ES2399028T3

ES2399028T3 - Inhibidores de la proliferación celular que contienen anticuerpo anti-glipicano 3

Info

Publication number: ES2399028T3
Application number: ES10003378T
Authority: ES
Inventors: Hiroyuki Aburatani; Tetsuo Nakamura; Masayuki Tsuchiya
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2013-03-25
Anticipated expiration: 2022-06-21
Also published as: EP1411118A4; AU2007201255B2; EP1780273A1; DK2208784T3; HK1079547A1; CN1688692A; PT1411118E; DK1411118T3; US20070172488A1; AU2007201255A1; EP1780273B1; JP2005225892A; HK1120522A1; WO2003000883A1; CA2451493A1; ES2353335T3; JP2008120828A; JP2007238632A; US8263077B2; JP4347402B2

Abstract

Un anti-glipicano 3 para su uso en el tratamiento de cáncer seleccionado entre el grupo que consiste en cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de mama, cáncer de próstata, leucemia, linfoma y cáncer de páncreas.

Description

Inhibidores de la proliferacion celular que contienen anticuerpo anti-glipicano 3.

Campo de la invenci6n

La presente invencion se refiere a un inhibidor del crecimiento celular que contiene un anticuerpo anti-glipicano 3 como ingrediente activo.

Antecedentes de la invenci6n

Se ha informado de que la familia de los glipicanos esta presente como una nueva familia de proteoglicanos de heparan sulfato que estan presentes en las superficies celulares. Hasta la fecha, se ha informado sobre los 5 tipos de glipicanos (glipicano 1, glipicano 2, glipicano 3, glipicano 4 y glipicano 5) como miembros de la familia de los glipicanos. Estos miembros de la familia tienen las proteinas nucleares de tamano uniforme (aproximadamente 60 kDa), comparten secuencias de cisteina especificas y bien conservadas, y se unen a las membranas celulares a traves de anclas de glicosil fosfatidil inositol (GPI).

Se ha identificado un gen quot;Dallyquot; (con quot;division anormalmente retrasadaquot;) por medio de la seleccion de genes de una variante de Drosophila melanogaster que tiene un patron de division celular anormal en el desarrollo del sistema nervioso central. Se sabe que el ADNc de quot;Dallyquot; representa un marco de lectura abierto (ORF) que codifica un producto que tiene una secuencia que muestra homologia (una homologia del 24 al 26%) con un proteoglicano transmembrana (GRIP) de un vertebrado que contiene todas las caracteristicas de un glipicano. Se ha sugerido que el gen dally interviene en la regulacion del mecanismo del receptor de dpp (decapentaplegia). Esto sugiere que el glipicano de un mamifero puede regular la transduccion de senales entre TGF y BMP. Se ha sugerido especificamente que el glipicano puede funcionar como un receptor comun para algunos de los factores de crecimiento de union a heparina (por ejemplo, EGF, PDGF, BMP2 y FGF).

Se ha aislado glipicano 3 como un transcrito en condiciones de regulacion del desarrollo en intestino de rata (Filmus, J., Church, J. G., y Buick, R.n. (1988) Mol. Cell Biol.8, 4243-4249), y despues se ha identificado como OCT-5, un proteoglicano de heparan sulfato unido a GPI de la familia de los glipicanos, que tiene una proteina nuclear con un peso molecular de 69 kDa (Filmus, J., Shi, W., Wong, Z. M y Wong, M.J. (1995) Biochem. J. 311, 561565). Tambien en seres humanos se ha aislado un gen que codifica glipicano 3 como MXR-7 a partir de una linea celular de cancer gastrico humano (Hermann Lage el al., Gene 188 (1997) 151-156). Se ha notificado que el glipicano 3 forma un complejo de proteina-proteina con un factor de crecimiento 2 de tipo insulinico para regular la accion del factor de crecimiento (Pilia, G. el al, (1996) Nat. Genet. 12, 241-247). Este informe sugiere que el glipicano 3 no siempre interacciona con el factor de crecimiento que tiene la cadena de heparan sulfato.

Existe un informe que sugiere que el glipicano 3 puede utilizarse como un marcador de cancer hepatico (Hey-Chi Hsu el al., CANCER RESEARCH 57, 5179-5184 (1997). Sin embargo, no hay ningun descubrimiento que indique una relacion clara entre el glipicano 3 y la proliferacion de celulas de carcinoma.

Ademas, tambien se ha sugerido que el glipicano puede funcionar como un receptor para endostatina que puede actuar como un inhibidor de la vascularizacion (Molecular Cell (2001), 7, 811-822). Sin embargo, todavia no se ha esclarecido la relacion entre esta funcion y la proliferacion celular.

Como se ha descrito mas arriba, se ha sugerido la implicacion del glipicano 3 en la proliferacion celular. Sin embargo, no se conoce el mecanismo de proliferacion celular y similar, y nunca se ha intentado la aplicacion del glipicano 3 para la regulacion de la proliferacion celular.

Compendio de la Invenci6n

Un objeto de la presente invencion es proporcionar un inhibidor del crecimiento celular que contenga un anticuerpo anti-glipicano 3 como ingrediente activo.

Como resultado de estudios profundos, los autores de la presente invencion han completado la presente invencion por medio del descubrimiento de que el anticuerpo anti-glipicano 3 ejerce actividad inhibidora de la proliferacion celular por ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y actividad CDC (citotoxicidad dependiente de complemento). Ademas, tambien se ha pronosticado que los anticuerpos anti-glipicano 3 ejercen actividad inhibidora de la proliferacion celular por inhibicion de la accion de un factor de crecimiento. Ademas, los anticuerpos antiglipicano 3 tambien pueden ejercer actividad inhibidora de la proliferacion celular por medio de la union a sustancias citotoxicas tales como un isotopo radiactivo, un agente quimioterapeutico o una toxina derivada de bacterias.

La presente invencion es como sigue:

(1): Un anti-glipicano 3 para uso en el tratamiento del cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, leucemia, linfoma y cancer de pancreas.

(2): Un anticuerpo de acuerdo con el apartado (1), en donde el cancer es cancer de pulmon.

(3): Un anticuerpo de acuerdo con los apartados (1) o (2) en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

(4): Un anticuerpo de acuerdo con uno cualquiera de los apartados (1) a (3), en donde el anticuerpo tiene una actividad citotoxica.

(5): Un anticuerpo de acuerdo con el apartado (4), en donde la actividad citotoxica es citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).

