CN104829704B - 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株 - Google Patents

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株 Download PDF

Info

Publication number
CN104829704B
CN104829704B CN201410767938.6A CN201410767938A CN104829704B CN 104829704 B CN104829704 B CN 104829704B CN 201410767938 A CN201410767938 A CN 201410767938A CN 104829704 B CN104829704 B CN 104829704B
Authority
CN
China
Prior art keywords
gpc3
cell strain
hybridoma cell
monoclonal antibody
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410767938.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN104829704A (zh
Inventor
程华
闫静辉
方向东
吴萌
崔硕
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Original Assignee
Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences filed Critical Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority to CN201410767938.6A priority Critical patent/CN104829704B/zh
Publication of CN104829704A publication Critical patent/CN104829704A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN104829704B publication Critical patent/CN104829704B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/577—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor involving monoclonal antibodies binding reaction mechanisms characterised by the use of monoclonal antibodies; monoclonal antibodies per se are classified with their corresponding antigens
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Abstract

本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段，其具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列；本发明的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测，包括蛋白含量、活性和蛋白结构的检测。本发明还涉及一种单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3‑1H5，分泌的GPC3抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。

Description

一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株
技术领域
本发明涉及一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3GPC3蛋白片段、其应用及其制备的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，具体属于细胞工程领域。
背景技术
我国肝癌的早期诊断中应用最多的检测指标是甲胎蛋白（AFP），吴孟超等检测了5343例肝癌病例中甲胎蛋白的水平，阳性率为69.4%。表明甲胎蛋白是目前诊断肝癌极为重要的血清标志物之一，但是同时仍有3成以上的错、漏检率。寻找新的肝癌特异性标志物是提高临床早期诊断的重要途径之一。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖是硫酸乙酰肝素糖蛋白中的一个家族，参与调控个体发育、细胞增殖和分化等过程。其中，磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（Glypican-3，GPC3）是1996年Pillia等在研究Simpson-Golabi-Behmel综合症（SGBS）时，从人胚胎cDNA文库中首次克隆。GPC3基因定位于人染色体Xq26[2-3]，结构全长大于900kb，是人类最大的基因之一。其5'端朝向端粒区，3'端朝向中心粒区，由8个外显子和7个内含子组成。启动子区有许多转录因子结合位点。cDNA序列全长为2263bp，1740bp的开放阅读框编码580个氨基酸，分子量为66KDa左右。
Glypican-3的结构具有Glypican家族的共同特点，如中央球状空间结构、C端通过糖基磷脂酰肌醇（glycosyl-phosphatidylinositol, GPI）锚定于细胞膜上等。近期的相关研究表明，Glypican-3与多种肿瘤的发生发展关系密切，特别是在肝细胞癌中特异性高表达，是一种潜在的肝癌血清学和组织学重要诊断标志物。专利CN200880103166.9公开了一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体，其是以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的胞外域制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。专利CN201210152819.0则公开了一种以磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3全长片段制备的单克隆抗体，用于肿瘤诊断药物。
发明内容
本发明的目的在于表达出磷脂酰肌醇蛋白聚糖3蛋白片段，同时提供一种所分泌抗体的效价高、特异性强的单克隆抗体杂交瘤细胞株，有利于提高检测的反应灵敏性。
本发明为实现上述发明目的，所采用的技术方案如下：
一种具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段。
