JP5554993B2 - Anexelektoに結合するモノクローナル抗体、およびその利用 - Google Patents
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Description
(2) 細胞増殖抑制活性を有することを特徴とする(1)に記載の抗体。
(3) 癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする(1)に記載の抗体。
(4) FND1に結合する(1)から(3)いずれかに記載の抗体。
(5) FND1全部または少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体。
(6) AXLに対してアゴニスト活性を有することを特徴とする(1)から(5)いずれかに記載の抗体。
(7) AXLに対してアンタゴニスト活性を有することを特徴とする(1)から(5)いずれかに記載の抗体。
(8) AXLを発現する細胞にAXLリガンドと共に接触させると、AXL内にリン酸化チロシンが検出されない抗体を選抜することによって得られる、(7)に記載の抗体。
(9) AXLの発現量を低下させる活性を有することを特徴とする(1)から(8)いずれかに記載の抗体。
(10) 血管新生阻害活性を有することを特徴とする(1)から(9)いずれかに記載の抗体。
(11) 以下の(a)〜(j)いずれかに記載の抗体;
(a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax285)、
(b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax292)、
(c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax223)、
(d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax96)、
(e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax258)、
(f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)、
(g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax7)、
(h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax51)、
(i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)、
(j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax232)。
(12) (11)に記載のいずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
(13) (11)に記載のいずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体。
(14) 重鎖CDR1,2,3の配列が配列番号4,5,6である抗体。
(15) (14)の抗体の重鎖CDRアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる重鎖CDRを有する抗体であって、(14)に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
(16) 軽鎖CDR1,2,3の配列が配列番号8,9,10である抗体。
(17) (16)の抗体の軽鎖CDRアミノ酸配列において、1もしくは複数のアミノ酸配列が置換、欠失、挿入、および/または付加したアミノ酸配列からなる軽鎖CDRを有する抗体であって、(16)に記載の抗体と機能的に同等な抗体。
(18) キメラ抗体である(13)〜(17)いずれかに記載の抗体。
(19) ヒト化抗体である(13)〜(17)いずれかに記載の抗体。
(20) 以下の(a)〜(j)いずれかに記載のハイブリドーマ;
(a)受託番号FERM BP-10858として寄託されたハイブリドーマ (Ax285)、
(b)受託番号FERM BP-10859として寄託されたハイブリドーマ (Ax292)、
(c)受託番号FERM BP-10853として寄託されたハイブリドーマ (Ax223)、
(d)受託番号FERM BP-10852として寄託されたハイブリドーマ (Ax96)、
(e)受託番号FERM BP-10856として寄託されたハイブリドーマ (Ax258)、
(f)受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマ (Ax284)、
(g)受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマ (Ax7)、
(h)受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマ (Ax51)、
(i)受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ (Ax225)、
(j)受託番号FERM BP-10855として寄託されたハイブリドーマ (Ax232)。
(21) 抗AXL抗体を有効成分とする血管新生阻害剤。
(22) 抗体が(1)〜(19)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする(21)記載の血管新生阻害剤。
(23) 抗AXL抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
(24) 細胞が癌細胞である(23)に記載の抑制剤。
(25) 抗体が(1)〜(19)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする(23)に記載の抑制剤。
(26) 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である(23)に記載の抑制剤。
(27) IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする(23)に記載の抑制剤。
(28) 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性誘導剤。
(29) 抗AXL抗体がIgDに結合する抗体である(28)に記載の誘導剤。
(30) 抗体が(6)に記載の抗体であることを特徴とする(28)に記載の誘導剤。
(31) 抗AXL抗体を有効成分とするAXLのリン酸化活性阻害剤。
(32) 抗AXL抗体がIgD2に結合する抗体である(31)に記載の阻害剤。
(33) 抗体が(7)又は(8)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする(31)に記載の阻害剤。
