PT1800693E - Terapia adjuvante utilizando anticorpo antiglipicana - Google Patents

Description

1 DESCRIÇÃO "TERAPIA ADJUVANTE UTILIZANDO ANTICORPO ANTI- GLIPICANA 3"

DOMÍNIO TÉCNICO A invenção presente diz respeito a evitar-se a recorrência do cancro por micrometástases intrahepáticas.

ESTADO DA TÉCNICA

Foi descrito que a família da glipicana é uma nova família de proteoglicanas de sulfato de heparana presente na superfície da célula. Foram reportadas cinco espécies de glipicana (glipicana 1, glipicana 2, glipicana 3, glipicana 4, e glipicana 5), como membros da família das glipicanas, até à data. Os membros desta família têm uma proteína nuclear de dimensão uniforme (cerca de 60 kDa), partilham uma sequência única e fortemente conservada de cisternas, e estão ligados à membrana celular por intermédio de uma âncora de glicosilfosfatidilinositol (GPI) . O gene Daily (divisão anormalmente atrasada) foi identificado por um despiste genético de mutantes de Drosophila melanogaster que apresentavam um perfil de 2 divisão celular anormal durante o desenvolvimento do seu sistema nervoso central. Mostrou-se que o cADN do Daily possui um quadro de leitura aberta (ORF) que codifica para um produto que exibe uma homologia de sequência (24 a 26 % de homologia) com proteoglicanas de membrana integral de vertebrados (GRIP), possuindo todas as caracteristicas das glipicanas. Foi mais tarde sugerido que o Daily desempenha um papel na regulação do mecanismo receptor dpp (decapentaplegia), sugerindo a possibilidade de a glipicana de mamíferos modular a transdução de sinal TGF e BMP. Isto é, foi sugerido que a glipicana pode funcionar como um co-receptor para alguns factores de crescimento que se ligam a heparina (por exemplo, EGF, PDGF, BMP2, os FGF).

Isolou-se a glipicana 3 como uma transcrição regulada a título de desenvolvimento, a partir do intestino delgado do rato (Filmus, J., Church, J.G., e Buick, R.N. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 4243-4249). Em seguida identificou-se como OCI-5, uma proteoglicana do tipo do sulfato de heparana ancorada por GPI, da família das glipicanas, contendo uma proteína nuclear com uma massa molecular de 69 kDa (Filmus, J., Shi, W. , Wong, Z. -M., e Wong, M.J. (1995) Biochem. J. 311, 561- 565) . Em seres humanos, também foi isolado um gene codificando para glipicana 3 denominado MRX-7, a partir de uma linha de células de cancro do estômago humano (Hermann Lage et al., Gene 188 (1997) 151-156) . Já foi reportado que a glipicana 3 forma um complexo proteína-proteína com o factor de crescimento 2 semelhante à insulina e que regula a acção 3 deste factor de crescimento (Pilia, G. et al. (1996) Nat. Genet. 12, 241-247) . Esta publicação sugere que a glipicana 3 não interactua necessariamente com factores de crescimento através da cadeia de sulfato de heparana.

Foi também reportado que a glipicana 3 pode possivelmente ser utilizada como marcadora do carcinoma hepatocelular (Hey-Chi Hsu et al., Câncer Research 57, 5179-5184 (1997)). Foi também reportado que o anticorpo anti-glipicana 3 exibe uma actividade citotóxica contra células de cancro do figado e pode ser útil como agente anti-cancro (WO 03/00.883). O WO 04/022.739 e o EP 1.541.680 Al dizem respeito ao anticorpo contra péptido do terminal N ou péptido do terminal C da GPC3 dissolvida em sangue. Cárter et al. (2001) Nature Reviews Câncer, 1: 118-129 diz respeito a melhorar a eficácia de terapias do cancro baseadas em anticorpos.

No entanto, não houve nenhumas publicações acerca de ser possivel utilizar anticorpo anti-glipicana 3 como terapia adjuvante, depois de um tratamento do cancro.

DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO

Em resultado de investigações extensivas e intensivas, os inventores presentes verificaram que o 4 anticorpo anti-glipicana 3 é útil para evitar a recorrência do cancro de micrometástases intrahepáticas num paciente após um tratamento por ressecção de um cancro do figado. A invenção presente proporciona portanto um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método de impedir a recorrência do cancro de micrometástases intrahepáticas num paciente depois de um tratamento por ressecção de um cancro do figado, em que a glipicana 3 esteja expressa em células de cancro do figado ressecionadas.

BEVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um gráfico que mostra o efeito do agente contra o cancro de acordo com a invenção presente, quando administrado a um modelo murino transplantado intrahepaticamente. A Figura 2 é um gráfico que mostra o efeito do agente contra o cancro de acordo com a invenção presente, quando administrado num estádio precoce a um modelo murino transplantado intrahepaticamente.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO A invenção presente proporciona um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método para evitar a 5 recorrência do cancro de micrometástases intrahepáticas num paciente, depois de um tratamento de ressecção para cancro do figado, em que a glipicana 3 esteja expressa nas células de cancro objecto de ressecção. 0004723538 282089017 0 anticorpo anti-glipicana 3 é preferivelmente um anticorpo monoclonal. 0 agente anti-cancro de acordo com a invenção presente é utilizado em terapia adjuvante. Mesmo nos casos em que se crê que a cirurgia para tratamento do cancro resultou na remoção das células cancerosas ou na sua morte, podem ainda restar presentes células cancerosas não detectadas. 0 cancro pode recorrer após um determinado periodo de tempo quando as referidas células cancerosas ainda estiverem presentes, e o tratamento do cancro tem portanto que ser seguido por um tratamento para evitar a recorrência do cancro. Um tratamento deste tipo é conhecido por uma terapia adjuvante ou após a cirurgia.

Adentro do contexto da invenção presente, tratamento do cancro refere-se a qualquer tratamento que tenha um obj ectivo que inclua inibir o crescimento das células cancerosas, ou matar células cancerosas, ou diminuir o número de células cancerosas, tal como ' a ressecção do cancro, a quimioterapia utilizando um agente contra o cancro, a terapia de radiação, a terapia por injecção percutânea de etanol, a terapia por coagulação térmica devida a uma radiofrequência percutânea, ou a 6 terapia por embolização arterial transcateteriana. Na invenção presente o tratamento do cancro inclui a ressecção para o cancro do figado. 0 conceito de "tratamento após o cancro" ou "tratamento para depois do cancro" refere-se a depois destes tratamentos terem sido levados a cabo. Este conceito de "tratamento após o cancro" ou "tratamento para depois do cancro" na invenção presente não significa necessariamente que o cancro foi curado. 0 anticorpo anti-glipicana 3 de acordo com a invenção presente é administrado a um paciente em tratamento após o cancro depois de se determinar se a glipicana 3 estava expressa nas células do figado obtidas por ressecção. Pode utilizar-se um método qualquer para se determinar se a glipicana 3 está a ser expressa. Por exemplo, a expressão da proteína de glipicana 3 pode ser determinada utilizando anticorpo anti-glipicana 3, enquanto a expressão do gene de glipicana 3 gene pode ser determinada, por exemplo, por PCR.

