JPWO2006046751A1 - 糖鎖改変抗グリピカン3抗体 - Google Patents
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Abstract
Description
GPC3に結合するある種の抗体が、ADCC(抗体依存性細胞障害)活性およびCDC(補体依存性細胞障害)活性により細胞増殖抑制作用を有することが見いだされている(WO2003/000883)。また、GPC3が生体内で切断されて可溶型GPC3として血中に分泌され、これを検出しうる抗体を用いて癌の診断が可能であることが示唆されている(WO2004/022739、WO2003/100429、WO2004/018667)。
抗体の細胞傷害活性を利用した抗癌剤を開発する場合、用いられる抗体は高いADCC活性を有していることが好ましい為、GPC3を認識する抗体においても高い細胞傷害活性を有する抗GPC3抗体が望まれていた。
抗体のADCC活性を増強する方法としては、抗体の糖鎖を改変する方法が知られている。例えば、WO 99/54342には、抗体のグリコシル化を修飾することによりADCC活性を改良することが記載されている。また、WO 00/61739には、抗体の糖鎖におけるフコースの存否によりADCC活性を調節することが記載されている。WO 02/31140には、YB2/0細胞において抗体を産生せしめることにより、α−1,6コアーフコースを含まない糖鎖を有する抗体を調製することが記載されている。WO 02/79255には、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体が記載されている。しかしながら、糖鎖の修飾によってADCC活性が増強された抗グリピカン3抗体は知られていない。
従って、本発明は糖鎖組成の変化によってADCC活性が増強された抗グリピカン3抗体組成物およびその製造方法を提供しようとするものである。
本発明はまた、上記の糖鎖が修飾された抗体の製造方法において、YB2/0細胞などのフコース付加能が低下した宿主細胞に抗グリピカン3抗体をコードする核酸を導入し、該宿主細胞を培養することにより当該抗体を取得することを特徴とする、抗グリピカン3抗体組成物の製造方法を提供する。好ましくは、糖鎖へのフコース付加能が減少した細胞はフコーストランスポーター欠損細胞である。
図2は、各キメラ抗体の、ヒトPBMCを用いHepG2を標的細胞とした場合のADCC活性を示す。
図3は、各キメラ抗体の、ヒトPBMCを用いHuH7を標的細胞とした場合のADCC活性を示す。
図4は、各抗体の、ヒトPBMCを用いHuH−7を標的細胞とした場合のADCC活性を示す。
図5は、FT−KO細胞産生抗体(a,b,c)およびCHO細胞産生の抗体から調製したアガラクトシル2−AB化糖鎖の順相HPLCクロマトグラムを示す。
図6は、図5で示したピークG(0)およびG(0)−Fucの推定構造を示す。
図7は、FT−KO細胞産生抗体(a)およびCHO細胞産生の抗体(b)についてDSC(示差走査熱量計)測定チャートを示す。
発明の詳細な説明
本発明は、糖鎖組成が変化した抗グリピカン3抗体組成物を特徴とする。抗体の細胞障害活性の発現には、抗体に結合した糖鎖の構造が大きな影響を及ぼすことが知られている。抗体に結合する糖鎖には、抗体分子のアスパラギンの側鎖のN原子に結合するN−グリコシド結合糖鎖と、抗体分子のセリンまたはスレオニンの側鎖ヒドロキシル基に結合するO−グリコシル結合糖鎖があり、本発明においてフコースの存否が問題となるのはN−グリコシド結合糖鎖である。
抗体に結合するN−グリコシド結合糖鎖の基本構造を図1に示す。N−グリコシル結合糖鎖は図1のIgG基本糖鎖(1)および(3)に示すごとく、1個のマンノース(Man)と2個のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)がβ1,4結合で結合した基本構造(コア)「−Manβ1−4GlcNACβ1−4GlcNAc−」を有し、この構造の右のGlcNAcを還元末端と称し、左側のManを非還元末端と称する。フコース(Fuc)が結合している場合、これは主として、還元末端のN−アセチルグルコサミンの6位とフコースの1位とがα結合している。他方、図1のIgG基本糖鎖(2)に示す糖鎖においては、基本構造(コアー)の非還元末端に、前記2個の糖鎖のほかに、1個のN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)がβ1,4結合により結合している。このN−アセチルグルコサミン(GlcNAc)が、「バイセクテングN−アセチルグルコサミン」である。バイセクティングN−アセチルグルコサミンを有する糖鎖は、O−グリコシル結合糖鎖またはN−グリコシル結合糖鎖であり、N−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼIII(GnTIII)により、N−アセチルグルコサミンを糖鎖に転移させることにより形成される。この酵素をコードする遺伝子は既にクローニングされており、そのアミノ酸配列およびそれをコードするDNAの塩基配列は記載されている(NCBIデーターベース(ACCESSION D13789))。
本発明において、糖鎖組成が変化した抗体組成物(糖鎖改変抗体組成物)とは、基準となる宿主細胞で産生される抗体組成物とは異なる糖鎖組成を有する抗体組成物のことをいう。
本発明において、糖鎖組成が変化したか否かは、基準となる宿主細胞で産生される抗体組成物を基準として判断することができる。基準となる抗体組成物と異なる糖鎖組成を有する抗体組成物の場合、その抗体組成物は糖鎖組成が変化した抗体組成物となる。
本発明において基準となる宿主細胞はCHO DG44である。CHO DG44は、例えばインビトロジェン社から入手することが可能である。
糖鎖組成が変化した抗体組成物の例としては 抗体組成物中のフコース(例えば、α−1,6コアーフコース(α−1,6core fucose)欠損抗体の割合が増加した抗体組成物や、抗体組成物中のバイセクティング(bisecting)N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)付加抗体の割合が増加した抗体組成物などを挙げることができる。
本発明の好ましい態様としては、フコース欠損抗体の割合が、基準となる抗体組成物と比較して高い抗体組成物を挙げることができる。
なお、抗体には複数のN−グリコシル糖鎖を有することもあるので、本発明のフコース欠損抗体には、フコースが全く付加していない抗体だけでなく、付加しているフコースの数が減少している抗体(少なくとも1つ以上の糖鎖においてフコースが付加されていない抗体)なども含まれる。
宿主細胞で糖鎖改変抗体を製造する場合、全て同一の糖鎖を有する均一な抗体を含有する組成物を得ることは困難なことが多い。従って、例えば、糖鎖組成が変化した抗体組成物がフコース欠損抗体の割合が増加した抗体組成物である場合、本発明の糖鎖組成が変化した抗体組成物にはフコースが欠損した抗体とフコース欠損していない抗体の両方が含まれることがあるが、フコースが欠損した抗体の割合が、基準となる宿主細胞で作製された抗体組成物よりも高い。本発明のフコース欠損抗体の割合が高い抗体組成物において、フコース欠損割合は特に限定されないが好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは90%以上である。
また、本発明のバイセクティングN−アセチルグルコサミン付加抗体の割合が高い抗体組成物において、バイセクティングN−アセチルグルコサミン付加抗体の割合は特に限定されないが、好ましくは20%以上、より好ましくは50%以上、さらに好ましくは90%以上である。
本発明の糖鎖組成が変化した抗グリピカン3抗体組成物は、当業者に公知の方法により得ることが可能である。
例えば、フコース欠損抗体は、α−1,6コアーフコース(α−1,6core fucose)を付加する能力を有しないかまたはその能力が低い宿主細胞中で抗グリピカン3抗体を発現させることにより製造することができる。
フコースを付加する能力を有しないまたはその能力が低い宿主細胞は特に限定されないが、例としては、フコース転移活性が欠損または低くなっている宿主細胞、ゴルジ体内のフコース濃度が低くなっている宿主細胞、などを挙げることができる。より具体的には、ラットミエローマYB2/3HL.P2.G11.16Ag.20細胞(YB2/0細胞と略される)(ATCC CRL1662として保存されている)、FTVIIIノックアウトCHO細胞(WO 02/31140)、Lec13細胞(WO03/035835)、フコーストランスポーター欠損細胞(WO 2005/017155)などを挙げることができる。
フコーストランスポーター欠損細胞とは、フコーストランスポーターの存在量が正常細胞より少ないか、またはフコーストランスポーターの構造に変異を有することにより、フコーストランスポーターの機能が低下している細胞である。フコーストランスポーター欠損細胞としては、例えば、フコーストランスポーター遺伝子がノックアウトされている細胞(以下、「FT−KO細胞」と呼ぶ。)、フコーストランスポーター遺伝子の一部が欠損または変異している細胞、フコーストランスポーター遺伝子の発現系に欠陥を有する細胞などが挙げられる。チャイニーズハムスターのフコーストランスポーターをコードする遺伝子の塩基配列およびフコーストランスポーターのアミノ酸配列をそれぞれ配列番号126および127に示す。
また、配列番号126に示す塩基配列を利用して、RNAi干渉(RNAinterference:RNAi)を用いても本発明のフコーストランスポーター欠損細胞を取得することができる。RNAiは二本鎖RNA(dsRNA)を細胞内に導入した際に、そのRNA配列に対応する細胞内のmRNAが特異的に分解され、タンパク質として発現されなくなる現象をいう。RNAiの場合、通常、二本鎖RNAが用いられるが、特に限定されず、例えば、自己相補的な一本鎖RNA中で形成される二本鎖を用いることも可能である。二本鎖を形成する領域は、全ての領域において二本鎖を形成していてもよいし、一部の領域(例えば両末端又は片方の末端)が一本鎖になっていてもよい。RNAiに用いられるオリゴRNAは、その長さは限定されない。本発明のオリゴRNAの長さとしては、例えば、5〜1000塩基(二本鎖の場合には5〜1000bp)であり、好ましくは10〜100塩基(二本鎖の場合には10〜100bp)であり、さらに好ましくは15〜25塩基(二本鎖の場合には15〜25bp)であり、特に好ましくは19〜23塩基(二本鎖の場合には19〜23bp)である。
