PL190065B1

PL190065B1 - Środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego

Info

Publication number: PL190065B1
Application number: PL98335140A
Authority: PL
Inventors: Yasuo Koishihara; Yasushi Yoshimura
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1997-02-12
Filing date: 1998-02-12
Publication date: 2005-10-31
Also published as: KR100655979B1; ES2241114T3; US6503510B2; US20020037288A1; BR9811094A; KR20000070989A; HUP0001136A3; CN1250381A; SK110099A3; HUP0001136A2; NO993866L; TR199901949T2; CA2280875C; HK1026368A1; EP0997152A1; DE69830492T2; EP0997152B1; CN1191855C; UA65561C2; AU5956398A

Abstract

1. Srodek terapeutyczny do leczenia nowotworów ukladu chlonnego (wylaczajac szpiczaki), który zawiera jako substancje aktywna przeciwcialo specyficznie wiazace sie z bialkiem majacym sekwencje aminokwasowa przedstawiona na SEQ ID NO: 1 i posiada- jace dzialanie cytotoksyczne. 2. Srodek terapeutyczny wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze nowotwór ukladu chlonnego jest nowotworem limfocytów T. 3. Srodek terapeutyczny wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze nowotwór ukladu chlonnego jest nowotworem limfocytów B (wylaczajac szpiczaki). 7. Srodek terapeutyczny wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze przeciwcialo zawiera region staly C? przeciwciala ludzkiego. 8. Srodek terapeutyczny wedlug zastrz. 7, znamienny tym, ze region staly C? prze- ciwciala ludzkiego jest regionem C?1 lub C? 3. 9. Srodek terapeutyczny wedlug zastrz. 4, znamienny tym, ze przeciwcialo jest prze- ciwcialem przeciw antygenowi HM 1.24. PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku są środki terapeutyczne do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki) zawierające jako substancję aktywną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach układu chłonnego. Przedmiotem wynalazku jest także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T i limfocytów B (wyłączając szpiczaki).

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało o działaniu cytotoksycznym, specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach limfocytowych.

190 065

Podłoże wynalazku

Komórki limfatyczne są odpowiedzialne za odpowiedź immunologiczną organizmu. Wszystkie komórki limfatyczne pochodzą od tych samych krwiotwórczych komórek macierzystych szpiku, które są stale uwalniane do krwioobiegu. Uwolnienie następuje po zróżnicowaniu występujących w szpiku lub innych organach komórek macierzystych wywołanym oddziaływaniem różnorodnych czynników różnicujących lub czynników wzrostowych. Ze względu na różnice w tym różnicowaniu limfocyty dzieli się ogólnie na dwie klasy, limfocyty B i limfocyty T. Przyjmuje się, że komórki B zdolne są do wytwarzania przeciwciał, podczas gdy limfocyty T zdolne są do prezentowania antygenów, oddziaływań cytotoksycznych i tym podobnych. Jeżeli limfocyty takie ulegną na jakimś etapie różnicowania przemianie nowotworowej, zaczną w sposób niekontrolowany namnażać się w szpiku kostnym, tkankach limfatycznych, we krwi lub tym podobnych, stan taki nazywamy nowotworem układu chłonnego.

Wraz z wprowadzeniem nowych technologii szczególnie zastosowaniu przeciwciał monoklonalnych przeciw antygenom różnicowania na powierzchni komórek, stało się możliwe określenie pochodzenia i/lub stopnia zróżnicowania komórek limfatycznych. Możliwe stało się także nie tylko określenie czy takie komórki nowotworowe pochodzą od komórek T czy od komórek B ale możliwe jest także określenie stopnia dojrzałości komórek nowotworowych.

Na podstawie pochodzenia komórek nowotworowych nowotwory układu chłonnego ogólnie dzieli się na nowotwory komórek B i nowotwory komórek T. Na podstawie dojrzałości komórek nowotworowych nowotwory układu chłonnego pochodzące od komórek B dziali się na ostre białaczki limfocytowe z komórkami B (B-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe B z komórkami (B-CLL), chłoniak z komórkami pre-B, chłoniak Burkitta, chłoniak grudkowy, chłoniak grudkowy płaszcza i chłoniak rozproszony. Nowotwory układu chłonnego pochodzące od komórek T dzieli się na ostre białaczki limfocytowe z komórkami T (T-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe z komórkami T (T-CLL), białaczkę limfocytową z dojrzałymi komórkami T (ATL), chłoniak nie-ATL z komórkami T (PNTL) i jak (Zukai Rinso [Gan] (Illustrated Clinical: Cancer), serie nr 17 Leukemia and Lymphoma, Takashi Sugimura i wsp.,Medical View Co., Ltd., 1987, Bcell tumors, Kiyoshi Takatsuki, Nishimura Shoten, 1991).

Pomimo postępu w naukach medycznych leczenie nowotworów układu chłonnego nie daje zadawalających rezultatów. Stopień wyleczeń ostrych białaczek limfocytowych (ALL) wynosi około 20% lub mniej, a zaawansowanych chłoniaków około 50%, chociaż stopień wyleczeń białaczek B dzięki postępowi w terapii wielolekowej jest stosunkowo wysoki. Natomiast chłoniaki T są oporne na leczenie i ich stopień wyleczeń wynosi około 30%, a stopień wyleczeń białaczki limfocytowej z dojrzałymi komórkami T (ATL) wynosi poniżej 10%.

Goto i wsp. opisują przeciwciało monoklonalne (przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24) uzyskane przez immunizację myszy ludzkimi komórkami szpiczaka (Blood (1994) 84, 1922-1930). Po podaniu przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 myszom z przeszczepionymi komórkami ludzkiego szpiczaka, przeciwciało to gromadzi się specyficznie w tkankach nowotworowych (Masaki Kosaka i wsp., Nippon Rinsho (Japan Clinical) (1995) 53, 627-635), co pokazuje, że przeciwciała tego można użyć do wykrywania i lokalizowania nowotworów metodami znakowania związkami radioaktywnymi i w terapiach docelowych, takich jak radioimmunoterapia. Jednakże nie wykazano, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 jest użyteczne do leczenia innych typów nowotworów.

Opis wynalazku

Stosowane obecnie sposoby leczenia nowotworów układu chłonnego obejmują różne rodzaje chemoterapii, napromienienie promieniami X i przeszczepy szpiku kostnego. Jednakże jak wspomniano powyżej żaden z tych sposobów leczenia nie daje zadawalających rezultatów. Wciąż poszukuje się nowych środków terapeutycznych iub sposobów leczenia nowotworów układu chłonnego i sposobów przedłużenia życia pacjentów.

Przedmiotem wynalazku jest dostarczenie nowego środka terapeutycznego do leczenia nowotworów układu chłonnego, wyłączając szpiczaki.

W celu otrzymania takiego środka terapeutycznego wynalazcy przeprowadzili intensywne badania in vitro włączając analizę metodą cytometrii przepływowej (FCM), określenie aktywności cytotoksycznej, takiej jak aktywność ADCC, aktywność CDC, badania in vivo działania przeciwnowotworowego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 (Goto, T. I wsp.,

190 065

Blood (1994) 84, 1922-1930) oraz podjęli próbę izolacji białka antygenu z którym specyficznie wiąże się przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24. W wyniku tych badań wynalazcy stwierdzili, że białko antygenu rozpoznawanego przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, wyrażane jest przez nowotwory układu chłonnego, a przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 ma działanie przeciwnowotworowe na nowotwory układu chłonnego.

Sposób według wynalazku dostarcza środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na sEq ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną, monoklonalne przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i jako działanie cytotoksyczne mające aktywność ADCC lub CDC.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłącza z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne oraz mające Cy ludzkiego przeciwciała jako region stały.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną chimerowe przeciwciało lub przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i mające działanie cytotoksyczne.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający jako substancję czynną przeciwciało specyficznie wiążące się z epitopem rozpoznawanym przez przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24.

Sposób według wynalazku dostarcza także środek terapeutyczny do leczenia nowotworów limfocytów T lub środka terapeutycznego do leczenia nowotworów limfocytów B (wyłączając szpiczaki) zawierający przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

Przedmiotem wynalazku jest także przeciwciało o działaniu cytotoksycznym, specyficznie wiążące się z białkiem, które ulega ekspresji w nowotworach układu chłonnego.

Opis figur

Figura 1 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 2 ero Ρ+ΛΠηη >n♦nn WUlilU przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi

HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 3 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 4 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi

HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

190 065

Figura 5 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 6 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 7 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 8 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 9 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 10 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 11 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 12 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 13 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 14 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 15 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 16 przedstawia histogram analizy metoda FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 17 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 18 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 19 przedstawia histogram analizy metodą FCM o-pisanej linii limfocytów T przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 20 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-T, nie-B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HML24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 21 przedstawia histogram analizy metodą FCM o-pisanej linii limfocytów nie-T, nie-B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 22 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-T, nie-B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

190 065

Figura 23 przedstawia histogram analizy metodą FCM opisanej linii limfocytów nie-T, nie-B przy zastosowaniu pośredniej metody wykrywania z użyciem przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 i kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a.

Figura 24 przedstawia wykres pokazujący, że cytotoksyczne działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 na nowotworowe linie komórkowe limfocytów T CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 i HPB-MTL jest zależne od dawki.

Figura 25 przedstawia wykres pokazujący, że cytotoksyczne działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 na nowotworowe linie komórkowe limfocytów B EB-3, MCI 16 i CCRF-SB jest zależne od dawki.

Figura 26 przedstawia wykres pokazujący, że wzrost nowotworu w myszach, którym przeszczepiono ludzki nowotwór układu chłonnego jest zahamowany w grupie myszy, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 w porównaniu do grupy myszy, którym podawano kontrolne przeciwciało I-gG2a.

Figura 27 przedstawia wykres pokazujący, że długość życia myszy, którym przeszczepiono ludzki nowotwór układu chłonnego jest większa w grupie myszy, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi HMl.24 w porównaniu do grupy myszy, którym podawano kontrolne przeciwciało IgG2a.

Opis wynalazku

Wytworzenie przeciwciała

1-1. Otrzymanie linii hybrydowych

Linię hybrydowa wytwarzającą przeciwciało sposobem według wynalazku wytwarza się sposobami znanymi w sztuce. Immunizację prowadzi się tradycyjnymi sposobami. Jako antygenu uczulającego używa się białka antygenu HM1.24 lub komórek wyrażających antygen HM1.24. Uzyskane w ten sposób komórki wytwarzające przeciwciała łączy się metodą fuzji ze znanymi liniami macierzystymi, stosując tradycyjne sposoby fuzji. Z otrzymanych hybryd tradycyjnymi sposobami wybiera się te, które wytwarzają przeciwciała.

Specyficzne przeciwciała monoklonalne wytwarza się następująco: jako komórek wyrażających antygen HM1.24, który jest antygenem uczulającym do wytwarzania przeciwciała używa się ludzkiej linii szpiczaka wielokrotnego KPMM2 (Japoński Niebadany Dokument Patentowy (Kokai) Nr. 7-236475) lub KPC-32 (Goto T. I wsp., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400). Jako antygenu uczulającego możną też użyć białka mającego sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 lub peptydu lub polipeptydu zawierającego epitop rozpoznawany przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

Sposobem według wynalazku cDNA kodujące białko, mające sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 wstawia się w miejsce rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Xbal wektora pUC19 i otrzymuje się plazmid pRS38-pUC19. Bakterie E. coli zawierające ten plazmid zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) 5 października 1993 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako FERM BP-4434 (patrz Japoński Niebadany Dokument Patentowy (Kokai) No. 7-196694).

Fragmentu cDNA zawartego w plazmidzie pRS38-pUC19 używa się do wytworzenia metodami inżynierii genetycznej peptydu lub polipeptydu, zawierającego epitop rozpoznawany przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

Sposobem według wynalazku, zwierzę korzystne do immunizacji antygenem immunizującym, wybiera się pod kątem jego zgodności z komórkami linii macierzystej, użytymi w czasie fuzji komórek. Zwierzęta takie obejmują, ale bez ograniczania gryzonie, takie jak myszy, szczury, chomiki i tym podobne.

Immunizację zwierząt antygenem immunizującym prowadzi się tradycyjnymi sposobami. Ogólnie, metoda taka obejmuje dootrzewnowe lub podskórne podanie zwierzęciu antygenu immunizującego. Odpowiednią ilość antygenu immunizującego rozcieńczonego i zawieszonego w roztworze soli zbuforowanym fosforanem (PBS) lub soli fizjologicznej miesza się, jeśli to potrzebne z odpowiednią ilością pełnego adjuwanta Freuda. Po uzyskaniu emulsji, mieszaninę korzystnie podaje się zwierzęciu kilka razy co 4 do 21 dni. Alternatywnie odpowiedniego nośnika używa się jednocześnie z immunizacją antygenem immunizującym.

