KR20070050963A

KR20070050963A - 항 글리피칸 3 항체를 이용한 어쥬번트 요법

Info

Publication number: KR20070050963A
Application number: KR1020077005914A
Authority: KR
Inventors: 야스코 키노시타; 마사미치 스기모토; 히사후미 오카베
Original assignee: 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤
Priority date: 2004-08-24
Filing date: 2005-08-23
Publication date: 2007-05-16
Also published as: DK1800693T3; HK1107010A1; CN101014367A; US7871613B2; US20070269444A1; KR20130103580A; TWI377951B; PT1800693E; SI1800693T1; CN101014367B; EP1800693A4; CN102698267B; TW200612988A; EP1800693B1; CN102698267A; ES2422898T3; JPWO2006022407A1; PL1800693T3; JP4733042B2; KR101300546B1

Abstract

본 발명은 암치료 후에 투여하는 것을 특징으로 하는, 항 글리피칸 3 항체를 함유하는 항암제를 제공한다. 바람직하게는, 암치료 후는 간암의 치료 후이고, 특히 간암치료는 간암세포의 절제이다. 바람직하게는, 본 발명의 항암제는 절제된 간암세포 글리피칸 3이 발현되고 있는 경우에 사용된다. 또한, 바람직하게는, 항 글리피칸 3 항체는 모노클로날 항체이다. 본 발명의 항암제는 암의 예방 또는 재발예방에 유용하다.

항 글리피칸 3 항체, 간암치료, 항암제

Description

항 글리피칸 3 항체를 이용한 어쥬번트 요법{Adjuvant Therapy with the Use of Anti-Glypican 3 Antibody}

본 발명은 항 글리피칸 3 항체를 이용한 암치료 후의 어쥬번트 치료에 관한 것이다.

세포 표면상에 존재하는 헤파란(heparan) 황산 프로테오글리칸(proteoglycan)의 새로운 패밀리로서 글리피칸 패밀리의 존재가 보고었다. 현재까지 글리피칸 패밀리의 멤버로서 5종류의 글리피칸(글리피칸 1, 글리피칸 2, 글리피칸 3, 글리피칸 4 및 글리피칸 5)가 존재하는 것이 보고되어 있다. 이 패밀리의 멤버는 균일한 사이즈(약 60kDa)의 코어(core) 단백질을 가지고, 특이적으로 잘 유지된 시스테인(cysteine)의 배열을 공유하고 있으며, 글리코실 포스파티딜 이노스톨(glycosylphosphatidylinostiol, GPI) 앵커(anchor)에 의하여 세포막에 결합하고 있다.

중추신경의 발달에 있어서 세포분열 패턴이 비정상적인 초파리 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 변이체의 유전자 스크리닝에 의하여 Dally(division abnormally delayed) 유전자가 동정되었다. Dally의 cDNA는 글리피칸의 모든 특징을 포함하고 있는 척추동물의 막형(membrane) 프로테오글리칸(GRIPs)과 상동서열(24 내지 26% 상동)을 나타내는 산물을 암호화하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame, ORF)를 나타내고 있는 것을 알 수 있었다. 그 후에, Dally가 dpp(decapentaplegia) 수용체 기구를 조절하는 역할을 가지는 것이 시사되었고, 이로부터 포유동물의 글리피칸이 TGF와 BMP의 시그널 전달을 조절할 가능성이 시사되었다. 즉, 글리피칸이 헤파란 결합성 증식인자(EGF, PDGF, BMP2, FGF's 등)의 몇 개의 공동 수용체로서 기능할 가능성이 시사되었다.

글리피칸 3은 랫트의 소장으로부터 발생적으로 조절되어 있는 전사물로서 분리된 다음(참조: Filmus, J., Church, J.G., and Buick, R.n.(1988) Mol. Cell Biol. 8, 4243-4249), 글리피칸 패밀리의 분자량 69kDa 코어 단백질을 가진 GPI-결합형의 헤파란 황산 프로테오글리칸, OCI-5로서 동정되었다(참조: Filmus, J., Shi, W., Wong, Z.-M., and Wong M. J.(1995) Biochem. J. 311, 561-565). 사람에 있어서도 사람 위암 세포주로부터 글리피칸 3을 암호화하는 유전자가 MRX-7로서 단리되어 있다(참조: Hermann Lage et al., Gene 188 (1997) 151-156). 글리피칸 3은 인슐린과 같은 증식인자-2와 단백질-단백질 복합체를 형성하고, 이 증식인자의 활동을 조절하는 것이 보고되었다(참조: Pilia, G. et al, (1996) Nat. Genet. 12, 241-247). 이 보고는 글리피칸 3이 반드시 헤파란 황산쇄에 의하여 증식인자와 상호작용하고 있지 않다는 것을 시사하고 있다.

또한, 글리피칸 3에 대하여 간세포암 마커로서 이용할 수 있는 가능성이 있 다는 것이 보고되었고(참조: Hey-Chi Hsu et al., CANCER RESEARCH 57, 5179-5184(1997)), 항 글리피칸 3 항체가 간암세포에 대하여 세포장해활성을 가지며, 항암제로서 유용하다는 것이 보고되었다(참조: 국제공개공보 WO 03/00883).

그러나, 항 글리피칸 3 항체를 암치료 후의 어쥬번트 요법으로 이용할 수 있다는 것은 보고되지 않았다.

발명의 개시

본 발명의 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 항 글리피칸 3 항체가 암치료 후의 어쥬번트 요법에 유용하다는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다. 또한, 항 글리피칸 3 항체를 암치료 후의 암세포가 관찰되지 않은 단계에서 투여하여, 암의 재발방지가 가능하므로, 항 글리피칸 3 항체는 암의 예방제 또는 재발 예방제로서 유용하다.

