KR20030097614A - 임파구계 종양의 치료제 - Google Patents
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Abstract
서열번호:1에 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 항체.
Description
본 발명은 임파구계 종양에 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로서 함유하는 임파구계 종양(골수종을 제외함) 치료제에 관한 것이다. 또, 본 발명은, T세포 종양 또는 B세포 종양(골수종을 제외함) 치료제에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 임파구계 종양에 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하고, 세포장해활성을 갖는 항체에 관한 것이다.
임파구계 세포는, 생체에 있어서 주로 면역을 담당하는 세포이다. 임파구계 세포는 모두 동일한 혈액간 세포에 유래하고, 골수 중 또는 기타 기관에서 여러가지의 분화유도인자, 또는 증식인자의 작용을 받아서 분화를 되풀이한 후, 말초혈 중으로 방출된다. 이 분화가 다른 것에 의해 임파구계 세포는 B세포와 T세포로 대별된다. B세포는 항체생산능을, T세포는 항원제시능, 세포장해능, 기타 여러가지의 능력을 갖고 있는 것으로 고려되고 있다. 이 분화단계에서 어떠한 원인에 의해 종양화하고, 골수 중, 임파조직 중, 말초혈 중 등에서 이상증식하도록 된 것이 임파구계 종양이다.
근래, 새로운 기술도입, 특히 세포표면의 분화항원에 대한 모노클로날 항체를 이용한 기술의 진보에 의해, 임파구계 세포의 유래나 분화단계의 동정이 가능하게 되었다. 이것에 수반해서, 임파구계 종양에 대해서도 그의 종양세포의 유래가 T세포일까 B세포일까 뿐만 아니라, 성숙도의 동정까지도 가능하게 되었다.
임파구계 종양은 그의 종양세포의 기원 또는 성숙도에 의해 B세포 종양 및 T세포 종양으로 대별된다. B세포 종양은 종양세포의 성숙도에 의해서, 급성 B 임파성 백혈병(B-ALL), 만성 B 임파성 백혈병(B-CLL), pre-B 임파종, Burkitt 임파종, 여포성 임파종, 여포외투 임파종, 비만성 임파종 등으로 분류된다. 또, T세포 종양은 그의 종양세포의 성숙도에 의해서, 급성T 임파성 백혈병(T-ALL), 만성T 임파성 백혈병(T-CLL), 성인 T세포 백혈병(ATL), 비 ATL 말초성 T임파종(PNTL) 등으로 분류된다(도해 임상[암]시리즈 No.17 백혈병·임파종·스기무라 다까시 등, MEDICAL VIEW사, 1987, B세포종양, 高月淸, 西村書店, 1991).
근년, 의료기술의 발달에도 불구하고, 임파구계 종양의 치료에 관해서는, 아직 불충분하다고 말할 수 밖에 없다. 예를 들면, 급성 임파성 백혈병(ALL)의 치유율은 20% 이하이다. 또, 임파종의 경우, B임파종은 많은 약제와 병용요법의 진보에 의해 비교적 치유율은 높다고 말할 수 있지만, 진행기에서의 치유율은 50% 정도이다. 또한, T임파종은 보다 난치성이고, 치유율은 약 30%, 성인 T세포 백혈병(ATL)에 있어서는 10%에도 만족하지 않는 현상이다.
한편, 고토, 티.(Goto, T.) 등은 인간 골수종세포를 마우스에 면역하여 얻어진 모노클로날 항체(항HM1.24항체)를 보고하고 있다(Blood (1994)84, 1922-1930). 인간 골수종 세포를 이식한 마우스에 항HM1.24항체를 투여하면, 이 항체가 종양조직에 특이적으로 집적한 것(小阪昌明 등, 일본임상(1995) 53,627-635)으로부터 항HM1.24항체는 방사성동위체 표지(radioisotopic labeling)에 의한 종양국재(腫瘍局在)의 진단이나, 방사성면역요법 등의 미사일요법(missile therapies)에 응용하는 것이 가능하다는 것이 시준되어 있다. 그러나, 항HM1.24항체가 다른 임파구계 종양의 치료에 유용하다는 것은 알려지지 않았다.
현재 행해지고 있는 임파구계 종양의 치료에는, 여러가지의 화학요법, X선요법, 골수종이식 등이 열거되지만, 상기와 같이, 어느 치료법도 아직 완전하지는 않고, 임파구계 종양을 경감시켜서 환자의 생명기간을 연장시키는 획기적인 치료제 또는 치료법이 기대되고 있다.
따라서, 본 발명의 목적은 골수종을 제외한 임파구계 종양에 대한 새로운 치료제를 제공하는 것이다.
본 발명자들은 이러한 치료제를 제공해야 되고, 항HM1.24항체(Goto, T, et al., Blood(1994)84, 1922-1930)를 이용해서, FCM(flow cytometry) 해석, ADCC 활성, CDC 활성과 같은 세포장해활성의 측정 등의 시험관내(in vitro)에서의 연구, 생체 내(in vivo)에서의 항종양효과의 검토, 또한 항HM1.24항체가 특이적으로 결합하는 항원단백질 단리의 연구를 거듭한 결과, 항HM1.24항체가 인식하는 항원 단백질이 임파구계 종양에 발현하고 있는 것, 및 항HM1.24항체가 임파구계 종양에 대해서 항종양효과를 갖는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
즉, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 임파구계 종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 모노클로날항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성으로서 ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖고, 정상영역으로서 인간항체의 Cγ를 갖는 항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 키메라 항체 또는 인간형화 항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 항HM1.24항체를 인식하는 에피토프(epitope)와 특이적으로 결합하는 항체를 유효성분으로하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함) 치료제를 제공한다.
또, 본 발명은 항HM1.24항체를 유효성분으로서 함유하는 T세포종양치료제, 또는 B세포종양(골수종을 제외함)치료제를 제공한다.
또한, 본 발명은 임파구계 종양에 발현되는 단백질에 특이적으로 결합하고, 세포장해활성을 갖는 항체에 관한 것이다.
도 1은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람(histogram)을 나타낸 것이다.
도 2는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 3은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 4는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 5는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 6은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 7은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 8은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 9는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 B세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 10은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 11은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 12는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 13은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 14는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 15는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 16은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 17은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 18은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 19는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 T세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 20은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 비T비B 세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 21은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 비T비B 세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 22는 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 비T비B 세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 23은 항HM1.24항체 및 대조구 마우스 IgG2a로, 간접법에 의해 도면에 나타낸 비T비B 세포주를 FCM 해석했을 때의 히스토그람을 나타낸 것이다.
도 24는 항HM1.24항체가 T세포종양주인 CCRF-CEM, CCRF-HSB-2 및 HPB-MLT에 대해서, 농도 의존적으로 세포장해를 일으키고 있는 것을 나타낸 그래프이다.
도 25는 항HM1.24항체가 B세포 종양주인 EB-3, MC116 및 CCRF-SB에 대해서, 농도 의존적으로 세포장해를 일으키고 있는 것을 나타낸 그래프이다.
도 26은 인간임파구계 종양 이식 마우스에 있어서, 항HM1.24항체 투여군은 대조구 마우스 IgG2a 투여군에 비해서, 종양체적의 증가가 제어되고 있는 것을 나타낸 그래프이다.
도 27은 인간임파구계 종양 이식 마우스에 있어서, 항HM1.24 항체투여군은 대조구 마우스 IgG2a 투여군에 비해서, 생존기간이 연장해 있는 것을 나타낸 그래프이다.
1. 항체의 제조
1-1. 하이브리도마의 제조
본 발명에서 사용되는 항체를 생산하는 하이브리도마는 기본적으로는 공지기술을 사용하여 다음과 같이 해서 제조할 수 있다. 즉, HM1.24항원 단백질이나 HM1.24항원을 발현하는 세포를 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라서 면역하고, 얻어지는 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해서 공지의 친세포와 융합시키고, 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날한 항체생산세포를 스크리닝함으로써 제조할 수 있다.
구체적으로는, 모노클로날 항체를 제작하는 것은 다음과 같이 하면 좋다. 예를 들면, 항체 취득의 감작항원인 HM1.24항원 발현세포로서는, 인간 다발성 골수종세포주인 KPMM2(특개평 7-236,475호)나 KPC-32(Goto, T. et al., Jpn. Clin. Hematol.(1991)32,1400)를 이용할 수 있다. 또, 감작항원으로서, 서열번호 1로 나타낸 아미노산서열을 갖는 단백질, 또는 항HM1.24항체를 인식하는 에피토프를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 사용할 수 있다.
또한, 감작항원으로서 사용되는, 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는단백질의 cDNA는 pUC19 벡터의 XbaI 절단부위 사이에 삽입되어, 플라스미드 pRS38-pUC19로서 제조되고 있다. 이 플라스미드 pRS38-pUC19를 함유하는 대장균(E.coli)은, 평성 5년(1993년) 10월 5일자로 공업기술원 생명공학 공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 Escherichia coli DH5α(pRS38-pUC19)로서, 수탁번호 FERM BP-4434로서 부다페스트 조약에 기초해서 국제기탁되어 있다(특개평 7-196,694호 참조). 이 플라스미드 pRS38-pUC19에 함유되는 cDNA 단편을 이용해서 유전자 공학적 수법에 의해, 항HM1.24항체를 인식하는 에피토프를 함유하는 펩티드 또는 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
감작항원으로 면역되는 포유동물로서는, 특히 한정되는 것은 아니지만, 세포융합에 사용하는 친세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하며, 일반적으로는 설치류의 동물, 예를 들면 마우스, 쥐(rat), 햄스터(hamster) 등이 사용된다.
