ES2889932T3

ES2889932T3 - Anticuerpo anti-DLL3

Info

Publication number: ES2889932T3
Application number: ES18156974T
Authority: ES
Inventors: Kenji Yoshida; Hiroyuki Aburatani; Shumpei Ishikawa
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; University of Tokyo NUC
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd; University of Tokyo NUC
Priority date: 2010-01-29
Filing date: 2011-01-28
Publication date: 2022-01-14
Anticipated expiration: 2031-01-28
Also published as: EP2530091A1; DK2530091T3; PL3342786T3; JP5918540B2; EP3342786A1; HRP20180952T1; US20120328624A1; PL2530091T3; RS57412B1; US20210380715A1; HUE038962T2; US20150368355A1; LT2530091T; EP3342786B1; PT3342786T; PT2530091T; SI3342786T1; JPWO2011093097A1; US11111311B2; US9127071B2

Abstract

Composición farmacéutica para la utilización en un método de tratamiento de cáncer pulmonar de células pequeñas que expresa proteína DLL3, en la que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3, en la que el anticuerpo presenta una actividad citotóxica y reconoce la región de aminoácidos 216 a 492 en la DLL3 humana que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID nº 1.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo anti-DLL3

Campo técnico

La presente solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente japonesa n° 2010-019391 (presentada el 29 de enero de 2010).

La presente invención se refiere a una composición farmacéutica para la utilización en un método de tratamiento del cáncer pulmonar de células pequeñas.

Antecedentes de la técnica

El cáncer pulmonar de células pequeñas constituye aproximadamente el 20% de toda la incidencia de cáncer pulmonar. El cáncer pulmonar de células pequeñas progresa rápidamente y resulta difícil de extirpar quirúrgicamente debido a que en muchos casos ya ha ocurrido en el momento del diagnóstico la metástasis a ganglios linfáticos o la metástasis distante. Dicho cáncer muestra elevadas tasas de respuesta a agentes anticáncer en su estadio temprano. De esta manera, la quimioterapia se considera la primera elección para el tratamiento del cáncer. Sin embargo, el cáncer se vuelve inmediatamente resistente a la quimioterapia y recurre, resultando en una tasa de supervivencia a 3 años de 5% o inferior. Por lo tanto, ha habido demanda de nuevas terapias.

La proteína de tipo delta 3 (DLL3) es una proteína membranal de tipo I perteneciente a la familia de ligandos Notch. DLL3 resulta necesaria para la formación de somitas y formación de patrón normales. Las mutaciones en DLL3 causan defectos en las costillas o espondilolisis en los pacientes de disostosis espondilocostal recesiva autosómica [referencias de la literatura no de patente n° 1 y n° 2]. DLL1 se localiza sobre la superficie celular y se une a Notch, mientras que DLL3 predominantemente se localiza en el aparato de Golgi y no se une a Notch [referencias de la literatura no de patentes n° 3 y n° 4].

Existen estudios anteriores que informan de la amplificación del gen DLL3 en el cromosoma y la expresión incrementada de dicho gen en líneas celulares de cáncer pancreático [referencia de la literatura no de patentes n° 5] y la expresión incrementada de DLL3 en algunos casos de glioma [referencia de la literatura no de patentes n° 6]. Sin embargo, el número de proteínas DLL3 sobre la superficie celular todavía no ha sido informado. La expresión de 105 o más moléculas de antígeno de anticuerpos no modificados o del orden de 104 o más moléculas de antígeno incluso para anticuerpos desfucosilados que presentan la capacidad potenciada de inducir citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC, por sus siglas en inglés) resulta necesaria para reconocer las moléculas de antígeno sobre la superficie celular mediante la utilización de dichos anticuerpos o para eliminar las células de cáncer bajo el mecanismo antitumoral de la actividad ADCC [referencia de la literatura no de patentes n° 7]. De esta manera, no se conoce con certeza que DLL3 resulte adecuada como diana terapéutica basándose en anticuerpos.

Los anticuerpos anti-DLL3 monoclonales de ratón (MAB4315, R&D Systems, Inc.) ya se encuentran disponibles comercialmente como reactivo de investigación.

Lista de referencias

Literatura no de patentes

Literatura no de patentes n° 1: Bulman, M. P. et al. Nat. Genet. 24, 438-441, 2000.

Literatura no de patentes n° 2: Turnpenny, P. D. et al. J. Med. Genet. 40, 333-339, 2003.

Literatura no de patentes n° 3: Geffers, I. et al. J. Cell Biol. 178, 465-476, 2007.

Literatura no de patentes n° 4: Ladi, E. et al. J. Cell Biol. 170, 983-992, 2005.

Literatura no de patentes n° 5: Phillips, H. S., Cancer Cell 9, 157-173, 2006.

Literatura no de patentes n° 6: Mulledndore, M. E., Clin. Cancer Res. 15, 2291-2301, 2009.

Literatura no de patentes n° 7: Kenya Shitara, YAKUGAKU ZASSHI 129, 3-9, 2009.

También se hace referencia a los documentos adicionales siguientes:

- el documento n°WO 2007/080597, que se refiere a nuevas secuencias de nucleótidos y aminoácidos, y a métodos de utilización de las mismas para el diagnóstico.

- Dunwoodie, Current Opinion in Genetics & Development, 19: 329-337, 2009, que se refiere al papel de Notch en la formación de patrón de la columna vertebral humana.

- D'Souza et al., Oncogene, 27: 5148-5167, 2008, que se refiere a las múltiples facetas de los ligandos Notch. Descripción resumida de la invención

Problema técnico

Un objetivo de la presente invención es proporcionar una composición farmacéutica para la utilización en un método de tratamiento del cáncer pulmonar de células pequeñas.

Solución al problema

Los presentes inventores han encontrado que la expresión de ARNm de DLL3 se encuentra incrementada en el cáncer pulmonar de células pequeñas. Su expresión era baja en todos los tejidos normales excepto en el cerebro fetal. Los presentes inventores prepararon anticuerpos monoclonales contra la proteína DLL3. El nivel de antígeno sobre la superficie celular medido basándose en la capacidad de unión al anticuerpo era inferior a 104 por cada célula expresante. Inesperadamente, los presentes inventores encontraron que un anticuerpo que se unía a DLL3 mediante un epítopo característico en la vecindad del extremo C-terminal del dominio extracelular residía establemente sobre la membrana celular y presentaba una actividad inductora de ADCC. Específicamente, los presentes inventores cribaron sucesivamente para un anticuerpo con una actividad antitumoral. Además, los presentes inventores encontraron que un anticuerpo conjugado con toxina presentaba una actividad citotóxica contra las células expresantes de DLL3. A partir de dichos resultados, los presentes inventores encontraron que el anticuerpo anti-DLL3 resultaba útil en el diagnóstico, prevención y tratamiento del cáncer primario o metastásico expresante de DLL3.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica para la utilización en un método de tratamiento del cáncer pulmonar de células pequeñas que expresa la proteína d LL3, en el que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3, en la que el anticuerpo presenta una actividad citotóxica y reconoce la región de aminoácidos 216 a 492 en la DLL3 humana que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 1.

El anticuerpo se une a la proteína DLL3 y presenta una actividad citotóxica. Particularmente preferentemente, la actividad citotóxica es una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (actividad ADCC). También preferentemente, el anticuerpo presenta una actividad de internalización. También preferentemente, el anticuerpo se conjuga con una sustancia citotóxica. El anticuerpo reconoce una región entre los aminoácidos 216 y 492 en la DLL3 humana que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 1.

En otro aspecto, la composición farmacéutica para la utilización según la invención comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 indicada en cualquiera de los elementos siguientes:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC iD n° 12, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 13, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 14, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 18, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 19, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 20;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 24, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 25, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 26, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 30, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 31, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 32;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 36, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 37, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 38, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 42, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 43, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 44;

(4) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 48, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 49, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 50, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 54, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 55, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 56.

La invención se define en la reivindicación 1. Se define aspectos adicionales y realizaciones preferentes en las reivindicaciones dependientes. Cualesquiera aspectos, realizaciones y ejemplos de la presente exposición que no se encuentren comprendidos en el alcance según las reivindicaciones adjuntas no forman parte de la invención y se proporcionan meramente con fines ilustrativos.

Breve descripción de los dibujos

[Figura 1] La figura 1 muestra la expresión incrementada de DLL3 en el cáncer pulmonar de células pequeñas y en el cerebro fetal.

[Figura 2] La figura 2 muestra la unión de un anticuerpo monoclonal anti-DLL3 a una proteína DLL3 soluble. [Figura 3] La figura 3 muestra la unión de un anticuerpo a la proteína DLL3 sobre una membrana celular y la renovación de los anticuerpos unidos a células.

[Figura 4] La figura 4 muestra la inducción de ADCC por un anticuerpo anti-DLL3 (concentración: 2,5 |jg/ml). [Figura 5] La figura 5 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpos de una actividad de ADCC contra células diana DLL3/BaF3 (a) y NCI-H1184 (b).

[Figura 6] La figura 6 muestra la inhibición del crecimiento celular por la incorporación de un anticuerpo anti-DLL3 y un anticuerpo secundario antiratón Mab-ZAP marcado con toxina.

[Figura 7] La figura 7 muestra la unión de un anticuerpo anti-DLL3 recombinante a la proteína DLL3 sobre la superficie celular.

[Figura 8] La figura 8 muestra la unión de un anticuerpo quimérico humano anti-DLL3 recombinante a una proteína DLL3 soluble y la competición para la unión de un anticuerpo quimérico anti-DLL3 con un anticuerpo de ratón contra una proteína DLL3 soluble.

[Figura 9] La figura 9 muestra la estructura esquemática de las proteínas DLL3 de longitud completa y solubles y un sitio reconocido por un anticuerpo anti-DLL3.

[Figura 10] La figura 10 muestra la unión del anticuerpo quimérico anti-DLL3 recombinante anticuerpo DL306 a la proteína DLL3 sobre la superficie celular.

[Figura 11] La figura 11 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpos de la actividad ADCC de un anticuerpo quimérico humano anti-DLL3 contra las células diana DLL3/BaF3 y NCI-H1184.

[Figura 12] La figura 12 muestra la dependencia de la concentración de anticuerpo de la actividad ADCC de un anticuerpo bajo en fucosa de ratón anti-DLL3 contra las células diana DLL3/BaF3 y NCI-H1184.

Descripción detallada

DLL3

La secuencia de aminoácidos de DLL3 (proteína de tipo delta 3) es conocida de la técnica. Por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de DLL3 humana es tal como se indica en la SEC ID n° 1 (NM_016941), y la secuencia de aminoácidos de DLL3 de ratón es tal como se indica en la SEC ID n° 2 (NM_007866).

La proteína DLL3 puede ser una proteína DLL3 que presenta la secuencia indicada anteriormente o puede ser una proteína modificada que presenta una secuencia derivada de la secuencia indicada anteriormente mediante la modificación de uno o más aminoácidos. Entre los ejemplos de la proteína modificada que presenta una secuencia derivada de la secuencia indicada anteriormente mediante la modificación de uno o más aminoácidos pueden incluirse los polipéptidos que presentan 70% o más, preferentemente 80% o más, más preferentemente 90% o más, todavía más preferentemente 95% o más, homología respecto a la secuencia de aminoácidos. Alternativamente, pueden utilizarse péptidos parciales de dichas proteínas d LL3.

La proteína DLL3 no se encuentra limitada por su origen y es preferentemente una proteína DLL3 humana.

Anticuerpo anti-DLL3

El anticuerpo anti-DLL3 solo necesita unirse a la proteína DLL3, presentar una actividad citotóxica y reconocer una región entre los aminoácidos 216 y 492 en la DLL3 humana que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 1 y no se encuentra particularmente limitada por su origen, tipo, forma, etc. Específicamente, puede utilizarse un anticuerpo, tal como un anticuerpo de origen animal no humano (p.ej., un anticuerpo de ratón, rata o camello), un anticuerpo de origen humano, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. El anticuerpo anti-DLL3 puede ser un anticuerpo policlonal o monoclonal y es preferentemente un anticuerpo monoclonal.

El anticuerpo anti-DLL3 es preferentemente un anticuerpo anti-DLL3 humana. El anticuerpo anti-DLL3 humana puede ser un anticuerpo que se une específicamente a DLL3 humana o puede ser un anticuerpo que se une a DLL3 humana, así como DLL3 de origen animal no humano (p.ej., DLL3 de ratón).

El anticuerpo anti-DLL3 puede obtenerse en forma de un anticuerpo policlonal o monoclonal mediante la utilización de medios conocidos de la técnica. El anticuerpo anti-DLL3 es particularmente preferentemente un anticuerpo monoclonal de origen mamífero. El anticuerpo monoclonal de origen mamífero comprende, por ejemplo, los producidos mediante hibridomas y los producidos por huéspedes transformados con vectores de expresión que contienen un gen de anticuerpo mediante un enfoque de ingeniería genética.

El anticuerpo anti-DLL3 puede modificarse con diversas moléculas, tales como polietilenglicol (PEG). Tal como se indica posteriormente, el anticuerpo anti-DLL3 también puede modificarse con un agente quimioterapéutico, un compuesto químico radioactivo o similar, que presenta una actividad citotóxica.

Entre los ejemplos del anticuerpo, que reconoce DLL3 y se une a la misma, pueden incluirse los anticuerpos siguientes:

(1) un anticuerpo (DL301) que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 12, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 13, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 14, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 18, c DR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 19, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 20;

(2) un anticuerpo (DL306) que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 24, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 25, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 26, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 30, c DR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 31, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 32;

(3) un anticuerpo (DL309) que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 36, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 37, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 38, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 42, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 43, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 44 y

(4) un anticuerpo (DL312) que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 48, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 49, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 50, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 54, c DR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 55, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 56.

Los anticuerpos (1) a (4) pueden contener regiones constantes. Las regiones constantes utilizadas no se encuentran particularmente limitadas, y puede utilizarse cualquier región constante. Entre los ejemplos preferentes de las regiones constantes pueden incluirse regiones constantes de origen humano. Por ejemplo, puede utilizarse una región constante derivada de IgG1 humana, derivada de IgG2 humana, derivada de IgG3 humana o derivada de IgG4 humana, a modo de región constante de cadena pesada. Además, por ejemplo, puede utilizarse una región constante derivada de cadena k humana o de cadena A humana a modo de región constante de cadena ligera. Las regiones constantes pueden ser regiones constantes que presentan una secuencia nativa o pueden ser regiones constantes modificadas que presentan una secuencia derivada de la secuencia nativa mediante la modificación de uno o más aminoácidos.

Los anticuerpos (1) a (4) pueden contener FR. Las FR utilizadas no se encuentran particularmente limitadas, y puede utilizarse cualquier FR con la condición de que el anticuerpo resultante mantenga su actividad de unión contra la DLL3 humana. Entre los ejemplos preferentes de las FR pueden incluirse FR derivadas de un anticuerpo humano. Debido a que la técnica de sustitución de la FR con mantenimiento de la actividad de unión a antígeno del anticuerpo es conocida de la técnica, el experto en la materia podrá seleccionar apropiadamente las FR. Las FR pueden ser FR que presentan una secuencia nativa o pueden ser Fr que presentan una secuencia derivada de la secuencia nativa mediante la modificación de uno o más aminoácidos.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 12, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 13, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° pueden incluirse una región variable de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 9. Además, entre los ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada pueden incluirse una cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 10 o n° 11.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 24, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 25, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 26 pueden incluirse una región variable de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 21. Además, entre los ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada pueden incluirse una cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 22 o n° 23.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 36, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 37, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 38 pueden incluirse una región variable de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 33. Además, entre los ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada pueden incluirse una cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 34 o n° 35.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 48, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 49, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 50 pueden incluirse una región variable de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la s Ec ID n° 45. Además, entre los ejemplos de la cadena pesada que comprende la región variable de cadena pesada pueden incluirse una cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 46 o n° 47.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 18, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 19, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 20 pueden incluirse una región variable de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 15. Además, entre los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera pueden incluirse una cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 16 o n° 17.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 30, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 31, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 32 pueden incluirse una región variable de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 27. Además, entre los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera pueden incluirse una cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 28 o n° 29.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 42, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 43, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 44 pueden incluirse una región variable de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 39. Además, entre los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera pueden incluirse una cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 40 o n° 41.

Entre los ejemplos de la región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 54, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 55, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 56 pueden incluirse una región variable de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 51. Además, entre los ejemplos de la cadena ligera que comprende la región variable de cadena ligera pueden incluirse una cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 52 o n° 53.

La expresión "que presenta una actividad equivalente a la del anticuerpo" se refiere a que presenta una actividad de unión a DLL3, una actividad de internalización y/o una actividad citotóxica (actividad ADCC, etc.) contra células expresantes de DLL3 equivalente a la del mismo. No resulta necesario que la actividad equivalente sea una actividad idéntica y puede ser, por ejemplo, una actividad de 50% o más, preferentemente de 70% o más, más preferentemente de 90% o más de la actividad de cualquiera de los anticuerpos (1) a (12). Entre los ejemplos del límite superior de la actividad pueden incluirse, aunque sin limitación particular, 1000% o menos, 500% o menos, 300% o menos, 150% o menos y 100% o menos.

En la presente memoria también se describe un anticuerpo derivado mediante la sustitución, deleción, adición y/o inserción de uno o más aminoácidos y puede prepararse artificialmente o encontrarse naturalmente. Entre los ejemplos de un método para introducir una mutación en el polipéptido se incluyen la mutagénesis dirigida a sitio (Hashimoto-Gotoh, T. et al., Gene 152, 271-275, 1995, Zoller, MJ y Smith, M., Methods Enzymol. 100, 468-500, 1983, Kramer, W. et al., Nucleic Acids Res. 12, 9441-9456, 1984, Kramer W y Fritz HJ, Methods. Enzymol. 154, 350-367, 1987, Kunkel, TA, Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 488-492, 1985, Kunkel, Methods Enzymol. 85, 2763-2766, 1988). Este es uno de los métodos bien conocidos por el experto en la materia para la preparación de un polipéptido funcionalmente equivalente a un determinado polipéptido. El experto en la materia puede introducir apropiadamente una mutación en un anticuerpo mediante la utilización de dicho método y de esta manera preparar un anticuerpo funcionalmente equivalente al anticuerpo. Además, pueden encontrarse naturalmente mutaciones de aminoácidos. Dicho anticuerpo que presenta una secuencia de aminoácidos derivada de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo mediante la mutación de uno o más aminoácidos y es funcionalmente equivalente al anticuerpo también se describe en la presente memoria.

