DE69836131T3

DE69836131T3 - Neue menschliche delta3-zusammensetzung und deren therapeutische und diagnostische verwendungen

Info

Publication number: DE69836131T3
Application number: DE69836131.8T
Authority: DE
Inventors: Sean McCarthy; David Gearing
Original assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-04-04
Filing date: 1998-04-06
Publication date: 2017-06-14
Anticipated expiration: 2018-04-07
Also published as: EP0972041B2; JP2001521382A; ATE342358T1; DE69836131T2; AU6952498A; DE69836131D1; CA2285020A1; EP0972041B1; EP0972041A1; WO1998045434A1; ES2275304T3

Description

1. Technischer Hintergrund der Erfindung
In den entwickelten Ländern ist der Schlaganfall die dritthäufigste Todesursache und der Hauptgrund für eine erworbene Körper- oder Geistesbehinderung. Bei der vaskulären Demenz handelt es sich nach Morbus Alzheimer um die zweithäufigste Ursache für Demenz. CADASIL (für: „Cerebral Autosomal Dominant Arteriopathy with Subcortical Infarcts and Leukoencephalopathy”) verursacht einen Typ von Schlaganfall und Demenz, dessen Schlüsselmerkmale wiederkehrende subkortikale ischämische Ereignisse, fortschreitende vaskuläre Demenz, das Kranium und Gesicht betreffende Lähmung, Migräne sowie Gemütserkrankungen mit schwerer Depression beinhalten (Chabriat, H. Et al., (1995) Lancet 346: 934–939). Diese Symptome treten üblicherweise zuerst im Alter von etwa 45 Jahren auf, und Patienten sterben typischerweise vor Erreichen des 65. Lebensjahrs. Es wird vermutet, daß das Leiden weitgehend nicht diagnostiziert wird, weswegen die Prävalenz nicht genau bekannt ist.
CADASIL ist mit diffusen Abnormalitäten der weißen Materie bei der Neuroimaging-Technik [bildliche Darstellung von Nervenstrukturen und -funktionen] assoziiert (Tournier-Lasserve, E. et al., (1991) Stroke 22: 1297–1302). Die pathologische Untersuchung zeigt mehrere kleine, tiefe Hirninfarkte, eine Leukoencephalopathie sowie eine hauptsächlich die kleinen Hirnarterien betreffende nichtatherosklerotische, nichtamyloide Angiopathie auf (Baudrimont, M. et al., (1993) Stroke 24: 122–125). Bei der Ultrastrukturanalyse sind starke Veränderungen der vaskulären glatten Muskelzellen zu sehen (Ruchoux, M. M. et al., (1995) Acta. Neuropathol. 89: 500–512).
Es konnte kürzlich gezeigt werden, daß das menschliche Notch3-Gen, das auf Chromosom 19 lokalisiert ist, in CADASIL-Patienten mutiert ist (Joutel. A. et al., (1996) Nature 383: 707–710). Die meisten dieser Mutationen führen zu Aminosäureaustauschen in der extrazellulären Domäne. Daher scheint die Unterbrechung des Notch-Signalisierungswegs für CADASIL-Schlaganfall und -Demenz verantwortlich zu sein.
Defekte im Notch-Signalisierungsweg können auch an anderen neurologischen Erkrankungen, beispielsweise Morbus Alzheimer, beteiligt sein. Tatsächlich sind ungefähr 10% der Fälle von Morbus Alzheimer mit Mutationen in die Amyloidvorläuferproteine Präsenilin 1 (PS1) und Präsenilin 2 (PS2) codierenden Genen assoziiert. Etwa 25% der früh auftretenden familiären Alzheimer-Fälle sind mit einer Mutation in PS1 assoziiert. Bei PS1 und PS2 handelt es sich um Transmembranproteine, die zu dem vom Gen sel-12 codierten Protein aus C. elegans, von dem gezeigt werden konnte, daß es mit dem Gen lin-12 aus C. elegans, das einen Rezeptor der Notch-Familie codiert, genetisch verknüpft ist (Levitan, D. und I. Greenwald (1995) Nature 377: 351–354), homolog sind; PS1 und PS2 sind ferner in der PCT-Anmeldung WO 96/34099 beschrieben; Sel12 ist ferner in der PCT-Anmeldung WO 97/11956 beschrieben). Weiterhin führt eine gezielte Unterbrechung von PS1 in Mäusen zu einer reduzierten Expression der Notch1 codierenden mRNA und des Delta-ähnlichen Gen 1 (Dll1), einem Notch-Liganden in Vertebraten, im präsomitischen Mesoderm im Vergleich zu Kontrollmäusen (Wong et al.. (1997) Nature 387–288). Dies deutet darauf hin, daß PS1 für die räumlich-zeitliche Expression von am Notch-Signalisierungsweg beteiligten Genen benötigt wird.
Der Notch-Signalisierungsweg umfaßt Notch-Proteine, bei denen es sich um Membranproteine handelt, sowie mit Notch-Proteinen wechselwirkende Proteine, die als Delta-Proteine bezeichnet werden. Das als Ligand wirkende Produkt des Delta-Gens und das als Rezeptor wirkende Produkt des Notch-Gens sind Schlüsselkomponenten in einem Signalisierungsweg der lateralen Hemmung, der die detaillierte Strukturierung für unterschiedliche Gewebe in Drosophila reguliert (Vassin, H., et al., (1987) EMBO J 6: 3431–3440; Kopczynski, C. et al., (1988) Genes Dev. 2: 1723–1735; Fehon, R. G. et al., (1990) Cell 61: 523–34; Artavanis-Tsakonas, S. et al., (1991) Trends, Genet. Sci. 7: 403–407; Heitzler, P. et al., (1991) Cell 64: 1083–1092; Greenwald, I. et al., (1992) Cell 68: 271–281; Fortini, M. et al., (1993) Cell 75: 1245–1247; und Muskavitch, M. (1994) Devl. Biol. 166: 415–430). Insbesondere während der Neurogenese hindern neurale Vorläufer durch Expression von Delta benachbarte, Notch exprimiertende Zellen daran, auf eine neurale Bestimmung festgelegt zu werden. Zu einem Versagen der lateralen Hemmung führende Mutationen verursachen eine Überproduktion an Neuronen, was zu einem Phänotyp mit der Bezeichnung „neurogener Phänotyp” in Drosophila führt. So führt beispielsweise der Verlust von Notch1 zu Somitdefekten und embryonalem Tod in Mäusen, wohingegen konstitutiv aktive mutante Formen von Notch1 die Zelldifferenzierung bei Xenopus- und bei kultivierten Säugerzellen zu hemmen scheinen (Swiatek et al. (1994) Genes Dev. 8: 707; Conlon et al. (1995) J. Development 121: 1533; Lopan et al. (1994) Development 120: 2385; und Nye et al. (1994) Development 120: 2421). In ähnlicher Weise führt eine reduzierte Aktivität von X-Delta1 dazu, daß mehr Zellen zu primären Neuronen werden, wohingegen eine erhöhte Aktivität dazu führt, daß weniger Zellen zu primären Neuronen werden (Chitnis et al. (1995) Nature 375: 761). Weiterhin führt der Verlust der Dll1-Funktion in Mäusen zu übermäßiger neuronaler Differenzierung, wodurch schwere Strukturierungsdefekte im paraxialen Mesoderm sowie ein hyperplastisches zentrales Nervensystem (ZNS) entstehen (Hrabe de Angelis et al. (1997) Nature 386: 717). Somit wird durch den Notch-Signalisierungsweg, insbesondere durch Delta-Proteine, während der Neurogenese laterale Hemmung vermittelt, so daß nur ein begrenzter Anteil an Zellen mit dem Potential, zu Neuronen zu werden, tatsächlich zu Neuronen ausdifferenziert.
Bei der Notch-Proteinfamilie handelt es sich um Transmembranrezeptoren, die mehrere konservierte Peptidmotive enthalten. Die extrazellulären Domänen enthalten viele in Tandemform wiederholte Kopien eines EGF(Epidermal Growth Factor)-ähnlichen Motivs. Die intrazellulären Domänen enthalten sechs Kopien eines weiteren konservierten Motivs mit der Bezeichnung Cdc10/Ankyrin-Wiederholung. Sowohl die EDF- als auch die Ankyrin-Wiederholungsmotive finden sich in vielen unterschiedlichen Proteinen, und es konnte zumindest in einigen Fällen gezeigt werden, daß sie an Protein-Protein-Wechselwirkungen beteiligt sind.
Das Drosophila-Notch-Protein codiert einen glycosylierten Transmembranrezeptor mit einem Molekulargewicht von 350 KD, der an der Bestimmung des Zellschicksals während der Entwicklung beteiligt ist (Wharton, K. A. et al., (1985) Cell 43: 567–581); Artavanis-Tsakonas, S. et al., (1995) Science 268: 225–232). Auf Grundlage der Analyse von Drosophila-Mutanten wird angenommen, daß es sich bei Notch um einen Rezeptor mit unterschiedlichen funktionellen Domänen handelt, wobei die intrazelluläre Domäne die intrinsische Signaltransduktionsaktivität des intakten Proteins und die extrazelluläre Domäne eine Regulationsaktivität aufweist (Rebay, I. et al., (1993) Cell 74: 319–329).
In Vertebraten konnten mehrere Notch-Homologe identifiziert werden (Larsson, C., et al., (1994) Genomics 24: 253–258). Beim Menschen wurden drei Notch-Proteine (Notch1, auch TAN1 genannt, Notch2 und Notch3) charakterisiert (Ellisen, L. W. et al., (1991) Cell 66: 649–661; Stifani, S. et al., (1992) Nature Genet. 2: 119–127). Notch1-Gentranslokationen wurden mit einem kleineren Teil der T-Zellen-Lymphoblastenleukämien assoziiert (Aster, J. (1994) Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 59: 125–136), und Notch3 wurde mit CADASIL in Verbindung gebracht.
Ein mit Notch wechselwirkendes Protein wurde zuerst in Drosophila entdeckt und Delta-Protein genannt. Dieses Protein codiert einen Transmembranproteinliganden, dessen extrazelluläre Domäne Tandem-Anordnungen von EGF-ähnlichen Wiederholungen enthält. Die Delta- und Notch-Proteine können direkt aneinander binden, wobei spezifische EGF-ähnliche Wiederholungen für diese Bindung hinreichend und notwendig sind (Fehon, R. G. et al., (1990) Cell 61: 523–534; Rebay I., et al., (1991) Cell 67: 687–699; und Lieber, T., et al., (1992) Neuron 9: 847–859).
Neben dem Drosophila-Delta-Protein wurden ein Delta-Homolog aus Huhn, das C-Delta-Protein (Henrique, D. et al., (1995) Nature 375: 787–790 und GenBank Accession No. U26590), zwei Xenopus-Homologe, X-Delta-1 und X-Delta-2 (Chitnis, A. et al., (1995) Nature 375: 761–766 und GenBank Accession Nos. L42229 und U70843), ein Maus-Homolog (GenBank Accession No. X80903), ein menschliches deltaähnliches Gen 1(Dlk) (Bettenhausen, B. et al., (1995) Development 121: 2407–2418), ein Ratte-Homolog (GenBank Accession No. U78889) sowie ein Zebrafisch-Homolog (GenBank Accession No. Y11760) identifiziert. Die Delta-Gene aus Xenopus, Huhn und Maus sind auch in der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US96/11178 (Veröffentlichungsnr. WO 97/01571 ) offenbart. Ebenso offenbart die Patentanmeldung ein partielles und fehlerhaftes menschliches Delta-Homolog (hDl). Nukleotidsequenzen menschlicher Notch-Gene sind aus der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US92/03651 (Veröffentlichungsnr. WO 92/19734 ) sowie der internationalen Patentanmeldung Nr. PCT/US93/09338 (Veröffentlichungsnr. WO 94/07474 ) bekannt.
Therapeutika, die den Delta/Notch-Signalisierungsweg modulieren (agonisieren oder antagonisieren), würden sich zur Vorbeugung und Behandlung verschiedener Krankheiten und Störungen, einschließlich neurologischer und vaskulärer Störungen, eignen. Darüber hinaus können durch Mutationen in Delta-Genen, die mit der Existenz einer oder einer Prädisposition für die Entwicklung einer Krankheit korrelieren, geeignete Diagnostika bereitgestellt werden.
2. Kurze Beschreibung der Erfindung
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:

a) einem Nukleinsäuremolekül, dessen Nukleotidsequenz zu wenigstens 95% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch ist;
b) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder die von der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids codierte Aminosäuresequenz aufweist,

Die Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung eines menschlichen Gens, das für ein neues Delta-Protein codiert, das sich wesentlich von den bereits beschriebenen Delta-Proteinen unterscheidet. Entsprechenderweise wird das erfindungsgemäße neue Delta-Protein hier mit Delta3 bezeichnet. Somit sind Delta3-Proteine sowie für Delta3-Proteine codierende Nukleinsäuren Gegenstand der in den Ansprüchen definierten Erfindung. Ein beispielhaftes hDelta3 ist in einem Plasmid enthalten, das bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 5. März 1997 hinterlegt wurde und der die ATCC Zugangsnummer 98348 zugeordnet wurde.
Auf Grundlage einer Northern-Blot-Analyse von aus einer Anzahl menschlicher Gewebe präparierter RNA wurde eine 3,5 kb große „Message” in fötalem Hirn, fötaler Lunge, Leber und Niere, sowie in adultem Herz, adulter Plazenta, Lunge, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm exprimiert. Darüber hinaus stellte sich heraus, daß das hDelta3-Gen in wenigstens einigen Tumorzellen (z. B. Kolonkarzinom) auf relativ hohem Niveau exprimiert wurde, und seine Expression ließ sich als Reaktion auf verschiedene Wachstumsfaktoren (z. B. bFGF und VEGF) heraufregulieren. Es konnte weiterhin ebenso gezeigt werden, daß die Expression von hDelta3 als Reaktion auf eine signalinduzierte Differenzierung von Endothelzellen erhöht war, was auf eine Rolle für hDelta3 bei der Modulation des Wachstums und/oder der Differenzierung von Zellen, insbesondere Endothelzellen, hinweist.
Wie hier beschrieben, wurde das hDelta3-Gen auf dem menschlichen Chromosom 15 in der Nähe der Grundgerüstmarker D15S1244 und D15S144, einem chromosomalen Bereich, der mit der neurologischen Erkrankung ACCPN (Agenesis of the Corpus Callosum with Peripheral Neuropathy) assoziiert worden ist (Casaubon et al. (1996) Am. J. Hum. Genet. 58: 28), lokalisiert.
Zur Expression können die betreffenden Delta3-Nukleinsäuren eine Transkriptionsregulationssequenz, beispielsweise mindestens einen Transkriptionspromotor (z. B. zur konstitutiven Expression oder induzierbaren Expression) oder eine Transkriptionsenhancersequenz, beinhalten, wobei die Regulationssequenz mit der Delta3-Gensequenz operativ verknüpft ist. Solche Regulationssequenzen können in Verbindung mit Delta3-Nukleinsäuremolekülen in Vektoren zur Genexpression geeignet sein. Ebenso beschreibt die vorliegende Erfindung mit den Expressionsvektoren transfizierte Wirtszellen, die entweder prokaryontisch oder eukaryontisch sein können. In-vitro-Verfahren (z. B. Zellkultur) und In-vivo-Verfahren (z. B. Transgenverfahren) zur Produktion von Delta3-Proteinen unter Einsatz der Expressionsvektoren sind auch beschrieben.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung isolierte Delta3-Polypeptide, deren Aminosäuresequenz zu wenigstens 95% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist, vorzugsweise weitgehend reine Präparationen, beispielsweise von plasmagereinigten oder rekombinant hergestellten Delta3-Polypeptiden. Ein noch weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft Antikörper und Antikörperfragmente, die spezifisch mit einem isolierten Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95% mit der Aminosäuresequenz von SEQ ID No: 2 identisch ist.
Weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden ausführlichen Beschreibung sowie den Ansprüchen ersichtlich.
3. Kurze Beschreibung der Figuren
In 1 ist eine DNA-Sequenz des menschlichen Delta3-Gens, einschließlich 5'- und 3'-nichtcodierender Sequenzen (SEQ ID No 1) ebenso wie die abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen Delta3-Proteins (SEQ ID No 2) gezeigt. Dabei sind die verschiedenen Domänen des Proteins angedeutet.
In 2 ist eine mehrere Sequenzen umfassende Anordnung des neuen menschlichen Delta3-Proteins (h-delta3)(SEQ ID No 2) mit dem Maus-Delta1-Protein (m-delta1)(SEQ ID No 4), dem Ratte-Delta1-Protein (r-delta1)(SEQ ID No 5), dem menschlichen Delta1-Teilprotein ( WO 97/01571 )(SEQ ID No 6), dem Xenopus-Delta1-Protein (x-delta1)(SEQ ID No 7), dem Huhn-Delta1-Protein (c-delta1)(SEQ ID No 8), dem Zebrafisch-Delta1-Protein (z-delta1)(SEQ ID No 9), dem Xenopus-Delta2-Protein (x-delta2)(SEQ ID No 10) und dem Drosophila-Delta1-Protein (d-delta1)(SEQ ID No 11) gezeigt. Die Konservierung der DSL(Delta3 Similarity)-Domäne, der EGF(Epidermal Growth Factor-like)-Wiederholungen sowie der Transmembrandomäne (TM) ist angedeutet. Für jedes dieser Delta-Proteine (mit Ausnahme der menschlichen Teilsequenz, die nicht in GenBank vorhanden ist) ist die GenBank Accession No. in Tabelle I angegeben.
In 3 ist ein phylogenetischer Stammbaum gezeigt, der die Verwandtschaft von hDelta3 mit dem menschlichen Delta1-Teilprotein ( WO 97/01571 ), dem Maus-Delta1-Protein (m-delta1), dem Ratte-Delta1-Protein (r-delta1), dem Xenopus-Delta1-Protein (x-delta1), dem Huhn-Delta1-Protein (c-delta1), dem Xenopus-Delta2-Protein (x-delta2), dem Zebrafisch-Delta1-Protein (z-delta1) und dem Drosophila-Delta1-Protein (d-delta1) angibt. Für jedes dieser Delta-Proteine (mit Ausnahme der menschlichen Teilsequenz, die nicht in GenBank vorhanden ist) ist die GenBank Accession No. in Tabelle I angegeben.
4. Ausführliche Beschreibung der Erfindung
Allgemeine Bemerkungen
Die vorliegende Erfindung beruht zumindest teilweise auf der Entdeckung eines neuen Gens, das für ein menschliches Delta-Protein codiert, welches hier mit „hDelta3”-Polypeptid bezeichnet wird. Ein beispielhaftes hDelta3 wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 5. März 1997 hinterlegt und der ATCC Zugangsnummer 98348 zugeordnet. Die Kartierung plaziert das menschliche Delta3-Gen auf das menschliche Chromosom 15.
In 1 ist die DNA-Sequenz des menschlichen Delta3-Gens, einschließlich 5'- und 3'-nichtcodierender Sequenzen (SEQ ID No. 1), der codierenden Sequenz (SEQ ID No. 3), ebenso wie die abgeleitete Aminosäuresequenz des menschlichen Delta3-Proteins (SEQ ID No. 2) gezeigt.
Menschliches Delta3 wird in Endothelzellen exprimiert und wurde in der Tat aus einer menschlichen mikrovaskulären Endothelzellenbank kloniert. Eine Northern-Blot-Analyse von aus einer Reihe unterschiedlicher menschlicher Gewebe präparierter RNA deutet darauf hin, daß ein 3,5 kb großes Delta3-mRNA-Transkript in fötalem Hirn, fötaler Lunge, Leber und Niere, sowie in adultem Herz, adulter Plazenta, Lunge, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm vorhanden ist. Niedrige Niveaus an Delta3-mRNA wurden auch in adultem Hirn und adulter Leber nachgewiesen. Allerdings wurde keine Delta3-mRNA in peripheren Blutleukozyten nachgewiesen. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß Delta3 auf eine gewebespezifische Weise exprimiert wird. Ferner wurde festgestellt, daß die Expression in menschlichen MV-Endothelzellen in Zellen, die mit bestimmten Wachstumsfaktoren (z. B. bFGF (basic fibroblast growth factor) oder VEGF (vascular endothelial growth factor)) stimuliert worden waren, heraufreguliert (etwa 2–3fach) war. Darüber hinaus wurde eine starke Expression von menschlichem Delta3 in der Kolorektalkarzinom-Zellinie SW480 beobachtet. Weiterhin konnte gezeigt werden, daß die Expression von hDelta3 als Reaktion auf Proliferations- und Differenzierungssignale induziert wird (siehe Beispiele). Somit handelt es sich bei dem hDelta3-Gen um ein Gen, dessen Expression in einer Zelle sich mit dem Proliferations- und/oder Differenzierungszustand ändert.
Wie aus der Nukleotidsequenz der hDelta3 codierenden Nukleinsäure vorhergesagt, umfaßt das Vollängen-hDelta3-Polypeptid 685 Aminosäuren und ist in seiner Sequenz und Struktur von anderen Organismen erhaltenen Delta-Proteinen ähnlich (siehe 2 und Diskussion unten). Eine Aminosäuresequenzanalyse des menschlichen Delta3-Proteins sagt voraus, daß das Protein mindestens die folgenden Strukturdomänen umfaßt: ein Signalpeptid, das etwa Aminosäure 1 bis Aminosäure 17 der SEQ ID No. 2 entspricht, ein DSL(Delta Similarity)-Motiv, das etwa Aminosäure 173 bis etwa Aminosäure 217 der SEQ ID NO: 2 entspricht (2), acht EGF(epidermal growth factor)-ähnliche Wiederholungen, die im wesentlichen den in 2 angegebenen Sequenzen entsprechen, eine Transmembrandomäne, die etwa Aminosäure 530 bis etwa Aminosäure 553 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht sowie eine zytoplasmatische Domäne, die etwa Aminosäure 554 bis etwa Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht. Entsprechenderweise wird durch die Aminosäuresequenz von hDelta3 vorhergesagt, daß es sich bei dem Protein um ein Transmembranprotein mit einer extrazellulären Domäne, die etwa Aminosäure 1 oder Aminosäure 18 bis etwa Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 (2) entspricht und die das DSL-Motiv sowie die EGF-ähnlichen Wiederholungen umfaßt, einer Transmembrandomäne sowie einer zytoplasmatischen Domäne handelt. Dabei ist es möglich, daß das Signalpeptid mehr als 17 Aminosäuren der SEQ ID No. 2 umfaßt, da der Bereich von Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 20 einen hydrophoben Bereich bildet.
Möglicherweise existieren auch lösliche Formen des Proteins. Solche löslichen Isoformen können durch variables Spleißen des Delta3-Gens oder alternativ als Ergebnis der Proteolyse einer membranständigen Isoform entstehen. Tatsächlich wurde eine Spleiß-Variante eines Delta-Proteins aus Huhn in der PCT-Anmeldung PCT/US96/11178 mit der Veröffentlichungsnr. WO 97/01571 beschrieben. Weiterhin handelt es sich bei dem menschlichen Delta-ähnlichen Polypeptid Dlk um ein lösliches Protein (Jansen et al. [1994] Eur. J. Biochem. 225: 83–92).

In seiner Struktur und Sequenz ist das menschliche Delta3-Protein den in Drosophila, Xenopus, Zebrafisch, Huhn, Ratte, Maus und Mensch identifizierten Delta-Proteinen ähnlich. Eine vergleichende Anordnung der Aminosäuresequenzen der bislang bekannten Delta-Proteine ist in 2 gezeigt. Diese vergleichende Anordnung enthält die folgenden Delta-Proteine, die von Genen, deren GenBank Accession Nos. In Tabelle I gezeigt sind, codiert werden: ein Maus-Delta1-Protein (m-delta1), Ratte-Delta1-Protein (r-delta1), ein menschliches Delta1-Protein (h-delta1), ein Xenopus-Delta1-Protein (x-delta1), ein Huhn-Delta1-Protein (c-delta1), ein Zebrafisch-Delta1-Protein (z-delta1), ein zweites Xenopus-Delta2-Protein (x-delta2), das menschliche Delta3-Protein (h-delta3) sowie ein Drosophila-Delta1-Protein (d-delta1). Bei der Aminosäuresequenz von h-delta1 handelt es sich um die in der PCT-Anmeldung WO 97/01571 veröffentlichte Aminosäuresequenz, die unvollständig ist und zahlreiche Fehler enthält, wie in der Anmeldung angegeben ist. Da die vergleichende Anordnung der Aminosäuresequenzen unter Verwendung des Computerprogramms pileup (GCG Package) durchgeführt wurde, spiegelt die Reihenfolge der Aminosäuresequenzen in der Figur die Homologie zwischen den unterschiedlichen Delta-Proteinen wider. Dementsprechend ist das Drosophila-Protein, das der untersten Sequenz in der vergleichenden Anordnung entspricht, am weitesten von den anderen Delta-Proteinen entfernt. Somit zeigt 2, daß hDelta3, das an zweitletzter Stelle in 2 aufgeführt ist, das von den bereits identifizierten Delta-Proteinen aus Maus, Ratte, Mensch, Xenopus, Zebrafisch und Huhn am zweitweitesten entfernte Delta-Protein ist. Dementsprechend unterscheidet sich das hDelta3-Protein in signifikanter Weise von dem bereits beschriebenen menschlichen Delta-Protein ebenso wie von den Delta-Proteinen aus den anderen Spezies. Interessanterweise weist das hDelta3-Protein eine Aminosäuresequenz auf, die von beiden Xenopus-Proteinen, d. h. Delta1 und Delta2, gleich weit entfernt ist, was darauf hindeutet, daß hDelta3 keinem der Xenopus-Delta-Proteine entspricht. Daher wurde das neu isolierte Polypeptid hDelta3 genannt, wobei die bereits identifizierten Delta-Proteine aus Maus, Ratte, Mensch, Zebrafisch und Xenopus hier als Delta1-Proteine und die beiden Xenopus-Proteine als Delta1- und Delta2-Proteine bezeichnet werden. Der Unterschied zwischen dem hDelta3-Protein und bereits isolierten Delta-Proteinen läßt sich auch anhand eines Vergleichs der prozentualen Homologie oder Identität zwischen hDelta3 und den bereits identifizierten Delta1- und Delta2-Proteinen einerseits (Tabelle I) und der prozentualen Homologie oder Identität eines Delta1-Proteins mit den anderen Delta1- bzw. Delta2-Proteinen (Tabelle II) veranschaulichen. Tabelle I: Prozentuale Ähnlichkeit zwischen der Aminosäuresequenz von menschlichem Delta3 (SEQ ID No. 2) und den Sequenzen der verschiedenen Delta-Proteine

	GenBank	% Identität	% Ähnlichkeit
	Accession
	No.
Menschliches		50	66
Delta1
Maus-Delta1	X80903	53	70
Ratte-Delta1	U78889	54	70
Huhn-Delta1	U26590	52	68
Xenopus-Delta1	L42229	51	68
Zebrafisch-Delta1	Y11760	48	67
Xenopus-Delta2	U70843	47	65
Drosophila-Delta1	AA142228	40	58
dlk (hDelta-like)	U15979	33	55

In der Tabelle II sind die prozentuale Ähnlichkeit und Identität zwischen dem in der PCT-Anmeldung PCT/US96/11178 (Veröffentlichungsnr. WO 97/01571 ) offenbarten menschlichen Delta1 und nichtmenschlichen Delta1-Proteinen angegeben. Da die Aminosäuresequenz des in dieser PCT-Anmeldung offenbarten menschlichen Delta1-Proteins unvollständig ist, wurde die prozentuale Ähnlichkeit bzw. Identität unter Verwendung eines Anteils der menschlichen Delta1-Aminosäuresequenz, der am zuverlässigsten erschien, bestimmt. Der verwendete Anteil der Aminosäuresequenz entspricht den Aminosäuren 214–370 der menschlichen Delta1-Aminosäuresequenz, die in 14A der PCT-Anmeldung gezeigt ist. Tabelle II: Prozentuale Ähnlichkeit zwischen menschlichem Delta1 und den verschiedenen nichtmenschlichen Delta1- oder Delta2-Proteinen

	GenBank	% Identität	% Ähnlichkeit
	Accession
	No.
Menschliches		100	100
Delta1
Maus-Delta1	X80903	86	95
Ratte-Delta1	U78889	88	94
Huhn-Delta1	U26590	85	89
Xenopus-Delta1	L42229	78	84
Zebrafisch-Delta1	Y11760	69	80
Xenopus-Delta2	U70843	57	70
Drosophila-Delta1	AA142228	45	62
dlk (hDelta-like)	U15979	37	55

Entsprechenderweise deutet Tabelle I an, daß hDelta3 nur eine Ähnlichkeit von ungefähr 66% mit dem menschlichen Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 70% mit dem Maus-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 70% mit dem Ratte-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 68% mit dem Huhn-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 68% zu dem Xenopus-Delta1-Protein, eine Ähnlichkeit von ungefähr 70% zu dem Xenopus-Delta2-Protein und eine Ähnlichkeit von ungefähr 58% zu dem Drosophila-Delta1-Protein aufweist. Das menschliche Delta1-Protein weist jedoch, wie in Tabelle II gezeigt, eine sehr hohe Ähnlichkeit zu den Delta1-Proteinen aus Maus, Ratte, Huhn, Xenopus, Zebrafisch und Drosophila sowie zu dem Xenopus-Delta2-Protein auf. Darüber hinaus besitzen die Delta1-Proteine aus Maus und Ratte eine Ähnlichkeit von etwa 95%. Somit teilen die Aminosäuresequenzen der Delta1-Proteine eine größere Homologie miteinander als mit dem erfindungsgemäßen menschlichen Delta3-Protein, was darauf hindeutet, daß mindestens zwei Familien von Delta-Proteinen existieren.
Der Unterschied zwischen dem neu isolierten hDelta3-Protein und den bereits identifizierten Delta1- und Delta2-Proteinen läßt sich auch mittels Erzeugung eines phylogenetischen Stammbaums unter Verwendung des Computerprogramms Growtree Phylogram (GCG Package) sehen. Das Ergebnis dieser Analyse, das in 3 gezeigt ist, deutet an, daß hDelta3 auf einem von den anderen Delta-Proteinen verschiedenen „Ast” im phylogenetischen Stammbaum liegt, womit bestätigt wird, daß das hDelta3-Protein von den anderen Delta1- und Delta2-Proteinen weiter entfernt ist als diese voneinander entfernt sind. Gemäß der Analyse und wie durch die vergleichende Sequenzanordnung vorhergesagt weist lediglich das Drosophila-Delta-Protein eine weiter entfernte Verwandtschaft mit den bereits identifizierten Delta-Proteinen aus Maus, Ratte, Xenopus, Huhn, Zebrafisch und Mensch als hDelta3 auf. Somit handelt es sich bei dem neu isolierten hDelta3-Protein um ein Mitglied einer unterschiedlichen Subspezies der Familie von Delta-Proteinen.
Ungeachtet der Tatsache, daß jede Tierspezies wahrscheinlich mindestens zwei oder drei Mitglieder (z. B. Delta1, Delta2 und Delta3) aufweist, läßt sich aus 2 erkennen, daß der DSL-Bereich, die acht EGF-Wiederholungen sowie die TM durchgehend hoch konserviert zu sein scheinen. Allerdings unterscheiden sich diese Domänen des hDelta3-Proteins, wie in 2 ersichtlich ist, stärker von den entsprechenden Domänen in den anderen Delta-Proteinen als sich die entsprechenden Domänen in dem anderen Delta voneinander unterscheiden.