감작항원을 동물에 면역하는 것은 공지의 방법에 따라서 행해진다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사해서 행한다. 구체적으로는 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량으로 희석·현탁한 것을 소망에 따라서 통상의 보조약(adjuvant), 예를 들면 프로인드 완전 보조약을 적당량 혼합하고, 유화 후, 포유동물에 4-21일마다 수회 투여하는 것이 바람직하다. 또, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수 있다.
이와 같이 면역하여, 혈청 중에 소망의 항체레벨이 상승하는 것을 확인한 후에, 포유동물로부터 면역세포를 꺼내서 세포융합시킨다. 세포융합에 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포를 들 수 있다.
상기 면역세포와 융합되는 다른 쪽의 친세포로서의 포유동물의 미에로오마 세포(myeloma cells)는, 이미 공지된 여러가지의 세포주, 예를 들면 P3X63Ag8. 653 (J. Immunol.(1979) 123: 1548-1550), P3X63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81: 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol, (1976) 6: 511-519), MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell (1976) 8: 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276: 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35: 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148: 313-323), R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277: 131-133) 등이 적당히 사용된다.
상기 면역세포와 미에로오마 세포의 세포융합은 기본적으로는 공지의 방법, 예를 들면 밀스테인(Milstein) 등의 방법(Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73: 3-46) 등에 준해서 행할 수 있다.
보다 구체적으로는, 상기 세포융합은 예를 들면, 세포융합촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 용합촉진제로서는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 소망에 따라 융합효율을 높이기 위해 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가 사용하는 것도 가능하다.
면역세포와 미에로오마 세포의 사용비율은, 예를 들면 미에로오마 세포에 대해서 면역세포를 1∼10배로 하는 것이 바람직하다. 상기 세포융합에 사용되는 배양액으로서는 예를 들면, 상기 미에로오마 세포주의 증식에 적합한 RPMI 1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이 종류의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용가능하고, 또한 소의 태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용하는 것도 가능하다.
세포융합은, 상기 면역세포와 미에로오마 세포의 소정량을 상기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액, 예를 들면 평균분자량 1000∼6000 정도의 PEG 용액을 통상 30∼60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합해서 목적하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 이어서, 적당한 배양액을 순차적으로 첨가하고, 원심분리하여 상징액을 제거하는 조작을 되풀이함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거할 수 있다.
상기 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예를 들면 HAT 배양액(히포키산틴, 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘을 함유하는 배양액)으로 배양함으로써 선택된다. 당해 HAT 배양액으로서의 배양액은, 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하는데 충분한 시간, 통상 수일 내지 수주간 계속한다. 이어서, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 행한다.
또, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 얻는 것 외에, 인간 임파구를 시험관내에서 HM1.24항원 또는 HM1.24항원 발현세포로 감작하고, 감작임파구를 인간 미에로오마 세포, 예를 들면 U266과 융합시키고, HM1.24항원 또는 HM1.24항원 발현세포로의 결합활성을 갖는 소망의 인간항체를 얻는 것도 가능하다(특허공고 평 1-59,878호 참조). 또한, 인간 항체 유전자 모두의레퍼토리(repertori)를 갖는 트랜스제닉 동물에 항원으로 되는 HM1.24항원 또는 HM1.24항원 발현세포를 투여하고, 상기한 방법에 따라 소망의 인간항체를 취득해도 좋다(국제특허출원공개번호 WO93/12227, WO92/03918, WO94/02602, WO94/25585, WO96/34096, WO96/33735 참조).
이와 같이 하여 제조되는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양(繼代倍養) 하는 것이 가능하고, 또 액체질소 중에서 장기 보존하는 것이 가능하다.
당해 하이브리도마로부터 모노클로날항체를 취득하는 데는, 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하여 그의 배양 상징액으로서 얻는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그의 복수(腹水)로서 얻는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은, 고순도의 항체를 얻는데 적합하고, 한편 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.
구체적으로는, 항HM1.24항체생산 하이브리도마의 제조는 고토, 티 등의 방법(Blood (1994) 84, 1922-1930)에 의해 행할 수 있다. 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에, 평성 7년(1995)9월 14일에 FERM BP-5233으로서 부다페스트 조약에 기초해서 국제기탁된 항HM1.24항체생산 하이브리도마를 BALB/c 마우스(일본 CLEA 제)의 복강내에 주입해서 복수(腹水)를 얻고, 이 복수로부터 항HM1.24항체를 정제하는 방법이나, 이 하이브리도마를 적당한 배지, 예를 들면 10% 소의 태아혈청, 5%BM-Condimed H1(Boehringer Mannheim 제)함유 RPMI 1640 배지, 하이브리도마 SFM 배지(GIBCO-BRL 제), PFHM-11배지(GIBCO-BRL 제)등으로 배양하고, 그의 배양상징액으로부터 항HM1.24항체를 정제하는 방법으로 행할 수 있다.
1-2. 재조합형 항체
본 발명에서는, 모노클로날 항체로서 항체유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고, 적당한 벡터에 넣어서 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합 기술을 이용해서 생산시킨 재조합형 항체를 이용할 수 있다(예를 들면, Carl, A.K. Borrebaeck, James, W. Larrick, THERAPEUTIC MONOCLONAL ANTIBODIES, Published in the United Kingdom by MACMILLAN PUBLISHERS LTD., 1990 참조).
구체적으로는, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항체의 가변(V)영역을 코드하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는, 공지의 방법, 예를 들면 구아니딘 초원심분리법(Chirgwin, J.M.등, Biochemistry(1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. 등, Analytical Biochemistry, (1987) 162, 156-159)등에 의해 전장 RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia 제)등을 사용해서 mRNA를 제조한다. 또, Quick Prep mRNA Purification Kit(Pharmacia 제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 제조할 수 있다.
얻어진 mRNA로부터 역전사효소를 사용해서 항체V영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은, AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit 등을 사용해서 행할 수 있다. 또, cDNA의 합성 및 증폭을 행하는 것은 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech 제) 및 PCR를 이용한 5'-RACE법(Frohman, M.a. 등 Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002; Belyavsky, A 등, Nucleic Acids Res.(1989) 17, 2919-2932)을 사용할 수 있다. 얻어진 PCR 산물로부터 목적하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터-DNA와 연결한다. 또한 이것에 의해 재조합벡터를 제조하고, 대장균 등에 도입하여 클로니를 선택하여 소망의 재조합 벡터를 제조한다. 목적으로 하는 DNA의 염기 서열을 공지의 방법, 예를 들면 데옥시법에 의해 확인한다.
목적하는 항체의 V영역을 코드하는 DNA가 얻어지면, 이것을 소망의 항체정상영역(C영역)을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현 벡터에 넣는다. 또는 항체의 V영역을 코드하는 DNA를 항체 C영역의 DNA를 함유하는 발현벡터에 넣어도 좋다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조함에는, 후술하는 바와 같이 항체 유전자를 발현제어영역, 예를 들면 인핸서(enhancer), 프로모터(promoter)의 제어하에서 발현하는 것과 같은 발현벡터에 넣는다. 다음에, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킬 수 있다.
1-3. 개변항체(Altered antibody)
본 발명에서는, 인간에 대한 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변(改變)한 유전자 재조합형항체, 예를 들면 키메라(Chimeric)항체, 인간형화(Humanized)항체 등을 사용할 수 있다. 이들의 개변항체는 기지의 방법을 사용해서 제조할 수 있다.
키메라항체는 상기한 바와 같이 하여 얻는 항체 V영역을 코드하는 DNA를 인간항체C 영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 넣어서 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO96/02576 참조). 이 기지의 방법을 사용해서, 본 발명에 유용한 키메라항체를 얻을 수 있다.
예를 들면, 키메라 항HM1.24항체의 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균을, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 평성 8년(1996년) 8월 29일에 각각 FERM BP-5646 및 FERM BP-5644로서 부파페스트 조약에 기초해서 국제기탁되어 있다(일본국 특허출원 평 9-271,536호 참조).
인간형화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체로도 칭해지고, 인간 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성결정영역(CDR; Complementarity determining region)을 인간항체의 상보성결정영역으로 이식한 것이고, 그의 일반적인 유전자 재조합 수법도 알려져있다(유럽특허출원 공개번호 EP 125023, 국제특허출원 공개번호 WO96/02576 참조).
구체적으로는, 마우스 항체의 CDR와 인간항체의 프레임워크영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을, 말단부에 겹치는 부분을 갖도록 제조한 수개의 올리고뉴클레오티드로부터 PCR법으로 합성한다. 얻어진 DNA를 인간항체 C영역을 코드하는 DNA와 연결하고, 이어서 발현벡터에 넣고, 이것을 숙주에 도입하여 생산시킴으로써 얻어진다(유럽특허출원 공개번호 EP239400, 국제특허출원 공개번호 WO96/02576 참조).
CDR를 통해서 연결되는 인간항체의 FR는, 상보성결정영역이 양호한 항원결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라서, 재구성 인간항체의 상보성결정영역이 적절한 항원결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역의 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 좋다(Sato, K. et al., Cancer Res.(1993) 53, 851-856).
예를 들면, 인간형화 항HM1.24항체의 L쇄 V영역a 버젼(서열번호:2) 및 H쇄 V영역r 버젼(서열번호:3)을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균은, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγ1)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에, 평성 8년(1996년) 8월 29일에 각각 FERM BP-5645 및 FERM BP-5643으로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되어 있다(일본 특허출원 평9-271536호 참조). 또, 인간형화 항HM1.24항체의 H쇄 V영역s 버젼(서열번호: 4)을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균은, Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγ1)로서, 공업기술연구원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔구바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 평성 9년(1997년) 9월 29일에 각각 FERM BP-6127 로서 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되어 있다(일본 특허출원 평9-271536호 참조).