El número de aminoácidos mutados en dicha variante habitualmente es de 50 o menos aminoácidos, preferentemente de 30 o menos aminoácidos, más preferentemente de 10 o menos aminoácidos (p.ej., de 5 o menos aminoácidos).

Para que muten residuos aminoácidos, resulta preferente que dicha mutación se lleve a cabo conservadoramente entre aminoácidos que presentan las mismas propiedades de cadena lateral. Por ejemplo, se ha establecido la clasificación siguiente basándose en las propiedades de las cadenas laterales de los aminoácidos:

aminoácidos hidrofóbicos (A, I, L, M, F, P, W, Y y V),

aminoácidos hidrofílicos (R, D, N, C, E, Q, G, H, K, S y T),

aminoácidos que presentan una cadena lateral alifática (G, A, V, L, I y P),

aminoácidos que presentan una cadena lateral que contiene un grupo hidroxi (S, T y Y),

aminoácidos que presentan una cadena lateral que contiene un átomo de azufre (C y M),

aminoácidos que presentan una cadena lateral que contiene ácido carboxílico y amida (D, N, E y Q), aminoácidos que presentan una cadena lateral que contiene una base (R, K y H), y

aminoácidos que presentan una cadena lateral que contiene un grupo aromático (H, F, Y y W)

(todos los símbolos entre paréntesis representan códigos de una letra de los aminoácidos).

Ya se conoce un polipéptido que presenta una secuencia de aminoácidos modificada a partir de una determinada secuencia de aminoácidos mediante la deleción y/o adición de uno o más residuos aminoácidos y/o la sustitución de los mismos por otros aminoácidos, a fin de mantener la actividad biológica del polipéptido original (Mark, D.F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 5662-5666, 1984, Zoller, M. J. y Smith, M., Nucleic Acids Research 10, 6487-650, 1982, Wang, A. et al., Science 224, 1431-1433, Dalbadie-McFarland, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 6409 6413, 1982). Específicamente, en el caso de que los aminoácidos en una secuencia de aminoácidos que constituye un determinado polipéptido se sustituyan por aminoácidos clasificados en el mismo grupo, generalmente se afirma que el polipéptido es probable que mantenga su actividad. La sustitución entre aminoácidos dentro del mismo grupo de aminoácidos indicado anteriormente se denomina sustitución conservadora.

La compartición o no de un epítopo el anticuerpo analito con un determinado anticuerpo puede confirmarse basándose en su competición para el mismo epítopo. La competición entre los anticuerpos se detecta mediante ensayo de bloqueo cruzado o similar. El ensayo de bloqueo cruzado es preferentemente, un ensayo de ELISA competitivo.

Específicamente, un ensayo de bloqueo cruzado implica preincubar proteínas DLL3 que recubren los pocillos de una placa de microtitulación en presencia o en ausencia de un anticuerpo competidor candidato y después añadir a la misma el anticuerpo anti-DLL3. La cantidad de anticuerpo anti-DLL3 unida a la proteína DLL3 en cada pocillo se correlaciona indirectamente con la capacidad de unión del anticuerpo competidor candidato (anticuerpo analito) que compite con el mismo para la unión al mismo epítopo. Específicamente, la afinidad más elevada del anticuerpo analito para el mismo epítopo resulta en una cantidad más baja de anticuerpo anti-DLL3 unida en el pocillo con recubrimiento de proteína DLL3 y, por el contrario, una cantidad más alta del anticuerpo analito unida en el pocillo con recubrimiento de proteína DLL3.

La cantidad de cada anticuerpo unida en el pocillo puede determinarse fácilmente mediante marcaje previo del anticuerpo. Por ejemplo, puede someterse a ensayo un anticuerpo biotinilado mediante la utilización de un conjugado de avidina-peroxidasa y un sustrato apropiado. El ensayo de bloqueo cruzado mediante la utilización de marcaje con enzima (p.ej., peroxidasa) se denomina particularmente ensayo de ELISA competitivo. El anticuerpo puede marcarse con cualquiera de los materiales de marcaje detectables o medibles. Específicamente, se conoce de la técnica, por ejemplo, el marcaje radioactivo o el marcaje fluorescente.

Además, en el caso de que el anticuerpo analito presente regiones constantes derivadas de una especie diferente de la del anticuerpo anti-DLL3, la cantidad de cualquier anticuerpo unida al pocillo también puede medirse mediante la utilización de un anticuerpo marcado que reconozca cualquier región constante. Alternativamente, incluso los anticuerpos de clase diferente, aunque derivados de la misma especie, pueden medirse para sus cantidades respectivas unidas en el pocillo mediante la utilización de anticuerpos que discriminan cada clase.

Con la condición de que el anticuerpo candidato pueda bloquear la unión del anticuerpo anti-DLL3 en como mínimo el 20%, preferentemente en como mínimo el 30%, más preferentemente en como mínimo el 50%, todavía más preferentemente en como mínimo el 80%, en comparación con la actividad de unión observada en el ensayo de control realizado en ausencia del anticuerpo competidor, dicho anticuerpo candidato se determina que es un anticuerpo que se une a sustancialmente el mismo epítopo al que se une el anticuerpo anti-DLL3 o que es un anticuerpo que compite con el mismo para la unión al mismo epítopo.

El anticuerpo de la composición farmacéutica reconoce una región entre los aminoácidos 216 y 492 en la DLL3 humana. En la presente memoria se indica además un anticuerpo que se une a la DLL3 humana y que además se une al polipéptido (DLL3delta1-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 6 al polipéptido (DLL3delta2-Fc) que consiste en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 7.

El anticuerpo puede presentar actividades tales como una actividad ADCC y una actividad de internalización y, de esta manera, resulta útil como fármaco farmacéutico, particularmente como agente anticáncer.

Anticuerpo anti-DLL3 genéticamente recombinante

El anticuerpo que debe administrarse en el ser humano puede convertirse en un anticuerpo genéticamente recombinante que ha sido manipulado artificialmente, por ejemplo con el fin de reducir la heteroantigenicidad en el ser humano. El anticuerpo genéticamente recombinante comprende, por ejemplo, anticuerpos quiméricos y anticuerpos humanizados. Dichos anticuerpos manipulados pueden producirse mediante la utilización de un método conocido de la técnica.

(1) Anticuerpo quimérico

Los anticuerpos quiméricos se refieren a anticuerpos que comprende regiones variables y constantes de diferentes orígenes ligadas entre sí. Por ejemplo, los anticuerpos quiméricos heterogéneos de ratón-humanos son anticuerpos que comprende las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo de ratón y las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera de un anticuerpo humano. Los ADN codificantes de región variable de anticuerpo de ratón se ligan con ADN codificantes de región constante de anticuerpo humano y los productos de ligación pueden incorporarse en vectores de expresión a fin de preparar vectores recombinantes expresantes de anticuerpos quiméricos. Las células transformadas con dichos vectores (células recombinantes) pueden cultivarse para la expresión del inserto de ADN a fin de obtener los anticuerpos quiméricos producidos durante el cultivo.

Se utilizan regiones constantes de anticuerpo humano como las regiones constantes de los anticuerpos quiméricos. Por ejemplo, puede utilizarse Cy1, Cy2, Cy3, Cy4, C|j, C8, C al, Ca2 y Ce como regiones constantes de cadena pesada. Además, pueden utilizarse Ck y CA como regiones constantes de cadena ligera. Las secuencias de aminoácidos de dichas regiones constantes y las secuencias de nucleótidos codificantes de las mismas son conocidas de la técnica. Además, uno o más aminoácidos en las regiones constantes de anticuerpo humano pueden sustituirse, delecionarse, añadirse y/o insertarse para mejorar la estabilidad del anticuerpo mismo o su producción.

(2) Anticuerpo humanizado

En general, los anticuerpos quiméricos comprenden regiones variables de anticuerpo de origen animal no humano y regiones constantes derivadas de anticuerpo humano. En contraste, los anticuerpos humanizados comprenden regiones determinantes de complementariedad (CDR, por sus siglas en inglés) de anticuerpo de origen animal no humano, regiones marco (FR) derivadas de anticuerpo humano y regiones constantes derivadas de anticuerpo humano. Los anticuerpos humanizados también se denominan anticuerpos humanos reformados. Específicamente, por ejemplo los anticuerpos humanizados que comprenden CDR de anticuerpo animal no humano (p.ej., de ratón) injertados en anticuerpos humanos son conocidos de la técnica. Los anticuerpos humanizados resultan útiles como ingredientes activos para un agente terapéutico, en virtud de su antigenicidad reducida en el cuerpo humano.

Cada región variable de anticuerpo habitualmente comprende 3 CDR flanqueadas por 4 FR. Las regiones de CDR determinan sustancialmente la especificidad de unión del anticuerpo. Las CDR presentan secuencias de aminoácidos diversas. Por otra parte, las secuencias de aminoácidos que constituyen las FR con frecuencia muestran una homología elevada entre anticuerpos con diferentes especificidades de unión. Por lo tanto, en general, la especificidad de unión de un determinado anticuerpo se cree que puede trasplantarse a otros anticuerpos mediante la injertación de CDR.

Los enfoques de recombinación génica general también se conocen para la obtención de anticuerpos humanizados. Específicamente, por ejemplo la PCR de extensión por solapamiento es conocida de la técnica como método para injertar CDR de anticuerpo de ratón en FR humanas. La PCR de extensión por solapamiento utiliza cebadores para la síntesis de FR de anticuerpo humano que comprenden una secuencia de nucleótidos adicional codificante de cada CDR de anticuerpo de ratón que debe injertarse. Los cebadores se preparan para cada una de las 4 FR. En la injertación de CDR de ratón en las FR humanas, en general, se cree que resulta ventajoso seleccionar FR humanas altamente homólogas a las FR de ratón a fin de mantener las funciones de la CDR. Específicamente, resulta generalmente preferente utilizar FR humanas que comprende secuencias de aminoácidos altamente homólogas a las FR contiguas a las CDR de ratón que deben injertarse.

Además, las secuencias de nucleótidos que deben ligarse están diseñarse de manera que están conectadas en el mismo marco. Las secuencias de nucleótidos codificantes de FR humana se sintetizan individualmente mediante la utilización de sus cebadores respectivos. Como resultado, se obtienen productos que comprenden ADN codificante de CDR de ratón añadido a cada secuencia codificante de FR. La secuencia de nucleótidos codificante de CDR de ratón en cada producto está diseñada de manera que la secuencia de nucleótidos se solape con otra. Posteriormente, las partes de CDR solapantes se hibridan entre sí para la reacción de síntesis de la cadena complementaria. Mediante dicha región, se ligan las secuencias de FR human mediante las secuencias de CDR de ratón.

Finalmente, el gen de longitud completa de la región variable que comprende 3 CDR y 4 FR ligadas se amplifica con cebadores que se hibridan respectivamente con los extremos 5' y 3' de los mismos y comprenden una secuencia adicional de reconocimiento para un enzima de restricción apropiado. El ADN obtenido de esta manera y el ADN codificante de región constante de anticuerpo humano pueden insertarse en vectores de expresión de manera que estén fusionados en el mismo marco a fin de preparar vectores para la expresión de anticuerpo humanizado. Los huéspedes se transforman con dichos vectores con el fin de establecer células recombinantes, que después se cultivan para la expresión del ADN codificante de anticuerpo humanizado para producir los anticuerpos humanizados en los cultivos de las células en cultivo (ver la publicación de patente europea n° EP 239400 y la publicación de patente internacional n° WO 96/02576).

Los anticuerpos humanizados preparados de esta manera pueden evaluarse para sus actividades de unión al antígeno mediante ensayo cualitativo o cuantitativo. Como resultado, pueden seleccionarse FR de anticuerpo humano preferentemente de manera que permitan que las CDR formen un sitio de unión a antígeno favorable al ligarse mediante las CDR. En caso necesario, el residuo o residuos aminoácidos de la FR pueden sustituirse de manera que las CDR del anticuerpo humanizado formen un sitio de unión a antígeno apropiado. Por ejemplo, puede introducirse una mutación en la secuencia de aminoácidos de la FR mediante la aplicación del método de PCR utilizado en la injertación de CDR de ratón en las FR humanas. Específicamente, puede introducirse una mutación de una secuencia de nucleótidos parcial en los cebadores que se hibridan con la secuencia de nucleótidos de la FR. La secuencia de nucleótidos de la FR sintetizada mediante la utilización de dichos cebadores contiene la mutación introducida de esta manera. Los anticuerpos variantes que presentan el aminoácido o aminoácidos sustituidos pueden evaluarse para sus actividades de unión al antígeno mediante el mismo ensayo que anteriormente a fin de seleccionar las secuencias de FR variantes que presentan la propiedad deseada (Sato K. et al., Cancer Res. 53:851-856, 1993).

(3) Anticuerpo polivalente

El anticuerpo presente en una composición farmacéutica comprende no sólo anticuerpos bivalentes tipificados por IgG (IgG1, IgG2, IgG4, etc.9, sino también anticuerpos monovalentes o anticuerpos polivalentes tipificados por IgM con la condición de que dichos anticuerpos se unan a la proteína DLL3. El anticuerpo polivalente que puede encontrarse presente en una composición farmacéutica comprende anticuerpos polivalentes que presentan sitios de unión a antígeno, la totalidad de los cuales son iguales entre sí o algunos o la totalidad de los cuales son diferentes entre sí.

(4) Anticuerpo de bajo peso molecular

El anticuerpo presente en una composición farmacéutica no se encuentra limitado a moléculas de anticuerpo completo y puede ser un anticuerpo de bajo peso molecular o una forma modificada, con la condición de que el anticuerpo se una a la proteína DLL3.

El anticuerpo de bajo peso molecular comprende un fragmento de anticuerpo deficiente en una parte del anticuerpo completo (p.ej., la IgG completa). Dicha deficiencia parcial de la molécula de anticuerpo se acepta con la condición de que el fragmento de anticuerpo resultante sea capaz de unirse al antígeno DLL3. Resulta preferente que el fragmento de anticuerpo utilizado en la composición farmacéutica contenga una o ambas regiones de entre la cadena variable pesada (VH) y la cadena variable ligera (VL). También resulta preferente que el fragmento de anticuerpo utilizado en la composición farmacéutica contenga CDR. El número de CDR contenido en el fragmento de anticuerpo utilizado en la composición farmacéutica no se encuentra particularmente limitado y es preferentemente de por lo menos 6 CDR: CDR1, CDR2 y CDR3 de cadena pesada y c Dr 1, CDR2 y CDR3 de cadena ligera.

La secuencia de aminoácidos de VH o VL puede contener una sustitución, deleción, adición y/o inserción. Además, el fragmento de anticuerpo que puede utilizarse en la composición farmacéutica puede ser deficiente en una parte de una o ambas de entre VH y VL con la condición de que el fragmento de anticuerpo resultante sea capaz de unirse al antígeno DLL3. Además, su región variable puede estar quimerizada o humanizada. Entre los ejemplos específicos del fragmento de anticuerpo pueden incluirse Fab, Fab', F(ab')2 y Fv. Además, entre los ejemplos específicos del anticuerpo de bajo peso molecular pueden incluirse Fab, Fab', F(ab')2, Fv, scFv (Fv de cadena sencilla), diacuerpo, sc(Fv)2 ((Fv)2 de cadena sencilla) y scFv-Fc. El anticuerpo de bajo peso molecular es preferentemente un diacuerpo o sc(Fv)2. Dichos multímeros de anticuerpo (p.ej., dímeros, trímeros, tetrámeros y polímeros) también se encuentran comprendidos en el anticuerpo de bajo peso molecular que puede utilizarse en la composición farmacéutica.

Dichos fragmentos del anticuerpo pueden obtenerse mediante tratamiento enzimático del anticuerpo para formar fragmentos de anticuerpo. Los enzimas digestivos cortan el fragmento de anticuerpo en una posición particular, proporcionando fragmentos de anticuerpo que presentan una estructura particular. Por ejemplo, la papaína, la pepsina o la plasmina es conocida de la técnica como enzima para formar los fragmentos de anticuerpo. La digestión con papaína proporciona F(ab)2 o Fab, mientras que la digestión con pepsina proporciona F(ab')2 o Fab'. Alternativamente, se construyen genes codificantes de dichos fragmentos de anticuerpo y dichos genes pueden introducirse en vectores de expresión y después expresarse en células huésped apropiadas (ver, p.ej., Co, M. S. et al., J. Immunol. 152, 2968 2976, 1994, Better, M. y Horwitz, A. H. Methods in Enzymology 178, 476-496, 1989, Plueckthun, A. y Skerra, A. Methods in Enzymology 178, 497-515, 1989, Lamoyi, E., Methods in Enzymology 121, 652-663, 1986, Rousseaux, J. et al., Methods in Enzymology 121, 663-669, 1986, Bird, R. E. et al., TIBTECH 9, 132-137, 1991).

La utilización de un enfoque de ingeniería genética para los fragmentos de anticuerpo obtenidos enzimáticamente puede delecionar una parte arbitraria del anticuerpo. El anticuerpo de bajo peso molecular puede no presentar una región arbitraria con la condición de que el fragmento de anticuerpo resultante presente afinidad de unión para DLL3.

i) Diacuerpo

Un "diacuerpo" se refiere a un fragmento de anticuerpo bivalente construido mediante fusión génica (p.ej., Holliger P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448, 1993, patente n° EP404.097 y documento n°WO 93/11161). Un diacuerpo es un dímero que comprende dos cadenas polipeptídicas. Habitualmente, cada una de las cadenas polipeptídicas que constituye el dímero comprende regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera unidas mediante un conector en la misma cadena. El conector en el diacuerpo es generalmente excesivamente corto para permitir el emparejamiento de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera en la misma cadena. Específicamente, el número de residuos aminoácidos que constituye el conector es, por ejemplo, de aproximadamente 5 residuos. Por lo tanto, las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera codificadas en la misma cadena polipeptídica no pueden formar juntas un fragmento de región variable de cadena sencilla. Por el contrario, forman un dímero mediante emparejamiento con otro fragmento de región variable de cadena sencilla. Como resultado, el diacuerpo presenta dos sitios de unión a antígeno.

ii) scFv

El scFv se obtiene mediante unión de las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera del anticuerpo. En el scFv, las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera están unidas mediante un conector, preferentemente un conector peptídico (Huston J. S. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 85, 5879-5883, 1988). Las regiones variables de cadena pesada y de cadena ligera en el scFv pueden proceder de cualquiera de los anticuerpos indicados en la presente especificación. El conector peptídico que une las regiones variables no se encuentra particularmente limitado. Por ejemplo, como el conector puede utilizarse un péptido de cadena sencilla arbitrario de aproximadamente 3 a 25 residuos. Específicamente, por ejemplo, puede utilizarse un conector peptídico indicado posteriormente.

