CN102698267B - 使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3抗体的辅助疗法 - Google Patents

使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3抗体的辅助疗法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖‑3抗体的辅助疗法，提供了一种含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂，其中所述抗癌剂在癌症治疗后给药。癌症治疗后优选是指在肝癌治疗后，其中肝癌的治疗特别是指肝癌细胞切除术。本发明的抗癌剂优选在切除的肝癌细胞中表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3时使用。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体优选是单克隆抗体。本发明的抗癌剂适用于预防癌症或预防癌症复发。

Description

使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的辅助疗法
本申请是2005年8月23日提交的申请号为200580028610.1（PCT/JP2005/015607），发明名称为“使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的辅助疗法”申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖在癌症治疗之后的辅助疗法。
背景技术
据报告，磷脂酰肌醇蛋白聚糖(glypican)家族是存在于细胞表面上的硫酸乙酰肝素蛋白多糖的新家族。迄今已报告有五种磷脂酰肌醇蛋白聚糖(磷脂酰肌醇蛋白聚糖1,磷脂酰肌醇蛋白聚糖2,磷脂酰肌醇蛋白聚糖3,磷脂酰肌醇蛋白聚糖4,和磷脂酰肌醇蛋白聚糖5)是磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的成员。该家族的成员有大小均一(约60kDa)的核心蛋白，共有特异、高度保守的半胱氨酸序列，并通过糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定结合到细胞膜上。
通过对中枢神经发育中细胞分裂形态异常的黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)突变体进行基因筛选，识别出Dally(division abnormally delayed，分裂异常延迟)基因。已经显示出Dally的cDNA展示了开放阅读框(ORF)，所述阅读框所编码的产物显示出与脊椎动物膜整合蛋白聚糖(GRIPs)有序列同源性(24-26%同源)，所述GRIPs具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖的全部特点。其后，这就提示了dally在调节dpp(decapentaplegia)受体的机制中发挥作用，由此，提示了哺乳动物的磷脂酰肌醇蛋白聚糖有可能调节TGF和BMP的信号转导。即，这提示了磷脂酰肌醇蛋白聚糖可以作为一些肝素结合生长因子(如，EGF、PDGF、BMP2、FGFs等)的辅受体行使功能。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3作为发育调节转录产物从大鼠小肠中被分离(Filmus,J.,Church,J.G.,和Buick,R.N.(1988)Mol.Cell.Biol.8,4243-4249)，并在之后被识别为OCI-5，磷脂酰肌醇蛋白聚糖家族的GPI-结合型硫酸乙酰肝素蛋白多糖，具有分子量69kDa的核心蛋白(Filmus,J.,Shi,W.,Wong,Z.-M.,和Wong,M.J.(1995)Biochem.J.311,561-565)。在人类中，编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因也从人胃癌细胞株中被分离，称为MRX-7(Hermann Lage等，Gene 188(1997)151-156)。已经报告磷脂酰肌醇蛋白聚糖3与胰岛素样生长因子-2构成蛋白-蛋白复合体，并调节该生长因子的功能(Pilia,G.等，(1996)Nat.Genet.12,241-247)。该报告提示，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3未必通过硫酸乙酰肝素链与生长因子相互作用。
利用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为肝细胞癌标记物的可能性也已有报告(Hey-ChiHsu等，Cancer Research 57,5179-5184(1997))，另外还有报告认为抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对肝癌细胞具有细胞毒性作用，作为抗癌剂是有用的(国际公开WO 03/00883)。