Pode administrar-se o anticorpo anti-glipicana 3 em qualquer altura após o tratamento do cancro, e pode fazer-se a administração imediatamente depois do tratamento do cancro, ou ao fim de um intervalo de tempo qualquer. Uma altura preferida para a administração na invenção presente é no intervalo entre depois do tratamento do cancro e até à recorrência do cancro. No caso de uma terapia adjuvante após a cirurgia, a administração inicia-se tipicamente até 12 semanas após o tratamento, ou nas 6 semanas após o 7 tratamento. A recorrência do cancro pode ser diagnosticada por métodos que são conhecidos dos especialistas da técnica; por exemplo, a ocorrência de um tumor pode ser determinada por inspecção visual ou de informação patológica. A presença de um tumor pode ser confirmada por métodos conhecidos dos especialistas da técnica, tais como por imagiologia, ou por métodos baseados num marcador do tumor tal como AFP. 0 cancro tratado utilizando o agente anti-cancro de acordo com a invenção presente é o cancro do figado. 0 hepatocarcinoma é um cancro especialmente adequado ao tratamento utilizando o agente anti-cancro de acordo com a invenção presente. 0 cancro do figado pode ser um cancro primário ou secundário, incluindo o carcinoma hepatocelular, o colangiocarcinoma intrahepático, o quistadenocarcinoma das vias biliares, carcinoma hepatocelular combinado com colangiocarcinoma, hepatoblastoma, carcinoma indiferenciado, angio-sarcoma, leiomio-sarcoma do figado, e sarcoma indiferenciado.

Na invenção presente, o anticorpo anti-glipicana é para ser utilizado num método de evitar a recorrência de cancro de micrometástases intrahepáticas num paciente, depois de um tratamento do cancro do figado por de ressecção do cancro, no caso em que a glipicana 3 está expressa nas células do cancro do figado obtidas por ressecçao. Não existem nenhumas limitações especificas no que toca à origem, ao tipo (monoclonal ou policlonal), e à forma do anticorpo anti-glipicana 3 utilizado na invenção presente.

Pode obter-se o anticorpo anti-glipicana 3 utilizado na invenção presente por um meio conhecido sob a forma de um anticorpo policlonal ou monoclonal. É especialmente preferido um anticorpo monoclonal anti-glipicana 3originado num mamífero, para utilização na invenção presente. Incluem-se nos exemplos de anticorpos monoclonais com origem em mamíferos, os anticorpos produzidos por hibridomas e os anticorpos produzidos por um hospedeiro que haja sido transformado por técnicas de engenharia genética com um vector de expressão contendo o gene do anticorpo.

Pode preparar-se um hibridoma produtor de anticorpos monoclonais utilizando substancialmente técnicas conhecidas como se segue. Pode preparar-se um hibridoma por imunização de um animal de acordo com um método padrão de imunização, recorrendo à glipicana 3 a título de antigénio sensibilizante; fundindo-se os imunócitos resultantes com células parceiras conhecidas recorrendo a uma técnica de fusão celular conhecida; e depois despistando-se as células produtoras de anticorpos monoclonais por um processo de despiste padrão. 9

Em termos específicos, pode preparar-se o anticorpo monoclonal como se segue. Em primeiro lugar, obtém-se glipicana 3 humana para utilização a título de agente sensibilizante na produção de anticorpo induzindo a expressão da glipicana 3 (MXR7) de acordo com a sua sequência genética/de aminoácidos, tal como descrita por Lage, H. et al., Gene 188 (1997), 151-156. Mostram-se as sequências do gene e dos aminoácidos da glipicana 3, respectivamente, na SEQ ID NO: 1 e na SEQ ID NO: 2. Especificamente, a sequência do gene que codifica para a glipicana 3 é inserida num sistema de vector de expressão conhecido; transforma-se uma célula hospedeira apropriada; e subsequentemente purifica-se a proteína humana, glipicana 3, com interesse, por um método conhecido, a partir da célula hospedeira ou do sobrenadante da cultura.

Utiliza-se então esta proteína glipicana 3 purificada como antigénio sensibilizante. Em alternativa, pode utilizar-se um péptido parcial da glipicana 3 como antigénio sensibilizante. Pode obter-se um tal péptido parcial por síntese química de um péptido de acordo com a sequência de aminoácidos da glipicana 3 humana. 0 anticorpo anti-glipicana 3 exibirá uma actividade anti-cancro através da sua actividade citotóxica, tal como ADCC ou CDC. Ele também exibirá uma actividade anti-cancro quando se conjugar um anticorpo anti-glipicana 3 com uma substância citotóxica tal como um radioisótopo, um agente quimioterapêutico, ou uma toxina 10 derivada de bactérias. O epítopo na molécula de glipicana 3 que é reconhecido pelo anticorpo anti-glipicana 3 não se limita a um epitopo especifico. O anticorpo anti-glipicana 3 pode reconhecer qualquer epitopo que esteja presente na molécula de glipicana 3. Deste modo, pode utilizar-se qualquer fragmento peptidico que contenha um epitopo presente na molécula de glipicana a titulo de antigénio para se preparar o anticorpo anti-glipicana 3 da invenção presente. Não há nenhuma limitação especifica do mamífero que se vai imunizar com o antigénio sensibilizante, e ele é seleccionado preferivelmente com base numa consideração da compatibilidade com a célula parceira que será utilizada para a fusão celular. Por exemplo, são em geral utilizados coelhos, macacos, ou roedores tais como murganhos, ratos, e cobaias. e emulsiona-se a

Imuniza-se o animal com o antigénio sensibilizante recorrendo a técnicas conhecidas. Por exemplo, pode levar-se a cabo a imunização por um método geral no qual se injecta o antigénio sensibilizante a um mamifero por via intraperitoneal ou subcutânea. Especificamente, dilui-se ou suspende-se o antigénio sensibilizante num volume apropriado de soro salino tamponizado com fosfato (PBS), soro salino fisiológico, ou outros semelhantes; mistura-se uma quantidade adequada de um adjuvante padrão tal como o adjuvante completo de Freund com ele, consoante seja necessário; 11 mistura e administra-se ao mamifero diversas vezes a intervalos de entre 4 e 21 dias. Além disto, também se pode utilizar um veiculo adequado durante a imunização com o antigénio sensibilizante.