Las regiones variables de ambas cadenas pueden unirse, por ejemplo mediante PCR. En primer lugar, de las secuencias de ADN codificantes de la cadena pesada o la región variable de cadena pesada del anticuerpo y secuencias de ADN codificantes de la cadena ligera o región variable de cadena ligera del anticuerpo, se utilizan los ADN codificantes de la secuencia de aminoácidos completa o de la secuencia parcial deseada, como moldes para la unión de las regiones variables mediante PCR.

El ADN codificante de la región variable de cadena pesada y el ADN codificante de la región variable de cadena ligera se amplifican por separado mediante PCR mediante la utilización de un par de cebadores que presentan secuencias correspondientes a ambas secuencias terminales de cada ADN que debe amplificarse. Seguidamente, se prepara ADN codificante de la parte de conector peptídico. El ADN codificante del conector peptídico también puede sintetizarse mediante la utilización de PCR. Las secuencias de nucleótidos que pueden unirse al producto de amplificación de cada región variable sintetizada separadamente se añaden respectivamente a las secuencias 5' de los cebadores utilizados en dicha PCR. Seguidamente, se lleva a cabo la reacción de PCR utilizando cada ADN de [ADN de región variable de cadena pesada]-[ADN de conector peptídico]-[ADN de región variable de cadena ligera] y cebadores para la PCR de ensamblaje.

Los cebadores para la PCR de ensamblaje comprenden la combinación de un cebador que se hibrida con la secuencia 5' del [ADN de región variable de cadena pesada] y un cebador que se hibrida con la secuencia 3' del [ADN de región variable de cadena ligera]. Específicamente, los cebadores para la PCR de ensamblaje son un cebador que es capaz de amplificar ADN codificante de la secuencia de longitud completa del scFv que debe sintetizarse. En contraste, el [ADN de conector peptídico] contiene una secuencia de nucleótidos adicional que puede unirse a cada ADN de región variable. Como resultado, dichos ADN se unen y, además, se preparan finalmente en un producto de amplificación de scFv de longitud completa mediante la utilización de los cebadores para la PCR de ensamblaje. Una vez se ha preparado el ADN codificante de scFv, pueden obtenerse vectores de expresión que contienen dicho ADN y células transformadas con los vectores de expresión (células recombinantes) de acuerdo con un método rutinario. Además, las células recombinantes resultantes pueden cultivarse para la expresión del ADN codificante de scFv a fin de obtener el scFv.

iii) scFv-Fc

El scFv-Fc es un anticuerpo de bajo peso molecular que comprende una región Fc fusionada con scFv (Cellular & Molecular Immunology 3: 439-443, 2006). El origen del scFv utilizado en scFv-Fc no se encuentra particularmente limitado y puede utilizarse, por ejemplo, scFv procedente de IgM. Además, el origen de Fc no se encuentra particularmente limitado y puede utilizarse, por ejemplo, Fc procedente de IgG humana (IgG1 humana, etc.). De esta manera, entre los ejemplos de un aspecto preferente de scFv-Fc pueden incluirse scFv-Fc que comprende un fragmento scFv de anticuerpo IgM unido a CH2 (p.ej., Cy2) y CH3 (p.ej., Cy3) de IgG1 humana mediante la región bisagra (Hy) de la IgG1 humana.

iv) sc(Fv)2

El fragmento sc(Fv)2 es un anticuerpo de bajo peso molecular que presenta una sola cadena que comprende dos regiones variables de cadena pesada (VH) y dos regiones variables de cadena ligera (VL) unidas mediante conectores o similares (Hudson et al., J. Immunol. Methods 231: 177-189, 1999). El fragmento sc(Fv)2 puede prepararse, por ejemplo, mediante unión de los scFv mediante un conector. Habitualmente resultan necesarios tres conectores para unir cuatro regiones variables de anticuerpo.

Además, el fragmento sc(Fv)2 es preferentemente un anticuerpo en el que se alinean dos VH y dos VL como VH, VL, VH y VL (es decir, [VH]-conector-[VL]-conector-[VH]-conector-[VL]) en dicho orden, partiendo del extremo N-terminal del polipéptido de cadena sencilla.

El orden de los dos VH y los dos VL no se encuentra particularmente limitado a la disposición indicada anteriormente y pueden organizarse en cualquier orden. Entre los ejemplos de los mismos también se incluyen las disposiciones siguientes:

[VL]-conector-[VH]-conector-[VH]-conector-[VL]

[VH]-conector-[VL]-conector-[VL]-conector-[VH]

[VH]-conector-[VH]-conector-[VL]-conector-[VL]

[VL]-conector-[VL]-conector-[VH]-conector-[VH]

[VL]-conector-[VH]-conector-[VL]-conector-[VH]

Por ejemplo, puede utilizarse un conector peptídico arbitrario o conector de compuesto sintético (p.ej., los conectores dados a conocer en la referencia Protein Engineering, 9(3), 299-305, 1996) que pueden introducirse mediante ingeniería genética, como el conector que une las regiones variables de anticuerpo. Puede utilizarse una pluralidad de conectores iguales o diferentes. Resulta preferente el conector peptídico. La longitud del conector peptídico no se encuentra particularmente limitada y puede ser apropiadamente seleccionada por el experto en la materia según el propósito. El número de residuos aminoácidos que constituyen el conector peptídico habitualmente es de 1 a 100 aminoácidos, preferentemente de 3 a 50 aminoácidos, más preferentemente de 5 a 30 aminoácidos, particularmente preferentemente de 12 a 18 aminoácidos (p.ej., 15 aminoácidos).

La secuencia de aminoácidos que constituye el conector peptídico puede ser una secuencia arbitraria con la condición de que esta secuencia no inhiba el efecto de unión del scFv. Por ejemplo, pueden utilizarse las secuencias de aminoácidos siguientes para el conector peptídico:

Ser

Gly ■Ser

Gly ■Gly ■Ser

Ser ■Gly ■Gly

Gly ■Gly ■Gly ■Ser (SEC ID n° 61)

Ser ■Gly ■Gly ■Gly (SEC ID n° 62)

Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■Ser (SEC ID n° 63)

Ser ■Gly ■Gly ■Gly ■Gly (SEC ID n° 64)

Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■ Ser (SEC ID n° 65)

Ser ■Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■ Gly (SEC ID n° 66)

Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■ Gly ■ Ser (SEC ID n° 67)

Ser ■Gly ■Gly ■Gly ■Gly ■ Gly ■ Gly (SEC ID n° 68)

(Gly Gly ■ Gly ■ Gly ■ Ser)n

(Ser ■ Gly ■ Gly ■ Gly ■ Gly)n

[n representa un número entero igual a 1 o superior].

La secuencia de aminoácidos del conector peptídico puede ser apropiadamente seleccionada por el experto en la materia según el propósito. Por ejemplo, el número entero n que determina la longitud del conector peptídico habitualmente es de 1 a 5, preferentemente de 1 a 3, más preferentemente 1 o 2.

De acuerdo con lo anterior, entre los ejemplos de un aspecto particularmente preferente de sc(Fv)2 que puede utilizarse en una composición farmacéutica puede incluirse el sc(Fv)2 siguiente:

[VH]-conector peptídico (15 aminoácidos)-[VL]-conector peptídico (15 aminoácidos)-[VH]-conector peptídico (15 aminoácidos)-[VL].

Alternativamente, las regiones variables también pueden unirse utilizando el conector sintetizado químicamente (agente de entrecruzamiento químico). Pueden utilizarse agentes de entrecruzamiento habitualmente utilizados en el enlace cruzado de compuestos peptídicos o similares. Por ejemplo, se conocen de la técnica agentes de entrecruzamiento químico tales como los mostrados posteriormente. Estos agentes de entrecruzamiento se encuentran disponibles comercialmente.

N-hidroxisuccinimida (NHS),

suberato de disuccinimidilo (DSS),

suberato de bis(sulfosuccinimidilo) (BS3),

ditiobis(propionato de succinimidilo) (DSP),

ditiobis(propionato de succinimidilo) (DTSSP),

etilenglicol bis(succinato de succinimidilo) (EGS),

etilenglicol bis(succinato de sulfosuccinimidilo) (sulfo-EGS),

tartrato de disuccinimidilo (DST), tartrato de disulfosuccinimidilo (sulfo-DST),

bis[2-(succinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (BSOCOES) y

bis[2-(sulfosuccinimidoxicarboniloxi)etil]sulfona (sulfo-BSoCOES), etc.

Actividad del anticuerpo anti-DLL3

(1) Actividad citotóxica

Para el tratamiento de enfermedades de proliferación celular, tales como el cáncer, resulta preferente que el anticuerpo mantenga su actividad efectora. Específicamente, el anticuerpo preferente presenta tanto una afinidad de unión para DLL3 como funciones efectoras. El anticuerpo utilizado presenta actividad citotóxica. Las funciones efectoras del anticuerpo comprenden una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (ADCC) y una actividad citotóxica dependiente del complemento (CDC). Un anticuerpo terapéutico particularmente preferentemente posee una actividad de ADCC como funciones efectoras.

El anticuerpo utilizado con propósito terapéutico es un anticuerpo que presenta una actividad citotóxica.

Entre los ejemplos de la actividad citotóxica pueden incluirse las actividades de ADCC y de CDC. La actividad de ADCC se refiere a la actividad de dañar las células diana mediante la unión de células portadoras de receptor de Fcy (inmunocitos, etc.) mediante los receptores de Fcy a los dominios Fc de los anticuerpos específicamente unidos a los antígenos de superficie celular de las células diana. Por otra parte, la actividad de CDC se refiere a una actividad citotóxica mediada por el sistema del complemento.

La presencia o no de una actividad de ADCC o una actividad de CDC del anticuerpo anti-DLL3 puede determinarse mediante un método conocido de la técnica (p.ej., Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, Editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993). Específicamente, en primer lugar se preparan células efectoras, una solución del complemento y las células diana.

i) Preparación de células efectoras

Se extirpan los bazos de ratones CBA/N o similares y se separan las células del bazo en un medio RPMI1640 (fabricado por Invitrogen Corp.). Las células pueden lavarse con dicho medio que contenía suero de feto bovino al 10% (FBS, fabricado por HyClone Laboratories, Inc.) y después se ajustaron a una concentración celular de 5*10® células/ml para preparar las células efectoras.

ii) Preparación de solución del complemento

El complemento de conejo neonato (fabricado por CEDARLANE Laboratories Ltd.) puede diluirse 10 veces con un medio (fabricado por Invitrogen Corp.) que contiene FBS al 10% para preparar una solución de complemento.

iii) Preparación de células diana

Las células que expresan proteínas DLL3 pueden cultivarse a 37°C durante 1 hora junto con 0,2 mCi de cromato sódico-51Cr (fabricado por GE Healthcare Bio-Sciences Corp.), en un medio DMEM que contiene FBS al 10% para marcar radioactivamente las células diana. Las células transformadas con genes codificantes de proteína DLL3, líneas celulares de cáncer pulmonar de células pequeñas o similares pueden utilizarse como las células expresantes de proteínas DLL3. Las células marcadas radioactivamente de esta manera se lavaron tres veces con un medio RPMI1640 que contenía FBS al 10% y se ajustaron a una concentración celular de 2*105 células/ml para preparar las células diana.

La actividad ADCC o CDC puede someterse a ensayo mediante un método descrito posteriormente. Para el ensayo de actividad de ADCC, las células diana y el anticuerpo anti-DLL3 (50 pl cada uno) se añaden a una placa de 96 pocilios de fondo en U (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y se hicieron reaccionar durante 15 minutos sobre hielo. A continuación, se añadieron 100 |jl de las células efectoras a la placa y las células se cultivaron durante 4 horas en un incubador de CO2. La concentración del anticuerpo se fijó en 0 o 10 jg/ml. Tras el cultivo, se recogieron 100 j l del sobrenadante y se midió la radioactividad mediante la utilización de un contador gamma (COBRA II AUTO-GAMMA, MODELO D5005, fabricado por Packard Instrument Company). La actividad citotóxica (%) puede calcularse basándose en la fórmula de cálculo (A - C) / (B - C) x 100 mediante la utilización del valor obtenido. En la fórmula, A representa la radioactividad (cpm) de cada muestra; B representa la radioactividad (cpm) de una muestra complementada con NP-40 al 1% (fabricado por Nacalai Tesque, Inc.) y C representa la radioactividad (cpm) de una muestra que contiene únicamente las células diana.

Por otra parte, para el ensayo de actividad de CDC, las células diana y el anticuerpo anti-DLL3 (50 j l cada uno) se añadieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y se hicieron reaccionar durante 15 minutos sobre hielo. A continuación, se añadieron 100 j l de la solución de complemento a la placa y las células se cultivaron durante 4 horas en un incubador de CO2. La concentración del anticuerpo se fijó en 0 o 3 jg/ml. Tras el cultivo, se recogieron 100 j l del sobrenadante y se midió la radioactividad mediante la utilización de un contador gamma. La actividad citotóxica puede calcularse de la misma manera que en el ensayo de actividad ADCC.

En contraste, en el ensayo de actividad citotóxica utilizando conjugados de anticuerpos, las células diana y los conjugados de anticuerpo anti-DLL3 (50 j l cada uno) se añadieron a una placa de 96 pocillos de fondo plano (fabricada por Becton, Dickinson and Company) y se hicieron reaccionar durante 15 minutos sobre hielo. Las células se cultivaron durante 1 a 4 horas en un incubador de CO2. La concentración del anticuerpo se fijó en 0 o 3 jg/ml. Tras el cultivo, se recogieron 100 j l del sobrenadante y se midió la radioactividad mediante la utilización de un contador gamma. La actividad citotóxica puede calcularse de la misma manera que en el ensayo de actividad ADCC.

(2) Anticuerpo conjugado

El anticuerpo puede conjugarse con una sustancia citotóxica, tal como un agente quimioterapéutico, un péptido tóxico o un compuesto químico radioactivo. Dicho anticuerpo modificado (en lo sucesivo en la presente memoria denominado conjugado de anticuerpo) puede obtenerse mediante modificación química del anticuerpo obtenido. Ya se ha establecido en la técnica un método para la modificación de los anticuerpos.

Entre los ejemplos del agente quimioterapéutico cuya actividad citotóxica funciona mediante la conjugación del anticuerpo anti-DLL3 pueden incluirse los agentes quimioterapéuticos siguientes: azaribina, anastrozol, azacitidina, bleomicina, bortezomib, briostatina-1, busulfán, camptotecina, 10-hidroxicamptotecina, carmustina, celebrex, clorambucilo, cisplatino, irinotecán, carboplatino, cladribina, ciclofosfamida, citarabina, dacarbazina, docetaxel, dactinomicina, glucurónido de daunomicina, daunorrubicina, dexametasona, dietilestilbestrol, doxorrubicina, glucurónido de doxorrubicina, epirrubicina, etinil-estradiol, estramustina, etopósido, glucurónido de etopósido, floxuridina, fludarabina, flutamida, fluorouracilo, fluoximesterona, gemcitabina, caproato de hidroxiprogesterona, hidroxiurea, idarrubicina, ifosfamida, leucovorina, lomustina, mecloretamina, acetato de medroxiprogesterona, acetato de megestrol, melfalán, mercaptopurina, metotrexato, mitoxantrona, mitramicina, mitomicina, mitotano, fenilbutirato, prednisona, procarbazina, paclitaxel, pentostatina, semustina, estreptozocina, tamoxifeno, taxanos, taxol, propionato de testosterona, talidomida, tioguanina, tiotepa, tenipósido, topotecán, mostaza de uracilo, vinblastina, vinorelbina y vincristina.

El agente quimioterapéutico es preferentemente un agente quimioterapéutico de bajo peso molecular. El agente quimioterapéutico de bajo peso molecular no es probable que interfiera con las funciones del anticuerpo, incluso después de su conjugación con el anticuerpo. El agente quimioterapéutico de bajo peso molecular habitualmente presenta un peso molecular de 100 a 2000, preferentemente de 200 a 1000. La totalidad de los agentes quimioterapéuticos ejemplificados anteriormente son agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular. Dichos agentes quimioterapéuticos comprenden profármacos que se convierten in vivo en agentes quimioterapéuticos activos. La activación del profármaco puede ser por conversión enzimática o por conversión no enzimática.

Además, el anticuerpo puede modificarse con el péptido tóxico. Entre los ejemplos del péptido tóxico pueden incluirse los siguientes: cadena A de la toxina diftérica (Langone J. J., et al., Methods in Enzymology, 93, 307-308, 1983), exotoxina de Pseudomonas (Nature Medicine, 2, 350-353, 1996), cadena A de la ricina (Fulton R. J., et al., J. Biol. Chem., 261, 5314-5319, 1986; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Gheeite V., et al., J. Immunol. Methods, 142, 223-230, 1991); cadena A de la ricina desglucosilada (Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); cadena A de la abrina (Wawrzynczak E. J., et al., Br. J. Cancer, 66, 361-366, 1992; Wawrzynczak E. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Thorpe P. E., et al., Cancer Res., 47, 5924-5931, 1987); gelonina (Sivam G., et al., Cancer Res., 47, 3169-3173, 1987; Cumber A. J. et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; WawrzynczakE. J., et al., Cancer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); PAP-s; proteína antivírica de hierba carmín procedente de semillas (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); briodina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); saporina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momordina (Cumber A. J., et al., J. Immunol. Methods, 135, 15-24, 1990; Wawrzynczak E. J., et al., Cáncer Res., 50, 7519-7562, 1990; Bolognesi A., et al., Clin. Exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); momorcoquina (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341 346, 1992); diantina 32 (Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992); diantina 30 (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); modeccina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); viscumina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); volkesina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); dodecandrina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); tritina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); lufina (Stirpe F., Barbieri L., FEBS letter 195, 1-8, 1986); trichokirina (Casellas P., et al., Eur. J. Biochem. 176, 581-588, 1988; Bolognesi A., et al., Clin. exp. Immunol., 89, 341-346, 1992).

