TW201625689A - 抗－ｂ７－ｈ４抗體及免疫結合物 - Google Patents

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史蒂芬Ｒ 梁
安佐 波森
保羅 波拉基斯
雁 吳
偉慶 梁
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    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Abstract

本發明提供抗-B7-H4抗體及免疫結合物以及其使用方法。

Description

抗-B7-H4抗體及免疫結合物
本申請案主張2014年9月12日申請之美國臨時申請案第62/049,701號之優先權，該臨時申請案以全文引用的方式併入本文中以達成任何目的。
本發明係關於抗-B7-H4抗體及免疫結合物以及其使用方法。
B7-H4為I型跨膜蛋白且為提供輔助信號與T細胞受體抗原信號一起之蛋白質B7超家族一員。B7-H4為T細胞功能之負調控劑且T細胞之接合抑制其生長、細胞因子分泌及細胞毒性。小鼠中B7-H4之消除不影響免疫細胞穩態且無自體免疫徵象。Zhu等人，Blood,113(8)：1759-1767(2009)；Suh等人，Molecular and Cellular Biology,26(17)：6403-6411(2006)。B7-H4之受體未知且未鑑別。
人類B7-H4為282個胺基酸之蛋白質(包括胺基端信號序列)，其中在胺基端信號序列裂解後預測約227個胺基酸在細胞外間隙中。B7-H4包含Ig樣V結構域、Ig樣C結構域、跨膜結構域及短胞質尾。
三陰性乳癌(TNBC)佔所有乳癌報導病例不到20%，且對臨床醫師而言，仍然為重大挑戰。因為此等腫瘤對激素受體(ER及PR)及人類表皮生長因子受體2(Her2)非陽性，所以TNBC患者不適合已有效治療大部分彼等受體陽性乳癌的使用ER/PR/Her2受體拮抗劑之靶向療 法。基底樣及富含Her2之兩種其他乳癌亞型不大可能表現ER或PR且大部分基底樣癌症亦為Her2陰性的。雖然TNBC與基底樣均缺乏ER/PR及Her2表現，但僅僅80% TNBC顯示與侵襲性基底樣亞型相關之分子型態。出於此原因，TNBC及基底樣視為不同亞型，但具有重疊之特徵。TNBC及基底樣具有侵襲性不如其他之各種組織學亞型(分泌性、腺樣囊性、髓性、侵襲性導管及化生性)，但整體上大部分與早期發作及快速進展相關。一旦疾病變成轉移性，自復發至死亡之中值時間比乳癌其他形式短得多。TNBC之當前治療庫包括蒽環黴素(anthracycline)、紫杉烷(taxane)、鉑劑及使用生物試劑之臨床試驗。然而，尚無TNBC管理之公認標準照護且此等患者之預後仍然不良。
靶向TNBC之方法已限於尋找藉由抑制DNA修復(Chk1、Chk2PARP)、血管生成(VEGF及VEGA)、EGFR、PI3K/Akt/mTor及Src信號傳導路徑來侵襲癌症之秘密途徑。幾種靶向方法包括雄激素受體，其在超過70%乳癌中表現；及FGFR，據報導其在4% TNBC中擴增。迄今為止，治療TNBC尚無證實之分子標靶。
B7-H4為能夠經由其共抑制信號以及T細胞受體對抗原依賴性信號傳導下調免疫系統之B7家族一員。B7-H4在正常人類組織中很少表現，但在包括女性生殖系統癌症(乳癌、卵巢癌及子宮內膜癌)之無數人類癌症中高度過度表現。據報導B7-H4之流行率在構成原發性(約95%)及轉移性乳癌(約97%)之侵襲性導管及小葉癌中為高的。雖然B7-H4染色增加與陰性PR及Her2狀態相關，但表現與腫瘤級別或階段無關。除彼等類型乳癌中高比例B7H4染色細胞之外，浸潤性淋巴球數目亦伴隨降低。近來，在肺部轉移性乳癌之B7-H4基因剔除模型中，作者報導B7-H4-/-小鼠具有較少肺腫瘤結，且展示與野生型小鼠相比，對腫瘤攻擊增強之存活及記憶反應。此歸因於結合於B7-H4-Ig融合蛋白之腫瘤相關嗜中性白血球對CD4及CD8細胞之免疫抑制作 用。此亦可解釋為何SCID小鼠中植入之過度表現B7-H4之SKOV3細胞比野生型SKOV3細胞更具侵襲性地生長。此外，展示在SKBR3細胞中B7-H4 mRNA及蛋白質之基因表現阻斷增加卡斯蛋白酶活性及細胞凋亡。總體而言，存在足夠證據確保研究B7-H4為乳癌之分子標靶。
在此項技術中需要靶向B7-H4之藥劑，以診斷及治療B7-H4相關病症，諸如癌症。本發明實現此需要且提供其他益處。
本發明提供抗-B7-H4抗體及免疫結合物以及其使用方法。
在一些實施例中，提供結合於B7-H4之分離抗體，其包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；或(b)(i)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2。
在一些實施例中，該抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3；或(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：53之重鏈構架FR3序列。
在一些實施例中，該抗體包含：(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及 (c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：47之輕鏈構架FR3序列。
在一些實施例中，該抗體包含：(a)與SEQ ID NO：38之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；(b)與SEQ ID NO：126之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)與SEQ ID NO：127之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；或(d)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；或(e)如(c)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：38或127之VH序列。在一些實施例中，該抗體包含SEQ ID NO：126之VL序列。
在一些實施例中，提供結合B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含(a)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(b)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
在一些實施例中，提供結合B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1， (v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在本文中描述之任一實施例中，抗體可為單株抗體。在本文中描述之任一實施例中，抗體可為人類、人類化或嵌合抗體。在本文中描述之任一實施例中，抗體可為結合B7-H4之抗體片段。
在本文中描述之任一實施例中，抗體可為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。在本文中描述之任一實施例中，抗體可包含一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基。在本文中描述之任一實施例中，該一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基可位於重鏈中。在本文中描述之任一實施例中，該一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基可位於輕鏈中。在本文中描述之任一實施例中，抗體在重鏈恆定區中可包含至少一個選自A118C及S400C之突變。在本文中描述之任一實施例中，抗體在輕鏈恆定區中可包含至少一個選自K149C及V205C之突變。
在一些實施例中，提供一種結合於B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含(a)SEQ ID NO：132之重鏈序列及SEQ ID NO：134之輕鏈序列；或(b)SEQ ID NO：133之重鏈序列及SEQ ID NO：134之輕鏈序列；或(c)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：140之輕鏈序列；或(d)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：141之輕鏈序列；或(e)SEQ ID NO：131之重鏈序列及SEQ ID NO：140之輕鏈序列；或(f)SEQ ID NO：131之重鏈序列及141之輕鏈序列；或(g)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：142之輕鏈序列；或(h)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：143之輕鏈序列；或(i)SEQ ID NO：137之重鏈序列及SEQ ID NO：138之輕鏈序列；或(j)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；或(d)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：146之輕鏈序列；或(e)SEQ ID NO：131之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；或(f) SEQ ID NO：131之重鏈 序列及146之輕鏈序列；或(g)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列；或(h)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：148之輕鏈序列。
在一些實施例中，提供一種包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元。在一些實施例中，第一抗原決定基或第二抗原決定基為整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基。在一些實施例中，第一抗原決定基或第二抗原決定基不在B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在含有B7-H4 Ig-V之結構域內。在一些實施例中，第一抗原決定基在整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內且第二抗原決定基不在B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在含有B7-H4 Ig-V之結構域內；或其中第一抗原決定基不在B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在含有B7-H4 Ig-V之結構域內，且第二抗原決定基在整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內。在一些實施例中，第一抗原決定基及第二抗原決定基各獨立地選自以下各者：a)在整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；b)在整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基；以及c)在整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基。
在一些實施例中，含有B7-H4 Ig-V之結構域具有SEQ ID NO：73之胺基酸29-157之序列。在一些實施例中，含有B7-H4 Ig-C之結構域具有SEQ ID NO：73之胺基酸158-250之序列。
在一些實施例中，a)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗 原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基；或b)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或c)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或d)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；或e)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；或f)第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基。
在一些實施例中，第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或其中第一半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且第二半抗體結合整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基。
在一些實施例中，第一半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1， (v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(c)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(d)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
在一些實施例中，第二半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(c)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(d)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
在一些實施例中，第一半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1， (v)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列。
在一些實施例中，第二半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列。
在一些實施例中，雙抗原決定基抗體為IgG1或IgG4抗體。在一些實施例中，第一半抗體含有包含杵突變之第一重鏈恆定區且第二重鏈含有包含臼突變之第二重鏈恆定區；或其中第一半抗體含有包含臼突變之第一重鏈恆定區且第二重鏈含有包含杵突變之第二重鏈恆定區。在一些實施例中，雙抗原決定基抗體為IgG1抗體且其中杵突變包含T366W突變。在一些實施例中，雙抗原決定基抗體為IgG1抗體且其中臼突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V之突變。在一些實施例中，雙抗原決定基抗體為IgG4抗體且其中杵突變包含T366W突變。在一些實施例中，雙抗原決定基抗體為IgG4抗體且其中臼突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V突變之突變。
在一些實施例中，提供一種雙抗原決定基抗體，其中：a)包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第一半抗體；b)包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第一半抗體； c)包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第一半抗體；d)包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第一半抗體；e)包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第二半抗體；f)包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第二半抗體；g)包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第二半抗體；或h)包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第二半抗體。
在一些實施例中，提供一種雙抗原決定基抗體，其中：a)包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第一半抗體，及包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第二半抗體；或b)包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列的第一半抗體，及包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列的第二半抗體。
在一些實施例中，提供一種雙抗原決定基抗體，其包含第一半抗體及第二半抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列，且第二半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列。
在本文中描述之任一實施例中，B7-H4可為SEQ ID NO：73之人 類B7-H4。
在一些實施例中，提供一種編碼本文所述之抗體的分離核酸。在一些實施例中，提供一種包含該核酸之宿主細胞。在一些實施例中，提供一種產生本文所述之抗體的方法，其包含培養該宿主細胞，從而產生該抗體。
在一些實施例中，提供包含本文所述之抗體及細胞毒性劑的免疫結合物。在一些實施例中，細胞毒性劑經由抗體序列中工程改造半胱胺酸結合於抗體。在一些實施例中，免疫結合物具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為技術方案1至18中任一項之抗體；(b)L為連接子；(c)D為藥物；且(d)p在1-8範圍內。
在一些實施例中，D或細胞毒性劑係選自類美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯(pyrrolobenzodiazepine)、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。在一些實施例中，D或細胞毒性劑為阿瑞他汀。在一些實施例中，D或細胞毒性劑具有式DE
且其中R2及R6各為甲基，R3及R4各為異丙基，R5為H，R7為第二丁基，各R8獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9為H；且R18為-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
在一些實施例中，D或細胞毒性劑為MMAE。
在一些實施例中，D或細胞毒性劑為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
在一些實施例中，D或細胞毒性劑具有如下結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，D或細胞毒性劑為奈莫柔比星衍生物。在一些實施例中，D或細胞毒性劑具有選自以下之結構：
在一些實施例中，細胞毒性劑包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。在一些實施例中，細胞毒性劑具有下式：
其中R1係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於L之鍵；R2係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於L之鍵； Ra及Rb獨立地選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基，或Ra及Rb形成五或六員雜環基；T為選自C3-C12伸烷基、Y、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C2-C6伸烯基)-Y-(C2-C6伸烯基)及(C2-C6伸炔基)-Y-(C2-C6伸炔基)之繫栓基團；其中Y獨立地選自O、S、NR1、芳基及雜芳基；其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基視情況經一或多個F取代；或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經鍵結於L之鍵取代；D'為選自以下各者之藥物部分：
其中波形線指示與T之附接位點；X1及X2獨立地選自O及NR3，其中R3係選自H及視情況經一或多 個F取代之C1-C6烷基；R4為H、CO2R或鍵結於連接子(L)之鍵，其中R為C1-C6烷基或苯甲基；且R5為H或C1-C6烷基。
在一些實施例中，細胞毒性劑具有選自以下各者之結構：
在一些實施例中，細胞毒性劑包含以下結構：
在一些實施例中，免疫結合物之連接子可藉由蛋白酶裂解。在一些實施例中，連接子包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。在一些實施例中，連接子對酸為不穩定的。在一些實施例中，連接子包含腙。
在一些實施例中，提供具有下式之免疫結合物：
其中S為硫原子。
在一些實施例中，提供具有下式之免疫結合物： 其中Ab為本文所述之抗體。
在一些實施例中，提供具有選自以下各者之式的免疫結合物： 其中Ab為本文所述之抗體。
在一些實施例中，提供具有選自以下各者之式的免疫結合物： 其中Ab為本文所述之抗體。
在任一本文所述之免疫結合物中，p可在1.4-5、2-5、1-3或1.4-2範圍內。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為結合人類B7-H4之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列的輕鏈；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為重鏈中之A118C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為結合人類B7-H4之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列的重鏈及包含SEQ ID NO：134之胺基酸序列的輕鏈；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為重鏈中之A118C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列，且第二半抗體包含SEQ ID NO：162或 166之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列；且其中細胞毒性劑與抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列，且第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中細胞毒性劑與抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中細胞毒性劑與抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為輕鏈中之K149C 半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供一種免疫結合物，其中該免疫結合物包含與細胞毒性劑結合之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中細胞毒性劑與抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
在一些實施例中，提供醫藥調配物，其包含本文所述之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在一些實施例中，醫藥調配物進一步包含另一治療劑。在一些實施例中，另一治療劑為Avastin®(貝伐單抗(bevacizumab))。
在一些實施例中，提供治療患有B7-H4陽性癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之本文所述之免疫結合物。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症係選自乳癌、卵巢癌及子宮內膜癌。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。在一些實施例中，該方法包含向該個體投與其他治療劑。在一些實施例中，其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗(bevacizumab))。在一些實施例中，其他治療劑係選自多烯紫杉醇(docetaxel)、小紅莓(doxorubicin)、環磷醯胺(cyclophosphamide)、卡鉑(carboplatin)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、nab-太平洋紫杉醇、吉西他濱(gemcitabine)、順鉑及 PARP抑制劑(諸如奧拉帕尼(olaparib)、依尼帕瑞(iniparib))。
在一些實施例中，提供抑制B7-H4陽性細胞之增殖的方法，該方法包含將該細胞暴露於本文所述之免疫結合物容許免疫結合物與細胞表面上之B7-H4結合的條件下，藉此抑制細胞增殖。在一些實施例中，細胞為乳房、卵巢或子宮內膜癌細胞。在一些實施例中，細胞為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。
在一些實施例中，提供與標記結合的本文所述之抗體。在一些實施例中，標記為正電子發射體。在一些實施例中，正電子發射體為89Zr。
在一些實施例中，提供偵測生物檢體中人類B7-H4之方法，其包含使該生物檢體與本文所述之抗-B7-H4抗體在容許抗-B7-H4抗體與天然存在之人類B7-H4結合之條件下接觸，且偵測生物檢體中在抗-B7-H4抗體與天然存在之人類B7-H4之間是否形成複合物。在一些實施例中，生物檢體為乳癌檢體、卵巢癌檢體或子宮內膜癌檢體。在一些實施例中，生物樣本為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。
在一些實施例中，提供偵測B7-H4陽性癌症之方法，其包含(i)向患有或懷疑患有B7-H4陽性癌症之個體投與經標記之抗-B7-H4抗體，其中該經標記之抗-B7-H4抗體包含本文所述之抗-B7-H4抗體，及(ii)偵測個體中經標記之抗-B7-H4抗體，其中經標記之抗-B7-H4抗體的偵測指示個體中之B7-H4陽性癌症。在一些實施例中，經標記之抗-B7-H4抗體包含與正電子發射體結合之抗-B7-H4抗體。在一些實施例中，正電子發射體為89Zr。
圖1展示如實例A中所述各種組織中人類B7-H4基因表現水準之圖示。
圖2展示如實例B中所述，藉由原位雜交，乳房癌檢體中B7-H4之 表現。
圖3A-E展示(A)所有乳癌亞型中B7-H4表現之流行率，(B)乳癌亞型中B7-H4染色之0、1+、2+及3+水準之流行率，(C)乳房腫瘤中B7-H4之整體表現(藉由西方分析)，(D)原發性乳房腫瘤中B7-H4之表現(藉由西方分析)，(E)卵巢瘤中B7-H4之表現，如實例B中所述。
圖4A-B展示(A)如實例中所述產生之某些抗-B7-H4單株抗體之特性，及(B)本文所述之抗-B7-H4單株抗體之抗原決定基分組。
圖5展示鼠類抗體1D11、32D6、9B9及22C10之輕鏈及重鏈可變區序列之比對。
圖6展示鼠類抗體mu1D11及其人類化變異體之輕鏈可變區序列的比對。
圖7展示鼠類抗體mu1D11及其人類化變異體之重鏈可變區序列的比對。
圖8展示鼠類抗體mu22C10及其人類化變異體之輕鏈可變區序列。
圖9展示鼠類抗體mu22C10及其人類化變異體之重鏈可變區序列。
圖10展示來自人類、黑猩猩、食蟹獼猴、大鼠及小鼠之B7-H4的比對。
圖11展示抗-B7-H4抗體之物種交叉反應性。
圖12展示嵌合抗體ch1D11及ch22C10及各種人類化變異體之親和力量測。
圖13展示抗-B7-H4抗體之內化，如藉由抗-B7-H4 9B9抗體之染色與SK-BR3細胞中EGF染色之重疊所證實。
圖14展示抗-B7-H4抗體可到達MX-1之溶酶體。
圖15展示抗-B7-H4免疫結合物證實在MX-1乳癌異種移植物中之 功效。
圖16展示抗-B7-H4免疫結合物證實在HBCX-24乳癌異種移植物中之功效。
圖17展示抗-B7-H4免疫結合物證實在MX-1乳癌異種移植物中之功效。
圖18展示抗-B7-H4免疫結合物證實在MX-1乳癌異種移植物中之功效。
圖19A-B展示(A)藉由FACS及免疫組織化學，B7-H4在HCC-1569x2乳癌異種移植物上之表現，及(B)抗-B7-H4免疫結合物證實在HCC-1569x2乳癌異種移植物中之功效。
圖20A-B展示在正常人類組織中之B7-H4表現：(A)藉由來自各種正常人類組織之蛋白質溶解物、過度表現B7-H4之293細胞及人類乳腺癌之西方墨點法，使用mAb A57.1；以及(B)藉由與人類乳腺癌相比，在正常人類胰臟、乳房、腎、肺及肝中免疫組織化學。
圖21展示hu1D11v1.9_VarD結合於重組人類B7-H4之抗原決定基定位。(A)嵌合Ig-結構域及可溶性人類B7-H4-IgV-Fc融合蛋白之質體表現構築體之圖；(B)偵測hu1D11v1.9_VarD與B7-H4(Ig-V)：MolX(Ig-C,TM,CD)之結合；(C)表現重組人類B7-H4之293細胞上hu1D11v1.9_VarD經B7-H4-(Ig-V)-hIgG1 Fc融合蛋白置換；以及(D)hu1D11v1.9_VarD與短暫表現重組人類B7-H4 S114A糖基化突變體之293細胞結合。
圖22A-B展示h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之(A)輕鏈及(B)重鏈之胺基酸序列。
圖23A-B展示(A)hu1D11v1.9_VarC2及hu1D11v1.9_VarD對人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠B7-H4之親和力以及對在乳癌細胞株MX-1中表現之內源性人類B7-H4的親和力；以及(B)h1D11v1.9_VarD抗體-藥物 結合物針對過度表現重組人類B7-H4之293細胞的活體外效能。
圖24A-C展示(A)藉由FACS(頂部)及IHC(底部)，B7-H4在HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳癌細胞上之表現；以及(B)h1D11v1.9_VarC2及(C)h1D11v1.9_VarD抗體藥物結合物在HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳癌異種移植模型中之功效。
圖25A-B展示(A)藉由FACS(頂部)及IHC(底部)，B7-H4在MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳癌細胞上之表現；以及(B)h1D11v1.9_VarD抗體藥物結合物在MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳癌異種移植模型中之功效。
圖26A-B展示(A)藉由FACS(頂部)及IHC(底部)，B7-H4在TNBC(Her2-/ER-/PR-)腫瘤細胞上之表現；以及(B)hu1D11v1.9_VarD抗體藥物結合物在TNBC(Her2-/ER-/PR-)腫瘤異種移植模型中之功效。
圖27展示89ZR標記之hu1D11v1.9_VarD IgG1 A118C(%ID/g)的組織吸收。圖展示Ab-1及抗-gD抗體在脾、腎、肝、肺及血液中之分佈。
圖28A-D展示經89Zr標記之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C(右邊)及經89Zr標記之同型對照(左邊)在來自每組兩隻大鼠之代表性大鼠中之組織分佈：(A)給藥後16小時、(B)給藥後48小時、(C)給藥後120小時；以及(D)hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C對Mx-1細胞上內源性B7-H4及來自各種物種之在293細胞中表現之B7-H4的識別。
圖29展示投與hu1D11v1.9-VarD、同型匹配抗體或作為陽性對照之mCTLA-4Ig的腦脊髓炎(EAE)模型小鼠中之發炎。
圖30展示雙抗原決定基抗體杵-h1D11v1.9 varD：臼-h22C10v2.7(「KH1D+22C」)或杵-h22C10v2：臼-7h1D11v1.9varD(「KH22C+1D」)及親本單抗原決定基抗體與MX-1細胞之表面的結合。
圖31A-D展示單抗原決定基抗-B7-H4抗體(A、B)及雙抗原決定基 抗-B7H4抗體(C、D)之膜染色及內化。
圖32A-D展示單抗原決定基及雙抗原決定基抗-B7H4抗體針對B7-H4陰性MCF-7細胞(A)、B7-H4陽性293hB7-H4細胞(B)、B7-H4陽性MX-1細胞(C)及B7-H4陽性SKBR3細胞(D)之活體外效能。
I. 定義
出於本文之目的，「接受體人類構架」為包含來源於如以下所定義之人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之輕鏈可變域(VL)構架或重鏈可變域(VH)構架之胺基酸序列的構架。「來源於」人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之接受體人類構架可包含人類免疫球蛋白構架或人類共同構架之相同胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化之數目為10個或10個以下、9個或9個以下、8個或8個以下、7個或7個以下、6個或6個以下、5個或5個以下、4個或4個以下、3個或3個以下、或2個或2個以下。在一些實施例中，VL接受體人類構架序列與VL人類免疫球蛋白構架序列或人類共同構架序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用之總和之強度。除非另外指明，否則如本文所用，「結合親和力」係指反映結合對(例如抗體與抗原)成員之間1：1相互作用之固有結合親和力。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。可藉由此項技術中已知之常用方法(包括本文所述之方法)量測親和力。用於量測結合親和力之特定說明性及示例性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指相較於在一或多個高變區(HVR)中不具有一或多個變化之親本抗體，具有此類變化之抗體，此等變化使抗體對抗原之親和力得到提高。
術語「抗-B7-H4抗體」及「結合於B7-H4之抗體」係指能夠以足夠親和力結合B7-H4之抗體，使得抗體適用作靶向B7-H4中之診斷及/或治療劑。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析(RIA)所量測，抗-B7-H4抗體與不相關之非B7-H4蛋白質之結合程度小於該抗體與B7-H4之結合的約10%。在某些實施例中，結合於B7-H4之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、10nM、5nm、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於在來自不同物種之B7-H4中保守的B7-H4之抗原決定基。
術語「抗體」在本文中以最廣泛意義使用且涵蓋各種抗體結構，包括(但不限於)單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要該等片段展示所需抗原結合活性。
「抗體片段」係指除完整抗體外之分子，其包含完整抗體之一部分，且結合完整抗體所結合之抗原。抗體片段之實例包括(但不限於)Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
與參考抗體「結合於相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析中，阻斷參考抗體與其抗原50%或50%以上之結合的抗體，且相反地，在競爭分析中，參考抗體阻斷該抗體與其抗原結合達50%或50%以上。本文提供一種示例性競爭分析。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中通常特徵為不受調控細胞生長/增殖之生理病狀。癌症之實例包括(但不限於)癌瘤、淋巴瘤(例如霍奇金氏淋巴瘤(Hodgkin's lymphoma)及非霍奇金氏淋巴瘤)、母細胞瘤、肉瘤及白血病。此類癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺鱗狀癌、腹膜癌、肝 細胞癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝瘤、乳癌(包括三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌)、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌或子宮癌、唾液腺癌、腎癌、肝癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌瘤、白血病及其他淋巴組織增生病症及各種類型頭頸癌。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同來源或物種之抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區之類型。抗體存在五種主要類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且其中若干者可進一步分成亞類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同類別之免疫球蛋白的重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
如本文所用，術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞之物質。細胞毒性劑包括(但不限於)放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如甲胺喋呤(methotrexate)、阿德力黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼(vincristine)、長春鹼(vinblastine)、依託泊苷(etoposide))、小紅莓、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如溶核酶；抗生素；毒素，諸如小分子毒素或細菌、真菌、植物或動物來源之酶促活性毒素，包括其片段及/或變異體；以及以下所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「效應功能」係指可歸因於抗體之Fc區之彼等生物活性，其隨抗體同型變化。抗體效應功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細 胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細胞表面受體(例如B細胞受體)之下調；及B細胞活化。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指以所需劑量及持續所需時間段有效達成所希望治療或預防結果之量。
術語「抗原決定基」係指抗體結合之抗原分子上之特定位點。
本文中之術語「Fc區」用於定義含有至少一部分恆定區之免疫球蛋白重鏈之C端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或自Pro230延伸至重鏈之羧基端。然而，Fc區之C端離胺酸(Lys447)可存在或可不存在。除非本文另外說明，否則Fc區或恆定區中胺基酸殘基之編號係依據EU編號系統，亦稱為EU索引，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD,1991中所述。
「構架」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域：FR1、FR2、FR3及FR4組成。因此，在VH(或VL)中HVR及FR序列一般以如下序列出現：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「全抗體」在本文中可互換使用且係指結構實質上類似於天然抗體結構或具有含有如本文所定義之Fc區之重鏈的抗體。
術語「B7-H4之糖基化形式」係指藉由添加碳水化合物殘基而經轉譯後修飾之B7-H4的天然存在之形式。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括此類細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉型細胞」，其包括初級轉型細胞及自其衍生 之子代(不考慮繼代次數)。子代之核酸含量可與親本細胞不完全相同，且可能含有突變。本文包括如針對原始轉型細胞篩選或選擇，具有相同功能或生物活性之突變子代。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源的抗體之胺基酸序列的抗體。人類抗體之此定義特定排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同構架」為表示一系列人類免疫球蛋白VL或VH構架序列中最常出現之胺基酸殘基之構架。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自可變域序列之亞群。一般而言，序列亞群為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞群。在一個實施例中，對於VL，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群κ I。在一實施例中，對於VH，亞群為如Kabat等人，前述中之亞群III。
「人類化」抗體係指包含來自非人類HVR之胺基酸殘基及來自人類FR之胺基酸殘基的嵌合抗體。在某些實施例中，人類化抗體將包含至少一個且通常兩個可變域之實質上全部，其中全部或實質上全部HVR(例如CDR)均對應於非人類抗體之HVR，且全部或實質上全部FR皆對應於人類抗體之FR。人類化抗體視情況可包含來源於人類抗體之抗體恆定區之至少一部分。抗體(例如非人類抗體)之「人類化形式」係指已經歷人類化之抗體。
如本文所用，術語「高變區」或「HVR」係指抗體可變域中在序列上具有高變性及/或形成結構上定義之環(「高變環」)的各區域。一般而言，天然四鏈抗體包含六個HVR；三個位於VH中(H1、H2、H3)，且三個位於VL中(L1、L2、L3)。HVR一般包含來自高變環及/或來自互補決定區(CDR)的胺基酸殘基，後者具有最高的序列可變性 及/或與抗原識別相關。示例性高變環出現在胺基酸殘基26-32(L1)、50-52(L2)、91-96(L3)、26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)(Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。示例性CDR(CDR-L1、CDR-L2、CDR-L3、CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基24-34、L2之胺基酸殘基50-56、L3之胺基酸殘基89-97、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-65及H3之胺基酸殘基95-102(Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。除VH中之CDR1之外，CDR一般包含形成高變環的胺基酸殘基。CDR亦包含「特異性決定殘基」或「SDR」，其為接觸抗原之殘基。SDR含於縮寫稱為-CDR或a-CDR之CDR區域內。示例性a-CDR(a-CDR-L1、a-CDR-L2、a-CDR-L3、a-CDR-H1、a-CDR-H2及a-CDR-H3)出現在L1之胺基酸殘基31-34、L2之胺基酸殘基50-55、L3之胺基酸殘基89-96、H1之胺基酸殘基31-35B、H2之胺基酸殘基50-58及H3之胺基酸殘基95-102(參見Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))。除非另外指示，否則在本文中根據前述Kabat等人對可變域中之HVR殘基及其他殘基(例如FR殘基)進行編號。
「免疫結合物」為結合於一或多個異源分子，包括(但不限於)細胞毒性劑之抗體。
「個體(individual)」或「個體(subject)」為哺乳動物。哺乳動物包括(但不限於)家養動物(例如牛、綿羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、家兔及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個體(individual)或個體(subject)為人類。
「分離抗體」為已與其天然環境之組分分離之抗體。在一些實施例中，抗體純化至大於95%或99%之純度，如藉由例如電泳(例如 SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於抗體純度評估方法之綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。
「分離核酸」係指已與其天然環境之組分分離之核酸分子。分離核酸包括通常含有核酸分子之細胞中所含的核酸分子，但該核酸分子存在於染色體外或存在於不同於其天然染色體位置之染色體位置。
「編碼抗-B7-H4抗體之分離核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多種核酸分子，包括單一載體或分開載體中之此類核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置之此類核酸分子。
如本文所用，術語「B7-H4」係指由細胞中B7-H4前驅蛋白之加工所產生的任何天然成熟之B7-H4。除非另外指示，否則該術語包括來自任何脊椎動物來源，包括哺乳動物，諸如靈長類動物(例如人類及食蟹獼猴)及嚙齒動物(例如小鼠及大鼠)之B7-H4。該術語亦包括天然存在之B7-H4變異體，例如剪接變異體或對偶基因變異體。具有信號序列之示例性人類B7-H4前驅蛋白之胺基酸序列(具有信號序列，胺基酸1-28)展示在SEQ ID NO：73中。示例性成熟人類B7-H4之胺基酸序列展示在SEQ ID NO：74中。示例性食蟹獼猴B7-H4前驅體之預測序列(具有信號序列，胺基酸1-28)及成熟序列分別展示在SEQ ID NO：75及76中。示例性大鼠B7-H4前驅體之胺基酸序列(具有信號序列，胺基酸1-28)及成熟序列分別展示在SEQ ID NO：77及78中。示例性小鼠B7-H4前驅體之胺基酸序列(具有信號序列，胺基酸1-28)及成熟序列分別展示在SEQ ID NO：79及80中。示例性黑猩猩B7-H4前驅體之胺基酸序列(具有信號序列，胺基酸1-24)及成熟序列分別展示在SEQ ID NO：81及82中。
術語「B7-H4陽性癌症」係指包含在表面上表現B7-H4之細胞的癌症。在一些實施例中，細胞表面上B7-H4之表現例如在諸如免疫組 織化學、FACS等方法中使用B7-H4之抗體來測定。或者，認為B7-H4 mRNA表現與細胞表面上B7-H4表現相關且可藉由選自原位雜交及RT-PCR(包括定量RT-PCR)之方法測定。
術語「B7-H4陽性細胞」係指在表面上表現B7-H4之細胞。
如本文所用，術語「單株抗體」係指自實質上均質抗體之群體獲得之抗體，亦即除可能變異抗體(例如含有天然存在之突變或在產生單株抗體製劑期間出現之變異抗體，此等變異體一般以較小量存在)之外，構成該群體之個別抗體相同及/或結合相同抗原決定基。相比於通常包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑，單株抗體製劑之各單株抗體係針對抗原上之單一決定子。因此，修飾語「單株」指示抗體如自實質上均質之抗體群體獲得之特性，且不應理解為需要藉由任何特定方法產生該抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製得，包括(但不限於)融合瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，此類方法及其他製備單株抗體之示例性方法在本文中描述。
「裸抗體」係指未與異源部分(例如細胞毒性部分)或放射性標記結合之抗體。裸抗體可存在於醫藥調配物中。
「天然抗體」係指具有變化結構之天然存在之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為約150,000道爾頓(dalton)之雜四聚體醣蛋白，其由二硫化物鍵結之兩條相同輕鏈及兩條相同重鏈構成。自N端至C端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，接著為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N端至C端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，接著為恆定輕鏈(CL)域。抗體輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列歸為兩種類型中之一種，稱為κ及λ。
術語「藥品說明書」用於指通常包括於治療性產品之商業包裝中之說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、與使用此類治療性產品有關之禁忌症及/或警告之資訊。