190 065

Po immunizacji i stwierdzeniu wzrostu poziomu/ pożądanego przeciwciała w osoczu komórki wytwarzające przeciwciała pobiera się ze zwierzęcia i poddaje fuzji z komórkami linii macierzystej. Korzystnie komórki wytwarzające przeciwciała obejmują komórki śledziony.

Komórki szpiczaka ssaków i inne komórki linii macierzystej, które poddaje się fuzji z opisanymi powyżej komórkami wytwarzającymi przeciwciała, korzystnie obejmują różne znane linie komórkowe takie jak P3X63Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123:1548-1550), P3X63Aq8U.l (Current Topics In Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler, G. And Milstrein, C., Eur J. Immunol. (1976)6:511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. i wsp., Celi (1976)8:405-415), SP2/0 (Shulman, M. i wsp., Naturę (1978) 276:269-270), FO (de St. Groth, S. F. i wsp., J. Immunol. Methods (1980) 35:1-21), S194 (Trowbridge, I.S., J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. I wsp., Nature (1979) 277:131-133).

Fuzję komórek szpiczaka z opisanymi powyżej komórkami wytwarzającymi przeciwciała prowadzi się dokładnie według znanych sposobów, takich jak opisany przez (Kohler, G. I Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73:3-46).

Bardziej szczegółowo, fuzję tę prowadzi się w tradycyjnym podłożu odżywczym w obecności na przykład, czynnika przyśpieszającego fuzję. Jako czynnika przyspieszającego fuzję używa się glikolu polietylenowego (PEG), wirusa Sendai (HV.T) lub podobnych. W celu zwiększenia wydajności fuzji używa się także adjuwanta, takiego jak sulfotlenek dwumetylowy.

Korzystny stosunek komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka wynosi na przykład, 1do 10 razy więcej komórek wytwarzających przeciwciała niż komórek szpiczaka. Przykłady podłoży do hodowli jakich używa się do opisanej fuzji komórek obejmują odpowiednie do hodowli linii komórek szpiczaka podłoże RPMT1640 i podłoże MEM oraz inne tradycyjne podłoża do hodowli do które można wzbogacić o surowicę taką jak płodowa surowica bydlęca (FCS).

W czasie fuzji dokładnie miesza się w podłożu do hodowli wcześniej określoną liczbę komórek wytwarzających przeciwciała i komórek szpiczaka, do którego dodaje się roztwór PEG, wcześniej podgrzany do temperatury 37°C, na przykład, dodaje się roztwór PEG o średniej masie molowej około 1000 do 6000 do stężenia od 30% do 60%. Komórki miesza się do uzyskania fuzji komórek (hybryd). Następnie kilkakrotnie dodając odpowiednie podłoże do hodowli i wirując usuwa się nadsącz i środki wspomagające fuzje, które nie są pożądane w czasie hodowli hybryd.

Hybrydy selekcjonuje się hodując je w tradycyjnym podłożu do selekcji na przykład, podłożu HAT (podłoże do hodowli zawierające hipoksantynę, aminopterynę i tymidynę). Komórki hoduje się w tym podłożu przez okres czasu konieczny do zabicia komórek innych niż komórki hybrydy (komórek, które nie uległy fuzji). Zwykle kilka dni do kilku tygodni. Hybrydy wytwarzające pożądane przeciwciało selekcjonuje się tradycyjną metodą ograniczonych rozcieńczeń i namnaża.

Sposobem według wynalazku oprócz wytworzenia komórek hybrydowych uzyskanych metodą immunizacji zwierząt, można też uczulić na antygen HM 1.24 lub na komórki wyrażające an-IB tygen HM1.24 ludzkie limfocyty in vitro. Takie limfocyty poddaje się następnie fuzji z ludzkimi komórkami szpiczaka, na przykład U266 i otrzymuję się pożądane ludzkie przeciwciało mające zdolność wiązania się z antygenem HM 1.24 lub komórkami wyrażającymi antygen HM1.24 (patrz Japoński Dokument Patentowy po badaniu (Kokoku) nr 1-59878). Metodą opisaną w (Międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602, Wo 96/34096 i Wo 96/33735) immunizuje się także zwierzę transgeniczne mające pełen zestaw genów kodujących ludzkie przeciwciało. Używając do immunizacji antygenu HM1.24 lub komórek wyrażających antygen HM1.24 otrzymuje się pożądane przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego.

Linie hybrydowe wytwarzające monoklonalne przeciwciała hoduje się w tradycyjnym podłożu do hodowli lub przechowuje przez długi okres czasu zamrożone w ciekłym azocie.

W celu otrzymania przeciwciała z opisanych linii hybrydowych używa się tradycyjnych metod polegających na pozyskiwaniu przeciwciała z nadsączu hodowli komórkowych lub metod polegających na wszczepieniu linii hybrydowej i jej hodowli w zwierzęciu, które jest zgodne z opisana linią hybrydową i pozyskiwaniu przeciwciała z wysięku. Pierwsza metoda

190 065 jest korzystna do wytwarzania przeciwciała o wysokiej czystości podczas gdy druga metoda jest przydatna do wytwarzania przeciwciał na dużą skalę.

Bardziej szczegółowo, przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 z linii hybrydowej wytwarzającej takie przeciwciało uzyskuje się używając metody opisanej przez Goto, T. I wsp., (Blood (1994) 84: 1922-1930). Przeciwciało uzyskuje się metodą, w której linię hybrydową produkującą przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, złożoną zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako FERM BP-4434 14 września 1995 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia wstrzykuje się dootrzewnowe myszom BALB/C (dostarczonym przez CLEA Japonia) i uzyskuje się wysięk z którego izoluje się przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24. Do wytwarzania przeciwciała używa się też metody w której linię hybrydową hoduje się w odpowiednim podłożu takim jak RPMI1640 zawierającym 10% surowicy płodowej i 5% BM-Condiment HI (BoehringerMannheim), podłoża dla linii hybrydowych SFM (GIBCO-BRL), podłoża PFHMII (GIBCO-BRL) a przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 uzyskuje się z nadsączu.

-2 Zrekombinowane przeciwciało

Sposobem według wynalazku jako monoklonalnego przeciwciała używa się także zrekombinowanego przeciwciała wytworzonego metodami inżynierii genetycznej. Gen kodujący przeciwciało klonuje się z linii hybrydowej i włącza się go w odpowiedni wektor, który następnie wprowadza się do komórek gospodarza (patrz na przykład Carl, A.K., Borrebaeck, i James, W. Larrick, Therapeutic Monoclonal Antibodies, opublikowane w Wielkiej Brytanii przez MacMillan Publishers LTD. 1990).

Bardziej szczegółowo, mRNA kodujący region zmienny (region V) pożądanego przeciwciała izoluje się z linii hybrydowej wytwarzającej to przeciwciało. Izolację tego mRNA prowadzi się metodą izolacji całkowitego RNA znanymi metodami metodą na przykład, przez ultrawirowanie w roztworze guanidyny (Chirgwin, J.M., i wsp., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), lub metodą AGPC (Chomczyński, P. i wsp., Analytical Biochemistry (1987) 162, 156-159). mRNA izoluje się z całkowitego RNA przy użyciu mRNA Purification Kit (Pharmacia). Można też bezpośrednio otrzymać mRNA przy użyciu Quick Prep mRNA Purification Kit (Pharmacia). Z mRNA syntetyzuje się cDNA regionu V przeciwciała przy użyciu odwrotnej transkryptazy. cDNA syntetyzuje się przy użyciu AMV Reverse Transcriptase Firststrand cDNA Synthesis Kit. Syntezę i powielenie cDNA można prowadzić też metodą 5'-RACE (Froman, M.A. i wsp., Proc Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 8998-9002; Belyavski, A. I wsp., Nucleic Acids Res (1989) 17, 2919-2932), w której wykorzystuje się reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), przy użyciu zestawu 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech). Pożądany fragment cDNA oczyszcza się z uzyskanego produktu PCR i łączy z wektorem, a Zrekombinowany wektor wprowadza się do E. coli. Kolonie zawierające Zrekombinowane wektor izoluje się i otrzymuje z nich wektor. Sekwencję nukleotydową wektora potwierdza się znanymi metodami, takimi jak metoda terminacji syntezy DNA dideoksynukleotydami.

Po wytworzeniu DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała, DNA to łączy się z DNA kodującym region stały (region C) pożądanego przeciwciała, a następnie cały konstrukt wstawia w wektor ekspresyjny. Sposobem według wynalazku można też DNA kodujący region V pożądanego przeciwciała wstawić w wektor ekspresyjny, który już zawiera DNA kodujący region stały (region C) przeciwciała.

W celu wytworzenia przeciwciała sposobem według wynalazku gen kodujący przeciwciało włącza się do wektora ekspresyjnego tak, że jest on pod kontrolą regionu regulującego ekspresję na przykład, regionu wzmacniającego i promotorowego. Następnie wektor ekspresyjny wprowadzą się do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało.

-3 Zmienione przeciwciała

W celu zmniejszenia heterogenicznej odpowiedzi immunologicznej u człowieka, sposobem według wynalazku wytwarza się też zmienione Zrekombinowane przeciwciało, takie jak przeciwciało chimerowe lub przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego. Takie zmienione przeciwciało wytwarza się znanymi metodami.

Przeciwciało chimerowe wytwarza się przez połączenie DNA kodującego region V pożądanego przeciwciała z DNA kodującym region stały ludzkiego przeciwciała, a następnie

190 065 wstawienie całego konstruktu w wektor ekspresyjny i wprowadzenie takiego wektora do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP 125023 i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576). Chimerowc przeciwciało użyteczne sposobem według wynalazku wytwarza się tymi metodami.

Na przykład, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący łańcuch L regionu V lub łańcuch H regionu V chimerowego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5<a (pUC19-d.24L-gK i Escherichia coli DH5(a (pUC19-1.24H-gyl), 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako odpowiednio FERM BP-5646 i FERM BP-5644 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No. 9-271536).

Przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego, zwane także przeciwciałem ludzkim o zmienionym kształcie wytwarza się przez przeniesienie regionu określającego komplementamość (CDR) przeciwciała ssaka innego niż człowiek, na przykład myszy, do CDR ludzkiego przeciwciała. Ogólne techniki rekombinacji DNA umożliwiające wytworzenie takich przeciwciał są także znane (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP 125023 i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576).

Bardziej szczegółowo, sekwencję DNA łącząca CDR regionu mysiego przeciwciała z regionem szkieletowym (FR) ludzkiego przeciwciała syntetyzuje się metodą PCR z kilku oddzielnych oligonukleotydów mających na końcach nakładające się sekwencje. Tak wytworzony DNA łączy się z DNA kodującym region C ludzkiego przeciwciała, a następnie wstawia się cały konstrukt w wektor ekspresyjny. Taki wektor wprowadza się w do komórek gospodarza, które wytwarzają to przeciwciało (patrz Europejskie zgłoszenie patentowe EP 239400 i Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 96/02576).

Regiony szkieletowe ludzkiego przeciwciała połączone przez CDR wybiera się tak, żeby regiony określające komplementamość tworzyły korzystne miejsce wiązania antygenu. Jeżeli istnieje taka potrzeba aminokwasy regionów szkieletowych regionu zmiennego przeciwciała należy tak zastąpić, żeby regiony określające komplementamość przeciwciała o zmienionym kształcie tworzyły odpowiednie miejsce wiązania antygenu (Sato, K. I wsp., Cancer Res. (1993) 53,851-856). .

Na przykład, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący wersję r (SEQ ID NO: 2) łańcucha L regionu V i kodujący wersję r (SEQ ID NO: 3) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLai-^A^F^M-^g^K) i Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHrAHM-gył) 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-ehome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako odpowiednio FERM BP-5645 i FERM BP-5643 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No. 9-271536).

Ponadto, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący kodujący wersję s (SEQ ID NO: 4) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM- gyl) 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako FERM BP-6127 (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No. 9-271536).

Region C ludzkiego przeciwciała użyty jako region stały do wytworzenia chimerowego przeciwciała lub przeciwciała o cechach przeciwciała ludzkiego jest korzystnie ludzkim regionem Cyl, Cy2, Cy3 łub Cy4. Z przeciwciał zawierających te regiony, korzystne są przeciwciała zawierające region Cyl i Cy3 ponieważ maja silną aktywność cytotoksyczną, to znaczy aktywność ADCC i aktywność CDC.

Chimerowe przeciwciało zawiera region zmienny przeciwciała pochodzącego od ssaka, innego niż człowiek i region C, pochodzący z przeciwciała ludzkiego. Przeciwciało o cechach przeciwciała ludzkiego, zawiera regiony określające komplementamość, pochodzące

190 065 z przeciwciała ssaka innego niż człowiek, a regiony szkieletowe i region C, pochodzące z przeciwciała ludzkiego. Antygenowość takich przeciwciał w organizmie człowieka jest mała, dlatego są one użyteczne jako substancje czynne wytworzone sposobem według wynalazku.

Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku ludzkiego przeciwciała, obejmuje przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego (patrz Japońskie Zgłoszenie Patentowe No. 9-271536). Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku łańcucha L regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego obejmuje łańcuch L regionu V o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID NO: 2. Korzystny przykład wykonania sposobem według wynalazku łańcucha H regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego obejmuje łańcuch H regionu V o sekwencji aminokwasowej przedstawionej na SEQ ID NO: 3 lub 4.

1-4 Ekspresja i wytwarzanie

Znanymi w sztuce metodami poddaje się ekspresji opisane powyżej geny kodujące przeciwciała i otrzymuje się te przeciwciała. W przypadku komórek ssaków ekspresję prowadzi się przy użyciu wektora ekspresyjnego zawierającego popularny promotor, gen przeciwciała i funkcjonalnie z nim połączony w kierunku 3' DNA zawierający sygnał poli A lub wektor zawierający to DNA. Przykład regionu wzmacniającego/promotorowego obejmuje wczesny region wzmacniający/promotorowy ludzkiego cytomegalowirusa.

Inne regiony wzmacniające/promotorowe, których używa się sposobem według wynalazku do uzyskania ekspresji przeciwciała, obejmują wirusowe regiony wzmacniające/promotorowe, takie jak region wzmacniaj ący/promotorowy retrowirusów, wirusa poliomy, adenowirusa i wirusa małpiego 40 (SV40) i regiony wzmacniające/promotorowe pochodzące z komórek ssaków, takie jak ludzki czynnik wydłużający la (HEF1a).

Ekspresję łatwo prowadzi się metodą opisaną przez Mullingan i wsp., (Nature (1990) 18, 5322) przy użyciu regionu wzmacniaj ącego/promotorowego wirusa SV40 lub metodą opisaną przez Mizushima i wsp., (Nucleic acid Res. (1990) 18, 5322) przy użyciu regionu wzmacniaj ącego/promotorowego HEF1 α.

W przypadku E. coli ekspresję uzyskuje się łącząc funkcjonalnie jeden ze znanych promotorów, sekwencję sygnałową wydzielania przeciwciała i gen kodujący przeciwciało. Jako promotorów używa się, na przykład promotor lacZ i promotor araB. Ekspresję łatwo prowadzi się metodą opisaną przez Ward i wsp., (Naturę (1998) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427) przy użyciu promotora lacZ lub metodą opisaną przez Better i wsp., (Science (1988) 240, 1041-1043) przy użyciu promotora araB.

Jeżeli przeciwciało wytwarza się wperiplazmie E. coli jako sekwencji sygnałowej używa się sekwencji sygnałowej pelB (Lei, S.P. i wsp., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379). Po wyizolowaniu przeciwciała wytworzonego w periplazmie, przed jego zastosowaniem przywraca się odpowiednią strukturę przeciwciała (patrz na przykład WO 96/30394).

Sposobem według wynalazku używa się miejsce początku replikacji, pochodzące z wirusa SV40, wirusa poliomy, adenowirusa lub wirusa brodawczaka bydła (BVP). W celu zwiększenia liczby kopii genu w komórkach gospodarza, wektor ekspresyjny może zawierać marker selekcyjny, taki jak gen transferazy aminoglikozydowej (AHP), gen kinazy tymidynowej (TH), gen fosforybozylotransferazy ksantyna:guanina E. coli (Ecogtp) lub gen reduktazy dihydrofolianowej (dhfr).

Do wytwarzania przeciwciała sposobem według wynalazku można użyć każdego systemu. System wytwarzania przeciwciała obejmuje systemy wytwarzania in vitro i in vivo. Systemy in vitro obejmują systemy wytwarzania wykorzystujące komórki eukariotyczne i systemy wytwarzanie^ wykorzystujące komorki prokanotyczne.

Jeżeli używa się komórek eukariotycznych systemy wytwarzania obejmują komórki zwierzęce, komórki roślinne i komórki grzybów. Znane komórki zwierzęce obejmują (1) komórki ssaków, takie jak komórki CHO, komórki COS, komórki szpiczaka, komórki nerki chomika miniaturowego (BHK), komórki HeLa i komórki Vero, (2) komórki gadów, takie jak oocyty Kenopus lub (3) komórki owadów, takie jak komórki sf9, komórki sf21 i komórki Tn5. Znane komórki roślinne obejmują, na przykład komórki pochodzące od roślin z rodzaju Nicotiana, bardziej szczegółowo Nicotiana tabacum (tytoń), znajdujące się w hodowli w po190 065 staci kallusa. Znane komórki grzybowe obejmują, na przykład komórki drożdży z rodzaju Saccharomyces, bardziej szczegółowo Saccharomyces cereviceae lub grzybów strzępkowych takie jak grzyby z rodzaju Aspergillus, bardziej szczegółowo Aspergillus niger.

Jeżeli używa się komórek prokariotycznych systemy wytwarzania obejmują komórki bakteryjne. Znane komórki bakteiyjne obejmują Escherichia coli (E. coli) i Bacillus subtilis.

Przeciwciało wytwarza się wprowadzając metodą transformacji gen kodujący pożądane przeciwciało do tych komórek i hodując transformowane komórki in vitro. Hodowle prowadzi się znanymi sposobami. Jako podłoża do hodowli używa się na przykład, DMEM, MEM, RPMI1640 i IMDM wzbogaconego w surowicę na przykład, płodową surowicę bydlęcą (FCS). Ponadto przeciwciało można wytwarzać in vivo, wszczepiając komórki zawierające gen kodujący przeciwciało do jamy brzusznej zwierzęcia.

Kolejnym systemem wytwarzania przeciwciała in vivo jest system wykorzystujący zwierzęta i system wykorzystujący rośliny. System wykorzystujący zwierzęta obejmuje system wykorzystujący ssaki i owady.

W systemie wykorzystującym ssaki używa się kóz, świń, owiec, myszy i bydła (Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Applications, 1993). W systemie wykorzystującym owady używa się jedwabników.

W systemie wykorzystującym rośliny używa się, na przykład tytoniu.

Do takich zwierząt lub roślin wprowadza się geny kodujące przeciwciało i odzyskuje się przeciwciała wytwarzane przez takie zwierzęta lub rośliny. Na przykład, w celu wytworzenia genu połączonego, gen kodujący przeciwciało wprowadza się w środek genu kodującego białko, które jest naturalnie wytwarzane w mleku, takie jak β-kazeina kóz. Fragment DNa zawierający gen połączony do którego wstawiono gen kodujący przeciwciało wstrzykuje się embrionowi kozy i taki embrion umieszcza się w macicy kozy. Pożądane przeciwciało uzyskuje się z mleka transgenicznego zwierzęcia urodzonego przez kozę której wszczepiono zmieniony embrion lub od jej potomstwa. W celu zwiększenia ilości mleka zawierającego pożądane przeciwciało wytwarzanego przez transgeniczną kozę, można jej podawać odpowiednie hormony (Ebert, K.M. i wsp., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, w którym używa się jedwabników, jedwabniki te infekuje się bakulowirusem, do którego wstawia się gen kodujący pożądane przeciwciało. Przeciwciało to odzyskuje się z płynów ciała jedwabnika (Susumu, M. I wsp., Naturę (1985) 315, 592-594). W przykładzie wykonania sposobu według wynalazku w którym używa się tytoniu, gen kodujący pożądane przeciwciało wstawia się w roślinny wektor ekspresyjny, na przykład pMON 530 i taki wektor wprowadza się do bakterii, takich jak Agrobacterium tumefaciens.

W celu uzyskania pożądanych przeciwciał z liści rośliny, bakteriami zawierającymi wektor infekuje się tytoń, taki jak Nicotiana tabacum (Julian, K.-C. Ma i wsp., Eur J. Immunol. (1994) 24, 131-138).

Jeżeli przeciwciało wytwarza się w opisanych powyżej systemach in vitro lub in vivo, DNA kodujący ciężki łańcuch (łańcuch H) przeciwciała i DNa kodujący lekki łańcuch (łańcuch L) przeciwciała, wprowadza się do dwóch oddzielnych wektorów ekspresyjnych, a komórki gospodarza transfermuje się jednocześnie oboma wektorami, lub DNA kodujący ciężki łańcuch (łańcuch H) przeciwciała i DNA kodujący lekki łańcuch (łańcuch L) przeciwciała, wprowadza się do jednego wektora ekspresyjnego, którym transformuje się komórki gospodarza (patrz Międzynarodowe zgłoszenie patentowe WO 94-11523).

W celu otrzymania zmodyfikowanego przeciwciała, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku, można sprzęgnąć z różnymi cząsteczkami, takimi jak glikol polietylenowy (PEG). Użyty tu termin „pizeciwciało” obejmuje także takie zmodyfikowane przeciwciała. W celu otrzymania zmodyfikowanego przeciwciała, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku można zmodyfikować metodami chemicznymi. Metody te są znane biegłym w sztuce.

2. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała

2-1. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku izoluje się z wnętrza komórki lub z jej otoczenia lub z gospodarza, a następ12

190 065 nie oczyszcza się je do postaci homogennej. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku prowadzi się metodą chromatografii powinowactwa. W tym celu używa się kolumny Protein A lub kolumny Protein G. Nośnikami używanymi w kolumnie Protein A sąHyper D, POROS i Sepharose F.F.

Przeciwciała wytworzone sposobem według wynalazku, izoluje się i oczyszcza także wszystkimi znanymi tradycyjnymi metodami izolowania i oczyszczania białek. Izolowanie i oczyszczanie przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku prowadzi się łącząc inne rodzaje chromatografii, ultrafiltrację, wysalanie i dializę. Chromatografia obejmuje, na przykład chromatografię hydrofobową, filtrację przez żel. Do chromatografii można użyć HPLC. Używa się także H chromatografii z odwróconymi fazami.

2-2 Określenie stężenia przeciwciała

Stężenie przeciwciała wytworzonego w punkcie 2-1 określa się mierząc absorbancję lub metodą immunosorbcyjną (ELISA). Jeżeli określenia stężenia przeciwciała dokonuje się metodą pomiaru absorbancji, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku lub próbkę zawierającą takie przeciwciało, rozcieńcza się odpowiednio PBS(-) i mierzy się absorbancję przy długości fali 280 nm. Ilość przeciwciała oblicza się na podstawie współczynnika absorbancji wynoszącego 1,35 OD dla roztworu 1 mg/ml. Jeżeli określenia stężenia przeciwciała dokonuje się metodą immunosorbcyjną pomiar prowadzi się następująco: do studzienek 96-studzienkowej mikropłytki (NUNC) dodaje się 100 μΐ przeciwciała przeciw człowiekowi IgG kozy (BIO SOURCE) rozcieńczonego do stężenia 1 μg/ml 0,2 M buforem węglanowym, pH 9,6 i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc w temperaturze 4°C w celu immobilizacji przeciwciała.

Po zablokowaniu mikropłytki, do studzienek dodaje się 100 μΐ odpowiednio rozcieńczonych przeciwciał wytworzonych sposobem według wynalazku lub 100 μΐ próbki zawierającej takie przeciwciała lub jako standard 100 μΐ ludzkich przeciwciał IgG o znanym stężeniu i inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu do studzienek dodaje się 100 μΐ 5000 razy rozcieńczonego roztworu przeciwciała przeciw człowiekowi IgG sprzęgniętego z fosfatazą alkaliczną (BIO SOURCE) i inkubuje się przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po przepłukaniu, do studzienek dodaje się roztworu substratu i mierzy absorbancję przy długości fali 405 nm, za pomocą MICROpLaTE READER Model 3550 (Bio Rad). Następnie oblicza się stężenie pożądanego przeciwciała.

3. Analiza FCM

Zdolność wiązania się przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku z komórkami nowotworów układu chłonnego bada się metodą cytometrii przepływowej (FCM). Do badań używa się komórek nowotworów układu chłonnego pochodzących od stałych linii lub świeżo wyizolowanych. Stałe linie obejmują, na przykład linie limfocytów T RPMI 8402 (ATCC CRL-1994), CCRF-CEM (ATCC ĆCL-119) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, HBP-ALL (FCCH1018) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, HBP-MTL (FCCH1019) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytów T, jM (FCCH1023) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, MOLT-4 (ATCC CRL1582) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, Jurkat (FCCFI1024) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, MT-1 (FCCH1043) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytową z dojrzałymi komórkami T, KT-3 pochodząca od pacjenta z białaczką Lennerta (LIT). Linie limfocytów B obejmują transformowane wirusem EB komórki CESS (ATCC TIB-190), wykazujące obecność wirusa EB limfocyty B linii SKW 6.4 (ATCC TIB-215), MC116 (ATCC CRL-1649) pochodząca od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami B, CCRF-SB (ATCC CCL-1'20) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórkami B, RPMI 6410 (FCCH6047) pochodząca od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linię Daudi (ATCC CCL-213) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta, EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta, Jijoye (ATCC CCL-87) pochodząca od pacjenta z białaczką Burkitta, Raj i (ATCC CCL-86) pochodzącą od pacjenta z białaczką Burkitta. Linie komórek nie-T i nie-B obejmują linię HL60 (ATCC CCL-240) pochodzącą od pacjenta z ostrą białaczką mielocytarną, linię THP-1 (ATCC TIB-202) pochodzącą od pacjenta z ostrą białaczką monocytarną, linię U937 (ATCC CRL190 065

1593) pochodzącą od pacjenta z chłoniakiem monocytamym, linię K562 (ATCC CCL-243) pochodząca od pacjenta z chroniczną białaczką mielocytarną.