(6): Un anticuerpo de acuerdo con el apartado (4), en donde la actividad citotoxica es citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

(7): El uso de un anticuerpo anti-glipicano 3 en la fabricacion de un medicamento para uso en el tratamiento del cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, leucemia, linfoma y cancer de pancreas.

En la invencion, el anti-glipicano 3 puede actuar como un inhibidor del crecimiento celular.

El anti-glipicano 3 puede tener actividad citotoxica. La actividad citotoxica puede ser dependiente de anticuerpos citotoxicidad mediada por celulas (ADCC) o actividad de complemento-dependiente de la actividad de citotoxicidad (CDC).

El anticuerpo anti-glipicano 3 puede actuar como inhibidor del crecimiento celular de uno cualquiera de los apartados

(1) a (3), en donde las celulas son celulas de carcinoma. Las celulas pueden seleccionarse del grupo que consiste en celulas de cancer de pulmon, celulas de cancer de colon, celulas cancerosas mamarias, celulas de cancer de prostata, celulas de leucemia, celulas de linfoma y celulas de cancer de pancreas.

En un caso, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otro caso, el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.

La presente invencion se describira en detalle a continuacion.

Los ejemplos del anticuerpo anti-glipicano 3 para su uso en la presente invencion incluyen un anticuerpo conocido tal como un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano (documento WO 96/33735), un anticuerpo quimerico (Publicacion de la Patente JP (Kokai) N° 4-228089 A (1992)) o un anticuerpo de raton, asi como anticuerpos de la presente invencion. Ademas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo policlonal y preferiblemente es un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo anti-glipicano 3 que se usa en la presente invencion puede tener cualquier origen, puede ser de cualquier tipo (monoclonal o policlonal) y puede estar en cualquier forma, siempre que sea capaz de inhibir la proliferacion celular.

1. Anticuerpo anti-glipicano 3

El anticuerpo anti-glipicano 3 que se usa en la presente invencion puede obtenerse por medios conocidos como un anticuerpo monoclonal o policlonal. Un anticuerpo anti-glipicano 3 particularmente preferido usado en la presente invencion es un anticuerpo monoclonal procedente de un mamifero. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal procedente de un mamifero incluyen un anticuerpo producido por un hibridoma y un anticuerpo producido por un hospedador transformado usando un vector de expresion que contiene el gen del anticuerpo por tecnicas de ingenieria genetica. Este anticuerpo se une a glipicano 3 para inhibir la proliferacion celular.

Un ejemplo de dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal producido por el clon de hibridoma de la presente invencion.

2. Hibridoma productor de anticuerpos

Un hibridoma productor de anticuerpos monoclonales puede prepararse basicamente usando tecnicas conocidas tales como las que se indican a continuacion. Es decir, el hibridoma puede prepararse realizando inmunizacion usando glipicano 3 como inmunogeno de acuerdo con un metodo de inmunizacion convencional, haciendo que los inmunocitos obtenidos de esta manera se fusionen con celulas parentales conocidas mediante un metodo de fusion celular convencional y despues seleccionando celulas productoras de anticuerpos monoclonales por un metodo de seleccion convencional.

En concreto, se pueden preparar anticuerpos monoclonales como se indica a continuacion.

En primer lugar se obtiene glipicano 3 humano para utilizarlo como inmunogeno para obtener anticuerpos expresando el gen de glipicano 3 (MXR7) (secuencia de aminoacidos) como se describe por Lage, H. et al (Gene 188 (1997), 151-156). En concreto, la secuencia genica que codifica glipicano 3 se inserta en un sistema de vector de expresion conocido, se utiliza para transformar una celula hospedadora apropiada y a continuacion se purifica una proteina glipicano 3 humana diana humana por un metodo conocido a partir de las celulas hospedadoras o del sobrenadante del cultivo.

A continuacion, esta proteina glipicano 3 purificada se usa como un inmunogeno. Como alternativa, el peptido parcial de glipicano 3 se puede utilizar como antigeno de sensibilizacion. En este momento, el peptido parcial puede obtenerse por sintesis quimica a partir de la secuencia de aminoacidos del glipicano 3 humano.

El anticuerpo anti-glipicano 3 inhibe la actividad de proliferacion celular con la accion ADCC, la accion CDC y la actividad de un factor de crecimiento. Ademas, el anticuerpo anti-glipicano 3 inhibe la proliferacion celular por union a una sustancia citotoxica tal como un radioisotopo, un agente quimioterapeutico o una toxina procedente de bacterias. Por lo tanto, en la presente invencion, un epitopo presente en una molecula de glipicano 3 que se reconoce por el anticuerpo anti-glipicano 3 no esta limitado a un epitopo particular. El anticuerpo anti-glipicano 3 puede reconocer cualquier epitopo, siempre que el epitopo este presente en una molecula de glipicano 3. Por consiguiente, como antigeno para preparar el anticuerpo anti-glipicano 3 de la presente invencion puede usarse cualquier fragmento, siempre que contenga el epitopo de una molecula de glipicano 3.

El mamifero que se va a inmunizar con un inmunogeno no esta limitado especificamente y se selecciona preferiblemente considerando la compatibilidad con la celula parental que se va a utilizar para la fusion celular. Por ejemplo, generalmente se usan roedores tales como ratones, ratas, hamsteres, conejos o monos.

Los animales se inmunizan con un inmunogeno de acuerdo con un metodo conocido. Por ejemplo, la inmunizacion se realiza por un metodo general en el que en un mamifero se inyecta un inmunogeno por via intraperitoneal o subcutanea. En concreto, un inmunogeno se diluye o se suspende en un volumen apropiado de PBS (solucion salina tamponada con fosfato), solucion salina fisiologica o similar; si es necesario, se mezcla con el producto un volumen apropiado de un adyuvante convencional tal como coadyuvante completo de Freund; se realiza la emulsion; y a continuacion la solucion se administra a mamiferos varias veces cada 4 a 21 dias. Ademas, tambien se puede usar un vehiculo apropiado para la inmunizacion con un inmunogeno.

Los mamiferos se inmunizan como se ha descrito anteriormente y a continuacion se confirma el aumento del titulo del anticuerpo deseado en el suero. Posteriormente, se recogen los inmunocitos de los mamiferos y despues se someten a fusion celular. Un inmunocito preferido es concretamente un esplenocito.