相對於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」定義為在比對參考多肽序列與候選序列且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比之後，且在不將保守性取代視為序列一致性之一部分之情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基之百分比。用於測定胺基酸序列一致性百分比之目的之比對可以此項技術之技能範圍內之多種方式達成，例如使用公開可獲得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定用於比對序列之適當參數，包括在所比較序列之全長內達成最大比對所需的任何演算法。然而，出於本文之目的，使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生胺基酸序列一致性%值。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.設計，且原始程式碼已在U.S.Copyright Office,Washington D.C.,20559申請用戶文檔，其中其註冊在美國版權註冊第TXU510087號下。ALIGN-2程式可公開獲自Genentech,Inc.,South San Francisco,California，或可自原始程式碼編寫。ALIGN-2程式應經編寫可用於UNIX操作系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數由ALIGN-2程式設定且不變化。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，既定胺基酸序列A相對於、與或針對既定胺基酸序列B之胺基酸序列一致性%(或者其可表述為，既定胺基酸序列A具有或包含相對於、與或針對既定胺基酸序列B的胺基酸序列一致性一定%)如下計算：100乘以分數X/Y
其中X為在A與B之比對程式中藉由序列比對程式ALIGN-2如一致匹配所得到之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基之總數 目。應瞭解，在胺基酸序列A之長度與胺基酸序列B之長度不相等之情況下，A相對於B之胺基酸序列一致性%將不等於B相對於A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文所使用之所有胺基酸序列一致性%值如剛剛前段中所描述使用ALIGN-2電腦程式獲得。
術語「醫藥調配物」係指所呈形式允許其中所含活性成分之生物活性有效發揮，且不含對調配物將投與之個體具有不可接受毒性之其他組分的製劑。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分外之對個體無毒的成分。醫藥學上可接受之載劑包括(但不限於)緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
如本文所用，「治療(treatment)」(及其語法變化形式，諸如「治療(treat)」或「治療(treating)」)係指試圖改變所治療個體之自然病程的臨床介入且可出於防治目的或在臨床病理學之病程期間進行。所需治療作用包括(但不限於)預防疾病發生或復發、緩解症狀、減輕疾病之任何直接或間接病理性後果、預防轉移、減緩疾病進展速率、改善或緩和疾病病況及緩解或改善預後。在一些實施例中，本發明之抗體用於延遲疾病發展或減慢疾病進展。
「化學治療劑」係指適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及環磷醯胺(cyclosphosphamide)(CYTOXAN®)；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯唑多巴(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、米特多巴(meturedopa)及尤利多巴(uredopa)；乙烯亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲蜜胺(altretamine)、三伸乙基三聚氰胺(triethylenemelamine)、三伸乙基磷醯胺(triethylenephosphoramide)、三伸乙基硫代磷醯胺(triethylenethiophosphoramide)及三羥甲基三聚氰胺；多聚乙醯(尤其 布拉他辛(bullatacin)及布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氫大麻酚(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL®)；β-拉帕酮；拉帕醇；秋水仙鹼；樺木酸；喜樹鹼(包括合成模擬拓朴替康(topotecan)(HYCAMTIN®)、CPT-11(伊立替康(irinotecan，CAMPTOSAR®))、乙醯基喜樹鹼(acetylcamptothecin)、東莨菪素(scopolectin)及9-胺基喜樹鹼)；苔蘚蟲素(bryostatin)；海洋抑素(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin))、卡折來新(carzelesin)及比折來新(bizelesin)合成類似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸；替尼泊甙(teniposide)；念珠藻環肽(cryptophycin)(尤其克瑞托欣(cryptophycin)1及克瑞托欣8)；海兔毒素(dolastatin)；倍癌黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；盤克斯塔叮(pancratistatin)；匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)；海綿抑素(spongistatin)；氮芥，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlornaphazine)、氯磷醯胺(chlorophosphamide)、雌氮芥(estramustine)、異環磷醯胺(ifosfamide)、二氯甲基二乙胺(mechlorethamine)、二氯甲基二乙胺氧化物鹽酸鹽、美法侖、新恩比興(novembichin)、芬司特瑞(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ΩI1(參見例如Nicolaou等人，Angew.Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；CDP323、口服α-4整合素抑制劑；達米辛(dynemicin)，包括達米辛A；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新抑癌蛋白發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysin)、放射菌素(actinomycin)、安麯黴 素(authramycin)、偶氮絲胺酸(azaserine)、博來黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡拉比辛(carabicin)、洋紅黴素(carminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycin)、放線菌素d(dactinomycin)、道諾黴素、地托比星(detorubicin)、6-重氮基-5-側氧基-L-正白胺酸、小紅莓(包括ADRIAMYCIN®)、嗎啉基-小紅莓、氰基嗎啉基-小紅莓、2-吡咯啉基-小紅莓、小紅莓HCl脂質體注射液(DOXIL®)、脂質體小紅莓TLC D-99(MYOCET®)、聚乙二醇化脂質體小紅莓(CAELYX®)及去氧小紅莓(deoxydoxorubicin))、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、艾達黴素(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(mitomycin)(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非羅黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、奎那黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑黴素(streptonigrin)、鏈脲菌素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、左柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如甲胺喋呤、吉西他濱(gemcitabine)(GEMZAR®))、喃氟啶(tegafur)(UFTORAL®))、卡培他濱(capecitabine)(XELODA®)、埃坡黴素(epothilone)及5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)；葉酸類似物，諸如迪諾特寧(denopterin)、甲胺喋呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉賓(fludarabine)、6-巰基嘌呤(6-mercaptopurine)、硫米嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤(thioguanine)；嘧啶類似物，諸如安西他濱(ancitabine)、阿紮胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(6-azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、雙去氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素，諸如卡魯睾酮(calusterone)、屈他雄酮丙酸鹽 (dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾內酯；抗腎上腺劑，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；乙醯葡醛酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布西(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；艾達曲克(edatraxate)；得弗伐胺(defofamine)；秋水仙胺(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；艾弗鳥胺酸(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃坡黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲(hydroxyurea)；蘑菇多醣(lentinan)；氯尼達明(lonidainine)；類美登素，諸如美登素(maytansine)及安絲菌素(ansamitocin)；丙脒腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫比達摩(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；蛋胺氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多醣複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofiran)；螺旋鍺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2'-三氯三乙胺；單端孢黴烯(尤其T-2毒素、弗納庫林(verracurin)A、桿孢菌素(roridin)A及胺癸叮(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)(ELDISINE®、FILDESIN®)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托星(gacytosine)；阿拉伯糖苷(arabinoside)(「Ara-C」)；噻替派；紫杉醇(taxoid)，例如太平洋紫杉醇(TAXOL®)、太平洋紫杉醇及多烯紫杉醇(docetaxel)(TAXOTERE®)之經白蛋白工程改造之奈米粒子調配物(ABRAXANETM))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫代鳥嘌呤(6- thioguanine)；巰基嘌呤(mercaptopurine)；甲胺喋呤；鉑劑，諸如順鉑(cisplatin)、奧沙利鉑(oxaliplatin)(例如ELOXATIN®)及卡鉑；長春花(vincas)，其防止微管蛋白聚合形成微管，包括長春鹼(VELBAN®)、長春新鹼(ONCOVIN®)、長春地辛(ELDISINE®、FILDESIN®)及長春瑞賓(NAVELBINE®)；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；甲醯四氫葉酸(leucovorin)；諾凡特龍(novantrone)；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基喋呤(aminopterin)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(difluoromethylornithine，DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸，包括貝瑟羅汀(bexarotene)(TARGRETIN®)；雙膦酸鹽(bisphosphonate)，諸如氯屈膦酸鹽(clodronate)(例如BONEFOS®或OSTAC®))、依替膦酸鹽(etidronate)(DIDROCAL®)、NE-58095、唑來膦酸(zoledronic acid)/唑來膦酸鹽(zoledronate)(ZOMETA®)、阿侖膦酸鹽(alendronate)(FOSAMAX®)、帕米膦酸鹽(pamidronate)(AREDIA®)、替魯膦酸鹽(tiludronate)(SKELID®)或利塞膦酸鹽(risedronate)(ACTONEL®)；曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其抑制與異常細胞增殖相關之信號傳導路徑中基因表現之反義寡核苷酸，諸如PKC-α、Raf、H-Ras及表皮生長因子受體(EGF-R)；疫苗，諸如THERATOPE®疫苗及基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；拓撲異構酶1抑制劑(例如LURTOTECAN®)；rmRH(例如ABARELIX®)；BAY439006(索拉非尼(sorafenib)；Bayer)；SU-11248(舒尼替尼(sunitinib)、SUTENT®，Pfizer)；哌立福新(perifosine)、COX-2抑制劑((例如塞內昔布(celecoxib)或依他昔布(etoricoxib))、蛋白體抑制劑(例如PS341)；硼替佐米(bortezomib)(VELCADE®)；CCI-779；替吡法尼(tipifarnib) (R11577)；索拉非尼(orafenib)、ABT510；Bcl-2抑制劑，諸如奧利默森鈉(oblimersen sodium)(GENASENSE®)；匹蒽醌(pixantrone)；EGFR抑制劑(參見以下定義)；酪胺酸激酶抑制劑；絲胺酸-蘇胺酸激酶抑制劑，諸如雷帕黴素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus)、RAPAMUNE®)；法呢基轉移酶抑制劑，諸如洛那法尼(lonafarnib)(SCH 6636、SARASARTM)；以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上藥劑中之兩者或兩者以上之組合，諸如CHOP(環磷醯胺、小紅莓、長春新鹼及潑尼龍之組合療法的縮寫)；以及FOLFOX(奧沙利鉑(ELOXATINTM)與5-FU及甲醯四氫葉酸組合之治療方案的縮寫)。
如本文所定義之化學治療劑包括用來調節、減輕、阻斷或抑制可促進癌症生長之激素作用的「抗激素劑」或「內分泌治療劑」。其本身可為激素，包括(但不限於)：具有混合促效劑/拮抗劑型態之抗雌激素，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX®)、4-羥基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)(FARESTON®)、艾多昔芬(idoxifene)、曲洛昔芬(droloxifene)、雷諾昔酚(raloxifene)(EVISTA®)、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛昔芬(keoxifene)及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)(諸如SERM3)；不具有促效劑特性之純抗雌激素，諸如氟維司群(fulvestrant)(FASLODEX®)及EM800(此類藥劑可阻斷雌激素受體(ER)二聚、抑制DNA結合、增加ER轉換及/或遏制ER含量)；芳香醇抑制劑，包括類固醇芳香酶抑制劑，諸如福美司坦(formestane)及依西美坦(AROMASIN®)，及非類固醇芳香酶抑制劑，諸如阿那曲唑(anastrazole)(ARIMIDEX®)、來曲唑(letrozole)(FEMARA®)及胺魯米特(aminoglutethimide)，及其他芳香酶抑制劑，包括伏羅唑(vorozole)(RIVISOR®)、乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE®)、法屈唑(fadrozole)及4(5)-咪唑；釋放促黃體激 素之激素促效劑，包括亮丙立德(leuprolide)(LUPRON®及ELIGARD®)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)及曲特瑞林(tripterelin)；性類固醇，包括助孕素(諸如乙酸甲地孕酮(megestrol acetate)及乙酸甲羥孕酮(medroxyprogesterone acetate))、雌激素(諸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)及普雷馬林(premarin))及雄激素/類視黃素(諸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式視黃酸及非瑞替尼(fenretinide))；奧那司酮(onapristone)；抗孕酮；雌激素受體下調劑(ERD)；抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯胺(nilutamide)及比卡魯胺(bicalutamide)；以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物；以及以上藥劑中之兩者或兩者以上的組合。
如本文針對佐劑療法所用，術語「免疫抑制劑」係指用來遏制或遮蔽本文中所治療之哺乳動物之免疫系統的物質。此將包括遏制細胞因子產生、下調或遏制自身抗原表現或遮蔽MHC抗原之物質。此類藥劑之實例包括2-胺基-6-芳基-5-取代之嘧啶(參見美國專利第4,665,077號)；非類固醇消炎藥(NSAID)；更昔洛韋(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮質激素(諸如皮質醇或醛固酮)、消炎藥(諸如環加氧酶抑制劑、5-脂肪加氧酶抑制劑或白三烯受體拮抗劑)；嘌呤拮抗劑，諸如硫唑嘌呤(azathioprine)或黴酚酸嗎啉乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷基化劑，諸如環磷醯胺；溴麥角隱亭(bromocryptine)；達那唑(danazol)；胺苯碸(dapsone)；戊二醛(其遮蔽MHC抗原，如美國專利第4,120,649號中所述)；針對MHC抗原及MHC片段之抗個體基因型抗體；環孢素A；類固醇，諸如皮質類固醇或糖皮質類固醇或糖皮質激素類似物，例如潑尼松(prednisone)、甲基潑尼龍(methylprednisolone)，包括SOLU-MEDROL®甲基潑尼龍丁二酸鈉及地塞米松(dexamethasone)；二氫葉酸還原酶抑制劑，諸如甲胺喋呤(口服或皮下)；抗瘧疾劑，諸如氯奎寧(chloroquine)及羥基氯 奎(hydroxychloroquine)；柳氮磺胺吡啶(sulfasalazine)；來氟米特(leflunomide)；細胞因子或細胞因子受體抗體，包括抗干擾素-α、干擾素-β或干擾素-γ抗體、抗腫瘤壞死因子(TNF)-α抗體(英利昔單抗(infliximab)(REMICADE®)或阿達木單抗(adalimumab))、抗-TNF-α免疫黏附素(依那西普(etanercept))、抗-TNF-β抗體、抗-介白素-2(IL-2)抗體及抗-IL-2受體抗體及抗-介白素-6(IL-6)受體抗體及拮抗劑(諸如ACTEMRATM(托西利單抗(tocilizumab)))；抗-LFA-1抗體，包括抗-CD11a及抗-CD18抗體；抗-L3T4抗體；異源抗淋巴細胞球蛋白；全-T抗體，較佳抗-CD3或抗-CD4/CD4a抗體；含有LFA-3結合域之可溶性肽(WO 90/08187，公開於7/26/90)；鏈激酶；轉化生長因子-β(TGF-β)；鏈道酶(streptodornase)；來自主體之RNA或DNA；FK506；RS-61443；苯丁酸氮芥；去氧斯匹胍素(deoxyspergualin)；雷帕黴素；T細胞受體(Cohen等人，美國專利第5,114,721號)；T細胞受體片段(Offner等人，Science,251：430-432(1991)；WO 90/11294；Ianeway,Nature,341：482(1989)；及WO 91/01133)；BAFF拮抗劑，諸如BAFF抗體及BR3抗體及zTNF4拮抗劑(評述參見Mackay及Mackay,Trends Immunol.,23：113-5(2002)且亦參見下文定義)；干擾T細胞輔助信號之生物製劑，諸如抗-CD40受體或抗-CD40配位體(CD154)，包括CD40-CD40配位體(例如Durie等人，Science,261：1328-30(1993)；Mohan等人，J.Immunol.,154：1470-80(1995))及CTLA4-Ig(Finck等人，Science,265：1225-7(1994))之阻斷抗體；及T細胞受體抗體(EP 340,109)，諸如T10B9。本文中之一些較佳免疫抑制劑包括環磷醯胺、苯丁酸氮芥、硫唑嘌呤、來氟米特、MMF或甲胺喋呤。
術語「PD-1軸結合拮抗劑」係指抑制PD-1軸結合搭配物與一或多種其結合搭配物之相互作用，以便移除由PD-1信號傳導軸上信號傳導引起之T細胞功能障礙的分子-結果為恢復或增強T細胞功能(例如增 殖、細胞因子產生、標靶細胞殺死)。如本文所用，PD-1軸結合拮抗劑包括PD-1結合拮抗劑、PD-L1結合拮抗劑及PD-L2結合拮抗劑。
術語「PD-1結合拮抗劑」係指減少、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-1與一或多種其結合搭配物(諸如PD-L1、PD-L2)之相互作用產生之信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抑制PD-1與一或多種其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑抑制PD-1與PD-L1及/或PD-L2之結合。舉例而言，PD-1結合拮抗劑包括抗-PD-1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及降低、阻斷、抑制、廢除或干擾由PD-1與PD-L1及/或PD-L2之相互作用產生之信號轉導的其他分子。在一個實施例中，PD-1結合拮抗劑減少藉由或經由在經由PD-1介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-1結合拮抗劑為抗-PD-1抗體。在一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中所描述之MDX-1106(尼沃單抗(nivolumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之MK-3475(拉立珠單抗(lambrolizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之CT-011(皮立珠單抗(pidilizumab))。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之AMP-224。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之PDR001。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之REGN2810。在另一特定態樣中，PD-1結合拮抗劑為本文中描述之BGB-108。
術語「PD-L1結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導的分子。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抑制PD-L1與其結合搭配物之結合的分子。在一特定態樣中，PD-L1結 合拮抗劑抑制PD-L1與PD-1及/或B7-1之結合。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑包括抗PD-L1抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L1與其結合搭配物中之一或多者(諸如PD-1、B7-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一個實施例中，PD-L1結合拮抗劑降低藉由或經由在經由PD-L1介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-L1結合拮抗劑為抗PD-L1抗體。在一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MPDL3280A(阿特唑單抗(atezolizumab))。在另一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MDX-1105。在再一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之YW243.55.S70。在再一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MEDI4736(杜威路單抗(durvalumab))。在再一特定態樣中，抗-PD-L1抗體為本文中描述之MSB0010718C(阿威路單抗(avelumab))。
術語「PD-L2結合拮抗劑」係指降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為抑制PD-L2與其結合搭配物中之一或多者結合的分子。在一特定態樣中，PD-L2結合拮抗劑抑制PD-L2與PD-1之結合。在一些實施例中，PD-L2拮抗劑包括抗-PD-L2抗體、其抗原結合片段、免疫黏附素、融合蛋白、寡肽及其他降低、阻斷、抑制、消除或干擾由PD-L2與其結合搭配物中之任一或多者(諸如PD-1)之相互相用引起的信號轉導之分子。在一個實施例中，PD-L2結合拮抗劑降低藉由或經由在經由PD-L2介導信號傳導之T淋巴細胞上表現的細胞表面蛋白質介導之負共刺激信號，以便降低功能異常T細胞之功能異常程度(例如增強對抗原識別之效應反應)。在一些實施例中，PD-L2結合拮抗劑為免疫黏附素。
術語「可變區」或「可變域」係指涉及抗體結合於抗原之抗體重鏈或輕鏈域。天然抗體之重鏈及輕鏈(分別為VH及VL)可變域一般具有類似結構，其中各結構域均包含四個保守構架區(FR)及三個高變區(HVR)(參見例如Kindt等人Kuby Immunology，第6版，W.H.Freeman and Co.，第91頁(2007))。單一VH或VL域可足以賦予抗原結合特異性。此外，可使用來自結合抗原之抗體的VH或VL域分離結合特定抗原之抗體以分別篩選互補VL或VH域之文庫。參見例如Portolano等人，J.Immunol.150：880-887(1993)；Clarkson等人，Nature 352：624-628(1991)。
如本文所用，術語「載體」係指一種核酸分子，其能夠傳送其所連接之另一種核酸分子。該術語包括呈自我複製核酸結構之載體以及併入其已引入之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠引導其可操作地連接之核酸的表現。此類載體在本文中稱為「表現載體」。
「烷基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子之C1-C18烴。實例為甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、正丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)、1-丁基(n-Bu、正丁基、-CH2CH2CH2CH3)、2-甲基-1-丙基(i-Bu、異丁基、-CH2CH(CH3)2)、2-丁基(s-Bu、第二丁基、-CH(CH3)CH2CH3)、2-甲基-2-丙基(t-Bu、第三丁基、-C(CH3)3)、1-戊基(正戊基、-CH2CH2CH2CH2CH3)、2-戊基(-CH(CH3)CH2CH2CH3)、3-戊基(-CH(CH2CH3)2)、2-甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH2CH3)、3-甲基-2-丁基(-CH(CH3)CH(CH3)2)、3-甲基-1-丁基(-CH2CH2CH(CH3)2)、2-甲基-1-丁基(-CH2CH(CH3)CH2CH3)、1-己基(-CH2CH2CH2CH2CH2CH3)、2-己基(-CH(CH3)CH2CH2CH2CH3)、3-己基(-CH(CH2CH3)(CH2CH2CH3))、2-甲基-2-戊基(-C(CH3)2CH2CH2CH3)、3-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH(CH3)CH2CH3)、4-甲基-2-戊基(-CH(CH3)CH2CH(CH3)2)、 3-甲基-3-戊基(-C(CH3)(CH2CH3)2)、2-甲基-3-戊基(-CH(CH2CH3)CH(CH3)2)、2,3-二甲基-2-丁基(-C(CH3)2CH(CH3)2)、3,3-二甲基-2-丁基(-CH(CH3)C(CH3)3。
如本文所用，術語「C1-C8烷基」係指具有1至8個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C8烷基」包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基、-正己基、-正庚基、-正辛基、-正壬基及-正癸基；而分支鏈C1-C8烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基、2-甲基丁基；不飽和C1-C8烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基、-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基、-3-己基、-乙炔基、-丙炔基、-1-丁炔基、-2-丁炔基、-1-戊炔基、-2-戊炔基、-3-甲基-1丁炔基。C1-C8烷基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，術語「C1-C12烷基」係指具有1至12個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。C1-C12烷基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-SO3R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
如本文所用，術語「C1-C6烷基」係指具有1至6個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C6烷基」包括(但不限於)- 甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基、-正戊基及-正己基；而分支鏈C1-C6烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基、-異戊基及2-甲基丁基；不飽和C1-C6烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基、-1-戊烯基、-2-戊烯基、-3-甲基-1-丁烯基、-2-甲基-2-丁烯基、-2,3-二甲基-2-丁烯基、-1-己基、2-己基及-3-己基。C1-C6烷基可未經取代或經一或多個如上針對C1-C8烷基所述之基團取代。
如本文所用，術語「C1-C4烷基」係指具有1至4個碳原子之直鏈或分支鏈、飽和或不飽和烴。代表性「C1-C4烷基」基團包括(但不限於)-甲基、-乙基、-正丙基、-正丁基；而分支鏈C1-C4烷基包括(但不限於)-異丙基、-第二丁基、-異丁基、-第三丁基；不飽和C1-C4烷基包括(但不限於)-乙烯基、-烯丙基、-1-丁烯基、-2-丁烯基及-異丁烯基。C1-C4烷基可未經取代或經一或多個如上針對C1-C8烷基所述之基團取代。
「烷氧基」為單一鍵結於氧之烷基。示例性烷氧基包括(但不限於)甲氧基(-OCH3)及乙氧基(-OCH2CH3)。「C1-C5烷氧基」為具有1至5個碳原子之烷氧基。烷氧基可未經取代或經一或多個如上針對烷基所述之基團取代。
「烯基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp 2 雙鍵的C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙烯或乙烯基(-CH=CH2)、烯丙基(-CH2CH=CH2)、環戊烯基(-C5H7)及5-己烯基(-CH2CH2CH2CH2CH=CH2)。「C2-C8烯基」為含有2至8個正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp2雙鍵的烴。
「炔基」為含有正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp參鍵的C2-C18烴。實例包括(但不限於)：乙炔 基(-C≡CH)及炔丙基(-CH2C≡CH)。「C2-C8炔基」為含有2至8個正鏈、第二、第三或環狀碳原子及至少一個不飽和位點，亦即碳-碳sp參鍵的烴。
「伸烷基」係指具有1-18個碳原子且具有藉由自母烷烴之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烷基包括(但不限於)：亞甲基(-CH2-)、1,2-乙基(-CH2CH2-)、1,3-丙基(-CH2CH2CH2-)、1,4-丁基(-CH2CH2CH2CH2-)及其類似基團。
「C1-C10伸烷基」為式-(CH2)1-10-之直鏈飽和烴基。C1-C10伸烷基之實例包括亞甲基、伸乙基、伸丙基、伸丁基、伸戊基、伸己基、伸庚基、伸辛基、伸壬基及伸癸基。
「伸烯基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體烯之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的不飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸烯基包括(但不限於)：1,2-伸乙基(-CH=CH-)。
「伸炔基」係指具有2-18個碳原子且具有藉由自母體炔之同一個或兩個不同碳原子移除兩個氫原子所衍生之兩個單價自由基中心的不飽和、分支鏈或直鏈或環狀烴基。典型伸炔基包括(但不限於)：伸乙炔(-C≡C-)、炔丙基(-CH2C≡C-)及4-戊炔基(-CH2CH2CH2C≡C-)。
「芳基」係指碳環芳族基。芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。碳環芳族基或雜環芳族基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C5-C20芳基」為碳環芳環中具有5至20個碳原子之芳基。C5-C20芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C20芳基可經如上針對芳基所述取代或未經取代。「C5-C14芳基」為碳環芳環中具有5至14個碳原子之芳基。C5-C14芳基之實例包括(但不限於)苯基、萘基及蒽基。C5-C14芳基可經如上針對芳基所述取代。
「伸芳基」為具有兩個共價鍵且可呈如以下結構中所示之鄰、間或對組態之芳基： 其中苯基可未經取代或經至多四個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「芳基烷基」係指其中鍵結於碳原子、通常末端或sp3碳原子之氫原子之一經芳基置換的非環狀烷基。典型芳基烷基包括(但不限於)苯甲基、2-苯基乙-1-基、2-苯基乙烯-1-基、萘基甲基、2-萘基乙-1-基、2-萘基乙烯-1-基、萘并苯甲基、2-萘并苯基乙-1-基及其類似基團。芳基烷基包含6至20個碳原子，例如芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基，為1至6個碳原子且芳基部分為5至14個碳原子。
「雜芳基烷基」係指其中鍵結於碳原子、通常末端或sp3碳原子之氫原子之一經雜芳基置換的非環狀烷基。典型雜芳基烷基包括(但不限於)2-苯并咪唑基甲基、2-呋喃基乙基及其類似基團。雜芳基烷基包含6至20個碳原子，例如雜芳基烷基之烷基部分，包括烷基、烯基或炔基為1至6個碳原子且雜芳基部分為5至14個碳原子及1至3個選 自N、O、P及S之雜原子。雜芳基烷基之雜芳基部分可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
「經取代之烷基」、「經取代之芳基」及「經取代之芳基烷基」分別意謂烷基、芳基及芳基烷基，其中一或多個氫原子各獨立地經取代基置換。典型取代基包括(但不限於)-X、-R、-O-、-OR、-SR、-S-、-NR2、-NR3、=NR、-CX3、-CN、-OCN、-SCN、-N=C=O、-NCS、-NO、-NO2、=N2、-N3、NC(=O)R、-C(=O)R、-C(=O)NR2、-SO3 -、-SO3H、-S(=O)2R、-OS(=O)2OR、-S(=O)2NR、-S(=O)R、-OP(=O)(OR)2、-P(=O)(OR)2、-PO- 3、-PO3H2、-C(=O)R、-C(=O)X、-C(=S)R、-CO2R、-CO2 -、-C(=S)OR、-C(=O)SR、-C(=S)SR、-C(=O)NR2、-C(=S)NR2、-C(=NR)NR2，其中各X獨立地為鹵素：F、Cl、Br或I；且各R獨立地為-H、C2-C18烷基、C6-C20芳基、C3-C14雜環、保護基或前藥部分。如上所述之伸烷基、伸烯基及伸炔基亦可類似地經取代。
「雜芳基」及「雜環」係指其中一或多個環原子為雜原子，例如氮、氧及硫之環系統。雜環自由基包含3至20個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子。雜環可為具有3至7個環成員之單環(2至6個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)或具有7至10個環成員之雙環(4至9個碳原子及1至3個選自N、O、P及S之雜原子)，例如：雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統。
示例性雜環描述於例如Paquette,Leo A.,「Principles of Modern Heterocyclic Chemistry」(W.A.Benjamin,New York,1968)，尤其章節1、3、4、6、7及9；「The Chemistry of Heterocyclic Compounds,A series of Monographs」(John Wiley & Sons,New York,1950至今)，尤 其第13、14、16、19及28卷；及J.Am.Chem.Soc.(1960)82：5566。
雜環之實例包括(作為實例而非限制)吡啶基、二氫吡啶基、四氫吡啶基(哌啶基)、噻唑基、四氫噻吩基、硫氧化四氫噻吩基、嘧啶基、呋喃基、噻吩基、吡咯基、吡唑基、咪唑基、四唑基、苯并呋喃基、噻萘基、吲哚基、吲哚烯基、喹啉基、異喹啉基、苯并咪唑基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡咯啶基、2-吡咯啶酮基、吡咯啉基、四氫呋喃基、雙四氫呋喃基、四氫哌喃基、雙四氫哌喃基、四氫喹啉基、四氫異喹啉基、十氫喹啉基、八氫異喹啉基、吖辛因基、三嗪基、6H-1,2,5-噻二嗪基、2H,6H-1,5,2-二噻嗪基、噻吩基、噻嗯基、哌喃基、異苯并呋喃基、烯基、基、啡噁噻基、2H-吡咯基、異噻唑基、異噁唑基、吡嗪基、噠嗪基、吲哚嗪基、異吲哚基、3H-吲哚基、1H-吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、酞嗪基、啶基、喹喏啉基、喹唑啉基、啉基、喋啶基、4aH-咔唑基、咔唑基、β-咔啉基、啡啶基、吖啶基、嘧啶基、啡啉基、啡嗪基、啡噻嗪基、呋呫基、啡噁嗪基、異烷基、烷基、咪唑啶基、咪唑啉基、吡唑啶基、吡唑啉基、哌嗪基、吲哚啉基、異吲哚啉基、啶基、嗎啉基、噁唑啶基、苯并三唑基、苯并異噁唑基、羥吲哚基、苯并噁唑啉基及靛紅醯基。
作為實例而非限制，碳鍵結之雜環鍵結在吡啶之位置2、3、4、5或6處、噠嗪之位置3、4、5或6處、嘧啶之位置2、4、5或6處、吡嗪環之位置2、3、5或6處、呋喃、四氫呋喃、硫代呋喃、噻吩、吡咯或四氫吡咯之位置2、3、4或5處、噁唑、咪唑或噻唑之位置2、4或5處、異噁唑、吡唑或異噻唑之位置3、4或5處、氮丙啶之位置2或3處、氮雜環丁烷之位置2、3或4處、喹啉之位置2、3、4、5、6、7或8處或異喹啉之位置1、3、4、5、6、7或8處。更通常，碳鍵結之雜環包括2-吡啶基、3-吡啶基、4-吡啶基、5吡啶基、6-吡啶基、3-噠嗪基、4-噠嗪基、5-噠嗪基、6-噠嗪基、2-嘧啶基、4-嘧啶基、5-嘧啶 基、6-嘧啶基、2-吡嗪基、3-吡嗪基、5-吡嗪基、6-吡嗪基、2-噻唑基、4-噻唑基或5-噻唑基。
作為實例而非限制，氮鍵結之雜環鍵結在氮丙啶、氮雜環丁烷、吡咯、吡咯啶、2-吡咯啉、3-吡咯啉、咪唑、咪唑啶、2-咪唑啉、3-咪唑啉、吡唑、吡唑啉、2-吡唑啉、3-吡唑啉、哌啶、哌嗪、吲哚、吲哚啉、1H-吲唑之位置1處、異吲哚或異吲哚啉之位置2處、嗎啉之位置4處及咔唑或β-咔啉之位置9處。更通常，氮鍵結之雜環包括1-氮丙啶、1-氮雜環丁烷基、1-吡咯基、1-咪唑基、1-吡唑基及1-哌啶基。
「C3-C8雜環」係指其中一至四個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換的芳族或非芳族C3-C8碳環。C3-C8雜環之代表性實例包括(但不限於)苯并呋喃基、苯并噻吩、吲哚基、苯并吡唑基、香豆素基、異喹啉基、吡咯基、噻吩基、呋喃基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、三唑基、喹啉基、嘧啶基、吡啶基、吡啶酮基、吡嗪基、噠嗪基、異噻唑基、異噁唑基及四唑基。C3-C8雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8雜環基」係指如上文所定義之C3-C8雜環基，其中雜環氫原子之一經一鍵置換。C3-C8雜環基可未經取代或經至多六個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及 芳基。
「C3-C20雜環」係指其中一至四個環碳原子獨立地經來自由O、S及N組成之群之雜原子置換的芳族或非芳族C3-C8碳環。C3-C20雜環可未經取代或經至多七個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C20雜環基」係指如上文所定義之C3-C20雜環基團，其中雜環氫原子之一經一鍵置換。
「碳環」意謂作為單環，具有3至7個碳原子或作為雙環，具有7至12個碳原子之飽和或不飽和環。單環碳環具有3至6個環原子，更通常具有5或6個環原子。雙環碳環具有7至12個環原子，例如配置為雙環[4,5]、[5,5]、[5,6]或[6,6]系統，或9或10個環原子，配置為雙環[5,6]或[6,6]。單環碳環之實例包括環丙基、環丁基、環戊基、1-環戊-1-烯基、1-環戊-2-烯基、1-環戊-3-烯基、環己基、1-環己-1-烯基、1-環己-2-烯基、1-環己-3-烯基、環庚基及環辛基。
「C3-C8碳環」為3、4、5、6、7或8員飽和或不飽和非芳族碳環。代表性C3-C8碳環包括(但不限於)-環丙基、-環丁基、-環戊基、-環戊二烯基、-環己基、-環己烯基、-1,3-環己二烯基、-1,4-環己二烯基、-環庚基、-1,3-環庚二烯基、-1,3,5-環庚三烯基、-環辛基及-環辛二烯基。C3-C8碳環基可未經取代或經一或多個包括(但不限於)以下各基之基團取代：-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-芳基、-C(O)R'、-OC(O)R'、-C(O)OR'、-C(O)NH2、-C(O)NHR'、-C(O)N(R')2、-NHC(O)R'、-S(O)2R'、-S(O)R'、-OH、-鹵素、-N3、-NH2、-NH(R')、-N(R')2及-CN；其中各R'獨立地選自H、-C1-C8烷基及芳基。
「C3-C8碳環基」係指如上文所定義之C3-C8碳環基團，其中碳環氫原子之一經一鍵置換。
「連接子」係指包含共價附接抗體於藥物部分之共價鍵或原子鏈的化學部分。在各種實施例中，連接子包括二價自由基，諸如烷二基、芳二基、雜芳二基、諸如-(CR2)nO(CR2)n-之部分、烷基氧基(例如聚伸乙基氧基、PEG、聚亞甲基氧基)及烷胺基(例如聚伸乙基胺基、JeffamineTM)之重複單元以及二酸酯及醯胺，包括丁二酸酯、順丁烯二醯胺、二乙醇酸酯、丙二酸酯及己醯胺。在各種實施例中，連接子可包含一或多個胺基酸殘基，諸如纈胺酸、苯丙胺酸、離胺酸及高離胺酸。
術語「對掌性」係指具有鏡像搭配物之非重疊性特性的分子，而術語「非對掌性」係指在其鏡像搭配物上可重疊之分子。
術語「立體異構體」係指具有一致的化學構成但在原子或基團在空間中之配置方面不同的化合物。
「非對映異構體」係指具有兩個或兩個以上對掌性中心且其分子並不互為鏡像之立體異構體。非對映異構體具有不同物理特性，例如熔點、沸點、光譜特性及反應性。可在諸如電泳及層析之高解析度分析程序下分離非對映異構體之混合物。
「對映異構體」係指化合物之兩個互為不可重疊鏡像的立體異構體。
本文中使用之立體化學定義及慣例一般遵循S.P.Parker編輯，McGraw-Hill Dictionary of Chemical Terms(1984)McGraw-Hill Book Company,New York；及Eliel,E.及Wilen,S.,Stereochemistry of Organic Compounds(1994)John Wiley & Sons,Inc.,New York。許多有機化合物以光學活性形式存在，亦即其能夠使平面偏振光之平面旋轉。在對光學活性化合物之描述中，使用前綴D及L或R及S表示分子 圍繞其對掌性中心之絕對組態。採用前綴d及l或(-)及(-)指明平面偏振光由化合物引起旋轉之跡象，其中(-)或l意謂化合物為左旋的。具有前綴(+)或d之化合物為右旋的。對於既定化學結構，此等立體異構體為一致的，例外之處在於其互為鏡像。特定立體異構體亦可稱為對映異構體，且此類異構體之混合物通常稱為對映異構體混合物。對映異構體之50：50混合物稱為外消旋混合物或外消旋體，其可在化學反應或製程中尚未具有立體選擇或立體特異性時出現。術語「外消旋混合物」及「外消旋體」係指兩種對映異構物質之等莫耳混合物，其缺乏光學活性。
「離去基」係指可經另一官能基取代之官能基。某些離去基為此項技術中熟知，且實例包括(但不限於)鹵基(例如氯基、溴基、碘基)、甲烷磺醯基(甲磺醯基)、對甲苯磺醯基(甲苯磺醯基)、三氟甲基磺醯基(三氟甲磺酸酯基)及三氟甲基磺酸酯基。
術語「保護基」係指通常用以阻斷或保護特定官能基同時使化合物上之其他官能基反應的取代基。舉例而言，「胺基保護基」為附接於胺基，阻斷或保護化合物中之胺基官能基之取代基。適合胺基保護基包括(但不限於)乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲氧羰基(CBZ)及9-茀基亞甲氧基羰基(Fmoc)。關於保護基及其使用之一般描述，參見T.W.Greene,Protective Groups in Organic Synthesis,John Wiley & Sons,New York,1991或隨後版本。
II. 組合物及方法
在一個態樣中，本發明部分基於結合於B7-H4之抗體及包含此類抗體之免疫結合物。本發明之抗體及免疫結合物適用於例如診斷或治療B7-H4陽性癌症。
A. 示例性抗-B7-H4抗體
在一些實施例中，本發明提供結合於B7-H4之分離抗體。B7-H4 為例如在抗原呈遞細胞(APC)表面上發現之I型跨膜蛋白。如本文中證實，B7-H4在檢驗之約80%乳癌檢體中及約60%卵巢腫瘤檢體中表現。
一種示例性天然存在之具有信號序列(胺基酸1-28)之人類B7-H4前驅蛋白序列提供於SEQ ID NO：73中，且對應成熟B7-H4蛋白質序列展示在SEQ ID NO：74(對應於SEQ ID NO：73之胺基酸29-282)中。
在某些實施例中，抗-B7-H4抗體具有以下特徵中之至少一或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基，及(b)結合B7-H4之親和力100nM、50nM、10nM或9nM或8nM或7nM或6nM或5nM或4nM或3nM或2nM或1nM，且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM。
非限制性示例性此類抗體包括本文中描述之hu1D11.v1.9 varC2及hu1D11.v1.9 varD。在一些實施例中，B7-H4為人類B7-H4。在一些實施例中，B7-H4係選自人類、食蟹獼猴、小鼠及大鼠B7-H4。
在一些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域 (SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基。在一些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，抗-B7-H4抗體結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些此類實施例中，抗-B7-H4抗體結合B7-H4之親和力100nM、50nM、10nM或9nM或8nM或7nM或6nM或5nM或4nM或3nM或2nM或1nM，且視情況0.0001nM或0.001nM或0.01nM。非限制性示例性此類抗體包括本文中描述之hu1D11.v1.9 varC2及hu1D11.v1.9 varD。在一些實施例中，B7-H4為人類B7-H4。在一些實施例中，B7-H4為人類B7-H4或食蟹獼猴B7-H4。在一些實施例中，B7-H4為小鼠B7-H4或大鼠B7-H4。