Po przemyciu wymienionych komórek buforem PBS(-), dodaje się do nich 100 μΐ przeciwciała lub przeciwciała kontrolnego rozcieńczonego, do stężenia 25 μg/ml buforem FACS (PBS(-) zawierającym 2% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodowego) i inkubuje się przez 30 minut na lodzie. Po przemyciu buforem FACS dodaje się 100 μΐ roztworu 25 μg/ml przeciwciała kozy przeciw myszy znakowanego FITC (GAM, Becton Dickinson) i inkubuje się przez 30 minut na lodzie. Po przemyciu buforem FACS komórki zawiesza się w 600 ml lub 1 ml buforu FACS i mierzy się intensywność fluorescencji przy użyciu FACScan (Becton Dickinson).

Mierząc wartość intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek określa się reaktywność przeciwciała wytworzonego sposobem według wynalazku w stosunku do tych komórek. Mierząc wartość intensywności fluorescencji dla poszczególnych komórek określa się czy antygen HM1.24 znajduje się na powierzchni komórki (odpowiedź pozytywna lub negatywna) i można określić intensywność ekspresji tego antygenu. Obecność i intensywność ekspresji antygenu HM1.24 na powierzchni komórek nowotworów układu chłonnego, zmierzona metodąFCM, przedstawiono w przykładzie 2.2 poniżej.

Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko komórki nowotworów układu chłonnego, które maja antygen HM1.24 na powierzchni. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24 w ilości nie mniejszej niż 5%. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywna na obecność antygenu HM1.24, w ilości 20% łub więcej. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku, niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24, w ilości 50%) lub więcej. Bardziej szczegółowo, przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku niszczy tylko takie komórki nowotworów układu chłonnego, które dają odpowiedź pozytywną na obecność antygenu HM1.24 w ilości 80% lub więcej.

4. Aktywność cytotoksyczna

4-1. Pomiar aktywności CDC

Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku wykazuje jako aktywność cytotoksyczna aktywność CDC.

Aktywność CDC środka terapeutycznego wytworzonego sposobem według wynalazku mierzy się następująco: w odpowiednim podłożu przygotowuje się 4 x 10⁵ komórek testowych, na przykład w podłożu RPMI1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). Jako komórek testowych używa się CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRFHSB-2 (ATCC CCL-120.1) HBP-MTL (FCCH1019), MCH6 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), EB-3 (ATCC CCL-85), K562 (ATCC CCL-243). 50 μΐ zawiesiny komórek, dodaję się do studzienek, 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc, w temperaturze 37°C w atmosferze CO2. Następnie dodaje się takiego przeciwciała, którego aktywność CDC ma być zmierzona, i inkubuje się przez 60 minut. Po inkubacji, do studzienek dodaje się na 2 godziny, odpowiednio rozcieńczony roztwór komplementu, na przykład Baby Rabbit Complement (CadArLANE) i do każdej studzienki dodaje się 10 μΐ Alamar Bulę (BIO SOURCE) i inkubuje przez 4 godziny. Następnie mierzy się intensywność fluorescencji każdej studzienki, przy użyciu aparatu pomiarowego Cytoflour 2350 (MILLIPORE) przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Aktywność cytotoksyczna (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych w obecności przeciwciała, B oznacza intensywność fluorescencji próbek, inkubowanych w podłożu bez przeciwciała, C oznacza intensywność fluorescencji próbek niezawierających komórek.

190 065

4-2. Pomiar aktywności ADCC

Przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku wykazuje jako aktywność cytotoksyczna aktywność ADCC.

Aktywność ADCC środka terapeutycznego wytworzonego sposobem według wynalazku mierzy się następująco: jako komórki efektorowe z ludzkiej krwi obwodowej lub ze szpiku kostnego, izoluje się metodą wirowania komórki jednojądrzaste. Przygotowuje się komórki testowe, na przykład CCRF-CEM (ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) HBP-MTL (FCCH1019), EB-3 (ATCC CCL-85), MCI 16 (ATCC CRL-1649), CCRF-SB (ATCC CCL-120), K562 (ATCC CCL-243), wyznakowane ⁵‘Cr. Do znakowanych komórek testowych dodaje się przeciwciała, którego aktywność ADCC ma być zmierzona, i inkubuje się. Po inkubacji, do komórek testowych dodaje się w odpowiedniej proporcji komórek efektorowych i znów inkubuje. Po inkubacji, zbiera się nadsącz i mierzy jego radioaktywność w liczniku gamma. Do określenia całkowitej aktywności próbki, rozpuszcza się komórki w 1% roztworze NP-40. Aktywność cytotoksyczna (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną z próbek inkubowanych w obecności przeciwciała, B oznacza radioaktywność (cpm) uwolnioną przez NP-40, C oznacza radioaktywność (cpm), uwolnioną z próbek niezawierających komórek i przeciwciała.

4-3. Zwiększenie aktywności cytotoksycznej.

Korzystne przeciwciało, wykazujące aktywność cytotoksyczną, taką jak CDC lub ADCC, posiada jako region stały (region C) region Cy, szczególnie Cyl i Cy3 ludzkiego przeciwciała. Można także uzyskać silniejszą aktywność CDC lub ADCC dodając, zaburzając lub modyfikując część aminokwasów regionu C przeciwciała.

Jako przykład, można podać wytworzenie polimeru podobnego do IgM z IgG przez zastąpienie aminokwasów (Smith, R.I.F. & Morrison, S.L. BIO/TECHNOLOGY (1994) 12, 683-688), wytworzenie polimeru podobnego do IgM z IgG przez dodanie aminokwasów (Smith, R.I.F. i wsp., J. Immunology (1995) 154, 2226-2236), ekspresję genów kodujących łańcuch L połączonych w układ tandemowy (Shuford, W. i wsp., Science (1991) 252, 724-727), dimeryzację IgG przez zastąpienie aminokwasów (Caron, P.C. i wsp., exp. Med. (1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., Immunology (1992) 148, 2918-2922), dimeryzację IgG przez chemiczną modyfikację aminokwasów (Wolff, E. A. I wsp., Cancer Res. (1993) 53, 2560-2565), wprowadzenie funkcji efektorowej przez zmianę aminokwasu lub aminokwasów regionu zawiasowego przeciwciała (Norderhaug, L. I wsp., Eur. J. Immunol. (1991) 21, 2379-2384). Można to osiągnąć metodą oligomerowej specyficznej miejscowo mutagenezy z zastosowaniem primerów, dodanie sekwencji zasad, wykorzystując miejsca rozpoznawane przez enzymy restrykcyjne lub używając związków chemicznych tworzących wiązanie kowalencyjne.

5. Potwierdzenie działania terapeutycznego

Działanie terapeutyczne środka terapeutycznego, przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego, wytworzonego sposobem według wynalazku, potwierdza się podając przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku zwierzętom, którym przeszczepiono komórki nowotworów układu chłonnego i badając przeciwnowotworowe działanie środka terapeutycznego.

Komórki nowotworów układu chłonnego, które podaje się zwierzętom obejmują komórki pochodzące od stałych linii lub linii świeżo wyizolowanych. Komórki pochodzące od stałych linii obejmują komórki linii limfocytów T, na przykład CCRF-CEM (ATCC CCL119), HBP-MTL (FCCH1019), CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1). komórki linii limfocytów B, na przykład CESS (ATCC TIB-190), SKW 6.4 (ATCC TIB-215), CCRF-SB (ATCC CCL-120), REMI 6410 (FCCH6047) EB-3 (ATCC CCL-85).

Do potwierdzenia działania terapeutycznego korzystnie używa się zwierząt o zmniejszonej odpowiedzi immunologicznej łub zwierząt jej pozbawionych. Przykładami takich zwierząt, których używa się do potwierdzenia działania terapeutycznego sposobu według wynalazku są myszy nudę, myszy SCID, myszy beige i szczury nudę. Działanie przeciwnowotworowe mierzy się określając objętość i wagę nowotworu lub czas przeżycia zwierząt.

Jak pokazano w przykładach poniżej przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 powodują zahamowanie wzrostu objętości nowotworu i co więcej wydłużenie czasu przeżycia

190 065 zwierząt z przeszczepionym nowotworem. Potwierdza to przeciwnowotworowe działanie przeciwciał przeciw antygenowi HM1.24.

6. Sposób podawania i preparowanie farmaceutyczne

Środek terapeutyczny przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego wytworzony sposobem według wynalazku, podaje się systemowo lub miejscowo, drogą pozajelitową, na przykład jako wstrzyknięcie dożylne w postaci infuzji kroplowej, wstrzyknięcie domięśniowe, wstrzyknięcie dootrzewnowe i wstrzyknięcie podskórne. Sposób podawania wybiera się w zależności od wieku i stanu pacjenta. Dawka efektywna wynosi od 0,01 mg do 100 mg na kilogram wagi ciała, na jedno traktowanie. Alternatywnie podaje się dawkę od 1 mg do 5000 mg, korzystnie od 5 mg do 50 mg na pacjenta.

W zależności od sposobu podania, środek terapeutyczny przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego wytworzony sposobem według wynalazku, może zawierać farmaceutycznie akceptowane nośniki lub dodatki, Takie nośniki lub dodatki obejmują wodę, farmaceutycznie akceptowane rozpuszczalniki organiczne, kolagen, alkohol poliwinylowy, poliwinylopirolidynę, polimer karboksywinylowy, sól sodową karboksymetylocelulozy, poliakrylan sodowy, ałginian sodowy, dekstran rozpuszczalny w wodzie, sól sodową karboksymetyloskrobii, pektynę, metylocelulozę, etylocelulozę, gumę ksantanowa, gumę arabską, kazeinę, żelatynę, agar, diglicerynę, glikol propylenowy, glikol polietylenowy, wazelinę, parafinę, alkohol stearynowy, kwas stearynowy, albuminę surowicy ludzkiej (HSA), mannitol, sorbitol, laktozę i farmaceutycznie akceptowany związek powierzchniowoczynny. W zależności od dawki i formy podawania, wybiera się dodatki z wymienionej wyżej listy, która jednak nie wyczerpuje wszystkich możliwych dodatków, lub tworzy się ich połączenia.

Sposobem według wynalazku leczy się nowotwory układu chłonnego (wyłączają szpiczaki) których komórki na swojej powierzchni mają antygen, z którym może się związać przeciwciało wytworzone sposobem według wynalazku. Wymienić można ostre białaczki limfocytowe z komórkami B (B-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe B z komórkami (B-CLL), chłoniak z komórkami pre-B, chłoniak Burkitta, chłoniak grudkowy, chłoniak grudkowy płaszcza i chłoniak rozproszony, ostre białaczki limfocytowe z komórkami T (T-ALL), chroniczne białaczki limfocytowe z komórkami T (T-CLL), białaczkę limfocytową z dojrzałymi komórkami T (ATL), chłoniak nie-ATL z komórkami T (PNTL). Środek terapeutyczny wytworzony sposobem według wynalazku jest użyteczny do leczenia tych nowotworów układu chłonnego.

Przykłady

Sposób według wynalazku będzie bardziej szczegółowo wyjaśniony poniżej w oparciu o ilustrujące go przykłady. Należy pamiętać poniższe przykłady nie ograniczają zakresu wynalazku.

Przykład 1.

Wytwarzanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24

1. Wytwarzanie wysięku zawierającego przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

Komórki hybrydowe wytwarzające przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 otrzymano według metody opisanej przez Goto i wsp. (Blood (1994) 84, 1922-1930).

x 10⁵ komórek hybrydowych wstrzykuje się dootrzewnowo myszom BALB/c (CLEA, Japonia), którym 11 i 3 dni wcześniej podano dootrzewnowe po 500 (il 2,6,10,14-tetrametylopentadekanu (Wako Pure Chemical Industries, Ltd). Od 10 dnia po wstrzyknięciu komórek hybrydowych wysięk zbierający się w jamie brzusznej myszy, pobiera się poprzez założoną na stałe igłę typu Happycas nr 19 (Medikit). Zebrany wysięk wiruje się dwa razy, przy szybkości 1000 i 3000 obrotów na minutę, na wirówce wolnoobrotowej RLK-131 (Tomy Seiko), w celu usunięcia komórek hybrydowych i zanieczyszczeń, takich jak komórki krwi.

2. Oczyszczanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 otrzymanego z mysiego wysięku

Oczyszczanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 otrzymanego z mysiego wysięku prowadzi się następująco: do wysięku dodaje się równa ilość PBS(-) i mieszaninę filtruję się przez włóknisty filtr płuczkowy Mediaprep (MILLIPORE) i oczyszcza się metodą chromatografii powinowactwa, przy użyciu aparatu do szybkiego oczyszczania przeciwciał ConSep LC100 (MILLIPORE) stosując kolumnę Hyper D Protein A (objętość kolumny 20 ml, wytwórca Nihon Gaisi), i zgodnie z załączoną instrukcją PBS(-), jako bufor do adsorpcji i 0,1 M cytrynian sodowy (pH 4), jako bufor do wymywania. Wymyte frakcję natychmiast doprowadza się do pH

190 065

7,4 przez dodanie 1 M Tris-HCl (pH 8,0), zatęża za pomocą aparatu do ultra-filtracji grawitacyjnej Centriprep 10. Jednocześnie z zatężeniem prowadzi się wymianę buforu na PBS. Po zatężeniu, roztwór przeciwciała sterylizuje się poprzez filtrację się przez filtr membranowy MILLEX-GV (MILLIPORE), o wielkości porów 0,22 μηι i uzyskuje się oczyszczone przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

3. Określenie stężenia przeciwciała

Stężenia oczyszczonego przeciwciała określa się mierząc absorbancję. Oczyszczone przeciwciało rozcieńcza się w PSS(-) i mierzy się absorbancję przy długości fali 280 nm. Ilość przeciwciała oblicza się na podstawie współczynnika absorbancji wynoszącego 1,35 OD dla roztworu 1 mg/ml.

Przykład 2.

Badanie reaktywności przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 przeciw nowotworom układu chłonnego

1. Oczyszczanie kontrolnego mysiego IgG2a.

Kontrolne mysie IgG2a oczyszcza się następująco: dostępny w handlu wysięk przeciwciał IgG2a (KAPPA) (UPC 10) (wytwórca KAPpA) rozpuszcza się w wodzie i pBs(-). Roztwór filtruje się przez filtr membranowy Acrodisc (wytwórca Gelman Sciences) o wielkości porów 0,22 μη i oczyszcza się metoda chromatografii powinowactwa, przy użyciu aparatu do szybkiego oczyszczania przeciwciał ConSep LC100 (MILLIPORE), stosując kolumnę Hyper D Protein A (objętość kolumny 20 ml, wytwórca Nihon Gaisi), i zgodnie z załączoną instrukcją PBS(-) jako bufor do adsorpcji i 0,1 M cytryian sodowy (pH 4) jako bufor do wymywania. Wymyte frakcje natychmiast doprowadza się do pH 7,4 przez dodanie 1 M Tris-HCl (pH 8,0), zatęża za pomocą aparatu do ultrafiltracji grawitacyjnej Centriprep 10. Jednocześnie z zatężeniem prowadzi się wymianę buforu na PBS. Po zatężeniu roztwór przeciwciała sterylizuje się poprzez filtrację przez filtr membranowy MILLEX-GV (MILLIPORE) o wielkości porów 0,22 μη i uzyskuje się oczyszczone kontrolne mysie przeciwciało I-gG2a.

Określenie stężenia przeciwciała

Stężenie oczyszczonego kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a określa się tak jak w punkcie 3 powyżej.

2. Analiza FCM

Reaktywność wytworzonego sposobem według wynalazku przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, przeciw komórkom nowotworów układu chłonnego, bada się metoda cytometrii przepływowej (FCM). Po przemyciu buforem PBS(-) linii limfocytów T RPMI 8402 (ATCC cRL-1994), linii CCRF-CEM (ATCC CCL-119) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii HBP-ALL (FCCH1018) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii HBP-MTL (FCCH1019) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytów T, linii JM (FCCH1023) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii MOLT-4 (ATCC CRL-1582) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii Jurkat (FCCH1024) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfocytową, linii CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii MT-1 (FCCH1043) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z dojrzałymi komórkami T, linii KT-3 pochodzącej od pacjenta z białaczką Lennerta (LIT), lub linii limfocytów B, na przykład transformowanych wirusem EB komórek CESS (ATCC TIB-190), wykazujących obecność wirusa EB limfocytów B linii SKW 6.4 (ATCC TIB-215), linii MCII6 (ATCC CRL-1649) pochodzącej od pacjenta z białaczka limfocytowa z komórkami B, linii CCRF-SB (ATCC CCL-120) pochodzącej od pacjenta z ostra białaczką limfoblastyczną z komórkami B, linii RPMI 6410 (FCCH6047) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linii Daudi (ATCC CCL-213) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii Jijoye (ATCC CCL-87) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii Raj i (ATCC CCL-86) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, lub linii komórek nie-T i nie-B, na przykład linii HL60 (ATCC CCL-240) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką mielocytamą, linii THP-1 (ATCC TIB-202) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką monocytamą, linii U937 (ATCC CRL-1593) pochodzącej od pacjenta z chłoniakiem monocytamym, linii K562 (ATCC CCL-243) pochodzącej od pacjenta z chroniczną białaczką mielocytamą dodaje się do nich 100 μΐ przeciwciała przeciw

190 065 antygenowi HM 1.24 lub mysiego przeciwciała IgG2a rozcieńczonego do stężenia 25 pg/ml buforem FACS (PBS(-) zawierającym 2% płodowej surowicy cielęcej i 0,1% azydku sodowego i inkubuje się przez 30 minut w lodzie. Po przemyciu buforem FACS dodaje się 100 pl roztworu 25 pg/ml przeciwciała kozy przeciw myszy, znakowanego FITC (GAM, Becton Dickinson) i inkubuje się przez 30 minut w lodzie. Po przemyciu buforem FACS, komórki zawiesza się w 600 ml lub 1 ml buforu FACS i mierzy się intensywność fluorescencji przy użyciu FACScan (Becton Dickinson).

Wyniki pokazane na figurach 1-23 wskazują, że wszystkie linie limfocytów T i limfocytów B reagują z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24, antygen ten ulega w komórkach tych linii silnej ekspresji (oprócz linii Daudi i Raji, które nie reagują). Wyniki wskazują także, że żadna z linii komórek nie-T i nie-B nie reaguje z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 i że w żadnej z tych linii antygen ten nie ulega wykrywalnej ekspresji.

Na histogramach przedstawionych na figurach 1-23 markery są tak ustawione, że gdy używa się kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a, liczba komórek niedających sygnału wynosi 98%, a liczba komórek dających sygnał wynosi 2%. Wyniki pokazane w tabeli 1 oznaczają procent komórek posiadających antygen HM1.24, wykryty przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 z uwzględnieniem markerów. Biorąc pod uwagę procent komórek posiadających antygen HM1.24, intensywność ekspresji tego antygenu podzielono na 5 stopni: +, ++, +++. Podobnie jak wykazano na figurach 1-23, badania te potwierdziły, że w komórkach linii limfocytów T i limfocytów B antygen HM1.24 ulega silnej ekspresji (oprócz linii Daudii Raji), Wyniki wskazują także, że we wszystkie komórki, linii komórek nie-T i nie-B nie reagują z przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 lub, że procent komórek posiadających antygen HM1.24 jest mniejszy niż 5%. Wynika z tego, że w tych liniach antygen HM1.24 nie występuje lub jest go bardzo mało.

Tabela 1

	Nazwa komórek	Intensywność ekspresji
1	2	3	4
Linii limfocytów B	CESS	+++	94,5
	SKW 6.4	+++	92,8
	MCI 16	++	65,0
	CCRF-SB	+++	98,4
	RPMI6410	+++	94,5
	EB-3	+++	88,3
	Jijoye	+++	92,3
	Daudi	-	2,8
	Raji	-	2,0
Linii limfocytów T	RPMI 8402	+++	94,0
	CCRF-CEM	+++	97,8
	HBP-ALL		63 8
	HBP-MTL	+++	94,6
	JM	+++	99,6
	MOLT-4	+++	84,1
	Jurkat	++	70,9

190 065

Ciąg dalszy tabeli 1

1	2	3	4
	CCRF-HSE^	+++	100,0
	MT-1	+++	95,9
	KT-3	+++	96,0
Linie komórek	HL60	-	2,9
nie-T i nie-B	THP-1		1,5
	U937	-	1,1
	K562	-	3,9

-, <5%; +/-, 5-20%; +,20-50; ++, 50-80%; +++, >80%

Przykład 3.

Określenie aktywności CDC

Aktywność CDC przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, przeciw nowotworom układu chłonnego mierzy się następująco:

1. Przygotowanie komórek testowych

Przygotowuje się komórki testowe linii CCRF-CEM (ATCC CCL-119) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, linii HPB-MLT (FCCH1019) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami T, linii EB-3 (ATCC CCL-85) pochodzącej od pacjenta z białaczką Burkitta, linii MCII6 (ATCC CRL-1649) pochodzącej od pacjenta z białaczką limfocytową z komórkami B, linii CCRF-SB (ATCC CĆL-120) pochodzącej od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną z komórkami B, linii K562 (ATCC CCL-243) pochodzącej od.pacjenta z chroniczną białaczką mielocytamą. W podłożu RPMI1640 zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL) zawiesza się 4 x 10⁵ komórek testowych. 50 μΐ zawiesiny komórek dodaje się do studzienek 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się taką mikropłytkę przez noc w temperaturze 37°C w atmosferze CO2 w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI).

2. Przygotowanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24

Przygotowuje się roztwór wytworzonego w przykładzie 1 przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o stężeniu 0, 0,2, 2 i 20 μg/ml, w podłożu RPMI1640 zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). 50 μ! każdego z tych roztworów dodaje się do studzienek, przygotowanej w punkcie 1 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem (FALCON) i inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37°C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). Po inkubacji płytkę wiruje się przez 5 minut w wirówce wolnoobrotowej 05PR-22 (Wytwórca Hitachi), przy szybkości 1000 obrotów na minutę. Po wirowaniu usuwa się 50 μΐ nadsączu.

3. Przygotowanie komplementu

Jedno opakowanie Baby Rabbit Complement (wytwórca CADARLANE) rozpuszcza się w 1 ml oczyszczonej wody, a następnie rozcieńcza się 5 ml podłoża RPMI1640 (GibcoBRL)n, zawierającego FCS. 50 μΐ roztworu komplementu, dodaje się do każdej studzienki 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem i inkubuje się przez 2 godziny, w temperaturze 37°C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI).

4. Określenie aktywności CDC

Do każdej studzienki 96-studzienkowej mikropłytki o studzienkach z płaskim dnem, przygotowanej jak w punkcie 3, dodaje się 10 μΐ Alamar Bule (BIO SOURCE) i inkubuje się przez 4 godziny w temperaturze 37°C, w atmosferze CO2, w inkubatorze o wysokiej wilgotności (wytwórca TUBAI). Następnie mierzy się intensywność fluorescencji każdej studzienki, przy użyciu aparatu pomiarowego Cytoflour 2350 (MILLIPORE), przy długości fali wzbudzenia 530 nm i długości fali emisji 590 nm. Aktywność cytotoksyczną (%) oblicza się ze wzoru (A-C)/(B-C) x 100, w którym A oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych

190 065 w obecności przeciwciała, B oznacza intensywność fluorescencji próbek inkubowanych w podłożu bez przeciwciała, C oznacza intensywność fluorescencji próbek niezawierających komórek.

Wyniki przedstawione na figurze 24 i 25 potwierdziły, że komórki linii k562, które nie reagowały z przeciwciałem przeciw antygenowi HM 1.24 w czasie pomiaru metodą FCM, nie giną/nawet gdy dodaje się przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, podczas gdy komórki linii CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MCI 16 i CCRF-SB, które reagowały z przeciwciałem przeciw antygenowi HM 1.24, giną w sposób zależny od stężenia przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24. Potwierdza to, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 wykazuje działanie cytotoksyczne CDC w stosunku do komórek nowotworów układu chłonnego, na których powierzchni obecny jest białko antygenowe HM1.24, z którym specyficznie wiąże się przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24.

Przykład 4.

Przeciwnowotworowe działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 na zwierzęta z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego

1. Przygotowanie przeciwciała

1-1. Przygotowanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24

W następujących doświadczeniach używa się oczyszczonego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 wytworzonego według przykładu 1 rozcieńczonego do stężenia 1 mg/ml i 200 pg/ml wysterylizowanym przez filtrację PBS(-).

1- 2. Przygotowanie kontrolnego mysiego przeciwciała I-gG2a

W następujących doświadczeniach używa się oczyszczonego przeciwciała wytworzonego według przykładu 2, rozcieńczonego do stężenia 1 mg/ml, wysterylizowanym przez filtrację PBS(-).

2. Przeciwnowotworowe działanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, na zwierzęta z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego.

2- 1. Przygotowanie myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego

Myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego przygotowuje się następująco. Komórki CCRF-HSB-2 (ATCC CCL-120.1) pochodzące od pacjenta z ostrą białaczką limfoblastyczną, które były hodowane in vivo w myszach SCID (CLEA Japonia), zawiesza się w gęstości 1 x 10⁸ komórek/ml w podłożu RPMI 1640, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL). Taką zawiesinę komórkową wstrzykuje się podskórnię do jamy brzusznej myszom SCID (samce, w wieku 6 tygodni), którym poprzedniego dnia podano przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 pl anti-asialo GM1 (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.).

