. 그러나, 상동 재조합에 의해 벡터의 1 사본만이 세포에 도입되어도, 하이그로마이신 B에 대한 내성을 획득하는 만큼 Hygr이 발현되는 것은 아니다. 한편, K01 벡터는 Not I에 의해 절단되고 세포에 도입되었다. K01 벡터에 의해, 푸코스 트랜스포터는 개시 코돈을 포함한 엑손(exon) 1의 41 염기쌍을 결손하게 되어, 기능을 잃는 것으로 생각이 된다.

(2) pBSK-pgk-1-Hygr의 제조

pKJ2 벡터(Popa H, Biochemical Genetics vo1.28, p299-308, 1990)로 부터 마우스 pgk-l 유전자의 프로모터를 EcoR I-PstI에 의해 잘라내고, pBluescript(Stratagene)의 EcoRI-PstI 사이트로 클로닝해서 pBSK-pgk-l 벡터를 제 조하였다. Hygr은 pcDNA3.1/Hygro 보다 Hyg5-AV와 Hyg3-BH의 프라이머로 PCR 함으로써, Hygr의 5'측에 EcoT22 I 사이트와 Kozak 서열을 부가하고, SV40 polyA 부가 시그널까지의 영역을 포함한 3'쪽에는 BamHI 사이트(site)를 부가해서 Hygr를 절단하였다.

포워드 프라이머

Hyg5-AV 5'-ATG CAT GCC ACC ATG AAA AAG CCT GAA CTC ACC-3'(SEQ ID NO: 130)

리버스 프라이머

Hyg3-BH 5'-GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C-3' (SEQ ID NO: 131)

이 Hygr(EcoT22I-BamHI) 단편을 pBSK-pgk-l의 PstI-BamHI 사이트에 삽입하여, pBSK-pgk-l-Hygr을 제조하였다.

(3) K02 벡터의 제조

푸코스 트랜스포터의 표적화 벡터 ver.2(이하, K02 벡터라 함)는 pMCIDT-A 벡터에 푸코스 트랜스포터의 5'측(SEQ ID NO: 126에 도시된 뉴클레오티드 서열의 N0.2,780의 SmaI으로부터 N0.4,232의 BamHI), 3'측(N0.4,284으로부터 N0.10,934의 SacI까지), 및 pgk-1-Hygr 단편을 각각 삽입함으로써 구축하였다. KOI 벡터와 달리, K02 벡터는 Hygr에 pgk-l 유전자의 프로모터가 부착되어 있기 때문에, 상동 재조합에 의해 벡터의 1 사본만 세포에 도입되어도, 하이그로마이신 B에 대한 내성을 획득하게 된다. 한편, K02 벡터는 Not I로 절단해서 세포에 도입하였다. K02 벡터 에 의해, 푸코스 트랜스포터는 개시 코돈(start codon)을 포함한 엑손(exon) 1의 46 염기쌍(base pairs)을 결손하게 되어, 기능을 잃는 것으로 생각될 수 있다.

(4) pBSK-pgk-1 Puror의 제조

pPUR 벡터(BD Biosciences)를 PstI와 BamHI로 절단하고, 소화된 단편(Puror)을 pBSK-pgk-1의 PstI-BamHI 사이트에 삽입하여 pBSK.pgk-1-Puror을 제조하였다.

(5) K03 벡터의 제조

푸코스 트랜스포터의 표적화 벡터 ver.3(이하, K03 벡터라 함)은 pMC1DT-A 벡터에 푸코스 트랜스포터의 5' 측(SEQ ID NO: 126에 나타내어진 뉴클레오티드 서열의 N0.2,780의 SmaI으로부터 N0.4,232의 BamHI), 3' 측(N0.4,284에서 N0.10,934의 SacI 까지), 및 pgk-1-Puror 단편을 각각 삽입함으로써 구축하였다. 한편, pgk-1-Puror의 3' 말단에는, 이하에 도시한 스크리닝용 프라이머가 결합하는 서열을 미리 부착해 두었다. 한편, K03 벡터는 NotI로 절단해서 세포에 도입하였다. K03 벡터에 의해, 푸코스 트랜스포터는 개시 코돈을 포함한 엑손 1의 46 염기쌍을 결손하게 되어 기능을 잃는 것으로 생각될 수 있다.

리버스 프라이머

RSGR-A 5'-GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C-3' (SEQ ID NO: 132)

상기의 3종류의 표적화 벡터를 이용해서, 푸코스 트랜스포터 유전자의 녹아웃(knock out)을 시도하였다.

2. CHO 세포에의 벡터의 도입

CHO-S-SFMII HT-(Invitrogen, Cat. No. 12052-098)에 HT Supplement(100 ×)(Invitrogen Cat. No. 11067-030)와 페니실린-스트렙토마이신(Invitrogen Cat. No. 15140-122)를 CHO-S-SFMII HT의 부피에 대해 각각 1/100 부피로 첨가했다. 이를 배양용 배지(이하, SFMII(+)라 함)로서 CHO 세포의 DXB11주를 계대하고, 또 유전자 도입 후의 배양도 이 SFMII(+)에서 실행하였다. 8 x 10⁶개의 CHO 세포를 0.8mL의 둘베코 인산염 완충액(이하, PBS로 약칭함. Invitrogen Cat. No. 14190-144)에 현탁하였다. 세포현탁액에 30㎍의 표적화 벡터를 가하고, Gene Pulser Cuvette(4mm)(Bio-Rad, Cat.No. 1652088)에 세포현탁액을 옮겼다. 빙상에서 10분간 방치한 후에, GENE-PULSER II(Bio-Rad, Code No. 340BR)에서 1.5kV, 25μFD의 조건에서, 일렉트로포레이션 법으로 벡터를 세포에 도입하였다. 벡터를 도입한 후, 세포를 200mL의 SFMII(+) 배지에 현탁하여 20매의 96-웰 평저 플레이트(Iwaki, Cat. No. 1860-096)에 100 μL/웰로 세포를 파종하였다. 플레이트를 C0₂ 인큐베이터 내에서, 24시간, 37℃에서 배양한 후, 약제를 첨가하였다.