El compuesto químico radioactivo se refiere a un compuesto químico que contiene un isótopo radiactivo. El isótopo radiactivo no se encuentra particularmente limitado y puede utilizarse cualquier isótopo radiactivo. Por ejemplo, puede utilizarse 32P, 14C, 125I, 3H, 131I, 186Re o 188Re.

En otro aspecto, puede utilizarse uno o dos o más agentes quimioterapéuticos de bajo peso molecular, y uno o dos o más péptidos tóxicos, en combinación en la modificación de anticuerpo. El anticuerpo anti-DLL3 puede conjugarse con el agente quimioterapéutico de bajo peso molecular mediante un enlace covalente o no covalente. Se conoce de la técnica un método para preparar dicho anticuerpo conjugado con agente quimioterapéutico.

Puede conjugarse un agente o toxina proteico con el anticuerpo mediante un enfoque de ingeniería genética. Específicamente, por ejemplo, el ADN codificante del péptido tóxico y el ADN codificante del anticuerpo anti-DLL3 se fusionan en el mismo marco y este ADN fusionado puede incorporarse en vectores de expresión para construir vectores recombinantes. Los vectores se introducen en células huésped apropiadas y se cultivan las células transformadas resultantes. El inserto de ADN puede expresarse en las células, obteniendo anticuerpos anti-DLL3 conjugados con péptido tóxico en forma de proteínas de fusión. Para la obtención de proteínas de fusión de anticuerpo, el agente o toxina proteico generalmente se localiza en el lado C-terminal del anticuerpo. Puede permitirse que un conector peptídico intervenga entre el anticuerpo y el agente o toxina proteico.

(3) Anticuerpo biespecífico

Además, el anticuerpo presente en una composición farmacéutica puede ser un anticuerpo biespecífico. El anticuerpo biespecífico se refiere a un anticuerpo que presenta, en la misma molécula de anticuerpo, regiones variables que reconocen diferentes epítopos. El anticuerpo biespecífico puede presentar sitios de unión a antígeno que reconocen diferentes epítopos sobre la molécula de DLL3. De esta manera, dos de dichas moléculas de anticuerpo biespecífico pueden unirse a una molécula de DLL3. En consecuencia, puede esperarse un efecto citotóxico más potente.

Alternativamente, el anticuerpo biespecífico presente en una composición farmacéutica puede presentar sitios de unión a antígeno, uno de los cuales reconoce DLL3, mientras que el otro reconoce una sustancia citotóxica. La sustancia citotóxica comprende específicamente, por ejemplo, un agente quimioterapéutico, un péptido tóxico y un compuesto químico radioactivo. Dicho anticuerpo biespecífico se une a células que expresan DLL3, capturando simultáneamente la sustancia citotóxica. Como resultado, puede conseguirse que la sustancia citotóxica actúe directamente sobre las células que expresan DLL3. Específicamente, el anticuerpo biespecífico que reconoce la sustancia citotóxica puede dañar específicamente las células tumorales e inhibir el crecimiento de las mismas.

Además, puede utilizarse un anticuerpo biespecífico que comprende un sitio de unión a DLL3 con un sitio de unión a antígeno que reconoce un antígeno diferente de DLL3. El sitio de unión a antígeno que puede combinarse de esta manera con dicho anticuerpo biespecífico reconoce, por ejemplo, un antígeno que se expresa específicamente sobre la superficie de las células de cáncer diana, tal como ocurre con DLL3, aunque es diferente de d LL3.

Se conoce de la técnica un método para producir el anticuerpo biespecífico. Por ejemplo, pueden unirse dos anticuerpos que difieren en el antígeno reconocido de esta manera pueden unirse para preparar el anticuerpo biespecífico. Cada uno de los anticuerpos unidos puede ser una 1/2 molécula que presenta cadenas pesadas y cadenas ligeras o puede ser un 1/4 de molécula que consiste en cadenas pesadas. Alternativamente, pueden fusionarse diferentes hibridomas productores de anticuerpo monoclonal para preparar células de fusión que producen anticuerpos biespecíficos. Además, el anticuerpo biespecífico puede prepararse mediante un enfoque de ingeniería genética.

La actividad de unión a antígeno del anticuerpo puede determinarse mediante la utilización de medios conocidos de la técnica (Antibodies: A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988). Por ejemplo, puede utilizarse ELISA (ensayo de inmunosorción ligada a enzima), EIA (inmunoensayo enzimático), RIA (radioinmunoensayo) o un fluoroinmunoensayo.

(4) Modificación de cadena sacárida

El anticuerpo puede ser un anticuerpo que presenta una cadena sacárida modificada. Es conocido que las actividades citotóxicas de los anticuerpos pueden potenciarse mediante modificación de sus cadenas sacáridas. Por ejemplo, los anticuerpos glucosilados (documento n° WO 99/54342, etc.), los anticuerpos deficientes en fucosa añadida a sus cadenas sacáridas (documentos n° WO 00/61739 y n° WO 02/31140, etc.) y los anticuerpos que presentan una cadena sacárida que presenta GlcNAc bisectada (documento n° WO 02/79255, etc.) son conocidos de la técnica como anticuerpo que presenta una cadena sacárida modificada.

(5) Actividad de internalización

Además, el anticuerpo presente en una composición farmacéutica puede presentar una actividad de internalización. El "anticuerpo que presenta una actividad de internalización" se refiere a un anticuerpo que es transportado al interior de las células (citoplasmas, vesículas, otros orgánulos, etc.) mediante su unión a DLL3.

La presencia o no de actividad de internalización en el anticuerpo puede confirmarse mediante un método generalmente conocido por el experto en la materia y puede confirmarse mediante, por ejemplo, un método que implica poner en contacto anticuerpos anti-DLL3 unidos a material de marcaje con células expresantes de DLL3 y confirmar si el material de marcaje es incorporado o no en las células, o un método que implica poner en contacto anticuerpos anti-DLL3 conjugados con sustancia citotóxica, con células expresantes de DLL3 y confirmar si se induce o no la muerte de las células expresantes de DLL3.

Más específicamente, la actividad de internalización del anticuerpo anti-DLL3 puede someterse a ensayo mediante, por ejemplo, un método descrito en los Ejemplos.

El anticuerpo que presenta una actividad de internalización puede conjugarse con, por ejemplo, la sustancia citotóxica y utilizarse como composición farmacéutica, tal como un agente anticáncer indicado posteriormente.

Preparación de anticuerpo anti-DLL3

1. Preparación de anticuerpo anti-DLL3 mediante la utilización de hibridoma productor de anticuerpos monoclonales

Pueden prepararse hibridomas productores de anticuerpo monoclonal según una técnica conocida de la técnica, de la manera siguiente: en primer lugar, se inmunizan animales con proteínas DLL3 o péptidos parciales de las mismas (que se indicarán posteriormente), que se utilizan como antígenos sensibilizadores, según un método de inmunización habitual. Los inmunocitos obtenidos se fusionan con células parentales conocidas de la técnica mediante un método habitual de fusión celular con el fin de obtener hibridomas. Dichos hibridomas se criban adicionalmente para células productoras del anticuerpo de interés mediante un método de cribado habitual a fin de seleccionar los hibridomas que producen el anticuerpo anti-DLL3. El anticuerpo monoclonal anti-DLL3 deseado se obtiene a partir de los hibridomas seleccionados. Específicamente, el anticuerpo monoclonal anti-DLL3 se prepara de la manera siguiente:

(1) Preparación de proteína DLL3

En primer lugar, los genes DLL3 pueden expresarse para obtener proteínas DLL3 que se utilizan como antígenos sensibilizadores para la obtención de anticuerpos. Específicamente, la secuencia génica codificante de DLL3 se inserta en vectores de expresión conocidos de la técnica, con los que se transforman las células huésped apropiadas. A continuación, las proteínas DLL3 humanas de interés se purificaron a partir de las células huésped o un sobrenadante de cultivo de las mismas, mediante un método conocido de la técnica. Las proteínas DLL3 naturales o proteínas de fusión purificadas que comprenden el polipéptido parcial deseado de la proteína DLL3 fusionada con un polipéptido diferente pueden utilizarse como inmunógenos. Por ejemplo, pueden utilizarse fragmentos Fc de anticuerpo, etiquetas peptídicas, etc., para producir las proteínas de fusión que se utilizan como inmunógenos. Pueden prepararse vectores de expresión para las proteínas de fusión mediante la fusión, en el mismo marco, de dos o más genes, codificantes respectivamente de los fragmentos de polipéptido deseados e insertando dicho gen de fusión en los vectores de expresión. El método para preparar las proteínas de fusión se describe en Molecular Cloning, 2a ed. (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning 2a ed., 9.47-9.58, Cold Spring Harbor Lab. Press, 1989).

Las proteínas DLL3 purificadas de esta manera pueden utilizarse como agentes sensibilizadores para la inmunización de mamíferos. También pueden utilizarse péptidos parciales de DLL3 como antígenos sensibilizadores. Por ejemplo, pueden utilizarse los péptidos siguientes como antígenos sensibilizadores.

La región y tamaño del péptido parcial de DLL3 utilizado no están limitados. El número de aminoácidos que constituyen el péptido que sirve de antígeno sensibilizador es preferentemente de por lo menos 3, o más, por ejemplo de 5 o más, o de 6 o más. Más específicamente, los péptidos de 8 a 50 residuos, preferentemente de 10 a 30 residuos, pueden utilizarse como antígenos sensibilizadores.

(2) Inmunización con proteína DLL3

Los mamíferos no humanos se inmunizan con las proteínas DLL3 o péptidos parciales de las mismas como antígenos sensibilizadores. Los mamíferos no humanos inmunizados no se encuentran particularmente limitados. Para obtener el anticuerpo monoclonal mediante el método de fusión celular, resulta preferente que los animales no humanos inmunizados se seleccionen considerando la compatibilidad con las células parentales utilizadas en la fusión celular.

En general, los roedores resultan preferentes como animales no humanos inmunizados. Específicamente, pueden utilizarse ratones, ratas, hámsteres o conejos como los animales no humanos inmunizados.

Dichos animales no humanos pueden inmunizarse con los antígenos sensibilizadores según un método conocido de la técnica. Por ejemplo, un método general puede implicar la inmunización de los mamíferos no humanos con los antígenos sensibilizadores mediante inyección intraperitoneal o subcutánea. Específicamente, los antígenos sensibilizadores se administran en los mamíferos no humanos varias veces a intervalos de 4 a 21 días. Los antígenos sensibilizadores se diluyeron en PBS (solución salina tamponada con fosfato), solución salina o similar en una proporción de dilución apropiada y se utilizaron en la inmunización. Además, los antígenos sensibilizadores pueden administrarse junto con un adyuvante. Por ejemplo, los antígenos pueden mezclarse con un adyuvante completo de Freund para la emulsificación a fin de preparar antígenos sensibilizadores. Además, puede utilizarse un portador apropiado en la inmunización con los antígenos sensibilizadores. Particularmente, en el caso de que se utilicen péptidos parciales con un peso molecular pequeño a modo de los antígenos sensibilizadores, resulta preferente que los péptidos antígenos sensibilizadores se unan a proteínas portadoras, tales como albúmina o hemocianina de lapa americana, y se utilicen en la inmunización.

(3) Inmunización con ADN

El anticuerpo monoclonal también puede obtenerse mediante inmunización con ADN. La inmunización con ADN es un método de inmunoestimulación que implica: la inmunización de animales mediante la administración de ADN vector que se ha construido en una forma capaz de expresar genes codificantes de proteína antigénica en los animales inmunizados, y permitiendo que los animales inmunizados expresen los antígenos inmunizadores in vivo. La inmunización con ADN puede esperarse que sea superior a los métodos de inmunización generales utilizando la administración de antígenos proteicos de la manera siguiente:

- puede proporcionar inmunoestimulación con mantenimiento de las estructuras de proteína membranal (p.ej., DLL3), y

- elimina la necesidad de purificar los antígenos inmunizadores.

Para la obtención del anticuerpo monoclonal mediante la inmunización con ADn, en primer lugar los animales se inmunizan mediante la administración de ADN vector de expresión de la proteína DLL3. El ADN codificante de DLL3 puede sintetizarse mediante un método conocido de la técnica, tal como PCR. El ADN obtenido se inserta en vectores de expresión apropiados, con los que los animales son inmunizados mediante administración. Por ejemplo, pueden utilizarse vectores de expresión disponibles comercialmente, tales como pcDNA3.1, como los vectores de expresión. De manera similar, puede utilizarse un método generalmente utilizado para la administración de los vectores en los animales. Por ejemplo, pueden insertarse partículas de oro con los vectores de expresión adsorbidos en las células mediante la utilización de una pistola génica para llevar a cabo la inmunización con ADN.

(4) Preparación de hibridoma

Se confirmó un incremento de la cantidad del anticuerpo deseado en el suero de los mamíferos inmunizados de esta manera. A continuación, se recolectaron inmunocitos de los mamíferos y se sometieron a fusión celular. Particularmente, las células de bazo pueden utilizarse como inmunocitos preferentes.

Se utilizan células de mieloma de mamífero en la fusión celular con los inmunocitos. Resulta preferente que las células de mieloma presenten un marcador de selección apropiado para el cribado. El marcador de selección se refiere a un carácter que puede sobrevivir (o no sobrevivir) bajo condiciones de cultivo particulares. Por ejemplo, la deficiencia en hipoxantina-guanina fosforibosiltransferasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia en HGPRT) o deficiencia en timidina quinasa (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como deficiencia en TK) es conocida de la técnica como el marcador de selección. Las células que presentan la deficiencia en HGPRT o TK son sensibles a hipoxantina-aminopterina-timidina (en lo sucesivo en la presente memoria, abreviada como sensibles a HAT). Las células sensibles a HAT son eliminadas en un medio selectivo de HAT debido a que no pueden sintetizar ADN. En contraste, dichas células, al fusionarse con células normales, pueden crecer incluso en el medio selectivo de HAT debido a que pueden continuar la síntesis de ADN mediante la utilización de la ruta de salvamento de las células normales.

Las células que presentan la deficiencia en HGPRT o TK pueden seleccionarse en un medio que contiene 6-tioguanina o 8-azaguanina (en lo sucesivo en la presente memoria abreviada como 8AG) para la deficiencia en HGPRT o 5'-bromodesoxiuridina para la deficiencia en TK. Las células normales mueren en dicho medio debido a que incorporar dichos análogos de pirimidina en sus ADN. En contraste, las células deficientes en dichos enzimas pueden sobrevivir en el medio selectivo debido a que no pueden incorporar los análogos de pirimidina en ellas. Además, un marcador de selección denominado resistencia a G418 proporciona a las células resistencia al antibiótico 2-desoxiestreptamina (análogo de gentamicina) mediante un gen de resistencia a neomicina. Se conocen de la técnica diversas células de mieloma adecuadas para la fusión celular. Por ejemplo, pueden utilizarse las células de mieloma siguientes en la producción del anticuerpo monoclonal para la utilización en composiciones farmacéuticas:

P3 (P3x63Ag8. 653) (J. Immunol. 123, 1548-1550, 1979),

P3x63Ag8U. 1 (Current Topics in Microbiology and Immunology 81, 1-7, 1978),

NS-1 (Kohler. G. y Milstein, C. Eur. J. Immunol. 6, 511-519, 1976),

MPC-11 (Margulies. D. H. et al., Cell 8, 405-415, 1976), SP2/0 (Shulman, M. et al., Nature 276, 269-270, 1978), FO (de St. Groth, S. F. et al., J. Immunol. Methods 35, 1-21, 1980),

S194 (Trowbridge, I. S. J. Exp. Med. 148, 313-323, 1978), R210 (Galfre, G. et al., Nature 277, 131-133, 1979) o similares.

Básicamente, la fusión celular de los inmunocitos con las células de mieloma se llevó a cabo según un método conocido de la técnica, por ejemplo el método de Kohler y Milstein et al. (Kohler. G. y Milstein, C., Methods Enzymol.

73, 3-46, 1981).

Más específicamente, la fusión celular puede llevarse a cabo, por ejemplo en un medio de cultivo nutritivo habitual en presencia de un promotor de fusión celular. Por ejemplo, puede utilizarse polietilenglicol (PEG) o virus hemaglutinante del Japón (VHJ) como el promotor de fusión. Además, también puede añadirse a lo anterior un auxiliar, tal como dimetilsulfóxido, si se desea, para potenciar la eficiencia de fusión.

La proporción entre los inmunocitos y las células de mieloma utilizada puede fijarse arbitrariamente. Por ejemplo, resulta preferente que las cantidades de los inmunocitos se fije en 1 a 10 veces la de las células de mieloma. Por ejemplo, puede utilizarse un medio de cultivo RPMI1640 o MEM adecuado para el crecimiento de la línea celular de mieloma, así como un medio de cultivo habitual utilizado en dicho tipo de cultivo celular como el medio de cultivo en la fusión celular. Además, puede añadirse una solución complementada con suero (p.ej., suero de feto bovino (SFB)) al medio de cultivo.

Para la fusión celular, los inmunocitos y las células de mieloma se mezclan bien en las cantidades predeterminadas en el medio de cultivo y después se mezclan con una solución de PEG precalentada a aproximadamente 37°C para formar las células de fusión (hibridomas) de interés. En el método de fusión celular, por ejemplo, puede añadirse habitualmente PEG con un peso molecular medio del orden de 1000 a 6000 a una concentración de 30% a 60% (p/v). Después, el medio de cultivo apropiado que se ha ejemplificado anteriormente se añade secuencialmente a los hibridomas y la mezcla se centrifuga, seguido de eliminación del sobrenadante. Dicho procedimiento se repite para eliminar los agentes de fusión celular o similares no favorables para el crecimiento del hibridoma.