키메라항체, 인간형화 항체에는, 인간항체 C영역이 사용되고, 세포장해활성을 나타내는 인간항체C 영역으로서, 인간 Cγ, 예를 들면 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를 사용할 수 있다. 이들 중, 특히 Cγ1, Cγ3를 갖는 항체가 강력한 세포장해활성, 즉, ADCC활성, CDC 활성을 갖고, 본 발명에 적합하게 사용된다.
키메라항체는 인간 이외의 포유동물유래 항체의 가변영역과 인간항체유래의 C영역으로부터 되고, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체유래의 프레임워크 영역(framework region;FR) 및 C영역으로부터 되고, 인간 체내에 있어서 항원성이 저해해 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 유용하다.
본 발명에 사용되는 인간형화 항체의 바람직한 구체예로서는, 인간형화 항HM1.24항체를 들 수 있다(일본국 특허출원 평9-271536호 참조). 인간형화 항HM1.24항체의 L쇄 V영역의 바람직한 구체예로서는, 서열번호 2로 나타낸 염기서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다. 또, 인간형화 항HM1.24항체의 H쇄 V영역의 바람직한 구체예로서는 서열번호 3 및 4로 나타낸 염기서열에 의해 코드되는 아미노산 서열을 갖는 것을 들 수 있다.
1-4. 발현 및 생산
상기와 같이 구축한 항체유전자는, 공지의 방법에 의해 발현시켜서 취득할 수 있다. 포유류세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현되는 항체유전자, 그의 3'측 하류에 폴리A 시그날을 기능적으로 결합시킨 DNA 또는 그것을 함유하는 벡터에 의해 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터/인핸서로서는, 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인핸서(human cytomegalovirus immediate early promotor/enhancer)를 들 수 있다.
또, 그외에 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용될 수 있는 프로모터/인핸서로서, 레트로바이러스(retrovirus), 폴리오마바이러스(polyma virus), 아데노바이러스(adenovirus), 시미안바이러스(simian virus) β40(SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서나 인간 일롱게이션 팩터(human elongation factor)-1α(HEF 1α) 등의 포유류세포 유래의 프로모터/인핸서를 사용하면 좋다.
예를 들면, SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 물리간(Mulligan) 등의 방법(Nature(1979)277,108), 또 HEF1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우, 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(Nucleic Acids Res.(1990) 18,5322)에 따르면 용이하게 실시할 수 있다.
대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그날 배열, 발현시키는 항체유전자를 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터로서는 lacz 프로모터, araB 프로모터를 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우, 와드(Ward)등의 방법(Nature(1098) 341, 544-546; FASEB J.(1992)6, 2422-2427), araB 프로모터를 사용하는 경우, 베터(Better)등의 방법(Science (1988) 240, 1041-1043)에 따르면 좋다.
항체분비를 위한 시그날 배열로서는, 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그날배열(Lei, S.P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)를 사용하면 좋다. 페리플라즘에 생산되는 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적당히 리폴드(refold)하여 사용한다(예를 들면, WO96/30394 참조).
복제기원으로서는, SV40, 폴리오마바이러스, 아데노바이러스, 소의 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus; BPV)등의 유래의 것을 사용할 수 있고, 또한 숙주세포계에서 유전자 복제수 증식을 위해, 발현벡터는 선택 마커로서, 아미노글리코시드 트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘키나제(TK)유전자, 대장균 크산틴구아닌포스포리보실트랜스퍼라제(Ecogpt)유전자, 디히드로 엽산환원효소(dhfr)유전자 등을 함유할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 항체를 제조하기 위하여, 임의의 생산계를 사용할 수 있다. 항체제조를 위한 생산계는, 시험관내(in vitro) 및 생체 내(in vivo)의 생산계이다. 시험관내의 생산계로서는, 잔핵세포를 사용하는 생산계나 원핵세포를 사용하는 생산계를 들 수 있다.
진핵세포를 사용하는 경우, 동물세포, 식물세포, 진균세포를 이용하는 생산계가 있다. 동물세포로서는, (1) 포유류 세포, 예를 들면, OCHO, COS, 미에로오마, BHK(baby hamster kidney), Hela, Vero, (2) 양생류 세포, 예를 들면 아프리카쓰메가엘 난모세포(xenopus oosytes), 또는 (3) 곤충세포, 예를 들면 sf9, sf21, Tn5 등이 알려져 있다. 식물세포로서는, 니코티아나(Nicotiana)속, 예를 들면 니코티아나· 타바컴(Nicotiana tabacum)유래의 세포가 알려져 있고, 이것을 칼스 배양하면 좋다. 진균세포로서는, 효모, 예를 들면 사카로미세스(Saccharomyces)속, 예를 들면 사카로미세스·세레비시애(Saccharomyces Cerevisiae), 사상균, 예를 들면 아스파길러스(Aspergillus)속, 예를 들면 아스파길러스. 니거(Aspergillus niger)등이 알려져 있다.
원핵세포를 사용하는 경우, 세균세포를 사용하는 생산계가 있다. 세균세포로서는, 대장균(E.coli), 고초균(枯草菌)이 알려져 있다.
이들에 세포에, 목적하는 항체유전자를 형질전환에 의해 도입하고, 형질전환된 세포를 시험관내에서 배양함으로써 항체가 얻어진다. 배양은, 공지의 방법에 따라서 행한다. 예를 들면, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM을 사용할 수가 있으며, 소의 태아혈청(FCS)등의 혈청보액을 병용하는 것도 가능하다. 또, 항체 유전자를 도입한 세포를 동물의 복강등으로 옮김으로써, 생체내에서 항체를 생산해도 좋다.
한편, 생체내의 생산계로서는, 동물을 사용하는 생산계나 식물을 사용하는 생산계를 들 수 있다. 동물을 사용하는 경우, 포유류 동물, 곤충을 이용하는 생산계가 있다.
포유류 동물로서는, 염소, 돼지, 양, 마우스, 소, 등을 이용할 수 있다(Vicki Glaser, SPECTRUM Biotechnology Application, 1993). 또, 곤충으로서는 누에를 이용할 수 있다. 식물을 사용하는 경우, 담배를 이용할 수 있다.
이들의 동물 또는 식물에 항체유전자를 도입하고, 동물 또는 식물의 체내에서 항체를 생산시켜서 회수한다. 예를 들면, 항체유전자를 염소β 카제인과 같은 유즙(乳汁)중에 고유하게 생산되는 단백질을 코드하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합유전자로서 제조한다. 항체유전자가 삽입된 융합유전자를 함유하는 DNA단편을 염소의 배(胚)에 주입하고, 이 배(胚)를 암컷의 염소에 도입한다. 배(胚)를 수용한 염소로부터 태어나는 트랜스제닉(tansgenic) 염소 또는 그의 자손이 생산하는 유즙으로부터 소망하는 항체를 얻는다. 트랜스제닉 염소로부터 생산되는 소망의 항체를 함유하는 유즙량을 증가시키기 위하여, 적당한 홀몬을 트랜스제닉 염소에 사용해도 좋다(Ebert, K.M. et al., Bio/Technology(1994) 12, 699-702).
또, 누에를 이용하는 경우, 목적 항체유전자를 삽입한 바큠 바이러스를 누에에 감염시키고, 이 누에의 체액에서 소망의 항체를 얻는다(Susumu M. et al.,Nature (1985) 315, 592-594). 또한, 담배를 이용하는 경우, 목적 항체유전자를 식물 발현용 벡터, 예를 들면 pMON 530에 삽입하고, 이 벡터를 아그로박테리움·투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 박테리아에 삽입한다. 이 박테리아를 담배, 예를 들면 니코티아나 타바컴(Nicotiana tabacum)에 감염시키고, 이 담배의 잎에서 소망의 항체를 얻는다(Julian, K.-C. Ma et al., Eur. J. Immunol.(1994) 24, 131-138).
상기와 같이, 생체내 또는 시험관내 생산계에서 항체를 생산하는 경우, 항체 중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코드하는 DNA를 따로 따로 발현벡터에 넣어서 숙주를 동시에 형질전환시켜도 좋고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코드하는 DNA를 단일의 발현벡터에 넣어서 숙주를 형질전환시켜도 좋다(국제특허출원 공개번호 WO94-11523 참조).
상기와 같이 얻어진 항체는 폴리에틸렌글리콜(PEG)등의 각종 분자와 결합시켜 항체수식물(antibody modifier)로서 사용하는 것도 가능하다.
본원의 특허청구의 범위에서 말하는 항체에는 이들의 항체수식물도 포함된다. 이와 같은 항체수식물을 얻는데는, 얻어진 항체에 화학적인 수식을 실시함으로써 얻을 수 있다. 이들의 방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.
2. 항체의 분리. 정제
2-1. 항체의 분리. 정제
상기와 같이 생산, 발현된 항체는, 세포 내외, 숙주로부터 분리하여 균일할 때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항체의 분리·정제는 친화성 크로마토그라피(affinity chromatography)에 의해 행할 수 있다. 친화성 크로마토그라피에 이용되는 칼럼으로서는, 예를 들면, 프로테인A 칼럼, 프로테인G 칼럼을 들 수 있다. 프로테인A 칼럼에 이용되는 담체로서, 예를 들면 Hyper D, POROS, Sepharose F.F. 등을 들 수 있다.
기타, 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 좋고, 어떤 한정되는 것은 없다. 예를 들면, 상기 친화성 크로마토그라피 이외의 크로마토그라피, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적당히 선택, 조합하면 본 발명에서 사용되는 분리, 정제하는 것이 가능하다. 크로마토그라피로서는, 예를 들면 이온교환 크로마토그라피, 소수(疎水)크로마토그라피, 겔여과 등을 들 수 있다. 이들의 크로마토그라피는 HPLC에 적용할 수 있다. 또, 역상 HPLC를 이용할 수 있다.