3. 녹아웃의 제1 단계

K01 벡터 또는 K02 벡터를 각각 CHO 세포에 도입해서, 벡터 도입으로부터 24시간 후에 하이그로마이신 B(Invitrogen Cat.No. 10687-010)에 의해 선택하였다. 하이그로마이신 B는 0.3mg/mL가 되도록 SFMII(+)에 용해하고, 100μL/웰로 첨가하였다.

4. PCR 에 의한 상동 재조합체의 스크리닝

(1) PCR용 샘플의 제조

상동 재조합체를 PCR 법으로 스크리닝하였다. 스크리닝에 사용되는 CHO 세포는 96-웰 평저 플레이트에서 배양하고, 배양 상청액을 제거한 후에 세포 용해용 완충액을 50μL/웰로 첨가하여 55℃로 2시간 동안 가온하고, 계속해서 95℃, 15분 가열함으로써, 프로테이나제 K를 불활성화시켜 PCR의 주형으로 하였다. 세포 용해용의 완충액은, 1웰당 10×LA 완충액 Ⅱ(Takara Bio Inc., LA Taq addded) 5㎕, 10% NP-40(Roche, Cat. No. 1 332 473) 2.5㎕, 프로테이나제 K(20mg/mL, Takara Bio, Inc. Cat. No. 9033) 4㎕, 및 증류수(Nacalai Tesque Cat. No. 36421-35) 38.5μL로 구성되어 있다.

(2) PCR의 조건

PCR 반응 혼합물은 상기의 PCR 샘플 1㎕, 10 × LA 완충액 Ⅱ 5㎕, MgCl₂(25mM) 5㎕, dNTP(2.5mM) 5㎕, 프라이머(각 10μM) 2㎕, LA Taq(5 IU/㎕ Cat. No. RR002B) 0.5㎕, 및 증류수 29.5㎕(총 50㎕)로 하였다. K01 벡터를 함유하는 세포의 스크리닝에는, TP-F4와 THygro-R1, K02 벡터를 도입한 세포의 스크리닝에는 TP-F4와 THygro-F1을 PCR 프라이머로 사용하였다.

K01 벡터를 도입한 세포의 PCR 조건은, 95℃에서 1분간의 예열, 95℃에서 80초간, 600℃에서 80초간, 및 60℃에서 2분간의 증폭 싸이클 40 순환, 및 72℃에서 7분의 재가열로 하였다. K02 벡터를 함유하는 세포의 스크리닝에는 95℃에서 1분간의 예열, 95℃에서 30초간, 및 70℃에서 3분간의 증폭 싸이클 40 순환, 및 70℃에서 7분의 재가열로 하였다.

사용된 프라이머는 다음과 같다. KO1 벡터 또는 KO2 벡터와 상동 재조합이 일어난 세포의 샘플에서, KOI 벡터에서는 약 1.6kb, K02 벡터에서는 약 2.0kb의 DNA가 증폭되게 된다. 프라이머 TP-F4는 벡터의 바깥쪽에서, 또한 5' 측의 푸코스 트랜스포터의 게놈 영역에 설정하고, THygro-Fl 및 THygro-R1은 벡터 내의 Hygr의 중에 설정하였다.

포워드 프라이머(KOl, K02)

TP-F4 5'-GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC-3' (SEQ ID NO: 133)

리버스 프라이머(KOl)

THygro-Rl 5'-TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC-3' (SEQ ID NO: 134)

리버스 프라이머(K02)

THygro-Fl 5'-GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT AGC-3' (SEQ ID NO: 135)

5. PCR 스크리닝 결과

K01 벡터를 도입한 세포는 918개를 해석하였고, 그 중 하나의 세포는 상동 재조합체로 생각될 수 있었다(상동 재조합 효율: 0.1%). 또, K02 벡터를 도입한 세포는 537개를 해석하였고, 그 중 17개의 세포를 상동 재조합체로 생각되었다(상동 재조합 효율: 3.2%).

6. 서던 블롯팅 해석

상동 재조합을 추가로 서던 블롯팅에 의해서도 확인하였다. 서던 블롯팅으로 분석하기 위해, 배양한 세포로부터 표준 방법에 따라 게놈 DNA 10㎍을 제조하였다. SEQ ID NO: 126에 나타난 뉴클레오티드 서열의 N0.2,113- N0.2,500의 영역에서, 이 하의 2종류의 프라이머를 이용해서 PCR법으로 387bp의 프로브를 조정하고, 이를 서던 블롯팅에 의한 확인에 이용하였다. 게놈 DNA는 Bgl II로 절단하였다.

포워드 프라이머

Bgl-F: 5'-TGT GCT GGG AAT TGA ACC CAG GAC-3'(SEQ ID NO: 136)

리버스 프라이머

Bgl-R: 5'-CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C-3'(SEQ ID NO: 137)

Bgl II에 의한 절단에 의해, 푸코스 트랜스포터 염색체로부터는 약 3.0kb, KO1 벡터에서 상동 재조합이 일어난 염색체로부터는 약 4.6kb, K02 벡터에서 상동재조합이 일어난 염색체로부터는 약 5.0kb의 밴드가 각각 출현하였다. K01 벡터 및 K02 벡터에 의해 상동 재조합을 일으킨 세포의 각각 1종류, 7종류를 실험에 이용하였다. K01 벡터에서 유일하게 획득된 세포는 5C1로 명명하였고, 그 후의 해석에 의해 복수의 세포집단으로 구성되는 것이 밝혀졌으므로, 한계 희석에 의해 클론화하고, 그 후의 실험에 이용하는 것으로 하였다. 또, K02 벡터에서 획득된 세포의 하나를 6E2로 명명하였다.