Utiliza-se um sistema de células de mieloma humano a titulo de célula parceira para fusão com o imunócito mencionado acima. Utilizam-se diversas linhas de células conhecidas, de forma adequada, a titulo de célula mieloma, belas se incluindo, por exemplo, P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.l (Current

Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler, G. e Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies, D. H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), e R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

Fundem-se imunócitos com as células de mieloma, seguindo substancialmente processos conhecidos, por exemplo, o processo de Kohler e Milstein et al. (Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mais especificamente, leva-se a cabo a fusão celular num meio de cultura nutriente padrão da presença de, por exemplo, um promotor de fusão celular. Por exemplo, pode utilizar-se polietilenoglicol (PEG), virus Sendai 12 (também conhecido como vírus hemaglutinante do Japão ou HVJ), ou outros semelhantes a título de promotores de fusão celular. Caso tal se pretenda, também se pode adicionar um auxiliar tal como sulfóxido de dimetilo para se aumentar ainda mais a eficiência da fusão.

Podem misturar-se em quaisquer proporções os imunócitos e as células de mieloma. Por exemplo, é preferível que o número de imunócitos seja de entre 1 e 10 vezes o número de células de mieloma. Incluem-se nos exemplos do meio de cultura utilizado para as células, por exemplo, meio de cultura RPMI1640 ou meio de cultura MEM, que são especialmente adequados para o crescimento das linhas de células de mieloma acima mencionadas, e outros meios de cultura padrão que são utilizados para cultura de células deste tipo. Também se pode utilizar em conjunto um suplemento com soro fetal de vitelo (FCS).

Leva-se a cabo a fusão de células misturando bem quantidades previamente quantificadas dos imunócitos e das células de mieloma mencionadas acima no meio de cultura mencionado acima; adicionando-se em seguida uma solução de um PEG (por exemplo, com uma massa molecular média de entre cerca de 1.000 e 6.000) com uma concentração de, em geral, 30 a 60 % (em peso por volume) que se pré-aqueceu a cerca de 37°C; e depois misturando estas componentes para permitir a formação das células fundidas (hibridomas) de interesse. Subsequentemente, adiciona-se um meio adequado e centrifuga-se para se remover o sobrenadante. Repete-se 13 este processo para se remover o agente de fusão de células e ouros materiais desfavoráveis ao crescimento do hibridoma.

Seleccionam-se os hibridomas que deste modo se obtiveram por cultura num meio de selecção de culturas padrão, tal como meio de cultura HAT (meio de cultura contendo hipoxantina, aminopterina, e timidina). Continua-se a cultura neste meio de cultura HAT durante um periodo de tempo suficiente para as outras células (células não fundidas), para além dos hibridomas, morrerem (normalmente entre diversos dias e diversas semanas). Leva-se então a cabo um processo de diluição limitativa para se despistar e se monoclonar o hibridoma que produz o anticorpo pretendido.

Para além do método mencionado acima de obtenção de um hibridoma imunizando um animal não humano com antigénio, os anticorpos humanos pretendidos que exibem uma actividade de ligação a glipicana 3 também podem ser obtidos sensibilizando linfócitos humanos a glipicana 3 in vitro e fundindo os linfócitos sensibilizados com células de mieloma derivadas de seres humanos, que possuam uma capacidade permanente de divisão (veja-se a Publicação de Patente Japonesa N°. Hei 1-59878). Além disto, pode administrar-se a glipicana 3 sob a forma de um antigénio, a um animal transgénico que possua o reportório completo de genes de anticorpos humanos; podem subsequentemente obter-se células que produzem anticorpos anti-glipicana 3; e pode 14 obter-se anticorpo humano contra a glipicana 3 a partir de células produzidas tornando imortais as células que produzam o anticorpo anti-glipicana 3 (vejam-se as Publicações de Pedidos de Patente Internacionais Nos. WO 94/25.585, WO 93/12.227, WO 92/03.918, e WO 94/02.602).

Pode cultivar-se o hibridoma produtor de anticorpo monoclonal que deste modo se preparou, em série com um meio de cultura de células, ou pode armazenar-se durante um prazo longo, em azoto liquido.

Podem obter-se anticorpos monoclonais a partir dos hibridomas, por exemplo, por cultura do hibridoma recorrendo a um método padrão, recuperando-se os anticorpos monoclonais a partir do sobrenadante da cultura, ou administrando e proliferando o hibridoma num mamífero compatível com o hibridoma, e obtendo os anticorpos monoclonais do fluido dos áscitos. O primeiro método é adequado para se obter um anticorpo com um grau de pureza elevado, enquanto o segundo método acima é adequado para a produção do anticorpo em massa. O anticorpo monoclonal utilizado na invenção presente pode ser um anticorpo monoclonal recombinante preparado por técnicas de engenharia genética clonando o gene do anticorpo a partir do hibridoma, integrando o gene num vector adequado, introduzindo o vector num hospedeiro, e levando o hospedeiro a produzir o anticorpo monoclonal 15 recombinante (por exemplo, veja-se Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990).

Especificamente, isola-se mARN codificando para a região variável (de um anticorpo anti-glipicana 3 a partir de um hibridoma que produza anticorpo anti-glipicana 3. Pode isolar-se o mARN por um método conhecido A, por exemplo, por preparação de um ARN total pelo método de ultracentrifugação com guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) ou pelo método AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), seguindo-se a preparação do mARN de interesse utilizando um Estojo de Purificação de mARN (Pharmacia), ou outros semelhantes. Além disto, também se pode preparar directamente o mARN utilizando um Estojo de Purificação de mARN QuickPrep (Pharmacia).

Sintetiza-se o cADN da região V do anticorpo a partir do mARN que deste modo se obteve utilizando transcriptase reversa. Pode levar-se a cabo a sintese do cADN utilizando, por exemplo, um Estojo AMV de Sintese da primeira cadeia de cADN com Transcriptase Reversa (Seikagaku Corporation), ou outros semelhantes. Também se pode levar a cabo a sintese e a amplificação de cADN, por exemplo, utilizando o método 5'-RACE que recorre a um Estojo 5'-Ampli FINDER RACE (Clontech) e por PCR (Frohman, Μ. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) . 16

Purifica-se o fragmento de ADN alvo a partir do produto de PCR que daquela forma se obteve, e depois liga-se a um vector de ADN para se preparar um vector recombinante. Introduz-se então o vector em, por exemplo, E. coli; e por selecção de colónias obtém-se o vector recombinante pretendido. Determina-se então sequência de nucleótidos do ADN alvo recorrendo a um método conhecido, tal como o método de terminação de cadeia de didesoxinucleótido.

Depois de se ter obtido a codificação do ADN da região V do anticorpo anti-glipicana 3 alvo, integra-se este ADN num vector de expressão que contenha ADN codificando para a região constante (região C) do anticorpo pretendido.