分析
為確定抗-B7-H4抗體是否「結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基」或「結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基」或「結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基」或「結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基」或「結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基」，如本文在實例F中所述，藉由如藉由FACS評估之競爭性結合來測定。
是否抗-B7-H4抗體「結合之親和力100nM、50nM、10nM或9nM或8nM或7nM或6nM或5nM或4nM或3nM或2nM或1nM」如本文在實例E中所述來測定。使用放射性配位體細胞結合分析測定所選人類化變異體之解離常數。簡言之，將約250pM 125I-抗體示蹤劑(與未標記之抗體競爭者相同)與100,000MX-1細胞或 293 B7-H4穩定細胞株在以1000nM開始2倍稀釋之未標記抗體存在下一起培育。將抗體/細胞混合物在DMEM(1% BSA、300nM人類IgG、0.1%疊氮化物)中在25℃下培育2小時且接著使用Millipore多篩濾盤收集且過濾。使用Perkin Elmer Wizard 1470自動γ計數器計數Durapore膜過濾器10分鐘。抗體親和力常數(Kd)藉由史卡查分析(Scatchard)，使用NewLigand軟體測定。
抗體1D11v1.9變異體及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗體：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在一些實施例中，本發明提供包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗體：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR- H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：128之胺基酸序列的HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VLHVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包 含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-B7-H4抗體人類化。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1：輕鏈構架區FR3中之Y49H、V58I、T69R及/或F71Y突變；重鏈構架區FR3中之V67A、I69L、R71A、T73K及/或T75S突變。
在一些實施例中，抗-B7-H4抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含SEQ ID NO：53之重鏈構架FR3序列。在一些此類實施例中，重鏈可變域構架為具有SEQ ID NO：53之FR3序列的經修飾之人類VH1構架。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：38或127之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：38或127之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：38或127中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：38或127中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。
視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：38之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：127之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：126之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：126之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：126中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：126中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：126之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含如 以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：126中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：127及SEQ ID NO：126中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本發明提供與本文提供之抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。
在某些實施例中，提供根據任一以上實施例之抗體，其結合於B7-H4且具有至少一個以下特徵：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體具有以下特徵中之至少一者或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如如本文中所定義之IgG1抗體或其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
抗體1D11及其他實施例
在一些實施例中，本發明提供包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗體：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，本發明提供包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR的抗-B7-H4抗體：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例 中，該抗體含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含選自SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列 之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一以上實施例中，抗-B7-H4抗體人類化。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體包含如任一以上實施例中之HVR且進一步包含人類接受體構架，例如人類免疫球蛋白構架或人類共同構架。在某些實施例中，人類接受體構架為人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1。在某些實施例中，人類接受體構架為包含任一以下突變之人類VLκI共同(VLKI)構架及/或VH構架VH1：輕鏈構架區FR3中之Y49H、V58I、T69R及/或F71Y突變；重鏈構架區FR3中之V67A、I69L、R71A、T73K及/或T75S突變。
在一些實施例中，抗-B7-H4抗體包含如任一以上實施例中之HVR，且進一步包含SEQ ID NO：51、52或53之重鏈構架FR3序列。在一些此類實施例中，重鏈可變域構架為具有SEQ ID NO：51、52或53之FR3序列的經修飾之人類VH1構架。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：4之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：4之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、 94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：4中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：4中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：4之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：5之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：6之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：7之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：36、37、38、99、100、101、102或103之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：36、37、38、99、100、101、102或103之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：36、37、38、99、100、101、102或103中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：36、37、38、99、100、101、102或103中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：36、37、38、99、100、101、102或103之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之 HVR：(a)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：3之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：3中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：3中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：3之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：8之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：9之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：10之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：35、93、94、95、96、97或98之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：35、93、94、95、96、97或98之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中， SEQ ID NO：35、93、94、95、96、97或98中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：35、93、94、95、96、97或98中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：35、93、94、95、96、97或98之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：44之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。
在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：4及SEQ ID NO：3中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：93中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：97中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：102及SEQ ID NO：98中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：103及SEQ ID NO：98中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：96中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：95中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：101及SEQ ID NO：94中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：100及SEQ ID NO：93中之VH及VL序列，包括 彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：99及SEQ ID NO：93中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：93中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：36及SEQ ID NO：35中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾.在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：37及SEQ ID NO：35中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：38及SEQ ID NO：35中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本發明提供與本文提供之抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：4之VH序列及SEQ ID NO：3之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：93之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：97之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：102之VH序列及SEQ ID NO：98之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：103之VH序列及SEQ ID NO：98之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：96之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：95之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：101之VH序列及SEQ ID NO：94之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。 在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：100之VH序列及SEQ ID NO：93之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：99之VH序列及SEQ ID NO：93之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：36之VH序列及SEQ ID NO：93之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：36之VH序列及SEQ ID NO：35之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：37之VH序列及SEQ ID NO：35之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：35之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。
在某些實施例中，提供根據任一以上實施例之抗體，其結合於B7-H4且具有至少一個以下特徵：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體具有以下特徵中之至少一者或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74 (成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體為單株抗體，包括嵌合抗體、人類化抗體或人類抗體。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如如本文中所定義之IgG1抗體或其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
抗體22C10及其他實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-B7-H4抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗-B7-H4抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO： 29之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3，及包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。在一個 實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一上述實施例中，抗-B7-H4抗體為人類抗體。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：28之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：28之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：28中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：28中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：28之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：29之胺基酸序列之HVR- H1，(b)包含SEQ ID NO：30之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：31之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含具有與SEQ ID NO：27之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：27之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：27中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：27中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：27之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：32之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含具有與SEQ ID NO：55、57、104、105或106之胺基酸序列至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：55、57、104、105或106之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：55、57、104、105或106中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。 在某些實施例中，SEQ ID NO：55、57、104、105或106中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：55、57、104、105或106之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：104中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：112及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：113及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：114及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：105中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：111及SEQ ID NO：106中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：110及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：109及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：108及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：107及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：55中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在另一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：56及SEQ ID NO：57中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本發明提供與本文提供之抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：28之VH序列及SEQ ID NO：27之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：111之VH序列及SEQ ID NO：104之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：111之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：112之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：113之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：114之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：111之VH序列及SEQ ID NO：105之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：111之VH序列及SEQ ID NO：106之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：110之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗 體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：109之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：108之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：107之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：之VL序列57的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。
在某些實施例中，提供根據任一以上實施例之抗體，其結合於B7-H4且具有至少一個以下特徵：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體具有以下特徵中之至少一者或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
抗體32D6及其他實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-B7-H4抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序 列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一上述實施例中，抗-B7-H4抗體為人類抗體。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：12之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例 中，與SEQ ID NO：12之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：12中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：12中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：12之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：13之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：14之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：15之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：11中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：11中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：11之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：16之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：17之胺基酸序列之HVR-L2； 及(c)包含SEQ ID NO：18之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：11中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。在另一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：12及SEQ ID NO：11中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本發明提供與本文提供之抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：12之VH序列及SEQ ID NO：11之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。
在某些實施例中，提供根據任一以上實施例之抗體，其結合於B7-H4且具有至少一個以下特徵：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體具有以下特徵中之至少一者或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；結合於整個或一部分SEQ ID NO： 73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
抗體9B9及其他實施例
在一個態樣中，本發明提供一種抗-B7-H4抗體，其包含至少一個、兩個、三個、四個、五個或六個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3及包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在另一個實施例中，該抗體含有包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3、包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3及包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2。在另一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。在一個實施例中，該抗體包含(a)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明之抗體包含(a)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VH HVR序列的VH域：(i)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；及(b)包含至少一個、至少兩個或全部三個選自以下各者之VL HVR序列的VL域：(i)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1，(ii)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，本發明提供一種抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1；(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2；(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3；(d)包含SEQ ID NO：24之胺基酸序列之HVR-L1；(e)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(f)包含選自SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在任一上述實施例中，抗-B7-H4抗體為人類抗體。
在另一個態樣中，抗-B7-H4抗體包含與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、 98%、99%或100%序列一致性的重鏈可變域(VH)序列。在某些實施例中，與SEQ ID NO：20之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VH序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：20中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：20中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：20之VH序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VH包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：21之胺基酸序列之HVR-H1，(b)包含SEQ ID NO：22之胺基酸序列之HVR-H2，及(c)包含SEQ ID NO：23之胺基酸序列之HVR-H3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列一致性的輕鏈可變域(VL)。在某些實施例中，與SEQ ID NO：19之胺基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性的VL序列相對於參考序列含有取代(例如保守取代)、插入或缺失，但包含該序列之抗-B7-H4抗體保留結合於B7-H4之能力。在某些實施例中，SEQ ID NO：19中總計1至5個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，SEQ ID NO：19中總計1至10個胺基酸已經取代、插入及/或缺失。在某些實施例中，取代、插入或缺失發生在HVR外部區域中(亦即在FR中)。視情況，抗-B7-H4抗體包含SEQ ID NO：11之VL序列，包括該序列之轉譯後修飾。在一特定實施例中，VL包含一個、兩個或三個選自以下各者之HVR：(a)包含SEQ ID NO：24之胺基 酸序列之HVR-L1；(b)包含SEQ ID NO：25之胺基酸序列之HVR-L2；及(c)包含SEQ ID NO：26之胺基酸序列之HVR-L3。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體，其中該抗體包含如以上提供之任一實施例中之VH及如以上提供之任一實施例中之VL。在一個實施例中，該抗體包含分別SEQ ID NO：20及SEQ ID NO：19中之VH及VL序列，包括彼等序列之轉譯後修飾。
在另一個態樣中，本發明提供與本文提供之抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基之抗體。舉例而言，在某些實施例中，提供與包含SEQ ID NO：20之VH序列及SEQ ID NO：19之VL序列的抗-B7-H4抗體結合於相同抗原決定基的抗體。
在某些實施例中，提供根據任一以上實施例之抗體，其結合於B7-H4且具有至少一種以下特徵：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。在一些實施例中，該抗體具有以下特徵中之至少一者或多者，呈任何組合：(a)結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-157)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分含有B7-H4 Ig-C之結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸158-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分B7-H4 Ig-V及Ig-C結構域(SEQ ID NO：73之胺基酸29-250)內的抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：74(成熟人類B7-H4)內之抗原決定基；或結合於整個或一部分SEQ ID NO：73(前驅人類B7-H4)內之抗原決定基。
在本發明之另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體為單株抗體，包括人類抗體。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體為抗體片段，例如Fv、Fab、Fab'、scFv、雙功能抗體或F(ab')2片段。在另一實施例中，抗體為實質上全長抗體，例如IgG2a抗體或如本文所定義之其他抗體類別或同型。
在另一態樣中，根據任一以上實施例之抗-B7-H4抗體可合併如以下所述之單一或組合之任一特徵。
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文提供之抗體的解離常數(Kd)1μM、100nM、50nM、10nM、5nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM且視情況可10-13M(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。
在一個實施例中，Kd藉由放射性標記之抗原結合分析(RIA)量測，該分析利用相關抗體之Fab型式及其抗原，如藉由以下分析所述進行。Fab對抗原之溶液結合親和力藉由在一系列滴定未標記抗原存在下使Fab與最低濃度之(125I)-標記抗原平衡，接著用抗-Fab抗體塗佈之盤捕捉結合抗原來量測(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為確定分析條件，將MICROTITER®多孔盤(Thermo Scientific)用50mM碳酸鈉(pH 9.6)中之5μg/ml捕捉抗-Fab抗體(Cappel Labs)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用PBS中之2%(w/v)牛血清白蛋白阻斷2至5小時。在無吸附劑盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如與抗-VEGF抗體Fab-12之評估一致，Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997))。接著將相關Fab培育隔夜；然而，培育可持續較長時間段(例如約65小時)以保證達到平衡。此後，將混合物轉移至捕捉盤中以在室溫下培育(例如一小時)。隨後移除溶液且用含0.1%聚山梨醇酯20(TWEEN- 20®)之PBS洗滌盤八次。當盤乾燥時，添加150微升/孔之閃爍體(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對盤計數10分鐘。選擇提供小於或等於最大結合20%之各Fab的濃度用於競爭性結合分析。
根據另一個實施例，Kd使用表面電漿子共振分析，使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)，在25℃下，利用固定抗原CM5晶片，在約10反應單元(RU)下量測。簡言之，根據供應商說明書，以N-乙基-N'-(3-二甲胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化葡聚糖生物感測器晶片(CM5,BIACORE,Inc.)。抗原用10mM乙酸鈉pH 4.8稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後在5微升/分鐘之流動速率下注射以獲得大約10個反應單元(RU)之偶合蛋白。在抗原注射後，注射1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。關於動力學量測，在25℃下，以約25μl/min之流動速率注射於含0.05%聚山梨醇酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑之PBS(PBST)中之Fab兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)。使用簡單的一比一朗格繆爾結合模型(one-to-one Langmuir binding model)(BIAcore®評估軟體3.2版)，藉由同時擬合結合及解離感測圖譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)係依比率koff/kon計算。參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999)。若藉由以上表面電漿子共振分析測定之締合速率超過106M-1 s-1，則締合速率可使用螢光淬滅技術量測，該技術在如光譜儀(諸如具有攪拌式光析槽之止流裝備型分光光度計(Aviv Instruments)或8000-系列SLM-AMINCOTM分光光度計(ThermoSpectronic))中所量測之濃度增加之抗原存在下，量測在25℃下PBS中之20nM抗-抗原抗體(Fab形式)(pH 7.2)之螢光發射強度(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)之增加或減少。
2. 抗體片段
在某些實施例中，本文所提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括(但不限於)Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2、Fv及scFv片段以及下文描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之評述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編輯，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；亦參見WO 93/16185；以及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基及具有延長之活體內半衰期之Fab及F(ab')2片段的論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為可為二價或雙特異性之具有兩個抗原結合位點之抗體片段。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。
單域抗體為包含抗體之重鏈可變域全部或一部分或輕鏈可變域全部或一部分的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.,Waltham,MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術製得，包括(但不限於)蛋白分解消化完整抗體以及藉由重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生，如本文所描述。
3. 嵌合及人類化抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或非人類靈長類 動物(諸如猴)之可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類別已自親本抗體之類別或子類別改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。通常，對非人類抗體進行人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自非人類抗體(例如HVR殘基所來源之抗體)之相應殘基取代以例如恢復或提高抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法綜述於例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述於例如Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重修」)；Dall'Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述FR改組之「引導選擇」方法)。
可用於人類化之人類構架區包括(但不限於)：使用「最佳擬合」方法選擇之構架區(參見例如Sims等人J.Immunol.151：2296(1993))；來源於具有特定子群輕鏈或重鏈可變區之人類抗體的共同序列之構架區(參見例如Carter等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細 胞突變)構架區或人類生殖系構架區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及來源於篩選FR文庫之構架區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
4. 人類抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為人類抗體。可使用此項技術中已知之各種技術來產生人類抗體。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)。
人類抗體可藉由將免疫原投與已經修飾以回應於抗原攻擊而產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。此類動物通常含有人類免疫球蛋白基因座的全部或一部分，其置換內源性免疫球蛋白基因座，或存在於染色體外或隨機整合至動物染色體中。在此類轉殖基因小鼠中，內源性免疫球蛋白基因座一般已不活化。關於自轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。亦參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號，描述XENOMOUSETM技術；美國專利第5,770,429號，描述HUMAB®技術；及美國專利第7,041,870號，描述K-M MOUSE®技術及美國專利申請公開案第US 2007/0061900號，描述VELOCIMOUSE®技術)。藉由此類動物產生之來自完整抗體之人類可變區可例如藉由與不同人類恆定區組合而經進一步修飾。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法製備。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜骨髓瘤細胞株(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86 (1991))。經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如描述於美國專利第7,189,826號(描述單株人類IgM抗體自融合瘤細胞株之產生)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中之方法。人類融合瘤技術(三源雜交瘤技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)。
人類抗體亦可藉由分離選自人類衍生噬菌體呈現庫之Fv純系可變域序列產生。此類可變域序列接著可與所需人類恆定域組合。下文描述用於自抗體文庫選擇人類抗體之技術。
5. 文庫衍生之抗體
本發明之抗體可藉由針對具有所需活性之抗體篩選組合文庫來分離。舉例而言，此項技術中已知多種方法用於產生噬菌體呈現文庫及針對具有所需結合特徵之抗體篩選此類文庫。此類方法綜述於例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編輯，Human Press,Totowa,NJ,2001)且進一步描述於例如McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編輯，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中，VH及VL基因之譜系分別藉由聚合酶鏈式反應(PCR)選殖且在噬菌體文庫中無規重組，接著可篩選抗原結 合噬菌體，如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所述。噬菌體通常以單鏈Fv(scFv)片段或Fab片段形式呈現抗體片段。來自經免疫來源之文庫提供抗免疫原之高親和力抗體而無需構築融合瘤。或者，可選殖原始譜系(例如自人類)以提供抗各種非自體抗原以及自體抗原之抗體之單一來源而無需任何免疫接種，如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所述。最終，亦可以合成方式藉由自幹細胞選殖未經重排之V基因區段，且使用含有隨機序列之PCR引子以編碼高度可變CDR3區及實現活體外重排來製備原始文庫，如藉由Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388(1992)描述。描述人類抗體噬菌體文庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體文庫分離之抗體或抗體片段在本文中視為人類抗體或人類抗體片段。
6. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。如本文所用，術語「多特異性抗體」係指包含具有多抗原決定基特異性(亦即能夠結合於一個分子上兩個或更多個不同抗原決定基或能夠結合於兩個或更多個不同分子上之抗原決定基)之抗原結合域的抗體。
在一些實施例中，多特異性抗體為對至少兩個不同抗原結合位點具有結合特異性之單株抗體(諸如雙特異性抗體)。在一些實施例中，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合同一個分子內之兩個抗原決定基(分子內結合)。舉例而言，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合於同一B7-H4分子上之兩個 不同抗原決定基。在某些實施例中，多特異性抗體結合之兩個不同抗原決定基為正常不同時藉由一種單特異性抗體(諸如習知抗體)或一種免疫球蛋白單一可變域結合的抗原決定基。在一些實施例中，多特異性抗體之第一抗原結合域及第二抗原結合域可結合位於兩個不同分子內之抗原決定基(分子間結合)。舉例而言，多特異性抗體之第一抗原結合域可結合於一種B7-H4分子上之一種抗原決定基，而多特異性抗體之第二抗原結合域可結合於不同B7-H4分子上之另一抗原決定基，由此使兩個分子交聯。
