WO2006022407A1 - 抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法 - Google Patents

抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法 Download PDF

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Masamichi Sugimoto
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Definitions

  • Glypican family has been reported as a new family of heparan sulfate proteodaricans present on the cell surface. To date, it has been reported that there are five types of Glypicans (Daribican 1, Glypican 2, Glypican 3, Glypican 4 and Glypican 5) as members of the Glypican family. Members of this family have a uniform size (approximately 60 kDa) core protein, share a specific and well-retained cysteine sequence, Is bound to the cell membrane.
  • Dal ly cDNA is a vertebrate membrane proteodarican that contains all the features of glypican.
  • human antibodies are used for the C region of chimeric and humanized antibodies.
  • Cr 1, Cr 2, C 3, C 4 can be used for the H chain
  • CK can be used for the L chain. it can.
  • the human antibody C region may be modified to improve the stability of the antibody or its production.
  • the DNA encoding scFv is the DNA encoding the H chain or H chain V region of the antibody, and the DM encoding the L chain or L chain V region.
  • the DNA part encoding the amino acid sequence is made into a saddle shape, amplified by PCR using a pair of primers that define both ends, and then DM that encodes a part of the peptide linker, and both ends are H chain, L It is obtained by combining and amplifying primer pairs that are specified so as to be linked to the strand.
  • the antibody used in the present invention is a bispecific antibody (bi spec i f i c
  • the bispecific antibody may be a bispecific antibody having an antigen binding site that recognizes different epitopes on the glypican 3 molecule, or one antigen binding site recognizes glypican 3 and the other antigen.
  • the binding site may recognize a cytotoxic substance such as a chemotherapeutic agent or a cell-derived toxin. In this case, the cytotoxic substance can be directly acted on the cells expressing glypican 3 to specifically damage the tumor cells, thereby suppressing the growth of the tumor cells.
  • Bispecific antibodies can be made by combining two HL pairs of antibodies, or using different monoclonal antibodies. A bispecific antibody-producing fused cell can also be produced by fusing the produced hyperidoma. Furthermore, bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • the CDC activity can be obtained by mixing the above-mentioned labeled target cells and anti-glypican 3 antibody, adding complement, performing incubation, and counting the radioactivity in the supernatant after culture. Can be measured.
  • an Fc moiety is required for an antibody to exert its cytotoxic activity. Therefore, when the cell growth inhibitor of the present invention utilizes the cytotoxic activity of an antibody, it is used in the present invention. It is preferred that the anti-glibican 3 antibody contains an Fc portion.
  • the anticancer agent of the present invention is used for the purpose of preventing cancer or preventing recurrence after cancer treatment. Particularly preferably, the anticancer agent of the present invention is used for the purpose of preventing recurrence of liver cancer after excision of liver cancer cells.
  • the administration time of the anticancer agent of the present invention can be administered regardless of before or after the clinical symptoms of the disease occur.
  • the anticancer agent of the present invention can be administered as an adjuvant therapy after excision of liver cancer cells.
  • the therapeutic agent containing the anti-glibican 3 antibody of the present invention as an active ingredient is a conventional method.
  • Can be formulated Remington's Pharmacyutical Science, late-stage medicine, Mark Publishing Co Immediately any, Eastern, USA) and includes pharmaceutically acceptable carriers and additives It may be.
  • Such carriers and pharmaceutical additives include water, pharmaceutically acceptable organic solvents, collagen, polyvinyl alcohol, polyvinyl pyrrolidone, dexoxyvinyl polymer, sodium carboxymethylcellulose, sodium polyacrylate, Sodium alginate, Water-soluble dextran, Sodium carboxymethyl starch, Pectin, Methylcellulose, Ethylcellulose, Xanthan gum, Gum arabic, Casein, Agar, Polyethylene glycol, Diglycerin, Daryserin, Propylene glycol, Vaseline, Paraffin, Stearyl Examples include alcohol, stearic acid, human serum albumin (HSA), mannitol, sorbitol, lactose, and surfactants acceptable as pharmaceutical additives.
  • HSA human serum albumin
  • the actual additive is selected from the above alone or in appropriate combination depending on the dosage form of the therapeutic agent of the present invention, but is not limited thereto.
  • the purified anti-glibican 3 antibody when used as an injectable preparation, is dissolved in a solvent, such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc., and adsorbent, such as Tween80, Tween20, gelatin, human serum. Those added with albumin or the like can be used.
  • a solvent such as physiological saline, buffer solution, glucose solution, etc.
  • adsorbent such as Tween80, Tween20, gelatin, human serum.
  • Those added with albumin or the like can be used.
  • it may be lyophilized so that it can be dissolved and reconstituted before use, and as an excipient for lyophilization, for example, sugar alcohols and saccharides such as mannitol and glucose are used. can do.
  • human AFP measurement ELISA kit manufactured by HOPE LABORATORIES
  • the ELISA measurement limit is approximately 1 ng / mL
  • the sample below the detection limit is 1 ng / mL.
  • Serum was obtained by orbital blood collection in Separapit S (Sekisui Chemical), left at room temperature for 15 minutes, and then centrifuged at 1200 xg for 20 minutes.
  • Mouse anti-human glypican 3 antibody GC33 was prepared on the day of administration using physiological saline (Otsuka Pharmaceutical Co., Ltd.) to 0.5 mg / mL, and used as an administration sample. The sample was administered to the mouse model at 10 mL / kg from the tail vein the next day and 7 days after tumor implantation. As a negative control, physiological saline was similarly administered as Vehi cle.
  • GC-3 was prepared at 100 g / head and emulsified with FCA was administered subcutaneously. Two weeks later, the preparation prepared to 50 g / head was emulsified with FIA and administered subcutaneously. After 5 immunizations, all mice were subjected to final immunization (50 g / head) in the tail vein for cell fusion.

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Abstract

　本発明は、癌治療後に投与されることを特徴とする、抗グリピカン３抗体を含有する抗癌剤を提供する。好ましくは、癌治療後は肝癌治療後であり、特に、肝癌治療は肝癌細胞切除である。好ましくは、本発明の抗癌剤は、切除された肝癌細胞にグリピカン３が発現している場合に使用される。また好ましくは、抗グリピカン３抗体はモノクローナル抗体である。本発明の抗癌剤は、癌の予防または再発予防に有用である。

