KR100877176B1

KR100877176B1 - 항글리피칸 3항체를 포함하는 세포증식 억제제

Info

Publication number: KR100877176B1
Application number: KR1020037016776A
Authority: KR
Inventors: 아브라타니히로유키; 나카무라테츠오; 츠치야마사유키
Original assignee: 츄가이 세이야꾸 가부시키가이샤
Priority date: 2001-06-22
Filing date: 2002-06-21
Publication date: 2009-01-07
Also published as: JP2007051159A; US7744880B2; JP4281869B2; CY1113854T1; US8263077B2; WO2003000883A1; US20070172488A1; JP4347402B2; CN1688692A; ES2312586T3; PT1411118E; JP2005225892A; US20110002922A1; KR20040030699A; EP2208784A1; JP2009024020A; CA2451493C; EP1411118A4; EP1411118B1; CN1314803C

Abstract

본 발명은 세포증식 억제제 및 세포의 이상증식에 기초한 질환, 특히 암에 대한 치료에 유용한 세포증식 억제제를 제공하며, 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 포함하는 세포증식 억제제에 관한 것이다.

세포증식 억제제, 항글리피칸 3항체

Description

항글리피칸 3항체를 포함하는 세포증식 억제제{Cell Proliferation Inhibitors Containing Anti-Glypican 3 Antibody}

본 발명은 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 포함하는 세포증식 억제제에 관한 것이다.

세포표면상에 존재하는 황산헤파란 프로테오글리칸(heparan sulfate proteoglycan)의 새로운 패밀리로서 글리피칸 패밀리가 보고되어 있으며, 현재까지, 글리피칸 패밀리의 멤버로서 5종류의 글리피칸(글리피칸 1, 글리피칸 2, 글리피칸 3, 글리피칸 4 및 글리피칸 5)가 존재하는 것으로 보고되어 있다. 이 패밀리의 멤버는 균일한 크기(약 60kDa)의 코아 단백질을 갖고, 특이적으로 잘 보존된 시스테인 서열을 공유하고 있으며, 글리코실포스파티딜이노시톨(GPI) 앵커(anchor)에 의해 세포막에 결합하고 있다.

중추신경의 발달에서 세포분열 패턴이 이상한 쇼우죠우바에 멜라노가스터(Drosophila melanogaster) 변이체의 유전자 스크리닝에 의해 Dally(division abnormally delayed) 유전자가 동정되어 있고, Dally의 cDNA는 글 리피칸의 모든 특징을 포함하고 있는 척추동물의 막형 프로테오글리칸(GRIPs)과 상동서열(24 내지 26% 상동)을 나타내는 산물을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)(ORF)을 나타내는 것이 알려져 있다. 그 후, Dally가 dpp(decapentaplegia) 리셉터 기구를 조절하는 역할을 갖는 것이 시사되었고, 이로부터 포유동물의 글리피칸이 TGF와 BMP의 시그널 전달을 조절하고 있는 가능성을 시사하고 있다. 즉, 글리피칸이 헤파린 결합성 증식인자(EGF, PDGF, BMP2, FGF's) 등) 중 어느 것인가의 공동 리셉터로서 기능하고 있는 가능성이 시사되어 있다.

글리피칸 3은 랫트의 소장에서 발생적으로 조절되고 있는 전사물로서 분리되고(참조: Filmus, J., Church, J.G., and Buick, R.n.(1988) Mol. Cell Biol. 8, 4243-4249), 이 후에 글리피칸 패밀리의 분자량 69kDa의 코아 단백질을 가진 GPI-결합형의 황산헤파린 프로테오글리칸, OCT-5로서 동정되었다(참조: Filmus, J., Shi, W., Wong, Z.-M., and Wong, M.J.(1995) Biochem. J. 311, 561-565). 인간에 있어서도, 인간 위염 세포주로부터 글리피칸 3을 코딩하는 유전자가 MXR-7로서 단리되어 있다(참조: Hermann Lage et al., Gene 188(1997) 151-156). 글리피칸 3은 인슐린 모양 증식인자-2와 단백-단백 복합체를 형성하고, 이 증식인자의 활동을 조절하는 것이 보고되어 있다(참조: Pilia, G. et al, (1996) Nat. Genet. 12, 241-247). 이 보고는 글리피칸 3이 반드시 황산헤파린쇄에 의해 증식인자와 상호작용하고 있는 것은 아니라는 것을 시사하고 있다.

또한, 글리피칸 3에 대해서 간세포암 마커로서 이용할 수 있는 가능성의 시사는 보고되어 있지만(참조: Hey-Chi Hsu et al., CANCER RESEARCH 57, 5179- 5184(1997)), 글리피칸 3과 암세포증식의 확실한 관계에 대해서는 알려지지 않았다.

또한, 글리피칸이 혈관신생 저해제로서 작용할 가능성이 있는 엔도스타틴(endostatin)의 수용체로서의 기능이 있을 가능성도 시사되어 있지만(참조: Molecular Cell(2001, 7, 811-822), 이 기능과 세포증식과의 관계도 명확하지 않다.

이상과 같이, 글리피칸 3이 세포증식에 관여하는 시사는 있었지만, 그의 세포증식의 기구 등에 대해서는 명확하지 않고, 글리피칸 3을 세포증식의 조절에 이용하는 시도도 전무하였다.

본 발명은 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 포함하는 세포증식 억제제를 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명자들은 예의 연구를 거듭한 결과, 항글리피칸 3항체가 ADCC(항체 의존성 세포장해, antibody-depedent cell-mediated cytotoxicity)활성, CDC(보체 의존성 세포장해, complement-dependent cytotoxicity) 활성에 의해 세포증식 억제활성을 발휘하는 것을 발견하고, 본 발명을 완성하기에 이르렀다. 또한, 항글리피칸 3항체가 증식인자의 작용을 저해함으로써도 세포증식 억제활성을 발휘하는 것도 예측되었다. 또한, 항글리피칸 3항체에 방사성 동위원소, 화학요법제, 세포유래 독소 등의 세포장해성 물질을 결합함으로써도 세포증식 억제활성을 발휘할 수 있었 다.