Der DSL-Bereich bzw. das DSL-Motiv wird von allen bekannten Mitgliedern der Familie der vermuteten Liganden Notch-ähnlicher Proteine geteilt (Delta1 und Serrate in Drosophila; Lag-2 und Apx-1 in Caenorhabditis elegans) (Henderson et al. (1994) Development 120: 2913; Tax et al. (1994) Nature 368: 150; Fleming et al. (1990) Genes Dev. 4: 2188; Thomas et al. (1991) Development 11: 749; Mello et al. (1994) Cell 77: 95). Das DSL-Motiv ist im aminoterminalen Teil des Proteins lokalisiert, der mit einer ähnlichen Domäne im Drosophila-Delta1-Protein eng verwandt ist und der als notwendig und hinreichend für die In-vitro-Bindung an Notch beschrieben wurde (Henrique et al. (1995) Nature 375: 787; Muskavitch (1994) Dev. Biol. 166: 415).
Weiterhin wurde, wie in Beispiel 5.5 dargelegt ist, Delta3 auf dem menschlichen Chromosom 15 in einem Bereich in der Nähe der Grundgerüstmarker D15S1244 und D15S144 lokalisisert. Interessanterweise konnte gezeigt werden, daß der Bereich auf Chromosom 15, der von den Markern D15S1040 und D15S118 flankiert wird, genetisch mit der unter dem Namen ACCPN (Agenesis of the Corpus Callosum with Peripheral Neuropathy) bekannten Krankheit in Verbindung steht (Casaubon et al., supra). Bislang wurde kein spezifisches Gen mit dieser Krankheit in Verbindung gebracht.
Dementsprechend betreffen bestimmte Aspekte der vorliegenden Erfindung Delta3-Proteine, für Delta3-Proteine codierende Nukleinsäuremoleküle, mit Delta3-Proteinen immunreaktive Antikörper sowie Präparationen solcher Zusammensetzungen. Darüber hinaus werden Tests zur Entdeckung von Arzneistoffen zur Identifizierung von Agentien, die die biologische Funktion von Delta-Proteinen, z. B. Delta3-Proteinen, modulieren, indem sie beispielsweise an Delta3 binden oder die Wechselwirkung von Delta3 mit entweder nachgeschalteten oder vorgeschalteten Elementen im Delta/Notch-Signaltransduktionsweg verändern, z. B. die Wechselwirkung zwischen Delta3 und einem Delta3 bindenden Protein verändern, beschrieben. Solche Agentien können sich therapeutisch beispielsweise zur Veränderung des Zellwachstums und/oder der Zelldifferenzierung oder zur Apoptoseinduktion eignen. Die vorliegende Offenbarung beschreibt zudem diagnostische und therapeutische Tests sowie Reagentien zum Nachweis und zur Behandlung von Störungen, an denen eine anomale Delta3-Aktivität, beispielsweise eine anomale Expression (oder deren Verlust) des Delta3-Gens, beteiligt ist oder die mit einem spezifischen Delta-Allel, z. B. einem Delta3-Allel, assoziiert sind. Weitere erfindungsgemäße Aspekte sind unten beschrieben oder werden dem Fachmann im Licht der vorliegenden Offenbarung ersichtlich.
4.2 Definitionen
Aus Gründen der Zweckmäßigkeit sind die Bedeutungen bestimmter in der Beschreibung, den Beispielen sowie den beigefügten Ansprüchen verwendeter Begriffe und Phrasen nachfolgend aufgeführt.
Der Begriff „Allel”, der hier zusammen mit „allelische Variante” gegeneinander austauschbar verwendet wird, bezieht sich auf alternative Formen eines Gens oder Anteile davon. Allele nehmen den gleichen Lokus bzw. die gleiche Position auf homologen Chromosomen ein. Besitzt eine Untersuchungsperson zwei identische Allele eines Gens, so sagt man, daß die Untersuchungsperson homozygot für das Gen bzw. Allel ist. Besitzt eine Untersuchungsperson zwei unterschiedliche Allele eines Gens, so sagt man, daß die Untersuchungsperson heterozygot für das Gen ist. Allele eines spezifischen Gens können sich voneinander in einem einzigen Nukleotid oder mehreren Nukleotiden unterscheiden und können Substitutionen, Deletionen und Insertionen von Nukleotiden beinhalten. Bei einem Allel eines Gens kann es sich auch um eine eine Mutation enthaltende Form eines Gens handeln.
Der Begriff „allelische Variante eines polymorphen Bereichs eines Delta-Gens” bezieht sich auf einen Bereich eines Delta-Gens mit einer von mehreren Nukleotidsequenzen, die in diesem Bereich des Gens in anderen Individuen angetroffen werden.
Der Begriff „Agonist”, wie er hier verwendet wird, soll sich auf ein Agens beziehen, das eine Delta3-Bioaktivität heraufreguliert (z. B. potenziert oder ergänzt). Bei einem Delta3-Agonisten kann es sich um eine Verbindung handeln, die die Expression eines Delta3-Gens heraufreguliert. Alternativ kann es sich bei einem Delta3-Agonisten um eine Verbindung handeln, die die Signalgebung von einem Delta3-Protein erhöht, beispielsweise eine an Delta3 gebundene Verbindung, wie z. B. eine stimulierende Form eines toporythmischen Proteins oder ein kleines Molekül. Bei einem Delta3-Agonisten kann es sich auch um eine Verbindung handeln, die die Expression oder Aktivität eines Proteins, das Delta3 nachgeschaltet ist oder das mit Delta3 wechselwirkt, moduliert.
„Antagonist”, wie hier verwendet, soll sich auf ein Agens beziehen, das eine Delta3-Bioaktivität herunterreguliert (z. B. supprimiert oder hemmt). Bei einem Delta3-Antagonisten kann es sich um eine Verbindung handeln, die die Expression eines Delta3-Gens herunterreguliert. Alternativ kann es sich bei einem Delta3-Antagonisten um eine Verbindung handeln, die die Signalgebung von einem Delta3-Protein reduziert, beispielsweise eine an Delta3 bindende Verbindung, wie z. B. eine inhibitorische Form eines toporythmischen Proteins oder ein kleines Molekül. Ein bevorzugter Delta3-Antagonist hemmt die Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem weiteren Molekül, z. B. einem toporythmischen Protein. Bei einem Delta3-Antagonisten kann es sich auch um eine Verbindung handeln, die die Expression oder Aktivität eines Proteins, das Delta3 nachgeschaltet ist oder das mit Delta3 wechselwirkt, moduliert.
Unter „biologische Aktivität”, gegeneinander austauschbar mit den Begriffen „Bioaktivität” bzw. „Aktivität” verwendet, versteht man im hier vorliegenden Sinne eine Effektor- oder antigene Funktion, die direkt oder indirekt von einem Delta3-Polypeptid (das entweder in seiner nativen oder in einer denaturierten Konformation vorliegen kann) oder von einer beliebigen Teilsequenz davon ausgeführt wird. Zu den Effektorfunktionen gehören Rezeptorbindung oder -aktivierung, Induktion der Differenzierung, mitogene oder wachstumsfördernde Aktivität, Apoptoseinduktion, Signaltransduktion, Immunmodulation, DNA-Regulationsfunktionen und dergleichen, gleichgültig ob sie gegenwärtig bekannt oder inhärent sind. Zu den antigenen Funktionen gehört der Besitz eines Epitops oder einer antigenen Stelle, die zur Kreuzreaktion mit gegen ein natürlich vorkommendes oder denaturiertes Delta3-Polypeptid oder ein Fragment davon produzierten Antikörpern fähig ist. Dementsprechend kann es sich bei einer biologische Aktivität eines Delta3-Proteins um die Bindung an einen Rezeptor, wie beispielsweise Notch, handeln. Ebenso kann es sich bei der biologischen Aktivität eines Delta3-Proteins um die Modulation der Zellproliferation und/oder -differenzierung oder Zelltod in einer Zielzelle mit einem entsprechenden Rezeptor handeln. Bei einer Zielzelle kann es sich beispielsweise um eine Nervenzelle, eine Endothelzelle oder eine Krebszelle handeln.
Zu den biologisch aktiven Delta3-Polypeptiden gehören Polypeptide, die sowohl eine Effektor- als auch eine antigene Funktion oder nur eine derartige Funktion aufweisen. Delta3 umfaßt Antagonistenpolypeptide und natives Delta3, vorausgesetzt, daß solche Antagonisten ein Epitop eines nativen Delta3 beinhalten oder eine biologische Aktivität von nativem Delta3 antagonisieren.
Der Begriff „anomale Delta3-Aktivität” oder „abnormale Delta3-Aktivität” soll eine Aktivität von Delta3 umfassen, die sich von der gleichen Delta3-Aktivität in einer gesunden Untersuchungsperson unterscheidet. Eine anomale Delta3-Aktivität kann beispielsweise von einer Mutation in dem Protein herrühren, die beispielsweise zu einer geringeren oder höheren Bindungsaffinität für einen Rezeptor führt. Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch von einem geringeren oder höheren Niveau von Delta3 auf Zellen herrühren, was beispielsweise durch eine anomale Transkription, ein anomales Spleißen oder eine anomale Translation des Delta3-Gens verursacht werden kann. So kann beispielsweise eine anomale Delta3-Aktivität von einer anomalen Promotoraktivität herrühren. Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch von einer anomalen Signalgebung durch die zytoplasmatische Domäne des Delta3-Proteins hindurch, so daß beispielsweise ein anomales Signal transduziert wird, herrühren. Eine anomale Signalgebung kann das Ergebnis einer Mutation in der zytoplasmatischen Domäne von Delta3 oder alternativ des Kontakts mit einem abnormalen zytoplasmatischen Protein sein. Eine anomale Delta3-Aktivität kann auch vom Kontakt eines Delta3-Proteins mit einem anomalen Rezeptor, beispielsweise einem abnormalen Notch-Protein, herrühren.
Die Begriffe „Zellen”, „Wirtszellen” bzw. „rekombinante Wirtszellen” werden hier gegeneinander austauschbar verwendet. Dabei versteht sich, daß sich solche Begriffe nicht nur auf die jeweilige Zelle der Untersuchungsperson, sondern auch auf die Nachkommenschaft oder potentielle Nachkommenschaft einer solchen Zelle beziehen. Da aufgrund entweder von Mutation oder von Umwelteinflüssen gewisse Modifikationen in nachfolgenden Generationen auftreten können, kann es sein, daß eine solche Nachkommenschaft nicht mit der Elternzelle identisch ist, doch ist sie dennoch im Rahmen des Begriffs, wie er hier verwendet wird, enthalten.
Bei einem „chimärischen Protein” oder „Fusionsprotein” handelt es sich um eine Fusion einer ersten, für eines der betreffenden Delta3-Polypeptide codierenden Aminosäuresequenz mit einer zweiten, eine Domäne (z. B. Polypeptidanteil), die gegenüber einer beliebigen Domäne eines der Delta3-Proteine fremd und nicht wesentlich homolog dazu ist, definierenden Aminosäuresequenz. Ein chimärisches Protein kann eine Fremddomäne präsentieren, die in einem Organismus, der auch das erste Protein exprimiert, angetroffen wird (wenn auch in einem anderen Protein), oder es kann sich dabei um ein „Interspezies”-, „intergenes” Molekül handeln, beispielsweise die Fusion von von unterschiedlichen Arten von Organismen exprimierten Proteinstrukturen. Im allgemeinen läßt sich ein Fusionsprotein durch die allgemeine Formel X-Delta3-Y darstellen, wobei Delta3 für einen Anteil des Proteins steht, der aus einem der Delta3-Proteine stammt, und X und Y unabhängig voneinander fehlen oder für Aminosäuresequenzen stehen, die nicht mit einem der Delta3-Sequenzen in einem Organismus, einschließlich natürlich vorkommender Mutanten, verwandt sind. Als Delta3-Fusionsprotein ist ein Delta3-Ig-Fusionsprotein bevorzugt.
„Komplementäre” Sequenzen, wie sie hier verwendet werden, beziehen sich auf Sequenzen, die eine hinreichende Komplementarität aufweisen, um hybridisieren zu können, wobei ein stabiler Duplex gebildet wird.
Unter einem „Zuführungskomplex” ist ein zielgerichtetes Mittel zu verstehen (z. B. ein Molekül, das zu einer höheren Affinitätsbindung eines Gens, Proteins, Polypeptids oder Peptids an eine Zielzellenoberfläche und/oder zu einer erhöhten zellulären Aufnahme durch eine Zielzelle führt). Zu zielgerichteten Mitteln gehören beispielsweise: Sterole (z. B. Cholesterin), Lipide (z. B. ein kationisches Lipid, Virosom oder Liposom), Viren (z. B. Adenovirus, Adeno-assoziiertes Virus und Retrovirus) oder Zielzellen-spezifische Bindungsagentien (z. B. von Zielzellen-spezifischen Rezeptoren erkannte Liganden). Die Komplexe sind vorzugsweise hinreichend stabil in vivo, um ein signifikantes Entkoppeln vor der Internalisierung durch die Zielzelle zu verhindern. Allerdings ist der Komplex unter geeigneten Bedingungen in der Zelle spaltbar, so daß das Gen, Protein, Polypeptid oder Peptid in einer funktionellen Form freigesetzt wird.
Wie allgemein bekannt ist, können Gene für ein bestimmtes Polypeptid in einer oder mehreren Kopien im Genom eines Individuums existieren. Solche Genduplikate können identisch sein oder gewisse Modifikationen aufweisen, einschließlich Nukleotidsubstitutionen, Additionen oder Deletionen, die allesamt noch für Polypeptide mit weitgehend der gleichen Aktivität codieren. Der Begriff „für ein Delta3-Polypeptid codierende DNA-Sequenz” kann sich somit auf eines oder mehrere Gene in einem bestimmten Individuum beziehen. Zudem können gewisse Unterschiede in den Nukleotidsequenzen zwischen individuellen Organismen bestehen, die Allele genannt werden. Solche allelischen Unterschiede können gegebenenfalls zu Unterschieden in der Aminosäuresequenz des codierten Polypeptids führen, aber dennoch ein Protein mit der gleichen biologischen Aktivität codieren.
Der Begriff „Delta3-Therapeutikum” bezieht sich auf verschiedene Zusammensetzungen von Delta3-Polypeptiden ebenso wie auf Peptidomimetika, kleine Moleküle und Nukleinsäuren, die zur Nachahmung oder Potenzierung (Agonisierung) oder Hemmung (Antagonisierung) der Effekte eines natürlich vorkommenden Delta3-Proteins in der Lage sind. Ein Delta3-Therapeutikum, das die Aktivität eines Wildtyp-Delta3-Proteins imitiert oder potenziert, ist ein „Delta3-Agonist”. Umgekehrt ist ein Delta3-Therapeutikum, das die Aktivität eines Wildtyp-Delta3-Proteins hemmt, ein „Delta3-Antagonist”.
Die Begriffe „Delta3-Polypeptid” und „Delta3-Protein” sollen Delta3-Polypeptide, die wenigstens eine biologische Aktivität aufweisen, d. h. wenigstens eine biologische Aktivität eines nativen Delta3-Polypeptids antagonisieren, umfassen.
Der Begriff „Gen” oder „rekombinantes Gen”, wie er hier verwendet und auf Delta3 angewandt wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das ein für eines der Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codierendes offenes Leseraster, einschließlich sowohl Exon- als auch (gegebenenfalls) Intronsequenzen, umfaßt. Ein „rekombinantes Delta3-Gen” bezieht sich auf eine für ein Delta3-Polypeptid codierende und für Delta codierende Exonsequenzen umfassende Nukleinsäure, obwohl diese gegebenenfalls Intronsequenzen enthalten kann, die entweder aus einem chromosomalen Delta3-Gen oder aus einem nicht verwandten chromosomalen Gen stammen. Beispielhafte rekombinante Gene, die für die betreffenden Delta3-Polypeptide codieren, sind im beigefügten Sequenzprotokoll dargestellt. Der Begriff „Intron” bezieht sich auf eine DNA-Sequenz, die in einem gegebenen Delta3-Gen vorhanden ist und die nicht in Protein translatiert und im allgemeinen zwischen Exons angetroffen wird.
Der Begriff „Wachstumszustand” einer Zelle bezieht sich auf den Proliferationszustand einer Zelle ebenso wie auf ihren Differenzierungszustand. Dementsprechend bezieht sich der Begriff auf die Phase des Zellzyklus, in der sich die Zelle befindet, beispielsweise G0, G1, G2, Prophase, Metaphase oder Telophase, ebenso wie auf ihren Differenzierungszustand, beispielsweise undifferenziert, teilweise differenziert oder voll ausdifferenziert. Ohne darauf beschränkt sein zu wollen, wird die Differenzierung einer Zelle normalerweise von einer Abnahme der Proliferationsgeschwindigkeit einer Zelle begleitet.
„Homologie” oder „Identität” oder „Ähnlichkeit” bezieht sich auf die Sequenzähnlichkeit zwischen zwei Peptiden oder zwischen zwei Nukleinsäuremolekülen. Die Homologie läßt sich dadurch bestimmen, daß man in jeder Sequenz, die für Vergleichszwecke vergleichend angeordnet werden kann, eine Position vergleicht. Wird eine Position in der verglichenen Sequenz von der gleichen Base bzw. Aminosäure besetzt, so sind die Moleküle an dieser Position identisch. Dabei ist ein Grad an Homologie oder Ähnlichkeit oder Identität zwischen Nukleinsäuresequenzen eine Funktion der Anzahl identischer oder übereinstimmender Nukleotide an von den Nukleinsäuresequenzen geteilten Positionen. Ein Grad an Identität von Aminosäuresequenzen ist eine Funktion der Anzahl identischer Aminosäuren an von den Aminosäuresequenzen geteilten Positionen. Ein Grad an Homologie oder Ähnlichkeit von Aminosäuresequenzen ist eine Funktion der Anzahl konservierter Aminosäuren an von den Aminosäuresequenzen geteilten Positionen. Bei einer Sequenz, die mit einer der hDelta3-Sequenzen der vorliegenden Erfindung „nicht verwandt” oder „nicht homolog” ist, handelt es sich um eine Sequenz, die weniger als 40% Identität, jedoch vorzugsweise weniger als 25% Identität, mit einer der hDelta3-Sequenzen der vorliegenden Erfindung teilt.
Der Begriff „wechselwirken”, wie er hier verwendet wird, soll nachweisbare Wechselwirkungen zwischen Molekülen umfassen, so wie sie beispielsweise unter Verwendung eines Hefe-„Two-Hybrid-Assay” nachgewiesen werden können. Der Begriff wechselwirken soll auch „Eindungs”-Wechselwirkungen zwischen Molekülen umfassen. Die Art der Wechselwirkungen kann Protein-Protein, Protein-Nukleinsäure, Protein-kleines Molekül oder Nukleinsäure-kleines Molekül sein.
Der Begriff „isoliert”, wie er hier bezüglich Nukleinsäuren, wie beispielsweise DNA oder RNA verwendet wird, bezieht sich auf Moleküle, die von anderen DNAs bzw. RNAs getrennt sind, die in der natürlichen Quelle des Makromoleküls vorhanden sind. So enthält beispielsweise eine für eines der betreffenden Delta3-Polypeptide codierende isolierte Nukleinsäure vorzugsweise nicht mehr als 10 Kilobasen (kb) Nukleinsäuresequenz, die in der genomischen DNA natürlicherweise das Delta3-Gen flankiert, wobei die isolierte Nukleinsäure stärker bevorzugt nicht mehr als 5 kb solcher natürlich vorkommender flankierender Sequenzen und am meisten bevorzugt weniger als 1,5 kb solcher natürlich vorkommender flankierender Sequenz enthält. Der Begriff isoliert, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auch auf eine Nukleinsäure oder ein Peptid, die bzw. das bei der Herstellung mittels rekombinanter DNA-Techniken weitgehend frei von Zellmaterial, Virusmaterial oder Kulturmedium ist oder bei der chemischen Synthese weitgehend frei von chemischen Vorläufermolekülen oder anderen Chemikalien ist. Zudem soll eine „isolierte Nukleinsäure” Nukleinsäurefragmente umfassen, die nicht natürlicherweise als Fragmente vorkommen und nicht im natürlichen Zustand angetroffen würden. Der Begriff „isoliert” wird hier ebenso mit Bezug auf Polypeptide verwendet, die von anderen zellulären Proteinen isoliert werden, und soll sowohl gereinigte als auch rekombinante Polypeptide umfassen.
Der Begriff „Modulation”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich sowohl auf Heraufregulierung, d. h. Stimulierung, als auch Herunterregulierung, d. h. Suppression, einer Antwort.
Der Begriff „mutiertes Gen” bezieht sich auf eine allelische Form eines Gens, die zur Veränderung des Phänotyps einer Untersuchungsperson mit dem mutierten Gen gegenüber einer Untersuchungsperson ohne das mutierte Gen in der Lage ist. Falls eine Untersuchungsperson, um einen geänderten Phänotyp aufzuweisen, für diese Mutation homozygot sein muß, so sagt man, daß die Mutation rezessiv ist. Falls eine Kopie des mutierten Gens ausreicht, um den Genotyp der Untersuchungsperson zu ändern, so sagt man, daß die Mutation dominant ist. Falls eine Untersuchungsperson eine Kopie des mutierten Gens sowie einen Phänotyp aufweist, der zwischen dem einer (für dieses Gen) homozygoten und dem einer heterozygoten Untersuchungsperson liegt, so sagt man, daß die Mutation codominant ist.
Zu den „nichtmenschlichen Tieren” der Erfindung gehören Säuger, wie beispielsweise Nager, nichtmenschliche Primaten, Schafe, Hunde, Rinder, Hühner, Amphibien, Reptilien usw. Nichtmenschliche Tiere sind bevorzugt ausgewählt aus der Nagerfamilie, einschließlich Ratte und Maus, am stärksten bevorzugt Maus, obwohl transgene Amphibien, wie beispielsweise Mitglieder der Gattung Xenopus, sowie transgene Hühner ebenso als wichtige Werkzeuge zum Verständnis und zur Identifizierung von Agentien, die beispielsweise die Embryogenese und Gewebsbildung beeinflussen können, dienen können. Der Begriff „chimärisches Tier”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Tiere, in denen das rekombinante Gen angetroffen wird oder in denen die Rekombinante in einigen, aber nicht allen Zellen des Tiers, exprimiert wird. Der Begriff „gewebespezifisches chimärisches Tier” deutet darauf hin, daß eines der rekombinanten Delta3-Gene in einigen Geweben, jedoch nicht in anderen vorhanden ist und/oder exprimiert wird oder unterbrochen ist.
Der Begriff „Nukleinsäure”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf Polynukleotide, wie beispielsweise Desoxyribonukleinsäure (DNA) und gegebenenfalls Ribonukleinsäure (RNA). Dabei ist der Begriff auch so zu verstehen, daß er als Äquivalente aus Nukleotidanalogen aufgebaute Analoge entweder von RNA oder DNA sowie, wie auf die beschriebene Ausführungsform anwendbar, einzel-(Sense- oder Antisense-) und doppelsträngige Polynukleotide umfaßt.
Der Begriff „Polymorphismus” bezieht sich auf die Koexistenz von mehr als einer Form eines Gens oder eines Anteils davon. Ein Anteil eines Gens, von dem wenigstens zwei unterschiedliche Formen, d. h. zwei unterschiedliche Nukleotidsequenzen, vorliegen, wird als ein „polymorpher Bereich eines Gens” bezeichnet. Bei einem polymorphen Bereich kann es sich um ein Einzelnukleotid handeln, dessen Identität in unterschiedlichen Allelen unterschiedlich ist. Ebenso kann ein polymorpher Bereich eine Länge von mehreren Nukleotiden aufweisen.
Ein „polymorphes Gen” bezieht sich auf ein Gen mit wenigstens einem polymorphen Bereich.
Die Begriffe „Protein”, „Polypeptid” und „Peptid” werden hier mit Bezug auf ein Genprodukt gegeneinander austauschbar verwendet.
Der Begriff „rekombinantes Protein” bezieht sich auf ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung, das mit rekombinanten DNA-Techniken hergestellt wird, wobei im allgemeinen für ein Delta3-Polypeptid codierende DNA in einen geeigneten Expressionsvektor inseriert wird, der wiederum zur Transformation einer Wirtszelle verwendet wird, so daß das heterologe Protein produziert wird. Zudem soll die Phrase „stammt aus” bezüglich eines rekombinanten Delta3-Gens innerhalb der Bedeutung „rekombinantes Protein” diejenigen Proteine umfassen, die eine Aminosäuresequenz eines nativen Delta3-Proteins oder eine dazu ähnliche Aminosäuresequenz, die durch Mutationen, einschließlich Substitutionen und Deletionen (einschließlich Verkürzung) einer natürlich vorkommenden Form des Proteins erzeugt wird, aufweisen.
Der Begriff „spezifisch hybridisiert” oder „spezifisch nachweist” bezieht sich auf die Fähigkeit eines erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküls, an wenigstens ungefähr 6, 12, 20, 30, 50, 100, 150, 200, 300, 350, 400 oder 425 aufeinanderfolgende Nukleotide eines Delta3-Gens aus Vertebraten, vorzugsweise Säugern, wie beispielsweise einer in einer der SEQ ID Nos: 1 oder 3 genannten Delta3-Sequenz, oder einer dazu komplementären Sequenz oder natürlich vorkommenden Mutanten davon zu hybridisieren, so daß es mehr als 10 mal mehr Hybridisierung, vorzugsweise mehr als 100 mal mehr Hybridisierung und noch stärker bevorzugt mehr als 100 mal mehr Hybridisierung als zu einer zellulären Nukleinsäure (z. B. mRNA oder genomischer DNA), die für ein anderes Protein als ein Vertebraten-, vorzugsweise Delta3-Protein, wie es hier definiert ist, codiert, zeigt.
Unter dem Begriff „gewebespezifischer Promotor”, wie er hier verwendet wird, versteht man eine DNA-Sequenz, die als Promotor dient, d. h. die die Expression einer mit dem Promotor operativ verknüpften ausgewählten DNA-Sequenz reguliert und die sich auf die Expression der ausgewählten DNA-Sequenz in spezifischen Zellen eines Gewebes, wie beispielsweise Zellen aus der Leber oder der Bauchspeicheldrüse, neuronalen Zellen oder Immunzellen, auswirkt. Der Begriff deckt ebenso sogenannte „leaky” [„undichte”] Promotoren ab, die die Expression einer ausgewählten DNA hauptsächlich in einem Gewebe regulieren, aber auch ebenso zu einer Expression in anderen Geweben führen.
Bei der „Transkriptionsregulationssequenz” handelt es sich um einen Oberbegriff, der in der gesamten Beschreibung in bezug auf DNA-Sequenzen, wie beispielsweise Initiationssignale, Enhancer und Promotoren, die die Transkription von proteincodierenden Sequenzen, mit denen sie operativ verknüpft sind, induzieren oder kontrollieren, verwendet wird. In bevorzugten Ausführungsformen steht die Transkription eines der rekombinanten Delta3-Gene unter der Kontrolle einer Promotorsequenz (oder einer anderen Transkriptionsregulationssequenz), die die Expression des rekombinanten Gens in einem Zelltyp, in dem die Expression durchgeführt werden soll, kontrolliert. Ebenso versteht sich, daß das rekombinante Gen unter der Kontrolle von Transkriptionsregulationssequenzen stehen kann, bei denen es sich um die gleichen Sequenzen wie diejenigen, die die Transkription der natürlich vorkommenden Formen von Delta3-Proteinen kontrollieren, oder um davon verschiedene Sequenzen handeln kann.
Unter dem Begriff „Transfektion”, wie er hier verwendet wird, versteht man die Einführung einer Nukleinsäure, beispielsweise eines Expressionsvektors, in eine Empfängerzelle mittels nukleinsäurevermitteltem Gentransfer. „Transformation”, wie hier verwendet, bezieht sich auf einen Vorgang, bei dem der Genotyp einer Zelle als Ergebnis der zellulären Aufnahme exogener DNA oder RNA verändert wird und bei dem beispielsweise die transformierte Zelle eine rekombinante Form eines Delta3-Polypeptids exprimiert oder, im Fall einer Antisense-Expression von dem übertragenen Gen, die Expression einer natürlich vorkommenden Form des Delta3-Proteins unterbrochen wird.
Unter dem Begriff „Transgen”, wie er hier verwendet wird, versteht man eine Nukleinsäuresequenz (die beispielsweise für eines der Delta3-Polypeptide oder für ein Antisense-Iranskript davon codiert), die für das transgene Tier oder die transgene Zelle, in das bzw. die sie eingeführt wird, teilweise oder vollständig heterolog, d. h. fremd, ist oder für ein endogenes Gen des transgenen Tiers oder der transgenen Zelle, in das bzw. die sie eingeführt wird, homolog ist, die jedoch so zur Insertion in das Genom des Tiers vorgesehen ist bzw. darin inseriert wird, daß das Genom der Zelle, in das sie inseriert wird, verändert wird (z. B. sie wird an einem Ort inseriert, der sich von dem des natürlichen Gens unterscheidet, oder ihre Insertion führt zu einem Knockout). Ein Transgen kann eine oder mehrere Transkriptionsregulationssequenzen sowie beliebige weitere Nukleinsäuren, wie beispielsweise Introns, die für die optimale Expression einer ausgewählten Nukleinsäure notwendig sein können, beinhalten.
Der Begriff „Vektor”, wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ein Nukleinsäuremolekül, das zum Transport einer anderen Nukleinsäure, mit der es verknüpft wurde, in der Lage ist. Bei einer bevorzugten Art von Vektor handelt es sich um ein Episom, d. h. eine zur extrachromosomalen Replikation fähige Nukleinsäure. Als Vektoren sind solche bevorzugt, die zur autonomen Replikation und Expression von Nukleinsäuren, mit denen sie verknüpft sind, in der Lage sind. Zur Steuerung der Expression von Genen, mit denen sie operativ verknüpft sind, fähige Vektoren werden hier mit „Expressionsvektoren” bezeichnet. Im allgemeinen liegen Expressionsvektoren mit Nutzung in rekombinanten DNA-Techniken häufig in Form von „Plasmiden” vor, die sich im allgemeinen auf zirkuläre doppelsträngige DNA-Schleifen beziehen, die in ihrer Vektorform nicht an das Chromosom gebunden sind. In der vorliegenden Beschreibung werden „Plasmid” und „Vektor” gegeneinander austauschbar verwendet, da es sich bei dem Plasmid um die am häufigsten verwendete Vektorform handelt. Die Erfindung soll jedoch auch solche weiteren Formen von Expressionsvektoren umfassen, die gleichwertige Funktionen ausüben und die im Anschluß hieran im Fachgebiet bekannt werden.
Der Begriff „Behandeln”, wie er hier verwendet wird, soll die Heilung ebenso wie die Linderung wenigstens eines Symptons des Leidens oder der Krankheit umfassen.