7. 녹아웃의 제2단계

K01 벡터 및 K02 벡터에 의해 상동 재조합이 성공한 세포에 대해, 3종류의 벡터를 이용해서 푸코스 트랜스포터 유전자가 완전히 결손된 세포주의 수립을 시도하였다. 벡터와 세포의 조합은 이하와 같다.

방법 1. K02 벡터와 5C1 세포(KO1), 방법 2. K02 벡터와 6E2 세포(K02), 방법 3. K03 벡터와 6E2 세포(K02). 벡터를 각각 세포에 도입해서, 벡터 도입으로부 터 24시간 후에 하이그로마이신 B, 퓨로마이신(Nacakai Tesque, Cat. No. 29455- 12)을 사용하여 선택을 개시하였다. 하이그로마이신 B는 방법 1에서는 최종 농도가 1mg/ml, 방법 2에서는 최종 농도가 7mg/ml가 되도록 하였다. 그리고 방법 3에서는, 하이그로마이신 B의 최종 농도가 0.15mg/ml, 퓨로마이신의 최종 농도가 8 ㎍/ml가 되도록 첨가하였다.

8. PCR 에 의한 상동 조합체의 스크리닝

방법 1로부터 세포를 스크리닝하기 위해, KO1 벡터 및 K02 벡터 모두와 상동 재조합을 일으킨 세포를 검출하는 PCR를 실시하였다. 방법 2로부터 세포를 스크리닝하기 위해서는, 하기의 PCR 프라이머를 설계하였다: SEQ ID NO: 126의 염기 No. 3924에서부터 3950의 영역에서 TPS-F1를 설정하였고, N0: 4248에서 4274의 영역에서 SHygro-R1를 설정하였다. 이들 프라이머는 K02 벡터에 의한 결손을 함유하는 푸코스 트랜스포터의 유전자 영역의 350bp를 증폭할 것이다. 따라서, 방법 2에서의 PCR 스크리닝에서는, 350bp의 증폭산물을 제공하지 않는 이들 세포들은 푸코스 트랜스포터 유전자가 완전히 결손된 세포로 간주되었다. PCR의 조건은, 95℃에서 1분간의 예열, 95℃에서 30초간, 70℃에서 1분간의 증폭 싸이클 35 순환, 및 70℃에서 7분의 재가열로 이루어졌다.

포워드 프라이머

TPS-F1: 5'-CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC-3' (SEQ ID NO: 138)

리버스 프라이머

SHygro-R1: 5'-TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC-3' (SEQ ID NO: 139)

방법 3에 관해서는, 포워드 프라이머에 TP-F4, 리버스 프라이머에 RSGR-A를 이용하였다. PCR의 조건은, 95℃에서 1분간의 예열, 95℃에서 30초간, 60℃에서 30초간, 72℃에서 2분간의 증폭 싸이클 35 순환, 및 72℃에서 7분의 재가열로 하였다. K03 벡터에 의해 상동 재조합을 일으킨 세포의 샘플에서는, 약 1.6kb의 DNA가 증폭되게 된다. 이 PCR 과정에서 K03 벡터에 의해 상동 재조합을 일으킨 세포를 검출함과 더불어, K02 벡터로의 상동 재조합이 남겨져 있는 것도 확인하였다.

9. PCR 스크리닝 결과

방법 1에서, 총 616개의 세포를 분석하였고, 그 중 18개의 세포가 상동 조합체로 생각되었다(상동 재조합 효율: 2.9%). 방법 2에서, 총 524개의 세포를 분석하였고, 그 중 2개의 세포가 상동 조합체로 생각되었다 (상동 재조합 효율: 0.4%). 그리고, 방법 3에서는 총 382개의 세포를 분석하였고, 그 중 7개의 세포가 상동 조합체로 생각되었다(상동 재조합 효율: 1.8%).

10. 서던 블롯팅 해석

서던 블롯팅을 상기 방법에 따라 실행하였다. 분석된 세포 중, 푸코스 트랜스포터의 유전자가 완전히 결손되어 있는 세포를 1개 알아내었다. 제1 단계의 녹아웃에서는, PCR와 서던 블롯팅의 분석결과가 일치하였으나, 이 제2 단계의 녹아웃에서는 일치하지 않았다. 가능한 원인은 다음과 같다: 1. 예를 들면, 방법 1에서 KO1 또는 K02와 독립적으로 상동 재조합을 일으킨 세포가 혼재하고 있다, 2. 푸코스 트랜스포터 유전자가 1쌍(2 유전자)이 아니라 복수 쌍(또는 3 유전자 이상) 존재한다, 3. 제1 단계의 녹아웃에서 수립된 세포주의 배양 중, 계대 중에 남은 푸코스 트랜스포터 유전자의 복제수가 늘어나는 등의 가능성을 생각할 수 있었다.

11. 푸코스의 발현 해석

PCR에 의해 상동 재조합체로 판단된 26개의 세포에서의 푸코스의 발현을 해석하였다. 5㎍/mL의 Lens culinaris Agglutinin, FITC 컨쥬게이트(Vector Laboratories, Cat. No. FL-1041), 2.5%의 FBS, 0.02%의 아지드화 나트륨을 함유하는 PBS(이하, FACS 용해액이라 함) 100㎕에서 1 x 10⁶개의 세포를 빙냉 중에서 1시간 염색하였다. 그 후, FACS 용해액에서 세포를 3회 세정하여 FACSCalibur(Becton Dickinson)로 측정을 실행하였다. 그 결과, 서던 블롯팅 해석에서 푸코스 트랜스포터의 유전자가 완전히 결손되어 있다고 판단된 세포만 푸코스의 발현이 저하되어 있음이 밝혀졌다.