Como celula acompanante que se va a fusionar con el inmunocito anterior se usa una celula de mieloma de mamifero. Los ejemplos de una linea celular de una celula de mieloma que se usa preferiblemente en la presente memoria incluyen diversas lineas celulares conocidas tales como P3 (P3x63Ag8.653) (J. Immunol. (1979) 123, 15481550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11(Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323) y R210 (Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133).

La fusion celular de los inmunocitos anteriores con celulas de mieloma se puede realizar basicamente de acuerdo con un metodo conocido, por ejemplo, el metodo de Kohler y Milstein et al (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46).

Mas concretamente, la fusion celular anterior se realiza en una solucion de cultivo de nutricion convencional en presencia, por ejemplo, de un acelerador de la fusion celular. Como acelerador de la fusion celular se usa, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), virus hemaglutinante de Japon (HVJ) o similares. Si se desea, tambien puede usarse un adyuvante tal como dimetilsulfoxido mediante adicion para mejorar adicionalmente la eficacia de la fusion.

Puede establecerse para su uso en la presente memoria cualquier proporcion entre inmunocitos y celulas de mieloma. Por ejemplo, es preferible que el numero de inmunocitos sea de 1 a 10 veces mayor que el de las celulas de mieloma. En cuanto a la solucion de cultivo que se va a utilizar para la fusion celular anterior puede usarse, por ejemplo, una solucion de cultivo RPMI1640 o una solucion de cultivo MEM que es apropiada para el crecimiento de la linea celular de mieloma anterior, u otras soluciones de cultivo convencionales que se usan para este tipo de cultivo celular. Ademas, puede usarse un liquido serico tal como suero bovino fetal (FCS) en combinacion con dichas soluciones.

La fusion celular se realiza mezclando suficientemente ciertas cantidades de los inmunocitos anteriores y celulas de mieloma en la solucion de cultivo anterior, anadiendo una solucion de PEG (por ejemplo, con un peso molecular medio de aproximadamente 1000 a 6000) (una concentracion general del 30 al 60% (p/v)) precalentada a aproximadamente 37°C y despues mezclando la solucion hasta formar las celulas fusionadas diana (hibridomas). Con posterioridad, se anade sucesivamente una solucion de cultivo apropiada y despues se repite una etapa de eliminacion del sobrenadante por centrifugacion para retirar de esta manera los reactivos para la fusion celular o similares que no son favorables para el crecimiento de los hibridomas.

Los hibridomas obtenidos de esta manera se seleccionan cultivandolos en una solucion de cultivo selectiva convencional tal como una solucion de cultivo HAT (una solucion de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). El cultivo en la solucion de cultivo HAT anterior se continua durante un periodo de tiempo suficiente para que mueran las celulas (celulas no fusionadas) distintas de los hibridomas diana (normalmente, de varios dias a varias semanas). Posteriormente, se realiza un metodo de dilucion limitante convencional para seleccionar y generar hibridomas monoclonales que produzcan un anticuerpo diana.

Ademas de un metodo con el que se obtienen los hibridomas anteriores inmunizando animales no humanos con antigenos, tambien pueden obtenerse anticuerpos humanos deseados que tienen actividad de union a glipicano 3 (vease la Publicacion de Patente japonesa (Kokoku) N° 1-59878 B (1989)) sensibilizando linfocitos humanos in vitro con glipicano 3, y haciendo que los linfocitos sensibilizados se fusionen con las celulas de mieloma de origen humano que tienen un potencial de division permanente. Por otra parte, el glipicano 3 como antigeno se administra a un animal transgenico que tiene todos los repertorios de un gen de anticuerpo humano para obtener celulas productoras de anticuerpo anti-glipicano 3 y despues pueden obtenerse los anticuerpos humanos para el glipicano 3 a partir de las celulas productoras de anticuerpo anti-glipicano 3 (veanse las Publicaciones de Patente Internacionales Num. WO 94/25585, WO 93/12227, WO92/03918 yWO 94/02602).

Los hibridomas preparados de esta manera que producen anticuerpos monoclonales pueden cultivarse con pases sucesivos en una solucion de cultivo convencional o pueden almacenarse durante un largo periodo en nitrogeno liquido.

Un ejemplo de un metodo que se emplea para obtener anticuerpos monoclonales a partir de los hibridomas implica cultivar los hibridomas y obtener anticuerpos monoclonales en el sobrenadante de cultivo de acuerdo con un metodo convencional. Otro metodo implica administrar los hibridomas a mamiferos que son compatibles con los hibridomas para hacer que proliferen y para obtener anticuerpos monoclonales en el liquido ascitico. El primer metodo es adecuado para obtener anticuerpos de alta pureza. Por otro lado, el segundo metodo es adecuado para la produccion de anticuerpos en grandes cantidades.

3. Anticuerpo recombinante

Un anticuerpo monoclonal que se puede usar en la presente invencion es un anticuerpo monoclonal recombinante que se prepara conando el gen de anticuerpo del hibridoma, incorporando el gen en un vector apropiado, introduciendo el vector en un hospedador y despues haciendo que el hospedador produzca los anticuerpos monoclonales recombinantes por tecnicas de ingenieria genetica (por ejemplo, vease Vandamme, A. M. et al., Eur.

J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990). En concreto, el ARNm que codifica la region variable (V) de un anticuerpo anti-glipicano 3 se aisla a partir de un hibridoma que produce el anticuerpo anti-glipicano 3. El ARNm se aisla por un metodo conocido tal como un metodo de ultracentrifugacion de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) o un metodo AGPC (Chomczynski, P et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159), preparandose de esta manera ARN total. Despues, se prepara el ARNm diana usando un kit de purificacion de ARNm (Pharmacia) o similar. Ademas, el ARNm tambien puede prepararse directamente usando un kit de purificacion de ARNm QuickPrep (Pharmacia).

El ADNc de la region V del anticuerpo se sintetiza usando la transcriptasa inversa del ARNm obtenido de esta manera. EL ADNc se sintetiza usando un kit de sintesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa AMV (SEIKAGAKU CORPORATION) o similar. Ademas, para sintetizar y amplificar el ADNc pueden emplearse, por ejemplo, un equipo 5-Ampli FINDER RACE (Clontech) y el metodo 5-RACE que usa PCR (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al. Nucleic Acids Res (1989) 17, 2919-2932).