4.3 Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung
Die Nukleinsäuren der vorliegenden Erfindung sind in Anspruch 1 definiert. Wie nachfolgend beschrieben, beschreibt die Offenbarung isolierte Nukleinsäuren, die für Delta3-Polypeptide codierende Nukleotidsequenzen umfassen, und/oder Äquivalente derartiger Polypeptide oder Nukleinsäuren. Dabei soll der Begriff äquivalent Nukleotidsequenzen umfassen, die für funktionell äquivalente Delta3-Polypeptide oder funktionell äquivalente Peptide mit einer Aktivität eines Delta3-Proteins, wie sie hier beschrieben ist, codieren, umfassen. Äquivalente Nukleotidsequenzen umfassen Sequenzen, die sich um eine oder mehrere Nukleotidsubstitutionen, -additionen oder -deletionen unterscheiden, wie beispielsweise allelische Varianten, und umfassen daher Sequenzen, die sich von der in einer der SEQ ID Nos: 1 oder 3 gezeigten Nukleotidsequenz des Delta3-Gens aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die Nukleinsäure für ein Protein, das die Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID No. 2 aufweist.
Die Nukleinsäuren der Offenbarung können für ein Delta3-Protein aus einer beliebigen Spezies, einschließlich Insekten, codieren. Nukleinsäuren können für Delta3-Proteine aus Vertebraten codieren. Andere Nukleinsäuren codieren für Primaten-Delta3-Proteine, einschließlich Säuger-Delta3-Proteine, z. B. menschliche Delta3-Proteine. Weitere Nukleinsäuren können für Delta3-Proteine aus Vögeln, Pferd, Hund, Katze, Rind oder Schwein codieren.
In einem Teil der Offenbarung codiert die Nukleinsäure für ein eine extrazelluläre Domäne von Delta3, z. B. Delta3 mit der SEQ ID No. 2, umfassendes Polypeptid. Entsprechenderweise können Nukleinsäuren für ein Polypeptid codieren, das etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 umfaßt. Andere Nukleinsäuren können für ein Polypeptid codieren, das einer extrazellulären Domäne von Delta3 entspricht, der im wesentlichen das Signalpeptid fehlt, beispielsweise ein Polypeptid, das etwa Aminosäure 18 bis etwa Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 umfaßt. Wiederum andere Nukleinsäuren codieren für ein Polypeptid, das wenigstens eine der konservierten Motive in der extrazellulären Domäne von Delta3 umfaßt, beispielsweise ein DSL-Motiv oder ein EGF-ähnliches Motiv, wie beispielsweise die in 2 gezeigten (SEQ ID No. 2). Die Nukleinsäure kann für ein Protein mit wenigstens einem EGF-ähnlichen Motiv codieren. Eine weitere Nukleinsäure codiert für Proteine mit wenigstens 2, wenigstens 3, wenigstens 4, wenigstens 5, wenigstens 6, wenigstens 7 oder 8 EGF-ähnlichen Wiederholungen, wie beispielsweise den in 2 gezeigten (SEQ ID No. 2). Das von einer eine beliebige Anzahl dieser EGF-ähnlichen Wiederholungen codierenden Nukleinsäure codierte Polypeptid kann ferner eine ein DSL-Motiv codierende Aminosäuresequenz umfassen.
Alle von den oben beschriebenen Nukleinsäuren codierten Polypeptide können löslich sein. Lösliche Peptide können wenigstens einen Teil der extrazellulären Domäne eines Delta3-Proteins umfassen. Lösliche Polypeptide können eine Aminosäuresequenz umfassen, die etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 oder einem Homolog davon entspricht. Noch weitere lösliche Delta3-Polypeptide umfassen wenigstens eine EGF-ähnliche Wiederholung. Solche Polypeptide können zusätzlich eine DSL-Domäne und gegebenenfalls ein Signalpeptid umfassen.
Beschrieben sind ebenso Nukleinsäuren, die für ein Delta3-Polypeptid codieren, bei dem es sich um ein Fusionsprotein handelt. Ein bevorzugtes Fusionsprotein ist ein Delta3-Ig-Fusionsprotein. Solche Fusionsproteine können wenigstens einen Anteil der extrazellulären Domäne einer Delta3-Domäne umfassen. Bei einem Anteil kann es sich um einen beliebigen Anteil von wenigstens etwa 10 Aminosäuren, wie etwa die oben beschriebenen Anteile, handeln. Derartige Fusionsproteine codierende Nukleinsäuren lassen sich wie im US-Patent Nr. 5,434,131 herstellen.
Alternativ können von der Nukleinsäure der Offenbarung codierte Polypeptide membrangebunden sein. Membrangebundene Polypeptide der Offenbarung können eine Transmembrandomäne umfassen. Die Transmembrandomäne kann dabei aus einem Delta3-Protein stammen, wie beispielsweise eine Transmembrandomäne, die etwa Aminosäure 530 bis Aminosäure 553 der in 2 gezeigten SEQ ID No. 2 umfaßt. Als Alternative kann die Transmembrandomäne aus einem anderen Membranprotein stammen, so daß ein chimärisches membranständiges Delta3-Protein gebildet wird. Bei noch weiteren Polypeptiden der Offenbarung kann es sich um intrazelluläre Proteine handeln. Dementsprechend sind auch Proteine, die keine Transmembrandomäne umfassen, beschrieben. Andere erfindungsgemäße Proteine enthalten keine extrazelluläre Domäne. Weitere Proteine der Offenbarung enthalten weder eine extrazelluläre Domäne noch eine Transmembrandomäne.
Von der Nukleinsäure der Offenbarung codierte Polypeptide können eine zytoplasmatische Domäne umfassen. Eine Nukleinsäure der Offenbarung kann für ein eine zytoplasmatische Delta3-Domäne umfassendes Polypeptid kodieren. Die zytoplasmatische Domäne kann eine Aminosäuresequenz aufweisen, die einer Sequenz von etwa Aminosäure 554 bis etwa Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 (2) oder einem Anteil davon entspricht.
In noch weiteren Ausgestaltungen der Offenbarung codiert die Nukleinsäure für ein Polypeptid, das wenigstens eine Domäne eines Delta3-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: einem Signalpeptid, einem DSL-Motiv, einer EGF-ähnlichen Wiederholung, einer Transmembrandomäne sowie einer zytoplasmatischen Domäne, umfaßt. Dabei kann das Polypeptid der Offenbarung mehrere dieser Domänen aus einem Delta3-Protein umfassen. Als Alternative kann es sich bei einem Polypeptid der Offenbarung um ein chimärisches Protein, d. h. ein Protein, das mehrere dieser konservierten Domänen umfaßt, von denen wenigstens einige aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein stammen, handeln. Dementsprechend codiert eine Nukleinsäure der Offenbarung für ein Polypeptid mit einem DSL-Motiv, das eine Aminosäuresequenz aus einem von Delta3 verschiedenen Delta3-Protein aufweist. Bei einer solchen Aminosäuresequenz kann es sich um eine beliebige in 2 gezeigte Sequenz als ein DSL-Motiv handeln. Noch eine weitere beschriebene Nukleinsäure kodiert für ein Delta3-Protein, das ein Signalpeptid aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein aufweist. Ebenso beschrieben sind Nukleinsäuren, die für ein Delta3-Polypeptid mit einer zytoplasmatischen Domäne aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein codieren, sowie Nukleinsäuren, die für eine zytoplasmatische Delta3-Domäne sowie eine extrazelluläre Domäne aus einem anderen Protein als einem Delta3-Protein codieren. Bei von Delta3-Proteinen verschiedenen Proteinen kann es sich beispielsweise um toporythmische Proteine handeln. Unter „toporythmische Proteine” sollen Notch, Delta, Serrate, Enhancer of Split, Deltex sowie weitere Mitglieder dieser Familie von Proteinen, die strukturelle Ähnlichkeiten teilen, fallen (siehe z. B. internationale Patentanmeldungen Nr. WO 97/01571 ; WO 92/19734 und WO 92/19734 und WO 94/07474 , supra).
Beschrieben sind ebenso Nukleinsäuren, die für Polypeptide mit einer Aminosäuresequenz, die homolog zu einem der oben beschriebenen Anteile der SEQ ID No. 2 ist, codieren. Einige Nukleinsäuren der Offenbarung codieren für Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens etwa 70%, mindestens etwa 75%, mindestens etwa 80% oder mindestens etwa 85% homolog oder identisch zu der Aminosäuresequenz einer der in 2 gezeigten Delta3-Domänen ist. Noch mehr Nukleinsäuren der Offenbarung codieren für Polypeptide, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die mindestens etwa 90%, mindestens etwa 95%, mindestens etwa 98% oder mindestens etwa 99% homolog oder identisch zu der Aminosäuresequenz einer der in 2 gezeigten Delta3-Domänen ist.
In einem Teil der Offenbarung codiert die Nukleinsäure, z. B. cDNA, für ein Peptid mit wenigstens einer Bioaktivität des betreffenden Delta3-Polypeptids, wie beispielsweise der Fähigkeit, an einen Delta3-Rezeptor, z. B. Notch, zu binden. Zur Wechselwirkung mit einem Delta3-Protein oder Fragment davon fähige Proteine oder Peptide lassen sich mit verschiedenen Verfahren, beispielsweise auf Bindungstests beruhenden Verfahren, identifizieren. So können beispielsweise verschiedene Arten von Expressionsbibliotheken einem Screening mit Delta3-Protein oder einem Anteil davon unterzogen werden. Zur Isolierung mit der zytoplasmatischen Domäne von Delta3 wechselwirkender zytoplasmatischer Proteine läßt sich ein 2-Hybrid-System verwenden. Anteile von Delta3-Proteinen, die zur Wechselwirkung mit einem Liganden in der Lage sind, lassen sich bestimmen, indem man Fragmente von Delta3-Proteinen präpariert und diese Fragmente einem Screening auf solche Fragmente, die zur Wechselwirkung mit dem Liganden in der Lage sind, unterzieht. Wenigstens zum Teil aufgrund der Beobachtung, daß der N-terminale Anteil des Drosophila-Delta-Proteins, der eine DSL-Domäne sowie eine EGF-ähnliche Domäne enthält, notwendig und hinreichend für eine In-vitro-Bindung an Notch ist (Henrique et al., supra; Muskavitch et al., supra), ist es wahrscheinlich, daß die zur Wechselwirkung mit einem Liganden fähige Domäne von Delta3-Proteinen die DSL-Domäne und/oder mindestens einen Anteil der EGF-ähnlichen Domäne enthält. Allerdings könnten auch andere Anteile der extrazellulären Domäne von Delta3 für die Bindung zumindest an einige Delta3-Liganden notwendig sein.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen kann das betreffende Delta3-Polypeptid die Proliferation und/oder Differenzierung oder den Zelltod spezifischer Zielzellen, beispielsweise Nervenzellen oder Endothelzellen, modulieren. Tests zur Bestimmung davon, daß ein Delta3-Polypeptid mindestens eine Bioaktivität eines Delta3-Proteins aufweist, sind unten beschrieben.
Die Offenbarung beschreibt ferner Nukleinsäuremoleküle zur Verwendung als Sonden/Primer oder Antisense-Moleküle (d. h. nichtcodierende Nukleinsäuremoleküle), die wenigstens etwa 6, 12, 20, 30, 50, 100, 125, 150 oder 200 Nukleotide oder Basenpaare umfassen, vor. Noch weitere Nukleinsäuren der Offenbarung umfassen wenigstens etwa 300, wenigstens etwa 350, wenigstens etwa 400, wenigstens etwa 450, wenigstens etwa 500 oder wenigstens etwa 600 Nukleotide der SEQ ID No. 1 oder 3. Gewisse Nukleinsäuren der Offenbarung entsprechen einem 5'-Anteil der Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 1. So kann beispielsweise eine Nukleinsäure der Offenbarung einem Anteil von etwa Nukleotid 1 bis etwa Nukleotid 2000 der Nukleinsäuresequenz SEQ ID No. 1 entsprechen.
Zu den als Sonde gemäß den Verfahren der Offenbarung verwendeten beschriebenen Nukleinsäuren gehören Nukleinsäuren, die eine Nukleotidsequenz mit wenigstens etwa 6, vorzugsweise wenigstens etwa 9, stärker bevorzugt wenigstens etwa 12 und noch stärker bevorzugt wenigstens etwa 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus SEQ ID No. 1 oder einem Anteil davon umfassen. Der Anteil kann etwa Nukleotid 1 bis etwa Nukleotid 2060 der SEQ ID No. 1 entsprechen. Als Alternative kann es sich bei einem Anteil um eine für ein konserviertes Motiv des hDelta3-Proteins codierende Nukleotidsequenz handeln. Andererseits kann es sich bei dem Anteil um eine Nukleotidsequenz handeln, die zwischen für konservierte Motive des hDelta3-Proteins codierende Nukleinsäuresequenzen lokalisiert ist.
Ein weiterer Gegenstand der Offenbarung ist eine Kombination aus wenigstens zwei Nukleinsäuren, die wenigstens einem Anteil der SEQ ID No. 1 oder einem Homolog davon entsprechen. Dementsprechend beschreibt die Offenbarung eine Kombination aus zwei Nukleinsäuren mit wenigstens etwa 6, wenigstens etwa 9, wenigstens etwa 12 und wenigstens etwa 15 aufeinanderfolgenden Nukleotiden aus SEQ ID No. 1 oder aus einem Anteil davon bereitgestellt. Wenigstens eine der Nukleinsäuren kann markiert sein.
Ebenso beschrieben ist eine Nukleinsäure, die unter stringenten Bedingungen an eine durch eine der SEQ ID Nos: 1 oder 3 dargestellte Nukleinsäure hybridisiert. Geeignete Stringenzbedingungen, die die DNA-Hybridisierung fördern, beispielsweise 6,0 × Natriumchlorid/Natriumcitrat (SSC) bei etwa 45°C mit einem anschließenden Waschschritt mit 2,0 × SSC bei 50°C, sind dem Fachmann bekannt oder lassen sich den Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, N. Y. (1989), 6.3.1–6.3.6 entnehmen. So läßt sich beispielsweise die Salzkonzentration im Waschschritt von einer niedrigen Stringenz von etwa 2,0 × SSC bei 50°C bis zu einer hohen Stringenz von etwa 0,2 × SSC bei 50°C oder bei 65°C auswählen. Darüber hinaus kann die Temperatur im Waschschritt von niedrigstringenten Bedingungen bei Raumtemperatur, etwa 22°C, bis zu hochstringenten Bedingungen bei etwa 65°C erhöht werden. Sowohl Temperatur als auch Salz können verändert werden, oder man kann die Temperatur und Salzkonzentration konstant halten, während die andere Variable verändert wird. In einem Teil der Offenbarung bindet eine konservierende Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung an eine der Sequenzen SEQ ID Nos 1 oder 3 unter mäßigstringenten Bedingungen, beispielsweise bei etwa 2,0 × SSC und etwa 40°C. Eine besondere Delta3-Nukleinsäure der vorliegenden Offenbarung bindet unter hochstringenten Bedingungen an eine der Sequenzen SEQ ID Nos: 1 oder 3.
Erfindungsgemäß ebenso umfaßt sind Nukleinsäuren mit einer Sequenz, die sich von den in einer der SEQ ID Nos: 1 oder 3 gezeigten Nukleotidsequenzen aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes unterscheidet. Derartige Nukleinsäuren codieren funktionell äquivalente Peptide (d. h. ein Peptid mit einer biologischen Aktivität eines Delta3-Polypeptids), unterscheiden sich jedoch in ihrer Sequenz aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes von der im Sequenzprotokoll aufgeführten Sequenz. So werden beispielsweise eine Reihe von Aminosäuren durch mehr als ein Triplett beschrieben. Codons, die die gleiche Aminosäure bezeichnen, oder Synonyme (beispielsweise codieren CAU und CAC jeweils für Histidin) können zu „stillen” Mutationen führen, die die Aminosäuresequenz eines Delta3-Polypeptids nicht beeinflussen. Es wird jedoch erwartet, daß DNA-Sequenzpolymorphismen existieren, die zu Veränderungen in den Aminosäuresequenzen der betreffenden Delta3-Polypeptide führen. Einem Fachmann ist ersichtlich, daß diese Variationen bei einem oder mehreren Nukleotiden (z. B. bis zu etwa 3–5% der Nukleotide) der Polypeptide mit einer Aktivität eines Delta3-Polypeptids codierenden Nukleinsäuren aufgrund natürlicher allelischer Variation zwischen Individuen einer gegebenen Spezies existieren können.
Wie in den unten aufgeführten Beispielen angedeutet, lassen sich für Delta3-Protein codierende Nukleinsäuren aus in einer aus einer Reihe von eukaryontischen Zellen vorhandener mRNA erhalten. Dabei sollte es auch möglich sein, Nukleinsäuren, die für Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung codieren, aus genomischer DNA sowohl aus Erwachsenen als auch aus Embryos zu erhalten. So läßt sich beispielsweise ein für ein Delta3-Protein codierendes Gen entweder von einer cDNA oder einer genomischen Bank gemäß den hier beschriebenen ebenso wie den dem Fachmann allgemein bekannten Vorschriften klonieren. Zu den zur Isolierung der betreffenden Nukleinsäuren geeigneten Geweben und/oder Bibliotheken gehören beispielsweise unter anderem Endothelzellenbibliotheken. Eine für ein Delta3-Protein codierende cDNA läßt sich erhalten, indem man Gesamt-mRNA von einer Zelle, beispielsweise einer Vertebratenzelle, einer Säugerzelle oder einer menschlichen Zelle, einschließlich embryonaler Zellen, isoliert. Anschließend lassen sich aus der Gesamt-mRNA doppelsträngige cDNAs präparieren und daraufhin mit einer aus einer Reihe bekannter Techniken in einen geeigneten Plasmid- oder Bakteriophagenvektor inserieren. Das für ein Delta3-Protein codierende Gen kann auch unter Verwendung etablierter Polymerasekettenreaktionstechniken im Sinne der von der Erfindung bereitgestellten Nukleotidsequenzangaben kloniert werden. Bei der erfindungsgemäßen Nukleinsäure kann es sich um DNA oder RNA handeln. Eine bevorzugte Nukleinsäure ist eine cDNA, die durch eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellt ist.
4.3.1 Vektoren
Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind ebenso Expressionsvektoren, die eine für ein Delta3-Polypeptid codierende Nukleinsäure in operativer Verknüpfung mit wenigstens einer Transkriptionsregulationssequenz enthalten. Dabei soll unter „operativer Verknüpfung” verstanden werden, daß die Nukleotidsequenz mit einer Regulationssequenz auf eine Weise verknüpft ist, die die Expression der Nukleotidsequenz gestattet. Regulationssequenzen sind im Fachgebiet bekannt und werden zur Steuerung der Expression der betreffenden Delta3-Proteine ausgewählt. Dementsprechend fallen unter den Begriff „Transkriptionsregulationssequenz” Promotoren, Enhancer und andere Expressionskontrollelemente. Derartige Regulationssequenzen sind bei Goeddel; Gene Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990) beschrieben. In einer Ausführungsform beinhaltet der Expressionsvektor ein für ein Peptid mit einer agonistischen Aktivität eines betreffenden Delta3-Polypeptids oder alternativ für ein Peptid, bei dem es sich um eine antagonistische Form des Delta3-Proteins handelt, codierendes rekombinantes Gen. Derartige Expressionsvektoren können zur Transfektion von Zellen verwendet werden, wodurch Polypeptide, einschließlich Fusionsproteine, die von den Nukleinsäuren, wie sie hier beschrieben sind, codiert werden, produziert werden. Zudem können die Genkonstrukte der vorliegenden Erfindung auch als Teil eines Gentherapieprotokolls zur Zuführung von entweder eine agonistische oder eine antagonistische Form eines der betreffenden Delta3-Proteine codierenden Nukleinsäuren verwendet werden. Somit betrifft ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt Expressionsvektoren zur In-vivo- oder In-vitro-Transfektion und Expression eines Delta3-Polypeptids in bestimmten Zellarten, so daß die Funktion der Delta-induzierten Signalgebung in einem Gewebe wiederhergestellt oder alternativ aufgehoben wird. Dies könnte beispielsweise wünschenswert sein, wenn die natürlich vorkommende Form des Proteins fehlexprimiert wird, oder um eine Form des Proteins, die die Differenzierung von Gewebe verändert, zuzuführen. Expressionsvektoren können auch zur Hemmung neoplastischer Transformation eingesetzt werden.
Neben viralen Transferverfahren, wie beispielsweise den oben dargestellten, lassen sich auch nichtvirale Verfahren zur Herbeiführung der Expression eines betreffenden Delta3-Polypeptids im Gewebe eines Tiers einsetzen. Die meisten nichtviralen Gentransferverfahren beruhen auf den von Säugerzellen verwendeten normalen Mechanismen für die Aufnahme und den intrazellulären Transport von Makromolekülen. In bevorzugten Ausführungsformen beruhen nichtvirale zielgerichtete Mittel der vorliegenden Erfindung auf endozytischen Wegen zur Aufnahme des betreffenden Delta3-Polypeptid-Gens durch die Zielzelle. Zu den beispielhaften zielgerichteten Mitteln dieser Art gehören von Liposomen abgeleitete Systeme, Polylysinkonjugate sowie künstliche Virushüllen.
4.30.2 Sonden und Primer
Zudem gestatten die aus der Klonierung von hDelta3-Genen bestimmten Nukleotidsequenzen ferner die Erzeugung von Sonden und Primern, die zur Verwendung bei der Identifizierung und/oder Klonierung von Delta3-Homologen in anderen Zellarten, beispielsweise aus anderen Geweben, ebenso wie von Delta3-Homologen aus anderen Säugerorganismen vorgesehen sind. Sonden und Primer können auch zur Bestimmung der Identität eines Delta3-Allels und/oder des Vorhandenseins oder der Abwesenheit einer oder mehrerer Mutationen in einem Delta3-Gen einer Untersuchungsperson verwendet werden. Eine Sonde bzw. ein Primer läßt sich zur Bestimmung davon, ob eine Untersuchungsperson eine Krankheit bzw. ein Leiden, die bzw. das mit einem spezifischen Delta3-Allel, wie beispielsweise einem eine Mutation tragenden Allel, assoziiert ist, aufweist oder in Gefahr ist, eine derartige Krankheit bzw. ein derartiges Leiden zu entwickeln, verwenden.
Die Offenbarung beschreibt ebenso eine Sonde/ein Primer, die bzw. der ein weitgehend gereinigtes Oligonukleotid umfaßt, wobei das Oligonukleotid einen Nukleotidsequenzbereich umfaßt, der unter stringenten Bedingungen an wenigstens etwa 12, vorzugsweise etwa 25, stärker bevorzugt etwa 40, 50 oder 75 aufeinanderfolgende Nukleotide von Sense- oder Antisense-Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID No: 1 und 3, oder natürlich vorkommende Mutanten davon hybridisiert. So lassen sich beispielsweise auf der in SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellten Nukleinsäure beruhende Primer in PCR-Reaktionen zur Klonierung von Delta3-Homologen, beispielsweise spezifischen Delta3-Allelen, verwenden. Derartige Primer werden vorzugsweise in einem Bereich ausgewählt, der keine signifikante Homologie mit anderen Genen, beispielsweise anderen Delta-Genen, teilt. Primer sind gemäß SEQ ID Nos. 4–8 nachfolgend angegeben: 5'-Ende-Primer

3'-Ende-Primer
Gleichfalls lassen sich auf den betreffenden Delta3-Sequenzen beruhende Sonden zum Nachweis von Transkripten oder genomischen Sequenzen, die für die gleichen oder homologe Proteine codieren, verwenden. Die Sonde kann ferner eine daran gebundene Markierungsgruppe, die nachgewiesen werden kann, umfassen; beispielsweise ist die Markierungsgruppe ausgewählt unter Radioisotopen, Fluoreszenzverbindungen, Enzymen und Enzym-Cofaktoren.
Derartige Sonden können auch, wie nachfolgend ausführlicher erörtert, als Teil eines diagnostischen Testkits zur Identifizierung von Zellen oder Gewebe, worin ein Delta3-Protein fehlexprimiert wird, verwendet werden, indem man beispielsweise ein Niveau einer für Delta codierenden Nukleinsäure in einer Probe von Zellen aus einem Patienten mißt, beispielsweise Delta3-mRNA-Niveaus nachweist oder bestimmt, ob ein genomisches Delta3-Gen mutiert oder deletiert wurde. Kurz gesagt lassen sich dafür Nukleotidsonden aus den betreffenden Delta3-Genen erzeugen, mit denen das histologische Screening von intaktem Gewebe sowie Gewebsproben auf das Vorhandensein (bzw. die Abwesenheit) von für Delta codierenden Transkripten erleichtert wird. Ähnlich wie die diagnostischen Anwendungen von Anti-Delta3-Antikörpern kann die Verwendung von gegen Delta3-Messages oder gegen genomische Delta3-Sequenzen gerichteten Sonden sowohl zur prognostischen als auch zur therapeutischen Bewertung allelischer Mutationen, die sich beispielsweise in neoplastischen oder hyperplastischen Erkrankungen (z. B. unerwünschtem Zellwachstum) oder einer abnormalen Gewebedifferenzierung äußern könnten, einsetzen. In Verbindung mit Immunoassays, wie sie hier beschrieben sind, können die Oligonukleotidsonden dazu verwendet werden, bei der Erleichterung der Bestimmung der molekularen Basis für eine Entwicklungsstörung, an der eine gewisse, mit der Expression (oder dem Fehlen davon) eines Delta3-Proteins assoziierte Abnormalität beteiligt sein kann, zu helfen. So läßt sich beispielsweise eine Variation in der Polypeptidsynthese von einer Mutation in einer codierenden Sequenz unterscheiden.
Ebenso beschrieben sind Kits zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer Krankheit bzw. eines Leidens, die bzw. das von einer anomalen Delta3-Bioaktivität verursacht wird oder an der bzw. an dem eine anomale Delta3-Bioaktivität beteiligt ist und/oder die bzw. das mit einem oder mehreren spezifischen Delta3-Allelen assoziiert ist, besteht. In einer bevorzugten Ausführungsform läßt sich der Kit zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer neurologischen Erkrankung oder Störung, beispielsweise einer peripheren Neuropathie, z. B. ACCPN, besteht, verwenden.
4.3.3 Antisense-, Ribozym- und Triplex-Techniken
Ein Teil der Offenbarung betrifft die Verwendung der isolierten Nukleinsäure in der „Antisense”-Therapie. „Antisense”-Therapie, wie hier verwendet, bezieht sich auf die Verabreichung oder In-situ-Erzeugung von Oligonukleotidmolekülen oder ihren Derivaten, die mit der zellulären mRNA und/oder genomischen DNA, die für eines oder mehrere der betreffenden Delta3-Proteine codiert, spezifisch unter zellulären Bedingungen hybridisieren (z. B. binden), so daß die Expression dieses Proteins, beispielsweise durch Hemmung der Transkription und/oder Translation, gehemmt wird. Die Bindung kann über herkömmliche Basenpaarkomplementarität oder beispielsweise im Fall der Bindung an DNA-Duplexe über spezifische Wechselwirkungen in der großen Furche der Doppelhelix erfolgen. Im allgemeinen bezieht sich „Antisense”-Therapie auf den Bereich von allgemein im Fachgebiet eingesetzten Techniken und umfaßt alle Therapien, die auf der spezifischen Bindung an Oligonukleotidsequenzen beruhen.
Beispielsweise läßt sich ein Antisense-Konstrukt als ein Expressionsplasmid zuführen, das, wenn es in der Zelle transkribiert wird, RNA produziert, welche wenigstens zu einem einzigartigen Anteil der zellulären mRNA, die für ein Delta3-Protein codiert, komplementär ist. Alternativ handelt es sich bei dem Antisense-Konstrukt um eine Oligonukleotidsonde, die ex vivo erzeugt wird und die bei ihrer Einführung in die Zelle die Hemmung der Expression durch Hybridisierung mit der mRNA und/oder genomischen Sequenzen eines Delta3-Gens herbeiführt. Bei derartigen Oligonukleotidsonden handelt es sich vorzugsweise um modifizierte Oligonukleotide, die gegenüber endogenen Nukleasen, beispielsweise Exonukleasen und/oder Endonukleasen, resistent und daher in vivo stabil sind. Als Antisense-Oligonukleotide verwendbare Nukleinsäuremoleküle sind bespielsweise Phosphoramidat-, Phosphothioat- und Methylphosphonat-DNA-Analoge (siehe auch US-Patente 5,176,996 ; 5,264,564 und 5,256,775 ). Darüber hinaus wurden allgemeine Ansätze zur Konstruktion von bei der Antisense-Therapie geeigneten Oligomeren in Übersichtsartikeln behandelt, beispielsweise von Van der Krol et al. (1988) Biotechniques 6: 958–976; und Stein et al. (1988) Cancer Res 48: 2659–2668. In bezug auf Antisense-DNA sind von der Translationsinitiationsstelle, beispielsweise zwischen den –10- und +10-Bereichen der interessierenden Delta3-Nukleotidsequenz, abgeleitete Oligodesoxyribonukleotide bevorzugt. Besondere Antisense-Moleküle sind nachfolgend aufgeführt:
Antisense-Ansätze beinhalten die Konstruktion von Oligonukleotiden (entweder DNA oder RNA), die zu Delta3-mRNA komplementär sind. Die Antisense-Oligonukleotide binden an die Delta3-mRNA-Transkripte und verhindern die Translation. Daher ist eine absolute Komplementarität, obwohl bevorzugt, nicht erforderlich. Unter einer zu einem Anteil einer RNA „komplementären” Sequenz, auf die hier verwiesen wird, versteht man eine Sequenz mit ausreichender Komplementarität, so daß sie an die RNA unter Ausbildung eines stabilen Duplexes hybridisieren kann; im Fall doppelsträngiger Antisense-Nukleinsäuren kann somit ein Einzelstrang der Duplex-DNA oder eine Triplexformation getestet werden. Die Fähigkeit zur Hybridisierung hängt sowohl vom Grad der Komplementarität als auch der Menge der Antisense-Nukleinsäure ab. Im allgemeinen gilt, je länger die hybridisierende Nukleinsäure ist, desto mehr Basenfehlpaarungen mit einer RNA kann sie enthalten und immer noch einen stabilen Duplex (oder Triplex, je nach Fall) bilden. Ein Fachmann kann einen tolerierbaren Grad an Fehlpaarung durch Verwendung von Standardverfahren zur Bestimmung des Schmelzpunkts des hybridisierten Komplexes ermitteln.
Am wirksamsten bei der Hemmung der Translation sollten Oligonukleotide arbeiten, die zum 5'-Ende der Message, beispielsweise der 5'-nichttranslatierten Sequenz bis zum und einschließlich des AUG-Initiationscodons, komplementär sind. Allerdings konnte kürzlich gezeigt werden, daß zu den 3'-nichttranslatierten Sequenzen von mRNAs komplementäre Sequenzen ebenso bei der Hemmung der Translation von mRNAs wirksam sind (Wagner, R. 1994. Nature 372: 333). Daher könnten in einem Antisense-Ansatz zur Hemmung der Translation endogener Delta3-mRNA Oligonukleotide verwendet werden, die entweder zu den 5'- oder den 3'-nichttranslatierten, nicht codierenden Bereichen eines Delta3-Gens komplementär sind. Zum 5'-nichttranslatierten Bereich der mRNA komplementäre Oligonukleotide sollten das Komplement des AUG-Startcodons beinhalten. Zu codierenden mRNA-Bereichen komplementäre Antisense-Oligonukleotide sind weniger wirksame Inhibitoren der Translation, könnten aber im erfindungsgemäßen Sinne verwendet werden. Gleichgültig, ob sie zur Hybridisierung an den 5'-, 3'- oder codierenden Bereich von Delta3-mRNA vorgesehen sind, sollten Antisense-Nukleinsäuren eine Länge von wenigstens sechs Nukleotiden aufweisen, wobei es sich dabei vorzugsweise um Oligonukleotide mit einer Länge im Bereich von 6 bis etwa 50 Nukleotiden handelt. In bestimmten Ausführungsformen besteht das Oligonukleotid aus wenigstens 10 Nukleotiden, wenigstens 17 Nukleotiden, wenigstens 25 Nukleotiden oder wenigstens 50 Nukleotiden.