上述のようにRNAi法は、ある遺伝子と相同な、センスRNAとアンチセンスRNAからなる二本鎖RNA(double−strand RNA;dsRNA)が、その遺伝子の転写産物(mRNA)の相同部分を破壊する、という現象を利用した方法である。用いるフコーストランスポーター遺伝子の全長配列に対応する二本鎖RNAを用いてもよいし、一部の配列に対応する短い(例えば、21〜23bpの)dsRNA(small interfering RNA;siRNA)を用いてもよい。該二本鎖RNAは、直接細胞に取り込ませてもよいし、二本鎖RNAを産生するベクターを作製し、宿主細胞に導入して細胞内で二本鎖RNAを産生させてもよい。例えば、本発明のフコーストランスポーターをコードするDNAの全部又は一部を逆向きの反復配列となるようにベクターに組み込み、該ベクターを宿主細胞に導入すればよい。RNAi法は、Fire A.et al.,Nature(1998),391,806−811、Montgoinery M.K.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998),95,15502−15507、Timmons L.etal.,Nature(1998),395,854、S▲a▼nchez A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96,5049−5054、Misquitta L.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96,1451−1456、Kennerdell J.R.et al.,Cell(1998),95,1017−1026、Waterhouse P.M.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1998),95,13959−13964、Wianny F.et all.,Nature Cell Biol.(2000),2,70−75等の記載に従って行うことができる。
RNAi法等により取得されるフコーストランスポーター欠損細胞のスクリーニングはフコーストランスポーターの活性を指標に行ってもよいし、ウエスタンブロッティングやノーザンブロッティングによるフコーストランスポーター遺伝子の転写、発現を指標にして行うこともできる。
また、糖鎖にバイセクティング(bisecting)N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)が付加した抗体は、糖鎖にバイセクティング(bisecting)N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)構造を形成する能力を有する宿主細胞中で抗グリピカン3抗体を発現させることにより製造することができる。
バイセクティングN−アセチルグルコサミンが付加した糖鎖を有する抗体の製造方法は既に公知である(WO 02/79255)。糖鎖にバイセクティング(bisecting)N−アセチルグルコサミン(GlcNAc)構造を形成する能力を有する宿主細胞は特に限定されず、例えば、GnTIIIをコードするDNAを含んでなる発現ベクターを有する宿主細胞を用いることが可能である。従って、GnTIIIをコードするDNAを含んでなる発現ベクターおよび抗グリピカン3抗体をコードする発現ベクターを有する宿主細胞を用いて、バイセクティングN−アセチルグルコサミンが付加した糖鎖を有する抗グリピカン3抗体を製造することができる。GnTIIIをコードするDNAと抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子は同一のベクター上に存在してもよいし、異なるベクター上に存在してもよい。
また、抗体組成物中のフコース欠損抗体またはバイセクティングN−アセチルグルコサミン付加抗体の割合を増加される他の方法として、フコース欠損抗体またはバイセクティングN−アセチルグルコサミン付加抗体を精製することにより組成物中のそれらの抗体の割合を増加させる方法を挙げることができる。
糖鎖の解析は当業者に公知の方法で行うことができる。例えば、抗体にN−Glycosidase F(Roche)等を作用させ、糖鎖を抗体から遊離させる。その後、セルロースカートリッジを用いた固相抽出(Shimizu Y.et al.,Carbohydrate Research 332(2001),381−388)による脱塩後に濃縮乾固し、2−アミノピリジンによる蛍光標識を行う(Kondo A.et al.,Agricultural and Biological Chemistry54:8(1990),2169−2170)。得られたPA化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製PA化糖鎖とする。その後、ODSカラムによる逆相HPLC分析を行うことにより測定することが可能である。また、PA化糖鎖の調製を行った後、ODSカラムによる逆相HPLC分析およびアミンカラムによる順相HPLC分析を組み合わせた、二次元マッピングを実施することにより行うことも可能である。
本発明において糖鎖が改変される抗グリピカン3抗体は、グリピカン3に結合する抗体であれば特に限定されない。グリピカン3への結合は特異的であることが好ましい。本発明において好ましい抗グリピカン3抗体としては、以下の表1に示されるCDR配列を有する抗体を挙げることができる。
本発明の1つの好ましい態様においては、本発明の糖鎖組成が変化した抗体組成物はADCC活性が増強していることを特徴とする。本発明においてADCC活性が増強しているか否かは、基準となる抗体組成物と比較して、該基準よりも高いADCC活性を示す場合にはADCC活性が増強されていると判断される。
ADCC活性の測定は当業者に公知の方法により行うことが可能であり、例えば、エフェクター細胞、標的細胞および抗グリピカン3抗体を混合し、ADCCの程度を調べることにより測定することができる。より具体的には、例えば、エフェクター細胞としてマウス脾細胞やヒト末梢血や骨髄から分離した単核球等を利用し、標的細胞としてはヒト肝細胞株HuH−7等のグリピカン3を発現するヒト株化細胞を用いる。標的細胞をあらかじめ51Crにより標識し、これに抗グリピカン3抗体を加えインキュベーションを行い、その後、標的細胞に対し適切な比のエフェクター細胞を加えインキュベーションを行う。インキュベーション後上清を採取し、上清中の放射活性をカウントすることによりADCC活性を測定することができる。
抗グリピカン3抗体
抗グリピカン3抗体の作製は当業者に公知の方法により行うことが可能である。すなわち、グリピカン3を感作抗原として使用して、これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、得られる免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させ、通常のスクリーニング法により、モノクローナルな抗体産生細胞をスクリーニングすることによって作製できる。具体的には、モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。まず、抗体取得の感作抗原として使用されるヒトグリピカン3を、Lage,H.et al.,Gene 188(1997),151−156に開示されたグリピカン3(MXR7)遺伝子/アミノ酸配例を発現することによって得る。すなわち、グリピカン3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトグリピカン3タンパク質を公知の方法で精製する。次に、この精製グリピカン3タンパク質を感作抗原として用いる。あるいは、グリピカン3の部分ペプチドを感作抗原として使用することもできる。この際、部分ペプチドはヒトグリピカン3のアミノ酸配列より化学合成により得ることができる。抗グリピカン3抗体がADCCの作用、CDCによる作用、増殖因子活性の阻害により細胞増殖抑制活性を阻害することから、また抗グリピカン3抗体に放射性同位元素、化学療法剤、細菌由来トキシン等の細胞傷害性物質を結合させることにより、細胞増殖を抑制し得ることから、本発明の抗グリピカン3抗体の認識するグリピカン3分子上のエピトープは特定のものに限定されず、グリピカン3分子上に存在するエピトープならばどのエピトープを認識してもよい。従って、本発明の抗グリピカン3抗体を作製するための抗原は、グリピカン3分子上に存在するエピトープを含む断片ならば、如何なる断片も用いることが可能である。
特に好ましい態様において、グリピカン3のアミノ酸番号524−563のエピトープを認識する抗体を取得する場合には、感作抗原としてアミノ酸番号524−563を含むペプチドを用いることができる。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、特に限定されるものではないが、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、一般的にはげっ歯類の動物、例えば、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギ、サル等が使用される。感作抗原を動物に免疫するには、公知の方法にしたがって行われる。例えば、一般的方法として、感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することにより行われる。具体的には、感作抗原をPBS(Phosphate−Buffered Saline)や生理食塩水等で適当量に希釈、懸濁したものに所望により通常のアジュバント、例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、乳化後、哺乳動物に4−21日毎に数回投与する。また、感作抗原免疫時に適当な担体を使用することもできる。