进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段由SEQ ID No.2的cDNA序列编码。
进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ ID No.3：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为SEQ ID No.4：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。
进一步的，所述磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段的表达载体为p3XFLAG-CMV-14，表达质粒为CMV-gpc3。
所述的磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用。
进一步的，所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。
分泌所述的GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，该细胞株于2014年11月28日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为：CCTCC C2014211。
所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备以GPC3重组蛋白为抗原免疫小鼠，取血清效价在1:105以上的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞株GPC3-1H5；所述GPC3重组蛋白具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列。
单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白由SEQ ID No.2的cDNA序列编码；所述cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ ID No.3：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，下游引物为SEQ ID No.4：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’。
单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备方法中所述GPC3重组蛋白的表达载体为p3XFLAG-CMV-14，表达质粒为CMV-gpc3。
单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体在制备GPC3蛋白表达检测试剂盒中的应用。
磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段在制备癌症检测制剂中的应用，其特征在于所述的癌症检测制剂包括以GPC3为标记物的检测制剂、含GPC3多克隆抗体的检测制剂或含GPC3单克隆抗体的检测制剂。
本发明单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的单克隆抗体可以应用于制备检测试剂盒，用于检测GPC3蛋白表达，如ELISA检测、免疫荧光分析、western-blot、免疫组织化学检测等。
本发明的有益效果为：
本发明的GPC3蛋白片段的抗体特异性强，可用于制备高效价的多克隆或单克隆抗体，或者制备GPC3蛋白标准品，可用于GPC3蛋白检测、包括含量、活性和蛋白结构的检测。
本发明的单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5分泌的抗体产量高，效价高，反应灵敏，有利于提高检测的灵敏性和准确性，可以广泛应用于GPC3蛋白表达的检测，降低GPC3抗体的生产成本，有利于GPC3检测的临床推广使用。
生物样品保藏信息
单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5，分类命名为细胞株（Cell Strain），已于2014年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址：武汉市武昌珞珈山武汉大学，邮编430072，菌种保藏号为CCTCC No. C2014211。
附图说明
图1为实施例1中gpc3基因PCR扩增的琼脂糖凝胶电泳图；
图2为实施例1中重组质粒CMV-gpc3的EcoRΙ和BamHΙ双酶切产物的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为GPC3真核表达后的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
本发明结合附图和具体实施例做进一步的说明。
实施例1 gpc3基因的克隆及重组表达质粒的构建
以含gpc3基因的质粒为模板进行PCR扩增。
上游引物：5’-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3’，插入EcoRΙ酶切位点。
下游引物：5’-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3’，插入BamHΙ酶切位点。
扩增条件：95℃预变性5 min；94℃变性1 min，62℃退火1 min，72℃延伸2 min，共30个循环；72℃延伸10 min。将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，实验结果如图1所示，扩增所得1650bp的核苷酸片段。
将PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收，连入pMD18-T载体，产物用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒pMD18-gpc3。
将质粒pMD18-gpc3和质粒p3XFLAG-CMV-14分别用EcoRΙ和BamHΙ双酶切，产物经琼脂糖凝胶电泳后切胶回收。取含有酶切位点的目的基因和经双酶切的p3XFLAG-CMV-14用T4连接酶在16℃水浴中连接。将连接产物转化至E.coli DH5α菌株，筛选阳性克隆，获得重组表达质粒CMV-gpc3。
转化E.coli DH5α，挑选阳性克隆，提取质粒，进行EcoRΙ和BamHΙ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳检测片段大小，结果如图2所示。质粒CMV-gpc3经测序鉴定，结果表明，插入片段与已经发表的全序列中该片段完全一致，且以正确的方向插入到表达载体的克隆位点。
实施例2融合蛋白的诱导表达和纯化