Ungeachtet der Wahl der Zielsequenz ist es bevorzugt, daß zunächst In-vitro-Untersuchungen zur Quantifizierung der Fähigkeit des Antisense-Oligonukleotids zur Hemmung der Genexpression durchgeführt werden. Dabei ist es bevorzugt, daß bei diesen Untersuchungen Kontrollen verwendet werden, die zwischen der Antisense-Genhemmung und nichtspezifischen biologischen Effekten von Oligonukleotiden unterscheiden. Ebenso ist es bevorzugt, daß in diesen Untersuchungen Niveaus der Ziel-RNA oder des Zielproteins mit dem einer internen Kontroll-RNA oder eines internen Kontrollproteins verglichen werden. Darüber hinaus ist vorgesehen, daß mit dem Antisense-Oligonukleotid erhaltene Ergebnisse mit den mit einem Kontrolloligonukleotid erhaltenen Ergebnissen verglichen werden. Dabei ist bevorzugt, daß das Kontrolloligonukleotid ungefähr die gleiche Länge wie das Testoligonukleotid aufweist und daß sich die Nukleotidsequenz des Oligonukleotids von der Antisense-Sequenz um nicht mehr als zur Verhinderung der spezifischen Hybridisierung an die Zielsequenz notwendig ist unterscheidet.
Bei den Oligonukleotiden kann es sich um einzelsträngige oder doppelsträngige DNA oder RNA oder chimärische Gemische oder Derivate oder modifizierte Versionen davon handeln. Dabei kann das Oligonukleotid an der Basengruppierung, der Zuckergruppierung oder dem Phosphatrückgrat modifiziert sein, um beispielsweise die Stabilität des Moleküls, die Hybridisierung usw. zu verbessern. Das Oligonukleotid kann weitere angehängte Gruppen, wie beispielsweise Peptide (z. B. zum Abzielen auf Wirtszellenrezeptoren in vivo) oder Agentien, die den Transport durch die Zellmembran (siehe z. B. Letsinger et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86: 6553–6556; Lemaitre et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. 84: 648–652; PCT-Veröffentlichung Nr. WO 88/09810 , veröffentlicht am 15. Dezember 1988) oder die Blut-Hirn-Schranke (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung Nr. WO 89/10134 , veröffentlicht am 25. April 1988), erleichtern, durch Hybridisierung ausgelöste Spaltungsagentien (siehe z. B. Krol et al., 1988, BioTechniques 6: 958–976) oder interkalierende Agentien (siehe z. B. Zon, 1988, Pharm. Res. 5: 539–549), enthalten. Hierzu kann das Oligonukleotid mit einem weiteren Molekül, beispielsweise einem Peptid, einem durch Hybridisierung ausgelösten Quervernetzungsmittel, einem Transportmittel, einem durch Hybridisierung ausgelösten Spaltungsagens usw. konjugiert sein.
Das Antisense-Oligonukleotid kann wenigstens eine modifizierte Basengruppierung, die ausgewählt ist aus der Gruppe, einschließend, ohne darauf beschränkt zu sein, 5-Fluoruracil, 5-Bromuracil, 5-Chloruracil, 5-Ioduracil, Hypoxanthin, Xanthin, 4-Acetylcytosin, 5-(Carboxyhydroxylmethyl)uracil, 5-Carboxymethylaminomethyl-2-thiouridin, 5-Carboxymethylaminomethyluracil, Dihydrouracil, beta-D-Galactosylcheosin, Inosin, N6-Isopentenyladenin, 1-Methylguanin, 1-Methylinosin, 2,2-Dimethylguanin, 2-Methyladenin, 2-Methylguanin, 3-Methylcytosin, 5-Methylcytosin, N6-adenin, 7-Methylguanin, 5-Methylaminomethyluracil, 5-Methoxyaminomethyl-2-thiouracil, beta-D-Mannosylcheosin, 5'-Methoxycarboxymethyluracil, 5-Methoxyuracil, 2-Methylthio-N6-isopentenyladenin, Uracil-5-oxyessigsäure (v), Wybutoxosin, Pseudouracil, Cheosin, 2-Thiocytosin, 5-Methyl-2-thiouracil, 2-Thiouracil, 4-Thiouracil, 5-Methyluracil, Uracil-5-oxyessigsäuremethylester, Uracil-5-oxyessigsäure (v), 5-Methyl-2-thiouracil, 3-(3-Amino-3-N-2-carboxypropyl)uracil, (acp3)w und 2,6-Diaminopurin, umfassen.
Das Antisense-Oligonukleotid kann auch wenigstens eine modifizierte Zuckergruppierung, ausgewählt aus der Gruppe, einschließend, ohne darauf beschränkt zu sein, Arabinose, 2-Fluorarabinose, Xylulose und Hexose, umfassen.
In noch einer weiteren Ausführungsform umfaßt das Antisense-Oligonukleotid wenigstens ein modifiziertes Phosphatrückgrat, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Phosphorothioat, einem Phosphorodithioat, einem Phosphoramidothioat, einem Phosphoramidat, einem Phosphordiamidat, einem Methylphosphonat, einem Alkylphosphotriester sowie einem Formacetal oder einem Analog davon.
In noch einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei dem Antisense-Oligonukleotid um ein α-anomeres Oligonukleotid. Ein α-anomeres Oligonukleotid bildet spezifische doppelsträngige Hybride mit komplementärer RNA, bei denen im Gegensatz zu den üblichen β-Einheiten die Stränge parallel zueinander verlaufen (Gautier et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6625–6641). Bei dem Oligonukleotid handelt es sich um ein 2'-O-Methylribonukleotid (Inoue et al., 1987, Nucl. Acids Res. 15: 6131–6148) oder ein chimärisches RNA-DNA-Analog (Inoue et al., 1987, FEBS Lett. 215: 327–330).
Oligonukleotide können mit im Fachgebiet bekannten Standardverfahren, beispielsweise unter Verwendung eines DNA-Syntheseautomaten (wie er beispielsweise kommerziell von den Firmen Biosearch, Applied Biosystems, usw. erhältlich ist), synthetisiert werden. So können beispielsweise Phosphorothioat-Oligonukleotide nach dem Verfahren von Stein et al. (1988, Nucl. Acids Res. 16: 3209) synthetisiert und Methylphosphonat-Oligonukleotide unter Verwendung von CPG(controlled pore glass)-Polymerträgern (Sarin et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85: 7448–7451) usw. hergestellt werden.
Obschon zur Sequenz des codierenden Bereichs komplementäre Antisense-Nukleinsäuren verwendet werden könnten, sind solche bevorzugt, die zu dem transkribierten nichttranslatierten Bereich komplementär sind. Noch stärker bevorzugt sind Antisense-Nukleinsäuren, die mit der Translationsinitiationsstelle überlappen. So lassen sich beispielsweise Antisense-Oligonukleotide, wie sie nachfolgend aufgeführt sind, im offenbarungsgemäßen Sinne nutzen.
Die Antisense-Moleküle sollten Zellen zugeführt werden, die das Delta3 in vivo exprimieren. Zur Zuführung von Antisense-DNA oder -RNA an Zellen wurden eine Reihe von Verfahren entwickelt; beispielsweise können Antisense-Moleküle direkt in die Gewebestelle injiziert werden, oder zur Abzielung auf die gewünschten Zellen vorgesehene modifizierte Antisense-Moleküle (z. B. Antisense in Verknüpfung mit Peptiden oder Antikörpern, die spezifisch Rezeptoren oder Antigene, die auf der Zielzellenoberfläche exprimiert werden, binden) können systematisch verabreicht werden.
Häufig ist es jedoch schwierig, intrazelluläre Konzentrationen des Antisense zu erzielen, die ausreichen, um die Translation auf endogenen mRNAs zu unterdrücken. Daher wird in einem bevorzugten Ansatz ein rekombinantes DNA-Konstrukt verwendet, in dem das Antisense-Oligonukleotid unter die Kontrolle eines starken polIII- oder polII-Promotors gestellt wird. Die Verwendung eines solchen Konstrukts zur Transfektion von Zielzellen im Patienten führt zur Transkription ausreichender Mengen an einzelsträngigen RNAs, die mit den endogenen Delta3-Iranskripten komplementäre Basenpaare ausbilden und dadurch die Translation der Delta3-mRNA verhindern. So läßt sich beispielsweise ein Vektor in vivo so einführen, daß er von einer Zelle aufgenommen wird und die Transkription einer Antisense-RNA steuert. Ein solcher Vektor kann episomal bleiben oder kann chromosomal integriert werden, solange wie er zur Produktion der gewünschten Antisense-RNA transkribiert werden kann. Derartige Vektoren lassen sich mit im Fachgebiet bekannten Standardverfahren der rekombinanten DNA-Technologie konstruieren. Bei den Vektoren kann es sich um Plasmid-, Virus- oder andere im Fachgebiet bekannte Vektoren, die zur Replikation und Expression in Säugerzellen verwendet werden, handeln. Die Expression der die Antisense-RNA codierenden Sequenz kann mittels eines beliebigen im Fachgebiet für die Wirkung in Säuger-, vorzugsweise menschlichen Zellen bekannten Promotors erfolgen. Solche Promotoren können induzierbar oder konstitutiv sein. Zu derartigen Promotoren gehören, ohne darauf beschränkt zu sein: der frühe Promotorbereich des SV40 (Bernoist und Chambon, 1981, Nature 290: 304–310), der im 3'-LTR (long terminal repeat) des Rous Sarkoma-Virus enthaltene Promotor (Yamamoto et al., 1980, Cell 22: 787–797), der Herpes-Thymidinkinase-Promotor (Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78: 1441–1445), die regulatorischen Sequenzen des Metallothionein-Gens (Brinster et al., 1982, Nature 296: 39–42), usw. Zur Herstellung des rekombinanten DNA-Konstrukts, das direkt in die Gewebestelle, z. B. den Plexus choroideus oder den Hypothalamus, eingeführt werden kann, können alle Arten von Plasmid-, Cosmid-, YAC- oder Virusvektoren verwendet werden. Als Alternative können Virusvektoren verwendet werden, die das gewünschte Gewebe selektiv infizieren (beispielsweise können für das Gehirn Herpesvirusvektoren verwendet werden), wobei in diesem Fall die Verabreichung über einen anderen Weg (z. B. systematisch) bewerkstelligt werden kann.
Ebenso lassen sich die Antisense-Konstrukte bei der Modulation zellulärer Aktivität sowohl in vivo als auch bei Ex-vivo-Gewebekulturen einsetzen, indem sie die normale biologische Aktivität eines der Delta3-Proteine antagonisieren.
Weiterhin können die Antisense-Techniken (z. B. Mikroinjektion von Antisense-Molekülen oder Transfektion mit Plasmiden, deren Transkripte im Hinblick auf eine Delta3-mRNA oder -Gensequenz antisense sind) zur Untersuchung der Rolle von Delta3 bei Entwicklungsereignissen ebenso wie die normale zelluläre Funktion von Delta3 in adultem Gewebe verwendet werden. Solche Techniken lassen sich in der Zellkultur einsetzen.
Ebenso können zur katalytischen Spaltung von Delta3-mRNA-Iranskripten vorgesehene Ribozymmoleküle zur Verhinderung der Translation von mRNA und der Expression von Delta3 verwendet werden. (Siehe z. B. PCT International Publication WO 94/11364 , veröffentlicht am 4. Oktober 1990; Sarver et al., 1990, Science 247: 1222–1225). Bei Ribozymen handelt es sich um enzymatische RNA-Moleküle, die zur Katalyse der spezifischen Spaltung von RNA in der Lage sind. Am Mechanismus der Ribozymwirkung ist eine sequenzspezifische Hybridisierung des Ribozymmoleküls an die komplementäre Ziel-RNA mit anschließender endonukleolytischer Spaltung beteiligt. Die Zusammensetzung von Ribozymmolekülen muß dabei eine oder mehrere zur Zielgen-mRNA komplementäre Sequenzen und ebenso die für mRNA-Spaltung verantwortliche allgemein bekannte katalytische Sequenz enthalten. Hinsichtlich dieser Sequenz siehe US-Patent Nr. 5,093,246 , die hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen ist. Als solches sind erfindungsgemäß ebenso gentechnisch hergestellte Hammerhead-Motiv-Ribozymmoleküle umfaßt, die die endonukleolytische Spaltung von für Delta3-Proteine codierenden RNA-Sequenzen spezifisch und wirksam katalysieren.
Spezifische Ribozymspaltstellen innerhalb eines potentiellen RNA-Ziels werden zunächst durch Scanning des interessierenden Moleküls auf Ribozymspaltstellen, die die nachfolgenden Sequenzen GUA, GUU und GUC umfassen, identifiziert. Nach der Identifizierung können kurze RNA-Sequenzen mit einer Länge zwischen 15 und 20 Ribonukleotiden, die dem die Spaltstelle enthaltenden Bereich des Zielgens entsprechen, hinsichtlich vorhergesagter Strukturmerkmale, wie beispielsweise Sekundärstruktur, durch die die Oligonukleotidsequenz unbrauchbar werden kann, beurteilt werden. Die Eignung von Kandidatensequenzen kann auch durch Testen ihrer Zugänglichkeit für eine Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden unter Verwendung von Ribonuklease-Protection Assays, beurteilt werden.
Obschon zur Zerstörung von Delta3-mRNAs Ribozyme, die mRNA an stellenspezifischen Erkennungssequenzen spalten, verwendet werden können, ist die Verwendung von Hammerhead-Ribozymen bevorzugt. Hammerhead-Ribozyme spalten mRNAs an Orten, die von den komplementäre Basenpaare mit der Ziel-mRNA bildenden flankierenden Bereichen diktiert werden. Die einzige Anforderung besteht darin, daß die Ziel-mRNA die folgende Sequenz aus zwei Basen aufweist: 5'-UG-3'. Die Konstruktion und Produktion von Hammerhead-Ribozymen ist im Fachgebiet allgemein bekannt und ausführlicher bei Haseloff und Gerlach, 1988, Nature, 334: 585–591 beschrieben. Es gibt hunderte potentieller Hammerhead-Ribozym-Spaltstellen in der Nukleotidsequenz der menschlichen Delta3-cDNA (1). Vorzugsweise wird das Ribozym gentechnisch so hergestellt, daß die Erkennungsspaltstelle in der Nähe des 5'-Endes der Delta3-mRNA lokalisiert ist; d. h. um die Effizienz zu erhöhen und die intrazelluläre Anhäufung nichtfunktioneller mRNA-Transkripte zu minimieren.
Zu den Ribozymen gehören auch RNA-Endoribonukleasen (nachfolgend „Ribozyme vom Cech-Typ”), wie beispielsweise diejenige, die natürlicherweise in Tetrahymena Thermophila vorkommt (als IVS oder L-19-IVS-RNA bekannt) und die umfassend von Thomas Cech und Mitarbeitern beschrieben wurde (Zaug, et al., 1984, Science, 224: 574–578; Zaug und Cech, 1986, Science, 231: 470–475; Zaug, et al., 1986, Nature, 324: 429–433; veröffentlichte internationale Patentanmeldung Nr. WO88/04300 von University Patents Inc.; Been und Cech, 1986, Cell, 47: 207–216). Die Ribozyme vom Cech-Typ weisen eine aktive Stelle von acht Basenpaaren auf, die an eine Ziel-RNA-Sequenz hybridisiert, wonach die Spaltung der Ziel-RNA erfolgt. Von der Offenbarung sind diejenigen Ribozyme vom Cech-Typ umfaßt, die auf die acht Basenpaare großen Sequenzen der aktiven Stelle, die in Delta3 vorhanden sind, abzielen.
Wie beim Antisense-Ansatz können die Ribozyme aus modifizierten Oligonukleotiden zusammengesetzt sein (z. B. für verbesserte Stabilität, verbessertes Abzielen usw.) und sollten Zellen zugeführt werden, die das Delta3 in vivo exprimieren, z. B. Hypothalamus und/oder Plexus choroidius. Bei einem bevorzugten Zuführungsverfahren wird ein DNA-Konstrukt verwendet, das das Ribozym unter der Kontrolle eines starken konstitutiven polIII- oder polII-Promotors „codiert”, so daß transfizierte Zellen ausreichende Mengen des Ribozyms produzieren, um endogene Delta3-Messages zu zerstören und die Translation zu hemmen. Da Ribozyme im Gegensatz zu Antisense-Molekülen katalytisch sind, ist für die Effizienz eine geringere intrazelluläre Konzentration erforderlich.
Eine endogene Delta3-Genexpression kann auch durch Inaktivierung oder „Knocking out” des Delta3-Gens oder seines Promotors unter Verwendung der zielgerichteten homologen Rekombination reduziert werden (z. B. siehe Smithies et al., 1985, Nature 317: 230–234; Thomas & Capecchi, 1987, Cell 51: 503–512; Thompson et al., 1989 Cell 5: 313–321, die jeweils hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen sind). So läßt sich beispielsweise ein von zum endogenen Delta3-Gen (entweder den codierenden Bereichen oder den regulatorischen Bereichen des Delta3-Gens) homologer DNA flankiertes mutantes nichtfunktionelles Delta3 (oder eine vollkommen unverwandte DNA-Sequenz) verwenden, und zwar mit oder ohne einen selektionierbaren Marker und/oder einen negativen selektionierbaren Marker, um Zellen, die Delta3 in vivo exprimieren, zu transfizieren. Die Insertion des DNA-Konstrukts über eine zielgerichtete homologe Rekombination führt zur Inaktivierung des Delta3-Gens. Solche Ansätze eignen sich insbesondere im landwirtschaftlichen Bereich, wo Modifikationen an ES-Zellen (embryonalen Stammzellen) zur Erzeugung von Tiernachkommen mit einem inaktiven Delta3 verwendet werden können (z. B. siehe Thomas & Capecchi 1987 und Thompson 1989, supra). Allerdings läßt sich dieser Ansatz zur Verwendung beim Menschen anpassen, vorausgesetzt, daß die rekombinanten DNA-Konstrukte direkt der erforderlichen Stelle in vivo unter Verwendung entsprechender Virusvektoren, z. B. Herpesvirusvektoren, verabreicht werden oder darauf abzielen.
Als Alternative läßt sich eine endogene Delta3-Genexpression reduzieren, indem man auf zum regulatorischen Bereich des Delta3-Gens (d. h. dem Delta3-Promotor und/oder -Enhancern) komplementäre Desoxyribonukleotidsequenzen abzielt, so daß Dreifachhelixstrukturen gebildet werden, durch die die Transkription des Delta3-Gens in Zielzellen im Körper verhindert wird. (Siehe allgemein Helene, C. 1991, Anticancer Drug Des., 6(6): 569–84; Helene, C., et al., 1992, Ann, N. Y. Acad. Sci., 660: 27–36; und Maher, L. J., 1992, Bioassays 14(12): 807–15).
Bei den Nukleinsäuremolekülen, die bei der Dreifachhelixbildung zur Hemmung der Transkription verwendet werden, handelt es sich vorzugsweise um Einzelstrangmoleküle, die aus Desoxyribonukleotiden bestehen. Die Hasenzusammensetzung dieser Oligonukleotide sollte nach den Basenpaarungsregeln von Hoogsteen, die im allgemeinen das Vorhandensein relativ großer Abschnitte aus entweder Purinen oder Pyrimidinen auf einem Strang eines Duplex erfordern, die Dreifachhelixbildung fördern. Die Nukleotidsequenzen können auf Pyrimidinen beruhen, was zu TAT- und CGC-Tripletts über die drei zusammengelagerten Stränge der erhaltenen Dreifachhelix führt. Die pyrimidinreichen Moleküle sorgen für die Basenkomplementarität mit einem purinreichen Bereich eines Einzelstrangs des Duplex in einer parallelen Orientierung zu diesem Strang. Daneben können Nukleinsäuremoleküle gewählt werden, die purinreich sind und beispielsweise einen Abschnitt aus G-Resten enthalten. Diese Moleküle formen eine Dreifachhelix mit einem DNA-Duplex, der reich an GC-Paaren ist, wobei die Mehrzahl der Purinreste auf einem Einzelstrang des Zielduplex lokalisiert ist, was zu CGC-Tripletts über die drei Stränge im Triplex führt.
Alternativ kann die Anzahl der potentiellen Sequenzen, die als Ziel für die Dreifachhelixbildung dienen können, durch Erzeugung eines sogenannten „Switchback”-Nukleinsäuremoleküls erhöht werden. Switchback-Moleküle werden abwechselnd 5'-3', 3'-5' synthetisiert, so daß sie eine Hasenpaarung mit zunächst einem Strang eines Duplex und dann dem anderen Strang eingehen, wodurch die Notwendigkeit für das Vorhandensein eines relativ großen Abschnitts aus entweder Purinen oder Pyrimidinen auf einem Strang eines Duplexes entfällt.
Antisense-RNA und -DNA-, Ribozym- und Dreifachhelixmoleküle können mit einem beliebigen im Fachgebiet zur Synthese von DNA- und RNA-Molekülen bekannten Verfahren hergestellt werden. Dazu gehören Techniken zur chemischen Synthese von Oligodesoxyribonukleotiden und Oligoribonukleotiden, die im Fachgebiet allgemein bekannt sind, wie beispielsweise die chemische Festphasen-Phosphoramiditsynthese. Alternativ können RNA-Moleküle durch In-vitro- und In-vivo-Transkription von für das Antisense-RNA-Molekül codierenden DNA-Sequenzen erzeugt werden. Derartige DNA-Sequenzen können in eine große Vielfalt von Vektoren, in denen geeignete RNA-Polymerase-Promotoren, wie beispielsweise die T7- oder SP6-Polymerase-Promotoren enthalten sind, eingebaut werden. Alternativ können Antisense-cDNA-Konstrukte, mit denen je nach dem verwendeten Promotor Antisense-RNA konstitutiv oder induzierbar synthetisiert wird, stabil in Zellinien eingeführt werden.
Zudem können verschiedene allgemein bekannte Modifikationen an Nukleinsäuremolekülen als Mittel zur Erhöhung der intrazellulären Stabilität und Halbwertszeit eingeführt werden. Zu möglichen Modifikationen gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, die Addition flankierender Sequenzen aus Ribonukleotiden oder Desoxyribonukleotiden an die 5'- und/oder 3'-Enden des Moleküls oder die Verwendung von Phosphorothioat- oder 2'-O-Methyl- statt Phosphodiesterase-Verknüpfungen im Oligodesoxyribonukleotidrückgrat.
4.4 Polypeptide der vorliegenden Erfindung
Durch die vorliegende Erfindung werden auch Delta3-Polypeptide zur Verfügung gestellt, die von anderen zellulären Proteinen, vor allem anderen Signaltransduktionsfaktoren und/oder Transkriptionsfaktoren, die normalerweise mit dem Delta3-Polypeptid assoziiert sein können, isoliert werden oder ansonsten weitgehend frei davon sind. Der Begriff „weitgehend frei von anderen zellulären Proteinen” (hier auch als „verunreinigende Proteine” bezeichnet) bzw. „weitgehend reine oder gereinigte Präparationen” ist so definiert, daß er Präparationen von Delta3-Polypeptiden mit weniger als etwa 20% (an Trockengewicht) verunreinigendem Protein und vorzugsweise mit weniger als etwa 5% verunreinigendem Protein umfaßt. Funktionelle Formen der betreffenden Polypeptide lassen sich zum ersten Mal als gereinigte Präparationen unter Verwendung eines wie hier beschriebenen klonierten Gens präparieren. Unter „gereinigt” versteht man in bezug auf ein Peptid oder eine DNA- oder RNA-Sequenz, daß das angegebene Molekül bei weitgehender Abwesenheit anderer biologischer Makromoleküle, wie z. B. anderer Proteine, vorliegt. Dabei versteht man unter dem Begriff „gereinigt”, wie er hier verwendet wird, daß vorzugsweise wenigstens 80% Trockengewicht, stärker bevorzugt im Bereich von 95–99 Gew.-% und am meisten bevorzugt wenigstens 99,8 Gew.-% biologische Makromoleküle des gleichen Typs vorliegen (wobei jedoch Wasser, Puffer und andere kleine Moleküle, vor allem Moleküle mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 5000 vorhanden sein können). Der Begriff „rein”, wie er hier verwendet wird, weist vorzugsweise die gleichen numerischen Beschränkungen auf wie „gereinigt” unmittelbar oberhalb. „Isoliert” und „gereinigt” umfassen weder natürliche Materialien in ihrem nativen Zustand noch natürliche Materialien, die in Bestandteile getrennt wurden (z. B. in einem Acrylamidgel), die jedoch weder als reine (z. B. ohne verunreinigende Proteine oder Chromatographiereagentien, wie z. B. Denaturierungsmitteln und Polymeren, z. B. Acrylamid oder Agarose) Substanzen oder Lösungen erhalten wurden. In bevorzugten Ausführungsformen fehlen gereinigten Delta3-Präparationen jegliche verunreinigende Proteine aus dem gleichen Tier, von dem Delta3 normalerweise produziert wird, wie sich beispielsweise durch rekombinante Expression eines menschlichen Delta3-Proteins in einer nichtmenschlichen Zelle bewerkstelligen läßt.
Beschrieben sind Vollängen-Proteine oder -Fragmente, die einem oder mehreren bestimmten Motiven und/oder einer oder mehreren Domänen oder willkürlichen Größen, beispielsweise wenigstens etwa 5, 10, 25, 50, 75, 100, 125, 150 Aminosäuren in der Länge entsprechen. Dabei umfaßt die Offenbarung alle Proteine, die von den im obigen, die erfindungsgemäßen Nukleinsäuren beschreibenden Abschnitt beschriebenen Nukleinsäuren codiert werden.
So können beispielsweise isolierte Delta3-Polypeptide die gesamte oder einen Anteil der Aminosäuresequenz, die einem in SEQ ID No: 2 dargestellten Delta3-Polypeptid entspricht, enthalten. Isolierte Peptidylanteile von Delta3-Proteinen lassen sich durch das Screening von Peptiden, die von dem entsprechenden Fragment der für derartige Peptide codierenden Nukleinsäure rekombinant hergestellt wurden, erhalten. Darüber hinaus können Fragmente mit im Fachgebiet bekannten Techniken, wie beispielsweise herkömmlicher f-Moc- oder t-Boc-Festphasenchemie nach Merrifield chemisch synthetisiert werden. So kann beispielsweise ein Delta3-Polypeptid der vorliegenden Erfindung willkürlich in Fragmente der gewünschten Länge ohne Überlappung der Fragmente oder vorzugsweise in überlappende Fragmente einer gewünschten Länge aufgeteilt werden. Die Fragmente lassen sich (rekombinant oder durch chemische Synthese) herstellen und testen, um diejenigen Peptidylfragmente zu identifizieren, die entweder als Agonisten oder Antagonisten eines Wildtyp-(z. B. „authentischen”)Delta3-Proteins fungieren können.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft rekombinante Formen der Delta3-Proteine. Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung weisen neben nativen Delta3-Proteinen eine Gesamtaminosäuresequenzidentität von wenigstens 95%, wenigstens etwa 98% oder wenigstens etwa 99% zur Aminosäuresequenz SEQ ID No. 2 auf. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weist ein Delta3-Protein die Aminosäuresequenz SEQ ID No: 2 auf. In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen weist das Delta3-Protein eine Delta3-Bioaktivität auf.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ferner rekombinante Formen eines der betreffenden Delta3-Polypeptide, die von aus einem Säugerorganismus stammenden Genen codiert werden und die Aminosäuresequenzen aufweisen, die evolutionsmäßig mit dem in SEQ ID No: 2 dargestellten Delta3-Protein verwandt sind. Solche rekombinanten Delta3-Polypeptide sind vorzugsweise dazu in der Lage, entweder in der Rolle eines Agonisten oder der eines Antagonisten mindestens einer biologischen Aktivität eines Wildtyp-(„authentischen”)Delta3-Proteins des beigefügten Sequenzprotokolls zu fungieren. Der Begriff „evolutionsmäßig verwandt mit” bezieht sich in bezug auf Aminosäuresequenzen des menschlichen Delta3-Proteins sowohl auf Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die natürlich entstanden sind, als auch auf Mutationsvarianten der Delta3-Polypeptide, die beispielsweise mittels kombinatorischer Mutagenese abgeleitet sind. Derartige evolutionsmäßig abgeleitete Delta3-Polypeptide können eine Delta3-Bioaktivität aufweisen und sind wenigstens 80% homolog und stärker bevorzugt 85% homolog und am meisten bevorzugt 90% homolog zur Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 2. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfaßt ein Delta3-Protein die codierende Aminosäuresequenz der SEQ ID No: 2.
Im allgemeinen sind Polypeptide, auf die hier so verwiesen wird, daß sie eine Aktivität (z. B. „Bioaktivität”) eines Delta3-Proteins aufweisen, als Polypeptide definiert, die eine allen oder einem Anteil der Aminosäuresequenzen eines in SEQ ID No: 2 gezeigten Delta3-Proteins entsprechende (z. B. identische oder weitgehend identische) Aminosäuresequenz beinhalten und die die gesamten oder einen Anteil der biologischen/biochemischen Aktivitäten eines natürlich vorkommenden Delta3-Proteins imitieren oder antagonisieren. In bevorzugten Ausführungsformen wechselwirkt ein Delta3-Protein der vorliegenden Erfindung spezifisch mit einem Notch-Polypeptid.
Gegenstand der Offenbarung sind verschiedene Formen von Delta3-Proteinen, die insbesondere alle im sich auf erfindungsgemäße Nukleinsäuren beziehenden Abschnitt „4.3” beschriebenen Delta3-Proteine umfassen.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ferner Verfahren zur Produktion der betreffenden Delta3-Polypeptide. So läßt sich beispielsweise eine mit einem die Expression einer die betreffenden Polypeptide codierenden Nukleotidsequenz steuernden Nukleinsäurevektor transfizierte Wirtszelle unter entsprechenden Bedingungen kultivieren, um die Expression des Peptids stattfinden zu lassen. Die Zellen können geerntet und lysiert werden, und das Protein kann isoliert werden. Eine Zellkultur beinhaltet Wirtszellen, Medien und weitere Nebenprodukte. Geeignete Medien zur Zellkultur sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Das rekombinante Delta3-Polypeptid läßt sich aus Zellkulturmedium und/oder aus Wirtszellen unter Verwendung von im Fachgebiet bekannten Techniken zur Reinigung von Proteinen, einschließlich Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltrationschromatographie, Ultrafiltration, Elektrophorese und Immunaffinitätsreinigung mit für ein solches Peptid spezifischen Antikörpern, isolieren. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem rekombinanten Delta3-Polypeptid um ein Fusionsprotein, das eine Domäne enthält, die seine Reinigung erleichtert, wie z. B. ein GST-Fusionsprotein oder ein Poly(His)-Fusionsprotein.