このように哺乳動物を免疫し、血清中に所望の抗体レベルが上昇するのを確認した後に、哺乳動物から免疫細胞を採取し、細胞融合に付されるが、好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が挙げられる。前記免疫細胞と融合される他方の親細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞を用いる。このミエローマ細胞は、公知の種々の細胞株、例えば、P3(P3x63Ag8.653)(J.Immnol.(1979)123,1548−1550)、P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1−7)、NS−1(Kohler.G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511−519)、MPC−11(Margulies.D.H.et al.,Cell(1976)8,405−415)、SP2/0(Shulman,M.et al.,Nature(1978)276,269−270)、FO(de St.Groth,S.F.et al.,J.Immunol.Methods(1980)35,1−21)、S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313−323)、R210(Galfre,G.et al.,Nature(1979)277,131−133)等が好適に使用される。前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法(Kohler.G.and Milstein,C.、Methods Enzymol.(1981)73,3−46)等に準じて行うことができる。より具体的には、前記細胞融合は、例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄養培養液中で実施される。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール(PEG)、センダイウィルス(HVJ)等が使用され、更に所望により融合効率を高めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加使用することもできる。免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1−10倍とするのが好ましい。前記細胞融合に用いる培養液としては、例えば、前記ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液が使用可能であり、さらに、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。細胞融合は、前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液(例えば平均分子量1000−6000程度)を通常30−60%(w/v)の濃度で添加し、混合することによって目的とする融合細胞(ハイブリドーマ)を形成する。続いて、適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等を除去する。このようにして得られたハイブリドーマは、通常の選択培養液、例えばHAT培養液(ヒポキサンチン、アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液)で培養することにより選択される。上記HAT培養液での培養は、目的とするハイブリドーマ以外の細胞(非融合細胞)が死滅するのに十分な時間(通常、数日〜数週間)継続する。ついで、通常の限界希釈法を実施し、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニングおよび単一クローニングを行う。また、ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリドーマを得る他に、ヒトリンパ球をin vitroでグリピカン3に感作し、感作リンパ球をヒト由来の永久分裂能を有するミエローマ細胞と融合させ、グリピカン3への結合活性を有する所望のヒト抗体を得ることもできる(特公平1−59878号公報参照)。さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に抗原となるグリピカン3を投与して抗グリピカン3抗体産生細胞を取得し、これを不死化させた細胞からグリピカン3に対するヒト抗体を取得してもよい(国際特許出願公開番号WO 94/25585号公報、WO 93/12227号公報、WO 92/03918号公報、WO 94/02602号公報参照)。このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することが可能であり、また、液体窒素中で長期保存することが可能である。
組換え型抗体
本発明では、モノクローナル抗体として、抗体遺伝子をハイブリドーマからクローニングし、適当なベクターに組み込んで、これを宿主に導入し、遺伝子組換え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いる(例えば、Vandamme,A.M.et al.,Eur.J.Biochem.(1990)192,767−775,1990参照)。具体的には、抗グリピカン3抗体を産生するハイブリドーマから、抗グリピカン3抗体の可変(V)領域をコードするmRNAを単離する。mRNAの単離は、公知の方法、例えば、グアニジン超遠心法(Chirgwin,J.M.et al.,Biochemistry(1979)18,5294−5299)、AGPC法(Chomczynski,P.et al.,Anal.Biochem.(1987)162,156−159)等により行って全RNAを調製し、mRNA Purification Kit(Pharmacia製)等を使用して目的のmRNAを調製する。また、QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia製)を用いることによりmRNAを直接調製することもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域のcDNAを合成する。cDNAの合成は、AMV Reverse Transcriptase First−strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社製)等を用いて行う。また、cDNAの合成および増幅を行うには、5’−Ampli FINDER RACE Kit(Clonteeh製)およびPCRを用いた5’−RACE法(Frohman,M.A.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998−9002、Belyavsky,A.et al.,Nucleic Acids Res.(1989)17,2919−2932)等を使用することができる。得られたPCR産物から目的とするDNA断片を精製し、ベクターDNAと連結する。さらに、これより組換えベクターを作製し、大腸菌等に導入してコロニーを選択して所望の組換えベクターを調製する。そして、目的とするDNAの塩基配列を公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認する。目的とする抗グリピカン3抗体のV領域をコードするDNAを得たのち、これを、所望の抗体定常領域(C領域)をコードするDNAを含有する発現ベクターへ組み込む。本発明で使用される抗グリピカン3抗体を製造するには、抗体遺伝子を発現制御領域、例えば、エンハンサー、プロモーターの制御のもとで発現するよう発現ベクターに組み込む。次に、この発現ベクターにより、宿主細胞を形質転換し、抗体を発現させる。抗体遺伝子の発現は、抗体重鎖(H鎖)または軽鎖(L鎖)をコードするDNAを別々に発現ベクターに組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、あるいはH鎖およびL鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい(WO 94/11523号公報参照)。また、組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、トランスジェニック動物を使用することができる。例えば、抗体遺伝子を、乳汁中に固有に産生される蛋白質(ヤギβカゼインなど)をコードする遺伝子の途中に挿入して融合遺伝子として調製する。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片をヤギの胚へ注入し、この胚を雌のヤギへ導入する。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、適宜ホルモンをトランスジェニックヤギに使用してもよい(Ebert,K.M.et al.,Bio/Technology(1994)12,699−702)。
改変抗体
本発明では、上記抗体のほかに、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、例えば、キメラ抗体、ヒト型化(Humanized)抗体を使用できる。これらの改変抗体は、既知の方法を用いて製造することができる。キメラ抗体は、前記のようにして得た抗体V領域をコードするDNAをヒト抗体C領域をコードするDNAと連結し、これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入し産生させることにより得られる。この既知の方法を用いて、本発明に有用なキメラ抗体を得ることができる。ヒト型化抗体は、再構成(reshaped)ヒト抗体とも称され、これは、ヒト以外の哺乳動物、例えばマウス抗体の相補性決定領域(CDR;complementarity determining region)をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、その一般的な遺伝子組換え手法も知られている(欧州特許出願公開番号EP 125023号公報、WO 96/02576号公報参照)。具体的には、マウス抗体のCDRとヒト抗体のフレームワーク領域(framework region;FR)とを連結するように設計したDNA配列を、CDRおよびFR両方の末端領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いてPCR法により合成する(WO98/13388号公報に記載の方法を参照)。CDRを介して連結されるヒト抗体のフレームワーク領域は、相補性決定領域が良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。必要に応じ、再構成ヒト抗体の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、抗体の可変領域におけるフレームワーク領域のアミノ酸を置換してもよい(Sato,K.et al.,Cancer Res.(1993)53,851−856)。キメラ抗体およびヒト型化抗体のC領域には、ヒト抗体のものが使用され、例えばH鎖では、Cγ1、Cγ2、Cγ3、Cγ4を、L鎖ではCκ、Cλを使用することができる。また、抗体またはその産生の安定性を改善するために、ヒト抗体C領域を修飾してもよい。キメラ抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とからなる。一方、ヒト型化抗体は、ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決定領域と、ヒト抗体由来のフレームワーク領或およびC領域とからなる。ヒト型化抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
抗体修飾物