Para se produzir o anticorpo anti-glipicana 3 para utilização na invenção presente, integra-se o gene do anticorpo num vector de expressão de um tal modo que o gene seja expresso sob o controlo de uma região de controlo de expressão, por exemplo, um incrementador e um promotor. Em seguida, transforma-se uma célula hospedeira com o vector de expressão e induz-se a expressão do anticorpo. em vectores de

Pode expressar-se o gene do anticorpo integrando o ADN que codifica para a cadeia pesada do anticorpo (cadeia H) e o ADN que codifica para a cadeia leve do anticorpo (cadeia L) , em separado, 17 expressão, e em seguida transformando em simultâneo uma célula hospedeira com estes vectores; ou integrando os ADN que codificam para a cadeia H e para a cadeia L num único vector de expressão, e transformando uma célula hospedeira com este vector (veja-se o WO 94/11.523).

Além da célula hospedeira tal como se descreveu acima, pode utilizar-se um animal transgénico para produzir anticorpo recombinante. Por exemplo, pode preparar-se um gene fundido inserindo o gene do anticorpo num gene que codifique para uma proteína (por exemplo, caseína β de cabra) que seja produzida no leite. Injecta-se então um fragmento de ADN contendo o gene fundido com o gene do anticorpo inserido, num embrião de cabra, e introduz-se o embrião numa cabra fêmea. Pode obter-se o anticorpo pretendido do leite produzido pela cabra transgénico (ou da sua prole), proveniente da cabra que recebeu o embrião. Além disto, podem administrar-se hormonas adequadas à cabra transgénica para se aumentar o volume de leite produzido pela cabra transgénica, que contém o anticorpo pretendido (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

Para além dos anticorpos citados acima, a invenção presente pode recorrer a anticorpos recombinados artificialmente modificados no seu genoma, tais como anticorpos quiméricos e anticorpos humanizados, com o objectivo de diminuir a heteroantigenicidade para seres humanos. Estes anticorpos modificados podem ser produzidos por métodos que já são conhecidos. 18

Podem obter-se anticorpos quiméricos ligando ADN que codifica para a região V do anticorpo (obtido tal como se descreveu acima) com ADN codificando par a região C do anticorpo humano, integrando o produto num vector de expressão, e depois introduzindo o vector num hospedeiro e induzindo a produção. Podem obter-se os anticorpos quiméricos para a invenção presente por estes métodos já conhecidos.

Preparam-se anticorpos humanizados, que também são referidos como anticorpos humanos re-enformados, enxertando uma região de determinação de complementaridade (CDR) de um anticorpo, proveniente de um mamífero não humano, tal como um murganho, na região de determinação de complementaridade de um anticorpo humano. Em geral, também são conhecidos na técnica os métodos de recombinação de genes para este processo (vejam-se a EP 125.023 e o WO 96/02.576) .

Especificamente, uma sequência de ADN concebida para ligar a CDR de um anticorpo murino à região-quadro (FR) de um anticorpo humano, é sintetizado por PCR utilizando a título de iniciadores diversos oligonucleótidos construídos para terem regiões que se sobrepõem às regiões terminais tanto da CDR como da FR (veja-se o método descrito no WO 98/13.388). 19

Selecciona-se uma região-quadro na qual a região de determinação de complementaridade forme um local excelente para ligação de antigénio, para a região-quadro de anticorpo humano ligada às regiões CDR. Podem substituir-se os aminoácidos na região-quadro da região variável do anticorpo, consoante seja necessário, para que a região de determinação da complementaridade do anticorpo re-enformado forme um local apropriado para ligação a antigénio (Sato, K. et al., Câncer Res. (1993) 53, 851-856) .

Utilizam-se regiões C de anticorpos humanos para as regiões C de anticorpos quiméricos e de anticorpos humanizados. Por exemplo, podem utilizar-se Ογΐ, 0γ2, 0γ3, e 0γ4 para a cadeia H e podem utilizar-se Ck e CX para a cadeia L. Além disto, pode modificar-se a região C do anticorpo humano para melhorar a estabilidade do anticorpo ou do seu processo de produção.

Um anticorpo quimérico é constituído pela região variável de um anticorpo derivado de um mamifero não humano e uma região constante derivada de um anticorpo humano, enquanto um anticorpo humanizado é constituído por uma região determinante da complementaridade de um anticorpo derivado de um mamifero não humano e uma região-quadro e uma região C derivadas de um anticorpo humano. Uma vez que o anticorpo humanizado é concebido para ter uma pequena antigenicidade nos seres humanos, ele é útil a titulo de 20 ingrediente activo no agente terapêutico de acordo com a invenção presente. O anticorpo que se utiliza na invenção presente não se limita à molécula de anticorpo completa, desde que exiba ligação a glipicana 3 e iniba a actividade da glipicana 3, e inclui portanto fragmentos e modificações do anticorpo referido bem como anticorpos divalentes e anticorpos monovalentes. Incluem-se nos exemplos dos fragmentos de anticorpo Fab, F(ab')2, Fv, Fab/c possuindo um Fab e um Fc completo, e Fv de cadeia singela (scFv) em que o Fv de cadeia H ou de cadeia L esteja ligado por um agente de ligação adequado. Especificamente, pode produzir-se um fragmento de anticorpo com um enzima tal como a papaina ou a pepsina. Em alternativa, pode construir-se um gene que codifique para um tal fragmento de anticorpo e introduzir-se em vectores de expressão e expressar-se em células hospedeiras adequadas (veja-se por exemplo, Co, M.S. et ai., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652- 663,Rousseaux, J. et al.r Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, e Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137).

Obtém-se scFv ligando uma região V de uma cadeia H a uma região V de uma cadeia leve de um anticorpo. A região V da cadeia H e a região V da cadeia L estão ligadas 21 no scFv através de um agente de ligação, e preferivelmente um agente de ligação peptídico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). Podem derivar-se a região V da cadeia H e a região V da cadeia L do scFv a partir de qualquer dos anticorpos descritos neste documento. 0 agente de ligação peptidico que liga as regiões V pode ser, por exemplo, qualquer péptido de cadeia singela incluindo 12 a 19 residuos de aminoácido.

Pode obter-se como segue o ADN codificando para scFv. Amplifica-se por PCR o ADN que codifica para cadeia H ou para a região V da cadeia H do anticorpo mencionado acima, bem como o ADN codificando para a cadeia L ou para a região V da cadeia L, utilizando como quadros as regiões de ADN que codificam para a totalidade ou para a parte pretendida das sequências de aminoácidos mencionadas acima, e os pares de iniciadores que especifiquem ambos os seus terminais. Em seguida leva-se a cabo uma amplificação adicional com uma combinação de ADN codificando para uma região de um agente de ligação peptidico, e um par de iniciadores que defina ambas as extremidades que se pretendem ligar à cadeia H e à cadeia L.