Description

明細書
抗グリピカン 3抗体を用いたアジュバント療法 技術分野
本発明は、 抗グリビカン 3抗体を用いた癌治療後のアジュバント療法に関する。 背景技術
細胞表面上に存在するへパラン硫酸プロテオダリカンの新しいファミリ一とし てグリピカンファミリーの存在が報告されている。 現在までのところ、 グリピ力 ンファミリ一のメンバ一として、 5種類のグリピカン （ダリビカン 1、 グリピ力 ン 2、 グリピカン 3、 グリピカン 4およびグリピカン 5 ) が存在することが報告 されている。 このファミリ一のメンバーは、 均一なサイズ （約 60kDa) のコア夕 ンパク質を持ち、 特異的でよく保持されたシスティンの配列を共有しており、 グ リコシルフォスファチジルイノシトール （GPI) アンカ一により細胞膜に結合し ている。
中枢神経の発達における細胞分裂パターンが異常なショウジヨウバエメラノガ スター （Drosophi la melanogas ter) 変異体の遺伝子スクリーニングにより、 Dal ly (divis ion abnormal ly delayed) 遺伝子が同定された。 Dal ly の cDNAは、 グリピカンの全ての特徴を含んでいる脊椎動物の膜型プロテオダリカン
(GRIPs) と相同配列 （24〜26相同） を示す産物をコードするオープンリーディ ングフレーム （0RF) を表していることがわかっている。 その後、 dal lyが dpp (decapentaplegia) レセプ夕一機構を調節する役割を持つことが示唆されてお り、 このことから哺乳動物のグリピカンが TGFと BMPのシグナル伝達を調節して いる可能性を示唆している。 すなわち、 グリピカンがへパリン結合性増殖因子 (EGF、 PDGF、 BMP 2, FGF' s) 等） のいくつかの共同レセプ夕一として機能してい る可能性が示唆されていた。
グリピカン 3は、 ラットの小腸から発生的に調節されている転写物として分離 され (Fi lraus, J. , Church, J. G. , and Buick, R. n. (1988) Mol . Cel l Biol. 8, 4243-4249) 、 後にグリピカンファミリ一の、 分子量 69kDaのコアタンパク質を 持った、 GPI-結合型のへパラン硫酸プロテオダリカン、 0CI- 5として同定された (Fi lmus, J. , Shi , W. , Wong, Ζ. -Μ. , and Wong, M. J. (1995) Bi ochem. J. 311 , 561-565) 。 ヒトにおいても、 ヒト胃癌細胞株よりグリピカン 3をコードする遺 伝子が、 MRX-7として単離されている （Hermann Lage et al .， Gene 188 (1997) 151-156) 。 グリピカン 3はインスリン様増殖因子- 2とタンパク-タンパク複合 体を形成し、 この増殖因子の活動を調節することが報告されている （Pi l i a, G. et al, (1996) Nat. Genet. 12, 241-247) 。 この報告は、 グリピカン 3が必ずし もへパラン硫酸鎖によって増殖因子と相互作用しているのではないことを示唆し ている。
また、 ダリピカン 3について肝細胞癌マーカ一として利用できる可能性がある ことが報告されており （Hey- Chi Hsu et al . , CANCER RESEARCH 57, 5179- 5184 (1997) ) 、 さらに抗グリピカン 3抗体が肝癌細胞に対して細胞障害活性を有 し、 抗癌剤として有用であることが報告されている （国際公開公報 WO O 3 Z 0 0 8 8 3 ) 。
しかしながら、 抗グリビカン 3抗体を癌治療後のアジュバント療法として用い ることが可能であることは報告されていない。 発明の開示
本発明者らは、 鋭意研究を重ねた結果、 抗グリビカン 3抗体が癌治療後のアジ ュバント療法に有用であることを見出し、 本発明を完成させるに至った。 また、 抗グリピカン 3抗体を癌治療後の癌細胞が観察されない段階で投与することによ り、 癌の再発防止が可能であることから、 抗グリピカン 3抗体は癌の予防剤また は再発予防剤として有用である。 図面の簡単な説明
図 1は、 本発明の抗癌剤を肝内移植マウスモデルに投与したときの効果を示す グラフである。
図 2は、 本発明の抗癌剤を肝内移植マウスモデルに早期投与したときの効果を 示すグラフである。 発明の詳細な説明
本発明は、 癌治療後に投与されることを特徴とする、 抗グリピカン 3抗体を含 有する钪癌剤を提供する。 好ましくは、 癌治療後は肝癌治療後であり、 特に、 肝 癌治療は肝癌細胞切除である。 好ましくは、 本発明の抗癌剤は、 切除された肝癌 細胞にグリピカン 3が発現している場合に使用される。 また好ましくは、 抗グリ ピカン 3抗体はモノク口一ナル抗体である。
本発明の抗癌剤は、 アジュバント療法において用いるのに特に有用である。 癌 の治療 ·手術において癌細胞が取り除かれた若しくは癌細胞を死滅させたと考え られる場合でも、 観察されない癌細胞が残っていることがある。 そのような癌細 胞が残っている場合には、 一定期間後に癌が再発することがあり、 癌の治療後に 癌の再発を予防するための治療を行う必要がある。 そのような治療をアジュパン ト療法または術後補助療法という。
本発明において癌治療とは、 癌の切除、 抗癌剤を用いる化学療法、 放射線療法、 経皮的エタノール注入療法、 経皮的ラジオ波照射熱凝固療法、 経カテーテル 動 脈塞栓療法など、 癌細胞の増殖抑制 ·癌細胞の死滅、 癌細胞の減少などを目的と する限り、 如何なる治療でもよい。 本発明において好ましい癌治療は、 癌の切除 である。 癌治療後とは、 これらの治療が行われた後のことをいう。 なお、 本発明 においては、 癌治療後とは、 必ずしも癌が治癒されたことを意味しない。
本発明の抗グリビカン 3抗体は、 癌治療後の患者においてダリビカン 3が発現 しているか否かを確認した後に投与してもよい。 ダリビカン 3が発現しているか 否かの確認はどのような方法で行われてもよいが、 例えば、 抗グリビカン 3抗体 等を用いてグリピカン 3タンパク質の発現を確認してもよいし、 P C R法などに よりグリピカン 3遺伝子の発現を確認してもよい。
癌治療後に抗グリピカン 3抗体を投与するタイミングとしては如何なるタイミ ングでもよく、 癌治療の直後に投与してもよいし、 期間をあけて投与してもよい。 本発明において好ましい投与タイミングは癌治療後から癌再発までの間である。 術後補助療法の場合、 典型的には、 治療後 12週間以内や 6週間以内に投与を開 始する。 癌が再発したか否かは当業者に公知の方法により判断することができ、 例えば、 肉眼所見や病理所見により腫瘍が確認できるか否かで判断することがで きる。 腫瘍の確認は AFP等の腫瘍マーカ一を指標とする方法やイメージングなど、 当業者に公知の方法により行うことが可能である。
本発明の抗癌剤を用いて治療することができる癌は、 肝癌、 肺癌、 大腸癌、 乳 癌、 前立腺癌、 白血病、 リンパ腫、 勝臓癌、 胆管癌など、 如何なる癌でもよい。 本発明の抗癌剤を用いて治療するのに特に適した癌は肝癌細胞である。 肝癌は、 原発性および続発性のどちらでもよく、 例えば、 肝細胞癒、 肝内胆管癌、 胆管嚢 胞腺癌、 混合型肝癌、 肝芽腫、 未分化癌、 血管肉腫、 肝平滑筋肉腫、 未分化肉腫 などを挙げることができる。
本発明の抗癌剤を用いるアジュバント療法において特に好ましい態様は、 肝癌 細胞の切除後に抗グリピカン 3抗体を投与することにより、 肝癒の再発を予防す ることである。
本発明で使用される抗グリピカン 3抗体は、 その由来、 種類 （モノクローナル、 ポリクローナル） および形状を問わない。
本発明で使用される抗グリピカン 3抗体は、 公知の手段を用いてポリクローナ ルまたはモノク口一ナル抗体として得ることができる。 本発明で使用される抗グ リピカン 3抗体として、 特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。 哺 乳動物由来のモノクローナル抗体は、 ハイプリドーマにより産生されるもの、 お よび遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主 により産生されるものを含む。
モノクローナル抗体産生ハイプリドーマは、 基本的には公知技術を使用し、 以 下のようにして作製できる。 すなわち、 グリピカン 3を感作抗原として使用して、 これを通常の免疫方法にしたがって免疫し、 得られる免疫細胞を通常の細胞融合 法によって公知の親細胞と融合させ、 通常のスクリーニング法により、 モノクロ 一ナルな抗体産生細胞をスクリ一ニングすることによつて作製できる。