本発明で使用される抗体は、抗体の全体分子に限られずグリピカン3に結合し、グリピカン3の活性を阻害する限り、抗体の断片またはその修飾物であってもよく、二価抗体も一価抗体も含まれる。例えば、抗体の断片としては、Fab、F(ab’)2、Fv、1個のFabと完全なFcを有するFab/c、またはH鎖若しくはL鎖のFvを適当なリンカーで連結させたシングルチェインFv(scFv)が挙げられる。具体的には、抗体を酵素、例えばパパイン、ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、または、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させる(例えば、Co,M.S.et al.,J.Immunol.(1994)152,2968−2976、Better,M.& Horwitz,A.H.Methods in Enzymology(1989)178,476−496,Academic Press,Inc.、Plueckthun,A.& Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,476−496,Academic Press,Inc.、Lamoyi,E.,Methods in Enzymology(1989)121,652−663、Rousseaux,J.et al.,Methods in Enzymology(1989)121,663−669、Bird,R.E.et al.,TIBTECH(1991)9,132−137参照)。scFvは、抗体のH鎖V領域とL鎖V領域とを連結することにより得られる。このscFvにおいて、H鎖V領域とL鎖V領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される(Huston,J.S.et al.、Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879−5883)。scFvにおけるH鎖V領域およびL鎖V領域は、本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。V領域を連結するペプチドリンカーとしては、例えばアミノ酸12−19残基からなる任意の一本鎖ペプチドが用いられる。scFvをコードするDNAは、前記抗体のH鎖またはH鎖V領域をコードするDNA、およびL鎖またはL鎖V領域をコードするDNAのうち、それらの配列のうちの全部または所望のアミノ酸配列をコードするDNA部分を鋳型とし、その両端を規定するプライマー対を用いてPCR法により増幅し、次いで、さらにペプチドリンカー部分をコードするDNA、およびその両端が各々H鎖、L鎖と連結されるように規定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。また、一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、および該発現ベクターにより形質転換された宿主を常法に従って得ることができ、また、その宿主を用いることにより、常法に従ってscFvを得ることができる。これら抗体の断片は、前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、宿主により産生させることができる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体の断片も包含される。抗体の修飾物として、ポリエチレングリコール(PEG)等の各種分子と結合した抗グリピカン抗体を使用することもできる。本発明における「抗体」にはこれらの抗体修飾物も包含される。このような抗体修飾物は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
さらに、本発明で使用される抗体は、二重特異性抗体(bispecific antibody)であってもよい。二重特異性抗体はグリピカン3分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、一方の抗原結合部位がグリピカン3を認識し、他方の抗原結合部位が化学療法剤、細胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。この場合、グリピカン3を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を与え、腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。二重特異性抗体は2種類の抗体のHL対を結合させて作製することもできるし、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、得ることもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製することも可能である。
組換え型抗体または改変抗体の発現および産生
前記のように構築した抗体遺伝子は、公知の方法により発現させ、取得することができる。哺乳類細胞の場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター/エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウィルス前期プロモーター/エンハンサー(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)を挙げることができる。また、その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーター/エンハンサーとして、レトロウィルス、ポリオーマウィルス、アデノウィルス、シミアンウィルス40(SV40)等のウィルスプロモーター/エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α(HEF1α)などの哺乳類細胞由来のプロモーター/エンハンサー等が挙げられる。SV40プロモーター/エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法(Nature(1979)277,108)により、また、HEF1αプロモーター/エンハンサーを使用する場合はMizushimaらの方法(Nucleic Acids Res.(1990)18,5322)により、容易に遺伝子発現を行うことができる。
本発明で使用される抗体の製造のためには、発現された抗体に糖鎖を付加する機能を有する任意の真核細胞発現系を使用することができる。真核細胞としては、例えば樹立された哺乳類細胞系、昆虫細胞系、真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げられる。
好ましくは、本発明で使用される抗体は、哺乳類細胞、例えばCHO、COS、ミエローマ、BHK、Vero、HeLa細胞中で発現される。次に、形質転換された宿主細胞をin vitroまたはin vivoで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清(FCS)等の血清補液を併用することもできる。
抗体の分離、精製
前記のように発現、産生された抗体は、細胞、宿主動物から分離し均一にまで精製することができる。本発明で使用される抗体の分離、精製はアフィニティーカラムを用いて行うことができる。例えば、プロテインAカラムを用いたカラムとして、Hyper D、POROS、Sepharose F.F.(Pharmacia製)等が挙げられる。その他、通常のタンパク質で使用されている分離、精製方法を使用すればよく、何ら限定されるものではない。例えば、上記アフィニティーカラム以外のクロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)。レクチンカラムを用いた所望の糖鎖を有する抗体の分離は当業者に公知の方法により行うことができ、例えばWO02/30954に記載の方法で行うことができる。
抗体の活性の確認
本発明で使用される抗体の抗原結合活性(Antibodies A Laboratory Manual.Ed Harlow,David Lane,Cold Spring Harbor Laboratory,1988)、リガンドレセプター結合阻害活性(Harada,A.et al.,International Immunology(1993)5,681−690)の測定には公知の手段を使用することができる。本発明で使用される抗グリピカン3抗体の抗原結合活性を測定する方法として、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光抗体法を用いることができる。例えば、酵素免疫測定法を用いる場合、グリピカン3をコーティングしたプレートに、抗グリピカン3抗体を含む試料、例えば、抗グリピカン3抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、プレートをインキュベートし、洗浄した後、p−ニトロフェニル燐酸などの酵素基質を加えて吸光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。
医薬組成物
本発明は、本発明の糖鎖組成が変化したグリピカン3抗体組成物を含む医薬組成物を提供する。
本発明の抗体組成物を含有する医薬組成物は癌などの細胞増殖に関連する疾患の治療および/または予防に有用であり、特に肝癌の治療および/または予防に有用である。本発明の抗体を医薬組成物として用いる場合には、当業者に公知の方法で製剤化することが可能である。例えば、水もしくはそれ以外の薬学的に許容し得る液との無菌性溶液、または懸濁液剤の注射剤の形で非経口的に使用できる。例えば、薬理学上許容される担体もしくは媒体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、乳化剤、懸濁剤、界面活性刑、安定剤、香味剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤などと適宜組み合わせて、一般に認められた製薬実施に要求される単位用量形態で混和することによって製剤化することが考えられる。これら製剤における有効成分量は指示された範囲の適当な容量が得られるようにするものである。
注射のための無菌組成物は注射用蒸留水のようなベヒクルを用いて通常の製剤実施に従って処方することができる。
注射用の水溶液としては、例えば生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液、例えばD−ソルビトール、D−マンノース、D−マンニトール、塩化ナトリウムが挙げられ、適当な溶解補助剤、例えばアルコール、具体的にはエタノール、ポリアルコール、例えばプロピレングリコール、ポリエチレングリコール、非イオン性界面活性剤、例えばポリソルベート80(TM)、HCO−50と併用してもよい。
油性液としてはゴマ油、大豆油があげられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコールと併用してもよい。また、緩衝剤、例えばリン酸塩緩衝液、酢酸ナトリウム緩衝液、無痛化剤、例えば、塩酸プロカイン、安定剤、例えばベンジルアルコール、フェノール、酸化防止剤と配合してもよい。調製された注射液は通常、適当なアンプルに充填させる。