2-2. 항체의 농도측정
2-1에서 얻어진 항체의 농도측정은 흡광도의 측정 또는 ELISA 등에 의해 행할 수 있다. 즉, 흡광도의 측정에 의한 경우에는, 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유한 샘플을 PBS(-)로 적당히 희석한 후, 280㎚의 흡광도를 측정하고, 1㎎/㎖를 1.35OD로해서 산출한다. 또, ELISA에 의한 경우는 이하와 같이 측정할 수 있다. 즉, 0.1M 중탄산완충액(pH9.6)으로 1㎍/㎖로 희석한 염소 항인간 IgG(BIO SOURCE 제) 100㎕를 96웰(穴)플레이트(Nunc 제)에 첨가하고, 4℃에서 하룻밤 배양하고, 항체를 고층화(固層化)한다.
블로킹 후, 적당히 희석한 본 발명에서 사용되는 항체 또는 항체를 함유한 샘플, 또는 기준(standard)으로서 인간IgG(CAPPEL 제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 5000배 희석한 알카리포스파타제 표지 항인간 IgG(BIOSOURCE 제) 100㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 배양한다. 세정 후, 기질용액을 첨가해 배양 후, MICROPLATE READER Model 3550(Bio-Rad 제)를 이용해서 405㎚에서의 흡광도를 측정하고, 목적하는 항체의 농도를 산출한다.
3. FCM 해석
임파구계 종양과 본 발명에서 사용되는 항체와의 반응성은, FCM(플로우 사이토 메트리) 해석으로 행할 수 있다. 세포로서는, 수립세포주(樹立細胞株) 또는 신선분리세포(新蘚分籬細胞)를 이용할 수 있다. 예를 들면, 수립세포주로서, T세포주인 RPMI 8402(ATCC CRL-1994), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-CEM(ATCC CCL-119), 급성 임파성 백혈병 유래 HPB-ALL (FCCH 1018), T임파종 유래 HPB-MLT(FCCH 1019), 급성 임파성 백혈병 유래 JM(FCCH 1023), 급성 임파구성 백혈병 유래 MOLT-4(ATCC CRL-1582), 급성 임파성 백혈병 유래 Jurkat(FCCH 1024), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1), 성인 T세포 백혈병 유래 MT-1(FCCH 1043), 렌넬트임파종 유래 KT-3(Shimizu, S. et al., Blood(1988)71, 196-203) 등을, 또, B세포주로서 EB바이러스형질전환세포 CESS(ATCC TIB-190), EB 바이러스 양성세포 SKW 6.4(ATCC TIB-215), B임파종 유래 MC116(ATCC CRL-1649), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-SB(ATCC CCL-120), 급성 골수성 백혈병환자 유래 B세포 RPMI 6410(FCCH 6047), Burkitt 임파종 유래 Daudi(ATCC CCL-213), Burkitt 임파종 유래 EB-3(ATCC CCL-85), Burkitt 임파종 유래 Jijoye(ATCC CCL-87), Burkitt 임파종 유래 Raji(ATCC CCL-86)등을, 또한 비T비B 세포주로서 급성 골수성 백혈병 유래 HL-60(ATCC CCL-240), 급성 단구성 백혈병 유래 THP-1(ATCC TIB-202), 조직구성 임파종 유래 U-937(ATCC CRL-1593), 만성 골수성 백혈병 유래 K-562(ATCC CCL-243) 등을 이용할 수 있다.
상기 세포를 PBS(-)로 세정한 후, FACS 완충액(2% 소의 태아혈청, 0.1% 아지화 나트륨함유 PBS(-))로 25㎍/㎖로 희석한 항체 또는 대조구 항체 100㎕를 첨가하고, 얼음상에서 30분간 배양한다. FACS 완충액으로 세정한 후, 25㎍/㎖의 FITC 표지 염소항 마우스항체(GAM, Becton Dickinson 제) 600㎕를 첨가하고, 얼음상에서 30분간 배양한다. FACS 완충액으로 세정한 후, 100㎕ 또는 1㎖의 FACS 완충액에 현탁하고, FACScan(Becton Dickinson 제)로 각 세포의 형광강도를 측정하면 좋다.
각 세포의 형광강도의 측정치에서, 본 발명에서 사용되는 항체와 각 세포의 반응성을 알 수 있다. 즉, 각 세포의 형광강도의 측정치에서, 각 세포에 HM1.24항원이 발현하고 있는가 아닌가(양성인가 음성인가) 및 발현의 강도를 알 수 있다. 임파구계 종양세포에 있어서 HM1.24항원의 발현 유뮤 및 발현강도에 대해서는, 후술하는 실시예 2.2 FCM 해석에 기재되어 있다.
본 발명의 치료대상이 되는 임파구계 종양의 종양세포는, HM1.24항원을 발현하고 있다. 보다 상세하게는, 임파구계 종양의 종양세포는 HM1.24항원 양성의 백분율이 5% 미만이 아닌 종양세포가 바람직하다. 보다 상세하게는, 임파구계 종양의 종양세포는, HM1.24항원, 양성의 백분율이 20% 이상인 종양세포가 바람직하다. 보다 상세하게는, 임파구계 종양의 종양세포는, HM1.24항원 양성의 백분율이 50% 이상인 종양세포가 바람직하다. 보다 상세하게는, 임파구계 종양의 종양세포는 HM1.24항원 양성의 백분율이 80% 이상인 종양세포가 바람직하다.
4. 세포장해활성
4-1. CDC 활성의 측정
본 발명에 사용되는 항체는, 세포장해활성으로서 예를 들면 CDC 활성을 갖는 항체이다.
본 발명의 임파구계 종양치료제의 임파구계 종양에 대한 CDC 활성은 다음과 같이 하여 측정할 수 있다. 우선 표적세포를 적당한 배지, 예를 들면 10% 소의 태아혈청(GIBCO-BRL 제) 함유 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL 제)로 4×105m/㎖가 되도록 조제한다. 표적 세포로서는, CCRF-CEM(ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1), HPB-MLT(FCCH 1019), EB-3(ATCC CCL-85), MC116(ATCC CRL-1649), CCRF-SB(ATCC CCL-120), K-562(ATCC CCL-243)등을 이용할 수 있다. 이들 세포를 96웰 평저(flat-bottomed) 플레이트(FALCON 제)에 50㎕ 첨가하고, 37℃, CO2배양기 중에서 하룻밤 배양한다.
이어서, CDC 활성을 측정하는 항체를 첨가하고, 60분간 배양한 후, 적당히 희석한 보체(補體), 예를 들면 Baby Rabbit Complement(CEDARLANE 제)를 첨가하고, 2시간 배양한다. 이것에 Alamar Blue(BIO SOURCE 제)를 각 웰에 10㎕씩 첨가하고, 4시간 배양한 후, 각 웰의 형광강도(여기파장 530㎚, 검출파장 590㎚)를 형광측정시스템 Cyto Fluor 2350(MILLIPORE 제)으로 측정한다. 세포장해활성(%)은, (A-C)/(B-C)×100으로 계산할 수 있다. 또한, A는 항체 존재하에서 배양했을 때의 형광감도, B는 항체를 함유하지 않고 배양액만으로 배양했을 때의 형광감도, C는 세포를 함유하지 않는 웰의 형광강도이다.
4-2. ADCC활성의 측정
본 발명에 사용되는 항체는, 세포장해활성으로서, 예를 들면 ADCC 활성을 가는 항체이다.
본 발명의 임파구계 종양치료제의 임파구계 종양에 대한 ADCC 활성은, 다음과 같이 하여 측정할 수 있다. 우선, 인간의 말초혈이나, 골수로부터 비중원심법으로 단핵구 분리하고, 이펙터 세포로서 조제한다. 또, 표적세포로서는 CCRF-CEM(ATCC CCL-119), CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1), HPB-MLT(FCCH 1019), EB-3(ATCC CCL-85), MC 116(ATCC CRL-1649), CCRF-SB(ATCC CCL-120), K-562(ATCC CCL-243)등을51Cr에 의해 표지하여 표적세포로서 조제한다. 이어서, 표지한 표적세포에 ADCC활성을 측정하는 항체를 첨가해 배양하고, 그 후에 표적세포에 대해 적절한 비의 이펙터 세포를 첨가해서 배양한다.
배양한 후 상징액을 취하고, 감마 카운터로 방사활성을 측정한다. 그 때, 최대 유리방사능 측정용에, 1%의 NP-40을 사용할 수 있다. 세포장해활성(%)은, (A-C)/(B-C)×100으로 계산할 수 있다. 여기서, A는 항체 존재하에서 유리된 방사활성(cpm), B는 NP-40에 의해 유리된 방사활성(cpm), C는 항체를 함유하지 않고 배양액 만으로 유리된 방사활성(cpm)이다.
4-3. 세포장해활성의 증가
ADCC 활성이나 CDC 활성과 같은 세포장해활성을 발휘하는 데는, 인간에 있어서는 항체정상영역(C영역)으로서 Cγ, 특히 Cγ1, Cγ3을 사용하는 것이 바람직하다. 또한, 항체 C영역의 아미노산을 일부 부가, 개변, 수식함으로써 보다 강력한 ADCC 활성, 또는 CDC 활성을 유도할 수 있다.