具体的には、 モノクローナル抗体を作製するには次のようにすればよい。 まず、 抗体取得の感作抗原として使用されるヒトグリピカン 3を、 Lage， H. et al . , Gene 188 (1997) , 15卜 156に開示されたグリピカン 3 (MXR 7 ) 遺伝子 Ζアミ ノ酸配列にしたがって発現させることによって得る。 グリピカン 3の遺伝子配列 およびアミノ酸配列は、 それぞれ配列番号 1およ 2に示される。 すなわち、 ダリ ピカン 3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクター系に挿入して適当な宿主 細胞を形質転換させた後、 その宿主細胞中または培養上清中から目的のヒトダリ ピカン 3夕ンパク質を公知の方法で精製する。
次に、 この精製グリピカン 3タンパク質を感作抗原として用いる。 あるいは、 ダリピカン 3の部分べプチドを感作抗原として使用することもできる。 この際、 部分べプチドはヒトダリピカン 3のアミノ酸配列より化学合成により得ることが できる。
抗グリピカン 3抗体は、 ADCO CDCなどの細胞障害活性により抗癌作用を示し、 また抗グリピカン 3抗体に放射性同位元素、 化学療法剤、 細菌由来トキシン等の 細胞傷害性物質を結合させることにより抗癌作用を示す。 抗グリビカン 3抗体の 認識するダリピカン 3分子上のェピトープは特定のものに限定されず、 ダリピカ ン 3分子上に存在するェピト一プならばどのェピト一プを認識してもよい。 従つ て、 本発明の抗グリピカン 3抗体を作製するための抗原は、 グリピカン 3分子上 に存在するェピトープを含む部分ペプチドであれば、 如何なるものを用いてもよ い。
感作抗原で免疫される哺乳動物としては、 特に限定されるものではないが、 細 胞融合に使用されるべき親細胞との適合性を考慮して選択するのが好ましく、 一 般的にはげつ歯類の動物、 例えば、 マウス、 ラット、 ハムスター、 あるいはゥサ ギ、 サル等が使用される。
感作抗原を動物に免疫するには、 公知の方法にしたがって行われる。 例えば、 一般的方法として、 感作抗原を哺乳動物の腹腔内または皮下に注射することによ り免疫することができる。 具体的には、 感作抗原を PBS (Phosphate-Buf fered Sal ine) や生理食塩水等で適当量に希釈または懸濁したものに所望により通常の アジュバント、 例えばフロイント完全アジュバントを適量混合し、 乳化後、 哺乳 動物に 4- 21 日毎に数回投与する。 また、 感作抗原免疫時に適当な担体を使用す ることもできる。
前記免疫細胞と融合されるの親細胞としては、 哺乳動物のミエローマ細胞を用 いる。 このミエローマ細胞は、 公知の種々の細胞株、 例えば、 P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immnol . (1979) 123, 1548-1550) 、 P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Mi crob iology and Immunology (1978) 81， 1-7) 、 NS-1 (Kohl er. G. and Mi l s tein, C. Eur. J. Immunol . (1976) 6， 511-519) 、 PC- 11 (Margul i es. D. H. et al .， Cel l (1976) 8, 405-415) 、 SP2/0 (Shu 1 man, M. et al .， Nature (1978) 276, 269-270) 、 FO (de St . Groth, S. F. et al .， J. Immuno l . Methods (1980) 35, 1-21) 、 S194 (Trowbr idge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) 、 R210 (Gal f re, G. et al .， Nature (1979) 277, 131- 133) 等が好適に使用される。
前記免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合は、 基本的には公知の方法、 たと えば、 ケーラ一とミルスティンらの方法 （Kohler. G. and Mi l s tein, 、 Methods Enzymol . (1981) 73, 3-46) 等に準じて行うことができる。
より具体的には、 前記細胞融合は、 例えば細胞融合促進剤の存在下に通常の栄 養培養液中で実施され 。 融合促進剤としては、 例えばポリエチレングリコール (PEG) 、 センダイウィルス （HVJ) 等が使用され、 更に所望により融合効率を高 めるためにジメチルスルホキシド等の補助剤を添加することもできる。
免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定することができる。 例え ば、 ミエ口一マ細胞に対して免疫細胞を卜 10倍とするのが好ましい。 前記細胞 融合に用いる培養液としては、 例えば、 前記ミエ口一マ細胞株の増殖に好適な
RPMI 1640培養液、 MEM培養液、 その他、 この種の細胞培養に用いられる通常の培 養液が使用可能であり、 さらに、 牛胎児血清 (FCS) 等の血清補液を併用するこ ともできる。
細胞融合は、 前記免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を前記培養液中でよく 混合し、 予め 37°C程度に加温した PEG溶液 （例えば平均分子量 1000-6000程 度） を通常 30- 60% (w/v) の濃度で添加し、 混合することによって目的とする 融合細胞 ひ、イブリド一マ） を形成する。 続いて、 適当な培養液を逐次添加し、 遠心して上清を除去する操作を繰り返すことにより、 ハイプリドーマの生育に好 ましくない細胞融合剤等を除去する。
このようにして得られたハイブリド一マは、 通常の選択培養液、 例えば HAT培 養液 （ヒポキサンチン、 アミノプテリンおよびチミジンを含む培養液） で培養す ることにより選択される。 上記 HAT培養液での培養は、 目的とするハイプリドー マ以外の細胞 （非融合細胞） が死滅するのに十分な時間 （通常、 数日〜数週間） 継続する。 ついで、 通常の限界希釈法を実施し、 目的とする抗体を産生するハイ ブリド一マのスクリーニングおよび単一クロ一ニングを行う。
また、 ヒト以外の動物に抗原を免疫して上記ハイブリド一マを得る他に、 ヒト リンパ球を in vi troでダリピカン 3に感作し、 感作リンパ球をヒト由来の永久 分裂能を有するミエ口一マ細胞と融合させ、 ダリピカン 3への結合活性を有する 所望のヒト抗体を得ることもできる （特公平 1-59878号公報参照） 。 さらに、 ヒ ト抗体遺伝子の全てのレパ一トリ一を有するトランスジェニック動物に抗原とな るグリピカン 3を投与して抗グリピカン 3抗体産生細胞を取得し、 これを不死化 させた細胞からダリピカン 3に対するヒト抗体を取得してもよい （国際特許出願 公開番号 W0 94/25585号公報、 W0 93/12227号公報、 TO 92/03918号公報、 W0 94/02602号公報参照） 。
このようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイプリドーマは、 通常の培養液中で継代培養することが可能であり、 また、 液体窒素中で長期保存 することが可能である。
当該八イブリドーマからモノクロ一ナル抗体を取得するには、 当該八イブリド 一マを通常の方法にしたがい培養し、 その培養上清として得る方法、 あるいはハ イブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、 その腹水とし て得る方法などが採用される。 前者の方法は、 高純度の抗体を得るのに適してお り、 一方、 後者の方法は、 抗体の大量生産に適している。
本発明では、 モノクローナル抗体として、 抗体遺伝子をハイプリドーマからク ローニングし、 適当なベクターに組み込んで、 これを宿主に導入し、 遺伝子組換 え技術を用いて産生させた組換え型のものを用いることができる （例えば、 Vandamme, A. M. et al .， Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990参 照） 。
具体的には、 抗グリピカン 3抗体を産生するハイブリド一マから、 抗グリピカ ン 3抗体の可変 （V) 領域をコードする mRNAを単離する。 mRNAの単離は、 公知 の方法、 例えば、 グァニジン超遠心法 (Chi rgwin, J. Μ· et al .， Bi ochemi s try (1979) 18, 5294-5299) 、 AGPC法 (Chomczynski, P.et al., Anal. Biochem.