投与は好ましくは非経口投与であり、具体的には、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などが挙げられる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。抗体または抗体をコードするポリヌクレオチドを含有する医薬組成物の投与量としては、例えば、一回につき体重1kgあたり0.0001mgから1000mgの範囲で選ぶことが可能である。あるいは、例えば、患者あたり0.001〜100000mg/bodyの範囲で投与量を選ぶことができるが、これらの数値に必ずしも制限されるものではない。投与量、投与方法は、患者の体重や年齢、症状などにより変動するが、当業者であれば適宜選択することが可能である。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。また,本出願が有する優先権主張の基礎となる出願である日本特許出願2004−311356号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用する。
実施例1
マウス抗ヒトグリピカン3抗体の作製
抗GPC3抗体作製のための免疫タンパク質として、C末端側の疎水性領域(564−580アミノ酸)を欠損させた可溶型GPC3タンパク質を作製し、これを用いて免疫を行った。自己免疫疾患マウスであるMRL/MpJUmmCrj−lpr/lprマウス(以下、MRL/lprマウス、日本チャールズ・リバーより購入)を免疫動物として用いた。7週齢、もしくは8週齢より免疫を開始し、初回免疫には可溶型GPC3を100μg/headとなるように調製し、フロイント完全アジュバント(FCA、ベクトンディッキンソン社)を月いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。5回免疫の後、最終免疫として50μg/headとなるようにPBSに希釈し尾静脈内に投与した。最終免疫の4日後、脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3−X63Ag8U1(P3U1、ATCCより購入)と2:1になるように混合し、PEG1500(ロシュ・ダイアグノスティック社)を徐々に加える事により細胞融合を行った。スクリーニングは可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたELISAにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、GPC3に対して強い結合活性を有する抗体を11クローン(M3C11、M13B3、M1E7、M3B8、M11F1、L9G11、M19B11、M6B1、M18D4、M5B9、M10D2)取得した。
得られた抗GPC3抗体のうち、特にM11F1、M3B8が強いCDC活性を示したことから、M11F1、M3B8のエピトープを含むGST融合タンパク質である、グリピカン3の524番目のAlaから563番目のLysまでのペプチドとGSTの融合タンパク質(GC−3)を免疫原として、Balb/c(日本チャールズリバーより購入)3匹、MRL/lpr3匹に対して免疫を行った。初回免疫にはGC−3を100μg/headとなるように調製し、FCAを用いてエマルジョン化したものを皮下に投与した。2週間後に50μg/headとなるように調製したものをFIAでエマルジョン化したものを皮下に投与した。5回免疫の後、全マウスに対し最終免疫(50μg/head)を尾静脈内に行い細胞融合を行った。スクリーニングは、C末端側の疎水性領域(564−580アミノ酸)を欠損させた可溶型GPC3コアタンパク質を固相化したイムノプレートを用いたELISAにより行った。陽性クローンについては限界希釈法によりモノクローン化した。その結果、GPC3に対して強い結合活性を有する抗体を5クローン(GC199、GC202、GC33、GC179、GC194)取得した。
このようにして得られた抗体のH鎖、L鎖の可変領域を定法によりクローニングし、配列を決定した。さらに、既知の抗体のアミノ酸配列のデータベースと比較して相同性を調べることにより、CDR領域を決定した。CDR領域の配列は表1および2に示される。
実施例2
抗GPC3抗体マウス−ヒトキメラ抗体の作製
抗GPC3抗体GC33のH鎖およびL鎖可変領域配列をヒトIgG1およびκ鎖定常領域配列に連結した。抗体のH鎖可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびNheI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、得られたPCR産物をヒトIgG1定常領域がpBluescript KS+ベクター(東洋紡社)に挿入されているpB−CHベクターにクローニングした。NheI部位により、マウスH鎖可変領域とヒトH鎖(γ1鎖)定常領域が連結している。作製されたH鎖遺伝子断片を発現ベクターpCXND3にクローニングした。また、抗体のL鎖可変領域の5’末端側塩基配列に相補的でコザック配列を有する合成オリゴヌクレオチドおよびBsiWI部位を有する3’末端側塩基配列に相補的な合成オリゴヌクレオチドを用いてPCRを行い、得られたPCR産物をヒトkappa鎖定常領域がpBluescript KS+ベクター(東洋紡社)に挿入されているpB−CLベクターにクローニングした。BsiWI部位により、ヒトL鎖可変領域と定常領域が連結している。作製されたL鎖遺伝子断片を発現ベクターpUCAGクローニングした。本ベクターpUCAGは、pCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193−200)を制限酵素BamHIで消化して得られる2.6kbpの断片をpUC19ベクター(東洋紡社)の制限酵素BamHI部位に連結し、クローニングしたベクターである。
抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体発現ベクターを作製するために、L鎖遺伝子断片が挿入されたpUCAGベクターを制限酵素HindIII(宝酒造社)で消化して得られる遺伝子断片をH鎖遺伝子が挿入されたpCXND3の制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体遺伝子(H鎖可変領域のアミノ酸配列は自己列番号3に、L鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号4に示される。)を発現する。
実施例3
低フコース型抗GPC3キメラ抗体の作製
宿主細胞としてYB2/0(ATCC,CRL−1662)を用い、10%FBSを含むRPMI1640培地にて培養した。実施例2で作製した抗GPC3キメラ抗体発現ベクター25μgを7.5×106/0.75mL PBS(−)のYB2/0(ATCC CRT−1662)へ、エレクトロポレーション法で1.4kV,25μFの条件で導入した。室温にて10分間の回復期間の後、エレクトロポレーション処理された細胞を、10%FBSを含むRPMI1640培地40mLに懸濁した。同様の培地で10倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、Geneticin(Invitrogen社)を0.5mg/mLになるように添加して2週間培養した。抗ヒトIgG抗体を用いたサンドイッチELISAによりキメラ抗体高発現株のスクリーニングを実施し、定常発現株を樹立した。各抗GPC3マウス―ヒトキメラ抗体の精製は、Hi Trap ProteinG HP(Amersham社)を用いて行った。
実施例4
ヒト末梢血由来PBMCを用いたADCC活性の測定
ヒトPBMC溶液の調製
健常人よりヘパリン加採血した末梢血を、PBS(−)で2倍に希釈し、Ficoll−PaqueTMPLUS(Amersham社)に重層した。これを遠心(500×g、30分間、20℃)した後、単核球画分である中間層を分取した。3回洗浄後、10%FBS/RPMIに懸濁し、ヒトPBMC溶液とした。
標的細胞の調製
10%FBS/RPMI1640培地で培養したHepG2細胞(ATCC)およびHuH−7細胞(ヒューマンサイエンス研究資源バンク)を、Cell Dissociation Buffer(Invitrogen社)を用いてディッシュから剥離し、96ウェルU字底プレート(Falcon)の各ウェルに1×104細胞/ウェルで分注し、1日間培養した。培養後、5.55MBqのCr−51を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃1時間培養し、この細胞を培地で1回洗浄し、50μLの10%FBS/RPMI1640培地を加え標的細胞とした。
クロム遊離試験(ADCC活性)
標的細胞に各濃度に調製した抗体溶液50μLを添加し、氷上で15分反応させた後に、ヒトPBMC溶液100μL(5×105細胞/ウェル)を加え、5%炭酸ガスインキュベータ中37℃4時間培養し、培養後、プレートを遠心分離し、培養上清100μL中の放射活性をガンマカウンターで測定した。下式により特異的クロム遊離率を求めた。
特異的クロム遊離率(%)=(A−C)×100/(B−C)
Aは各ウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Bは標的細胞に2%NP−40水溶液(Nonidet P−40、Code No.252−23、ナカライテスク株式会社)を100μL、10%FBS/RPMI培地を50μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値、Cは標的細胞に10%FBS/RPMI培地を150μL添加したウェルにおける放射活性(cpm)の平均値を示す。試験は三重に行い、ADCC活性(%)について平均値および標準偏差を算出した。
抗GPC3キメラ抗体のヒトPBMCを用いたADCC活性を図2および3に示す。図中、縦軸は細胞傷害活性(%)を、横軸は添加した抗体の濃度(μg/mL)を示す。図2は標的細胞としてHepG2を用いた場合の、図3はHuH−7を用いた場合の結果を示す。白抜きはCHO細胞産生キメラGC33抗本の活性を、黒塗りはYB2/0産生キメラGC33抗体の活性をそれぞれ示す。低フコース型であるYB2/0産生GC33キメラ抗体は、CHO細胞産生GC33キメラ抗体に比較して強いADCC活性を示したことより、糖鎖の改変によって抗GPC3抗体のADCC活性が増強されることが明らかとなった。
実施例5
抗体産生細胞の樹立
SFMII(+)培地にハイグロマイシンBの最終濃度が1mg/mlになるように調製し、フコーストランスポーター欠損株(クローン名3F2)を継代した。8X106個の3F2を0.8mLのダルベッコリン酸緩衝液に懸濁した。細胞懸濁液に25μgの抗体発現ベクター(参考実施例1及び2)を加え、Gene Pulser Cuvetteに細胞懸濁液を移した。氷上で10分間放置した後に、GENE−PULSERIIで1.5kV,25μFDの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞をSFMII(+)培地40mLに懸濁して96穴平底プレート(イワキ社)に100μl/ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをCO2インキュベータ内で、24時間、37℃で培養した後、Geneticin(インビトロジェン社、cat.10131−027)を終濃度0.5mg/mLになるように添加した。薬剤に耐性になった細胞の抗体産生量を測定し、ヒト化抗GPC3抗体産生細胞株をそれぞれ樹立した。