在一些實施例中，多特異性抗體(諸如雙特異性抗體)之抗原結合域包含兩個VH/VL單元，其中第一VH/VL單元結合於第一抗原決定基且第二VH/VL單元結合於第二抗原決定基，其中各VH/VL單元包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)。此類多特異性抗體包括(但不限於)全長抗體、具有兩個或兩個以上VL及VH域之抗體及抗體片段(諸如Fab、Fv、dsFv、scFv、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體及三功能抗體、已共價或非共價連接之抗體片段)。進一步包含重鏈可變區至少一部分及/或輕鏈可變區至少一部分之VH/VL單元亦可稱為「臂」或「半聚體」或「半抗體」。在一些實施例中，半聚體包含足以允許與第二半聚體形成二硫鍵之重鏈可變區部分。在一些實施例中，半聚體包含杵突變或臼突變，例如以允許與包含互補臼突變或杵突變之第二半聚體或半抗體雜二聚。杵突變及臼突變在下文中進一步論述。
在某些實施例中，本文提供之多特異性抗體可為雙特異性抗體。如本文所用，術語「雙特異性抗體」係指包含能夠結合於一個分子上之兩個不同抗原決定基或能夠結合於兩個不同分子上之抗原決定基的抗原結合域的多特異性抗體。雙特異性抗體亦可在本文中稱為具有「雙重特異性」或「雙重特異性的」。示例性雙特異性抗體可結合B7-H4與任何其他抗原。在某些實施例中，結合特異性之一係針對 B7-H4且另一係針對CD3。參見例如美國專利第5,821,337號。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於同一B7-H4分子之兩個不同抗原決定基。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合於兩個不同B7-H4分子上之兩個不同抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位至表現B7-H4之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段。
用於製備多特異性抗體之技術包括(但不限於)具有不同特異性之兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983)，WO 93/08829及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))及「杵臼」工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號、WO2009/089004、US2009/0182127、US2011/0287009，Marvin及Zhu,Acta Pharmacol.Sin.(2005)26(6)：649-658，及Kontermann(2005)Acta Pharmacol.Sin.,26：1-9)。如本文所用，術語「杵臼」或「KnH」技術係指活體外或活體內，藉由在相互作用界面處將突起(杵)引入一種多肽及空腔(臼)引入另一多肽中來指導兩個多肽配對在一起之技術。舉例而言，KnH已引入抗體之Fc：Fc結合界面、CL：CH1界面或VH/VL界面(參見例如US 2011/0287009、US2007/0178552、WO 96/027011、WO 98/050431，Zhu等人，1997,Protein Science 6：781-788，及WO2012/106587)。在一些實施例中，在製造多特異性抗體期間KnH驅動兩個不同重鏈配對在一起。舉例而言，在Fc區中具有KnH之多特異性抗體可進一步包含連接於各Fc區之單一可變域，或進一步包含與類似或不同輕鏈可變域配對之不同重鏈可變域。KnH技術亦可用於將兩個不同受體細胞外域配對在一起或配對包含不同標靶識別序列之任何其他多肽序列(例如包括親和抗體、肽體及其他Fc融合物)。
如本文所用，術語「杵突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將突起(杵)引入多肽之突變。在一些實施例中，另一多肽具有臼突變。
如本文所用，術語「臼突變」係指在多肽與另一多肽相互作用之界面處將空腔(臼)引入多肽之突變。在一些實施例中，另一多肽具有杵突變。
以下提供簡單非限制性論述。
「突起」係指自第一多肽之界面伸出且因此可定位於相鄰界面(亦即第二多肽之界面)中之補償空腔以便穩定化雜多聚體且藉此促進例如雜多聚體形成而非均多聚體形成的至少一個胺基酸側鏈。突起可存在於原始界面或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。在一些實施例中，編碼第一多肽之界面的核酸經改變以編碼突起。為實現此，編碼第一多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸經編碼至少一個側鏈體積大於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基的核酸置換。應瞭解可存在一個以上原始及對應輸入殘基。各種胺基殘基之側鏈體積展示於例如US2011/0287009之表1。引入「突起」之突變可稱為「杵突變」。
在一些實施例中，用於形成突起之輸入殘基為選自精胺酸(R)、苯丙胺酸(F)、酪胺酸(Y)及色胺酸(W)的天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基為色胺酸或酪胺酸。在一些實施例中，用於形成突起之原始殘基具有小側鏈體積，諸如丙胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸或纈胺酸。
「空腔」係指自第二多肽之界面凹陷且因此容納第一多肽之相鄰界面上之對應突起的至少一個胺基酸側鏈。空腔可存在於原始界面或可以合成方式(例如藉由改變編碼界面之核酸)引入。在一些實施例中，編碼第二多肽之界面的核酸經改變以編碼空腔。為實現此，編碼第二多肽之界面中之至少一個「原始」胺基酸殘基的核酸經編碼至少一個側鏈體積小於原始胺基酸殘基之「輸入」胺基酸殘基之DNA置換。應瞭解可存在一個以上原始及對應輸入殘基。在一些實施例中， 用於形成空腔之輸入殘基為選自丙胺酸(A)、絲胺酸(S)、蘇胺酸(T)及纈胺酸(V)的天然存在之胺基酸殘基。在一些實施例中，輸入殘基為絲胺酸、丙胺酸或蘇胺酸。在一些實施例中，用於形成空腔之原始殘基具有大側鏈體積，諸如酪胺酸、精胺酸、苯丙胺酸或色胺酸。引入「空腔」之突變可稱為「臼突變」。
突起「可定位」於空腔中，此意謂分別第一多肽及第二多肽之界面上的突起及空腔之空間位置及突起及空腔之尺寸使得突起可位於空腔中，且不顯著擾動第一及第二多肽在該界面之正常締合。因為諸如Tyr、Phe及Trp之突起通常不自界面軸線垂直延長且具有較佳構形，所以突起與對應空腔之比對在一些情況下可依賴於基於三維結構，諸如藉由X射線結晶學或核磁共振(NMR)獲得之三維結構將突起/空腔對模型化。此可使用此項技術中公認之技術實現。
在一些實施例中，IgG1恆定區中之杵突變為T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG1恆定區中之臼突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
在一些實施例中，IgG4恆定區中之杵突變為T366W(EU編號)。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼突變包含一或多個選自T366S、L368A及Y407V(EU編號)之突變。在一些實施例中，IgG4恆定區中之臼突變包含T366S、L368A及Y407V(EU編號)。
亦可藉由以下來製備多特異性抗體：工程改造靜電轉向作用以製備抗體Fc-雜二聚體分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或兩個以上抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號，及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鏈產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc. Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；以及使用單鏈Fv(sFv)二聚體(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；以及製備三特異性抗體，如例如Tutt等人J.Immunol.147：60(1991)中描述。
本文中亦包括具有三個或三個以上功能抗原結合位點之工程改造抗體，包括「章魚抗體」或「雙重可變域免疫球蛋白」(DVD)(參見例如US 2006/0025576A1，及Wu等人Nature Biotechnology(2007)))。本文之抗體或片段亦包括包含結合於B7-H4以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
7. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文所提供之抗體之胺基酸序列變異體。舉例而言，可能需要提高抗體之結合親和力及/或其他生物特性。抗體之胺基酸序列變異體可藉由將適當修飾引入編碼該抗體之核苷酸序列中或藉由肽合成來製備。此類修飾包括例如發生於抗體胺基酸序列內的殘基缺失及/或插入及/或取代。可進行缺失、插入及取代之任何組合以獲得最終構築體，其限制條件為最終構築體具有所需特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。用於取代突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守取代展示於表1中標題「較佳取代」下。更多實質性變化提供於表1中標題「示例性取代」下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。胺基酸取代可引入相關抗體中且針對所需活性篩選產物，例如保留/提高抗原結合、降低免疫原性或改善ADCC或CDC的產物。
胺基酸可根據共有側鏈特性進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別中之一者之成員換成另一類別。
一種類型之取代變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體相對於親本抗體將在某些生物特性方面具有修改(例如改善)(例如親和力提高、免疫原性降低)及/或將實質上保留親本抗體之 某些生物特性。一種示例性取代變異體為親和力成熟抗體，其可例如使用基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文所描述之技術)便利地產生。簡言之，使一或多個HVR殘基突變且在噬菌體上呈現變異抗體且針對特定生物活性(例如結合親和力)進行篩選。
改變(例如取代)可在HVR中進行以例如提高抗體親和力。可在HVR「熱點」(亦即由在體細胞成熟過程期間經歷高頻率突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008)))及/或SDR(a-CDR)中用測試結合親和力之所得變異VH或VL進行此類改變。藉由構築二級文庫及自二級文庫再選擇來達成親和力成熟已描述於Hoogenboom等人之Methods in Molecular Biology 178：1-37(O'Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸引導之突變誘發)中之任一者將多樣性引入選擇用於成熟之可變基因中。隨後產生二級文庫。隨後篩選該文庫以鑑別具有所需親和力之任何抗體變異體。引入多樣性之另一方法涉及HVR引導途徑，其中將若干HVR殘基(例如一次4-6個殘基)隨機分組。參與抗原結合之HVR殘基可例如使用丙胺酸掃描突變誘發或模型化來特定鑑別。常常尤其以CDR-H3及CDR-L3為目標。
在某些實施例中，取代、插入或缺失可發生在一或多個HVR內，只要此等改變不實質上降低抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行不實質上降低結合親和力之保守改變(例如，如本文所提供之保守取代)。此類改變可在HVR「熱點」或SDR外。在上文提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變，或含有不超過一個、兩個或三個胺基酸取代。
一種適用於鑑別可靶向用於突變誘發之抗體之殘基或區的方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如由Cunningham及Wells(1989) Science,244：1081-1085所描述。在此方法中，鑑別標靶殘基之殘基或群(例如帶電殘基，諸如arg、asp、his、lys及glu)且經中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在對初始取代顯示功能敏感性之胺基酸位置處引入其他取代。或者或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構用於鑑別抗體與抗原之間的接觸點。此類接觸殘基及鄰近殘基可作為取代候選物之目標或排除在取代候選物之外。可篩選變異體以判定其是否含有所需特性。
胺基酸序列插入包括在一個殘基至含有一百個或一百個以上殘基之多肽長度範圍內的胺基及/或羧基端融合物，以及具有單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入變異體包括抗體之N端或C端與酶(例如對於ADEPT而言)或延長抗體之血清半衰期之多肽的融合物。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，對本文所提供之抗體進行改變以增加或降低抗體糖基化之程度。在抗體上添加糖基化位點或使抗體缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列以便產生或移除一或多個糖基化位點來便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變附接於其上之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體通常包含分支鏈雙觸角寡醣，其一般藉由N鍵附接於Fc區之CH2域的Asn297。參見例如Wright等人TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及附接於雙觸寡醣結構之「主幹」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可對本發明抗體中之寡醣進行修飾以便形成具有某些改良特性之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有缺乏附接(直接或間接)於Fc區之海藻 糖之碳水化合物結構的抗體變異體。舉例而言，此類抗體中海藻糖之量可為1%至80%，1%至65%，5%至65%或20%至40%。海藻糖之量藉由計算相對於如藉由MALDI-TOF質譜分析量測之附接於Asn 297之所有醣結構(例如複合、雜交及高甘露糖結構)的總和，糖鏈內Asn297處之海藻糖之平均量來確定，如例如WO 2008/077546中所描述。Asn297係指位於Fc區中約位置297之天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，歸因於抗體中微小序列變化，Asn297亦可位於位置294與300之間位置297之上游或下游約±3個胺基酸處。此類海藻糖基化變異體可具有改善之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號(Presta,L.)；第US 2004/0093621號(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd)。關於「去海藻糖基化」或「缺乏海藻糖」抗體變異體之公開案之實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人J.Mol.Biol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株之實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lecl3 CHO細胞(Ripka等人Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；以及WO 2004/056312 A1,Adams等人，尤其實例11)，及基因剔除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因剔除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda,Y.等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；以及WO2003/085107)。
進一步提供具有平分寡醣之抗體變異體，例如其中附接於抗體之Fc區的雙觸角寡醣藉由GlcNAc平分。此類抗體變異體可具有減少之海藻糖基化及/或改善之ADCC功能。此類抗體變異體之實例描述於例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等人)；美國專利第6,602,684號(Umana等人)；以及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基與Fc區附接之抗體變異體。此類抗體變異體可具有改善之CDC功能。此類抗體變異體描述於例如WO 1997/30087(Patel等人)；WO 1998/58964(Raju,S.)；及WO 1999/22764(Raju,S.)中。
c)Fc區變異體
在某些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文所提供之抗體之Fc區中，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)，其在一或多個胺基酸位置處包含胺基酸修飾(例如取代)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應功能之抗體變異體，此使得該抗體成為對於其中活體內抗體半衰期至關重要，而某些效應功能(諸如補體及ADCC)為不必要或有害的應用而言合乎需要之候選物。可進行活體外及/或活體內細胞毒性分析以確認CDC及/或ADCC活性之降低/消除。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體不具有FcγR結合能力(從而可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之初級細胞NK細胞僅表現FcγRIII，而單核細胞表現FcγRI、FcγRII及FcγRIII。FcR在造血細胞上之表現概述於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)之第464頁之表3中。評估相關分子之ADCC活性之活體外分析的非限制性實例描述於以下中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986))及Hellstrom,I 等人，Proc.Nat'l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；第5,821,337號(參見Bruggemann,M.等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。或者，可採用非放射性分析方法(參見例如流動式細胞量測術之ACTITM非放射性細胞毒性分析(CellTechnology,Inc.Mountain View,CA)；及CytoTox 96®非放射性細胞毒性分析(Promega,Madison,WI))。適用於此類分析之效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。或者或另外，可評估相關分子之活體內ADCC活性，例如在動物模型(諸如Clynes等人Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示)中。亦可進行C1q結合分析以確認抗體無法結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為評估補體活化，可進行CDC分析(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg,M.S.等人，Blood 101：1045-1052(2003)；以及Cragg,M.S.及M.J.Glennie,Blood 103：2738-2743(2004))。亦可使用此項技術中已知之方法測定FcRn結合及活體內清除率/半衰期(參見例如Petkova,S.B.等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
在一些實施例中，可將一或多個胺基酸修飾引入本文提供之抗體之Fc部分中以增加IgG與新生Fc受體之結合。在某些實施例中，抗體包含根據EU編號之以下三個突變：M252Y、S254T及T256E(「YTE突變」)(美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006))。在某些實施例中，YTE突變不影響抗體結合於其同源抗原之能力。在某些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期3倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期2倍。在一些 實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期4倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期至少5倍。在一些實施例中，與天然(亦即非YTE突變)抗體相比，YTE突變增加抗體之血清半衰期至少10倍。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，YTE突變體提供一種調節抗體之抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)活性的方式。在某些實施例中，YTEO突變體提供一種調節人類化IgG抗體針對人類抗原之ADCC活性的方式。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
在某些實施例中，YTE突變體允許同時調節血清半衰期、組織分佈及抗體活性(例如IgG抗體之ADCC活性)。參見例如美國專利第8,697,650號；亦參見Dall'Acqua等人，Journal of Biological Chemistry 281(33)：23514-23524(2006)。
具有減少之效應功能的抗體包括根據EU編號Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代的抗體(美國專利第6,737,056號)。此類Fc突變體包括在根據EU編號胺基酸位置265、269、270、297及327 Fc中之兩者或兩者以上經取代的突變體，包括根據EU編號殘基265及297取代為丙胺酸(亦即根據EU編號D265A及N297A)的所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。在某些實施例中，Fc突變體包含以下兩個胺基酸取代：D265A及N297A。在某些實施例中，Fc突變體由以下兩個胺基酸取代組成：D265A及N297A。
在某些實施例中，野生型人類Fc區之位置329(EU編號)(P329)的脯胺酸經甘胺酸或精胺酸或大至足以破壞Fc/Fcγ(受體界面，在Fc之 P329與FcgRIII之色胺酸殘基W87及W110之間形成(Sondermann等人：Nature 406,267-273(2000年7月20日))內之脯胺酸夾心的胺基酸殘基取代。在另一個實施例中，Fc變異體中之至少一個其他胺基酸取代為S228P、E233P、L234A、L235A、L235E、N297A、N297D或P331S，且在另一個實施例中，該至少一個其他胺基酸取代為人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E，均係根據EU編號(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在某些實施例中，多肽包含野生型人類IgG Fc區之Fc變異體，其中該多肽之人類IgG Fc區P329經甘胺酸取代且其中Fc變異體包含人類IgG1 Fc區之L234A及L235A或人類IgG4 Fc區之S228P及L235E的至少兩個其他胺基酸取代，且其中殘基係根據EU編號進行編號(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。在某些實施例中，包含P329G、L234A及L235A(EU編號)取代之多肽顯示對人類FcγRIIIA及FcγRIIA之親和力減少，從而下調ADCC至藉由包含野生型人類IgG Fc區之多肽誘發的ADCC之至少20%，及/或下調ADCP(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。
在一特定實施例中，包含野生型人類Fc多肽之Fc變異體的多肽包含三重突變：根據EU編號位置Pro329之胺基酸取代、L234A及L235A突變(P329/LALA)(美國專利第8,969,526號，其以全文引用的方式併入本文中)。在特定實施例中，多肽包含以下胺基酸取代：P329G、L234A及L235A，根據EU編號。
描述具有提高或降低之與FcR之結合的某些抗體變異體(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312，及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體包含具有一或多個提高ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334(EU編號)之取代的Fc 區。
在一些實施例中，在Fc區中進行改變，引起C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)改變(亦即提高或降低)，例如如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人J.Immunol.164：4178-4184(2000)中描述。
半衰期延長且與負責將母體IgG轉移至胎兒之新生兒Fc受體(FcRn)(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))之結合改良的抗體描述於US 2005/0014934A1(Hinton等人)中。彼等抗體包含其中具有一或多個取代之Fc區，其中Fc區與FcRn之結合得以改善。此類Fc變異體包括在Fc區殘基中之一或多者具有取代之Fc變異體：根據EU編號，238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。關於Fc區變異體之其他實例，亦參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要產生半胱胺酸工程改造之抗體，例如「THIOMABTM抗體」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於抗體之可接近位點。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，反應性硫醇基從而定位於抗體之可接近位點且可用於使抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合以產生如本文中進一步描述之免疫結合物。在某些實施例中，以下殘基中之任一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A140(EU編號)；重鏈之L174(EU編號)；重鏈之Y373(EU編號)；輕鏈之K149(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；以及重鏈Fc 區之S400(EU編號)。在特定實施例中，本文所述之抗體包含HC-A140C(EU編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文所述之抗體包含LC-K149C(Kabat編號)半胱胺酸取代。在特定實施例中，本文所述之抗體包含HC-A118C(EU編號)半胱胺酸取代。可如例如美國專利第7,521,541號中所述產生半胱胺酸工程改造之抗體。
在某些實施例中，抗體包含以下重鏈半胱胺酸取代之一：
在某些實施例中，抗體包含以下輕鏈半胱胺酸取代之一：
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2重鏈(HC)A118C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：132及134之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD重鏈(HC)A118C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：133及134之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7重鏈(HC)A118C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：137及138之重鏈及輕鏈胺基酸序列。
示例性S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區展示在SEQ ID NO：135中。S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區可與SEQ ID NO：127中展示之hu1D11.v1.9 varC2重鏈可變區之C端融合。所得hu1D11.v1.9 varC2 HC S400C重鏈可與hu1D11.v1.9 varC2κ輕鏈，諸如SEQ ID NO：134中展示之輕鏈配對。S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區可與SEQ ID NO：38中展示之hu1D11.v1.9 varD重鏈可變區之C端融合。所得hu1D11.v1.9 varD HC S400C重鏈可與hu1D11.v1.9 varDκ輕鏈，諸如SEQ ID NO：134中展示之輕鏈配對。S400C半胱胺酸工程改造之重鏈恆定區可與SEQ ID NO：56中展示之hu22C10.v2.7重鏈可變區之C端融合。所得hu22C10.v2.7 HC S400C重鏈可與hu22C10.v2.7 κ輕鏈，諸如SEQ ID NO：138中展示之輕鏈配對。
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：130及140之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：130及145之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：131及140之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：131及145之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：144及142之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7輕鏈(LC)K149C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：144及147之重鏈及輕鏈胺基酸序列。
非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：130及141之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varC2輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：130及146之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：131及141之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu1D11.v1.9 varD輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：131及146之 重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：144及143之重鏈及輕鏈胺基酸序列。非限制性示例性hu22C10.v2.7輕鏈(LC)V205C THIOMABTM具有分別SEQ ID NO：144及148之重鏈及輕鏈胺基酸序列。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，可將本文中所提供之抗體進一步修飾以含有此項技術中已知且可易於獲得之其他非蛋白質部分。適合於抗體衍生化之部分包括(但不限於)水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括(但不限於)聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三噁烷、乙烯/順丁烯二酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(n-乙烯吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚氧化丙烯/氧化乙烯共聚物、聚氧乙烯多元醇(例如丙三醇)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛因其於水中之穩定性而可具有製造優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分支或未分支的。與抗體附接之聚合物的數目可變化，且若連接一個以上聚合物，則聚合物可相同或不同分子。一般而言，用於衍生作用之聚合物之數目及/或類型可基於包括(但不限於)待改善抗體之特殊特性或功能，抗體衍生物是否將用於指定病症下之療法等考慮因素來確定。
在另一實施例中，提供抗體與可藉由暴露於放射線選擇性地加熱之非蛋白質部分之結合物。在一個實施例中，非蛋白質部分為碳奈米管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。放射線可具有任何波長，且包括(但不限於)不損害普通細胞但將非蛋白質部分加熱至靠近殺死抗體-非蛋白質部分之細胞之溫度的波長。
B. 重組方法及組合物
可使用例如如US 4,816,567中所描述之重組方法及組合物產生抗 體。在一個實施例中，提供編碼本文所述之抗-B7-H4抗體之分離核酸。此類核酸可編碼構成抗體之VL之胺基酸序列及/或構成VH之胺基酸序列(例如抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供包含此類核酸之一或多種載體(例如表現載體)。在又一實施例中，提供包含此類核酸之宿主細胞。在一個此類實施例中，宿主細胞包含(例如已經以下轉型)：(1)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列及構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的載體；或(2)包含編碼構成抗體VL之胺基酸序列之核酸的第一載體及包含編碼構成抗體VH之胺基酸序列之核酸的第二載體。在一個實施例中，宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴細胞(例如Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製備抗-B7-H4抗體之方法，其中該方法包含在適合於表現抗體之條件下培養如上文所提供之包含編碼抗體之核酸的宿主細胞且視情況自宿主細胞(或宿主細胞培養基)回收抗體。
為重組產生抗-B7-H4抗體，分離例如如上所述之編碼抗體之核酸且插入一或多種載體中以在宿主細胞中進一步選殖及/或表現。此類核酸可易於使用習知程序(例如藉由使用能夠與編碼抗體之重鏈及輕鏈之基因特異性結合的寡核苷酸探針)分離及定序。
適於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文所描述之原核或真核細胞。舉例而言，抗體可於細菌中產生，尤其當不需要糖基化及Fc效應功能時。關於抗體片段及多肽在細菌中之表現，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號(亦參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，描述大腸桿菌中抗體片段之表現)。在表現之後，抗體可以可溶性溶離份自細菌細胞糊狀物分離且其可進一步經純化。
除原核生物外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為抗體編碼 載體之適合選殖或表現宿主，包括糖基化路徑已經「人類化」，從而使得所產生之抗體具有部分或完全人類糖基化型態的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
用於表現糖基化抗體之適合宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出眾多可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地黏蟲(Spodoptera frugiperda)細胞之桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429號(描述在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可為適用的。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為經SV40(COS-7)轉型之猴腎CV1株；人類胚腎細胞株(如例如在Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠睾丸支持細胞(mouse sertoli cell)(如例如在Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類子宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK；布法羅大鼠肝細胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳腺腫瘤(MMT 060562)；如例如在Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用之哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR-CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編輯，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C. 分析
可藉由此項技術中已知之各種分析對本文所提供之抗-B7-H4抗體針對其物理/化學特性及/或生物活性進行鑑別、篩選或表徵。
在一個態樣中，例如藉由已知之方法，諸如ELISA、BIACore®、FACS或西方墨點法測試本發明抗體之抗原結合活性。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與本文中描述之任一抗體競爭結合於B7-H4之抗體。在某些實施例中，此類競爭抗體結合於由本文所述之抗體所結合者相同之抗原決定基(例如線性或構形抗原決定基)。用於定位抗體結合之抗原決定基的詳細示例性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)。
在一示例性競爭分析中，在如下溶液中培育固定B7-H4，該溶液包含結合於B7-H4之第一標記抗體(例如本文所述之任一抗體)及測試與第一抗體競爭結合於B7-H4之能力的第二未標記抗體。第二抗體可存在於融合瘤上清液中。作為對照，在包含第一標記抗體但無第二未標記抗體之溶液中培育固定B7-H4。在允許第一抗體結合於B7-H4之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與固定B7-H4締合之標記之量。若測試樣本中與固定B7-H4締合之標記之量相對於對照樣本中實質上降低，則表明第二抗體與第一抗體競爭結合於B7-H4。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
D. 免疫結合物
本發明亦提供免疫結合物，其包含本文中結合於一或多種細胞毒性劑之抗-B7-H4抗體，該一或多種細胞毒性劑諸如為化學治療劑或 藥物、生長抑制劑、毒素(例如細菌、真菌、植物或動物來源之蛋白質毒素、酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(亦即放射性結合物)。
免疫結合物允許藥物部分靶向傳遞至腫瘤且在一些實施例中其中在胞內累積，其中全身性投與未結合藥物可對正常細胞造成不可接受之毒性水準(Polakis P.(2005)Current Opinion in Pharmacology 5：382-387)。
抗體-藥物結合物(ADC)為靶向型化學治療分子，其藉由將有效細胞毒性藥物靶向表現抗原之腫瘤細胞，將抗體與細胞毒性藥物之特性組合(Teicher,B.A.(2009)Current Cancer Drug Targets 9：982-1004)，藉此藉由最大化功效且最小化脫靶毒性而增強治療指數(Carter,P.J.及Senter P.D.(2008)The Cancer Jour.14(3)：154-169；Chari,R.V.(2008)Acc.Chem.Res.41：98-107)。
本發明之ADC化合物包括具有抗癌活性之化合物。在一些實施例中，ADC化合物包括結合，亦即共價附接於藥物部分之抗體。在一些實施例中，抗體經由連接子共價連接於藥物部分。本發明之抗體-藥物結合物(ADC)選擇性地傳遞有效劑量之藥物至腫瘤組織，從而可實現較大選擇性，亦即較低有效劑量，同時增加治療指數(「治療窗」)。
抗體-藥物結合物(ADC)之藥物部分(D)可包括具有細胞毒性或細胞生長抑制作用之任何化合物、部分或基團。藥物部分可藉由包括(但不限於)微管蛋白結合、DNA結合或插入及抑制RNA聚合酶、蛋白質合成及/或拓撲異構酶來賦予其細胞毒性及細胞生長抑制作用。示例性藥物部分包括(但不限於)類美登素、海兔毒素、阿瑞他汀、卡奇黴素、吡咯并苯并二氮呯(PBD)、奈莫柔比星及其衍生物、PNU-159682、蒽環黴素(anthracycline)、倍癌黴素、長春花生物鹼、紫杉烷、單端孢黴烯族毒素、CC1065、喜樹鹼(camptothecin)、依利奈法 德(elinafide)及具有細胞毒活性之其立體異構體、電子等排體、類似物及衍生物。此類免疫結合物之非限制性實例進一步詳細論述於下文中。
1. 示例性抗體-藥物結合物
抗體-藥物結合物(ADC)化合物之一示例性實施例包含靶向腫瘤細胞之抗體(Ab)、藥物部分(D)及附接Ab與D之連接子部分(L)。在一些實施例中，抗體經由一或多個胺基酸殘基，諸如離胺酸及/或半胱胺酸附接於連接子部分(L)。
一示例性ADC具有式I：Ab-(L-D)p I
其中p為1至約20。在一些實施例中，可結合於抗體之藥物部分的數目由游離半胱胺酸殘基之數目限制。在一些實施例中，游離半胱胺酸殘基藉由本文所描述之方法引入抗體胺基酸序列中。示例性式I之ADC包括(但不限於)具有1、2、3或4個工程改造半胱胺酸胺基酸的抗體(Lyon,R.等人(2012)Methods in Enzym.502：123-138)。在一些實施例中，一或多個游離半胱胺酸殘基不使用工程改造已存在於抗體中，在此情況下現有游離半胱胺酸殘基可用於將抗體結合於藥物。在一些實施例中，抗體在抗體結合前暴露於還原條件以產生一或多個游離半胱胺酸殘基。
a)示例性連接子
「連接子」(L)為可用於連接一或多個藥物部分(D)於抗體(Ab)以形成式I之抗體-藥物結合物(ADC)的雙官能或多官能部分。在一些實施例中，抗體-藥物結合物(ADC)可使用具有用於共價附接於藥物及抗體之反應性官能基之連接子製備。舉例而言，在一些實施例中，抗體(Ab)之半胱胺酸硫醇可與連接子或藥物-連接子中間物之反應性官能基形成一鍵以製備ADC。
在一個態樣中，連接子具有能夠與抗體上存在之游離半胱胺酸反應形成共價鍵的官能基。非限制性示例性此類反應性官能基包括順丁烯二醯亞胺、鹵乙醯胺、α-鹵乙醯基、活化酯(諸如丁二醯亞胺酯、4-硝基苯基酯、五氟苯基酯、四氟苯基酯)、酸酐、酸氯化物、磺醯基氯、異氰酸酯及異硫氰酸酯。參見例如Klussman等人(2004),Bioconjugate Chemistry 15(4)：765-773第766頁之結合方法，及其中之實例。
在一些實施例中，連接子具有能夠使抗體上存在之親電子基團反應的官能基。示例性此類親電子基團包括(但不限於)醛及酮羰基。在一些實施例中，連接子之反應性官能基之雜原子可與抗體上之親電子基團反應且形成與抗體之共價鍵。非限制性示例性此類反應性官能基包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼。
連接子可包含一或多種連接子組分。示例性連接子組分包括6-順丁烯二醯亞胺基己醯基(「MC」)、順丁烯二醯亞胺基丙醯基(「MP」)、纈胺酸-瓜胺酸(「val-cit」或「vc」)、丙胺酸-苯丙胺酸(「ala-phe」)、對胺基苯甲氧基羰基(「PAB」)、4-(2-吡啶基硫基)戊酸N-丁二醯亞胺基酯(「SPP」)及環己烷-1-甲酸4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)酯(「MCC」)。各種連接子組分為此項技術中已知，其中一些在下文中描述。
連接子可為「可裂解連接子」，促進藥物之釋放。非限制性示例性可裂解連接子包括酸不穩定連接子(例如包含腙)、蛋白酶敏感性(例如肽酶敏感性)連接子、光不穩定連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Research 52：127-131(1992)；US 5208020)。
在某些實施例中，連接子具有下式II：-Aa-Ww-Yy- II
其中A為「延伸子單元」，且a為0至1之整數；W為「胺基酸單元」，且w為0至12之整數；Y為「間隔子單元」，且y為0、1或2；且Ab、D及p如上文針對式I所定義。此類連接子之示例性實施例描述於明確地以引用的方式併入本文中之美國專利第7,498,298號中。
在一些實施例中，連接子組分包含將抗體連接於另一連接子組分或藥物部分之「延伸子單元」。非限制性示例性延伸子單元展示如下(其中波形線指示共價連接於抗體、藥物或其他連接子組分之位點)：
在一些實施例中，連接子可為肽模擬連接子，諸如WO2015/095227、WO2015/095124或WO2015/095223中描述之肽模擬連接子，該等文獻以全文引用的方式併入本文中。
在一些實施例中，連接子組分包含「胺基酸單元」。在一些此類實施例中，胺基酸單元允許連接子藉由蛋白酶裂解，藉此促進藥物在暴露於胞內蛋白酶，諸如溶酶體酶時自免疫結合物釋放(Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784)。示例性胺基酸單元包括(但不限於)二肽、三肽、四肽及五肽。示例性二肽包括(但不限於)纈胺酸- 瓜胺酸(vc或val-cit)、丙胺酸-苯丙胺酸(af或ala-phe)；苯丙胺酸-離胺酸(fk或phe-lys)；苯丙胺酸-高離胺酸(phe-高lys)；及N-甲基-纈胺酸-瓜胺酸(Me-val-cit)。示例性三肽包括(但不限於)甘胺酸-纈胺酸-瓜胺酸(gly-val-cit)及甘胺酸-甘胺酸-甘胺酸(gly-gly-gly)。胺基酸單元可包含天然存在之胺基酸殘基及/或次要胺基酸及/或非天然存在之胺基酸類似物，諸如瓜胺酸。胺基酸單元可針對藉由特定酶，例如腫瘤相關蛋白酶、組織蛋白酶B、C及D或纖維蛋白溶酶蛋白酶之酶裂解進行設計且最佳化。
在一些實施例中，連接子組分包含將抗體直接或經由延伸子單元及/或胺基酸單元連接於藥物部分的「間隔子單元」。間隔子單元可為「自分解型」或「非自分解型」。「非自分解型」間隔子單元為在ADC裂解時部分或所有間隔子單元仍然結合於藥物部分之間隔子單元。非自分解型間隔子單元之實例包括(但不限於)甘胺酸間隔子單元及甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。在一些實施例中，含有甘胺酸-甘胺酸間隔子單元之ADC藉由腫瘤細胞相關蛋白酶進行酶裂解，使得甘胺酸-甘胺酸-藥物部分自ADC之其餘部分釋放。在一些此類實施例中，甘胺酸-甘胺酸-藥物部分在腫瘤細胞中進行水解步驟，因此自藥物部分裂解甘胺酸-甘胺酸間隔子單元。
「自分解型」間隔子單元允許釋放藥物部分。在某些實施例中，連接子之間隔子單元包含對胺基苯甲基單元。在一些此類實施例中，對胺基苯甲基醇經由醯胺鍵附接於胺基酸單元，且在苯甲醇與藥物之間製得胺基甲酸酯、甲基胺基甲酸酯或碳酸酯(Hamann等人(2005)Expert Opin.Ther.Patents(2005)15：1087-1103)。在一些實施例中，間隔子單元為對胺基苯甲氧基羰基(PAB)。在一些實施例中，包含自分解型連接子之ADC具有以下結構：
其中Q為-C1-C8烷基、-O-(C1-C8烷基)、-鹵素、-硝基或-氰基；m為在0至4範圍內之整數；且p在1至約20範圍內。在一些實施例中，p在1至10、1至7、1至5或1至4範圍內。
自分解型間隔基之其他實例包括(但不限於)電子上類似於PAB基團之芳族化合物，諸如2-胺基咪唑-5-甲醇衍生物(美國專利第7,375,078號；Hay等人(1999)Bioorg.Med.Chem.Lett.9：2237)及鄰或對胺基苯甲基乙醛。在一些實施例中，可使用在醯胺鍵水解時進行環化之間隔子，諸如經取代及未經取代之4-胺基丁醯胺(Rodrigues等人(1995)Chemistry Biology 2：223)、適當經取代之雙環[2.2.1]及雙環[2.2.2]環系統(Storm等人(1972)J.Amer.Chem.Soc.94：5815)及2-胺基苯基丙醯胺(Amsberry等人(1990)J.Org.Chem.55：5867)。藥物與甘胺酸殘基之α-碳的連接為適用於ADC之自分解型間隔子的另一實例(Kingsbury等人(1984)J.Med.Chem.27：1447)。
在一些實施例中，連接子L可為用於經由分支之多官能連接子部分共價連接一個以上藥物部分於抗體的樹突型連接子(Sun等人(2002)Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 12：2213-2215；Sun等人(2003)Bioorganic & Medicinal Chemistry 11：1761-1768)。樹突狀連接子可增加藥物與抗體之莫耳比，亦即負載，其與ADC效能有關。因此，在抗體僅僅載有一個反應性半胱胺酸硫醇基之情況下，可經由樹突狀連接子附接多個藥物部分。