但是，对于应用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为肝癌治疗后的辅助疗法尚没有报告。
发明内容
本发明人经反复专心研究，结果发现抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体对癌症治疗之后的辅助疗法有用，遂完成了本发明。另外，因为在癌症治疗后观察不到癌细胞的阶段，给药抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体能防止癌症复发，因此抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为预防癌症的药物或作为预防癌症复发的药物是有用的。
附图说明
图1是表示对肝内移植小鼠模型给药本发明的抗癌剂后的效果图。
图2是表示早期对肝内移植小鼠模型给药本发明的抗癌剂后的效果图。
具体实施方式
本发明提供了一种含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂，其特征为在癌症治疗后给药。癌症治疗后优选是指在肝癌治疗后，其中肝癌的治疗特别是指肝癌细胞切除术。本发明的抗癌剂优选应用于在切除的肝癌细胞表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的情况下。并且，抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体优选是单克隆抗体。
本发明的抗癌剂在辅助疗法中尤为有用。即使在癌症治疗、手术中认为癌细胞已被摘除或死亡的情况下，仍可能残留观察不到的癌细胞。当上述癌细胞仍残留时，一定时间后，癌症就可能复发，因此癌症治疗后必须进行继续治疗以预防癌症复发。该治疗称作辅助治法或术后辅助治法。
在本发明范围内，癌症治疗指以抑制癌细胞增殖或杀灭癌细胞或减少癌细胞为目的的任何一种治疗，如癌切除术、用抗癌剂化疗、放疗、经皮乙醇注射疗法、经皮射频热凝疗法或经导管动脉栓塞疗法。本发明中优选的癌症治疗是癌切除术。“癌症治疗后”是指在已经进行上述治疗后。需要说明的是，“癌症治疗后”在本发明中未必意味着癌症已经治愈。
本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可以在确认磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表达后，给药至癌症治疗后的患者。可以用任何方法确认磷脂酰肌醇蛋白聚糖3是否表达，例如，可以用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体等确认磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白的表达，也可用PCR等方法确认磷脂酰肌醇蛋白聚糖3基因的表达。
癌症治疗后可以在任何时间给药抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，并且给药可以在癌症治疗后立即进行或间隔一些时间后进行。本发明中优选的给药时间是从癌症治疗后直至癌症复发的期间。在术后辅助疗法中，通常在治疗后12周内或6周内开始给药。可以通过本领域技术人员已知的方法判断癌症是否复发，例如，通过视觉所见或病理所见来确认肿瘤是否发生进行判断。肿瘤可以通过本领域技术人员已知的方法确认，如成像法和以AFP等肿瘤标记物作为指标的方法。
使用本发明的抗癌剂可以治疗癌症，可列举如肝癌，肺癌，结肠癌，乳腺癌，前列腺癌，白血病，淋巴瘤，胰腺癌和胆管癌等，任何癌症都可以。本发明的抗癌剂特别适合用于治疗的癌症是肝癌细胞。肝癌可以是原发或继发性的，可举例是肝细胞癌，肝内胆管癌，胆管囊腺癌，混合型肝癌，肝母细胞瘤，未分化癌，血管肉瘤，肝平滑肌肉瘤和未分化肉瘤。
应用本发明抗癌剂的辅助疗法的实施方式特别优选是，在切除肝癌细胞后通过给药抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，防止肝癌复发。
至于本发明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的来源、类型(单克隆或多克隆)和形态，没有要求。
本发明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可以通过已知方法形成多克隆或单克隆抗体获得。本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体特别优选源自哺乳动物的单克隆抗体。源自哺乳动物的单克隆抗体包括经杂交瘤细胞产生的抗体，和用含有抗体基因的表达载体经遗传工程技术遗传转化后宿主所产生的抗体。
产生单克隆抗体的杂交瘤细胞使用已知技术，可以如下述进行制备。即，经如下步骤制备：以磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为致敏抗原，将其依照通常的免疫方法进行免疫化，利用通常的细胞融合技术使形成的免疫细胞与公知的伴侣细胞融合，然后通过通常的筛选方法筛选出单克隆的抗体产生细胞。