実施例6
抗体の精製
抗体発現株より培養上清を回収し、P−1ポンプ(Pharmacia)を用いてHitrap rProtein A(Pharmacia CAT# 17−5080−01)にチャージした。結合バッファー(20mM Sodium phosphate(pH7.0))にて洗浄後、溶出バッファー(0.1MGlycin−HCl(pH2.7))で溶出した。溶出液は直ちに中和バッファー(1M Tris−HCl(pH9.0))で中和した。DC protein assay(BIO−RAD CAT# 500−0111)により抗体の溶出画分を選択しプールした後、Centriprep−YM10(Millipore CAT#4304)にて2mL程度まで濃縮した。次に、20mM酢酸バッファー,150mM NaCl,(pH6.0)にて平衡化したSuperdex200 26/60(Pharmacia)を用いてゲルろ過により分離した。モノマー画分のピークを回収し、Centriprep−YM10にて濃縮後、MILLEX−GW 0.22μm Filter Unit(Millipore CAT# SLGV 013SL)を用いてFiltrationした後、4℃で保管した。精製された抗体の濃度は、280nmの吸光度を測定し、モル吸光計数から換算した。
実施例7
FT−KO細胞産生ヒト化抗GPC3抗体のin vitro ADCC活性
FT−KO細胞産生抗GPC3抗体のヒトPBMCを用いたin vitro ADCC活性を図4に示す。方法は実施例4に記載の方法で行った。図中、縦軸は細胞傷害活性(%)を、横軸は添加した抗体の濃度(μg/mL)を示す。標的細胞としてはHuH−7を用いた。白抜きはWild TypeのCHO細胞産生抗GPC3抗体の活性を、黒塗りはFT−KO細胞産生抗GPC3抗体の活性をそれぞれ示す。低フコース型であるFT−KO細胞産生抗GPC3抗体は、Wild TypeのCHO細胞産生抗GPC3抗体に比較して強いADCC活性を示した。このことによりFT−KO細胞産生抗GPC3抗体ではADCC活性が増強されることが明らかとなった。
実施例8
FT−KO細胞産生ヒト化抗GPC3抗体糖鎖の解析
1.2−アミノベンズアミド標識糖鎖(2−AB化糖鎖)の調製
本発明のFT−KO細胞産生抗体、及び対照試料としてCHO細胞産生の抗体に、N−Glycosidase F(Roche diagnostics)を作用させ、糖鎖を蛋白質から遊離させた(Weitzhandler M.et al.,Journal of Pharmaceutical Sciences 83:12(1994),1670−1675)。エタノールを用いた除タンパク質後(Schenk B.et al.,The Journal of Clinical Investigation 108:11(2001),1687−1695)、濃縮乾固し、2−アミノピリジンによる蛍光標識を行った(Bigge J.C.et al.,Analytical Biochemistry 230:2(1995),229−238)。得られた2−AB化糖鎖を、セルロースカートリッジを用いた固相抽出により脱試薬した後遠心濃縮し、精製2−AB化糖鎖とした。次に,β−Galactosidase(生化学工業)を精製2−AB化糖鎖に作用させ,アガラクトシル2−AB化糖鎖とした。
2.アガラクトシル2−AB化糖鎖の順相HPLCによる分析
前項の方法で、本発明のFT−KO細胞産生抗体、及び対照試料としてCHO細胞産生抗体についてアガラクトシル2−AB化糖鎖の調製を行った後、アミドカラム(東ソー製TSKgel Amide−80)による順相HPLC分析を行い、クロマトグラムを比較した。CHO細胞産生抗体ではG(0)が主成分として存在しており、G(0)−Fucはピーク面積比として4%程度であった。一方,FT−KO細胞産生抗体ではG(0)−Fucが主成分であり,いずれの産生株においてもピーク面積比として90%以上存在していた(図5および表2)。ピークG(0)およびG(0)−Fucの推定構造を図6に示す。
FT−KO細胞産生ヒト化抗GPC3抗体の熱安定性分析
1.DSC測定用試料溶液の調製
200mmol/Lの塩化ナトリウムを含む20mol/Lの酢酸ナトリウム緩衝溶液(pH6.0)を透析外液とし,これに700μg相当量の抗体溶液を封入した透析膜を浸して一昼夜透析し,試料溶液とした。
2.DSCによる熱変性温度測定
試料溶液およびリファレンス溶液(透析外液)を十分に脱気した後、これらをそれぞれ熱量計セルに封入し20℃での熱平衡化を十分に行った。次にDSC走査を20℃〜100℃で約1K/分走査速度で行った。結果は、温度の関数としての変性ピークの頂点として表される(図7)。本測定より,CHO細胞産生抗体およびFT−KO細胞産生抗体における熱変性温度は同等であった。
参考実施例1
GC33のヒト化
公開されているKabat Database(ftp://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/kabat/)、およびImMunoGeneTics Database(IMGT)より抗体の配列データを入手し、H鎖可変領域、L鎖可変領域に分けてホモロジー検索を行った。その結果、H鎖可変領域はDN13(Smithsonら、Mol Immunol.1999;36:113−124)と高い相同性を持つことが分かった。また、L鎖可変領域はAccession nnumber AB064105のhomo sapiens IGK mRNA for immunoglobulin kappa light chain VLJ region,partial cds,clone:K64と高い相同性を持つことが分かった。また、L鎖のシグナル配列についてはAB064105と相同性の高いAccession Number S40357のシグナル配列を利用した。これらの抗体のフレームワーク領域(以下、FR)に相補性抗原決定領域(以下、CDR)を移植したヒト化抗体を作製した。
具体的には、50base程度の合成オリゴDNAを約20base程度ハイブリダイズするように設計し、これらの合成オリゴDNAをPCR法によりアッセンブリさせて各可変領域をコードする遺伝子を作製した。5’端の合成オリゴDNAの末端に挿入したHindIII配列、および3’端の合成オリゴDNAの末端に挿入したBamHI配列で切断し、ヒトIgG1定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgγ1、ヒトκ鎖定常領域がクローニングされた発現ベクターHEFgκへクローニングした(Satoら、Mol Immunol.1994;371−381)。このようにして作製したヒト化GC33はH鎖、L鎖それぞれver.aと命名した。H鎖、L鎖ともにver.aのヒト化GC33(ver.a/ver.a)はマウスGC33可変領域の抗体(mouse/mouse)と比較して結合活性が低かった。H鎖とL鎖についてマウスGC33配列とver.a配列をキメラに組み合わせた抗体(mouse/ver.a、ver.a/mouse)を作製し結合活性を評価した結果、ver.a/mouseで結合活性の低下が認められ、アミノ酸置換による結合活性の低下はH鎖に起因する事が判明した。そこで、H鎖の改変体ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.kを作製した。全てのヒト化GC33はマウスGC33可変領域を有するキメラ抗体と同等の結合活性を示した。ヒト化GC33H鎖可変領域ver.a、ver.c、ver.f、ver.h、ver.i、ver.j、ver.kの塩基配列を配列番号74、75、76、77、78、79、80に、アミノ酸配列を配列番号81、82、83、84、85、86、87に示す。ヒト化GC33L鎖可変領域ver.aの塩基配列を配列番号88に、アミノ酸配列を配列番号89に示す。ヒト化GC33H鎖可変領域ver.i、ver.j、ver.kでは、6番目のグルタミン酸がグルタミンに置換されているが、これらの抗体は熱安定性が顕著に増加していた。
参考実施例2
ヒト化GC33L鎖の改変
蛋白質の脱アミド化については一次配列依存的な脱アミド化の反応速度定数が知られており、Asn−Glyが特に脱アミド化し易い配列として知られている(Rocinsonら、Proc.Natl.Acad.Sci.USA 2001;98;944−949.)。配列番号88に示されるヒト化GC33L鎖ver.a可変領域のCDR1内にあるAsn33については、一次配列がAsn−Glyであることから、脱アミド化が容易に起きやすい配列である事が予想された。
Asn33の脱アミド化による結合活性に対する影響を評価する為に、Asn33をAspに置換した改変抗体を作製した。点変異の導入には、Quick Change Site−Directed Mutagenesis Kit(Stratagene社)を使用した。すなわち、125ngのセンスプライマー(CTT GTA CAC AGT GAC GGAAAC ACC TAT:配列番号124)、125ngのアンチセンスプライマー(ATA GGT GTT TCC GTC ACT GTG TAC AAG:配列番号125)、5μLの10x reaction buffer、1μLのdNTP mix、10ngのヒト化GC33L鎖ver.aがクローニングされたHEFgκ、1μLのPfu Turbo DNA Polymeraseを含む50μLの反応液を、95℃で30秒、55℃で1分、68℃で9分からなるサイクルを12回行った。その後制限酵素DpnIを加え37℃で2時間消化したものを添付のXL1−Blueコンピテント細胞に導入し形質転換体を得た。正しく変異の導入されたクローンについて、可変領域を切り出し、再度HEFgκへクローニングし直した。ヒト化GC33H鎖ver.kがクローニングされたHEFgγ1と共にFugene6(Roche社)を用いてCOS7細胞へ導入し一過性に発現させた培養上清を回収した。抗ヒトIgG抗体を用いたサンドイッチELISAにより抗体濃度を定量し、可溶型GPC3コア蛋白質を固相化したELISAにより改変抗体の結合活性を評価した。Asn33をAspに置換した改変抗体(N33D)では結合活性が消失しており、Asn33で脱アミド化が起きた場合結合活性に与える影響は大きいと考えられた。
Asn33の脱アミド化を抑制する方法として、Gly34を他のアミノ酸に改変する方法が報告されている(WO03057881A1)。上記方法に従い、Quick Change Site−Directed Mutagenesis Kitを用いCys、Metを除く他の17アミノ酸に置換した改変抗体G34A、G34D、G34E、G34F、G34H、G34N、G34P、G34Q、G34I、G34K、G34L、G34V、G34W、G34Y、G34R、G34S、G34Tを作製し、COS7細胞一過性発現培養上清を用いて結合活性の評価を行った。その結果、Pro(G34P)、Val(G34V)以外へのアミノ酸置換は結合活性を維持している事が判明した。