(1987) 162, 156-159) 等により行って全 RNAを調製し、 mRNA Purification Kit (Pharmacia製） 等を使用して目的の mRNAを調製する。 また、 QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia製） を用いることにより mRNAを直接調製 することもできる。
得られた mRNAから逆転写酵素を用いて抗体 V領域の cDNAを合成する。 cDNA の合成は、 顧 Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit . (生 化学工業社製） 等を用いて行う。 また、 cDNAの合成および増幅を行うには、 5'- Ampli FINDER RACE Kit (Clontech製） および PCRを用いた 5' -RACE法
(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998—9002、 Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932) 等を使用す ることができる。
得られた PCR産物から目的とする DNA断片を精製し、 ベクタ一 DNAと連結する。 さらに、 これより組換えべクタ一を作製し、 大腸菌等に導入してコロニ一を選択 して所望の組換えベクターを調製する。 そして、 目的とする DNAの塩基配列を公 知の方法、 例えば、 ジデォキシヌクレオチドチェイン夕一ミネーシヨン法等によ り確認する。
目的とする抗グリピカン 3抗体の V領域をコ一ドする DNAを得たのち、 これを、 所望の抗体定常領域 （C領域） をコードする DNAを含有する発現ベクターへ組み 込む。
本発明で使用される抗グリビカン 3抗体を製造するには、 抗体遺伝子を発現制 御領域、 例えば、 ェン八ンサ一、 プロモー夕一の制御のもとで発現するよう発現 ベクタ一に組み込む。 次に、 この発現べクタ一により、 宿主細胞を形質転換し、 抗体を発現させる。
抗体遺伝子の発現は、 抗体重鎖 （H鎖） または軽鎖 （L鎖） をコードする DNA を別々に発現べクタ一に組み込んで宿主細胞を同時形質転換させてもよいし、 あ るいは H鎖および L鎖をコードする DNAを単一の発現べクタ一に組み込んで宿主 細胞を形質転換させてもよい （TO 94/11523号公報参照） 。
また、 組換え型抗体の産生には上記宿主細胞だけではなく、 トランスジェニッ ク動物を使用することができる。 例えば、 抗体遺伝子を、 乳汁中に固有に産生さ れるタンパク質 （ャギ /3カゼインなど） をコードする遺伝子の途中に揷入して融 合遺伝子として調製する。 抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含む DNA断片を ャギの胚へ注入し、 この胚を雌のャギへ導入する。 胚を受容したャギから生まれ るトランスジエニックャギまたはその子孫が産生する乳汁から所望の抗体を得る。 また、 トランスジェニックャギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加さ せるために、 適宜ホルモンをトランスジエニックャギに使用してもよい （Eber t,
K. M. et al .， Bio/Technology (1994) 12, 699-702) 。
本発明では、 上記抗体のほかに、 ヒトに対する異種抗原性を低下させること等 を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体、 例えば、 キメラ 体、 ヒト 化 （Humani zed) 抗体を使用できる。 これらの改変抗体は、 既知の方法を用いて 製造することができる。
キメラ抗体は、 前記のようにして得た抗体 V領域をコ一ドする DNAをヒト抗体
C領域をコ一ドする DNAと連結し、 これを発現ベクターに組み込んで宿主に導入 し産生させることにより得られる。 この既知の方法を用いて、 本発明に有用なキ メラ抗体を得ることができる。
ヒト化抗体は、 再構成 （reshaped) ヒト抗体とも称され、 これは、 ヒト以外の 哺乳動物、 例えばマウス抗体の相補性決定領域 （CDR; ci pl ement ar i ty
determining region) をヒト抗体の相補性決定領域へ移植したものであり、 その 一般的な遺伝子組換え手法も知られている （欧州特許出願公開番号 EP 125023号 公報、 W0 96/02576号公報参照） 。
具体的には、 マウス抗体の CDRとヒト抗体のフレームワーク領域 （framework region； FR) とを連結するように設計した DNA配列を、 CDR及び FR両方の末端 領域にオーバーラップする部分を有するように作製した数個のオリゴヌクレオチ ドをプライマーとして用いて PCR法により合成する（W098/13388号公報に記載の 方法を参照） 。
CDRを介して連結されるヒ卜抗体のフレームワーク領域は、 相補性決定領域が 良好な抗原結合部位を形成するものが選択される。 必要に応じ、 再構成ヒト抗体 の相補性決定領域が適切な抗原結合部位を形成するように、 抗体の可変領域にお けるフレームワーク領域のア^ノ酸を置換してもよい （Sato, Let al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856) 。
キメラ抗体及びヒト化抗体の C領域には、 ヒト抗体のものが使用され、 例えば H鎖では、 Cr l、 Cr 2, Cァ 3、 Cァ 4を、 L鎖では C K、 を使用する ことができる。 また、 抗体またはその産生の安定性を改善するために、 ヒト抗体 C領域を修飾してもよい。
キメラ抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常 領域とからなる。 一方、 ヒト化抗体は、 ヒト以外の哺乳動物由来抗体の相補性決 定領域と、 ヒト抗体由来のフレームワーク領域および C領域とからなる。 ヒト化 抗体はヒト体内における抗原性が低下されているため、 本発明の治療剤の有効成 分として有用である。
本発明で使用される抗体は、 抗体の全体分子に限られずダリピカン 3に結合し、 ダリピカン 3の活性を阻害する限り、 抗体の断片又はその修飾物であってもよく、 二価抗体も一価抗体も含まれる。 例えば、 抗体の断片としては、 Fab、 F (ab') 2、 Fv、 1個の Fabと完全な Fcを有する Fab/c、 または H鎖若しくは L鎖の Fvを適 当なリンカ一で連結させたシングルチェイン Fv (scFv) が挙げられる。 具体的 には、 抗体を酵素、 例えばパパイン、 ペプシンで処理し抗体断片を生成させるか、 または、 これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、 これを発現べクタ一に導 入した後、 適当な宿主細胞で発現させる （例えば、 Co， M.S. et al., J.
Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, . S Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc.、 Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc. ¾ Lamoyi, E. , Methods in Enzymology (1989) 121, 652 - 663、 Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663—669、 Bird, R. E. et al., TIBTECH (1991) 9, 132- 137参照) 。
scFvは、 抗体の H鎖 V領域と L鎖 V領域とを連結することにより得られる。 この scFvにおいて、 H鎖 V領域と L鎖 V領域は、 リンカ一、 好ましくはべプチ ドリンカ一を介して連結される （Huston, J. S. et al.、 Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883) 。 scFvにおける H鎖 V領域および L鎖 V 領域は、 本明細書に抗体として記載されたもののいずれの由来であってもよい。
V領域を連結するべプチドリンカーとしては、 例えばアミノ酸 12-19残基からな る任意の一本鎖べプチドが用いられる。
scFvをコ一ドする DNAは、 前記抗体の H鎖または H鎖 V領域をコードする DNA、 および L鎖または L鎖 V領域をコードする DMのうち、 それらの配列のうちの全 部又は所望のアミノ酸配列をコードする DNA部分を铸型とし、 その両端を規定す るプライマ一対を用いて PCR法により増幅し、 次いで、 さらにペプチドリンカ一 部分をコードする DM、 およびその両端が各々 H鎖、 L鎖と連結されるように規 定するプライマー対を組み合せて増幅することにより得られる。