具体而言，单克隆抗体如下述制备即可。首先，用作生产抗体致敏抗原的人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，可以通过诱导由Lage H.等，Gene188(1997),151-156公开的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(MXR7)基因/氨基酸序列的表达获得。磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列和氨基酸序列分别显示于序列编号1和2。即，编码磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的基因序列插入公知的表达载体系统，遗传转化适当的宿主细胞后，将来自宿主细胞或培养基上清液中的目标人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白通过公知方法进行纯化。
接着，将该纯化后的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白用作敏化抗原。或者，也可以用磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的肽片段作为敏化抗原。这时，所述肽片段可以由人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的氨基酸序列经化学合成而获得。
抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体依靠细胞毒性如ADCC或CDC等体现抗癌活性，还在抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体与细胞毒性物质如放射性同位素、化疗药或菌源毒素等结合时体显示抗癌活性。抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体识别的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的表位不限于特定表位，只要抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可以识别的存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的任何表位都可。因此，为了制备本发明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗原，任何存在于磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上的含有表位的肽片段，都可以用作制备本发明抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗原。
要用致敏抗原免疫的哺乳动物没有具体限制，并优选基于同在细胞融合中使用的伴侣细胞的兼容性的考虑来选择。通常使用啮齿类动物如小鼠、大鼠和仓鼠，或兔、猴等。
可根据已知技术用致敏抗原对动物进行免疫。例如，免疫可以通过一般方如向哺乳动物腹腔内或皮下注射致敏抗原。具体而言，将致敏抗原用适量的PBS(磷酸盐缓冲液)、生理盐水等稀释或悬浮，根据需要向其中混合通常的佐剂如弗氏完全佐剂，乳化后，每4-21天多次对哺乳动物进行给药。另外，以致敏抗原免疫期间，也能用适当的载体。
哺乳动物的骨髓瘤细胞用作与前述免疫细胞融合的伴侣细胞。各种已知的细胞株适合用作该骨髓瘤细胞，例如P3(P3x63Ag8.653)(J.Immunol.(1979)123,1548-1550),P3x63Ag8U.1(Current Topics in Microbiology and Immunology(1978)81,1-7),NS-1(Kohler,G.and Milstein,C.Eur.J.Immunol.(1976)6,511-519),MPC-11(Margulies,D.H.等，Cell(1976)8,405-415),SP2/0(Shulman,M.等，Nature(1978)276,269-270),FO(deSt.Groth,S.F.等，J.Immunol.Methods(1980)35,1-21),S194(Trowbridge,I.S.J.Exp.Med.(1978)148,313-323),和R210(Galfre,G.等，Nature(1979)277,131-133)等。.
前述免疫细胞和骨髓瘤细胞之间的细胞融合基本上可根据已知的方法进行，例如，Kohler和Milstein等的方法(Kohler,G.和Milstein,C.,Methods Enzymol.(1981)73,3-46)。
更具体而言，所述细胞融合在例如细胞融合促进剂存在的条件下在通常的营养培养基中实施。例如，聚乙二醇(PEG)，仙台病毒(HVJ)等可以用作细胞融合促进剂，根据需要，还可加入助剂如二甲基亚砜等，以便提高融合效率。