(34) 抗AXL抗体を有効成分とするAXL発現量低下剤。
(35) 抗AXL抗体がFND1に結合する抗体である(34)に記載の発現量低下剤。
(36) 抗体が(9)に記載の抗体であることを特徴とする(34)に記載の発現量低下剤。
(37) 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を誘導する方法。
(38) 抗AXL抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法。
(39) 抗AXL抗体を用いてAXLのリン酸化を阻害する方法。
(40) 抗AXL抗体を有効成分とする抗癌剤。
(41) 抗体が(1)〜(19)いずれかに記載の抗体であることを特徴とする(40)に記載の抗癌剤。
(42) IgD2に結合しリン酸化活性阻害作用を有する抗体を有効成分とする(40)に記載の抗癌剤。
(43) 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である(40)の抗癌剤。
(44) 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である(42)の抗癌剤。
(45) 癌が膵臓腺癌または乳癌である(43)の抗癌剤。
(46) AXLのリン酸化阻害作用を有することを特徴とする(1)に記載の抗体。
(47) 抗AXL抗体を用いて血管新生を阻害する方法。
(48) 血管新生阻害剤を製造するための抗AXL抗体の使用方法。
(49) 抗AXL抗体を用いて細胞の増殖を抑制する方法。
(50) 抗AXL抗体を用いて癌の治療及び/又は予防をする方法。
(51) 細胞増殖抑制剤を製造する為の抗AXL抗体の使用方法。
(52) 抗癌剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
(53) リン酸化誘導剤を製造する為の抗AXL抗体の使用方法。
(54) リン酸化阻害剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
(55) AXL発現量低下剤の製造の為の抗AXL抗体の使用方法。
(56) 次の工程を含む抗AXL特異抗体の製造方法;
(a)FND1全部または少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを非ヒト動物に免疫する工程、および
(b)(a)の非ヒト動物から抗体を回収するか、または抗体産生細胞を回収して該抗体産生細胞が産生する抗体を回収する工程。
本発明によって、新規な抗AXL抗体が提供される。さらに、本発明によって抗AXL抗体の新規な用途が提供される。
後述の実施例で明らかなように、特にFND1に結合する抗体は他の抗体に比べて、in vivoにおいて顕著に高い抗腫瘍活性を有することが明らかになった。
抗AXL抗体とFND1の結合活性は、当業者に公知の方法で評価することができ、例えば、以下の方法により行うことが可能である。FND1を電気泳動し抗AXL抗体とウェスタンブロットすることにより、抗AXL抗体とFND1の結合活性を確認する。
(a) 受託番号FERM BP-10858として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax285)
(b) 受託番号FERM BP-10852として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax96)
(c) 受託番号FERM BP-10856として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax258)
(d) 受託番号FERM BP-10859として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax292)
(e) 受託番号FERM BP-10853として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax223)
(f) (a)から(e)いずれかの抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(g) (a)から(e)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体
(a) 受託番号FERM BP-10850として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax7)
(b) 受託番号FERM BP-10851として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax51)
(c) (a)から(b)の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(d) (a)から(c)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体
アンタゴニスト活性を有する抗体は血管新生阻害や細胞増殖抑制などに有用である。
(a) 受託番号FERM BP-10858として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax285)
(b) 受託番号FERM BP-10852として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax96)
(c) 受託番号FERM BP-10856として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax258)
(d) 受託番号FERM BP-10850として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax 7)
(e) 受託番号FERM BP-10859として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体(Ax292)
(f) 受託番号FERM BP-10853として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax 223)
(g) 受託番号FERM BP-10854として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)
(h) 受託番号FERM BP-10857として寄託されているハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)
(i) (a)から(h)の抗体が認識するエピトープと同じエピトープを認識する抗体
(j) (a)から(i)いずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体
AXLの発現量を低下させる活性を有する抗体は血管新生阻害や細胞増殖抑制などに有用である。
血管新生阻害作用を有する抗体の具体的な例としては、例えば上述の抗体を挙げることができる。