Zudem ist allgemein ersichtlich, daß es unter gewissen Umständen vorteilhaft sein kann, Varianten für eines der betreffenden Delta3-Polypeptide bereitzustellen, die mit beschränkter Kapazität entweder als ein Delta3-Agonist (imitierend) oder ein Delta3-Antagonist fungieren, um lediglich eine Teilmenge der biologischen Aktivitäten der natürlich vorkommenden Form des Proteins zu fördern bzw. zu hemmen. Somit lassen sich spezifische biologische Effekte durch Behandlung mit einer Variante mit beschränkter Funktion und mit weniger Nebenwirkungen im Vergleich zur Behandlung mit Agonisten oder Antagonisten, die auf alle biologischen Aktivitäten von natürlich vorkommenden Formen von Delta3-Proteinen gerichtet sind, hervorrufen.
Varianten und/oder Mutanten lassen sich für jedes der betreffenden Delta3-Proteine durch Mutagenese, wie beispielsweise durch diskrete Punktmutation(en) oder durch Verkürzung erzeugen. So kann beispielsweise eine Mutation Homologe ergeben, die weitgehend die gleiche oder lediglich eine Teilmenge der biologischen Aktivität des Delta3-Polypeptids, von dem es abgeleitet wurde, behalten. Alternativ lassen sich antagonistische Formen des Proteins erzeugen, die zur Hemmung der Funktion der natürlich vorkommenden Form des Proteins fähig sind, indem sie beispielsweise kompetitiv an ein nachgeschaltetes oder vorgeschaltetes Mitglied der Delta3-Kaskade, die das Delta3-Protein umfaßt, binden. Darüber hinaus können agonistische Formen des Proteins erzeugt werden, die konstitutiv aktiv sind.
Die rekombinanten Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung umfassen auch Homologe der authentischen Delta3-Proteine, wie beispielsweise Versionen jenes Proteins, die gegenüber proteolytischer Spaltung resistent sind, wie beispielsweise aufgrund von Mutationen, die die Ubiquitinierung oder andere mit dem Protein assoziierte enzymatische Zielmechanismen verändern.
Delta3-Polypeptide können auch chemisch modifiziert werden, um Delta3-Derivate durch Ausbildung kovalenter oder zusammengelagerter Konjugate mit anderen chemischen Gruppierungen, wie z. B. Glycosylgruppen, Lipiden, Phosphat-, Acetylgruppen und dergleichen, zu erzeugen. Kovalente Derivate von Delta3-Proteinen lassen sich auch herstellen, indem man die chemischen Gruppierungen mit funktionellen Gruppen auf Aminosäureseitenketten des Proteins oder am N-Terminus oder am C-Terminus des Polypeptids verknüpft.
Die Modifikation der Struktur der betreffenden Delta3-Polypeptide kann solchen Zwecken wie der Verbesserung der therapeutischen oder prophylaktischen Wirksamkeit, der Stabilität (z. B. Ex-vivo-Haltbarkeit und Resistenz gegenüber proteolytischem Abbau in vivo) oder posttranslationalen Modifikationen (z. B. zur Veränderung des Phosphorylierungsmusters des Proteins) dienen. Derartige modifizierte Peptide werden, wenn sie zur Beibehaltung mindestens einer Aktivität der natürlich vorkommenden Form des Proteins oder zur Produktion spezifischer Antagonisten davon vorgesehen sind, als funktionelle Äquivalente der hier ausführlicher beschriebenen Delta3-Polypeptide betrachtet. Solche modifizierten Polypeptide können beispielsweise durch Aminosäuresubstitution, -deletion oder -addition hergestellt werden.
Beispielsweise kann man vernünftigerweise erwarten, daß ein isolierter Austausch eines Leucins gegen ein Isoleucin oder Valin, eines Aspartats gegen ein Glutamat, eines Threonins gegen ein Serin oder ein ähnlicher Austausch einer Aminosäure gegen eine strukturverwandte Aminosäure (d. h. isosterische und/oder isoelektrische Mutationen) keinen größeren Effekt auf die biologische Aktivität des entstandenen Moleküls aufweist. Bei konservativen Austauschen handelt es sich um Austausche, die innerhalb einer Familie von Aminosäuren, die in ihren Seitenketten miteinander verwandt sind, stattfinden. Genetisch codierte Aminosäuren lassen sich in vier Familien aufteilen: (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch Lysin, Arginin, Histidin; (3) unpolar = Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Prolin, Phenylalanin, Methionin, Tryptophan; und (4) ungeladen polar = Glycin, Asparagin, Glutamin, Cystein, Serin, Threonin, Tyrosin. In ähnlicher Weise kann das Aminosäurenrepertoir in (1) sauer = Aspartat, Glutamat; (2) basisch = Lysin, Arginin, Histidin, (3) aliphatisch = Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Serin, Threonin, wobei Serin und Threonin gegebenenfalls getrennt als aliphatischhydroxyl gruppiert werden können; (4) aromatisch = Phenylalanin, Tyrosin, Tryptophan; (5) Amid = Asparagin, Glutamin; und (6) schwefelhaltig = Cystein und Methionin, gruppiert werden (siehe beispielsweise Biochemistry, 2. Aufl., hrsg. von L. Stryer, WH Freeman and Co.: 1981). Ob eine Änderung der Aminosäuresequenz eines Peptids zu einem funktionellen Delta3-Homolog führt (z. B. funktionell im Sinne, daß das entstandene Polypeptid die Wildtypform imitiert oder antagonisiert), läßt sich leicht bestimmen, indem man die Fähigkeit der Peptidvariante, in Zellen eine Antwort in ähnlicher Weise wie das Wildtypprotein zu produzieren oder eine solche Antwort kompetitiv zu hemmen, beurteilt. Polypeptide, in denen mehr als ein Austausch stattgefunden hat, können leicht auf die gleiche Weise getestet werden.
Die vorliegende Offenbarung sieht ferner ein Verfahren zur Erzeugung von Sätzen von kombinatorischen Mutanten der betreffenden Delta3-Proteine ebenso wie von Verkürzungsmutanten vor und eignet sich vor allem zur Identifizierung potentieller funktioneller Sequenzvarianten (z. B. Homologe). Der Zweck des Screening solcher kombinatorischer Bibliotheken besteht beispielsweise in der Erzeugung neuer Delta3-Homologe, die entweder als Agonisten oder Antagonisten wirken können oder alternativ vollkommen neuartige Aktivitäten besitzen.
In einer Ausführungsform wird die variegierte Bibliothek von Delta3-Varianten durch kombinatorische Mutagenese auf dem Nukleinsäureniveau erzeugt und durch eine variegierte Genbank codiert. Beispielsweise läßt sich ein Gemisch aus synthetischen Oligonukleotiden enzymatisch in Gensequenzen ligieren, so daß der degenerierte Satz potentieller Delta3-Sequenzen in Form individueller Polypeptide oder alternativ als Satz größerer Fusionsproteine (z. B. für Phagen-Display), die den Satz der Delta3-Sequenzen darin enthalten, exprimierbar ist.
Es gibt viele Wege, mit denen solche Bibliotheken potentieller Delta3-Homologe oder -Varianten von einer degenerierten Oligonukleotidsequenz erzeugt werden können. Die chemische Synthese einer degenerierten Gensequenz läßt sich in einem DNA-Syntheseautomaten durchführen, wonach die synthetisierten Gene in einen entsprechenden Expressionsvektor ligiert werden. Der Zweck eines degenerierten Satzes von Genen besteht darin, in einem einzigen Gemisch alle für den gewünschten Satz potentieller Delta3-Sequenzen codierende Sequenzen bereitzustellen. Die Synthese degenerierter Oligonukleotide ist im Fachgebiet allgemein bekannt (siehe beispielsweise Narang, SA (1983) Tetrahedron 39:3; Itakura et al. (1981) Recombinant DNA, Proc 3rd Cleveland Sympos. Macromolecules, Hrsg. AG Walton, Amsterdam: Elsevier S. 273–289; Itakura et al. (1984) Annu. Rev. Biochem. 53: 323; Itakura et al. (1984) Science 198: 1056; Ike et al. (1983) Nucleic Acid Res. 11: 477. Solche Techniken wurden bei der direkten Evolution anderer Proteine eingesetzt (siehe beispielsweise Scott et al. (1990) Science 249: 386–390; Roberts et al. (1992) PNAS 89: 2429–2433; Devlin et al. (1990) Science 249: 404–406; Cwirla et al. (1990) PNAS 87: 6378–6382; ebenso wie US-Patente Nr. 5,223,409 , 5,198,346 und 5,096,815 ).
Gleichfalls kann eine Bibliothek aus codierenden Sequenzfragmenten für einen Delta3-Klon bereitgestellt werden, um eine variegierte Population von Delta3-Fragmenten zum Screening und zur nachfolgenden Selektion bioaktiver Fragmente zu erzeugen. Zur Erzeugung solcher Bibliotheken sind verschiedenartige Techniken im Fachgebiet bekannt, einschließlich chemischer Synthese. In einer Ausführungsform lassen sich codierende Sequenzfragmente erzeugen, indem man (i) ein doppelsträngiges PCR-Fragment einer codierenden Delta3-Sequenz mit einer Nuklease unter Bedingungen, bei denen ein Stammbruch nur etwa einmal pro Molekül stattfindet, behandelt; (ii) die doppelsträngige DNA denaturiert; (iii) die DNA unter Bildung doppelsträngiger DNA renaturiert, die Sense/Antisense-Paare aus unterschiedlichen Produkten mit Stammbruch enthalten kann; (iv) einzelsträngige Anteile aus wieder gebildeten Duplexen durch Behandlung mit S1-Nuklease entfernt und (v) die erhaltene Fragmentbibliothek in einen Expressionsvektor ligiert. Mit diesem beispielhaften Verfahren läßt sich eine Expressionsbibliothek ableiten, die für N-terminale, C-terminale und interne Fragmente verschiedener Größe codiert.
Im Fachgebiet ist eine große Bandbreite an Techniken zum Screening von Genprodukten aus durch Punktmutationen oder Verkürzung hergestellten kombinatorischen Bibliotheken sowie zum Screening von cDNA-Banken auf Genprodukte mit einer bestimmten Eigenschaft bekannt. Derartige Techniken lassen sich im allgemeinen an das schnelle Screening der durch die kombinatorische Mutagenese von Delta3-Homologen erzeugten Genbanken anpassen. Die am häufigsten verwendeten Techniken zum Screening großer Genbanken umfassen typischerweise die Klonierung der Genbank in replizierbare Expressionsvektoren, die Transformation entsprechender Zellen mit der erhaltenen Vektorbank und die Expression der kombinatorischen Gene unter Bedingungen, bei denen der Nachweis einer gewünschten Aktivität die relativ einfache Isolierung des für das Gen, dessen Produkt nachgewiesen wurde, codierenden Vektors erleichtert. Alle der zur Veranschaulichung unten beschriebenen Tests sind einer Analyse mit hohem Durchsatz zugänglich, wie sie zum Screening einer großen Anzahl von degenerierten Delta3-Sequenzen, die durch kombinatorische Mutagenesetechniken erzeugt wurden, benötigt wird. Mit der kombinatorischen Mutagenese können sehr große Bibliotheken von mutanten Proteinen, beispielsweise in der Größenordnung von 10²⁶ Molekülen, erzeugt werden. Das Screening von kombinatorischen Bibliotheken dieser Größe kann selbst mit Screening-Tests mit hohem Durchsatz eine technische Herausforderung darstellen. Zur Überwindung dieses Problems wurde kürzlich eine neue Technik unter dem Namen REM (recrusive ensemble mutagenesis) entwickelt, die es gestattet, den sehr hohen Anteil an nichtfunktionellen Proteinen in einer Zufallsbibliothek zu vermeiden, und mit der einfach die Häufigkeit funktioneller Proteine erhöht wird, womit die zur Erzielung eines geeigneten Querschnitts des Sequenzraums benötigte Komplexität verringert wird. Bei REM handelt es sich um einen Algorithmus, mit dem die Häufigkeit funktioneller Mutanten in einer Bibliothek bei Einsatz eines entsprechenden Selektions- oder Screening-Verfahrens erhöht wird (Arkin und Yourvan, 1992, PNAS USA 89: 7811–7815; Yourvan et al., 1992, Parallel Problem Solving from Nature, 2., In Maenner und Manderick, Hrsg., Elsevir Publishing Co., Amsterdam, S. 401–410; Delgrave et al., 1993, Protein Engineering 6(3): 327–331).
Ebenso sieht die Offenbarung die Reduktion der Delta3-Proteine vor, um Mimetika zu erzeugen, beispielsweise Peptid- oder Nichtpeptidagentien, die in der Lage sind, an ein Delta3-Protein zu binden und/oder die Bindung eines Delta3-Polypeptids der vorliegenden Erfindung mit entweder vorgeschalteten oder nachgeschalteten Komponenten einer Delta/Notch-Signalisierungskaskade, wie beispielsweise Bindungsproteinen oder Interaktoren, zu stören. Somit eignen sich derartige mutagene Techniken, wie sie oben beschrieben sind, auch zur Kartierung der Determinanten der Delta3-Proteine, die an Protein-Protein-Wechselwirkungen, beispielsweise im Zusammenhang mit der Bindung des betreffenden Delta3-Polypeptids an Proteine, die eine vorgeschaltete Funktion ausüben können (einschließlich sowohl Aktivatoren als auch Repressoren seiner Aktivität), oder an Proteine oder Nukleinsäuren, die eine dem Delta3-Polypeptid nachgeschaltete Funktion ausüben können, gleichgültig, ob sie von diesem positiv oder negativ reguliert werden, beispielsweise Notch, teilnehmen. Zur Veranschaulichung lassen sich die kritischen Reste eines betreffenden Delta3-Polypeptids, die an der molekularen Erkennung beispielsweise des Notch-Genprodukts oder einer anderen, einem Delta3-Gen vor- oder nachgeschalteten Komponente beteiligt sind, bestimmen und zur Erzeugung von von Delta abgeleiteten peptidomimetischen Verbindungen, die die Bindung des authentischen Delta3-Proteins mit jener Gruppierung kompetitiv hemmen, verwenden. Durch Einsatz beispielsweise von Rastermutagenese zur Kartierung der Aminosäurereste eines jeden der betreffenden Delta3-Proteine, die an der Bindung anderer extrazellulärer Proteine beteiligt sind, können peptidomimetische Verbindungen erzeugt werden, die diejenigen Reste des Delta3-Proteins, welche die Wechselwirkung erleichtern, imitieren. Solche Mimetika können dann zur Störung der normalen Funktion eines Delta3-Proteins eingesetzt werden. Beispielsweise lassen sich nichthydrolysierbare Peptidanaloge solcher Reste unter Verwendung von Benzodiazepin (siehe z. B. Freidinger et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden, Niederlande, 1988), Azepin (siehe z. B. Huffman et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden, Niederlande, 1988), substituierten gamma-Lactam-Ringen (Garvey et al. in Peptides: Chemistry and Biology, G. R. Marshall Hrsg., ESCOM Publischer: Leiden, Niederlande, 1988), Ketomethylen-Pseudopeptiden (Ewenson et al. (1986) J Med Chem 29: 295; und Ewenson et al. in Peptides: Structure and Function (Proceedings of the 9th American Peptide Symposium) Pierce Chemical Co. Rockland, IL, USA, 1985), b-Turn-Dipeptidkernen (Nagai et al. (1985) Tetrahedron Lett 26: 647; und Sato et al. (1986) J Chem Soc Perkin Trans 1: 1231) sowie b-Aminoalkoholen (Gordon et al. (1985) Biochem Biophys Res Commun 126: 419; und Dann et al. (1986) Biochem Biophys Res Commun 134: 71) erzeugen.
4.4.1 Zellen, die rekombinante Delta3-Polypeptide exprimieren
Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso eine zur Expression einer rekombinanten Form der betreffenden Delta3-Polypeptide transfizierte Wirtszelle. Bei der Wirtszelle kann es sich um eine beliebige prokaryontische oder eukaryontische Zelle handeln. Somit läßt sich eine aus der Klonierung von Delta3-Proteinen stammende Nukleotidsequenz, die für das gesamte Vollängenprotein oder einen ausgewählten Anteil davon codiert, zur Produktion einer rekombinanten Form eines Delta3-Polypeptids über mikrobielle oder eukaryontische zelluläre Prozesse verwenden. Bei dem Ligieren der Polynukleotidsequenz in ein Genkonstrukt, wie beispielsweise einen Expressionsvektor, sowie dem Transformieren oder Transfizieren in Wirte, und zwar eukaryontische (Hefe-, Vogel-, Insekten- oder Säuger-) oder prokaryontische (Bakterien-)Zellen, handelt es sich um Standardverfahren, die bei der Produktion anderer allgemein bekannter Proteine, z. B. MAP-Kinase, S. 53, WTI, PTP-Phosphotasen, SRC und dergleichen, verwendet werden. Ähnliche Verfahren oder Modifikationen davon lassen sich zur Herstellung rekombinanter Delta3-Polypeptide mit mikrobiellen Mitteln oder Gewebekulturtechnologie gemäß der vorliegenden Erfindung einsetzen.
Die rekombinanten Delta3-Gene lassen sich durch Ligieren einer für ein Delta3-Protein oder einen Anteil davon codierenden Nukleinsäure in einen zur Expression in prokaryontischen Zellen oder/und eukaryontischen Zellen geeigneten Vektor herstellen. Expressionsvektoren zur Produktion rekombinanter Formen der betreffenden Delta3-Polypeptide umfassen Plasmide und andere Vektoren. So gehören beispielsweise zu den für die Expression eines Delta3-Polypeptids geeigneten Vektoren Plasmide der folgenden Arten: von pBR322 abgeleitete Plasmide, von pEMBL abgeleitete Plasmide, von pEX abgeleitete Plasmide, von PBTac abgeleitete Plasmide sowie von pUC abgeleitete Plasmide zur Expression in prokaryontischen Zellen, wie z. B. E. coli.
Für die Expression rekombinanter Proteine in Hefe gibt es eine Reihe von Vektoren. So sind beispielsweise YEP24, YIP5, YEP51, YEP52, pYES2 und YRP17 Klonierungs- und Expressionsvehikel, die sich bei der Einführung genetischer Konstrukte in S. cerevisiae eignen (siehe z. B. Broach et al. (1983) in Experimental Manipulation of Gene Expression, Hrsg. M. Inouye Academic Press, S. 83, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Diese Vektoren können in E. coli aufgrund des Vorhandenseins des pBR322 ori und in S. cerevisiae aufgrund der Replikationsdeterminante des 2-Mikron-Plasmids der Hefe replizieren. Darüber hinaus können Arzneistoffresistenzmarker wie beispielsweise Ampicillin verwendet werden. In einer der Veranschaulichung dienenden Ausführungsform wird ein Delta3-Polypeptid unter rekombinanter Verwendung eines durch Subklonieren des in SEQ ID No: 1 dargestellten Delta3-Gens erzeugten Expressionsvektors hergestellt.
Die bevorzugten Säugerexpressionsvektoren enthalten sowohl prokaryontische Sequenzen, um die Vermehrung des Vektors in Bakterien zu erleichtern, sowie eine oder mehrere eukaryontische Transkriptionseinheiten, die in eukaryontischen Zellen exprimiert werden. Beispiele für zur Transfektion eukaryontischer Zellen geeignete Säugerexpressionsvektoren sind die von pcDNAI/amp, pcDNAI/neo, pRc/CMV, pSV2gpt, pSV2neo, pSV2-dhfr, pTk2, pRSVneo, pMSG, pSVT7, pko-neo und pHyg abgleiteten Vektoren. Einige dieser Vektoren sind mit Sequenzen von Bakterienplasmiden, wie z. B. pBR322 modifiziert, um die Replikation und Arzneistoffresistenzselektion sowohl in prokaryontischen als auch eukaryontischen Zellen zu erleichtern. Als Alternative lassen sich Derivate von Viren, wie beispielsweise dem Rinderpapillomavirus (BPV-1) oder dem Epstein-Barr-Virus (pHEBo, von pREP abgeleitet und p205) zur transienten Expression von Proteinen in eukaryontischen Zellen verwenden. Die verschiedenen bei der Herstellung der Plasmide und der Transformation der Wirtsorganismen eingesetzten Verfahren sind im Fachgebiet allgemein bekannt. Hinsichtlich weiterer geeigneter Expressionssysteme sowohl für prokaryontische als auch eukaryontische Zellen ebenso wie allgemeiner rekombinanter Vorgehensweisen, siehe Molecular Cloning A Laboratory Manual, 2. Auflage, hrsg. von Sambrook, Fritsch und Maniatis (Cold Spring Harbor Laboratory Press: 1989) Kapitel 16 und 17.
In einigen Fällen kann es wünschenswert sein, das rekombinante Delta3-Polypeptid unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystems zu exprimieren. Zu derartigen Baculovirus-Expressionssystemen gehören beispielsweise von pVL abgeleitete Vektoren (wie z. B. pVL1392, pVL1393 und pVL941, von pAcUW abgeleitete Vektoren (wie z. B. pAcUW1) sowie von pBlueBac abgeleitete Vektoren (wie z. B. das β-gal enthaltende pBlueBac III).
Ist die Expression nur eines Anteils eines Delta3-Proteins wünschenswert, wie beispielsweise einer Form, der ein Teil des N-Terminus fehlt, d. h. einer Verkürzungsmutante, der das Signalpeptid fehlt, so kann es notwendig sein, das die gewünschte zu exprimierende Sequenz enthaltende Oligonukleotidfragment mit einem Startcodon (ATG) zu versehen. Es ist im Fachgebiet allgemein bekannt, daß sich ein Methionin in der N-terminalen Stellung durch die Verwendung des Enzyms Methionin-Aminopeptidase (MAP) enzymatisch abspalten läßt. MAP wurde aus E. coli (Ben-Bassat et al. (1987) J. Bacteriol. 169: 751–757) und Salmonella typhimurium kloniert und seine In-vitro-Aktivität anhand rekombinanter Proteine demonstriert (Miller et al. (1987) PNAS 84: 2718–2722). Daher kann, falls gewünscht, die Entfernung eines N-terminalen Methionins entweder in vivo durch Expression von Delta abgeleiteter Polypeptide in einem MAP produzierenden Wirt (z. B. E. coli oder CM89 oder S. cerevisiae) oder in vitro durch Verwendung von gereinigtem MAP (z. B. Verfahren nach Miller et al., supra) erreicht werden.
In weiteren Ausführungsformen könnten zur Produktion rekombinanter Proteine transgene Tiere, die ausführlicher unten beschrieben sind, verwendet werden.
4.4.2 Fusionsproteine und Immunogene
In einem weiteren Teil der Offenbarung können die für das Polypeptid codierenden Sequenzen als Teil eines Fusionsgens, das eine ein anderes Polypeptid codierende Nukleotidsequenz enthält, eingebaut werden.
Ein Delta3-Ig-Polypeptid ist beschrieben. Dabei kann das Delta3-Ig-Polypeptid die gesamte extrazelluläre Domäne von Delta3, z. B. menschliches Delta3, oder eine Variante davon umfassen. So kann beispielsweise ein Delta3-Ig-Polypeptid eine Aminosäuresequenz von etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 umfassen. Andere Delta3-Ig-Proteine umfassen kein Signalpeptid und somit vorzugsweise nicht etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 17 der SEQ ID No. 2. Alternativ kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein einen Teil der extrazellulären Domäne eines Delta3-Proteins oder eine Variante eines Teils der extrazellulären Domäne eines Delta3-Proteins umfassen. Zu den bevorzugten Teilen der extrazellulären Domäne gehören Anteile mit wenigstens einem in 2 gezeigten Motiv. So kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein beispielsweise wenigstens eine EGF-ähnliche Wiederholung umfassen. Ein Delta3-Ig-Fusionsprotein kann ferner eine DSL-Domäne umfassen. Ferner kann ein Delta3-Ig-Fusionsprotein auch ein Signalpeptid umfassen. Delta3-Ig-Fusionsproteine lassen sich wie beispielsweise im US-Patent Nr. 5,434,131 beschrieben herstellen.
Diese Art von Expressionssystem kann unter Bedingungen, bei denen es wünschenswert ist, ein immunogenes Fragment eines Delta3-Proteins zu produzieren, geeignet sein. So läßt sich beispielsweise das VP6-Capsidprotein aus Rotavirus als immunologisches Trägerprotein für Anteile des Delta3-Polypeptids entweder in der monomeren Form oder in Form eines Viruspartikels verwenden. Die dem Anteil eines betreffenden Delta3-Proteins, gegen den Antikörper produziert werden sollen, entsprechenden Nukleinsäuresequenzen können in ein Fusionsgenkonstrukt, das codierende Sequenzen für ein spätes Vacciniavirus-Strukturprotein enthält, eingebaut werden, so daß ein Satz rekombinanter Viren, die Delta3-Epitope als Teil des Virions umfassende Fusionsproteine exprimieren, produziert wird. Unter Verwendung immunogener Fusionsproteine, bei denen die Fusionsproteine mit dem Hepatitis-B-Oberflächenantigen genutzt werden, konnte demonstriert werden, daß sich rekombinante Hepatitis-B-Virionen ebenso in dieser Rolle einsetzen lassen. In ähnlicher Weise können für Fusionsproteine, die einen Anteil eines Delta3-Proteins sowie das Poliovirus-Capsidprotein enthalten, codierende chimärische Konstrukte erzeugt werden, um die Immunogenität des Satzes von Polypeptidantigenen zu verbessern (siehe beispielsweise EP-Veröffentlichung Nr.: 0259149; und Evans et al. (1989) Nature 339: 385; Huang et al. (1988) J. Virol. 62: 3855; und Schlienger et al. (1992) J. Virol. 66: 2).
Das Multiple Antigen Peptide-System für die Immunisierung auf Peptidbasis kann ebenso zur Erzeugung eines Immunogens genutzt werden, wobei ein gewünschter Anteil eines Delta3-Polypeptids direkt aus der organochemischen Synthese des Peptids an einen oligomeren Verzweigungslysinkern erhalten wird (siehe z. B. Posnett et al. (1988) JBC 263: 1719 und Nardelli et al. (1992) J. Immunol. 148: 914). Ebenso können antigene Determinanten von Delta3-Proteinen von Bakterienzellen exprimiert und präsentiert werden.
Zusätzlich zur Nutzung von Fusionsproteinen zur Verbesserung der Immunogenität ist es weithin ersichtlich, daß Fusionsproteine auch die Expression von Proteinen erleichtern können und sich dementsprechend bei der Expression der Delta3-Polypeptide der vorliegenden Erfindung verwenden lassen. So können Delta3-Polypeptide beispielsweise als Glutathion-S-Transferase(GST)-Fusionsproteine erzeugt werden. Solche GST-Fusionsproteine können die leichte Reinigung des Delta3-Polypeptids, wie beispielsweise unter Verwendung von mit Glutathion derivatisierten Matrices, ermöglichen (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. (N. Y.: John Wiley & Sons, 1991)).
In einer weiteren Ausführungsform kann ein für eine Reinigungsleitsequenz, wie beispielsweise eine Poly-(His)/Enterokinase-Spaltstellensequenz am N-Terminus des gewünschten Anteils des rekombinanten Proteins, codierendes Fusionsgen die Reinigung des exprimierten Fusionsproteins mittels Affinitätschromatographie unter Verwendung eines Ni2+-Metall-Harzes gestatten. Die Reinigungsleitsequenz kann anschließend dann durch Behandlung mit Enterokinase abgetrennt werden, so daß das gereinigte Protein erhalten wird (siehe z. B. Hochuli et al. (1987) J. Chromatography 411: 177; und Janknecht et al. PNAS 88: 8972).
Techniken zur Herstellung von Fusionsgenen sind dem Fachmann bekannt. Im wesentlichen wird dabei die Verbindung verschiedener DNA-Fragmente, die für unterschiedliche Polypeptidsequenzen codieren, gemäß herkömmlichen Techniken durchgeführt, wobei zur Ligation stumpfendige oder versetztendige Termini, gegebenenfalls das Auffüllen kohäsiver Enden, Behandlung mit alkalischer Phosphatase zur Vermeidung einer unerwünschten Zusammenfügung sowie enzymatische Ligation eingesetzt werden. In einer weiteren Ausführungsform läßt sich das Fusionsgen mittels herkömmlicher Techniken, einschließlich DNA-Syntheseautomaten, synthetisieren. Alternativ kann die PCR-Amplifikation von Genfragmenten unter Verwendung von Ankerprimern, durch die komplementäre Überhänge zwischen zwei aufeinanderfolgenden Genfragmenten entstehen, wobei die Fragmente anschließend einem Annealing unter Erzeugung einer chimärischen Gensequenz unterzogen werden, durchgeführt werden (siehe z. B. Current Protocols in Molecular Biology, Hrsg. Ausubel et al. John Wiley & Sons: 1992).
4.4.3 Antikörper
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft einen Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das spezifisch gegenüber einem isolierten Polypeptid, dessen Aminosäuresequenz zu wenigstens 95% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 identisch ist, reaktiv ist. Beispielsweise können unter Verwendung von von einem Delta3-Protein beispielsweise aufgrund der cDNA-Sequenzen abgeleiteten Immunogenen Anti-Protein/Anti-Peptid-Antiseren oder monoklonale Antikörper nach Standardvorschriften hergestellt werden (siehe z. B. Antibodies: A Laboratory Manual hrsg. von Harlow und Lane (Cold Spring Harbor Press: 1988)). Ein Säuger, wie beispielsweise eine Maus, ein Hamster oder ein Kaninchen, läßt sich mit einer immunogenen Form des Peptids (z. B. einem Delta3-Polypeptid oder einem antigenen Fragment, das eine Antikörperantwort hervorrufen kann, oder einem wie oben beschriebenen Fusionsprotein) immunisieren. Zu den Techniken zur Vermittlung von Immunogenität an einem Protein oder Peptid gehören die Konjugation an Träger bzw. weitere im Fachgebiet bekannte Techniken. Ein immunogener Anteil eines Delta3-Proteins läßt sich in Gegenwart eines Adjuvans verabreichen. Der Verlauf der Immunisierung läßt sich durch Nachweis von Antikörpertitern im Plasma oder Serum verfolgen. Zur Beurteilung der Antikörperspiegel können Standard-ELISA- oder andere Immunoassays mit dem Immunogen als Antigen verwendet werden. Die betreffenden Antikörper sind für antigene Determinanten eines durch SEQ ID No: 2 dargestellten Proteins oder nahe verwandter Homologe mit wenigstens 92% Identität immunspezifisch.
Nach Immunisierung eines Tiers mit einer antigenen Präparation eines Delta3-Polypeptids lassen sich Anti-Delta3-Antiseren erhalten und, falls gewünscht, polyklonale Anti-Delta3-Antikörper aus dem Serum isolieren. Zur Herstellung monoklonaler Antikörper können Antikörper produzierende Zellen (Lymphozyten) einem immunisierten Tier entnommen und nach Standardfusionsverfahren für somatische Zellen mit immortalisierten Zellen, wie beispielsweise Myelomzellen, unter Erhalt von Hybridomzellen fusioniert werden. Derartige Techniken sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen beispielsweise die Hybridomtechnik (ursprünglich von Kohler und Milstein (1975) Nature, 256: 495–497 entwickelt), die menschliche B-Zellen-Hybridomtechnik (Kozbar et al., (1983) Immunology Today, 4: 72) sowie die EBV-Hybridomtechnik zur Herstellung menschlicher monoklonaler Antikörper (Cole et al., (1985) Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, Inc., S. 77–96). Hybridomzellen lassen sich einem immunchemischen Screening auf die Produktion von gegenüber einem Delta3-Polypeptid der vorliegenden Erfindung spezifisch reaktiven Antikörpern unterziehen und monoklonale Antikörper aus einer solche Hybridomzellen enthaltenden Kultur isolieren. In einer Ausführungsform reagieren Anti-Mensch-Delta3-Antikörper spezifisch mit den von der DNA der ATCC Deposit Accession Number 98348 codierten Proteinen.