下文展示在式I之ADC之情況下非限制性示例性連接子：
其他非限制性示例性ADC包括如下結構： 其中X為： Y為： 各R獨立地為H或C1-C6烷基；且n為1至12。
通常，肽型連接子可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。例如根據液相合成方法可製備此類肽鍵(例如E.Schröder及K.Lübke(1965)「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，Academic Press)。
在一些實施例中，連接子經調節溶解性及/或反應性之基團取代。作為一非限制性實例，諸如磺酸根(-SO3 -)或銨之帶電取代基可增加連接子試劑之水溶性且促進連接子試劑與抗體及/或藥物部分之偶合反應，或促進Ab-L(抗體-連接子中間物)與D或D-L(藥物-連接子中間物)與Ab之偶合反應，視用於製備ADC之合成途徑而定。在一些實施例中，一部分連接子與抗體偶合且一部分連接子與藥物偶合，且接著Ab-(連接子部分)a與藥物-(連接子部分)b偶合以形成式I之ADC。在一些此類實施例中，抗體包含一個以上(連接子部分)a取代基，使得在式I之ADC中一個以上藥物與抗體偶合。
本發明之化合物明確涵蓋(但不限於)用以下連接子試劑製備之ADC：雙-順丁烯二醯亞胺基-三氧基乙二醇(BMPEO)、N-(β-順丁烯二醯亞胺基丙基氧基)-N-羥基丁二醯亞胺酯(BMPS)、N-(ε-順丁烯二醯亞胺基己醯基氧基)丁二醯亞胺酯(EMCS)、N-[γ-順丁烯二醯亞胺基丁醯基氧基]丁二醯亞胺酯(GMBS)、1,6-己烷-雙-乙烯基碸(HBVS)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-羧基-(6-醯胺基己酸)丁二醯亞胺基酯(LC-SMCC)、間順丁烯二醯亞胺基苯甲醯基-N-羥基丁二醯亞胺 酯(MBS)、4-(4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基)丁醯肼(MPBH)、3-(溴乙醯胺基)丙酸丁二醯亞胺酯(SBAP)、碘乙酸丁二醯亞胺酯(SIA)、(4-碘乙醯基)胺基苯甲酸丁二醯亞胺酯(SIAB)、N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫基)丙酸酯(SPDP)、N-丁二醯亞胺基-4-(2-吡啶基硫基)戊酸酯(SPP)、4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸丁二醯亞胺酯(SMCC)、4-(對順丁烯二醯亞胺基苯基)丁酸丁二醯亞胺酯(SMPB)、6-[(β-順丁烯二醯亞胺基丙醯胺基)己酸丁二醯亞胺酯](SMPH)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、磺酸基-EMCS、磺酸基-GMBS、磺酸基-KMUS、磺酸基-MBS、磺酸基-SIAB、磺酸基-SMCC及磺酸基-SMPB以及丁二醯亞胺基-(4-乙烯基碸)苯甲酸酯(SVSB)，且包括雙-順丁烯二醯亞胺基試劑：二硫基雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(DTME)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基丁烷(BMB)、1,4-雙順丁烯二醯亞胺基-2,3-二羥基丁烷(BMDB)、雙順丁烯二醯亞胺基己烷(BMH)、雙順丁烯二醯亞胺基乙烷(BMOE)、BM(PEG)2(下文展示)及BM(PEG)3(下文展示)；醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如二亞胺代己二酸二甲酯HCl)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯基)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯基)-乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。在一些實施例中，雙順丁烯二醯亞胺試劑允許抗體中半胱胺酸之硫醇基附接於含硫醇之藥物部分、連接子或連接子-藥物中間物。與硫醇基反應之其他官能基包括(但不限於)碘乙醯胺、溴乙醯胺、乙烯基吡啶、二硫鍵、吡啶基二硫鍵、異氰酸酯及異硫氰酸酯。
某些適用之連接子試劑可自各種商業來源獲得，諸如Pierce Biotechnology,Inc.(Rockford,IL)、Molecular Biosciences Inc.(Boulder,CO)，或根據此項技術中描述之程序合成；例如Toki等人(2002)J.Org.Chem.67：1866-1872；Dubowchik等人(1997)Tetrahedron Letters,38：5257-60；Walker,M.A.(1995)J.Org.Chem.60：5352-5355；Frisch等人(1996)Bioconjugate Chem.7：180-186；US 6214345；WO 02/088172；US 2003130189；US2003096743；WO 03/026577；WO 03/043583；及WO 04/032828。
碳14標記之1-異硫氰基苯甲基-3-甲基二伸乙三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於將放射性核苷酸結合於抗體之示例性螯合劑。參見例如WO94/11026。
b)示例性藥物部分
(1)美登素及類美登素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個類美登素分子之抗體。類美登素為美登素之衍生物，且為藉由抑制微管蛋白聚合而起作用之有絲分裂抑制劑。美登素首次係自東非灌木齒葉美登木(Maytenus serrata)分離而得(美國專利第3896111號)。隨後，發現某些微生物亦產生類美登素，諸如美登醇及C-3美登醇酯(美國專利第4,151,042號)。合成類美登素揭示於例如美國專利第4,137,230號；第4,248,870號；第4,256,746號；第4,260,608號；第4,265,814號；第4,294,757號；第4,307,016號；第4,308,268號；第4,308,269號；第4,309,428號；第4,313,946號；第4,315,929號；第4,317,821號；第 4,322,348號；第4,331,598號；第4,361,650號；第4,364,866號；第4,424,219號；第4,450,254號；第4,362,663號；及第4,371,533號。
類美登素藥物部分為抗體-藥物結合物中具有吸引力之藥物部分，因為其：(i)藉由醱酵或醱酵產物之化學改質或衍生，相對易於製備；(ii)易由適合於經由非二硫化物連接子結合於抗體的官能基衍生；(iii)在血漿中穩定；及(iv)有效針對多種腫瘤細胞株。
適用作類美登素藥物部分之某些類美登素為此項技術中已知，且可自天然來源根據已知方法分離，或使用基因工程改造技術產生(參見例如Yu等人(2002)PNAS 99：7968-7973)。類美登素亦可根據已知方法以合成方式製備。
示例性類美登素藥物部分包括(但不限於)具有經改質之芳環的類美登素，諸如：C-19-去氯(美國專利第4256746號)(例如藉由氫化鋰鋁還原安莎黴素P2製備)；C-20-羥基(或C-20-去甲基)+/-C-19-去氯(美國專利第4361650號及第4307016號)(例如藉由使用鏈黴菌或放線菌去甲基化或使用LAH去氯來製備)；及C-20-去甲氧基、C-20-醯氧基(-OCOR)、+/-去氯(美國專利第4,294,757號)(例如藉由使用醯基氯醯化來製備)及在芳環其他位置具有改質之類美登素。
示例性類美登素藥物部分亦包括具有諸如以下修飾之類美登素：C-9-SH(美國專利第4424219號)(例如藉由美登醇與H2S或P2S5反應製備)；C-14-烷氧基甲基(去甲氧基/CH2 OR)(US 4331598)；C-14-羥基甲基或醯氧基甲基(CH2OH或CH2OAc)(美國專利第4450254號)(例如由諾卡菌屬(Nocardia)製備)；C-15-羥基/醯氧基(US 4364866)(例如藉由鏈黴菌轉化美登醇製備)；C-15-甲氧基(美國專利第4313946號及第4315929號)(例如自滑桃樹屬(Trewia nudlflora)製備)；C-18-N-去甲基(美國專利第4362663號及第4322348號)(例如藉由美登醇由鏈黴菌去甲基化製備)；及4,5-去氧基(US 4371533)(例如藉由三氯化鈦/LAH 還原美登醇製備)。
類美登素化合物上之許多位置適用作連接位置。舉例而言，酯鍵可藉由使用習知偶合技術與羥基反應形成。在一些實施例中，反應可在具有羥基之C-3位置、經羥基甲基修飾之C-14位置、經羥基修飾之C-15位置及具有羥基之C-20位置發生。在一些實施例中，鍵在美登醇或美登醇類似物之C-3位置形成。
類美登素藥物部分包括具有以下結構之類美登素藥物部分：
其中波形線指示類美登素藥物部分之硫原子共價附接於ADC之連接子。各R可獨立地為H或C1-C6烷基。將醯胺基附接於硫原子之伸烷基鏈可為甲基、乙基或丙基，亦即m為1、2或3(US 633410；US 5208020；Chari等人(1992)Cancer Res.52：127-131；Liu等人(1996)Proc.Natl.Acad.Sci USA 93：8618-8623)。
本發明之ADC涵蓋類美登素藥物部分之所有立體異構體，亦即對掌性碳R及S組態之任何組合(US 7276497；US 6913748；US 6441163；US 633410(RE39151)；US 5208020；Widdison等人(2006)J.Med.Chem.49：4392-4408，以全文引用的方式併入本文中)。在一些實施例中，類美登素藥物部分具有以下立體化學：
類美登素藥物部分之示例性實施例包括(但不限於)DM1；DM3；及DM4，具有以下結構：
其中波形線指示藥物之硫原子共價連接於抗體-藥物結合物之連接子(L)。
其他示例性類美登素抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫(其中Ab為抗體且p為1至約20。在一些實施例中，p在1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4)：
其中DM1經由BMPEO連接子連接於抗體之硫醇基的示例性抗體-藥物結合物具有以下結構及縮寫：
其中Ab為抗體；n為0、1或2；且p為1至約20。在一些實施例中，p在1至10，p為1至7，p為1至5，或p為1至4。
含有類美登素之免疫結合物、其製備方法及其治療用途例如揭示於美國專利第5,208,020號及第5,416,064號、US 2005/0276812 A1及歐洲專利EP 0 425 235 B1(揭示內容以引用的方式明確併入本文中)中。亦參見Liu等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)；及Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992)。
在一些實施例中，抗體-類美登素結合物可藉由化學連接抗體於類美登素分子來製備，不顯著降低抗體或類美登素分子之生物活性。參見例如美國專利第5,208,020號(揭示內容以引用的方式明確併入本 文中)。在一些實施例中，每個抗體分子平均結合3-4個類美登素分子之ADC已展示增強標靶細胞之細胞毒性的功效，不負面影響抗體之功能或溶解性。在一些情況下，即使一個分子毒素/抗體亦預期與使用裸抗體相比，增強細胞毒性。
用於製備抗體-類美登素結合物之示例性連接基團包括例如本文中描述之連接基團及以下中揭示之連接基團：美國專利第5208020號；EP專利0 425 235 B1；Chari等人Cancer Research 52：127-131(1992)；US 2005/0276812 A1；及US 2005/016993 A1，揭示內容以引用的方式明確併入本文中。
(2)阿瑞他汀及海兔毒素
藥物部分包括海兔毒素、阿瑞他汀及其類似物及衍生物(US 5635483；US 5780588；US 5767237；US 6124431)。阿瑞他汀為海洋軟體動物化合物海兔毒素-10之衍生物。雖然不欲受任何特定理論束縛，但海兔毒素及阿瑞他汀已展示干擾微管動力學、GTP水解及核及細胞分裂(Woyke等人(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12)：3580-3584)且具有抗癌(US 5663149)及抗真菌活性(Pettit等人(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42：2961-2965)。海兔毒素/阿瑞他汀藥物部分可經由肽藥物部分之N(胺基)端或C(羧基)端附接於抗體(WO 02/088172；Doronina等人(2003)Nature Biotechnology 21(7)：778-784；Francisco等人(2003)Blood 102(4)：1458-1465)。
示例性阿瑞他汀實施例包括N端連接之單甲基阿瑞他汀藥物部分DE及DF，揭示於US 7498298及US 7659241(揭示內容以全文引用之方式明確併入)中：
其中DE及DF之波形線指示共價連接於抗體或抗體-連接子組分之位點，且在各位置獨立地：R2係選自H及C1-C8烷基；R3係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R4係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；R5係選自H及甲基；或R4及R5共同形成碳環且具有式-(CRaRb)n-，其中Ra及Rb獨立地選自H、C1-C8烷基及C3-C8碳環且n係選自2、3、4、5及6；R6係選自H及C1-C8烷基；R7係選自H、C1-C8烷基、C3-C8碳環、芳基、C1-C8烷基-芳基、C1-C8烷基-(C3-C8碳環)、C3-C8雜環及C1-C8烷基-(C3-C8雜環)；各R8獨立地選自H、OH、C1-C8烷基、C3-C8碳環及O-(C1-C8烷基)；R9係選自H及C1-C8烷基；R10係選自芳基或C3-C8雜環；Z為O、S、NH或NR12，其中R12為C1-C8烷基；R11係選自H、C1-C20烷基、芳基、C3-C8雜環、-(R13O)m-R14或-(R13O)m-CH(R15)2；m為在1-1000範圍內之整數；R13為C2-C8烷基； R14為H或C1-C8烷基；R15每次出現時獨立地為H、COOH、-(CH2)n-N(R16)2、-(CH2)n-SO3H或-(CH2)n-SO3-C1-C8烷基；R16每次出現時獨立地為H、C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH；R18係選自-C(R8)2-C(R8)2-芳基、-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8雜環)及-C(R8)2-C(R8)2-(C3-C8碳環)；且n為在0至6範圍內之整數。
在一個實施例中，R3、R4及R7獨立地為異丙基或第二丁基且R5為-H或甲基。在一示例性實施例中，R3及R4各為異丙基，R5為-H，且R7為第二丁基。
在另一實施例中，R2及R6各為甲基，且R9為-H。
在另一實施例中，每次出現時R8為-OCH3。
在一示例性實施例中，R3及R4各為異丙基，R2及R6各為甲基，R5為-H，R7為第二丁基，R8每次出現時為-OCH3，且R9為-H。
在一個實施例中，Z為-O-或-NH-。
在一個實施例中，R10為芳基。
在一示例性實施例中，R10為-苯基。
在一示例性實施例中，當Z為-O-時，R11為-H、甲基或第三丁基。
在一個實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-N(R16)2，且R16為-C1-C8烷基或-(CH2)n-COOH。
在另一個實施例中，當Z為-NH時，R11為-CH(R15)2，其中R15為-(CH2)n-SO3H。
式DE之一示例性阿瑞他汀實施例為MMAE，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價附接：
式DF之一示例性阿瑞他汀實施例為MMAF，其中波形線指示與抗體-藥物結合物之連接子(L)的共價附接：
其他示例性實施例包括在五肽阿瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸羧基修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008848)及在五肽阿瑞他汀藥物部分之C端具有苯丙胺酸側鏈修飾之單甲基纈胺酸化合物(WO 2007/008603)。
包含MMAE或MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性示例性實施例具有以下結構及縮寫(其中「Ab」為抗體；p為1至約8，「Val-Cit」為纈胺酸-瓜胺酸二肽；且「S」為硫原子：
Ab-MC-vc-PAB-MMAF
Ab-MC-vc-PAB-MMAE
Ab-MC-MMAE
Ab-MC-MMAF
包含MMAF及各種連接子組分之式I之ADC的非限制性示例性實施例進一步包括Ab-MC-PAB-MMAF及Ab-PAB-MMAF。包含藉由非蛋白分解可裂解之連接子附接於抗體之MMAF的免疫結合物已展示具有與包含藉由蛋白分解可裂解連接子附接於抗體之MMAF的免疫結合物相當之活性(Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124)。在一些此類實施例中，咸信藥物釋放由抗體在細胞中降解來實現。
通常，基於肽之藥物部分可藉由在兩個或兩個以上胺基酸及/或肽片段之間形成肽鍵來製備。例如根據液相合成方法可製備此類肽鍵(參見例如E.Schröder及K.Lübke,「The Peptides」，第1卷，第76-136頁，1965,Academic Press)。在一些實施例中，阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分可根據以下之方法製備：US 7498298；US 5635483；US 5780588；Pettit等人(1989)J.Am.Chem.Soc.111：5463-5465；Pettit等人(1998)Anti-Cancer Drug Design 13：243-277；Pettit,G.R.等人，Synthesis,1996,719-725；Pettit等人(1996)J.Chem.Soc.Perkin Trans.1 5：859-863；及Doronina(2003)Nat.Biotechnol.21(7)：778-784。
在一些實施例中，式DE(諸如MMAE)及DF(諸如MMAF)之阿瑞他汀/海兔毒素藥物部分及其藥物-連接子中間物及衍生物(諸如MC-MMAF、MC-MMAE、MC-vc-PAB-MMAF及MC-vc-PAB-MMAE)可使用US 7498298、Doronina等人(2006)Bioconjugate Chem.17：114-124及Doronina等人(2003)Nat.Biotech.21：778-784製備，且接著結合於相關抗體。
(3)卡奇黴素
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個卡奇黴素分子之抗體。抗生素之卡奇黴素家族及其類似物能夠在低於皮莫耳濃度下產生雙鏈DNA斷裂(Hinman等人，(1993)Cancer Research 53：3336-3342；Lode等人，(1998)Cancer Research 58：2925-2928)。卡奇黴素具有胞內作用位點，但在某些情況下，不容易跨過質膜。因此，在一些實施例中，此等藥劑經由抗體介導之內化的細胞吸收可大大增強其細胞毒性作用。製備具有卡奇黴素藥物部分之抗體-藥物結合物之非限制性示例性方法描述於例如US 5712374、US 5714586、US 5739116及US 5767285中。
在一些實施例中，結合於抗體之卡奇黴素藥物部分為具有下式之化合物：，其中X為Br或I；L為連接子；R為氫、C1-6烷基或-C(=O)C1-6烷基；且Ra為氫或C1-6烷基。
在一些實施例中，X為Br，Ra為氫且R為異丙基。
在其他實施例中，X為Br，Ra為氫且R為乙基。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為異丙基。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為乙基。
在一些實施例中，X為Br，Ra為氫且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為I，Ra為氫且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為I，Ra為乙基且R為-C(=O)CH3。
在其他實施例中，X為Br，Ra為乙基且R為-C(=O)CH3。
(4)吡咯并苯并二氮呯
在一些實施例中，ADC包含吡咯并苯并二氮呯(PBD)。在一些實施例中，PDB二聚體識別且結合於特定DNA序列。天然產物安麯黴素(一種PBD)於1965年首次報導(Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5793-5795；Leimgruber等人，(1965)J.Am.Chem.Soc.,87：5791-5793)。此後，已報導許多PBD，天然存在之PBD與類似物(Thurston等人，(1994)Chem.Rev.1994,433-465，包括三環PBD骨架之二聚體(US 6884799；US 7049311；US 7067511；US 7265105；US 7511032；US 7528126；US 7557099)。不欲受任何特定理論束縛，咸信二聚體結構用B形式DNA之小溝賦予適當等螺旋性三維形狀，使得在結合位點緊密貼合(Kohn,Antibiotics III.Springer-Verlag,New York,第3-11頁(1975)；Hurley及Needham-VanDevanter,(1986)Acc.Chem.Res.,19：230-237)。載有C2芳基取代基之二聚PBD化合物已展示適用作細胞毒性劑(Hartley等人(2010)Cancer Res.70(17)：6849-6858；Antonow(2010)J.Med.Chem.53(7)：2927-2941；Howard等人(2009)Bioorganic and Med.Chem.Letters 19(22)：6463-6466)。
在一些實施例中，PBD化合物可藉由在N10位置經活體內可移除之氮保護基保護而用作前藥(WO 00/12507；WO 2005/023814)。
PBD二聚體已結合於抗體且所得ADC展示具有抗癌特性(US 2010/0203007)。PBD二聚體上非限制性示例性連接位點包括五員吡咯環(PBD單元之間的繫栓子)及N10-C11亞胺基(WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598)。
ADC之非限制性示例性PBD二聚體組分具有式A：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示共價附接於連接子之位點；點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH；R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C1-12烷基、C3-8雜環基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子，例如O、S、N(H)、NMe及/或芳環，例如苯或吡啶，該等環視情況經取代；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
在一些實施例中，R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-12烷基、C3-20雜環及C5-20芳基，且視情況關於基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環。
在一些實施例中，R9及R19為H。
在一些實施例中，R6及R16為H。
在一些實施例中，R7為R17均為OR7A，其中R7A為視情況經取代之C1-4烷基。在一些實施例中，R7A為Me。在一些實施例中，R7A為Ch2Ph，其中Ph為苯基。
在一些實施例中，X為O。
在一些實施例中，R11為H。
在一些實施例中，各單體單元中C2與C3之間存在雙鍵。
在一些實施例中，R2及R12獨立地選自H及R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為R。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之C5-20芳基或C5-7芳基或C8-10芳基。在一些實施例中，R2及R12獨立地為視情況經取代之苯基、噻吩基、萘基、吡啶基、喹啉基或異喹啉基。在一些實施例中，R2及R12獨立地選自=O、=CH2、=CH-RD及=C(RD)2。在一些實施例中，R2及R12各為=CH2。在一些實施例中，R2及R12各為H。在一些實施例中，R2及R12各為=O。在一些實施例中，R2及R12各為=CF2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=C(RD)2。在一些實施例中，R2及/或R12獨立地為=CH-RD。
在一些實施例中，當R2及/或R12為=CH-RD時，各基團可獨立地具有下文所示之任一組態：
在一些實施例中，=CH-RD呈組態(I)。
在一些實施例中，R"為C3伸烷基或C5伸烷基。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(I)之 結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(II)之結構： 其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(III)之結構： 其中RE及RE"各獨立地選自H或RD，其中RD如上所定義；且 其中n為0或1。
在一些實施例中，n為0。在一些實施例中，n為1。在一些實施例中，RE及/或RE"為H。在一些實施例中，RE及RE"為H。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為視情況經取代之C1-12烷基。在一些實施例中，RE及/或RE"為RD，其中RD為甲基。
在一些實施例中，ADC之一示例性PBD二聚體組分具有式A(IV)之結構： 其中Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，ADC之示例性PBD二聚體組分具有式A(V)之結構： 其中Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之C5-20芳基；其中Ar1及Ar2可相同或不同；且其中n為0或1。
在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地選自視情況經取代之苯基、呋喃基、噻吩基及吡啶基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之苯基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之噻吩-2-基或噻吩-3-基。在一些實施例中，Ar1及Ar2各獨立地為視情況經取代之喹啉基或異喹啉基。喹啉基或異喹啉基可經由任何可用環位置結合於PBD核心。舉例而言，喹啉基可為喹啉-2-基、喹啉-3-基、喹啉-4-基、喹啉-5-基、喹啉-6-基、喹啉-7-基及喹啉-8-基。在一些實施例中，喹啉基係選自喹啉-3-基及喹啉-6-基。異喹啉基可為異喹啉-1-基、異喹啉-3-基、異喹啉-4-基、異喹啉-5-基、異喹啉-6-基、異喹啉-7-基及異喹啉-8-基。在一些實施例中，異喹啉基係選自異喹啉-3-基及異喹啉-6-基。
ADC之其他非限制性示例性PBD二聚體組分具有式B：
及其鹽及溶劑合物，其中：波形線指示共價附接於連接子之位點；連接於OH之波形線指示S或R組態；RV1及RV2獨立地選自H、甲基、乙基及苯基(該苯基可視情況經氟取代，尤其在4位置中)及C5-6雜環基；其中RV1及RV2可相同或不同；且n為0或1。
在一些實施例中，RV1及RV2獨立地選自H、苯基及4-氟苯基。
在一些實施例中，連接子可附接在PBD二聚體藥物部分之各種位點之一，包括B環之N10亞胺、C環之C-2內/外位置或連接A環之繫栓單元(參見以下結構C(I)及C(II))。
ADC之非限制性示例性PBD二聚體組分包括式C(I)及C(II)：
式C(I)及C(II)呈其N10-C11亞胺形式展示。示例性PBD藥物部分亦包括甲醇胺以及經保護之甲醇胺形式，如下表中所示：
其中：X為CH2(n=1至5)、N或O；Z及Z'獨立地選自OR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R1、R'1、R2及R'2各獨立地選自H、C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經取代之芳基)、C5-20雜芳基、-NH2、-NHMe、-OH及-SH，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R3及R'3獨立地選自H、OR、NHR及NR2，其中R為含有1至5個碳原子之一級、二級或三級烷基鏈；R4及R'4獨立地選自H、Me及OMe；R5係選自C1-C8烷基、C2-C8烯基、C2-C8炔基、C5-20芳基(包括經鹵基、硝基、氰基、烷氧基、烷基、雜環基取代之芳基)及C5-20雜芳基，其中在一些實施例中，烷基、烯基及炔基鏈包含至多5個碳原子；R11為H、C1-C8烷基或保護基(諸如乙醯基、三氟乙醯基、第三丁氧羰基(BOC)、苯甲基氧基羰基(CBZ)、9-茀基亞甲基氧基羰基(Fmoc)或包含自分解型單元之部分，諸如纈胺酸-瓜胺酸-PAB)；R12為H、C1-C8烷基或保護基；其中R1、R'1、R2、R'2、R5或R12中之一者之氫或A環之間的-OCH2CH2(X)nCH2CH2O-間隔子之氫經連接於ADC之連接子之鍵置換。
ADC之示例性PDB二聚體部分包括(但不限於)(波形線指示共價附接於連接子之位點)： 包含PBD二聚體之ADC之非限制性示例性實施例具有以下結構： PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab； PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab，其中：n為0至12。在一些實施例中，n為2至10。在一些實施例中，n為4至8。在一些實施例中，n係選自4、5、6、7及8。
在一些實施例中，包含本文中描述之PBD二聚體之ADC可藉由包括吡啶離去基之連接子-藥物中間物經由硫原子與抗體之半胱胺酸硫醇結合以形成雙硫鍵來製備。此外，在一些實施例中，包含本文中描 述之PBD二聚體之ADC可藉由結合包括硫基吡啶基之連接子-藥物中間物來製備，其中吡啶環經一或多個硝基取代。在一些實施例中，吡啶環經-NO2單取代。在一些實施例中，-NO2單取代相對於二硫鍵為對位。在一些實施例中，PBD二聚體經由N10位置連接。舉例而言，包含PBD二聚體之非限制性示例性ADC可藉由單甲基乙基吡啶基二硫化物、N10連接之PBD連接子中間物(以下展示)結合於抗體來製備：
在一些實施例中，結合以上N10連接之PBD連接子中間物產生如下文所示之單甲基二硫化物N10連接之PBD抗體-藥物結合物： 。參見例如PCT公開案第WO 2013/055987號。
PBD二聚體-val-cit-PAB-Ab及PBD二聚體-Phe-Lys-PAB-Ab之連接子為蛋白酶可裂解的，而PBD二聚體-順丁烯二醯亞胺-縮醛之連接子對酸為不穩定的。
PBD二聚體及包含PBD二聚體之ADC可根據此項技術中已知之方法製備。參見例如WO 2009/016516；US 2009/304710；US 2010/047257；US 2009/036431；US 2011/0256157；WO 2011/130598；WO 2013/055987。
(5)1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚體藥物部分
在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。DNA小溝烷基化劑之5-胺基-1-(氯甲基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚(胺基CBI)類別為有效細胞毒素(Atwell等人(1999)J.Med.Chem.,42：3400)，且已在設計用於癌症療法之許多類別前藥中用作效應單元。此等包括抗體結合物(Jeffrey等人(2005)J.Med.Chem.,48：1344)、基於胺基甲酸硝基苯甲酯之用於基因療法的前藥(Hay等人(2003)J.Med.Chem.46：2456)及呈低氧活化之前藥形式之對應硝基-CBI衍生物(Tercel等人(2011)Angew.Chem.,Int.Ed.,50：2606-2609)。CBI及吡咯并[2,1-c][1,4]苯并二氮呯(PBD)藥效團已藉由烷基鏈連接在一起(Tercel等人(2003)J.Med.Chem 46：2132-2151)。
在一些實施例中，ADC包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)二聚體(WO 2015/023355)。在一些此類實施例中，二聚體為其中二聚體之一半為CBI部分且二聚體之另一半為PBD部分的雜二聚體。
在一些實施例中，CBI二聚體包含下式： 其中：R1係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於連接子(L)之鍵；R2係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於連接子(L)之鍵；Ra及Rb獨立地選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基，或Ra及Rb形成五或六員雜環基； T為選自C3-C12伸烷基、Y、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C2-C6伸烯基)-Y-(C2-C6伸烯基)及(C2-C6伸炔基)-Y-(C2-C6伸炔基)之繫栓基團；其中Y獨立地選自O、S、NR1、芳基及雜芳基；其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6烷基取代，其中烷基視情況經一或多個F取代；或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經鍵結於L之鍵取代；D'為選自以下各者之藥物部分：
其中波形線指示與T之附接位點；X1及X2獨立地選自O及NR3，其中R3係選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基；R4為H、CO2R或鍵結於連接子(L)之鍵，其中R為C1-C6烷基或苯 甲基；且R5為H或C1-C6烷基。
ADC之示例性CBI二聚體部分包括(但不限於)以下CBI-PBD二聚體(波形線指示共價附接於連接子之位點)： ；及以下CBI-CBI二聚體：
包含CBI二聚體之ADC之非限制性示例性實施例具有以下結構： CBI-PBD-二硫化物-Ab；或 CBI-PBD(哌嗪-胺基甲酸酯前藥)-二硫化物-Ab； CBI-PBD(磷酸酯)-二硫化物-Ab；及 CBI-CBI(磷酸酯)-縮醛-順丁烯二醯亞胺-Ab。
(6)蒽環黴素
在一些實施例中，ADC包含蒽環黴素。蒽環黴素為顯示細胞毒活性之抗生素化合物。雖然不欲受任何特定理論束縛，但研究已指示蒽環黴素可藉由許多不同機制用以殺死細胞，包括：1)藥物分子插入細胞DNA中，藉此抑制DNA依賴性核酸合成；2)藉由藥物產生自由基，接著自由基與細胞大分子反應，對細胞造成損害，及/或3)藥物分子與細胞膜相互作用(參見例如C.Peterson等人，「Transport And Storage Of Anthracycline In Experimental Systems And Human Leukemia」,Anthracycline Antibiotics In Cancer Therapy；N.R.Bachur,「Free Radical Damage」同上第97-102頁)。因為具有細胞毒性潛能，所以蒽環黴素已用於治療大量癌症，諸如白血病、乳癌、肺癌、卵巢腺癌及肉瘤(參見例如P.H- Wiernik,Anthracycline：Current Status And New Developments第11頁)。
非限制性示例性蒽環黴素包括小紅莓、表柔比星、艾達黴素、道諾黴素、奈莫柔比星及其衍生物。已製備及研究道諾黴素及小紅莓之免疫結合物及前藥(Kratz等人(2006)Current Med.Chem.13：477-523；Jeffrey等人(2006)Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362；Torgov等人(2005)Bioconj.Chem.16：717-721；Nagy等人(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834；Dubowchik等人(2002)Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532；King等人(2002)J.Med.Chem.45：4336-4343；EP 0328147；US 6630579)。抗體-藥物結合物BR96-小紅莓與腫瘤相關抗原路易斯-Y(Lewis-Y)特異性反應且已在I及II階段研究中評估(Saleh等人(2000)J.Clin.Oncology 18：2282-2292；Ajani等人(2000)Cancer Jour.6：78-81；Tolcher等人(1999)J.Clin.Oncology 17：478-484)。
PNU-159682為奈莫柔比星之有效代謝物(或衍生物)(Quintieri等人(2005)Clinical Cancer Research 11(4)：1608-1617)。奈莫柔比星為在小紅莓之糖苷胺基上具有2-甲氧基嗎啉基之小紅莓半合成類似物，且已處於臨床評定下(Grandi等人(1990)Cancer Treat.Rev.17：133；Ripamonti等人(1992)Brit.J.Cancer 65：703)，包括針對肝細胞癌之階段II/III試驗(Sun等人(2003)Proceedings of the American Society for Clinical Oncology 22,Abs1448；Quintieri(2003)Proceedings of the American Association of Cancer Research ，第44：1版，Abs 4649；Pacciarini等人(2006)Jour.Clin.Oncology 24：14116)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之一非限制性示例性ADC展示於式Ia中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基，且R2為C1-C5烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽；L1及Z一起為如本文所述之連接子(L)；T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
包含奈莫柔比星或奈莫柔比星衍生物之另一非限制性示例性ADC展示於式Ib中：
其中R1為氫原子、羥基或甲氧基，且R2為C1-C5烷氧基，或其醫藥學上可接受之鹽；L2及Z一起為如本文所述之連接子(L)；T為如本文所述之抗體(Ab)；且m為1至約20。在一些實施例中，m為1至10、1至7、1至5或1至4。
在一些實施例中，R1及R2均為甲氧基(-OMe)。
在一些實施例中，含奈莫柔比星之ADC之奈莫柔比星組分為PNU-159682。在一些此類實施例中，ADC之藥物部分可具有以下結構之一： 其中波形線指示連接於連接子(L)。
包括PNU-159682之蒽環黴素可經由若干連接位點及多種連接子結合於抗體(US 2011/0076287；WO2009/099741；US 2010/0034837；WO 2010/009124)，包括本文中描述之連接子。
包含奈莫柔比星及連接子之示例性ADC包括(但不限於)： PNU-159682順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab； PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab，其中：R1及R2獨立地選自H及C1-C6烷基；且PNU-159682-順丁烯二醯亞胺-Ab。
PNU-159682順丁烯二醯亞胺縮醛-Ab之連接子對酸為不穩定的，而PNU-159682-val-cit-PAB-Ab,PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子-Ab及PNU-159682-val-cit-PAB-間隔子(R1R2)-Ab為蛋白酶可裂解的。
(7)毒傘毒素(Amatoxin)
在一些實施例中，免疫結合物包含結合於一或多個毒傘毒素分子之抗體。毒傘毒素為由8個胺基酸構成之環狀肽。其可自條蕈(Amanita phalloides)蘑菇中分離或以合成方式製備。毒傘毒素特異性抑制哺乳動物細胞之DNA依賴性RNA聚合酶II，且藉此亦抑制所影響細胞之轉錄及蛋白質生物合成。細胞中轉錄之抑制引起生長及增殖停止。參見例如Moldenhauer等人JNCI 104：1-13(2012)、VO2010115629、WO2012041504、WO2012119787、WO2014043403、WO2014135282及WO2012119787，其以全文引用的方式併入本文中。在一些實施例中，一或多個毒傘毒素分子為一或多個α-瓢菌素分子。
(8)其他藥物部分
藥物部分亦包括格爾德黴素(geldanamycin)(Mandler等人(2000)J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581；Mandler等人(2000)Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028；Mandler等人(2002)Bioconjugate Chem.13：786-791)；及酶活性毒素及其片段，包括(但不限於)白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(來自綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、篦麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素A鏈、α-帚麴菌素、油桐(Aleurites fordii)蛋白、康乃馨蛋白、美洲商陸(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制劑、麻瘋樹毒蛋白、巴豆毒素、肥皂草抑制劑、白樹素、有絲分裂素、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素(enomycin)及黴菌毒素(tricothecene)。參見例如WO 93/21232。
藥物部分亦包括具有溶核活性之化合物(例如核糖核酸酶或DNA核酸內切酶)。
在某些實施例中，免疫結合物可包含高度放射性原子。多種放射性同位素可用於產生放射性結合之抗體。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。在一些實施例中，當免疫結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍攝影研究之放射性原子，例如TC99m或I123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱磁共振成像，MRI)之自旋標記物，諸如鋯-89、碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。鋯-89可與各種金屬螯合劑錯合且結合於抗體，例如用於PET成像(WO 2011/056983)。
放射性或其他標記可以已知方式併入免疫結合物中。舉例而言，肽可使用包含例如一或多個氟-19原子代替一或多個氫之適合胺基酸前驅物生物合成或化學合成。在一些實施例中，諸如Tc99、I123、Re186、Re188及In111之標記可經由抗體中之半胱胺酸殘基附接。在一些 實施例中，釔-90可經由抗體之離胺酸殘基附接。在一些實施例中，IODOGEN方法(Fraker等人(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57)可用於併入碘-123。「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal,CRC Press 1989)描述某些其他方法。
在某些實施例中，免疫結合物可包含結合於前藥活化酶之抗體。在一些此類實施例中，前藥活化酶將前藥(例如肽基化學治療劑，參見WO 81/01145)轉化為活性藥物，諸如抗癌藥物。在一些實施例中，此類免疫結合物適用於抗體依賴性酶介導之前藥療法(「ADEPT」)。可結合於抗體之酶包括(但不限於)鹼性磷酸酶，其適用於將含磷酸酯基之前藥轉變成游離藥物；芳基硫酸酯酶，其適用於將含硫酸酯基之前藥轉變成游離藥物；胞嘧啶去胺酶，其適用於將無毒5-氟胞嘧啶轉變成抗癌藥物5-氟尿嘧啶；蛋白酶，諸如沙雷菌屬蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶、枯草桿菌蛋白酶、羧基肽酶及組織蛋白酶(諸如組織蛋白酶B及L)，其適用於將含肽前藥轉變成游離藥物；D-丙胺醯基羧基肽酶，其適用於轉變含有D-胺基酸取代基之前藥；碳水化合物裂解酶，諸如β-半乳糖苷酶及神經胺酸苷酶，其適用於將糖基化前藥轉變成游離藥物；β-內醯胺酶，其適用於將經β-內醯胺衍生之藥物轉變成游離藥物；以及青黴素醯胺酶，諸如青黴素V醯胺酶及青黴素G醯胺酶，其適用於將分別在胺氮經苯氧基乙醯基或苯乙基衍生之藥物轉變成游離藥物。在一些實施例中，酶可藉由此項技術中熟知之重組DNA技術共價結合於抗體。參見例如Neuberger等人，Nature 312：604-608(1984)。
c)藥物負載
藥物負載由p表示，為式I之分子中每個抗體之藥物部分之平均數目。藥物負載可在每個抗體1至20個藥物部分(D)之範圍內。式I之ADC包括與1至20個之範圍的藥物部分結合之抗體的集合。在由結合 反應製備ADC時，每個抗體之藥物部分之平均數目可藉由諸如質譜分析、ELISA分析及HPLC之習知方式表徵。亦可測定就p而言之ADC之定量分佈。在一些情況下，可藉由諸如逆相HPLC或電泳之方式來實現其中p為來自具有其他藥物負載之ADC之一定值的均質ADC之分離、純化及表徵。
對於一些抗體-藥物結合物，p可受抗體上之附著位點之數目限制。舉例而言，在附接為半胱胺酸硫醇之情況下，如在以上某些示例性實施例中，抗體可僅僅具有一個或若干個半胱胺酸硫醇基，或可僅僅具有一個或若干個可附接連接子之足夠反應性硫醇基。在某些實施例中，較高藥物負載(例如p>5)可造成某些抗體-藥物結合物之凝聚、不可溶性、毒性或細胞滲透性喪失。在某些實施例中，ADC之平均藥物負載在1至約8、約2至約6或約3至約5之範圍內。實際上，已展示對於某些ADC而言，每個抗體之藥物部分的最佳比率可小於8，且可為約2至約5(US 7498298)。
在某些實施例中，在結合反應期間使少於理論最大值之藥物部分結合於抗體。抗體可含有例如不與藥物-連接子中間產物或連接子試劑反應的離胺酸殘基，如下文所論述。一般而言，抗體不含許多可連接於藥物部分之游離及反應性半胱胺酸硫醇基；實際上抗體中之大部分半胱胺酸硫醇殘基以二硫橋鍵之形式存在。在某些實施例中，抗體可用諸如二硫蘇糖醇(DTT)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑在部分或完全還原條件下還原，產生反應性半胱胺酸硫醇基。在某些實施例中，抗體經受變性條件，展現反應性親核基團，諸如離胺酸或半胱胺酸。
ADC之負載(藥物/抗體比率)可用不同方式控制，且例如藉由如下來控制：(i)限制藥物-連接子中間物或連接子試劑相對於抗體之莫耳過量；(ii)限制結合反應時間或溫度；及(iii)針對半胱胺酸硫醇修飾 之部分或限制性還原條件。
應瞭解在一個以上親核基團與藥物-連接子中間物或連接子試劑反應之情況下，所得產物為具有一或多個藥物部分附接於抗體之分佈的ADC化合物之混合物。每個抗體之藥物之平均數目(藥物-抗體比率或DAR)可藉由雙重ELISA抗體分析自混合物計算，該分析對抗體具有特異性且對藥物具有特異性。個別ADC分子可在混合物中藉由質譜分析鑑別，且藉由HPLC，例如疏水相互作用層析法分離(參見例如McDonagh等人(2006)Prot.Engr.Design & Selection 19(7)：299-307；Hamblett等人(2004)Clin.Cancer Res.10：7063-7070；Hamblett,K.J.等人「Effect of drug loading on the pharmacology,pharmacokinetics,and toxicity of an anti-CD30 antibody-drug conjugate,」文摘號624,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月；Alley,S.C.等人「Controlling the location of drug attachment in antibody-drug conjugates,」文摘號627,American Association for Cancer Research,2004 Annual Meeting,2004年3月27-31日，Proceedings of the AACR，第45卷，2004年3月)。在某些實施例中，具有單一負載值之均質ADC可藉由電泳或層析法自結合物混合物分離。
d)製備免疫結合物之某些方法
式I之ADC可藉由若干途徑，採用熟習此項技術者已知之有機化學反應、條件及試劑製備，包括以下：(1)抗體之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成Ab-L，接著與藥物部分D反應；及(2)藥物部分之親核基團與二價連接子試劑反應，經由共價鍵形成D-L，接著與抗體之親核基團反應。經由後一途徑製備式I之ADC的示例性方法描述於以引用的方式明確併入本文中之US 7498298中。