즉, 본 발명은

(1) 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 포함하는 세포증식 억제제,

(2) 항글리피칸 3항체가 세포장해 활성을 갖는 (1)에 개시된 세포증식 억제제,

(3) 세포장해 활성이 항체 의존성 세포장해(ADCC) 활성 또는 보체 의존성 세포장해(CDC) 활성인 (2)에 개시된 세포증식 억제제,

(4) 세포가 암세포인 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 개시된 세포증식 억제제,

(5) 세포가 간암세포, 폐암세포, 대장암세포, 유방암세포, 전립선암세포, 백혈병세포, 림파종세포 및 췌장암세포로 이루어진 군으로부터 선택된 (4)에 개시된 세포증식 억제제,

(6) 세포가 간암세포인 (5)에 개시된 세포증식 억제제,

(7) 항체가 모노클로날 항체인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 개시된 세포증식 억제제,

(8) 항체가 인간형 또는 키메라화된 것인 (1) 내지 (6) 중 어느 하나에 개시된 세포증식 억제제,

(9) 글리피칸 3에 결합하는 항체,

(10) 세포장해 활성을 갖는 (9)에 개시된 항체,

(11) 간암세포에 대해서 세포장해 활성을 갖는 (10)에 개시된 항체, 및

(12) 간암세포주 HuH-7에 대해서 세포장해 활성을 갖는 (11)에 개시된 항체 이다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

본 발명은 항글리피칸 항체를 유효성분으로 함유하는 세포증식 억제제이다. 또한, 본 발명은 항글리피칸 항체를 유효성분으로 포함하는 세포의 이상증식에 기초한 질환, 특히 암에 대한 치료에 이용할 수 있는 세포증식 억제제이다.

본 발명의 항글리피칸 3항체로서는 예컨대, 인간형화 항체, 인간항체(참조: 국제공개 제 WO96/33735호 공보) 또는 키메라 항체(참조: 특개평 제 4-228089호), 마우스 항체 등의 공지의 항체 외에, 본 발명에 있어서 항체 등을 예로 들 수 있다. 또한, 항체는 폴리크로날 항체이어도 무방하지만, 모노클로날 항체인 것이 바람직하다.

본 발명에서 사용되는 항글리피칸 3항체는 세포증식 억제기능을 갖는 것이면 그 유래, 종류(모노클로날, 폴리클로날) 및 형상을 묻지 않는다.

1. 항글리피칸 3항체

본 발명에서 사용되는 항글리피칸 3항체는 공지의 수단을 사용하여 폴리클로날 또는 모노클로날 항체로서 수득할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 항글리피칸 3항체로서, 특히 포유동물 유래의 모노클로날 항체가 바람직하다. 포유동물 유래의 모노클로날 항체는 하이브리도마(hybridoma)에서 생산되는 것 및 유전공학적 방법에 의해 항체 유전자를 포함하는 발현벡터로 형질전환한 숙주에서 생산되는 것을 포함한다. 이 항체는 글리피칸 3과 결합하고 세포증식을 억제하는 항체이다.

이와 같은 항체로서는 본 발명의 하이브리도마 클론에 의해 생산되는 모노클로날 항체를 예로 들 수 있다.

2. 항체 생산 하이브리도마

모노클로날 항체생산 하이브리도마는 기본적으로는 공지기술을 사용하고, 이하와 같이 하여 작제할 수 있다. 즉, 글리피칸 3을 감작항원으로서 사용하고, 이것을 통상의 면역방법에 따라 면역하여 수득한 면역세포를 통상의 세포융합법에 의해 공지의 신세포와 융합시켜 통상의 스크리닝법에 의해 모노클로날 항체생산 세포를 스크리닝함으로써 작제할 수 있다.

기본적으로는, 모노클로날 항체를 작제하는 것은 다음과 같이 하면 바람직하다.

먼저, 항체 취득의 감작항원으로서 사용되는 인간 글리피칸 3을 [Lage, H. et al., Gene 188(1997), 151-156]에 개시된 글리피칸 3(MXR 7)유전자/아미노산 서열을 발현함으로써 수득한다. 즉, 글리피칸 3을 코딩하는 유전자 서열을 공지의 발현벡터계에 삽입하여 적당한 숙주세포를 형질전환시킨 후, 그 숙주세포 중 또는 배양상등액 중에서 목적하는 인간 글리피칸 3 단백질을 공지의 방법으로 정제한다.

이어서, 이렇게 정제된 글리피칸 3 단백질을 감작항원으로서 사용하거나, 또는, 글리피칸 3의 부분 펩티드를 감작항원으로서 사용할 수도 있다. 이 때, 부분 펩티드는 인간 글리피칸 3의 아미노산 서열로부터 화학합성에 의해 수득할 수 있다.

항글리피칸 3항체가 ADCC의 작용, CDC에 의한 작용, 증식인자 활성의 저해에 의한 세포증식 억제활성을 저해하는 것으로부터, 또는 항글리피칸 3 항체에 방사성 동위원소, 화학요법제, 세균유래 독소 등의 세포장해성 물질을 결합시킴으로써 세포증식을 억제할 수 있는 것으로부터, 본 발명의 항글리피칸 3 항체의 인식하는 글리피칸 3 분자상의 에피톱은 특정의 것에 한정되지 않고, 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피톱이면 어느 에피톱을 인식해도 무방하다. 따라서, 본 발명의 항글리피칸 3 항체를 작제하기 위한 항원은 글리피칸 3 분자상에 존재하는 에피톱을 포함하는 단편이면 어느 단편도 사용할 수 있다.

감작항원으로 면역시킨 포유동물로서는 특별히 한정되지는 않지만, 세포융합에 사용하는 신세포와의 적합성을 고려하여 선택하는 것이 바람직하고, 일반적으로는 설치류의 동물, 예컨대 마우스, 랫트, 햄스터, 또는 토끼, 원숭이 등이 사용된다.

감작항원으로 동물을 면역시켜 공지 방법에 따라 수행된다. 예컨대, 일반적인 방법으로서, 감작항원을 포유동물의 복강내 또는 피하에 주사함으로써 수행된다. 구체적으로는, 감작항원을 PBS(Phosphate-Buffered Saline) 또는 생리식염수 등으로 적당량 희석하고, 현탁한 것에 필요에 따라 통상의 보조제(adjuvant) 예컨대, 프로인트 완전 보조제를 적당량 혼합하고, 유화시킨 후, 포유동물에 4 내지 21일 마다 수회 투여한다. 또한, 감작항원 면역시에 적당한 담체를 사용할 수도 있다.