Los hibridomas obtenidos de esta manera pueden seleccionarse mediante la utilización de un medio de cultivo selectivo apropiado para el marcador de selección de las células de mieloma utilizadas en la fusión celular. Por ejemplo, las células que presentan la deficiencia en HGPRT o en TK pueden seleccionarse mediante el cultivo de los hibridomas en un medio de cultivo HAT (medio de cultivo que contiene hipoxantina, aminopterina y timidina). Específicamente, al utilizar células de mieloma sensibles a HAT en la fusión celular, sólo las células fusionadas con éxito con las células normales pueden cultivarse selectivamente en el medio de cultivo de HAT. El cultivo que utiliza el medio de cultivo de HAT se continúa durante un tiempo suficientemente largo para eliminar las células (células no fusionadas) diferentes de los hibridomas de interés. Específicamente, el cultivo puede llevarse a cabo generalmente durante unos cuantos días a unas cuantas semanas para seleccionar los hibridomas de interés. Después, los hibridomas que producen el anticuerpo de interés pueden cribarse y clonarse como clones individuales mediante un método habitual de dilución limitante.

El cribado del anticuerpo de interés y la clonación como clones individuales del mismo puede llevarse a cabo preferentemente mediante un método de cribado basado en la reacción de antígeno-anticuerpo conocida de la técnica. Por ejemplo, los antígenos se unen a un portador, tal como perlas de poliestireno o similar, o una placa de microtitulación de 96 pocillos disponible comercialmente, y hacerse reaccionar con el sobrenadante de cultivo de los hibridomas. Seguidamente, el portador se lava y después se hace reaccionar con anticuerpos secundarios marcados con enzima o similares. En el caso de que el sobrenadante de cultivo contenga el anticuerpo de interés reactivo con los antígenos sensibilizadores, los anticuerpos secundarios se unen al portador mediante dicho anticuerpo. Finalmente, los anticuerpos secundarios unidos al portador pueden detectarse para determinar la presencia del anticuerpo de interés en el sobrenadante de cultivo. Los hibridomas productores del anticuerpo deseado capaces de unión al antígeno pueden clonarse mediante un método de dilución limitante o similar. En dicho cribado, pueden utilizarse proteínas DLL3 utilizadas en la inmunización o proteínas DLL3 sustancialmente idénticas a ellas, preferentemente como los antígenos. Por ejemplo, pueden utilizarse líneas celulares expresantes de DLL3, DLL3 soluble, o similares, como los antígenos.

Puede utilizarse un método descrito en la publicación de patente internacional n° WO 03/104453 en la producción del anticuerpo contra la DLL3 humana.

Además, adicionalmente al método de obtención de los hibridomas mediante inmunización de animales no humanos con los antígenos, pueden sensibilizarse linfocitos humanos con los antígenos a fin de obtener el anticuerpo de interés. Específicamente, los linfocitos humanos en primer lugar se sensibilizan con las proteínas DLL3 in vitro. Después, los linfocitos sensibilizadores se fusionan con parejas de fusión apropiadas. Por ejemplo, pueden utilizarse células de mieloma de origen humano capaces de dividirse durante todas sus vidas, como las parejas de fusión (ver la publicación de patente japonesa n° 1-59878).

Además, el anticuerpo anti-DLL3 humana también puede obtenerse mediante la administración de las proteínas DLL3 como antígenos en animales no humanos transgénicos que presentan todos los repertorios de genes de anticuerpo humano o mediante inmunización de los animales no humanos con ADN que ha sido construido para expresar DLL3 en los animales no humanos. Las células productoras de anticuerpos procedentes de los animales no humanos inmunizados pueden inmortalizarse mediante tratamiento, tal como la fusión celular con parejas de fusión apropiadas, o la fusión con virus de Epstein-Barr. A partir de ls células inmortalizadas obtenidas de esta manera, pueden aislarse anticuerpos humanos contra la proteína DLL3 (ver las publicaciones de patente internacional n° WO 94/25585, n° WO 93/12227, n° WO 92/03918 y n° WO 94/02602. Además, las células inmortalizadas también pueden clonarse como células productoras de anticuerpos que presentan la especificidad de reacción de interés. En el caso de que se utilicen animales no humanos transgénicos como los animales no humanos inmunizados, los sistemas inmunitarios de los animales no humanos reconocen la DLL3 humana como foránea. De esta manera, los anticuerpos humanos contra la DLL3 humana pueden obtenerse con facilidad.

(5) Obtención de anticuerpos monoclonales a partir de hibridomas

Los hibridomas productores de anticuerpos monoclonales preparados de esta manera pueden subcultivarse en un medio de cultivo habitual. Además, los hibridomas pueden almacenarse durante un periodo prolongado en nitrógeno líquido.

Los hibridomas se cultivan según un método habitual y el anticuerpo monoclonal de interés puede obtenerse a partir del sobrenadante de cultivo del mismo. Alternativamente, los hibridomas se administran en mamíferos no humanos compatibles con los mismos, y se cultivan, y el anticuerpo monoclonal también puede obtenerse en la forma de líquidos ascíticos. El primer método resulta adecuado para obtener anticuerpos altamente puros.

2. Preparación de anticuerpo anti-DLL3 mediante un enfoque de ingeniería genética

(1) Clonación de gen de anticuerpo

El anticuerpo puede prepararse mediante un enfoque de ingeniería genética mediante la utilización de genes de anticuerpo clonados a partir de células productoras de anticuerpos. Los genes de anticuerpo clonados pueden incorporarse en vectores apropiados y expresarse en forma de anticuerpos mediante la transformación de los huéspedes. Los métodos de aislamiento de genes de anticuerpo, la introducción en vectores y la transformación de las células huésped ya han sido establecidos (ver, p.ej., Vandamme A.M. et al., Eur. J. Biochem. 192, 767-775, 1990).

Por ejemplo, los ADNc codificantes de las regiones variables del anticuerpo anti-DLL3 pueden obtenerse a partir de las células de hibridoma productor de anticuerpos anti-DLL3. Con este propósito, habitualmente en primer lugar se extraen ARN totales a partir de los hibridomas. Por ejemplo, pueden utilizarse los métodos siguientes para la extracción de ARNm a partir de las células:

- método de ultracentrifugación de guanidina (Chirgwin, J. M. et al., Biochemistry 18, 5294-5299, 1979) y

- método de AGPC (Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem. 162, 156-159, 1987).

Los ARNm extraídos pueden purificarse mediante la utilización de un kit de purificación de ARNm (fabricado por GE Healthcare BioSciences Corp.) o similar. Alternativamente, un kit para extraer directamente los ARNm totales de las células también se encuentra disponible comercialmente, tal como el kit de purificación de ARNm QuickPrep (fabricado por GE Healthcare BioSciences Corp.). Los ARNm totales pueden obtenerse de hibridomas mediante la utilización de dicho kit. A partir de los ARNm obtenidos, pueden sintetizarse ADNc codificantes de región variable de anticuerpo mediante la utilización de transcriptasa inversa. En este procedimiento, pueden utilizarse como cebadores secuencias arbitrarias de 15 a 30 bases seleccionadas de secuencias comunes a los genes de anticuerpo. Los ADNc pueden sintetizarse mediante la utilización del kit de síntesis de ADNc de primera cadena de transcriptasa inversa del VMA (fabricado por Seikagaku Corp.) o similar. Además, los kits RACE 5'-Ampli FINDER (fabricado por Clontech Laboratories, Inc.) y PCR 5'-Ra Ce (Frohman, M. A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 8998-9002, 1988 y Belyavsky, A. et al., Nucleic Acids Res. 17, 2919-2932, 1989) pueden utilizarse para la síntesis de ADNc y la amplificación. Además, pueden introducirse sitios de enzima de restricción apropiados, indicados posteriormente, en ambos extremos de los ADNc durante el curso de dicha síntesis de ADNc.

A partir de los productos de PCR obtenidos, los fragmentos de ADNc de interés se purifican y posteriormente se ligan con ADN de vector. Los vectores recombinantes preparados de esta manera se introdujeron en E. coli o similar. Tras la selección de colonias, los vectores recombinantes deseados pueden prepararse a partir de E. coli que ha formado la colonia. A continuación, el ADNc puede secuenciarse mediante un método conocido de la técnica, por ejemplo un método de terminación de cadena dideoxinucleótido.

Además, pueden utilizarse bibliotecas de ADNc para obtener los genes codificantes de región variable de anticuerpo. En primer lugar, se sintetizan ADNc con ARNm extraídos a partir de las células productoras de anticuerpos como moldes para obtener bibliotecas de ADNc. Convenientemente se utiliza un kit disponible comercialmente en la síntesis de bibliotecas de ADNc. Actualmente se obtienen ARNm de sólo un pequeño número de células en cantidades muy pequeñas. Por lo tanto, la purificación directa del mismo resulta en rendimientos bajos. De esta manera, habitualmente se añaden a lo anterior ARN portadores que se muestra que están libres de los genes de anticuerpo, seguido de la purificación de ARNm. Alternativamente, en el caso de que puedan extraerse ARN en cantidades dadas a partir de las células productoras de anticuerpos, puede conseguirse la extracción eficiente sin utilizar ARN portadores. La adición de los ARN portadores puede resultar innecesaria para la extracción de ARN de, por ejemplo, 10 o más, o 30 o más, preferentemente 50 o más células productoras de anticuerpos.

Los genes de anticuerpo se amplifican mediante PCR con las bibliotecas de ADNc obtenidas como moldes. Los cebadores para la amplificación por PCR de los genes de anticuerpo son conocidos de la técnica. Por ejemplo, pueden diseñarse cebadores para la amplificación de genes de anticuerpo humano basándose en la exposición del artículo (J. Mol. Biol. 222, 581-597, 1991) o similar. Dichos cebadores presentan una secuencia de nucleótidos que difiere según la subclase de inmunoglobulina. De eta manera, en el caso de que se utilicen como moldes bibliotecas de ADNc cuya subclase sea desconocida, se lleva a cabo una PCR mediante la selección de cebadores considerando todas las posibilidades.

Específicamente, por ejemplo, para el fin de obtener genes codificantes de IgG humana, pueden utilizarse cebadores que sean capaces de amplificar cada uno de los genes codificantes de las cadenas pesadas y1 a y4 y las cadenas ligeras k y A. Los cebadores que se hibridan con una parte correspondiente a la región bisagra generalmente se utilizan como cebadores 3' para amplificar los genes de región variable de IgG. Por otra parte, pueden utilizarse cebadores apropiados para cada subclase como los cebadores 5'.

Los productos de PCR obtenidos de los cebadores para la amplificación génica para dichas subclases de cadena pesada y de cadena ligera se prepararon como sus bibliotecas independientes respectivas. Las bibliotecas sintetizadas de esta manera pueden utilizarse para reformar inmunoglobulinas que comprenden las cadenas pesadas y ligeras en combinación. El anticuerpo de interés puede cribarse para las actividades de unión de las inmunoglobulinas reformadas para DLL3 como índice.

(2) Introducción de gen de anticuerpo en las células huésped

Para producir el anticuerpo anti-DLL3, los genes de anticuerpo clonados pueden incorporarse en vectores de expresión de manera que estos genes se expresen bajo el control de regiones de control de la expresión. Las regiones de control de la expresión para la expresión de anticuerpos comprenden, por ejemplo, intensificadores y promotores. Seguidamente, pueden transformarse células huésped apropiadas con dichos vectores de expresión a fin de obtener células recombinantes que expresan el ADN codificante de anticuerpo anti-DLL3.

Para la expresión de genes de anticuerpo, pueden incorporarse ADN codificantes de cadena pesada y cadena ligera de anticuerpo por separado en diferentes vectores de expresión. La misma célula huésped puede cotransfectarse con los vectores en los que se han incorporado cadenas pesadas y cadenas ligeras y permitir de esta manera la expresión de moléculas de anticuerpo que comprenden las cadenas pesadas y las cadenas ligeras. Alternativamente, los ADN codificantes de cadena pesada y de cadena ligera pueden incorporarse en vectores de expresión individuales, con los que se transforman células huésped (ver la publicación de patente internacional n° WO 94/11523).

Se conocen de la técnica muchas combinaciones de huéspedes y vectores de expresión para la introducción de los genes de anticuerpo aislados en huéspedes apropiados para la preparación de anticuerpos. Puede aplicarse la totalidad de dichos sistemas de expresión. En el caso de que se utilicen células eucarióticas como los huéspedes, pueden utilizarse células animales, vegetales o fúngicas. Específicamente, entre los ejemplos de las células animales que pueden utilizarse pueden incluirse las células siguientes:

i) células de mamífero, tales como células CHO, COS, mieloma, BHK (renales de hámster neonato), Hela, Vero, HEK293, Ba/F3, HL-60, Jurkat y SK-HEP1;

ii) células de anfibio, tales como ovocitos de Xenopus y

iii) células de insecto, tales como células sf9, sf21 y Tn5.

Para las células vegetales, se conocen de la técnica sistemas de expresión de genes de anticuerpo, que implican células derivadas del género Nicotiana (p.ej., Nicotiana tabacum). Pueden utilizarse células de callo en cultivo en la transformación de las células vegetales.

Además, pueden utilizarse las células siguientes como las células fúngicas:

células derivadas de levaduras, tales como el género Saccharomyces (p.ej., Saccharomyces cerevisiae) y hongos filamentosos del género Pichia (p.ej., Pichia pastoris) y células derivadas del género Aspergillus (p.ej., Aspergillus niger).

Alternativamente, también se conocen de la técnica sistemas de expresión génica de anticuerpos que utilizan células procarióticas. Por ejemplo, en el caso de que se utilicen células bacterianas, pueden utilizarse células bacterianas derivadas de E. coli, Bacillus subtilis o similares.

Para la expresión génica utilizando células de mamífero, pueden ligarse funcionalmente un promotor útil utilizado rutinariamente, el gen de anticuerpo que debe expresarse y una señal poli-A situado 3'-cadena abajo de la misma. Entre los ejemplos del promotor/intensificador pueden incluirse un promotor/intensificador temprano inmediato de citomegalovirus humano.

Además, por ejemplo, pueden utilizarse promotores/intensificadores víricos o promotores/intensificadores derivados de células de mamífero (p.ej., el factor de elongación humano 1a (HEF1a)) en la expresión del anticuerpo. Entre los ejemplos de los virus cuyo promotor/intensificador puede utilizarse se incluyen específicamente retrovirus, poliomavirus, adenovirus y virus 40 del simio (SV40).

El promotor/intensificador de SV40 puede utilizarse según el método de Mulligan et al. (Nature 277, 108, 1979). Además, el promotor/intensificador de HEF1a puede utilizarse fácilmente en la expresión génica de interés mediante el método de Mizushima et al. (Nucleic Acids Res. 18, 5322, 1990).

En el caso de que se produzcan anticuerpos mediante la utilización de células animales, la secuencia de señal del gen de cadena pesada o ligera del anticuerpo preferentemente se utiliza como una secuencia de señal requerida para la secreción extracelular. Además, puede utilizarse la secuencia de señal de una proteína secretoria, tal como IL-3 o IL-6.

Para la expresión génica mediante la utilización de E. coli, pueden ligarse funcionalmente un promotor útil utilizado rutinariamente, una secuencia de señal para la secreción de anticuerpos y el gen de anticuerpo que debe expresarse. Entre los ejemplos del promotor pueden incluirse los promotores lacZ y araB. El promotor lacZ puede utilizarse según el método de Ward et al. (Nature 341, 544-546, 1989 y FASEBJ. 6, 2422-2427, 1992). Alternativamente, puede utilizarse el promotor araB en la expresión génica de interés mediante el método de Better et al. (Science 240, 1041 1043, 1988).

En el caso de que se produzcan anticuerpos en periplasma de E. coli, puede utilizarse una secuencia de señal pelB (Lei S.P. et al., J. Bacteriol. 169, 4379, 1987) para la secreción de anticuerpos. A continuación, los anticuerpos producidos en el periplasma se separan y después se pliegan nuevamente mediante la utilización de desnaturalizantes de proteínas, tales como urea e hidrocloruro de guanidina, de manera que los anticuerpos resultantes presentan la actividad de unión deseada.

Puede insertarse en los vectores de expresión un origen de replicación derivado de SV40, poliomavirus, adenovirus, papilomavirus bovino (VPB) o similar. Además, puede insertarse un marcador de selección en los vectores de expresión para incrementar el número de copia del gen en los sistemas celulares del huésped. Específicamente, pueden utilizarse marcadores de selección, tales como el gen de la aminoglucósido fosfotransferasa (APH), el gen de la timidina quinasa (TK), el gen de la xantina-guanina fosforibosiltransferasa de E. coli (Ecogpt) y el gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr).

(3) Obtención de anticuerpos a partir de las células huésped

Las células huésped se transforman con dichos vectores de expresión y las células huésped transformadas y después se cultivan in vitro o in vivo para producir el anticuerpo de interés. El cultivo de las células huésped se lleva a cabo según un método conocido de la técnica. Por ejemplo, puede utilizarse un medio de cultivo DMEM, MEM, RPMI1640 o IMDM y puede utilizarse en combinación con una solución complementada con suero, tal como suero de feto bovino (SFB).

Los anticuerpos expresados y producidos de esta manera pueden purificarse mediante la utilización, solos o en una combinación apropiada, de métodos de purificación de proteínas habituales conocidos de la técnica. Por ejemplo, pueden seleccionarse columnas de afinidad o cromatografía (p.ej., columnas de proteína A), filtros, ultrafiltración, precipitación salina y diálisis, y combinarse apropiadamente para separar y purificar los anticuerpos (Antibodies A Laboratory Manual. Ed Harlow, David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988).

3. Producción de anticuerpo por animal no humano transgénico

Además de las células huésped, también pueden utilizarse animales no humanos transgénicos en la producción de anticuerpos recombinantes. Específicamente, el anticuerpo de interés puede obtenerse de animales no humanos transfectados con los genes codificantes de dicho anticuerpo de interés. Por ejemplo, los genes de anticuerpo pueden insertarse en el mismo marco en genes codificantes de proteínas producidas específicamente en la leche a fin de construir genes de fusión. Por ejemplo, puede utilizarse caseína p de cabra como la proteína secretada en la leche. Los fragmentos de ADN que contienen los genes de fusión que presentan el inserto de gen de anticuerpo se inyectan en embriones de cabra, que a su vez se introducen en cabras hembra. A partir de leche producida por las cabras transgénicas (o progenie de las mismas) criadas por las cabras que han recibido los embriones, puede obtenerse el anticuerpo deseado en forma de una proteína de fusión con la proteína láctea. Además, en las cabras transgénicas, puede utilizarse hormona apropiadamente para incrementar la cantidad de leche que contiene el anticuerpo deseado que producen las cabras transgénicas (Ebert, K. M. et al., Bio/Technology 12, 699-702, 1994).