抗體上之親核基團包括(但不限於)：(i)N端胺基；(ii)側鏈胺 基，例如離胺酸；(iii)側鏈硫醇基，例如半胱胺酸；及(iv)在抗體發生糖基化下糖羥基或胺基。胺、硫醇及羥基為親核性的且能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應形成共價鍵，該等親電基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。某些抗體具有可還原之鏈間二硫鍵，亦即半胱胺酸橋鍵。藉由用諸如DTT(二硫蘇糖醇)或三羰基乙基膦(TCEP)之還原劑處理，使得抗體完全或部分還原，可使抗體具有反應性，以與連接子試劑結合。理論上各半胱胺酸橋鍵將因此形成兩個反應性硫醇親核體。可經由例如使離胺酸殘基與2-亞胺基硫雜環戊烷(妥特氏試劑(Traut's reagent))反應，修飾離胺酸殘基，使胺轉化成硫醇，而將額外親核基團引入抗體中。亦可藉由引入一個、兩個、三個、四個或更多個半胱胺酸殘基(例如藉由製備包含一或多個非天然半胱胺酸胺基酸殘基之變異抗體)，而將反應性硫醇基引入抗體中。
本發明之抗體-藥物結合物亦可藉由抗體上之親電基團(諸如醛或酮羰基)與連接子試劑或藥物上之親核基團之間發生反應來產生。連接子試劑上之適用親核基團包括(但不限於)醯肼、肟、胺基、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼。在一個實施例中，抗體經修飾以引入能夠與連接子試劑或藥物上之親核取代基反應之親電部分。在另一個實施例中，糖基化抗體之糖可例如用過碘酸鹽氧化試劑氧化，以形成醛基或酮基，其可與連接子試劑或藥物部分之胺基反應。所得亞胺希夫鹼(Schiff base)基團可形成穩定鍵，或可例如藉由硼氫化物試劑還原，以形成穩定之胺鍵。在一個實施例中，糖基化抗體之碳水化合物部分與半乳糖氧化酶或偏過碘酸鈉反應可在抗體中產生羰基(醛及酮)，其可與藥物(Hermanson,Bioconjugate Techniques)上之適當基團反應。在另一個實施例中，含有N端絲胺酸或蘇胺酸殘基之抗體可與 偏過碘酸鈉反應，產生醛代替第一胺基酸(Geoghegan及Stroh,(1992)Bioconjugate Chem.3：138-146；US 5362852)。此類醛可與藥物部分或連接子親核試劑反應。
藥物部分上之示例性親核基團包括(但不限於)：能夠與連接子部分及連接子試劑上之親電基團反應形成共價鍵的胺、硫醇、羥基、醯肼、肟、肼、硫半卡巴肼、肼羧酸酯及芳基醯肼基團，該等親電基團包括：(i)活性酯，諸如NHS酯、HOBt酯、鹵基甲酸酯及酸鹵化物；(ii)烷基及苯甲基鹵化物，諸如鹵乙醯胺；及(iii)醛、酮、羧基及順丁烯二醯亞胺基。
可用於製備ADC之非限制性示例性交聯試劑在本文中描述於標題為「示例性連接子」之章節下。使用此類交聯試劑連接兩個部分，包括蛋白質部分及化學部分之方法為此項技術中已知。在一些實施例中，包含抗體及細胞毒性劑之融合蛋白可例如藉由重組技術或肽合成來製備。重組DNA分子可包含編碼結合物之抗體及細胞毒性部分的區域，該等區域彼此相鄰或由編碼不破壞結合物之所需特性之連接子肽的區域分離。
在又一實施例中，抗體可結合於「受體」(諸如抗生蛋白鏈菌素)，以用於腫瘤預先靶向中，其中抗體-受體結合物投與患者，接著使用清除劑將未結合之結合物自循環中移除且接著投與結合於細胞毒性劑(例如藥物或放射性核苷酸)之「配位體」(例如抗生素蛋白)。
表A之抗體藥結合物51-58可藉由使藥物部分與連接子試劑偶合且根據WO 2013/055987、WO 2015/023355、WO 2010/009124、WO 2015/095227，且與任一本文所述之抗-B7-H4抗體，包括經半胱胺酸工程改造之抗體結合來製備。
其他示例性抗體藥物結合物包括：
應注意為簡單起見，以上結構及ADC 51至58之彼等結構僅僅展 示一個連接子-藥物基團附接於抗體。如上文所提及，一個以上連接子-藥物基團可附接於抗體。
E. 用於診斷及偵測之方法及組合物
在某些實施例中，任一本文提供之抗-B7-H4抗體適用於偵測生物檢體中B7-H4之存在。如本文所用，術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。「生物檢體」包含例如細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宮內膜或卵巢組織)。
在一個實施例中，提供一種用於診斷或偵測方法之抗-B7-H4抗體。在另一態樣中，提供一種偵測生物檢體中B7-H4之存在的方法。在某些實施例中，該方法包含使生物檢體與如本文所述之抗-B7-H4抗體在允許抗-B7-H4抗體結合於B7-H4之條件下接觸，且偵測生物檢體中抗-B7-H4抗體與B7-H4之間是否形成複合物。此類方法可為活體外或活體內方法。在一個實施例中，抗-B7-H4抗體用於選擇適於用抗-B7-H4抗體治療之個體，例如其中B7-H4為選擇患者之生物標記物。在另一個實施例中，生物檢體為細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宮內膜或卵巢組織)。
在另一個實施例中，抗-B7-H4抗體活體內用於例如藉由活體內成像來偵測個體之B7-H4陽性癌症，例如以診斷、預後癌症或將癌症分期，確定適當治療過程，或監測癌症對療法之反應。一種此項技術中已知用於活體內偵測之方法為免疫-正電子發射斷層攝影法(免疫-PET)，如例如van Dongen等人，The Oncologist 12：1379-1389(2007)及Verel等人，J.Nucl.Med.44：1271-1281(2003)中所述。在此類實施例中，提供一種用於偵測個體之B7-H4陽性癌症的方法，該方法包含向患有或懷疑患有B7-H4陽性癌症之個體投與經標記之抗-B7-H4抗體，且偵測該個體中經標記之抗-B7-H4抗體，其中該經標記之抗-B7-H4抗體之偵測指示該個體患有B7-H4陽性癌症。在某些此類實施例中，經 標記之抗-B7-H4抗體包含與諸如68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I之正電子發射體結合之抗-B7-H4抗體。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
在其他實施例中，診斷或偵測之方法包含使固定於基質之第一抗-B7-H4抗體與待測試B7-H4之存在的生物檢體接觸，將該基質暴露於第二抗-B7-H4抗體，且偵測該生物檢體中該第二抗-B7-H4是否結合於該第一抗-B7-H4抗體與B7-H4之間的複合物。基質可為任何支撐介質，例如玻璃、金屬、陶瓷、聚合物珠粒、載玻片、晶片及其他基質。在某些實施例中，生物檢體包含細胞或組織(例如生檢材料，包括癌性或可能癌性乳房、子宮內膜或卵巢組織)。在某些實施例中，第一或第二抗-B7-H4抗體為任一本文所述之抗體。
可根據任一以上實施例診斷或偵測之示例性病症包括B7-H4陽性癌症，諸如B7-H4陽性乳癌、B7-H4陽性卵巢癌及B7-H4陽性子宮內膜癌。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為在本文實例B中描述之條件下抗-B7-H4免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分超過「0」之癌症，0對應於超過90%腫瘤細胞中染色非常弱或無染色。在另一個實施例中，B7-H4陽性癌症以如在本文實例B中描述之條件下所定義，1+、2+或3+水準表現B7-H4。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為根據偵測B7-H4mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現B7-H4的癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
在某些實施例中，提供經標記之抗-B7-H4抗體。標記包括(但不限於)直接偵測之標記或部分(諸如螢光、發色、電子緻密、化學發光及放射性標記)，以及例如經由酶促反應或分子相互作用間接偵測之部分(諸如酶或配位體)。示例性標記包括(但不限於)放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍 生物；若丹明及其衍生物；丹醯基；傘酮；螢光素酶，例如螢火蟲螢光素酶及細菌螢光素酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸去氫酶；雜環氧化酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，其與採用過氧化氫氧化染料前驅體之酶(諸如HRP、乳過氧化酶或微過氧化酶)偶合；生物素/抗生物素蛋白；自旋標記；噬菌體標記；穩定自由基及其類似標記。在另一個實施例中，標記為正電子發射體。正電子發射體包括(但不限於)68Ga、18F、64Cu、86Y、76Br、89Zr及124I。在一特定實施例中，正電子發射體為89Zr。
F. 醫藥調配物
如本文所述之抗-B7-H4抗體或免疫結合物之醫藥調配物藉由將具有所需純度之此類抗體或免疫結合物與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑混合來製備(Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980))，呈凍乾調配物或水溶液形式。醫藥學上可接受之載劑在所用劑量及濃度下一般對接受者而言無毒，且包括(但不限於)：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如氯化十八烷基二甲基苯甲基銨；氯化六羥季銨；氯化苯甲烴銨；苄索氯銨(benzethonium chloride)；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷酯，諸如對羥苯甲酸甲酯或對羥苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、雙醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖類，諸如蔗糖、甘露糖醇、海藻糖或山梨糖醇； 成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如Zn-蛋白質錯合物)；及/或非離子型界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之示例性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性玻尿酸酶醣蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20玻尿酸酶醣蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些示例性sHASEGP及使用方法，包括rHuPH20，描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP與一或多種其他葡萄糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
示例性凍乾抗體或免疫結合物調配物描述於美國專利第6,267,958號中。抗體或免疫結合物調配物水溶液包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中描述之抗體或免疫結合物調配物水溶液，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物亦可含有一種以上為所治療之特定適應症所必需之活性成分，較佳為具有不會對彼此產生不利影響之補充性活性的活性成分。舉例而言，在一些情況下，可能需要進一步提供Avastin®(貝伐單抗)例如用於治療B7-H4陽性癌症，諸如B7-H4陽性乳癌(包括B7-H4陽性三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌)、B7-H4陽性卵巢癌或B7-H4陽性子宮內膜癌。
活性成分可包覆於微膠囊中，例如藉由凝聚技術或藉由界面聚合法所製備之微膠囊，例如分別為羥基甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊；包覆於膠態藥物傳遞系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)中或巨乳液中。此類技術揭示於Remington's Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編輯(1980)中。
可製備持續釋放製劑。持續釋放製劑之適合實例包括含有抗體或免疫結合物之固體疏水性聚合物之半滲透基質，該等基質呈成形制 品形式，例如薄膜或微膠囊。
用於活體內投與之調配物一般為無菌的。無菌性可容易藉由例如無菌過濾膜過濾來實現。
G. 治療方法及組合物
本文提供之任一抗-B7-H4抗體或免疫結合物可用於例如治療方法之方法中。
在一個態樣中，本文提供之抗-B7-H4抗體或免疫結合物用於抑制B7-H4陽性細胞增殖之方法中，該方法包含在容許抗-B7-H4抗體或免疫結合物結合於細胞表面上之B7-H4之條件下將該細胞暴露於抗-B7-H4抗體或免疫結合物，藉此抑制細胞增殖。在某些實施例中，方法為活體外或活體內方法。在其他實施例中，細胞為乳房、卵巢或子宮內膜細胞。
活體外細胞增殖之抑制可使用可購自Promega(Madison,WI)之CellTiter-GloTM發光細胞活力分析來分析。該分析基於存在之ATP(其指示代謝活性細胞)之定量，確定培養物中活細胞之數目。參見Crouch等人(1993)J.Immunol.Meth.160：81-88；美國專利第6602677號。分析可以96或384孔格式進行，易於進行自動化高通量篩選(HTS)。參見Cree等人(1995)AntiCancer Drugs 6：398-404。分析程序涉及向培養細胞中直接添加單一試劑(CellTiter-Glo®試劑)。此導致細胞溶解及由螢光素酶反應產生之發光信號之產生。發光信號與存在之ATP之量成比例，ATP之量與培養物中存在之活細胞數目成正比。資料可藉由光度計或CCD相機成像裝置記錄。發光輸出表示為相對光單位(RLU)。
在另一個態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體或免疫結合物，其適用作藥劑。在其他態樣中，提供一種抗-B7-H4抗體或免疫結合物，其用於治療方法中。在某些實施例中，提供一種抗-B7-H4抗體或免疫結 合物，其用於治療B7-H4陽性癌症。在某些實施例中，本發明提供一種抗-B7-H4抗體或免疫結合物，其用於治療患有B7-H4陽性癌症之個體的方法中，該方法包含向該個體投與有效量之抗-B7-H4抗體或免疫結合物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供抗-B7-H4抗體或免疫結合物之用途，其用於製造或製備藥劑。在一個實施例中，該藥劑係用於治療B7-H4陽性癌症。在另一個實施例中，藥劑係用於治療B7-H4陽性癌症之方法中，該方法包含向患有B7-H4陽性癌症之個體投與有效量之藥劑。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
在另一態樣中，本發明提供一種治療B7-H4陽性癌症之方法。在一個實施例中，該方法包含向患有此類B7-H4陽性癌症之個體投與有效量之抗-B7-H4抗體或免疫結合物。在一個此類實施例中，該方法進一步包含向個體投與有效量之至少一種例如如下文所描述之其他治療劑。
根據任一以上實施例之B7-H4陽性癌症可為例如B7-H4陽性乳癌(包括B7-H4陽性三陰性乳癌)(ER-/PR-/Her2-)、B7-H4陽性卵巢癌及B7-H4陽性子宮內膜癌。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為在本文實例B中描述之條件下抗-B7-H4免疫組織化學(IHC)或原位雜交(ISH)評分超過「0」之癌症，0對應於超過90%腫瘤細胞中染色非常弱或無染色。在另一個實施例中，B7-H4陽性癌症以如在本文實例B中描述之條件下所定義，1+、2+或3+水準表現B7-H4。在一些實施例中，B7-H4陽性癌症為根據偵測B7-H4mRNA之逆轉錄酶PCR(RT-PCR)分析表現B7-H4的癌症。在一些實施例中，RT-PCR為定量RT-PCR。
根據任一以上實施例之「個體」可為人類。
在另一態樣中，本發明提供包含本文提供之任一抗-B7-H4抗體或免疫結合物的醫藥調配物，其例如用於任一以上治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗-B7-H4抗體或免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。在另一個實施例中，醫藥調配物包含本文提供之任一抗-B7-H4抗體或免疫結合物及至少一種例如如下所描述之其他治療劑。
本發明之抗體或免疫結合物可單獨或與其他藥劑組合用於療法中。舉例而言，本發明之抗體或免疫結合物可與至少一種其他治療劑共同投與。在某些實施例中，其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗)，例如用於治療B7-H4陽性癌症，諸如B7-H4陽性乳癌(包括B7-H4陽性三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌)。在一些實施例中，其他治療劑係選自多烯紫杉醇、小紅莓、環磷醯胺、卡鉑、太平洋紫杉醇、nab-太平洋紫杉醇、吉西他濱、順鉑及PARP抑制劑(諸如奧拉帕尼、依尼帕瑞)，例如用於治療B7-H4陽性癌症，諸如B7-H4陽性乳癌(包括B7-H4陽性三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌)。在某些實施例中，例如當癌症為Her2+癌症時，其他治療劑為Kadcyla®(曲妥珠單抗恩他新(Trastuzumab emtansine))或Perjeta®(帕妥珠單抗(pertuzumab))。
以上所指出之此類組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或兩種以上治療劑包括於同一或分開調配物中)及分開投與，在此情況下本發明之抗體或免疫結合物之投與可在其他治療劑及/或佐劑投與之前、與其同時及/或在其之後進行。本發明之抗體或免疫結合物亦可與放射療法組合使用。
本發明之抗體或免疫結合物(及任何其他治療劑)可藉由任何適合之方式，包括非經腸、肺內及鼻內且必要時針對局部治療，病灶內投與來投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投藥。給藥可藉由任何適當途徑(例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下 注射)給藥，視投與之短期或長期性而定。本文中涵蓋各種給藥時程，包括(但不限於)單次投與或經各個時間點多次投與、快速投與及脈衝式輸注。
本發明之抗體或免疫結合物以符合良好醫學實務之方式調配、給藥及投與。在此情形下考慮之因素包括所治療之特定病症、所治療之特定哺乳動物、個別患者之臨床病狀、病症起因、藥劑傳遞部位、投藥方法、投藥時程及醫學從業者已知之其他因素。抗體或免疫結合物無需但視情況與一或多種當前用於預防或治療所述病症之藥劑一起調配。此類其他藥劑之有效量視存在於調配物中之抗體或免疫結合物之量、病症或治療之類型及如上文所述之其他因素而定。此等藥劑一般以與本文所描述相同之劑量且用如本文所描述之投與途徑使用，或以本文所描述之劑量之約1%至99%使用，或以憑經驗/臨床上確定為適當之任何劑量及任何途徑使用。
為預防或治療疾病，本發明之抗體或免疫結合物(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)之適當劑量將視待治療之疾病類型、抗體或免疫結合物之類型、疾病之嚴重程度及過程、抗體或免疫結合物係出於預防性還是治療性目的投與、先前療法、患者臨床病史及對抗體或免疫結合物之反應、及主治醫師之判斷而定。該抗體或免疫結合物係一次性或歷經一系列治療適當地投與患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，投與患者之初始候選劑量可為約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)抗體或免疫結合物，無論例如藉由一或多次分開投與還是藉由連續輸注。一種典型日劑量可在約1μg/kg至100mg/kg或100mg/kg以上之範圍內，視上文所提及之因素而定。對於經歷數日或更長時間重複投藥，視病狀而定，治療一般持續至疾病症狀出現所需抑制為止。抗體或免疫結合物之一種示例性劑量將在約0.05mg/kg至約10mg/kg之範圍內。因此，可向患者投與約0.5mg/kg、2.0 mg/kg、4.0mg/kg或10mg/kg(或其任何組合)之一或多種劑量。此類劑量可間歇地投與，例如每週或每三週(例如以使得患者接受約二至約二十或例如約六劑抗體)。初始可投與較高起始劑量，隨後可投與一或多種較低劑量。然而，其他給藥方案可能適用。很容易藉由習知技術及分析來監測此療法之進程。
應瞭解任一以上調配物或治療方法可使用本發明之免疫結合物與抗-B7-H4抗體進行。
H. 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之物質的製品。製品包含容器及附於或連結於容器之標籤或藥品說明書。適合容器包括例如瓶子、小瓶、注射器、IV溶液袋等。容器可由多種材料(諸如玻璃或塑膠)形成。容器裝有單獨或與有效治療、預防及/或診斷病症之另一組合物組合之組合物，且可具有無菌接取口(例如容器可為具有可由皮下注射針刺穿之塞子的靜脈內溶液袋或小瓶)。組合物中之至少一種活性劑為本發明之抗體或免疫結合物。標籤或藥品說明書指示組合物用於治療所選病狀。此外，製品可包含(a)其中含有組合物之第一容器，其中該組合物包含本發明之抗體或免疫結合物；及(b)其中含有組合物之第二容器，其中該組合物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示組合物可用於治療特定病狀之藥品說明書。或者或另外，製品可進一步包含第二(或第三)容器，其包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸鹽緩衝生理食鹽水、林格氏溶液(Ringer's solution)或右旋糖溶液。其可進一步包括就商業及使用者觀點而言所需之其他物質，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
III.實例
以下為本發明之方法及組合物之實例。應瞭解，考慮到上文提供之一般描述，可實施各種其他實施例。
A. 人類B7-H4基因表現
1. B7-H4 mRNA之表現
使用含有基因表現資訊之專用資料庫(GeneExpress®,Gene Logic Inc.,Gaithersburg,MD)分析人類B7-H4基因表現。使用微陣列型態檢視器進行GeneExpress®資料庫之圖形分析。圖1為各種組織中人類B7-H4基因表現之圖示。y軸上之刻度指示基於雜交信號強度之基因表現水準。點出現在自各列出組織之名稱延伸之線的左邊與右邊。出現在線左邊之點表示正常組織中之基因表現，且出現在線右邊之點表示腫瘤及患病組織中之基因表現。圖1展示在某些腫瘤或患病組織中，相對於其正常對應物，B-H4基因表現增加。詳言之，B7-H4實質上在乳房、子宮內膜及卵巢腫瘤中過度表現。
2. B7-H4蛋白質之表現
自Genentech之人類組織實驗室獲得人類正常組織。按照製造商說明書，藉由在Complete Lysis-M(Roche)中均勻化，自冷凍組織提取蛋白質。所有蛋白質溶解物均使用Nanodrop 1000定量，且針對完整性及濃度一致性，藉由SDS-PAGE檢查。
藉由西方墨點法，各樣本使用約50μg蛋白質溶解產物且在4℃下用於含有0.05% Tween-20之Odyssey阻斷緩衝液(Li-Cor,Lincoln,NE)中1μg/ml之A57.1 mAb(diaDexus,South San Francisco,CA)探測隔夜，來確定完全B7-H4蛋白質之評估。在用TBST緩衝液洗滌之後，與1：15,000之山羊抗小鼠IRDye 800CW二級抗體(Li-Cor)一起培育且墨點在Odyssey紅外成像器(Li-Cor)上成像。
自US Biomax(Rockville,MD)獲得正常人類(FDA999c)、食蟹獼猴(CyFDA1a)、小鼠(MO541)及大鼠(Rat901)組織微陣列(TMA)。免疫 組織化學(IHC)在Ventana Discovery XT自動染色儀(Ventana Medical Systems,Tucson,AZ)上進行。將福馬林固定之石蠟包埋的組織微陣列切片去石蠟且用CC1溶液(Ventana Medical Systems)預處理60分鐘，接著與1.5μg/ml A57.1兔mAb或原始兔IgG一起在37℃下培育60分鐘。用OmniMap抗兔HRP及DAB(Ventana Medical Systems)偵測16分鐘，接著用蘇木精II及發藍試劑(Ventana Medical Systems)複染。藉由有經驗之病理學家，考慮染色劑之強度及寬度，對樣本進行評分。評分：0(陰性)：在超過90%細胞中非常弱或無雜交；1+(輕度)：主要雜交模式為弱的；2+(中度)：主要雜交模式在大部分(>50%)細胞中為中等強度的；3+(強)：主要雜交模式在大部分(>50%)細胞中為強的。
B7-H4在來自過度表現rhB7-H4之293細胞及乳房腺癌之代表性病例的蛋白質溶解物中高度表現(圖20A)。與乳腺癌檢體相比，在胎盤、心臟、乳房、腎、胰臟、食道、肝、肺及睪丸中微弱地偵測到B7-H4之高度糖基化形式(約60kDa)，而非B7-H4之未糖基化形式(約28kDa)。藉由IHC，僅僅在以下正常組織上觀測到B7-H4在細胞膜上之表現(圖20B)：乳房導管上皮細胞、胰臟之腺泡及導管上皮細胞、腎之小管上皮細胞、膽管上皮細胞及氣管/肺、子宮頸及胎盤之上皮細胞。亦有證據表明肝細胞中B7-H4之胞內表現而非膜表現。總體而言，來自西方墨點法及IHC之結果一致。對於食蟹獼猴觀測到類似WB及IHC結果(資料未展示)。利用在Genentech研發之B7-H4之兔mAb獨立地證實使用A57.1之西方墨點法及IHC結果(資料未展示)。結果指示大部分正常組織之B7-H4表現水準低，僅僅幾個組織在其細胞表面上呈現B7-H4。
B. 乳房及卵巢癌中人類B7-H4之流行率
為評估乳房癌中B7-H4之表現，自多個來源獲得202個原發性乳房癌。使用如Bubendorf L等人，J Pathol.2001年9月；195(1)：72-9中所 述之複製核，組裝組織微陣列(TMA)，且包括來自匹配情況之正常乳房檢體。
藉由免疫組織化學，使用針對人類B7-H4之A57.1抗體(diaDexus,South San Francisco,CAB7-H4)測定B7-H4表現。根據以下流程，考慮強度(銀粒)以及染色寬度，藉由訓練有素之病理學家對雜交強度進行評分。
0(陰性)：超過90%腫瘤細胞中雜交非常弱或無雜交
1+(輕度)：主要雜交模式為弱的
2+(中度)：大部分(>50%)贅生性細胞中主要雜交模式中等強度
3+(強)：大部分(>50%)贅生性細胞中主要雜交模式為強的
相同A57.1抗體用作正常乳房組織中雜交特異性之對照。
圖2展示具有0、1+、2+及3+染色水準之示例性乳房癌切片。影像中銀粒之沈積指示抗體之雜交及B7-H4蛋白質之表現。約80%情況展示環形膜及細胞質染色，65%檢體中B7-H4染色為中度(2+)至高度(3+)(總計：評分0(40)；1+(31)；2+(74)；3+(57))。
為評估不同乳癌亞型中B7-H4表現及流行率之重要性，將乳癌檢體彙集且基於原發性腫瘤之人類表皮生長因子受體2(Her2)、激素受體(HR)及三陰性(TN)狀態，分成三個亞型。表現B7-H4之腫瘤的百分比如上所述進行及評分。
如圖3A中所示，B7-H4表現在所有乳癌亞型中流行，其中所有亞型之約65%為陽性(評分1-3)。詳言之，約60% Her2+及HR+乳癌亞型亦表現B7-H4且約80% TN乳癌為B7-H4陽性。圖3B展示藉由免疫組織化學所量測，在乳癌亞型中B7-H4染色之0、1+、2+及3+水準之流行率。約20% Her2+及HR+乳癌亞型及約25% TN乳癌亞型展示針對B7-H4，1+之染色水準。約28% Her2+及TN乳癌亞型及約18% HR+乳癌亞型展示針對B7-H4，2+之染色水準。分別約15%、約20%及約25% 之Her2+、HR+及TN乳癌亞型展示針對B7-H4，3+之染色水準。
西方墨點分析亦提出，乳房腫瘤中B7-H4之總表現為約70%，其中在約40%彼等乳房腫瘤中表現相當高，如圖3C中所示。MX-1腫瘤模型用作內源性陽性對照，且BT549(對B7-H4呈陰性之腫瘤細胞株)作為內源性陰性對照，且與4個正常乳房組織(正常定義為與腫瘤相鄰之正常組織)相比，評估10個不同乳房腫瘤檢體之B7-H4蛋白質表現。亦包括293野生型細胞及經人類B7-H4轉染之293細胞作為對照。B-肌動蛋白含量用於校正負載不一致。
如使用A57.1抗體，使用西方墨點分析所偵測，B7-H4在82%原發性乳房腫瘤(Xentech小組)中表現。如圖3D中所示，在23/28個測試之原發性乳房腫瘤中B7-H4呈約62Kd亮帶出現。
西方墨點分析亦提出，卵巢瘤中B7-H4之總表現為約80%，其中在約60%彼等卵巢瘤中表現相當高，如圖3E中所示。
C. 小鼠單株抗體產生
使用以下程序產生針對人類B7-H4之單株抗體。將兩組分開之Balb/C小鼠(Charles River Laboratories,Hollister,CA)用過度表現重組人類B7-H4之293細胞或人類B7-H4之DNA表現構築體超免疫，且將第三組小鼠B7-H4 KO BL/6N小鼠用在鼠類骨髓瘤表現系統中表現之具有C端Fc之小鼠B7-H4細胞外域(ECD；胺基酸29-258)免疫。
向Balb/c小鼠(Charles River Laboratories International,Inc.,Hollister,CA,USA)注射於PBS中之過度表現人類B7-H4之293細胞(五百萬/劑，經由腹膜內)或於乳酸林格氏溶液中之huB7-H4質體DNA(經由尾靜脈)，接著用重組人類B7-H4ECD(4微克/劑，腹膜內)進行蛋白質加強。向小鼠B7-H4 KO BL/6N小鼠注射於含有可代謝角鯊烯(4% v/v)、Tween 80(0.2% v/v)、海藻糖6,6-二黴菌酸酯(0.05% w/v)及單磷醯基脂質A(0.05% w/v；Sigma Aldrich,USA)之佐劑中的如上所述之 重組小鼠B7-H4 ECD(經由後腳墊)。在6-9次注射後，藉由標準酶聯免疫吸附分析(ELISA)及FACS評估血清效價。使自血清B7-H4陽性小鼠收穫之脾B細胞與小鼠骨髓瘤細胞(X63.Ag8.653；美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection),Manassas,VA,USA)藉由電融合(Hybrimune；Harvard Apparatus,Inc.,Holliston,MA,USA)進行融合。在10-14天之後，針對抗體分泌，藉由ELISA篩選融合瘤上清液。接著對所有陽性純系進行擴增且針對與huB7-H4及muB7-H4之結合，藉由ELISA及FACS再次篩選。藉由螢光活化細胞分選術(FACs)，使用表現重組人類、食蟹獼猴及小鼠-B7-H4之穩定細胞株，鑑別四種融合瘤純系：1D11(自小鼠B7-H4免疫之mB7-H4 KO小鼠鑑別)、2.32D6(自人類B7-H4對DNA進行免疫之小鼠鑑別)及9B9及3.22.C10(自使用過度表現重組人類B7-H4之293細胞的細胞免疫鑑別)反應強烈。
圖4A展示所產生之某些單株抗體以及某些特性，其中一些將在下文進一步詳細描述。
D. 小鼠單株抗體之選殖及嵌合
單株抗體1D11、32D6、9B9及22C10係如下進行選殖及嵌合。
使用標準方法，自產生鼠類1D11、32D6、9B9及22C10之融合瘤細胞提取全部RNA。使用RT-PCR，利用簡併引子，將可變輕鏈(VL)及可變重鏈(VH)域擴增成重鏈及輕鏈。正向引子對VL及VH區之N端胺基酸序列具有特異性。LC及HC反向引子經設計以分別黏接於在物種間高度保守之恆定輕鏈域(CL)及恆定重鏈域1(CH1)中之區域。使用常規測序方法測定插入物之聚核苷酸序列。1D11 VL及VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO：3及4中。1D11重鏈高變區(HVR)H1、H2及H3分別展示於SEQ ID NO：5、6及7中。1D11輕鏈高變區(HVR)L1、L2及L3分別展示於SEQ ID NO：8、9及10中。32D6 VL及VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO：11及12中。32D6重鏈高變區(HVR)H1、H2及H3 分別展示於SEQ ID NO：13、14及15中。32D6輕鏈高變區(HVR)L1、L2及L3分別展示於SEQ ID NO：16、17及18中。9B9 VL及VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO：19及20中。9B9重鏈高變區(HVR)H1、H2及H3分別展示於SEQ ID NO：21、22及23中。9B9輕鏈高變區(HVR)L1、L2及L3分別展示於SEQ ID NO：24、25及26中。22C10 VL及VH胺基酸序列展示於SEQ ID NO：27及28中。22C10重鏈高變區(HVR)H1、H2及H3分別展示於SEQ ID NO：29、30及31中。22C10輕鏈高變區(HVR)L1、L2及L3分別展示於SEQ ID NO：32、33及34中。抗體1D11、32D6、9B9及22C10之輕鏈及重鏈可變區之比對展示於圖5中。
各抗體藉由將小鼠重鏈可變區選殖至人類IgG1重鏈恆定區上且將輕鏈可變區選殖至人類κ輕鏈恆定區上來嵌合，除了9B9，其選殖至人類λ輕鏈恆定區上。
E. 1D11及22C10之人類化
單株抗體1D11及22C10係如下所述進行人類化。殘基編號係根據Kabat等人，Sequences of proteins of immunological interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)。
高變區直接移植至接受體人類共同構架上
在1D11及22C10之人類化期間構築的變異體呈IgG形式評估。將來自鼠類1D11及22C10之VL及VH域與人類VLκI(VLKI)及人類VH亞群I(VHI)共同序列比對。
來自鼠類1D11(mu1D11)抗體之高變區經工程改造至VLKI及VHI接受體構架中以產生人類化1D11.v1(h1D11.v1)、1D11.v2(h1D11.v2)、1D11.v3(h1D11.v3)、1D11.v4(h1D11.v4)、1D11.v1.1(h1D11.v1.1)、1D11.v1.2(h1D11.v1.2)、1D11.v1.3(h1D11.v1.3)、 1D11.v1.4(h1D11.v1.4)、1D11.v1.5(h1D11.v1.5)、1D11.v1.6(h1D11.v1.6)、1D11.v1.7(h1D11.v1.7)、1D11.v1.8(h1D11.v1.9)及1D11.v1.9(h1D11.v1.9)。具體言之，自mu1D11 VL域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI中。自mu1D11 VH域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI中。
另外，發現某些殘基為充當「維尼爾(Vernier)」區之構架殘基之一部分，維尼爾區可調整CDR結構且微調抗原配合。參見例如Foote及Winter,J.Mol.Biol.224：487-499(1992)(圖5及6)。此等CDR定義包括藉由其序列高變性(Wu,T.T.及Kabat,E.A.(1970))、其結構位置(Chothia,C.及Lesk,A.M.(1987))及其參與抗原-抗體接觸(MacCallum等人J.Mol.Biol.262：732-745(1996))定義之位置。舉例而言，VH及VL中之以下位置在以下人類化1D11變異體中自小鼠序列保留：
h1D11.v1--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v2--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置71
h1D11.v3--VH之構架III中的位置67、69、71及73；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置58、69及71
h1D11.v4--VH之構架III中的位置67、69、71、73及75；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置58、69及71
h1D11.v1.1--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.2--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置71
h1D11.v1.3--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置69
h1D11.v1.4--VH之構架III中的位置69及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.5--VH之構架III中的位置67及71；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.6--VH之構架III中的位置67及69；VL之構架II中的位置49以及VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.7--VH之構架III中的位置67及69；VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.8--VH之構架III中的位置67；VL之構架III中的位置69及71
h1D11.v1.9-VH中無變化；VL之構架III中的位置69及71
1D11之各種人類化變異體之輕鏈可變區序列及重鏈可變區序列分別展示於圖6及圖7中。
在所有四種h1D11變異體(h1D11.v1-4)中，藉由利用FACS，在表現人類B7-H4之293細胞上，與小鼠1D11比較，h1D11.v1展示保留最接近親和力。因此，藉由如上所述，修飾重鏈及輕鏈可變區之不同維尼爾位置，產生其他h1D11.v1變異體。
來自鼠類22C10(mu22C10)抗體之高變區經工程改造至VLKI及VHI接受體構架中以產生各種人類化22C10。具體言之，自mu22C10 VL域，位置24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)移植至VLKI。自mu22C10 VH域，位置26-35(H1)、50-65(H2)及95-102(H3)移植至VHI中。
舉例而言，VH及VL中之以下位置在以下人類化22C10變異體中自小鼠序列保留：
h22C10.v1--VH之構架III中的位置67、69、71及93；VL之構架II中的位置46及47以及VL之構架III中的位置71
h22C10.v2--VH之構架III中的位置67、69、71及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v3--VH之構架III中的位置67、69、71、73及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v4--VH之構架III中的位置67、69、71、76及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v5--VH之構架III中的位置67、69、71、75、76及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.1--VH之構架III中的位置67、69、71及93；VL之構架II中的位置47
h22C10.v2.2--VH之構架III中的位置67、69、71及93；VL之構架II中的位置46
h22C10.v2.3--VH之構架III中的位置69、71及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.4--VH之構架III中的位置67、71及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.5--VH之構架III中的位置67、69及93；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.6--VH之構架III中的位置67、69及71；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.7-VH中無變化；VL之構架II中的位置46及47
h22C10.v2.8-VH中無變化；VL之構架II中的位置46
22C10之各種人類化變異體之輕鏈可變區序列及重鏈可變區序列分別展示於圖8及圖9中。
1D11及22C10之人類化變異體藉由Kunkel突變誘發，針對各高變區使用分開寡核苷酸來產生。藉由DNA測序鑑別正確純系。
評估變異體
出於篩選之目的，最初在293細胞中產生IgG變異體。將編碼VL及VH之載體轉染至293細胞中。藉由蛋白A親和層析，自細胞培養基純化IgG。
最初藉由FACS及史卡查分析，篩選小規模製劑，以確定物種特異性及對重組及內源性B7-H4之親和力(Kd)。藉由將不同濃度(0-10μg/ml)人類化變異體與過度表現重組人類、食蟹獼猴或小鼠-B7-H4之293細胞及表現內源性人類B7-H4之腫瘤細胞株MX-1一起在4℃下培育40分鐘，接著洗滌且在4℃下用結合於Dylight-650之二級山羊抗人類IgG抗體染色20分鐘，來確定初始EC50及物種特異性。利用BD FACS Calibur獲得螢光信號且藉由Graph Pad程式Prism 4確定EC50值。
1. 物種交叉反應性
測試單株抗體以確定其是否與來自除人類外之物種的B7-H4交叉反應。圖10展示人類(SEQ ID NO：73)、黑猩猩(SEQ ID NO：81)、食蟹獼猴(SEQ ID NO：75)、大鼠(SEQ ID NO：77)及小鼠(SEQ ID NO：79)B7-H4之間的比對。在所有五個物種中一致之殘基藉由紅框內之分組指示。不同之殘基藉由紅點指示。B7-H4直系同源物具有極高序列一致性：人類B7-H4 100%；黑猩猩B7-H4 96.09%；食蟹獼猴B7-H4 98.6%、大鼠B7-H4 86.87%及小鼠B7-H4 87.63%。詳言之，大鼠B7-H4與小鼠B7-H4 97.17%一致。B7-H4直系同源物亦具有極高序列相似性：人類B7-H4 100%；黑猩猩B7-H4 97.42%；食蟹獼猴B7-H4 98.8%、大鼠B7-H4 89.3%及小鼠B7-H4 90.12%。
藉由經B7-H4(人類、黑猩猩、食蟹獼猴、大鼠或小鼠B7-H4)穩定轉染的293細胞之FACS分析，確定與各物種B7-H4之結合；Dylight-650結合之山羊抗人類抗體染色。未轉染之293細胞通常不表現B7-H4。
如圖11中所示，代表性FACs篩選資料展示hu1D11v1.7-9及hu 22C10v2.7-8以親本嵌合抗體範圍內之EC50結合於重組人類、食蟹獼猴及小鼠B7-H4。
2. 抗體親和力
按照標準程序(Holmes等人，Science 256：1205-1210(1992))進行史卡查分析以確定ch1D11、ch9B9、ch2210及ch32D6抗體之相對結合親和力。
使用間接Iodogen法對抗-B7-H4抗體進行[I125]標記。藉由使用NAP-5管柱(GE Healthcare)之凝膠過濾，自游離125I-Na純化[I125]標記之抗-B7-H4抗體；經純化之碘化抗-B7-H4抗體具有8-10μCi/μg之範圍的特定活性。將50μL體積含有固定濃度之[I125]標記抗體及遞減濃度之連續稀釋之未標記抗體的競爭分析混合物置於96孔盤中。將穩定表現人類、食蟹獼猴、大鼠或小鼠B7-H4之293細胞或MX-1腫瘤細胞在生長培養基中在37℃下在5% CO2中培養。使用Sigma細胞解離溶液將細胞自燒瓶分離且用結合緩衝液洗滌，該結合緩衝液由具有1%牛血清白蛋白(BSA)之達爾伯克氏改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle Medium，DMEM)、300mM人類IgG及0.1%疊氮化鈉組成。將經洗滌之細胞以0.2mL結合緩衝液中100,000個細胞之密度添加至96孔盤。各孔中[I125]標記抗體之最終濃度為約250pM。競爭分析中未標記抗體之最終濃度在1000nM，經十次2倍數稀釋步驟，至0nM僅僅緩衝液分析物之範圍內。競爭分析一式三份地進行。將競爭分析物在室溫下培育2小時。在培育2小時之後，將競爭分析物轉移至Millipore多篩濾盤(Billerica,MA)中且用結合緩衝液洗滌4次以將游離與結合之[I125]標記抗體分開。過濾器在Wallac Wizard 1470γ計數器(PerkinElmer Life and Analytical Sciences Inc.；Wellesley,MA)上計數。使用NewLigand軟體(Genentech)評估結合資料，該軟體使用Munson及 Robard之擬合算法確定抗體之結合親和力(Munson及Robard 1980)。
如圖4A中所示，ch1D11分別以6.1nM、4.1nM、9.4nM及4.1nM之親和力結合於在穩定轉染之293細胞上表現的人類B7-H4、食蟹獼猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch22C10分別以6.6nM、4.6nM、18.3nM及5.7nM之親和力結合於在穩定轉染之293細胞上表現的人類B7-H4、食蟹獼猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch9B9分別以6.6nM、5.2nM、13.7nM及4.7nM之親和力結合於在穩定轉染之293細胞上表現的人類B7-H4、食蟹獼猴B7-H4、小鼠B7-H4及大鼠B7-H4。ch32D6分別以4.8nM及3.1nM之親和力結合於在穩定轉染之293細胞上表現的人類B7-H4及食蟹獼猴B7-H4。
亦使用如上所述之史卡查分析評估各種人類化抗-B7-H4抗體之親和力。將穩定表現人類B7-H4之MX-1腫瘤細胞在生長培養基中在37℃下在5% CO2中培養。如圖12中所示，hu1D11.v1.7、hu1D11.v1.8及hu1D11.v1.9分別以8.3nM、8.7nM及7.8nM之親和力結合於人類B7-H4(與親本1D11抗體之7.8nM相比)。hu22C10.v2.7及hu22C10.v2.8分別以6.3nM及10nM之親和力結合於人類B7-H4(與親本22C10抗體之4.9nM相比)。
F. 單株抗體抗原決定基分組
為確定單株抗體之抗原決定基分組，進行FACS分析以評估其他抗體是否可替換參考抗體。
使用基於細胞之競爭結合FACS分析測定抗原決定基分組。將表現重組人類B7-H4之293細胞與Dylight-488標記之示蹤劑抗體(0.3-1μg/ml)一起在未標記抗體(0、0.05、0.5、5、50μg/ml)存在下培育。當示蹤劑由未標記抗體替換時，已發生競爭，指示抗體特異性結合於B7-H4上相同或類似之區域-此應發生在相同抗體用作示蹤劑及競爭劑時。當示蹤劑未由不同未標記抗體替換時，未標記抗體結合於B7-H4 中之不同區域。
為確定B7-H4抗體結合於B7-H4之Ig-V還是Ig-C域，使用標準分子選殖方法，對含有B7-H4(IgV；包括間隔子S151-V157之G28-F150)-不相關(Ig-C)(構築體-88)或不相關(Ig-V)-B7-H4(Ig-C；包括TM/CD D237-K282之D158-G236)(構築體-88B)膜蛋白質的嵌合Ig域分子進行工程改造。附接N端或胞質標籤以證實經此等構築體轉染之293細胞在細胞膜上表現蛋白質(資料未展示)。簡言之，使用polyfect，293細胞經構築體88及88B短暫轉染。在48小時之後，在4℃下將細胞用10μg/ml Dylight-488或Dylight-650標記之ch9B9、ch1D11、ch22C10或ch32D6染色30-40分鐘，洗滌且在BD FACS calibur上分析。
另外，用經工程改造之可溶性B7-H4(Ig-V；G28-V157)-Fc融合蛋白獨立地證實該等結果。當在3-300倍濃度之染料標記之示蹤劑抗體下培育時，如藉由FACS所測定，阻斷示蹤劑與293-huB7-H4細胞之結合。
B7-H4(Ig-V)域含有單一N連接之糖基化位點(N112-S114)，且為確定糖基化是否影響抗體與B7-H4之結合，使用標準位點特異性突變誘發，將S114經丙胺酸取代以防止全長人類B7-H4膜構築體中之糖基化。突變S114A人類B7-H4構築體用polyfect轉染至293細胞中，且48小時後，藉由FACS，與293-huB7-H4穩定細胞株一起分析抗體結合。
圖4A概述標題為「抗原決定基群」之列中的結果。如圖4中所示，抗體1D11及9B9均結合於分組在「A」下之抗原決定基，而抗體22.C10結合於分組在「B」下之抗原決定基，且抗體32D6結合於分組在「C」下之抗原決定基。
進一步證實三個單株抗體明確結合於B7-H4 Ig-V域，其中ch22C10可能結合包含Ig-V/Ig-C之抗原決定基且此類結合與糖基化無 關-所有4種抗體結合超過同型對照100倍。ch1D11及ch22C10之代表性資料展示於圖4B中。所用ch1D11型式為ch1D11之略微修飾型式，其中1D11 mAb輕鏈含有C43G之取代。未偵測到任一單株抗體與B7-H4 Ig-C域之結合。
G. 抗-B7-H4抗體之內化
ADC標靶之一種所希望屬性為能夠將抗體內化至細胞中之降解隔室。為確定抗-B7-H4抗體在結合時是否內化，將SKBR3腺癌細胞接種於經細胞培養物處理之4孔腔室載玻片(Nalge Nunc International)，且在4℃下與Dylight 594結合之抗-B7-H4 9B9 mAb(10μg/mL)或作為膜染色對照之抗-EGF-Alexa 488(3μg/mL)一起培育2小時。為內化，添加兩者且在4℃下培育2小時。接著洗滌細胞且在溶酶體蛋白酶抑制劑胃酶抑素(5μg/mL)/抗纖維蛋白溶酶肽(10μg/mL)存在下經受16小時追逐。所有處理組接著在室溫下固定在3%對甲醛(Polysciences,Inc.)中20分鐘，且用50mM氯化銨及PBS洗滌，且隨後用DAPI將核染色。Leica SP5共焦顯微鏡(Leica Microsystems)用於圖像分析。
如圖13中所示，細胞內9B9及EGF(用作溶酶體標記物)染色明顯相當大重疊。此等結果預測抗-B7-H4 ADC應有效地內化，進行降解，且釋放藥物以殺死癌細胞。
為證實抗-B7-H4抗體到達溶酶體，將經染料結合物標記之ch1D11及ch22C10抗-B7-H4抗體與MX-1癌瘤細胞一起培育且螢光共振能量轉移(FRET)用於追蹤抗體在胞內之位置。FRET為兩個發色團(在此情況下為供體及接受體染料)之間能量轉移的機制。簡言之，ch1D11或ch22C10結合於兩種染料FAM及TAMRA，藉由含有組織蛋白酶裂解位點之肽間隔子固持在一起。在未裂解狀態中，歸因於紅色染料(接受體)接近，綠色染料(供體)猝滅，因此膜及胞漿染色出現紅色。當抗體結合物進入溶酶體時，溶酶體酶組織蛋白酶將肽間隔子裂 解，增加供體與接受體之距離，因此防止能量轉移至紅色染料且允許綠色染料可見。為實現此，將細胞與2μg/ml抗體結合物一起在冰上培育30分鐘。利用Leica SP5共焦顯微鏡與延時攝影，在10小時時間段內在37℃下，立即將細胞成像以展示膜染色(T0)。如圖14中所示，ch1D11及ch22C10定位於完整(紅色)及裂解(綠色)之溶酶體合併影像中，展示其中兩種結合物共定位於溶酶體中之黃色區域。
H. 產生抗-B7-H4抗體藥物結合物