예를 들면, 아미노산 치환에 의한 IgG의 IgM 모양 폴리머화(Smith, R.I.F.A. Morrison, S. L. BIO/TECHNOLOGY(1994) 12, 683-688), 아미노산 부가에 의한 IgG의 IgM 모양 폴리머화 (Smith, R.I.F. et al., J. Immunology(1995) 154, 2226-2236), L쇄를 코드하는 유전자의 직렬연결에서의 발현(Shuford, W. et al., Science(1991) 252, 724-727), 아미노산 치환에 의한 IgG의 이량체화(Caron, P.C. et al., J. Exp. Med.(1992) 176, 1191-1195, Shopes, B., J. Immunology(1992) 148, 2918-2922), 화학수식에 의한 IgG의 이량체화(Wolff, E.A. et al., Cancer Res.(1993) 53, 2560-2565), 및 항체힌지영역의 아미노산 개변에 의한 이펙터기능의 도입(Norderhaug, L. et al., Eur. J. Immunol.(1991) 21, 2379-2384)를 들 수 있다. 이들은, 프라이머를 이용한 올리고머 부위 특이적 변이도입법, 제한효소 절단부위를 이용한 염기서열의 부가, 공유결합을 초래하는 화학수식제를 사용함으로써 달성된다.
5. 치료효과의 확인
본 발명의 임파구계 종양치료제의 치료효과를 확인하는데는 본 발명에서 사용되는 항체를 임파구계 종양세포를 이식한 동물에 투여하여, 항종양효과를 평가함으로써 행할 수 있다.
동물에 이식하는 임파구형 종양세포로서는, 수립세포주 또는 신선분리세포를이용할 수 있다. 예를 들면, 수립세포주로서 T세포주인 CCRF-CEM(ATCC CCL-119), HPB-MLT(FCCH 1019), MOLT-4(ATCC CRL-1582), CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1) 등을, 또 B세포주로서 CESS(ATCC TIB-190), SKW 6.4(ATCC TIB-215), CCRF-SB(ATCC CCL-120), RPMI 6410(FCCH 6047), EB-3(ATCC CCL-85)등을 이용할 수 있다.
또, 이식되는 동물로서는 면역기능이 저하 또는 결실한 동물이 바람직하며, 예를 들면 누드 마우스, SCID 마우스, 베지(beige)마우스, 누드 랫트 등을 이용할 수 있다. 평가하는 항종양 효과의 확인은 종양체적, 중량의 측정이나 동물의 생존기간 등에 의해 행할 수 있다.
후술하는 실시예에 나타낸 바와 같이, 항HM1.24항체의 투여에 의해 인간 임파구계 종양이식 마우스에 있어서, 종양체적의 증가가 억제되고, 또한 종양이식 마우스의 생존기간의 연장이 인지되었다. 이들의 것으로부터 항HM1.24항체는 임파구계 종양에 대해 항종양효과를 갖는 것으로 나타났다.
6. 투여경로 및 제제
본 발명의 임파구계 종양치료제는 비경구적으로 전신 또는 국소적으로 투여할 수 있다. 예를 들면, 점적 등의 정맥내 주사, 근육내 주사, 복강내 주사, 피하주사를 선택할 수 있고, 환자의 연령, 증상에 의해 적당히 투여방법을 선택할 수 있다. 유효투여량은 1회에 대해 체중 1㎏당 0.01㎎으로부터 100㎎의 범위로 선택된다. 또는 환자당 1-1000㎎, 바람직하기로는 5-50㎎의 투여량을 선택할 수 있다.
본 발명은 임파구계 종양치료제는 투여경로순서로 의학적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 함유한 것이어도 좋다. 이와 같은 담체 및 첨가물의 예로서, 물,의학적으로 허용되는 유기용매, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐 피롤리돈, 카르복시비닐폴리머,카르복시메틸셀룰로스 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란, 카르복시메틸스타치 나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로스, 에틸셀룰로스, 크산틴검, 아라비아고무, 카제인, 젤라틴, 한천, 디글리세린, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 바셀린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아린산, 인간혈청알부민 (HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토오스, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 들 수 있다. 사용되는 첨가물을 제형에 따라서 상기한 것 중에서 적당히 또는 조합해서 선택되지만, 이들에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 치료대상 질환으로서는, 표적하는 종양세포상에 본 발명에서 사용되는 항체가 결합하는 항원이 존재하는 골수종을 제외한 임파구계 종양이다. 구체적으로는, 급성B 임파성 백혈병(B-ALL), 만성B 임파성 백혈병(B-CLL), pre-B 임파종, Burkitt 임파종, 여포성 임파종(follicular lymphoma), 여포외투임파종(follicular pullium lymphoma), 비만성 임파종, 급성T 임파성 백혈병(T-ALL), 만성T 임파성 백혈병(T-CLL), 성인T세포 백혈병(ATL), 비ATL 말초성 T임파종(PNTL)등을 들 수 있다. 본 발명의 치료제는 이들 임파구계 종양의 치료제로서 유용하다.
실시예
다음에, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
항HM1.24항체의 제조
1. 항HM1.24항체를 함유하는 마우스 복수의 조제
항HM1.24 항체 생산 하이브리도마를 고토. 티등의 방법(Blood(1994)84. 1922-1930)에 따라서 얻었다.
미리 11일, 3일 전에 2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(和光純藥工業 제)을 각각 500㎕씩 복강내에 투여한 BALB/c 마우스(일본 CLEA 제)에, 이 하이브리도마 5×106개를 복강내로 주입했다. 하이브리도마 주입 후, 10일째부터, 마우스의 복강내에 괸 복수를 19게이지의 유치침(留置針) 해피카스(Happy cas)(Medikit 제)로 채취했다. 채취한 복수는 저속원심분리기 RLX-131(토미정공제)를 이용해서 회전수 1000 rpm, 3000rpm으로 2회 원심분리하여, 하이브리도마 혈구 등의 잡배물(雜排物)을 제거했다.
2. 마우스 복수로 부터의 항HM1.24 항체의 정제
상기 마우스 복수로부터 항HM1.24 항체의 정제는 이하의 방법으로 행했다. 마우스 복수에 등량의 PBS(-)를 첨가한 후, 중공사(中空絲) 필터 메디아 프렙(Mediaprep)(MILLIPORE 제)을 이용해서 여과한 후, 고속항체정제장치 ConSep LC100(MILLIPORE 제) 및 Hyper D Protein A 칼럼(칼럼체적 20㎖, 일본가이시제)를 이용하고, 부속 설명서에 기초해 흡착완충액으로서 PBS(-), 용출 완충액으로서 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH4)을 사용해서 친화성 정제했다. 용출 획분은 곧 1M Tris-HCl(pH8.0)을 첨가해서 pH7.4 부근으로 조정한 후, 원심 한외 농축기Centriprep 10을 이용해서 농축 및 PBS(-)으로의 완충액 치환을 행하고, 웰직경 0.22㎛의 막 필터-MILLEX-GV(MILLIPORE 제)로 여과멸균하여 정제 항HM1.24항체를 얻었다.
3. 항체농도의 측정
정제항체의 농도측정은 흡광도의 측정에 의하여 행했다. 즉, 정제항체를 PBS(-)로 희석한 후, 280㎚의 흡광도를 측정하고, 1㎎/㎖를 1.35OD으로해서 산출했다.
실시예 2
항HM1.24항체의 임파구계 종양세포에 대한 반응성의 검토
1. 대조구 마우스 IgG2a의 정제
대조구 마우스 IgG2a의 정제는 이하의 방법으로 행했다.
시판하는 마우스 IgG2a(KAPPA)(UPC 10) 복수(ascites, CAPPEL 제)를 정제수 및 PBS(-)로 용해했다. 이것을 웰직경 0.2㎛의 막 필터 Acrodisc (Gelman Sciences 제)를 이용해서 여과한 후, 고속항체 정제장치 ConSep LC100 (MILLPORE 제) 및 Hyper D Protein A 칼럼(칼럼 체적 20㎖, 일본가이시제)을 이용하고, 부속 설명서에 기초해 흡착완충액으로서 PBS(-)), 용출완충액으로서, 0.1M 구연산 나트륨 완충액(pH4)을 사용해서 친화성 정제했다.
용출분획은 곧 1M Tris-HCl(pH8.0)을 첨가해서 pH7.4 부근으로 조정한 후, 원심한외농축기 Centriprep 10을 이용해서 농축 및 PBS(-)으로의 완충액치환을 행하고, 웰직경 0.22㎛의 막 필터 MILLEX-GV(MILLIPORE 제)로 여과멸균하여 정제 대조구 마우스 IgG2a를 얻었다.
정제 대조구 마우스 IgG2a의 농도측정은 상기 3의 항체 농도의 측정에 따랐다.
2. FCM 해석
항HM1.24항체의 임파구계 종양세포에 대한 반응성의 검토는, FCM(플로우사이트메트리)해석으로 행했다. T세포주인 RPMI 8402(ATCC CRL-1995), 급성 임파 아구성 백혈병 유래 CCRF-CEM(ATCC CCL-119), 급성 임파성 백혈병 유래 HPB-ALL(FCCH 1018), T임파종 유래 HPB-MLT(FCCH 1019), 급성 임파성 백혈병 유래 JM(FCCH 1023), 급성 임파구성 백혈병 유래 MOLT-4(ATCC CRL-1582), 급성 임파성 백혈병 유래 Jurkat(FCCH 1024), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1), 성인T세포 백혈병 유래 MT-1(FCCH 1043), 렌넬트(Lennert's) 임파종 유래 KT-3(Shimizu, S. et al., Blood(1988) 71, 196-203)을, 또, B세포주로서 EB 바이러스 형질전환 세포 CESS (ATCC TIB-190), EB 바이러스 양성 B세포 SKW 6.4(ATCC TIB-215), B임파종 유래 MC 116(ATCC CRL-1649), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-SB(ATCC CCL-120), 급성 골수성 백혈병환자 유래 B세포 RPMI 6410(FCCH 6047), Burkitt 임파종 유래 Daudi (ATCC CCL-213), Burkitt 임파종 유래 EB-3(ATCC CCL-85), Burkitt 임파종 유래 Jijoye(ATCC CCL-87), Burkitt 임파종 유래 Raji(ATCC CCL-86)을 또한, BTB세포주로서 급성 골수성 백혈병 유래 HL-60(ATCC CCL-240), 급성 단구성 백혈병 유래 THP-1(ATCC TIB-202), 조직구성 임파종 유래 U-937(ATCC CRL-1593), 만성 골수성 백혈병 유래 K-562(ATCC CRL-243)을 PBS(-)로 세정한 후,FACS 완충액(2% 소의 태아혈청, 0.1% 아지화 나트륨 함유 PBS(-))으로 25㎍/㎖로 희석한 항HM1.24항체 또는 정제 대조구 마우스 IgG2a 100㎕를 첨가하고, 얼음상에서 30분간 배양했다.