이와 같이 포유동물을 면역시키고, 혈청 중에 소망하는 항원 레벨이 상승하 는 것을 확인한 후, 포유동물에서 면역세포를 채취하여, 세포융합시키는데, 바람직한 면역세포로서는 특히 비장세포를 예로 들 수 있다.

전기 면역세포와 융합되는 타방의 친세포로서, 포유동물의 미에로마(myeloma) 세포를 사용한다. 이 미에로마 세포는 공지의 각종 세포주, 예컨대 P3(P3×63Ag8.653)(참조: J. Immnol. (1979) 123, 1548-1550), P3×63Ag8U. 1(참조: Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1(참조: Kohler, G. and Milstein, C. Eur. J. Immunl. (1976) 6, 511-519), MPC-11(참조: Margulies. D.H. et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2/0(참조: Shulman M. et al., Nature(1978)276, 269-270), FO(참조: deSt, Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods (1980) 35, 1-21), S194(참조: Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. (1978) 148, 313-323), R210(참조: Galfre, G. et al., Nature (1979) 277, 131-133) 등이 바람직하게 사용된다.

전기 면역세포와 미에로마 세포의 세포융합은 기본적으로 공지의 방법, 예컨대 콜러 및 밀스테인 등의 방법(참조: Kohler, G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46) 등에 따라 수행할 수 있다.

보다 구체적으로는, 전기 세포융합은 예컨대, 세포융합 촉진제의 존재하에 통상의 영양배양액 중에서 실시된다. 융합 촉진제로서는 예컨대, 폴리에틸렌글리콜(PEG), 센다이바이러스(HVJ) 등이 사용되고, 또한 필요에 따라 융합효율을 높이기 위해서 디메틸술폭시드 등의 보조제를 첨가하여 사용할 수 있다.

면역세포와 미에로마 세포의 사용비율은 임의로 설정할 수 있다. 예컨대, 미에로마 세포에 대해서 면역세포를 1 내지 10배로 하는 것이 바람직하다. 전기 세포융합에 사용하는 배양액으로서는 예컨대, 전기 미에로마 세포주의 증식에 적당한 RPMI1640 배양액, MEM 배양액, 기타 이러한 종의 세포배양에 사용되는 통상의 배양액을 사용할 수 있고, 또한 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

세포융합은 전기 면역세포와 미에로마 세포의 소정량을 전기 배양액 중에서 잘 혼합하고, 미리 37℃ 정도로 가온한 PEG 용액(예컨대, 평균 분자량 1000-6000 정도)를 통상 30 내지 60%(w/v)의 농도로 첨가하고, 혼합함으로써 목적하는 융합세포(하이브리도마)를 형성한다. 이어서, 적당한 배양액을 순차 첨가하고, 원심하여 상등액을 제거하는 조작을 반복함으로써 하이브리도마의 생육에 바람직하지 않은 세포융합제 등을 제거한다.

이와 같이 하여 수득한 하이브리도마는 통상의 선택배양액, 예컨대 HAT 배양액(하이폭산틴(hypoxantin), 아미노프테린(aminopterin) 및 티미딘(thymidine) 등을 포함하는 배양액)에서 배양함으로써 선택된다. 상기 HAT 배양액에서의 배양은 목적하는 하이브리도마 이외의 세포(비융합세포)가 사멸하기에 충분한 시간(통상, 수일 내지 수주일) 계속한다. 이어서, 통상의 한계 희석법을 실시하여 목적하는 항체를 생산하는 하이브리도마의 스크리닝 및 단일 클로닝을 수행한다.

또한, 인간 이외의 동물에 항원을 면역하여 상기 하이브리도마를 수득하는 외에, 인간 림파구를 실험실적 조건(in vitro)에서 글리피칸 3에 감작하고, 감작 림파구를 인간 유래의 영구 분열능을 갖는 미에로마 세포와 융합시켜 글리피칸 3으 로의 결합활성을 갖는 소망하는 인간항체를 수득할 수 있다(참조: 특공평 제 1-59878호 공보). 또한, 인간항체 유전자의 모든 레퍼토리(repertory)를 갖는 유전자도입 동물에 항원이 되는 글리피칸 3을 투여하여 항글리피칸 3항체 생산세포를 취득하고, 이것을 불사화시킨(immortalized) 세포에서 글리피칸 3에 대한 인간항체를 취득해도 무방하다(참조: 국제공개 제 WO 94/25585호, WO 93/12227호, WO 92/03918호, WO 94/02602호).

이와 같이 하여 작제된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 통상의 배양액 중에서 계대배양하는 것이 가능하고, 또한 액체 질소 중에서 장기간 보존하는 것도 가능하다.

당해 하이브리도마에서 모노클로날 항체를 취득하기 위해서는 당해 하이브리도마를 통상의 방법에 따라 배양하고, 그 배양상등액으로서 수득하는 방법, 또는 하이브리도마를 이것과 융합성이 있는 포유동물에 투여하여 증식시키고, 그 복수(abdominal dropsy)로서 수득하는 방법 등이 채용된다. 전자의 방법은 고순도의 항체를 수득하기에 적당한 반면, 후자의 방법은 항체의 대량생산에 적당하다.

3. 재조합형 항체

본 발명에서는 모노클로날 항체로서 항체 유전자를 하이브리도마에서 클로닝하고, 적당한 벡터에 재조합시켜 이것을 숙주에 도입하고, 유전자재조합 기술을 사용하여 생산시킨 재조합형의 것을 사용할 수 있다(참조: Vandamme, A. M. et al., Eur. J. Biochem. (1990) 192, 767-775, 1990)

구체적으로는 항글리피칸 항체를 생산하는 하이브리도마에서, 항글리피칸 3항체의 가변(V) 영역을 코딩하는 mRMA를 단리한다. mRNA의 단리는 공지의 방법, 예컨대 구아니딘 초원심법(참조: Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299), AGPC법(참조: Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159) 등에 따라 수행하여 전체 RNA를 조제하고, mRNA Purification Kit(Pharmacia제) 등을 사용하여 목적하는 mRNA를 조제한다. 또한, QuickPrep mRNA Purification Kit (Pharmacia제)를 사용함으로써 mRNA를 직접 조제할 수도 있다.