對於更大規模之抗體產生，在CHO細胞中產生抗體。編碼VL及VH之載體轉染至CHO細胞中且藉由蛋白A親和層析，自細胞培養基純化IgG。
抗-B7-H4抗體-藥物結合物(ADC)藉由1D11、22C10及9B9結合於本文中描繪之藥物-連接子部分MC-vc-PAB-MMAE來產生。為方便起見，藥物-連接子部分MC-vc-PAB-MMAE在此等實例及圖中有時稱為「vcMMAE」或「VCE」。在結合前，抗體使用標準方法，根據WO 2004/010957 A2中描述之方法用TCEP部分還原。部分還原之抗體使用標準方法，根據例如Doronina等人(2003)Nat.Biotechnol.21：778-784及US 2005/0238649 A1中描述之方法結合於藥物-連接子部分。簡言之，部分還原之抗體與藥物-連接子部分組合，以允許藥物-連接子部分結合於抗體之還原半胱胺酸殘基。將結合反應猝滅，且純化ADC。
另外，抗-B7-H4抗體-藥物結合物(ADC)藉由用本文中描繪之縮醛連接子(PNU-159682順丁烯二醯亞胺縮醛連接子)將1D11結合於藥物-連接子部分PNU-159682順丁烯二醯亞胺來產生。
測定各ADC之藥物負載(每個抗體之藥物部分之平均數目)且對於抗-B7-H4抗體，在3.5-3.9(阿瑞他汀)及1.6-1.9(奈莫柔比星)之間。
I. MX-1人類乳癌細胞株異種移植物中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功 效
使用MX-1人類乳癌異種移植模型研究抗-B7-H4 ADC之功效。MX-1細胞株為三陰性(TN；ER(-)/PR(-)/Her2(-))乳房導管癌細胞株(NCI-Frederick Cancer Center DCT Tumor Repository)。B7-H4在MX-1細胞中高度表現且藉由IHC、FACS、IF及共聚焦顯微鏡及西方墨點法證實。MX-1腫瘤片段(1mm3)(藉由FACS，使用9B9，B7-H4陽性)皮下植入10隻小鼠/組之背側腰窩中，且當接種後植入物達到100-150mm3時，向小鼠單次靜脈內注射3mg/kg或10mg/kg人類抗-gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物、3mg/kg或10mg/kg ch9B9-vcMMAE抗體-藥物結合物、ch22C10-vcMMAE抗體-藥物結合物、ch1D11-vcMMAE抗體-藥物結合物或10mg/kg ch9B9裸抗體或單獨媒劑(PBS)。藉由在注射後1、7及14天PK抽血，證實抗體之存在。
如圖15中所示，在兩種測試濃度下用所有三種抗-B7-H4抗體-藥物結合物實現實質性腫瘤生長抑制。
J. HBCX-24乳癌細胞株異種移植物中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用HBCX-24乳癌異種移植模型研究抗-B7-H4 ADC之功效。HBCX-24細胞株為三陰性(TN；ER(-)/PR(-)/Her2(-))乳癌細胞株。B7-H4在HBCX-24乳癌細胞中高度表現，且藉由IHC、FACS、IF及共聚焦顯微鏡及西方墨點法證實。在HBCX-24乳癌細胞中存在B7-H4染色之1+及2+水準之流行率，藉由免疫組織化學量測。HBCX-24腫瘤片段(20mm3)皮下植入5-10隻小鼠/組之背側腰窩中，且當接種後植入物達到75-200mm3時，向小鼠單次靜脈內注射6mg/kg或10mg/kg人類抗-gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物、3mg/kg、6mg/kg或10mg/kg ch9B9-vcMMAE抗體-藥物結合物或10mg/kg ch9B9裸抗體或單獨媒劑(PBS)。藉由在注射後1、7及14天PK抽血，證實抗體之存在。
如圖16中所示，在所有測試濃度下用ch9B9抗-B7-H4抗體-藥物結合物實現實質性腫瘤生長抑制。
K. MX-1乳癌細胞異種移植物中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用MX-1乳癌異種移植模型研究藉由用縮醛連接子將1D11結合於藥物-連接子部分PNU-159682順丁烯二醯亞胺所產生之抗-B7-H4 ADC的功效。MX-1腫瘤片段(1mm3)皮下植入10隻小鼠/組之背側腰窩中，且當接種後植入物達到100-150mm3時，向小鼠單次靜脈內注射0.1mg/kg、0.5mg/kg或2.5mg/kg人類抗-gD 5B6-vcMMAE對照抗體-藥物結合物或0.1mg/kg、0.5mg/kg或2.5mg/kg具有縮醛連接子之ch1D11-PNU-159682順丁烯二醯亞胺或單獨媒劑(PBS)。藉由在注射後1、7及14天PK抽血，證實抗體之存在。
如圖17中所示，發現2.5mg/kg劑量之ch1D11 ADC延緩腫瘤生長，而較低劑量之0.1mg/kg及0.5mg/kg對腫瘤生長作用不明顯。
L. MX-1乳癌細胞異種移植物中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用如實例K中所述之MX-1異種移植模型，研究hu22C10v2.7之抗-B7-H4 ADC之功效。小鼠分成10個一組，且投與以下單一靜脈內劑量：hu22C10v2.7裸抗體，12mg/kg；hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE，0.5mg/kg、1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg、9mg/kg、12mg/kg；人類抗-gD-5B6-vc-PAB-MMAE，6或12mg/kg；或單獨媒劑(PBS)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。腫瘤生長抑制(TGI)計算為各處理組相對於媒劑，每天經擬合之腫瘤體積-時間曲線(AUC)下面積%，使用下式：%TGI=100 '(1-AUC處理/天，AUC媒劑/天)
100%之TGI值指示腫瘤停滯，TGI>1%但<100%指示腫瘤生長延遲，且TGI>100%指示腫瘤消退。
如圖18中所示，hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE展示6、9及12 mg/kg劑量分別91%、106%及108%之顯著腫瘤生長抑制；其中在9mg/kg劑量下38%部分反應(PR)及62%完全反應(CR)。在媒劑或對照ADC下未觀測到反應。
M. HCC-1569x2乳癌細胞異種移植物中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳癌細胞異種移植模型研究hu22C10v2.7之抗-B7-H4 ADC的功效。HCC-1569x2為活體內衍生之細胞株，自NCR裸小鼠(Taconic,Cambridge City,IN)中來源於親本HCC1569細胞(ATCC,Manassas,VA)之異種移植腫瘤的兩個隨後繼代產生。B7-H4在HCC-1569x2異種移植物中高度表現且藉由IHC及FACS證實(圖19A)。SCID米色小鼠用HCC-1569x2細胞(於基質膠中5×106)接種至其乳房脂肪墊中，且監測直至腫瘤體積達到250-375mm3。小鼠分至10個一組，且投與以下單一靜脈內劑量：ch22C10-vc-PAB-MMAE，5mg/kg；或hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE，3mg/kg或5mg/kg；或人類抗-gD-5B6-vc-PAB-MMAE，5mg/kg；或單獨媒劑(PBS)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。
如圖19B中所示，在5mg/kg劑量下ch22C10-vc-PAB-MMAE及hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE分別展示107%及105%之腫瘤生長抑制(TGI)。在嵌合或人類化22C10抗體藥物結合物之間，功效無顯著差異。與媒劑或對照ADC相比，較低3mg/kg劑量之hu22C10v2.7-vc-PAB-MMAE展示94%之腫瘤生長抑制(TGI)。
N. h1D11v1.9之變異體
使用如章節F(「單株抗體抗原決定基分組」)中所述之位點特異性突變誘發的標準分子生物學方案製備h1D11v1.9之變異體。
對輕鏈之修飾展示於圖22A中。在h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之輕鏈的CDR-L3中進行胺基酸取代N93D。
對重鏈之修飾展示於圖22B中。在重鏈h1D11v1.9_VarC2之CDR-H3中進行胺基酸取代D96A。將工程改造半胱胺酸(A118C)併入h1D11v1.9_VarC2及h1D11v1.9_VarD之重鏈恆定區中，且亦併入h22C10v2.7中，以位點特異性附接連接子藥物結合物。
O. h1D11v1.9之變異體之某些特性
1. 物種交叉反應性及親和力
藉由如先前在章節E(「抗體親和力」)中描述之史卡查分析，測定h1D11v1.9變異體C2及D之親和力。
如圖23A中所示，抗體變異體維持親本抗體物種特異性與對重組人類或食蟹獼猴或小鼠或大鼠B7-H4及對乳癌細胞株MX-1中表現之內源性人類B7-H4的高親和性。VarC2之親和力為0.9nM(重組人類B7-H4)、2.0nM(MX-1細胞上之人類B7-H4)、1.0nM(重組食蟹獼猴B7-H4)、2.1nM(重組小鼠B7-H4)及1.2nM(重組大鼠B7-H4)，且VarD之親和力為2.9nM(重組人類B7-H4)、7.4nM(MX-1細胞上之B7-H4)、3.7nM(重組食蟹獼猴B7-H4)、5.0nM(重組小鼠B7-H4)及2.7nM(重組大鼠B7-H4)。
2. 抗原決定基定位
使用如圖21頂部(亦參見圖4B)中所示的表現B7-H4之Ig-V或Ig-C樣域之嵌合Ig分子且實質上如實例F中所述，測定h1D11v1.9變異體D(h1D11v1.9varD)抗體在重組人類B7-H4上之結合位點。所有構築體展示嵌合Ig之細胞表面表現，如藉由N端Herpes-gD標籤之10-100倍染色所判斷。h1D11v1.9varD展示與模擬轉染293細胞(圖21，左圖)相比，與表現B7-H4 Ig-V域之Ig-嵌合體顯著結合(約44倍)。此觀測結果藉由在3倍連續濃度(0.1-300μg/ml)可溶性B7-H4 IgV-Fc融合蛋白存在下h1D11v1.9varD(1μg/ml)競爭結合於穩定表現人類B7-H4之293細胞所證實。在此情況下，B7-H4 Ig-V-Fc以劑量依賴性方式抑制 h1D11v1.9varD與293-hB7H4之結合(圖21，中圖)。h1D11v1.9varD與具有B7-H4之Ig-C域之Ig-嵌合體不結合，但在Mol-X Ig-V特定抗體下偵測到顯著結合(39倍)。
B7-H4之Ig-V樣域在位置N112-S114含有單一N連接之糖基化位點。S114經丙胺酸取代，因此移除NXS/T基元，不會引起h1D11v1.9varD之結合顯著喪失(圖21，右圖)。總之，此等觀測結果指示h1D11v1.9varD類似於親本抗體，以與糖基化無關之方式結合於人類B7-H4之Ig-V域。
P. 抗-B7-H4抗體-藥物結合物之活體外效能
使用過度表現重組人類B7-H4之293細胞，測定抗-B7-H4 hu1D11v1.9-varD、hu22C10v2.7、hu1D11v1.9-varD IgG1 A118C及hu22C10v2.7 IgG1 A118C抗體藥物結合物之效能。
實質上如本文在實例H中所述，Hu1D11v1.9-varD、hu22C10v2.7、hu1D11v1.9-varD IgG1 A118C及hu22C10v2.7 IgG1 A118C結合於MC-vc-PAB-MMAE。亦參見Junutula等人，2008,Nat.Biotechnol.26：925-32。每個mAb結合之MC-vc-PAB-MMAE分子之數目藉由LC/MS分析，使用6530 Accurate-Mass Quadrupole飛行時間(Q-TOF)LC/MS(Agilent Technologies)定量。藉由尺寸排阻層析測定純度。簡言之，樣本在加熱至80℃之1000Å 8μm之PRLP-S管柱(50mm×2.1mm，Agilent Technologies)上層析。使用在4.3分鐘內30-60% B之線性梯度(溶劑A，含0.05% TFA之水；溶劑B，含0.04% TFA之乙腈)且使用電噴射來源直接將溶離液電離。收集資料且使用Agilent Mass Hunter定性分析軟體去卷積。在LC/MS分析前，將抗體藥結合物用離胺醯基內肽酶(Wako)在1：100 w/w酶與抗體比率、pH 8.0及37℃下處理30分鐘以產生Fab及Fc部分，從而易於分析。選擇層析條件以實現Fab及Fab+1藥物在不同峰中之基線解析度。使用280nm下UV層 析圖之積分峰面積且與LC/MS去卷積結果中存在之離子豐度正交計算藥物與抗體比率(DAR)。使用LC/MS鑑別峰。A118C硫基mab之藥物：Fab比率為約1：1，且完整A118C硫基mab抗體之藥物：抗體比率(DAR)為約2：1(或約2之DAR)。完整非硫基mab抗體-藥物結合物之DAR為約3。
在96孔盤中，將150μl表現B7-H4之293細胞以1.33×104個細胞/毫升塗鋪且允許恢復24小時。次日，非硫基mab抗體藥物結合物(ADC)以在0.003至10μg/ml範圍內之3倍連續稀釋液添加，且A118C硫基mab ADC以在0.0045至15μg/ml範圍內之3倍稀釋液添加。硫基mab ADC劑量更高以校正ADC之間藥物負載之差異。ADC之稀釋液以4X最終濃度製得；將連續稀釋之藥物以50μl添加至適當孔中。細胞在37℃與5% CO2下培育4天。使用試劑CellTiter-Glo(Promega)測定細胞活力，在Envision 2012 Multi-Label讀數器(Perkin Elmer)上獲得資料，且用Prism 4分析資料。
如圖23B中所示，實線表示非硫基mab ADC且短劃線表示A118C硫基mab ADC(「TDC」)。與對應陰性對照抗-gD-5B6 ADC相比，對於非硫基mab ADC及A118C硫基mab ADC，觀測到過度表現B7-H4之293細胞的類似活體外殺死。hu1D11v1.9-varD-vc-MMAE及hu1D11v1.9-varD IgG1 A118C-vc-MMAE之EC50分別為55.4ng/ml及81.9ng/ml，且hu22C10v2.7-vc-MMAE及hu22C10v2.7 IgG1 A118C-vc-MMAE之EC50分別為33.9ng/ml及40.5ng/ml。
Q. Her2+ HCC-1569x2乳癌細胞異種移植模型中抗-B7-H4變異體C2及D抗體藥物結合物之功效
使用HCC-1569x2(Her2+/ER-)乳癌細胞異種移植模型研究抗-B7-H4hu1D11v1.9-VarC2-vc-MMAE、hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE、hu1D11v1.9-VarC2 IgG1 A118C-vc-MMAE及hu1D11v1.9-VarD ADC IgG1 A118C-vc-MMAE之功效。B7-H4在HCC-1569x2腫瘤異種移植物(解離活腫瘤異種移植細胞或FFPE切片)中高度表現，且藉由IHC及FACS證實(圖24A)。SCID米色小鼠(Charles River Laboratories,San Diego,CA)用HCC-1569x2細胞(於基質膠中5×106)接種至#2/3乳房脂肪墊中，且監測直至腫瘤體積達到約330mm3。小鼠分至8個(VarC2)或9個(VarD)一組，且投與以下單一靜脈內劑量：hu1D11v1.9-VarC2 IgG1 A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；或對照抗-gD-5B6-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；或單獨媒劑(20mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。
將第二組小鼠分成9隻一組之各組，且投與以下單一靜脈內劑量：hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；對照抗-gD-5B6-vc-MMAE，3mg/kg；對照抗-gD-5B6-IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；裸h1D11v1.9-VarD IgG1 A118C，或投與單獨媒劑(20mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。
量測腫瘤且對於研究之持續時間，體重一週收集兩次。腫瘤體積(mm3)係使用下式計算：(長度×寬度2×0.5)。腫瘤生長抑制(TGI)計算為各處理組相對於媒劑，每天經擬合之腫瘤體積-時間曲線(AUC)下面積%，使用下式：%TGI=100×(1-AUC處理/天÷AUC媒劑/天)
100%之TGI值指示腫瘤停滯，TGI>1%但<100%指示腫瘤生長延遲，且TGI>100%指示腫瘤消退。
如圖24B中所示，觀測到h1D11v1.9-VarC2 IgG1 A118C-vc-MMAE在9mg/kg下具有實質功效，其中%TGI為118%(4/8部分反應及4/8完全反應)。亦在3mg/kg及6mg/kg組中看到腫瘤消退，其中%TGI為 96%(1/8部分反應)及108%(3/8部分反應)。另外，未觀測到任何處理組重量減輕。在對照ADC或媒劑下未觀測到反應。
如圖24C中所示，觀測到劑量依賴性功效，其中1.5mg/kg、3mg/kg、6mg/kg及9mg/kg單一劑量之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE分別引起56%、75%、91%及93%之%TGI。在3mg/kg劑量下之功效大致相等，無論小鼠接受hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE還是hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE。未觀測到任何處理組重量減輕。在裸hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C與對照ADC或媒劑下未觀測到反應。
R. TNBC MX-1乳癌細胞異種移植模型中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用MX-1(Her2-/ER-/PR-)乳癌異種移植模型，研究hu1D11v1.9-VarD及hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C ADC之抗-B7-H4 TDC或ADC的功效。B7-H4在MX-1腫瘤異種移植物(解離活腫瘤異種移植細胞或FFPE切片)中高度表現，且藉由IHC及FACS證實(圖25A)。NCR裸小鼠(Taconic,Cambridge City,IN)用MX-1細胞(於基質膠中1×106)接種至#2/3乳房脂肪墊中，且監測直至腫瘤體積達到約240mm3。小鼠分至九個一組，且投與以下單一靜脈內劑量：hu1D11v1.9-VarD-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE，1.5mg/kg或3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；hu1D11v1.9-VarD，9mg/kg；或對照抗-gD-5B6 IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；或單獨媒劑(20mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。
如圖25B中所示，所有劑量之u1D11v1.9-VarD-vc-MMAE或hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE均實現實質性腫瘤消退，其中%TGI在95-119%範圍內(3、6及9mg/kg劑量之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE分別引起114%、117%及119%之%TGI)。在3mg/kg劑量下非硫基mab ADC及硫基mab ADC之功效類似，但對3mg/kg硫基mab ADC之反應在給藥後持續大約25天，其中腫瘤再生小於給與3mg/kg非硫基mab ADC之動物。在整個該研究中，兩組中體重維持。在6mg/kg或9mg/kg hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE下功效提高，因為在研究結束時在此等組中無腫瘤再生徵象或體重減輕(第29天)。媒劑及陰性對照組未展示顯著腫瘤抑制或體重減輕。
S. HCI-002乳癌細胞異種移植模型中抗-B7-H4抗體藥物結合物之功效
使用藉由the Huntsman Cancer Institute(University of Utah)研發之來源於患者之三陰性乳癌(TNBC；Her2-/ER-/PR-)異種移植模型(HCI-002)研究抗-B7-H4 hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE及hu22C10v2.7-vc-MMAE ADC之功效。藉由FACS，B7-H4在來自HCI-002腫瘤異種移植物之解離細胞之細胞表面上表現，不過其低於在MX-1模型中觀測到之情況。IHC展示在FFPE異種移植切片上表現水準類似(圖26A)。NCR裸小鼠用2×2mm腫瘤片段接種至#2/3乳房脂肪墊中，且監測直至腫瘤體積達到約260mm3。小鼠分至七個一組，且投與以下單一靜脈內劑量：hu22C10v2.7-vc-MMAE，3mg/kg；或hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或6mg/kg或9mg/kg；對照抗-gD 5B6 IgG1 A118C-vc-MMAE，3mg/kg或9mg/kg；單獨媒劑(20mM組胺酸乙酸鹽緩衝液)。藉由PK抽血，證實抗體之存在。
如圖26B中所示，所有劑量之hu22C10v2.7-vc-MMAE或hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE均實現實質性腫瘤消退，其中%TGI在112-115%範圍內(3、6及9mg/kg劑量之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE分別引起112%、114%及114%之%TGI)。在3 mg/kg下hu22C10v2.7-vc-MMAE與hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE之間無顯著差異，但兩組中之幾個動物在大約第25天開始展示腫瘤再生。在3mg/kg組中整體上未觀測到體重顯著減輕。在6mg/kg及9mg/kg hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C-vc-MMAE下功效略微提高，因為在研究結束時在此等組中無腫瘤再生徵象或體重減輕(第33天)。媒劑及陰性對照組未展示顯著腫瘤抑制，其中例外為給與9mg/kg抗-gD 5B6 IgG1 A118C-vc-MMAE之小鼠，其延遲腫瘤生長直至第20天，但在研究結束前或結束時達到最大允許腫瘤體積。
在先前實驗中，發現2-3mg/kg劑量之習知ADC靠近在人類臨床試驗研究中觀測到之劑量限制毒性(DLT；2.4mg/kg)。參見Junutula等人，2008,Nat.Biotechnol.26：925-932。已報導THIOMABTM技術(亦即具有工程改造半胱胺酸之抗體，諸如本文中論述之A118C)與相等細胞毒性藥物劑量之習知抗體-藥物結合物相比，提高安全性且不喪失功效。同上。資料表明歸因於在循環中滯溜時間較長且與習知ADC相比藥物與抗體比率較低，3-6mg/kg之間的抗-B7-H4-vc-MMAE THIOMABTM劑量應產生更佳功效及安全性。
T. 大鼠中之抗-B7-H4抗體組織分佈
藉由鋯iPET成像，使用經由側鏈離胺酸結合於去鐵敏B(DFO)螯合基之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C，評估組織分佈。參見例如Verel等人，2003,J.Nucl.Med.44：1271-81。所有研究均根據Genentech,Inc.之AAALAC批准之機構動物護理及使用委員會進行。
動物用3.5%七氟烷輕微麻醉以約束，且藉由升溫氣流維持體溫。向大鼠(n=2個/組)經由側向尾靜脈注射1mCi(700μL，0.7mg/ml)89Zr-mAb。使用Siemens Inveon PET/CT掃描器(Siemens Preclinical Solutions,Knoxville,TN,USA)之PET掃描在第0天及第1天之時間點為15分鐘靜態掃描，且在第2天增加至30分鐘靜態掃描，且 在第5天增加至1小時掃描，以補償放射性衰變。CT掃描緊隨所有PET掃描，以供解剖參考及PET資料之衰減校正。每隻大鼠需要掃描兩次以容納整個身體長度。使用供應商提供之迭代OP-MAP實施，使用設為0.05之β平滑化參數，將列表模式資料重構成具有0.4×0.4mm之256×256共平面立體像素及0.8mm經平面立體像素厚度的影像。參見例如Qi等人，2000,IEEE transactions on medical imaging,19：493-506。
未校正之吸收表示為每公克特定相關區域(ROI；在此實驗中，為諸如卵巢、肺、肝等組織)之平均注射劑量(ID)。每公克放射能之注射劑量百分比(ID)如下確定：%ID/g=ROI活性除以放射能所注射劑量乘以100%。ROI活性為相關區域(ROI)中累積之放射能，其量測為影像掃描上之像素。
如圖27中所示，89Zr標記之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C展示至第5天，與同型匹配對照89Zr-抗-gD類似的組織分佈(血液、脾、腎、肝及肺)，除了卵巢。在16小時之後，89Zr標記之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C展示在血池及卵巢中分佈(圖28A)。當抗體自血池消散時，最大強度投影展示89Zr-標記之hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C與同型對照相比僅僅在卵巢中顯著累積，吸收值分別為2.75% +/- 0.4及1.0% +/- 0.2(圖28B、C)。此結果並不意外，因為hu1D11v1.9-VarD IgG1 A118C結合重組大鼠B7-H4(圖28D)。藉由至第5天，無其他組織展示累積任一成像抗體。
U. 抗-B7-H4抗體不增強小鼠模型中之發炎
在腦脊髓炎(EAE)之實驗模型中評估mu1D11。在第0天，將C57BL/6小鼠用0.2ml含有300μg MOG 35-55肽於0.1ml PBS及0.1ml CFA中之乳液免疫接種。所有組亦接受百日咳毒素(200ng)於0.1ml PBS中之IP注射。測試物品以10mg/kg 3次/週IV投與3週。第二IP劑量 百日咳毒素在第2天給與。臨床評估開始於第7天且藉由臨床檢查，小鼠評估一週3次，直至第25天。臨床評分如下：0-正常小鼠；無明顯疾病徵象。1-尾巴疲軟或後肢無力，但非兩者。2-尾部疲軟及後肢無力。3-部分後肢麻痹。4a-完全後肢麻痹；4b-完全後肢麻痹且前肢中度至嚴重無力。5-藉由EAE，瀕死狀態或死亡。測試物品：陽性對照(mCTLA-4-Ig，mIgG2a)、陰性對照(抗-gp120，mIgG2a)、抗-B7-H4 mu1D11(mIgG2a)。如圖29中所示，藉由mCTLA-4Ig改善EAE，但同型匹配Ig對照或mu1D11(「Ab-11」)抗體在減輕或加重疾病發作或嚴重程度上之間無顯著差異。不欲受任何特定理論束縛，CIA(資料未展示)及EAE模型中缺乏增強之發炎表明腫瘤抑制係歸因於MMAE之作用，而非重新開始抗-B7-H4抗體之抗腫瘤免疫性。
V. 抗-B7H4雙抗原決定基抗體
hu1D11v1.9 varD/hu22C10v2.7之雙抗原決定基抗體分子以杵及臼格式藉由分開表現杵及臼型半抗體臂來產生。表現之半抗體臂分開純化且接著在活體外組裝成雙抗原決定基抗體。簡言之，將hu1D11v1.9之重鏈重新格式化成hu1D11v1.9杵pHIS重鏈(SEQ ID NO：149)及hu1D11v1.9臼FLAG重鏈(SEQ ID NO：151)。將hu22C10v2.7之重鏈重新格式化成hu22C10v2.7杵pHIS重鏈(SEQ ID NO：154)及hu22C10v2.7臼FLAG重鏈(SEQ ID NO：156)。將聚his標籤(pHIS)添加至杵臂之羧基端且FLAG標籤添加至臼臂之羧基端，以純化活體外組裝之雙抗原決定基分子。hu1D11v1.9 varD之輕鏈包括用於藥物結合之K149C突變(SEQ ID NO：145)，hu22C10v2.7之輕鏈(SEQ ID NO：147)亦如此。為產生hu1D11v1.9 varD K149C.杵pHIS/hu22C10v2.7 K149C.臼FLAG，將hu1D11v1.9 varD杵HIS重鏈(SEQ ID NO：149)/hu1D11v1.9 varD K149C輕鏈(SEQ ID NO：145)及hu22C10v2.7臼FLAG重鏈(SEQ ID NO：156)/hu22C10v2.7 K149C輕鏈(SEQ ID NO：147)分開在Expi293細胞中 表現，如下所述。為產生hu22C10v2.7 K149C.杵pHIS/hu1D11v1.9 varD K149C.臼FLAG，將hu22C10v2.7杵pHIS重鏈(SEQ ID NO：154)/hu22C10v2.7 K149C輕鏈(SEQ ID NO：147)及hu1D11v1.9 varD K149C.臼FLAG重鏈(SEQ ID NO：151)/hu1D11v1.9 varD K149C輕鏈(SEQ ID NO：145)分開在Expi 293細胞中表現，如下所述。
雙抗原決定基抗體之各臂在30mL哺乳動物短暫表現培養物中表現為半抗體。簡言之，Expi293細胞(Invitrogen,Inc.)經編碼各半抗體之重鏈及輕鏈(His標記之杵重鏈與輕鏈對，或FLAG標記之臼重鏈與輕鏈對)之質體DNA轉染且按照製造商方案培養。將細胞培養物上清液轉移至含有0.1mL MabSelect Sure樹脂(GE Healthcare Life Sciences)之新鮮管且在平台震盪器(Innova 2000,New Brunswick Scientific)上以200rpm培育隔夜。在靜置之後，樹脂轉移至濾盤且用1mL PBS緩衝液pH 7.4洗滌兩次以移除未結合之蛋白質及培養基組分。在3個連續溶離步驟(溶離總體積為約0.51mL)中用溶離緩衝液(50mM磷酸，pH 2.9)自樹脂溶離結合之半抗體，且藉由添加中和緩衝液(1M精胺酸、0.685M丁二酸鹽，pH 5.0)提高pH值。在分光光度計(Nanodrop 8000,Thermo Scientific)上在280nm之波長下量測吸光度之後計算半抗體製劑之濃度。
分離之半抗體校正至相同濃度且以1：1比率混合。藉由添加1M精胺酸pH 9.5溶液，將混合物之pH值提高至8.0。添加還原之L-麩胱甘肽(於1M精胺酸中之0.5M儲備液，pH 9.5)，使得麩胱甘肽濃度比溶液中蛋白質之量過量200倍。此混合物在32℃下培育24小時以允許半抗體組裝成雙抗原決定基抗體。
使用2步過程，如上所述產生之所需雙抗原決定基抗體(由杵及臼半抗體構成之雜二聚體)與其他物質(未組裝之半抗體及杵-杵或臼-臼均二聚體)分離。第一步包括使用液體處置尖端(Dynamic Devices LLC,1.25mL)，其通常填充(Glycen Corp.)0.1mL Ni-NTA瓊脂糖樹脂(Qiagen)。使用Lynx LM1200液體處置工作站，藉由吸液15個循環，將所有HIS標記之物質(包括未組裝之杵半抗體、杵-杵均二聚體及杵-臼雜二聚體)捕捉至樹脂尖端上。將樹脂尖端用1mL PBS pH 7.4洗滌，且以2個連續溶離步驟(溶離總體積為約0.5mL)，用溶離緩衝液(50mM磷酸鈉、500mM氯化鈉、300mM咪唑pH 7.5)將HIS標記之物質自尖端溶離。溶離樣本用試劑級水1：2稀釋以準備用於下一步驟。
在第一階段分離之後，將0.4mL 50%抗-FLAG抗體樹脂漿液(Genentech)添加至溶離樣本且在4℃下在震盪器上以200rpm培育所得混合物3小時。藉由以1000rpm離心5分鐘，樹脂與上清液分離。將樹脂轉移至濾盤且用1mL PBS pH 7.4洗滌以移除未結合之蛋白質。在3個連續溶離中，使用總共約1.57mL溶離緩衝液(50mM磷酸，pH 2.9)將結合之雙抗原決定基抗體(雜二聚體)自樹脂溶離，且經0.11mL 20x PBS pH 11.0中和，以調整經純化之雙抗原決定基抗體溶液之pH值至6.0。
W. 藉由抗-B7-H4雙抗原決定基抗體之功能結合
評估經組裝之抗-B7-H4雙抗原決定基抗體與MX-1細胞之細胞表面上的腫瘤衍生內源性人類B7-H4的結合。將雙抗原決定基抗體杵-h1D11v1.9 varD：臼-h22C10v2.7(「KH1D+22C」)或杵-h22C10v2：臼-7h1D11v1.9varD(「KH22C+1D」)(各包含輕鏈K149C突變用於附接細胞毒性劑且各經Dylight-650結合物標記)與MX-1細胞在0.01至10μg/ml範圍內3倍步驟之濃度下在冰上一起培育40分鐘。將細胞洗滌且在碘化丙錠存在下再懸浮，緊接著在BD FACSCaliburTM上使用4色參數進行分析。
圖30展示抗-B7-H4雙抗原決定基抗體結合MX-1細胞之表面上之B7-H4，親和力與親本單抗原決定基抗體相當。
X. 雙抗原決定基抗體膜染色及內化
上述Dylight-650結合之抗體用於監測抗體與MX-1細胞之膜的結合及其隨後內化至細胞。MX-1細胞以每腔室約30,000個細胞塗鋪在NuncTM Lab-TekTM 1.0隔室硼矽酸鹽蓋片上。使細胞恢復且生長一天，接著用h1D11v1.9 varD、h22C10v2.7、雙抗原決定基抗體杵-h1D11v1.9 varD：臼-h22C10v2.7或雙抗原決定基杵-h22C10v2：臼-7h1D11v1.9varD染色。將細胞用15μg/ml螢光結合之抗體(各具有每個Ab分子大約6個染料分子)在冰上染色1小時。移除含有抗體之培養基且經新鮮冰冷培養基置換，且保存在冰上，直至成像或轉變至37℃。藉由共聚焦顯微鏡，在以下時間點捕捉影像：0小時、1小時、2小時、3小時、4小時及5小時。製備腔室載玻片用於每個時間點，以將Dylight-650抗體結合物由於暴露於光源之光致漂白降至最低。
圖31A-B展示單抗原決定基親本抗-B7-H4抗體之結果且圖31C-D展示雙抗原決定基抗-B7-H4抗體之結果。5小時時間點展示於圖31中。C及D中之影像展示對於雙抗原決定基抗體，與親本單抗原決定基抗體相比，細胞內更強染色及更多螢光點。
Y. 藉由雙抗原決定基抗-B7-H4抗體活體外殺死乳房腫瘤細胞株
實質上如實例P中所述對單特異性及雙抗原決定基抗-B7-H4抗體之活體外效能進行評估。所有抗體均包含輕鏈K149C突變且結合於vc-PAB-MMAE且藥物抗體比率(DAR)為約2。針對B7-H4陰性MCF-7細胞、B7-H4陽性293hB7-H4細胞、B7-H4陽性MX-1細胞及B7-H4陽性SKBR3細胞測試抗體。
實驗結果展示於圖32A-32D中。如圖32A中所示，單抗原決定基或雙抗原決定基抗-B7-H4 ADC均對B7-H4-乳房腫瘤細胞株MCF-7無影響。相比之下，所有ADC展示針對293-hB7-H4細胞類似之效能，該等細胞在細胞表面上表現大量B7-H4複本(每個細胞約1.2×106個複 本，如使用抗體h1D11v1.9varD所量測)。參見圖32B。如圖32C及32D中所示，在細胞膜上B7-H4含量顯著較低(如使用抗體h1D11v1.9varD所量測，MX-1每個細胞約1×105個複本，且SKBR3每個細胞約1.9×104個複本)之乳房腫瘤細胞株MX-1(三陰性)及SKBR3(Her2+)中，抗-B7-H4雙抗原決定基抗體與親本單抗原決定基抗體相比，更有效地抑制腫瘤細胞生長。
雖然不欲受任何特定理論束縛，但圖31中之結果指示與單抗原決定基抗體相比，在雙抗原決定基抗體下內化程度可更高，表明圖32C及32D中所展示之增強之活體外殺死可能為藥物傳遞至腫瘤細胞提高的結果。
Z. 合成某些連接子-藥物(LD)中間物用於製備表A中示例之某些抗體-藥物結合物
ADC-51之連接子-藥物中間物：(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：875[M+H]+)可藉由WO2013/055987之程序製備。
在氬氣氛圍下在0℃(冰/丙酮)下將硫醯氯(2.35mL 1.0M於DCM中之溶液，2.35mmol)逐滴添加至經攪拌之5-硝基吡啶-2-硫醇(334mg，2.14mmol)於無水DCM(7.5mL)中之懸浮液中。反應混合物自黃色懸浮液變為黃色溶液且升溫至室溫，接著攪拌2小時，此後藉由真 空蒸發來移除溶劑，得到黃色固體。在0℃下在氬氣氛圍下使固體再溶解於DCM(15mL)中且用(R)-2-巰基丙-1-醇(213mg，2.31mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴處理。使反應混合物升溫至室溫且攪拌20小時，此時藉由LC/MS分析顯示在滯留時間1.41分鐘形成實質性產物(ES+)m/z 247([M+H]+，約100%相對強度)。藉由過濾移除沈澱且真空蒸發濾液，得到橙色固體，其經H2O(20mL)處理且用氫氧化銨溶液鹼化。將混合物用DCM(3×25mL)萃取且經合併之萃取物用H2O(20mL)、鹽水(20mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以1%增量增加：100% DCM至98：2 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈油狀之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，21%產率)。
將三光氣(48mg，0.16mmol)添加至攪拌之(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙-1-醇(111mg，0.45mmol)及吡啶(34μL，33.5mg，0.42mmol)於無水DCM(5mL)中之溶液中。將反應混合物在氬氣氛圍下攪拌45分鐘，此後藉由真空蒸發來移除溶劑，得到呈黃色膜狀之氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯。產物未經純化或分析即用於下一步驟。
在室溫下將氯甲酸(R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(約139mg，0.45mmol)於無水DCM(5mL)中之溶液逐滴添加至經攪拌之((戊-1,5-二基雙(氧基))雙(6-((2R)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基環戊烷-1-羰基)-4-甲氧基-3,1-伸苯基))二胺基甲酸二-第三丁酯51a(可藉由WO 2013/055987中實例1之程序製備)(430mg，約0.45mmol)及吡啶(40μL，39mg，0.49mmol)於無水DCM(12mL)中之溶液中。在氬氣氛圍下將反應混合攪拌2.5小時，此時藉由LC/MS分析顯示在滯留時間2.42分鐘形成實質性產物(ES+)m/z 1226([M+H]+，約20%相對強度)、1248([M+Na]+，約60%相對強度)。將混合物用DCM(20mL)稀釋且用SiO2處理，且藉由真空蒸發來移除溶劑。所得殘餘物藉由急驟層析法(梯度溶離以10%增量增加：80：20 v/v己烷/EtOAc至70：30 v/v己烷/EtOAc)進行純化，得到呈黃色泡沫狀之(2-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(((第三丁基二甲基矽烷基)氧基)甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基) 羰基)胺基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)胺基甲酸第三丁酯51b(419mg，76%產率)。(MS(ESI)：1224[M+H]+)
將冰醋酸(24mL)添加至經攪拌的經TBS保護之51b(419mg，0.34mmol)於THF(8mL)及H2O(8mL)中之溶液中。將反應混合物攪拌16小時，此時藉由LC/MS分析顯示反應完成，其中在滯留時間1.82分鐘觀測到所需產物(ES+)m/z 997([M+H]+，約100%相對強度)、1019([M+Na]+，約45%相對強度)。將反應混合物逐滴添加至冷卻(0-5℃)飽和NaHCO3溶液(400mL)。使中性溶液升溫至室溫且用EtOAc(4×100mL)萃取，且將經合併之有機層用H2O(80mL)、鹽水(100mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以1%增量增加：100% DCM至98：2 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈微黃色泡沫狀之(2-((S)-2-(羥基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-5-((5-(4-((S)-2-(羥基甲基)-4-亞甲基吡咯啶-1-羰基)-2-甲氧基-5-((((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)胺基)苯氧基)戊基)氧基)-4-甲氧基苯基)胺基甲酸第三丁酯51c(341mg，100%產率)。(MS(ESI)：995[M+H]+)
在氬氣氛圍下在-45℃(乾冰/CH3CN)下將無水DMSO(107μL， 188mg，1.50mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴添加至經攪拌之乙二醯氯(410μL 2.0M於DCM中之溶液，0.82mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液中。在-45℃下攪拌15分鐘之後，將反應混合物用51c(341mg，0.34mmol)於無水DCM(15mL)中之溶液逐滴處理。在-45℃下又攪拌1小時之後，將反應混合物用TEA(476μL，342mg，3.42mmol)於無水DCM(7.5mL)中之溶液逐滴處理。經1.5小時之時間使反應混合物升溫至室溫且用DCM(50mL)稀釋，接著用飽和NH4Cl(15mL)、飽和NaHCO3(15mL)、鹽水(15mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以0.4%增量增加：100% DCM至98.4：1.6 v/v DCM/MeOH)純化，得到呈微黃色泡沫狀之(11S,11aS)-11-羥基-8-((5-(((11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-2-亞甲基-10-(((R)-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙氧基)羰基)-5-側氧基-2,3,5,10,11,11a-六氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸第三丁酯51d(227mg，67%產率)：LC/MS滯留時間1.69分鐘(ES+)m/z 993([M+H]+，約80%相對強度)、1015([M+Na]+，約20%相對強度)。
在0℃(丙/丙酮)下將95：5 v/v TFA/H2O溶液(4mL)添加至51d(216mg，0.22mmol)之粗樣本中。在0℃下攪拌30分鐘之後，反應可如藉由LC/MS判斷，認為完成，所需產物峰在滯留時間1.60分鐘下(ES+)m/z 875([M+H]+，約100%相對強度)。保持反應混合物為冷的，且逐滴添加至冷卻之飽和NaHCO3水溶液(100mL)中。將混合物用DCM(3×30mL)萃取且經合併之有機層用鹽水(50mL)洗滌，乾燥(MgSO4)，過濾且真空蒸發，得到粗產物。藉由急驟層析法(梯度溶離以0.4%增量增加：100% CHCl3至98.4：1.6 v/v CHCl3/MeOH)純化，得到呈黃色泡沫狀之LD-51(127mg，66%產率)：LC/MS(操作15分 鐘)，滯留時間6.18分鐘(ES+)m/z 875([M+H]+，約100%相對強度)；1H NMR(400MHz,CDCl3)δ 9.21(s,1H),8.30(d,1H,J=8.8Hz),7.69(d,1H,J=4.5Hz),7.62(d,1H,J=8.9Hz),7.49(s,1H),7.25(s,1H),6.79(s,1H),6.74(s,1H),5.58(dd,1H,J=4.4,9.8Hz),5.22-5.10(m,4H),4.43(d,1H,J=3.7Hz),4.33-4.25(m,4H),4.15-3.98(m,5H),3.95-3.80(m,7H),3.68-3.59(m,1H),3.20-3.07(m,2H),2.99-2.87(m,2H),2.76-2.68(m,2H),1.99-1.83(m,4H),1.72-1.57(m,2H),1.19(d,3H,J=6.6Hz)。
ADC-52之連接子-藥物中間物：(2,5-雙((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)苯基)胺基甲酸2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：1098[M+H]+)可藉由WO 2015/023355LD-53之程序製備。二氫磷酸(S)-1-(氯甲基)-3-((E)-3-(4-((E)-3-((S)-1-(氯甲基)-5-(膦醯氧基)-1,2-二氫-3H-苯并[e]吲哚-3-基)-3-側氧基丙-1-烯-1-基)-2-(2-(2-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)乙氧基)乙氧基)苯基)丙烯醯基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚-5-基酯(MS(ESI)：994[M+H]+)可藉由WO 2015/023355之程序製備。
ADC-54之連接子-藥物中間物：(11S,11aS)-11-羥基-7-甲氧基-8-((5-(((S)-7-甲氧基-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,5,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-8-基)氧基)戊基)氧基)-2-亞甲基-5-側氧基-2,3,11,11a-四氫-1H-苯并[e]吡咯并[1,2-a][1,4]二氮呯-10(5H)-甲酸(R)-2-((3-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙酯(MS(ESI)：876[M+H]+)可藉由WO 2013/055987之程序製備。
ADC-55之連接子-藥物中間物：雙(甲基胺基甲酸)4-((S)-2-((S)-2-(6-(2,5-二側氧基-2,5-二氫-1H-吡咯-1-基)己醯胺基)-3-甲基丁醯胺基)-5-脲基戊醯胺基)苯甲酯(2-側氧基-2-((2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基- 4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-基)乙基)乙-1,2-二基酯。
按照US 8389697之實例3，向PNU-159682(15.3mg，0.02038mmol)(其可如WO 1998/02446及US 8470984實例1中報導製備)於3ml甲醇及2ml H2O中之溶液中添加NaIO4(5.1mg，0.0238mmol)於1ml H2O中之溶液。將反應混合物在室溫下攪拌3小時，直至無法偵測到起始物質(TLC及HPLC分析)。溶劑減壓移除，且粗紅色固體(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-{[(1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5][1,3]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基]氧基}-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲酸55a(MS(ESI)：628[M+H]+)藉由WO 2010/009124之程序轉化成LD-55(MS(ESI)：1355[M+H]+)。
ADC-56之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)乙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：842[M+H]+)可藉由WO 2013/055987之程序製備。
ADC-57之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并 [4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：856[M+H]+)可藉由US8389697之程序製備。
ADC-58之連接子-藥物中間物：(2S,4S)-2,5,12-三羥基-7-甲氧基-4-(((1S,3R,4aS,9S,9aR,10aS)-9-甲氧基-1-甲基八氫-1H-哌喃并[4',3'：4,5]噁唑并[2,3-c][1,4]噁嗪-3-基)氧基)-N-(2-甲基-2-((5-硝基吡啶-2-基)二硫基)丙基)-6,11-二側氧基-1,2,3,4,6,11-六氫并四苯-2-甲醯胺(MS(ESI)：870[M+H]+)可藉由US8389697之程序製備。
雖然出於清楚瞭解之目的，前述本發明已藉助於說明及實例詳細地描述，但描述及實例不應解釋為限制本發明之範疇。本文引用的所有專利及科學文獻之揭示內容以全文引用的方式明確併入本文中。
<110> 美商建南德克公司 史蒂芬 R 梁 安佐 波森 保羅 波拉基斯 雁 吳 梁偉慶 朗 費爾斯丹
<120> 抗-B7-H4抗體及免疫結合物
<130> 01146-0038-00PCT
<150> US 62/049,701
<151> 2014-09-12
<160> 166
<170> PatentIn version 3.5
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 HC FR3
<400> 51
<210> 52
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 HC FR3
<400> 52
<210> 53
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 HC FR3
<400> 53
<210> 54
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 HC FR4
<400> 54
<210> 55