免疫细胞和骨髓瘤细胞使用比例可任意设定。举例，优选免疫细胞的数量是杂交瘤细胞的1-10倍。用于上述细胞融合的培养基可以是，例如，特别适于上述杂交瘤细胞细胞株增殖的RPMI1640培养基或MEM培养基，或者其它用于培养该类型细胞的通常的培养基，此外，血清添加物如胎牛血清(FCS)等可以与之组合使用。
细胞融合通过在上述培养基中，充分混合规定量的上述免疫细胞和杂交瘤细胞，加入浓度通常为30-60%(w/v)、预加热至大约37°C的PEG溶液(如，平均分子量约1000-约6000)，然后混合形成目标融合细胞(杂交瘤细胞)。接着通过反复进行每次加入合适的培养基然后离心除去上清的程序，清除不利于杂交瘤细胞增殖的细胞融合剂等。
这样得到的杂交瘤细胞，可以通过通常的选择培养基如HAT培养基(含有次黄嘌呤，氨基蝶呤和胸苷的培养基)进行培养选择。为使除了目标杂交瘤细胞以外的细胞(非融合细胞)死亡，就要使在所述HAT培养基上进行的培养持续足够的时间(通常为数天至数周)。然后进行通常的限制稀释法，之后筛选以及单克隆产生目标抗体的杂交瘤细胞。
除了通过用抗原免疫非人类动物得到上述杂交瘤细胞之外，也可以通过人淋巴细胞在体外对磷脂酰肌醇蛋白聚糖3敏化，并把敏化的淋巴细胞与具有永久分裂能力的人源骨髓瘤细胞融合获得(见日本特公平1-59878号)所需的具有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合活性的人类抗体。另外，将磷脂酰肌醇蛋白聚糖3作为抗原给药具有完整的人抗体基因库的转基因动物后能得到产生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞，也可以从将产生抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体细胞永生化的细胞中获得(见国际专利申请公开编号WO 94/25585号公报,WO 93/12227号公报,WO92/03918号公报,和WO 94/02602号公报。
产生这样制备得到的单克隆抗体的杂交瘤细胞能连续培养在通常的培养基上，或者可以长时间保存在液氮中。
为使单克隆抗体能从该杂交瘤细胞获得，一般采用如下方法：依照通常方法培养该杂交瘤细胞得到并在培养基上清液中回收单克隆抗体的方法，或者将杂交瘤细胞施用到与之相容的哺乳动物中并使之增殖，在腹水中得到单克隆抗体的方法等。前一个方法适于得到高纯度抗体，而后一个方法适于抗体的大量产生。
本发明所用的单克隆抗体可以是重组的单克隆抗体，其制备是通过从杂交瘤细胞克隆抗体基因，将基因整合在适当的载体中，将其转导到宿主中，并使宿主通过基因重组技术产生(例如，参见Vandamme,A.M.等，Eur.J.Biochem.(1990)192,767-775,1990)。
具体而言，编码抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体可变(V)区的mRNA，从生成抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的杂交瘤细胞中分离。所述mRNA可以通过已知的方法分离，例如，通过氨基甲脒超离心法(Chirgwin,J.M.等，Biochemistry(1979)18,5294-5299)或AGPC法(Chomczynski,P.等，Anal.Biochem.(1987)162,156-159)等制备总RNA，之后用mRNA提纯试剂盒(由Pharmacia制造)等制备目标mRNA。另外，mRNA也能用QuickPrep mRNA提纯试剂盒(由Pharmacia制造)直接制备。
抗体V区的cDNA可以用逆转录酶由得到的mRNA合成。CDNA的合成可以用例如，AMV逆转录酶第一链cDNA合成试剂盒(Reverse Transcriptase First-Strand cDNASynthesis Kit)(由生成化学工業公司制造)等。CDNA的合成和扩增还能用例如，5′-AmpliFINDER RACE试剂盒(由Clontech制造)和使用了PCR的5′-RACE法(Frohman,M.A.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)85,8998-9002,Belyavsky,A.等，Nucleic Acids Res.(1989)17,2919-2932)等。
将目标DNA片段从如此得到的PCR产物纯化，然后连接到载体DNA上。另外，由此制备重组载体，然后将其导入大肠杆菌等，再选择菌落制备所需的重组载体。接着目标DNA核苷酸序列用已知的方法证实，如双脱氧核糖核酸链终止法。
得到编码目标抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体V区的DNA后，该DNA被整合在含有编码所期望的抗体恒定区(C区)的DNA的表达载体中。
为了制备用于本发明中的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，抗体基因整合在表达控制区例如，增强子和启动子这样的控制区，以表达的表达载体。接着用该表达载体遗传转化宿主细胞，并诱导抗体表达。
抗体基因表达可以通过编码抗体重链(H链)或轻链(L链)的DNA分别整合到表达载体中，然后用这些载体同时转化宿主细胞，或者也可以通过编码H链和L链的DNA整合在单个表达载体中，用该载体转化宿主细胞(参见WO 94/11523)。