将状态良好的HEK293细胞以2×105个/孔的密度铺于6孔板中培养。培养24h后，待细胞融合度为80%～90%时进行转染。用PBS冲洗3次，加入无血清DMEM高糖培养基。按照LipofectamineTM2000转染试剂说明书进行，以上述步骤获得的重组表达质粒CMV-gpc3进行转染，同时设立空白对照组（HEK293细胞）和阳性对照组（p3XFLAG-CMV-14）。用含有0.5mg/L G418、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基加压筛选，采用有限稀释法进行单克隆细胞制备，最终得到稳定表达重组蛋白的细胞株。
实施例3 单克隆抗体杂交瘤细胞株GPC3-1H5的制备
以常规方法扩增上述步骤制备的表达重组蛋白的细胞株，低温离心收集菌体，在冰浴中进行超声波破碎，以4℃、8000r/min离心20min，收集上清，按Anti-FLAG resin 纯化试剂盒纯化获得GPC3重组蛋白。
表达的GPC3重组蛋白经过纯化作为抗原，按照标准免疫程序进行免疫，即第一次免疫为等体积重组蛋白和完全弗氏佐剂混合，小鼠腹腔注射，剂量为100ul/只，其中含重组蛋白50ug。从第二次免疫开始，用等体积重组蛋白和不完全弗氏佐剂混合，重组蛋白免疫剂量同第一次免疫，每两周免疫一次。取小鼠尾静脉血检测抗体滴度，当达到1∶1×105后，无菌条件下取小鼠脾脏，分离脾细胞，与Sp2/0细胞以10∶1 比例进行融合。以重组蛋白为检测原，利用间接ELISA方法检测杂交瘤细胞效价。通过多轮得有限稀释法筛出阳性杂交瘤细胞株GPC3-1H5，按照常规方法制备腹水，利用Protein G亲和层析柱纯化mAb。用间接ELISA 法测定，其分泌的单抗效价为1∶5.12×106，抗体亚型为IgG1 型。
采用间接ELISA法进行抗体效价测定，具体步骤如下：
（1）抗原包被，采用碳酸盐缓冲液作为包被液，包被原GPC3浓度为0.5ug/ml，96孔酶标板每孔100ul，4℃过夜；洗涤，包被板恢复至室温，倾去包被液，每孔加洗液300ul，每次震荡lmin，洗3-4次，拍干；
（2）封闭，每孔加200ul 10%小牛血清作为封闭液，37℃1h；洗涤，恢复至室温，倾去封闭液，洗涤三次，每次震荡lmin，拍干；
（3）加待测抗体样品，用缓冲溶液将待测血清溶液以200倍开始倍比稀释，每孔加入100uL，并且设置空白对照孔(PBS)和阴性孔(阴性血清)，37℃放置45min；洗涤，洗涤3次，每次震荡lmin，拍干；
（4）加酶标二抗，每孔加入100ul的l:10000稀释的HRP酶标记的山羊抗鼠IgG，37℃放置30min；洗涤，洗涤3次，每次震荡1min，拍干；
（5）显色，每孔加底物显色液 100ul，37℃保温避光反应15min；终止反应，每孔加入50ul 终止液，
（6）终止反应；测定OD450nm值，用检测波长为450nm的酶标仪读取各孔光密度值。阴性对照孔OD450nm值为N，阳性为P，以P/N≧2.1，为阳性结果。
SEQUENCE LISTING
<110> 河北省科学院生物研究所
<120> 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖GPC3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株
<130> 2014
<160> 4
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 537
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Leu Val Val Ala Met Leu Leu Ser Leu Asp Phe Pro Gly Gln Ala Gln
1 5 10 15
Pro Pro Pro Pro Pro Pro Asp Ala Thr Cys His Gln Val Arg Ser Phe
20 25 30
Phe Gln Arg Leu Gln Pro Gly Leu Lys Trp Val Pro Glu Thr Pro Val
35 40 45
Pro Gly Ser Asp Leu Gln Val Cys Leu Pro Lys Gly Pro Thr Cys Cys
50 55 60
Ser Arg Lys Met Glu Glu Lys Tyr Gln Leu Thr Ala Arg Leu Asn Met
65 70 75 80
Glu Gln Leu Leu Gln Ser Ala Ser Met Glu Leu Lys Phe Leu Ile Ile
85 90 95
Gln Asn Ala Ala Val Phe Gln Glu Ala Phe Glu Ile Val Val Arg His
100 105 110
Ala Lys Asn Tyr Thr Asn Ala Met Phe Lys Asn Asn Tyr Pro Ser Leu
115 120 125
Thr Pro Gln Ala Phe Glu Phe Val Gly Glu Phe Phe Thr Asp Val Ser
130 135 140
Leu Tyr Ile Leu Gly Ser Asp Ile Asn Val Asp Asp Met Val Asn Glu
145 150 155 160
Leu Phe Asp Ser Leu Phe Pro Val Ile Tyr Thr Gln Leu Met Asn Pro
165 170 175
Gly Leu Pro Asp Ser Ala Leu Asp Ile Asn Glu Cys Leu Arg Gly Ala
180 185 190
Arg Arg Asp Leu Lys Val Phe Gly Asn Phe Pro Lys Leu Ile Met Thr
195 200 205
Gln Val Ser Lys Ser Leu Gln Val Thr Arg Ile Phe Leu Gln Ala Leu
210 215 220
Asn Leu Gly Ile Glu Val Ile Asn Thr Thr Asp His Leu Lys Phe Ser
225 230 235 240
Lys Asp Cys Gly Arg Met Leu Thr Arg Met Trp Tyr Cys Ser Tyr Cys
245 250 255
Gln Gly Leu Met Met Val Lys Pro Cys Gly Gly Tyr Cys Asn Val Val
260 265 270
Met Gln Gly Cys Met Ala Gly Val Val Glu Ile Asp Lys Tyr Trp Arg
275 280 285
Glu Tyr Ile Leu Ser Leu Glu Glu Leu Val Asn Gly Met Tyr Arg Ile
290 295 300
Tyr Asp Met Glu Asn Val Leu Leu Gly Leu Phe Ser Thr Ile His Asp
305 310 315 320
Ser Ile Gln Tyr Val Gln Lys Asn Ala Gly Lys Leu Thr Thr Thr Ile
325 330 335