Composición farmacéutica

Debido a que DLL3 se expresa a nivel elevado en los tejidos de cáncer pulmonar de células pequeñas, el anticuerpo anti-DLL3 presenta una actividad citotóxica específica de las células de cáncer. De esta manera, el anticuerpo anti-DLL3 resulta útil en el tratamiento del cáncer pulmonar expresante de DLL3.

La expresión "que comprende el anticuerpo que se une a DLL3 como ingrediente activo" se refiere a que comprende el anticuerpo anti-DLL3 como un ingrediente activo principal y a que no limita el contenido de anticuerpo anti-DLL3.

La composición farmacéutica puede comprender un anticuerpo anti-DLL3 conjugado con una sustancia citotóxica a modo de ingrediente activo. Dicha composición farmacéutica puede utilizarse a modo de, por ejemplo, inhibidor del crecimiento celular, particularmente como agente anticáncer. Preferentemente, el inhibidor del crecimiento celular y el agente anticáncer se administran en un sujeto que presenta cáncer o que posiblemente presenta cáncer.

La expresión "que comprende el anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a que comprende el anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica como un ingrediente activo principal y a que no limita el contenido de anticuerpo anti-DLL3 conjugado con sustancia citotóxica.

La composición farmacéutica está destinada a la utilización en el tratamiento del cáncer pulmonar de células pequeñas. El cáncer puede ser cualquiera de entre focos primarios y focos metastásicos.

La composición farmacéutica puede administrarse por vía oral o parenteral en el paciente. Resulta preferente la administración parenteral. Entre los ejemplos específicos de dicho método de administración se incluyen la administración mediante inyección, transnasal, pulmonar y transdérmica. Entre los ejemplos de la administración mediante inyección se incluyen las inyecciones intravenosa, intramuscular, intraperitoneal y subcutánea, mediante las que puede administrarse la composición farmacéutica sistémica o localmente. Además, el método de administración puede seleccionarse apropiadamente según la edad o síntomas del paciente. La dosis de la composición farmacéutica puede seleccionarse de un intervalo de dosis de, por ejemplo 0,0001 mg a 1000 mg por kg de peso corporal por dosis. Alternativamente, la dosis puede seleccionarse de un intervalo, por ejemplo de 0,001 a 100000 mg por cuerpo. Sin embargo, la composición farmacéutica no se encuentra limitada a dichas dosis.

La composición farmacéutica puede formularse según un método estándar (p.ej., Remington's Pharmaceutical Science, última edición, Mark Publishing Company, Easton, EE.UU.) y adicionalmente puede contener portadores o aditivos farmacéuticamente aceptables. Entre los ejemplos de los mismos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, tensioactivos, excipientes, agentes colorantes, agentes saborizantes, conservantes, estabilizadores, tampones, agentes de suspensión, agentes de tonicidad, ligantes, desintegrantes, lubricantes, promotores de flujo y correctores. Pueden utilizarse apropiadamente otros portadores utilizados rutinariamente. Entre los ejemplos específicos de los portadores pueden incluirse ácido silícico anhidro ligero, lactosa, celulosa cristalina, manitol, almidón, carmelosa cálcica, carmelosa sódica, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, dietilaminoacetato de polivinilacetal, polivinilpirrolidona, gelatina, triglicérido de ácido graso de cadena intermedia, aceite de ricino hidrogenado polioxietilenado 60, azúcar blanco, carboximetilcelulosa, almidón de maíz y sales inorgánicas.

Tras el contacto con las células expresantes de DLL3, el anticuerpo anti-DLL3 puede dañar las células expresantes de DLL3 o inhibir su crecimiento. El anticuerpo utilizado no se encuentra particularmente limitado y puede utilizarse, por ejemplo, cualquiera de los anticuerpos indicados anteriormente. Las células a las que se une el anticuerpo anti-DLL3 no se encuentran particularmente limitadas con la condición de que las células expresen DLL3. Las células expresantes de DLL3 son preferentemente células de cáncer, más preferentemente células de cáncer pulmonar, particularmente preferentemente células de cáncer pulmonar de células pequeñas.

El "contacto" se lleva a cabo, por ejemplo, mediante la adición del anticuerpo a un medio de cultivo de células expresantes de DLL3 cultivadas in vitro. El "contacto" también se lleva a cabo mediante la administración del anticuerpo anti-DLL3 en animales no humanos implantados con células expresantes de DLL3 en sus cuerpos o en animales que presentan endógenamente células de cáncer que expresan DLL3.

Los métodos mostrados posteriormente se utilizan preferentemente para evaluar o determinar la citotoxicidad causada en las células expresantes de DLL3 mediante el contacto del anticuerpo anti-DLL3. Entre los ejemplos de los métodos para evaluar o determinar la actividad citotóxica in vitro pueden incluirse el ensayo de actividad ADCC o CDC indicado anteriormente. La presencia o no de una actividad de ADCC o de una actividad de CDC en el anticuerpo anti-DLL3 puede determinarse mediante un método conocido de la técnica (p.ej., Current protocols in Immunology, Chapter 7. Immunologic studies in humans, editor, John E, Coligan et al., John Wiley & Sons, Inc., 1993). En el ensayo de actividad, los anticuerpos que presentan un isotipo idéntico al del anticuerpo anti-DLL3 y no se unen a las células se utilizan como anticuerpos de control de la misma manera que el anticuerpo anti-DLL3. En el caso de que el anticuerpo anti-DLL3 muestre una actividad citotóxica más potente que la de los anticuerpos de control, puede determinarse que el anticuerpo anti-DLL3 presenta la actividad.

El isotipo de un anticuerpo se define basándose en la secuencia de la región constante de cadena pesada en la secuencia de aminoácidos de dicho anticuerpo. El isotipo del anticuerpo se determina finalmente según el intercambio de clase causado por la recombinación genética en el cromosoma durante la maduración de las células B productoras de anticuerpos in vivo. La diferencia de isotipo refleja la diferencia entre las funciones fisiológicas/patológicas de los anticuerpos. Específicamente, es conocido que, por ejemplo, la potencia de la actividad citotóxica se ve influida no solo por los niveles de expresión de antígeno sino por los isotipos de los anticuerpos. De esta manera, para el ensayo de actividad citotóxica indicado anteriormente, resulta preferente que los anticuerpos utilizados como controles presenten un isotipo idéntico al del anticuerpo analito.

Además, para evaluar o determinar la actividad citotóxica in vivo, por ejemplo células de cáncer expresantes de DLL3 se trasplantan intradérmica o subcutáneamente en animales de experimentación no humanos. A continuación, se administra en los mismos el anticuerpo analito por vía intravenosa o intraperitoneal diariamente o a intervalos de unos cuantos días desde el día de administración o el día siguiente. La actividad citotóxica puede determinarse mediante la medición de los tamaños tumorales durante el tiempo. Se administran anticuerpos de control que presentan un isotipo idéntico al mismo en la evaluación in vitro. En el caso de que el grupo en que se ha administrado anticuerpo anti-DLL3 presente un tamaño tumoral significativamente menor que el del grupo en el que se ha administrado el anticuerpo de control, puede determinarse que el anticuerpo anti-DLL3 presenta actividad citotóxica. En el caso de que se utilicen ratones como los animales de experimentación no humanos, pueden utilizarse preferentemente ratones desnudos (nu/nu), que son genéticamente deficientes en glándula timo y, de esta manera, no presentan las funciones de los linfocitos T. La utilización de dichos ratones puede excluir la participación de los linfocitos T endógenos de los animales no humanos de experimentación en la evaluación/determinación de la actividad citotóxica de los anticuerpos administrados.

Fármaco diagnóstico (método de diagnóstico) - no parte de la invención reivindicada

También se hace referencia a un método para el diagnóstico del cáncer, que comprende detectar la proteína DLL3 o un gen codificante de la proteína DLL3. Se ha confirmado que la expresión de DLL3 se encuentra notablemente incrementada en los tejidos de cáncer o en las líneas celulares de cáncer. De esta manera, DLL3 resulta útil como marcador para la detección específica del cáncer.

Un ejemplo específico del método de diagnóstico puede incluir un método para el diagnóstico de cáncer, que comprende las etapas siguientes:

(a) proporcionar una muestra aislada a partir de un sujeto de ensayo, y

(b) detectar el nivel de expresión de la proteína DLL3 o del gen DLL3 en la muestra.

El método puede comprender además la etapa de (c) evaluar la posibilidad de que el sujeto de ensayo presente cáncer, basándose en el nivel de expresión de la proteína DLL3 o del gen DLL3.

Detección de la proteína DLL3 o del gen codificante de la proteína DLL3

Se da a conocer, además, aunque no forma parte de la invención reivindicada, un método en el que se diagnostica cáncer mediante detección de la proteína DLL3 en la muestra. Resulta preferente que la detección de la proteína DLL3 se lleve a cabo mediante la utilización de un anticuerpo que reconozca la proteína DLL3.

La detección comprende detección cuantitativa o cualitativa. Entre los ejemplos de la detección cualitativa pueden incluirse los ensayos siguientes:

- ensayo para determinar la presencia o la ausencia de la proteína DLL3,

- ensayo para determinar la presencia o la ausencia de más de una cantidad predeterminada de la proteína DLL3, y

- ensayo para comparar la cantidad de la proteína DLL3 con la contenida en otra muestra (p.ej., una muestra de control).

Por otra parte, entre los ejemplos de la detección cuantitativa pueden incluirse la medición de una concentración de proteína DLL3 y la medición de la cantidad de la proteína DLL3.

La muestra de ensayo no se encuentra particularmente limitada con la condición de que la muestra es probable que contenga la proteína DLL3. Específicamente, las muestras recolectadas de cuerpos vivos, tales como mamíferos, resultan preferentes. Las muestras recolectadas de seres humanos resultan más preferentes. Entre los ejemplos específicos de la muestra de ensayo pueden incluirse sangre, líquido intersticial, plasma, líquido extravascular, líquido cerebroespinal, líquido sinovial, líquido pleural, suero, linfa, saliva, orina y tejidos. La muestra es preferentemente una muestra obtenida de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan tejidos o células recogidos de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular.

El cáncer diagnosticado puede ser cualquier cáncer, sin limitaciones particulares. Entre los ejemplos específicos del mismo pueden incluirse cáncer pulmonar, particularmente, cáncer pulmonar de células pequeñas. Puede diagnosticarse cualquiera de los focos primarios y focos metastásicos de dichos cánceres.

En el caso de que se detecte la proteína en la muestra de ensayo, se diagnostica cáncer con su nivel como índice. Específicamente, en el caso de que la cantidad de proteína DLL3 detectada en la muestra de ensayo sea superior a la de un control negativo o a la de un individuo sano, se muestra que el sujeto de ensayo presenta cáncer o es altamente probable que presente cáncer en el futuro. Específicamente, se da a conocer, además, aunque no forma parte de la invención reivindicada, un método para el diagnóstico del cáncer, que comprende las etapas siguientes:

(1) detectar el nivel de expresión de DLL3 en una muestra biológica recolectada de un sujeto de ensayo, y (2) comparar el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1) con el de un control, en el que el nivel de expresión de DLL3 es superior al del control, se determina que el sujeto de ensayo presenta cáncer.

El control se refiere a una muestra de referencia para la comparación y comprende controles negativos y muestras biológicas de individuos sanos. Los controles negativos pueden obtenerse mediante recolección de muestras biológicas de individuos sanos y mezcla de las mismas, en caso necesario. El nivel de expresión de DLL3 en el control puede detectarse en paralelo con la detección del nivel de expresión de DLL3 en la muestra biológica del sujeto de ensayo. Alternativamente, el nivel de expresión de DLL3 en un gran número de muestras biológicas de individuos sanos puede detectarse previamente a fin de determinar estadísticamente el nivel de expresión estándar en los individuos sanos. Específicamente, por ejemplo, también puede utilizarse como valor estándar, la media ± 2 x desviaciones estándares (S.D.) o la media ± 3 x desviaciones estándares (S.D.). Estadísticamente, la media ± 2 * desviaciones estándar (S.D.) y la media ± 3 * desviaciones estándar (S.D.) incluyen valores de 80% y 90% de los individuos sanos, respectivamente.

Alternativamente, el nivel de expresión de DLL3 en el control puede fijarse mediante la utilización de una curva ROC. La curva ROC, o curva característica de receptor-operador, es un gráfico que muestra la sensibilidad de detección en la ordenada y las tasas de falsos positivos (es decir, "1-especificidad") en las abscisas. La curva ROC puede obtenerse mediante representación gráfica de los cambios de sensibilidad y la tasa de falsos positivos en una serie de valores de referencia variables a fin de determinar el nivel de expresión de DLL3 en muestras biológicas.

El "valor de referencia" para obtener la curva ROC es un valor numérico utilizado temporalmente para el análisis estadístico. En general, el "valor de referencia" para obtener la curva ROC se modifica en serie dentro de un intervalo que puede cubrir todos los valores de referencia seleccionables. Por ejemplo, el valor de referencia puede modificarse entre los valores medidos mínimo y máximo de DLL3 en una población que debe analizarse.

Un valor estándar que puede esperarse que ofrezca la sensibilidad y precisión de detección deseadas puede seleccionarse basándose en la curva ROC obtenida. El valor estándar fijado estadísticamente basándose en la curva ROC o similar también se denomina valor de corte. En un método para detectar el cáncer basado en el valor de corte, la etapa (2) indicada anteriormente comprende comparar el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1) con el valor de corte. A continuación, en el caso de que el nivel de expresión de DLL3 detectado en la etapa (1) sea superior al valor de corte, se detecta cáncer en el sujeto de ensayo.

El nivel de expresión de DLL3 puede determinarse mediante un método arbitrario. Específicamente, el nivel de expresión de DLL3 puede determinarse mediante evaluación de la cantidad de ARNm de d LL3, la cantidad de proteína DLL3 o la actividad biológica de la proteína DLL3. La cantidad de ARNm o proteína DLL3 puede determinarse mediante un método tal como se indica en la presente especificación.

En el caso de que se utilice un animal no humano como el sujeto de experimentación, la proteína DLL3 que debe detectarse se deriva de dicha especie animal.

Un método para detectar la proteína DLL3 contenida en la muestra de ensayo no se encuentra particularmente limitado y es preferentemente un método de detección inmunitaria que utiliza el anticuerpo anti-DLL3 tal como se ejemplifica a continuación:

ensayo de inmunosorción ligada a enzima (ELISA),

radioinmunoensayo (RIA),

inmunoensayo enzimático (EIA),

fluoroinmunoensayo (FIA),

inmunoensayo luminiscente (LIA),

inmunoprecipitación (IP),

inmunoensayo turbidimétrico (TIA),

transferencia western (WB),

método inmunohistoquímico (IHC),

inmunodifusión radial única (SRID),

transferencia por puntos, y

transferencia por ranuras.

Entre dichos enfoques, el método inmunohistoquímico (IHC) es un método de ensayo inmunitario preferente para el diagnóstico del cáncer, que comprende la etapa de detectar las proteínas DLL3 en secciones en las que los tejidos o células obtenidas de un paciente que presenta cáncer se fijan. Los métodos inmunitarios indicados anteriormente, tales como el método inmunohistoquímico (IHC), son generalmente conocidos por el experto en la materia.

Debido a que DLL3 es una proteína membranal cuya expresión se encuentra potenciada de una manera específica en las células de cáncer, pueden detectarse las células de cáncer o tejidos de cáncer mediante la utilización del anticuerpo anti-DLL3. Las células de cáncer contenidas en células o tejidos recolectados de cuerpos vivos se detectan mediante el análisis inmunohistológico.

También pueden detectarse tejidos de cáncer in vivo mediante la utilización del anticuerpo anti-DLL3. Dicho método comprende específicamente las etapas de: (1) administrar, en un sujeto de ensayo, un anticuerpo marcado con un material de marcaje (p.ej., un isótopo radiactivo), que se une a la proteína DLL3, y (2) detectar la acumulación del material de marcaje. El anticuerpo puede marcarse detectablemente para realizar un seguimiento del anticuerpo administrado en el cuerpo vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un material fluorescente o luminiscente, o un isótopo radiactivo, y puede realizarse un seguimiento de su comportamiento in vivo. El anticuerpo marcado con el material fluorescente o luminiscente puede observarse mediante la utilización de un endoscopio o peritoneoscopio. Pueden obtenerse imágenes de la localización del anticuerpo mediante seguimiento de la radioactividad del isótopo radiactivo. La localización in vivo del anticuerpo anti-DLL3 representa la presencia de células de cáncer.

Puede utilizarse un nucleido emisor de positrones como el isótopo radiactivo para el marcaje del anticuerpo para la detección de cáncer in vivo. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse con un nucleido emisor de positrones, tal como 18F, 55Co, 64Cu, 66Ga, 68Ga, 76Br, 89Zr y 1241. Puede utilizarse un método conocido de la técnica (Acta Oncol. 32, 825-830, 1993) en el marcaje del anticuerpo anti-DLL3 con dichos nucleidos emisores de positrones.

El anticuerpo anti-DLL3 marcado con el nucleido emisor de positrones se administra en seres humanos o animales. A continuación, la radiación emitida por el radionucleido se mide no invasivamente mediante PET (tomografía de emisión de positrones) y se convierte en imágenes mediante un enfoque de tomografía computerizada. El aparato de PET está destinado a obtener datos no invasivamente sobre el comportamiento del fármaco in vivo o similar. El PET puede proporcionar imágenes cuantitativas de la intensidad de la radiación en forma de intensidad de la señal. Mediante dicho uso de PET, pueden detectarse moléculas de antígeno que se expresan a nivel elevado en particular en el cáncer, sin recolectar muestras de los pacientes. El anticuerpo anti-DLL3 puede marcarse radioactivamente con un nucleido de vida corta mediante la utilización de un nucleido emisor de positrones, tal como 11C, 13N, 15O, 18F y 45Ti, además de los nucleidos indicados anteriormente.