抗AXL抗体により増殖が抑制される細胞は特に限定されないが、好ましくは疾患に関連した細胞であり、特に好ましくは癌細胞である。細胞が癌細胞の場合、癌種は特に限定されず、例えば、膵臓癌(膵臓腺癌など)、胃癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌など)、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、食道癌などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌、乳癌を挙げることができる。
試験管内において該細胞増殖抑制活性を評価又は測定する方法としては、培地中に添加した[3H]ラベルしたチミジンの生細胞による取り込みをDNA複製能力の指標として測定する方法が用いられる。より簡便な方法としてトリパンブルー等の色素を細胞外に排除する能力を顕微鏡下で計測する色素排除法や、MTT法が用いられる。後者は、生細胞がテトラゾリウム塩であるMTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide)を青色のホルマザン産物へ転換する能力を有することを利用している。より具体的には、被検細胞の培養液にリガンドと共に被検抗体を添加して一定時間を経過した後に、MTT溶液を培養液に加えて一定時間静置することによりMTTを細胞に取り込ませる。その結果、黄色の化合物であるMTTが細胞内のミトコンドリア内のコハク酸脱水素酵素により青色の化合物に変換される。この青色生成物を溶解し呈色させた後にその吸光度を測定することにより生細胞数の指標とするものである。MTT以外に、MTS、XTT、WST-1、WST-8等の試薬も市販されており(nacalai tesqueなど)好適に使用することができる。活性の測定に際しては、対照抗体を用いることも可能である。
細胞増殖抑制作用を有する抗AXL抗体の例として、上述の抗体を挙げることができる。
抽出されたmRNAは、mRNA Purification Kit (GEヘルスケアバイオサイエンス製)等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep mRNA Purification Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス製)などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体V領域をコードするcDNAを合成することができる。cDNAは、AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit(生化学工業社製)等によって合成することができる。また、cDNAの合成および増幅のために、5'-Ampli FINDER RACE Kit(Clontech製)およびPCRを用いた5'-RACE法(Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1988)85, 8998-9002、Belyavsky, A.et al., Nucleic Acids Res.(1989)17, 2919-2932)を利用することができる。更にこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
パパイン消化:F(ab)2またはFab;
ペプシン消化:F(ab’)2またはFab’;
プラスミン消化:Facb。
また2つのVH及び2つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL([VH]リンカー[VL]リンカー[VH]リンカー[VL])の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。
抗体の抗原結合活性の測定には公知の手段を使用することができる(Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988)。例えば、ELISA(酵素結合免疫吸着検定法)、EIA(酵素免疫測定法)、RIA(放射免疫測定法)あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。更に、細胞に発現する抗原に対する抗体の結合活性を測定する手法としては、例えば、前記Antibodies A Laboratory Manual中の359 - 420ページに記載されている方法が挙げられる。
本発明はさらに、受託番号FERM BP-10858(AX285)、FERM BP-10859(AX292)FERM BP-10853(AX223)、FERM BP-10852(AX96)、FERM BP-10856(AX258)、FERM BP-10857(AX284)、FERM BP-10850(Ax7)、FERM BP-10851(Ax51)、FERM BP-10854(Ax225)、FERM BP-10855(Ax232)として寄託されているハイブリドーマを提供する。該ハイブリドーマはアゴニスト活性を有する抗AXL抗体、アンタゴニスト活性を有する抗AXL抗体、AXLの発現量を低下させる活性を有する抗AXL抗体、血管新生阻害活性を有する抗AXL抗体および/または細胞増殖抑制活性を有する抗AXL抗体を産生する。
本発明はさらに抗AXL抗体を含む血管新生阻害剤を提供する。血管新生が阻害されるメカニズムは特に限定されず、例えば、血管内皮細胞の遊走活性の阻害作用、血管内皮細胞のアポトーシス誘導作用、血管内皮細胞の血管形態形成の阻害作用などを挙げることができる。本発明の血管新生阻害剤は腫瘍組織において血管新生を阻害するものであることが好ましい。腫瘍組織は特に限定されないが、例えば、膵臓癌組織(膵臓腺癌組織など)、胃癌組織、肺癌組織(小細胞肺癌、非小細胞肺癌組織など)、骨肉腫組織、大腸癌組織、前立腺癌組織、メラノーマ組織、子宮内膜癌組織、卵巣癌組織、子宮平滑筋腫組織、甲状腺癌組織、幹細胞癌組織、乳癌組織、膀胱癌組織、腎臓癌組織、グリオーマ組織、神経芽腫組織、食道癌組織などを挙げることができる。さらに好ましくは、グリオーマ組織、胃癌組織、子宮内膜癌組織、非小細胞肺癌組織、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。特に好ましくは、膵臓腺癌組織、乳癌組織を挙げることができる。
本発明はさらに抗AXL抗体を含む細胞増殖抑制剤を提供する。細胞の増殖が抑制されるメカニズムは特に限定されず、例えば、血管新生阻害作用によるもの、抗体の細胞障害活性によるもの、抗体に結合した細胞障害性物質によるものなどを挙げることができるが、好ましくは血管新生阻害作用によるものである。
本発明はさらに抗AXL抗体を含むリン酸化誘導剤を提供する。本発明のリン酸化誘導剤は通常、AXLを発現している細胞内でのリン酸化を誘導する。リン酸化が誘導される対象は特に限定されないが、通常、チロシンを有するポリペプチドであり、好ましくはAXLである。
本発明はさらに抗AXL抗体を含むリン酸化阻害剤を提供する。本発明のリン酸化阻害剤は通常、AXLリガンド(例えばGas6など)がAXLに結合することにより誘導されるリン酸化を阻害する。リン酸化が阻害される対象は特に限定されないが、通常、チロシンを有するポリペプチドであり、好ましくはAXLである。
本発明はさらに抗AXL抗体を含むAXL発現量低下剤を提供する。AXL発現量低下剤は、AXLを発現する細胞内のAXL発現量を減少させるものである。AXLを発現する細胞は特に限定されないが、例えば癌細胞(Calu-1、MDA-MB-231、DU-145など)などを挙げることができる。
本発明の血管新生阻害剤、細胞増殖抑制剤、リン酸化誘導剤、リン酸化阻害剤またはAXL発現量低下剤の投与方法は、経口、非経口投与のいずれかによって実施できる。特に好ましくは非経口投与による投与方法であり、係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身または局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1 kgあたり0.0001 mgから1000 mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000 mg/bodyの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1−1 抗原の調製
ハムスター卵巣細胞(CHO(dhfr-) cells)にヒトAXL細胞外領域とマウスIgG2aのFc領域を融合したFusion protein(hAXL-ECD-mIgG2aFc)発現ベクターを遺伝子導入し、G418 selection法により、hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質産生CHO細胞株をクローニングした。無血清培地(CHO-S-SFM II, GIBCO)を用いて回収したhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白産生CHO細胞株の培養上清を、結合緩衝液(20 mM リン酸緩衝液, pH 7.0)で平衡化したProtein Gカラム(HiTrap Protein G HP, GE Healthcare)に添加した。結合緩衝液で非結合蛋白を洗浄した後、溶出緩衝液(100 mM Glycine-HCl, pH 2.7)を用いて、中和緩衝液(1 M Tris-HCl, pH 9.0)を分注したチューブにhAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質の画分を回収し、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット(Centricon(登録商標), Millipore)を用いて、精製蛋白質の緩衝液をリン酸緩衝生理食塩水(pH7.35-7.65, タカラバイオ)に緩衝液置換し、精製蛋白質を濃縮した。C.N. Pace et al., Prof. Sci. 4:2411-2423, (1995)の計算式に従い算出したモル吸光係数を用いて、280 nmの吸光度から精製蛋白質の濃度を算出した。
BALB/cマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)4匹およびMRL/lprマウス(雄、免疫開始時6週齢、日本チャールス・リバー)2匹に、前項で作製した抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質)を以下の通り免疫した。初回免疫としてFCA(フロイント完全アジュバントH37 Ra(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。2週間後にFIA(フロイント不完全アジュバント(Difco laboratories))でエマルジョン化した抗原を40μg/head皮下投与した。以後1週間間隔で追加免疫を3回行った。抗原に対する血清抗体価の上昇を、次項に示したELISA(Enzyme linked immunosorbent assay)で確認後、最終免疫としてリン酸緩衝生理食塩水(カルシウムイオン、マグネシウムイオンを含まないphosphate buffered saline(PBS(-))、日水製薬)に希釈した抗原を10μg/head静脈内投与した。最終免疫の3日後、マウスの脾臓細胞とマウスミエローマ細胞P3X63Ag8U.1(P3U1と称す、ATCC CRL-1597)を、PEG1500(Roche Diagnostics)を用いた常法に従い細胞融合した。10%FBS(Invitrogen)を含むRPMI1640培地(Invitrogen)(以下、10%FBS/RPMI1640と称す)にて融合細胞を培養した。融合の翌日に、融合細胞を半流動培地(StemCells)に懸濁し、ハイブリドーマの選択培養を行うと共に、ハイブリドーマのコロニー化を実施した。融合後9日目または10日目にハイブリドーマのコロニーをピックアップし、HAT選択培地(10%FBS/RPMI1640, 2 vol% HAT 50x concentrate(大日本製薬), 5 vol% BM-Condimed H1(Roche Diagnostics))の入った96-ウェルプレートに、1ウェル当り1コロニーを播種した。3〜4日培養後、各ウェルの培養上清を回収し、次項に示したELISAにより、上記抗原、及びマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白に対する結合活性を測定することにより、ヒトAXL細胞外領域に結合活性を有するハイブリドーマを選択した。
選択したハイブリドーマ上清の結合活性を表1に示す。
名称:独立行政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センター
あて名:日本国茨城県つくば市東1丁目1番1 中央第6(郵便番号305-8566)
(b)受託日(寄託日):2007年7月5日
(c)受託番号:
AXL No.7 #070402 (Ax7)(受託番号 FERM BP-10850)
AXL No.51 #070406 (Ax51)(受託番号 FERM BP-10851)
AXL No.232 #070406 (Ax232)(受託番号 FERM BP-10855)
AXL No.96 #070402 (Ax96)(受託番号 FERM BP-10852)
AXL No.223 #070402 (Ax223)(受託番号 FERM BP-10853)
AXL No.225 #070402 (Ax225)(受託番号 FERM BP-10854)
AXL No.258 #070402 (Ax258)(受託番号 FERM BP-10856)
AXL No.284 #070402 (Ax284)(受託番号 FERM BP-10857)
AXL No.285 #070402 (Ax285)(受託番号 FERM BP-10858)
AXL No.292 #070411 (Ax292)(受託番号 FERM BP-10859)
Coating Buffer(100 mM sodium bicarbonate, pH9.6, 0.02% sodium azide)で1μg/mLに希釈した抗原(hAXL-ECD-mIgG2aFc蛋白質)、またはマウスIgG2aのFc領域を融合した対照蛋白を、96-ウェルプレート(Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))に、80μL/wellで分注後、4℃で一晩以上インキュベーションした。0.05 vol%のTween(登録商標)20を含むリン酸緩衝生理食塩水(tPBS(-))で3回洗浄後、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)の1/5希釈液)にて、該プレートを、4℃で一晩以上ブロッキングした。緩衝液を除去後、該プレートに、Diluent Bufferで希釈したマウスの抗血清またはハイブリドーマの培養上清を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて3回洗浄後、Diluent Bufferで1/5000に希釈したHRP標識抗マウスIgG抗体(Stressgen)を80μL/well添加し、室温で1時間インキュベーションした。該プレートをtPBS(-)にて5回洗浄後、発色基質Peroxidase Substrate(Kirkegaad & Perry Laboratories)を80μL/well添加し、室温で20分インキュベーションした。Peroxidase Stop Solution(Kirkegaad & Perry Laboratories)を80μL/well添加した後、405 nmにおける吸光度をMicroplate Reader Model 3550(Bio-Rad Laboratories)で測定した。
上記で得られたハイブリドーマを、FBSとしてlow IgG FBS(Invitrogen)を用いた HAT選択培地で培養した。該培養上清20 - 50 mLに、溶媒をWash Buffer (20 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH5.0) に置換したProtein Gビーズ(Pharmacia)を、該培養上清10 mL当り50μL加え、4℃で一晩転倒混和した。Protein Gビーズを回収した後、Wash Bufferで洗浄後、溶出 Buffer (50 mM酢酸ナトリウム緩衝液、pH3.3)にて抗体を溶出し、直ちに中和Buffer (トリス塩酸緩衝液、pH7.8)で中和した。精製抗体は、分画分子量10 kDaの限外ろ過キット(Amicon(登録商標), Millipore)を用いて、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.35-7.65, 日水製薬)への緩衝液置換及び濃縮を行い、0.22μmの滅菌フィルター(MilliporeGV Millipore)にて滅菌した。
実施例1で得られた抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLのリン酸化を誘導する能力を試験した。細胞(ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1、ヒト乳癌細胞株MDA-MB-231、ヒト前立腺癌細胞株DU-145)を6-ウェルプレートに4 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し(serum starved)、さらに一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6(R&D)を添加し、37℃で30分間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、30分間氷上で細胞溶解バッファー(137 mM NaCl /20 mM Tris-HCl, pH8.0, 10% glycerol, 2 mM EDTA, 1 mMバナジン酸ナトリウム,1 vol% NP-40, 1 mMフッ化フェニルメチルスルフォニル(PMSF), 10μg/mLアプロチニン, 10μg/mL ロイペプチン,10μg/mL ペプスタチン)で溶解した。細胞・溶液混合物を超音波破砕機(トミー精工)で破砕後、4℃で10分間遠心した(20,000 × g)。細胞・溶液混合物の上清を0.05容量のプロテインG-アガロース(Roche Diagnostics)と30分間混合した。4℃で1分遠心後(2,300 × g)、上清に1.2μgの抗AXLモノクローナル抗体(R&G)を添加し、4℃で1時間振盪し、ついで10μLのプロテインG-アガロースを添加し、該溶液をさらに4℃で1時間振盪した。4℃で1分遠心後(2,300 × g)、免疫沈澱物を洗浄し、NuPAGE-LDSサンプルバッファー(Invitrogen)に懸濁し、70℃で10分加熱した。免疫沈降物を7% NuPAGE(Invitrogen)を用いて150 Vで1時間電気泳動した。
抗AXLモノクローナル抗体による、癌細胞内のリガンド依存的リン酸化阻害能力を試験した。細胞(ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1またはヒト乳癌細胞株MDA-MB-231またはヒト前立腺癌細胞株DU-145)を6-ウェルプレートに4 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し(serum starved)、一晩培養した。2μg/mLとなるように、実施例1で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、同時に200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6(R&D)を添加し、37℃で30分間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体(SantaCruzTM)で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE(Invitrogen)を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。この免疫沈降した細胞内AXLは、リガンドであるGAS6処理により抗リン酸化チロシン抗体でブロットされたが、Ax7、Ax51の抗AXLモノクローナル抗体により抗リン酸化チロシン抗体のブロットが減弱した(図2a、b)。従って、リガンド依存的なAXLのチロシンリン酸化は、本発明者の取得した抗AXLモノクローナル抗体をさらしたことで阻害されることが確認された。これら抗AXLモノクローナル抗体はAXLのキナーゼドメインのリガンド依存的なリン酸化を阻害することができる。
抗AXLモノクローナル抗体の癌細胞内AXLの分解を誘導する能力を試験した。細胞(ヒト非小細胞肺癌細胞株Calu-1またはヒト乳癌細胞株MDA-MB-231またはヒト前立腺癌細胞株DU-145)を6-ウェルプレートに4 × 105 cells/wellの密度で播種し、24時間後に血清を除いた培地に交換し(serum starved)、一晩培養した。ついで、2μg/mLとなるように、上記で作製した抗AXLモノクローナル抗体を添加し、一方では陽性コントロールとして200 ng/mLとなるようにリコンビナントGAS6(R&D)を添加し、37℃で24時間インキュベーションした。ついで細胞をPBS(-)で洗浄し、上記細胞溶解バッファーで細胞からタンパク質を抽出した。市販の抗AXL抗体(SantaCruzTM)で免疫沈降した細胞溶解産物を7% NuPAGE(Invitrogen)を介して分離し、上記のウエスタンブロッティングおよびチロシンリン酸化アッセイで免疫ブロットした。
クラボウが販売している血管新生キットを用いて抗AXL抗体のヒト臍帯血管内皮細胞(HUVEC)の管腔形成阻害活性を測定した。実験手順は、キット添付のプロトコールに従った。以下に概略を示す。HUVECおよび線維芽細胞を共培養し、管腔形成初期段階の増殖状態とした細胞を含む24-ウェルプレート(キット添付)を37℃、5%-CO2、加湿空気のインキュベーターに3時間入れた。25 mL入り専用培地(キット添付)3本のキャップを緩めて、37℃、5%-CO2、加湿空気のインキュベーターに約30分入れた。プレートをインキュベーターから出し、ウェルキャップシートを剥がした。プレートの蓋を新しいもの(キット添付)に交換した。細胞を顕微鏡で観察し異常がないか確認した。37℃に温めた培地(>12 mL/plate)をファルコンチューブに分注し、VEGF-A (2 μg/mL)を200倍希釈で最終濃度10 ng/mLになるよう培地に添加した。チューブに分注した培地に最終濃度10μg/mLとなるように上記で作製した抗AXL抗体を添加した。ネガティブコントロールには、抗体の代わりにPBS(-)を加えた。24-ウェルプレートのウェルの培地を静かに吸引除去し、薬物の入った培地を500μL静かに添加した。細胞の様子を顕微鏡で観察し、インキュベーターに戻した。抗体を添加した日を1日目として、4, 7, 9日目の培地交換も同様の手順で行った。
マウスAXLの細胞外領域(R&D社、以下mAXL-ECD)をCoating Buffer(100 mM Sodium bicarbonate buffer, pH9.6)で2μg/mLに希釈後、96-ウェルプレート(Nunc-ImmunoTM 96 MicroWellTM plates MaxiSorpTM(Nalge Nunc International))に100μLずつ分注した。冷蔵庫で一晩放置した後、プレート内の抗体溶液を除去し、Diluent Buffer (BlockingOne, ナカライテスク)を200μL/wellずつ分注し、室温で2時間ブロッキングした。Diluent Bufferを除去した後に、Diluent Bufferで3μg/mLに希釈した上記で作製した抗AXL抗体を100μL/wellずつ分注し、室温で1.5時間放置した。抗体溶液を除去した後に、tPBS(-)で3回洗浄した。アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG1抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG2a抗体、アルカリホスファターゼ標識ヤギ抗マウスIgG2b抗体(Southern Biotech)を各抗体の最終希釈が1/2250:1/4000:1/4000となるように調製した標識抗体カクテルを100μL/wellずつ分注し、室温で1時間放置した。抗体溶液を除去した後に、tPBS(-)で3回洗浄した。アルカリホスファターゼ用発色基質溶液(BluePhos Microwell Phosphatase Substrate System, Kirkegaad & Perry Laboratories)を100μL/wellずつ分注し、室温で発色させた。マイクロプレートリーダー(Emax、Molecular Devices社製)にて650 nmの吸光度を測定した。
Ax96、Ax119、Ax223、Ax225、Ax284でマウスAXLへの結合が確認された。
ATCCより購入したHCT-116 (CCL-247)、Calu-1(HTB-54)、DU 145 (HTB-81)、T-47D(HTB-133)および大日本住友製薬より購入したAsPC-1、MDA-MB-231、PANC-1を用いて評価を行った。細胞の維持は、各細胞の供給元の推奨条件にて行った。上記で作製した抗AXL抗体を10%FBS/RPMI1640にて希釈系列を作成し、その20μLを96-ウェルプレート(平底)に分注した。HCT-116、Calu-1、DU 145、T-47D、AsPC-1、MDA-MB-231、PANC-1の各細胞懸濁液を1ウェルあたり2000、3000、2000、5000、3000、5000、3000個となるよう調製し、各ウェルに細胞懸濁液の180μLを加え、37℃、5% CO2 インキュベーターにて培養した。4日後、WST-8(Cell Counting Kit-8、株式会社同仁化学研究所社製)を各ウェルに10μL加え、キット添付のプロトコールに準じて、マイクロプレートリーダー(Model 3550-UV、BIO-RAD社製)にて450 nmの吸光度を測定した。被験物質を含まない場合の測定値を0%阻害、被験物質および細胞を含まない場合の測定値を100%阻害として、抗AXL抗体の細胞阻害活性(%)を算出した。
Ax51がHCT116細胞に対して30%以上のCGI活性を示した。
1.ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(1×107個/マウス)を移植した。腫瘍体積の平均値がおよそ210 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
表1の抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール(日本イーライリリー株式会社)は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。
ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より4日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した(図5)。
腫瘍増殖抑制効果(%)=(1−抗体処理群の腫瘍増殖量/対照群の腫瘍増殖量)×100
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(*;p<0.05)をもって有意とした。
いずれの抗体も腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた(図5)。
1.ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルの作製
大日本製薬株式会社(現 大日本住友製薬株式会社)より入手したヒト膵臓腺癌細胞株PANC-1は、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(1×107個/マウス)を移植した。腫瘍体積の平均値がおよそ270 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
抗AXL抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、20 mg/kgにてヒト膵臓腺癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。陽性対照として、ジェムザール(日本イーライリリー株式会社)は生理食塩水で12 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、120 mg/kgにて腹腔内投与した。
ヒト膵臓腺癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より4日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍増殖抑制効果(%)=(1−抗体処理群の腫瘍増殖量/対照群の腫瘍増殖量)×100
腫瘍増殖抑制効果を図6に示した。腫瘍増殖抑制効果(%)が30%より低い場合を"−"、30%以上を"+"、60%以上を"++"とした。図6には、〔実施例3〕 抗体によるリガンド依存的リン酸化阻害アッセイの結果も併せて表示した。
FND-1に結合する抗体は、腫瘍体積の平均値がおよそ270mm3となった時点で投与を開始しても、60%以上のTGI活性を示した。FND-1に結合する抗AXL抗体が、in vivoでこのような顕著な抗腫瘍効果を有することは、本願で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。
また、IgD2に結合する抗AXL抗体で、実施例3、実施例8および実施例9のようなリン酸化阻害効果を有し、かつin vivoで抗腫瘍効果を示すものが存在することは、本願で新たに発見されたものであり、全く予想外であった。
1. ヒトAXL-FND1、ヒトAXL-IgD2への結合活性
抗AXLモノクローナル抗体のAXL-Fibronectin type 3 domain 1(AXL-FND1)、AXL Immunoglobulin family domain 2 (AXL-IgD2)への結合能力を試験した。
ヒト組み換えAXL-FND1は全長ヒトAXL cDNA(O'Bryanら,Mol. Cell. Biol. 1991; 11: 5016-5031)(GenBank#NM_021913)から、225番から331番目のアミノ酸に相当する領域をPCRにて増幅し、GST-tagとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)(Novagen)にクローニングし、pET-AXL-FND1を構した。その他のドメインについては、137番から224番目のアミノ酸に相当する領域AXL-IgD2をPCRにて増幅し、GSTタグとの融合タンパク質を発現するため、pET-41a(+)にクローニングした。
作製した各ベクター(5μL)をDH5α(東洋紡,Cat# DNA-903)にヒートショック法により形質転換し、SOC培地で培養後、カナマイシンを含むLBプレート上37度で終夜培養後、コロニーを選抜した。
作製した各コロニーを、カナマイシンを含む20 mLのLB培地に終夜37度で前培養し、500 mLの培地に移し、A600=0.5±0.05まで培養しIPTGを0.5 mMとなるように添加した。37度で1時間培養後集菌し、Buffer A(50 mM Tris-HCl, pH8.0, 1 mM EDTA, 0.5 mM PMSF, 1 mM DTT)にて懸濁後、液体窒素を用いて凍結融解を2回繰り返した。NP-40を0.5%となるように加え、超音波破砕機で破砕(30秒x5)後、204,000xG、30分遠心し、上清を回収した。
得られた上清を用いて、以下のようにヒト組み換えAXL-FND1を精製した。可溶化した大腸菌上清とグルタチオンセファロースTM 4 Fast Flow(GEヘルスケア)を混合し、ローテーターで4度1時間攪拌した。500xG、5分遠心分離し、上清を捨てBuffer Aを加えてグルタチオンセファロースTM 4Bを洗浄した。この洗浄操作を3回繰り返した。洗浄したグルタチオンセファロースTM 4 Fast Flowからミニカラムに移し、ヒト組み換えAXL-FND1は、50 mM Tris-HCl, pH7.5, 25 mM グルタチオンでグルタチオンセファロースTM 4 Fast Flowから分離・溶出した。その他のAXLの各ドメインも同様の方法で発現・分離・溶出した。
グルタチオンセファロースTM4 Fast Flowから分離・溶出したヒト組み換えAXL-FND1をはじめ、AXL-IgD1、AXL-IgD2、AXL-FND2、AXL-IgD1+IgD2、AXL-IgD2+FND1、AXL-FND1+FND2はBIO-RAD Dc Protein Assayでタンパク定量し、1μgをNuPAGE(登録商標) Sample buffer(Invitrogen)と混合し、NuPAGE(登録商標) 10% Bis-Tris Gelで電気泳動を行った。電気泳動したGelはImmobilonTM-FL(Millipore)PVDF膜に転写した。転写したタンパク質を含むPVDF膜は、Odyssey(登録商標) Blocking Buffer(LI-COR)でブロッキング後、抗AXL抗体を5μg/mLとなるように希釈した一次抗体溶液に浸し、終夜4度でインキュベートした。一次抗体溶液に浸した転写したタンパク質を含むPVDF膜は、0.1% TBS-T [0.1% Tween-20を含むTBS(Tris-buffered Saline, TaKaRa)]で5分4回洗浄した。抗AXL抗体に浸したPVDF膜は、80 ng/mLに希釈したAlexa Fluor(登録商標) 680 goat anti-mouse IgG(H+L)(Invitrogen)二次抗体溶液に浸し、室温で1時間インキュベートした。二次抗体溶液に浸したPVDF膜は0.1% TBS-Tで5分3回洗浄後、0.01% SDSを含むTBS-Tで5分洗浄後、TBSで5分洗浄した。洗浄したPVDF膜は遠赤外線イメージングシステムOdyssey(登録商標)でスキャンして結合性を評価した。
評価結果を図6に記載した。
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax225)は、AXLのFND1を認識することが明らかとなった(図6)。受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax284)は、AXLのFND1およびIgD2を認識すると考えられた(図6)。受託番号FERM BP-10850として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax7)、および受託番号FERM BP-10851として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗AXL抗体 (Ax51) は、AXLのIgD2を認識することが明らかとなった(図6)。
1.ヒト乳癌移植マウスモデルの作製
ATCCより入手したヒト乳癌細胞株MDA-MB-435Sは、HBSSにて5×107個/mLになるように調製した。日本チャールズ・リバー株式会社より購入したCAnN.Cg-Foxn1<nu>/CrlCrlj nu/nu(BALB-nu/nu)マウスのそけい部皮下へ、上記細胞懸濁液200μL(1×107個/マウス)を移植した。腫瘍体積がおよそ200 mm3になった時点でマウスを当該実験に供した。
抗AXL抗体はPBSで2 mg/mLになるように調製し、週2回、2週間、20 mg/kgにてヒト乳癌移植マウスの腹腔内へ投与した。陰性対照として、PBSを同様に投与した。
ヒト乳癌移植マウスモデルにおける抗腫瘍効果は、最終投与より4日後における陰性対照群の腫瘍増殖量との比較により腫瘍増殖抑制効果として算出した。
腫瘍増殖抑制効果(%)=(1−抗体処理群の腫瘍増殖量/対照群の腫瘍増殖量)×100
腫瘍体積は、平均値±標準偏差で表した。統計解析は、SAS前臨床パッケージVersion5.0を用いてLSD法による対照群と処置群の比較を実施した。また、95%の信頼度(*;p<0.05)をもって有意とした。
使用した抗AXL抗体は、腫瘍の増殖を抑制し、抗腫瘍効果を有していた(図7)。よって、FND1に結合する抗AXL抗体は種々の腫瘍に対して抗腫瘍効果が期待できる。
1.キメラ抗体発現ベクターの作製
受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ細胞(Ax225)から、RNeasy Mini Kits(QIAGEN)を用いてトータルRNAを抽出し、SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)によりcDNAを合成した。SMART RACE cDNA Amplification Kit(BD Biosciences)に添付の10X Universal Primer A Mixと抗体のそれぞれの定常領域に設定した、以下のプライマー(H鎖:MHCg1、L鎖MLCk)を用い、PrimeSTAR HS DNA polymerase(TaKaRa)によってPCRを行い、抗体の可変領域遺伝子を単離した。
MHCg1:5’-GGGCCAGTGGATAGACAGATG-3’ (配列番号:1)
MLCk:5’-GCTCACTGGATGGTGGGAAGATG-3’ (配列番号:2)
単離した各DNA断片の塩基配列は、BigDye Terminator Cycle Sequencing Kit(Applied Biosystems)を用い、DNAシークエンサーABI PRISM 3730xL DNA SequencerまたはABI PRISM 3700 DNA Sequencer(Applied Biosystems)にて、添付説明書記載の方法に従い決定した。
得られたAXL225のマウス抗体のアミノ酸配列の、重鎖可変領域を配列番号:3、該領域のCDR1を配列番号:4、CDR2を配列番号:5、CDR3を配列番号:6に示す。得られたAXL225のマウス抗体のアミノ酸配列の、軽鎖可変領域を配列番号:7、該領域のCDR1を配列番号:8、CDR2を配列番号:9、CDR3を配列番号:10に示した。
Claims (23)
- 細胞増殖抑制活性を有し、AXLのFND1に結合するモノクローナル抗体。
- 癌細胞の増殖を抑制することを特徴とする請求項1に記載の抗体。
- FND1全部または少なくとも5個以上の連続するアミノ酸配列を有するペプチドを免疫原として作製した抗体である、請求項1に記載の抗体。
- AXLの発現量を低下させる活性を有することを特徴とする請求項1から3のいずれかに記載の抗体。
- 血管新生阻害活性を有することを特徴とする請求項1から4のいずれかに記載の抗体。
- AXLのリン酸化を阻害しないことを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の抗体。
- 以下のいずれかの抗体;
・受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax284)、
・受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマにより産生される抗体 (Ax225)。 - 細胞増殖抑制活性を有し、請求項7に記載の抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
- 細胞増殖抑制活性を有し、AXLのFND1に結合し、請求項7に記載のいずれかの抗体が有するCDR配列と同一のCDR配列を有する抗体。
- 細胞増殖抑制活性を有し、AXLのFND1に結合し、重鎖CDR1,2,3の配列が配列番号4,5,6であり、かつ軽鎖CDR1,2,3の配列が配列番号8,9,10である抗体。
- キメラ抗体である請求項9〜10のいずれかに記載の抗体。
- ヒト化抗体である請求項9〜10のいずれかに記載の抗体。
- AXLのリン酸化を阻害しないことを特徴とする、請求項8〜12のいずれかに記載の抗体。
- 以下のいずれかのハイブリドーマ;
・受託番号FERM BP-10857として寄託されたハイブリドーマ (Ax284)、
・受託番号FERM BP-10854として寄託されたハイブリドーマ (Ax225)。 - 請求項1〜13のいずれかに記載の抗体を有効成分とする血管新生阻害剤。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の抗体を有効成分とする細胞増殖抑制剤。
- 細胞が癌細胞である請求項16に記載の抑制剤。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の抗体を有効成分とするAXL発現量低下剤。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の抗体を用いてAXLの発現量を低下させる方法。
- 請求項1〜13のいずれかに記載の抗体を有効成分とする抗癌剤。
- 癌が膵臓癌、胃癌、肺癌、骨肉腫、大腸癌、前立腺癌、メラノーマ、子宮内膜癌、卵巣癌、子宮平滑筋腫、甲状腺癌、幹細胞癌、乳癌、膀胱癌、腎臓癌、グリオーマ、神経芽腫、または食道癌である請求項20の抗癌剤。
- 癌がグリオーマ、胃癌、子宮内膜癌、非小細胞肺癌、膵臓腺癌または乳癌である請求項20の抗癌剤。
- 癌が膵臓腺癌または乳癌である請求項21の抗癌剤。
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