また、 一旦 scFvをコードする DNAが作製されると、 それらを含有する発現べ クタ一、 および該発現べクタ一により形質転換された宿主を常法に従って得るこ とができ、 また、 その宿主を用いることにより、 常法に従って scFvを得ること ができる。
これら抗体の断片は、 前記と同様にしてその遺伝子を取得し発現させ、 宿主に より産生させることができる。 本発明における 「抗体」 にはこれらの抗体の断片 も包含される。
抗体の修飾物として、 ポリエチレングリコール （PEG) 等の各種分子と結合し た抗グリピカン抗体を使用することもできる。 本発明における 「抗体」 にはこれ らの抗体修飾物も包含される。 このような抗体修飾物は、 得られた抗体に化学的 な修飾を施すことによって得ることができる。 なお、 抗体の修飾方法はこの分野 においてすでに確立されている。
さらに、 本発明で使用される抗体は、 二重特異性抗体 (bi spec i f i c
ant ibody) であってもよい。 二重特異性抗体はグリピカン 3分子上の異なるェピ トープを認識する抗原結合部位を有する二重特異性抗体であってもよいし、 一方 の抗原結合部位がグリピカン 3を認識し、 他方の抗原結合部位が化学療法剤、 細 胞由来トキシン等の細胞傷害性物質を認識してもよい。 この場合、 グリピカン 3 を発現している細胞に直接細胞傷害性物質を作用させ腫瘍細胞に特異的に傷害を 与え、 腫瘍細胞の増殖を抑えることが可能である。 二重特異性抗体は 2種類の抗 体の HL対を結合させて作製することもできるし、 異なるモノクローナル抗体を 産生するハイプリドーマを融合させて二重特異性抗体産生融合細胞を作製し、 得 ることもできる。 さらに、 遺伝子工学的手法により二重特異性抗体を作製するこ とも可能である。
前記のように構築した抗体遺伝子は、 公知の方法により発現させ、 取得するこ とができる。 哺乳類細胞の場合、 常用される有用なプロモータ一、 発現させる抗 体遺伝子、 その 3'側下流にポリ Aシグナルを機能的に結合させて発現させるこ とができる。 例えばプロモーター ェンハンサーとしては、 ヒトサイトメガロウ ィ Jレス前期プロモーター Zェンノヽンサ一 、 human cytomegal ovi rus immediate early promoter/enhancer) を挙け ことができる。
また、 その他に本発明で使用される抗体発現に使用できるプロモーターノエン ハンサ一として、 レトロウイルス、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 シミ アンウィルス 40 (SV40) 等のウィルスプロモーター Zェンハンサ一、 あるいは ヒトェロンゲーシヨンファクター 1ひ (HEFl a ) などの哺乳類細胞由来のプロモ —夕一 Zェンハンサ一等が挙げられる。
SV40プロモーター Zェンハンサーを使用する場合は Mul l iganらの方法
(Nature (1979) 277, 108) により、 また、 HEF1ひプロモ一夕一 Zェンハンサ一 を使用する場合は Mizushimaらの方法 (Nuc lei c Ac i ds Res. (1990) 18， 5322) により、 容易に遺伝子発現を行うことができる。
大腸菌の場合、 常用される有用なプロモータ一、 抗体分泌のためのシグナル配 列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子を発現させること ができる。 プロモータ一としては、 例えば l aczプロモーター、 araBプロモー夕 —を挙げることができる。 l aczプロモ一夕一を使用する場合は Wardらの方法
(Nature (1098) 341 , 544-546 ； FASEB J. (1992) 6， 2422-2427) により、 あ るいは araBプロモーターを使用する場合は Be t terらの方法 （Sc ience (1988) 240, 1041-1043) により発現することができる。
抗体分泌のためのシグナル配列としては、 大腸菌のペリブラズムに産生させる 場合、 pelBシグナル配列 (Lei, S. P. et al J. Bac ter i ol . (1987) 169, 4379) を使用すればよい。 そして、 ペリブラズムに産生された抗体を分離した後、 抗体の構造を適切に組み直して （refold) 使用する。 複製起源としては、 SV40、 ポリオ一マウィルス、 アデノウイルス、 ゥシパピ口 一マウィルス （BPV) 等の由来のものを用いることができ、 さらに、 宿主細胞系 で遺伝子コピー数増幅のため、 発現べクタ一は、 選択マ一力一としてアミノグリ コシドトランスフェラーゼ (APH) 遺伝子、 チミジンキナーゼ （TK) 遺伝子、 大 腸菌キサンチングァニンホスホリポシルトランスフェラ一ゼ （Ecogpt) 遺伝子、 ジヒドロ葉酸還元酵素 （dhfr) 遺伝子等を含むことができる。
本発明で使用される抗体の製造のために、 任意の発現系、 例えば真核細胞又は 原核細胞系を使用することができる。 真核細胞としては、 例えば樹立された哺乳 類細胞系、 昆虫細胞系、 真糸状菌細胞および酵母細胞などの動物細胞等が挙げら れ、 原核細胞としては、 例えば大腸菌細胞等の細菌細胞が挙げられる。
好ましくは、 本発明で使用される抗体は、 哺乳類細胞、 例えば CH0、 COS, ミ エローマ、 BHK、 Vero、 HeLa細胞中で発現される。
次に、 形質転換された宿主細胞を in vi troまたは in vivoで培養して目的と する抗体を産生させる。 宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。 例えば、 培養 液として、 DMEM、 MEM、 RPMI 1640, IMDMを使用することができ、 牛胎児血清
(FCS) 等の血清補液を併用することもできる。
本発明で使用される抗体の抗原結合活性 （Ant ibodies A Laboratory
Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) 、 リ ガンドレセプ夕一結合阻害活性 (Harada, A. et al.， Internat ional
Immunology (1993) 5, 681-690) の測定には公知の手段を使用することができる。 本発明で使用される抗グリピカン 3抗体の抗原結合活性を測定する方法として、 ELISA (酵素結合免疫吸着検定法） 、 EIA (酵素免疫測定法） 、 RIA (放射免疫測 定法） あるいは蛍光抗体法を用いることができる。 例えば、 酵素免疫測定法を用 いる場合、 グリピカン 3をコ一ティングしたプレートに、 抗グリビカン 3抗体を 含む試料、 例えば、 抗グリビカン 3抗体産生細胞の培養上清や精製抗体を加える。 アルカリフォスファターゼ等の酵素で標識した二次抗体を添加し、 プレートをィ ンキュペートし、 洗浄した後、 P-ニトロフエニル燐酸などの酵素基質を加えて吸 光度を測定することで抗原結合活性を評価することができる。 本発明に使用する 抗体は、 細胞傷害活性の測定は当業者に公知の方法により行うことができる。 ADCC活性は、 エフェクター細胞と標的細胞と抗グリピカン 3抗体を混合し、 ADCCの程度を調べることにより測定することができる。 ェフエクタ一細胞とし て例えば、 マウス脾細胞や骨髄、 ヒト末梢血から分離した単核球等を利用するこ とができ、 標的細胞としてはヒト肝細胞株 HuH- 7等のヒト株化細胞を用いること ができる。 標的細胞をあらかじめ51 Crにより標識し、 これに抗グリピカン 3抗 体を加えインキュベーションを行い、 その後、 標的細胞に対し適切な比のエフェ クタ一細胞を加えインキュベーションを行う。 インキュベーション後上清を採取 し、 上清中の放射活性をカウントすることにより ADCC活性を測定することがで さる。
また、 CDC活性は、 上述の標識標的細胞と抗グリピカン 3抗体を混合し、 その 後補体を添加してィンキュベーシヨンを行い、 培養後に上清中の放射活性をカウ ントすることにより測定することができる。
通常、 抗体が細胞傷害活性を発揮するには、 Fc部分が必要であるので、 本発 明の細胞増殖阻害剤が、 抗体の細胞傷害活性を利用したものである場合には、 本 発明に使用する抗グリビカン 3抗体は Fc部分を含んでいることが好ましい。
本発明の抗癌剤は癌の予防または癌治療後の再発予防を目的として使用される。 特に好ましくは、 本発明の抗癌剤は、 肝癌細胞の切除後に肝癌の再発予防を目的 として使用される。
有効投与量は、 一回につき体重 lkgあたり O. OOlmgから lOOOmgの範囲で選ば れる。 あるいは、 患者あたり 0. 01〜100000mg/bodyの投与量を選ぶことができる。 しかしながら、 本発明の抗グリピカン 3抗体を含有する抗癌剤はこれらの投与量 に制限されるものではない。