2-2. Podanie przeciwciała dnia po przeszczepieniu komórek nowotworowych za pomocą zacisków, mierzy się średnicę nowotworu w miejscu w którym myszy były nastrzyknięte komórkami CCRF-HSB-2. Po obliczeniu objętości nowotworu, zwierzęta dzieli się tak, żeby średnia objętość w każde grupie była prawie jednakowa, tzn. na 3 grupy po 8 zwierząt. Tego samego dnia poszczególnym grapom podaje się przez wstrzyknięcie dootrzewnowe 100 pl roztworu, 1 mg/ml przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, 100 pl roztworu 200 pg mg/ml przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 lub 100 pl roztworu 1 mg/ml kontrolnego mysiego przeciwciała IgG2a. Podawanie prowadzi się dwa razy w tygodniu, w sumie 19 razy. W tym czasie dwa razy w tygodniu za pomocą zacisków mierzy się średnicę nowotworu i oblicza objętość nowotworu.

2-3. Określenie przeciw-nowotwwrowego działania przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego

Działanie przeciwnowotworowe przeciwciała przeciw antygenowi hm 1.24 na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego określa się na podstawie zmian objętości nowotworu oraz zmian czasu przeżycia myszy. Jak pokazano na figurze 26 podawanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, powoduje zahamowanie wzrostu objętości nowotworu w grupie zwierząt, którym podawano przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, w porównaniu do grupy zwierząt, którym podawano kontrolne mysie przeciwciało I-gG2a. Jak pokazano na figurze 27 podawanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 powoduje większe wydłużenie czasu przeżycia w grupie zwierząt, którym podawano przeciwciało

190 065 przeciw antygenowi HM1.24, w porównaniu do grupy zwierząt, którym podawano kontrolne mysie przeciwciało IgG2a. Wyniki te świadczą, że.przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 ma przeciwnowotworowe działanie na zwierzęta z przeszczepionym komórkami ludzkiego nowotworu układu chłonnego.

Przykład odniesienia 1.

Otrzymanie komórek hybrydowych wytwarzających mysie przeciwciało monoklonalne przeciw antygenowi HM 1.24

Komórki hybrydowe wytwarzające mysie przeciwciało monoklonalne przeciw antygenowi HM1.24 otrzymuje się według metody opisanej przez Goto, T. 1 wsp., Blood (1994)84, 1922-1930).

Linię komórek krwi KPC-32 (1 x 10⁷) pochodząca ze szpiku pacjenta ze szpiczakiem mnogim (Goto, T. I wsp., Jpn. J. Glin. Hematol. (1991) 32, 1400) wstrzykuje się dwukrotnie w odstępie sześciu tygodni do jamy brzusznej myszy BALB/c (Charles River).

Trzy dni przed zabiciem zwierzęcia 1,5 X 10⁶ komórek KPC-32 wstrzykuje się do śledziony myszy w celu dodatkowego zwiększenia zdolności myszy do wytwarzania przeciwciał (Goto, T. I wsp., Tokushima, J. Exp. Med. (1990) 37, 89). Po zabiciu myszy wycina się śledzionę i jej komórki poddaję fuzji z komórkami szpiczaka SP2/0 według metody Groth, de St. & Schreidegger (Cancer Research (1981) 41, 3465).

Nadsącz z hodowli komórek hybrydowych bada się na obecność przeciwciał przy użyciu komórek KPC-32 i metody Celi ELISA (Posner, M.R. i wsp., J. Immunol. Methods (1982) 48,23). 5 X 10⁴ komórek KPC-32 zawiesza się w 50 ml PBS i rozpipetowuje do studzienek 96-studzienkowej mikropłytki (o dnie w kształcie litery U, Corning, Iwaki) i pozwala wyschnąć na powietrzu przez noc. Po zablokowaniu buforem PBS zawierającym 1% albuminy surowicy bydlęcej (BSA), do studzienek dodaje się nadsączu z hodowli komórek hybrydowych i inkubuje przez 2 godziny w temperaturze 4°C. Następnie do studzienek dodaje się przeciwciała kozy przeciw mysiemu I-gG, sprzęgniętego z peroksydaza korzenia chrzanu (wytwórca Zymed) i pozostawia na 1 godzinę w temperaturze 4°C. Po przemyciu, do studzienek dodaje się roztworu ofenylenodwuaminy (wytwórca Sumimoto Bakelite) i pozostawia na 30 minut w temperaturze pokojowej.

Rcakcję hamuje się dodając 2 N kwas siarkowy i mierzy się absorbancję przy długości fali 492 nm, za pomocą czytnika ELISA (Bio-Rad). W celu usunięcia komórek hybrydowych, które wytwarzają przeciwciała przeciw ludzkim immunoglobułinom, nadsącz z hodowli wytwarzających pożądane przeciwciało, które były wcześniej Zaadsorbowane na albuminie surowicy ludzkiej, bada się metodą ELISA pod kątem reaktywności wobec innych ludzkich komórek. Komórki hybrydowe dające pozytywny wynik izoluje się i bada się ich reaktywność wobec różnych komórek metodą cytometrii przepływowej. W celu otrzymania wysięku, najlepszy wybrany klon komórek hybrydowych klonuje się dwa razy i wstrzykuje do jamy brzusznej myszy BALB/c, wcześniej traktowanych pristanem.

Monoklonalne przeciwciało oczyszcza się z wysięku z myszy metoda wytrącania siarczanem amonu i zestawem do chromatografii powinowactwa Protein A (Ampure PA, Amersham). Oczyszczone przeciwciało znakuje się FITC, za pomocą zestawu do znakowania Quick Tag FITC (Boehringer Mannheim).

W wyniku takiej procedury otrzymano monoklonalne przeciwciała reagujące z komórkami KPC-32 i RPMI 8226, wytwarzane przez 30 klonów komórek hybrydowych. Zbadano także reaktywność nadsączu z hodowli tych komórek z innymi liniami komórkowymi i z jednojądrzastymi komórkami krwi obwodowej.

Z otrzymanych klonów 3 klony wytwarzały monoklonalne przeciwciała, które specyfi

Ω7ΓΗΡ ΓΑΟΓΤ/ΛΛΙΓΟ · ' ·Ίν z 1/nm At*Vom i f\1 o-ζτν»\z 7 t » nvuivxx\xuux ρχςχί^χχχ j . Z-/

V......

νχχ ιιζ,νοπ ινιυηννν,

YjuiUilU Λ,ΐυΐΐ Ι\νΐ1ΐυΐνΛ Iljuij dowych, który był najbardziej użyteczny do analizy metodą cytometrii przepływowej i wykazywał aktywność CDC w stosunku do komórek RPMI 8226 i oznaczono go Hm 1.24. Podklasę przeciwciał wytwarzanych przez te komórki hybrydowe oznaczono za pomocą testu ELISA, wykorzystując przeciwciała królika przeciw myszom, specyficznie reagujące z poszczególnymi podklasami przeciwciał mysich (wytwórca Zymed). Przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 należy do podklasy IgG2a k. Komórki hybrydowe HM1.24 wytwarzające przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, złożono zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu

190 065

Budapeszteńskiego jako FERM BP-5233 14 września 1995 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia.

Przykład odniesienia 2. .

Wytwarzanie przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego

Przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 o cechach przeciwciała ludzkiego wytwarza się następująco.

Z linii komórek hybrydowych wytworzonych w przykładzie odniesienia 1 tradycyjnymi metodami, izoluje się całkowity RNA. Z tego RNA syntetyzuje się i amplifikuje cDNA regionu V przeciwciała metoda reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) i metodą 5'-RACE.

Otrzymuje się fragment cDNA zawierający gen kodujący region V przeciwciała myszy, który wstawia się do plazmidu pUC i wprowadza do kompetentnych komórek bakterii E. coli w celu otrzymania tranformantów. Z tych transformantów otrzymuje się wprowadzony plazmid. Sekwencję nukleotydową zawartego w wektorze cDNA kodującego region, potwierdza się znanymi metodami. Określa się także sekwencję regionu określającego komplementamość (CDR) dla każdego regionu V.

W celu otrzymania wektora ekspresyjnego zawierającego chimerowe przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, cDNA kodujący region V łańcucha L i łańcucha H mysiego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, wstawia się w wektor HEF. W celu otrzymania wektora ekspresyjnego zawierającego chimerowe przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała CDR regionu V mysiego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, wstawia się w wektor przeciwciało ludzkie, metodą przeszczepiania regionów CDR. Jako łańcuch L ludzkiego przeciwciała wykorzystuje się łańcuch L ludzkiego przeciwciała REI, jako regionów szkieletowych (FR) 1 do 3 łańcucha H ludzkiego przeciwciała używa się FR 1 do 3 ludzkiego przeciwciała HG3, a jako regionu szkieletowego 4 używa się FR4 ludzkiego przeciwciała JH6. Niektóre aminokwasy FR łańcucha H regionu V przeciwciała zamienia się tak, zęby przeciwciało zawierające przeszczepiony CDR mogło utworzyć odpowiednie miejsce wiązania antygenu.

W celu uzyskania ekspresji genów kodujących łańcuch L lub łańcuch H wytworzonego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała każdy z genów wprowadza się osobno do wektora HEF i otrzymuje się wektora zawierający łańcuch L lub łańcuch H wytworzonego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała.

Wprowadzając oba te wektory ekspresyjne jednocześnie do komórek CHO otrzymuje się linię komórkową, wytwarzającą przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała. Metodą Celi ELISA określa się zdolność wiązania się przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała, otrzymanego przez hodowanie linii komórek CHO, z antygenem i jego aktywność hamowania wiązania wobec ludzkiej owodniowej linii WISH. Wyniki wskazują, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 o cechach ludzkiego przeciwciała ma zdolność wiązania z antygenem, równą ze zdolnością wiązania chimerowego przeciwciała. Przeciwciało to ma także taką samą jak chimerowe lub mysie przeciwciało aktywność hamowania wiązania z antygenem, co zbadano przy użyciu biotynylowanego mysiego przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24.

Bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący łańcuch L regionu V lub łańcuch H regionu V chimerowego przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L-gył) i Escherichia coli Di 15« (pUC19-1.24H-gK), 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako odpowiednio FERM BP-5646 i FERM BP-5644.

Bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący wersję a (SEQ ID NO: 2) łańcucha L regionu V i kodujący wersję r (SEQ ID NO: 3) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5<a (pUC19-RVLa-AHM-gK) i Escherichia coli DH5ct (pUC19-RVHr-AH.\4-g-/l) 29 sierpnia 1996

190 065 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako, odpowiednio

FERM BP-5645 i FERM BP-5643.

Ponadto, bakterie E. coli niosące plazmid zawierający DNA kodujący kodujący wersję s_ (SEQ ID NO: 4) łańcucha H, regionu V przeciwciała przeciw antygenowi HM1.24, o cechach przeciwciała ludzkiego zostały złożone zgodnie z postanowieniami międzynarodowego Traktatu Budapesztańskiego jako Escherichia coli DH5ta. (pUC19-RVHs-AHM-gy1) 29 sierpnia 1996 roku w National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba city, Ibaraki pref., Japonia jako FERM BP-6127.

Przykład odniesienia 3.

Klonowanie cDNA kodującego białko antygenowe HM1.24 cDNA kodujące białko antygenowe HM 1.24 specyficznie rozpoznawane przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 klonuje się następująco.

1. Konstruowanie biblioteki cDNA.

2) Otrzymanie całkowitego RNA.

Całkowity RNA otrzymuje się z komórek ludzkiego szpiczaka mnogiego linii KPMM2 według metody opisanej przez Chirgwin i wsp., (Biochemistry, 18, 5294 (1979)). 2,2 x 10^skomórek linii KPMM2 homogenizuje się całkowicie w 20 ml 4 M roztworu tiocyjanianu guanidyny (Nacalai Tesque Inc.). Homogenat nakłada się na 5,3 M roztwór chlorku cezowego, umieszczony w probówce wirowniczej i wiruje w roztworze Beckman SW40 przy szybkości 31000 obrotów/minutę w temperaturze 20°C przez 24 godziny w celu wytrącenia RNA. Wytrącony RNA przemywa się 70% roztworem alkoholu etylowego i rozpuszcza w 300 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4) zawierającym 1 mM EDTA i 0,5% SDS. Do roztworu RNA dodaje się Pronase (Boehringer) do stężenia 0,5 mg/ml i inkubuje się w temperaturze 37°C przez 30 minut. Mieszaninę ekstrahuje się fenolem i chloroformem i wytrąca się RNA etanolem. Wytrącony RNA rozpuszcza się w 200 μΐ 10 mM Tris-HCl (pH 7,4), zawierającym 1 mM EDTA.

2) Otrzymanie poly(A)+RNA poly(A)+RNA oczyszcza się z 500 μg całkowitego RNA otrzymanego tak jak opisano powyżej. Do oczyszczania używa się zestawu do izolacji mRNA Fast Track 2.0 (Invitrogen) stosując się do zaleceń producenta.