Além disto, uma vez preparado o ADN codificando para scFv, pode obter-se um vector de expressão contendo este ADN e um hospedeiro transformado com o vector de expressão pelos métodos habituais. Pode então obter-se o scFv pelos métodos habituais utilizando um tal hospedeiro. 22

Pode produzir-se um fragmento de anticorpo preparando um gene que codifique para o fragmento e expressando-o num hospedeiro do mesmo modo que se descreveu acima. 0 termo "anticorpo" tal como se utiliza neste documento, também inclui estes fragmentos de anticorpo.

Outro exemplo de um anticorpo modificado utilizado na invenção é um anticorpo anti-glipicana conjugado com qualquer uma de entre diversas moléculas, tais como polietilenoglicol (PEG). 0 termo "anticorpo", tal como se utiliza neste documento, também inclui estes anticorpos modificados. Pode preparar-se um tal anticorpo modificado modificando quimicamente um anticorpo obtido tal como acima. Os métodos de modificação já foram estabelecidos na técnica. 0 anticorpo utilizado na invenção presente pode ser um anticorpo biespecifico. Um anticorpo biespecífico pode ter locais de ligação a antigénio que reconhecem diferentes epitopos na molécula de glipicana 3, ou um local de ligação a antigénio pode reconhecer a glipicana 3 e o outro local de ligação a antigénio pode reconhecer uma substância citotóxica tal como um agente quimioterapêutico ou uma toxina derivada de uma célula. Isto permite que a substância citotóxica actue directamente sobre uma célula que expresse a glipicana 3, lesionando especificamente deste modo as células tumorais e suprimindo a proliferação de células tumorais. Pode preparar-se um anticorpo biespecifico ligando os pares H-L de dois tipos de 23 anticorpos. Ele também pode ser obtido fundindo hibridomas que produzam diferentes anticorpos monoclonais para se preparem células fundidas produzindo anticorpos biespecificos. Também se podem preparar anticorpos biespecificos por técnicas de engenharia genética.

Constrói-se um gene de um anticorpo tal como se descreveu acima, e pode expressar-se e obter-se por métodos conhecidos. No caso de células de mamíferos, pode expressar-se um gene ligando funcionalmente um promotor eficaz habitualmente utilizado, o gene de anticorpo a expressar, e um sinal de poli-A do seu lado a jusante 3'. Um exemplo do promotor/incrementador é um promotor/incrementador serôdio imediato humano de citomegalovírus.

Incluem-se nos exemplos de outros tipos de promotor/incrementador que se podem utilizar na invenção presente para expressão do anticorpo, por exemplo, um promotor/incrementador virai proveniente de um retrovírus, de um vírus polioma, de um adenovírus, ou do vírus símio 40 (SV40), e outros tipos de promotor/incrementador provenientes de células de mamíferos, tais como o factor de alongamento humano la (HEFla).

Quando se utiliza um promotor/incrementador SV40, pode facilmente fazer-se a expressão do gene pelo método de Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108), e quando se utiliza um promotor/incrementador HEFla, a expressão do 24 gene pode ser feita facilmente pelo método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

No caso de E. coli, a expressão do gene pode ser conseguida ligando funcionalmente um promotor eficaz habitualmente utilizado, uma sequência de sinal para a secreção de anticorpo, e o gene do anticorpo a expressar. Pode exemplificar-se o promotor através do promotor lacz e do promotor araB. Quando se utiliza o promotor lacz, pode conseguir-se a expressão pelo método de Ward et al. (Nature (1998) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), e quando se utiliza o promotor araB, pode conseguir-se a expressão pelo método de Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).

No que toca à sequência de sinal para a secreção de anticorpos, pode utilizar-se a sequência de sinal pelB (Lei, S. P. et al. J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) quando se produz o anticorpo no periplasma de E. coli. Depois de se isolar o anticorpo produzido no periplasma, volta a dobrar-se adequadamente a estrutura para utilização.

Inclui-se nas origens de replicação utilizada na invenção, por exemplo, as derivadas de SV40, de virus polioma, de adenovirus, ou de virus papiloma bovino (BPV). Para se amplificar o número de cópias do gene no sistema da célula hospedeira, o vector de expressão pode conter, por exemplo, o gene da aminoglicósido transferase (ΑΡΗ), o gene da timidina quinase (TK), o gene da xantina guanina fosfo- 25 ribosiltransferase (Ecogpt) de E. coli, ou o gene da dihidrofolato reductase (dhfr) a título de marcador de selecção.

Pode utilizar-se um qualquer sistema de expressão, por exemplo, um sistema de célula eucariótica ou um sistema de célula procariótica, para se produzir o anticorpo utilizado na invenção presente. Incluem-se como exemplos de células eucarióticas as células animais tai como um sistema estabelecido de células de mamífero ou um sistema de células de insecto e células de verdadeiros fungos filamentosos e células de levedura. Incluem-se nos exemplos de células procarióticas as células bacterianas, tais como células de E. coli. 0 anticorpo utilizado na invenção presente é expresso preferivelmente em células de mamífero, tais como células CHO, COS, mieloma, BHK, Vero, ou HeLa. A célula hospedeira transformada é então cultivada in vitro ou in vivo para se induzir a produção do anticorpo de interesse. Pode fazer-se a cultura da células hospedeira de acordo com métodos conhecidos. Por exemplo, podem utilizar-se DMEM, MEM, RPMI1640, ou IMDM a título de maios de cultura. Também se pode utilizar um suplemento tal como soro fetal de vitelo (FCS).

Podem utilizar-se meios conhecidos para se ensaiar a actividade de ligação a antigénio do anticorpo 26 utilizado na invenção presente (Antibodies A Laboratory Manual. Editor Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) e para medir a sua actividade inibidora de ligação ligando-receptor (Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690). A actividade de ligação a antigénio do anticorpo anti-glipicana 3 utilizado na invenção presente pode ser medida utilizando ELISA (ensaio de imuno-sorvente ligado a enzima), EIA (imunoensaio enzimática), RIA (radioimunoensaio), ou uma técnica com anticorpo fluorescente. Num imunoensaio enzimático, por exemplo, pode avaliar-se a actividade de ligação a antigénio adicionando uma amostra contendo o anticorpo anti-glipicana 3, tal como o sobrenadante de cultura de células produtoras de anticorpo anti-glipicana 3 ou o anticorpo purificado, a uma placa revestida com glipicana 3; adicionar-se um anticorpo secundário marcado com um enzima tal como fosfatase alcalina; incubar-se e depois lavar-se a placa; adicionar-se um substrato do enzima tal como fosfato de p-nitrofenilo; e medir-se a absorvância. Pode medir-se a citotoxicidade do anticorpo utilizado na invenção presente por métodos que são do conhecimento dos especialistas da técnica.