本発明の抗癌剤は通常、 非経口投与経路で、 例えば注射剤 （皮下注、 静注、 筋 注、 腹腔内注など） 、 経皮、 経粘膜、 経鼻、 経肺などで投与されるが、 経口投与 も可能である。
また、 本発明の抗癌剤の投与時期としては、 疾患の臨床症状が生ずる前後を問 わず投与することができる。 本発明の特に好ましい態様においては、 本発明の抗 癌剤は、 肝癌細胞の切除後にアジュパント療法として投与することができる。 本発明の抗グリビカン 3抗体を有効成分として含有する治療剤は、 常法にした がって製剤化することができ (Remington' s Pharmaceut ical Science, lates t edi t ion, Mark Publ ishing Co即 any, Eas tern,米国） 、 医薬的に許容される担体 や添加物を共に含むものであってもよい。
このような担体および医薬添加物の例として、 水、 医薬的に許容される有機溶 剤、 コラーゲン、 ポリビニルアルコール、 ポリビニルピロリドン、 力ルポキシビ 二ルポリマ一、 カルポキシメチルセルロースナトリウム、 ポリアクリル酸ナトリ ゥム、 アルギン酸ナトリウム、 水溶性デキストラン、 カルポキシメチルスターチ ナトリウム、 ぺクチン、 メチルセルロース、 ェチルセルロース、 キサンタンガム、 アラビアゴム、 カゼイン、 寒天、 ポリエチレングリコール、 ジグリセリン、 ダリ セリン、 プロピレングリコ一ル、 ワセリン、 パラフィン、 ステアリルアルコール、 ステアリン酸、 ヒト血清アルブミン （HSA) 、 マンニトール、 ソルビト一ル、 ラ クトース、 医薬添加物として許容される界面活性剤等が挙げられる。
実際の添加物は、 本発明治療剤の剤型に応じて上記の中から単独で又は適宜組 み合わせて選ばれるが、 もちろんこれらに限定するものではない。 例えば、 注射 用製剤として使用する場合、 精製された抗グリビカン 3抗体を溶剤、 例えば生理 食塩水、 緩衝液、 ブドウ糖溶液等に溶解し、 これに吸着防止剤、 例えば Tween80、 Tween20、 ゼラチン、 ヒト血清アルブミン等を加えたものを使用することができ る。 あるいは、 使用前に溶解再構成する剤形とするために凍結乾燥したものであ つてもよく、 凍結乾燥のための賦形剤としては、 例えば、 マンニトール、 ブドウ 糖等の糖アルコールや糖類を使用することができる。
本明細書において明示的に引用される全ての特許および参考文献の内容は全て 本明細書の一部としてここに引用する。 また， 本出願が有する優先権主張の基礎 となる出願である日本特許出願 2 0 0 4 - 2 4 4 2 7 3および 2 0 0 5— 9 0 9 4 5号の明細書および図面に記載の内容は全て本明細書の一部としてここに引用 する。 実施例
以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが， これらの実施例は本発明 の範囲を制限するものではない。 実施例 1
肝内移植マウスモデルにおけるマウス抗ヒトダリビカン 3抗体 GC33の薬効試験 ( 1 ) α—フエトプロテイン (AFP)の測定
腫瘍マーカ一として、 ヒト AFP測定 ELISAキット （HOPE LABORATORIES社製） を用い、 血清中のヒト AFP濃度を測定した。 ELISAの測定限界は約 1 ng/mLであ り、 検出限界以下のサンプルについては 1 ng/mLとした。 血清は眼窩採血により 血液をセパラピット S (セキスィ化学） に採取し、 室温で 15分静置した後、 1200 X g, 20分間遠心分離して得た。
( 2 ) 肝内移植マウスモデルの作製
肝内移植マウスモデルは以下のように作製した。 HepG2細胞 （ATCC) をハンク ス培地 （SIGMA社製） で 1 X 108個/ mLになるように調製した。 ネンブ夕一ル による麻酔下で、 ヌードマウス （チヤ一ルスリバ一） の肝臓皮膜内へ HepG2細胞 懸濁液 50 il (5 X 106個ノマウス） を注入した。 移植後 21日に血清中の AFP 濃度を測定し、 10 - 100 ng/mLの範囲の個体について 2群に分けた （n=4) 。 こ の時点では肝癌細胞 （腫瘍塊） は肉眼では観察されず、 肝切除後に残存する微小 肝内転移のモデルとして用いた。
( 3 ) 抗体投与
マウス抗ヒトグリピカン 3抗体 GC33 (後述の参考例を参照） を、 投与当日、 生理食塩水 （大塚製薬） を用いて、 0. 5 mg/DiLになるように調製し、 投与試料と した。 上記マウスモデルに対し、 腫瘍移植後 21 日目と 28日目に投与試料を 10 mL/kgにて、 尾静脈より投与した。 陰性対照には生理食塩水を Vehicleとして同 様に投与した。
( 4 ) 抗腫瘍効果の評価
抗腫瘍効果については腫瘍移植後 35 日目の AFP濃度にて評価した。 その結果、 図 1に示すとおり、 GC33投与群では Vehic le投与群と比較して腫瘍移植後 35日 目において AFP濃度の低下が認められ、 本抗体による抗腫瘍効果が確認された。 以上より、 GC33が肝内移植モデルに対して、 抗腫瘍効果を有することが示さ れ、 本抗体のアジュバント療法への使用が可能であることが見出された。 実施例 2
肝内移植マウスモデルにおけるマウス抗ヒトダリビカン抗体 GC33の早期投与言 ( 1 ) 一フエトプロテイン (AFP)の測定
腫瘍マーカーとして、 ヒト AFP測定 EL ISAキット （HOPE LABORATORIES社製） を用い、 血清中のヒト AFP濃度を測定した。 ELISAの測定限界は約 1 ng/mLであ り、 検出限界以下のサンプルについては 1 ng/mLとした。 血清は眼窩採血により 血液をセパラピット S (セキスィ化学） に採取し、 室温で 15分静置した後、 1200 X g, 20分間遠心分離して得た。
( 2 ) 肝内移植マウスモデルの作製
肝内移植マウスモデルは以下のように作製した。 HepG2細胞 （ATCC) をハンク ス培地 （SIGMA社製） で 1 X 108個/ mLになるように調製した。 ネンブタール による麻酔下で、 ヌードマウス （チヤ一ルスリバ一） の肝臓皮膜内へ HepG2細胞 懸濁液 50 ti l (5 X 106個 マウス） を注入した。 移植翌日の個体について無作 為に 2群に分けた （n=10) 。 移植翌日の時点ではマウス肝内に HepG2が存在する が、 マウス血清中にヒト AFPは検出されず、 より臨床の肝切除後に残存する微小 肝内転移に近いモデルとして用いた。
( 3 ) 抗体投与
マウス抗ヒトグリピカン 3抗体 GC33を、 投与当日、 生理食塩水 （大塚製薬） を用いて、 0. 5 mg/mLになるように調製し、 投与試料とした。 上記マウスモデル に対し、 腫瘍移植後翌日と 7日目に投与試料を 10 mL/kgにて、 尾静脈より投与 した。 陰性対照には生理食塩水を Vehi c leとして同様に投与した。
( 4 ) 抗腫瘍効果の評価
抗腫瘍効果については腫瘍移植後 15日目と 40曰目の AFP濃度にて評価した。 その結果、 図 2に示すとおり、 Vehicle投与群では AFP濃度の上昇が認められた のに対して、 GC33投与群では、 いずれの測定時においても AFP濃度の上昇が認 められなかった。
以上より、 肝臓がん細胞肝内移植モデルに対して、 AFPが検出されない時期か らマウス抗ヒトグリピカン 3抗体 GC33を投与することによつても、 腫瘍増殖が 抑制されることが示され、 本抗体のアジュバント療法への使用可能性が示唆され た。 参考例 マウス抗ヒトグリピカン 3抗体 GC33の作製
グリピカン 3の 524番目の Al aから 563番目の Lysまでのペプチドと GSTの融 合タンパク質 （GC- 3)を免疫原として、 Balb/c (日本チャールズリバ一より購 入） 3匹、 MRL/lpr 3匹に対して免疫を行った。 初回免疫には GC- 3を 100 g/headとなるように調製し、 FCAを用いてェマルジヨン化したものを皮下に投与 した。 2週間後に 50 g/headとなるように調製したものを FIAでェマルジヨン 化したものを皮下に投与した。 5回免疫の後、 全マウスに対し最終免疫 （50 g/head) を尾静脈内に行い細胞融合を行った。 スクリーニングは、 C末端側の疎 水性領域 （564- 580アミノ酸） を欠損させた可溶型 GPC3コアタンパク質を固相 化したィムノプレートを用いた EL I SAにより行った。 陽性クローンについては限 界希釈法によりモノクロ一ン化した。 その結果、 GPC3に対して強い結合活性を 有する抗体 GC33を取得した。 GC33の H鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号 3 に、 L鎖可変領域のアミノ酸配列は配列番号 4に示される。 産業上の利用性
本発明の抗癌剤は、 癌の予防または再発予防に有用である。