Der Begriff Antikörper, wie er hier verwendet wird, soll Fragmente davon umfassen, die auch spezifisch gegenüber einem der betreffenden Delta3-Polypeptide reaktiv sind. Antikörper können unter Verwendung herkömmlicher Techniken in Fragmente zerlegt und die Fragmente einem Screening auf Verwendbarkeit auf die gleiche Weise wie oben für ganze Antikörper beschrieben unterzogen werden. So lassen sich beispielsweise F(ab)₂-Fragmente durch Behandlung von Antikörper mit Pepsin erzeugen. Das erhaltene F(ab)₂-Fragment kann dann zur Reduktion der Disulfidbrücken behandelt werden, so daß Fab-Fragmente entstehen. Der Antikörper der vorliegenden Erfindung soll ferner wie bispezifische und chimärische Moleküle mit einer Affinität für ein Delta3-Protein, die von mindestens einem CDR-Bereich des Antikörpers verliehen wird, umfassen.
Antikörper, die spezifisch Delta3-Epitope binden, lassen sich auch bei der immunhistochemischen Anfärbung von Gewebsproben einsetzen, um jeweils die vorhandene Menge und das Muster der Expression eines jeden der betreffenden Delta3-Polypeptide zu beurteilen. Anti-Delta3-Antikörper lassen sich diagnostisch bei der Immunpräzipitation und dem Immunoblotting verwenden, um Delta3-Proteinniveaus in Gewebe als Teil eines klinischen Testverfahrens nachzuweisen und zu beurteilen. So können derartige Messungen beispielsweise bei prognostischen Schätzungen des Ausbruchs oder des Verlaufs neurodegenerativer, neoplastischer oder hyperplastischer Erkrankungen sinnvoll sein. Gleichfalls kann die Fähigkeit zur Überwachung von Delta3-Proteinspiegeln in einem Individuum die Bestimmung der Wirksamkeit eines gegebenen Behandlungsplans für ein an einer derartigen Erkrankung leidendes Individuum gestatten. Das Niveau der Delta3-Polypeptide kann von Zellen in einer Körperflüssigkeit, wie beispielsweise in Proben von Liquor oder Fruchtwasser, aus gemessen werden oder läßt sich in Gewebe, wie es beispielsweise durch eine Biopsie erhalten wird, messen. Diagnostische Tests unter Verwendung von Anti-Delta3-Antikörpern können beispielsweise Immunoassays, die zur Unterstützung bei der frühen Diagnose einer neurodegenerativen Störung, insbesondere solcher, die sich bei der Geburt manifestieren, vorgesehen sind, umfassen. Ebenso können diagnostische Tests unter Verwendung von Anti-Delta3-Polypeptid-Antikörpern Immunoassays umfassen, die zur Unterstützung bei der frühen Diagnose und Phänotypisierung neurodegenerativer, neoplastischer oder hyperplastischer Erkrankungen vorgesehen sind.
Eine weitere Anwendung von Anti-Delta3-Antikörpern der vorliegenden Erfindung besteht im immunologischen Screening von in Expressionsvektoren, wie z. B. λgt11, λgt18–23, λZAP und ORF8, konstruierten cDNA-Banken. Mit derartigen Messenger-Bibliotheken, die im korrekten Leseraster und in korrekter Orientierung inserierte codierende Sequenzen aufweisen, lassen sich Fusionsproteine herstellen. So produziert beispielsweise λgt11 Fusionsproteine, deren Aminotermini aus β-Galactosidase-Aminosäuresequenzen und deren Carboxy-Termini aus einem Fremdpolypeptid bestehen. Antigene Epitope eines Delta3-Proteins, beispielsweise andere Orthologe eines bestimmten Delta3-Proteins oder andere Paraloge aus der gleichen Spezies, können dann mit Antikörpern nachgewiesen werden, indem man beispielsweise von infizierten Platten abgehobene Nitrocellulosefilter mit Anti-Delta3-Antikörpern reagiert. Anschließend lassen sich mit diesen Tests nachgewiesene positive Phagen von der infizierten Platte isolieren. Somit läßt sich das Vorhandensein von Delta3-Homologen nachweisen und von anderen Tieren, ebenso wie alternative Isoformen (einschließlich Spleißvarianten) aus dem Menschen, klonieren.
4.5 Verfahren zur Krankheitsbehandlung
Wenigstens teilweise aufgrund der Tatsache, daß der Notch-Signalisierungsweg mit der Entwicklung des Nervensystems, insbesondere der Regulation neuronaler Differenzierung und Gefäßversorgung, z. B. ZNS-Gefäßversorgung, in Verbindung gebracht wurde, kann eine Behandlung mit Delta3-Therapeutika Vorteile für eine große Vielfalt pathologischer Krankheiten oder Leiden bringen. Der Notch-Signalisierungsweg spielt eine Rolle bei der Entwicklung der Gefäßversorgung. So werden beispielsweise Mutanten mit dem Verlust der Dll1-Funktion nach Embryotag 10 stark hämorrhagisch. Weiterhin führen Mutationen in Notch3 zu CADASIL, einer durch Schlaganfall gekennzeichneten Erkrankung. Darüber hinaus zeigen Mäuse mit einem funktionell ablatierten PS1-Gen Blutungen im Gehirn und/oder dem Rückenmark nach Embryotag 11,5 (Wong et al., supra). Weiterhin ist es, da der Notch-Signalisierungsweg an der Bestimmung des Zellschicksals wenigstens im Nervensystem und Endothelsystem beteiligt ist, wahrscheinlich, daß der Notch-Signalisierungsweg und insbesondere Delta3 an der Bestimmung des Zellschicksals in weiteren biologischen Systemen beteiligt ist. Dementsprechend beschreibt die Offenbarung auch Verfahren zur Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die aus einer abnormalen Zellproliferation und/oder Differenzierung von anderen Zellen als den Zellen des Nervensystems und der Gefäßversorgung entstehen.
Zu den bevorzugten Störungen, die sich gemäß den beschriebenen Verfahren behandeln oder verhindern lassen, gehören pathologische neurogene, neoplastische oder hypoplastische Leiden.
Zu den Störungen des Gefäßversorgungssystems, die auch als „vaskuläre Störungen” bezeichnet werden und die sich gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren behandeln oder verhindern lassen, gehören neben CADASIL und Schlaganfall auch Atheroma, Tumorangiogenese, Wundheilung, diabetische Retinopathie, Hämangioma, Psoriasis und Restenose, beispielsweise durch Ballon-Angioplastie entstandene Restenose.
Krankheiten oder Störungen, die von einer anomalen Delta3-Aktivität, wie beispielsweise anomalen Delta3-Proteinspiegeln oder einer anomalen biologischen Aktivität, verursacht werden oder zu denen eine solche Aktivität beiträgt oder die mit einem oder mehreren spezifischen Delta3-Allelen, beispielsweise einem mutanten Delta3-Allel, assoziiert sind, lassen sich mit Delta3-Therapeutika behandeln. Anomale Proteinspiegel können beispielsweise durch anomale Genexpression verursacht werden. Eine solche anomale Aktivität kann beispielsweise zu einer anomalen Zellproliferation und/oder -differenzierung oder zum Zelltod führen. So kann beispielsweise eine anomale Delta3-Aktivität in einer Untersuchungsperson zu einer erhöhten Proliferation bestimmter Zellen in dieser Untersuchungsperson führen. Untersuchungspersonen mit einer durch abnormale Zellproliferation gekennzeichneten Störung können mittels Verabreichung eines eine derartige Proliferation hemmenden oder verringernden Delta3-Therapeutikums behandelt werden. Das spezifische verwendete Delta3-Therapeutikum kann je nach Art der anomal proliferierenden Zelle variieren. Das zur Verwendung geeignete Delta3-Therapeutikum läßt sich beispielsweise durch In-vitro-Kultur einer Probe solcher Zellen, die der Untersuchungsperson entnommen werden können, in Gegenwart und Abwesenheit von Delta3-Therapeutika bestimmen.
Zu den mit einer anomalen Zellproliferation assoziierten Krankheiten oder Leiden, die sich mit Delta3-Therapeutika behandeln oder verhindern lassen, gehören Krebserkrankungen, maligne Leiden, prämaligne Leiden und gutartige Leiden. Bei dem zu behandelnden oder zu verhindernden Leiden kann es sich um einen soliden Tumor, wie beispielsweise in einem Epithelgewebe entstehenden Tumor handeln. Bei der Krebserkrankung kann es sich beispielsweise um Dickdarm- oder Gebärmutterhalskrebs handeln. In der Tat konnte festgestellt werden, daß Dickdarm- und Gebärmutterhalskrebs jeweils erhöhte Notch-Expressionsniveaus im Vergleich mit normalem Gewebe aufweisen (PCT-Anmeldung WO/07474 ). Dementsprechend könnte die Behandlung einer solchen Krebserkrankung die Verabreichung eines die Wechselwirkung von Notch mit Delta3 verringernden Delta3-Therapeutikums an die Untersuchungsperson umfassen. Weitere Krebserkrankungen, die sich mit einem Delta3-Protein behandeln oder verhindern lassen, umfassen Sarkome und Karzinome, beispielsweise Lungenkrebs, Speiseröhrenkrebs, Melanom, Seminom und Schuppenzell-Adenokarzinom. Weitere solide Tumoren schließen jene ein, die sich in einem Lehrbuch der Medizin finden lassen. Bei dem zu behandelnden oder zu verhindernden Leiden kann es sich auch um einen löslichen Tumor handeln, wie beispielsweise Leukämie, entweder chronisch oder akut, einschließlich chronischer oder akuter myelogener Leukämie, chronischer oder akuter lymphozytärer Leukämie, promyelozytärer Leukämie, monozytärer Leukämie, myelomonozytärer Leukämie und Erythroleukämie. Zu den proliferativen Störungen, die sich mit einem erfindungsgemäßen Delta3-Therapeutikum behandeln lassen, gehören weiterhin auch die Schwerkettenkrankheit, multiples Myelom, Lymphom, beispielsweise Hodgkin-Lymphom und Nicht-Hodgkin-Lymphom, Morbus Waldenström sowie fibroproliferative Störungen, insbesondere des zerebrovaskulären Gewebes.
Durch einen soliden oder löslichen Tumor gekennzeichnete Krankheiten oder Leiden lassen sich behandeln, indem man ein Delta3-Therapeutikum entweder lokal oder systemisch verabreicht, so daß die Proliferation der eine anomale Proliferation aufweisenden Zellen gehemmt oder verringert wird. Verfahren zur Verabreichung der Verbindungen werden unten genauer beschrieben.
Gegenstand der Offenbarung sind ebenso Verfahren zur Verhinderung der Bildung und/oder Entwicklung von Tumoren. So kann der Entwicklung eines Tumors beispielsweise das Vorhandensein einer spezifischen Läsion, wie beispielsweise einer präneoplastischen Läsion, z. B. Hyperplasie, Metaplasie und Dysplasie, vorangehen. Solche Läsionen finden sich beispielsweise in Epithelgewebe. Somit ist ein Gegenstand der Offenbarung ein Verfahren zur Hemmung der Entwicklung einer solchen Läsion zu einer neoplastischen Läsion, wobei man der Untersuchungsperson mit einer präneoplastischen Läsion eine zur Hemmung der Entwicklung der präneoplastischen Läsion zu einer neoplastischen Läsion ausreichende Menge eines Delta3-Therapeutikums verabreicht.
Die Offenbarung beschreibt ein Verfahren zur Hemmung der Proliferation und/oder Differenzierung von Endothelzellen bereitgestellt, bei dem man ein Delta3-Therapeutikum mit einem Gewebe, in dem Endothelzellen proliferieren, wie beispielsweise ein sich entwickelnder Tumor oder eine hyperproliferative Erkrankung, d. h. einer mit einer abnormalen Zellproliferation assoziierten Krankheit, in Kontakt bringt. Die Blockierung der Proliferation von Endothelzellen führt zur Hemmung der Entwicklung von Endothel und Blutgefäßen, womit der Zugang von für die Tumorentwicklung notwendigen Verbindungen zu dem Tumor beschränkt wird.
Die Offenbarung beschreibt ebenso Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von mit unzureichender Zellproliferation assoziierten Krankheiten oder Leiden. So lassen sich beispielsweise Delta3-Therapeutika zur Stimulierung von Gewebereparatur, -regeneration und/oder Wundheilung, beispielsweise von Nervengewebe, wie etwa nach einer Operation oder zur Stimulierung der Heilung von Gewebe nach Verbrennungen, verwenden. Andere Krankheiten, bei denen die Proliferation von Zellen gewünscht ist, sind hypoproliferative Krankheiten, d. h. Krankheiten, die durch eine abnormal niedrige Proliferation bestimmter Zellen gekennzeichnet sind.
Die Offenbarung beschreibt ebenso ein Verfahren zur Behandlung oder Vorbeugung von Krankheiten oder Leiden, die durch anomale Zelldifferenzierung gekennzeichnet sind, bereitgestellt. Dementsprechend sind Verfahren zur Stimulierung der Zelldifferenzierung bei Leiden, die durch eine Hemmung der normalen Zelldifferenzierung, die gegebenenfalls von übermäßiger Proliferation begleitet sein kann, gekennzeichnet sind, Gegenstand der Offenbarung. Als Alternative können Delta3-Therapeutika zur Hemmung der Differenzierung spezifischer Zellen verwendet werden.
Bei einem bevorzugten Verfahren handelt es sich bei der anomal proliferierenden und/oder differenzierenden Zelle um eine im Nervensystem vorhandene Zelle. Entsprechenderweise werden durch die Offenbarung Verfahren zur von mit einem zentralen oder peripheren Nervensystem assoziierten Krankheiten oder Leiden bereitgestellt. So sind beispielsweise Verfahren zur Behandlung von Läsionen des Nervensystems, an denen eine anomale Delta3-Aktivität in Neuronen, in Schwann-Zellen, Gliazellen oder anderen Arten von Nervenzellen beteiligt ist, Gegenstand der Offenbarung. Erkrankungen des Nervensystems sind oben angegeben.
Die Offenbarung beschreibt ebenso ein Verfahren zur Verbesserung des Überlebens und/oder zur Stimulierung der Proliferation und/oder Differenzierung von Zellen und Geweben in vitro. So können beispielsweise einer Untersuchungsperson Gewebe entnommen und in vitro in Gegenwart eines Delta3-Therapeutikums angezogen werden, so daß die Gewebezellen zur Proliferation und/oder Differenzierung angeregt werden. Anschließend kann das Gewebe dann wieder der Untersuchungsperson verabreicht werden.
Da Gene in einigen Fällen bei einem Krankheitszustand heraufreguliert und in anderen Fällen herunterreguliert sein können, ist es wünschenswert, je nach dem zu behandelnden Leiden die Delta3-Bioaktivität unter Verwendung der hier beschriebenen Techniken, Verbindungen und Verfahren zu aktivieren und/oder zu potenzieren oder zu supprimieren und/oder herunterzumodulieren. Einige Gene können bei bestimmten Krankheitszuständen unterexprimiert sein. Die Aktivität von Delta3-Genprodukten kann in gewisser Weise beeinträchtigt sein, was zur Entwicklung neurodegenerativer Krankheitssymptome führt. Eine derartige Herunterregulierung der Delta3-Genexpression oder Abnahme der Aktivität eines Delta3-Proteins kann einen ursächlichen oder verstärkenden Effekt auf den Krankheitszustand haben.
Unter den Ansätzen, die zur Linderung von Krankheitssymptomen, an denen die Fehlexpression eines Delta3-Gens beteiligt ist, verwendet werden können, befinden sich beispielsweise die oben beschriebenen Antisense-, Ribozym- und Dreifachhelixmoleküle. Verbindungen, die mit einem Delta3-Protein um die Bindung an vorgeschaltete oder nachgeschaltete Elemente in einer Delta-Notch-Signalisierungskaskade konkurrieren, antagonisieren ein Delta3-Protein, wodurch ein therapeutischer Effekt induziert wird. Zu geeigneten Verbindungen gehören beispielsweise die oben ausführlich beschriebenen Antagonisten oder Homologen. In anderen Fällen kann die erhöhte Expression oder Bioaktivität eines Delta3-Proteins erwünscht sein und beispielsweise durch die Verwendung der Delta3-Agonisten oder -Mimetika oder durch Genaustauschtherapie bewerkstelligt werden, wie hier beschrieben.
Noch weitere Delta3-Therapeutika bestehen aus einem ersten Peptid, das ein zur Bindung an einen Rezeptor, z. B. einen Notch-Rezeptor, fähiges Delta3-Peptid umfaßt, und einem zweiten Peptid, das zytotoxisch ist. Solche Therapeutika lassen sich zum spezifischen Abzielen auf und zur spezifischen Lyse von einen Rezeptor für Delta3 exprimierenden oder überexprimierenden Zellen verwenden. Beispielsweise kann ein ein an ein zytotoxisches Peptid fusioniertes Delta3-Peptid enthaltendes Fusionsprotein zur Eliminierung oder Reduktion eines Notch überexprimierenden Tumors, beispielsweise von neoplastischen Dickdarm- und Gebärmutterhalstumoren, verwendet werden. Alternativ kann auf Delta3 exprimierende oder überexprimierende Zellen zu deren Lyse abgezielt werden, indem man beispielsweise einen spezifisch an ein mit einem zytotoxischen Peptid verknüpftes Delta3-Protein bindenden Antikörper auf die Zelle richtet.
Es ist zumindest teilweise aufgrund der Ähnlichkeit der Proteinstruktur wahrscheinlich, daß Delta3-Therapeutika auch zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die durch eine anomale Delta-Aktivität, beispielsweise eine anomale Delta1- oder Delta2-Aktivität, verursacht werden oder zu denen eine solche anomale Delta-Aktivität beiträgt, oder von Krankheiten oder Störungen, die mit einem oder mehreren spezifischen Delta-Allelen, beispielsweise Delta1- oder Delta2-Allelen, assoziiert sind, verwendet werden können. Solche Krankheiten oder Leiden könnten neurologische Krankheiten und Krebserkrankungen umfassen. In ähnlicher Weise könnten Delta-Therapeutika, beispielsweise Delta1- oder Delta2-Therapeutika, dazu verwendet werden, Krankheiten oder Störungen, die durch eine anomale Delta3-Aktivität verursacht werden oder zu denen eine anomale Delta3-Aktivität beiträgt, oder Krankheiten oder Störungen, die mit einem spezifischen Delta3-Allel assoziiert sind, vorzubeugen oder zu behandeln. Delta-Therapeutika lassen sich beispielsweise unter Verwendung der in der PCT-Patentanmeldung WO 97/01571 offenbarten Nukleotid- und Proteinsequenzangaben herstellen und unter Verwendung der hier beschriebenen Tests zum Testen von Delta3-Therapeutika testen.
Verbindungen, für die nachgewiesen wurde, daß sie die Delta3-Genexpression oder -Proteinaktivität erhöhen oder reduzieren, können einer Untersuchungsperson in einer therapeutisch wirksamen Dosis zur Behandlung oder Linderung einer kardiovaskulären Krankheit verabreicht werden. Eine therapeutisch wirksame Dosis bezieht sich auf diejenige Menge der Verbindung, die ausreicht, um eine Linderung von mit der jeweiligen Krankheit assoziierten Symptomen herbeizuführen.
4.5.1 Wirksame Dosis
Die Toxizität und therapeutische Wirksamkeit solcher Verbindungen läßt sich mit pharmazeutischen Standardverfahren in Zellkulturen oder Versuchstieren beispielsweise zur Bestimmung des LD₅₀-Werts (der für 50% der Population letalen Dosis) und des ED₅₀-Werts (der bei 50% der Population therapeutisch wirksamen Dosis), bestimmen. Das Dosisverhältnis zwischen toxischen und therapeutischen Effekten stellt den therapeutischen Index dar und läßt sich als LD₅₀/ED₅₀-Verhältnis ausdrücken. Verbindungen, die große therapeutische Indices zeigen, sind bevorzugt. Obschon Verbindungen, die toxische Nebenwirkungen zeigen, verwendet werden können, sollte dafür Sorge getragen werden, daß ein Zuführungssystem vorgesehen ist, mit dem solche Verbindungen zielgerichtet der Stelle des betroffenen Gewebes zugeführt werden, um eine mögliche Schädigung nicht infizierter Zellen zu minimieren und dadurch Nebenwirkungen zu reduzieren.
Die aus den Zellkulturtests und Tierstudien erhaltenen Daten lassen sich bei der Formulierung eines Dosierungsbereichs zur Verwendung beim Menschen verwenden. Die Dosierung solcher Verbindungen liegt vorzugsweise in einem Bereich zirkulierender Konzentrationen, die den ED₅₀-Wert einschließen, wobei nur eine geringe oder keine Toxizität vorhanden ist. Die Dosierung kann innerhalb dieses Bereichs je nach der eingesetzten Dosierungsform und dem benutzten Verabreichungsweg variieren. Für alle im erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Verbindungen läßt sich die therapeutisch wirksame Dosis zunächst aus Zellkulturtests abschätzen. Eine Dosis kann in Tiermodellen formuliert werden, um einen zirkulierenden Plasmakonzentrationsbereich zu erzielen, der den IC₅₀-Wert (d. h. die Konzentration der Testverbindung, mit der eine halbmaximale Hemmung der Symptome erzielt wird), wie er in der Zellkultur bestimmt wurde, einschließt. Solche Angaben können dazu verwendet werden, geeignete Dosen beim Menschen genauer zu bestimmen. Plasmaspiegel können beispielsweise mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.
5.2 Formulierung und Verwendung
Pharmazeutische Zusammensetzungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung können auf herkömmliche Weise unter Verwendung eines oder mehrerer physiologisch unbedenklicher Träger- oder Hilfsstoffe formuliert werden. Somit können die Verbindungen und ihre physiologisch unbedenklichen Salze und Solvate zur Verabreichung mittels beispielsweise Injektion, Inhalation oder Insufflation (entweder durch den Mund oder die Nase) oder zur oralen, bukkalen, parenteralen oder rektalen Verabreichung formuliert werden.
Für eine derartige Therapie lassen sich die erfindungsgemäßen Oligomere für viele verschiedene Verabreichungen, einschließlich systemischer und topischer oder örtlicher Verabreichung, formulieren. Techniken und Formulierungen finden sich allgemein bei Remmington's Pharmaceutical Sciences, Meade Publishing Co., Easton, PA. Zur systemischen Verabreichung wird die Injektion, einschließlich intramuskuläre, intravenöse, intraperitoneale und subkutane Injektion, bevorzugt. Zur Injektion können die erfindungsgemäßen Oligomere in flüssigen Lösungen, vorzugsweise in physiologisch kompatiblen Puffern, wie z. B. Hank's Lösung oder Ringer-Lösung, formuliert werden. Darüber hinaus können die Oligomere in fester Form formuliert und unmittelbar vor Gebrauch wieder aufgelöst oder suspendiert werden. Ebenso sind lyophilisierte Formen umfaßt.
Zur oralen Verabreichung können die pharmazeutischen Zusammensetzungen in Form von beispielsweise Tabletten oder Kapseln, die mit herkömmlichen Mitteln mit pharmazeutisch unbedenklichen Hilfsstoffen, wie z. B. Bindemitteln (z. B. vorgelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose), Füllstoffen (z. B. Lactose, mikrokristalline Cellulose oder Calciumhydrogenphosphat), Schmiermitteln (z. B. Magnesiumstearat, Talkum oder Kieselsäure), Sprengmitteln (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumstärkeglykolat) oder Benetzungsmitteln (z. B. Natriumlaurylsulfat), zubereitet werden. Die Tabletten können mit im Fachgebiet allgemein bekannten Verfahren beschichtet werden. Flüssigzubereitungen zur oralen Verabreichung können in Form von beispielsweise Lösungen, Sirupen oder Suspensionen vorliegen oder als Trockenprodukt zur Konstituierung mit Wasser oder einem anderen geeigneten Vehikel vor Gebrauch präsentiert werden. Solche Flüssigzubereitungen können mit herkömmlichen Mitteln zusammen mit pharmazeutisch unbedenklichen Additiven, wie z. B. Suspensionsmitteln (z. B. Sorbitsirup, Cellulosederivate oder hydrierte Speisefette), Emulgatoren (z. B. Lecithin oder Akaziengummi), nichtwäßrigen Vehikeln (z. B. Mandelöl, ölige Ester, Ethylalkohol oder fraktionierte Pflanzenöle) sowie Konservierungsstoffen (z. B. Methyl- oder Propyl-p-hydroxybenzoate oder Sorbinsäure), zubereitet werden. Die Zubereitungen können auch gegebenenfalls Puffersalze, Geschmacks-, Farb- und Süßstoffe enthalten.
Zubereitungen für die orale Verabreichung können zur kontrollierten Freisetzung des Wirkstoffs in geeigneter Weise formuliert werden.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen in Form von auf herkömmliche Weise formulierten Tabletten oder Lutschtabletten vorliegen.
Zur Verabreichung durch Inhalation werden die Verbindungen zur Verwendung gemäß der vorliegenden Offenbarung zweckmäßigerweise in Form einer Aerosolspray-Darstellung aus Druckpackungen oder einem Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibmittels, z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluormethan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder einem anderen geeigneten Gas, zugeführt. Im Fall eines Druckaerosols kann die Dosierungseinheit durch Bereitstellung eines Ventils zur Zuführung einer abgemessenen Menge bestimmt werden. Kapseln und Patronen aus z. B. Gelatine zur Verwendung in einem Inhalator oder Insufflator können mit einer Pulvermischung aus der Verbindung und einer geeigneten Pulvergrundlage, wie z. B. Lactose oder Stärke, formuliert werden.
Die Verbindungen können zur parenteralen Verabreichung mittels Injektion, beispielsweise mittels Bolusinjektion oder Dauerinfusion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Dosiseinheitsform, beispielsweise in Ampullen oder in Mehrfachdosisbehältern, zusammen mit einem beigefügten Konservierungsstoff präsentiert werden. Dabei können die Zusammensetzungen in Form von Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wäßrigen Vehikeln vorliegen und können Formulierungsmittel, wie z. B. Suspendierungs-, Stabilisierungs- und/oder Dispersionsmittel enthalten. Alternativ kann der wirksame Inhaltsstoff in Pulverform zur Konstituierung mit einem geeigneten Vehikel, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor Gebrauch vorliegen.
Die Verbindungen können auch zu Rektalzusammensetzungen, wie etwa Suppositorien oder Bleibeklistieren, die beispielsweise herkömmliche Suppositoriengrundlagen wie etwa Kakaobutter oder andere Glyceride enthalten, formuliert werden.
Neben den bereits beschriebenen Formulierungen können die Verbindungen auch in Form einer Depotzubereitung formuliert werden. Derartige Formulierungen mit Langzeitwirkung können mittels Implantation (beispielsweise subkutan oder intramuskulär) oder mittels intramuskulärer Injektion verabreicht werden. So kann man die Verbindungen beispielsweise mit geeigneten polymeren oder hydrophoben Stoffen (beispielsweise als Emulsion in einem unbedenklichen Öl) oder Ionenaustauschern oder als schwerlösliche Derivate, beispielsweise als schwerlösliches Salz, formulieren.
Die systemische Verabreichung kann auch mit transmukosalen oder transdermalen Mitteln erfolgen. Zur transmukosalen oder transdermalen Verabreichung werden für die zu überwindende Schranke geeignete Penetrationsmittel in der Formulierung verwendet. Derartige Penetrationsmittel sind im Fachgebiet allgemein bekannt und umfassen beispielsweise Gallensalze und Fusidinsäurederivate für die transmukosale Verabreichung. Um die Durchlässigkeit zu erleichtern, können darüber hinaus auch Detergentien verwendet werden. Die transmukosale Verabreichung kann über Nasensprays oder unter Verwendung von Suppositorien erfolgen. Für die topische Verabreichung werden die Oligomere zu Salben, Balsamen, Gelen oder Cremes formuliert, wie es im Fachgebiet allgemein bekannt ist.
Im klinischen Rahmen lassen sich die Genzuführungssysteme für das therapeutische Delta3-Gen mit einem aus einer Reihe von Verfahren, die jeweils im Fachgebiet geläufig sind, in einen Patienten einführen. So kann man beispielsweise eine pharmazeutische Zubereitung des Genzuführungssystems systemisch, z. B. durch intravenöse Injektion, einführen, wobei die spezifische Weiterleitung des Proteins in den Zielzellen vorwiegend aufgrund der vom Genzuführungsvehikel bereitgestellten Transfektionsspezifität, der zelltypischen oder gewebetypischen Expression aufgrund der die Expression des Rezeptorgens kontrollierenden Transkriptionsregulationssequenzen oder einer Kombination davon erfolgt. In weiteren Ausführungsformen ist die anfängliche Zuführung des rekombinanten Gens relativ begrenzt, wobei die Einführung in das Tier ziemlich lokalisiert erfolgt. So kann das Genzuführungsvehikel beispielsweise mit einem Katheter (siehe US-Patent 5,328,470 ) oder mittels stereotaktischer Injektion (z. B. Chef et al. (1994) PNAS 91: 3054–3057) eingeführt werden. Ein Delta3-Gen, wie beispielsweise eine der in der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1 oder 3 dargestellten Sequenzen oder eine dazu homologe Sequenz, kann mittels Elektroporation unter Verwendung von beispielsweise von Dev et al. ((1994) Cancer Treat Rev 20: 105–115) beschriebenen Techniken in einem Gentherapiekonstrukt zugeführt werden.
Die pharmazeutische Zubereitung des Gentherapiekonstrukts kann im wesentlichen aus dem Genzuführungssystem in einem unbedenklichen Verdünnungsmittel bestehen oder kann eine Retardmatrix, in der das Genzuführungsvehikel eingebettet ist, umfassen. Andererseits kann dort, wo das vollständige Genzuführungssystem in intakter Form von rekombinanten Zellen, beispielsweise retroviralen Vektoren, produziert werden kann, die pharmazeutische Zubereitung eine oder mehrere Zellen, die das Genzuführungssystem produzieren, umfassen.
Falls gewünscht, können die Zusammensetzungen in einer Packung oder einer Spendervorrichtung, die eine oder mehrere den wirksamen Inhaltsstoff enthaltende Dosiseinheitsformen enthalten kann, präsentiert werden. Die Packung kann beispielsweise eine Metall- oder Kunststoffolie, wie beispielsweise eine Blisterverpackung, umfassen. Der Packung oder Spendervorrichtung können Anweisungen zur Verabreichung beigelegt sein.
4.6 Diagnostische und prognostische Tests
Durch die vorliegenden Verfahren werden Mittel zur Bestimmung davon, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer von einer anomalen Delta3-Aktivität gekennzeichneten Störung, wie beispielsweise einer zum Beispiel zu einer neurodegenerativen Krankheit oder Krebs führenden anomalen Zellproliferation, -degeneration und/oder -differenzierung, besteht, bereitgestellt. Gegenstand der Offenbarung sind ebenso Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer mit einem oder mehreren spezifischen Allelen eines Delta3-Gens assoziierten Krankheit oder Störung besteht. Tatsächlich können spezifische Delta3-Allele mit spezifischen Krankheiten oder Störungen assoziiert sein. Dementsprechend werden gemäß der Offenbarung Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson eine neurologische Krankheit, z. B. ACCPN, vorliegt oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Krankheit besteht, bereitgestellt. Die Offenbarung beschreibt ebenso Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson eine vaskuläre Störung oder eine mit der Bestimmung des Zellschicksals assoziierte Störung vorliegt oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Störung besteht.