발명의 상세한 설명

본 발명은 암치료 후에 투여하는 것을 특징으로 하는 항 글리피칸 3 항체를 함유하는 항암제를 제공한다. 바람직하게는, 암치료 후는 간암의 치료 후이고, 특히 간암치료는 간암세포의 절제(resection)이다. 바람직하게는, 본 발명의 항암제는 절제된 간암세포에 글리피칸 3이 발현되고 있는 경우에 사용된다. 또한 바람직하게는, 항 글리피칸 3 항체는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 항암제는 어쥬번트 요법에 있어서 이용하는 것에 특히 유용하다. 암의 치료·수술에 있어서 암세포가 제거되거나 암세포를 사멸시켰다고 여겨질 때에도 관찰되지 않은 암세포가 남아 있는 경우가 있다. 이러한 암세포가 남아있는 경우에는 일정기간 후에 암이 재발하는 경우가 있고, 암의 치료 후에 암의 재발을 예방하기 위한 치료를 수행할 필요가 있다. 이러한 치료를 어쥬번트 요법(adjuvant therapy) 또는 수술후 보조요법(post-surgical adjuvant therapy)이라고 한다.

본 발명에 있어서 암치료(cancer treatment)란, 암의 절제, 항암제를 이용하는 화학요법, 방사선요법, 경피적 에탄올 주입요법, 경피적 라디오파 조사열 응고요법(percutaneous radiofrequency thermal coagulation therapy), 경카테터 간동맥 색전요법(transcatheter arterial embolization therapy) 등 간세포의 증식억제·암세포의 사멸, 암세포의 감소 등을 목적으로 하는 한, 어떠한 치료라도 무방하다. 본 발명에 있어서 바람직한 암치료는 암의 절제이다. 암치료 후란, 이러한 치료가 수행된 후를 의미한다. 또한, 본 발명에 있어서 암치료 후(post-cancer treatment, after cancer treatment)란, 반드시 암이 치유된 것을 의미하지 않는다.

본 발명의 항 글리피칸 3 항체는 암치료 후의 환자에 있어서 글리피칸 3이 발현되고 있는지 아닌지를 확인한 후에 투여하여도 무방하다. 글리피칸 3이 발현되고 있는지 아닌지의 확인은 어떠한 방법으로 수행하여도 무방하나, 예를 들면, 항 글리피칸 3 항체 등을 이용하여 글리피칸 3 단백질의 발현을 확인하여도 무방하고, PCR법 등에 의하여 글리피칸 3 유전자의 발현을 확인하여도 무방하다.

암치료 후에 항 글리피칸 3 항체를 투여하는 시기는 어떠한 시기라도 무방하고, 암치료 직후에 투여하여도 무방하며 시기에 간격을 두어 투여하여도 무방하다. 본 발명에 있어서 바람직한 투여시기는 암치료 후로부터 암재발까지의 사이이다. 수술 후 보조요법의 경우, 전형적으로는 치료 후 12주 이내나 6주 이내에 투여를 개시한다. 암이 재발했는지 아닌지는 당업자에게 공지된 방법에 의하여 판단할 수 있고, 예를 들면, 육안소견이나 병리소견에 의하여 종양이 확인될 수 있는지 아닌지로 판단할 수 있다. 종양의 확인은 AFP 등의 종양 마커를 지표로 하는 방법이나 이미징(imaging) 등 당업자에게 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있다.

본 발명의 항암제를 이용하여 치료할 수 있는 암은 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 임파종, 췌장암, 담관암(bile duct cancer) 등 어떠한 암이라도 무방하다. 본 발명의 항암제를 이용하여 치료하는데 특히 적합한 암은 간암세포이다. 간암은 원발성 및 속발성 중 어느 것이라도 무방하고, 예를 들면, 간세포암, 간내담관암, 담관낭포선암(bile duct cystadenocarcinoma), 혼합형 간암, 간아종(hepatoblastoma), 미분화암(undifferentiated carcinoma), 혈관육종(angiosarcoma), 간평활근육종(leiomyosarcoma liver), 미분화육종(undifferentiated sarcoma) 등을 예로 들 수 있다.

본 발명의 항암제를 이용하는 어쥬번트 요법에 있어서 특히 바람직한 태양은 간암세포의 절제 후에 항 글리피칸 3 항체를 투여하여 간암의 재발을 예방하는 것이다.

본 발명에서 사용하는 항 글리피칸 3 항체는 그의 유래, 종류(모노클로날, 폴리클로날) 및 형상을 불문한다.

본 발명에서 사용하는 항 글리피칸 3 항체는 공지된 수단을 이용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 항 글리피칸 3 항체로서 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체는 하이브리도마(hybridoma)에 의하여 생산되는 것, 및 유전공학적 방법에 의하여 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에 의하여 생산되는 것을 포함한다.

모노클로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지된 기술을 사용하여, 이하와 같이 작제할 수 있다. 즉, 글리피칸 3을 감작항원으로서 사용하여 이를 통상의 면역방법에 따라 면역하고, 수득된 면역세포를 통상의 세포융합법에 의하여 공지된 친세포와 융합시켜, 통상의 스크리닝법에 의하여 모노클로날인 항체생산세포를 스크리닝하여 작제할 수 있다.