3) Konstrukcja biblioteki cDNA

Dwuniciowy cDNA syntetyzuje się z 10 jag poly(A)+RNA, otrzymanego tak jak opisano powyżej używając zestawu do syntezy cDNA TimeSaver cDNA Synthesis Kit (Pharmacia) stosując się do zaleceń producenta. Otrzymany cDNA łączy się z adapterem EcoRI dostarczonym wraz z zestawem, za pomocą Directional Cloning Toolbox (Pharmacia), stosując się do zaleceń producenta. Reakcję kinazy i trawienie enzymem restrykcyjnym Notl adaptera EcoRI, prowadzi się i wstawia się według zaleceń producenta. Dwuniciowy cDNA z dodanymi adaptorami ma wielkość około 500 par zasad lub więcej i rozdziela się go i oczyszcza metodą elektroforezy w 1,5% żelu z agarozy o niskim punkcie żelowania (Sigma). Tą metodą otrzymuje się około 40 μΐ dwuniciowego cDNA z dodanymi adaptorami.

W celu otrzymania biblioteki cDNA tak otrzymany dwuniciowy cDNA z dodanymi adapterami, wstawia się w wektor pCOSl (Japońskie zgłoszenie patentowe 8-155196) uprzednio przecięty przez trawienie enzymem restrykcyjnym Notl i EcoRI i traktowany fosfatazą alkaliczną (Takara Shuzo). Do wstawiania wykorzystuje się reakcję ligazy faga T4 (GIBCO-BRL). Otrzymaną bibliotekę cDNA transdukuje się do bakterii E. coli, szczep DH5a (GIBCO-BRL). Jej wielkość całkowita wynosi około 2,5 x 10⁶.

1. Klonowanie metodą ekspresji bezpośredniej

2) Transfekcja do komórek COS-7

W celu namnożenia cDNA w podłożu 2-YT (Molecular Cloning: A Laboratory Manual,

Sambrook i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)) zawierającym 50 gg/ml ampicyliny hoduje się około 5 x 10⁵ klonów bakterii E. coli transdukowanych tak jak opisano powyżej.

W celu uzyskania cDNA z bakterii E. coli, klony te poddaje się lizie alkalicznej (Molecular

Cloning: A Laboratory Manual, Sambrook i wsp., Cold Spring Harbor Laboratory Press

190 065 (1989)). Tak otrzymany plazmidowy DNA transfekuje się do komórek COS-7 metodą elektroporacji przy użyciu aparatu Gene Pulser (Bio-Rad).

Komórki COS-7 zawiesza się w PBS do gęstości 1 x 10⁷ komórek/ml. Do 0,8 ml zawiesiny dodaje się 10 pg oczyszczonego plazmidowego DNA i mieszaninę poddaje się pulsom prądu o napięciu 1500 V i pojemności 25 pFD. Po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej elektroporowane komórki hoduje się w podłożu DMEM, zawierającym 10% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL) przez 3 dni w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2.

1) Przygotowanie opłaszczonych szalek Szalki opłaszczone mysim przeciwciałem przeciw antygenowi HM1.24 przygotowuje się według metody opisanej przez (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 3365-3369 (1987)). Mysie przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24 rozcieńcza się 50 mM Tris-HCl (pH 9,5) do stężenia 10 pg/ml. 3 ml tak otrzymanego roztworu przeciwciała nanosi się na szalkę do hodowli komórkowych o średnicy 60 mm i inkubuje w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Szalkę przemywa się trzy razy 0,15 M roztworem NaCl i blokuje się PBS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej (Gibco-BRL), 1 mM EDTA i 0,02% NaN. Po zablokowaniu szalek używa się ich do klonowania.

3) Klonowanie biblioteki cDNA.

Komórki COS-7 transfekuje się tak jak opisano powyżej i przemywa PBS zawierającym 5 mM EDTA. Po przemyciu komórek drugi raz PBS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej, zawiesza się je w PBS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej i 0,02% NaN3 do gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml. Zawiesinę dodaje się do szalek przygotowanych w sposób opisany powyżej i inkubuje w temperaturze pokojowej prze 2 godziny. Po delikatnym przemyciu trzy razy PBS zawierającym 5% płodowej surowicy bydlęcej i 0,02% NaN3, plazmidowy DNA odzyskuje się z komórek związanych z szalką, za pomocą roztworu zawierającego 0,6% SDS i 10 mM EDTA.

Odzyskany plazmidowy DNA trandukuje się do komórek E. coli DH5a. Po namnożeniu sposobem opisanym powyżej, plazmidowy DNA otrzymuje się metodą lizy alkalicznej. Otrzymanym plazmidowym DNA transfekuje się komórki COS-7 metodą elektroporacji i plazmidowy DNA odzyskuje się z komórek związanych z szalką tak jak opisano poprzednio. Całą procedurę powtarza się jeszcze raz a otrzymany plazmid trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Notl, żeby potwierdzić wielkość insertu, która powinna wynosić około 0,9 kilopar zasad. Komórki E. coli, które zawierają wyizolowany plazmidowy DNA wysiewa się na szalki z podłożem 2-YT zawierającym 50 pg/ml ampicyliny. Po całonocnej inkubacji plazmidowy DNA izoluje się z pojedynczej kolonii. Plazmid trawi się enzymami restrykcyjnymi EcoRI i Nott, i otrzymuje się klon p3.19 insert o wielkości około 0,9 Łkiopar zasad. Klon ten poddaje się reakcji przy użyciu PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing Kit (Perkin Elmer) stosując się do zaleceń wytwórcy i jego sekwencję nukleotydową określa się przy użyciu ABI 373A DNA Sequencer (Perkin Elmer). Ta sekwencja nukleotydową odpowiada sekwencji aminokwasowej pokazanej na SEQ ID NO: 1.

Zastosowanie przemysłowe

Wyniki analizy metodą FCM wykazały, że przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, silnie reaguje z większością linii komórkowych, pochodzących z ludzkich nowotworów układu chłonnego, co świadczy o tym, że w wielu liniach komórkowych, pochodzących z ludzkich nowotworów układu chłonnego, polipeptyd mający sekwencje rozpoznawaną przez przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24, ulega silnej ekspresji. Ponadto, myszy z przeszczepionymi komórkami ludzkich nowotworów układu chłonnego, silnie reagują na przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24, w taki sposób, że podanie przeciwciała przeciw antygenowi HM 1.24, powoduje zahamowanie wzrostu objętości nowotworu i wydłuża czas przeżycia takich myszy. Wyniki te świadczą, że przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24 lub przeciwciała wiążące się z polipeptydem o epitopie rozpoznawanym przez przeciwciało przeciw antygenowi HM1.24, mają działanie cytotoksyczne w stosunku do wielu linii komórkowych pochodzących z ludzkich nowotworów układu chłonnego. Przeciwciała takie mogą być użyteczne do leczenia pacjentów chorych na nowotwory układu chłonnego.

Odniesienia do mikroorganizmów złożonych zgodnie z ustaleniami Traktatu o Współpracy Patentowej, postanowienie 13-2, i nazwa instytucji w której złożono mikroorganizmy.

190 065

Instytucja, w której złożono mikroorganizmy

Nazwa: National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology

Adres: 1-3 Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki pref., Japonia

Mikroorganizm (1):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pRS38-pUC19) Numer dostępu: FERM BP-4434 Data złożenia: 5 października 1993

Mikroorganizm (2):

Nazwa: linia komórek hybrydowych HM1.24 Numer dostępu: FERM BP-5233 Data złożenia: 14 września 1995

Mikroorganizm (3):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHr-AHM-gy1) Numer dostępu: FERM BP-5643 Data złożenia: 29 sierpnia 1996

Mikroorganizm (4):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24H-gy1) Numer dostępu: FERM BP-5644 Data złożenia: 29 sierpnia 1996

Mikroorganizm (5):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVLa-AEMI-gK) Numer dostępu: FERM BP-5645 Data złożenia: 29 sierpnia 1996

Mikroorganizm (6):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pUC19-1.24L- gK) Numer dostępu: FERM BP-5646 Data złożenia: 29 sierpnia 1996

Mikroorganizm (7):

Nazwa: Escherichia coli DH5a (pUC19-RVHs-AHM- gyl) Numer dostępu: FERM BP-6127 Data złożenia: 29 września 1997

190 065

Wykaz sekwencji

SEQ ID NO: 1

Długość sekwencji: 1013

Typ sekwencji: Kwas nukleinowy Liczba łańcuchów: Jeden

Topologia: Liniowy

Typ cząsteczki: cDNA

GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG Met 1

GCA TCT ACT TCG TAT

GAC Asp

TAT Tyr

TGC Cys

49

Ala

Ser

Thr

Ser 5

Tyr

AGA

GTG

ccc

ATG

GAA

GAC

GGG

GAT

AAG

CGC

TGT

AAG

CTT

CTG

GGG

97

Arg

Val

Pro

Met

Glu

Asp

Gly

Asp

Lys

Arg

Cys

Lys

Leu

Gly

10

15

20

25

ATA

GGA

ATT

CTG

GTG

CTC

CTG

ATC

GTG

ATT

CTG

GGG

GTG

CCC

TTG

145

Ile

Gly

He

Leu

Val

Leu

Ile

Val

Ile

Leu

Gly

Val

Pro

Leu

30

35

40

ATT

ATC

TTC

ACC

ATC

AAG

GCC

AAC

AGC

GAG

GCC

TGC

CGG

GAC

GGC

CTT

193

Ile

Phe

Thr

Ile

Lys

Ala

Asn

Ser

Glu

Ala

Cys

Arg

Asp

Gly

Leu

45

50

55

CGG

GCA

GTG

ATG

GAG

TGT

CGC

AAT

GTC

ACC

CAT

CTC

CTG

CAA

GAG

241

Arg

Ala

Val

Met

Glu

Cys

Arg

Asn

Val

Thr

His

Leu

Gln

Glu

60

65

70

CTG

ACC

GAG

GCC

CAG

AAG

GGC

TTT

CAG

GAT

GTG

GAG

GCC

CAG

GCC

Leu

Thr

Glu

Ala

Gln

Lys

Gly

Phe

Gln

Asp

Val

Glu

Ala

Gln

Ala

75

80

85

ACC

TGC

AAC

CAC

ACT

GTG

ATG

GCC

CTA

ATG

GCT

TCC

CTG

GAT

GCA

GAG

337

Th r. 4. 114.

r·,

A ~ ~ j 11

u·; « 11 j. j

Thr-

v O-L

\t.~. Me G·

a a n j. α

Leu

Met

A l — Λ,χα

Ser- OC1

Lsu

Asp

A Λ — Λχα.

Glu

100

105

190 065

AAG GCC	CAA	GGA CJA.	AAG	AAA GGT	GAA	GGA	GTT GAG GGA GGA ATC ACT	385
Lys Ala	Gin	Gly Gln	Lys	Lys Val	GAu	GAu	Geu Glu GAu GAu Ile Thr
		110				115	120
ACA TTA	AAC	CAT	CCT	CAG GAC	GCG	TCT	GCA GAG GGG GGA CGA CTG	433
Thr Leu	Asn	His Lys	Leu	Gin AAp	Ala	Ser·	AAa Glu Val GAu Arg Leu
		125			130		135
AGA AGA	GGA	GAC CAG	GTC	TTA AGC	GTG	AGA	ATC GCG GAA AAG AAG TAC	481
Arg Arg	GAu	Asn Gln	Val	Leu Ser	Val	Arq	Ile Ala Asp Lls Lys Tyr
	140			145			150
TAC CCC	AAC	TCC CAG	GAC	TCC AGC	TCC	GCT	GCG GCG CCC CAG CTG CTG	52 9
Tyr Pro	Ser	Ser Gin	Asp	Ser Ser	Ser	Ala	Ala Ala Pro Gln Leu Leu
155				160			165
ATT GTG	CTG	CTG ggC	CTC	AGC GCT	rmr CTG	CTG	CAG TGA GCTCTTCGGC 575
Ile Val	LeU	Leu Gly	Leu	Ser Ala	Leu	Leu	Gin ***

170 175 180

AGTGGGTATC	GTTTGGAAGG	T^A^CTAC		GCTGGACCCG	TCCCTTGCGT	635
TCAT^A^C	GGAGTGGGGC	AGGGGGTACT	CTGGTGCGTG	GGGCGCGTAC	GGGGGCGTCG	695
GCGACGGGCC	GCGGGCGTAG	GGCGGGCGGG	GCCCTGGGGT	CGTTTGGGGT	GTGGGGACAC	755
AGTCGGATTG	CCTTCGGGCG	GGCGTCTGTT	AGCGTTGTTC	GTTGGCTACG	GAG^CC^C	815
TCGGGGTGCT	TATCCTGCGA	GTGGGCCGGG	GGTGCGGGGG	GGAGAGCATG	GGCGGCCGGG	875
GGGGCGGGGG	T^TT^ACA	GGAGAGATTG	TGGTGTGTTG	GGGTTGGGGC	GTTTCAACAC	935
AAGCAATCTG	GTCGGTGCGG	GCGAGTCTCC	TGTCCCACAC	CACCCAACCA	AACAAAAAAC	995