FACS 완충액으로 청정한 후, 25㎍/㎖의 FITC표지 염소항 마우스 항체(GAM) 100㎕를 첨가하고, 얼음상에서 30분간 배양했다. FACS 완충액으로 세정한 후, 600㎕ 또는 1㎖의 FACS 완충액에 현탁하고, FACScan(Becton Deckinson사 제)로 각 세포의 형광강도를 측정했다. 그 결과, 도 1∼23에 나타낸 바와 같이, 모든 T세포주와 B세포주는, Daudi, Raji의 2종류로 반응하지 않는 것을 제외하고, 모든 항HM1.24항체와 반응하여, HM1.24항원을 고발현하고 있는 것이 확인되었다. 한편 비T비B 세포주는 모든 항HM1.24항체와 반응하지 않고, 항원의 발현을 검출할 수 없었다.
또, 도 1∼23의 각 세포의 히스토그람에 있어서, 대조구 마우스 IgG2a를 사용한 염색으로 음성세포가 98%, 양성세포가 2% 되도록 히스토그램마커를 설정하고, 그의 히스토그램마커에 따라서 항HM1.24항체를 사용했을 때의 HM1.24항원 양성의 세포의 백분율을 산출하는 것을 표 1에 나타내었다. HM1.24항원 양성세포의 백분율에 의해 HM1.24항원 발현율을 -, +/-, +, ++, +++의 5단계로 구별한 결과, 도 1∼23과 동일하게, 모든 T세포주 및 B세포주는 Daudi, Raji를 제외하고는 ++, 또는 +++와 대단히 HM1.24항원을 고발현하고 있는 것이 확인되었다. 또, 비T비B 세포주는 모든 HM1.24항원 양성세포가 5% 미만의 -이고, 항원의 발현이 없거나 또는 대단히 적은 것으로 나타났다.
| 세포명 | 발현율 | ||
| B세포주 | CESS | +++ | 94.5 |
| SKW 6.4 | +++ | 92.8 | |
| MC116 | ++ | 65.0 | |
| CCRF-SB | +++ | 98.4 | |
| RPMI 6410 | +++ | 94.5 | |
| EB-3 | +++ | 88.3 | |
| Jijoye | +++ | 92.3 | |
| Daudi | - | 2.8 | |
| Raji | - | 2.0 | |
| T세포주 | RPMI 8402 | +++ | 94.0 |
| CCRF-CEM | +++ | 97.8 | |
| HPB-ALL | ++ | 63.8 | |
| HPB-MLT | +++ | 94.6 | |
| JM | +++ | 99.6 | |
| MOLT-4 | +++ | 84.1 | |
| Jurkat | ++ | 70.9 | |
| CCRF-HSB-2 | +++ | 100.0 | |
| MT-1 | +++ | 95.9 | |
| KT-3 | +++ | 96.0 | |
| 비T비B 세포주 | HL-60 | - | 2.9 |
| THP-1 | - | 1.5 | |
| U-937 | - | 1.1 | |
| K-562 | - | 3.9 |
-,〈 5%; +/-, 5-20%; +.20-50%; ++, 50-80%; +++,〉80%
실시예 3
CDC 활성의 측정
항HM1.24항체의 임파구계 종양세포에 대한 CDC 활성은, 이하에 기재된 바와 같이 측정했다.
1. 표적세포의 조제
표적세포로서 급성 임파성 백혈병 유래 CCRF-CEM(ATCC CCL-119), 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-HSB-2(ATCC CCL-120.1), T임파종 유래 HPB-MLT(FCCH 1019), Burkitt 임파종 유래 EB-3(ATCC CCL-85), B임파종 유래 116(ATCC CRL-1649), 급성 임파성 백혈병 유래 CCRF-SB(ATCC CCL-120), 만성 골수성 백혈병 유래 K562 (ATCC CCL-243)을, 10% 소의 태아혈청(GIBCO-BRL 제)함유 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL 제)로 4×105개/㎖가 되도록 조제했다. 이들 세포현탁액을 96웰 평저 플레이트(FALCON 제)에 50㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2고습 배양기(TABAI 제)중에서 하룻밤 배양했다.
2. 항HM1.24항체의 조제
상기 실시예 1에서 얻어진 정제 항HM1.24항체를, 10% 소의 태아혈청(GIBCO-BRL 제조)함유 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL 제)로 0, 0.2, 2, 20 ㎍/㎖로 조제하고, 상기 1에서 제조한 96웰 평저 플레이트의 각 웰에 50㎕씩 첨가했다. 37℃, 5% CO2고습 배양기(TABAI 제)중에서 60분간 배양한 후, 저속원심기 05PR-22(히다찌 제)를 이용해서, 1000rpm, 5분간 원심분리하여 상징액 50㎕를 제거했다.
3. 보체의 조제
Baby Rabbit Complement(CEDARLANE 제)를 1바이알당 1㎖의 정제수로 용해하고, 또한 FCS비함유 RPMI 1640 배지(GIBCO-BRL 제) 5㎖로 희석했다. 이것을 상기 2의 96웰 평저 플레이트의 각 웰에 50㎕ 첨가하고, 37℃, 5% CO2고습 배양기(TABAI 제) 중에서 2시간 배양했다.
4. CDC 활성의 측정
배양 후, 상기 3의 96웰 평저 플레이트 각 웰에 Alamar Blue(BIO SOURCE 제)를 10㎕씩 첨가하고, 37℃, 5% CO2, 고습 배양기(TABAI 제) 중에서 4시간 배양한 후, 각 웰의 형광강도(여기파장 530㎚, 검출파장 590㎚)를 형광측정시스템 Cyto Fluor 2350(MILLIPORE 제)으로 측정했다. 세포장해활성(%)은 (A-C)/(B-C)×100으로 계산했다. 여기서, A는 항체 존재하에서 배양했을 때의 형광강도, B는 항체를 함유하지 않고, 배양액만으로 배양했을 때의 형광강도, C는 세포를 함유하지 않는 웰의 형광강도이다.
그 결과, 도 24 및 도 25에 나타낸 바와 같이, FCM 해석으로, 항HM1.24항체와 반응하지 않은 K562는, 항HM1.24항체를 첨가해도 세포장해가 일어나지 않았던 것에 대해서, 항HM1.24항체와 반응하는 CCRF-CEM, CCRF-HSB-2, HPB-MLT, EB-3, MC116 및 CCRF-SB에서는, 첨가한 항HM1.24항체의 농도 의존적으로 세포장해가 보여졌다.
이것으로부터, 항HM1.24항체는, 세포표면에 항HM1.24항체가 특이적으로 결합하는 항원 단백질을 갖는 임파구계 종양에 대해서, CDC 활성을 나타내는 것이 명확해졌다.
실시예 4
항HM1.24항체의 인간 임파구계 종양 이식 마우스에 대한 항종양 효과
1. 투여항체의 조제
1-1. 항HM1.24항체의 조제
상기 실시예 1에서 얻어진 정제 항HM1.24항체를, 여과멸균한 PBS(-)를 이용해서 1㎎/㎖, 200㎍/㎖로 조제하고, 이하의 실험에 사용했다.
1-2. 대조구 마우스 IgG2a의 조제
상기 실시예 2에서 얻어진 정제를 여과멸균한 PBS(-)를 이용해서 1㎎/㎖로 조제하고, 이하의 실험에 사용했다.
2. 항HM1.24항체의 인간 임파구계 종양 이식 마우스에 대한 항종양효과
2-1. 인간 임파구계 종양 이식 마우스의 제작
인간 임파구계 종양 이식 마우스는 이하와 같이 제작했다.
SCID 마우스(일본 CLEA)를 이용해서 생체 내에서 (in vivo) 계대(繼代)한 급성 임파구성 백혈병 유래 CCRF-HSB-2세포(ATCC CCL-120.1)를, 10% 소의 태아혈청(GIBCO-BRL 제)을 함유한 RPMI 1640 배지로 1×108개/㎖가 되도록 조제했다.
미리 전날에 항-아시아로(anti-asialo0 GMI(和光純藥工業 제) 100㎕를 복강내 투여한 SCID 마우스(수컷, 6주령)(일본 CLEA)의 복부피하에, 상기에서 조제한 세포현탁액을 주입했다.
2-2. 항체 투여
종양이식 후 7일 째에 상기 인간 임파구계 종양이식 마우스의 CCRF-HSB-2 이식부위의 종양직경을 캘리퍼를 이용해서 측정하고, 종양체적을 산출한 후, 각 군의 종양체적의 평균이 거의 같게 되도록 무리로 나누기를 행했다(각 군 8마리, 3군). 같은 날 상기 1에서 조제한 1㎎/㎖ 또는 200㎍/㎖의 항HM1.24항체, 또는 1㎎/㎖의대조구마우스 IgG2a 각각 100㎕를 각 군에 복강내 투여했다. 투여는 주 2회, 합계 19회 동일하게 행했다. 이 사이에, 주 2회 캘리퍼를 이용해서 종양직경을 측정하여 종양체적을 산출했다.