Pode medir-se a actividade de ADCC misturando células efectivadoras, células alvo, e anticorpo anti-glipicana 3, e depois determinando o teor em ADCC. Por exemplo, podem utilizar-se a titulo de células 27 efectivadoras células do baço de murganho, ou monócitos isolados da medula óssea ou de sangue periférico humano. Incluem-se nos exemplos de uma célula alvo uma linha de células humanas estabelecida, tal como a linha HuH-7 de células de hepatoma humano. Pode medir-se a actividade de ADCC marcando-se preliminarmente as células alvo com 51Cr; adicionar-se anticorpo anti-glipicana 3 às células; incubarem-se as células; e depois adicionarem-se células efectivadoras a uma razão adequada em relação às células alvo; recolher-se o sobrenadante depois da incubação; e contar-se a radioactividade no sobrenadante.

Pode medir-se a actividade de CDC misturando as células marcadas mencionadas acima com anticorpo anti-glipicana 3; adicionando-se complemento e incubando-se; e depois contando a radioactividade no sobrenadante.

Uma vez que é em geral necessária uma região Fc para que um anticorpo exerça citotoxicidade, o anticorpo anti-glipicana 3 utilizado na invenção presente contém de preferência uma região Fc naqueles casos em que o inibidor do crescimento da invenção presente utiliza a actividade citotóxica do anticorpo. 0 agente anti-cancro de acordo com a invenção presente destina-se a ser utilizado num método para evitar a recorrência do cancro por micrometástases intrahepáticas num paciente, após um tratamento por ressecção de um cancro, no cancro do figado, em que a glipicana 3 esteja 28 expressa nas células de cancro de fígado obtidas por ressecção. A dose eficaz é seleccionada de entre 0,001 mg e 1.000 mg por kg de massa corporal, por administração. Ora, pode seleccionar-se uma dose de entre 0,01 e 100.000 mg/corpo, por paciente. No entanto, a dose eficaz do agente anti-cancro de acordo com a invenção presente contendo anticorpo anti-glipicana 3 não se limita as doses enunciadas acima.

Administra-se em geral o agente anti-cancro de acordo com a invenção presente por uma via parentérica, por exemplo, por injecção (por exemplo, subcutânea, endovenosa, intramuscular, intraperitoneal) ou por uma via transdérmica, transmucosal, nasal, ou pulmonar. Ela também se pode administrar por via oral.

No que toca à altura da administração do agente anti-cancro de acordo com a invenção presente, ele pode ser administrado quer antes, quer depois de aparecerem os sintomas clínicos da doença. De acordo com a invenção, administra-se o agente anti-cancro de acordo com a invenção presente a título de terapia adjuvante depois da ressecção das células cancerosas do fígado.

Pode formular-se um agente terapêutico incluindo o anticorpo anti-glipicana 3 de acordo com a invenção presente a título de ingrediente activo, pelos métodos 29 habituais (Remington's Pharmaceutical Science, última edição, Mark Publishing Company, Easton, E.U.A.), e pode conter veículos e aditivos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico.

Estes veículos e aditivos farmacêuticos podem incluir água, solventes orgânicos aceitáveis do ponto de vista farmacêutico, colagénio, poli(álcool vinílico), polivinilpirrolidona, polímero carboxivinílico, carboximetilcelulose sódica, poliacrilato de sódio, alginato de sódio, dextrana solúvel em água, carboximetilamido sódico, pectina, metilcelulose, etilcelulose, goma xantana, goma-arábica, caseína, agar, polietilenoglicol, diglicerina, glicerina, propilenoglicol, vaselina, parafina, álcool estearílico, ácido esteárico, albumina de soro humano (HSA), manitol, sorbitol, lactose, e um tensioactivo aceitável a título de aditivo farmacêutico. 0 ou os aditivos destes tipos podem ser seleccionados de forma adequada consoante a forma de dosagem do agente terapêutico da invenção presente, mas não se limitam aso que se listaram acima. Por exemplo, pode preparar-se uma formulação injectável dissolvendo anticorpo anti-glipicana 3 purificado num solvente tal como soro salino fisiológico, um tampão, ou uma solução de glucose, e adicionar-se em seguida á solução um inibidor da absorção tal como Tween 80, Tween 20, gelatina, ou albumina de soro humano. Ou pode utilizar-se o agente liofilizado para se 30 preparar uma forma de dosagem, que é reconstituída por dissolução antes da utilização. Incluem-se nos exemplos do excipiente utilizado para a liofilização os álcoois de açúcares e os sacáridos, tais como o manitol e a glucose.

EXEMPLOS A invenção presente é descrita em mais pormenor nos exemplos proporcionados adiante, mas estes exemplos não limitam o âmbito da invenção presente.

Exemplo 1

Eficácia do anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana no modelo de transplante intrahepático em murganho (1) Determinação da α-fetoproteína (AFP)

Determinou-se a concentração em AFP humana no soro a título de marcador tumoral utilizando um estojo de ELISA para a determinação da AFP humana (Hope Laboratories). O limite de detecção por ELISA é de cerca de 1 ng/mL, e considerou-se que a concentração nas amostras que não atingiam o limite de detecção era de 1 ng/mL. Para se obter o soro, recolheu-se sangue num Separapit S (Sekisui Chemical) por recolha de sangue orbital, deixou-se repousar durante 15 minutos à temperatura ambiente depois centrifugou-se durante 20 minutos a 1200 χ g. 31 (2) Preparação do modelo de transplante intrahepático em murganho

Preparou-se tal como se segue um modelo de transplante intrahepático em murganho. Ajustaram-se células HepG2 (ATCC) a 1 χ 108/mL com meio de Hanks (Sigma) . Sob anestesia com nembutal, injectaram-se 50 yL da suspensão de células HepG2 (5 χ 106/murganho) adentro da cápsula hepática de murganhos nus (Charles River). Determinou-se a concentração em AFP no sangue no dia 21 após o transplante, e repartiram-se os animais para os quais se obtiveram valores de 10-100 ng/mL por dois grupos (n = 4). Nesta altura, as células cancerosas do fígado (massa tumoral) não eram observáveis visualmente. Estes animais representam um modelo portadores de micrometástases intrahepáticas sobrevivas, após ressecção do fígado. (3) Administração de anticorpo

Preparou-se a formulação para administração no dia da administração, diluindo anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana (veja-se o Exemplo de Referência adiante) a 0,5 mg/mL em soro salino fisiológico (Otsuka Pharmaceutical). Administrou-se a formulação ao modelo em murganho acima a 10 mL/kg pela veia da cauda, nos dias 21 e 28 após o transplante tumoral. Administrou-se o soro salino fisiológico do mesmo modo a título de controlo negativo. 32 (4) Avaliação do efeito antitumoral

Avaliou-se 0 efeito antitumoral com base na concentração em AFP no 35° dia após a transplantação tumoral. Tal como se pode observar na Figura 1, concentração em AFP no 35° dia após a transplantação tumoral era menor para o grupo que havia recebido o GC33, do que para o grupo a que se administrar veiculo, indicando que o anticorpo da invenção demonstra um efeito antitumoral.