不仅是以上列举的宿主细胞，还有转基因动物也能用于产生重组抗体。例如，融合基因的制备能通过将抗体基因插入在乳汁中产生的编码蛋白(如山羊β酪蛋白)的基因中。然后将含有插入了抗体基因的融合基因的DNA片段，注射到山羊胚胎中，该胚胎导入母山羊。所需的抗体可以从接受胚胎的山羊所生的转基因山羊或其后代所产生的乳汁中得到。此外，可以给转基因山羊施用适当的激素，以便增加转基因山羊产生的含有所需抗体的乳汁量(Ebert,K.M.等，Bio/Technology(1994)12,699-702)。
除了上面列举的抗体，本发明可以利用人工修饰的基因重组抗体，如嵌合抗体和人源化抗体，旨在降低对人类的异种抗原性。这些修饰的抗体可以通过已知的方法制备。
嵌合抗体的获得是通过，编码由上述方法得到的抗体V区的DNA与编码人类抗体C区的DNA连接，将其整合在表达载体中，然后把载体导入宿主并诱导生产。对本发明有用的嵌合抗体能以该已知方法获得。
人源化抗体，也称为改型人类抗体，其是通过将非人类哺乳动物如小鼠抗体互补决定区(complementarity determining region，CDR)，移植到人类抗体的互补决定区，对此的常规基因重组技术也是已知的(见欧洲专利申请公开No.EP 125023号公报和WO 96/02576号公报)。
具体而言，以连接小鼠抗体CDR与人类抗体骨架区(FR)设计的DNA序列以PCR法合成，其是用与CDR和FR二者的末端区都具有重叠的区域而构建的数个寡核苷酸作为引物(参见WO 98/13388号公报中记载的方法)。
其中的互补决定区构成了良好的抗原结合部位的骨架区被选作跨CDR连接的人抗体骨架区。抗体可变区中骨架区的氨基酸必要时可被取代，以便改型的人类抗体的互补决定区能构成适当的抗原结合部位(Sato,K.等，Cancer Res.(1993)53,851-856)。
在嵌合抗体和人源化抗体的C区中可以使用人类抗体C区，例如，Cγ1,Cγ2,Cγ3和Cγ4可用作H链，Cκ和Cλ可用作L链。另外，可以修饰人类抗体C区以便改善抗体或其生成的稳定性。
嵌合抗体包含源自非人类哺乳动物的抗体可变区和源自人类的抗体恒定区。另一方面，人源化抗体包含源自非人类哺乳动物的抗体互补决定区和源自人类的抗体骨架区以及C区。由于人源化抗体在体内的抗原性降低，其可用作本发明的治疗药的有效成分。
本发明所用的抗体只要能与磷脂酰肌醇蛋白聚糖3结合并且能抑制磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的活性，抗体片段或其修饰体即可，还可以含有二价抗体和单价抗体，并不限于整个抗体分子。抗体片段的实例如Fab、F(ab′)2、Fv、具有一个Fab和一个完整Fc的Fab/c，或H链或L链Fv由适当的接头连接的单链Fv(scFv)。具体而言，抗体片段可以通过用酶如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶处理抗体而产生，或者可以构建编码所述抗体片段的基因，并将其导入表达载体，由适当的宿主细胞表达(参见,例如Co,M.S.等，J.Immunol.(1994)152,2968-2976,Better,M.&Horwitz,A.H.Methods in Enzymology (1989)178,476-496,Academic Press,Inc.,Plueckthun,A.& Skerra,A.Methods in Enzymology(1989)178,476-496,AcademicPress,Inc.,Lamoyi,E.,Methods in Enzymology (1989)121,652-663,Rousseaux,J.等，Methods in Enzymology (1989)121,663-669,and Bird,R.E.等，TIBTECH(1991)9,132-137)。
ScFv通过连接抗体的H链V区和L链V区得到。H链V区和L链V区通过接头并优选肽接头连接在scFv中(Huston,J.S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.(1988)85,5879-5883)。ScFv的H链V区和L链V区可以是源自本说明书所述的任何抗体。连接V区的肽接头可使用例如，包含12-19个氨基酸残基的任何单链肽。
编码scFv的DNA可以按下述方法得到：编码上述抗体H链或H链V区的DNA，以及编码L链或L链V区的DNA，以编码前面所述序列的全部或所需的氨基酸序列的DNA部分作为模板，使用指定了末端的引物对经PCR进行扩增，接着重组指定的引物对，并进行扩增以使编码肽接头区的DNA和其两端分别结合于H链和L链。
另外，一旦编码scFv的DNA制备好，含有该DNA的表达载体和用该表达载体转化的宿主可以依照常法获得，并且通过应用所述宿主，依照常法可以得到scFv。
所述抗体片段可以通过和上述同样方法，由宿主获得和表达其基因并诱导生产。本发明的“抗体”也包括这些抗体的片段。