上述の改変抗体の軽鎖CDR1のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号90(G34A)、配列番号91(G34D)、配列番号92(G34E)、配列番号93(G34F)、配列番号94(G34H)、配列番号95(G34N)、配列番号96(G34T)、配列番号97(G34Q)、配列番号98(G341)、配列番号99(G34K)、配列番号100(G34L)、配列番号101(G34S)、配列番号102(G34W)、配列番号103(G34Y)、配列番号104(G34R)、配列番号105(G34V)、配列番号106(G34P)に記載する。また、上述の改変抗体の軽鎖可変領域のアミノ酸配列を、それぞれ配列番号107(G34A)、配列番号108(G34D)、配列番号109(G34E)、配列番号110(G34F)、配列番号111(G34H)、配列番号112(G34N)、配列番号113(G34T)、配列番号114(G34Q)、配列番号115(G34I)、配列番号116(G34K)、配列番号117(G34L)、配列番号118(G34S)、配列番号119(G34W)、配列番号120(G34Y)、配列番号121(G34R)、配列番号122(G34V)、配列番号123(G34P)に記載する。
参考実施例3
CHO細胞におけるフコーストランスポーター遺伝子の破壊
1.ターゲッティングベクターの構築
(1) KO1ベクターの作製
pcDNA3.1/Hygro(インビトロジェン社)よりHyg5−BHとHyg3−NTのプライマーでPCRすることによって、Hygromycin耐性遺伝子(Hygr)の開始コドンの5’側にBamH IサイトとTGCGCの配列を付加することで、フコーストランスポーター遺伝子の開始コドンの5’側と同じ配列にし、SV40polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはNot Iサイトを付加してHygrを抜き出した。
フォワードプライマー
Hyg5−BH 5’−GGA TCC TGC GCA TGAAAAAGC CTG AAC TCA CC−3’(配列番号128)
リバースプライマー
Hyg3−NT 5’−GCG GCC GCC TAT TCC TTT GCC CTC GGA CG−3’(配列番号129)
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.1(以下、KO1ベクターと称する)はpMC1DT−Aベクター(Yagi T,Proc.Natl.Acad.Sci.USA vol.87,p9918−9922,1990)に、フコーストランスポーターの5’側(配列番号126に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I)、3’側(No.4,284からNo.10,934のSac Iまで)、及びHygrフラグメントを各々挿入することで構築した。ベクターの特徴としては、Hygrにプロモーターが付加されていないことから、相同組み換えを起こしたときにフコーストランスポーターのプロモーターによって、Hygrが発現することとなる。しかしながら、相同組み換えによって1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンBに対する耐性を獲得するほどHygrが発現するとは限らない。なお、KO1ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO1ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン1の41塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
(2)pBSK−pgk−1−Hygrの作製
pKJ2ベクター(Popo H,Biochemical Genetics vol.28,p299−308,1990)よりマウスpgk−1遺伝子のプロモーターをEcoR I−Pst Iによって切り出し、pBluescript(ストラタジーン社)のEcoR I−Pst IサイトにクローニングしてpBSK−pgk−1を作製した。HygrはpcDNA3.1/HygroよりHyg5−AVとHyg3−BHのプライマーでPCRすることによって、Hygrの5’側にEcoT22 IサイトとKozak配列を付加し、SV40 polyA付加シグナルまでの領域を含む3’側にはBamH Iサイトを付加してHygrを抜き出した。
フォワードプライマー
Hyg5−AV 5’−ATG CAT GCC ACC ATG AAAAAG CCT GAA CTC ACC−3’(配列番号130)
リバースプライマー
Hyg3−BH 5’−GGA TCC CAG GCT TTA CAC TTT ATG CTT C−3’(配列番号131)
このHygr(EcoT22 I−BamH I)フラグメントをpBSK−pgk−1のPst I−BamH Iサイトに挿入し、pBSK−pgk−1−Hygrを作製した。
(3)KO2ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.2(以下、KO2ベクターと称する)はpMC1DT−Aベクターにフコーストランスポーターの5’側(配列番号126に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I)、3’側(No.4,284からNo.10,934のSac Iまで)、及びpgk−1−Hygrフラグメントを各々挿入することで構築した。KO1ベクターと異なり、KO2ベクターはHygrにpgk−1遺伝子のプロモーターが付加されていることから、相同組み換えによって1コピーのみベクターが細胞に導入されても、ハイグロマイシンBに対する耐性を獲得する。なお、KO2ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO2ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン1の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
(4)pBSK−pgk−1−Purorの作製
pPURベクター(BD Biosciences社)をPst IとBamH Iで切断し、切り出されたフラグメント(Puror)をpBSK−pgk−1のPst I−BamH Iサイトに挿入し、pBSK−pgk−1−Purorを作製した。
(5)KO3ベクターの作製
フコーストランスポーターのターゲッティングベクターver.3(以下、KO3ベクターと称する)はpMC1DT−Aベクターにフコーストランスポーターの5’側(配列番号126に示す塩基配列のNo.2,780のSma IからNo.4,232のBamH I)、3’側(No.4,284からNo.10,934のSac Iまで)、及びpgk−1−Purorフラグメントを各々挿入することで構築した。なお、pgk−1−Purorの3’末端には、以下に示すスクリーニング用のプライマーが結合する配列を予め付加しておいた。なお、KO3ベクターはNot Iで切断して細胞に導入した。KO3ベクターによって、フコーストランスポーターは開始コドンを含むエクソン1の46塩基対を欠損することになり、機能を失うものと考えられる。
リバースプライマー
RSGR−A 5’−GCT GTC TGG AGT ACT GTG CAT CTG C−3’(配列番号132)
以上の3種類のターゲッティングベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子のノックアウトを試みた。
2.CHO細胞へのベクターの導入
CHO−S−SFMII HT−(インビトロジェン社、cat 12052−098)にHT Supplement(100X)(インビトロジェン社 cat.11067−030)とペニシリンストレプトマイシン(インビトロジェン社 cat.15140−122)をCHO−S−SFMII HT−の容量に対して、それぞれ1/100量を加えた。これを培養用の培地(以下、SFMII(+)と称する)としてCHO細胞のDXB11株を継代し、さらに遺伝子導入後の培養もこのSFMII(+)で行った。8X106個のCHO細胞を0.8mLのダルベッコリン酸緩衝液(以下、PBSと略す。インビトロジェン社 cat 14190−144)に懸濁した。細胞懸濁液に30μgのターゲッティングベクターを加え、Gene Pulser Cuvette(4mm)(バイオラッド社 cat.1652088)に細胞懸濁液を移した。氷上で10分間放置した後に、GENE−PULSER II(バイオラッド社code No.340BR)で1.5kV,25μFDの条件で、エレクトロポレーション法によりベクターを細胞に導入した。ベクターを導入後、細胞を200mlのSFMII(+)培地に懸濁して20枚の96穴平底プレート(イワキ社 cat.1860−096)に100μl/ウェルで細胞を播きこんだ。プレートをCO2インキュベータ内で、24時間、37℃で培養した後、薬剤を添加した。
3.ノックアウトの第一段階
KO1ベクター、もしくはKO2ベクターをそれぞれCHO細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB(インビトロジェン社 cat.10687−010)による選抜を行った。ハイグロマイシンBは0.3mg/mlになるようにSFMII(+)に溶解し、100μl/ウェル添加した。
4.PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
(1)PCR用のサンプルの調整
相同組み換え体はPCR法によってスクリーニングした。スクリーニングで用いるCHO細胞は96穴平底プレートで培養し、培養上清除去後に細胞溶解用の緩衝液を50μl/ウェル加えて55℃、2時間加温し、続いて95℃、15分加熱することで、プロティナーゼKを失活させてPCRの鋳型とした。細胞溶解用の緩衝液は、1ウェルあたり10XLA緩衝液II(タカラ社LA Taqに添付)5μl、10%NP−40(ロッシュ社 cat.1332 473)2.5μl、プロティナーゼK(20mg/ml、タカラ社 cat.9033)4μl、及び蒸留水(ナカライテスク社 cat.36421−35)38.5μlで構成されている。
(2)PCRの条件
PCR反応混合物は上記のPCRサンプル1μl、10XLA緩衝液II5μl、MgCl2(25mM)5μl、dNTP(2.5mM)5μl、プライマー(各10μM)2μl、LATaq(5IU/μl cat.RR002B)0.5μl、及び蒸留水29.5μl(全50μl)とした。KO1ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP−F4とTHygro−R1、KO2ベクターを導入した細胞のスクリーニングには、TP−F4とTHygro−F1をPCRプライマーに用いた。