수득한 mRNA에서 역전사 효소를 사용하여 항체 V 영역의 cDNA를 합성한다. cDNA의 합성은 AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(생화학공업사제) 등을 사용하여 수행한다. 또한, cDNA의 합성 및 증폭을 수행하기 위해서는 5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech제) 및 PCR을 이용한 5'-RACE법 등을 사용할 수 있다(참조: Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932).

수득한 PCR 산물에서 목적하는 DNA 단편을 정제하고, 벡터 DNA와 연결한다. 또한, 이것으로부터 재조합 벡터를 작제하고, 대장균 등에 도입하여 클로닝을 선택하여 소망하는 재조합 벡터를 조제한다. 그리고, 목적하는 DNA의 염기서열을 공지의 방법, 예컨대 디데옥시 뉴클레오티드 체인 터미네이션법 등에 의해 확인한다.

목적하는 항글리피칸 3항체의 V 영역을 코딩하는 DNA를 수득한 경우, 이것을 소망하는 항체 정상영역(C 영역)을 코딩하는 DNA를 포함하는 발현벡터에 재조합한다.

본 발명에서 사용되는 항글리피칸 3항체를 제조하기 위해서는 항체 유전자를 발현제어영역, 예컨대 인헨서, 프로모터를 제어하는 것으로 발현하도록 발현벡터에 재조합한다. 이어서, 이 발현벡터에 의해 숙주세포를 형질전환하고, 항체를 발현시킨다.

항체 유전자의 발현은 항체중쇄(H쇄) 또는 경쇄(L쇄)를 코딩하는 DNA를 별도로 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 동시 형질전환시켜도 무방하고, 또는 H쇄 및 L쇄를 코딩하는 DNA를 단일의 발현벡터에 재조합하여 숙주세포를 형질전환시켜도 무방하다(참조: 국제공개 제 WO 94/11523호).

또한, 재조합형 항체의 생산에는 상기 숙주세포만 뿐만 아니라, 유전자도입 동물을 사용할 수 있다. 예컨대, 항체 유전자를 유즙 중에서 고유하게 생산되는 단백질(염소 β카제인 등)을 코딩하는 유전자의 도중에 삽입하여 융합 유전자로서 조제한다. 항체 유전자가 도입된 융합 유전자를 포함하는 DNA 단편을 염소의 배 에 주입하고, 이 배를 암컷 염소에 도입한다. 배를 수용한 염소에서 발생하는 유전자도입 염소 또는 그 자손이 생산하는 유즙에서 소망하는 항체를 수득한다. 또한, 유전자도입 염소에서 생산된 소망하는 항체를 포함하는 유즙량을 증가시키기 위해서 적절한 호르몬을 유전자도입 염소에 사용해도 무방하다(참조: Ebert, K. M. et al., Bio/Technology (1994) 12, 699-702).

4. 개변항체

본 발명에서는 상기 항체 외에, 인간에 대하여 이종항원성을 저하시키는 것 등을 목적으로 하여 인위적으로 개변한 유전자 재조합형 항체 예컨대, 키메라 항체, 인간형화(humanized) 항체를 사용할 수 있다. 이들 개변항체는 공지된 방법을 사용하여 제조할 수 있다.

키메라 항체는 전기와 같이 하여 수득한 항체 V 영역을 코딩하는 DNA를 인간 항체 C 영역을 코딩하는 DNA와 연결하고, 이것을 발현벡터에 조합하여 숙주에 도입생산시킴으로써 수득된다. 이 공지의 방법을 사용하여 본 발명에 유용한 키메라 항체를 수득할 수 있다.

인간형화 항체는 재구성(reshaped) 인간항체라고도 칭하고, 이것은 인간 이외의 포유동물, 예컨대 마우스 항체의 상보성 결정영역(CDR; complementarity determining region)을 인간항체의 상보성 결정영역에 이식한 것이고, 그의 일반적인 유전자 재조합 방법도 알려져 있다(참조: 유럽특허공개 제 125023호, 국제공개 WO 제 96/02576호).

구체적으로는, 마우스 항체의 CDR 및 인간 항체의 프레임워크 영역(framework region; FR)을 연결하도록 설계된 DNA 서열을 CDR 및 FR 양방의 말단영역에 오버랩하는 부분을 갖도록 작제한 수개의 올리고 뉴클레오티드를 프라이머로서 사용하여 PCR법에 의해 합성한다(참조: 국제공개 제 WO98/13388호).

CDR을 통해 연결된 인간 항체의 프레임워크 영역은 상보성 결정영역이 양호한 항원결합 부위를 형성하는 것이 선택된다. 필요에 따라, 재구성 인간 항체의 상 보성 결정영역이 적절한 항원결합 부위를 형성하도록 항체의 가변영역에서 프레임워크 영역의 아미노산을 치환해도 무방하다(참조: Sato, K. et al., Cancer Res. (1993) 53, 851-856).

키메라 항체 및 인간형화 항체의 C영역에는 인간항체의 것이 사용되고, 예컨대 H쇄에는 Cγ1, Cγ2, Cγ3, Cγ4를 L쇄에는 Cκ, Cλ를 사용할 수 있다. 또한, 항체 또는 그의 생산의 안정성을 개선하기 위해서 인간항체 C 영역을 수식해도 무방하다.

키메라 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 가변영역과 인간항체 유래의 정상영역으로 이루어진다. 한편, 인간형화 항체는 인간 이외의 포유동물 유래 항체의 상보성 결정영역과 인간항체 유래의 프레임워크 영역 및 C영역으로 이루어진다. 인간형화 항체는 인간체내에서 항원성이 저하되어 있기 때문에, 본 발명의 치료제의 유효성분으로서 유용하다.