이상의 결과로부터 다음의 사실이 판명되었다:

푸코스 트랜스포터의 유전자가 완전히 결실되어 있는 세포는 스크린된 세포 616개 중 오직 하나의 세포주였고, 상동 재조합의 빈도는 약 0.16%로 매우 낮았다. 제2 단계의 녹아웃에서, PCR와 서던 블롯팅의 해석결과가 일치하지 않았던 이유는, 앞에서 설명한 것과 같이 몇 가지 생각할 수 있다. 그러나, 방법 3에서 얻어진 세포주는, 선택에 두 종류의 약제를 사용하였기 때문에 K02 벡터, K03 벡터와 독립적으로 상동 재조합을 일으킨 세포의 혼합물을 포함하지 않는다. 또, 기타의 PCR에서 상동 재조합을 일으켰다고 판단된 세포주도 모두, 복수의 세포집단으로 구성되어 있다고는 생각하기 어렵다. 앞에서 설명한 것과 같이 푸코스 트랜스포터 유전자가 3개 이상 존재한 경우에는, 세포에서의 표적화는 훨씬 어렵게 된다. 상동 재조합은, Hygr가 거의 발현되지 않는 KO1 벡터와 같은 벡터를 사용하고, 그리고 수많은 스크리닝에 의해서만 얻어질 수 있다.