Tal como os resultados acima demonstram, o GC33 exibia um efeito antitumoral no modelo de transplante intrahepático, sugerindo que o anticorpo da invenção é útil em terapia adjuvante.

Exemplo 2

Teste de uma administração precoce do anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana no modelo de transplante intrahepático em murganho (1) Determinação da <x-fetoproteína (AFP)

Determinou-se a concentração em AFP humana no soro a titulo de marcador tumoral utilizando um estojo de ELISA para a determinação da AFP humana (Hope Laboratories). 0 limite de detecção por ELISA é de cerca de 1 ng/mL, e considerou-se que a concentração nas amostras 33 que não atingiam o limite de detecção era de 1 ng/mL. Para se obter o soro, recolheu-se sangue num Separapit S (Sekisui Chemical) por recolha de sangue orbital, deixou-se repousar durante 15 minutos à temperatura ambiente depois centrifugou-se durante 20 minutos a 1200 χ g. (2) Preparação do modelo de transplante intrahepático em murganho

Preparou-se tal como se segue um modelo de transplante intrahepático em murganho. Ajustaram-se células HepG2 (ATCC) a 1 χ 108/mL com meio de Hanks (Sigma) . Sob anestesia com nembutal, injectaram-se 50 yL da suspensão de células HepG2 (5 χ 106/murganho) adentro da cápsula hepática de murganhos nus (Charles River). No dia a seguir ao transplante repartiram-se os animais por dois grupos (n = 10) . Embora estivesse presente HepG2 nos fígados dos murganhos no dia após o transplante, não se detectou AFP humana no soro de murganho nessa altura. Estes animais representam um modelo clinicamente mais próximo de portadores de micrometástases intrahepáticas remanescentes após ressecção hepática. (3) Administração de anticorpo

Preparou-se a formulação para administração no dia da administração, diluindo anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana (veja-se o Exemplo de Referência adiante) a 0,5 mg/mL em soro salino fisiológico (Otsuka 34

Pharmaceutical). Administrou-se a formulação ao modelo em murganho acima a 10 mL/kg pela veia da cauda, no após o transplante tumoral e no 7o dia após o transplante tumoral. Administrou-se o soro salino fisiológico do mesmo modo a titulo de controlo negativo. (4) Avaliação do efeito antitumoral

Avaliou-se o efeito antitumoral com base na concentração em AFP no 15° e no 40° dia após o transplante do tumor. Tal como se mostra na Figura 2, não se observou um aumento da concentração em AFP em nenhuma destas alturas no grupo a que se administrou GC33. Por outro lado, observou-se um aumento da concentração em AFP para o grupo a que se administrou o veiculo.

Tal como o mostram os resultados acima, o crescimento do tumor também era inibido num modelo no qual se transplantavam intrahepaticamente células de cancro do figado, por administração de anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana em que não se detectou AFP, indicando que o anticorpo da invenção presente é útil em terapia adjuvante.

Exemplo de Referência

Preparação de anticorpo GC33 de murganho anti-glipicana 3 humana 35

Utilizando a titulo imunogénico uma proteína de fusão (GC-3) de GST e o péptido a partir da alanina na posição 524 e até à lisina na posição 563 da glipicana 3, imunizaram-se três murganhos Balb/c (adquiridos à Charles River Japão) e três murganhos MRL/lpr. Na imunização inicial, administrou-se por via subcutânea a emulsão preparada com FCA e ajustada a 100 yg de GC-3 por animal, por via subcutânea. Ao fim de duas semanas, administrou-se por via subcutânea uma emulsão preparada com FIA e ajustada a 50 yg por animal. Ao fim da quinta imunização, injectaram-se 50 yg por animal pela veia da cauda e para todos os murganhos, a título de imunização final, e depois levou-se a cabo a fusão celular. Despistou-se o hibridoma por ELISA utilizando imunoplacas sobre as quais se havia imobilizado a proteína nuclear GPC3 (a região hidrofóbica retirando-se entre o aminoácido 564 e o 580 do lado do terminal C). Seleccionaram-se os clones positivos obtendo-se monoclones pelo método da diluição limitativa. Este modo, obteve-se o anticorpo GC33 exibindo uma forte actividade de ligação a GPC3. Mostram-se respectivamente as sequências de aminoácidos das regiões variáveis das cadeias H e L de GC33 na SEQ ID NO: 3 e na SEQ ID NO: 4,.

APLICABILIDADE INDUSTRIAL O agente anti-cancro de acordo com a invenção presente é útil para evitar o cancro e para evitar a recorrência do cancro. 36

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha <120> Terapia Adjuvante por utilização de Anticorpos Anti-Glipicana 3 <130> NI00 92 6 <140> EP 05780979.0 <141> 2005-08-23 <150> PCT/JP05/15607 <151> 2005-08-23 <150> JP 2005-90945 <151> 2005-03-28 <150> JP 2004-244273 <151> 2004-08-24 <160> 4 <170> Patente na versão 3.1 <210> 1 <211> 1743 <212> ADN <213> Homo sapiens 37 <4 Ο 0> 1 afcggccggga eegtgçgesc cgcgfcgcfctg gtggtggcça igctgctcag cttggacttc 60 ccgggacagg cgcagcccce gcscgccgccg ecggacgcca octgtcacca agteegefcec 120 ttctfcccaga gactgcagec cggacteâag tgggtgeeag aaactcccgt gccaggateca 180 çafcttgcaag tatgtctccc taagggecoa acatgctgcfc eaagaaagat ggaagaaaaa 240 caccaactaa cagcacgatt gaaçatggaa c&gctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300 aagt&ottaa ttatfceagaa tgctgcggtt ttccaagagg ccttfcgaaat· tgttgttcgc 360 catgçcaaga actacacc&a tgccafcgt&c aagaaeaact. acccaagcct gactecacaa 420 gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaea gatgtgt.ctc tctacatctfc ggg*-«etgac 480 atcaatgtag atgaeatggt caatgaattg fcttgacagcc fcgtttocagt catctatacc $40 cagctaatga acccaggcct gçc&gattca gcettggaca teaatgagtg cctccgagga 600 geaagacgtg acctgaaagfc «tttgggaat ttccccaagc ttattatgae ccaggtttcc 660 aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga afcctfcggaat tgaagtgatc 720 aacacaactg atcacctgaa gttcagt&ag gactgtggcc gaatgctcac cagaatgtgg 760 cactgctctt actgccaggg actgatg&tg gfctaaaccct gtggcggtta ctgcaatgtg 840 gtcatgcaag gctgtstggc aggtgtggfcg gagattgaca agtactggag agaatacatt 500 ctgtcccttg aagaacttgt gaatggcatg tacagaafcct atgacatgga. g&acgtaçtg 860 cttggtctct tttcaacaat ccatgattet atecagtatg tccagaagaa tgcaggaaag 1020 ctgaccacca ctattggcaa gttafcgtgcc cattctcaac aacgceaata tagatcfcgct 1080 feattatcctg aagatctctt uattgacaag aaagtattaa aagttgstca tgtagaacat 1140 gaagaaacct tatccagccg «agaagggaa etaafctcaga agfctgaagte tttcatcage 1260 ttctatagfcg etttgccfcgg cfcacatctge agceatagce ctgtggcgga aaacgacace 1260 ctttgccgga atggacaaga actcgtggag agatacagcc aaaaggcagc aaggaatgga 1320 atgaaaaacc agttcaatct çgatgagctg aaaatgaagg gccctgagcc agtggtcagt 1380 caaattattg acaaaetgaa gcacattaac eagctcctga gaaccafcgtc tatgcccaaa 1440 ggtagagstc tggataaaaa cctggatgag gaagggtttg aaagtggaga ctgcggtgat 2 soo gatgaagatg agtgcattgg «ggctctggt gatggaatga taaaagtgaa gaatcagcta 1560 cgcttccttg- cagaactggc etatgatctg gatgtggatg atgegcctgg aaacagtcag 1620 eaggcaactc cgaaggacaa cgsgataagc acctttcaca acctcgggaa cgttcatfccc 1680 cggctgaagc ttetcâceag catggccatc tcggfeggtgt gcttcttctt cctggtgcac 1740 tga 1743