La investigación y desarrollo han buscado, por ejemplo, técnicas para producir nucleidos de vida corta mediante la utilización de un ciclotrón médico y los nucleidos indicados anteriormente, o la producción de compuestos de marcaje radioactivo de vida corta. El anticuerpo anti-DLL3 puede marcarse con diversos isótopos radioactivos mediante dichas técnicas. El anticuerpo anti-DLL3 administrado en los pacientes se acumula en los focos primarios y focos metastásicos según la especificidad del anticuerpo anti-DLL3 para los tejidos patológicos en cada sitio. En el caso de que el anticuerpo anti-DLL3 se marque con el nucleido emisor de positrones, puede detectarse su radioactividad para detectar la presencia de los focos primarios y los focos metastásicos basándose en la localización de la radioactividad. Puede utilizarse un valor activo de radiación gamma o emisión de positrones de 25 a 4000 kEv apropiadamente para el uso diagnóstico. Además, también puede esperarse un efecto terapéutico mediante la selección de un nucleido apropiado y la administración del nucleido seleccionado en cantidades más elevadas. Un nucleido que proporciona un valor de radiación gamma o emisión de positrones de 70 a 700 eV puede utilizarse para obtener un efecto anticáncer atribuido a la radiación.

Detección de polinucleótido codificante de proteína DLL3

La expresión del polinucleótido de DLL3 puede detectarse. El polinucleótido detectado no se encuentra particularmente limitado y es preferentemente ARNm. La detección comprende la detección cuantitativa o cualitativa. Entre los ejemplos de la detección cualitativa pueden incluirse los procedimientos de ensayo siguientes:

- ensayo para determinar simplemente la presencia o la ausencia de ARNm de DLL3,

- ensayo para determinar la presencia o la ausencia de más de una cantidad predeterminada de ARNm de DLL3, y - ensayo para comparar la cantidad de ARNm de DLL3 con la contenida en otra muestra (p.ej., una muestra de control).

Por otra parte, entre los ejemplos de la detección cuantitativa pueden incluirse la medición de una concentración de ARNm de DLL3 y la medición de la cantidad de ARNm de DLl3.

Puede utilizarse una muestra arbitraria que es probable que contenga el ARNm de DLL3 a modo de la muestra de ensayo. Las muestras recolectadas de cuerpos vivos, tales como mamíferos, resultan preferentes. Las muestras recolectadas de seres humanos resultan más preferentes. Entre los ejemplos específicos de la muestra de ensayo pueden incluirse sangre, líquido intersticial, plasma, líquido extravascular, líquido cerebroespinal, líquido sinovial, líquido pleural, suero, linfa, saliva, orina y tejidos. La muestra es preferentemente una muestra obtenida de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan tejidos o células recogidos de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular. Dichas muestras están comprendidas en la muestra de ensayo.

La hibridación in situ se utiliza preferentemente para la muestra obtenida de la muestra de ensayo, tal como una preparación en la que se fijan los tejidos o células recogidos de un cuerpo vivo, o un medio de cultivo celular. La hibridación in situ ha evolucionado como enfoque para confirmar la presencia, la ausencia o la distribución de ADN o ARN particular en células o tejidos, y la potencia de su expresión. Dicho método utiliza los principios por los que un ácido nucleico sonda que presenta una secuencia de nucleótidos complementaria a una secuencia de ácidos nucleicos intracelular particular presenta la propiedad de formar específicamente un complejo. La sonda se marca previamente con un isótopo radiactivo (IR), una sustancia antigénica (hapteno) o similar. Como resultado, el sitio de hibridación puede distinguirse mediante la detección del marcaje. De esta manera, la hibridación in situ se utiliza en, por ejemplo, la detección de ADN o ARN intracelular, o similar. Preferentemente puede utilizarse el IR para el marcaje de sondas. Por ejemplo, el marcaje de fluorescencia con una sustancia no radioactiva, tal como biotina o hapteno (p.ej., digoxigenina) puede utilizarse más preferentemente. Por ejemplo, particularmente preferentemente se utiliza un método de detección mediante hibridación in situ fluorescente denominado FISH.

Entre los cánceres diagnosticados pueden incluirse cáncer pulmonar, particularmente, cáncer pulmonar de células pequeñas. Puede diagnosticarse cualquiera de los focos primarios y focos metastásicos de dichos cánceres.

Puede utilizarse como el sujeto de ensayo una especie animal no humana arbitraria expresante del gen de DLL3. El sujeto de ensayo es particularmente preferentemente un ser humano. En el caso de que se utilice una especie animal no humana como el sujeto de experimentación, el gen de DLL3 que debe detectarse se deriva de dicha especie animal.

A continuación, en la presente memoria se describe un aspecto específico del método de detección. En primer lugar, se prepara una muestra a partir de un sujeto de ensayo. Después, se detecta el ARNm de DLL3 contenido en la muestra. En el método, también puede detectarse el ADNc sintetizado a partir del ARNm. En el caso de que el ARNm de DLL3 o el ADNc codificante de DLL3 se detecte en la muestra de ensayo, se diagnostica que el sujeto de ensayo posiblemente presenta cáncer. Por ejemplo, en el caso de que la cantidad de ARNm de DLL3 o de ADNc codificante de DLL3 detectada en la muestra de ensayo sea superior a la observada en controles negativos o en individuos sanos, se muestra que el sujeto de ensayo presenta cáncer o es altamente probable que presente cáncer en el futuro.

Se conoce de la técnica un método para detectar el ARNm. Entre los ejemplos específicos del método que pueden utilizarse se incluyen: hibridación de ácidos nucleicos mediante la utilización de muestras inmovilizadas sobre una fase sólida seleccionadas de entre chips génicos, matrices de ADNc y filtros de membrana; RT-PCT; PCR en tiempo real; método de substracción; método de expresión diferencial; hibridación diferencial e hibridación cruzada.

El método de detección puede automatizarse mediante la utilización de diversos detectores automáticos. Dicha automatización consigue la detección de un gran número de muestras en un tiempo corto.

Kit para el diagnóstico de cáncer - no parte de la invención

Se describe además un fármaco diagnóstico o un kit para el diagnóstico del cáncer, que comprende un reactivo para la detección de la proteína DLL3 en una muestra de ensayo. El fármaco diagnóstico comprende por lo menos el anticuerpo anti-DLL3.

El reactivo para el diagnóstico del cáncer puede combinarse con otros factores utilizados en la detección de DLL3 con el fin de preparar un kit para el diagnóstico de cáncer. Específicamente, se describe además un kit para el diagnóstico del cáncer, que comprende: un anticuerpo que se une a DLL3, y un reactivo para la detección de la unión del anticuerpo a DLL3 y puede comprender además una muestra de control que comprende una muestra biológica que contiene DLL3. Puede incluirse adicionalmente en el kit un manual de instrucciones de los procedimientos de ensayo.

Ejemplos

A continuación, en la presente memoria, la presente invención se describirá más específicamente en referencia a Ejemplos.

[Ejemplo 1] Transcripción incrementada de DLL3 (proteína de tipo delta 3) en el cáncer pulmonar de células pequeñas La distribución de la expresión génica del ARNm de DLL3 humana en cánceres clínicos, líneas celulares de cáncer y diversos órganos normales se analizaron mediante la utilización de la matriz de exones humanos 1.0 ST (Affymetrix, Inc.). En el análisis de expresión, se obtuvieron ARN totales a partir de sitios tumorales en 13 casos de tejidos de cáncer pulmonar de células pequeñas aislados, 3 tipos de líneas celulares de cáncer pulmonar de células pequeñas y 49 tipos de tejidos normales (adquiridos de Clontech Laboratories, Inc.; Ambion, Inc.; Stratagene Corp.; Cell Applications, Inc.; Panomics, Inc.; CHEMICON y BioChain Institute, Inc.). La totalidad de los sitios tumorales en tejidos de cáncer clínico aislados y líneas celulares de cáncer (adquiridas de la ATCC) se sometieron a extracción del ARN total mediante la utilización de Trizol (Invitrogen Corp.) siguiendo el protocolo incluido en el producto. El experimento de análisis de la expresión génica se llevó a cabo mediante la utilización de 1 |jg de cada a Rn total obtenido de esta manera de acuerdo con el manual de ensayo de marcaje de diana de transcrito completo (WT, por sus siglas en inglés) de sentido GeneChip (Affymetrix, Inc.). Los datos de matrices de exones humanos 1.0 ST fueron digitalizados mediante la utilización del software ExACT (herramienta computacional de matrices de exones) proporcionado por Affymetrix, Inc.

Se encuentran presentes 13 juegos de sondas nucleares de DLL3 en la matriz de exones humanos 1.0 ST. Se determinó la media de los valores de expresión a partir de dichos juegos de sondas y se comparó el nivel de expresión génica entre tejidos. Los datos de expresión obtenidos de los tejidos normales, los sitios tumorales en tejidos de cáncer pulmonar de células pequeñas aislados y las líneas celulares de cáncer pulmonar de células pequeñas se muestran en la figura 1.

Se encontró que la expresión génica de DLL3 humana se encontraba notablemente incrementada en los sitios tumorales en tejidos de cáncer pulmonar de células pequeñas aislados y en las líneas celulares de cáncer pulmonar de células pequeñas, en comparación con los tejidos normales, excepto en el cerebro fetal. Estos resultados son prometedores de eficacia de la terapia con un agente antitumoral con diana molecular en la DLL3 humana, es decir, de la posibilidad de reducir el tamaño del tumor sin dañar tejidos normales.

[Ejemplo 2] Clonación de ADNc y preparación de células recombinantes

Se amplificó el ADNc de la DLL3 humana (NM_016941) tal como se indica en las SEC ID n° 1 y n° 57, mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de cerebro fetal humano y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. El vector pMCN consiguió la expresión de un gen foráneo bajo el control de un promotor de c Mv de ratón (GenBank: U68299). El vector pMCN presenta un gen de resistencia a la geneticina. Se transformó la línea celular CHO DG44 (Invitrogen Corp.) con el vector de expresión de DLL3 humana. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Las células clonadas que expresaban establemente la proteína DLL3 humana se seleccionaron mediante la utilización de anticuerpos anti-DLL3 disponibles comercialmente (R&D Systems, Inc., MAB4315) para establecer células DLL3/DG humanas. De manera similar, se transformó una línea celular proB dependiente de IL-3 de ratón/F- con el vector de expresión de DLL3 humana a fin de establecer células DLL3/BaF3 humanas.

Se amplificó el ADNc de DLL3 de ratón (NM_007866) tal como se indica en las SEC ID n° 2 y n° 58, mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc fetal de ratón y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular Ba/F3 con el vector de expresión de DLL3 de ratón. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Las células que expresaban la proteína DLL3 de ratón se seleccionaron mediante la utilización de anticuerpos disponibles comercialmente (R&D Systems, Inc., MAB4315) para establecer células DLL3/BaF3 de ratón.

Se amplificó el ADNc de la DLL1 humana (NM_005618) tal como se indica en las SEC ID n° 3 y n° 59, mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de bazo humano y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular Ba/F3 con el vector de expresión de DLL1 humano. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Las células que expresaban la proteína DLL1 humana se seleccionaron mediante la utilización de anticuerpos disponibles comercialmente (R&D Systems, Inc., MAB1818) para establecer células DLL1/BaF3 humanas.

Se amplificó el ADNc de la Notch1 humana (NM_017617) tal como se indica en las SEC ID n° 4 y n° 60, mediante PCR a partir de una biblioteca de ADNc de la línea celular de cáncer de mama DU4475 y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular DG44 con el vector de expresión de Notch1 humano. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Las células que expresaban la proteína Notch1 humana se seleccionaron mediante la utilización de anticuerpos disponibles comercialmente (R&D Systems, Inc., GTX23294) para establecer células Notch1/DG44 humanas.

Las líneas celulares productoras de proteína DLL3 soluble o su proteína variante por deleción N-terminal se prepararon con el fin de obtener inmunógenos para la obtención de anticuerpo anti-DLL3 y determinar los epítopos de los anticuerpos obtenidos. La secuencia extracelular de la DLL3 humana está compuesta de un dominio DSL de motivo de unión a receptor Notch (n° 176 a n° 215 en la secuencia de aminoácidos) y seis dominios de tipo EGF (1: 216-249, 2: 274-310, 3: 312-351, 4: 353-389, 5: 391-427, y 6: 429-465).

Se preparó el ADNc codificante de la molécula quimérica DLL3-Fc humana (SEC ID n° 5) que consistía en una región extracelular de la DLL3 humana (27-492 en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1) y secuencias de región constante del anticuerpo IgG2a de ratón, y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular DG44 con el vector de expresión DLL3-Fc humano. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron mediante ELISA clones de expresión elevada de la proteína DLL3 humana-Fc, mediante la utilización de anticuerpos antiratón a fin de establecer células DG44 productoras de DLL3 humana-Fc.

Se preparó el ADNc codificante de la molécula quimérica DLL3delta1 humana-Fc (SEC ID n° 6) que consistía en una secuencia parcial de la región extracelular de la DLL3 humana (176-492 en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1) y secuencias de región constante del anticuerpo IgG2a de ratón, y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular d G44 con el vector de expresión de DLL3delta1 humana-Fc. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron mediante ELISA clones de expresión elevada de la proteína DLL3delta1delta1 humana-Fc, mediante la utilización de anticuerpos antiratón a fin de establecer células DG44 productoras de DLL3delta1 humana-Fc.

Se preparó el ADNc codificante de la molécula quimérica DLL3delta2 humana-Fc (SEC ID n° 7) que consistía en una secuencia parcial de la región extracelular de la DLL3 humana (216-492 en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 1) y secuencias de región constante del anticuerpo IgG2a de ratón, y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular d G44 con el vector de expresión de DLL3delta2 humana-Fc. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron mediante ELISA clones de expresión elevada de la proteína DLL3deltaldelta2 humana-Fc, mediante la utilización de anticuerpos antiratón a fin de establecer células DG44 productoras de DLL3delta2 humana-Fc.

Se preparó ADNc codificante de la molécula quimérica DLL3-Fc de secuencia SEC ID n° 8) que consistía en una región extracelular de la DLL3 humana (33-490 en la secuencia de aminoácidos SEC ID n° 2) y secuencias de región constante del anticuerpo IgG2a de ratón, y se clonó en vectores de expresión pMCN para mamíferos. Se transformó la línea celular DG44 con el vector de expresión de DLL3 de ratón-Fc. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron mediante ELISA clones de expresión elevada de la proteína DLL3 de ratón-Fc, mediante la utilización de un anticuerpo antiratón a fin de establecer células DG44 productoras de DLL3 de ratón-Fc.

Se purificó cada proteína de interés a partir del sobrenadante de cultivo de la línea celular productora de proteína de fusión de Fc mediante cromatografía de columna de afinidad a proteína G y cromatografía de filtración en gel. Se determinó la concentración de la proteína purificada mediante ensayo de proteína DC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) con la IgG de concentración conocida a modo de patrón.

[Ejemplo 3] Obtención de anticuerpo anti-DLL3 y análisis de epítopos e internalización de anticuerpos

Se inmunizaron ratones Balb/C de seis a siete semanas de edad (Charles River Laboratories Japan, Inc.) y MRL/MpJJmsSIc-Ipr/Ipr (Japan SLC Inc.). Para el reto inicial, mediante preparación en una emulsión que utilizaba adyuvante completo de Freund (Becton, Dickinson y Company) se administraron por vía subcutánea las proteínas antigénicas en ellos a una dosis de 0,1 mg de DLLE humana-Fc/cabeza. Dos semanas después, la emulsión de antígeno preparada utilizando adyuvante incompleto de Freund se administró por vía subcutánea en ellos a una dosis de 0,05 mg/cabeza un total de 3 a 6 veces una vez a la semana. Se administraron por vía intravenosa 0,05 mg de las proteínas antigénicas en cada ratón individual en el que se confirmase una elevación del título de anticuerpo en el suero. Tres días después, se extrajeron las células de bazo y se mezclaron con células de mieloma de ratón P3-X63Ag8U1 (ATCC) en una proporción de recuentos celulares de aproximadamente 3:1. Se fusionaron dichas células mediante el método de polietilenglicol (PEG). Tras la eliminación del PEG mediante centrifugación, las células se suspendieron en un medio RPMI1640 que contenía complemento de medio 1xHAT (Sigma-Aldrich Corp.), 0,5x complemento de clonación de hibridoma BM-Condimed H1 (Roche Diagnostics GmbH) y suero de feto bovino al 10% para ajustar la concentración celular. A continuación, se sembraron las células en cada pocillo de una placa de 96 pocillos. Se confirmó la formación de colonias de hibridoma y después se analizaron la presencia o la ausencia de anticuerpos anti-DLL3 contenidos en el sobrenadante de cultivo mediante ELIA mediante la utilización de una placa recubierta con DLL3 humana-Fc. Las células de hibridoma contenidas en los pocillos positivos se clonaron mediante el método de dilución limitante para establecer líneas de hibridoma productoras de los anticuerpos anti-DLL3. Los anticuerpos monoclonales se isotiparon mediante la utilización de IsoStrip (Roche Diagnostics GmbH).

Cada anticuerpo monoclonal IgG se purificó a partir de los sobrenadantes de cultivo de los hibridomas establecidos mediante cromatografía de columna de afinidad a proteína G y tratamiento de desalación. La concentración del anticuerpo purificado se determinó mediante ensayo de proteína DC.

Se inmovilizaron por separado en una inmunoplaca Nunc (439454), DLL3 humana-Fc, DLL3 de ratón-Fc, DLL3delta1 humana-Fc y DLL3delta2 humana-Fc. Seguidamente, la superficie no reaccionada de la placa se bloqueó con una solución que contenía albúmina de suero bovino. Tras el lavado, cada solución diluida de anticuerpo ajustada a una concentración apropiada se añadió a lo anterior y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. Se extrajo la solución de reacción respecto de la placa. Tras el lavado con TBS que contenía Tween-20, se añadieron anticuerpos IgK antiratón marcados con fosfatasa alcalina y se incubaron durante 1 hora. Tras el lavado de la placa, se añadió a la misma un sustrato de fosfatasa alcalina Sigma 104 y se incubó a temperatura ambiente. Tras la incubación, se midió la absorbancia a una longitud de onda de 405 nm y una longitud de onda de referencia de 655 nm. Se muestran los resultados en la figura 2. Todos los anticuerpos purificados se unieron a la DLL3 humana-Fc de una manera dependiente de la dosis. Los anticuerpos monoclonales DL301, DL302, DL306 y DL312 y el anticuerpo disponible comercialmente MAB4315 se unieron a DLL3 de ratón-Fc. El anticuerpo disponible comercialmente MAB4315 se unió a DLL3delta1 humana-Fc, aunque no se unió a DLL3detal2 humana-Fc, demostrando que su epítopo estaba localizado en el dominio DSL. Los anticuerpos DL303, DL304, DL307 y DL311 no se unieron ni a DLL3detal1 humana-Fc ni a DLL3delta2 humana-Fc. De esta manera, los epítopos predichos de dichos anticuerpos están localizados entre los residuos 27 y 175 en la secuencia de aminoácidos s Ec iD n° 1. DL301, DL302, DL305, DL306, DL308, DL309 y DL312 se unieron tanto a DLL3delta1 humana-Fc y a DLL3delta2 humana-Fc, demostrando que los epítopos para dichos anticuerpos están localizados en los residuos 216 a 492 en la secuencia de aminoácidos SEC iD n° 1. La estructura esquemática de la proteína DLL3 de longitud completa, de la proteína de fusión de DLL3 soluble-Fc y de un sitio reconocido por cada anticuerpo anti-DLL3 se muestran en la figura 9.