修饰抗体还可以使用与聚乙二醇(PEG)等各种不同分子结合的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖抗体。本发明的“抗体”也包括这些修饰抗体。所述修饰抗体可以通过实施化学修饰已得到的抗体而获得。需要说明的是，修饰抗体的方法在本领域中已建立。
本发明所用的抗体还可以是双特异性抗体。双特异性抗体可以是具有识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3分子上不同表位的抗原结合位点的双特异性抗体，或一个可识别磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的抗原结合位点和另一个可识别细胞毒性物质如化疗药或细胞产生的毒素等的抗原结合位点。这时，使得细胞毒性物质能直接作用在表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的细胞上，从而特异性破坏肿瘤细胞和抑制肿瘤细胞增殖。双特异性抗体可以通过结合两种类型的抗体的H-L对来制备，也可以通过融合能产生不同的单克隆抗体的杂交瘤细胞，制成产生双特异性抗体的融合细胞来获取。双特异性抗体也可以通过基因工程技术制备。
按上述所构建的抗体基因可通过公知的方法表达和获得。为哺乳动物细胞时，基因可以通过常用的有效启动子、要表达的抗体基因和在其3′下游侧的poly A信号的功能性连接来表达。启动子/增强子举例说明是人巨细胞病毒的早期启动子/增强子。
可以用来表达本发明所用的抗体的其它启动子/增强子的实例包括，来自例如源自逆转录病毒、多瘤病毒、腺病毒或猴病毒40(SV40)的病毒启动子/增强子，或人延伸因子1α(HEF1α)等哺乳动物细胞的启动子/增强子等。
应用SV40启动子/增强子时，基因表达易于以Mulligan等方法进行(Nature(1979)277,108)，应用HEF1α启动子/增强子时，基因表达易于以Mizushima等方法进行(NucleicAcids Res.(1990)18,5322)。
在使用大肠杆菌时，基因表达可以通过常用的有效启动子、抗体分泌的信号序列和要表达的抗体基因的功能性连接来实现。举例说明启动子可以是lacz启动子、araB启动子。用lacz启动子时，表达可以通过Ward等方法实现(Nature(1098)341,544-546;FASEB J.(1992)6,2422-2427)，而用araB启动子时，表达可通过Better等方法实现(Science(1988)240,1041-1043)。
至于抗体分泌的信号序列，当抗体在大肠杆菌的外周胞质中产生时，可以用pelB信号序列(Lei,S.P.等，J.Bacteriol.(1987)169,4379)。当外周胞质中产生的抗体被分离后，抗体结构被适当再折叠并使用。
作为复制起点适用的是，举例，源自SV40、多瘤病毒、腺病毒或牛乳头瘤病毒(BPV)的复制起点。此外，为了扩增宿主细胞系统中的基因拷贝数，表达载体可以含有例如氨基糖苷转移酶(APH)基因、胸苷激酶(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、或二氢叶酸还原酶(dhfr)基因等作为选择标记。
任何表达系统，例如真核细胞系统或原核细胞系统，都可以用于制备本发明所用的抗体。真核细胞的实例包括例如已建立的哺乳动物细胞系统或昆虫细胞系统，以及丝状真菌细胞和酵母细胞等的动物细胞等。原核细胞的实例包括细菌细胞如大肠杆菌细胞。
本发明所用的抗体优选在哺乳动物细胞中表达，如在CHO,COS,骨髓瘤,BHK,Vero,或HeLa细胞中。
然后转化的宿主细胞在体外或体内培养，以诱导产生目标抗体。宿主细胞可以根据已知方法培养。例如，可用DMEM,、MEM、RPMI1640或IMDM作为培养基，也可合用血清添加物如胎牛血清(FCS)等。
使用已知的方法可测定本发明所用抗体的抗原结合活性(Antibodies A Laboratory Manual Ed Harlow David Lane Cold Spring Harbor Laboratory,1988)和其配体-受体结合抑制活性(Harada,A.等，International Immunology(1993)5,681-690)。
测定本发明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗原结合活性，可以用ELISA(酶联免疫吸附分析)、EIA(酶免分析)、RIA(放免分析)或荧光抗体技术来测定。举例，用酶免分析时，将含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的样本，如抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体生成细胞的培养上清液或纯化的抗体，加至涂有磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的板上。加入以酶如碱性磷酸酶标记的第二抗体，对板进行培养，清洗后加入酶底物如对硝基苯磷酸盐，通过测定吸光度来评价抗原结合活性。本发明所用抗体的细胞毒性可以通过本领域技术人员公知的方法测定。