<210> 2 <211> 580 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 38 mt 1 Ma Gly Thr val 5 Arg Thr Ala Cys Leu 1Ô Val Vâi Ala Mefc Leu 15 Leu Ser L eu Asp Phe 20 Pro Gly Gin Ala Gin 25 Pro Pro Pro Pro Pro 30 Pro Asp Ala Thr Cys 35 His Gin Vai Arg Ser 40 Phe Phe Gin Arg Leu 45 Gin Pro Gly Leu Lys 50 Trp Vai Pro Giu Thr 55 Pro Vai Pro Gly Ser 60 Asp Leu Gin Vai Cys 65 Leu Pr o Lys Gly Pro 70 Thr Cys Cys Ser Arg 75 Lys Mefc Giu Glu Lys 80 Tyr Gin Leu Thr Ala 85 Arg Leu Asn Mefc Glu 90 Gin Leu Leu Gin Ser 95 Al© Ser Het Glu Leu 100 Lys Phe Leu xie 1 Xe 105 Gin Asn Ala Ala Val 110 Phe GXn Giu Ma Phe 115 Glu lio val val Arg 120 His Ala Lys Asn Tyr 125 Thr Asn Ala mt Phe 130 Lys Asn Asn Tyr Pro 135 Ser l$u Thr Pro Gin 140 Ala Phe Giu Phe Vai 145 siy Giu Phe Phe Thr ISO Asp Vai Ser Leu Tyr 155 He Leu Gly Ser Asp 160 Ik Asn Vai Asp Aso 165 Het Val Asn Giu Leu 170 Phe Asp Ser Leu Phe 375 Pro val XI* Tyr Thr ISO Gin Leu Met Asn Pro 185 Gly Leu Pro Asp Ser 190 Ala Leu Asp Ile Asn 195 Glu Cys Leu Arg Gly 200 Ala Arg Arg Asp Leu 205 Lys Vai phe Giy Asn 210 Phe Pro Lys Leu He 215 Met Thr Gin Val Ser 220 Lys Ser Leu Gin Vai 225 Thr Arg I le Phe Leu 230 Gin Ala Leu Asn Leu 235 Gly lie Glu Val Ile 240 &sn Thr Thr Asp Sis 24S Leu Lys Pbe Ser Lys 250 Asp Cys Gly Arg Met 255 Leu Thr Arg Met Trp 260 Tyr Cys Ser Tyr Cys 265 Gin Gly Leu Met Mét 270 Val Lys Pro Cys Gly 275 Gly Tyr Cys Asn vai 280 Val Met Gin Gly Cys 285 Met Ala Gly Vai Vai 290 Glu lie A$p Lys Tyr 295 Trp Arg Giu Tyr 1 Xe 300 Leu Ser Leu Giu e.i« 305 Leu Val Asn Gly Hefc 310 Tyr Arg Ile Tyr Asp 315 Mefc Glu Asn val Leu 320 Leu Gly Leu Phe Ser 325 Thr 11« HIS Asp Ser 330 lie Gin Tyr vai Gl» 335 Lys Asn Ala Gly Lys 340 Leu Thr Thr Thr ne 34 5 Gly Lys Leu Cys Ala 35 0 His Ser Gin Gin Arg 355 Gin Tyr Arg Ser Ala 360 Tyr Tyr Pro Giu Asp 385 Leu Phe lie Asp Lys Ιϊ'ΤΑ Lys val Leu Lys Val *> '* «; Ala His vai Giu Hi$ 300 Giu Giu Thr Leu Ser 385 ,3 > U Ser Arg Arg Arg Glu 390 Leu lie Gin Lys Leu 395 Lys Ser Phe X re Ser 4Õ0 Phe Tyr Ser Ala Leu 405 Pro Gly Tyr Ile Cys 410 Ser HiS Ser Pro Vai 415 Ai a GlU Asn Asp Thr 420 Leu Cys Trp Asn Gly 425 Gin Glu Leu val Glu 430 Arg Tyr 39 ser Glo Lys 435 Alei Glu Leu 450 Lys ífet Lys 463 Leu Lys His 61 y Afp Uai Leu Asp Cys Gly Asp SOÔ llm Lys 515 Vai Asp Leu Asp Vai Lys 545 •.Í-.7 V? A$P Asn Glu Pro Leu Lys Leu Phe Léu Vai Bis S80

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<210> 3 <211> 115 <212> PRT <213> Mus musculus <4Ο0> 3

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<211> 112 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 4

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Lisboa 7 de Agosto de 2013.

Claims (5)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método para evitar a recorrência do cancro em micrometástases intrahepáticas num paciente, após um tratamento do cancro por ressecção, para o cancro do figado, em que a glipicana 3 esteja expressa nas células cancerosas do figado obtidas na ressecção.
2. 2. Um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método de acordo com a reivindicação 1, em que o referido anticorpo seja administrado de modo a que não se observe no soro do paciente um aumento da concentração em AFP.
3. 3. Um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, em que o anticorpo seja um anticorpo monoclonal.
4. 4. Um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método de acordo com a reivindicação 3, em que o anticorpo monoclonal seja um anticorpo humanizado.
5. 5. Um anticorpo anti-glipicana 3 para utilização num método de acordo com a reivindicação 4, em que o anticorpo humanizado inclua as CDR da região variável da cadeia pesada, tal como se encontram na SEQ ID NO: 3, e 2 2 se as CDR de uma região variável da cadeia leve, tal como encontra, na SEQ ID NO: 4. Lisboa, 7 de Agosto de 2013.