Se purifica un fragmento de ADN diana a partir del producto de PCR obtenido de esta manera y a continuacion se liga al ADN del vector. Ademas, se prepara un vector recombinante a partir del producto y despues el vector se introduce en Escherichia coli o similar de forma consecutiva, posteriormente se seleccionan las colonias preparandose de esta forma el vector recombinante deseado. La secuencia de nucleotidos del ADN diana despues se confirma mediante un metodo conocido, tal como un metodo de terminacion de cadena con didesoxinucleotido.

Despues de obtener una cadena de ADN que codifica la region V del anticuerpo anti-glipicano 3 diana, este ADN se incorpora en un vector de expresion de contiene un ADN que codifica la region constante (region C) del anticuerpo deseado.

Para producir los anticuerpos anti-glipicano 3 usados en la presente invencion, el gen del anticuerpo se incorpora en un vector de expresion de manera que el gen se exprese bajo la regulacion de la region control de expresion del gen, por ejemplo, un potenciador y un promotor. Despues, se transforma una celula hospedadora con el vector de expresion, haciendo que el hospedador exprese el anticuerpo.

Un gen de anticuerpo se puede expresar incorporando un ADN que codifica la cadena pesada (cadena H) del anticuerpo o un ADN que codifica la cadena ligera (cadena L) del anticuerpo por separado en vectores de expresion, y despues transformando simultaneamente una celula hospedadora con los vectores; o incorporando ADN que codifican la cadena-H y la cadena-L en un solo vector de expresion y luego transformando una celula hospedadora con el vector (vease el documento WO 94/11523).

Ademas de la celula hospedadora anterior, tambien puede usarse un animal transgenico para producir un anticuerpo recombinante. Por ejemplo, un gen de anticuerpo se inserta en un gen que codifica una proteina (por ejemplo, caseina � de cabra) que se produce exclusivamente en la leche, preparandose de esta manera como un gen fusionado. Un fragmento de ADN que contiene el gen fusionado en el que se ha insertado el gen del anticuerpo se inyecta en un embrion de cabra y luego dicho embrion se introduce en una cabra hembra. Los anticuerpos deseados pueden obtenerse a partir de la leche producida por la cabra transgenica o la descendencia nacida de la cabra que ha aceptado el embrion. Ademas, para aumentar el volumen de leche que contiene el anticuerpo deseado producido por la cabra transgenica, pueden administrase hormonas para la cabra transgenica (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. Anticuerpo alterado

En la presente invencion, ademas del anticuerpo anterior, pueden usarse anticuerpos recombinantes de genes alterados artificialmente tales como anticuerpos quimericos o anticuerpos humanizados para, por ejemplo, reducir la heteroantigenicidad contra un ser humano. Estos anticuerpos alterados pueden producirse usando un metodo conocido.

Se pueden obtener anticuerpos quimericos ligando el ADN que codifica la region V del anticuerpo anterior a un ADN que codifica la region C del anticuerpo humano, incorporando el producto en un vector de expresion y despues introduciendo el vector en un hospedador para hacer que el hospedador produzca los anticuerpos. Usando este metodo conocido, pueden obtenerse anticuerpos quimericos utiles en la presente invencion.

Los anticuerpos humanizados tambien se denominan anticuerpos humanos reformados, que se prepararan injertando una CDR (region determinante de complementariedad) de un mamifero distinto de un ser humano, tal como un raton, en la CDR de un anticuerpo humano. Tambien se conoce la tecnica general de recombinacion genica (vease la Publicacion de Solicitud de Patente Europea Num. EP 125023 y el documento WO 96/02576).

En concreto, la secuencia de ADN se sintetiza por el metodo de PCR usando como cebadores varios oligonucleotidos que se han preparado para tener una parte que solapa con las regiones terminales tanto de la CDR de anticuerpo de raton como de la region flanqueante (FR) de un anticuerpo humano (vease el metodo descrito en el documento WO 98/133388).

Se selecciona la region flanqueante ligada a la CDR que tiene un buen sitio de union a antigeno. Si es necesario se pueden sustituir aminoacidos de la region flanqueante en la region variable del anticuerpo de manera que la CDR de un anticuerpo humano reformado forme un sitio de union al antigeno adecuado (Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

Se utilizan regiones de un anticuerpo humano para las regiones C de un anticuerpo quimerico y un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, para la cadena H pueden usarse Cy1, Cy2, Cy3 o Cy4C, y para la cadena L, CK o CA. Ademas, para mejorar la estabilidad de los anticuerpos o la produccion de los mismos, puede modificarse la region C del anticuerpo humano.

Un anticuerpo quimerico consiste en la region variable de un anticuerpo procedente de un mamifero distinto de un ser humano y una region constante procedente de un anticuerpo humano. Sin embargo, un anticuerpo humanizado consiste en la CDR de un anticuerpo procedente de un mamifero distinto de un ser humano y la region flanqueante y region C procedentes de un anticuerpo humano. Puesto que el anticuerpo humanizado se disena de tal manera que la antigenicidad sea baja en el cuerpo humano, este es util como ingrediente activo de un agente terapeutico de la presente invencion.

5. Anticuerpo modificado

El anticuerpo usado en la presente invencion no esta limitado a la molecula entera siempre que se una al glipicano 3 y suprima la proliferacion celular, y puede ser un fragmento del anticuerpo o un producto modificado del mismo. Se incluyen tanto un anticuerpo bivalente como un anticuerpo monovalente. Los ejemplos del fragmento de un anticuerpo incluyen Fab, F(ab')2, Fv, Fab/c que tiene un Fab y un Fc completo y un Fv monocatenario (svFv) donde el Fv de la cadena H o la cadena L se une con un enlazador apropiado. En concreto, se sintetiza un fragmento de anticuerpo tratando el anticuerpo con una enzima tal como papaina o pepsina, o se construyen genes que codifican estos fragmentos de anticuerpo, los genes se introducen en vectores de expresion y despues los genes se expresan por celulas hospedadoras adecuadas (vease, por ejemplo, Co., M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. el al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669 y Bird, R. E. et al.,TIBTECH (1991) 9, 132137).

Se obtiene un scFv por union de la region V de la cadena H y la region V de la cadena L de anticuerpos. En los scFv, la region V de la cadena H y la region V de la cadena L se unen a traves de un enlazador, o preferiblemente un enlazador peptidico (Huston, J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. (1988) 85, 5879-5883). La region V de la cadena H y la region V de la cadena L de scFv pueden proceder de cualquiera de los anticuerpos descritos en esta memoria descriptiva. Como enlazador peptidico para unir las regiones V, por ejemplo, se usa cualquier peptido monocatenario que comprende de 12 a 19 residuos de aminoacidos.