Claims

請求の範囲
1 . 癌治療後に投与されることを特徴とする、 抗グリピカン 3抗体を含有する抗 癌剤。
2 . 癌治療後が肝癌治療後である請求項 1記載の抗癌剤。
3 . 肝癌治療が肝癌細胞切除である請求項 2記載の抗癌剤。
4. 切除された肝癌細胞にダリビカン 3が発現している場合に使用されることを 特徴とする、 請求項 2または 3に記載の抗癌剤。
5 . 抗体がモノク口一ナル抗体である請求項 1一 4のいずれかに記載の抗癌剤。
6 . 癌治療後の患者に抗グリビカン 3抗体を含有する抗癌剤を投与することによ り癌の再発を予防する方法。
7 . 癌治療後が肝癌治療後である請求項 6記載の方法。
8 . 肝癌治療が肝癌細胞切除である請求項 7記載の方法。
9 . 切除された肝癌細胞にグリピカン 3が発現している、 請求項 7または 8に記 載の方法。
1 0 . 抗体がモノクローナル抗体である請求項 6 - 9のいずれかに記載の方法。
PCT/JP2005/015607 2004-08-24 2005-08-23 抗グリピカン３抗体を用いたアジュバント療法 WO2006022407A1 (ja)

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KR1020137016653A KR20130103580A (ko) 2004-08-24 2005-08-23 항 글리피칸 3 항체를 이용한 어쥬번트 요법
PL05780979T PL1800693T3 (pl) 2004-08-24 2005-08-23 Terapia adiuwantowa z zastosowaniem przeciwciała przeciw glipikanowi 3
CN2005800286101A CN101014367B (zh) 2004-08-24 2005-08-23 使用抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体的辅助疗法
HK07112625.1A HK1107010A1 (en) 2004-08-24 2007-11-20 Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody

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Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2007047291A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
US7867734B2 (en) 2004-10-26 2011-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
US7871613B2 (en) 2004-08-24 2011-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody
US7919086B2 (en) 2004-07-09 2011-04-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
JP2013500261A (ja) * 2009-07-24 2013-01-07 ロード アイランド ホスピタル アスパラギニル−β−ヒドロキシラーゼ発現腫瘍に対する樹状細胞ワクチン
JP2013540424A (ja) * 2010-07-29 2013-11-07 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） 幹細胞の運命を調節するためのグリピカン４活性の制御及びその使用
US8680247B2 (en) 2007-07-17 2014-03-25 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies against glypican-3
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7361336B1 (en) * 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
AU2002338020A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3
BRPI0817637A2 (pt) 2007-09-28 2015-09-08 Chugai Pharmaceutical Co Ltd anticorpo anti-glipican-3 tendo cinéticas aperfeiçoadas no plasma
CL2009000647A1 (es) * 2008-04-04 2010-06-04 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Composicion farmaceutica para tratar o prevenir cancer hepatico que comprende una combinacion de un agente quimioterapeutico y un anticuerpo anti-glipicano 3; agente para atenuar un efecto secundario que comprende dicho anticuerpo; metodo para tratar o prevenir un cancer hepatico de un sujeto.
CN103561771B (zh) 2011-03-17 2019-01-04 伯明翰大学 重新定向的免疫治疗
JP6494507B2 (ja) * 2012-06-01 2019-04-03 ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ， アズ リプレゼンテッド バイ ザ セクレタリー， デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ グリピカン−３に対する高親和性モノクローナル抗体およびその使用
TWI693073B (zh) 2012-12-21 2020-05-11 日商中外製藥股份有限公司 對ｇｐｃ３標的治療劑療法為有效之患者投與的ｇｐｃ３標的治療劑
WO2015106311A1 (en) * 2014-01-17 2015-07-23 Minomic International Ltd. Cell surface prostate cancer antigen for diagnosis
EP3141603A4 (en) * 2014-05-08 2017-12-27 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Gpc3-targeted therapeutic agent for administration to patients for whom gpc3-targeted therapeutic agent therapy is effective
US11376326B2 (en) 2015-07-01 2022-07-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha GPC3-targeting therapeutic agent which is administered to patient for whom the GPC3-targeting therapeutic agent is effective
CA3004438A1 (en) * 2015-11-09 2017-05-18 The Children's Hospital Of Philadelphia Glypican 2 as a cancer marker and therapeutic target
JP2022514262A (ja) 2018-12-17 2022-02-10 レビトープ リミテッド 双子型免疫細胞エンゲージャー
WO2022268196A1 (zh) * 2021-06-25 2022-12-29 天辰生物医药(苏州)有限公司 靶向gpc3的抗原结合蛋白

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003000883A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody
WO2004018667A1 (ja) * 2002-08-26 2004-03-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ペプチド及びこれを含む医薬