구체적으로는 모노클로날 항체를 작제하기 위해서 다음과 같이 하면 좋다. 우선, 항체수득의 감작항원으로서 사용되는 사람 글리피칸 3을 [Lage, H. et al., Gene 188 (1997), 151-156]에 개시된 글리피칸 3(MXR 7) 유전자/아미노산 서열에 따라 발현시켜 수득한다. 글리피칸 3의 유전자 서열 및 아미노산 서열은 각각 서열번호 1 및 2에 개시된다. 즉, 글리피칸 3을 암호화하는 유전자 서열을 공지된 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상등액 중으로부터 목적하는 사람 글리피칸 3 단백질을 공지된 방법으로 정제한다.

그런 다음, 이 정제 글리피칸 3 단백질을 감작항원으로서 이용한다. 또는, 글리피칸 3의 부분 펩티드를 감작항원으로서 사용할 수도 있다. 이 때, 부분 펩티드는 사람 글리피칸 3의 아미노산 서열로부터 화학합성에 의하여 수득할 수 있다.

항 글리피칸 3 항체는 ADCC·CDC 등의 세포장해활성에 의하여 항암작용을 나타내고, 또한 항 글리피칸 3 항체에 방사성 동위원소, 화학요법제, 세균유래 톡신(toxin) 등의 세포장해성 물질을 결합시켜 항암작용을 나타낸다. 항 글리피칸 3 항체가 인식하는 글리피칸 3 분자상의 에피토프(epicope)는 특별히 한정되지 않고, 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피토프라면 어떤 에피토프를 인식하여도 무방하다. 따라서, 본 발명의 항글리피칸 3 항체를 작제하기 위한 항원은 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피토프를 포함하는 부분 펩티드라면 어떠한 것을 이용하여도 무방하다.

감작항원으로 면역되는 포유동물로는 특별히 한정되지 않으나, 세포융합에 사용될 친세포와의 융합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류 동물, 예를 들면, 마우스, 랫트, 햄스터 또는 토끼, 원숭이 등이 사용된다.

감작항원을 동물에 면역하기 위하여는, 공지된 방법에 따라 수행된다. 예를 들면, 일반적인 방법으로서 감작항원을 포유동물의 복강 내 또는 피하에 주사하여 면역할 수 있다. 구체적으로는 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline)나 생리식염수 등으로 적당량 희석하거나 현탁한 것에 원한다면 통상의 어쥬번트, 예를 들면 프레운드(Freund) 완전 어쥬번트를 적량 혼합하고 유화한 후, 포유동물에게 4 내지 21일간 매일 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

전기 면역세포와 융합되는 친세포로는 포유동물의 미엘로마(myeloma) 세포를 이용한다. 이 미엘로마 세포는 공지된 여러가지 세포주, 예를 들면, P3(P3x63Ag8.653)(참조: J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag.8U.1(참조: Current Topics in Microbioligy and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(참조: Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(참조: Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(참조: Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), F0(참조: de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(참조: Trowbrige, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.

전기 면역세포와 미엘로마 세포와의 세포융합은 기본적으로는 공지된 방법. 예를 들면, 콜러와 밀스테인 등의 방법(참조: Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 준하여 수행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 전기 세포융합은 예를 들면, 세포융합 촉진제의 존재하에서 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합촉진제로는 예를 들면, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이 바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 원한다면 융합효율을 높이기 위하여 디메틸 설폭시드(dimethyl sulfoxide) 등의 보제조를 첨가할 수도 있다.

면역세포와 미엘로마 세포와의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예를 들면, 미엘로마 세포에 대하여 면역세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 이용하는 배양액으로는 예를 들면, 전기 미엘로마 세포주의 증식에 적합한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타, 이 종의 세포배양에 이용되는 통상의 배양액이 사용가능하고, 우태아혈청(fetal calf serum, FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 전기 면역세포와 미엘로마 세포의 소정량을 전기 배양액 중에 잘 혼합하여, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예를 들면, 평균분자량 1000 내지 6000 정도)를 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합하여 목적으로 하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 계속해서, 적당한 배양액을 순차적으로 첨가하고, 원심분리하여 상등액을 제거하는 조작을 반복하여, 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거한다.

이렇게 하여 수득된 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예를 들면, HAT 배양액(히포크산틴(hypoxanthine), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine)을 포함하는 배양액)으로 배양하여 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적으로 하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합 세포)가 사멸하기 위하여 충분한 시간(통상적으로 수일 내지 수주 동안) 계속한다. 그런 다음, 통상의 한계희석법을 실시하고, 목적으로 하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 수행한다.

또한, 사람 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 수득하는 것 이외에, 사람 림파구를 시험관 내에서 글리피칸 3에 감작하고, 감작 림파구를 사람 유래의 영구분열능을 가지는 미엘로마 세포와 융합시켜 글리피칸 3에의 결합활성을 가지는 원하는 사람항체를 수득할 수도 있다(참조: 특공평 1-59878호 공보 참조). 또한, 사람항체 유전자 의 모든 레파토리를 가지는 형질전환 동물에 항원이 되는 글리피칸 3을 투여하여 항 글리피칸 3 항체 생산세포를 수득하고, 이것을 불멸화(immortalization)시킨 세포로부터 글리피칸 3에 대한 사람 항체를 수득하여도 무방하다(참조: 국제특허출원 공개번호 WO 94/25585호 공보, WO 93/12227호 공보, WO 92/03918호 공보, WO 94/02602호 공보).

이렇게 하여 작제된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양할 수 있고, 액체질소 중에서 장기보존할 수 있다.

당해 하이브리도마로부터 모노클로날 항체를 수득하기 위하여는, 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양 상등액으로서 수득하는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 적합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시켜 그 복수(ascites fluid)로서 수득하는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 수득하는데 적합한 한편, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적합하다.