Gly Lys Leu Cys Ala His Ser Gln Gln Arg Gln Tyr Arg Ser Ala Tyr
340 345 350
Tyr Pro Glu Asp Leu Phe Ile Asp Lys Lys Val Leu Lys Val Ala His
355 360 365
Val Glu His Glu Glu Thr Leu Ser Ser Arg Arg Arg Glu Leu Ile Gln
370 375 380
Lys Leu Lys Ser Phe Ile Ser Phe Tyr Ser Ala Leu Pro Gly Tyr Ile
385 390 395 400
Cys Ser His Ser Pro Val Ala Glu Asn Asp Thr Leu Cys Trp Asn Gly
405 410 415
Gln Glu Leu Val Glu Arg Tyr Ser Gln Lys Ala Ala Arg Asn Gly Met
420 425 430
Lys Asn Gln Phe Asn Leu His Glu Leu Lys Met Lys Gly Pro Glu Pro
435 440 445
Val Val Ser Gln Ile Ile Asp Lys Leu Lys His Ile Asn Gln Leu Leu
450 455 460
Arg Thr Met Ser Met Pro Lys Gly Arg Val Leu Asp Lys Asn Leu Asp
465 470 475 480
Glu Glu Gly Phe Glu Ser Gly Asp Cys Gly Asp Asp Glu Asp Glu Cys
485 490 495
Ile Gly Gly Ser Gly Asp Gly Met Ile Lys Val Lys Asn Gln Leu Arg
500 505 510
Phe Leu Ala Glu Leu Ala Tyr Asp Leu Asp Val Asp Asp Ala Pro Gly
515 520 525
Asn Ser Gln Gln Ala Thr Pro Lys Asp
530 535
<210> 2
<211> 1641
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ttggtggtgg cgatgctgct cagcttggac ttcccgggac aggcgagccc ccgccgccgc 60
cgccggacgc cacctgtcac caagtccgct ccttcttcca gagactgcag cccggactca 120
agtgggtgcc agaaactccc gtgccaggat cagatttgca agtatgtctc cctaagggcc 180
caacatgctg ctcaagaaag atggaagaaa aataccaact aacagcacga ttgaacatgg 240
aacagctgct tcagtctgca agtatggagc tcaagttctt aattattcag aatgctgcgg 300
ttttccaaga ggcctttgaa attgttgttc gccatgccaa gaactacacc aatgccatgt 360
tcaagaacaa ctacccaagc ctgactccac aagcttttga gtttgtgggt gaatttttca 420
cagatgtgtc tctctacatc ttgggttctg acatcaatgt agatgacacg gtcaatgaat 480
tgtttgacag cctgtttcca gtcatctata cccagctaat gaacccaggc ctgcctgatt 540
cagccttgga catcaatgag tgcctccgag gagcaagacg tgacctgaaa gtatttggga 600
atttccccaa gcttattatg acccaggttt ccaagtcact gcaagtcact aggatcttcc 660
ttcaggctct gaatcttgga attgaagtga tcaacacaac tgatcacctg aagttcagta 720
aggactgtgg ccgaatgctc accagaatgt ggtactgctc ttactgccag ggactgatga 780
tggttaaacc ctgtggcggt tactgcaatg tggtcatgca aggctgtatg gcaggtgtgg 840
tggagattga caagtactgg agagaataca ttctgtccct tgaagaactt gtgaatggca 900
tgtacagaat ctatgacatg gagaacgtac tgcttggtct cttttcaaca atccatgatt 960
ctatccagta tgtccagaag aatgcaggaa agctgaccac cactattggc aagttatgtg 1020
cccattctca acaacgccaa tatagatctg cttattatcc tgaagatctc tttattgaca 1080
agaaagtatt aaaagttgct catgtagaac atgaagaaac cttatccagc cgaagaaggg 1140
aactaattca gaagttgaag tctttcatca gcttctatag tgctttgcct ggctacatct 1200
gcagccatag ccctgtggcg gaaaacgaca ccctttgctg gaatggacaa gaactcgtgg 1260
agagatacag ccaaaaggca gcaaggaatg gaatgaaaaa ccagttcaat ctccatgagc 1320
tgaaaatgaa gggccctgag ccagtggtca gtcaaattat tgacaaactg aagcacatta 1380
accagctcct gagaaccatg tctatgccca aaggtagagt tctggataaa aacctggatg 1440
aggaagggtt tgaaagtgga gactgcggtg atgatgaaga tgagtgcatt ggaggctctg 1500
gtgatggaat gataaaagtg aagaatcagc tccgcttcct tgcagaactg gcctatgatc 1560
tggatgtgga tgatgcgcct ggaaacggtc agcaggcaac tccgaaggac aacgagataa 1620
gccacctttc acaacctcgg g 1641
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
cggaattcct tggtggtggc gatgct 26
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cgggatcccc cgaggttgtg aaaggt 26