可以通过混合效应细胞、靶细胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体测定，检查ADCC的程度来测定ADCC的活性。例如，小鼠脾细胞或者从骨髓或人外周血分离的单核细胞等可以用作效应细胞，可以用人类建立的细胞株如人肝细胞株HuH-7等作为靶细胞。预先用51Cr标记靶细胞，向该细胞中加入抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，之后培养，然后加入与靶细胞成适当比例的效应细胞，进行培养。ADCC活性可以用通过收集培养后的上清，计算上清中的放射活性进行测定。
CDC活性可以通过混合上述标记的靶细胞和抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，然后加入补足物进行培养，在培养后计算上清中的放射活性来测定。
由于Fc区通常对于抗体发挥细胞毒性是必需的，在本发明的细胞生长抑制剂利用了抗体细胞毒活性的那些情况下，本发明所用的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体优选含有Fc区。
本发明的抗癌剂用于预防癌症或预防癌症治疗后的癌症复发。本发明的抗癌剂特别优选用于预防肝癌细胞切除术后的肝癌复发。
有效剂量选自每次给药0.001mg-1000mg/kg体重的范围。或者，剂量可以选自每名患者0.01-100000mg/个体。但是，本发明的含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的抗癌剂不受所述剂量的限制。
本发明的抗癌剂通常以非口服途径给药，例如，注射(如皮下，静脉内，肌内，腹膜内)或经皮、经粘膜、经鼻或经肺等途径，但是，口服给药也是可能的。
至于本发明的抗癌剂的给药时间，可以在疾病临床症状出现之前或之后给药。根据特别优选的本发明的实施方案，本发明的抗癌剂可以在肝癌细胞切除术后作为辅助治疗给药。
含有本发明的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体作为活性成分的治疗药可以依照常法配制(Remington′s Pharmaceutical Science,latest edition,Mark PublishingCompany,Easton,U.S.A.)并且还可以同时含有药用载体和添加剂。
所述载体和药用添加剂的实例是，水、药用有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸钠、藻酸钠、水溶性右旋糖苷、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯胶、酪蛋白、琼脂、聚乙二醇、双甘油、甘油、丙烯醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨醇、乳糖和适合作为药物添加剂的表面活性剂。
根据本发明的治疗药剂型，实际的添加剂可以是上述中的一种或多种进行适当组合，当然也不受其限制。例如，可注射制剂的制备如下：在溶剂如生理盐水、缓冲液或葡萄糖溶液中溶解纯化的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体，然后在溶液中加入防吸附剂如Tween 80、Tween20、明胶、或人血清白蛋白。或者，在使用前通过溶解重构的剂型，可以是冻干制剂，用于冻干的赋形剂可以用如甘露醇和葡萄糖等的糖醇或糖类。
本说明书特意引用的所有专利和参考文献的内容，整体合并作为本说明书的一部分。此外，日本专利申请2004-244273和2005-90945的说明书和附图的内容，是构成本发明持有的优先权基础的申请，整体合并作为本说明书的一部分。
实施例
本发明通过下面提供的实施例更具体地描述，但这些实施例不限制本发明的范围。
实施例1
小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33在肝内移植的小鼠模型中的药效试验
(1)甲胎蛋白(AFP)的测定
使用人ELISA试剂盒(由Hope Laboratories公司制造)，测定血清中的AFP浓度，作为肿瘤标记物。ELISA的检测限约1ng/mL，低于检测限的样本作为1ng/mL。为了获取血清，在Separapit S(由セキスイ化学制造)中通过眼窝采血收集血液，室温下静置15分钟后，以1200×g离心分离20分钟。
(2)制备肝内移植小鼠模型
肝内移植小鼠模型的制备如下：HepG2细胞(ATCC)用Hanks培养基(由Sigma制造)配制到1×108个/mL。在戊巴比妥钠麻醉下，50μL的HepG2细胞悬液(5×106个/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊内。移植后第21天测定血清中AFP浓度，在10-100ng/mL范围内的个体被分成两组(n＝4)。在该时间点，肝癌细胞(瘤块)还没有视觉可见，将其用作肝脏切除术后微肝内移植存活模型。
(3)抗体给药
给药当天通过用生理盐水(由大製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33(参考下面的参考例)达0.5mg/mL作为给药样本。给药样本在肿瘤移植后的第21天和28天，以10mL/kg通过尾静脉给药至前述的小鼠模型。阴性对照中将生理盐水作为媒介同样给药。