2-3. 항HM1.24항체의 인간 임파구계 종양이식 마우스에 대한 항종양효과의 평가
항HM1.24항체의 항종양효과에 대해서는, 종양체적의 변화 및 마우스의 생존기간으로 평가했다. 그 결과, 도 26에 나타낸 바와 같이, 항HM1.24항체 투여군은 대조구마우스 IgG2a 항체투여군에 비해 종양체적의 증가가 억제되었다. 또, 도 27에 나타낸 바와 같이, 항HM1.24항체 투여군은, 대조구 마우스 IgG2a항체 투여군에 비해 마우스의 생존기간의 연장이 보였다. 이들의 결과로부터, 항HM1.24 항체는 인간 임파구계 종양이식 마우스에 대해서 항종양효과를 갖는 것으로 나타났다.
참고예 1
마우스 항HM1.24 모노클로날 항체생산 하이브리도마의 조제
Goto, T. et al., Blood(1994) 84, 1992-1930에 기재된 방법으로, 마우스 항HM1.24 모노클로날 항체생산 하이브리도마를 조제했다.
인간 다발성 골수종환자 골수 유래의 형질세포주 KPC-32(1×107개)(Goto, T., et al., Jpn. J. Clin. Hematol. (1991) 32, 1400)를 BALB/C 마우스 (챨스리바 제)의 복강내로 6마다 2회 주사했다.
이 마우스를 도살하기 3일 전에 마우스의 항체 생산가를 더욱 상승시키기 위하여, 1.5×106개의 KPC-32를 마우스의 비장 내에 주입했다(Goto, T. et al., Tokushima J. Exp. Med. (1990) 37,89). 마우스를 도살한 후에 비장을 적출하고, Groth, de ST.& Schreidegger의 방법(Cancer Research (1981) 41,3465)에 따라 적출한 비장세포와 미에로오마 세포 SP2/O을 세포융합했다.
KPC-32를 사용한 Cell ELISA(Posner, M.R. et al. J. Immunol Methods(1982) 48,23)에 의해 하이브리도마 배양 상징액 중의 항체의 스크리닝을 행했다. 5×104개의 KPC-32를 50㎖의 PBS에 현탁하고, 96웰 플레이트(U저형(低型), Corning, Iwaki 제)에 분주(分注)하여 37℃에서 하룻밤 공기건조시켰다.
1% 소의 혈청알부민(BSA)을 함유하는 PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양상징액을 첨가하고 4℃에서 2시간 배양했다. 이어서, 4℃에서 1시간 퍼옥시다제표지 항마우스 IgG 염소항체(Zymed 제)를 반응시키고, 세정 후 실온에서 30분간 O-페닐렌디아민 기질용액(Sumitomo Bakelite 제)을 반응시켰다.
2N 황산으로 반응을 정지시키고, ELISA reader(Bio-Rad 제)로 492㎚에 있어서 흡광도를 측정했다. 인간 면역 글로불린에 대한 항체를 생산하는 하이브리도마를 제거하기 위하여, 양성 하이브리도마 배양 상징액을 인간 혈청에 미리 흡착시키고, 다른 세포주에 대한 반응성을 ELISA로 스크리닝했다. 양성의 하이브리도마를 선택하고, 여러가지의 세포에 대한 반응성을 플로우 사이토메트리로 조사했다. 최후에 선택된 하이브리도마 클론을 2회 클론화하고, 이것을 프리스탄(pristane) 처리한 (pristane-treated) BALB/C 마우스의 복강에 주사하여, 복수를 취득했다.
모노클로날 항체는, 황산 암모늄에 의한 침전과 프로테인A 친화성 크로마토그라피 키트(Ampure PA, Amersham 제)에 의해 마우스복수로부터 정제했다. 정제항체는, Quick Tag FITC 결합 키트(Boehringer Mannheim 제)를 사용해서 FITC 표지했다.
그 결과, 30개의 하이브리도마 클론을 생산하는 모노클로날항체를 KPC-32 및 RPMI 8226과 반응했다. 클로닝 후, 이들 하이브리도마의 배양 상징액과 다른 세포주 또는 말초혈 단핵구와의 반응성을 검토했다.
이 중, 3개의 클론이 형질세포에 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체이였다. 이들 3개의 클론 중, 가장 플로우 사이토메트리 분석에 유용하고, 또한 RPMI 8226에 대한 CDC 활성을 갖는 하이브리도마 클론을 선택하고, HM1.24로 명명했다. 이 하이브리도마가 생산하는 모노클로날항체의 서브클라스를, 서브클라스 특이적 항마우스 토끼 항체(Zymed 제)를 사용한 ELISA로 결정했다. 항HM1.24항체는 IgG2a κ의 서브클라스를 갖고있다. 항HM1.24항체를 생산하는 하이브리도마 HM1.24는 공업기술원 생명공학공업연구소(이바라기껭 쯔구바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 평성 7년(1995년) 9월 14일에 FERM BP-5233으로 부다페스트 조약에 기초해 국제기탁되었다.
참고예 2
인간형화 항HM1.24항체의 제조
인간형화 항HM1.24항체를 하기의 방법으로 얻었다. 참고예 1에서 제조된 하이브리도마 HM1.24로부터, 통상의 방법에 의해 전(全)RNA를 조제했다. 이것으로부터 마우스 항체V영역을 코드하는 cDNA를 폴리머라제 연쇄반응(PCR)법 및 5'-RACE법에 의해 합성, 증폭했다. 마우스V영역을 코드하는 유전자를 함유하는 DNA 단편을 얻고, 이들의 DNA 단편을 각각 플라스미드 pUC계 클로닝벡터에 연결하고, 대장균 수용성 세포에 도입하여 대장균형질전환체를 얻었다.
이 형질전환체로부터 상기 플라스미드를 얻고, 플라스미드 중의 cDNA 코드영역의 염기서열을 통상의 방법에 따라서 결정하고, 또한 각각의 V영역의 상보성 결정영역(CDR)을 결정했다.
키메라 항HM1.24항체를 발현하는 벡터를 제작하기 위해, 각각 마우스 항HM1.24항체 L쇄 및 H쇄의 V영역을 코드하는 cDNA를 HEF 벡터에 삽입했다. 또, 인간형화 항HM1.24항체를 제조하기 위하여, CDR 이식법에 의해 마우스 항HM1.24항체의 V영역CDR를 인간 항체에 이식했다. 인간 항체의 L쇄로서 인간 항체 REI의 L쇄를 사용하고, 인간 항체 H쇄로서 프레임워크 영역(FR)1-3에 대해서는 인간 항체 HG3의 FR1-3을 사용하고, FR4에 대해서는 인간 항체 JH6의 FR4를 사용했다. CDR를 이식한 항체가 적절한 항원결합부위를 형성하도록 H쇄V영역의 FR의 아미노산을 치환했다.
이와 같이하여 제조한 인간형화 항HM1.24항체의 L쇄 또는 H쇄의 유전자를 포유류세포에서 발현시키기 위하여, HEF 벡터에 각각의 유전자를 따로 따로 도입하고, 인간형화 항HM1.24항체의 L쇄 또는 H쇄를 발현하는 벡터를 제조했다.
이들 2개의 발현벡터를 CHO 세포에 동시에 도입함으로써, 인간형화 항HM1.24항체를 생산하는 세포주를 수립했다. 이 세포주를 배양해서 얻어진 인간형화 항HM1.24항체의 인간양막유래 세포주 WISH으로의 항원결합활성 및 결합저해활성을,Cell ELISA로 검토했다. 그 결과, 인간형화 항HM1.24항체는 키메라항체와 동등의 항원결합활성을 갖고, 또한 비오틴화 마우스 항HM1.24항체를 사용한 결합저해활성에 대해서도, 키메라항체 또는 마우스 항체와 동등한 활성을 가졌다.
또한, 키메라 항HM1.24항체의 L쇄 V영역 및 H쇄 V영역을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균은, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24L-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγl)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 평성 8년(1996년) 8월 29일에 각각 FERM BP-5646 및 FERM BP-5644로서 부다페스트조약에 기초해 국제기탁되었다. 또, 인간형화 항HM1.24항체의 L쇄 V영역 a버젼(서열번호:2) 및 H쇄 V영역 r버젼(서열번호:3)을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균은, 각각 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ) 및 Escherichia coli DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에 평성 8년(1996년) 8월 29일에, 각각 FERM BP-5645 및 FERM BP-5643으로서 부다페스트조약에 기초해 국제기탁되었다. 또, 인간형화 항HM1.24항체의 H 쇄 V영역 s버젼(서열번호:4)을 코드하는 DNA를 함유하는 플라스미드를 갖는 대장균은,Escherichia coliDH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)로서, 공업기술원 생명공학공업기술연구소(이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1반 3고)에, 평성 9년(1997년) 9월 29일에 FERM BP-6127로서 부다페스트조약에 기초해 기탁되었다.
참고예 3. HM1.24항원단백질 cDNA의 클로닝
항HM1.24항체를 특이적으로 인식하는 HM1.24항원 단백질을 코드하는 cDNA를클로닝했다.
Ⅰ. cDNA 라이브러리의 제조
1) 전장 RNA의 조제
인간 다발성 골수종 세포주 KPMM2로부터 전(全)RNA를 Chirgwin 등(Biochemistry, 18, 5294(1979))의 방법에 따라서 조제했다. 즉, 2.2×108개의 KPMM2를 20㎖의 4M 구아니딘 티오시아네이트(Nacalai Tesque Inc. 제)중에서 완전히 균질화시켰다.