KO1ベクターを導入した細胞のPCRは、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、及び60℃にて2分間の増幅サイクル40サイクル、並びに72℃にて7分の複加熱とした。KO2ベクターを導入した細胞のスクリーニングには95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、及び70℃にて3分間の増幅サイクル40サイクル、並びに70℃にて7分の複加熱とした。
プライマーは以下の通りで、相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、KO1ベクターでは、約1.6kb、KO2ベクターでは約2.0kbのDNAが増幅される。プライマーはTP−F4がベクターの外側で、かつ5’側のフコーストランスポーターのゲノム領域に設定し、THygro−F1、及びTHygro−R1はベクター内のHygrの中に設定した。
フォワードプライマー(KO1,KO2)
TP−F4 5’−GGA ATG CAG CTT CCT CAA GGG ACT CGC−3’(配列番号133)
リバースプライマー(KO1)
THygro−R1 5’−TGC ATC AGG TCG GAG ACG CTG TCG AAC−3’(配列番号134)
リバースプライマー(KO2)
THygro−F1 5’−GCA CTC GTC CGA GGG CAA AGG AAT AGC−3’(配列番号135)
5.PCRスクリーニング結果
KO1ベクターを導入した細胞は918個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は1個であった(相同組み換え効率は約0.1%)。また、KO2ベクターを導入した細胞は537個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は17個であった(相同組み換え効率は約3.2%)。
6.サザンブロット解析
さらに、サザンブロット法によっても確認を行った。培養した細胞から定法に従ってゲノムDNAを10μg調整し、サザンブロットを行った。配列番号126に示す塩基配列のNo.2,113−No.2,500の領域から、以下の二種類のプライマーを用いてPCR法により387bpのプローブを調整し、これをサザンブロット法による確認に用いた。ゲノムDNAはBgl IIで切断した。
フォワードプライマー
Bgl−F:5’−TGT GCT GGG AAT TGAACC CAG GAC−3’(配列番号136)
リバースプライマー
Bgl−R:5’−CTA CTT GTC TGT GCT TTC TTC C−3’(配列番号137)
Bgl IIによる切断によって、フコーストランスポーターの染色体からは約3.0kb、KO1ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約4.6kb、KO2ベクターで相同組み換えを起こした染色体からは約5.0kbのバンドがそれぞれ出現する。KO1ベクター、及びKO2ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のそれぞれ1、7種類を実験に用いた。KO1ベクターで唯一獲得された細胞は5C1と名づけたが、その後の解析により複数の細胞集団から構成されることが明らかになったので、限界希釈によってクローン化し、その後の実験に用いることにした。また、KO2ベクターで獲得された細胞の一つを6E2と名付けた。
7.ノックアウトの第二段階
KO1ベクター、及びKO2ベクターによって相同組み換えが成功した細胞に対し、3種類のベクターを用いて、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞株の樹立を試みた。ベクターと細胞の組み合わせは、以下の通りである。方法1.KO2ベクターと5C1細胞(KO1)、方法2.KO2ベクターと6E2細胞(KO2)、方法3.KO3ベクターと6E2細胞(KO2)。ベクターをそれぞれの細胞に導入し、ベクター導入から24時間後にハイグロマイシンB、ピューロマイシン(ナカライテスク社、cat.29455−12)による選抜を開始した。ハイグロマイシンBは方法1では最終濃度が1mg/ml、方法2では最終濃度が7mg/mlになるようにした。さらに方法3では、ハイグロマイシンBの最終濃度が0.15mg/ml、ピューロマイシンの最終濃度が8μg/mlになるように添加した。
8.PCRによる相同組み換え体のスクリーニング
サンプルの調整は前述の通り。方法1に関するスクリーニングは、前述のKO1ベクター、及びKO2ベクターで相同組み換えを起こした細胞を検出するPCRを両方行った。方法2に関しては、下記のPCRプライマーを設計した。配列番号126に示す塩基配列のNo.3,924−3,950の領域にTPS−F1を、No.4,248−4,274にSHygro−R1を設定した。このPCRプライマーによって、KO2ベクターにより欠損するフコーストランスポーターの遺伝子領域の350bpが増幅される。従って、方法2におけるPCRスクリーニングにおいては、350bpが増幅されないものを、フコーストランスポーター遺伝子が完全に欠損した細胞とみなすことにした。PCRの条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、70℃にて1分間の増幅サイクル35サイクル、並びに70℃にて7分の複加熱とした。
フォワードプライマー
TPS−F1:5’−CTC GAC TCG TCC CTA TTA GGC AAC AGC−3’(配列番号138)
リバースプライマー
SHygro−R1:5’−TCA GAG GCA GTG GAG CCT CCA GTC AGC−3’(配列番号139)
方法3に関しては、フォワードプライマーにTP−F4、リバースプライマーにRSGR−Aを用いた。PCRの条件は、95℃にて1分間の前加熱、95℃にて30秒間、60℃にて30秒間、72℃にて2分間の増幅サイクル35サイクル、並びに72℃にて7分の複加熱とした。KO3ベクターによって相同組み換えを起こした細胞のサンプルでは、約1.6kbのDNAが増幅される。このPCRでKO3ベクターによって相同組み換えを起こした細胞を検出するとともに、KO2ベクターでの相同組み換えが残っていることも確認した。
9.PCRスクリーニング結果
方法1では616個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は18個であった(相同組み換え効率は2.9%)。方法2では524個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は2個であった(相同組み換え効率は約0.4%)。さらに、方法3では382個を解析し、そのうち相同組み換え体と考えられる細胞は7個であった(相同組み換え効率は約1.8%)。
10.サザンブロット解析
前述の方法に準じて解析を行った。その結果、解析できた細胞のうち、フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損している細胞を1つ見出した。第一段階のノックアウトでは、PCRとサザンブロットの解析結果が一致したが、この第二段階のノックアウトでは、一致しなかった。この原因としては、1.例えば、方法1でKO1、KO2のそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在している、2.フコーストランスポーター遺伝子が一対(2遺伝子)ではなく複数対(あるいは3遺伝子以上)存在する、3.第一段階のノックアウトが成功した細胞株を培養していると、継代中に残ったフコーストランスポーター遺伝子がコピー数を増やすことなどの可能性が考えられた。
11.フコースの発現解析
さらに、PCRで相同組み換え体と判断された26の細胞におけるフコースの発現を解析した.5μg/mLのLens culinaris Agglutinin,FITC Conjugate(ベクターラボラトリー社 cat.FL−1041)、2.5%のFBS、0.02%のアジ化ナトリウムを含むPBS(以下、FACS溶解液と称する)100μlで1×106個の細胞を氷冷中で1時間染色した。その後、FACS溶解液で細胞を3回洗浄してFACSCalibur(ベクトンディッキンソン社)で測定を行った。その結果、サザンブロット解析でフコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠損していろと判断された細胞のみ、フコースの発現が低下していることが明らかになった。
以上の結果より以下のことが判明した。
フコーストランスポーターの遺伝子が完全に欠失していろ細胞は1株しかなく、スクリーニングした数が616個であったことを考えると、相同組み換えの頻度は約0.16%と低い結果になった。第二段階のノックアウトで、PCRとサザンブロットの解析結果が一致しなかった理由は、前述のようにいくつか考えられるが、方法3においては、2種類の薬剤で選抜しているため、得られた細胞株がKO2ベクター、KO3ベクターのそれぞれ単独で相同組み換えを起こした細胞が混在しているとは考えられない。また、その他のPCRで相同組み換えを起こしたと判断された細胞株もすべて、複数の細胞集団から構成されているとは考えにくい。前述のようにフコーストランスポーター遺伝子が3以上存在した場合には、細胞におけるターゲッティングは格段に難しくなり、KO1ベクターのようなHygrが発現しにくいもの使用し、なおかつ数多くのスクリーニングを行わないと相同組み換え体が得られないものと考えられた。
Claims (8)
- 糖鎖組成が変化した抗グリピカン3抗体組成物。
- 抗体依存性細胞傷害性(Antibody−Dependent Cellular Cytotoxicity;ADCC)が増強されていることを特徴とする請求項1に記載の抗体組成物。
- 前記抗体組成物中の抗体がモノクローナル抗体である、請求項1または2に記載の抗体組成物。
- 糖鎖組成の変化が、フコースが欠損した抗体の割合の増加であることを特徴とする請求項1〜3のいずれか1項に記載の抗体組成物。
- 抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子が導入され、かつ糖鎖へのフコース付加能が減少した細胞を用いることを特徴とする、抗グリピカン3抗体の製造方法。
- 糖鎖へのフコース付加能が減少した細胞がフコーストランスポーター欠損細胞である、請求項5に記載の抗グリピカン3抗体の製造方法。
- 以下の工程を含む抗グリピカン3抗体の製造方法:
(a)抗グリピカン3抗体をコードする遺伝子を糖鎖へのフコース付加能が減少した細胞に導入する工程、
(b)該細胞を培養する工程。 - 請求項1〜4のいずれかに記載の抗体組成物を有効成分として含む抗癌剤。
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