Un ADN que codifica scFv puede obtenerse como se indica a continuacion. La amplificacion se realiza por el metodo de PCR usando como moldes el ADN completo o las porciones de ADN que codifican secuencias de aminoacidos deseadas (de un ADN que codifica la cadena H o la region V de la cadena H del anticuerpo anterior y un ADN que codifica la cadena L o la region V de la cadena L), y usando un par de cebadores que especifica los dos extremos. Despues se realiza la amplificacion mediante el uso combinado de un ADN que codifica una parte del enlazador peptidico y un par de cebadores que especifica que los dos extremos se unan respectivamente a la cadena H y la cadena L.

Ademas, una vez que se ha preparado un ADN que codifica scFv, pueden obtenerse vectores de expresion que contienen los ADN y hospedadores transformados con los vectores de expresion de acuerdo con el metodo convencional. Ademas, mediante el uso del hospedador, pueden obtenerse scFv de acuerdo con el metodo convencional.

Estos fragmentos de anticuerpo pueden producirse usando hospedadores obteniendo los genes de los mismos de una forma similar al metodo anterior y causando despues la expresion de los genes. El �anticuerpo� de la presente invencion tambien incluye estos fragmentos de anticuerpo.

Como anticuerpo modificado, pueden usarse anticuerpos anti-glipicano unidos al polietilenglicol (PEG) o una de diversas moleculas tales como una sustancia citotoxica. El �anticuerpo� de la presente invencion tambien comprende estos anticuerpos modificados. Dicho anticuerpo modificado se puede obtener modificando quimicamente al anticuerpo obtenido. Ademas, ya se ha establecido en la tecnica un metodo de modificacion de anticuerpos.

Ademas, el anticuerpo usado en la presente invencion puede ser un anticuerpo biespecifico. El anticuerpo biespecifico puede tener sitios de union a antigeno que reconocen un epitopo diferente en una molecula de glipicano

3. Como alternativa, un sitio de union a antigeno puede reconocer glipicano 3 y el otro sitio de union a antigeno puede reconocer una sustancia citotoxica tal como un agente quimioterapeutico, toxinas derivadas de celulas, una sustancia radiactiva o similar. En este caso, una sustancia citotoxica se deja actuar directamente en una celula que expresa glipicano 3 para danar especificamente las celulas tumorales, de manera que pueda reprimirse la proliferacion de las celulas tumorales. Un anticuerpo biespecifico puede prepararse por union de pares H-L de dos tipos de anticuerpos, y tambien puede obtenerse por fusion de hibridomas que producen diferentes anticuerpos monoclonales para preparar celulas fusionadas productoras de anticuerpos biespecificos. Ademas, un anticuerpo biespecifico tambien puede prepararse por tecnicas de ingenieria genetica.

6. Expresion y produccion de un anticuerpo recombinante o anticuerpo modificado.

Los genes de anticuerpo construidos como se ha descrito anteriormente pueden expresarse y por lo tanto obtenerse por un metodo conocido. En el caso de celulas de mamifero, un gen puede expresarse por medio de la union funcional a un promotor util que se emplea generalmente del gen de anticuerpo a expresar, y por union a una senal de poliA cadena abajo en posicion 3' del mismo. Un promotor/potenciador es, por ejemplo, el promotor/potenciador temprano inmediato del citomegalovirus humano.

Ademas, los ejemplos de otros promotores/potenciadores que se pueden usar en la presente invencion para la expresion de anticuerpos incluyen un promotor/potenciador de un virus tal como retrovirus, un virus de polioma, un adenovirus o un virus de simio 40 (SV40), o un promotor/potenciador derivado de celulas de mamifero tal como el factor de elongacion humano 1a (HEF1a).

Cuando se usa un promotor/potenciador de SV40, la expresion genica puede realizarse facilmente por el metodo de Mulligan et al (Nature (1979) 277, 108) y cuando se usa un promotor/potenciador de HEF1a, la expresion genica puede realizarse facilmente por el metodo de Mizushima et al (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).

En el caso de Escherichia coli, se unen de manera funcional un promotor util que se usa generalmente, una secuencia senal para la secrecion del anticuerpo y el gen del anticuerpo a expresar, de manera que pueda expresarse el gen. Los ejemplos de un promotor incluyen un promotor lacz y un promotor araB. Cuando se usa el promotor lacz, el gen de anticuerpo se puede expresar por el metodo de Ward et al (Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427), o cuando se usa el promotor araB, el gen de anticuerpo se puede expresar por el metodo de Better el al (1988) 240, 1041-1043).

Como secuencia senal para la secrecion de anticuerpo puede usarse una secuencia senal pelB (Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) cuando el anticuerpo se produce en el periplasma de Escherichia coli. Despues se aislan los anticuerpos producidos en el periplasma, se repliega la estructura del anticuerpo de manera apropiada y se utiliza.

Un origen de replicacion que se puede usar procede de un SV40, un poliomavirus, un adenovirus, un papilomavirus bovino (BPV) o similares. Ademas, para amplificar el numero de copias genicas en un sistema de celulas hospedadoras, un vector de expresion puede contener un gen de aminoglucosido transferasa (APH), un gen de timidina quinasa (TK), un gen de xantina guanina fosforribosiltransferasa de Escherichia coli (Ecogpt), un gen de dihidrofolato reductasa (dhfr) o similar como marcador de seleccion.

Para producir los anticuerpos usados en la presente invencion se usa cualquier sistema de expresion, tal como un sistema de celulas eucariotas o un sistema de celulas procariotas. Los ejemplos de celulas eucariotas incluyen celulas animales tales como celulas de un sistema de celulas de mamifero establecido o un sistema de celulas de insecto, celulas de hongos filamentosos y celulas de levadura. Los ejemplos de celulas procariotas incluyen celulas bacterianas tales como celulas Escherichia coli.

Preferiblemente, los anticuerpos que se usan en la presente invencion se expresan en celulas de mamifero tales como celulas CHO, COS, de mieloma, BHK, Vero o HeLa.

Despues, una celula hospedadora transformada se cultiva in vitro o in vivo de manera que la celula hospedadora produzca un anticuerpo diana. Las celulas hospedadoras se cultivan de acuerdo con un metodo conocido. Por ejemplo, como solucion de cultivo pueden usarse DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM o similares. Se puede usar combinado un fluido serico tal como suero bovino fetal (FCS).