5. 항체 수식물

본 발명에서 사용되는 항체는 항체의 전체 분자에 한정되지 않고, 글리피칸 3에 결합하고, 세포의 증식을 억제하는 한, 항체의 단편 또는 그의 수식물이어도 무방하고, 이가 항체도 일가 항체도 포함된다. 예컨대, 항체의 단편으로서는 Fab, F (ab') 2, Fv, 1개의 Fab와 완전한 Fc를 갖는 Fab/c, 또는 H쇄 또는 L쇄의 Fv를 적당한 링커로 연결시킨 시그널체인 Fv(scFv)를 예로 들 수 있다. 구체적으로는 항체를 효소, 예컨대 파파인(papain), 펩신으로 처리하고 항체단편을 생성시키거나 또는 이들 항체 단편을 코딩하는 유전자를 정제하고, 이것을 발현벡터에 도입한 후, 적당한 숙주세포에서 발현시킨다(참조: Co, M.S. et al., J. Immunol. (1994) 152, 2968-2976, Better, M. & Horwitz, A. H. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Plueckthun, A. & Skerra, A. Methods in Enzymology (1989) 178, 476-496, Academic Press, Inc., Lamoyi, E., Methods in Enzymology (1989) 121, 652-663, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology (1989) 121, 663-669, Bird, R. E. et al., TIBTECH(1991) 9, 132-137).

scFv는 항체의 H쇄V영역과 L쇄V영역을 연결함으로써 수득된다. 이 scFv에서 H쇄V영역과 L쇄V영역은 링커, 바람직하게는 펩티드링커를 통해 연결된다(참조: Huston, J. S. et al., Proc. Nat1. Acad, Sci. U.S.A. (1998) 85, 5879-5883). scFv에서 H쇄V영역 및 L쇄V영역은 본 명세서에서 항체로서 기재된 것이면 임의의 유래이어도 무방하다. V영역을 연결하는 펩티드링커로서는 예컨대, 아미노산 12 내지 19잔기로 이루어지는 임의의 일본쇄 펩티드가 사용된다.

scFv를 코딩하는 DNA는 전기 항체의 H쇄 또는 H쇄V영역을 코딩하는 DNA 및 L쇄 또는 L쇄V영역을 코딩하는 DNA 중, 그들 서열중에서 전부 또는 소망하는 아미노산 서열을 코딩하는 DNA 부분을 주형으로 하고, 그 양단을 규정하는 프라이머대를 사용하여 PCR법에 의해 증폭하고, 이어서, 펩티드 링커 부분을 다시 코딩하는 DNA 및 그 양단이 각각 H쇄, L쇄와 연결되도록 규정하는 프라이머대를 조합시켜 증폭함으로써 수득된다.

또한, 일단 scFv를 코딩하는 DNA가 작제되면, 이것을 함유하는 발현벡터 및 당해 발현벡터에 의해 형질전환된 숙주를 통상의 방법에 따라 수득할 수 있고, 또한 그 숙주를 사용함으로써 통상의 방법에 따라 scFv를 수득할 수 있다.

이들 항체의 단편은 전기와 동일하게 하여 그 유전자를 취득하고 발현시켜, 숙주에 의해 생산시킬 수 있다. 본 발명에서「항체」에는 이들 항체의 단편도 포함된다.

항체의 수식물로서 폴리에틸렌글리콜(PEG) 또는 세포장해성 물질 등의 각종 분자와 결합한 항글리피칸 항체를 사용할 수도 있다. 본 발명에서「항체」에는 이들의 항체 수식물도 포함된다. 이와 같은 항체 수식물은 수득한 항체에 화학적으로 수식함으로써 수득할 수 있다. 또한, 항체의 수식방법은 이 분야에서 이미 확립되어 있다.

또한, 본 발명에서 사용되는 항체는 이중 특이성 항체(bispecific antibody)이어도 무방하다. 이중 특이성 항체는 글리피칸 3분자상의 다른 에피톱을 인식하는 항원결합 부위를 갖는 이중 특이성 항체이어도 무방하고, 일방의 항원결합부위가 글리피칸 3을 인식하고, 타방의 항원결합 부위가 화학요법제, 세포유래독소, 방사성 물질 등의 세포장해성 물질을 인식해도 무방하다. 이 경우, 글리피칸 3을 발현하고 있는 세포에 직접 세포 장해성 물질을 작용시켜 종양세포에 특이적으로 장해를 부여하여 종양세포의 증식을 억제할 수 있다. 이중 특이성 항체는 2종류의 항체의 HL대를 결합시켜 작제할 수도 있고, 다른 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 융합시켜 이중 특이성 항체 생산 융합 세포를 작제하여 수득할 수도 있다. 또한, 유전공학적 방법에 의해 이중 특이성 항체를 작제할 수도 있다.

6. 재조합형 항체 또는 개변항체의 발현 및 생산

전기와 같이 구축한 항체 유전자는 공지의 방법에 의해 발현시키고, 취득할 수 있다. 포유류 세포의 경우, 통용되는 유용한 프로모터, 발현시킨 항체 유전자, 그 3'측 하류에 폴리A시그널을 기능적으로 결합시켜 발현시킬 수 있다. 예컨대, 프로모터/인헨서로서는 인간 사이토메갈로바이러스 전기 프로모터/인헨서(human cytomegalovirus immediate early promoter/enhancer)를 예로 들 수 있다.

또한, 그 외에 본 발명에서 사용되는 항체발현에 사용할 수 있는 프로모터/인헨서로서, 레트로 바이러스, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 시미안 바이러스 40(SV 40) 등의 바이러스 프로모터/인헨서, 또는 인간 인롱게이션 펙터 1α(HEF1α) 등의 포유류 세포 유래의 프로모터/인헨서 등을 예로 들 수 있다.

SV40 프로모터/인헨서를 사용하는 경우는 Mulligan 등의 방법(참조: Nature (1979) 277, 108)에 의해, 또는 HEF1α 프로모터/인헨서를 사용하는 경우는 미주시마(Mizushima) 등의 방법(참조: Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322)에 의해 용이하게 유전자 발현을 수행할 수 있다.

대장균의 경우, 사용된 유용한 프로모터, 항체분비를 위한 시그널 서열 및 발현시킨 항체 유전자를 기능적으로 결합시켜 당해 유전자를 발현시킬 수 있다. 프로모터로서는 예컨대, lacz 프로모터, araB 프로모터를 예로 들 수 있다. lacz 프로모터를 사용하는 경우는 워드(Ward) 등의 방법(참조: Nature (1098) 341, 544-546; FASEB J. (1992) 6, 2422-2427)에 의해, 또는 araB 프로모터를 사용하는 경우 는 베터(Better) 등의 방법(참조: Science (1988) 240, 1041-1043)에 의해 발현할 수 있다.

항체분비를 위한 시그널 서열로서는 대장균의 페리플라즘(periplasm)에서 생산시키는 경우, pelB 시그널 서열(참조: Lei, S. P. et al J. Bacteriol. (1987) 169, 4379)를 사용하면 바람직하다. 그리고, 페리플라즘에서 생산시킨 항체를 분리한 후, 항체의 구조를 적절하게 포개어(refold) 사용한다.