본 발명에서는 모노클로날 항체로서 항체 유전자를 하이브리도마로부터 클로닝하고 적당한 벡터에 통합하여(integrate), 이것을 숙주에 도입하고, 유전자 재조합기술을 이용하여 생산시킨 재조합형인 것을 이용할 수 있다(예를 들면, Vandamme A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990 참조).

구체적으로는 항글리피칸 3 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 항 글리피칸 3 항체의 가변(V) 영역을 암호화하는 mRNA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지된 방법, 예를 들면 구아니딘(guanidine) 초원심법(Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 의하여 수행하여 전(total) RNA를 제조하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia제) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 제조한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit(Pharmacia제)를 이용하여 mRNA를 직접 제조할 수도 있다.

수득된 mRNA로부터 역전사 효소를 이용하여 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Trasncriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사제) 등을 이용하여 수행한다. 또한, cDNA를 합성하거나 증폭하기 위하여는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acid Res. (1989) 71, 2919-2932) 등을 사용할 수 있다.

수득된 PCR 산물로부터 목적으로 하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이로부터 재조합 벡터를 작제하고, 대장균 등에 도입하여 콜로니(colony)를 선택하여 원하는 재조합 벡터를 제조한다. 그리고, 목적으로 하는 DNA의 염기서열을 공지된 방법, 예를 들면, 디데옥시누클레오티드 체인 터미네이션법(dideoxynucleotide chain termination method)에 의하여 확인한다.

목적으로 하는 항 글리피칸 3 항체의 V 영역을 암호화하는 DNA를 수득한 후, 이를 원하는 항체 정상영역(C영역)을 암호화하는 DNA를 함유하는 발현벡터에 혼입한다.

본 발명에서 사용된 항 글리피칸 3 항체를 제조하기 위하여는 항체 유전자를 발현제어 영역, 예를 들면, 인핸서(enhancer), 프로모터의 제어하에서 발현하도록 발현벡터에 혼입한다. 그런 다음, 이 발현벡터에 의하여 숙주세포를 형질전환시키고 항체를 발현시킨다.

항체 유전자의 발현은 항체중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 암호화하는 DNA를 각각 발현벡터에 혼입하여 숙주세포를 동시에 형질전환시켜도 무방하고, 또는 H쇄 및 L쇄를 암호화하는 DNA를 단일의 발현벡터에 혼입하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(WO 94/11523호 공보 참조).

또한, 재조합형 항체의 생산에는 상기 숙주세포뿐만 아니라, 형질전환 동물을 사용할 수 있다. 예를 들면, 항체 유전자를 유즙(milk) 중에 고유하게 생산되는 단백질(염소β-카세인(casein) 등)을 암호화하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 제조한다. 항체 유전자가 삽입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배(embryo)에 주입하고, 이 배를 수컷 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소로부터 태어난 형질전환 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙으로부터 원하는 항체를 수득한다. 또한, 형질전환 염소로부터 생산되는 원하는 항체를 포함한 유즙양을 증가시키기 위하여, 적절한 호르몬을 형질전환 염소에게 사용하여도 무방하다(참조: Ebert, K.M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

본 발명에서는 상기 항체 이외에 사람에 대한 이종항원성(heteroantigenicity)을 저하시키는 등을 목적으로 하고 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체, 예를 들면, 키메라 항체, 사람화(humanized) 항체를 사용할 수 있다. 이들의 개변항체는 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 전기와 같이 하여 수득한 항체 V 영역을 암호화하는 DNA를 사람항체 C 영역을 암호화하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 혼입하여 숙주에 도입하고 생산시켜 수득된다. 이 공지된 방법을 이용하여 본 발명에 유용한 키메라 항체를 수득할 수 있다.

사람화 항체는 재구성(reshaped) 사람 항체라고도 불리워지고, 이것은 사람 이외의 포유동물, 예를 들면 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR: complementarity determining region)을 사람항체의 상보성 결정영역에 이식한 것이고, 그 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다(유럽 특허출원 공개번호 EP 125023호 공보, WO 96/02576호 공보 참조).

구체적으로는 마우스 항체의 CDR과 사람항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계한 DNA 서열을 CDR 및 FR 양쪽 말단영역에 오버랩하는 부분을 가지도록 작제한 수개의 올리고누클레오티드를 프라이머로서 이용하여 PCR법에 의하여 합성한다(WO 98/13388호 공보에 기재된 방법을 참조).

CDR을 통하여 연결되는 사람항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원 결합부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라 재구성 사람항체의 상보성 결정영역이 적절한 항원 결합부위를 형성하도록 항체의 가변영역에 있어서 프레임워크 영역의 아미노산을 치환하여도 무방하다(참조: Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

키메라 항체 및 사람화 항체의 C 영역에는 사람항체가 사용되고, 예를 들면, H쇄로는 Cｒ1, Cｒ2, Cｒ3, Cｒ4를, L쇄로는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그 생산의 안정성을 개선하기 위하여 사람항체 C 영역을 변형하여도 무방하다.

키메라 항체는 사람 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 사람항체 유래의 정상영역으로 구성된다. 한편, 사람화 항체는 사람 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과, 사람항체 유래의 프레임워크 영역 및 C 영역으로 구성된다. 사람화 항체는 사람체내에 있어서 항원성이 저하되어 있으므로 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 유용하다.