La unión de cada anticuerpo monoclonal a DLL3 humana expresada sobre la membrana celular y el comportamiento del complejo de DLL3 humana-anticuerpo monoclonal sobre la membrana celular se analizaron mediante citometría de flujo. Se suspendieron células DLL3/BaF3 humanas en un tampón de FACS (PBS que contiene suero de feto bovino al 1% y azida sódica al 0,05%). La suspensión celular de 1 x 106 células/ml se hizo reaccionar con el anticuerpo monoclonal (concentración final: 5 pg/ml) a 4°C durante 30 minutos. Tras la centrifugación y eliminación del sobrenadante, las células se lavaron una vez con un tampón de FACS. Se añadieron a lo anterior anticuerpos anti-IgG (H+L) de ratón marcados con FITC (Beckman Coulter, Inc.) y se incubaron a 4°C durante 30 minutos. Los anticuerpos-FITC no reaccionados se separaron mediante centrifugación. A continuación, se suspendieron las células y se analizaron mediante la utilización de un citómetro de flujo FACSCalibur (Becton, Dickinson and Company). Para el propósito de analizar el movimiento o la desaparición del complejo de DLL3-anticuerpo de la membrana celular, se suspendieron células DLL3/BaF3 en un medio de cultivo RPMI1640 que contenía suero de feto bovino al 10% (FBS) e IL3 de ratón. La suspensión celular de 1 x 106 células/ml se mezcló con el anticuerpo monoclonal (concentración final: 5 pg/ml) y se hizo reaccionar a 37°C durante 1 hora o durante 4 horas en un incubador de CO2. Tras la reacción, la cantidad de anticuerpo unido a la membrana celular se analizó mediante citometría de flujo de la misma manera que anteriormente. Se determinó la media geométrica de los valores de intensidad de fluorescencia (x media geométrica) en un gráfico de histograma celular mediante la utilización del software analítico CELlQuest Pro incluido en el FACSCalibur. Todos los anticuerpos monoclonales anti-DLL3 aislados se unieron a DLL3 sobre las células (figura 3(a)). La reacción del anticuerpo con las células a 4°C inhibe la fluidez membranal, tal como la incorporación celular del complejo de DLL3-anticuerpo por la membrana celular. La reacción del anticuerpo con las células a 37°C puede causar la incorporación celular del complejo de DLL3-anticuerpo y la exocitosis (liberación por la membrana celular) resultante de la digestión de proteasa o similar. La cantidad de cada anticuerpo monoclonal unida a la membrana celular como resultado de la incubación a 37°C durante 1 hora o durante 4 horas se muestra en la figura 3(b) como un valor relativo respecto al valor a 4°C. Como resultado de la incubación a 37°C, la cantidad del anticuerpo DL303, DL304, DL305, DL308, DL309 o MAB4315 sobre la superficie de la membrana celular se redujo. Estos resultados sugieren la internalización o la exocitosis del complejo de DLL3-anticuerpo. En contraste, como resultado de la incubación a 37°C, la cantidad del anticuerpo Dl301, DL306, DL307, d L311 o DL312 sobre la superficie de la membrana celular prácticamente no cambió o, por el contrario, se incrementó. Este último resultado demuestra que dichos anticuerpos eran capaces de residir establemente en forma de un complejo de DLL3 sobre la membrana celular.

Se determinó el número de proteínas DLL3 sobre la superficie celular mediante la utilización de un QIFIKIT (DAKO F0479) para la determinación cuantitativa del antígeno de superficie celular mediante citometría de flujo. El análisis se llevó a cabo con el anticuerpo anti-DLL3 llamado DL303 (concentración final: 5 pg/ml) como anticuerpo primario siguiendo el protocolo incluido en el mismo. Los números del antígeno sobre las superficies de las células humanas DLL3/BaF3, NCI-H1184 (ATCC), NCI-H1436 (ATCC) y Y79 (Riken Cell Bank) eran de aproximadamente 9000, 7000, 6000 y 3000, respectivamente.

[Ejemplo 4] Inducción de la actividad de ADCC por anticuerpo anti-DLL3 e inhibición del crecimiento mediada por el complejo de anticuerpo-toxina

Se examinó cada anticuerpo anti-DLL3 para su actividad inductora de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) contra las células expresantes de DLL3 marcadas con calceína. Se cultivaron por separado las líneas celulares de DLL3 humana/BaF3 y de cáncer pulmonar de células pequeñas NCI-H1184 (ATCC) expresantes de DLL3, durante 90 minutos en presencia de 20 pg/ml de calceína-AM (Dojindo, 349-07201), después se centrifugaron y se lavaron para preparar células diana marcadas con calceína. Las células diana se sembraron a razón de 1 x 104 células/pocillo en una placa de 96 pocillos (Coster 3799). Seguidamente, se añadió a lo anterior anticuerpo ajustado a una concentración final apropiada y se incubó a temperatura ambiente durante 15 minutos. Se añadieron células efectoras a lo anterior a razón de 5 x 104 células/pocillo. La placa de reacción se incubó a 37°C en un incubador de CO2. Las células efectoras utilizadas eran células NK92 que expresaban una molécula quimérica de FcyR3 de ratón-FcyR3 humano (documento n° WO 2008/093688). Tras una incubación de 4 horas, la placa se centrifugó y se recogieron de cada pocilio 100 ^l del sobrenadante de cultivo. Se midió la intensidad de la fluorescencia utilizando un ARVO SX (Wallac).

Se calculó la actividad inductora de ADCC según la fórmula a continuación:

ADCC [%] = (A - C) / (B - C) x 100,

en la que:

A representa la intensidad de fluorescencia en cada pocillo; B representa la media de la intensidad de fluorescencia en el sobrenadante de células lisadas con Nonidet P-40 con una concentración final de 1%, y C representa la media de la intensidad de fluorescencia en un pocillo suplementado con sólo medio. Se calculó la media y desviación estándar a partir de tres mediciones bajo cada condición experimental. La figura 4 muestra la actividad inductora de ADCC del anticuerpo añadido a la concentración final de 2,5 ^g/ml contra las células DLL3/BaF3. No se confirmó actividad de ADCC en los anticuerpos de control IgG1 e IgG2b, mientras que se confirmó actividad inductora de ADCC en DL301, DL306 y DL312. No se confirmó una clara actividad de inducción de ADCC en el anticuerpo monoclonal disponible comercialmente MAB4315. La figura % MUESTRA que los anticuerpos DL301, DL306 y DL3l2 inducen ADCC contra DLL3/BaF3 y NCK-H1184 de una manera dependiente de la dosis.

Se evaluó cada anticuerpo monoclonal anti-DLL3 para su incorporación celular mediante la utilización de un anticuerpo secundario antiratón marcado con toxina Mab-ZAP (Advanced Targeting Systems). Se sembraron células DLL3/BaF3 a razón de 5 x 103 células/pocillo en una placa de 96 pocillos. Seguidamente, se añadió a lo anterior anticuerpo monoclonal de ratón anti-DLL3 y Mab-ZAP (concentración final: 1 ^g/ml) y se incubaron a 37°C en un incubador de CO2. Cuatro días después, se añadió a lo anterior reactivo de recuento celular SF (Nacalai Tesque, Inc.). Se midió la absorbancia a 450 nm y a una longitud de onda de control de 620 nm mediante la utilización de un lector de microplacas a fin de determinar el crecimiento celular (figura 6). La adición del anticuerpo monoclonal anti-DLL3 y Mab-ZAP a las células inhibió el crecimiento celular. Los anticuerpos DL301, DL306 y DL312 que presentaban una actividad de inducción de ADCC confirmada se mantuvieron en grandes cantidades sobre las células expresantes de DLL3 tras mezclarlas con las células y se cultivaron a 37°C y mostraron un bajo efecto de inhibición del crecimiento producido por la incorporación celular del complejo Mab-ZAP.

[Ejemplo 5] Clonación de región variable de anticuerpo y preparación de anticuerpo recombinante

Se preparó una biblioteca de ADNc Smart 5'-RACE (Clontech Laboratories, Inc.) a partir de los ARN totales de hibridomas productores de cada anticuerpo anti-DLL3. Se llevó a cabo la preparación de ARN total mediante la utilización de una columna RNeasy Mini (Qiagen). La preparación de la biblioteca de ADNc se realizó siguiendo las instrucciones del fabricante. Las secuencias codificantes de las regiones variables de anticuerpo (VH y VL) se amplificaron por PCR utilizando cebadores complementarios de las secuencias codificantes de las regiones constantes de los anticuerpos. Los fragmentos amplificados de esta manera por PCR se clonaron en pCR2.1TOPO y se secuenciaron. Se construyeron los vectores de expresión de anticuerpo quiméricos que contenían las secuencias codificantes de VH y VL obtenidas y las secuencias codificantes de región constante de IgG1 humana. Las secuencias codificantes de cadena ligera y de cadena pesada se incorporaron ambas en un vector de expresión para células de mamífero y se transcribieron bajo el control de un promotor de CMV de ratón. La Tabla 1 muestra las SEC ID n° de las secuencias de región variable de anticuerpo identificadas y sus secuencias de CDR, secuencias de anticuerpo de ratón de longitud completa y secuencias de anticuerpo quimérico.

Las células COS-7 se transfectaron con cada vector de expresión de anticuerpo quimérico y se dejó que expresasen transitoriamente el anticuerpo quimérico. Se confirmó que el anticuerpo quimérico en el sobrenadante de cultivo de COS-7 se unía a la proteína DLL3 humana mediante citometría de flujo y ELISA. Se calculó la concentración de anticuerpo quimérico en el sobrenadante de cultivo de COS-7 mediante ELISA de tipo sándwich. En dicho cálculo de la concentración, se utilizó como patrón un anticuerpo quimérico humano de concentración conocida. El anticuerpo quimérico (concentración final: 1 |jg/ml) se añadió a células DLL3 humana/BaF3 suspendidas en un tampón de FACs (PBS que contiene suero de feto bovino al 1%). Tras la incubación a 4°C durante 30 minutos y el lavado, las células se hicieron reaccionar con anticuerpos antihumanos marcados con FITC (Beckman Coulter, Inc.) y se analizó la unión del anticuerpo quimérico mediante la utilización de un citómetro de flujo FACSCalibur. Tal como se muestra en la figura 7, los anticuerpos quiméricos DL301, DL309 y DL312 se unieron a células DLL3 humana/BaF3. Ninguno de los anticuerpos quiméricos se unió a las células Ba/F3, que eran una línea parental de las células de expresión forzada. Se inmovilizó DLL3 humana-Fc sobre una inmunoplaca Nunc y se analizó la unión de cada anticuerpo quimérico a la proteína inmovilizada. Para la detección de los anticuerpos quiméricos unidos a antígeno, se añadió el anticuerpo quimérico a los mismos y después se añadieron anticuerpos antihumanos marcados con fosfatasa alcalina (Biosource, AHI0305) y un sustrato de fosfatasa alcalina Sigma 104, en este orden. Se determinó la absorbancia. Los anticuerpos quiméricos DL301, DL309 y DL312 se unieron a DLL3 humana-Fc de una manera dependiente de la dosis (figura 8(a)).

[Ejemplo 6] Agrupamiento de epítopos mediante ELISA competitivo

La competición de un anticuerpo quimérico y un anticuerpo de ratón para la unión a la molécula de antígeno se analizó mediante ELISA (figura 8(b)). Se añadió DLL3 humana-Fc a razón de 10 ng/pocillo a una inmunoplaca Nunc y se inmovilizó sobre la misma. Se añadió una mezcla (concentración final: 50 ng/ml) del anticuerpo quimérico y el anticuerpo de ratón apropiadamente diluido a la placa con proteína DLL3-Fc inmovilizada. La placa se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora y después se lavó. Se añadieron a la misma anticuerpos antihumanos marcados con fosfatasa alcalina y se incubaron. Tras la incubación, se añadió a lo anterior Sigma 104 y se midió la absorbancia. La unión del anticuerpo quimérico a la molécula de antígeno competía con la unión a la misma del anticuerpo monoclonal de ratón original. Los anticuerpos aparte del anticuerpo de ratón DL301 no inhibieron la unión del anticuerpo quimérico DL301 al antígeno. Los anticuerpos aparte del anticuerpo de ratón DL312 no inhibieron la unión del anticuerpo quimérico DL312 al antígeno. Estos resultados demuestran que DL301 y DL312 se unen a sus epítopos únicos respectivos. Los anticuerpos de ratón DL305, DL308 y DL309 inhibieron la unión del anticuerpo quimérico DL309 al antígeno prácticamente al mismo nivel, sugiriendo que un epítopo era el mismo en estos 3 anticuerpos. El anticuerpo de ratón DL306 con actividad de inducción de ADCC confirmada no inhibió la unión del anticuerpo quimérico DL301, DL309 o DL312 al antígeno. Estos resultados demuestran que DL306 reconoce un epítopo independiente del epítopo de DL301, DL309 o DL312.

[Ejemplo 7] Establecimiento de línea celular expresante de anticuerpo anti-DLL3 recombinante y purificación del anticuerpo recombinante

Las células COS-7 se transfectaron con el vector de expresión de anticuerpo quimérico DL306 y se dejó que expresasen transitoriamente el anticuerpo quimérico. Se confirmó mediante citometría de flujo que el anticuerpo quimérico en el sobrenadante de cultivo de COS-7 se unía a la proteína DLL3 humana. Se calculó la concentración de anticuerpo quimérico en el sobrenadante de cultivo de COS-7 mediante ELISA de tipo sándwich. En dicho cálculo de la concentración, se utilizó como patrón un anticuerpo quimérico humano de concentración conocida. El anticuerpo quimérico (concentración final: 1 jg/m l) se añadió a células DLL3 humana/BaF3 suspendidas en un tampón de FACS (PBS que contiene suero de feto bovino al 1%). Tras la incubación a 4°C durante 30 minutos y el lavado, las células se hicieron reaccionar con anticuerpos antihumanos marcados con FITC (Beckman Coulter, Inc.) y se analizó la unión del anticuerpo quimérico mediante la utilización de un citómetro de flujo FACSCalibur. Tal como se muestra en la figura 10, el anticuerpo quimérico DL306 se une a DLL3 humana/BaF3 y no se une a las células Ba/F3, que son una línea parental.

La línea celular DG44 se transformó con el vector de expresión del anticuerpo quimérico humano DL301, DL306, DL309 o DL312. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron mediante ELISA clones de expresión elevada del anticuerpo quimérico humano mediante la utilización de anticuerpos antihumanos a fin de establecer células DG44 productoras de anticuerpos quiméricos humanos.

Se purificó cada proteína de interés a partir del sobrenadante de cultivo de la línea celular productora de anticuerpo quimérico humano mediante cromatografía de columna de afinidad a proteína A y cromatografía de filtración en gel. Se determinó la concentración de la proteína purificada mediante ensayo de proteína DC (Bio-Rad Laboratories, Inc.) con la IgG de concentración conocida a modo de patrón.

Se construyó un vector de expresión de anticuerpo IgG2a de ratón que contenía las secuencias codificantes de VH y VL de DL301, DL306 o DL312 y secuencias codificantes de la región constante de IgG2a de ratón. Las secuencias codificantes de cadena ligera y de cadena pesada se incorporaron ambas en un vector de expresión para células de mamífero y se transcribieron bajo el control de un promotor de CMV de ratón. Una línea celular CHO deficiente en transportador de fucosa (documento n° WO2005/017155) se transformó con el vector de expresión de anticuerpo IgG2a de ratón. Se seleccionaron las células resistentes al fármaco en presencia de geneticina. Se seleccionaron clones de expresión elevada del anticuerpo IgG2a de ratón mediante ELISA mediante la utilización de anticuerpos IgG2a antiratón a fin de establecer células CHO productoras de anticuerpo IgG2a bajo en fucosa de ratón. Se purificó

Claims

REIVINDICACIONES

i. Composición farmacéutica para la utilización en un método de tratamiento de cáncer pulmonar de células pequeñas que expresa proteína DLL3, en la que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3, en la que el anticuerpo presenta una actividad citotóxica y reconoce la región de aminoácidos 216 a 492 en la DLL3 humana que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 1.
2 Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 1, en la que la actividad citotóxica es una actividad citotóxica mediada por células dependiente de anticuerpos (actividad ADCC).
3. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 1, en la que la actividad citotóxica es una citotoxicidad dependiente del complemento (actividad CDC).
4. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que el anticuerpo presenta una actividad de internalización.
5. Composición para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que el anticuerpo se conjuga con una sustancia citotóxica.
6. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que la composición farmacéutica comprende un anticuerpo que se une a la proteína DLL3 indicada en cualquiera de los elementos siguientes:

(1) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 12, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 13, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 14, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 18, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 19, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 20;

(2) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 24, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 25, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 26, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 30, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 31, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 32;

(3) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 36, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 37, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 38, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 42, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 43, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 44 y (4) un anticuerpo que comprende una región variable de cadena pesada que comprende CDR1 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 48, CDR2 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 49, y CDR3 de cadena pesada que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 50, y una región variable de cadena ligera que comprende CDR1 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 54, CDR2 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 55, y CDR3 de cadena ligera que presenta la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID n° 56.
7. Composición farmacéutica para la utilización según cualquiera de las realizaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo biespecífico.
8. Composición farmacéutica para la utilización según la reivindicación 7, en la que el anticuerpo comprende un sitio de unión a antígeno que reconoce un antígeno diferente de DLL3.