복제기원으로서는 SV40, 폴리오머 바이러스, 아데노 바이러스, 소파필로머 바이러스(BPV) 등에서 유래된 것을 사용할 수 있다. 또한, 숙주세포계에서 유전자 복제수 증폭을 위해 발현벡터는 선택마커로서 아미노 글리코시드 트랜스퍼라제(APH) 유전자, 티미딘 키나제(TK) 유전자, 대장균 크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제(Ecogpt) 유전자, 디히드로 엽산환원 효소(dhfr) 유전자 등을 포함할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 제조를 위해, 임의의 발현계, 예컨대 진핵세포 또는 원핵세포계를 사용할 수 있다. 진핵세포로서는 예컨대, 수립된 포유류 세포계, 곤충세포계, 진계상균세포 및 효모세포 등의 동물세포 등을 예로들 수 있고, 원핵세포로서는 예컨대, 대장균 세포 등의 세균 세포를 예로 들 수 있다.

바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 항체는 포유류 세포, 예컨대, CHO, COS, 미에로마, BHK, Vero, HeLa 세포 중에서 발현된다.

이어서, 형질전환된 숙주세포를 실험실적 조건(in vitro) 또는 생체내 조건(in vivo)에서 배양하여 목적하는 항체를 생산시킨다. 숙주세포의 배양은 공 지의 방법에 따라 수행한다. 예컨대, 배양액으로서, DMEM, MEM, RPMI1640, IMDM을 사용할 수 있고, 소태아혈청(FCS) 등의 혈청보액을 병용할 수도 있다.

7. 항체의 분비, 정제

전기와 같이 발현, 생산된 항체는 세포, 숙주동물에서 분리하여 균일하게 될때까지 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용된 항체의 분리, 정제는 친화성 컬럼을 사용하여 수행할 수 있다. 예컨대, 프로테인A 컬럼을 사용한 컬럼으로서, Hyper D, POROS, Sepharose F.F.(Pharmacia제) 등을 예로 들 수 있다. 기타, 통상의 단백질에서 사용되고 있는 분리, 정제방법을 사용하면 바람직하고, 특별히 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 상기 친화성 컬럼 이외의 크로마토그래피 컬럼, 필터, 한외여과, 염석, 투석 등을 적절히 선택, 조합시킴으로써 항체를 분리, 정제할 수 있다(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

8. 항체활성의 확인

본 발명에서 사용되는 항체의 항원결합활성(참조: Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988), 리간드리셉터 결합저해활성(참조: Harada, A. et al., International Immunology (1993) 5, 681-690)의 측정에는 공지의 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항글리피칸 3항체의 항원결합활성을 측정하는 방법으 로서, ELISA(효소결합 면역흡착 검정법), EIA(효소면역 측정법), RIA(방사면역 측정법) 또는 형광항체법을 사용할 수 있다. 예컨대, 효소면역 측정법을 사용하는 경우, 글리피칸 3을 코팅한 플레이트에 항글리피칸 3항체를 포함하는 시료, 예컨대 항글리피칸 3항체 생산세포의 배양상등액 또는 정제항체를 부가한다. 알칼리포스파제 등의 효소로 표지한 2차항체를 첨가하고, 플레이트를 배양하여 세정한 후, p-니트로페닐인산 등의 효소기질을 부가하여 흡광도를 측정함으로써 항원결합활성을 평가할 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체의 활성을 확인하기 위해서는 항글리피칸 3항체의 중화활성을 측정한다.

9. 세포장해활성

본 발명에서 사용하는 항체는 세포장해활성으로서, ADCC 활성 또는 CDC 활성을 갖는다.

ADCC 활성은 효과기 세포와 표적세포 및 항글리피칸 3항체를 혼합하고, ADCC 정도를 조사함으로써 측정할 수 있다. 효과기 세포로서 예컨대, 마우스 비장세포 또는 인간말초혈이나 골수에서 분리한 단핵구 등을 이용할 수 있고, 표적세포로서는 인간 간암세포주 HuH-7 등의 인간주화세포를 사용할 수 있다. 표적세포를 미리 ⁵¹Cr로 표지하고, 여기에 항글리피칸 3항체를 가하여 배양한다. 그 후, 표적세포에 대해 적절한 비율의 효과기 세포를 가하여 배양한다. 배양후 상등액을 채취하고, 상등액 중의 방사활성을 측정함으로써 ADCC 활성을 측정할 수 있다.

또한, CDC 활성은 상술한 표지된 표적세포와 항글리피칸 3항체를 혼합하고, 그 후 보체를 첨가하여 배양하고, 배양후에 상등액 중의 방사활성을 측정함으로써 측정할 수 있다.

항체가 세포장해활성을 발휘하기 위해서는 Fc 부분이 필요하기 때문에, 본 발명의 세포 증식저해제가 항체의 세포장해활성을 이용한 것인 경우는, 본 발명에서 사용하는 항글리피칸 3항체는 Fc 부분을 포함하고 있는 것이 필요하다.

10. 혈관신생억제

본 발명의 항글리피칸 3항체를 혈관신생 억제에 사용할 수도 있다.

11. 투여방법 및 제제

본 발명의 세포증식 억제제는 세포의 이상증식에 기초한 질환, 특히 암에 대한 치료 또는 개선을 목적으로 사용된다.

본 발명의 세포증식 억제제의 대상이 되는 암세포는 특별히 한정되지는 않지만, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 림파종, 췌장암이 바람직하고, 간암이 특히 바람직하다.

유효투여량은 일회에 체중 1kg 당 0.001mg 내지 1000mg의 범위로 선택되거나, 또는 환자 당 0.01 내지 100000mg/body의 투여량을 선택할 수 있다. 그러나, 본 발명의 항글리피칸 3항체를 함유하는 치료제는 이들의 투여량에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 치료제의 투여시간으로서는 환자의 임상증상이 발생하는 전후를 불문하고 투여할 수 있다.

본 발명의 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 함유하는 치료제는 통상의 방법에 따라 제제화할 수 있고(참조: Remington's Pharmaceutical Science, Latest Edition, Mark Publishing Company, Easton, 미국), 의약적으로 허용되는 담체 또는 첨가물을 동시에 포함하는 것이어도 무방하다.