Claims (5)

1.一种分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，该细胞株于2014年11月28日在中国典型培养物保藏中心进行了保藏，保藏号为：CCTCC No. C2014211。
2.根据权利要求1所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，其特征在于其通过下述方法制备：以GPC3重组蛋白为抗原免疫小鼠，取血清效价在1:105以上的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞融合，筛选获得杂交瘤细胞株GPC3-1H5；所述GPC3重组蛋白具有如SEQ ID No.1的氨基酸序列。
3.根据权利要求2所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，其特征在于所述GPC3重组蛋白由SEQ ID No.2的cDNA序列编码。
4.根据权利要求3所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，其特征在于所述cDNA序列通过PCR扩增获得，所述PCR的上游引物为SEQ ID No.3：5´-CGGAATTCCTTGGTGGTGGCGATGCT-3´，下游引物为SEQ ID No.4：5´-CGGGATCCCCCGAGGTTGTGAAAGGT-3。
5.根据权利要求3所述的分泌GPC3单克隆抗体的杂交瘤细胞株GPC3-1H5，其特征在于所述GPC3重组蛋白利用表达载体p3XFLAG-CMV-14进行表达。
CN201410767938.6A 2014-12-15 2014-12-15 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株 Active CN104829704B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410767938.6A CN104829704B (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410767938.6A CN104829704B (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN104829704A CN104829704A (zh) 2015-08-12
CN104829704B true CN104829704B (zh) 2016-08-17

Family

ID=53807936

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410767938.6A Active CN104829704B (zh) 2014-12-15 2014-12-15 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN104829704B (zh)