본 발명에서 사용되는 항체는 항체의 전체분자에 한정하지 않고 글리피칸 3에 결합하고, 글리피칸 3의 활성을 저해하는 한, 항체의 단편 또는 그의 변형물이어도 무방하고, 이가항체(divalent antibody)와 일가항체(monovalent antibody)도 포함된다. 항체의 단편으로는 Fab, F(ab')2, Fv, 1개의 Fab와 완전한 Fc를 가지는 Fab/c, 또는 H쇄 또는 L쇄의 Fv를 적당한 링커(linker)로 연결시킨 싱글체인 Fv(scFv)를 예로 들 수 있다. 구체적으로는 항체를 효소, 예를 들면, 파파인(papain), 펩신(pepsin)으로 처리하여 항체단편을 생성시키거나 이들 항체단편을 암호화하는 유전자를 구축하고, 이를 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포로 발현시킨다(예를 들면, Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology(1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132-137 참조).

scFv는 항체의 H쇄 V 영역과 L쇄 V 영역을 연결하여 수득된다. 이 scFv에 있어서, H쇄 V 영역과 L쇄 V 영역은 링커, 바람직하게는 펩티드 링커를 통하여 연결된다(참조: Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1998) 85, 5879-5883). scFv에 있어서 H쇄 V 영역 및 L쇄 V 영역은 본 명세서에 항체로서 기재된 것 중 어느 하나의 유래이어도 무방하다. V 영역을 연결하는 펩티드 링커로는, 예를 들면, 아미노산 12 내지 19 잔기로 구성되는 임의의 단쇄(single-stranded) 펩티드가 이용된다.

scFv를 암호화하는 DNA는 전기 항체의 H쇄 또는 H쇄 V 영역을 암호화하는 DNA, 및 L쇄 또는 L쇄 V 영역을 암호화하는 DNA 안에, 이들 서열 내에 전부 또는 원하는 아미노산 서열을 암호화하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양 끝을 규정하는 프라이머대(pair)를 이용하여 PCR법에 의하여 증폭한 다음, 펩티드 링커 부분을 암호화하는 DNA, 및 그 양 끝이 각각 H쇄, L쇄와 연결시키도록 규정하는 프라이머대를 조합하고 증폭하여 수득한다.

또한, 일단 scFv를 암호화하는 DNA가 작제되면, 이들을 함유하는 발현벡터, 및 전기 발현벡터에 의하여 형질전환시킨 숙주를 당업계의 통상의 방법에 따라 수득할 수 있고, 그 숙주를 이용하여 당업계의 통상의 방법에 따라 scFv를 수득할 수 있다.

이들 항체의 단편은 전기와 마찬가지로 하여 그 유전자를 수득하고 발현시켜, 숙주에 의하여 생산시킬 수 있다. 본 발명에 있어서, 「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.

항체의 변형물로서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 등의 각종 분자와 결합한 항 글리피칸 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에 있어서 「항체」에는 이들의 항체 변형물도 포함된다. 이러한 항체 변형물은 수득된 항체에 화학적인 변형을 주어 수득할 수 있다. 또한, 항체의 변형방법은 이 분야에 있어서 이미 확립되어 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중특이성 항체(bispecific antibody)이어도 무방하다. 이중특이성 항체는 글리피칸 3 분자상의 다른 에피토프를 확인하는 항원 결합부위를 가지는 이중특이성 항체이어도 무방하고, 하나의 항원 결합부위가 글리피칸 3을 확인하고, 다른 하나의 항원결합부위가 화학요법제, 세포유래 톡신(toxin) 등의 세포상해성 물질(cytotoxic substance)을 확인하여도 무방하다. 이런 경우, 글리피칸 3을 발현하고 있는 세포에 직접 세포상해성 물질을 작용시켜 종양세포에 특이적으로 상해를 가하고, 종양세포의 증식을 억제할 수 있다. 이중특이성 항원은 2 종류의 항체의 HL대를 결합시켜서 작제할 수도 있고, 다른 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜서 이중특이성 항체생산 융합세포를 작제하고 수득할 수도 있다. 또한, 유전공학적 방법에 의하여 이중특이성 항체를 작제할 수도 있다.

상술한 바와 같이 구축한 항체 유전자는 공지된 방법에 의하여 발현시켜 수득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 발현시키는 항체 유전자, 그의 3'측 하류에 폴리 A 시그널을 기능적으로 결합시켜서 발현시킬 수 있다. 예를 들면, 프로모터/인핸서로는 사람 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 예로 들 수 있다.

또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용할 수 있는 프로모터/인핸서로서 레트로 바이러스(retrovirus), 폴리오마 바이러스(polyoma virus), 아데노 바이러스(adenovirus), 시미안 바이러스 40(simian virus 40, SV40) 등의 바이러스 프로모터/인핸서, 또는 사람 엘롱게이션 팩터 1α(human elongation factor 1α, HER1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인핸서 등을 예로 들 수 있다.

SV40 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 멀리간(Mulligan) 등의 방법(참조: Nature (1979) 277, 108)에 의하거나, HER1α 프로모터/인핸서를 사용하는 경우는 미즈시마(Mizushima) 등의 방법(참조: Nucleic Acid Res. (1990) 18, 5322)에 의하여 용이하게 유전자 발현을 수행할 수 있다.

대장균의 경우, 상용되는 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 서열 및 발현시키는 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜서 전기 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터로는, 예를 들면, lacz 프로모터, araB 프로모터를 예로 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우는 워드(Ward) 등의 방법(참조: Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)에 의하여, 또는 araB 프로모터를 사용하는 경우는 베터(Better) 등의 방법(참조: Science (1998) 240, 1041-1043)에 의하여 발현할 수 있다.

항체분비를 위한 시그널 서열로는 대장균의 페리플라즘(periplasm)에 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(참조: Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)을 사용하면 좋다. 또한, 페리플라즘에 생산된 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 재구성(refold)하여 사용한다.