균등질(homogenate)을 원심관 중의 5.3M 염화세슘 용액에 중층하고, 이어서 이것을 Beckman SW40 로타(rotor) 중에서 31,000rpm으로 20℃에서 24시간 원심분리하여 RNA를 침전시켰다. RNA침전물을 70% 에타놀로 세정하고, 이어서 1mM EDTA 및 0.5% SDS를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH7.4) 300㎕중에 용해시키고, 여기에 프로나제(pronase)(Boehringer 제)를 0.5㎎/㎖가 되도록 첨가한 후, 37℃에서 30분간 배양했다. 혼합물을 페놀 및 클로로포름으로 추출하고, RNA를 에타놀로 침전시켰다. 이어서, RNA침전물을 1mM EDTA를 함유하는 10mM Tris-HCl(pH 7.4) 200㎕에 용해했다.
2) poly(A)+RNA의 조제
상기한 바와 같이 조제한 전(全)RNA의 약 500㎍을 재료로서 Fast Track 2.0 mRNA Isolation Kit(Invitrogen 제)를 사용해서 키트 첨부의 처방에 따라서 poly(A)+RNA를 정제했다.
3) cDNA 라이브러리의 구축
상기 poly(A)+RNA 10㎍을 재료로서 cDNA합성 키트 TimeSaver cDNA Synthesis Kit(Pharmacia 제)를 사용해서 키트첨부의 처방에 따라서 2본쇄 cDNA를 합성하고, 또한 Directional Cloning Toolbox(Pharmacia 제)를 사용해서 키트부속의 EcoRI어댑터를 키트첨부의 처방에 따라서 연결했다. EcoRI 어댑터의 카이네이션(kination) 및 제한효소 NotI처리는 키트첨부의 처방에 따라서 행했다. 또한, 약 500bp 이상의 크기의 어댑터부가 2본쇄 cDNA를 1.5% 저융점 아가로오스 겔(Sigma 제)을 사용해서 분리, 정제하여, 어댑터부가 2본쇄 cDNA 약 40㎕를 얻었다.
이와 같이하여 제조한 어댑터부가 2본쇄 cDNA를 미리 제한효소 EcoRI, NotⅠ 및 알카리 포스파타제(寶酒造 제) 처리한 pCOSI 벡터(일본 특허출원 평8-255196호 참조)와 T4DNA 리가제(GIBCO-BRL 제)를 사용해서 연결하며, cDNA 라이브러리를 구축했다. 구축한 cDNA 라이브러리는 대장균 세포주 DH5α(GIBCO-BRL 제)에 형질도입되고, 전체의 사이즈는 약 2.5×106개의 독립한 클론인 것으로 추정되었다.
2. 직접발현법에 의한 클로닝
1) COS-7 세포로의 형질감염(transfection)
상기 형질도입한 대장균 약 5×105클론을 50㎍/㎖의 암피실린을 함유하는 2-YT 배지(Molecular cloning: A Laboratory Mannual. Sambrook 등, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989))로 배양해서 cDNA의 증폭을 행하고,알카리법(Molecular Cloning: A Laboratory Mannual. Sambrook 등, Cold Spring Habor Laboratory Press(1989))에 의해 대장균으로부터 플라스미드 DNA를 회수했다. 얻어진 플라스미드 DNA는 Gene Pulser 장치(Bio-Rad 제)를 사용해서 일렉트로포레이션법(electroporation method)에 의해 COS-7 세포에 형질감염했다.
즉, 정제한 플라스미드 DNA 10㎍을 1×107cells/㎖로 PBS 중에 현탁한 COS-7 세포액 0.8㎖에 첨가하고, 1500V, 25㎌D의 용량으로 펄스를 주었다. 실온에서 10분간의 회복기간 후, 일렉트로포레이션 처리된 세포는, 10% 소의 태아혈청(GIBCO-BRL 제)을 함유하는 DMEM 배양액(GIBCO-BRL 제)으로, 37℃, 5% CO2의 조건하에서 3일간 배양했다.
2) 판닝 디쉬(panning dish)의 조제
마우스 항HM1.24항체를 코팅한 판닝 디쉬를 B.Seed 등(Proc. Natl. Acad. Sci. USA,84, 3365-3369(1987)의 방법에 따라서 조제했다. 즉, 마우스 항HM1.24항체를 10㎍/㎖가 되도록 50mM Tris-HCl(pH 9.5)에 첨가했다. 이와 같이하여 제조한 항체용액 3㎖를 직경 60㎜의 세포배양접시에 넣고, 실온에서 2시간 배양했다. 0.15M NaCl용액으로 3회 세정한 후, 5% 소의 태아혈청, 1mM EDTA, 0.02% NAN3를 함유하는 PBS를 첨가하고, 블로킹한 후, 하기 클로닝에 사용했다.
3) cDNA 라이브러리의 클로닝
상기한 바와 같이, 형질감염한 COS-7세포는, 5mM EDTA를 함유하는 PBS로 벗기고, 5% 소의 태아혈청을 함유하는 PBS로 1회 세정한 후, 약 1×106cells/㎖가 되도록 5% 소의 태아혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS에 현탁하고, 상기와 같이 제조한 판닝디쉬에 넣고, 실온에서 약 2시간 배양했다. 5%의 소의 태아혈청 및 0.02% NaN3를 함유하는 PBS로 3회 완만하게 세정한 후, 0.6% SDS 및 10mM EDTA를 함유하는 용액을 사용해서 판닝 디쉬에 적합한 세포로부터 플라스미드 DNA의 회수를 행했다.
회수한 플라스미드 DNA를 다시 대장균 DH5α에 형질도입하고, 상기한 바와 같이 플라스미드 DNA를 증폭시킨 후, 알카리법으로 회수했다. 회수한 플라스미드 DNA를 COS-7 세포에 일렉트로포레이션법에 의해 형질감염시켜 전술한 것과 동일하게 결합한 세포로부터 플라스미드 DNA의 회수를 행했다. 동일한 조작을 또한 1회 반복하여 회수한 플라스미드 DNA를 제한효소 EcoRI 및 NotⅠ로 소화한 결과, 약 0.9kbp의 사이즈의 인서트의 농축이 확인되었다. 또한 회수한 플라스미드 DNA의 일부를 형질도입한 대장균을 50㎍/㎖이 암피실린을 함유하는 2-YT 아가 플레이트에 접종하고, 하룻밤 배양 후, 단일의 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 회수했다. 제한효소 EcoRI 및 NotⅠ로 소화(消化)하고, 인서트의 사이즈가 약 0.9kbp를 나타내는 클론 p3.19를 얻었다.
이 클론에 대해서는, PRISM, Dye Terminater Cycle Sequencing kit(Perkin Elmer 제)를 사용하고, 키트첨부의 처방에 따라서 반응을 행하여, ABI 373A DNA Sequencer(Perkin Elmer 제)로 염기서열의 결정을 행했다. 이 염기서열 및 대응하는 아미노산 서열을 서열번호 1에 나타냈다.
FCM 해석의 결과, 항HM1.24항체는 거의 인간 임파구계 종양유래의 세포와 강하게 반응했다. 이 것은, 임파구계 종양이 많은 것으로, 항HM1.24항체가 인식하는 에피토프를 갖는 폴리펩티드가 강하게 발현하고 있는 것을 나타낸다. 또, 항HM1.24항체와 반응하는 인간 임파구계 종양이식 마우스에 있어서, 항HM1.24항체의 투여에 의해 종양체적의 증가가 억제되고, 또한 생존기간의 연장이 인지되었다. 이들의 것으로부터, 항H1.24항체 또는 항HM1.24항체가 인식하는 에피토프를 갖는 폴리펩티드를 인식하는 항체는 많은 임파구계 종양에 대해서 세포장해활성을 나타내고, 그 결과 임파구계 종양환자의 치료에 대해 대단히 유용한 것이 시준된다.
특허협력조약 제13규칙의 2의 기탁된 미생물의 언급 및 기탁기관
기탁기관 명 칭 : 공업기술원 생명공학공업기술연구소
주 소 : 일본국 이바라기껭 쯔꾸바시 히가시 1쪼메 1-3
미생물(1) 명 칭 : Escherichia coli DH5α (pRS38-pUC19)
기탁번호 : FERM BP-4434
기탁일 : 1993년 10월 5일
(2) 명 칭 : 하이브리도마HM1.24
기탁번호 : FERM BP-5233
기탁일 : 1995년 9월 14일
(3) 명 칭 : Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHr-AHM-gγ1)
기탁번호 : FERM BP-5643
기탁일 : 1996년 8월 29일
(4) 명 칭 : Escherichia coli DH5α(pUC19-1.24H-gγ1)
기탁번호 : FERM BP-5644
기탁일 : 1996년 8월 29일
(5) 명 칭 : Escherichia coli DH5α (pUC19-RVLa-AHN-gκ)
기탁번호 : FERM BP-5645
기탁일 : 1996년 8월 29일
(6) 명 칭 : Escherichia coli DH5α (pUC19-1.24L-gκ)
기탁번호 : FERM BP-5646
기탁일 : 1996년 8월 29일
(7) 명 칭 : Escherichia coli DH5α (pUC19-RVHs-AHM-gγ1)
기탁번호 : FERM BP-6127
기탁일 : 1997년 9월 29일
Claims (3)
- 서열번호 1로 나타낸 아미노산 서열을 갖는 단백질에 특이적으로 결합하고, 또한 세포장해활성을 갖는 항체.
- 제1항에 있어서, 세포장해활성이 ADCC활성인 항체.
- 제1항에 있어서, 세포장해활성이 CDC활성인 항체.
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