SEQUENCE LISTING <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Anti-Glypican 3 Antibodies with Modified Sugars <130> PCG-9012WO <150> JP 2004-311356 <151> 2004-10-26 <160> 139 <170> PatentIn version 3.1 <210> 1 <211> 1743 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60 ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120 ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180 gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240 taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300 aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360 catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420 gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480 atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540 cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600 gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660 aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga atcttggaat tgaagtgatc 720 aacacaactg atcacctgaa gttcagtaag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 780 tactgctctt actgccaggg actgatgatg gttaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840 gtcatgcaag gctgtatggc aggtgtggtg gagattgaca agtactggag agaatacatt 900 ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaatct atgacatgga gaacgtactg 960 cttggtctct tttcaacaat ccatgattct atccagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020 ctgaccacca ctattggcaa gttatgtgcc cattctcaac aacgccaata tagatctgct 1080 tattatcctg aagatctctt tattgacaag aaagtattaa aagttgctca tgtagaacat 1140 gaagaaacct tatccagccg aagaagggaa ctaattcaga agttgaagtc tttcatcagc 1200 ttctatagtg ctttgcctgg ctacatctgc agccatagcc ctgtggcgga aaacgacacc 1260 ctttgctgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320 atgaaaaacc agttcaatct ccatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt 1380 caaattattg acaaactgaa gcacattaac cagctcctga gaaccatgtc tatgcccaaa 1440 ggtagagttc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat 1500 gatgaagatg agtgcattgg aggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagctc 1560 cgcttccttg cagaactggc ctatgatctg gatgtggatg atgcgcctgg aaacagtcag 1620 caggcaactc cgaaggacaa cgagataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcattcc 1680 ccgctgaagc ttctcaccag catggccatc tcggtggtgt gcttcttctt cctggtgcac 1740 tga 1743 <210> 2 <211> 580 <212> PRT <213> homo sapiens <400> 2 Met Ala Gly Thr Val Arg Thr Ala Cys Leu Val Val Ala Met Leu Leu 1 5 10 15 Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp 20 25 30 Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly 35 40 45 Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val 50 55 60 Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys 65 70 75 80 Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala 85 90 95 Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln 100 105 110 Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala 115 120 125 Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu Thr 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Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 5 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 6 Ala Ile Asn Asn Asn Gly Asp Asp Thr Tyr Tyr Leu Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Asp <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 7 Gln Gly Gly Ala Tyr 1 5 <210> 8 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 8 Thr Tyr Gly Met Gly Val Gly 1 5 <210> 9 <211> 16 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 9 Asn Ile Trp Trp Tyr Asp Ala Lys Tyr Tyr Asn Ser Asp Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 10 <211> 8 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 10 Met Gly Leu Ala Trp Phe Ala Tyr 1 5 <210> 11 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 11 Ile Tyr Gly Met Gly Val Gly 1 5 <210> 12 <211> 16 <212> PRT 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75 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 75 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 76 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 76 caggtgcagc tggtggagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca 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aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 79 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 79 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 80 <211> 345 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 80 caggtgcagc tggtgcagtc tggagctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggata caccttcacc gactatgaaa tgcactgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggagct cttgatccta aaactggtga tactgcctac 180 agtcagaagt tcaagggcag agtcacgctg accgcggaca aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgac atctgaggac acggccgtgt attactgtac aagattctac 300 tcctatactt actggggcca gggaaccctg gtcaccgtct cctca 345 <210> 81 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 81 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Ala Leu Asp Pro Lys Thr Gly Asp Thr Ala Tyr Ser Gln Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Tyr Ser Tyr Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110 Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 115 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mouse-human chimeric antibody H chain <400> 82 Gln Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp 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gattaagaag 300 tagacggacc tctgttagtt caagtctacc attacctaca caagagtgaa gagtaaccga 360 tctcatgcct ttgatcccag cagctgggat catgtgcatt caatcccagc attcgggagt 420 tatataagac aggagcaagg tctcagagct ggcattcatt ctccagccac attgaggata 480 ggaaaacatt gaagtgtcag gatgctgagg agaggcagca gtttgaggtt tggtagaacc 540 aggatcacct tttggtctga ggtagagtaa gaactgtggc tggctgcttt gcttttctga 600 tcttcagctt gaagcttgaa ctccaatatt tgtctctggg tctattatta tcatgttaca 660 cctaacttta aagctgattt acgcaagaca gttgtaggtg gacctttctt tcctgcccac 720 cagttcccaa ataactgaca cggagactca atattaatta taaatgattg gttaatagct 780 cagtcttgtt actggctaac tcttacattt taaattaact catttccatc cctttacttg 840 ctgccatgtg gttcatggct tgttcaagtc ctgcttcttc tgtctctggc tggtgatgcc 900 tctggttctg ccctttatcc cagaattctc ctagtctggc tctcctgccc agctataggc 960 cagtcagctg tttattaacc aatgagaata atacatattt atagtgtaca aagattgctc 1020 ctcaacaccc aattttttat gtgcaacctg agaatctgga ctcattgccc tcatgcttgc 1080 agaggcggca cccttaccca ctaagccacc tttctagccc tgttgctttt gttttttgag 1140 acaggttcca ctatgtagcc caggctggcc tcaaactgac cattctcctg cctaaacctc 1200 ccgaacactg gaattatagt caaggcctac ctgccctggc attttcacac ttttatttcc 1260 tggctgagtc cattgacttt acactcatca aggttgaacc agttggagtt taattacagt 1320 gccaatcgca ctgaatccca cataatcaaa caacttcaag gaagcaaaaa accagttttt 1380 cctgaagatc aatgtcagct tgcctgattc agaatagacc cccgaaaaaa ggcaaatgct 1440 tgataaccaa tttcttctta ttgttcaatc ccctgctgct gtgtgtaagc tcctgagaaa 1500 ggacagtaag gggacattca tgatcagaga aagagcccca actccccccc cagccccacc 1560 cccaccctgt ccacagtctg ttggtttggt ttccccctgg ctgacaccca gaaatcacaa 1620 cataatcacc taggtcactg taacaagttc ctttctggaa