복제기원으로는, SV40, 폴리오마 바이러스, 아데노 바이러스, 소 파필로마 바이러스(bovine papilloma virus, BPV) 등으로부터 유래된 것을 이용할 수 있고, 숙주세포계에서 유전자 복제의 수의 증폭을 위하여, 발현벡터는 선택마커로서 아미노글리코시드 트랜스퍼라제(aminoglycoside transferase, APH) 유전자, 티미딘 키나제(thymidine kinase, TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase)(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산환원효소(dihydrofolate reductase, dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위하여, 임의의 발현계, 예를 들면 진핵세포 또는 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로는, 예를 들면, 수립된(established) 포유류 세포계, 곤충세포계, 진사상균(true filamentous fungus) 세포 및 효모세포 등의 동물세포 등을 예로 들 수 있고, 원핵세포로는, 예를 들면, 대장균 세포 등의 세균세포를 예로 들 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항체는 포유류 세포, 예를 들면, CHO, COS, 미엘로마, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다.

다음으로, 형질전환된 숙주세포를 시험관내 또는 생체내에서 배양하여 목적으로 하는 항체를 생산시킨다. 숙주세포의 배양은 공지된 방법에 따라 수행한다. 예를 들면, 배양액으로서 DMEM, MEM, RPMI 1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 항원결합활성(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 리간드 수용체(ligand-receptor) 결합저해활성(참조: Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690)의 측정에는 공지된 수단을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항 글리피칸 3 항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으로서, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소면역 측정법), RIA(방사면역 측정법) 또는 형광항체법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 효소면역 측정법을 이용하는 경우, 글리피칸 3 을 암호화한 플레이트에 항 글리피칸 3 항체를 포함하는 시료, 예를 들면, 항 글리피칸 3 항체 생산세포의 배양상등액이나 정제항체를 가한다. 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase) 등의 효소로 표지한 이차 항체를 첨가하고, 플레이트를 배양하고 세정한 후, p-니트로페닐(nitrophenyl) 인산 등의 효소기질을 가하여 흡광도를 측정하여 항원결합활성을 평가할 수 있다. 본 발명에 사용하는 항체는, 세포상해활성의 측정은 당업자에게 공지된 방법에 의하여 수행할 수 있다.

ADCC 활성은 이펙터(effector) 세포와 표적세포와 항 글리피칸 3 항체를 혼합하고, ADCC의 정도를 조사하여 측정할 수 있다. 이펙터 세포로서 예를 들면, 마우스 비장세포나 골수, 사람 말초혈로부터 분리된 단핵구 등을 이용할 수 있고, 표적세포로는 사람 간세포주 HuH-7 등의 사람주화세포(human established cell line)를 이용할 수 있다. 표적세포를 미리 ⁵¹Cr에 의하여 표지하고, 이것에 항 글리피칸 3 항체를 가하여 배양하고, 그런 다음 표적세포에 대하여 적절한 비율의 이펙터 세포를 가하여 배양한다. 배양 후 상등액을 수득하고, 상등액 중의 방사능(radioactivity)을 계산하여 ADCC 활성을 측정할 수 있다.

또한, CDC 활성은 상술한 표지표적세포와 항글리피칸 3 항체를 혼합한 다음, 보체를 첨가하여 배양하고, 배양 후에 상등액 중의 방사능을 계산하여 측정할 수 있다.

통상적으로 항체가 세포장해활성을 발휘하기 위하여 Fc부분이 필요하므로, 본 발명의 세포증식 저해제가 항체의 세포장해활성을 이용한 것인 경우에는, 본 발명에 사용하는 항 글리피칸 3 항체는 Fc부분을 포함하고 있는 것이 바람직하다.

본 발명의 항암제는 암의 예방 또는 암치료 후의 재발예방을 목적으로 사용된다. 특히 바람직하게는, 본 발명의 항암제는 간암세포의 절제 후에 간암의 재발예방을 목적으로 사용된다.

유효투여량은 1회에 체중 1kg당 0.001mg 내지 1000mg의 범위로 선택된다. 또는, 환자당 0.01 내지 100000mg/body의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항 글리피칸 3 항체를 함유하는 항암제는 이들 투여량에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 항암제는 통상적으로 비경구 투여경로이고, 예를 들면, 주사제(피하주사(subcutaneous), 정맥내 주사(intravenous), 근육내 주사(intramuscular), 복강내 주사(intraperitoneal) 등), 경피, 경점막, 경비, 경폐 등에서 투여되나, 경구투여도 가능하다.

또한, 본 발명의 항암제의 투여시기로는 환자의 임상증상이 발생하는 전후를 불문하고 투여할 수 있다. 본 발명의 특히 바람직한 태양은, 본 발명의 항암제는 간암세포의 절제 후에 어쥬번트 요법으로 투여할 수 있다.

본 발명의 항 글리피칸 3 항체를 유효성분으로 함유하는 치료제는 당업계의 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있고(참조: Remington's Pharmaceutocal Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, 미국), 의약적으로 허용되는 담체나 첨가물을 함께 포함하는 것이라도 무방하다.

이러한 담체 및 의약첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기용제, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈(polyvinylpyrrolidone), 카복시비닐 폴리머(carboxyvinyl polymer), 카복시메틸 셀룰로스(carboxymethyl cellulose) 나트륨, 폴리아크릴산 나트륨, 알긴산 나트륨, 수용성 덱스트란(dextran), 카복시메틸 스타치(carboxymethyl starch) 나트륨, 펙틴(pectin), 메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 잔탄 검(xanthan gum), 아라비아 검(gum arabic), 카세인, 한천(agar), 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린(diglycerin), 글리세린, 프로필렌글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴 알콜(stearyl alcohol), 스테아린산, 사람 혈청 알부민(HSA), 만니톨, 소비톨, 락토스(lactose), 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 예로 들 수 있다.