(4)抗肿瘤作用的评价
抗肿瘤作用根据肿瘤移植后第35天的AFP浓度评价。其结果显示在图1中，GC33给药组与媒介给药组相比，肿瘤移植后第35天的AFP浓度较低，从而证实了本发明抗体的抗肿瘤作用。
如前所显示，GC33在肝内移植模型中表现出具有抗肿瘤的作用，可见本发明抗体能用在辅助治疗中。
实施例2
小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33在肝内移植的小鼠模型中的早期给药试 验
(1)甲胎蛋白(AFP)的测定
使用人ELISA试剂盒(由Hope Laboratories公司制造)，测定血清中的AFP浓度，作为肿瘤标记物。ELISA的检测限约1ng/mL，低于检测限的样本作为1ng/mL。为了获取血清，在Separapit S(由セキスイ化学制造)中通过眼窝采血收集血液，室温下静置15分钟后，以1200×g离心分离20分钟。
(2)制备肝内移植小鼠模型
肝内移植小鼠模型的制备如下：HepG2细胞(ATCC)用Hanks培养基(由Sigma制造)配制到1×108个/mL。在戊巴比妥钠麻醉下，50μL的HepG2细胞悬液(5×106个/小鼠)注射到裸鼠(Charles River)的肝囊内。移植后的第2天，随机分成两组(n＝10)。虽然HepG2在移植后的第一天的时间点就存在于小鼠肝内，但此时小鼠血清中测不到人AFP，这可用作在临床上更接近于肝脏切除术后残余的微肝内移植的模型。
(3)抗体给药
给药当天通过用生理盐水(由大製薬制造)配制小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33(参考下面的参考例)达0.5mg/mL作为给药样本。给药样本在肿瘤移植后的第2天和第7天，以10mL/kg通过尾静脉给药至前述的小鼠模型。阴性对照中将生理盐水作为媒介同样给药。
(4)抗肿瘤作用的评价
抗肿瘤作用根据肿瘤移植后第15天和第40天的AFP浓度评价。其结果显示在图2中，媒介组中观察到AFP浓度升高，而GC33给药组两个测定时间都没有看到AFP浓度升高。
如前所显示，在肝癌细胞肝内移植的模型中，通过在AFP尚检测不到的早期给与小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33，可以抑制肿瘤增殖，从而提示本发明抗体能用在辅助治疗中。
参考实施例
制备小鼠抗人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体GC33
用来自GST和来自磷脂酰肌醇蛋白聚糖3中524位丙氨酸至563位赖氨酸的肽形成的融合蛋白作为免疫原，免疫三只Balb/c小鼠(购自Charles River Japan)和三只MRL/lpr小鼠。在初次免疫中，皮下给与乳剂，所述乳剂用FCA制备并调节使之能提供每只(perhead)100μgGC-3。两周后，皮下给药乳剂，所述乳剂用FIA制备并调节使之能提供每只50μg。第五次免疫后，每只最后免疫(50μg)在所有小鼠的尾静脉中进行，并进行细胞融合。用固定有已去除C端侧的疏水区(564至580的氨基酸)的可溶性GPC3核心蛋白的免疫板，通过ELISA进行筛选。对于阴性对照，用限制性稀释法进行单克隆化。结果是获得了具有对GPC3的较强结合活性的GC33抗体。GC33H链可变区的氨基酸序列显示在序列编号3中，而L链可变区的氨基酸序列显示在序列编号4中。
工业实用性
本发明的抗癌剂适用于预防癌症和预防癌症复发。

Claims (5)

1.抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体在制备用于预防肝癌复发的抗癌剂中的应用，其中所述抗癌剂给药的患者已将肝癌细胞切除术作为肝癌治疗，并且所述肝癌细胞表达磷脂酰肌醇蛋白聚糖3，并且其中所述抗体与一表位结合，该表位(1)与被下列抗体结合的磷脂酰肌醇蛋白聚糖3上的表位相同，该抗体包含如SEQ ID NO:3所示的H链可变区和如SEQ ID NO:4所示的L链可变区，以及(2)包含在磷脂酰肌醇蛋白聚糖3第524-563位的氨基酸序列中。
2.根据权利要求1所述的应用，其中所述用于制备预防肝癌复发的抗癌剂的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的给药使得患者血清中的AFP浓度未见升高。
3.根据权利要求1或2的应用，其中所述用于制备预防肝癌复发的抗癌剂的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是单克隆抗体。
4.根据权利要求3的应用，其中所述用于制备预防肝癌复发的抗癌剂的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体是嵌合抗体。
5.根据权利要求4的应用，其中所述用于制备预防肝癌复发的抗癌剂的抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体为人源化抗体。
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