Families Citing this family (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116063528A (zh) * 2019-08-16 2023-05-05 原启生物科技(上海)有限责任公司 一种分离的抗原结合蛋白及其用途
CN111175520A (zh) * 2020-01-15 2020-05-19 河北省科学院生物研究所 一种Glypican-3双抗体夹心法检测试剂盒及检测方法
CN111909902B (zh) * 2020-06-24 2021-12-21 天津金虹生物科技开发有限公司 一种杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其制备方法和应用、制备致敏胶乳原液的方法以及试剂盒
CN112608907B (zh) * 2020-12-18 2023-01-17 十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院） 磷脂酰肌醇蛋白聚糖3单克隆抗体，杂交瘤细胞株和应用
CN113354737B (zh) * 2021-07-20 2022-11-18 广州爱思迈生物医药科技有限公司 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体及其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1678740A (zh) * 2002-09-04 2005-10-05 中外制药株式会社 抗存在于血液中的gpc3的分泌性n－端肽或c－端肽的抗体
CN1688692A (zh) * 2001-06-22 2005-10-26 中外制药株式会社 含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂
CN101287492A (zh) * 2005-10-14 2008-10-15 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体
CN101815726A (zh) * 2007-07-17 2010-08-25 米德列斯公司 针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004023145A1 (ja) * 2002-09-04 2004-03-18 Perseus Proteomics Inc. Ｇｐｃ3の検出による癌の診断方法
CN101377506A (zh) * 2008-04-16 2009-03-04 北京科美东雅生物技术有限公司 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3化学发光免疫分析测定试剂盒及其制备方法

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1688692A (zh) * 2001-06-22 2005-10-26 中外制药株式会社 含有抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3抗体的细胞生长抑制剂
CN1678740A (zh) * 2002-09-04 2005-10-05 中外制药株式会社 抗存在于血液中的gpc3的分泌性n－端肽或c－端肽的抗体
CN101287492A (zh) * 2005-10-14 2008-10-15 中外制药株式会社 抗-磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3抗体
CN101815726A (zh) * 2007-07-17 2010-08-25 米德列斯公司 针对磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3的单克隆抗体

Also Published As

Publication number Publication date
CN104829704A (zh) 2015-08-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN104829704B (zh) 一种磷脂酰肌醇蛋白聚糖gpc3蛋白片段及其应用和制备的杂交瘤细胞株
CN111499746B (zh) 一种针对人白介素-2的高亲和力兔单克隆抗体及其应用
CN109096395A (zh) 阻断型cd47纳米抗体及其用途
CN112079920A (zh) 一种用于检测SARS-CoV-2病毒N蛋白的单克隆抗体及其应用
CN110144009A (zh) Cd47单域抗体及其用途
AU2017213844A1 (en) Anti-ROR1 antibodies and uses thereof
CN112661842B (zh) 一种抗Ki-67特异性单克隆抗体及其应用
CN113045656B (zh) 抗hla-g异构体分子hla-g5及hla-g6的单克隆抗体及其用途
CN108795880B (zh) 产生人胸苷激酶1（tk1）特异性单克隆抗体的小鼠杂交瘤细胞株及其应用
EP3239176A1 (en) Anti-active gip antibody
CN114507287A (zh) 一种抗cldn18.2重组兔单克隆抗体及其应用
CN114989303A (zh) 一种抗cd56重组兔单克隆抗体及其应用
CN106866820A (zh) 一种用于捕获肿瘤细胞的抗人角蛋白18的单克隆抗体及其应用
CN115073591B (zh) 一种可识别asfv外膜糖基化修饰蛋白的单克隆抗体及应用
EP2757376A9 (en) Molecular marker for early indentification of pleural mesothelioma patients, and expression analysis method for same
CN107916254B (zh) Homer1单克隆抗体及其应用
CN109535255A (zh) 一种抗人cd26抗体及其在检测试剂盒中的应用
CN112646037B (zh) 一种抗cd105特异性单克隆抗体及其应用
CN116217720A (zh) 一种抗HbA1c的纳米抗体及其制备方法和应用
CN111647085B (zh) 抗体、其制备方法和应用
CN114316048A (zh) 一种可溶性b7-h5蛋白含量检测的酶联免疫检测试剂盒及其应用
CN110133278B (zh) 一种用于检测人vegf蛋白表达水平的体外试剂盒
CN110128540B (zh) 一种基于便携式血糖仪的二抗
CN112646036A (zh) 一种抗cd23特异性单克隆抗体及其应用
EP2187216B1 (en) Novel liver cancer marker

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
EXSB Decision made by sipo to initiate substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant