WO2011093097A1 - 抗dll3抗体 - Google Patents

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吉田　賢二
油谷　浩幸
俊平 石川
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株式会社未来創薬研究所
国立大学法人東京大学
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    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4703—Regulators; Modulating activity

Definitions

  • the present invention relates to an anticancer agent and a method for diagnosing cancer.
  • Small cell lung cancer accounts for about 20% of lung cancer. Small cell lung cancer progresses rapidly, and in many cases, lymph node metastasis and distant metastasis are already observed at the time of diagnosis, and surgery is difficult. Chemotherapy is considered as a first-line therapy because it initially shows high sensitivity to anticancer drugs. However, cancer quickly relapses with resistance to chemotherapy and its 3-year survival rate is less than 5%. Therefore, a new treatment method is required.
  • DLL3 Delta-like 3
  • Notch ligand family members are types I membrane protein belonging to Notch ligand family members. DLL3 is required for normal somitogenesis and patterning. DLL3 mutations cause rib defects and spinal fission in patients with autosomal recessive abnormal spondylocostal dysostosis [1, 2]. DLL1 is localized on the cell surface and binds to Notch, whereas DLL3 is mainly localized in the Golgi and does not bind to Notch [Non-Patent Documents 3 and 4].
  • Non-patent document 5 Reported that DLL3 chromosomal gene amplification and gene expression enhancement occurred in pancreatic cancer cell lines [Non-patent document 5], and that some gliomas had enhanced DLL3 expression [Non-patent document 6].
  • mouse anti-DLL3 monoclonal antibody (MAB4315, R & D System) is already on the market.
  • An object of the present invention is to provide a novel antibody, an anticancer agent using the same, and a method for diagnosing cancer.
  • the present inventors have found that DLL3 has increased mRNA expression in small cell lung cancer. Expression in normal tissues was low except for fetal brain.
  • the inventors of the present invention produced a monoclonal antibody against the DLL3 protein, but the amount of antigen on the cell surface measured as antibody-binding ability was less than 10 4 per expressed cell.
  • an antibody that binds to a characteristic epitope near the C-terminus of the extracellular domain and stably binds to DLL3 on the cell membrane was surprisingly found to have ADCC-inducing activity. That is, the present inventors succeeded in selecting an antibody having antitumor activity.
  • an antibody conjugated with a toxin has an activity of causing cytotoxicity to DLL3 expressing cells. Based on the above findings, the present inventors have found that the anti-DLL3 antibody is effective for the diagnosis, prevention and treatment of primary or metastatic cancers that express DLL3, thereby completing the present invention.
  • the present invention provides an antibody that binds to DLL3 protein.
  • the antibody of the present invention has cytotoxic activity.
  • the cytotoxic activity is antibody-dependent cytotoxic activity (ADCC activity).
  • the antibody of the present invention has an internalizing activity.
  • a cytotoxic substance is bound to the antibody of the present invention.
  • the antibody of the present invention recognizes a region of amino acids from the 216th amino acid to the 492th amino acid in human DLL3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1.
  • the present invention provides an antibody that binds to a DLL3 protein described in any of the following: (1) Heavy chain variable comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 An antibody comprising the region; (2) Heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 An antibody comprising the region; (3) A heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 An antibody comprising the region
  • a light chain variable comprising a region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • An antibody comprising the region;
  • a heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26
  • a light chain variable comprising a region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition comprising any of the above-described antibodies as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is an anticancer agent.
  • the anticancer agent is intended for lung cancer.
  • the present invention provides a method for diagnosing cancer comprising the following steps: (a) providing a sample isolated from a subject; (b) detecting the expression level of DLL3 protein or DLL3 gene in the sample, I will provide a.
  • the diagnostic method of the present invention is for diagnosing lung cancer.
  • the present invention also provides a diagnostic agent for cancer comprising any of the antibodies described above.
  • FIG. 1 shows enhanced DLL3 expression in small cell lung cancer and fetal brain.
  • FIG. 2 shows the binding of anti-DLL3 monoclonal antibody to soluble DLL3 protein.
  • FIG. 3 shows the binding of the antibody to the DLL3 protein on the cell membrane and the turnover of the antibody bound to the cell.
  • FIG. 4 shows ADCC induction by anti-DLL3 antibody (concentration 2.5 ⁇ g / ml).
  • FIG. 5 shows antibody concentration dependence of ADCC activity against target cells DLL3 / BaF3 (a) and NCI-H1184 (b).
  • FIG. 6 shows cell growth suppression by uptake of anti-DLL3 antibody / toxin-labeled anti-mouse secondary antibody Mab-ZAP.
  • FIG. 1 shows enhanced DLL3 expression in small cell lung cancer and fetal brain.
  • FIG. 2 shows the binding of anti-DLL3 monoclonal antibody to soluble DLL3 protein.
  • FIG. 3 shows the binding of the antibody to the DLL3 protein on
  • FIG. 7 shows the binding of recombinant anti-DLL3 antibody to DLL3 protein on the cell surface.
  • FIG. 8 shows the binding competition of the recombinant anti-DLL3 human chimeric antibody to the soluble DLL3 protein and the binding competition of the anti-DLL3 chimeric antibody to the soluble DLL3 protein by the mouse DLL3 antibody.
  • FIG. 9 shows the structure of the full-length and soluble DLL3 protein and the recognition site of the anti-DLL3 antibody.
  • FIG. 10 shows the binding of recombinant anti-DLL3 human chimeric antibody DL306 to DLL3 protein on the cell surface.
  • FIG. 11 shows the antibody concentration dependence of ADCC activity of anti-DLL3 human chimeric antibody against target cells DLL3 / BaF3 and NCI-H1184.
  • FIG. 12 shows the antibody concentration dependence of ADCC activity of anti-DLL3 mouse low-fucose antibodies against target cells DLL3 / BaF3 and NCI-H1184.
  • DLL3 The amino acid sequence of DLL3 (Delta-like 3) is known.
  • the amino acid sequence of human DLL3 is described in SEQ ID NO: 1 (NM_016941), and the amino acid sequence of mouse DLL3 is described in SEQ ID NO: 2, (NM_007866).
  • the DLL3 protein used in the present invention may be a DLL3 protein having the above-described sequence, or may be a variant in which one or more amino acids are modified in the above-described sequence.
  • variants in which one or more amino acids are modified in the above sequence include polypeptides having 70% or more homology with the above amino acid sequences, preferably polypeptides having 80% or more homology, A polypeptide having a homology of 90% or more is preferable, and a polypeptide having a homology of 95% or more is more preferable.
  • the partial peptide of these DLL3 may be sufficient.
  • the origin of the DLL3 protein used in the present invention is not limited, but is preferably a human DLL3 protein.
  • the anti-DLL3 antibody used in the present invention may be bound to DLL3 protein, and its origin, type, shape and the like are not particularly limited. Specifically, antibodies such as antibodies derived from non-human animals (eg, mouse antibodies, rat antibodies, camel antibodies), human-derived human antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies and the like can be used.
  • the anti-DLL3 antibody used in the present invention may be a polyclonal antibody or a monoclonal antibody, but is preferably a monoclonal antibody.
  • the anti-DLL3 antibody used in the present invention is preferably an anti-human DLL3 antibody.
  • the anti-human DLL3 antibody may be an antibody that specifically binds to human DLL3, or may be an antibody that binds to DLL3 derived from other animals (for example, mouse DLL3) in addition to human DLL3.
  • the anti-DLL3 antibody used in the present invention can be obtained as a polyclonal or monoclonal antibody using known means.
  • the anti-DLL3 antibody used in the present invention is particularly preferably a mammal-derived monoclonal antibody.
  • Mammal-derived monoclonal antibodies include those produced by hybridomas and those produced by hosts transformed with expression vectors containing antibody genes by genetic engineering techniques.
  • the anti-DLL3 antibody of the present invention may be modified with various molecules such as polyethylene glycol (PEG). Further, as described later, it may be modified with a chemotherapeutic agent having a cytotoxic activity or a radioactive chemical substance.
  • PEG polyethylene glycol
  • antibodies that recognize and bind to DLL3 used in the present invention include, for example, the following antibodies: (1) Heavy chain variable comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14 An antibody comprising the region (DL301); (2) Heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 An antibody comprising the region (DL306); (3) A heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38 An
  • a light chain variable comprising a region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20
  • An antibody comprising the region (DL301); (10) A heavy chain variable comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26
  • a light chain variable comprising a region, a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32.
  • the constant region to be used is not particularly limited, and any constant region may be used.
  • a preferred constant region used in the present invention is a human-derived constant region.
  • a constant region derived from human IgG1, a constant region derived from human IgG2, a constant region derived from human IgG3, a constant region derived from human IgG4, and the like can be used.
  • a constant region derived from a human ⁇ chain, a constant region derived from a human ⁇ chain, or the like can be used.
  • the constant region used in the present invention may be a constant region having a natural sequence, or may be a variant in which one or more amino acids are modified in a constant region having a natural sequence.
  • the FR to be used is not particularly limited, and any FR may be used as long as the binding activity to human DLL3 is maintained.
  • Preferred examples of FRs used in the present invention include FRs derived from human antibodies. Since a technique for replacing FR while maintaining the binding activity of an antibody to an antigen is known, those skilled in the art can appropriately select FR.
  • the FR used in the present invention may be an FR having a natural sequence, or an FR in which one or more amino acids are modified in the natural sequence.
  • a heavy chain variable region comprising a heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 12, a heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 13, and a heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 14.
  • Examples of the heavy chain containing the heavy chain variable region include a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 10 or SEQ ID NO: 11.
  • Example of heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 24, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 25, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 26 Can include the heavy chain variable region having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 21.
  • Examples of the heavy chain containing the heavy chain variable region include a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 22 or SEQ ID NO: 23.
  • Example of heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 36, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 37, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 38
  • Examples of the heavy chain containing the heavy chain variable region include a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 34 or SEQ ID NO: 35.
  • Example of heavy chain variable region comprising heavy chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 48, heavy chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 49, and heavy chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 50
  • Examples of the heavy chain containing the heavy chain variable region include a heavy chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 46 or SEQ ID NO: 47.
  • a light chain variable region comprising a light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 18, a light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 19, and a light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 20.
  • Examples of the light chain containing the light chain variable region include a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 16 or SEQ ID NO: 17.
  • Example of light chain variable region comprising light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 30, light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 31, and light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 32
  • Examples of the light chain containing the light chain variable region include a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 28 or SEQ ID NO: 29.
  • Example of light chain variable region comprising light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 42, light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 43, and light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 44
  • An example of a light chain containing the light chain variable region is a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 or SEQ ID NO: 41.
  • Example of light chain variable region comprising light chain CDR1 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 54, light chain CDR2 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 55, and light chain CDR3 having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 56
  • An example of a light chain containing the light chain variable region is a light chain having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 52 or SEQ ID NO: 53.
  • having the same activity as the antibody of the present invention means that the binding activity to DLL3, the internalizing activity and / or the cytotoxic activity (such as ADCC activity) on cells expressing DLL3 are equivalent.
  • the equivalent activity is not necessarily required to be the same, for example, 50% or more, preferably 70% or more, compared to any of the activities (1) to (12) described above. More preferably, it should have an activity of 90% or more.
  • the upper limit of the activity is not particularly limited, and examples include, for example, 1000% or less, 500% or less, 300% or less, 150% or less, 100% or less.
  • an antibody in which one or several amino acids are substituted, deleted, added and / or inserted in the antibody of the present invention is also within the scope of the present invention, and even an artificially produced antibody is naturally produced. There may be.
  • Methods for introducing mutations into polypeptides include, for example, site-directed mutagenesis (Hashimoto-Gotoh, T. et al. (1995) Gene 152, 271-275, Zoller, MJ, and Smith, M. (1983 ) Methods Enzymol. 100, 468-500, Kramer, W. et al. (1984) Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, Kramer W, and Fritz HJ (1987) Methods. Enzymol.
  • the number of amino acids to be mutated is usually within 50 amino acids, preferably within 30 amino acids, and more preferably within 10 amino acids (for example, within 5 amino acids).
  • the amino acid residue to be mutated is preferably mutated to another amino acid in which the properties of the amino acid side chain are conserved.
  • Hydrophobic amino acids A, I, L, M, F, P, W, Y, V
  • Hydrophilic amino acids R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S, T
  • Amino acids with aliphatic side chains G, A, V, L, I, P
  • An amino acid having a hydroxyl group-containing side chain S, T, Y
  • Amino acids having side chains containing sulfur atoms C, M
  • Amino acids having carboxylic acid and amide-containing side chains D, N, E, Q
  • Amino acids with base-containing side chains R, K, H
  • Amino acids with aromatic-containing side chains H, F, Y, W
  • a polypeptide having an amino acid sequence modified by deletion, addition and / or substitution by other amino acids of one or several amino acid residues to a certain amino acid sequence maintains the biological activity of the original polypeptide Is already known (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1984) 81, 5562-5666, Zoller, M. J. and Smith, M., Nucleic Acids Research (1982) 10, 6487-6500, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1982) 79, 6409- 6413).
  • the present invention also provides an antibody that binds to the same epitope as that to which any one of the above-mentioned antibodies (1) to (12) binds.
  • Specific examples of the antibodies (1) to (12) described above include the antibodies DL301, DL306, DL309, and DL312 described in the following examples. That is, the present invention also provides antibodies that recognize the same epitope as those recognized by these antibodies.
  • test antibody shares an epitope with a certain antibody can be confirmed by the competition for the same epitope.
  • Competition between antibodies is detected by a cross-blocking assay or the like.
  • a competitive ELISA assay is a preferred cross-blocking assay.
  • the anti-DLL3 antibody of the present invention is added after preincubating the DLL3 protein coated on the well of the microtiter plate in the presence or absence of the candidate competitive antibody. Is done.
  • the amount of anti-DLL3 antibody of the present invention bound to the DLL3 protein in the well is indirectly correlated with the binding ability of the candidate competitive antibody (test antibody) that competes for binding to the same epitope. That is, the greater the affinity of the test antibody for the same epitope, the lower the binding amount of the anti-DLL3 antibody of the present invention to the well coated with DLL3 protein, while the test antibody binds to the well coated with DLL3 protein. The amount of binding increases.
  • the amount of antibody bound to the well can be easily measured by labeling the antibody in advance.
  • biotin-labeled antibodies can be measured by using an avidin peroxidase conjugate and an appropriate substrate.
  • a cross-blocking assay using an enzyme label such as peroxidase is particularly referred to as a competitive ELISA assay.
  • the antibody can be labeled with another labeling substance that can be detected or measured. Specifically, radiolabels or fluorescent labels are known.
  • the antibody bound to the well can be measured by a labeled antibody that recognizes any of the constant regions.
  • the antibodies bound to the wells can be measured by the antibodies that identify the respective classes.
  • the candidate antibody is at least 20%, preferably at least 30%, more preferably at least 50%, more preferably at least 80% compared to the binding activity obtained in a control test carried out in the absence of the competing antibody, If the binding of the anti-DLL3 antibody can be blocked, the candidate antibody is an antibody that binds to substantially the same epitope as the anti-DLL3 antibody of the present invention or competes for binding to the same epitope.
  • an antibody that recognizes the region from the 27th amino acid to the 175th amino acid of human DLL3 (SEQ ID NO: 1), the 216th amino acid to the 492th amino acid of human DLL3
  • An antibody that recognizes the region can be mentioned.
  • a polypeptide that binds to human DLL3 and has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (DLL3delta1-Fc) and a polypeptide that has the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (DLL3delta2- An antibody that does not bind to Fc), and a polypeptide that binds to human DLL3 and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (DLL3delta1-Fc) and a polypeptide that consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (DLL3delta2-Fc)
  • DLL3delta1-Fc an antibody that does not bind to Fc
  • a polypeptide that binds to human DLL3 and consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6 (DLL3delta1-Fc) and a polypeptide that consists of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 7 (DLL3delta2-Fc) Can also be mentioned.
  • the antibody of the present invention has activities such as ADCC activity and internalization activity, it is useful as a pharmaceutical, particularly as an anticancer agent.
  • a recombinant anti-DLL3 antibody antibody When a recombinant anti-DLL3 antibody antibody is to be administered to humans, it can be a genetically modified antibody that has been artificially modified for the purpose of reducing the heteroantigenicity of humans.
  • the recombinant antibody includes, for example, a chimeric antibody and a humanized antibody. These modified antibodies can be produced using known methods.
  • a chimeric antibody refers to an antibody in which variable regions and constant regions derived from each other are linked.
  • an antibody consisting of the variable regions of the heavy and light chains of a mouse antibody and the constant regions of the heavy and light chains of a human antibody is a mouse-human-heterologous chimeric antibody.
  • a recombinant vector that expresses a chimeric antibody can be prepared by linking DNA encoding the variable region of a mouse antibody to DNA encoding the constant region of a human antibody and incorporating it into an expression vector.
  • the chimeric antibody produced in the culture can be obtained by culturing recombinant cells transformed with the vector and expressing the incorporated DNA.
  • a human antibody is used as the constant region of the chimeric antibody.
  • C ⁇ 1, C ⁇ 2, C ⁇ 3, C ⁇ 4, C ⁇ , C ⁇ , C ⁇ 1, C ⁇ 2, and C ⁇ can be used as constant regions.
  • C ⁇ and C ⁇ can be used as constant regions.
  • the amino acid sequences of these constant regions and the base sequences encoding them are known.
  • one or several amino acids in the human antibody constant region can be substituted, deleted, added and / or inserted.
  • Humanized antibodies In general, chimeric antibodies are composed of variable regions of non-human animal-derived antibodies and human antibody-derived constant regions, whereas humanized antibodies are complementary to non-human animal-derived antibodies. It is composed of a sex determining region (CDR), a framework region (FR) derived from a human antibody, and a constant region derived from a human antibody. Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies. Specifically, non-human animals, for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful as active ingredients of the therapeutic agent of the present invention.
  • CDR sex determining region
  • FR framework region derived from a human antibody
  • Humanized antibodies are also referred to as reshaped human antibodies.
  • non-human animals for example, humanized antibodies obtained by grafting mouse antibody CDRs to human antibodies are known. Since humanized antibodies have reduced antigenicity in the human body, they are useful as active ingredients of
  • Antibody variable regions are usually composed of three CDRs sandwiched between four FRs.
  • CDRs are regions that substantially determine the binding specificity of an antibody.
  • the amino acid sequence of CDR is rich in diversity.
  • the amino acid sequence constituting FR often shows high homology among antibodies having different binding specificities. Therefore, it is generally said that the binding specificity of one antibody can be transplanted to another antibody by CDR grafting.
  • overlap extension PCR is known as a method for transplanting mouse antibody CDRs to human FRs.
  • a primer in which a nucleotide sequence encoding the CDR of a mouse antibody to be transplanted is added to a primer for synthesizing an FR of a human antibody.
  • Primers are prepared for each of the four FRs.
  • selection of human FRs having high homology with mouse FRs is advantageous in maintaining CDR function. That is, generally, it is preferable to use a human FR comprising an amino acid sequence having high homology with the amino acid sequence of the FR adjacent to the mouse CDR to be transplanted.
  • the base sequences to be linked are designed to be connected to each other in frame.
  • Human FRs are synthesized individually by each primer.
  • a product in which DNA encoding mouse CDR is added to each FR is obtained.
  • the base sequences encoding mouse CDRs of each product are designed to overlap each other.
  • the overlapping CDR portions are annealed with each other to perform a complementary strand synthesis reaction.
  • human FRs are linked via the mouse CDR sequence.
  • a humanized antibody expression vector can be prepared by inserting the DNA obtained as described above and a DNA encoding a human antibody constant region into an expression vector so as to be fused in frame. After introducing this vector into a host to establish recombinant cells, the recombinant cells are cultured, and the DNA encoding the humanized antibody is expressed, whereby the humanized antibody is produced in the culture of the cultured cells. (See European Patent Publication EP 239400, International Publication WO 96/02576).
  • the CDR forms a favorable antigen-binding site when linked via CDR.
  • a human antibody FR can be suitably selected.
  • FR amino acid residues can be substituted so that the CDR of the humanized antibody forms an appropriate antigen-binding site.
  • amino acid sequence mutations can be introduced into FRs by applying the PCR method used for transplantation of mouse CDRs into human FRs.
  • partial nucleotide sequence mutations can be introduced into primers that anneal to the FR.
  • a nucleotide sequence mutation is introduced into the FR synthesized by such a primer.
  • a mutant FR sequence having a desired property can be selected by measuring and evaluating the antigen-binding activity of a mutant antibody substituted with an amino acid by the above method (Sato, K. et al., Cancer Res, 1993, 53 , 851-856).
  • the antibody of the present invention is represented not only by a bivalent antibody represented by IgG (IgG1, IgG2, IgG4, etc.), but also by a monovalent antibody or IgM. Multivalent antibodies are also included.
  • the multivalent antibodies of the present invention include multivalent antibodies that all have the same antigen-binding site, or multivalent antibodies that have some or all different antigen-binding sites.
  • the antibody of the present invention is not limited to the full-length antibody molecule, and may be a low-molecular-weight antibody or a modified product thereof as long as it binds to DLL3 protein.
  • the low molecular weight antibody includes an antibody fragment in which a part of a full-length antibody (whole antibody such as whole IgG) is deleted. As long as it has the ability to bind to the DLL3 antigen, partial deletion of the antibody molecule is tolerated.
  • the antibody fragment in the present invention preferably contains either or both of a heavy chain variable region (VH) and a light chain variable region (VL).
  • the antibody fragment in the present invention preferably contains CDR.
  • the number of CDRs contained in the antibody fragment of the present invention is not particularly limited, but preferably contains at least six of heavy chain CDR1, CDR2, CDR3, light chain CDR1, CDR2, and CDR3.
  • the amino acid sequence of VH or VL can contain substitutions, deletions, additions and / or insertions. Furthermore, as long as it has the ability to bind to the DLL3 antigen, either or both of VH and VL can be deleted.
  • the variable region may be chimerized or humanized.
  • Specific examples of antibody fragments include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, and Fv.
  • Specific examples of the low molecular weight antibody include, for example, Fab, Fab ′, F (ab ′) 2, Fv, scFv (single chain Fv), diabody, sc (Fv) 2 (single chain (Fv) 2 ), ScFv-Fc, and the like.
  • the preferred low molecular weight antibody in the present invention is diabody or sc (Fv) 2. Multimers of these antibodies (eg, dimer, trimer, tetramer, polymer) are also included in the low molecular weight antibody of the present invention.
  • Antibody fragments can be obtained by treating antibodies with enzymes to generate antibody fragments. Digestive enzymes cleave specific positions of antibody fragments to give antibody fragments of a specific structure. As an enzyme that generates an antibody fragment, for example, papain, pepsin, or plasmin is known.In the case of papain digestion, F (ab) 2 or Fab is used. In the case of pepsin digestion, F (ab ′) 2 or Fab ′ is used. give. Alternatively, genes encoding these antibody fragments can be constructed, introduced into an expression vector, and then expressed in an appropriate host cell (for example, Co, MS et al., J. Immunol. (1994) 152). , 2968-2976, Better, M.
  • enzymes to generate antibody fragments for example, papain, pepsin, or plasmin is known. In the case of papain digestion, F (ab) 2 or Fab is used. In the case of pepsin digestion, F (ab ′) 2 or Fab
  • the low molecular weight antibody in the present invention can be an antibody fragment lacking any region as long as it has binding affinity for DLL3.
  • Diabodies refer to bivalent antibody fragments constructed by gene fusion (Holliger P et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993), EP404 No. 097, WO 93/11161, etc.). Diabodies are dimers composed of two polypeptide chains. Usually, in the polypeptide chain constituting the dimer, the heavy chain variable region and the light chain variable region are connected by a linker in the same chain. The linker in the diabody is generally short enough that the heavy chain variable region and the light chain variable region cannot bind to each other. Specifically, the amino acid residues constituting the linker are, for example, about 5 residues. Therefore, the heavy chain variable region and the light chain variable region encoded on the same polypeptide chain cannot form a single chain variable region fragment but form a dimer with another single chain variable region fragment. As a result, the diabody has two antigen binding sites.
  • scFv is obtained by linking an antibody heavy chain variable region and a light chain variable region.
  • the heavy chain variable region and the light chain variable region are linked via a linker, preferably a peptide linker (Huston, JS et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 5879- 5883).
  • the heavy chain variable region and light chain variable region in scFv may be derived from any of the antibodies described herein.
  • the peptide linker that links the variable regions.
  • any single chain peptide consisting of about 3 to 25 residues can be used as a linker.
  • a peptide linker described later can be used.
  • variable regions of both strands can be linked by, for example, the PCR method.
  • the DNA sequence encoding the heavy chain or heavy chain variable region of the antibody and the DNA sequence encoding the light chain or light chain variable region of the antibody all or a desired portion DNA encoding an amino acid sequence is used as a template.
  • the DNAs encoding the variable regions of the heavy chain and the light chain are each amplified by PCR using a pair of primers having sequences corresponding to the sequences at both ends of the DNA to be amplified.
  • DNA encoding a peptide linker portion is prepared.
  • DNA encoding a peptide linker can also be synthesized using PCR.
  • a base sequence that can be linked to the amplification product of each variable region synthesized separately is added to the 5 ′ side of the primer to be used.
  • a PCR reaction is performed using each DNA of [heavy chain variable region DNA]-[peptide linker DNA]-[light chain variable region DNA] and a primer for assembly PCR.
  • the primer for assembly PCR consists of a combination of a primer that anneals to the 5 ′ side of [heavy chain variable region DNA] and a primer that anneals to the 3 ′ side of [light chain variable region DNA]. That is, the assembly PCR primer is a primer set that can amplify DNA encoding the full-length sequence of scFv to be synthesized. On the other hand, a base sequence that can be linked to each variable region DNA is added to [peptide linker DNA]. As a result, these DNAs are ligated, and the full length of scFv is finally produced as an amplification product by the primers for assembly PCR.
  • an expression vector containing them and a recombinant cell transformed with the expression vector can be obtained according to a conventional method. Further, the scFv can be obtained by culturing the resulting recombinant cells and expressing the DNA encoding the scFv.
  • scFv-Fc is a low molecular weight antibody in which the Fc region is fused to scFv (Cellular & Molecular Immunology 2006; 3: 439-443).
  • scFv used for scFv-Fc is not specifically limited, For example, scFv derived from IgM can be used.
  • the origin of Fc is not particularly limited, and for example, human IgG (human IgG1 etc.) can be used.
  • scFv-Fc scFv- fragment obtained by linking the scFv fragment of IgM antibody and human IgG1 CH2 (eg, C ⁇ 2) and CH3 (eg, C ⁇ 3) at the hinge region (H ⁇ ) of human IgG1.
  • Fc can be mentioned.
  • sc (Fv) 2 is a low molecular weight antibody in which two heavy chain variable regions (VH) and two light chain variable regions (VL) are combined with a linker or the like to form a single chain (Hudson et al, J Immunol. Methods 1999; 231: 177-189).
  • sc (Fv) 2 can be prepared, for example, by linking scFv with a linker. When linking four antibody variable regions, usually three linkers are required.
  • VHs and two VLs are arranged in the order of VH, VL, VH, and VL ([VH] linker [VL] linker [VH] linker [VL]) starting from the N-terminal side of the single-chain polypeptide.
  • An antibody characterized in that it is preferred.
  • a linker that binds the variable region of an antibody a linker disclosed in any peptide linker that can be introduced by genetic engineering, or a synthetic compound linker (for example, see Protein Engineering, 9 (3), 299-305, 1996), etc. Can be used.
  • a plurality of linkers may be the same or different linkers may be used.
  • a peptide linker is preferred.
  • the length of the peptide linker is not particularly limited, and can be appropriately selected by those skilled in the art according to the purpose.
  • the amino acid residue constituting the peptide linker is 1 to 100 amino acids, preferably 3 to 50 amino acids, more preferably 5 to 30 amino acids, particularly preferably 12 to 18 amino acids (for example, 15 amino acids).
  • the amino acid sequence constituting the peptide linker can be any sequence as long as the binding action of scFv is not inhibited.
  • the following amino acid sequence can be used.
  • n for determining the length of the above peptide linker is usually 1 to 5, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • sc (Fv) 2 in the present invention include the following sc (Fv) 2: [VH] Peptide linker (15 amino acids) [VL] Peptide linker (15 amino acids) [VH] Peptide linker (15 amino acids) [VL].
  • variable regions can be linked using synthetic chemical linkers (chemical crosslinkers).
  • a crosslinking agent usually used for crosslinking such as peptide compounds can be used in the present invention.
  • chemical crosslinking agents are known. These crosslinkers are commercially available: N-hydroxysuccinimide (NHS), Disuccinimidyl suberate (DSS), Bis (sulfosuccinimidyl) suberate (BS3), Dithiobis (succinimidyl propionate) (DSP), Dithiobis (sulfosuccinimidyl propionate) (DTSSP), Ethylene glycol bis (succinimidyl succinate) (EGS), Ethylene glycol bis (sulfosuccinimidyl succinate) (sulfo-EGS), Disuccinimidyl tartrate (DST), disulfosuccinimidyl tartrate (sulfo-DST), Bis [2- (succinimid)
  • Anti-DLL3 antibody activity (1) Cytotoxic activity In the treatment of cell proliferative diseases such as cancer, it is desirable that the antibody maintain its effector activity. That is, a preferred antibody in the present invention has both a binding affinity for DLL3 and an effector function.
  • Antibody effector functions include antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) activity and complement-dependent cytotoxicity (CDC) activity.
  • the therapeutic antibody in the present invention particularly preferably comprises ADCC activity as an effector function.
  • the antibody of the present invention is used for therapeutic purposes, the antibody is preferably an antibody having cytotoxic activity.
  • cytotoxic activity examples include ADCC activity and CDC activity.
  • ADCC activity means that when a specific antibody adheres to a cell surface antigen of a target cell, an Fc ⁇ receptor-bearing cell (such as an immune cell) binds to the Fc portion via the Fc ⁇ receptor and binds to the target cell. It means an activity that causes injury.
  • CDC activity means cytotoxic activity by the complement system.
  • Whether or not the anti-DLL3 antibody has ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)). Specifically, first, effector cells, complement solution, and target cells are prepared.
  • effector cells Spleens are removed from CBA / N mice and the like, and spleen cells are isolated in RPMI1640 medium (Invitrogen). After washing with the same medium containing 10% fetal bovine serum (FBS, HyClone), effector cells can be prepared by adjusting the cell concentration to 5 ⁇ 10 6 / ml.
  • FBS fetal bovine serum
  • target cells Culture cells expressing DLL3 protein with 0.2 mCi of 51 Cr-sodium chromate (GE Healthcare Biosciences) in DMEM medium containing 10% FBS for 1 hour at 37 ° C.
  • the target cell can be radiolabeled.
  • cells expressing DLL3 protein cells transformed with a gene encoding DLL3 protein, a small cell lung cancer cell line, and the like can be used. After radiolabeling, the target cells can be prepared by washing the cells three times with 10% FBS-containing RPMI1640 medium and adjusting the cell concentration to 2 ⁇ 10 5 / ml.
  • ADCC activity or CDC activity can be measured by the method described below.
  • 50 ⁇ l each of target cells and anti-DLL3 antibody are added to a 96-well U-bottom plate (Becton Dickinson) and allowed to react on ice for 15 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of effector cells are added and cultured for 4 hours in a carbon dioxide incubator. The final antibody concentration is 0 or 10 ⁇ g / ml. After the culture, 100 ⁇ l of the supernatant is collected, and the radioactivity is measured with a gamma counter (COBRAII AUTO-GAMMA, MODEL D5005, Packard Instrument Company).
  • COBRAII AUTO-GAMMA MODEL D5005, Packard Instrument Company
  • Cytotoxic activity (%) can be calculated based on the formula (A-C) / (B-C) x 100 using the obtained value.
  • A is the radioactivity (cpm) in each sample
  • B is the radioactivity (cpm) in the sample with 1% NP-40 (manufactured by nacalai tesque)
  • C is the radioactivity (cpm) of the sample containing only the target cells Show.
  • a cytotoxic substance such as a chemotherapeutic agent, a toxic peptide or a radioactive chemical substance
  • antibody conjugate a modified antibody
  • Antibody modification methods have already been established in this field.
  • Preferred chemotherapeutic agents are low molecular chemotherapeutic agents. Small molecule chemotherapeutic agents are less likely to interfere with antibody function after binding to the antibody.
  • the low-molecular chemotherapeutic agent usually has a molecular weight of 100 to 2000, preferably 200 to 1000.
  • the chemotherapeutic agents exemplified here are all low-molecular chemotherapeutic agents.
  • These chemotherapeutic agents in the present invention include a prodrug that is converted into an active chemotherapeutic agent in vivo. Activation of the prodrug may be enzymatic conversion or non-enzymatic conversion.
  • the antibody can also be modified with a toxic peptide.
  • a toxic peptide the following can be mentioned, for example. Diphtheria toxin A chain (Diphtheria toxin A Chain) (Langone JJ, et al., Methods in Enzymology, 93, 307-308, 1983), Pseudomonas Exotoxin (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), lysine chain ( Ricin A Chain) (Fulton RJ, et al., J. Biol.
  • the radioactive chemical substance refers to a chemical substance containing a radioisotope.
  • the radioactive isotope is not particularly limited, and any radioactive isotope may be used.
  • 32 P, 14 C, 125 I, 3 H, 131 I, 186 Re, 188 Re, etc. can be used. .
  • one or two or more small molecule chemotherapeutic agents and a toxic peptide can be used in combination to modify the antibody.
  • Coupling between the anti-DLL3 antibody and the above-described small molecule chemotherapeutic agent can be covalent or non-covalent. Methods for producing antibodies bound with these chemotherapeutic agents are known.
  • Proteinaceous drugs and toxins can be combined with antibodies by genetic engineering techniques.
  • a recombinant vector in which a DNA encoding the toxic peptide and a DNA encoding an anti-DLL3 antibody are fused in frame and incorporated into an expression vector can be constructed.
  • a transformed cell obtained by introducing the vector into an appropriate host cell is cultured, and the incorporated DNA is expressed, whereby an anti-DLL3 antibody to which a toxic peptide is bound can be obtained as a fusion protein.
  • a proteinaceous drug or toxin is generally arranged on the C-terminal side of the antibody.
  • a peptide linker can be interposed between the antibody and the proteinaceous drug or toxin.
  • bispecific antibody refers to antibodies that have variable regions that recognize different epitopes within the same antibody molecule.
  • bispecific antibodies can have antigen binding sites that recognize different epitopes on the DLL3 molecule.
  • Such bispecific antibodies can bind two antibody molecules to one molecule of DLL3. As a result, a stronger cytotoxic effect can be expected.
  • the cytotoxic substance can be a bispecific antibody in which one antigen binding site recognizes DLL3 and the other antigen binding site recognizes a cytotoxic substance.
  • the cytotoxic substance includes a chemotherapeutic agent, a toxic peptide, a radioactive chemical substance, and the like.
  • Such bispecific antibodies capture cytotoxic substances while binding to cells expressing DLL3.
  • the cytotoxic substance can directly act on the DLL3-expressing cells. That is, the bispecific antibody that recognizes the cytotoxic substance can specifically damage the tumor cell and suppress the growth of the tumor cell.
  • a bispecific antibody combined with an antigen binding site that recognizes an antigen other than DLL3 can also be used.
  • a bispecific antibody can be combined with an antigen-binding site that recognizes an antigen that is specifically expressed on the cell surface of the target cancer cell in the same manner as DLL3 and that is different from DLL3. it can.
  • bispecific antibodies can be produced by combining two types of antibodies with different recognition antigens.
  • the antibody to be bound may be a half molecule each having a heavy chain and a light chain, or may be a quarter molecule consisting only of a heavy chain.
  • bispecific antibody-producing fused cells can be prepared by fusing hybridomas that produce different monoclonal antibodies.
  • bispecific antibodies can be produced by genetic engineering techniques.
  • ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
  • EIA enzyme immunoassay
  • RIA radioimmunoassay
  • fluorescent immunoassay can be used.
  • the antibody of the present invention may be an antibody having a modified sugar chain. It is known that the cytotoxic activity of an antibody can be enhanced by modifying the sugar chain of the antibody. Examples of antibodies with modified sugar chains include antibodies with modified sugar chains (WO99 / 54342, etc.), antibodies lacking fucose added to sugar chains (WO00 / 61739, WO02 / 31140, etc.), bisecting GlcNAc, etc. An antibody having a sugar chain having WO (such as WO02 / 79255) is known.
  • the antibody of the present invention may have internalization activity.
  • an antibody having an internalizing activity means an antibody that is transported into a cell (cytoplasm, vesicle, other organelle, etc.) when bound to DLL3.
  • Whether or not the antibody has an internalizing activity can be confirmed using a method known to those skilled in the art.
  • an anti-DLL3 antibody to which a labeling substance is bound is brought into contact with a cell expressing DLL3 and the labeling substance is contacted with the cell.
  • a method for confirming whether or not it has been taken into the cell a method for confirming whether or not cell death is induced in the DLL3-expressing cells by contacting an anti-DLL3 antibody conjugated with a cytotoxic substance with cells expressing DLL3, etc. Can be confirmed.
  • the internalization activity of the anti-DLL3 antibody can be measured by the method described in the Examples.
  • An antibody having an internalizing activity can be used as a pharmaceutical composition such as an anticancer agent to be described later by binding, for example, the above-mentioned cytotoxic substance.
  • a monoclonal antibody-producing hybridoma can be prepared according to a known technique as follows. First, an animal is immunized according to a normal immunization method using DLL3 protein or a partial peptide thereof described later as a sensitizing antigen. The obtained immune cells are fused with a known parent cell by an ordinary cell fusion method to obtain a hybridoma. Further, from this hybridoma, a hybridoma producing an anti-DLL3 antibody is selected by screening cells producing the target antibody by a usual screening method. A desired anti-DLL3 monoclonal antibody is obtained from the selected hybridoma. Specifically, this is performed as follows.
  • DLL3 protein to be used as a sensitizing antigen for antibody acquisition can be obtained by expressing DLL3 gene. That is, after inserting a gene sequence encoding DLL3 into a known expression vector and transforming an appropriate host cell, the desired human DLL3 protein is purified from the host cell or culture supernatant by a known method. To do. A purified natural DLL3 protein or a fusion protein obtained by fusing a desired partial polypeptide of DLL3 protein with a different polypeptide can also be used as an immunogen. In order to produce a fusion protein as an immunogen, for example, an Fc fragment of an antibody, a peptide tag, or the like can be used.
  • a vector that expresses the fusion protein can be prepared by fusing genes encoding two or more desired polypeptide fragments in-frame and inserting the fusion gene into an expression vector. Methods for producing fusion proteins are described in Molecular Cloning 2nd ed. (Sambrook, J et al., Molecular Cloning 2nd ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).
  • the DLL3 protein purified in this manner can be used as a sensitizing antigen used for immunization against mammals.
  • a partial peptide of DLL3 can also be used as a sensitizing antigen.
  • the following peptides can be used as the sensitizing antigen.
  • the region and size of DLL3 used as a partial peptide are not limited.
  • the number of amino acids constituting the peptide to be sensitized antigen is preferably at least 3 or more, for example, 5 or more, or 6 or more. More specifically, a peptide having 8 to 50, preferably 10 to 30 residues can be used as a sensitizing antigen.
  • a mammal is immunized using DLL3 protein or a partial peptide thereof as a sensitizing antigen.
  • the mammal to be immunized is not particularly limited, but in order to obtain a monoclonal antibody by the cell fusion method, it is preferable to select the immunized animal in consideration of compatibility with the parent cell used for cell fusion.
  • rodent animals are preferred as immunized animals. Specifically, mice, rats, hamsters, or rabbits can be used as immunized animals. In addition, monkeys and the like can be used as immunized animals.
  • the above animals can be immunized with a sensitizing antigen according to a known method.
  • a mammal can be immunized by injecting a sensitizing antigen intraperitoneally or subcutaneously.
  • the sensitizing antigen is administered to mammals several times every 4 to 21 days.
  • the sensitizing antigen is diluted with PBS (Phosphate-Buffered Saline, phosphate buffered saline) or physiological saline at an appropriate dilution ratio and used for immunization.
  • a sensitizing antigen may be administered together with an adjuvant.
  • it can be mixed with Freund's complete adjuvant and emulsified to give a sensitizing antigen.
  • An appropriate carrier can be used for immunization with the sensitizing antigen.
  • a partial peptide having a small molecular weight is used as a sensitizing antigen, it is desirable to immunize the sensitizing antigen peptide by binding it to a carrier protein such as albumin or keyhole limpet hemocyanin.
  • DNA immunity monoclonal antibodies can also be obtained by DNA immunization.
  • DNA immunization refers to immunization by administering a vector DNA constructed in such a manner that a gene encoding an antigen protein can be expressed in an immunized animal, and expressing the immunizing antigen in the body of the immunized animal. It is a method of giving a stimulus.
  • DNA immunization can be expected to have the following advantages. ⁇ Implement immune stimulation by maintaining the structure of membrane proteins such as DLL3. -There is no need to purify immune antigens.
  • DNA expressing DLL3 protein is first administered to an immunized animal.
  • DNA encoding DLL3 can be synthesized by a known method such as PCR.
  • the obtained DNA is inserted into an appropriate expression vector and administered to an immunized animal.
  • the expression vector for example, a commercially available expression vector such as pcDNA3.1 can be used.
  • a method of administering the vector to a living body a generally used method can be used.
  • DNA immunization can be performed by implanting gold particles adsorbed with an expression vector into cells with a gene gun.
  • immune cells are collected from the mammal and subjected to cell fusion.
  • spleen cells can be used.
  • Mammalian myeloma cells are used as cells to be fused with the above immune cells.
  • the myeloma cell is preferably provided with an appropriate selection marker for screening.
  • a selectable marker refers to a trait that can (or cannot) survive under certain culture conditions.
  • Known selection markers include hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency (hereinafter abbreviated as HGPRT deficiency) or thymidine kinase deficiency (hereinafter abbreviated as TK deficiency).
  • HGPRT deficiency hypoxanthine-guanine-phosphoribosyltransferase deficiency
  • TK deficiency thymidine kinase deficiency
  • Cells having HGPRT or TK deficiency have hypoxanthine-aminopterin-thymidine sensitivity (hereinafter abbreviated as HAT sensitivity).
  • HGPRT-deficient or TK-deficient cells can be selected in a medium containing 6 thioguanine, 8 azaguanine (hereinafter abbreviated as 8AG), or 5 'bromodeoxyuridine, respectively.
  • 8AG 8 azaguanine
  • Normal cells die because they incorporate these pyrimidine analogs into the DNA, but cells deficient in these enzymes cannot survive these pyrimidine analogs and can survive in selective media.
  • a selectable marker called G418 resistance confers resistance to 2-deoxystreptamine antibiotics (gentamicin analogs) with a neomycin resistance gene.
  • Various myeloma cells suitable for cell fusion are known. For example, the following myeloma cells can be used for the production of the monoclonal antibody in the present invention.
  • P3 P3x63Ag8.653 (J. Immunol. (1979) 123, 1548-1550), P3x63Ag8U.1 (Current Topics in Microbiology and Immunology (1978) 81, 1-7), NS-1 (Kohler. G. and Milstein, C. Eur. J. Immunol. (1976) 6, 511-519), MPC-11 (Margulies. DH et al., Cell (1976) 8, 405-415), SP2 / 0 (Shulman, M. et al., Nature (1978) 276, 269-270), FO (de St. Groth, S. F. etal., J. Immunol.
  • immune cells and myeloma cells according to known methods such as the method of Kohler and Milstein (Kohler. G. and Milstein, C., Methods Enzymol. (1981) 73, 3-46), etc. And cell fusion.
  • cell fusion can be carried out in a normal nutrient culture medium in the presence of a cell fusion promoter.
  • a cell fusion promoter for example, polyethylene glycol (PEG), Sendai virus (HVJ) or the like can be used.
  • an auxiliary agent such as dimethyl sulfoxide can be added as desired in order to increase the fusion efficiency.
  • the usage ratio of immune cells and myeloma cells can be set arbitrarily.
  • the number of immune cells is preferably 1 to 10 times that of myeloma cells.
  • the culture solution used for cell fusion for example, RPMI1640 culture solution suitable for growth of myeloma cell line, MEM culture solution, and other normal culture solutions used for this type of cell culture can be used.
  • serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be added to the culture medium.
  • a predetermined amount of immune cells and myeloma cells are mixed well in a culture solution, and a target PEG (hybridoma) is formed by mixing a PEG solution preheated to about 37 ° C.
  • a target PEG hybrida
  • PEG having an average molecular weight of about 1000 to 6000 can be usually added at a concentration of 30 to 60% (w / v).
  • cell fusion agents and the like that are undesirable for the growth of hybridomas are removed by sequentially adding the appropriate culture medium listed above, and then centrifuging to remove the supernatant.
  • the hybridoma obtained in this manner can be selected by using a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • a selective culture solution corresponding to the selection marker possessed by the myeloma used for cell fusion.
  • cells having HGPRT or TK deficiency can be selected by culturing in a HAT culture solution (a culture solution containing hypoxanthine, aminopterin and thymidine). That is, when HAT-sensitive myeloma cells are used for cell fusion, cells that have succeeded in cell fusion with normal cells can be selectively proliferated in the HAT culture solution.
  • the culture using the HAT culture solution is continued for a time sufficient for cells other than the target hybridoma (non-fusion cells) to die.
  • the target hybridoma can be selected by culturing for several days to several weeks. Subsequently, by carrying out the usual limiting dilution method, screening and single cloning of the hybridoma producing the target antibody can be performed.
  • Screening and single cloning of the target antibody can be preferably performed by a screening method based on a known antigen-antibody reaction.
  • the antigen is bound to a carrier such as beads made of polystyrene or the like, or a commercially available 96-well microtiter plate, and reacted with the culture supernatant of the hybridoma.
  • a secondary antibody labeled with an enzyme is reacted.
  • the target antibody that reacts with the sensitizing antigen is contained in the culture supernatant, the secondary antibody binds to the carrier via this antibody.
  • By detecting the secondary antibody that finally binds to the carrier it can be determined whether the antibody of interest is present in the culture supernatant.
  • substantially the same DLL3 protein can be preferably used as the antigen, including those used for immunization.
  • cell lines that express DLL3, soluble DLL3, and the like can be used as antigens.
  • a target antibody can be obtained by sensitizing human lymphocytes with an antigen.
  • human lymphocytes are first sensitized with DLL3 protein in vitro.
  • the immunized lymphocytes are then fused with an appropriate fusion partner.
  • the fusion partner for example, a myeloma cell derived from human and having a permanent division ability can be used (see Japanese Patent Publication No. 1-59878).
  • anti-DLL3 can be obtained by administering an antigenic DLL3 protein to a transgenic animal having the entire repertoire of human antibody genes or by immunizing with DNA constructed to express DLL3 in the animal.
  • Human antibodies can also be obtained.
  • Antibody-producing cells of the immunized animal can be immortalized by treatment such as cell fusion with an appropriate fusion partner or Epstein-Barr virus infection. From the immortalized cells thus obtained, a human antibody against DLL3 protein can be isolated (see International Publications WO 94/25585, WO 93/12227, WO 92/03918, WO 94/02602). Further, by cloning the immortalized cells, it is possible to clone cells that produce an antibody having the desired reaction specificity. When a transgenic animal is used as an immunized animal, the immune system of the animal recognizes human DLL3 as a foreign substance. Therefore, a human antibody against human DLL3 can be easily obtained.
  • the hybridoma producing the monoclonal antibody produced as described above can be subcultured in a normal culture solution.
  • the hybridoma can also be stored for a long time in liquid nitrogen.
  • the target monoclonal antibody can be obtained from a culture supernatant obtained by culturing a hybridoma according to a conventional method.
  • a hybridoma can be administered to a mammal compatible therewith to proliferate and a monoclonal antibody can be obtained as its ascites.
  • the former method is suitable for obtaining a highly pure antibody.
  • cDNA encoding the variable region of an anti-DLL3 antibody can be obtained from a hybridoma cell that produces the anti-DLL3 antibody.
  • total RNA is extracted from the hybridoma.
  • the following method can be used. ⁇ Guanidine ultracentrifugation (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry (1979) 18, 5294-5299) AGPC method (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. (1987) 162, 156-159).
  • Extracted mRNA can be purified using mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) or the like. Alternatively, kits for extracting total mRNA directly from cells such as QuickPrep mRNA Purification Kit (manufactured by GE Healthcare Bioscience) are also commercially available. Using such a kit, total mRNA can also be obtained from the hybridoma. From the obtained mRNA, cDNA encoding the antibody variable region can be synthesized using reverse transcriptase. At that time, an arbitrary 15-30 base sequence selected from sequences common to antibody genes can be used as a primer.
  • cDNA can be synthesized by AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit (manufactured by Seikagaku Corporation).
  • AMV Reverse Transcriptase First-strand cDNA Synthesis Kit manufactured by Seikagaku Corporation.
  • 5'-Ampli FINDER RACE Kit (Clontech)
  • 5'-RACE method using PCR Frohman, M.A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1988) 85, 8998-9002, Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. (1989) 17, 2919-2932
  • appropriate restriction enzyme sites described later can be introduced at both ends of the cDNA.
  • the desired cDNA fragment is purified from the obtained PCR product and then ligated with vector DNA.
  • a recombinant vector is produced, introduced into Escherichia coli or the like and a colony is selected, a desired recombinant vector can be prepared from Escherichia coli that has formed the colony. Then, the base sequence of the cDNA can be confirmed by a known method such as the dideoxynucleotide chain termination method.
  • a cDNA library can be used to obtain a gene encoding the variable region of an antibody.
  • cDNA is synthesized using mRNA extracted from antibody-producing cells as a template to obtain a cDNA library. It is convenient to use a commercially available kit for the synthesis of the cDNA library. Actually, the amount of mRNA obtained from only a small number of cells is extremely small, and the yield is low when it is directly purified. Therefore, mRNA is usually purified after adding carrier RNA that is apparently free of antibody genes. Alternatively, when a certain amount of RNA can be extracted from antibody-producing cells, it can be extracted efficiently without adding carrier RNA. For example, carrier RNA may not be necessary for RNA extraction from 10 or more, 30 or more, preferably 50 or more antibody-producing cells.
  • Antibody gene is amplified by PCR using the obtained cDNA library as a template.
  • Primers for amplifying antibody genes by PCR are known.
  • primers for human antibody gene amplification can be designed based on the disclosure of a paper (J. Mol. Biol. (1991) 222, 581-597). These primers have different base sequences for each immunoglobulin subclass. Therefore, when a cDNA library whose subclass is unknown is used as a template, PCR is performed by selecting primers in consideration of all possibilities.
  • a primer capable of amplifying genes encoding ⁇ 1 to ⁇ 5 as a heavy chain and ⁇ chain and ⁇ chain as a light chain may be used. it can.
  • a primer that anneals to a portion corresponding to the hinge region is generally used as the 3′-side primer.
  • a primer corresponding to each subclass can be used as the 5′-side primer.
  • PCR products using primers for gene amplification of heavy and light chain subclasses should be independent libraries.
  • an immunoglobulin comprising a combination of a heavy chain and a light chain can be reconstructed.
  • the target antibody can be screened using the binding activity of the reconstituted immunoglobulin to DLL3 as an index.
  • an anti-DLL3 antibody the cloned antibody gene is incorporated into an expression vector so as to be expressed under the control of an expression control region.
  • An expression control region for expressing an antibody includes, for example, an enhancer and a promoter. Subsequently, by transforming an appropriate host cell with this expression vector, a recombinant cell expressing a DNA encoding an anti-DLL3 antibody can be obtained.
  • DNAs encoding antibody heavy chains and light chains can be incorporated into separate expression vectors.
  • a vector in which a heavy chain and a light chain are incorporated into the same host cell at the same time an antibody molecule having a heavy chain and a light chain can be expressed.
  • host cells may be transformed by incorporating DNAs encoding heavy and light chains into a single expression vector (see International Publication WO 94/11523).
  • a host and an expression vector for producing an antibody by introducing an isolated antibody gene into a suitable host are known. Any of these expression systems can be applied to the present invention.
  • animal cells, plant cells, or fungal cells can be used. Specifically, the following cells can be exemplified as animal cells that can be used in the present invention.
  • Mammalian cells CHO, COS, myeloma, BHK (baby hamster kidney), Hela, Vero, HEK293, Ba / F3, HL-60, Jurkat, SK-HEP1, etc.
  • Amphibian cells Xenopus oocytes, etc.
  • Insect cells sf9, sf21, Tn5, etc.
  • Nicotiana As plant cells, antibody gene expression systems using cells from the genus Nicotiana such as Nicotiana tabacum are known. Callus cultured cells can be used for transformation of plant cells.
  • Yeast Saccharomyces genus such as Saccharomyces serevisiae, Pichia genus such as methanol-utilizing yeast (Pichia pastoris), Filamentous fungi: Aspergillus genus such as Aspergillus niger.
  • antibody gene expression systems using prokaryotic cells are also known.
  • bacterial cells such as E. coli and Bacillus subtilis can be used in the present invention.
  • the promoter / enhancer can include human cytomegalovirus immediate early promoter / enhancer.
  • a promoter / enhancer derived from a mammalian cell such as a viral promoter / enhancer or human elongation factor 1 ⁇ (HEF1 ⁇ ) can be used for antibody expression.
  • viruses that can utilize promoters / enhancers include retroviruses, polyomaviruses, adenoviruses, and simian virus 40 (SV40).
  • the method of Mulligan et al. (Nature (1979) 277, 108) can be used. Further, the HEF1 ⁇ promoter / enhancer can be easily used for target gene expression by the method of Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. (1990) 18, 5322).
  • the signal sequence of the antibody heavy chain gene or light chain gene is desirable to use as the signal sequence required for secretion outside the cell. It is also possible to use signal sequences possessed by secreted proteins such as IL-3 and IL-6.
  • the gene can be expressed by functionally combining a commonly used useful promoter, a signal sequence for antibody secretion, and an antibody gene to be expressed.
  • the promoter include lacZ promoter and araB promoter.
  • the lacZ promoter the method of Ward et al. (Nature (1989) 341, 544-546; FASEBJ. (1992) 6, 2422-2427) can be used.
  • the araB promoter can be used for expression of the target gene by the method of Better et al. (Science (1988) 240, 1041-1043).
  • the pelB signal sequence (Lei, S. P. et al., J. Bacteriol. (1987) 169, 4379) may be used when it is produced in the periplasm of E. coli. Then, after separating the antibody produced in the periplasm, the structure of the antibody is refolded so as to have a desired binding activity by using a protein denaturant such as urea or guanidine hydrochloride.
  • a selectable marker can be inserted into the expression vector for amplification of the gene copy number in the host cell system.
  • a selection marker such as an aminoglycoside phosphotransferase (APH) gene, a thymidine kinase (TK) gene, an E. coli xanthine guanine phosphoribosyltransferase (Ecogpt) gene, a dihydrofolate reductase (dhfr) gene, etc. can be used. it can.
  • Obtaining antibodies from host cells These expression vectors are introduced into host cells, and then transformed host cells are cultured in vitro or in vivo to produce the desired antibodies.
  • Host cells are cultured according to a known method. For example, DMEM, MEM, RPMI1640, and IMDM can be used as the culture medium, and serum supplements such as fetal calf serum (FCS) can be used in combination.
  • FCS fetal calf serum
  • the antibody expressed and produced as described above can be purified by using a known method used in normal protein purification alone or in combination as appropriate.
  • antibodies can be separated and purified by appropriately selecting and combining affinity columns such as protein A columns, chromatography columns, filters, ultrafiltration, salting out, dialysis, etc. (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).
  • the present invention provides a gene encoding the antibody of the present invention. Furthermore, the present invention provides a vector containing the gene. The present invention further provides a host cell carrying the vector. Furthermore, the present invention provides a method for producing an antibody encoded by the gene, comprising the step of culturing the host cell.
  • transgenic animals can also be used for the production of recombinant antibodies. That is, the target antibody can be obtained from an animal into which a gene encoding the target antibody has been introduced.
  • an antibody gene can be constructed as a fusion gene by inserting in frame into a gene that encodes a protein that is uniquely produced in milk.
  • a protein secreted into milk for example, goat ⁇ -casein can be used. The DNA fragment containing the fusion gene into which the antibody gene has been inserted is injected into a goat embryo, and the injected embryo is introduced into a female goat.
  • the desired antibody can be obtained as a fusion protein with milk protein from the milk produced by the transgenic goat (or its offspring) born from the goat that received the embryo.
  • hormones can be used as appropriate in transgenic goats to increase the amount of milk containing the desired antibody produced from the transgenic goat (Ebert, KM et al., Bio / Technology (1994) 12, 699-702 ).
  • the anti-DLL3 antibody Since the pharmaceutical composition DLL3 is highly expressed in cancer tissues of small cell lung cancer, the anti-DLL3 antibody has a cytotoxic activity specific to cancer cells. Accordingly, anti-DLL3 antibodies are useful for the treatment of cancers that express DLL3.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition containing an antibody that binds to DLL3 protein as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition is a cytostatic agent, particularly an anticancer agent.
  • the cell growth inhibitor and anticancer agent of the present invention are preferably administered to a subject suffering from or possibly suffering from cancer.
  • the anti-DLL3 antibody used in the pharmaceutical composition (for example, anticancer agent) of the present invention is not particularly limited, and for example, any of the anti-DLL3 antibodies described above can be used.
  • containing an antibody that binds to DLL3 as an active ingredient means that the anti-DLL3 antibody is contained as a main active ingredient, and does not limit the content of the anti-DLL3 antibody.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may contain an anti-DLL3 antibody bound with a cytotoxic substance as an active ingredient.
  • the pharmaceutical composition can be used, for example, as a cell growth inhibitor, particularly as an anticancer agent.
  • the cell growth inhibitor and anticancer agent of the present invention are preferably administered to a subject suffering from or possibly suffering from cancer.
  • containing an anti-DLL3 antibody bound with a cytotoxic substance as an active ingredient means that the anti-DLL3 antibody bound with a cytotoxic substance is included as a main active ingredient, and is cytotoxic. It does not limit the content of anti-DLL3 antibody bound by the substance.
  • the target cancer is not particularly limited, but is preferably lung cancer, particularly small cell lung cancer.
  • the cancer may be either a primary lesion or a metastatic lesion.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be administered to a patient by either oral or parenteral administration. Preferably, it is parenteral administration. Specific examples of such administration methods include injection administration, nasal administration, transpulmonary administration, and transdermal administration.
  • injection administration the pharmaceutical composition of the present invention can be administered systemically or locally by, for example, intravenous injection, intramuscular injection, intraperitoneal injection, subcutaneous injection and the like.
  • the administration method can be appropriately selected depending on the age and symptoms of the patient.
  • the dosage for example, the dosage can be selected in the range of 0.0001 mg to 1000 mg per kg body weight per administration. Alternatively, for example, the dose can be selected in the range of 0.001 to 100,000 mg per patient.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not limited to these doses.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be formulated in accordance with a conventional method (for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA) and contains both pharmaceutically acceptable carriers and additives. It may be.
  • a conventional method for example, Remington's Pharmaceutical Science, latest edition, Mark Publishing Company, Easton, USA
  • pharmaceutically acceptable carriers and additives It may be.
  • it is not limited to these, and other commonly used carriers can be used as appropriate.
  • silicic acid lactose, crystalline cellulose, mannitol, starch, carmellose calcium, carmellose sodium, hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyvinylacetal diethylaminoacetate, polyvinylpyrrolidone, gelatin, medium chain fatty acid triglyceride
  • the carrier include polyoxyethylene hydrogenated castor oil 60, sucrose, carboxymethylcellulose, corn starch, and inorganic salts.
  • the anti-DLL3 antibody of the present invention can cause damage to DLL3-expressing cells or suppress cell proliferation by contacting with DLL3-expressing cells. Such utilization is also within the scope of the present invention.
  • the antibody used is not particularly limited, and for example, any of the antibodies described above can be used.
  • the cell to which the anti-DLL3 antibody binds is not particularly limited as long as DLL3 is expressed.
  • Preferred DLL3 expressing cells in the present invention are cancer cells. More preferred are lung cancer cells, especially small cell lung cancer cells.
  • contact is performed, for example, by adding an antibody to a culture solution of DLL3-expressing cells cultured in a test tube.
  • contact is also performed by administering to a non-human animal transplanted with DLL3 expressing cells into the body or an animal having cancer cells that endogenously express DLL3.
  • the following method is preferably used as a method for evaluating or measuring the cytotoxicity caused to the DLL3-expressing cells by the contact with the anti-DLL3 antibody.
  • Examples of a method for evaluating or measuring the cytotoxic activity in a test tube include the above-described measuring methods such as ADCC activity and CDC activity. Whether an anti-DLL3 antibody has ADCC activity or CDC activity can be measured by a known method (for example, Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E , Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., (1993)).
  • an antibody having the same isotype as the anti-DLL3 antibody that does not bind to the cells as a control antibody is used in the same manner as the anti-DLL3 antibody, and the anti-DLL3 antibody has a stronger cytotoxic activity than the control antibody. Can be determined to have activity.
  • Antibody isotype is defined by the heavy chain constant region sequence of the amino acid sequence of the antibody. In vivo, the antibody isotype is finally determined by class switching caused by genetic recombination on the chromosome that occurs during maturation of antibody-producing B cells. Differences in isotypes are reflected in differences in the physiological and pathological functions of antibodies. Specifically, for example, it is known that the intensity of cytotoxic activity is influenced by the antibody isotype as well as the antigen expression level. Therefore, in the measurement of the cytotoxic activity described above, it is preferable to use the same isotype as the test antibody as the antibody used as a control.
  • the test antibody in order to evaluate or measure the cytotoxic activity in vivo, for example, after transplanting DLL3-expressing cancer cells intradermally or subcutaneously in a non-human test animal, the test antibody is administered daily or at intervals of several days from that day or the next day. Administer intravenously or intraperitoneally. Cytotoxic activity can be determined by measuring tumor size over time. Similar to the in vitro evaluation, a control antibody having the same isotype was administered, and cytotoxic activity was observed when the tumor size in the anti-DLL3 antibody administration group was significantly smaller than the tumor size in the control antibody administration group. Then it can be determined.
  • a nude (nu / nu) mouse in which the thymus is genetically deleted and the function of the T lymphocyte is deleted can be preferably used.
  • the mouse it is possible to eliminate the involvement of T lymphocytes in the test animal in the evaluation and measurement of the cytotoxic activity by the administered antibody.
  • the present invention also provides a method for diagnosing cancer, comprising detecting DLL3 protein or a gene encoding DLL3 protein.
  • DLL3 has been confirmed to significantly increase expression in cancer tissues or cancer cell lines. Therefore, DLL3 is useful as a marker for specifically detecting cancer.
  • One specific example of the diagnostic method of the present invention is a cancer diagnostic method including the following steps. (a) providing a sample isolated from a subject; (b) A step of detecting the expression level of DLL3 protein or DLL3 gene in the sample.
  • Detection of DLL3 protein or gene encoding DLL3 protein is diagnosed by detecting DLL3 protein in a sample. Detection of DLL3 protein is preferably performed using an antibody that recognizes DLL3 protein.
  • detection includes quantitative or qualitative detection.
  • qualitative detection can include the following measurements. ⁇ Measurement of whether or not DLL3 protein is present ⁇ Measurement of whether or not DLL3 protein is present in a certain amount or more ⁇ Measurement of comparing the amount of DLL3 protein with other samples (for example, control samples)
  • quantitative detection includes measurement of the concentration of DLL3 protein, measurement of the amount of DLL3 protein, and the like.
  • the test sample in the present invention is not particularly limited as long as it may contain DLL3 protein.
  • a sample collected from the body of a living organism such as a mammal is preferable. Further preferred samples are samples taken from humans. Specific examples of the test sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, tissue, and the like.
  • a preferred sample is a sample obtained from a test sample such as a specimen in which tissue or cells collected from the body of an organism are fixed, or a culture solution of cells.
  • the cancer diagnosed by the present invention is not particularly limited and may be any cancer. Specific examples include lung cancer, particularly small cell lung cancer. In the present invention, both primary lesions and metastatic lesions can be diagnosed.
  • the present invention when a protein is detected in a test sample, cancer is diagnosed using the level as an index. Specifically, when the amount of DLL3 protein detected in a test sample is large compared to a negative control or a healthy subject, the subject is likely to have cancer or suffer from cancer in the future. It is shown. That is, the present invention relates to a method for diagnosing cancer including the following steps.
  • the control refers to a sample serving as a reference for comparison, and includes a negative control and a biological sample of a healthy person.
  • the negative control can be obtained by collecting a biological sample of a healthy person and mixing as necessary.
  • the control expression level of DLL3 can be detected in parallel with the expression level of DLL3 in the biological sample of the subject.
  • the expression level of DLL3 in biological samples of a large number of healthy subjects can be detected in advance, and the standard expression level in healthy subjects can be statistically determined. Specifically, for example, an average value ⁇ 2 ⁇ standard deviation (S.D.) or an average value ⁇ 3 ⁇ standard deviation (S.D.) can be used as the standard value.
  • the mean ⁇ 2 ⁇ standard deviation (S.D.) contains 80% and the mean ⁇ 3 ⁇ standard deviation (S.D.) contains 90% of healthy subjects.
  • the expression level of DLL3 in the control can be set using the ROC curve.
  • the ROC curve (receiver operating characteristic curve) is a graph showing the detection sensitivity on the vertical axis and the false positive rate (that is, “1-specificity”) on the horizontal axis.
  • an ROC curve can be obtained by plotting changes in sensitivity and false positive rate when the reference value for determining the expression level of DLL3 in a biological sample is continuously changed.
  • the “reference value” for obtaining the ROC curve is a numerical value temporarily used for statistical analysis.
  • the “reference value” for obtaining the ROC curve is generally changed continuously within a range that can cover all selectable reference values. For example, the reference value can be changed between the minimum and maximum measured values of DLL3 of the population to be analyzed.
  • a standard value statistically set by an ROC curve or the like is also called a cut-off value.
  • the expression level of DLL3 detected in (1) is compared with the cut-off value in the step (2).
  • the expression level of DLL3 detected in (1) is higher than the cut-off value, the subject's cancer is detected.
  • the expression level of DLL3 can be determined by any method. Specifically, the expression level of DLL3 can be determined by evaluating the amount of DLL3 mRNA, the amount of DLL3 protein, or the biological activity of DLL3 protein. The amount of DLL3 mRNA or protein can be determined by a method as described herein.
  • a particularly suitable subject is a human.
  • DLL3 protein of the animal species is detected.
  • DLL3 protein contained in a test sample is not specifically limited, It is preferable to detect by the immunological method as illustrated below using an anti-DLL3 antibody.
  • Enzyme-linked immunosorbent assay ELISA
  • Radioimmunoassay RIA
  • Enzyme immunoassay EIA
  • Fluorescence immunoassay FIA
  • Luminescent immunoassay LIA
  • Immunoprecipitation IP
  • Immunoturbidimetry TAB
  • WB Western blot
  • IHC Immunohistochemistry
  • SRID Immunodiffusion
  • the immunohistochemistry (IHC) method includes a step of detecting DLL3 protein on a section on which tissue or cells obtained from a patient suffering from cancer is immobilized, and is preferable as a method for diagnosing cancer.
  • One of the immunological assay methods One of the immunological assay methods.
  • the immunological methods described above, such as the immunohistochemistry (IHC) method, are methods known to those skilled in the art.
  • DLL3 is a membrane protein whose expression is specifically enhanced in cancer cells
  • cancer cells or cancer tissues can be detected with an anti-DLL3 antibody.
  • cancer tissue in a living body can be detected with an anti-DLL3 antibody.
  • this method comprises (1) a step of administering an antibody binding to a DLL3 protein labeled with a labeling substance such as a radioisotope to a subject, and (2) detecting the accumulation of the labeling substance.
  • the antibodies can be detectably labeled.
  • the behavior of a fluorescent substance, a luminescent substance, or an antibody labeled with a radioisotope in a living body can be traced.
  • An antibody labeled with a fluorescent substance or a luminescent substance can be observed using an endoscope or a laparoscope.
  • a radioisotope can image the localization of an antibody by following its radioactivity.
  • the localization of the anti-DLL3 antibody in vivo indicates the presence of cancer cells.
  • a positron emitting nuclide can be used as a radioisotope for labeling an antibody to detect cancer in vivo.
  • antibodies can be labeled with positron emitting nuclides such as 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr, and 124I.
  • a known method Acta Oncol. 32, 825-830, 1993 can be used for labeling the anti-DLL3 antibody with these positron emitting nuclides.
  • the radiation emitted by the radionuclide is measured from outside the body by PET (positron tomography) and converted into an image by computer tomography. Is done.
  • PET is a device for non-invasively obtaining data on the behavior of a drug in the body. With PET, radiation intensity can be quantitatively imaged as signal intensity.
  • antigen molecules highly expressed in a specific cancer can be detected without collecting a sample from a patient.
  • the anti-DLL3 antibody can be radiolabeled with a short-lived nuclide using a positron emitting nuclide such as 11C, 13N, 15O, 18F, and 45Ti in addition to the above-mentioned nuclide.
  • a positron emitting nuclide such as 11C, 13N, 15O, 18F, and 45Ti in addition to the above-mentioned nuclide.
  • anti-DLL3 antibodies can be labeled with various radioisotopes.
  • the anti-DLL3 antibody administered to the patient accumulates in the primary and metastatic lesions according to the specificity of the anti-DLL3 antibody for the pathological tissue at each site. If the anti-DLL3 antibody is labeled with a positron emitting nuclide, the presence of the primary and metastatic lesions is detected by the localization of the radioactivity by detecting the radioactivity.
  • 25-4000 keV gamma particles or positron emission activity values can be used appropriately.
  • therapeutic effects can be expected by selecting appropriate nuclides and administering them in larger amounts.
  • a gamma particle of 70-700 keV or a nuclide that gives a positron emission value can be used.
  • the expression of a DLL3 polynucleotide is detected.
  • the polynucleotide detected in the present invention is not particularly limited, but mRNA is preferable.
  • detection includes quantitative or qualitative detection. For example, the following measurement operation can be given as qualitative detection. -Simply measuring whether DLL3 mRNA is present, ⁇ Measure whether or not there is more than a certain amount of DLL3 mRNA, -Measurements comparing the amount of DLL3 mRNA with other samples (eg, control samples).
  • quantitative detection includes measurement of DLL3 mRNA concentration, measurement of DLL3 mRNA amount, and the like.
  • test sample in the present invention any sample that may contain DLL3 mRNA can be used.
  • a sample collected from the body of a living organism such as a mammal is preferable, and a sample collected from a human is more preferable.
  • Specific examples of the test sample include blood, interstitial fluid, plasma, extravascular fluid, cerebrospinal fluid, synovial fluid, pleural fluid, serum, lymph fluid, saliva, urine, tissue, and the like.
  • a preferable sample includes a sample obtained from a test sample, such as a specimen in which tissues or cells collected from the body of an organism are fixed, or a culture solution of cells, and the like.
  • an in situ hybridization method is preferably used.
  • the in situ hybridization method has been developed as a method for confirming the presence or distribution of specific DNA or RNA in cells or tissues and the intensity of its expression. In principle, this utilizes the property that a probe nucleic acid having a base sequence complementary to a specific nucleic acid sequence in a cell specifically forms a complex.
  • RI radioisotope
  • hapten antigenic substance
  • an RI label can be preferably used.
  • a fluorescent label using a non-radioactive material such as biotin or hapten such as digoxigenin can be used.
  • a detection method by fluorescence in situ hybridization called FISH is used.
  • the cancer diagnosed by the present invention is not particularly limited. Specific examples include lung cancer, particularly small cell lung cancer. In the present invention, both primary lesions and metastatic lesions can be diagnosed.
  • any animal species expressing the DLL3 gene can be used as the subject.
  • a particularly suitable subject is a human.
  • the DLL3 gene of the animal species is detected.
  • a sample is prepared from a subject.
  • the mRNA of DLL3 contained in the sample is detected.
  • cDNA synthesized from mRNA can also be detected.
  • the test sample it is determined that there is a possibility of cancer. For example, if the amount of DLL3 mRNA detected in a test sample or cDNA encoding DLL3 is high compared to a negative control or a healthy person, the test subject has cancer or will suffer from future cancer. It is shown that there is a high probability of
  • Methods for detecting mRNA are known. Specifically, for example, a nucleic acid hybridization method using an immobilized sample selected from a gene chip, a cDNA array, and a membrane filter, an RT-PCR method, a real-time PCR method, a subtraction method, a differential display method, a differential high method. Hybridization methods, cross-hybridization methods, and the like can be used in the present invention.
  • the detection method of the present invention described above can be automated using various automatic inspection apparatuses. By automation, a large number of samples can be inspected in a short time.
  • Kit for Diagnosing Cancer also provides a diagnostic agent or kit for diagnosing cancer comprising a reagent for detecting DLL3 protein in a test sample.
  • the diagnostic agent of the present invention contains at least an anti-DLL3 antibody.
  • kits for diagnosing cancer can be obtained by combining the diagnostic reagent for cancer of the present invention with other elements used for detection of DLL3. That is, the present invention includes a kit for diagnosing cancer, which comprises an antibody that binds to DLL3, a reagent for detecting the binding between the antibody and DLL3, and may further comprise a control sample comprising a biological sample containing DLL3. About.
  • the kit of the present invention may further include instructions for explaining the measurement operation.
  • DLL3 delta-like 3 transcriptional enhancement in small cell lung cancer
  • the tumor part of 13 small cell lung cancer excised tissues, 3 types of small cell lung cancer cell lines, and 49 normal tissues (Clontech, Ambion, STATAGENE, Cell APPLICATIONS, Panomics, CHEMICON And purchased from BioChain Institute).
  • Trizol Invitrogen
  • Example 2 cDNA cloning and preparation of recombinant cells
  • pMCN can express a foreign gene under a mouse CMV promoter (GenBank: U68299).
  • the pMCN vector has a geneticin resistance gene.
  • CHO cell line DG44 Invitrogen
  • Drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • Cloned cells that stably express human DLL3 protein were selected with a commercially available anti-DLL3 antibody (R & D Systems, MAB4315) to establish human DLL3 / DG cells.
  • mouse DLL-3 dependent pro B cell line Ba / F3 was transformed with a human DLL3 expression vector to establish human DLL3 / BaF3 cells.
  • the mouse DLL3 cDNA (NM — 007866) represented by SEQ ID NOs: 2 and 58 was PCR amplified from a mouse fetal cDNA library and cloned into the mammalian expression vector pMCN.
  • the cell line Ba / F3 was transformed with a mouse DLL3 expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • Mouse DLL3 protein-expressing cells were selected with commercially available antibodies (R & D Systems, MAB4315) to establish mouse DLL3 / BaF3 cells.
  • the human DLL1 cDNA (NM — 005618) represented by SEQ ID NOs: 3 and 59 was PCR amplified from a human spleen cDNA library and cloned into the mammalian expression vector pMCN.
  • the cell line Ba / F3 was transformed with a human DLL1 expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • Human DLL1 protein-expressing cells were selected with a commercially available antibody (R & D Systems, MAB1818) to establish human DLL1 / BaF3 cells.
  • the human Notch1 cDNA (NM — 017617) represented by SEQ ID NOs: 4 and 60 was PCR amplified from the breast cancer cell line DU4475 cDNA library and cloned into the mammalian expression vector pMCN.
  • Cell line DG44 was transformed with a human Notch1 expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • Human Notch1 protein-expressing cells were selected with a commercially available antibody (GeneTex, GTX23294) to establish human Notch1 / DG44 cells.
  • Human DLL3 extracellular sequence is Notch receptor binding motif DSL domain (amino acid sequence number 176-215), 6 EGF-like domains (1: 216-249, 2: 274-310, 3: 312-351, 4: 353 -389, 5: 391-427, 6: 429-465).
  • a cDNA encoding a chimeric molecule human DLL3-Fc (SEQ ID NO: 5) consisting of human DLL3 extracellular region (SEQ ID NO: 1 amino acid sequence 27-492) and mouse IgG2a antibody constant region sequence was prepared, and mammalian expression vector pMCN Cloned into.
  • Cell line DG44 was transformed with a human DLL3-Fc expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • a clone highly expressing human DLL3-Fc protein was selected by ELISA using an anti-mouse antibody to establish human DLL3-Fc-producing DG44 cells.
  • a cDNA encoding a chimeric molecule human DLL3delta1-Fc (SEQ ID NO: 6) consisting of a partial sequence of human DLL3 extracellular region (SEQ ID NO: 1 amino acid sequence 176-492) and mouse IgG2a antibody constant region sequence is prepared and expressed in mammals Cloned into vector pMCN.
  • Cell line DG44 was transformed with the human DLL3delta1-Fc expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • a clone highly expressing human DLL3delta1delta1-Fc protein was selected by ELISA using an anti-mouse antibody to establish human DLL3delta1-Fc-producing DG44 cells.
  • a cDNA encoding a chimeric molecule human DLL3delta2-Fc (SEQ ID NO: 7) consisting of human DLL3 extracellular region partial sequence (SEQ ID NO: 1 amino acid sequence 216-492) and mouse IgG2a antibody constant region sequence was prepared and expressed in mammals Cloned into vector pMCN.
  • Cell line DG44 was transformed with a human DLL3delta2-Fc expression vector, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • a clone highly expressing the human DLL3delta1delta2-Fc protein was selected by ELISA using an anti-mouse antibody to establish human DLL3delta2-Fc-producing DG44 cells.
  • a cDNA encoding a chimeric molecule human DLL3-Fc (SEQ ID NO: 8) consisting of a mouse DLL3 extracellular region (SEQ ID NO: 2 amino acid sequence 33-490) and a mouse IgG2a antibody constant region sequence was prepared, and the mammalian expression vector pMCN Cloned into.
  • Cell line DG44 was transformed with a mouse DLL3-Fc expression vector, and drug-resistant cells were selected in the presence of geneticin.
  • a clone highly expressing mouse DLL3-Fc protein was selected by ELISA using an anti-mouse antibody to establish mouse DLL3-Fc-producing DG44 cells.
  • the target protein was purified using Protein G affinity column chromatography and gel filtration chromatography.
  • the purified protein concentration was determined by a DC protein assay (BioRad) using a known concentration of IgG as a standard.
  • mice Acquisition of anti-DLL3 antibody, analysis of epitope and antibody internalization Balb / c (Charles River Japan) and MRL / MpJJmsSlc-lpr / lpr (Japan SLC) mice were immunized from 6 to 7 weeks of age went. At the time of the first immunization, an emulsion was prepared using Freund's complete adjuvant (Becton Dickinson), and the antigen protein was administered subcutaneously to 0.1 mg human DLL3-Fc / head.
  • Freund's complete adjuvant Becton Dickinson
  • an antigen emulsion prepared with Freund's incomplete adjuvant was prepared once a week for a total of 3-6 times and administered subcutaneously at a dose of 0.05 mg / head.
  • 0.05 mg of antigenic protein was intravenously administered to individual mice with increased serum antibody titers.
  • the spleen cells were excised, mixed with mouse myeloma cells P3-X63Ag8U1 (ATCC) at a cell number ratio of about 3: 1, and cell-fused by the polyethylene glycol (PEG) method.
  • IgG monoclonal antibody was purified from the established hybridoma culture supernatant by Protein G affinity column chromatography and desalting. Purified antibody concentration was determined by DC protein assay.
  • Human DLL3-Fc, mouse DLL3-Fc, human DLL3delta1-Fc, and human DLL3delta2-Fc were each solidified on a Nunc immunoplate (439454). Subsequently, the unreacted surface of the plate was blocked with a solution containing bovine serum albumin. After washing, an antibody dilution prepared to an appropriate concentration was added and incubated for 1 hour at room temperature. After removing the reaction solution from the plate and washing with TBS containing Tween 20, alkaline phosphatase-labeled anti-mouse IgK antibody was added to the plate and incubated for 1 hour. After washing the plate, the alkaline phosphatase substrate Sigma104 was added and incubated at room temperature.
  • FIG. 9 shows the structural outline of full-length DLL3 protein and soluble DLL3Fc fusion protein, and the recognition site of anti-DLL3 antibody.
  • FITC-labeled anti-mouse IgG (H + L) antibody (Beckman Coulter) was added and incubated at 4 ° C. for 30 minutes. After removing unreacted FITC antibody by centrifugation, the cells were resuspended and analyzed with a flow cytometer FACSCalibur (Becton Dickinson).
  • human DLL3 / BaF3 cells were suspended in a RPMI1640 culture medium containing 10% fetal bovine serum (FBS) and mouse IL3.
  • the mixture was mixed so that the monoclonal antibody had a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells / ml and a final concentration of 5 ⁇ g / ml, and reacted at 37 ° C. for 1 hour or 4 hours in a CO 2 incubator. After the reaction, the amount of antibody bound on the cell membrane was analyzed by flow cytometry in the same manner as described above.
  • the geometric mean value (X Geo Mean) of the fluorescence intensity of the cell histogram plot was determined using the analysis software CELLQuestPro attached to the FACSCalibur. All isolated anti-DLL3 monoclonal antibodies bound to DLL3 on the cells (FIG. 3 (a)).
  • the number of DLL3 proteins on the cell surface was determined using an antigen quantity quantitative analysis system QIFIKIT (DAKO, F0479) by flow cytometry.
  • An anti-DLL3 antibody DL303 having a final concentration of 5 ⁇ g / ml was used as a primary antibody, and analysis was performed according to the attached protocol.
  • the number of antigens on the cell surface of human DLL3 / BaF3, NCI-H1184 (ATCC), NCI-H1436 (ATCC), and Y79 (RIKEN Cell Bank) were about 9000, 7000, 6000, and 3000, respectively.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • ADCC induction activity was calculated by the following formula.
  • ADCC [%] (AC) / (BC) x 100
  • A is the fluorescence intensity in each well
  • B is the average fluorescence intensity in the supernatant lysed with 1% Nonidet P-40
  • C is the average fluorescence intensity when only the medium is added. Three points were measured under each experimental condition, and an average value and a standard deviation were calculated.
  • FIG. 4 shows ADCC-inducing activity against DLL3 / BaF3 cells when an antibody is added at a final concentration of 2.5 ⁇ g / ml.
  • the control antibodies IgG1 and IgG2b did not show ADCC activity
  • DL301, DL306, and DL312 showed ADCC-inducing activity.
  • FIG. 5 shows that DL301, DL306, D312 antibodies induce ADCC in a dose-dependent manner against DLL3 / BaF3 and NCI-H1184.
  • the uptake of the anti-DLL3 monoclonal antibody into the cells was evaluated using a toxin-labeled anti-mouse secondary antibody Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems).
  • Mab-ZAP Advanced Targeting Systems
  • a 96-well plate was seeded with 5 ⁇ 10 3 DLL3 / BaF3 cells per well.
  • anti-DLL3 mouse monoclonal antibody and MabZAP were added to a final concentration of 1 ⁇ g / ml, and incubated at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • the cell proliferation was measured by adding the living cell count reagent SF (Nacalai Tesque) and measuring the absorbance at 450 nm and the control wavelength of 620 nm using a microplate reader (FIG. 6).
  • a microplate reader FIG. 6
  • anti-DLL3 monoclonal antibody and MabZAP were added to the cells, cell proliferation was suppressed.
  • DL301, DL306, and DL312, which have ADCC-inducing activity have a large amount of antibody remaining on the cells after mixing the antibody and DLL3-expressing cells and culturing at 37 ° C, and also suppress growth due to intracellular uptake of MabZAP complex The effect was low.
  • Example 5 Antibody variable region cloning and preparation of recombinant antibody A Smart 5'-RACE cDNA library (Clontech) was prepared from hybridoma total RNA producing an anti-DLL3 antibody. Total RNA preparation was performed using RNeasy Mini columns (Qiagen). The cDNA library was prepared according to the manufacturer's instructions. Antibody variable region sequences (VH, VL) were PCR amplified using primers complementary to the antibody constant region sequences. The PCR amplified fragment was cloned into pCR2.1TOPO and its nucleotide sequence was determined. A chimeric antibody expression vector composed of the obtained VH and VL sequences and a human IgG1 constant region sequence was constructed.
  • Both the light and heavy chains are incorporated into one mammalian cell expression vector, and both are transcribed under the mouse CMV promoter.
  • Table 1 shows the correspondence between the identified antibody variable region sequences and their CDR sequences, mouse antibody full-length sequences, and chimeric antibody sequence SEQ ID NOs.
  • a chimeric antibody expression vector was introduced into COS-7 cells to transiently express the chimeric antibody. It was confirmed by flow cytometry and ELISA that the chimeric antibody in the COS-7 culture supernatant bound to the human DLL3 protein. The concentration of the chimeric antibody in the COS-7 culture supernatant was calculated by sandwich ELISA. At this time, a human chimeric antibody having a known concentration was used as a standard for concentration calculation. A chimeric antibody was added to human DLL3 / BaF3 cells suspended in FACS buffer (PBS containing 1% fetal bovine serum) to a final concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • FACS buffer PBS containing 1% fetal bovine serum
  • the alkaline phosphatase-labeled anti-human antibody Biosource, AHI0305
  • the alkaline phosphatase substrate Sigma104 were sequentially added after the addition of the chimeric antibody, and the absorbance was determined.
  • DL301, DL309, and DL312 chimeric antibodies bound to human DLL3-Fc in a dose-dependent manner (FIG. 8 (a)).
  • Example 6 Epitope grouping by competitive ELISA The binding competition between the chimeric antibody and the mouse antibody for the antigen molecule was analyzed by ELISA (Fig. 8 (b)). 10 ng of human DLL3-Fc per well was added to the Nunc immunoplate and solidified. A mixture of chimeric antibody at a final concentration of 50 ng / ml and appropriately diluted mouse antibody was added to the DLL3-Fc protein solidified plate. The plate was incubated at room temperature for 1 hour, then washed and added with an alkaline phosphatase-labeled anti-human antibody and incubated. After incubation, Sigma104 was added and the absorbance was measured.
  • the binding of the chimeric antibody to the antigen molecule was competitive with that of the original mouse monoclonal antibody.
  • Antibodies other than DL301 mouse antibody did not inhibit the binding of DL301 chimeric antibody to antigen.
  • Antibodies other than DL312 mouse antibody did not inhibit the binding of DL312 chimeric antibody to antigen. Therefore, it was shown that DL301 and DL312 each bind to a unique epitope.
  • DL305, DL308, and DL309 mouse antibodies inhibited the binding of DL309 chimeric antibody to antigen to almost the same extent. Therefore, the epitopes of these three antibodies are considered to be the same.
  • the DL306 mouse antibody in which ADCC induction activity was observed did not inhibit the binding of DL301 chimeric antibody, DL309 chimeric antibody, DL312 chimeric antibody to the antigen. It was shown that DL306 recognizes an epitope independent of DL301, DL309, and DL312.
  • Example 7 Establishment of recombinant anti-DLL3 antibody expression strain and purification of recombinant antibody A DL306 chimeric antibody expression vector was introduced into COS-7 cells to transiently express the chimeric antibody. It was confirmed by flow cytometry that the chimeric antibody in the COS-7 culture supernatant bound to the human DLL3 protein. The concentration of the chimeric antibody in the COS-7 culture supernatant was calculated by sandwich ELISA. At this time, a human chimeric antibody having a known concentration was used as a standard for concentration calculation.
  • a chimeric antibody was added to human DLL3 / BaF3 cells suspended in FACS buffer (PBS containing 1% fetal bovine serum) to a final concentration of 1 ⁇ g / ml. Incubated for 30 minutes at 4 ° C., washed, reacted with FITC-labeled anti-human antibody (Beckman-Coulter), and analyzed for binding with a flow cytometer FACSCalibur. As shown in FIG. 10, the chimeric antibody DL306 bound to human DLL3 / BaF3 and did not bind to the parental Ba / F3 cell.
  • FACS buffer PBS containing 1% fetal bovine serum
  • Cell line DG44 was transformed with DL301, DL306, DL309, DL312 human chimeric antibody expression vectors, and drug resistant cells were selected in the presence of geneticin. Clones that highly express human chimeric antibodies were selected by ELISA using anti-human antibodies to establish human chimeric antibody-producing DG44 cells.
  • the target protein was purified from the culture supernatant of the human chimeric antibody-producing strain using rProtein A affinity column chromatography and gel filtration chromatography.
  • the purified protein concentration was determined by a DC protein assay (BioRad) using a known concentration of IgG as a standard.
  • a mouse IgG2a antibody expression vector consisting of DL301, DL306, DL312 VH and VL sequences and a mouse IgG2a constant region sequence was constructed. Both the light and heavy chains are incorporated into one mammalian cell expression vector, and both are transcribed under the mouse CMV promoter.
  • a CHO cell line (WO2005 / 017155) lacking the fucose transporter was transformed with a mouse IgG2a antibody expression vector, and drug-resistant cells were selected in the presence of geneticin. Clones that highly express mouse IgG2a antibody were selected by ELISA using anti-mouse IgG2a antibody to establish low-fucose mouse IgG2a antibody-producing CHO cells.
  • the target protein was purified from the culture supernatant of a low fucose mouse IgG2a antibody-producing strain using Protein G affinity column chromatography and gel filtration chromatography.
  • the purified protein concentration was determined by DC protein assay using a known concentration of IgG as a standard.
  • Example 8 Induction of ADCC activity by recombinant anti-DLL3 antibody The antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC) -inducing activity of human chimeric and mouse IgG2a recombinant anti-DLL3 antibodies against calcein-labeled DLL3-expressing cells was examined. By culturing human DLL3 / BaF3 expressing DLL3 and small cell lung cancer cell line NCI-H1184 (ATCC) in the presence of 20 ⁇ g / ml Calcein-AM (Dojindo, 349-07201) for 90 minutes, centrifuging and washing A target cell labeled with calcein was prepared.
  • ADCC antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity
  • a 96-well plate (Coster 3799) was seeded with 1 ⁇ 10 4 target cells. Subsequently, an antibody prepared to an appropriate final concentration was added and incubated at room temperature for 15 minutes. 5 ⁇ 10 4 effector cells were added to each well and the reaction plate was incubated at 37 ° C. in a CO 2 incubator.
  • NK92 cells expressing mouse Fc ⁇ R4 human Fc ⁇ R3 chimeric molecule (WO 2008/093688) were used as effector cells of low-fucose mouse IgG2a recombinant antibody.
  • NK92 cells expressing human Fc ⁇ R3 molecules were used as effector cells for human chimeric recombinant antibodies. After incubation for 4 hours, 100 ⁇ l of culture supernatant was collected from each well of the centrifuged plate, and the fluorescence intensity was measured using ARVO SX. ADCC induction activity was calculated by the method described in Example 4.
  • FIG. 11 shows that recombinant human chimeric antibodies DL301, DL306, DL309, D312 induce ADCC in a dose-dependent manner against DLL3 / BaF3 and NCI-H1184.
  • FIG. 12 shows that low-fucose recombinant mouse IgG2a antibodies DL301, DL306, D312 induce ADCC in a dose-dependent manner against DLL3 / BaF3 and NCI-H1184.

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Abstract

DLL3タンパク質に結合する抗体が開示される。好ましくは、本発明の抗体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトDLL3において、216番目のアミノ酸～492番目までのアミノ酸の領域を認識する。本発明はまた、本発明の抗体を有効成分として含む医薬組成物、例えば抗癌剤を提供する。さらに、本発明の抗体を用いて癌を診断する方法、ならびに本発明の抗体を含む癌の診断薬も開示される。

Description

抗DLL3抗体
　本出願は、日本特許出願２０１０－０１９３９１（２０１０年１月２９日出願）に基づく優先権を主張しており，この内容は本明細書に参照として取り込まれる。
　本発明は、抗癌剤ならびに癌の診断方法に関する。
　小細胞肺癌は肺癌のうち約20%をしめる。小細胞肺癌は進行がはやく、多くの症例では診断時に既にリンパ節転移や遠隔転移が認められるため、外科手術が難しい。抗癌剤に対して初期には高い感受性を示すことから、化学療法が第一選択の治療法として考えられている。しかし癌は化学療法耐性へと速やかに移行して再発し、その3年生存率は5%以下である。ゆえに新しい治療法が求められている。
　Delta-like　3(DLL3)はNotchリガンドファミリメンバーに属するI型膜蛋白質である。DLL3は正常な体節形成とパタニングに必要である。DLL3変異は常染色体劣性異常脊椎肋骨異形成症(spondylocostal　dysostosis)患者において肋骨欠損と脊椎分裂を引き起こす［非特許文献1,2］。DLL1が細胞表面に局在し、Notchに結合する一方で、DLL3は主にゴルジに局在し、Notchに結合しない［非特許文献3,4］。
　膵癌細胞株においてDLL3染色体遺伝子の増幅および遺伝子の発現亢進が起きていること［非特許文献5］、ならびに、一部のグリオーマでDLL3の発現亢進が起きていること［非特許文献6］を報告した先行研究が存在する。しかしながら、細胞表面上でのDLL3蛋白質数についての報告はない。細胞表面上の抗原分子を抗体でターゲッティング、抗体依存性細胞傷害活性を抗腫瘍メカニズムとして癌細胞を殺すためには、通常の抗体では105個以上の、ADCC誘導能を高めた低フコース化抗体でも104個オーダーの抗原分子の発現が必要である［非特許文献7］。したがって、DLL3が抗体を利用した治療標的として適切であるかどうかは不明である。
　研究試薬として、マウス抗DLL3モノクローナル抗体(MAB4315,　R&D　System)が既に市販されている。
Bulman,　M.P.　et　al.　(2000)　Nat　Genet　24,　438-441. Turnpenny,　P.D.　et　al.　(2003)　J　Med　Genet　40,　333-339. Geffers,　I.　et　al.　(2007)　J　Cell　Biol　178,　465-476. Ladi,　E.　et　al.　(2005)　J　Cell　Biol　170,　983-992. Phillips,　H.S.　(2006)　Cancer　Cell　9,157-173. Mulledndore,　M.E.　(2009)　Clin　Cancer　Res　15,　2291-2301. 設楽研也　(2009)　YAKUGAKU　ZASSHI　129,3-9.
　本発明は、新規抗体およびこれを用いた抗癌剤ならびに癌の診断方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、DLL3が小細胞肺癌でmRNA発現亢進していることを見出した。正常組織での発現は、胎児脳を除き、いずれも低かった。本発明者らはDLL3蛋白質に対するモノクローナル抗体を作製したが、抗体結合能として測定される細胞表面の抗原量は発現細胞あたりわずか104未満であった。しかし、細胞外ドメインC末端付近の特徴あるエピトープに結合し、細胞膜上のDLL3に結合して安定に存在する抗体は、意外にもADCC誘導活性をもつことを見出した。すなわち、本発明者らは抗腫瘍活性を有する抗体を選抜することに成功した。また、毒素を結合させた抗体は、DLL3発現細胞に細胞傷害を与える活性をもつことを見出した。以上の知見により、本発明者らは抗DLL3抗体が、DLL3を発現する原発性あるいは転移性の癌の診断、予防および治療に有効であることを見出して本発明を完成させた。
　本発明は、DLL3タンパク質に結合する抗体を提供する。好ましくは、本発明の抗体は細胞傷害活性を有する。特に好ましくは、細胞傷害活性は抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である。また好ましくは、本発明の抗体はインターナライズ活性を有する。また好ましくは、本発明の抗体には細胞傷害性物質が結合している。また好ましくは、本発明の抗体は、配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトDLL3において、216番目のアミノ酸～492番目までのアミノ酸の領域を認識する。
　別の観点においては、本発明は、以下のいずれかに記載のDLL3タンパク質に結合する抗体：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
（５）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（７）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（８）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１０）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１２）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体、
を提供する。
　さらに別の観点においては、本発明は、上述のいずれかの抗体を有効成分として含む医薬組成物を提供する。好ましくは、本発明の医薬組成物は抗癌剤である。特に好ましくは、抗癌剤は肺癌を対象とする。
　さらに別の観点においては、本発明は、以下の工程を含む癌の診断方法
(a)被験者から単離された試料を提供する工程、
(b)上記試料におけるDLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量を検出する工程、
を提供する。好ましくは、本発明の診断方法は肺癌を診断するためのものである。本発明はまた、上述のいずれかの抗体を含む癌の診断薬を提供する。
図１は、小細胞肺癌および胎児脳でのDLL3発現亢進を示す。 図２は、抗DLL3モノクローナル抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合を示す。 図３は、抗体の細胞膜上DLL3蛋白質への結合、細胞に結合した抗体のターンオーバーを示す。 図４は、抗DLL3抗体(濃度2.5μg/ml)によるADCC誘導を示す。 図５は、ターゲット細胞DLL3/BaF3(a)およびNCI-H1184(b)に対するADCC活性の抗体濃度依存性を示す。 図６は、抗DLL3抗体/トキシン標識した抗マウス2次抗体Mab-ZAPの取り込みによる細胞増殖抑制を示す。 図７は、組換え抗DLL3抗体の細胞表面上DLL3蛋白質への結合を示す。 図８は、組換え抗DLL3ヒトキメラ抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合およびマウスDLL3抗体による抗DLL3キメラ抗体の可溶型DLL3蛋白質への結合競合を示す。 図９は、全長および可溶型DLL3蛋白質の構造概要および抗DLL3抗体の認識部位を示す。 図１０は、組換え抗DLL3ヒトキメラ抗体DL306の細胞表面上DLL3蛋白質への結合を示す。 図１１は、ターゲット細胞DLL3/BaF3およびNCI-H1184に対する抗DLL3ヒトキメラ抗体のADCC活性の抗体濃度依存性を示す。 図１２は、ターゲット細胞DLL3/BaF3およびNCI-H1184に対する抗DLL3マウス低フコース化抗体のADCC活性の抗体濃度依存性を示す。
DLL3
　DLL3（Delta-like　3）のアミノ酸配列は公知であり、例えばヒトDLL3のアミノ酸配列は配列番号：１（NM＿016941）、マウスDLL3のアミノ酸配列は配列番号：２、（NM＿007866）に記載されている。
　本発明で使用されるDLL3タンパク質は上述の配列を有するDLL3タンパク質でもよいし、上述の配列において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。上述の配列において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体の例としては、上述のアミノ酸配列と70%以上の相同性を有するポリペプチド、好ましくは80%以上の相同性を有するポリペプチド、さらに好ましくは90%以上の相同性を有するポリペプチド、より好ましくは95%以上の相同性を有するポリペプチドを挙げることができる。又、これらのDLL3の部分ペプチドであってもよい。
　本発明で使用されるDLL3タンパク質の由来は限定されないが、ヒトDLL3タンパク質であることが好ましい。
抗DLL3抗体
　本発明で用いられる抗DLL3抗体は、DLL3タンパク質に結合すればよく、その由来、種類、形状などは特に限定されない。具体的には、非ヒト動物由来の抗体（例えば、マウス抗体、ラット抗体、ラクダ抗体）、ヒト由来のヒト抗体、キメラ抗体、ヒト化抗体などの抗体が使用できる。本発明において使用される抗DLL3抗体はポリクローナル抗体でもモノクローナル抗体でもよいが、モノクローナル抗体であることが好ましい。
　本発明で用いられる抗DLL3抗体は抗ヒトDLL3抗体であることが好ましい。抗ヒトDLL3抗体は、ヒトDLL3に特異的に結合する抗体であってもよいし、ヒトDLL3以外に他の動物由来のDLL3（例えばマウスDLL3）に結合する抗体であってもよい。
　本発明で使用される抗DLL3抗体は、公知の手段を用いてポリクローナル又はモノクローナル抗体として取得できる。本発明で使用される抗DLL3抗体としては、特に哺乳動物由来のモノクローナル抗体が好ましい。哺乳動物由来のモノクローナル抗体は、ハイブリドーマにより産生されるもの、及び遺伝子工学的手法により抗体遺伝子を含む発現ベクターで形質転換した宿主により産生されるもの等を含む。
　本発明の抗DLL3抗体は、ポリエチレングリコール（PEG）等の各種分子で修飾してもよい。また、後述するように、細胞傷害活性を有する化学療法剤や放射性化学物質等で修飾してもよい。
　本発明で用いられる、DLL3を認識してこれに結合する抗体の例として、例えば以下の抗体を挙げることができる：
（１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL301)；
（２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（５）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL301)；
（６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（７）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（８）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体（DL301）；
（１０）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL306)；
（１１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL309)；
（１２）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体(DL312)；
（１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；および
（１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
　上述の（１）～（１２）の抗体が定常領域を含む場合、使用される定常領域は特に限定されず、如何なる定常領域が使用されてもよい。本発明で使用される好ましい定常領域としてヒト由来の定常領域を挙げることができる。例えば、重鎖定常領域の場合、ヒトIgG1由来の定常領域、ヒトIgG2由来の定常領域、ヒトIgG3由来の定常領域、ヒトIgG４由来の定常領域などを使用することができる。又、例えば、軽鎖定常領域の場合、ヒトκ鎖由来の定常領域、ヒトλ鎖由来の定常領域などを使用できる。本発明で使用される定常領域は天然配列を有する定常領域であってもよいし、天然配列を有する定常領域において１又は複数のアミノ酸が改変された改変体であってもよい。
　上述の（１）～（１２）の抗体がFRを含む場合、使用されるFRは特に限定されず、ヒトDLL3への結合活性が維持される限り如何なるFRが使用されてもよい。本発明で使用されるFRの好ましい例としては、ヒト抗体由来のFRを挙げることができる。抗体の抗原への結合活性を維持したままFRを置換する技術は公知であるので、当業者は適宜、FRを選択することが可能である。本発明で使用されるFRは天然配列を有するFRであってもよいし、天然配列において１又は複数のアミノ酸が改変されたFRであってもよい。
　配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号１０又は配列番号１１のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。
　配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：２１に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号２２又は配列番号２３のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。
　配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：３３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号３４又は配列番号３５のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。
　配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域の例としては、配列番号：４５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖可変領域を挙げることができる。又、当該重鎖可変領域を含む重鎖の例としては、配列番号４６又は配列番号４７のアミノ酸配列を有する重鎖を挙げることができる。
　配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：１５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：１６又は配列番号：１７のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。
　配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：２７に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：２８又は配列番号：２９のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。
　配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：３９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：４０又は配列番号：４１のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。
　配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域の例としては、配列番号：５１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖可変領域を挙げることができる。又、当該軽鎖可変領域を含む軽鎖の例としては、配列番号：５２又は配列番号：５３のアミノ酸配列を有する軽鎖を挙げることができる。
　本発明において、本発明の抗体と同等の活性を有するとは、DLL3への結合活性、インターナライズ活性及び／又はDLL3を発現する細胞への細胞傷害活性（ADCC活性など）が同等であることをいう。本発明において活性が同等とは、必ずしも活性が同一であることは要求されず、例えば上述の（１）～（１２）のいずれかの活性と比較して50%以上、好ましくは70%以上、さらに好ましくは90%以上の活性を有していればよい。活性の上限は特に限定されず、例えば1000%以下、500%以下、300%以下、150%以下、100%以下などの例をあげることができる。
　本発明の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体も本発明の範囲内であり、人為的に作製されたものでも、自然的に生じたものであってもよい。ポリペプチドに変異を導入する方法としては、例えば、部位特異的変異誘発法（Hashimoto-Gotoh,　T.　et　al.　(1995)　Gene　152,　271-275、Zoller,　MJ,　and　Smith,　M.(1983)　Methods　Enzymol.　100,　468-500、Kramer,　W.　et　al.　(1984)　Nucleic　Acids　Res.　12,　9441-9456、Kramer　W,　and　Fritz　HJ(1987)　Methods.　Enzymol.　154,　350-367、Kunkel,TA(1985)　Proc　Natl　Acad　Sci　USA.　82,　488-492、Kunkel　(1988)　Methods　Enzymol.　85,　2763-2766）などが挙げられ、これは、あるポリペプチドと機能的に同等なポリペプチドを調製するための、当業者によく知られた方法の一つである。当業者であれば、このような方法を用いて、本発明の抗体に適宜変異を導入することにより、該抗体と機能的に同等な抗体を調製することができる。また、アミノ酸の変異は自然界においても生じうる。このように、本発明の抗体のアミノ酸配列において1もしくは数個のアミノ酸が変異したアミノ酸配列を有し、該抗体と機能的に同等な抗体もまた本発明の抗体に含まれる。
　このような変異体において、変異するアミノ酸数は、通常、50アミノ酸以内であり、好ましくは30アミノ酸以内であり、さらに好ましくは10アミノ酸以内（例えば、5アミノ酸以内）である。
　変異するアミノ酸残基においては、アミノ酸側鎖の性質が保存されている別のアミノ酸に変異されることが望ましい。例えばアミノ酸側鎖の性質に基づいて、次のような分類が確立している：
疎水性アミノ酸（A、I、L、M、F、P、W、Y、V）、
親水性アミノ酸（R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T）、
脂肪族側鎖を有するアミノ酸（G、A、V、L、I、P）、
水酸基含有側鎖を有するアミノ酸（S、T、Y）、
硫黄原子含有側鎖を有するアミノ酸（C、M）、
カルボン酸及びアミド含有側鎖を有するアミノ酸（D、N、E、Q）、
塩基含有側鎖を有するアミノ酸（R、K、H）、
芳香族含有側鎖を有するアミノ酸（H、F、Y、W）
（括弧内はいずれもアミノ酸の一文字標記を表す）。
　あるアミノ酸配列に対する１又は数個のアミノ酸残基の欠失、付加及び／又は他のアミノ酸による置換により修飾されたアミノ酸配列を有するポリペプチドが、元のポリペプチドの生物学的活性を維持することはすでに知られている（Mark,　D.　F.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1984)　81,　5662-5666、Zoller,　M.　J.　and　Smith,　M.,　Nucleic　Acids　Research　(1982)　10,　6487-6500、Wang,　A.　et　al.,　Science　224,　1431-1433、Dalbadie-McFarland,　G.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA　(1982)　79,　6409-6413）。すなわち、一般に、あるポリペプチドを構成するアミノ酸配列中、各群に分類されたアミノ酸の間で相互に置換したときに、当該ポリペプチドの活性が維持される可能性が高いといわれている。本発明において、上記アミノ酸群の群内のアミノ酸間の置換を保存的置換と言う。
　また本発明は、上述の（１）～（１２）いずれかの抗体が結合するエピトープと同じエピトープに結合する抗体もまた提供する。上述の（１）～（１２）の抗体の具体的な例として、下記の実施例に記載されたDL301、DL306、DL309、DL312の抗体を挙げることができる。すなわち本発明は、これらの抗体が認識するエピトープと同一のエピトープを認識する抗体も提供する。
　被験抗体が、ある抗体とエピトープを共有するか否かは、両者の同じエピトープに対する競合によって確認することができる。抗体間の競合は、交叉ブロッキングアッセイなどによって検出される。例えば競合ELISAアッセイは、好ましい交叉ブロッキングアッセイである。
　具体的には、交叉ブロッキングアッセイにおいては、マイクロタイタープレートのウェル上にコートしたDLL3タンパク質を、候補の競合抗体の存在下、又は非存在下でプレインキュベートした後に、本発明の抗DLL3抗体が添加される。ウェル中のDLL3タンパク質に結合した本発明の抗DLL3抗体の量は、同じエピトープへの結合に対して競合する候補競合抗体（被験抗体）の結合能に間接的に相関している。すなわち同一エピトープに対する被験抗体の親和性が大きくなればなる程、本発明の抗DLL3抗体のDLL3タンパク質をコートしたウェルへの結合量は低下し、一方、被験抗体のDLL3タンパク質をコートしたウェルへの結合量は増加する。
　ウェルに結合した抗体量は、予め抗体を標識しておくことによって、容易に測定することができる。たとえば、ビオチン標識された抗体は、アビジンペルオキシダーゼコンジュゲートと適切な基質を使用することにより測定できる。ペルオキシダーゼなどの酵素標識を利用した交叉ブロッキングアッセイを、特に競合ELISAアッセイと言う。抗体は、検出あるいは測定が可能な他の標識物質で標識することができる。具体的には、放射標識あるいは蛍光標識などが公知である。
　さらに被験抗体が本発明の抗DLL3抗体と異なる種に由来する定常領域を有する場合には、ウェルに結合した抗体を、いずれかの定常領域を認識する標識抗体によって測定することもできる。あるいは同種由来の抗体であっても、クラスが相違する場合には、各クラスを識別する抗体によって、ウェルに結合した抗体を測定することができる。
　競合抗体の非存在下で実施されるコントロール試験において得られる結合活性と比較して、候補抗体が、少なくとも20％、好ましくは少なくとも30％、さらに好ましくは少なくとも50％、より好ましくは少なくとも80％、抗DLL3抗体の結合をブロックできるならば、該候補抗体は本発明の抗DLL3抗体と実質的に同じエピトープに結合するか、又は同じエピトープへの結合に対して競合する抗体である。
　さらに、本発明の抗体の例として、ヒトDLL3（配列番号：１）の27番目のアミノ酸～175番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体、ヒトDLL3の216番目のアミノ酸～492番目のアミノ酸までの領域を認識する抗体を挙げることができる。又、本発明の抗体の他の態様として、ヒトDLL3に結合するが、配列番号：６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（DLL3delta1-Fc）および配列番号：７のアミノ酸配列からなるポリペプチド(DLL3delta2-Fc)には結合しない抗体、ならびに、ヒトDLL3に結合し、かつ配列番号：６のアミノ酸配列からなるポリペプチド（DLL3delta1-Fc）および配列番号：７のアミノ酸配列からなるポリペプチド(DLL3delta2-Fc)にも結合する抗体を挙げることができる。
　本発明の抗体はADCC活性、インターナライズ活性などの活性を有することから、医薬品、特に抗癌剤として有用である。
遺伝子組換え型抗DLL3抗体
　抗体がヒトに投与されるべきものである場合、ヒトに対する異種抗原性を低下させること等を目的として人為的に改変した遺伝子組換え型抗体とすることができる。遺伝子組換え型抗体とは、例えば、キメラ（Chimeric）抗体、ヒト化（Humanized）抗体などを含む。これらの改変抗体は、公知の方法を用いて製造することができる。
（１）キメラ抗体
　キメラ抗体とは、互いに由来の異なる可変領域と定常領域を連結した抗体をいう。例えば、マウス抗体の重鎖、軽鎖の可変領域と、ヒト抗体の重鎖、軽鎖の定常領域からなる抗体は、マウス－ヒト－異種キメラ抗体である。マウス抗体の可変領域をコードするDNAをヒト抗体の定常領域をコードするDNAと連結させ、これを発現ベクターに組み込むことによって、キメラ抗体を発現する組換えベクターが作製できる。該ベクターにより形質転換された組換え細胞を培養し、組み込まれたDNAを発現させることによって、培養中に生産される当該キメラ抗体を取得できる。
　キメラ抗体の定常領域には、ヒト抗体のものが使用される。例えば重鎖においては、Cγ１、Cγ２、Cγ３、Cγ４、Cμ、Cδ、Cα1、Cα2、及びCεを定常領域として利用することができる。また軽鎖においてはCκやCλを定常領域として使用できる。これらの定常領域のアミノ酸配列、ならびにそれをコードする塩基配列は公知である。また、抗体自体の安定性、あるいは抗体の産生の安定性を改善するために、ヒト抗体定常領域中の１又は数個のアミノ酸を置換、欠失、付加及び／又は挿入することができる。
（２）ヒト化抗体
　一般にキメラ抗体が、ヒト以外の動物由来抗体の可変領域とヒト抗体由来の定常領域とから構成されるのに対して、ヒト化抗体は、ヒト以外の動物由来抗体の相補性決定領域（CDR；complementarity　determining　region）と、ヒト抗体由来のフレームワーク領域（FR；framework　region）及びヒト抗体由来の定常領域とから構成される。ヒト化抗体は、再構成（reshaped）ヒト抗体とも称される。具体的には、ヒト以外の動物、たとえばマウス抗体のCDRをヒト抗体に移植したヒト化抗体などが公知である。ヒト化抗体はヒト体内における抗原性が低下しているため、本発明の治療剤の有効成分として有用である。
　抗体の可変領域は、通常、４つのFRにはさまれた３つのCDRで構成されている。CDRは、実質的に、抗体の結合特異性を決定している領域である。CDRのアミノ酸配列は多様性に富む。一方FRを構成するアミノ酸配列は、異なる結合特異性を有する抗体の間でも、高い相同性を示すことが多い。そのため、一般に、CDRの移植によって、ある抗体の結合特異性を、他の抗体に移植することができるといわれている。
　ヒト化抗体を得るための一般的な遺伝子組換え手法も知られている。具体的には、マウスの抗体のCDRをヒトのFRに移植するための方法として、たとえばオーバーラップエクステンションPCR（Overlap　Extension　PCR）が公知である。オーバーラップエクステンションPCRにおいては、ヒト抗体のFRを合成するためのプライマーに、移植すべきマウス抗体のCDRをコードする塩基配列が付加されたプライマーを用いる。プライマーは４つのFRのそれぞれについて用意される。一般に、マウスCDRのヒトFRへの移植においては、マウスのFRと相同性の高いヒトFRを選択するのが、CDRの機能の維持において有利であるといわれている。すなわち、一般に、移植すべきマウスCDRに隣接しているFRのアミノ酸配列と相同性の高いアミノ酸配列からなるヒトFRを利用するのが好ましい。
　また連結される塩基配列は、互いにインフレームで接続されるようにデザインされる。それぞれのプライマーによってヒトFRが個別に合成される。その結果、各FRにマウスCDRをコードするDNAが付加された産物が得られる。各産物のマウスCDRをコードする塩基配列は、互いにオーバーラップするようにデザインされている。続いて、オーバーラップしたCDR部分を互いにアニールさせて相補鎖合成反応が行われる。この反応によって、ヒトFRがマウスCDRの配列を介して連結される。
　最終的に３つのCDRと４つのFRが連結された可変領域遺伝子は、その5’末端と3'末端にアニールし適当な制限酵素認識配列を付加されたプライマーによってその全長が増幅される。上記のように得られたDNAとヒト抗体定常領域をコードするDNAとをインフレームで融合するように発現ベクター中に挿入することによって、ヒト化抗体発現用ベクターが作成できる。このベクターを宿主に導入して組換え細胞を樹立した後に、組換え細胞を培養し、ヒト化抗体をコードするDNAを発現させることによって、ヒト化抗体が培養細胞の培養物中に産生される（欧州特許公開EP　239400　、国際公開WO　96/02576参照）。
　上記のように作製されたヒト化抗体の抗原への結合活性を定性的又は定量的に測定し、評価することによって、CDRを介して連結されたときに該CDRが良好な抗原結合部位を形成するようなヒト抗体のFRが好適に選択できる。必要に応じ、ヒト化抗体のCDRが適切な抗原結合部位を形成するようにFRのアミノ酸残基を置換することもできる。たとえば、マウスCDRのヒトFRへの移植に用いたPCR法を応用して、FRにアミノ酸配列の変異を導入することができる。具体的には、FRにアニーリングするプライマーに部分的な塩基配列の変異を導入することができる。このようなプライマーによって合成されたFRには、塩基配列の変異が導入される。アミノ酸を置換した変異型抗体の抗原への結合活性を上記の方法で測定し評価することによって所望の性質を有する変異FR配列が選択できる（Sato,　K.et　al.,　Cancer　Res,　1993,　53,　851-856）。
（３）多価抗体
　本発明の抗体には、DLL3タンパク質に結合する限り、IgG（IgG1、IgG2、IgG4など）に代表される二価抗体だけでなく、一価抗体、若しくはIgMに代表される多価抗体も含まれる。本発明の多価抗体には、全て同じ抗原結合部位を有する多価抗体、又は、一部もしくは全て異なる抗原結合部位を有する多価抗体が含まれる。
（４）低分子化抗体
　本発明の抗体は、抗体の全長分子に限られず、DLL3タンパク質に結合する限り、低分子化抗体又はその修飾物であってもよい。
　低分子化抗体は、全長抗体（whole　antibody、例えばwhole　IgG等）の一部分が欠損している抗体断片を含む。DLL3抗原への結合能を有する限り、抗体分子の部分的な欠損は許容される。本発明における抗体断片は、重鎖可変領域（VH）及び軽鎖可変領域（VL）のいずれか、又は両方を含んでいることが好ましい。また、本発明における抗体断片はCDRを含んでいることが好ましい。本発明の抗体断片に含まれるCDRの数は特に限定されないが、重鎖CDR1、CDR2、CDR3、軽鎖CDR1、CDR2、CDR3の６つを少なくとも含んでいることが好ましい。
　VH又はVLのアミノ酸配列は、置換、欠失、付加及び／又は挿入を含むことができる。さらにDLL3抗原への結合能を有する限り、VH及びVLのいずれか、又は両方の一部を欠損させることもできる。また、可変領域はキメラ化やヒト化されていてもよい。抗体断片の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fvなどを挙げることができる。また、低分子化抗体の具体例としては、例えば、Fab、Fab'、F(ab')2、Fv、scFv（single　chain　Fv）、ダイアボディー、sc(Fv)2（single　chain　(Fv)2）、scFv-Fcなどを挙げることができる。本発明において好ましい低分子化抗体はダイアボディー又はsc(Fv)2である。これら抗体の多量体（例えば、ダイマー、トリマー、テトラマー、ポリマー）も、本発明の低分子化抗体に含まれる。
　抗体の断片は、抗体を酵素で処理して抗体断片を生成させることによって得ることができる。消化酵素は、抗体断片の特定の位置を切断し、特定の構造の抗体断片を与える。抗体断片を生成する酵素として、例えばパパイン、ペプシン、あるいはプラスミンなどが公知であり、パパイン消化の場合、F(ab)2又はFabを、ペプシン消化の場合、F(ab’)2又はFab’を与える。あるいは、これら抗体断片をコードする遺伝子を構築し、これを発現ベクターに導入した後、適当な宿主細胞で発現させることができる（例えば、Co,　M.S.　et　al.,　J.　Immunol.（1994）152,　2968-2976、Better,　M.　&　Horwitz,　A.　H.　Methods　in　Enzymology（1989）178,　476-496、Plueckthun,　A.　&　Skerra,　A.　Methods　in　Enzymology（1989）178,　497-515、Lamoyi,　E.,　Methods　in　Enzymology（1986）121,　652-663、Rousseaux,　J.　et　al.,　Methods　in　Enzymology（1986）121,　663-669、Bird,　R.　E.　et　al.,　TIBTECH（1991）9,　132-137参照）。
　酵素的に得られた抗体断片に対して、遺伝子工学的手法を利用すると、抗体の任意の部分を欠失させることができる。本発明における低分子化抗体は、DLL3に対する結合親和性を有する限り、任意の領域を欠失した抗体断片であることができる。
i)ダイアボディー
　ダイアボディーは、遺伝子融合により構築された二価（bivalent）の抗体断片を指す（Holliger　P　et　al.,　Proc.Natl.Acad.Sci.USA　90:　6444-6448　(1993)、EP404,097号、WO93/11161号等）。ダイアボディーは、2本のポリペプチド鎖から構成されるダイマーである。通常、ダイマーを構成するポリペプチド鎖は、各々、同じ鎖中で重鎖可変領域及び軽鎖可変領域がリンカーにより結合されている。ダイアボディーにおけるリンカーは、一般に、重鎖可変領域と軽鎖可変領域が互いに結合できない位に短い。具体的には、リンカーを構成するアミノ酸残基は、例えば、5残基程度である。そのため、同一ポリペプチド鎖上にコードされる重鎖可変領域と軽鎖可変領域とは、単鎖可変領域フラグメントを形成できず、別の単鎖可変領域フラグメントと二量体を形成する。その結果、ダイアボディーは2つの抗原結合部位を有することとなる。
ii）scFv
　scFvは、抗体の重鎖可変領域と軽鎖可変領域とを連結することにより得られる。scFvにおいて、重鎖可変領域と軽鎖可変領域は、リンカー、好ましくはペプチドリンカーを介して連結される（Huston,　J.　S.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　U.S.A,　1988,　85,　5879-5883）。scFvにおける重鎖可変領域及び軽鎖可変領域は、本明細書に記載されたいずれの抗体由来であってもよい。可変領域を連結するペプチドリンカーには、特に制限はない。例えば３から25残基程度からなる任意の一本鎖ペプチドをリンカーとして用いることができる。具体的には、たとえば後述のペプチドリンカー等を用いることができる。
　両鎖の可変領域は、たとえばPCR法によって連結することができる。PCR法による可変領域の連結のために、まず抗体の重鎖又は重鎖可変領域をコードするDNA配列、及び抗体の軽鎖又は軽鎖可変領域をコードするDNA配列のうち、全部あるいは所望の部分アミノ酸配列をコードするDNAが鋳型として利用される。
　増幅すべきDNAの両端の配列に対応する配列を有するプライマーの一対を用いたPCR法によって、重鎖と軽鎖の可変領域をコードするDNAがそれぞれ増幅される。次いで、ペプチドリンカー部分をコードするDNAを用意する。ペプチドリンカーをコードするDNAもPCRを利用して合成することができる。このとき利用するプライマーの5'側に、別に合成された各可変領域の増幅産物と連結できる塩基配列を付加しておく。次いで、［重鎖可変領域DNA］－［ペプチドリンカーDNA］－［軽鎖可変領域DNA］の各DNAと、アセンブリーPCR用のプライマーを利用してPCR反応を行う。
　アセンブリーPCR用のプライマーは、［重鎖可変領域DNA］の5’側にアニールするプライマーと、［軽鎖可変領域DNA］の3'側にアニールするプライマーとの組み合わせからなる。すなわちアセンブリーPCR用プライマーとは、合成すべきscFvの全長配列をコードするDNAを増幅することができるプライマーセットである。一方［ペプチドリンカーDNA］には各可変領域DNAと連結できる塩基配列が付加されている。その結果、これらのDNAが連結され、さらにアセンブリーPCR用のプライマーによって、最終的にscFvの全長が増幅産物として生成される。一旦scFvをコードするDNAが作製されると、それらを含有する発現ベクター、及び該発現ベクターにより形質転換された組換え細胞が常法に従って取得できる。また、その結果得られる組換え細胞を培養して該scFvをコードするDNAを発現させることにより、該scFvが取得できる。
iii)scFv-Fc
　scFv-FcはscFvにFc領域を融合させた低分子化抗体である（Cellular　&　Molecular　Immunology　2006；　3：　439-443）。scFv-Fcに用いられるscFvの由来は特に限定されないが、例えばIgM由来のscFvを用いることができる。また、Fcの由来は特に限定されないが、例えばヒトIgG（ヒトIgG1など）を用いることができる。従って、scFv-Fcの好ましい態様の例として、IgM抗体のscFv断片と、ヒトIgG1のCH2(たとえば、Cγ2)とCH3（たとえば、Cγ3)をヒトIgG1のヒンジ領域（Hγ)で連結させたscFv-Fcを挙げることができる。
iv)sc(Fv)2
　sc(Fv)2は、2つの重鎖可変領域（VH）及び2つの軽鎖可変領域（VL）をリンカー等で結合して一本鎖にした低分子化抗体である（Hudson　et　al、J　Immunol.　Methods　1999；231：177-189）。sc(Fv)2は、例えば、scFvをリンカーで結ぶことによって作製できる。4つの抗体可変領域を結合する場合には、通常、3つのリンカーが必要となる。
　また２つのVH及び２つのVLが、一本鎖ポリペプチドのN末端側を基点としてVH、VL、VH、VL（［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］）の順に並んでいることを特徴とする抗体が好ましい。
　2つのVHと2つのVLの順序は特に上記配置に限定されず、どのような順序で並べられていてもよい。例えば以下のような配置も挙げることができる。
［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］
［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］
［VH］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VL］
［VL］リンカー［VL］リンカー［VH］リンカー［VH］
［VL］リンカー［VH］リンカー［VL］リンカー［VH］
　抗体の可変領域を結合するリンカーとしては、遺伝子工学により導入し得る任意のペプチドリンカー、又は合成化合物リンカー（例えば、Protein　Engineering,　9(3),　299-305,　1996参照）に開示されるリンカー等を用いることができる。複数のリンカーは、同じでもよいし、異なるリンカーを用いることもできる。本発明においてはペプチドリンカーが好ましい。ペプチドリンカーの長さは特に限定されず、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。通常、ペプチドリンカーを構成するアミノ酸残基は、1から100アミノ酸、好ましくは3から50アミノ酸、さらに好ましくは5から30アミノ酸、特に好ましくは12から18アミノ酸（例えば、15アミノ酸）である。
　ペプチドリンカーを構成するアミノ酸配列は、scFvの結合作用を阻害しない限り、任意の配列とすることができる。例えば、ペプチドリンカーの場合次のようなアミノ酸配列を利用することができる。
Ser
Gly・Ser
Gly・Gly・Ser
Ser・Gly・Gly
Gly・Gly・Gly・Ser　(配列番号61）
Ser・Gly・Gly・Gly　(配列番号62）
Gly・Gly・Gly・Gly・Ser　(配列番号63）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly　(配列番号64）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser　(配列番号65）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly　(配列番号66）
Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Ser　(配列番号67）
Ser・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly・Gly　(配列番号68）
(Gly・Gly・Gly・Gly・Ser)n
(Ser・Gly・Gly・Gly・Gly)n
　［nは１以上の整数である］。
　ペプチドリンカーのアミノ酸配列は、目的に応じて当業者が適宜選択することができる。たとえば上記のペプチドリンカーの長さを決定するnは、通常１～５、好ましくは１～３、より好ましくは１又は２である。
　よって本発明において特に好ましいsc(Fv)2の態様としては、例えば、以下のsc(Fv)2を挙げることができる：
［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VH］ペプチドリンカー(15アミノ酸)［VL］。
　あるいは、合成化学物リンカー（化学架橋剤）を利用して可変領域を連結することもできる。ペプチド化合物などの架橋に通常用いられている架橋剤を本発明に利用することができる。例えば次のような化学架橋剤が公知である。これらの架橋剤は市販されている：N-ヒドロキシスクシンイミド（NHS）、
ジスクシンイミジルスベレート（DSS）、
ビス（スルホスクシンイミジル）スベレート（BS3）、
ジチオビス（スクシンイミジルプロピオネート）（DSP）、
ジチオビス（スルホスクシンイミジルプロピオネート）（DTSSP）、
エチレングリコールビス（スクシンイミジルスクシネート）（EGS）、
エチレングリコールビス（スルホスクシンイミジルスクシネート）（スルホ－EGS）、
ジスクシンイミジル酒石酸塩（DST）、ジスルホスクシンイミジル酒石酸塩（スルホ－DST）、
ビス［2-（スクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（BSOCOES）、及び
ビス［2-（スルホスクシンイミドオキシカルボニルオキシ）エチル］スルホン（スルホ-BSOCOES）など。
抗DLL3抗体の活性
（１）細胞障害活性
　癌などの細胞増殖性疾患の治療においては、抗体は、そのエフェクター活性を維持していることが望ましい。すなわち、本発明における好ましい抗体は、DLL3に対する結合親和性とエフェクター機能の両方を有する。抗体のエフェクター機能には、抗体依存性細胞介在性細胞傷害（antibody-dependent　cell-mediated　cytotoxicity：ADCC）活性及び補体依存性細胞傷害（complement-dependent　cytotoxicity：CDC）活性が含まれる。本発明における治療用の抗体は、特に好ましくは、ADCC活性をエフェクター機能として備える。
　本発明の抗体が治療目的で用いられる場合、抗体は好ましくは細胞傷害活性を有する抗体である。
　本発明における細胞傷害活性としては、例えば、ADCC活性、CDC活性などを挙げることができる。本発明において、ADCC活性とは標的細胞の細胞表面抗原に特異的抗体が付着した際、そのFc部分にFcγ受容体保有細胞（免疫細胞等）がFcγ受容体を介して結合し、標的細胞に傷害を与える活性を意味する。一方、CDC活性とは補体系による細胞傷害活性を意味する。
　抗DLL3抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current　protocols　in　Immunology,　Chapter7.　Immunologic　studies　in　humans,　Editor,　John　E,　Coligan　et　al.,　John　Wiley　&　Sons,　Inc.,(1993)等）。具体的には、まず、エフェクター細胞、補体溶液、標的細胞の調製が実施される。
i）エフェクター細胞の調製
　CBA/Nマウスなどから脾臓を摘出し、RPMI1640培地（Invitrogen社製）中で脾臓細胞が分離される。10％ウシ胎児血清（FBS、HyClone社製）を含む同培地で洗浄後、細胞濃度を5×106/mlに調製することによって、エフェクター細胞が調製できる。
ii）補体溶液の調製
　Baby　Rabbit　Complement（CEDARLANE社製）を10％　FBS含有培地（Invitrogen社製）にて10倍希釈し、補体溶液が調製できる。
iii）標的細胞の調製
　DLL3タンパク質を発現する細胞を0.2　mCiの51Cr-クロム酸ナトリウム（GEヘルスケアバイオサイエンス社製）とともに、10％　FBS含有DMEM培地中で37℃にて1時間培養することにより該標的細胞を放射性標識できる。DLL3タンパク質を発現する細胞としては、DLL3タンパク質をコードする遺伝子で形質転換された細胞、小細胞肺癌細胞株等を利用することができる。放射性標識後、細胞を10％　FBS含有RPMI1640培地にて３回洗浄し、細胞濃度を2×105/mlに調製することによって、該標的細胞が調製できる。
　ADCC活性、又はCDC活性は下記に述べる方法により測定できる。ADCC活性の測定の場合は、96ウェルＵ底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、エフェクター細胞100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は10μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンター（COBRAII　AUTO-GAMMA、MODEL　D5005、Packard　Instrument　Company社製）で放射活性を測定する。細胞傷害活性（%）は得られた値を使用して(A-C)　/　(B-C)　x　100の計算式に基づいて計算できる。Aは各試料における放射活性（cpm）、Bは1％NP-40（nacalai　tesque社製)を加えた試料における放射活性（cpm）、Cは標的細胞のみを含む試料の放射活性（cpm）を示す。
　一方、CDC活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体を50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。その後、補体溶液100μlを加え、炭酸ガスインキュベーター内で4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
　一方、抗体コンジュゲートによる細胞傷害活性の測定の場合は、96ウェル平底プレート（Becton　Dickinson社製）に、標的細胞と、抗DLL3抗体コンジュゲートを50μlずつ加え、氷上にて15分間反応させる。炭酸ガスインキュベーター内で1から4時間培養する。抗体の終濃度は0又は3μg/mlとする。培養後、100μlの上清を回収し、ガンマカウンターで放射活性を測定する。細胞傷害活性はADCC活性の測定と同様にして計算できる。
（２）コンジュゲート抗体
　抗体に化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質などの細胞傷害性物質を結合することも可能である。このような抗体修飾物（以下、抗体コンジュゲートと称する。）は、得られた抗体に化学的な修飾を施すことによって得ることができる。なお、抗体の修飾方法はこの分野においてすでに確立されている。
　抗DLL3抗体に結合させて細胞傷害活性を機能させる化学療法剤としては、たとえば次のような化学療法剤が例示できる：アザリビン（azaribine）、アナストロゾール（anastrozole）、アザシチジン（azacytidine）、ブレオマイシン（bleomycin）、ボルテゾミブ（bortezomib）、ブリオスタチン-1（bryostatin-1）、ブスルファン（busulfan）、カンプトテシン（camptothecin）、10-ヒドロキシカンプトテシン（10-hydroxycamptothecin）、カルムスチン（carmustine）、セレブレックス（celebrex）、クロラムブシル（chlorambucil）、シスプラチン（cisplatin）、イリノテカン（irinotecan）、カルボプラチン（carboplatin）、クラドリビン（cladribine）、シクロホスファミド（cyclophosphamide）、シタラビン（cytarabine）、ダカルバジン（dacarbazine）、ドセタキセル（docetaxel）、ダクチノマイシン（dactinomycin）、ダウノマイシングルクロニド（daunomycin　glucuronide）、ダウノルビシン（daunorubicin）、デキサメタゾン（dexamethasone）、ジエチルスチルベストロール（diethylstilbestrol）、ドキソルビシン（doxorubicin）、ドキソルビシンブルクロニド（doxorubicin　glucuronide）、エピルビシン（epirubicin）、エチニルエストラジオール（ethinyl　estradiol）、エストラムスチン（estramustine）、エトポシド（etoposide）、エトポシドグルクロニド（etoposide　glucuronide）、フロキシウリジン（floxuridine）、フルダラビン（fludarabine）、フルタミド（flutamide）、フルオロウラシル（fluorouracil）、フルオキシメステロン（fluoxymesterone）、ゲムシタビン（gemcitabine）、ヒドロキシプロゲステロンカプロエート（hydroxyprogesterone　caproate）、ヒドロキシウレア（hydroxyurea）、イダルビシン（idarubicin）、イフォスファミド（ifosfamide）、ロイコボリン（leucovorin）、ロムスチン（lomustine）、メクロレタミン（mechlorethamine）、メドロキシプロゲステロンアセテート（medroxyprogesterone　acetate）、メゲストロールアセテート（megestrol　acetate）、メルファラン（melphalan）、メルカプトプリン（mercaptopurine）、メトトレキセート（methotrexate）、ミトキサントロン（mitoxantrone）、ミトラマイシン（mithramycin）、ミトマイシン（mitomycin）、ミトタン（mitotane）、フェニルブチレート（phenylbutyrate）、プレドニゾン（prednisone）、プロカルバジン（procarbazine）、パクリタキセル（paclitaxel）、ペントスタチン（pentostatin）、セムスチン（semustine）、ストレプトゾシン（streptozocin）、タモキシフェン（tamoxifen）、タキサン類（taxanes）、タキソール（taxol）、テストステロンプロピオネート（testosterone　propionate）、サリドマイド（thalidomide）、チオグアニン（thioguanine）、チオテパ（thiotepa）、テニポシド（teniposide）、トポテカン（topotecan）、ウラシルマスタード（uracil　mustard）、ビンブラスチン（vinblastine）、ビノレルビン（vinorelbine）、ビンクリスチン（vincristine）。
　好ましい化学療法剤は、低分子の化学療法剤である。低分子の化学療法剤は、抗体への結合の後も、抗体の機能に干渉する可能性が低い。本発明において、低分子の化学療法剤は、通常100～2000、好ましくは200～1000の分子量を有する。ここに例示した化学療法剤は、いずれも低分子の化学療法剤である。これらの本発明における化学療法剤は、生体内で活性な化学療法剤に変換されるプロドラッグを含む。プロドラッグの活性化は酵素的な変換であっても、非酵素的な変換であっても良い。
　また、抗体を毒性ペプチドで修飾することもできる。毒性ペプチドの例としては、例えば、次のものを挙げることができる。ジフテリアトキシンＡ鎖(Diphtheria　toxin　A　Chain)(Langone　J.J.,et　al.,Methods　in　Enzymology,93,307-308,1983)、シュードモナスエキソトキシン(Pseudomonas　Exotoxin)(Nature　Medicine,2,350-353,1996)、リシン鎖(Ricin　A　Chain)(Fulton　R.J.,et　al.,J.Biol.Chem.,261,5314-5319,1986;Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Cumber　A.J.et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Gheeite　V.,et　al.,J.Immunol.Methods,142,223-230,1991);無糖鎖リシンＡ鎖(Deglicosylated　Ricin　A　Chain)(Thorpe　P.E.,et　al.,Cancer　Res.,47,5924-5931,1987);アブリンＡ鎖(Abrin　A　Chain)(Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Br.J.Cancer,66,361-366,1992;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Thorpe　P.E.,et　al.,Cancer　Res.,47,5924-5931,1987);ゲロニン(Gelonin)(Sivam　G.,et　al.,Cancer　Res.,47,3169-3173,1987;Cumber　A.J.et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;WawrzynczakE.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ポークウイード抗ウィルス蛋白（PAP-s;Pokeweed　anti-viral　protein　fromseeds)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ブリオジン(Briodin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);サポリン(Saporin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルジン(Momordin)(Cumber　A.J.,et　al.,J.Immunol.Methods,135,15-24,1990;Wawrzynczak　E.J.,et　al.,Cancer　Res.,50,7519-7562,1990;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);モモルコキン(Momorcochin)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３２(Dianthin　32)(Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992);ジアンシン３０(Dianthin　30)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);モデッシン(Modeccin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ビスカミン(Viscumin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ボルケシン(Volkesin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ドデカンドリン(Dodecandrin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);トリチン(Tritin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);ルフィン(Luffin)(Stirpe　F.,Barbieri　L.,FEBS　letter　195,1-8,1986);トリコキリン(Trichokirin)(Casellas　P.,et　al.,Eur.J.Biochem.176,581-588,1988;Bolognesi　A.,et　al.,Clin.exp.Immunol.,89,341-346,1992)。
　本発明において放射性化学物質とは、放射性同位体を含む化学物質のことをいう。放射性同位体は特に限定されず、如何なる放射性同位体を用いてもよいが、例えば、32P、14C、125I、3H、131I、186Re、188Reなどを用いることが可能である。
　また別の態様では、一又は二以上の低分子化学療法剤と毒性ペプチドをそれぞれ組み合わせて抗体の修飾に使用できる。抗DLL3抗体と上記の低分子化学療法剤との結合は共有結合又は非共有結合が利用できる。これら化学療法剤を結合した抗体の作製方法は公知である。
　タンパク質性の薬剤や毒素は、遺伝子工学的な手法によって抗体と結合することができる。具体的には、たとえば上記毒性ペプチドをコードするDNAと抗DLL3抗体をコードするDNAをインフレームで融合させて発現ベクター中に組み込んだ組換えベクターが構築できる。該ベクターを適切な宿主細胞に導入することにより得られる形質転換細胞を培養し、組み込んだDNAを発現させて、毒性ペプチドを結合した抗DLL3抗体を融合タンパク質として得ることができる。抗体との融合タンパク質を得る場合、一般に、抗体のC末端側にタンパク質性の薬剤や毒素を配置される。抗体と、タンパク質性の薬剤や毒素の間には、ペプチドリンカーを介在させることもできる。
（３）二重特異性抗体
　さらに、本発明の抗体は二重特異性抗体（bispecific　antibody）であってもよい。二重特異性抗体とは、異なるエピトープを認識する可変領域を同一の抗体分子内に有する抗体を言う。本発明において、二重特異性抗体はDLL3分子上の異なるエピトープを認識する抗原結合部位を有することができる。このような二重特異性抗体は、１分子のDLL3に対して２分子の抗体分子が結合できる。その結果、より強力な細胞傷害作用を期待できる。
　あるいは、一方の抗原結合部位がDLL3を認識し、他方の抗原結合部位が細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体とすることもできる。細胞傷害性物質には、具体的には、化学療法剤、毒性ペプチド或いは放射性化学物質等が含まれる。このような二重特異性抗体は、DLL3を発現している細胞に結合する一方で、細胞傷害性物質を捕捉する。その結果、細胞傷害性物質をDLL3発現細胞に直接作用させることができる。すなわち細胞傷害性物質を認識する二重特異性抗体によって、腫瘍細胞を特異的に傷害し、腫瘍細胞の増殖を抑制することができる。
　また本発明においては、DLL3以外の抗原を認識する抗原結合部位と組み合わせた二重特異性抗体を用いることもできる。たとえば、DLL3と同様に標的とする癌細胞の細胞表面に特異的に発現する抗原であって、DLL3とは異なる抗原を認識するような抗原結合部位と組み合わせて二重特異性抗体とすることができる。
　二重特異性抗体を製造するための方法は公知である。たとえば、認識抗原が異なる２種類の抗体を結合させて、二重特異性抗体を作製することができる。結合させる抗体は、それぞれが重鎖と軽鎖を有する１／２分子であっても良いし、重鎖のみからなる１／４分子であっても良い。あるいは、異なるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを融合させて、二重特異性抗体産生融合細胞を作製することもできる。さらに、遺伝子工学的手法により二重特異性抗体が作製できる。
　抗体の抗原結合活性（Antibodies　A　Laboratory　Manual.　Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）の測定には公知の手段を使用することができる。例えば、ELISA（酵素結合免疫吸着検定法）、EIA（酵素免疫測定法）、RIA（放射免疫測定法）あるいは蛍光免疫法などを用いることができる。
（４）糖鎖の改変
　本発明の抗体は糖鎖が改変された抗体であってもよい。抗体の糖鎖を改変することにより抗体の細胞傷害活性を増強できることが知られている。糖鎖が改変された抗体としては、例えば、糖鎖が修飾された抗体（WO99/54342など）、糖鎖に付加するフコースが欠損した抗体（WO00/61739、WO02/31140など）、バイセクティングGlcNAcを有する糖鎖を有する抗体（WO02/79255など）などが公知である。
（５）インターナライズ活性
　また、本発明の抗体はインターナライズ活性を有していてもよい。本発明において「インターナライズ活性を有する抗体」とは、DLL3に結合した際に細胞内（細胞質内、小胞内、他の小器官内など）に輸送される抗体を意味する。
　抗体がインターナライズ活性を有するか否かは当業者に公知の方法を用いて確認することができ、例えば、標識物質を結合した抗DLL3抗体をDLL3を発現する細胞に接触させ該標識物質が細胞内に取り込まれたか否かを確認する方法、細胞傷害性物質を結合した抗DLL3抗体をDLL3を発現する細胞に接触させ該DLL3発現細胞に細胞死が誘導されたか否かを確認する方法、などにより確認することができる。
　より具体的には、例えば、実施例に記載された方法により抗DLL3抗体のインターナライズ活性を測定することが可能である。
　インターナライズ活性を有する抗体は例えば上述の細胞傷害性物質を結合することにより、後述する抗癌剤などの医薬組成物として用いることができる。
抗DLL3抗体の作製
１．　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマによる抗DLL3抗体の作製
　モノクローナル抗体産生ハイブリドーマは、公知技術にしたがい、以下のようにして作製できる。まず、DLL3タンパク質、あるいは後述するその部分ペプチドを感作抗原として使用し、通常の免疫方法にしたがって動物を免疫する。得られた免疫細胞を通常の細胞融合法によって公知の親細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマから、通常のスクリーニング法により、目的とする抗体を産生する細胞をスクリーニングすることによって抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマを選択する。選択したハイブリドーマから所望の抗DLL3モノクローナル抗体を得る。具体的には、以下のようにして行う。
（１）DLL3タンパク質の調製
　まず、DLL3遺伝子を発現させることによって、抗体取得の感作抗原として使用されるDLL3タンパク質が取得できる。すなわち、DLL3をコードする遺伝子配列を公知の発現ベクターに挿入して適当な宿主細胞を形質転換させた後、その宿主細胞中又は培養上清中から、目的のヒトDLL3タンパク質を公知の方法で精製する。精製した天然のDLL3タンパク質、あるいは、DLL3タンパク質の所望の部分ポリペプチドを異なるポリペプチドと融合した融合タンパク質を免疫原として利用することもできる。免疫原とする融合タンパク質を製造するために、例えば、抗体のFc断片やペプチドタグなどを利用することができる。融合タンパク質を発現するベクターは、所望の二種類又はそれ以上のポリペプチド断片をコードする遺伝子をインフレームで融合させ、当該融合遺伝子を発現ベクターに挿入することにより作製することができる。融合タンパク質の作製方法はMolecular　Cloning　2nd　ed.（Sambrook,J　et　al.,　Molecular　Cloning　2nd　ed.,　9.47-9.58,　Cold　Spring　Harbor　Lab.　press,　1989）に記載されている。
　このようにして精製されたDLL3タンパク質を、哺乳動物に対する免疫に使用する感作抗原として使用できる。DLL3の部分ペプチドもまた感作抗原として使用できる。たとえば、次のようなペプチドを感作抗原とすることができる。
　部分ペプチドとして用いるDLL3の領域及び大きさは限定されない。感作抗原とするペプチドを構成するアミノ酸の数は、少なくとも３以上、たとえば、５以上、あるいは６以上であることが好ましい。より具体的には、８～５０、好ましくは１０～３０残基のペプチドを感作抗原とすることができる。
（２）DLL3タンパク質による免疫
　DLL3タンパク質あるいはその部分ペプチドを感作抗原として、哺乳動物を免疫する。免疫される哺乳動物は、特に限定されないが、モノクローナル抗体を細胞融合法によって得るためには、細胞融合に使用する親細胞との適合性を考慮して免疫動物を選択するのが好ましい。一般的には、げっ歯類の動物が免疫動物として好ましい。具体的には、マウス、ラット、ハムスター、あるいはウサギを免疫動物とすることができる。その他、サル等を免疫動物とすることもできる。
　上記の動物は、公知の方法にしたがい、感作抗原により免疫できる。例えば、一般的方法として、感作抗原を腹腔内又は皮下に注射することにより哺乳動物を免疫することができる。具体的には、該感作抗原が哺乳動物に4から21日毎に数回投与される。感作抗原は、PBS（Phosphate-Buffered　Saline、リン酸緩衝食塩水）や生理食塩水等で適当な希釈倍率で希釈して免疫に使用される。さらに、感作抗原をアジュバントとともに投与してもよい。例えばフロイント完全アジュバントと混合し、乳化して、感作抗原とすることができる。また、感作抗原の免疫時には適当な担体が使用できる。特に分子量の小さい部分ペプチドが感作抗原として用いられる場合には、該感作抗原ペプチドをアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等の担体タンパク質と結合させて免疫することが望ましい。
（３）DNA免疫
　モノクローナル抗体は、DNA免疫（DNA　Immunization）によっても得ることができる。DNA免疫とは、免疫動物中で抗原タンパク質をコードする遺伝子が発現できるような態様で構築されたベクターDNAを当該免疫動物に投与し、免疫抗原を免疫動物の生体内で発現させることによって、免疫刺激を与える方法である。蛋白質抗原を投与する一般的な免疫方法と比べて、DNA免疫には、次のような優位性を期待できる。
　・DLL3のような膜蛋白質の構造を維持して免疫刺激を与えることができる。
　・免疫抗原を精製する必要が無い。
　DNA免疫によって本発明のモノクローナル抗体を得るには、まず、DLL3タンパク質を発現するDNAを免疫動物に投与する。DLL3をコードするDNAは、PCRなどの公知の方法によって合成することができる。得られたDNAを適当な発現ベクターに挿入し、免疫動物に投与する。発現ベクターとしては、たとえばpcDNA3.1などの市販の発現ベクターを利用することができる。ベクターを生体に投与する方法も、一般に用いられている方法を利用することができる。たとえば、発現ベクターを吸着させた金粒子を、遺伝子銃（gene　gun）で細胞内に打ち込むことによってＤＮＡ免疫を行うことができる。
（４）ハイブリドーマの作製
　上述のように哺乳動物が免疫され、血清中における所望の抗体量の上昇が確認された後に、哺乳動物から免疫細胞が採取され、細胞融合に付される。好ましい免疫細胞としては、特に脾細胞が使用できる。
　上記の免疫細胞と融合される細胞として、哺乳動物のミエローマ細胞が用いられる。ミエローマ細胞は、スクリーニングのための適当な選択マーカーを備えていることが好ましい。選択マーカーとは、特定の培養条件の下で生存できる（あるいはできない）形質を指す。選択マーカーには、ヒポキサンチン－グアニン－ホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損（以下HGPRT欠損と省略する）、あるいはチミジンキナーゼ欠損（以下TK欠損と省略する）などが公知である。HGPRTやTKの欠損を有する細胞は、ヒポキサンチン－アミノプテリン－チミジン感受性（以下HAT感受性と省略する）を有する。HAT感受性の細胞はHAT選択培地中でDNA合成を行うことができず死滅するが、正常な細胞と融合すると正常細胞のサルベージ回路を利用してDNAの合成を継続することができるためHAT選択培地中でも増殖するようになる。
　HGPRT欠損やTK欠損の細胞は、それぞれ6チオグアニン、8アザグアニン（以下8AGと省略する）、あるいは5'ブロモデオキシウリジンを含む培地で選択することができる。正常な細胞はこれらのピリミジンアナログをDNA中に取り込んでしまうので死滅するが、これらの酵素を欠損した細胞は、これらのピリミジンアナログを取り込めないので選択培地の中で生存することができる。この他、G418耐性と呼ばれる選択マーカーは、ネオマイシン耐性遺伝子によって2-デオキシストレプタミン系抗生物質（ゲンタマイシン類似体）に対する耐性を与える。細胞融合に好適な種々のミエローマ細胞が公知である。例えば、以下のようなミエローマ細胞を、本発明におけるモノクローナル抗体の製造に利用することができる。
　P3（P3x63Ag8.653）（J.　Immunol.（1979）123,　1548-1550）、
P3x63Ag8U.1（Current　Topics　in　Microbiology　and　Immunology（1978）81,　1-7）、
NS-1（Kohler.　G.　and　Milstein,　C.　Eur.　J.　Immunol.（1976）6,　511-519）、
MPC-11（Margulies.　D.H.　et　al.,　Cell（1976）8,　405-415）、
SP2/0（Shulman,　M.　et　al.,　Nature（1978）276,　269-270）、
FO（de　St.　Groth,　S.　F.　etal.,　J.　Immunol.　Methods（1980）35,　1-21）、
S194（Trowbridge,　I.　S.　J.　Exp.　Med.（1978）148,　313-323）、
R210（Galfre,　G.　et　al.,　Nature（1979）277,　131-133）等。
　基本的には公知の方法、たとえば、ケーラーとミルステインらの方法（Kohler.　G.　and　Milstein,　C.、Methods　Enzymol.（1981）73,　3-46）等に準じて、免疫細胞とミエローマ細胞との細胞融合が行われる。
　より具体的には、例えば細胞融合促進剤の存在下で通常の栄養培養液中で、細胞融合が実施できる。融合促進剤としては、例えばポリエチレングリコール（PEG）、センダイウイルス（HVJ）等を使用することができる。さらに融合効率を高めるために所望によりジメチルスルホキシド等の補助剤を加えることもできる。
　免疫細胞とミエローマ細胞との使用割合は任意に設定できる。例えば、ミエローマ細胞に対して免疫細胞を1から10倍とするのが好ましい。細胞融合に用いる培養液としては、例えば、ミエローマ細胞株の増殖に好適なRPMI1640培養液、MEM培養液、その他、この種の細胞培養に用いられる通常の培養液を利用することができる。さらに、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を培養液に添加することができる。
　細胞融合は、免疫細胞とミエローマ細胞との所定量を培養液中でよく混合し、予め37℃程度に加温したPEG溶液を混合することによって目的とする融合細胞（ハイブリドーマ）が形成される。細胞融合法においては、例えば平均分子量1000から6000程度のPEGを、通常30から60％（w/v）の濃度で添加することができる。続いて、上記に挙げた適当な培養液を逐次添加し、遠心して上清を除去する操作を繰り返すことによりハイブリドーマの生育に好ましくない細胞融合剤等が除去される。
　このようにして得られたハイブリドーマは、細胞融合に用いられたミエローマが有する選択マーカーに応じた選択培養液を利用することによって選択することができる。例えばHGPRTやTKの欠損を有する細胞は、HAT培養液（ヒポキサンチン、アミノプテリン及びチミジンを含む培養液）で培養することにより選択できる。すなわち、HAT感受性のミエローマ細胞を細胞融合に用いた場合、HAT培養液中で、正常細胞との細胞融合に成功した細胞を選択的に増殖させることができる。目的とするハイブリドーマ以外の細胞（非融合細胞）が死滅するのに十分な時間、上記HAT培養液を用いた培養が継続される。具体的には、一般に、数日から数週間の培養によって、目的とするハイブリドーマを選択することができる。ついで、通常の限界希釈法を実施することによって、目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスクリーニング及び単一クローニングが実施できる。
　目的とする抗体のスクリーニング及び単一クローニングは、公知の抗原抗体反応に基づくスクリーニング方法によって好適に実施できる。例えば、ポリスチレン等でできたビーズや市販の96ウェルのマイクロタイタープレート等の担体に抗原を結合させ、ハイブリドーマの培養上清と反応させる。次いで担体を洗浄した後に酵素で標識した二次抗体等を反応させる。培養上清中に感作抗原と反応する目的とする抗体が含まれる場合、二次抗体はこの抗体を介して担体に結合する。最終的に担体に結合する二次抗体を検出することによって、目的とする抗体が培養上清中に存在しているかどうかが決定できる。抗原に対する結合能を有する所望の抗体を産生するハイブリドーマを限界希釈法等によりクローニングすることが可能となる。この際、抗原としては免疫に用いたものを始め、実質的に同質なDLL3タンパク質が好適に使用できる。たとえばDLL3を発現する細胞株、可溶型DLL3などを抗原として利用することができる。
　ヒトDLL3に対する抗体の産生には、国際公開WO03/104453に記載された方法を利用することもできる。
　また、ヒト以外の動物に抗原を免疫することによって上記ハイブリドーマを得る方法以外に、ヒトリンパ球を抗原感作して目的とする抗体を得ることもできる。具体的には、まずインビトロにおいてヒトリンパ球をDLL3タンパク質で感作する。次いで免疫感作されたリンパ球を適当な融合パートナーと融合させる。融合パートナーには、たとえばヒト由来であって永久分裂能を有するミエローマ細胞を利用することができる（特公平1-59878号公報参照）。
　さらに、ヒト抗体遺伝子の全てのレパートリーを有するトランスジェニック動物に対して抗原となるDLL3タンパク質を投与するか、又はDLL3を当該動物中において発現するように構築されたDNAによって免疫することによって、抗DLL3ヒト抗体を得ることもできる。免疫動物の抗体産生細胞は、適当な融合パートナーとの細胞融合やエプスタインバーウイルスの感染などの処理によって不死化させることができる。このようにして得られた不死化細胞から、DLL3タンパク質に対するヒト抗体を単離することができる（国際公開WO　94/25585、WO　93/12227、WO　92/03918、WO　94/02602参照）。さらに不死化された細胞をクローニングすることにより、目的の反応特異性を有する抗体を産生する細胞をクローニングすることもできる。トランスジェニック動物を免疫動物とするときには、当該動物の免疫システムは、ヒトDLL3を異物と認識する。したがって、ヒトDLL3に対するヒト抗体を容易に得ることができる。
（５）ハイブリドーマからのモノクローナル抗体の取得
　以上のようにして作製されるモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマは、通常の培養液中で継代培養することができる。また、該ハイブリドーマを液体窒素中で長期にわたって保存することもできる。
　目的とするモノクローナル抗体は、ハイブリドーマを通常の方法に従い培養し、その培養上清から得ることができる。あるいはハイブリドーマをこれと適合性がある哺乳動物に投与して増殖させ、その腹水としてモノクローナル抗体を得ることもできる。前者の方法は、高純度の抗体を得るのに適している。
２．　遺伝子工学的手法による抗DLL3抗体の作製
（１）抗体遺伝子のクローニング
　抗体産生細胞からクローニングされた抗体遺伝子を利用することにより、遺伝子工学的手法を用いて、抗体を作製することもできる。クローニングした抗体遺伝子は、適当なベクターに組み込んで宿主に導入することによって抗体として発現させることができる。抗体遺伝子の単離と、ベクターへの導入、そして宿主細胞の形質転換のための方法は既に確立されている（例えば、Vandamme,　A.　M.　et　al.,　Eur.J.　Biochem.（1990）192,　767-775参照）。
　たとえば、抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ細胞から、抗DLL3抗体の可変領域をコードするcDNAを得ることができる。そのためには、通常、まずハイブリドーマから全RNAが抽出される。細胞からmRNAを抽出するための方法として、たとえば次のような方法を利用することができる。
・グアニジン超遠心法（Chirgwin,　J.　M.　et　al.,　Biochemistry（1979）18,　5294-5299）
・AGPC法（Chomczynski,　P.et　al.,　Anal.　Biochem.（1987）162,　156-159）。
　抽出されたmRNAは、mRNA　Purification　Kit　（GEヘルスケアバイオサイエンス製）等を使用して精製することができる。あるいは、QuickPrep　mRNA　Purification　Kit　（GEヘルスケアバイオサイエンス製）などのように、細胞から直接全mRNAを抽出するためのキットも市販されている。このようなキットを用いて、ハイブリドーマから全mRNAを得ることもできる。得られたmRNAから逆転写酵素を用いて抗体可変領域をコードするcDNAを合成することができる。その際、抗体遺伝子に共通な配列より選び出した任意の15-30塩基の配列をプライマーとして用いることができる。cDNAは、AMV　Reverse　Transcriptase　First-strand　cDNA　Synthesis　Kit（生化学工業社製）等によって合成することができる。また、cDNAの合成及び増幅のために、5’-Ampli　FINDER　RACE　Kit（Clontech製）及びPCRを用いた5’-RACE法（Frohman,　M.　A.　et　al.,　Proc.　Natl.　Acad.　Sci.　USA（1988）85,　8998-9002、Belyavsky,　A.et　al.,　Nucleic　Acids　Res.（1989）17,　2919-2932）を利用することができる。さらにこうしたcDNAの合成の過程においてcDNAの両末端に後述する適切な制限酵素サイトが導入できる。
　得られたPCR産物から目的とするcDNA断片が精製され、次いでベクターDNAと連結される。このように組換えベクターが作製され、大腸菌等に導入されコロニーが選択された後に、該コロニーを形成した大腸菌から所望の組換えベクターが調製できる。そして、cDNAの塩基配列を、公知の方法、例えば、ジデオキシヌクレオチドチェインターミネーション法等により確認することができる。
　また、抗体の可変領域をコードする遺伝子を得るために、cDNAライブラリーを利用することもできる。まず抗体産生細胞から抽出されたmRNAを鋳型としてcDNAを合成し、cDNAライブラリーを得る。cDNAライブラリーの合成には市販のキットを用いるのが便利である。実際には、少数の細胞のみから得られるmRNAは極めて微量なので、それを直接精製すると収率が低い。したがって通常は、抗体遺伝子を含まないことが明らかなキャリアRNAを添加した後にmRNAを精製する。あるいは抗体産生細胞から一定量のRNAを抽出できる場合には、キャリアRNAを添加しなくても効率よく抽出することができる。たとえば10以上、あるいは30以上、好ましくは50以上の抗体産生細胞からのRNA抽出には、キャリアRNAの添加は必要でない場合がある。
　得られたcDNAライブラリーを鋳型として、PCR法によって抗体遺伝子が増幅される。抗体遺伝子をPCR法によって増幅するためのプライマーが公知である。たとえば、論文（J.　Mol.　Biol.　(1991)　222,　581-597）などの開示に基づいて、ヒト抗体遺伝子増幅用のプライマーをデザインすることができる。これらのプライマーは、イムノグロブリンのサブクラスごとに異なる塩基配列をもつ。したがって、サブクラスが不明のcDNAライブラリーを鋳型とするときには、あらゆる可能性を考慮してプライマーを選択してPCR法が行われる。
　具体的には、たとえばヒトIgGをコードする遺伝子の取得を目的とするときには、重鎖としてγ１～γ５、軽鎖としてκ鎖とλ鎖をコードする遺伝子の増幅が可能なプライマーを利用することができる。IgGの可変領域遺伝子を増幅するためには、一般に3'側のプライマーにはヒンジ領域に相当する部分にアニールするプライマーが利用される。一方5'側のプライマーには、各サブクラスに応じたプライマーを用いることができる。
　重鎖と軽鎖の各サブクラスの遺伝子増幅用プライマーによるPCR産物は、それぞれ独立したライブラリーとする。こうして合成されたライブラリーを利用して、重鎖と軽鎖の組み合せからなるイムノグロブリンを再構成することができる。再構成されたイムノグロブリンの、DLL3に対する結合活性を指標として、目的とする抗体をスクリーニングすることができる。
（２）宿主細胞への抗体遺伝子の導入
　抗DLL3抗体を製造するために、クローニングされた抗体遺伝子を、発現制御領域の制御下で発現するように発現ベクターに組み込む。抗体を発現するための発現制御領域とは、例えば、エンハンサーやプロモーターを含む。次いで、この発現ベクターで適当な宿主細胞を形質転換することによって、抗DLL3抗体をコードするDNAを発現する組換え細胞を得ることができる。
　抗体遺伝子の発現にあたり、抗体重鎖及び軽鎖をコードするDNAは、それぞれ別の発現ベクターに組み込むことができる。重鎖と軽鎖が組み込まれたベクターを、同じ宿主細胞に同時に形質転換（co-transfect）することによって、重鎖と軽鎖を備えた抗体分子を発現させることができる。あるいは重鎖及び軽鎖をコードするDNAを単一の発現ベクターに組み込んで宿主細胞を形質転換させてもよい（国際公開WO　94/11523参照）。
　単離した抗体遺伝子を適当な宿主に導入して抗体を作製するための宿主と発現ベクターの多くの組み合わせが公知である。これらの発現系は、いずれも本発明に応用することができる。真核細胞を宿主として使用する場合、動物細胞、植物細胞、あるいは真菌細胞が使用できる。具体的には、本発明に利用することができる動物細胞としては、次のような細胞を例示することができる。
i)　哺乳類細胞：CHO、COS、ミエローマ、BHK（baby　hamster　kidney）、Hela、Vero、HEK293、Ba/F3、HL-60、Jurkat、SK-HEP1など
ii)　両生類細胞：アフリカツメガエル卵母細胞など
iii)　昆虫細胞：sf9、sf21、Tn5など。
　植物細胞としては、ニコティアナ・タバカム（Nicotiana　tabacum）などのニコティアナ（Nicotiana）属由来の細胞による抗体遺伝子の発現系が公知である。植物細胞の形質転換には、カルス培養した細胞を利用することができる。
　さらに真菌細胞としては、次のような細胞を利用することができる：
酵母：サッカロミセス・セレビシエ（Saccharomyces　serevisiae）などのサッカロミセス（Saccharomyces　）属、メタノール資化酵母（Pichia　pastoris）などのPichia属、糸状菌：アスペスギルス・ニガー（Aspergillus　niger）などのアスペルギルス（Aspergillus）属。
　あるいは原核細胞を利用した抗体遺伝子の発現系も公知である。たとえば、細菌細胞を用いる場合、大腸菌（E.　coli）、枯草菌などの細菌細胞を本発明に利用することができる。
　哺乳類細胞を用いる場合、常用される有用なプロモーター、発現させる抗体遺伝子、その3’側下流にポリAシグナルを機能的に結合させて発現させることができる。例えばプロモーター／エンハンサーとしては、ヒトサイトメガロウイルス前期プロモーター／エンハンサー（human　cytomegalovirus　immediate　early　promoter/enhancer）を挙げることができる。
　また、その他に、ウイルスプロモーター／エンハンサー、あるいはヒトエロンゲーションファクター1α（HEF1α）などの哺乳類細胞由来のプロモーター／エンハンサー等を、抗体発現のために使用することができる。プロモーター／エンハンサーを利用することができるウイルスとして、具体的には、レトロウイルス、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、シミアンウイルス40（SV40）等を示すことができる。
　SV40プロモーター／エンハンサーを使用する場合はMulliganらの方法（Nature（1979）277,　108）を利用することができる。また、HEF1αプロモーター／エンハンサーはMizushimaらの方法（Nucleic　Acids　Res.（1990）18,　5322）により、容易に目的とする遺伝子発現に利用することができる。
　動物細胞を用いて抗体を産生させる場合に、細胞外への分泌のために必要とされるシグナル配列としては抗体の重鎖遺伝子又は軽鎖遺伝子のシグナル配列を用いることが望ましい。また、IL-3やIL-6などの分泌タンパク質が有するシグナル配列を用いることも可能である。
　大腸菌の場合、常用される有用なプロモーター、抗体分泌のためのシグナル配列及び発現させる抗体遺伝子を機能的に結合させて当該遺伝子が発現できる。プロモーターとしては、例えばlacZプロモーター、araBプロモーターを挙げることができる。lacZプロモーターを使用する場合はWardらの方法（Nature（1989）341,　544-546　;　FASEBJ.（1992）6,　2422-2427）を利用することができる。あるいはaraBプロモーターはBetterらの方法（Science（1988）240,　1041-1043）により、目的とする遺伝子の発現に利用することができる。
　抗体分泌のためのシグナル配列としては、大腸菌のペリプラズムに産生させる場合、pelBシグナル配列（Lei,　S.　P.　et　al.,　J.　Bacteriol.（1987）169,　4379）を使用すればよい。そして、ペリプラズムに産生された抗体を分離した後、尿素やグアニジン塩酸塩の様なタンパク質変性剤を使用することによって所望の結合活性を有するように、抗体の構造が組み直される（refolded）。
　発現ベクターに挿入される複製起源としては、SV40、ポリオーマウイルス、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス（BPV）等の由来のものを用いることができる。さらに、宿主細胞系で遺伝子コピー数増幅のため、発現ベクター中に、選択マーカーを挿入することができる。具体的には、アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（APH）遺伝子、チミジンキナーゼ（TK）遺伝子、大腸菌キサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ（Ecogpt）遺伝子、ジヒドロ葉酸還元酵素（dhfr）遺伝子等のような選択マーカーを利用することができる。
（３）宿主細胞からの抗体の取得
　これらの発現ベクターを宿主細胞に導入し、次に、形質転換された宿主細胞をインビトロ又はインビボで培養して目的とする抗体を産生させる。宿主細胞の培養は公知の方法に従い行う。例えば、培養液として、DMEM、MEM、RPMI1640、IMDMを使用することができ、牛胎児血清（FCS）等の血清補液を併用することもできる。
　上述のように発現、産生された抗体は、通常のタンパク質の精製で使用されている公知の方法を単独で使用することによって又は適宜組み合わせることによって精製できる。例えば、プロテインAカラムなどのアフィニティーカラム、クロマトグラフィーカラム、フィルター、限外濾過、塩析、透析等を適宜選択、組み合わせることにより、抗体を分離、精製することができる（Antibodies　A　Laboratory　Manual.　Ed　Harlow,　David　Lane,　Cold　Spring　Harbor　Laboratory,　1988）。
　従って、本発明は、本発明の抗体をコードする遺伝子を提供する。さらに本発明は当該遺伝子を含むベクターを提供する。さらに本発明は当該ベクターを保持する宿主細胞を提供する。さらに本発明は当該宿主細胞を培養する工程を含む、当該遺伝子によりコードされる抗体を製造する方法を提供する。
３．　トランスジェニック動物による抗体産生
　組換え型抗体の産生には、上記宿主細胞に加えて、トランスジェニック動物を利用することもできる。すなわち目的とする抗体をコードする遺伝子を導入された動物から、目的とする抗体を得ることができる。例えば、抗体遺伝子は、乳汁中に固有に産生されるタンパク質をコードする遺伝子の内部にインフレームで挿入することによって融合遺伝子として構築できる。乳汁中に分泌されるタンパク質として、たとえば、ヤギβカゼインなどを利用することができる。抗体遺伝子が挿入された融合遺伝子を含むDNA断片はヤギの胚へ注入され、該注入胚が雌のヤギへ導入される。胚を受容したヤギから生まれるトランスジェニックヤギ（又はその子孫）が産生する乳汁からは、所望の抗体を乳汁タンパク質との融合タンパク質として取得できる。また、トランスジェニックヤギから産生される所望の抗体を含む乳汁量を増加させるために、ホルモンがトランスジェニックヤギに適宜使用できる（Ebert,　K.M.　et　al.,　Bio/Technology（1994）12,　699-702）。
医薬組成物
　DLL3は小細胞肺癌の癌組織で高発現していることから、抗DLL3抗体は癌細胞特異的な細胞傷害活性を有する。したがって、抗DLL3抗体は、DLL3を発現する癌の治療に有用である。
　すなわち、本発明は、DLL3タンパク質に結合する抗体を有効成分として含有する医薬組成物を提供する。ある実施形態において、前記医薬組成物は細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤である。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
　本発明の医薬組成物（例えば、抗癌剤）において用いられる抗DLL3抗体は特に限定されず、例えば上述した任意の抗DLL3抗体を用いることができる。
　本発明において、「DLL3に結合する抗体を有効成分として含有する」とは、抗DLL3抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、抗DLL3抗体の含有率を制限するものではない。
　本発明の医薬組成物は、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を有効成分としてもよい。前記医薬組成物は、例えば、細胞増殖抑制剤、特に抗癌剤として利用できる。本発明の細胞増殖抑制剤及び抗癌剤は、癌を罹患している対象又は罹患している可能性がある対象に投与されることが好ましい。
　本発明において、「細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を有効成分として含有する」とは、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体を主要な活性成分として含むという意味であり、細胞傷害性物質が結合した抗DLL3抗体の含有率を制限するものではない。
　本発明の医薬組成物が対象とする疾患が癌の場合、対象となる癌は特に限定されないが、肺癌、特に小細胞肺癌であることが好ましい。癌は原発巣及び転移巣のいずれであってもよい。
　本発明の医薬組成物は、経口、非経口投与のいずれかによって患者に投与することができる。好ましくは非経口投与である。係る投与方法としては具体的には、注射投与、経鼻投与、経肺投与、経皮投与などが挙げられる。注射投与の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などによって本発明の医薬組成物が全身又は局部的に投与できる。また、患者の年齢、症状により適宜投与方法を選択することができる。投与量としては、例えば、一回の投与につき体重1　kgあたり0.0001　mgから1000　mgの範囲で投与量が選択できる。あるいは、例えば、患者あたり0.001から100000　mgの範囲で投与量が選択できる。しかしながら、本発明の医薬組成物はこれらの投与量に制限されるものではない。
　本発明の医薬組成物は、常法に従って製剤化することができ（例えば、Remington's　Pharmaceutical　Science,　latest　edition,　Mark　Publishing　Company,　Easton,　U.S.A）、医薬的に許容される担体や添加物を共に含むものであってもよい。例えば界面活性剤、賦形剤、着色料、着香料、保存料、安定剤、緩衝剤、懸濁剤、等張化剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、流動性促進剤、矯味剤等が挙げられる。さらにこれらに制限されず、その他常用の担体が適宜使用できる。具体的には、軽質無水ケイ酸、乳糖、結晶セルロース、マンニトール、デンプン、カルメロースカルシウム、カルメロースナトリウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポリビニルアセタールジエチルアミノアセテート、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、中鎖脂肪酸トリグリセライド、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油60、白糖、カルボキシメチルセルロース、コーンスターチ、無機塩類等を担体として挙げることができる。
　本発明の抗DLL3抗体は、DLL3発現細胞と接触させることによりDLL3発現細胞に傷害を引き起こす又は細胞の増殖を抑制することができる。こうした利用方法も、本発明の範囲である。用いられる抗体は、特に限定されず、例えば上述した任意の抗体を用いることが可能である。抗DLL3抗体が結合する細胞はDLL3が発現している細胞であれば特に限定されない。本発明における好ましいDLL3発現細胞は癌細胞である。より好ましくは、肺癌細胞、特に小細胞肺癌細胞である。
　本発明において「接触」は、例えば、試験管内で培養しているDLL3発現細胞の培養液に抗体を添加することにより行われる。また本発明において「接触」はさらに、DLL3発現細胞を体内に移植した非ヒト動物や内在的にDLL3を発現する癌細胞を有する動物に投与することによっても行われる。
　抗DLL3抗体の接触によってDLL3発現細胞に引き起こされた細胞傷害を評価又は測定する方法として、以下の方法が好適に使用される。試験管内において該細胞傷害活性を評価又は測定する方法としては、上記のADCC活性、CDC活性などの測定法を挙げることができる。抗DLL3抗体がADCC活性を有するか否か、又はCDC活性を有するか否かは公知の方法により測定することができる（例えば、Current　protocols　in　Immunology,　Chapter　7.　Immunologic　studies　in　humans,　Editor,　John　E,　Coligan　et　al.,　John　Wiley　&　Sons,　Inc.,(1993)等）。活性の測定に際しては、対照抗体として抗DLL3抗体と同一のアイソタイプを有する抗体で該細胞に結合しない抗体を、抗DLL3抗体と同様に使用して、抗DLL3抗体が対照抗体よりも強い細胞傷害活性を示す場合に活性を有すると判定することができる。
　抗体のアイソタイプは、その抗体のアミノ酸配列の重鎖定常領域の配列で規定される。生体内においては、抗体産生Ｂ細胞の成熟化の際に起こる染色体上の遺伝子組み換えにより生じるクラススイッチによって抗体のアイソタイプが最終的に決定される。アイソタイプの相違が抗体の生理的・病理的機能の相違に反映される。具体的には、例えば、細胞傷害活性の強度は抗原の発現量と共に、抗体のアイソタイプによっても影響されることが知られている。従って、上記記載の細胞傷害活性の測定に際しては、対照として用いられる抗体は被験抗体と同一のアイソタイプを用いることが好ましい。
　また、生体内で細胞傷害活性を評価、あるいは測定するために、例えばDLL3発現癌細胞を非ヒト被検動物の皮内又は皮下に移植後、当日又は翌日から毎日又は数日間隔で被験抗体を静脈又は腹腔内に投与する。腫瘍の大きさを経日的に測定することにより細胞傷害活性を判定することができる。試験管内での評価と同様に同一のアイソタイプを有する対照抗体を投与し、抗DLL3抗体投与群における腫瘍の大きさが対照抗体投与群における腫瘍の大きさよりも有意に小さい場合に細胞傷害活性を有すると判定することができる。非ヒト被検動物としてマウスを用いる場合には、胸腺を遺伝的に欠損してそのＴリンパ球の機能を欠失したヌード（nu/nu）マウスを好適に用いることができる。当該マウスを使用することにより、投与された抗体による細胞傷害活性の評価・測定に当たって被検動物中のTリンパ球の関与を除くことができる。
診断薬（診断方法）
　また、本発明はDLL3タンパク質又はDLL3タンパク質をコードする遺伝子を検出することを特徴とする癌の診断方法を提供する。DLL3は癌組織あるいは癌細胞株において顕著な発現亢進が確認されている。したがって、DLL3は、癌を特異的に検出するためのマーカーとして有用である。
　本発明の診断方法の具体例の一つとして、以下の工程を含む癌の診断方法を挙げることができる。
(a)被験者から単離された試料を提供する工程、
(b)上記試料におけるDLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量を検出する工程。
　本発明の方法においては、さらに
(c)上記DLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量に基づいて、被験者が癌である可能性を評価する工程、
を含んでも良い。
DLL3タンパク質又はDLL3タンパク質をコードする遺伝子の検出
　本発明の方法の1つの態様においては、試料中のDLL3タンパク質を検出することにより癌の診断が行われる。DLL3タンパク質の検出はDLL3タンパク質を認識する抗体を用いて行われることが好ましい。
　本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出としては、次のような測定を挙げることができる。
・単にDLL3タンパク質が存在するか否かの測定
・DLL3タンパク質が一定の量以上存在するか否かの測定
・DLL3タンパク質の量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
　一方、定量的な検出とは、DLL3タンパク質の濃度の測定、DLL3タンパク質の量の測定などを挙げることができる。
　本発明における被検試料は、DLL3タンパク質が含まれる可能性のある試料であれば特に制限されない。具体的には、哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましい。さらに好ましい試料は、ヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は、生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの被検試料から得られる試料である。
　本発明によって診断される癌は、特に制限されることはなく如何なる癌でもよい。具体的には、肺癌、特に小細胞肺癌を挙げることができる。本発明においては、原発病巣及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
　本発明においては、被検試料中にタンパク質が検出された場合に、そのレベルを指標として癌が診断される。具体的には、陰性コントロール又は健常者と比較して被検試料中に検出されるDLL3タンパク質の量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。すなわち本発明は、次の工程を含む癌の診断方法に関する。
　(1)　被検者から採取された生体試料中のDLL3発現レベルを検出する工程、及び
(2)　(1)で検出されたDLL3の発現レベルが、対照と比較して高い場合に被検者が癌を有すると判定される工程。
　本発明において、対照とは、比較の基準となる試料をいい、陰性コントロールや健常者の生体試料が含まれる。陰性コントロールは、健常者の生体試料を採取し、必要に応じて混合することによって得ることができる。対照のDLL3の発現レベルは、被検者の生体試料におけるDLL3の発現レベルと平行して検出することができる。あるいは、予め、多数の健常者の生体試料におけるDLL3の発現レベルを検出し、健常者における標準的な発現レベルを統計学的に決定することができる。具体的には、たとえば、平均値±２×標準偏差(S.D.)、あるいは平均値±３×標準偏差(S.D.)を標準値として用いることもできる。統計学的に、平均値±２×標準偏差(S.D.)は80％の、また平均値±３×標準偏差(S.D.)は90％の健常者の値を含む。
　あるいは、対照におけるDLL3の発現レベルを、ROC曲線を利用して設定することができる。ROC曲線(receiver　operating　characteristic　curve；受信者操作特性曲線）は、縦軸に検出感度を、横軸に擬陽性率（すなわち"１－特異度"）を示すグラフである。本発明においては、生体試料中のDLL3の発現レベルを判定するための基準値を連続的に変化させたときの、感度と擬陽性率の変化をプロットすることによって、ROC曲線を得ることができる。
　なおROC曲線を得るための「基準値」は、統計学的な解析のために一時的に利用される数値である。ROC曲線を得るための「基準値」は、一般的には、選択しうる全ての基準値をカバーできる範囲内で、連続的に変化させられる。たとえば、解析される集団のDLL3の測定値の最小値と最大値の間で、基準値を変化させることができる。
　得られたROC曲線に基づいて、所望の検出感度、並びに精度を期待できる標準値を選択することができる。ROC曲線などによって統計学的に設定された標準値は、カットオフ値(cut-off　value)とも呼ばれる。カットオフ値に基づく癌の検出方法においては、上記工程(2)において、(1)で検出されたDLL3の発現レベルが、カットオフ値と比較される。そして、カットオフ値よりも(1)で検出されたDLL3の発現レベルが高いときに、被検者の癌が検出される。
　本発明において、DLL3の発現レベルは、任意の方法によって決定することができる。具体的には、DLL3のmRNAの量、DLL3タンパク質の量、またはDLL3タンパク質の生物学的な活性を評価することによって、DLL3の発現レベルを知ることができる。DLL3のmRNAやタンパク質の量は、本明細書に記載したような方法によって決定することができる。
　本発明においては、特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物を被験者とするときは、当該動物種のDLL3タンパク質が検出される。
　被検試料に含まれるDLL3タンパク質の検出方法は、特に限定されないが、抗DLL3抗体を用いた、以下に例示されるような免疫学的方法により検出することが好ましい。
酵素結合免疫吸着法（ELISA）、
ラジオイムノアッセイ（RIA）、
エンザイムイムノアッセイ（EIA）、
蛍光イムノアッセイ（FIA）、
発光イムノアッセイ（LIA）、
免疫沈降法（IP）、
免疫比濁法（TIA）、
ウエスタンブロット（WB）、
免疫組織化学（IHC）法、
免疫拡散法（SRID）、
ドットブロット法、
スロットブロット法。
　これらの手法の中で、免疫組織化学（IHC）法は、癌に羅患した患者から取得した組織若しくは細胞を固定化した切片上でDLL3タンパク質を検出する工程を含み、癌の診断方法として好ましい免疫学的アッセイ法の一つである。免疫組織化学（IHC）法などの上述した免疫学的方法は当業者に公知の方法である。
　DLL3は、癌細胞において特異的に発現が増強している膜タンパク質であることから、抗DLL3抗体によって、癌細胞、あるいは癌組織を検出することができる。上記の免疫組織学的な解析によって、生体から採取された細胞や組織に含まれる癌細胞が検出される。
　別な好ましい態様では、生体内の癌組織を抗DLL3抗体によって検出することもできる。この方法は、具体的には、(1)放射性同位元素等の標識物質で標識されたDLL3タンパク質に結合する抗体を被検者に投与する工程と、(2)該標識物質の集積を検出する工程を含む。生体内に投与した抗体を追跡するために、抗体は、検出可能に標識することができる。たとえば蛍光物質や発光物質、あるいは放射性同位元素で標識された抗体の生体における挙動を追跡することができる。蛍光物質や発光物質で標識された抗体は、内視鏡や腹腔鏡を利用して観察することができる。放射性同位元素は、その放射活性を追跡することによって、抗体の局在を画像化することができる。本発明において、生体内における抗DLL3抗体の局在は、癌細胞の存在を表している。
　生体内の癌を検出するために抗体を標識する放射性同位元素として、陽電子放出核種を利用することができる。たとえば18F、55Co、64Cu、66Ga、68Ga、76Br、89Zr、及び124Iのような陽電子放出核種で抗体を標識することができる。これらの陽電子放出核種による抗DLL3抗体の標識には、公知の方法（Acta　Oncol.　32,　825-830,　1993）を利用することができる。
　陽電子放出核種で標識された抗DLL3抗体がヒトや動物に投与された後に、PET（ポジトロン断層撮影装置）により、その放射性核種が放射する放射線が体外から計測され、コンピュータートモグラフィーの手法で画像に変換される。PETは、薬物の体内挙動などに関するデータを非侵襲的に得るための装置である。PETによって、放射強度をシグナル強度として定量的に画像化することができる。上記のようにPETを使用することによって、患者から試料を採取することなく特定の癌で高発現する抗原分子が検出できる。抗DLL3抗体は、上記の核種の他に11C、13N、15O、18F、45Ti等の陽電子放出核種を用いた短寿命核種によって放射標識することもできる。
　医療用サイクロトロンによる上記核種を用いた短寿命核種の生産、短寿命放射標識化合物の製造技術等に関する研究開発が進められている。これらの技術により抗DLL3抗体を種々の放射性同位元素によって標識することができる。患者に投与された抗DLL3抗体は、各部位の病理組織に対する抗DLL3抗体の特異性に従って原発巣及び転移巣に集積する。抗DLL3抗体が陽電子放出核種で標識されていれば、その放射活性を検出することにより該原発巣及び転移巣の存在が放射活性の局在によって検出される。該診断用途に用いる場合には25-4000　keVのガンマ粒子又は陽電子放射量の活性値が適切に使用できる。また、適切な核種を選択して、さらに大量に投与すれば治療効果も期待できる。放射線による抗癌作用を得るためには、70-700　keVのガンマ粒子又は陽電子放射量値を与える核種を使用できる。
DLL3タンパク質をコードするポリヌクレオチドの検出
　本発明の方法の別の態様においては、DLL3のポリヌクレオチドの発現を検出する。本発明において検出されるポリヌクレオチドは特に限定されないが、mRNAが好ましい。本発明において検出とは、定量的又は定性的な検出を含む。例えば、定性的な検出として、次のような測定操作を挙げることができる。
・単にDLL3のmRNAが存在するか否かの測定、
・DLL3のmRNAが一定の量以上存在するか否かの測定、
・DLL3のmRNAの量を他の試料（例えば、コントロール試料など）と比較する測定など。
　一方、定量的な検出とは、DLL3のmRNAの濃度の測定、DLL3のmRNAの量の測定などを挙げることができる。
　本発明における被検試料としては、DLL3のmRNAが含まれる可能性のある任意の試料を利用することができる。哺乳類などの生物の体から採取された試料が好ましく、さらに好ましくはヒトから採取された試料である。被検試料の具体的な例としては、例えば、血液、間質液、血漿、血管外液、脳脊髄液、滑液、胸膜液、血清、リンパ液、唾液、尿、組織などが例示できる。好ましい試料は生物の体から採取された組織若しくは細胞が固定化された標本又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料も本発明の被検試料に含まれる。
　生物の体から採取された組織、若しくは細胞が固定化された標本、又は細胞の培養液などの、被検試料から得られる試料を用いる場合にはインシトゥーハイブリダイゼーション法が好適に用いられる。インシトゥーハイブリダイゼーション法は、細胞や組織内の特定のDNAやRNAの有無若しくは分布及びその発現の強弱を確認する手法として発展してきた。原理としては細胞内の特定の核酸配列に対して相補的な塩基配列を有するプローブ核酸が特異的に複合体を形成する性質を利用したものである。当該プローブに予め放射性同位元素（RI）や抗原物質（ハプテン）等を標識しておくことにより、当該標識の検出を通じてハイブリダイゼーションした箇所が識別可能となることから、インシトゥーハイブリダイゼーション法は細胞内DNAやRNAなどの検出等に用いられている。プローブの標識としては好適にはRIによる標識を用いることができる。さらに好適な例としては、非放射性物質のビオチンやジゴキシゲニン等のハプテン等を利用した蛍光標識を用いることができる。特に好適な例としてはFISHと呼ばれる蛍光インシトゥーハイブリダイゼーション（fluorescence　in　situ　hibridization）による検出法が用いられる。
　本発明によって診断される癌は、特に制限されない。具体的には、肺癌、特に小細胞肺癌を挙げることができる。本発明においては、原発病巣及び転移病巣のいずれをも診断することができる。
　本発明においてはDLL3遺伝子を発現する任意の動物種を被験者とすることができる。特に好適な被検者はヒトである。なおヒト以外の動物種を被験者とするときには、当該動物種のDLL3の遺伝子が検出される。
　以下に検出方法の具体的な態様を記載する。まず、被検者から試料を調製する。次いで、該試料に含まれるDLL3のmRNAを検出する。本発明においては、mRNAから合成したcDNAを検出することもできる。本発明においては、被検試料中にDLL3のmRNAやDLL3をコードするcDNAが検出された場合、癌の可能性があると判定される。たとえば、陰性コントロール又は健常者と比較して、被検試料中に検出されるDLL3のmRNAやDLL3をコードするcDNAの量が多い場合に、被検者が癌である、又は将来癌を羅患する可能性が高いことが示される。
　ｍRNAを検出する方法は、公知である。具体的には、例えば遺伝子チップ、cDNAアレイ、及びメンブレンフィルターから選ばれる固相化試料を用いた核酸ハイブリダイゼーション法、RT-PCR法、リアルタイムPCR法、サブトラクション法、ディファレンシャル・ディスプレイ法、ディファレンシャル・ハイブリダイゼーション法、ならびにクロスハイブリダイゼーション法等を本発明に利用することができる。
　上記した本発明の検出方法は、種々の自動検査装置を用いて自動化することもできる。自動化することによって、短時間に多数の試料を検査することができる。
癌の診断のためのキット
　本発明は、被検試料中のDLL3タンパク質を検出するための試薬を含む、癌の診断のための診断薬又はキットも提供する。本発明の診断薬は、少なくとも抗DLL3抗体を含む。
　本発明の癌の診断用試薬と、DLL3の検出に用いられるその他の要素を組み合わせることによって、癌の診断のためのキットとすることができる。すなわち本発明は、DLL3に結合する抗体と、該抗体とDLL3との結合を検出する試薬を含み、さらにDLL3を含む生体試料からなる対照試料を含んでいてもよい、癌の診断のためのキットに関する。本発明のキットには、さらに測定操作を説明するための指示書をキットに添付することもできる。
　以下に実施例により本発明をより詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。
〔実施例1〕DLL3(delta-like　3)の小細胞肺癌における転写亢進
　ヒトDLL3　mRNAの臨床癌、癌細胞株、各種正常臓器における遺伝子発現分布を　Human　Exon　1.0　ST　Array　(Affymetrix社)　を用いて解析した。発現解析において、13例の小細胞肺癌癌摘出組織の腫瘍部、3種類の小細胞肺癌細胞株、及び49種類の正常組織(Clontech　社、Ambion社、STRATAGENE社、Cell　APPLICATIONS社、Panomics社、CHEMICON社、BioChain　Institute社から購入)に由来するtotal　RNAを使用した。全ての臨床癌摘出組織の腫瘍部及び癌細胞株(ATCCから購入)については、Trizol　(Invitrogen)を用いて製品添付の方法に従ってtotal　RNA抽出を実施した。上述のtotal　RNA　1μgを用い、GeneChip　Whole　Transcript　(WT)　Sense　Target　Labeling　Assay　Manual　(Affymetrix)に準じて遺伝子発現解析実験を実施、Human　Exon　1.0　ST　Array　Dataの数値化は、Affymetrix社提供のExACT　(Exon　Array　Computational　Tool)ソフトウェアを用いて実施した。
　Human　Exon　1.0　ST　Array上にはDLL3に対するコアプローブセットが13個存在した。これらプローブセット発現値の平均を求め、組織間での遺伝子発現量を比較した。正常組織、小細胞肺癌摘出組織の腫瘍部および小細胞肺癌細胞株の発現データを図1に示した。
　小細胞肺癌摘出組織の腫瘍部、小細胞肺癌細胞株において、胎児脳を除く正常組織に比較しヒトDLL3遺伝子発現が著明に亢進していることが見出された。結果は、ヒトDLL3を分子標的とした抗腫瘍剤を用いた治療法の有効性、すなわち、正常組織へダメージを与えずに腫瘍を縮小させる可能性を期待させる。
〔実施例2〕cDNAクローニング、組換え細胞の作製
　配列番号:1および57で示されるヒトDLL3　cDNA（NM＿016941）をヒト胎児脳cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。pMCNは、マウスCMVプロモータ（GenBank:　U68299）下で外来遺伝子を発現させることが可能である。pMCNベクターはジェネティシン耐性遺伝子をもっている。ヒトDLL3発現ベクターでCHO細胞株DG44（Invitrogen）を形質転換した。ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3蛋白質を安定発現するクローン化細胞を市販抗DLL3抗体(R&D　Systems,　MAB4315)で選抜し、ヒトDLL3/DG細胞を樹立した。同様にしてヒトDLL3発現ベクターでマウスIL-3依存性　pro　B　細胞株Ba/F3を形質転換し、ヒトDLL3/BaF3細胞を樹立した。
　配列番号:2および58で示されるマウスDLL3　cDNA（NM＿007866）をマウス胎児cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。マウスDLL3発現ベクターで細胞株Ba/F3を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスDLL3蛋白質発現細胞を市販抗体(R&D　Systems,　MAB4315)で選抜しマウスDLL3/BaF3細胞を樹立した。
　配列番号:3および59で示されるヒトDLL1　cDNA（NM＿005618）をヒト脾臓cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL1発現ベクターで細胞株Ba/F3を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL1蛋白質発現細胞を市販抗体(R&D　Systems,　MAB1818)で選抜しヒトDLL1/BaF3細胞を樹立した。
　配列番号:4および60で示されるヒトNotch1　cDNA（NM＿017617）を乳癌細胞株DU4475　cDNAライブラリよりPCR増幅し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトNotch1発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトNotch1蛋白質発現細胞を市販抗体(GeneTex,　GTX23294)で選抜しヒトNotch1/DG44細胞を樹立した。
　DLL3抗体を取得するための免疫原ならびに取得した抗体のエピトープ決定を目的として、DLL3可溶型蛋白質およびそのN末端欠失変異体蛋白質産生株を作製した。ヒトDLL3細胞外配列はNotch受容体結合モチーフDSLドメイン(アミノ酸配列番号176-215)、6個のEGF様ドメイン（1:216-249,　2:274-310,　3:312-351,　4:353-389,　5:391-427,　6:429-465）から構成される。
　ヒトDLL3細胞外領域　(配列番号:1アミノ酸配列27-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3-Fc（配列番号:5）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3-Fc産生DG44細胞を樹立した。
　ヒトDLL3細胞外領域部分配列(配列番号:1アミノ酸配列176-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3delta1-Fc（配列番号:6）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3delta1-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3delta1delta1-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3delta1-Fc産生DG44細胞を樹立した。
　ヒトDLL3細胞外領域部分配列(配列番号:1アミノ酸配列216-492)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3delta2-Fc（配列番号:7）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。ヒトDLL3delta2-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトDLL3delta1delta2-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトDLL3delta2-Fc産生DG44細胞を樹立した。
　マウスDLL3細胞外領域　(配列番号:2　アミノ酸配列33-490)とマウスIgG2a抗体定常領域配列からなるキメラ分子ヒトDLL3-Fc（配列番号:8）をコードするcDNAを作製し、哺乳動物発現ベクターpMCNにクローニングした。マウスDLL3-Fc発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスDLL3-Fc蛋白質を高発現するクローンを、抗マウス抗体を用いたELISAで選抜し、マウスDLL3-Fc産生DG44細胞を樹立した。
　Fc融合蛋白質産生株培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイ(バイオラッド)で決定した。
〔実施例3〕抗DLL3抗体の取得、エピトープおよび抗体インターナライゼーションの解析
　Balb/c(日本チャールス・リバー)およびMRL/MpJJmsSlc-lpr/lpr(日本エスエルシー)マウスに6～7週令より免疫を行った。初回免疫時にはフロイント完全アジュバント(ベクトン・ディッキンソン)を用いてエマルジョンを作製し0.1mg　ヒトDLL3-Fc/headとなるように皮下に抗原蛋白質を投与した。二週置いたのち、週一回合計3～6回のフロイント不完全アジュバントで作製した抗原エマルジョンを作製し0.05mg/headの容量で皮下投与した。血清抗体価上昇の認められたマウス個体に対し0.05mgの抗原蛋白質を静脈内に投与した。3日後にその脾臓細胞を摘出し、マウスミエローマ細胞P3-X63Ag8U1(ATCC)と細胞数比で約3:1の割合で混合し、ポリエチレングリコール(PEG)法にて細胞融合した。遠心操作によりPEGを除去したのち、1x　HAT　media　supplemet(シグマ)、0.5x　BM-Condimed　H1　Hybridomacloning　supplement(ロシュダイアグノスティック)、10%牛胎児血清を含むRPMI1640培地に懸濁し、細胞濃度を調製したのち96ウェルプレートに細胞を播き込んだ。ハイブリドーマコロニー形成を確認した後、培養上清中に含まれる抗DLL3抗体の有無をヒトDLL3-Fcをコートしたプレートを用いてELISA解析した。陽性ウェルに含まれるハイブリドーマ細胞を限界希釈法によりクローン化し、抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ株を樹立した。モノクローナル抗体のアイソタイプをIsoStrip(ロシュダイアグノスティック)を用いて決定した。
　樹立したハイブリドーマ培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、および脱塩処理によりIgGモノクローナル抗体を精製した。精製抗体濃度はDCプロテインアッセイにより決定した。
　ヒトDLL3-Fc、マウスDLL3-Fc、ヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-FcをそれぞれNuncイムノプレート(439454)に固層化した。続いて牛血清アルブミンを含む溶液でプレートの未反応表面をブロッキングした。洗浄後、適切な濃度になるように調製された抗体希釈液を添加し、1時間、室温にてインキュベートした。プレートから反応液を除去、Tween20を含むTBSで洗浄後、アルカリフォスファターゼ標識した抗マウスIgK抗体をプレートに添加し、１時間インキュベートした。プレートを洗浄後、アルカリフォスファターゼ基質Sigma104を添加し、室温にてインキュベートした。インキュベーション後の波長405nmおよび参照波長655nmでの吸光度を測定した。結果を図2に示した。すべての精製抗体が、用量依存的にヒトDLL3-Fcに結合した。モノクローナル抗体DL301,　DL302,　DL306,　DL312および市販抗体MAB4315はマウスDLL3-Fcに結合した。市販抗体MAB4315はヒトDLL3delta1-Fcに結合したが、ヒトDLL3delta2-Fcに結合しなかったことより、そのエピトープはDSLドメインにあることが示された。DL303,　DL304,　DL307,　DL311抗体はヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-Fc両方に結合しなかった。したがってこれらの抗体のエピトープは配列番号1のアミノ酸配列27-175の間に存在すると推測された。DL301,　DL302,　DL305,　DL306,　DL308,DL309,　DL312は、ヒトDLL3delta1-Fc、ヒトDLL3delta2-Fc両方に結合したことから、これら抗体のエピトープは配列番号1のアミノ酸配列216-492上にあることが示された。図9に全長DLL3蛋白質および可溶型DLL3Fc融合蛋白質の構造概要、抗DLL3抗体の認識部位を示した。
　細胞膜上に発現するヒトDLL3へのモノクローナル抗体の結合、ヒトDLL3-モノクローナル抗体複合体の細胞膜上での挙動をフローサイトメトリー解析した。FACS　buffer(1%　牛胎児血清、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBS)でヒトDLL3/BaF3細胞を懸濁し、1x106細胞/ml、終濃度5μg/mlのモノクローナル抗体となるように4℃で30分間反応させた。遠心し、上清を除去した後、FACS　bufferで細胞を一度洗浄した。FITC標識抗マウスIgG(H+L)抗体(ベックマンコールター)を添加し、4℃、30分間インキュベートした。遠心して未反応のFITC抗体を除去したのち、細胞を再懸濁してフローサイトメーターFACSCalibur(ベクトンディッキンソン)で解析した。DLL3-抗体複合体の細胞膜上からの移動消失を解析する目的では、ヒトDLL3/BaF3細胞を10%牛胎児血清(FBS)、マウスIL3を含むRPMI1640培養液に懸濁した。1x106細胞/ml、終濃度5μg/mlのモノクローナル抗体となるように混合し、CO2インキュベーター中37℃で1時間、もしくは4時間反応させた。反応後、上述と同様の方法にて細胞膜上に結合した抗体量をフローサイトメトリー解析した。細胞ヒストグラムプロット蛍光強度の幾何平均値(X　Geo　Mean)をFACSCalibur付属解析ソフトウェアCELLQuestProを用いて求めた。単離した抗DLL3モノクローナル抗体はすべて細胞上のDLL3に結合した(図3(a))。4℃で抗体と細胞を反応させると、DLL3-抗体複合体の細胞膜上から細胞内への取り込みなどの膜流動性は抑制される。37℃で抗体と細胞を反応させると、DLL3-抗体複合体の細胞内への取り込み、プロテアーゼ分解などによる細胞膜上からの遊離であるシェディングが起こりうる。37℃、1時間および4時間インキュベーションした場合の、それぞれのモノクローナル抗体の細胞膜上の結合量を、4℃における細胞結合量と比較した相対値として図3(b)に示した。37℃でインキュベーションした場合、細胞膜表面上のDL303,　DL304,　DL305,　DL308,　DL309,　MAB4315抗体量は減少した。結果はDLL3-抗体複合体のインターナライゼーション、もしくはシェディングを示唆している。一方、DL301,　DL306,　DL307,　DL311,　DL312は37℃でインキュベーションした場合、細胞膜表面上の抗体量はほとんど変わらないか、逆に増加した。後者の抗体はDLL3複合体として細胞膜上に安定に滞在できることを示している。
　細胞表面上のDLL3蛋白質数を、フローサイトメトリーによる抗原量定量分析システムQIFIKIT(DAKO,　F0479)を用いて決定した。終濃度5μg/mlの抗DLL3抗体DL303を一次抗体として使用し、添付プロトコールに従い、解析した。ヒトDLL3/BaF3,　NCI-H1184(ATCC),　NCI-H1436(ATCC),　Y79(理研Cell　Bank　)の細胞表面の抗原数はそれぞれ、約9000,　7000,　6000,　3000であった。
〔実施例4〕抗DLL3抗体によるADCC活性の誘導、抗体トキシン複合体を介した増殖抑制
　抗DLL3抗体の、カルセインラベルしたDLL3発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)誘導活性を調べた。DLL3を発現する、ヒトDLL3/BaF3および小細胞肺癌細胞株NCI-H1184(ATCC)を、20μg/ml　Calcein-AM(Dojindo,　349-07201)存在下で90分間培養し、遠心、洗浄することで、カルセインラベルしたターゲット細胞を準備した。96ウェルプレート(Coster　3799)に1x104のターゲット細胞を播き込んだ。つづいて適切な終濃度になるように調製された抗体を添加して室温にて15分間インキュベートした。各ウェルに5x104のエフェクター細胞を添加し、反応プレートを37℃、CO2インキュベーター中にてインキュベートした。エフェクター細胞にはマウスFcγR3-ヒトFcγR3キメラ分子を発現するNK92細胞(WO　2008/093688)が用いられた。4時間インキュベートした後、遠心したプレートの各ウェルより100μlの培養上清を回収し、蛍光強度をARVO　SX(Wallac)を用いて測定した。
　下式によりADCC誘導活性を算出した。
ADCC[%]=(A-C)/(B-C)　×　100
ここでAは各ウェルにおける蛍光強度、Bは終濃度1%　Nonidet　P-40で細胞溶解した上清中の蛍光強度平均値、Cは培地のみ添加した場合の蛍光強度平均値である。各々の実験条件において3点測定し、平均値と標準偏差を算出した。図4は終濃度2.5μg/mlで抗体を添加した場合のDLL3/BaF3細胞に対するADCC誘導活性を示す。コントロール抗体であるIgG1,　IgG2bにADCC活性が認められなかった一方で、DL301,　DL306,　DL312にADCC誘導活性が認められた。市販モノクローナル抗体MAB4315には明瞭なADCC誘導活性は認められなかった。図5は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対しDL301,　DL306,　D312抗体が用量依存的にADCCを誘導することを示す。
　抗DLL3モノクローナル抗体の細胞内への取り込みを、トキシン標識した抗マウス2次抗体Mab-ZAP(Advanced　Targeting　Systems)を用いて評価した。96ウェルプレートに1ウェルあたり5x103のDLL3/BaF3細胞を播き込んだ。続いて終濃度1μg/mlになるように抗DLL3マウスモノクローナル抗体およびMabZAPを添加し、37℃、CO2インキュベーター中でインキュベートした。4日後、生細胞数測定試薬SF(ナカライテスク)を添加し、マイクロプレートリーダーを用いて450nm、対照波長620nmの吸光度を測定することで細胞増殖を測定した(図6)。抗DLL3モノクローナル抗体およびMabZAPを細胞に添加すると、細胞の増殖は抑制された。ADCC誘導活性が認められたDL301,　DL306,　DL312は、抗体とDLL3発現細胞を混合して37℃培養した後に細胞上に残存する抗体量が多く、かつ、MabZAP複合体の細胞内取り込みによる増殖抑制効果は低かった。
〔実施例5〕抗体可変領域クローニング、組換え抗体の作製
　抗DLL3抗体を産生するハイブリドーマ全RNAよりSmart　5’-RACE　cDNAライブラリ(Clontech)を作製した。全RNA調製はRNeasy　Miniカラム(Qiagen)を用いて行った。cDNAライブラリ作製は製造者の指示に従った。抗体定常領域配列に相補するプライマーを使い、抗体可変領域配列(VH,　VL)をPCR増幅した。PCR増幅したフラグメントをpCR2.1TOPOにクローニングし、その塩基配列を決定した。得られたVH、VL配列とヒトIgG1定常領域配列からなるキメラ抗体発現ベクターを構築した。軽鎖、重鎖はともに一つの哺乳動物細胞発現ベクターに組み込まれ、両者はマウスCMVプロモータ下で転写される。表1は同定した抗体可変領域配列とそのCDR配列、マウス抗体全長配列、キメラ抗体配列の配列番号の対応を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　キメラ抗体発現ベクターをCOS-7細胞に導入し、一過的にキメラ抗体を発現させた。COS-7培養上清中のキメラ抗体がヒトDLL3蛋白質に結合することをフローサイトメトリー法とELISA法で確認した。COS-7培養上清中のキメラ抗体濃度をサンドイッチELISA法で算出した。この際既知濃度のヒトキメラ抗体を濃度算出のスタンダートとして利用した。FACS　buffer(1%　牛胎児血清を含むPBS)に懸濁されたヒトDLL3/BaF3細胞に終濃度1μg/mlとなるようキメラ抗体を添加した。30分間4℃にてインキュベーション、洗浄、FITCラベルした抗ヒト抗体(Beckman-Coulter)と反応させ、フローサイトメーターFACSCaliburで結合を解析した。図7に示したように、キメラ抗体DL301,　DL309,　DL312はヒトDLL3/BaF3に結合した。いずれのキメラ抗体も強制発現細胞の親株であるBa/F3細胞には結合しなかった。ヒトDLL3-FcをNuncイムノプレートに固層化し、固層化蛋白質に対するキメラ抗体の結合を解析した。抗原に結合したキメラ抗体を検出するために、キメラ抗体添加後に、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒト抗体(Biosource、AHI0305)、アルカリフォスファターゼ基質Sigma104を順に添加し、その吸光度を求めた。DL301,　DL309,　DL312キメラ抗体は用量依存的にヒトDLL3-Fcに結合した(図8(a))。
〔実施例6〕競合ELISAによるエピトープグルーピング
　キメラ抗体とマウス抗体の抗原分子に対する結合競合をELISA法で解析した(図8(b))。Nuncイムノプレートに1ウェルあたり10ngのヒトDLL3-Fcを添加し固層化した。終濃度50ng/mlのキメラ抗体および適切に希釈されたマウス抗体の混和物をDLL3-Fc蛋白質固層化プレートに添加した。プレートを室温にて1時間インキュベートした後、洗浄、アルカリフォスファターゼ標識した抗ヒト抗体を添加してインキュベートした。インキュベーション後、Sigma104を添加し、吸光度を測定した。キメラ抗体の抗原分子への結合はもととなるマウスモノクローナル抗体のそれと競合的であった。DL301マウス抗体以外の抗体はDL301キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。DL312マウス抗体以外の抗体はDL312キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。したがって、DL301、DL312はそれぞれユニークなエピトープに結合することが示された。DL305,　DL308,　DL309マウス抗体はそれぞれほぼ同程度にDL309キメラ抗体の抗原への結合を阻害した。したがってこれら3抗体のエピトープは同一であると考えられる。ADCC誘導活性が認められたDL306マウス抗体は、DL301キメラ抗体、DL309キメラ抗体、DL312キメラ抗体の抗原への結合を阻害しなかった。DL306はDL301,DL309,DL312とは独立なエピトープを認識していることが示された。
〔実施例7〕組換え抗DLL3抗体発現株樹立、組換え抗体精製
　DL306キメラ抗体発現ベクターをCOS-7細胞に導入し、一過的にキメラ抗体を発現させた。COS-7培養上清中のキメラ抗体がヒトDLL3蛋白質に結合することをフローサイトメトリー法で確認した。COS-7培養上清中のキメラ抗体濃度をサンドイッチELISA法で算出した。この際既知濃度のヒトキメラ抗体を濃度算出のスタンダートとして利用した。FACS　buffer(1%　牛胎児血清を含むPBS)に懸濁されたヒトDLL3/BaF3細胞に終濃度1μg/mlとなるようキメラ抗体を添加した。30分間4℃にてインキュベーション、洗浄、FITCラベルした抗ヒト抗体(Beckman-Coulter)と反応させ、フローサイトメーターFACSCaliburで結合を解析した。図10に示したように、キメラ抗体DL306はヒトDLL3/BaF3に結合し、親株であるBa/F3細胞には結合しなかった。
　DL301,　DL306,　DL309,　DL312ヒトキメラ抗体発現ベクターで細胞株DG44を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。ヒトキメラ抗体を高発現するクローンを、抗ヒト抗体を用いたELISAで選抜し、ヒトキメラ抗体産生DG44細胞を樹立した。
　ヒトキメラ抗体産生株培養上清より、rProteinAアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイ(バイオラッド)で決定した。
　DL301,　DL306,　DL312　のVH,VL配列とマウスIgG2a定常領域配列からなるマウスIgG2a抗体発現ベクターを構築した。軽鎖、重鎖はともに一つの哺乳動物細胞発現ベクターに組み込まれ、両者はマウスCMVプロモータ下で転写される。マウスIgG2a抗体発現ベクターでフコーストランスポーターを欠失させたCHO細胞株(WO2005/017155)を形質転換し、ジェネティシン存在下で薬剤耐性細胞を選抜した。マウスIgG2a抗体を高発現するクローンを、抗マウスIgG2a抗体を用いたELISAで選抜し、低フコース化マウスIgG2a抗体産生CHO細胞を樹立した。低フコース化マウスIgG2a抗体産生株培養上清より、ProteinGアフィニティカラムクロマトグラフィ、ゲルろ過クロマトグラフィを用いて目的蛋白質を精製した。精製蛋白質濃度は既知濃度のIgGをスタンダートとして用いてDCプロテインアッセイで決定した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
〔実施例8〕組換え抗DLL3抗体によるADCC活性の誘導
　ヒトキメラおよびマウスIgG2a組換え抗DLL3抗体の、カルセインラベルしたDLL3発現細胞に対する抗体依存性細胞介在性細胞傷害(ADCC)誘導活性を調べた。DLL3を発現する、ヒトDLL3/BaF3および小細胞肺癌細胞株NCI-H1184(ATCC)を、20μg/ml　Calcein-AM(Dojindo,　349-07201)存在下で90分間培養し、遠心、洗浄することで、カルセインラベルしたターゲット細胞を準備した。96ウェルプレート(Coster　3799)に1x104のターゲット細胞を播き込んだ。つづいて適切な終濃度になるように調製された抗体を添加して室温にて15分間インキュベートした。各ウェルに5x104のエフェクター細胞を添加し、反応プレートを37℃、CO2インキュベーター中にてインキュベートした。低フコース化マウスIgG2a組換え抗体のエフェクター細胞としてマウスFcγR4ヒトFcγR3キメラ分子(WO　2008/093688)を発現するNK92細胞が用いられた。ヒトキメラ組換え抗体のエフェクター細胞としてヒトFcγR3分子を発現するNK92細胞が用いられた。4時間インキュベートした後、遠心したプレートの各ウェルより100μlの培養上清を回収し、蛍光強度をARVO　SXを用いて測定した。ADCC誘導活性を実施例4に記載した方法にて算出した。
　図11は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対し組換えヒトキメラ抗体DL301,　DL306,　DL309,　D312が用量依存的にADCCを誘導することを示す。
　図12は、DLL3/BaF3とNCI-H1184に対し低フコース化組換えマウスIgG2a抗体DL301,　DL306,　D312が用量依存的にADCCを誘導することを示す。
　本明細書中で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願をそのまま参考として本明細書中にとり入れるものとする。

Claims (13)

  1. DLL3タンパク質に結合する抗体。
  2. 細胞傷害活性を有することを特徴とする請求項１に記載の抗体。
  3. 細胞傷害活性が、抗体依存性細胞傷害活性（ADCC活性）である請求項２に記載の抗体。
  4. インターナライズ活性を有することを特徴とする請求項１～３いずれかに記載の抗体。
  5. 細胞傷害性物質が結合していることを特徴とする請求項１～４いずれかに記載の抗体。
  6. 配列番号：１に記載のアミノ酸配列を有するヒトDLL3において、216番目のアミノ酸～492番目までのアミノ酸の領域を認識することを特徴とする、請求項１～５いずれかに記載の抗体。
  7. 以下のいずれかに記載のDLL3タンパク質に結合する抗体：
    （１）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
    （２）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
    （３）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
    （４）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域を含む抗体；
    （５）配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （６）配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （７）配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （８）配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （９）配列番号１２に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号１３に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号１４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号１８に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号１９に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号２０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （１０）配列番号２４に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号２５に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号２６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号３０に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号３１に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号３２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （１１）配列番号３６に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号３７に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号３８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号４２に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号４３に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号４４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （１２）配列番号４８に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR1、配列番号４９に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR2、及び配列番号５０に記載のアミノ酸配列を有する重鎖CDR3を含む重鎖可変領域、および配列番号５４に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR1、配列番号５５に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR2、及び配列番号５６に記載のアミノ酸配列を有する軽鎖CDR3を含む軽鎖可変領域を含む抗体；
    （１３）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体において1若しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、付加及び／又は挿入された抗体であって、（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体と同等の活性を有する抗体；または
    （１４）（１）から（１２）のいずれかに記載の抗体が結合するDLL3タンパク質のエピトープと同じエピトープに結合する抗体。
  8. 請求項１～７のいずれかに記載の抗体を有効成分として含む医薬組成物。
  9. 抗癌剤である請求項８に記載の医薬組成物。
  10. 肺癌を対象とする抗癌剤である請求項９に記載の医薬組成物。
  11. 以下の工程を含む癌の診断方法
    (a)被験者から単離された試料を提供する工程、
    (b)上記試料におけるDLL3タンパク質又はDLL3遺伝子の発現量を検出する工程。
  12. 肺癌を診断するためのものである、請求項１１に記載の診断方法。
  13. 請求項１～７のいずれかに記載の抗体を含む癌の診断薬。
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