실제로 첨가물은 본 발명 치료제의 제형에 따라 상술한 바로부터 단독으로 또는 적절히 조합하여 선택가능하나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 예를 들면, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 항 글리피칸 3 항체를 용제, 예를 들면, 생리식염수, 완충액, 포도당 용액 등에 용해하고, 이것에 흡착방지제, 예를 들면, Tween 80, Tween 20, 젤라틴, 사람 혈청 알부민 등을 가한 것을 사용할 수 있다. 또는, 사용 전에 용해 재구성하는 제형으로 만들기 위하여 동결건조한 것이어도 무방하고, 동결건조를 위한 부형제로는, 예를 들면, 만니톨, 포도당 등의 당 알콜이나 당류를 사용할 수 있다.

본 명세서에 있어서 명시적으로 인용되는 모든 특허 및 참고문헌의 내용은 모두 본 명세서의 일부로 인용된다. 또한, 본 출원이 가지는 우선권 주장의 기초가 되는 출원인 일본특허출원 2004-244273 및 2005-90945호의 명세서 및 도면에 기재된 내용은 모두 본 명세서의 일부로 인용한다.

도 1은 본 발명의 항암제를 간내 이식 마우스 모델에 투여한 경우의 효과를 나타내는 그래프이다.

도 2는 본 발명의 항암제를 간내 이식 마우스 모델에 조기투여한 경우의 효과를 나타내는 그래프이다.

이하에서는 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세히 설명하였으나, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

실시예 1: 간내 이식 마우스 모델에 있어서 마우스 항 글리피칸 3 항체 GC33의 약효시험

(1) α-페토프로테인(α-fetoprotein, AFP)의 측정

종양 마커로서 사람 AFP 측정 ELISA 키트(HOPE LABORATORIES사제)를 이용하여, 혈청 중의 사람 AFP 농도를 측정하였다. ELISA의 측정한계는 약 1ng/mL이고, 검출한계 이하의 시료에 대하여는 1ng/mL로 하였다. 혈청은 안와채혈(orbital blood collection)에 의하여 혈액을 세파라피트 S(Separapit S)(세키스이화학)에 수득하고, 실온에서 15분간 정치한 후, 1200×g, 20분간 원심분리하여 수득하였다.

(2) 간내 이식 마우스 모델의 작제

간내 이식 마우스 모델은 이하와 같이 작제하였다. HepG2 세포(ATCC)를 행크스(Hanks) 배지(SIGMA사제)에서 1×10⁸개/mL이 되도록 제조하였다. 넴뷰 탈(nembutal)에 의한 마취 하에서 누드마우스(챨스리버)의 간장피막내에 HepG2 세포현탁액 50㎕(5×10⁶개/마우스)를 주입하였다. 이식 후 21일에 혈청 중의 AFP 농도를 측정하고, 10 내지 100ng/mL의 범위의 개체에 대하여 2군으로 나누었다(n=4). 이 시점에서는 간암세포(종양괴)는 육안으로는 관찰되지 않고, 간 절제 후에 잔존하는 미소 간내전이(intrahepatic micrometastasis)의 모델로서 이용하였다.

(3) 항체투여

마우스 항 사람 글리피칸 3 항체 GC33(하기의 참고예를 참조)를 투여 당일 생리식염수(오츠카제약)을 이용하여, 0.5mg/mL가 되도록 제조하고, 투여시료로 사용하였다. 상기 마우스 모델에 대하여 종양이식 후 21일째와 28일째에 투여시료를 10mL/kg으로 미정맥(tail vein)에 투여하였다. 음성 대조군으로는 생리식염수를 vehicle로서 마찬가지로 투여하였다.

(4) 항종양효과의 평가

항종양효과에 대하여는 항종양이식 후 35일째의 AFP 농도로 평가하였다. 그 결과, 도 1에서 보듯이, GC33 투여군으로는 Vehicle 투여군과 비교하여 종양이식 후 35일째에 있어서 AFP 농도의 저하가 관찰되고, 본 항체에 의한 항종양효과가 관 찰되었다.

이상으로부터 GC33이 간내 이식 모델에 대하여 항종양효과를 가지는 것이 나타났고, 본 항체의 어쥬번트 요법에의 사용이 가능하다는 것이 발견되었다.

실시예 2: 간내이식 마우스 모델에 있어서 마우스 항 사람 글리피칸 항체 GC33의 조기투여 시험

(1) α-페토프로테인(α-fetoprotein, AFP)의 측정

(2) 간내 이식 마우스 모델의 작제

간내 이식 마우스 모델은 이하와 같이 작제하였다. HepG2 세포(ATCC)를 행크스(Hanks) 배지(SIGMA사제)에서 1×10⁸개/mL이 되도록 제조하였다. 넴뷰 탈(nembutal)에 의한 마취 하에서 누드마우스(챨스리버)의 간장피막내에 HepG2 세포현탁액 50㎕(5×10⁶개/마우스)를 주입하였다. 이식 다음날의 개체에 대하여 무작위로 2군으로 나누었다(n=10). 이식 다음날의 시점에서는 마우스 간내에 HepG2가 존재하나, 마우스 혈청 중에 사람 AFP는 검출되지 않고, 보다 임상의 간 절제 후에 잔존하는 미소 간내전이(intrahepatic micrometastasis)에 가까운 모델로서 이용하였다.

(3) 항체투여

마우스 항 사람 글리피칸 3 항체 GC33를 투여 당일 생리식염수(오츠카제약)을 이용하여, 0.5mg/mL가 되도록 제조하고, 투여시료로 사용하였다. 상기 마우스 모델에 대하여 종양이식 후 다음날과 7일째에 투여시료를 10mL/kg으로 미정맥(tail vein)에 투여하였다. 음성 대조군으로는 생리식염수를 Vehicle로서 마찬가지로 투여하였다.