In einer Ausführungsform beschreibt die Offenbarung ein Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson eine genetische Läsion in einem Delta3-Gen oder eine spezifische allelische Variante eines polymorphen Bereichs in einem Delta3-Gen vorliegt, bereitgestellt. Bei dem spezifischen Allel kann es sich um ein mutantes Allel handeln. Die Offenbarung beschreibt ebenso Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson ein anomales Delta3-Protein aufgrund anomaler posttranslationaler Modifikationen des Proteins, wie beispielsweise anomaler Phosphoregulation oder Glycosylierung, vorliegt. Ebenso beschrieben sind Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson ein anomales Expressionsniveau eines Delta3-Proteins, was an einer genetischen Läsion im Delta3-Gen oder an einem anomalen Niveau oder einer anomalen Aktivität eines die Expression eines Delta3-Gens regulierenden Proteins liegen könnte, vorliegt.
Die Verfahren können dadurch gekennzeichnet sein, daß man dabei in einer Probe von Zellen aus der Untersuchungsperson das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer genetischen Läsion, die wenigstens entweder durch (i) eine sich auf die Integrität eines für ein Delta-Protein codierenden Gens auswirkende Veränderung oder (ii) die Fehlexpression eines Delta3-Gens gekennzeichnet ist, nachweist. Zur Veranschaulichung: Solche genetischen Läsionen können nachgewiesen werden, indem man wenigstens ein Ereignis aus (i) einer Deletion eines oder mehrerer Nukleotide aus einem Delta3-Gen, (ii) einer Addition eines oder mehrerer Nukleotide an ein Delta3-Gen, (iii) einer Substitution eines oder mehrerer Nukleotide eines Delta3-Gens, (iv) einer gesamtchromosomalen Umordnung eines Delta3-Gens, (v) einer Gesamtänderung im Niveau eines Messenger-RNA-Transkripts eines Delta3-Gens, (vi) einer anomalen Modifikation eines Delta3-Gens, wie beispielsweise des Methylierungsmusters der genomischen DNA, (vii) dem Vorhandensein eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts eines Delta3-Gens, (viii) einem Nicht-Wildtyp-Niveau eines Delta-Proteins, (ix) dem allelischen Verlust eines Delta3-Gens und (x) einer ungeeigneten posttranslationalen Modifikation eines Delta-Proteins ermittelt. Wie nachfolgend dargestellt, wird durch die vorliegende Erfindung eine große Anzahl von Testtechniken zum Nachweis von Läsionen in einem Delta3-Gen und, was wichtig ist, die Fähigkeit zwischen unterschiedlichen molekularen Ursachen, die der Delta-abhängigen anomalen Zellproliferation und/oder -differenzierung zugrundeliegen, unterscheiden zu können, bereitgestellt.
Um zu bestimmen, ob bei einer Untersuchungsperson eine Krankheit oder ein Leiden, die bzw. das mit einem spezifischen Allel eines Delta3-Gens assoziiert ist, vorliegt oder die Gefahr der Entwicklung einer solchen Krankheit bzw. eines solchen Leidens besteht, können zur Bestimmung der Identität des mit einer Krankheit assoziierten Allels Vorversuche durchgeführt werden. So kann man beispielsweise zur Bestimmung der Identität des mit ACCPN assoziierten hDelta3-Allels Mutationsnachweisuntersuchungen des Delta3-Gens in Populationen mit einem hohen Risiko der Entwicklung von ACCPN durchführen. So kann man beispielsweise eine Mutationsnachweisanalyse der genomischen DNA aus Untersuchungspersonen in der französisch-kanadischen Bevölkerung in den Regionen Charlevoix und Saguenay-Lac St Jean der Provinz Quebec durchführen (Casaubon et al., supra). Aus einer solchen Analyse ergibt sich die Identität des bzw. der mit ACCPN assoziierten Delta3-Allels bzw. Delta3-Allele. Der Vergleich des Delta3-Allels einer Untersuchungsperson mit diesem mit ACCPN assoziierten Allel bzw. diesen mit ACCPN assoziierten Allelen liefert einen Hinweis darauf, ob bei einer Untersuchungsperson ein mit ACCPN assoziiertes Delta3-Allel vorliegt, und somit, ob bei der Untersuchungsperson ACCPN vorliegt oder die Wahrscheinlichkeit der Entwicklung von ACCPN besteht. Auf ähnliche Weise läßt sich eine Mutationsnachweisanalyse auch durchführen, um die Identität von mit anderen Krankheiten oder Leiden assoziierten Delta3-Allelen zu bestimmen.
In einer beispielhaften Ausführungsform wird eine Nukleinsäurezusammensetzung bereitgestellt, die eine (gereinigte) Oligonukleotidsonde umfaßt, welche einen Nukleotidsequenzbereich enthält, der zur Hybridisierung an eine Sense- oder Antisense-Sequenz eines Delta3-Gens, wie es durch eine der SEQ ID Nos: 1 und 3 dargestellt ist, von Allelen davon, natürlich vorkommenden Mutanten davon oder an natürlicherweise mit den betreffenden Delta3-Genen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon assoziierte 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen oder Intronsequenzen in der Lage ist. Dabei wird die Nukleinsäure einer Zelle für die Hybridisierung zugänglich gemacht, die Sonde Nukleinsäure der Probe ausgesetzt und die Hybridisierung der Sonde an die Probennukleinsäure nachgewiesen. Derartige Techniken lassen sich zum Nachweis von Läsionen entweder auf dem genomischen oder dem mRNA-Niveau, einschließlich Deletionen, Substitutionen usw., ebenso wie zur Bestimmung von mRNA-Transkriptniveaus verwenden.
Wie oben dargelegt, betrifft ein Teil der Offenbarung diagnostische Tests zur Bestimmung im Zusammenhang mit aus einem Patienten isolierten Zellen, ob Mutationen in einem oder mehreren Delta3-Genen der Probenzellen entstanden sind. Mit dem vorliegenden Verfahren wird ein Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr einer durch anomale Delta3-Aktivität, beispielsweise Zellproliferation und/oder -differenzierung, gekennzeichnete Störung besteht, bereitgestellt. Das Verfahren läßt sich allgemein dadurch kennzeichnen, daß man dabei in einer Probe von Zellen aus der Untersuchungsperson das Vorhandensein oder die Abwesenheit einer durch eine sich auf die Integrität eines für ein Delta-Protein codierenden Gens auswirkende Änderung gekennzeichneten genetischen Läsion nachweist. Zur Veranschaulichung: Solche genetischen Läsionen können nachgewiesen werden, indem man wenigstens ein Ereignis aus (i) einer Deletion eines oder mehrerer Nukleotide aus einem Delta-Gen, (ii) einer Addition eines oder mehrerer Nukleotide an ein Delta-Gen, (iii) einer Substitution eines oder mehrerer Nukleotide eines Delta-Gens und (iv) dem Vorhandensein eines Nicht-Wildtyp-Spleißmusters eines Messenger-RNA-Transkripts eines Delta-Gens ermittelt. Wie nachfolgend dargestellt, wird durch die vorliegende Offenbarung eine große Anzahl von Testtechniken zum Nachweis von Läsionen in Delta3-Genen und, was wichtig ist, die Fähigkeit zwischen unterschiedlichen molekularen Ursachen, die der Delta-abhängigen anomalen Zellproliferation und/oder -differenzierung zugrundeliegen, unterscheiden zu können, beschrieben.
In bestimmten Verfahren umfaßt der Nachweis der Läsion in einem Delta-Gen oder der Identität einer allelischen Variante eines polymorphen Bereichs eines Delta-Gens die Nutzung der Sonde/des Primers in einer Polymerasekettenreaktion (PCR) (siehe z. B. US-Patente Nr. 4,683,195 und 4,683,202 ), wie beispielsweise Anker-PCR oder RACE-PCR, oder als Alternative in einer Ligationskettenreaktion (LCR) (siehe z. B. Landegran et al. (1988) Science 241: 1077–1080; und Nakazawa et al. (1994) PNAS 91: 360–364), wobei die letztere besonders zum Nachweis von Punktmutationen im Delta-Gen geeignet sein kann (siehe Abravaya et al. (1995) Nuc Acid Res 23: 675–682). In einem lediglich veranschaulichenden Verfahren beinhaltet das Verfahren die Schritte: (i) Sammeln einer Probe von Zellen aus einem Patienten, (ii) Isolieren von Nukleinsäure (z. B. genomische Nukleinsäure oder/und mRNA) aus den Zellen der Probe, (iii) Inkontaktbringen der Nukleinsäureprobe mit einem oder mehreren spezifisch an ein Delta-Gen hybridisierenden Primern unter solchen Bedingungen, daß die Hybridisierung und Amplifikation des Delta-Gens (falls vorhanden) stattfindet, und (iv) Nachweisen des Vorhandenseins oder der Abwesenheit eines Amplifikationsprodukts oder Nachweisen der Größe des Amplifikationsprodukts und Vergleichen der Länge mit einer Kontrollprobe. Man darf erwarten, daß die Verwendung der PCR und/oder LCR als Voramplifikationsschritt in Verbindung mit einer der zum Nachweis der hier beschriebenen Mutationen verwendeten Techniken wünschenswert ist.
Zu alternativen Amplifikationsverfahren gehören: die sich selbst erhaltende Sequenzreplikation (Guatelli, J. C. et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874–1878), das transkriptionale Amplifikationssystem (Kwoh, D. Y. et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173–1177), Q-Beta-Replikase (Lizardi, P. M. et al., 1988, Bio/Technology 6: 1197) oder alle anderen Nukleinsäureamplifikationsverfahren, wobei die amplifizierten Moleküle anschließend unter Verwendung von dem Fachmann allgemein bekannten Techniken nachgewiesen werden. Diese Nachweisprotokolle eignen sich vor allem zum Nachweis von Nukleinsäuremolekülen, wenn derartige Moleküle in einer sehr geringen Anzahl vorliegen.
In einem bevorzugten betreffenden Test werden Mutationen in einem Delta3-Gen oder spezifischen Allelen eines Delta3-Gens aus einer Probenzelle anhand von Veränderungen in den Restriktionsenzymspaltmustern identifiziert. So wird beispielsweise Proben- und Kontroll-DNA isoliert, (gegebenenfalls) amplifiziert, mit einer oder mehreren Restriktionsendonukleasen verdaut und die Länge der Fragmente durch Gelelektrophorese bestimmt. Zudem läßt sich die Verwendung sequenzspezifischer Ribozyme (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,498,531 ) zum Aufzeichnen des Vorhandenseins spezifischer Mutationen über die Entwicklung oder den Verlust einer Ribozymspaltstelle einsetzen.
In noch einem weiteren Test kann eine von verschiedenen im Fachgebiet bekannten Sequenzierreaktionen zur direkten Sequenzierung des Delta3-Gens und zum Nachweis von Mutationen oder allelischen Varianten polymorpher Bereiche durch Vergleichen der Sequenz des Proben-Delta3 mit der entsprechenden Wildtyp(Kontroll-)Sequenz verwendet werden. Zu diesen Sequenzierreaktionen gehören beispielsweise die auf den von Maxam und Gilbert (Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1977) 74: 560) bzw. Sanger (Sanger et al. (1977) Proc. Natl. Acad. Sci. 74: 5463) entwickelten Techniken beruhenden Reaktionen. Ebenso ist vorgesehen, daß eines von verschiedenen automatisierten Sequenzierverfahren bei der Durchführung der betreffenden Tests benutzt werden kann (Biotechniques (1995) 19: 448), einschließlich durch Sequenzieren mittels Massenspektrometrie (siehe z. B. PCT-Veröffentlichung WO 94/16101 ; Cohen et al. (1996) Adv Chromatogr 36: 127–162; und Griffin et al. (1993) Appl Biochem Biotechnol 38: 147–159). Dem Fachmann ist ersichtlich, daß bei gewissen Ausführungsformen lediglich das Auftreten von einer, zwei oder drei Nukleinsäurebasen in der Sequenzierreaktion bestimmt zu werden braucht. So kann man beispielsweise A-tract oder dergleichen, wo zum Beispiel nur eine Nukleinsäure nachgewiesen wird, durchführen.
In einem weiteren Test kann der Schutz vor Spaltungsagentien (wie z. B. einer Nuklease, Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin) zum Nachweis fehlgepaarter Basen in RNA/RNA- oder RNA/DNA-Heteroduplexen verwendet werden (Myers, et al. (1985) Science 230: 1242). Im allgemeinen beginnt die im Fachgebiet bekannte Technik der „Fehlpaarungsspaltung” („mismatch cleavage”) damit, daß man durch Hybridisierung von die Wildtyp-Delta3-Sequenz enthaltender (markierter) RNA oder DNA mit aus einer Gewebsprobe gewonnenen potentiellen mutanten RNA oder DNA gebildete Heteroduplexe bereitstellt. Die doppelsträngigen Duplexe werden mit einem Agens behandelt, das einzelsträngige Bereiche des Duplexes, so wie sie aufgrund von Basenpaarfehlpaarungen zwischen dem Kontroll- und dem Probenstrang existieren, spaltet. So können beispielsweise RNA/DNA-Duplexe mit RNase und DNA/DNA-Hybride mit S1-Nuklease zur enzymatischen Verdauung der fehlgepaarten Bereiche behandelt werden. In weiteren Ausführungsformen können entweder DNA/DNA- oder RNA/DNA-Duplexe mit Hydroxylamin oder Osmiumtetroxid und mit Piperidin behandelt werden, um fehlgepaarte Bereiche zu verdauen. Nach Verdauung der fehlgepaarten Bereiche wird das erhaltene Material dann auf denaturierenden Polyacrylamidgelen nach Größe getrennt, um die Stelle der Mutation zu bestimmen. Siehe beispielsweise Cotton et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 4397; Saleeba et al. (1992) Methods Enzymod. 217: 286–295. In einer bevorzugten Ausführungsform kann die Kontroll-DNA oder -RNA zum Nachweis markiert werden.
In noch einem weiteren Test werden bei der Fehlpaarungsspaltreaktion ein oder mehrere Proteine, die fehlgepaarte Basenpaare in doppelsträngiger DNA erkennen (sogenannte „DNA mismatch repair”-Enzyme), in definierten Systemen zum Nachweis und zur Kartierung von Punktmutationen in aus Proben von Zellen gewonnenen Delta3-cDNAs eingesetzt. So spaltet beispielsweise das Enzym mutY aus E. coli A bei G/A-Fehlpaarungen und die Thymidin-DNA-Glycosylase aus HeLa-Zellen T bei G/T-Fehlpaarungen (Hsu et al. (1994) Carcinogenesis 15: 1657–1662). Gemäß einem beispielhaften Test wird eine auf einer Delta3-Sequenz, z. B. einer Wildtyp-Delta3-Sequenz, beruhende Sonde an eine cDNA oder ein anderes DNA-Produkt aus einer Testzelle(n) hybridisiert. Der Duplex wird mit einem DNA-Fehlpaarungsreparaturenzym behandelt, und die Spaltprodukte, falls vorhanden, lassen sich nach Elektrophoresevorschriften oder dergleichen nachweisen. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 5,459,039 .
In weiteren Tests werden Veränderungen in der elektrophoretischen Mobilität zur Identifizierung von Mutationen in Delta3-Genen oder zur Bestimmung der Identität des Delta3-Allels verwendet. So kann beispielsweise ein Einzelstrangkonformationspolymorphismus (SSCP) zum Nachweis von Unterschieden in der elektrophoretischen Mobilität zwischen mutanten und Wildtyp-Nukleinsäuren verwendet werden (Orita et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 2766, siehe auch Cotton (1993) Mutat Res 285: 125–144; und Hayashi (1992) Genet Anal Tech Appl 9: 73–79). Dabei denaturiert man einzelsträngige DNA-Fragmente von Proben- und Kontroll-Delta3-Nukleinsäuren und läßt sie dann denaturieren. Die Sekundärstruktur einzelsträngiger Nukleinsäuren variiert entsprechend der Sequenz, und die erhaltene Veränderung in der elektrophoretischen Mobilität ermöglicht den Nachweis selbst eines einzelnen Basenaustauschs. Die DNA-Fragmente können mit markierten Sonden markiert oder nachgewiesen werden. Die Empfindlichkeit des Tests kann durch Verwendung von RNA (statt DNA), bei der die Sekundärstruktur gegenüber einer Sequenzänderung empfindlicher ist, erhöht werden. In einer bevorzugten Ausführungsform wird bei dem betreffenden Verfahren eine Heteroduplexanalyse benutzt, um doppelsträngige Heteroduplexmoleküle auf Grundlage von Änderungen in der elektrophoretischen Mobilität zu trennen (Keen et al. (1991) Trends Genet 7: 5).
In noch einem weiteren Test wird die Bewegung von mutanten oder Wildtyp-Fragmenten in Polyacrylamidgelen, die einen Denaturierungsmittelgradienten enthalten, mit der denaturierenden Gradientengelelektrophorese (DGGE) getestet (Myers et al (1985) Nature 313: 495). Bei Verwendung von DGGE als Analyseverfahren wird die DNA modifiziert, um sicherzustellen, daß sie nicht vollständig denaturiert, indem man beispielsweise eine GC-Klammer von ungefähr 40 bp hochschmelzender GC-reicher DNA mittels PCR hinzufügt. In einer weiteren Ausführungsform wird zur Identifizierung von Unterschieden in der Mobilität der Kontroll- und Proben-DNA statt eines Denaturierungsmittelgradienten ein Temperaturgradient verwendet (Rosenbaum und Reissner (1987) Biophys Chem 265: 12753).
Zu weiteren Techniken zum Nachweis von Punktmutationen gehören beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, selektive Oligonukleotidhybridisierung, selektive Amplifikation oder selektive Primerverlängerung. Beispielsweise kann man Oligonukleotidprimer, bei denen die bekannte Mutation in der Mitte plaziert ist, herstellen und anschließend an Ziel-DNA hybridisieren, und zwar unter Bedingungen, bei denen die Hybridisierung nur dann gestattet ist, wenn eine perfekte Paarung gefunden wird (Saiki et al. (1986) Nature 324: 163); Saiki et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6230). Derartige allelspezifische Oligonukleotidhybridisierungstechniken können zum Testen einer Mutation pro Reaktion bei Hybridisierung der Oligonukleotide an PCR-amplifizierte Ziel-DNA oder einer Reihe unterschiedlicher Mutationen bei Bindung der Oligonukleotide an die Hybridisierungsmembran und Hybridisierung mit markierter Ziel-DNA verwendet werden.
Als Alternative kann eine allelspezifische Amplifikationstechnologie, die auf selektiver PCR-Amplifikation beruht, in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Als Primer für die spezifische Amplifikation verwendete Oligonukleotide können die interessierende Mutation im Zentrum des Moleküls (so daß die Amplifikation von differentieller Hybridisierung abhängt) (Gibbs et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17: 2437–2448) oder am äußersten 3'-Ende des einen Primers tragen, wo eine Fehlpaarung unter entsprechenden Bedingungen die Verlängerung durch die Polymerase verhindern oder reduzieren kann (Prossner (1993) Tibtech 11: 238. Darüber hinaus kann es wünschenswert sein, eine neue Restriktionsstelle im Bereich der Mutation einzuführen, um einen auf Spaltung beruhenden Nachweis zu erzeugen (Gasparini et al. (1992) Mol. Cell Probes 6:1). Es wird erwartet, daß in gewissen Ausführungsformen eine Amplifikation auch unter Verwendung der Taq-Ligase zur Amplifikation durchgeführt werden kann (Barany (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88: 189). In solchen Fällen findet eine Ligation nur dann statt, wenn am 3'-Ende der 5'-Sequenz eine perfekte Paarung vorhanden ist, die es ermöglicht, das Vorhandensein einer bekannten Mutation an einer spezifischen Stelle nachzuweisen, indem man nach dem Vorhandensein oder der Abwesenheit einer Amplifikation sucht.
Eine weitere beschriebene Nukleinsäurezusammensetzung umfaßt eine (gereinigte) Oligonukleotidsonde, welche einen Nukleotidsequenzbereich enthält, der zur Hybridisierung an eine Sense- oder Antisense-Sequenz eines Delta-Gens oder natürlich vorkommender Mutanten davon oder an natürlicherweise mit den betreffenden Delta-Genen oder natürlich vorkommenden Mutanten davon assoziierte 5'- oder 3'-flankierende Sequenzen oder Intronsequenzen in der Lage ist. Dabei wird die Nukleinsäure einer Zelle für die Hybridisierung zugänglich gemacht, die Sonde Nukleinsäure der Probe ausgesetzt und die Hybridisierung der Sonde an die Probennukleinsäure nachgewiesen. Derartige Techniken lassen sich zum Nachweis von Läsionen entweder auf dem genomischen oder dem mRNA-Niveau, einschließlich Deletionen, Substitutionen usw., ebenso wie zur Bestimmung von mRNA-Transkriptniveaus verwenden. Solche Oligonukleotidsonden können sowohl zur prognostischen als auch therapeutischen Bewertung allelischer Mutationen, die sich beispielsweise in einer neurodegenerativen, in neoplastischen oder hyperplastischen Störungen (z. B. anomales Zellwachstum) manifestieren könnten, verwendet werden.
Die hier beschriebenen Verfahren können beispielsweise unter Nutzung fertig abgepackter Kits, die wenigstens eine Sondennukleinsäure oder wenigstens ein Antikörperreagens, wie hier beschrieben, umfassen und die zweckmäßigerweise beispielsweise im klinischen Rahmen zur Diagnose von Symptome zeigenden Patienten oder der Familiengeschichte einer Krankheit oder Erkrankung, an der ein Delta3-Gen beteiligt ist, verwendet werden können, durchgeführt werden.
In den unten beschriebenen Diagnostika können alle Zellarten oder Gewebe, vorzugsweise Nerven- oder Endothelzellen, in denen das Delta3 exprimiert wird, verwendet werden. So kann beispielsweise die Körperflüssigkeit einer Untersuchungsperson (z. B. Blut) mit bekannten Techniken (z. B. Venenpunktur) gewonnen werden. Als Alternative lassen sich Nukleinsäuretests an trockenen Proben (z. B. Haare oder Haut) durchführen. Fötale Nukleinsäureproben lassen sich aus dem mütterlichen Blut, wie in der internationalen Patentanmeldung Nr. WO91/07660 an Bianchi beschrieben, gewinnen. Als Alternative können zur Durchführung von pränatalen Tests, beispielsweise auf ACCPN, bei der es sich um eine Krankheit handelt, die normalerweise im dritten Lebensjahrzehnt tödlich verläuft, Amniozyten oder Chorionzotten gewonnen werden.
Diagnostische Verfahren können auch in situ direkt auf Gewebeschnitten (fixiert und/oder gefroren) von aus Biopsien oder Resektionen erhaltenem Patientengewebe durchgeführt werden, so daß keine Nukleinsäurereinigung notwendig ist. Dabei können Nukleinsäurereagentien als Sonden und/oder Primer für derartige In-situ-Verfahren eingesetzt werden (siehe z. B. Nuovo, G. J., 1992, PCR in situ hybridization: protocols and applications, Raven Press, NY).
Neben Verfahren, die sich hauptsächlich auf den Nachweis einer Nukleinsäuresequenz konzentrieren, können in derartigen Nachweisprotokollen auch Profile beurteilt werden. Dabei können beispielsweise Fingerabdruckprofile unter Nutzung eines differentiellen Display-Verfahrens, einer Northern-Analyse und/oder RT-PCR erzeugt werden.
Gegen Wildtyp- oder mutante Delta3-Proteine gerichtete Antikörper, die oben erörtert sind, können ebenso bei der Krankheitsdiagnose und -prognose verwendet werden. Derartige prognostische Verfahren können zum Nachweis von Abnormalitäten auf der Ebene der Delta3-Proteinexpression oder von Abnormalitäten in der Struktur und/oder der Gewebe-, zellulären oder subzellulären Lokalisation von Delta3-Proteinen verwendet werden. Zu den strukturellen Unterschieden gehören beispielsweise Unterschiede in der Größe, der Elektronegativität oder Antigenität des mutanten Delta3-Proteins gegenüber dem normalen Delta3-Protein. Protein aus dem zu analysierenden Gewebe oder der zu analysierenden Zellart kann leicht mit Techniken, die dem Fachmann allgemein bekannt sind, einschließlich, ohne darauf beschränkt zu sein, der Western-Blot-Analyse, nachgewiesen oder isoliert werden. Für eine ausführliche Erläuterung von Verfahren zur Durchführung der Western-Blot-Analyse, siehe Sambrook et al., 1989, supra, unter Kapitel 18. Bei den hier verwendeten Proteinnachweis- und Isolierungsverfahren kann es sich auch um solche Verfahren handeln, wie sie beispielsweise bei Harlow und Lane (Harlow, E. und Lane, D., 1988, „Antibodies: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York), hiermit vollinhaltlich durch Bezugnahme aufgenommen, beschrieben sind.
Dies läßt sich beispielsweise mit Immunfluoreszenztechniken bewerkstelligen, bei denen ein fluoreszenzmarkierter Antikörper (siehe unten) zusammen mit einem lichtmikroskopischen, durchflußzytometrischen oder fluorimetrischen Nachweis eingesetzt wird. Die bei der vorliegenden Erfindung geeigneten Antikörper (oder Fragmente davon) können zusätzlich histologisch, wie bei der Immunfluoreszenz- oder Immunelektronenmikroskopie, zum In-situ-Nachweis von Delta3-Proteinen eingesetzt werden. Der In-situ-Nachweis kann bewerkstelligt werden, indem man einem Patienten eine histologische Probe entnimmt und diese mit einem markierten Antikörper der vorliegenden Erfindung versieht. Der Antikörper (bzw. das Fragment) wird vorzugsweise durch Überlagerung einer biologischen Probe mit dem markierten Antikörper (bzw. Fragment) aufgetragen. Durch die Verwendung eines solchen Verfahrens ist es möglich, nicht nur das Vorhandensein des Delta3-Proteins, sondern auch seine Verteilung in dem untersuchten Gewebe zu bestimmen. Bei der Verwendung der vorliegenden Erfindung ist es dem Fachmann leicht ersichtlich, daß zur Erreichung eines solchen In-situ-Nachweises eines von vielen verschiedenen histologischen Verfahren (wie etwa Anfärbeverfahren) modifiziert werden können.
Häufig wird eine Festphasenstütze bzw. ein Festphasenträger als zur Bindung eines Antigens oder eines Antikörpers fähige Stütze verwendet. Zu allgemein bekannten Stützen bzw. Trägern gehören Glas, Polystyrol, Polypropylen, Polyethylen, Dextran, Nylon, Amylasen, natürliche und modifizierte Cellulosen, Polyacrylamide, Gabbros und Magnetit. Der Träger kann in seiner Beschaffenheit für die Zwecke der vorliegenden Erfindung entweder zu einem gewissen Grad löslich oder unlöslich sein. Das Trägermaterial kann praktisch alle möglichen Strukturkonfigurationen aufweisen, solange wie das gekoppelte Molekül zur Bindung an ein Antigen oder einen Antikörper fähig ist. Somit kann die Trägerkonfiguration kugelförmig, wie in einer Perle, oder zylindrisch, wie bei der inneren Oberfläche eines Teströhrchens oder der äußeren Oberfläche eines Stabs, sein. Andererseits kann die Oberfläche flach sein, wie etwa bei einem Blatt, Teststreifen usw. Zu den bevorzugten Trägern gehören Polystyrolperlen. Dem Fachmann sind viele geeignete Träger zur Bindung von Antikörper oder Antigen bekannt oder er kann diese unter Verwendung von Routineversuchen ermitteln.
Ein Mittel zur Markierung eines Anti-Delta3-Protein-spezifischen Antikörpers besteht in der Verknüpfung mit einem Enzym und der Verwendung in einem Enzym-Immunoassay (EIA) (Voller, „The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA)”, Diagnostic Horizons 2: 1–7, 1978, Microbiological Associates Quarterly Publication, Walkersville, MD; Voller, et al., J. Clin. Pathol. 31: 507–520 (1978); Butler, Meth. Enzymol. 73: 482–523 (1981); Maggio, (Hrsg.) Enzyme Immunoassay, CRC Press, Boca Raton, FL, 1980; Ishikawa, et al., (Hrsg.) Enzyme Immunoassay, Kgaku Shoin, Tokyo, 1981). Das an den Antikörper gebundene Enzym reagiert mit einem entsprechenden Substrat, vorzugsweise einem chromogenen Substrat, so daß eine chemische Gruppierung produziert wird, die sich beispielsweise mit spektrophotometrischen, fluorimetrischen oder optischen Mitteln nachweisen läßt. Zu den Enzymen, die zur nachweisbaren Markierung des Antikörpers verwendet werden können, gehören, ohne darauf beschränkt zu sein, Malatdehydrogenase, Staphylokokken-Nuklease, delta-5-Steroid-Isomerase, Hefe-Alkoholdehydrogenase, alpha-Glycerophosphat-Dehydrogenase, Triosephosphatisomerase, Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, Asparaginase, Glucoseoxidase, beta-Galactosidase, Ribonuklease, Urease, Katalase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase, Glucoamylase sowie Acetylcholinesterase. Der Nachweis läßt sich mit kolorimetrischen Verfahren, bei denen ein chromogenes Substrat für das Enzym eingesetzt wird, bewerkstelligen. Der Nachweis kann ebenso durch optischen Vergleich des Ausmaßes der enzymatischen Reaktion eines Substrats im Vergleich mit auf ähnliche Weise hergestellten Standards bewerkstelligt werden.
Der Nachweis kann ebenso unter Verwendung eines von verschiedenen weiteren Immunotests bewerkstelligt werden. So ist es beispielsweise durch radioaktive Markierung der Antikörper oder Antikörperfragmente möglich, Fingerabdruck-Gen-Wildtyp- oder -mutante Peptide über die Verwendung eines Radioimmunoassays (RIA) nachzuweisen (siehe z. B. Weintraub, B., Principles of Radioimmunoassays, Seventh Training Course an Radioligand Assay Techniques, The Endocrine Society, März 1986, hiermit durch Bezugnahme aufgenommen). Das radioaktive Isotop läßt sich mit solchen Mitteln wie beispielsweise der Verwendung eines Gammazählers oder eines Szintillationszählers oder durch Autoradiographie nachweisen.
Ebenso besteht die Möglichkeit, den Antikörper mit einer Fluoreszenzverbindung zu markieren. Wird der fluoreszenzmarkierte Antikörper Licht der korrekten Wellenlänge ausgesetzt, so läßt sich sein Vorhandensein dann aufgrund der Fluoreszenz nachweisen. Unter den am häufigsten verwendeten Verbindungen zur Fluoreszenzmarkierung befinden sich Fluoresceinisothiocyanat, Rhodamin, Phycoerythrin, Phycocyanin, Allophycocyanin, o-Phthalaldehyd und Fluorescamin.