이와 같은 담체 및 의약첨가물의 예로서, 물, 의약적으로 허용되는 유기용제, 콜라겐, 폴리비닐알콜, 폴리비닐피롤리돈, 카르복시비닐폴리머, 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 폴리아크릴산나트륨, 알긴산나트륨, 수용성덱스트린, 카르복시메틸스타티나트륨, 펙틴, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 잔탄검, 아라비아고무, 카제인, 한천, 폴리에틸렌글리콜, 디글리세린, 글리세린, 프로필렌글리콜, 바세린, 파라핀, 스테아릴알콜, 스테아린산, 인간혈청알부민(HSA), 만니톨, 솔비톨, 락토스, 의약첨가물로서 허용되는 계면활성제 등을 예로 들 수 있다.

실제 첨가물은 본 발명의 치료제의 제형에 따라 상기 중에서 단독으로 또는 적절히 조합시켜 선택되지만, 물론 이들에 한정되는 것은 아니다. 예컨대, 주사용 제제로서 사용하는 경우, 정제된 항글리피칸 3항체를 용제, 예컨대 생리식염수, 완충액, 포도당용액 등에 용해하고, 이것에 흡착방지제, 예컨대 Tween 80, Tween 20, 젤라틴, 인간혈청알부민 등을 부가한 것을 사용할 수 있다. 또는 사용전에 용해 재구성하는 제형으로 하기 위해 동결건조한 것이어도 무방하고, 동결건조를 위한 부형제로서는 예컨대, 만니톨, 포도당 등의 당알콜 또는 당류를 사용할 수 있다.

도 1은 항글리피칸 3항체(K6534)의 HuH-7 세포에 대한 ADCC 활성을 나타내는 그래프이다.

도 2는 항글리피탄 3항체(K6511)의 HuH-7 세포에 대한 CDC 활성을 나타내는 그래프이다.

도 3은 HuH-7 세포상에 글리피칸이 발현하고 있는 것을 나타내는 그래프이다.

도 4A는 인간 폐암 세포주에 대하여 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4B는 인간 백혈병 세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4C는 인간 림파종 세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4D는 인간 대장암 세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4E는 인간 유방암 세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4F는 인간 전립선암 세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내 는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

도 4G는 인간 췌장암 및 인간 간암세포주에 대한 GPC3 발현의 FACS 해석 결과는 나타내는 그래프로서, 항글리피칸 3항체(K6534)로 분석한 결과이다.

이하, 실시예에 의해 본 발명을 더욱 구체적으로 설명한다. 단, 본 발명은 이들 실시예 등에 의해 그 기술적 범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 글리피칸 3 합성 펩티드에 대한 모노클로날 항체 작제

인간 글리피칸 단백의 아미노산 서열 355번째에서 371번째의 펩티드(RQYRSAYYPEDLFIDKK)을 합성하고, 키홀·린펫트·헤모시아닌(KLH)에 합성 펩티드를 말레인이미드벤조일옥시삭신이미드(MBS)형 가교제에 의해 연결하고, 면역원으로 만들었다. 마우스(BALB/c, 암컷 6주령)에 100㎍/마리로 3회 면역하고, 혈청중의 항체값을 검정하였다. 항체검정법으로서, 펩티드(0.5㎍)을 고상화한 플레이트에 희석 혈청을 반응시키고, HRP 표지 항마우스항체의 반응을 거쳐, 기질을 첨가한 후에 수득한 발색을 450nm의 흡광도를 측정하는 방법(펩티드 고상 ELISA법)을 사용하였다. 항체값을 확인한 후에, 비장세포를 채취하고, 골수종세포(P3/X63-Ag8)과의 세포융합(참조: 코라, G, 밀스테인 C: Nature, 256:495 (1975))에 의해 하이브리도마를 작제하였다. 5종류의 하이브리도마가 생산하는 모노클로날 항체를 정제한 후, 펩티드 고상 ELISA법을 사용하여 펩티드로의 결합활성을 측정하고, 결 합활성이 높은 IgGI항체(이하, K6534로 칭함) 및 IgG3항체(이하, K6511로 칭함)을 선택하였다.

실시예 2: 항글리피칸 3항체를 사용한 세포증식 억제

ADCC(antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity)활성, CDC(complement-dependnt cytotoxicity)활성의 측정은 [Current Protocols in Immunodogy, Chapter 7. Immunologic Studies in Humans, Editor, John E. Cologan et al., John Wiley & Sons. Inc., 1993]의 방법에 따랐다.

1. 효과기 세포의 작제

CBA/N 마우스(8주령, 오스)에서 비장을 적출하고, RPMI1640배지(GIBCO사제) 중에서 비장세포를 분리하였다. 10%의 소태아혈청(FBS, HyClone사제)를 포함하는 동일 배지에서 세정한 후, 세포농도를 5×10⁶/ml로 조제하고, 효과기 세포로 만들었다.

2. 보체용액의 조제

Baby Rabbit Complement(CEDARLANE사제)를 10% FBS를 함유하는 DMEM배지(GIBCO사제)로 10배 희석하고 보체용액으로 만들었다.

3. 표적세포의 작제

인간 간암세포주 HuH-7(JCRB No. JCRB0403, 휴먼사이언스연구지원뱅크)을 0.2mCi의 ⁵¹Cr-sodium chromate(Amersham Pharmacia Biotech사제)와 함께 10% FBS를 함유하는 DMEM배지 중에서 37℃에서 1시간 배양함으로써 방사성 표지하였다. 방사성 표지 후, 세포를 10% FBS 함유 RPMI1640배지에서 3회 세정하고, 세포농도를 2×10⁵/ml로 조제하고, 표적세포로 만들었다.

4. ADCC활성의 측정

96웰 U저 플레이트(Beckton Dickinson사제)에 표적세포와 항글리피칸 3항체(K6534)을 50㎕씩 가하고, 얼음중탕으로 15분 동안 반응시켰다. 그 후, 효과기 세포 100㎕를 가하고, 탄산가스 배양기 내에서 4시간 배양하였다. 항체의 총농도는 0 또는 10㎍/ml로 하였다. 배양 후, 100㎕의 상등액을 회수하고, 감마 카운터(COBRA Ⅱ AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company사제)로 방사활성을 측정하였다. 세포장해활성(%)은 (A-C)/(B-C)×100에 의해 구하였다. A는 각 시료에서 방사활성(cpm), B는 1% NP-40(반정사제)을 가한 시료에서 방사활성(cpm), C는 표적세포만을 포함하는 시료의 방사활성(cpm)을 나타낸다. 실험은 2회(duplicate)로 수행하였으며, 평균값을 산출하였다.