(4) 항종양효과의 평가

항종양효과에 대하여는 항종양이식 후 15일째와 40일째의 AFP 농도로 평가하였다. 그 결과, 도 2에서 보듯이, Vehicle 투여군에서는 AFP 농도의 상승이 관찰 되었던 것에 비하여, GC33 투여군에서는 어느 쪽의 측정시에 있어서도 AFP 농도의 상승이 관찰되지 않았다.

이상으로부터 간장암세포 간내 이식 모델에 대하여 AFP가 검출되지 않는 시기로부터 마우스 항 사람 글리피칸 3 항체 GC33을 투여하여도 종양증식이 억제됨이 나타나고, 본 항체의 어쥬번트 요법에의 사용가능성이 시사되었다.

참고예: 마우스 항 사람 글리피칸 3 항체 GC33의 작제

글리피칸 3의 524번째의 Ala부터 563번째의 Lys까지의 펩티드와 GST의 융합단백질(GC-3)을 면역원으로서, Balb/c(일본챨스리버에서 구입) 3마리, MRL/lpr 3마리에 대하여 면역을 수행하였다. 첫 면역에는 GC-3을 100㎍/head가 되도록 제조하고, FCA를 이용하여 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 2주 후에 50㎍/head가 되도록 제조한 것을 FIA로 에멀젼화한 것을 피하에 투여하였다. 5회 면역한 후, 전 마우스에 대하여 최종면역(50㎍/head)를 미정맥 내에 수행하여 세포융합하였다. 스크리닝은 C 말단측의 소수성 영역(564 내지 580 아미노산)을 결손시킨 가용형 GPC3 코어 단백질(core protein)을 고정화한(immobilized) 임뮤노플레이트(immunoplate)를 이용한 ELISA에 의하여 수행하였다. 양성 클론에 대하여는 한계희석법에 의하여 모노클론화하였다. 그 결과, GPC3에 대하여 강한 결합활성을 가지는 항체 GC33을 수득하였다. GC33의 H쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 3에, L쇄 가변영역의 아미노산 서열은 서열번호 4에 나타내었다.

본 발명의 항암제는 암의 예방 또는 재발예방에 유용하다.

<110> CHUGAI SEIYAKU, Kabushiki Kaisha <120> Adjuvent therapy using Anti-Glypican 3 Antibodies <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1743 <212> DNA <213> homo sapiens <400> 1 atggccggga ccgtgcgcac cgcgtgcttg gtggtggcga tgctgctcag cttggacttc 60 ccgggacagg cgcagccccc gccgccgccg ccggacgcca cctgtcacca agtccgctcc 120 ttcttccaga gactgcagcc cggactcaag tgggtgccag aaactcccgt gccaggatca 180 gatttgcaag tatgtctccc taagggccca acatgctgct caagaaagat ggaagaaaaa 240 taccaactaa cagcacgatt gaacatggaa cagctgcttc agtctgcaag tatggagctc 300 aagttcttaa ttattcagaa tgctgcggtt ttccaagagg cctttgaaat tgttgttcgc 360 catgccaaga actacaccaa tgccatgttc aagaacaact acccaagcct gactccacaa 420 gcttttgagt ttgtgggtga atttttcaca gatgtgtctc tctacatctt gggttctgac 480 atcaatgtag atgacatggt caatgaattg tttgacagcc tgtttccagt catctatacc 540 cagctaatga acccaggcct gcctgattca gccttggaca tcaatgagtg cctccgagga 600 gcaagacgtg acctgaaagt atttgggaat ttccccaagc ttattatgac ccaggtttcc 660 aagtcactgc aagtcactag gatcttcctt caggctctga 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Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp 145 150 155 160 Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro 165 170 175 Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu 180 185 190 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe 195 200 205 Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln 210 215 220 Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile 225 230 235 240 Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu 245 250 255 Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys Gln Gly Leu Met Met Val Lys 260 265 270 Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val Met Gln Gly Cys Met Ala Gly 275 280 285 Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu 290 295 300 Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu 305 310 315 320 Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys 325 330 335 Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile Gly Lys Leu Cys Ala His Ser 340 345 350 Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr 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Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Asn 85 90 95 Thr His Val Pro Pro Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110

Claims

암치료 후에 투여하는 것을 특징으로 하는, 항 글리피칸 3 항체를 함유하는 항암제.
제 1항에 있어서,

암치료 후는 간암의 치료 후인 것을 특징으로 하는

항암제.
제 2항에 있어서,

간암치료는 간암세포의 절제(resection)인 것을 특징으로 하는

항암제.
제 2항 또는 3항에 있어서,

절제된 간암세포에 글리피칸 3이 발현되고 있는 경우에 사용하는 것을

특징으로 하는

항암제.
제 1항 내지 제 4항의 어느 한 항에 있어서,

항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는

항암제.
암치료 후의 환자에 항 글리피칸 3 항체를 함유하는 항암제를 투여하여 암의 재발을 예방하는 방법.
제 6항에 있어서,

암치료 후는 간암의 치료 후인 것을 특징으로 하는

방법.
제 7항에 있어서,

간암치료는 간암세포의 절제인 것을 특징으로 하는

방법.
제 7항 또는 제 8항에 있어서,

절제된 간암세포에 글리피칸 3이 발현되고 있는 것을 특징으로 하는

방법.
제 6항 내지 제 9항의 어느 한 항에 있어서,

항체는 모노클로날 항체인 것을 특징으로 하는

방법.