7.: Separacion y purificacion de anticuerpo

Los anticuerpos expresados y producidos como se ha descrito anteriormente pueden aislarse de las celulas o animales hospedadores y purificarse a un nivel uniforme. El aislamiento y purificacion de los anticuerpos que se van a utilizar en la presente invencion pueden realizarse usando columnas de afinidad. Un ejemplo de una columna que usa una columna de proteina A es Hyper D, POROS, Sepharose F.F. (Pharmacia). Se pueden usar otros metodos convencionales de aislamiento y purificacion que se emplean para proteinas y no hay limitacion con respecto a su uso. Por ejemplo, ademas de la columna de afinidad anterior pueden seleccionarse de manera apropiada y combinarse para uso una columna de cromatografia, un filtro, ultrafiltracion, un metodo de desplazamiento salino, dialisis y similares, de manera que los anticuerpos pueden aislarse y purificarse (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

8.: Confirmacion de la actividad del anticuerpo

Pueden emplearse medios conocidos para someter a ensayor la actividad de union a antigenos del anticuerpo que se usa en la presente invencion (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988) y la actividad para inhibir la union del receptor al ligando (Harada, A. et al., International Immunology (1993)5, 681-690).

Como metodo para medir la actividad de union a antigeno del anticuerpo anti-glipicano 3 usado en la presente invencion pueden emplearse ELISA (ensayo de inmunoabsorbente ligado a enzima), EIA (inmunoensayo enzimatico), RIA (radioinmunoensayo) o la tecnica de anticuerpos fluorescentes. Por ejemplo, cuando se emplea el inmunoensayo enzimatico, a una placa recubierta con glipicano 3 se le anade una muestra que contiene anticuerpos anti-glipicano 3, tal como el sobrenadante de cultivo de celulas productoras de anticuerpos anti-glipicano 3 o anticuerpos purificados. Despues se anade un anticuerpo secundario marcado con una enzima tal como fosfatasa alcalina. La placa despues se incuba y posteriormente se lava, se anade un sustrato enzimatico tal como acido pnitrofenil fosforico y despues se mide la absorbancia, de manera que puede evaluarse la actividad de union al antigeno.

Para confirmar la actividad del anticuerpo usado en la presente invencion se mide la actividad de neutralizacion de un anticuerpo anti-glipicano

9. Actividad citotoxica

Los anticuerpos usados en la presente invencion tienen actividad ADCC o actividad CDC como actividad citotoxica.

La actividad ADCC puede medirse mezclando celulas efectoras, celulas diana y anticuerpos anti-glipicano 3 y despues examinando el grado de ADCC. Como celulas efectoras pueden usarse, por ejemplo, esplenocitos de raton, sangre periferica humana o monocitos aislados a partir de la medula osea. Como celulas diana pueden usarse, por ejemplo, lineas celulares humanas establecidas tales como la linea celular humana de cancer hepatico HuH-7. Las celulas diana previamente se marcan con 51Cr, se anaden anticuerpos antiglipicano 3 a las celulas y despues se realiza la incubacion. A continuacion se anaden celulas efectoras en una relacion apropiada entre dichas celulas y las celulas diana y despues se realiza una incubacion. Despues de la incubacion se recoge el sobrenadante y se cuenta la radiactividad en el sobrenadante, de forma que puede medirse la actividad ADCC.

La actividad CDC puede medirse mezclando las celulas diana marcadas anteriores y los anticuerpos anti-glipicano 3, anadiendo complementos, realizando la incubacion, cultivando y despues contando la radiactividad en el sobrenadante.

Los anticuerpos necesitan una porcion Fc para ejercer la actividad citotoxica. Cuando el inhibidor del crecimiento celular de la presente invencion utiliza la actividad citotoxica de un anticuerpo, es necesario que anticuerpo antiglipicano 3 usado en la presente invencion contenga la porcion Fc.

10.: Inhibicion de la vascularizacion

El anticuerpo anti-glipicano 3 de la presente invencion se puede utilizar para inhibir la vascularizacion.

11.: Metodo de administracion y preparacion farmaceutica

El inhibidor del crecimiento celular de la presente invencion se usa para tratar o mejorar canceres seleccionados del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, leucemia, linfoma y cancer de pancreas.

Los ejemplos preferidos de las celulas de carcinoma diana del inhibidor del crecimiento celular de la presente invencion son celulas de cancer de pulmon, celulas de cancer de colon, celulas de cancer de mama, celulas de cancer de prostata, celulas de leucemia, celulas de linfoma y celulas de cancer pancreatico.

La dosis eficaz se selecciona del intervalo de 0,001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por administracion. Como alternativa, puede seleccionarse una dosis en el intervalo de 0,01 a 100.000 mg/peso corporal por paciente. Sin embargo, la dosis del agente terapeutico que contiene los anticuerpos antiglipicano 3 de la presente invencion no se limita a estas dosis.

Ademas, en cuanto al momento de dosificacion del agente terapeutico de la presente invencion, el agente puede administrarse antes o despues del inicio de los sintomas clinicos de una enfermedad.

El agente terapeutico que contiene los anticuerpos anti-glipicano 3 como ingrediente activo de la presente invencion puede formularse de acuerdo con metodos convencionales (Remingtons Pharmaceutical Science, ultima edicion, Mark Publishing Company, Easton, U.S.A) y puede contener un vehiculo farmaceuticamente aceptable y un aditivo conjuntamente.

Los ejemplos de dichos vehiculos y aditivos farmaceuticos incluyen agua, un disolvente organico farmaceuticamente aceptable, colageno, poli(alcohol vinilico), polivinilpirrolidona, polimero carboxivinilico, carboximetilcelulosa sodica, poliacrilato sodico, alginato sodico, dextrano soluble en agua, carboximetilalmidon sodico, pectina, metil celulosa, etil celulosa, goma xantana, goma arabiga, caseina, agar, polietilenglicol, diglicerina, glicerina, propilenglicol, vaselina, parafina, alcohol estearilico, acido estearico, albumina de suero humano (HSA), manitol, sorbitol, lactosa, y un tensioactivo que sea aceptable como aditivo farmaceutico.