aatgctacaa atgatattgg 1680 taacatgagt aatgaataat gcctggagtc caactccctt gtgacccagc aatgttttcc 1740 gtgggtgctc ccttccccag ctgcaggcct gacatgtacc ttaaaaagcc tcccctggag 1800 gacagaattt tgtgggtact atagtgttct cacaaatact tcccctaata cccttactta 1860 gttaccataa ataacatgca gcccctggtg aggcacacag ggctccaatg tacagcttct 1920 cagacactgc aggaaccttc ctctcctaat gcagcactgg tctcttcagg ctggacagca 1980 ggaacccata ccactccaat cctagtgtgg agtagagctg tctacgaaaa ccagcagatc 2040 tatagctaaa tgtgtttcaa ttttatgctt tgacaaattg tactgacccc acccccaccc 2100 cttccccctt gctgtgctgg gaattgaacc caggaccttg tgcatgccag gcaagtactc 2160 taacactgag ctatagcccc aatctttcat ccaagtctct atgtgtgccc acactcgctt 2220 tttattttga gacaaaaggt tcttattttg agataaggtc tcactatgtt gccttgactt 2280 tttttttttt ttttttttga acttttgacc ttcctacctc agctgagact acaagtcttt 2340 taccatcagg cccggctgat ggtaaaataa cagtatttga aatagtttaa acacatcatc 2400 ttaatggtca accacacaat ttccgaaatg ttgctggctc agtctggggc aaacctgtcc 2460 gccccaacat tggtgctagg aagaaagcac agacaagtag ccctcccagc tcaggagtaa 2520 aagacctgga gggggtggcc cacttcggtc aagttcacgg gatggggagg ggtaccctcc 2580 tccagtagtg gtggtatttg gcagttcctc caccgacgcc ctctggaagc acctgcttgg 2640 acccgcaaag ccaggaatgc agcttcctca agggactcgc cagcgagggt aacaggacag 2700 aggcgtccca agagggctgg ggcggaaggg ggaagacagg gtcggcctta gatagggcaa 2760 agggccttct ggctgtgttc ccggggtaac cgccccacca cgcctggagc ccgacgtggc 2820 gagcgatggg gacagcgagc aggaagtcgt actggggagg gccgcgtagc agatgcagcc 2880 gagggcggcg ctgccaggta cacccgaggg caccgcgggg gtgagcgcca ggtccctgaa 2940 ccagccaggc ctccagagcc gagtccggcg gaccgacggt acgttctgga atgggaaggg 3000 atccgggaca ccgaattgct gcattgaggg gctcagaggt tctgatgtgg gagtccagaa 3060 agggttttat ctaccggagg tgatgtgact tccggcctct ggaagtgctg ttggagtctc 3120 tgggaccttg ggtcctctcg actaggtttg gaaggggtga aataggggta gggagaaagg 3180 agaggactgc agcaatgtct tcccgaacga cctgggttcg ggaggggtcg aaggacaagg 3240 ggctgttgtg gggggtcttc agacgcggag gggtggtatt ctattttctg ggaagatggt 3300 gtcgatgcac ttgaccaagt ctagtcgatc tgaagaggct aggggaacag acagtgagag 3360 aggatggtgg agggagtggc agaacccttc cagaaactgg gagaggctct agcacctgca 3420 accccttccc tggcctccgg ggagtcccag aagagggcag gaccatggac acaggtgcat 3480 tcgtgccggc gcgctccggc ctggcgaagg tgcgcgctct tggaggccgc gggagggcca 3540 gacgcgcgcc cggagagctg gccctttaag gctacccgga ggcgtgtcag gaaatgcgcc 3600 ctgagcccgc ccctcccgga acgcggcccg agacctggca agctgagacg gaactcggaa 3660 ctagcactcg gctcgcggcc tcggtgaggc cttgcgcccg ccatgcctct gtcattgccc 3720 ctcgggccgc ctccctgaac ctccgtgacc gccctgcagt cctccctccc ccccttcgac 3780 tcggcgggcg cttccgggcg ctcccgcagc ccgccctcca cgtagcccac acctccctct 3840 cggcgctccg cttcccacgc ggtccccgac ctgttctttc ctcctccacc ctgcccttct 3900 gtccctctcc cttcctttct cccctcgact cgtccctatt aggcaacagc ccctgtggtc 3960 cagccggcca tggctgtcaa ggctcacacc cttagctagg ccccttctcc cttccctggg 4020 tcttgtctca tgaccccctg ccccgcccgg gagcgagcgc gatgtggagc agtgcctctg 4080 gcaagcagaa cttcacccaa gccatgtgac aattgaaggc tgtaccccca gaccctaaca 4140 tcttggagcc ctgtagacca gggagtgctt ctggccgtgg ggtgacctag ctcttctacc 4200 accatgaaca gggcccctct gaagcggtcc aggatcctgc gcatggcgct gactggaggc 4260 tccactgcct ctgaggaggc agatgaagac agcaggaaca agccgtttct gctgcgggcg 4320 ctgcagatcg cgctggtcgt ctctctctac tgggtcacct ccatctccat ggtattcctc 4380 aacaagtacc tgctggacag cccctccctg cagctggata cccctatctt cgtcactttc 4440 taccaatgcc tggtgacctc tctgctgtgc aagggcctca gcactctggc cacctgctgc 4500 cctggcaccg ttgacttccc caccctgaac ctggacctta aggtggcccg cagcgtgctg 4560 ccactgtcgg tagtcttcat tggcatgata agtttcaata acctctgcct caagtacgta 4620 ggggtggcct tctacaacgt ggggcgctcg ctcaccaccg tgttcaatgt gcttctgtcc 4680 tacctgctgc tcaaacagac cacttccttc tatgccctgc tcacatgtgg catcatcatt 4740 ggtgagtggg gcccgggggc tgtgggagca ggatgggcat cgaactgaag ccctaaaggt 4800 caacactgta ggtaccttta cttactgtcc caggtccctt gcatcagcag ttacaggaag 4860 agccctgtag aaaacaaata acttccttat ggtcattcaa caagttaggg acccagccag 4920 ggtgaaaata atgttagcag caactacagc aaagatggct ctcgccactt gcatgattaa 4980 aatgtgccag gtactcagat ctaagcattg gatccacatt aactcaacta atccctatta 5040 caaggtaaaa tatatccgaa ttttacagag ggaaaaccaa ggcacagaga ggctaagtag 5100 cttgaccagg atcacacagc taataatcac tgacatagct gggatttaaa cataagcagt 5160 tacctccata gatcacacta tgaccaccat gccactgttc cttctcaaga gttccaggat 5220 cctgtctgtc cagttctctt taaagaggac aacacatctg acattgctac cttgaggtaa 5280 catttgaaat agtgggtaga catatgtttt aagttttatt cttacttttt atgtgtgtgt 5340 gtttgggggg ccaccacagt gtatgggtgg agataagggg acaacttaag aattggtcct 5400 ttctcccacc acatgggtgc tgaggtctga actcaggtca tcaggattgg cacaaatccc 5460 tttacccact gagccatttc actggtccaa tatatgtgtg cttttaagag gctttaacta 5520 ttttcccaga tgtgaatgtc ctgctgatca ttatcccctt ttacccggaa gccctctggg 5580 aggtgccatc cctgtggtcg tctgcataca aatggggaaa ctgcaactca gagaaacaag 5640 gctacttgcc agggccccac aagtaagata ggctgggatg ccatcccaga ctggccacac 5700 tccctggcct gtgcttcaag ccagtttact ttgttcctgc ccattggaag ttagcatgtt 5760 gcagtcaaac acaataacta caggccaaaa gtgcttttaa attaaagtca gatgaacttt 5820 taaacatcca gagctcctca actgcaggag ttacaacctg attctgcaac catctttgca 5880 gtgcccggta gtcatatgta gctagaggct cttggctagg acagcatgtg ttaggaaaca 5940 tctggccctg agatcattga attgagtgac tgctgggtga caaagaccaa ggcatccgtt 6000 ccctgagagt cctgggcaag cagcaatgtg accttcattt gtacctactc aggttcttta 6060 tctgtcctgt ttgacctact tagtctcctc tggtgtctca gaggcccagg ctgggtactc 6120 tggatgtcag gatcaggcca atgcgcacat ctgccctaga aatgtccccc tggttgagca 6180 gctcctgaat ccatcggtaa agggtctgga ccagggagga gtcagataaa aagctgacag 6240 cactggggga ctccatgggg aactcccacc tgcccccaca catccatcct aagagaactg 6300 gtattccttg tttcctcttt gtcctacaag gcaccctggg atcccacttc agtctcccag 6360 ccttgccagg gttagagggc atgagcctcc ttgtggggaa tttagatgca agaaggtaca 6420 gtcactagag aacctgagct cagatcccca aagtaaccag tacctgatag tgaggcagct 6480 gagaaccgca gcagcctgcc tgagtggctg aactctgcgg cctccggaac tggccccaac 6540 tgttgggtct cctcttcctt cctcctgtga gggagggccc atctctgata agtgctgtgg 6600 ggactctaga gtagggagga ggaggagcaa tctaagcagg ccttactgag aagtccttgc 6660 tggcatgtgg ctgcctgagg agtacagact gggaacaccc atttgaatga gtaaggtttt 6720 tcctgaaggc catggggagc cacggaggaa aatcatttta gttacaagac aaagagtaga 6780 ttggttaaca tgggagcaag gacatggccc caattttcat agatgaagga aattggaact 6840 cagagaggtt aagtaacttc tcccaaatag ctcagcttca aaatcacaga acagtcagag 6900 tctagatctc tctgatgcct gtgatggtcc tgccattcca tgttgctgat ccctgtggca 6960 tcagtaagcc tctaccttgt gggaatgcag gatctaaatg aagagaggaa gtgctggccc 7020 catgctgtgg tctggaaagc tatgcaggct ctttgagcag agagtgaccc acaagtgaat 7080 agagtcctat gagactcaaa gcaacatcca cccttaagca gctctaacca aatgctcaca 7140 ctgagggagc caaagccaag ttagagtcct gtgcttgccc aaggtcactt tgcctggccc 7200 tcctcctata gcacccgtgt tatcttatag ccctcattac agtgattaca attataatta 7260 gagaggtaac agggccacac tgtccttaca cattcccctg ctagattgta gctgggagag 7320 ggggagatgt aggtggctgg gggagtggga gggaagatgc agattttcat tctgggctct 7380 actccctcag ccattttttg gtgtgggagt tagactttgg atatgttgat gatgaggtaa 7440 gggccacaga acagtctgaa ctgtggtatc agaatcctgt ccctctccct ctctcctcat 7500 ccctcttcac cttgtcactc ctctgtctgc tacaggtggt ttctggctgg gtatagacca 7560 