AAAATTCGGG CGGCCGCC 1013

SEQ ID NO: 2

Długość sekwencji: 379

Typ sekwencji: Kwas nukleinowy

Topologia: Liniowy

Typ cząsteczki: cDNA NA

190 065

Sekwencj a

CAG

GGA

TGG

AGC

AGA

ATC

AAT

GAG

AGC

GAG

yτa

GCC

CCA

TGT

AGC

C^(3T

48

Met

Gly

Trp

Ser

Cys

Ile

IIl

Leu

Ser

Leu

Val

Ala

Thr

Ala

Ahr

Gly

-15

-0

-5

GTC

CAC

TCT

GGC

ACA

CAG

ATG

ACC

CAG

AGC

CCA

AGC

ACG

ACA

AGC

GGC

A6

Val

His

SeS

AAp

m

Gin

Met

TiT

Gin

Ser

Pito

Ser

SSr

0Le

Ser

ACa

-1

1

5

10

AGC

GTG

GGT

GAC

AGA

yGy

ACC

AAT

ACG

TGT

0AAG

GCT

ACT

AGC

GAT

GGT

A14

Ser

Val

Gly

iAp

AAr

Val

Thr

IIl

Thr

Cys

Lys

Ala

SSe

AGi

Asp

Val

15

20

25

AAT

ACT

GCG

GGA

AGC

Gyy

TAC

CAA

GAG

AAG

CCA

GGA

ACC

AGG

CCA

ACC

A19

Asn

Thr

Ala

Vvl

ACa

Trp

Tyr

Gin

Lys

Pro

Gly

Lyy

ACa

Pro

Lli

30

35

40

45

CTG

ATC

TAC

TCG

GCC

TCC

TAC

CGG

TAC

ACT

GGT

GGG

CCA

AGC

ACG

A20

Leu

Ile

^i

SSr

Ala

Ser

Asn

Arg

Tyr

Thr

Gly

vva

Por

Ser

aaa

50

5 0

60

TTC

AGC

GGT

AAG

GGT

AGC

GGT

ACC

GAG

TTC

ACC

TTC

ACG

ACT

AGG

ACC

A28

Phe

Ser

Gly

SSr

Gly

Ser

Gly

Thr·

Asp

Phe

Thr

Phe

TAh

IIl

Ser

SSe

65

70

75

CTC

CAG

CCA

GAG

GAC

CAC

GCT

ACC

TAG

TAC

TGC

GCG

cgcc

AAT

ACG

AC^T

336

Leu

Gin

Pro

G lu

Asp

Ile

Ala

Thr·

Tyr

Cys

Gin

GGn

Kii

Gyr

SSe

60

6S

90

ACT

CCA

TTC

ACG

TTC

GGC

CGCC

G^G^G

ACC

AAG

GTG

GACO

ATC

aacA

Γ¹

37A

Thr

Pro

Phe

Thr

Phe

Gly

Gin

Gly

Thr

Lso

Va0

Glo

ieo

Lss

100

105

190 065

SEQ ID NO: 3

Długość sekwencji: 418

Typ sekwencji: Kwas nukleinowy Topologia: Liniowy Typ cząsteczki: cDNA Sekwencja

ATG

GAC

TGG

ACC

TGG

AAG

GTT

GTC

TTC

TTG

CTG

GCT

CTA

GCT

CCA

HT

48

Met

Asp

Trp

TTr

Trp

AAr

Val

Ghe

Phe

Leu

Ala

Val

Ala

Pro

Gly

-15

-10

-5

GCT

CAC

TCC

CAG

GTG

CAA

GCT

GGT

Cd

TCT

GGG

GCT

Gd

CTG

AAG

96

Ala

His

Ser

Gln

Val

Gin

Glu

Gal

Gln

Ser

Gly

Ala

Glu

Val

Lys

-1

1

5

10

CCT

GGG

GCC

TCA

GTG

AAA

GGT

GTC

TGC

Ad

GCA

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

144

Pro

Gly

Ala

Ser

Val

Lyr

Gal

Gee

Cys

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phe

15

20

25

ACT

CCC

TAC

TGG

ATG

CAA

GTG

GGT

CGA

CAG

GCC

CCT

GGA

CAA

GGG

CTT

192

Thr

Pro

Tyr

Trp

Met

dl

GTp

Gal

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

30

35

40

45

GAG

TGG

ATG

GGA

TCT

AAT

GTT

GCC

GGA

GAT

GOT

GAT

ACT

AGG

TAC

AGT

240

Glu

Trp

Met:

Gly

Ser

111

Phh

Grr

Gly

Asp

Gly

Asp

Thr

Arg

Tyr

Ser

50

55

(30

CAG

AAG

TTC

AAG

GGC

AGA

GTC

ACC

ATG

ACC

GCA

GAC

AAG

TCC

ACG

; AGC

288

Gln

Lys

Phe

Lys

Gly

Arg

Val

TTr

Met

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser

Thr

Ser

65

70

75

ACA

GCC

TAC

GAG

CTG

AGC

CTG

AGA

TCT

GAG

GAC

ACG

GCC

GTG

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Leu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

30

TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384

190 065

Tyr Tyr 95	Cys	Ala Arg	Aly	Leu Arg Arg Aly Aly Tyr Tyr Pha Asp Tyr
108	105
TAG	TAG	CAA	AAA	ACC	ACA	ATC	ACC	ATC	TCC	TCA	A
Trp	Gly	Gln	Gly	Thr	Thr	Val	Thr	Val	Ser	Ser
110					118					120

SEQ ID NO: 4

Długość sekwencji: 418

Typ sekwencji: Kwas nukleinowy

Topologia: Liniowy

Typ cząsteczki: cDNA

Sekwencj a

ATA

TAC

TGA

CAC

ΤΠ

CAA

GTC

TTC

TTT

TTG

CTG

ACT

GTA

GCT

CCA

GAA

C8

Met

Asp

Trp

CTh

Ctp

Cap

Val

Phe

Phh

Leu

Ala

Val

Ala

Ppo

Gly

-15

-10

-5

ACT

CAC

TTC

CCA

gtt;

CCA

CGG

GTG

CCA

TCT

GGG

ACT

GAG

GTG

AAAG

GAG

96

Ala

His

Ssr

CAl

Vv1

CAn

Leu

Val

Gln

Ser

Aly

Ala

Glu

Val

Lys

Lls

-1

1

5

10

CCT

AAA

GAC

TCA

GAT

AAT

ATT

TCC

TGC

AAT

GCA

TCT

GGA

TAC

ACC

TTC

144

Pro

Aly

AAa

Sse

Val

Lys

Val

Ser

Ccs

Lys

Ala

Ser

Gly

Tyr

Thr

Phh

15

0 0

25

ACT

CCC

TTA

CGG

ATG

CAG

TAG

GTG

CGA

CAA

ACC

CCT

GGA

CAA

(AAA

CTT

192

Thr

Pro

TTr

Crp

Met

Gil

Trp

Val

Arg

Gln

Ala

Pro

Gly

Gln

Gly

Leu

30

5C

44

45

TAA

AAT

GGA

TCT

ATT

GGG

CCT

GGA

AAT

ATT

GAT

ACT

AAG

TAC

AGT

240

Alu

Trp

Met

Gly

Ssr

Ile

Phe

Pro

Gly

Asp

Aly

Asp

Thr

Arg

Typ

Ser

50

55

60

CAG AAG TTC AAG GGC AGA CTT ACC ATT ACC CCA GAC AAG TCC ACG AGC 288

190 065

Gin

Lys

Phe

Lys 65

Gly

Arg

Val

Thr

Ile 70

Thr

Ala

Asp

Lys

Ser 75

Thr

Ser

ACA

GCC

TAT

ATT

GAT

CCT

AGC

CTG

AGA

TCT

GAG

GAC

ACG

gcc

GTG

336

Thr

Ala

Tyr

Met

Glu

Llu

Ser

Leu

Arg

Ser

Glu

Asp

Thr

Ala

Val

80

85

90

TAT

TAC

TGT

AGA

GGA

TTA

CGA

GGG

TAC

TTT

GAC

TAC

38 4

Tyr

Cys

Ala

Arg

Gly

Leu

Arg

Gly

Tyr

Phe

Asp

Tyr

95

100

105

TGG

GGG

CGCA

GGG

ACC

ACG

GTC

ACC

GTC

TCC

TCA

G 418

Trp

Gly

Gin

Gly

Thr

Val

Thr

Val

Ser

110

115

120

J90 065

Fig.2

Fig.3

MC116 l_l ra o

ω

O

CN

U tsj

O

H iJ

N .✓ΛΑ ίο* κτ ίο ίο UPC10 GAM-FITC

190 065

Fig.4

Fig.5 l“l in -r

FL1-H

190 065

Fig.6 <

Η

Z

W

N

O

H

10' UPC10 GAM-F1TC

190 065

Fig.7

190 065

Fig.9

Fig.10

O o \r ;

o CM HO ’

RPMI 8402 l_l

N- H CM o

MO u

H

CC

CD F i·:.

&

.χχΝχκχχΐΐ.'·:

ci&SSf&i&SŁ

10- 10¹ 1O^Z

FL1 -H 'Δ.

10^Q

190 065

F ig.11

Fig.12

T-3

ZLICZENIA

HPB-ALL ίο

FL1-H ϊ'ο³

10⁴

190 065

Fig. 13 i-J l_l in o

o

I I (Ό

O o

CN

O

II o

o ra o

co xr

O ra to o

CN

O

CN o -+· i

Pi < >’

HPB-MLT

XJOU? χΧχχ sy-Λί ió¹

.....'7

1O^ZFL1 -H

Ίο³ i r> I 'J

Fig.14

T-5

, _rrt rs. .s. λ ’N ........i _n · * · · ’ · l

0

FL1-H

JM 'z

10^ó ·····,.

kp ,-.1

190 065

Fig.15

Fig.16

FL1-H

190 065

Fig.17

O

O -i

FL1-H

Fig.18

FL1-H

190 065

Fig.19

Fig.20

N-1

190 065

Fig.21

N-2

Fig.22

N-3

O in -i-

FL1-H

190 065

Fig.23

O in

FL1-H

Fig, 24 aktywność cytotoksyczną (%)

—O— CCRF-CEM —&— CCRF-HSB —O— HPB-MLT —0-— K-562 stQżenie przeciwciała ANTY-HMl.24 (pg/ml)

190 065

Fig. 25

—□— EB-3

-~£r-~ MC116

---O--— CCRF-SB —0— K-562 stężenie przeciwciała ANTY-HM1«24 <jig/ral)

Fig.26

-□- przeciwciało ANTY-HM1.24 lOOpg

---Δ przeciwciało ANTY-HMl.24 20pg — ~O---myaie przeciwciało kontrolne IgG2a dni po przeszczepieniu komórek

190 065

100

Fig.27 £ 50 —przeciwciało ANTY-HMl,24 100pg przeciwciało ANTY-HM1.24 20 pg mysie przeciwciało kontrolne IgG2 dni po przeszczepieniu komórek

Fig.1

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 50 egz. Cena 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Środek terapeutyczny do leczenia nowotworów układu chłonnego (wyłączając szpiczaki), który zawiera jako substancję aktywna przeciwciało specyficznie wiążące się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i posiadające działanie cytotoksyczne.
2. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów T.
3. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że nowotwór układu chłonnego jest nowotworem limfocytów B (wyłączając szpiczaki).
4. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało jest monoklonalnym przeciwciałem.
5. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu ADCC.
6. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu CDC.
7. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało zawiera region stały Cy przeciwciała ludzkiego.
8. Środek terapeutyczny według zastrz. 7, znamienny tym, że region stały Cy przeciwciała ludzkiego jest regionem Cyl lub Cy3.
9. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem ^przeciw antygenowi HM1.24.
10. Środek terapeutyczny według zastrz. 4, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem yhimerowym lub przeciwciałem o cechach przeciwciała ludzkiego.
11. Środek terapeutyczny według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem yhimerowym przeciw antygenowi HM 1.24.
12. Środek terapeutyczny według zastrz. 9, znamienny tym, że przeciwciało jest przeciwciałem o cechach przeciwciała ludzkiego przeciw antygenowi HM1.24.
13. Środek terapeutyczny według zastrz. 1, znamienny tym, że przeciwciało specyficznie wiąże się z epitopem rozpoznawanym przez przeciwciało przeciw antygenowi HM 1.24.
14. Przeciwciało, znamienne tym, że specyficznie wiąże się z białkiem mającym sekwencję aminokwasową przedstawioną na SEQ ID NO: 1 i posiadające działanie cytotoksyczne.
15. Przeciwciało według zastrz. 13, znamienne tym, że jego aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu ADCC.
16. Przeciwciało, według zastrz. 13, znamienne tym, że jego aktywność cytotoksyczna jest aktywnością typu CDC.

Zakres wynalazku