De acuerdo con la forma de dosificacion del agente terapeutico de la presente invencion se selecciona uno o una combinacion apropiada de los aditivos anteriores, pero la invencion no se limita por esto. Por ejemplo, el agente que puede usarse como preparacion farmaceutica para inyeccion puede prepararse disolviendo anticuerpos antiglipicano 3 purificados en un disolvente tal como una solucion fisiologica salina, un tampon o una solucion de glucosa, y anadiendo a continuacion un inhibidor de la adsorcion tal como Tween80, Tween20, gelatina o albumina de suero humano a la solucion. Como alternativa, puede usarse un agente liofilizado para preparar una forma de dosificacion que se disuelve para la reconstitucion antes del uso. Como excipiente para la liofilizacion puede usarse un alcohol de azucar o sacaridos, tales como manitol o glucosa.

Breve Descripci6n de los Dibujos

La Fig. 1 muestra la actividad ADCC en celulas HuH-7 de anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 2 muestra la actividad CDC en celulas HuH-7 de anticuerpos anti-glipicano 3 (K6511).

La Fig. 3 muestra la expresion de glipicano en celulas HuH-7.

La Fig. 4A muestra los resultados de un analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de cancer pulmonar humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4B muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de leucemia humana. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4C muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de linfoma humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4D muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de cancer de colon humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4E muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de cancer de mama humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4F muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por lineas celulares de cancer de prostata humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534).

La Fig. 4G muestra los resultados del analisis FACS de la expresion de GPC3 por la linea celular de cancer pancreatico humano y la linea celular de cancer hepatico humano. Son los resultados de analisis con anticuerpos antiglipicano 3 (K6534).

Mejor Modo de Llevar a cabo la Invenci6n

La presente invencion se describira adicionalmente haciendo referencia a los siguientes ejemplos. Sin embargo, el alcance tecnico de la presente invencion no se limita por estos ejemplos o similares.

Ejemplo 1 Preparacion de anticuerpo monoclonal contra el peptido sintetico glipicano-3

Se sintetizo un peptido que tenia una secuencia de aminoacidos (del 355° al 371° aminoacido) (RQYRSAYYPEDLFIDKK) de la proteina glipicano-3 humana. El peptido sintetico se unio a hemocianina de lapa ojo de cerradura (KLH) usando un agente de entrecruzamiento del tipo de maleinimida benzoiloxi succinimida (MBS), preparandose de esta manera un inmunogeno. Se inmunizaron ratones (BALB/c, hembras, de 6 semanas de edad) 3 veces con el inmunogeno a 100 Ig/raton. Se sometieron a ensayo los titulos de anticuerpo en suero. Un metodo empleado como metodo de ensayo de titulo de anticuerpos implica hacer que el suero diluido reaccione con los peptidos (0,5 Ig) inmovilizados en una placa, realizar la reaccion con anticuerpos anti-raton marcados con HRP, anadir un sustrato y despues medir la absorbancia a 450 nm del color desarrollado del color desarrollado de esta manera (un metodo ELISA en fase solida de peptidos). Despues de confirmar los titulos de anticuerpo, se recogieron los esplenocitos y despues se fusionaron (Kohler, G, Milstein, C: Nature, 256: 495 (1975)) con celulas de mieloma (P3/X63-Ag8), preparandose de esta manera hibridomas. Despues se purificaron anticuerpos monoclonales producidos por cinco tipos de hibridomas. La actividad de union al peptido se midio usando el metodo ELISA en fase solida de peptidos y despues se seleccionaron anticuerpos IgG1 (en lo sucesivo K6534) y anticuerpos IgG3 (en lo sucesivo K6511) que tenian alta actividad de union.

Ejemplo 2 Inhibicion de la proliferacion celular usando anticuerpo anti-glipicano 3

Se midieron la actividad ADCC (citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos) y la actividad CDC (citotoxicidad dependiente de complemento) de acuerdo con el metodo de Current Protocols in Immunology; capitulo 7 Immunologic studies in humans, Editor, John E, Cologan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993.

1.: Preparacion de celulas efectoras

Se extrajo el bazo a partir de un raton CBA/N (8 semanas de edad, macho) y despues se aislaron los esplenocitos en medio RPMI1640 (GIBCO). Las celulas se lavaron en el mismo medio que contenia suero bovino fetal al 10% (FBS, HyClone) y despues se preparo una concentracion celular a 5x106/ml, preparandose de esta manera las celulas efectoras.

2.: Preparacion de solucion de complemento

Se diluyo complemento de cria de conejo (CEDARLANE) 10 veces en medio DMEM que contenia FBS al 10% (GIBCO), preparandose de esta manera una solucion de complemento.

3.: Preparacion de celulas diana

Se cultivo una linea de celulas de cancer hepatico humano HuH-7 (Japanese Collection of Research Bioresources (JCRB) N° JCRB0403, Human Science Research Support Bank (Human Science Kenkyu Shien Bank)) con 0,2 mCi de 51Cr-cromato sodico (Amersham Pharmacia Biotech) en medio DMEM que contenia FBS al 10% a 37°C durante 1 hora, realizandose de esta manera el marcaje radiactivo. Despues del marcaje radiactivo, las celulas se lavaron 3 veces en medio RPMI1640 que contenia FBS al 10% y se preparo una concentracion celular a 2x105/ml, obteniendose de esta manera las celulas diana.

4.: Medicion de la actividad ADCC

Se anadieron 50 Il de las celulas diana y de anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534) a una placa de fondo en U de 96 pocillos (Beckton Dickinson) y despues se dejaron reaccionar en hielo durante 15 minutos. Despues se anadieron 100 Il de celulas efectoras y posteriormente se cultivaron dentro de un incubador con gas dioxido de carbono durante 4 horas. La concentracion final de los anticuerpos se preparo a 0 o 10 Ig/ml. Despues del cultivo, se recogieron 100 Il del sobrenadante y despues se midio la radiactividad usando un contador gamma (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, Packard Instrument Company). La actividad citotoxica (%) se calculo usando la formula (A-C)(B-C)x100. Aqui �A� representa la radiactividad (cpm) en cada muestra, �B� representa la radiactividad (cpm) en una muestra suplementada con NP-40 al 1% (Nacalai Tesque) y �C� representa la radioactividad (cpm) en una muestra que contiene solo celulas diana. El experimento se realizo por duplicado y se calcularon los valores medios.