Family Cites Families (41)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0242355A (ja) 1988-08-02 1990-02-13 Hitachi Constr Mach Co Ltd 超音波検査装置
US5530101A (en) * 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
JPH04336051A (ja) 1991-05-10 1992-11-24 Toshiba Corp 超音波診断装置
WO1993022332A2 (en) 1992-04-24 1993-11-11 Board Of Regents, The University Of Texas System Recombinant production of immunoglobulin-like domains in prokaryotic cells
US5622701A (en) * 1994-06-14 1997-04-22 Protein Design Labs, Inc. Cross-reacting monoclonal antibodies specific for E- and P-selectin
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
US7361336B1 (en) * 1997-09-18 2008-04-22 Ivan Bergstein Methods of cancer therapy targeted against a cancer stem line
JPH11118775A (ja) 1997-10-09 1999-04-30 Canon Inc 超音波検査装置
US6528624B1 (en) * 1998-04-02 2003-03-04 Genentech, Inc. Polypeptide variants
PT1071700E (pt) 1998-04-20 2010-04-23 Glycart Biotechnology Ag Modificação por glicosilação de anticorpos para melhorar a citotoxicidade celular dependente de anticorpos
US6737056B1 (en) * 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
PT1914244E (pt) 1999-04-09 2013-07-26 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Processo para regular a actividade de moléculas funcionais sob o ponto de vista imunológico
JP3606132B2 (ja) 1999-10-14 2005-01-05 Ｊｆｅエンジニアリング株式会社 超音波探傷方法およびその装置
WO2001081346A2 (en) * 2000-04-25 2001-11-01 Icos Corporation Inhibitors of human phosphatidyl-inositol 3-kinase delta
NZ505538A (en) * 2000-07-03 2004-12-24 Malaghan Inst Of Medical Res A vaccine comprising immunogenic acyl glyceryl phosphatidylinositol manno-oligosaccharide (PIM); and the use of PIM for inducing an immune response in a patient effective in the prevention or treatment of Th2-mediated diseases or disorders such as asthma
JP2002048867A (ja) 2000-08-07 2002-02-15 Mitsubishi Heavy Ind Ltd 音響探査装置
DE60128817T2 (de) 2000-09-12 2008-02-07 Union Carbide Chemicals & Plastics Technology Corp., Danbury Polymerische mischungen enthaltend ethylenoxid-copolymere
CA2785941C (en) 2000-10-06 2017-01-10 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Antibody composition-producing cell
JP4336051B2 (ja) 2001-01-31 2009-09-30 株式会社エヌ・ティ・ティ・ドコモ 無線通信端末、発呼制限方法及びプログラム
WO2002079255A1 (en) 2001-04-02 2002-10-10 Idec Pharmaceuticals Corporation RECOMBINANT ANTIBODIES COEXPRESSED WITH GnTIII
JP3961359B2 (ja) 2002-07-18 2007-08-22 株式会社東芝 超音波画像化装置
CN100460872C (zh) * 2001-11-14 2009-02-11 株式会社东芝 超声波成像装置
JP4087098B2 (ja) 2001-11-14 2008-05-14 株式会社東芝 超音波検査装置
EP3960855A1 (en) * 2001-12-28 2022-03-02 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Method for stabilizing proteins
US8188231B2 (en) * 2002-09-27 2012-05-29 Xencor, Inc. Optimized FC variants
US7317091B2 (en) * 2002-03-01 2008-01-08 Xencor, Inc. Optimized Fc variants
WO2003074679A2 (en) 2002-03-01 2003-09-12 Xencor Antibody optimization
US20040132101A1 (en) 2002-09-27 2004-07-08 Xencor Optimized Fc variants and methods for their generation
AU2003236018A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. METHOD OF ENHANCING ACTIVITY OF ANTIBODY COMPOSITION OF BINDING TO FcGamma RECEPTOR IIIa
WO2003100429A2 (en) * 2002-05-23 2003-12-04 Sunnybrook And Women's College Health Sciences Centre Diagnosis of hepatocellular carcinoma
AU2002338020A1 (en) * 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Antibody against blood-solubilized n-terminal peptide in gpc3
WO2004023145A1 (ja) 2002-09-04 2004-03-18 Perseus Proteomics Inc. Ｇｐｃ3の検出による癌の診断方法
AU2002328429A1 (en) 2002-09-04 2004-03-29 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha CONSTRUCTION OF ANTIBODY USING MRL/lpr MOUSE
US20090010920A1 (en) * 2003-03-03 2009-01-08 Xencor, Inc. Fc Variants Having Decreased Affinity for FcyRIIb
WO2005023301A1 (ja) 2003-09-04 2005-03-17 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha 胆管癌治療剤および検出薬
ITBO20040008U1 (it) 2004-02-03 2004-05-03 Tonazzi S R L Macchina per il riempimento e la chiusura di tubetti
NZ579543A (en) 2004-07-09 2011-07-29 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody
CA2577370A1 (en) * 2004-08-16 2006-03-02 Medimmune, Inc. Integrin antagonists with enhanced antibody dependent cell-mediated cytotoxicity activity
KR20130103580A (ko) 2004-08-24 2013-09-23 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 항 글리피칸 3 항체를 이용한 어쥬번트 요법
NZ554940A (en) 2004-10-26 2010-04-30 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
US20070087005A1 (en) * 2005-10-14 2007-04-19 Lazar Gregory A Anti-glypican-3 antibody

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2003000883A1 (en) 2001-06-22 2003-01-03 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cell proliferation inhibitors containing anti-glypican 3 antibody
WO2004018667A1 (ja) * 2002-08-26 2004-03-04 Kirin Beer Kabushiki Kaisha ペプチド及びこれを含む医薬

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HEY-CHI HSU ET AL., CANCER RESEARCH, vol. 57, 1997, pages 5179 - 5184
See also references of EP1800693A4
SUNG Y.K. ET AL: "Glypican-3 is overexpressed in human hepatocellular carcinoma", CANCER SCI., vol. 94, no. 3, March 2003 (2003-03-01), pages 259 - 262, XP002261241 *
YAMAGUCHI Y. ET AL: "Gan Biotherapy no Kyo Ashita (Current Status and Future Perspective of Biotherapy for Cancer)", BIOTHERAPY, vol. 13, no. 7, July 1999 (1999-07-01), pages 747 - 753, XP002998838 *

Cited By (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7919086B2 (en) 2004-07-09 2011-04-05 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody
US7871613B2 (en) 2004-08-24 2011-01-18 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Adjuvant therapy with the use of anti-glypican 3 antibody
US7867734B2 (en) 2004-10-26 2011-01-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican 3 antibody having modified sugar chain
US9102739B2 (en) 2005-10-14 2015-08-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
WO2007047291A3 (en) * 2005-10-14 2007-06-21 Chugai Pharmaceutical Co Ltd Anti-glypican-3 antibody
US10118959B2 (en) 2005-10-14 2018-11-06 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
WO2007047291A2 (en) * 2005-10-14 2007-04-26 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Anti-glypican-3 antibody
US9217033B2 (en) 2007-07-17 2015-12-22 E. R. Squibb & Sons, L.L.C. Monoclonal antibodies against Glypican-3
US8680247B2 (en) 2007-07-17 2014-03-25 Medarex, L.L.C. Monoclonal antibodies against glypican-3
US9687537B2 (en) 2009-07-24 2017-06-27 Rhode Island Hospital Dendritic cell vaccines for asparaginyl-β-hydroxylase expressing tumors
JP2013500261A (ja) * 2009-07-24 2013-01-07 ロード アイランド ホスピタル アスパラギニル−β−ヒドロキシラーゼ発現腫瘍に対する樹状細胞ワクチン
JP2013540424A (ja) * 2010-07-29 2013-11-07 サントル ナシオナル ドゥ ラ ルシェルシェサイアンティフィク（セエヌエールエス） 幹細胞の運命を調節するためのグリピカン４活性の制御及びその使用
US9975966B2 (en) 2014-09-26 2018-05-22 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing theraputic agent
US11001643B2 (en) 2014-09-26 2021-05-11 Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Cytotoxicity-inducing therapeutic agent

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Publication number Publication date
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JP4733042B2 (ja) 2011-07-27
KR101300546B1 (ko) 2013-09-02
EP1800693A1 (en) 2007-06-27

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