agagggagct gagggcaccc tgtccctcat aggcaccatc ttcggggtgc tggccagcct 7620 ctgcgtctcc ctcaatgcca tctataccaa gaaggtgctc ccagcagtgg acaacagcat 7680 ctggcgccta accttctata acaatgtcaa tgcctgtgtg ctcttcttgc ccctgatggt 7740 tctgctgggt gagctccgtg ccctccttga ctttgctcat ctgtacagtg cccacttctg 7800 gctcatgatg acgctgggtg gcctcttcgg ctttgccatt ggctatgtga caggactgca 7860 gatcaaattc accagtcccc tgacccacaa tgtatcaggc acagccaagg cctgtgcgca 7920 gacagtgctg gccgtgctct actatgaaga gactaagagc ttcctgtggt ggacaagcaa 7980 cctgatggtg ctgggtggct cctcagccta tacctgggtc aggggctggg agatgcagaa 8040 gacccaagag gaccccagct ccaaagaggg tgagaagagt gctattgggg tgtgagcttc 8100 ttcagggacc tgggactgaa cccaagtggg gcctacacag cactgaaggc ttcccatgga 8160 gctagccagt gtggccctga gcaatactgt ttacatcctc cttggaatat gatctaagag 8220 gagccagggt ctttcctggt aatgtcagaa agctgccaaa tctcctgtct gccccatctt 8280 gttttgggaa aaccctacca ggaatggcac ccctacctgc ctcctcctag agcctgtcta 8340 cctccatatc atctctgggg ttgggaccag ctgcagcctt aaggggctgg attgatgaag 8400 tgatgtcttc tacacaaggg agatgggttg tgatcccact aattgaaggg atttgggtga 8460 ccccacacct ctgggatcca gggcaggtag agtagtagct taggtgctat taacatcagg 8520 aacacctcag cctgcctttg aagggaagtg ggagcttggc caagggagga aatggccatt 8580 ctgccctctt cagtgtggat gagtatggca gacctgttca tggcagctgc accctggggt 8640 ggctgataag aaaacattca cctctgcatt tcatatttgc agctctagaa cgggggagag 8700 ccacacatct tttacgggtt aagtagggtg atgagctcct ccgcagtccc taaccccagc 8760 tttacctgcc tggcttccct tggcccagct acctagctgt actccctttc tgtactcttc 8820 tcttctccgt catggcctcc cccaacacct ccatctgcag gcaggaagtg gagtccactt 8880 gtaacctctg ttcccatgac agagcccttt gaatacctga acccctcatg acagtaagag 8940 acatttatgt tctctggggc tggggctgaa ggagcccact ggttctcact tagcctatct 9000 ggctcctgtc acaaaaaaaa aaaaagaaaa aaaaaaagca taaaccaagt tactaagaac 9060 agaagttggt ttataacgtt ctggggcagc aaagcccaga tgaagggacc catcgaccct 9120 ctctgtccat atcctcatgc tgcagaagta caggcaagct cctttaagcc tcatatagga 9180 acactagcct cactcatgag ggttttactc catgacctgt caacctcaaa gccttcaaca 9240 tgaggactcc aacgtaaatt tggggacaga agcactcaga ccatacccca gcaccacacc 9300 ctcctaacct cagggtagct gtcattctcc tagtctcctc tcttgggcct ttagaacccc 9360 catttccttg gggtaatgtc tgatgttttt gtccctgtca taaaaagatg gagagactgt 9420 gtccagcctt tgattcctac ttcctacaat cccaggttct aatgaagttt gtggggcctg 9480 atgccctgag ttgtatgtga tttaataata aaaaagcaag atacagcatg tgtgtggact 9540 gagtgagggc cacagggatc taaaagccaa gtgtgagggg acccagctac agcaggcagc 9600 atcctgagcc tggaatctct tcaggacaag aattctccat atacctacct actctgggga 9660 gtaggtggcc agagttcaag cttcccttag taccaactac cactggctgt gctcttactg 9720 aaggcagaca tggcactgag tgctgtccat ctgtcactca tctccacagc cattcctaat 9780 gtgtggggtg ggagccatca ccaaacccca ttttcagata aggacacagg ctcagagagg 9840 cttgtgtgga gaaaagtagc agcagaattc agagagctgg gtctcctgca gcaccttgga 9900 ctgccagcag ccacagtgct tgtcacacag cacatactca aaagaatgcc agccccctca 9960 gcctagagtg cctggccttt ctttcagatg aggaagaggg tcaaagctgt tagcttgccc 10020 accatatgac cacatacatg accaacagct tgagggaggg aggattactg tggctcccag 10080 cctgagaggt gggacaccca aatgtattag gtccttgaat cagggctgac cttgtgattc 10140 agtcactcct accagaatgc tggggaatgg ggatgccaaa ggcaaaggag gctttctaag 10200 gtgtggtgta agataggcat ttctgcttcc atgtacacct gtgagcagag taggaaggcc 10260 ctgtggagaa tatatcccac aaaccagtag cccttcctgg cagtgggtga atactgccac 10320 cctatacccc tatgcaaggc cagtagaacc acccaaccca caacatctag agaaattaca 10380 ggtcatctta agcctctaaa ttgtggagaa actcgacatg cgcacgattc ctaacctgct 10440 agcctagggt gcggggtgga taatttaagg aaactggggt ttcttataga atcggaggct 10500 ccatgaagtc accctgacaa gaggtcagca atagccagca gcagtggcta ctcctaagcc 10560 tccagacaga gcaccctgtg aatgtacctt attctcacat ctgggtgtct ataggtgtga 10620 ctgggtcaga tgtcacccag gccattgcaa tgggccctta gccccatggg gtgttgggat 10680 agcagccaag cagctcccat gctgagatac tgcctgcagt agactgatgg ataagaaaac 10740 aaggcccaaa atgttttctt tccagacttg atctttcttt gttcaaaaat gctgttttcc 10800 cttaaacttg cccaaaccca ttgttttgca gttgaggaaa ataaggcata gaaagattaa 10860 aggaagtttc tgaggttaca gagcaaagta ctggcttcac ctgaaataga caggtgtgcc 10920 ctgatcctga tttgagctc 10939 <210> 127 <211> 352 <212> PRT <213> Cricetulus griseus <400> 127 Met Ala Leu Thr Gly Gly Ser Thr Ala Ser Glu Glu Ala Asp Glu Asp 1 5 10 15 Ser Arg Asn Lys Pro Phe Leu Leu Arg Ala Leu Gln Ile Ala Leu Val 20 25 30 Val Ser Leu Tyr Trp Val Thr Ser Ile Ser Met Val Phe Leu Asn Lys 35 40 45 Tyr Leu Leu Asp Ser Pro Ser Leu Gln Leu Asp Thr Pro Ile Phe Val 50 55 60 Thr Phe Tyr Gln Cys Leu Val Thr Ser Leu Leu Cys Lys Gly Leu Ser 65 70 75 80 Thr Leu Ala Thr Cys Cys Pro Gly Thr Val Asp Phe Pro Thr Leu Asn 85 90 95 Leu Asp Leu Lys Val Ala Arg Ser Val Leu Pro Leu Ser Val Val Phe 100 105 110 Ile Gly Met Ile Ser Phe Asn Asn Leu Cys Leu Lys Tyr Val Gly Val 115 120 125 Ala Phe Tyr Asn Val Gly Arg Ser Leu Thr Thr Val Phe Asn Val Leu 130 135 140 Leu Ser Tyr Leu Leu Leu Lys Gln Thr Thr Ser Phe Tyr Ala Leu Leu 145 150 155 160 Thr Cys Gly Ile Ile Ile Gly Gly Phe Trp Leu Gly Ile Asp Gln Glu 165 170 175 Gly Ala Glu Gly Thr Leu Ser Leu Ile Gly Thr Ile Phe Gly Val Leu 180 185 190 Ala Ser Leu Cys Val Ser Leu Asn Ala Ile Tyr Thr Lys Lys Val Leu 195 200 205 Pro Ala Val Asp Asn Ser Ile Trp Arg Leu Thr Phe Tyr Asn Asn Val 210 215 220 Asn Ala Cys Val Leu Phe Leu Pro Leu Met Val Leu Leu Gly Glu Leu 225 230 235 240 Arg Ala Leu Leu Asp Phe Ala His Leu Tyr Ser Ala His Phe Trp Leu 245 250 255 Met Met Thr Leu Gly Gly Leu Phe Gly Phe Ala Ile Gly Tyr Val Thr 260 265 270 Gly Leu Gln Ile Lys Phe Thr Ser Pro Leu Thr His Asn Val Ser Gly 275 280 285 Thr Ala Lys Ala Cys Ala Gln Thr Val Leu Ala Val Leu Tyr Tyr Glu 290 295 300 Glu Thr Lys Ser Phe Leu Trp Trp Thr Ser Asn Leu Met Val Leu Gly 305 310 315 320 Gly Ser Ser Ala Tyr Thr Trp Val Arg Gly Trp Glu Met Gln Lys Thr 325 330 335 Gln Glu Asp Pro Ser Ser Lys Glu Gly Glu Lys Ser Ala Ile Gly Val 340 345 350 <210> 128 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 128 ggatcctgcg catgaaaaag cctgaactca cc 32 <210> 129 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 129 gcggccgcct attcctttgc cctcggacg 29 <210> 130 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 130 atgcatgcca ccatgaaaaa gcctgaactc acc 33 <210> 131 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 131 ggatcccagg ctttacactt tatgcttc 28 <210> 132 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 132 gctgtctgga gtactgtgca tctgc 25 <210> 133 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 133 ggaatgcagc ttcctcaagg gactcgc 27 <210> 134 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 134 tgcatcaggt cggagacgct gtcgaac 27 <210> 135 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 135 gcactcgtcc gagggcaaag gaatagc 27 <210> 136 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 136 tgtgctggga attgaaccca ggac 24 <210> 137 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 137 ctacttgtct gtgctttctt cc 22 <210> 138 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 138 ctcgactcgt ccctattagg caacagc 27 <210> 139 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Primer <400> 139 tcagaggcag tggagcctcc agtcagc 27 1/44 8