5.: Medicion de la actividad CDC

Se anadieron 50 Il de las celulas diana y de anticuerpos anti-glipicano 3 (K6511) a una placa de fondo en U de 96 pocillos (Beckton Dickinson) y despues se dejaron reaccionar en hielo durante 15 minutos. Posteriormente se anadieron 100 Il de una solucion de complemento, seguido de 4 horas de cultivo en un incubador con gas dioxido de carbono. La concentracion final del anticuerpo fue de 0 o 3 Ig/ml. Despues del cultivo, se recogieron 100 Il del sobrenadante y posteriormente se midio la radiactividad usando un contador gamma. La actividad citotoxica (%) se calculo de la misma manera que en el punto en �4. Medicion de la actividad ADCC�. El experimento se realizo por duplicado y se calcularon los valores medios.

La Figura 1 muestra la actividad ADCC y la Figura 2 muestra la actividad CDC. Estos resultados revelaron que los anticuerpos anti-glipicano 3 ejercen actividad ADCC y actividad CDC en una linea de celulas de cancer hepatico humano HuH-7 y de esta manera inhiben la proliferacion celular.

Ejemplo 3 Medicion del nivel de expresion de glipicano en celulas HuH-7

Se suspendieron aproximadamente 5x105 celulas HuH-7 en 100 Il de FACS/PBS (preparado disolviendo 1 g de albumina de suero bovino (SIGMA) en 1 L de CellWASH (Beckton Dickinson)). Despues se anadieron anticuerpos anti-glipicano 3 (K6511) o IgG2a de raton (Biogenesis) como anticuerpos de control a 25 Ig/ml y posteriormente la solucion se dejo en reposo en hielo durante 30 minutos. Despues de lavar con FACS/PBS, el producto se suspendio en 100 Il de FACS/PBS. Se anadieron 4 Il de Ig de cabra anti-raton FITC (Becton Dickinson) y despues la solucion se dejo en reposo en hielo durante 30 minutos.

Despues de lavar dos veces con FACS/PBS, el producto se suspendio en 1 ml de FACS/PBS. La intensidad de fluorescencia de las celulas se midio usando un citometro de flujo (EPICS XL, BECKMAN COULTER).

La Figura 3 muestra el resultado de la citometria de flujo. Se expreso glipicano 3 en celulas HuH-7, lo cual sugiere que los anticuerpos anti-glipicano 3 se unen al glipicano 3 expresado en las celulas inhibiendo de esta manera la proliferacion celular (Fig. 3).

Ejemplo 4 Analisis de la expresion de GPC3 en un panel de celulas de carcinoma usando FCM.

Se analizo la expresion de glipicano 3 (GPC3) por lineas celulares de cancer humano (pulmon, colon, recto, mamario, prostata, leucemia, linfoma, mieloma, pancreas e higado) usando FCM.

Las celulas se cultivaron durante 2 dias y despues se sometieron a ensayo. Las celulas adheridas se recogieron usando Tripsina-EDTA (N° de Cat. 25300-054, Lote 14210, GIBCO) que se habia diluido 10 veces con tampon de disociacion celular (N° de Cat. 13150-016, Lote 1098554, GIBCO). Las celulas recogidas se dejaron reaccionar en hielo con anticuerpos anti-glipicano 3 (K6534, 600 Ig/ml) o anticuerpos mIgG2a como control negativo (Biogenesis,

M-IgG2a-i, Lote EA990719A, 1 mg/ml) (concentracion final de anticuerpo de 10 Ig/ml). Despues de lavarse, las celulas se dejaron reaccionar con anticuerpo Ig anti-raton marcado con FITC (Num. de Cat. 349031, BD PharMingen) en hielo (2 Il/ensayo). Despues de lavar las celulas, se midio la intensidad de 5 fluorescencia usando un citometro de flujo (EPICS XL, BECKMAN COULTER). Como resultado, se confirmo la expresion de GPC3 en las lineas de celulas de cancer de pulmon (A549, NCI-H460, NCI-H23, NCI-H226, DMS114, EKVX, HOP-62 y NCI-H322 M); las lineas de celulas de leucemia P30/OHK, BALL-1, THP-1 y P39/TSU), las lineas de celulas de linfoma (MLMA, Ramos y U937); las lineas de celulas de cancer de colon (SW480, COLO205, LoVo y SW837), la lineas de celulas de cancer de mama (MDA-MB-231, SK-BR-3 y MDA-MB468), las lineas de celulas de cancer de prostata (LNCaP y 22Rv1), la linea de celulas de cancer pancreatico (MIAPaCa-2) y la linea de celulas de cancer hepatico (higado) (HepG2). Basandose en estos resultados, se concluye que el inhibidor del crecimiento celular de la presente invencion es util para tratar el cancer de pulmon, el cancer de colon, el cancer de mama, el cancer de prostata, la leucemia, el linfoma, el cancer pancreatico y similares.

Aplicabilidad Industrial

De acuerdo con la presente invencion, se proporciona un anticuerpo antiglipicano 3 para su uso en el tratamiento del cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, leucemia, linfoma y cancer de pancreas.

LISTA DE SECUENCIAS

lt;110gt; CHUGAI SEIYAKU KABUSHIKI KAISHA

lt;120gt; INHIBIDORES DE LA PROLIFERACION CELULAR QUE CONTIENENE UN ANTICUERPO ANTI-GLIPICANO 3

5 lt;130gt; N90727C

lt;150gt; JP 2001-189443 lt;151gt; 2001-06-22

lt;160gt; 1

lt;170gt; PatentIn version 3.5

lt;210gt; 1 10 lt;211gt; 17

lt;212gt; PRT

lt;213gt; Secuencia Artificial

lt;220gt;

lt;223gt; Peptido sintetico basado en los aminoacidos 355 a 371 de la proteina glipicano 3 humana 15 lt;400gt; 1

Claims

REIVINDICACIONES

1.

Un anti-glipicano 3 para su uso en el tratamiento de cancer seleccionado entre el grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, leucemia, linfoma y cancer de pancreas.
2.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1, en donde el cancer es cancer de pulmon.

5 3. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimerico.
4. Un anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde el anticuerpo tiene una actividad citotoxica.
5. Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde la actividad citotoxica es la citotoxicidad celular 10 dependiente de anticuerpos (ADCC).
6.

Un anticuerpo de acuerdo con la reivindicacion 4, en donde la actividad citotoxica es la citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).
7.

El uso de un anti-glipicano 3 en la fabricacion de un medicamento para su uso en el tratamiento del cancer

seleccionado del grupo que consiste en cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de mama, cancer de prostata, 15 leucemia, linfoma y cancer de pancreas.