5. CDC활성의 측정

96웰 평저 플레이트(Becton Dickinson사제)에 표적세포와 항글리피칸 3항체(K6511)을 50㎕씩 가하고, 얼음중탕으로 15분 동안 반응시켰다. 그 후, 보체용액 100㎕을 가하고, 탄산가스 배양기 내에서 4시간 배양하였다. 항체의 총농도는 0 또는 3㎍/ml로 하였다. 배양 후, 100㎕의 상등액을 회수하고, 감마카운터로 방사활성을 측정하였다. 세포장해활성(%)은「4. ADCC 활성의 측정」과 동일하게 하여 구하였다. 실험은 2회(duplicate)로 수행하였으며, 평균값을 산출하였다.

도 1에 ADCC활성을, 도 2에 CDC활성을 나타내었고, 이 결과에서 항글리피칸 3항체는 인간 간암세포주 HuH-7에 대하여 ADCC활성, CDC활성을 나타내는 세포증식을 억제하는 것이 명확하게 밝혀졌다.

실시예 3: HuH-7 세포에서의 글리피칸 발현량의 측정

약 5×10⁵개의 HuH-7세포를 100㎕의 FACS/PBS(1g의 소혈청 알부민(SIGMA사제를 1L의 CellWASH(Beckton Dickinson사제)에 용해하여 조제)에 현탁한 후, 항글리피칸 3항체(K6511) 또는 대조군 항체로서 마우스 IgG2a(Biogenesis사제)을 25㎍/ml가 되도록 가하고, 얼음중탕으로 30분 동안 정치하였다. FACS/PBS에서 세정한 후, 100㎕의 FACS/PBS에 현탁하고, 4㎕의 Goat Anti-Mouse Ig FITC(Becton Dickinson사제)을 가하고, 얼음중탕으로 30분 동안 정치하였다.

FACS/PBS에서 2회 세정한 후, 1ml의 FACS/PBS에서 현탁하고, 프로사이토미터(EPICS XL, BECKMAN COULTER)에서 세포의 형광강도를 측정하였다.

도 3에 프로사이토미터의 결과를 나타내었다. HuH-7 세포상에서 글리피칸 3이 발현하고 있고, 이것은 항글리피칸 3항체가 세포상에서 발현한 글리피칸 3과 결합하여 세포증식을 억제하는 것을 나타내고 있다(참조: 도 3).

실시예 4: FCM을 사용한 암세포 패널에서 GPC 3 발현해석

인간암세포주(Lung, Colon, Rectum, Breast, Prostate, Leukemia, Lymphoma, Myeloma, Pancreas, Liver)에서 글리피칸 3(GPC 3)의 발현을 FCM을 사용하여 해석하였다.

세포는 2일 동안 배양한 후 어세이를 수행하였다. 부착세포는 Trypsin-EDTA(Cat. No. 25300-054, Lot 14210, GIBCO)를 Cell dissociation buffer (Cat. No. 13150-016, Lot 1098554, GIBCO)로 10배로 희석한 용액을 사용하여 회수하였다. 회수한 세포를 항글리피칸 3항체(K6534, 600㎍/ml) 또는 음성대조 mIgG2a 항체(Biogenesis, M-IgG2a-i, Lot EA990719A, 1mg/ml)와 얼음중탕으로 반응시켰다(최종 항체농도 10ug/ml). 세포를 세정한 후, FITC 표지된 항마우스 Ig 항체(Cat. No. 349031, BD PharMingen)와 얼음중탕으로 반응시켰다(2㎕/test). 세포를 세정한 후, 그 형광강도를 프로사이토미터(EPICS XL, BECKMAN COULTER)로 측정하였다. 그 결과, A549, NCI-H460, NCI-H460, NCI-H23, NCI-H226, DMS114, EKVX, HOP-62, NCI-H322M(이상, Lung), P30/OHK, BALL-1, THP-1, P39/TSU(이상, Leukemia), MLMA, Ramos, U-937(이상, Lymphoma), SW480, COL0205, LoVo, SW837(이상, Colon), MDA-MB-231, SK-BR-3, MDA-MB-468(이상, Breast), LNCaP, 22Rv1(이상, Prostate), MIAPaCa-2(Pancreas), HepG2(Liver)에서 GPC3의 발현이 확인되었다. 이상의 결과에서 본 발명의 세포증식 억제제는 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 림파종, 췌장암 등의 치료에 유효하다고 생각되었다.

본 발명에 의해 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 하는 세포증식 억제제가 제공된다. 또한, 본 발명에 의해 항글리피칸 3항체를 유효성분으로 하는 암세포 증식 억제제가 제공된다. 항글리피칸 3항체는 인간 간암세포주 HuH-7 세포상에서 발현된 글리피칸 3과 결합하여 세포증식을 억제하는 것으로부터 세포증식 억제제, 특히 암세포 억제제로서 유효하다.

본 발명에서 사용된 모든 간행물은 그 내용의 전부가 본 명세서에 삽입된 것으로 한다. 또한, 첨부된 청구범위에 기재된 기술사상 및 발명의 범위를 탈피하지 않는 범위내에서, 본 발명의 각종 변형 및 변경이 가능한 것은 당업자에게 용이하게 이해될 수 있다. 본 발명은 이와 같은 변형 및 변경을 포함하는 것을 의도하고 있다.

Claims

항글리피칸 3항체를 유효성분으로 포함하는 항암제.
제 1항에 있어서,

항글리피칸 3항체가 세포장해 활성을 갖는

항암제.
제 2항에 있어서,

세포장해 활성이 항체 의존성 세포장해(ADCC) 활성 또는 보체 의존성 세포장해(CDC) 활성인

항암제.
삭제
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

암은 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 림파종 및 췌장암으로 이루어진 군으로부터 선택된

항암제.
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

암은 간암인

항암제.
삭제
제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

항체가 모노클로날 항체인

항암제.
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제 1항 내지 제 3항 중 어느 한 항에 있어서,

항체가 인간형 또는 키메라화된 것인

항암제.
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