Claims

당쇄 조성이 변형된 항-글리피간 3 항체 조성물.
제1항에 있어서, 항체-의존성 세포 독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity; ADCC)이 증강된 것을 특징으로 하는 항-글리피간 3 항체 조성물.
제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 조성물 중의 항체가 모노크로날 항체인 것을 특징으로 하는 항-글리피칸 3 항체 조성물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당쇄 조성의 변형이 푸코스가 결손된 항체의 비율의 증가인 것을 특징으로 하는 항-글리피칸 3 항체 조성물.
세포를 사용한 항-글리피간 3 항체의 제조방법으로, 상기 방법은 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 유전자를, 당쇄로 푸코스를 부가하는 능력이 감소된 상기 세포에 도입되어 있는 것을 특징으로 하는 항-글리피칸 3 항체의 제조방법.
제5항에 있어서, 당쇄로 푸코스를 부가하는 능력이 감소된 세포는 푸코스 트랜스포터 결손 세포임을 특징으로 하는 항-글리피칸 3 항체의 제조방법.
항-글리피간 3 항체의 제조방법으로, 상기 방법은

(a) 항-글리피칸 3 항체를 코드하는 유전자를, 당쇄로 푸코스를 부가하는 능력이 감소된 세포에 도입하는 단계; 및

(b) 상기 세포를 배양하는 단계를 포함하는 것인 항-글리피칸 3 항체의 제조방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 따른 항체 조성물을 활성성분으로 함유하는 항암 약물.