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10輕鏈可變區
<400> 55
<210> 56
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈可變區；hu22C10.v2.8重鏈可變區
<400> 56
<210> 57
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.8輕鏈可變區
<400> 57
<210> 58
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR H1
<400> 58
<210> 59
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR H2
<400> 59
<210> 60
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR H3
<400> 60
<210> 61
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR L1
<400> 61
<210> 62
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR L2
<400> 62
<210> 63
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HVR L3
<400> 63
<210> 64
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 LC FR1
<400> 64
<210> 65
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 LC FR2
<400> 65
<210> 66
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.8 LC FR2
<400> 66
<210> 67
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 LC FR3
<400> 67
<210> 68
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 LC FR4
<400> 68
<210> 69
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HC FR1
<400> 69
<210> 70
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HC FR2
<400> 70
<210> 71
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HC FR3
<400> 71
<210> 72
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HC FR4
<400> 72
<210> 73
<211> 282
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 人類B7_H4前驅體；信號序列=胺基酸1-28
<400> 73
<210> 74
<211> 254
<212> PRT
<213> 人類
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 人類B7-H4成熟，無信號序列；胺基酸29至282
<400> 74
<210> 75
<211> 282
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 食蟹獼猴B7-H4前驅體；信號序列=胺基酸1-28
<400> 75
<210> 76
<211> 254
<212> PRT
<213> 食蟹獼猴
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 食蟹獼猴B7-H4成熟，無信號序列；胺基酸29-282
<400> 76
<210> 77
<211> 282
<212> PRT
<213> 大鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(282)
<223> 大鼠B7-H4前驅體；信號序列=胺基酸1-28
<400> 77
<210> 78
<211> 254
<212> PRT
<213> 大鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 大鼠B7-H4成熟，無信號序列；胺基酸29-282
<400> 78
<210> 79
<211> 283
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(283)
<223> 小鼠B7_H4前驅體；信號序列=胺基酸1-28
<400> 79
<210> 80
<211> 255
<212> PRT
<213> 小鼠
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(255)
<223> 小鼠B7-H4成熟，無信號序列；胺基酸29至283
<400> 80
<210> 81
<211> 278
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(278)
<223> 黑猩猩B7-H4前驅體；信號序列=胺基酸1-24
<400> 81
<210> 82
<211> 254
<212> PRT
<213> 黑猩猩
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(254)
<223> 黑猩猩B7-H4成熟，無信號序列；胺基酸25至278
<400> 82
<210> 83
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.1 LC FR2
<400> 83
<210> 84
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v2 LC FR3
<400> 84
<210> 85
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 LC FR3
<400> 85
<210> 86
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.2 LC FR3
<400> 86
<210> 87
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.3 LC FR3
<400> 87
<210> 88
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11 HC FR3
<400> 88
<210> 89
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v3 HC FR3
<400> 89
<210> 90
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v4 HC FR3
<400> 90
<210> 91
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.4 HC FR3
<400> 91
<210> 92
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.5 HC FR3
<400> 92
<210> 93
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11輕鏈可變區；
<400> 93
<210> 94
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.3輕鏈可變區
<400> 94
<210> 95
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.2輕鏈可變區
<400> 95
<210> 96
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.1輕鏈可變區
<400> 96
<210> 97
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v2輕鏈可變區
<400> 97
<210> 98
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v3輕鏈可變區；hu1D11.v4輕鏈可變區
<400> 98
<210> 99
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.5重鏈可變區
<400> 99
<210> 100
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.4重鏈可變區
<400> 100
<210> 101
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11重鏈可變區
<400> 101
<210> 102
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v3重鏈可變區
<400> 102
<210> 103
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v4重鏈可變區
<400> 103
<210> 104
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v1輕鏈可變區
<400> 104
<210> 105
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.1輕鏈可變區
<400> 105
<210> 106
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.2輕鏈可變區；hu22C10.v2.8輕鏈可變區
<400> 106
<210> 107
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.6重鏈可變區
<400> 107
<210> 108
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.5重鏈可變區
<400> 108
<210> 109
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.4重鏈可變區
<400> 109
<210> 110
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.3重鏈可變區
<400> 110
<210> 111
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10重鏈可變區；
<400> 111
<210> 112
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v3重鏈可變區；
<400> 112
<210> 113
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v4重鏈可變區；
<400> 113
<210> 114
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v5重鏈可變區；
<400> 114
<210> 115
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.1 LC FR2
<400> 115
<210> 116
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.2 LC FR2
<400> 116
<210> 117
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v1 LC FR3
<400> 117
<210> 118
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.6 HC FR3
<400> 118
<210> 119
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.5 HC FR3
<400> 119
<210> 120
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.4 HC FR3
<400> 120
<210> 121
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.3 HC FR3
<400> 121
<210> 122
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10 HC FR3
<400> 122
<210> 123
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v3 HC FR3
<400> 123
<210> 124
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v4 HC FR3
<400> 124
<210> 125
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v5 HC FR3
<400> 125
<210> 126
<211> 108
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2輕鏈可變區
<400> 126
<210> 127
<211> 121
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2重鏈可變區
<400> 127
<210> 128
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2 HVR H3
<400> 128
<210> 129
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2 HVR L3
<400> 129
<210> 130
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2 IgG1重鏈
<400> 130
<210> 131
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD IgG1重鏈
<400> 131
<210> 132
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2 IgG1 A118C重鏈
<400> 132
<210> 133
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD IgG1 A118C重鏈
<400> 133
<210> 134
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2、varD IgK輕鏈
<400> 134
<210> 135
<211> 330
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：IgG1 S400C重鏈恆定區
<400> 135
<210> 136
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：IgK V205C輕鏈恆定區
<400> 136
<210> 137
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgG1 A118C重鏈
<400> 137
<210> 138
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgK輕鏈
<400> 138
<210> 139
<211> 106
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：IgK K149C輕鏈恆定區
<400> 139
<210> 140
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2、varD IgK K149C輕鏈前驅體
<400> 140
<210> 141
<211> 233
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2、varD IgK V205C輕鏈前驅體
<400> 141
<210> 142
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgK K149C輕鏈前驅體
<400> 142
<210> 143
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgK V205C輕鏈前驅體
<400> 143
<210> 144
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgG1重鏈
<400> 144
<210> 145
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2、varD IgK K149C輕鏈
<400> 145
<210> 146
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varC2、varD IgK V205C輕鏈
<400> 146
<210> 147
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgK K149C輕鏈
<400> 147
<210> 148
<211> 213
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7 IgK V205C輕鏈
<400> 148
<210> 149
<211> 459
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈杵pHIS
<400> 149
<210> 150
<211> 1380
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：示例性hu1D11.v1.9 varD重鏈杵pHIS編碼序列
<400> 150
<210> 151
<211> 461
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈臼FLAG
<400> 151
<210> 152
<211> 1386
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：示例性hu1D11.v1.9 varD重鏈臼FLAG編碼序列
<400> 152
<210> 153
<211> 645
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：示例性hu1D11.v1.9 varD Igk K149C輕鏈編碼序列
<400> 153
<210> 154
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈杵pHIS
<400> 154
<210> 155
<211> 1365
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：示例性hu22C10.v2.7重鏈杵pHIS編碼序列
<400> 155
<210> 156
<211> 456
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈臼FLAG
<400> 156
<210> 157
<211> 1371
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<2.23> 合成性：示例性hu22C10.v2.7重鏈臼FLAG編碼序列
<400> 157
<210> 158
<211> 642
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：示例性hu22C10.v2.7 Igk K149C輕鏈編碼序列
<400> 158
<210> 159
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈杵
<400> 159
<210> 160
<211> 451
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈臼
<400> 160
<210> 161
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈杵
<400> 161
<210> 162
<211> 446
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈臼
<400> 162
<210> 163
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈杵
<400> 163
<210> 164
<211> 450
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu1D11.v1.9 varD重鏈臼
<400> 164
<210> 165
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈杵
<400> 165
<210> 166
<211> 445
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成性：hu22C10.v2.7重鏈臼
<400> 166

Claims (100)

  1. 一種結合於B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2；或(b)(i)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(ii)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3，及(iii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3；或(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，及(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3。
  3. 如請求項1或請求項2之抗體，其進一步包含SEQ ID NO：53之重鏈構架FR3序列。
  4. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含(a)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(b)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(c)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
  5. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO：47之輕鏈構架FR3序列。
  6. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含(a)與SEQ ID NO：38之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列； (b)與SEQ ID NO：126之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VL序列；或(c)與SEQ ID NO：127之胺基酸序列具有至少95%序列一致性之VH序列；或(d)如(a)中之VH序列及如(b)中之VL序列；或(e)如(c)中之VH序列及如(b)中之VL序列。
  7. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO：38或127之VH序列。
  8. 如前述請求項中任一項之抗體，其包含SEQ ID NO：126之VL序列。
  9. 一種結合於B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含(a)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(b)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
  10. 一種結合於B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3。
  11. 如前述請求項中任一項之抗體，其為單株抗體。
  12. 如前述請求項中任一項之抗體，其為人類、人類化或嵌合抗 體。
  13. 如前述請求項中任一項之抗體，其為結合B7-H4之抗體片段。
  14. 如前述請求項中任一項之抗體，其為IgG1、IgG2a或IgG2b抗體。
  15. 如前述請求項中任一項之抗體，其中該抗體包含一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基。
  16. 如請求項15之抗體，其中該一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基位於輕鏈中。
  17. 如請求項15之抗體，其中該一或多個工程改造半胱胺酸胺基酸殘基位於重鏈中。
  18. 如請求項17之抗體，其中該抗體在重鏈恆定區中包含至少一個選自A118C及S400C之突變。
  19. 如請求項16之抗體，其中該抗體在輕鏈恆定區中包含至少一個選自K149C及V205C之突變。
  20. 一種結合於B7-H4之分離抗體，其中該抗體包含(a)SEQ ID NO：132之重鏈序列及SEQ ID NO：134之輕鏈序列；或(b)SEQ ID NO：133之重鏈序列及SEQ ID NO：134之輕鏈序列；或(c)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：140之輕鏈序列；或(d)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：141之輕鏈序列；或(e)SEQ ID NO：131之重鏈序列及SEQ ID NO：140之輕鏈序列；或(f)SEQ ID NO：131之重鏈序列及141之輕鏈序列；或(g)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：142之輕鏈序列；或(h)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：143之輕鏈序列；或(i)SEQ ID NO：137之重鏈序列及SEQ ID NO：138之輕鏈序列；或(j)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；或(d)SEQ ID NO：130之重鏈序列及SEQ ID NO：146之輕鏈序列； 或(e)SEQ ID NO：131之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；或(f)SEQ ID NO：131之重鏈序列及146之輕鏈序列；或(g)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列；或(h)SEQ ID NO：144之重鏈序列及SEQ ID NO：148之輕鏈序列。
  21. 一種雙抗原決定基抗體，其包含第一半抗體及第二半抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基之第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基之第二VH/VL單元。
  22. 如請求項21之雙抗原決定基抗體，其中該第一抗原決定基或該第二抗原決定基為整個或一部分含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基。
  23. 如請求項21或請求項22之雙抗原決定基抗體，其中該第一抗原決定基或該第二抗原決定基不在該B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在該含有B7-H4 Ig-V之結構域內。
  24. 如請求項23之雙抗原決定基抗體，其中該第一抗原決定基在整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內且該第二抗原決定基不在該B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在該含有B7-H4 Ig-V之結構域內；或其中該第一抗原決定基不在該B7-H4 Ig-V結構域內或不完全在該含有B7-H4 Ig-V之結構域內，且該第二抗原決定基在整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內。
  25. 如請求項21至24中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第一抗原決定基及該第二抗原決定基各獨立地選自：a)在整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；b)在整個或一部分該含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基；以及 c)在整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基。
  26. 如請求項25之雙抗原決定基抗體，其中該含有B7-H4 Ig-V之結構域具有SEQ ID NO：73之胺基酸29-157之序列。
  27. 如請求項25或請求項26之雙抗原決定基抗體，其中含有B7-H4 Ig-C之結構域具有SEQ ID NO：73之胺基酸158-250之序列。
  28. 如請求項21至27中任一項之雙抗原決定基抗體，其中：a)該第一半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基；或b)該第一半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或c)該第一半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或d)該第一半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；或e)該第一半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基；或f)該第一半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-C之結構域內的抗原決定基。
  29. 如請求項28之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體結合整個 或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基；或其中該第一半抗體結合整個或一部分該等含有B7-H4 Ig-V及Ig-C之結構域內的抗原決定基，且該第二半抗體結合整個或一部分該含有B7-H4 Ig-V之結構域內的抗原決定基。
  30. 如請求項21至24中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(c)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(d)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
  31. 如請求項21至24中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第二半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：128之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3； (b)(i)包含SEQ ID NO：39之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：43之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：129之胺基酸序列之HVR-L3；(c)SEQ ID NO：38之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列；或(d)SEQ ID NO：127之VH序列及SEQ ID NO：126之VL序列。
  32. 如請求項21至24及31中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列。
  33. 如請求項21至24及30中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第二半抗體包含：(a)(i)包含SEQ ID NO：58之胺基酸序列之HVR-H1，(ii)包含SEQ ID NO：59之胺基酸序列之HVR-H2，(iii)包含SEQ ID NO：60之胺基酸序列之HVR-H3，(iv)包含SEQ ID NO：61之胺基酸序列之HVR-L1，(v)包含SEQ ID NO：62之胺基酸序列之HVR-L2，及(vi)包含SEQ ID NO：63之胺基酸序列之HVR-L3；或(b)SEQ ID NO：56之VH序列及SEQ ID NO：55之VL序列。
  34. 如請求項21至33中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該抗體為IgG1或IgG4抗體。
  35. 如請求項21至34中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該第一半 抗體含有包含杵突變之第一重鏈恆定區且該第二重鏈含有包含臼突變之第二重鏈恆定區；或其中該第一半抗體含有包含臼突變之第一重鏈恆定區且該第二重鏈含有包含杵突變之第二重鏈恆定區。
  36. 如請求項21至35中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該抗體為IgG1抗體且其中該杵突變包含T366W突變。
  37. 如請求項21至36中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該抗體為IgG1抗體且其中該臼突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V之突變。
  38. 如請求項21至35中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該抗體為IgG4抗體且其中該杵突變包含T366W突變。
  39. 如請求項21至35中任一項之雙抗原決定基抗體，其中該抗體為IgG4抗體且其中該臼突變包含至少一個、至少兩個或三個選自T366S、L368A及Y407V突變之突變。
  40. 如請求項21至35中任一項之雙抗原決定基抗體，其中：a)該第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列；b)該第一半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列；c)該第一半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列；d)該第一半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列；e)該第二半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列；f)該第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列；g)該第二半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列；或h)該第二半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列。
  41. 如請求項21至35中任一項之雙抗原決定基抗體，其中：a)該第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列；或b)該第一半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147或148之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145或146之輕鏈序列。
  42. 一種雙抗原決定基抗體，其包含第一半抗體及第二半抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列。
  43. 一種雙抗原決定基抗體，其包含第一半抗體及第二半抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第一半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列。
  44. 如前述請求項中任一項之抗體，其中B7-H4為SEQ ID NO：73之人類B7-H4。
  45. 一種分離核酸，其編碼：a)如請求項1至20及44中任一項之抗體；b)如請求項21至44中任一項之雙抗原決定基抗體，c)如請求項21至44中任一項之雙抗原決定基抗體之第一半抗體，或d)如請求項21至44中任一項之雙抗原決定基抗體之第二半抗體。
  46. 一種宿主細胞，其包含如請求項45之核酸。
  47. 一種產生抗體之方法，其包含培養如請求項45之宿主細胞，從而產生該抗體或半抗體。
  48. 一種免疫結合物，其包含如請求項1至44中任一項之抗體及細胞毒性劑。
  49. 如請求項48之免疫結合物，其中該細胞毒性劑經由該抗體序列中工程改造半胱胺酸與該抗體結合。
  50. 如請求項48或請求項49之免疫結合物，其具有式Ab-(L-D)p，其中：(a)Ab為如請求項1至44中任一項之抗體；(b)L為連接子；(c)D為該細胞毒性劑；及(d)p在1-8範圍內。
  51. 如請求項48至50中任一項之免疫結合物，其中該細胞毒性劑係選自類美登素(maytansinoid)、阿瑞他汀(auristatin)、卡奇黴素(calicheamicin)、吡咯并苯并二氮呯、奈莫柔比星(nemorubicin)衍生物及1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
  52. 如請求項48至51中任一項之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為阿瑞他汀。
  53. 如請求項52之免疫結合物，其中D具有式DE 且其中R2及R6各為甲基，R3及R4各為異丙基，R5為H，R7為第二丁基，各R8獨立地選自CH3、O-CH3、OH及H；R9為H；且R18為-C(R8)2-C(R8)2-芳基。
  54. 如請求項53之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為MMAE。
  55. 如請求項49至51中任一項之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為式A之吡咯并苯并二氮呯： 其中點線指示C1與C2或C2與C3之間視情況存在雙鍵；R2獨立地選自H、OH、=O、=CH2、CN、R、OR、=CH-RD、=C(RD)2、O-SO2-R、CO2R及COR，且視情況進一步選自鹵基或二鹵基，其中RD獨立地選自R、CO2R、COR、CHO、CO2H及鹵基；R6及R9獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；R7獨立地選自H、R、OH、OR、SH、SR、NH2、NHR、NRR'、NO2、Me3Sn及鹵基；Q獨立地選自O、S及NH； R11為H或R，或其中Q為O、SO3M，其中M為金屬陽離子；R及R'各獨立地選自視情況經取代之C1-8烷基、C3-8雜環基及C5-20芳基，且視情況關於該基團NRR'，R及R'連同其附接之氮原子一起形成視情況經取代之4、5、6或7員雜環；R12、R16、R19及R17係如分別針對R2、R6、R9及R7所定義；R"為C3-12伸烷基，該鏈可雜有一或多個雜原子及/或視情況經取代之芳環；且X及X'獨立地選自O、S及N(H)。
  56. 如請求項55之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有如下結構： 其中n為0或1。
  57. 如請求項49至51中任一項之免疫結合物，其中該細胞毒性劑為奈莫柔比星衍生物。
  58. 如請求項57之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有選自以下各者之結構：
  59. 如請求項49至51中任一項之免疫結合物，其中該細胞毒性劑包含1-(氯甲基)-2,3-二氫-1H-苯并[e]吲哚(CBI)。
  60. 如請求項59之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有下式： 其中R1係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於L之鍵；R2係選自H、P(O)3H2、C(O)NRaRb或鍵結於L之鍵；Ra及Rb獨立地選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基，或Ra及Rb形成五或六員雜環基；T為選自C3-C12伸烷基、Y、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)-Y-(C1-C6伸烷基)、(C2-C6伸烯基)-Y-(C2-C6伸烯基)及(C2-C6伸炔基)-Y-(C2-C6伸炔基)之繫栓基團；其中Y獨立地選自O、S、NR1、芳基及雜芳基；其中伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經F、OH、O(C1-C6烷基)、NH2、NHCH3、N(CH3)2、OP(O)3H2及C1-C6 烷基取代，其中烷基視情況經一或多個F取代；或伸烷基、伸烯基、芳基及雜芳基獨立且視情況經鍵結於L之鍵取代；D'為選自以下各者之藥物部分： 其中波形線指示與T之附接位點；X1及X2獨立地選自O及NR3，其中R3係選自H及視情況經一或多個F取代之C1-C6烷基；R4為H、CO2R或鍵結於連接子(L)之鍵，其中R為C1-C6烷基或苯甲基；且R5為H或C1-C6烷基。
  61. 如請求項59或請求項60之免疫結合物，其中該細胞毒性劑具有選自以下各者之結構：
  62. 如請求項59或請求項60之免疫結合物，其中該細胞毒性劑包含如下結構：
  63. 如請求項50至62中任一項之免疫結合物，其中該連接子可藉由蛋白酶裂解。
  64. 如請求項63之免疫結合物，其中該連接子包含val-cit二肽或Phe-Lys二肽。
  65. 如請求項50至62中任一項之免疫結合物，其中該連接子對酸為不穩定。
  66. 如請求項65之免疫結合物，其中該連接子包含腙。
  67. 如請求項48至52中任一項之免疫結合物，其具有下式： 其中S為硫原子。
  68. 如請求項49、50或55之免疫結合物，其具有下式：
  69. 如請求項49、50、57或58之免疫結合物，其具有選自以下各者之式：
  70. 如請求項49、50及59至62中任一項之免疫結合物，其具有選自以下各者之結構：
  71. 如請求項50至70中任一項之免疫結合物，其中p在2-5或1.4-2範圍內。
  72. 如請求項50至71中任一項之免疫結合物，其包含如請求項9、10、20或42之抗體。
  73. 一種醫藥調配物，其包含如請求項49至72中任一項之免疫結合物及醫藥學上可接受之載劑。
  74. 如請求項73之醫藥調配物，其進一步包含其他治療劑。
  75. 如請求項74之醫藥調配物，其中該其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗(bevacizumab))。
  76. 一種治療患有B7-H4陽性癌症之個體之方法，該方法包含向該個體投與有效量之如請求項47至72中任一項之免疫結合物。
  77. 如請求項76之方法，其中該B7-H4陽性癌症係選自乳癌、卵巢癌及子宮內膜癌。
  78. 如請求項76或77之方法，其中該B7-H4陽性癌症為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。
  79. 如請求項76至78中任一項之方法，其進一步包含向該個體投與其他治療劑。
  80. 如請求項79之方法，其中該其他治療劑為Avastin®(貝伐單抗)。
  81. 一種抑制B7-H4陽性細胞之增殖的方法，該方法包含將該細胞暴露於如請求項48至72中任一項之免疫結合物容許該免疫結合物與該細胞表面上之B7-H4結合的條件下，藉此抑制該細胞增殖。
  82. 如請求項81之方法，其中該細胞為乳癌、卵巢癌或子宮內膜癌細胞。
  83. 如請求項81或82之方法，其中該細胞為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。
  84. 如請求項1至44中任一項之抗體，其結合於標記。
  85. 如請求項84之抗體，其中該標記為正電子發射體。
  86. 如請求項85之抗體，其中該正電子發射體為89Zr。
  87. 一種偵測生物檢體中人類B7-H4之方法，其包含使該生物檢體與如請求項1至44及84至86中任一項之抗-B7-H4抗體在容許該抗-B7-H4抗體與天然存在之人類B7-H4結合之條件下接觸，且偵測該生物檢體中該抗-B7-H4抗體與天然存在之人類B7-H4之間是否 形成複合物。
  88. 如請求項87之方法，其中該抗-B7-H4抗體為如請求項9、10、20、42或43之抗體。
  89. 如請求項87或請求項88之方法，其中該生物檢體為乳癌檢體、卵巢癌檢體或子宮內膜癌檢體。
  90. 如請求項87至89中任一項之方法，其中該生物檢體為三陰性(ER-/PR-/Her2-)乳癌。
  91. 一種偵測B7-H4陽性癌症之方法，其包含(i)向患有或懷疑患有B7-H4陽性癌症之個體投與經標記之抗-B7-H4抗體，其中該經標記之抗-B7-H4抗體包含如請求項1至44中任一項之抗-B7-H4抗體，及(ii)偵測該個體中該經標記之抗-B7-H4抗體，其中該經標記之抗-B7-H4抗體的偵測指示該個體中之B7-H4陽性癌症。
  92. 如請求項91之方法，其中該經標記之抗-B7-H4抗體為經標記之如請求項9、10、20、43或44之抗體。
  93. 如請求項91或請求項92之方法，其中該經標記之抗-B7-H4抗體包含結合於正電子發射體之抗-B7-H4抗體。
  94. 如請求項93之抗體，其中該正電子發射體為89Zr。
  95. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為結合人類B7-H4之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：133之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：134之胺基酸序列的輕鏈；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為該等重鏈中之 A118C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
  96. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為結合人類B7-H4之抗體，其中該抗體含有包含SEQ ID NO：132之胺基酸序列的重鏈及含有SEQ ID NO：134之胺基酸序列的輕鏈；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為該等重鏈中之A118C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
  97. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：162或166之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為在該等輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
  98. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第一半抗體包含SEQ ID NO：161或165之重鏈序列及SEQ ID NO：147之輕鏈序列，且該第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為在該等輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
  99. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第一半抗體包含SEQ ID NO：159或163之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為在該等輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
  100. 一種免疫結合物，其包含結合於細胞毒性劑之抗體(Ab)且具有以下結構： 其中Ab為包含第一半抗體及第二半抗體之雙抗原決定基抗體，其中該第一半抗體包含結合B7-H4之第一抗原決定基的第一VH/VL單元，且其中該第二半抗體包含結合B7-H4之第二抗原決定基的第二VH/VL單元，其中該第二半抗體包含SEQ ID NO：160或164之重鏈序列及SEQ ID NO：145之輕鏈序列；且其中該細胞毒性劑與該抗體之一或多個工程改造半胱胺酸結合，其中該工程改造半胱胺酸為在該等輕鏈中之K149C半胱胺酸取代；且其中p為1.4-2。
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