Der Antikörper kann auch unter Verwendung fluoreszenzabgebender Metalle, wie z. B. ¹⁵²Eu oder anderen Metallen der Lanthanidenreihe, nachweisbar markiert werden. Diese Metalle lassen sich an den Antikörper unter Verwendung solcher Metallkomplexbildnergruppen wie etwa Diethylentriaminpentaessigsäure (DTPA) oder Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) binden.
Der Antikörper läßt sich ebenso nachweisbar markieren, indem er an eine Chemilumineszenzverbindung gekoppelt wird. Das Vorhandensein des mit einem Chemilumineszenz-Tag versehenen Antikörpers wird dann bestimmt, indem man das Vorhandensein der während des Verlaufs einer chemischen Reaktion entstehenden Lumineszenz nachweist. Zu den besonders geeigneten Verbindungen für die Chemilumineszenzmarkierung gehören beispielsweise Luminol, Isoluminol, theromatische Acridiniumester, Imidazol, Acridiniumsalz und Oxalsäureester.
Gleichfalls kann eine Biolumineszenzverbindung zur Markierung des Antikörpers der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Bei der Biolumineszenz handelt es sich um eine Art der Chemilumineszenz, die in biologischen Systemen angetroffen wird, und bei der ein katalytisches Protein die Effizienz der Chemilumineszenzreaktion erhöht. Das Vorhandensein eines Biolumineszenzproteins wird durch den Nachweis des Vorhandenseins der Lumineszenz bestimmt. Im Sinne der Markierung wichtige Biolumineszenzverbindungen sind Luciferin, Luciferase und Äquorin.
Zudem versteht es sich, daß alle obigen Verfahren zum Nachweis von Veränderungen in einem Delta3-Gen oder -Genprodukt zur Überwachung des Verlaufs einer Behandlung oder Therapie eingesetzt werden können.
4.7 Arzneistoff-Screening-Tests
Die Offenbarung beschreibt Verbindungen, beispielsweise therapeutische Verbindungen, zur Behandlung von Krankheiten oder Leiden, die durch eine anomale Delta3-Aktivität verursacht werden oder zu denen eine solche anomale Aktivität beiträgt. Bei den Verbindungen, die für diesen Zweck verwendet werden können, kann es sich um eine beliebige Art von Verbindung, einschließlich eines Proteins, eines Peptids, eines Peptidomimetikums, eines kleinen Moleküls und einer Nukleinsäure, handeln. Bei einer Nukleinsäure kann es sich beispielsweise um ein Gen, eine Antisense-Nukleinsäure, ein Ribozym oder ein Triplexmolekül handeln. Bei einer offenbarungsgemäßen Verbindung kann es sich um einen Agonisten oder einen Antagonisten handeln. Eine Verbindung kann auf ein Delta3-Gen wirken, beispielsweise um dessen Expression zu modulieren. Eine Verbindung kann auch auf ein Delta3-Protein wirken, um beispielsweise die Signaltransduktion vom Rezeptor zu modulieren. Entsprechenderweise kann es sich bei einer offenbarungsgemäßen Verbindung um eine Verbindung handeln, die an Delta3 bindet und die die Signaltransduktion vom Rezeptor induziert, so daß beispielsweise eine Delta3-Aktivität induziert wird. Als Alternative kann es sich bei einer offenbarungsgemäßen Verbindung um eine Verbindung handeln, die die Wechselwirkung eines Delta3-Proteins mit einem toporhythmischen Protein, z. B. Notch, hemmt. Es handelt sich bei einer offenbarungsgemäßen Verbindung, die mit einem Delta-Protein wechselwirkt, bei der es sich entweder um einen Agonisten oder einen Antagonisten handelt, um ein anderes, mit Delta3 wechselwirkendes Protein. Eine andere Verbindung ist ein lösliches toporhytmisches Protein oder ein anderes mit Delta3 wechselwirkendes Protein. Dementsprechend kann es sich bei einem löslichen toporhythmischen Protein um eine stimulatorische Form eines toporhythmischen Proteins oder eine inhibitorische Form eines toporhythmischen Proteins handeln, je nachdem, ob das jeweilige toporhythmische Protein eine Delta3-Aktivität stimuliert oder hemmt.
Auf ähnliche Weise kann ein lösliches Delta3-Protein, z. B. Delta3-Ig, zur Modulation einer Aktivität eines toporhythmischen Proteins, z. B. Notch, verwendet werden. Beispielsweise kann es sich bei einem löslichen Delta3-Protein um eine stimulatorische Form eines Delta3-Proteins, d. h. ein Delta3-Protein, das zur Stimulierung einer Aktivität eines toporhythmischen Proteins in der Lage ist, handeln. In einer Ausführungsform wirkt ein solches Protein im wesentlichen auf die gleiche Weise wie Wildtyp-Delta3. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei einem löslichen Delta3-Protein um eine inhibitorische Form eines Delta3-Proteins, d. h. ein Delta3-Protein, das zur Hemmung einer Aktivität eines toporhythmischen Proteins in der Lage ist. Beispielsweise könnte ein solches Delta3-Protein die Wechselwirkung von Wildtyp-Delta3 mit dem toporhythmischen Protein hemmen. In einer bevorzugten Ausführungsform hemmt eine inhibitorische Form eines Delta3-Proteins die Wechselwirkung mehrerer Proteine, die normalerweise mit einem toporhythmischen Protein beispielsweise durch Bindung an eine Stelle des toporhythmischen Proteins, die auch eine Bindungsstelle für verschiedene andere Proteine, z. B. andere Delta-Proteine darstellt, wechselwirken. Dementsprechend kann ein Delta3-Therapeutikum im allgemeinen eine Wirkung auf die Wechselwirkung verschiedener toporhythmischer Proteine miteinander ausüben. Auf ähnliche Weise kann wenigstens teilweise aufgrund der Sequenz- und Strukturähnlichkeiten zwischen Delta-Proteinen ein anderes Delta-Therapeutikum als ein Delta3-Therapeutikum ebenso zur Modulierung der Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem mit Delta3 wechselwirkenden Bindungsmolekül verwendet werden.
Die offenbarungsgemäßen Verbindungen lassen sich unter Verwendung verschiedener Tests, je nach Art der Verbindung und gewünschten Aktivität der Verbindung, identifizieren. Wenigstens einige Tests, die sich zur Identifizierung von Delta3-Therapeutika verwenden lassen, sind unten aufgeführt. Es liegt im fachmännischen Können, zusätzliche Tests zur Identifizierung von Delta-Therapeutika, beispielsweise Delta3-Therapeutika, zu entwerfen.
Durch das Zurverfügungstellen gereinigter und rekombinanter Delta3-Polypeptide erleichtert die vorliegende Erfindung die Entwicklung von Tests, die zum Screening auf Arzneistoffe, einschließlich Delta3-Varianten, bei denen es sich entweder um Agonisten oder Antagonisten der normalen zellulären Funktion der betreffenden Delta3-Polypeptide oder deren Rolle bei der Pathogenese der Zelldifferenzierung und/oder -proliferation sowie damit verwandten Störungen handelt, verwendet werden können. In einer Ausführungsform beurteilt der Test die Fähigkeit einer Verbindung, die Bindung zwischen einem Delta3-Polypeptid und einem Molekül, bei dem es sich um ein Protein oder DNA handeln kann und dessen Wechselwirkung dem Delta/Notch-Signalisierungsweg entweder vorgeschaltet oder nachgeschaltet ist, zu modulieren. Verschiedene Testformate genügen hier und sind im Licht der vorliegenden Erfindungen der Fachkraft ersichtlich.
4.7.1 Zellfreie Tests
Zellfreie Tests können zur Identifizierung von Verbindungen, die mit einem Delta3-Protein wechselwirken, verwendet werden. Solche Tests stehen zum Testen von Verbindungen, bei denen es sich um Proteine, beispielsweise toporhythmische Proteine oder Varianten davon, handelt ebenso zur Verfügung wie zum Testen von Verbindungen, bei denen es sich um Peptidomimetika, kleine Moleküle oder Nukleinsäuren handelt. Der zum Testen dieser Verbindungen spezifische Test kann mit der Art der Verbindung variieren.
In einer Ausführungsform wird eine mit einem Delta3-Protein wechselwirkende Verbindung durch das Screening beispielsweise einer Bibliothek von Verbindungen auf die Bindung an ein rekombinantes oder gereinigtes Delta3-Protein oder wenigstens einen Anteil davon identifiziert. Solche Tests können die Markierung einer oder beider Komponenten sowie die Messung des Ausmaßes ihrer Wechselwirkung beispielsweise durch Bestimmen des Niveaus der einen bzw. der beiden Markierungen beinhalten. In diesen Tests kann es bevorzugt sein, das Delta3-Protein an eine Festphasenoberfläche zu binden. Verfahren, um dieses zu erreichen, sind unten weiter beschrieben. In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Bibliothek von Verbindungen um eine Bibliothek kleiner Moleküle. In einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Bibliothek von Verbindungen um eine Bibliothek von Delta3-Varianten, die gemäß unten beschriebener Verfahren hergestellt werden kann.
Die Identifizierung einer Verbindung, die eine Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem toporhythmischen Protein hemmt, läßt sich auch durch das Screening von Verbindungen unter Verwendung von Aggregationstests, wie beispielsweise bei Fehon et al. (1990) Cell 61: 523–534 beschrieben, durchführen.
Die Offenbarung beschreibt Verfahren zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung eines Delta3-Proteins mit einem Molekül, beispielsweise einem toporhythmischen Protein oder einem mit der zytoplasmatischen Domäne eines Delta3-Proteins wechselwirkenden Protein, hemmen. Derartige Verfahren, die vorzugsweise in Tests mit hohem Durchsatz verwendet werden, lassen sich wie folgt durchführen.
Bei vielen Arzneistoff-Screening-Programmen, bei denen Bibliotheken von Verbindungen und natürlichen Extrakten getestet werden, sind Tests mit hohem Durchsatz wünschenswert, um die Anzahl der über einen gegebenen Zeitraum untersuchten Verbindungen zu maximieren. Tests, die in zellfreien Systemen durchgeführt werden, wie sie beispielsweise mit gereinigten oder halbgereinigten Proteinen erhalten werden können, sind häufig als „primäre” Screens bevorzugt, da sie erzeugt werden können, um eine schnelle Entwicklung und einen relativ einfachen Nachweis einer Veränderung in einem Zielmolekül, die durch eine Testverbindung vermittelt wird, zu gestatten. Zudem können die Effekte der zellulären Toxizität und/oder Bioverfügbarkeit der Testverbindung im allgemeinen im In-vitro-System ignoriert werden, wohingegen der Test hauptsächlich auf die Wirkung des Arzneistoffs auf das Zielmolekül wie sie in einer Veränderung der Bindungsaffinität mit vorgeschalteten oder nachgeschalteten Elementen manifestiert sein kann, ausgerichtet ist. Dementsprechend wird in einem beispielhaften Screening-Test die interessierende Verbindung mit Proteinen, die eine vorgeschaltete Funktion ausüben können (einschließlich sowohl Aktivatoren als auch Repressoren ihrer Aktivität) oder mit Proteinen oder Nukleinsäuren, die eine dem Delta3-Polypeptid nachgeschaltete Funktion ausüben können, gleichgültig ob sie durch letzteres positiv oder negativ reguliert werden, in Kontakt gebracht. So kann es sich beispielsweise bei einem Protein mit einer einem Delta3-Polypeptid vorgeschalteten Funktion um eine Verbindung handeln, die mit dem extrazellulären Anteil des Delta3-Moleküls wechselwirkt. Bei einem Protein mit einer einem Delta3-Polypeptid nachgeschalteten Funktion kann es sich um ein Protein handeln, das mit der zytoplasmatischen Domäne von Delta3 wechselwirkt und beispielsweise ein Signal an den Zellkern weiterleitet. Zu dem Gemisch aus der Verbindung und dem vorgeschalteten bzw. nachgeschalteten Element wird dann eine ein Delta3-Polypeptid enthaltende Zusammensetzung gegeben. Mit dem Nachweis und der Quantifizierung von Komplexen von Delta3 mit seinen vorgeschalteten oder nachgeschalteten Elementen stehen Mittel zur Bestimmung der Wirksamkeit einer Verbindung bei der Hemmung (oder Potenzierung) der Komplexbildung zwischen Delta3 und den Delta-bindenden Elementen bereit. Die Wirksamkeit der Verbindung läßt sich beurteilen, indem man Dosis-Wirkungskurven von mit verschiedenen Konzentrationen der Testverbindung erhaltenen Daten erstellt. Zudem kann auch ein Kontrolltest durchgeführt werden, um eine Basislinie als Vergleich zu liefern. Im Kontrolltest wird ein isoliertes und gereinigtes Delta3-Polypeptid zu einer das Delta-bindende Element enthaltenden Zusammensetzung gegeben und die Bildung eines Komplexes in Abwesenheit der Testverbindung quantifiziert.
Die Komplexbildung zwischen dem Delta3-Polypeptid und einem Delta3-bindenden Element kann mit verschiedenen Techniken nachgewiesen werden. Die Modulation der Ausbildung von Komplexen läßt sich beispielsweise unter Verwendung nachweisbar markierter Proteine, wie beispielsweise radioaktiv markierter, fluoreszenzmarkierter oder enzymatisch markierter Delta3-Polypeptide, mittels Immunoassay oder mittels chromatographischem Nachweis quantifizieren.
Typischerweise ist es wünschenswert, entweder Delta3 oder sein Bindungsprotein zu immobilisieren, um die Trennung der Komplexe von nicht komplexierten Formen eines oder beider Proteine zu erleichtern ebenso wie der Automatisierung des Tests entgegenzukommen. Die Bindung von Delta3 an ein vorgeschaltetes oder nachgeschaltetes Element in Gegenwart und Abwesenheit eines Kandidatenagens läßt sich in einem beliebigen zur Aufnahme der Reaktanden geeigneten Gefäß bewerkstelligen. Als Gefäß dienen beispielsweise u. a. Mikrotiterplatten, Teströhrchen und Mikrozentrifugenröhrchen. Ein Fusionsprotein kann bereitgestellt werden, das eine Domäne hinzufügt, die die Bindung des Proteins an eine Matrix gestattet. So können beispielsweise Glutathion-S-Transferase/Delta3(GST/Delta)-Fusionsproteine an Glutathion-Sepharoseperlen (Sigma Chemicals, St. Louis, MO) oder Glutathion-derivatisierte Mikrotiterplatten adsorbiert werden, die dann mit den Zellysaten, beispielsweise mit einem ³⁵S-markierten Lysat, und der Testverbindung kombiniert werden, wobei das Gemisch unter Bedingungen inkubiert wird, die der Komplexbildung förderlich sind, beispielsweise unter hinsichtlich Salz und pH-Wert physiologischen Bedingungen, obwohl etwas stringentere Bedingungen erwünscht sein können. Nach der Inkubation werden die Perlen zur Abtrennung eventuell vorhandener nicht gebundener Markierung gewaschen und die Matrix immobilisiert und die radioaktive Markierung direkt bestimmt (indem z. B. die Perlen in einen Szintillator gegeben werden) oder im Überstand nach anschließender Dissoziation der Komplexe bestimmt. Als Alternative können die Komplexe von der Matrix dissoziiert und mittels SDS-PAGE getrennt werden und das in der Perlenfraktion vorgefundene Niveau des Delta-bindenden Proteins aus dem Gel unter Verwendung von Standardelektrophoresetechniken, wie beispielsweise den in den angefügten Beispielen beschriebenen, quantifiziert werden.
Ebenso stehen andere Techniken zur Immobilisierung von Proteinen auf Matrices für die Verwendung im betreffenden Test zur Verfügung. So kann beispielsweise entweder Delta3 oder sein zugehöriges Bindungsprotein unter Nutzung der Konjugation von Biotin und Streptavidin immobilisiert werden. Biotinylierte Delta3-Moleküle lassen sich beispielsweise aus Biotin-NHS (N-Hydroxy-succinimid) mit im Fachgebiet allgemein bekannten Techniken (z. B. Biotinylierungskit, Pierce Chemicals, Rockford, IL) herstellen und in den Vertiefungen von mit Streptavidin beschichteten 96-Loch-Platten (Pierce Chemical) immobilisieren. Alternativ können Antikörper, die mit Delta3 reagieren, jedoch nicht die Bindung vorgeschalteter oder nachgeschalteter Elemente stören, in die Vertiefungen der Platte derivatisiert werden und Delta3 durch Antikörperkonjugation in den Vertiefungen eingefangen werden. Wie oben werden Präparationen eines Delta-bindenden Proteins sowie einer Testverbindung in den Delta-präsentierenden Vertiefungen der Platte inkubiert, wonach die Menge an in der Vertiefung eingefangenem Komplex quantifiziert werden kann. Zu den Verfahren zum Nachweis derartiger Komplexe gehören neben den oben für die GST-immobilisierten Komplexe beschriebenen Verfahren beispielsweise der Immunnachweis von Komplexen unter Verwendung von Antikörpern, die mit dem Delta3-bindenden Element reagieren oder die mit Delta3-Protein reagieren und mit dem Bindungselement konkurrieren, ebenso wie enzymverknüpfte Tests, die auf den Nachweis einer mit dem Bindungselement assoziierten enzymatischen Aktivität, bei der es sich entweder um eine intrinsische oder extrinsische Aktivität handeln kann, beruhen. Im Fall der letzteren kann das Enzym chemisch konjugiert sein oder als Fusionsprotein mit dem Delta-BP bereitgestellt werden. Zur Veranschaulichung: Das Delta-BP läßt sich chemisch mit Meerrettich-Peroxidase quervernetzen oder genetisch damit fusionieren, und die Menge an im Komplex gefangenem Polypeptid kann mit einem chromogenen Substrat des Enzyms, z. B. 3,3'-Diaminobenzadin-tetrahydrochlorid oder 4-Chlor-1-naphthol, beurteilt werden. Gleichfalls kann ein das Polypeptid und Glutathion-S-Transferase umfassendes Fusionsprotein bereitgestellt und die Komplexbildung durch Nachweisen der GST-Aktivität unter Verwendung von 1-Chlor-2,4-dinitrobenzol quantifiziert werden (Habig et al. (1974) J Biol Chem 249:7 130).
Für Verfahren, die auf dem Immunnachweis zur Quantifizierung eines der im Komplex gefangenen Proteine beruhen, können Antikörper gegen das Protein, wie beispielsweise Anti-Delta3-Antikörper, verwendet werden. Alternativ läßt sich das im Komplex nachzuweisende Protein in Form eines Fusionsproteins mit einem „Epitop-Tag” versehen, wobei das Fusionsprotein neben der Delta3-Sequenz ein zweites Polypeptid beinhaltet, für das Antikörper leicht verfügbar sind (z. B. aus kommerziellen Quellen). Beispielsweise lassen sich die oben beschriebenen GST-Fusionsproteine auch zur Quantifizierung der Bindung unter Verwendung von Antikörpern gegen die GST-Gruppierung verwenden. Zu weiteren geeigneten Epitop-Tags gehören myc-Epitope (z. B. siehe Ellison et al. (1991) J. Biol Chem 266: 21150–21157), die eine Sequenz aus 10 Resten von c-myc enthalten, ebenso wie das pFLAG-System (International Biotechnologies, Inc.) oder das pEZZ-Protein-A-System (Pharamacia, NJ).
4.7.2 Tests auf Zellbasis
Neben zellfreien Tests, wie den oben beschriebenen, erleichtert die leicht verfügbare Quelle von durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten Delta3-Proteinen ebenso die Entwicklung von Tests auf Zellbasis zur Identifizierung kleiner Molekülagonisten/-antagonisten und dergleichen. So können beispielsweise Zellen, die gegenüber bFGF/VEGF oder Matrigel empfindlich sind, zur Überexpression eines rekombinanten Delta3-Proteins in Gegenwart und Abwesenheit eines interessierenden Testagens veranlaßt werden, wobei der Test die von dem Testagens vermittelte Modulation der Delta3-Antworten durch die Zielzelle aufzeichnet. Wie bei den zellfreien Tests lassen sich Agentien, die eine statistisch signifikante Änderung der Delta-abhängigen Antworten (entweder Hemmung oder Potenzierung) produzieren, identifizieren. In einer veranschaulichenden Ausführungsform wird die Expression oder Aktivität eines Delta3 in Embryos oder Zellen moduliert, wobei die Auswirkungen interessierender Verbindungen auf das interessierende Ableseereignis (wie z. B. Gewebedifferenzierung, Proliferation, Tumorigenese) gemessen werden. So läßt sich beispielsweise die Expression von Genen, die als Antwort auf eine Delta-abhängige Signalkaskade herauf- oder herunterreguliert werden, testen. In bevorzugten Ausführungsformen sind die regulatorischen Bereiche solcher Gene, beispielsweise die 5'-flankierenden Promotor- und Enhancer-Bereiche, mit einem nachweisbaren Marker (wie z. B. Luciferase), der für ein Genprodukt, das leicht nachgewiesen werden kann, codiert, operativ verknüpft.
Beispielhafte Zellinien können Endothelzellen, wie z. B. MVECs, sowie aortische Endothelzellen aus Rindern (BAECs) ebenso wie generische Säugerzellinien, wie z. B. HeLa-Zellen und COS-Zellen, z. B. COS-7(ATCC#-CRL-1651), umfassen.
Eine Testverbindung, die eine Delta3-Aktivität modifiziert, läßt sich durch Inkubieren einer ein Delta3-Protein aufweisenden Zelle mit der Testverbindung sowie Messen der Signaltransduktion von dem Delta3-Protein identifizieren. Ein Vergleich der Signaltransduktion in den mit oder ohne die Testverbindung inkubierten Zellen zeigt, ob es sich bei der Testverbindung um ein Delta3-Therapeutikum handelt. Auf ähnliche Weise läßt sich eine Testverbindung, die eine Delta3-Aktivität modifiziert, durch Inkubieren einer einen Delta3-Liganden aufweisenden Zelle mit der Testverbindung, z. B. einer von Delta3 abgeleiteten Verbindung, und Messen der Signaltransduktion von dem Delta3-Liganden identifizieren. Ein Vergleich der Signaltransduktion in den mit der oder ohne die Testverbindung inkubierten Zellen zeigt, ob es sich bei der Testverbindung um ein Delta3-Therapeutikum handelt.
Für den Fall, daß die Delta3-Proteine selbst oder in Komplexen mit anderen Proteinen zur Bindung von DNA und/oder Modifikation der Transkription eines Gens in der Lage sind, könnte ein Test auf Transkriptionsbasis verwendet werden, bei dem beispielsweise eine auf Delta3 reagierende regulatorische Sequenz mit einem nachweisbaren Markergen, z. B. einem Luciferase-Gen, operativ verknüpft ist. Auf ähnliche Weise könnten auch Delta3-Therapeutika unter Verwendung eines Tests identifiziert werden, bei dem die Expression von Genen, die nach Bindung eines Delta3-Proteins an einen Delta3-Liganden auf einer Zelle moduliert werden, befolgt wird. Gene, die auf eine Wechselwirkung mit einem Delta3-Protein oder Delta3-Liganden reagieren, können gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren, beispielsweise Differentialhybridisierung oder differentiellem Display, identifiziert werden.
Eine Vorrichtung auf Siliciumbasis, die als Mikrophysiometer bezeichnet wird, kann zum Nachweis und zur Messung der Antwort von Zellen mit einem Delta3-Protein verwendet werden, um Verbindungen zur Identifizierung von Delta3-Therapeutika zu testen. Dabei mißt dieses Gerät die Geschwindigkeit, mit der Zellen ihre Umgebung ansäuern, was ein Hinweis auf Zellwachstum und/oder -differenzierung ist (McConnel et al. (1992) Science 257: 1906).
Die Verfolgung des Einflusses von Verbindungen auf Zellen kann nicht nur beim grundlegenden Arzneistoff-Screening, sondern auch in klinischen Versuchen angewandt werden. In solchen klinischen Versuchen kann die Expression einer Reihe von Genen als ein „Read out” der therapeutischen Wirkung eines bestimmten Arzneistoffs verwendet werden.
Die betreffenden Delta3-Polypeptide können zur Entwicklung eines „Two hybrid”-Tests (siehe z. B. US-Patent Nr. 5,283,317 ; Zervos et al. (1993) Cell 72: 223–232; Madura et al. (1993) J Biol Chem 268: 12046–12054; Bartel et al. (1993) Biotechniques 14: 920–924; Iwabuchi et al. (1993) Oncogene 8: 1693–1696; und Brent WO94/10300 ), zur Isolierung codierender Sequenzen für andere zelluläre Proteine, die an Delta3 binden oder damit wechselwirken („Delta-bindende Proteine” bzw. „Delta-bp”), wie z. B. Notch, und dergleichen verwendet werden. In Kürze: der Two-hybrid-Test beruht auf der In-vivo-Rekonstituierung eines funktionellen Transkriptionsaktivatorproteins aus zwei getrennten Fusionsproteinen. Insbesondere werden bei dem Verfahren chimärische Gene, die Hybridproteine exprimieren, verwendet. Zur Veranschaulichung: ein erstes Hybridgen umfaßt die codierende Sequenz für eine DNA bindende Domäne eines Transkriptionsaktivators, die im Leseraster mit der codierenden Sequenz für ein Delta3-Polypeptid fusioniert ist. Das zweite Hybridprotein codiert für eine Transkriptionsaktivierungsdomäne, die im Leseraster mit einem Probegen aus einer cDNA-Bank fusioniert ist. Falls das Köder- und das Proben-Hybridprotein miteinander wechselwirken können, beispielsweise unter Ausbildung eines Delta-abhängigen Komplexes, so bringen sie dadurch die beiden Domänen des Transkriptionsaktivators in enge Nachbarschaft zueinander. Diese Nähe zueinander reicht aus, um die Transkription eines Reportergens auszulösen, das mit einer auf den Transkriptionsaktivator reagierenden Transkriptionsregulationsstelle operativ verknüpft ist, und die Expression des Reportergens läßt sich nachweisen und zum Aufzeichnen der Wechselwirkung der Delta3- und Probenproteine verwenden. Dieses System läßt sich zur Identifizierung von Verbindungen, die die Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem anderen Protein modifizieren, z. B. hemmen, verwenden, indem man die Testverbindung zu einer die oben beschriebenen Plasmide enthaltenden Zelle gibt. Die Wirkung der Testverbindung auf die Expression des Reportergens wird dann gemessen, um die Wirkung der Testverbindung auf die Wechselwirkung zu bestimmen.
Ebenso beschrieben sind Arrays zur Identifizierung von Verbindungen, die über ein Delta3-Protein Zellapoptose induzieren können, bereitgestellt. Apoptotische Arrays sind im Fachgebiet bekannt und beispielsweise bei Grimm et al. (1996) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 10923 beschrieben.
5. BEISPIELE
5.1 Isolierung einer hDelta3 codierenden Vollängen-cDNA
Menschliche mikrovaskuläre Endothelzellen (MVEC, Katalog-Nr. CC2543; Clonetics, San Diego, CA) wurden in vier Proben von Zellen getrennt, die wie folgt behandelt wurden. Bei der ersten Probe handelte es sich um eine unbehandelte Probe. Die zweite Probe wurde mit menschlichem TGF-β1 (hTGF-β1) (10 ng/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, N. Y., Katalog-Nr. 01-134) behandelt. Die dritte Probe wurde mit bFGF (10 ng/ml)/VEGF (25 ng/ml) (Upstate Biotechnology, Lake Placid, N. Y., Katalog-Nr. 01-134, Katalog-Nr. 01-106 bzw. 01-185) behandelt. Die vierte Probe wurde auf Matrigel (Collaborative Biomedical Products, Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) differenziert. Die Zellen wurden wie angegeben 24 Stunden behandelt, die vier Proben wurden vereinigt, und RNA wurde aus den vereinigten Zellen unter Verwendung eines RNeasy-Kits der Firma QIAGEN extrahiert. Die erhaltene cDNA-Bank wurde einer Zufallssequenzierung mit hohem Durchsatz ausgesetzt. Dies gestattete die Identifizierung eines cDNA-Fragments, das die folgende 171 Nukleotide lange Sequenz umfaßt:
Ein Vergleich der Nukleotidsequenz dieser partiellen cDNA mit den Sequenzen in GenBank unter Verwendung des Programms BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403) zeigte, daß die Nukleotidsequenz für ein Proteinfragment codierte, das eine signifikante Homologie mit Delta-Proteinen aufweist. In der Tat wies die Aminosäuresequenz eine signifikante Homologie mit einem Delta1-Protein aus Huhn (GenBank Accession No. U26590), einem Delta1-Protein aus Xenopus (GenBank Accession No. L42229), einem Delta1-Protein aus Ratte (GenBank Accession No. U78889), einem Delta2-Protein aus Xenopus (GenBank Accession No. U70843) ebenso wie mit Notch-Proteinen auf.
Anschließend wurde eine etwa 3,2 kb große Vollängen-cDNA durch Screening einer cDNA-Bank aus menschlichen mikrovaskulären Endothelzellen (HMVEC) unter Verwendung der partiellen cDNA (SEQ ID NO. 21) isoliert. Diese Nukleinsäure wurde bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 5. März 1997 hinterlegt und ATCC Accession No. 98348 zugeordnet. Die Nukleotidsequenz der isolierten cDNA ist in 1 gezeigt und weist die SEQ ID No. 1 auf.
Ein Nukleinsäuresequenzvergleich der SEQ ID No. 1 gegen EST-Sequenzdatenbanken unter Verwendung des Programms BLAST (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403) deutete an, daß 5 ESTs eine Homologie zu Anteilen der SEQ ID No. 1 aufweisen. Diese sind allesamt 3' von der für die Transmembrandomäne codierenden Nukleotidsequenz, d. h. stromabwärts von Nukleotid 1996 der SEQ ID No. 1 lokalisiert. Drei dieser ESTs (mit den Zugangsnr. T33770, T33811 und T07963) weisen eine Nukleotidsequenz auf, die bei etwa Nukleotid 2044 der SEQ ID No. 1 beginnt. Allerdings unterscheidet sich die Nukleotidsequenz der drei EST in signifikanter Weise von der Nukleotidsequenz von hDelta3 in etwa den ersten 50 Nukleotiden 3' von Nukleotid 2044 der SEQ ID No. 1. Zwei ESTs (mit Accession Nos. R32717 und T07962) sind weiter stromabwärts von den drei ESTs lokalisiert.
Die Nukleinsäure mit der SEQ ID No. 1 codiert für ein Protein aus 685 Aminosäuren mit der SEQ ID No. 2. Ein Vergleich der Aminosäuresequenz der SEQ ID No. 2 mit Sequenzen in GenBank unter Verwendung von BLASTP (Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403) zeigt, daß dieses Protein eine gewisse Homologie zu bereits beschriebenen Delta-Proteinen aufweist. 2 zeigt eine vergleichende Gegenüberstellung des menschlichen Delta3-Proteins mit der SEQ ID No. 2 mit der Aminosäuresequenz des Maus-Delta1-Proteins (Accession No. X80903), des Ratte-Delta1-Proteins (Accession No. U78889), des Huhn-Delta1-Proteins (Accession No. U26590), der zwei Xenopus-Delta1-Proteine (Accession Nos. L42229 und U70843) und des Drosophila-Delta1-Proteins (Accession No. AA142228). Der Sequenzvergleich deutet an, daß das menschliche Delta3-Protein die allgemeine Struktur eines Delta3-Proteins aufweist. Insbesondere weist das menschliche Delta3-Protein ein Signalpeptid, das etwa Aminosäure 1 bis etwa Aminosäure 17 der SEQ ID No. 2 entspricht, ein DSL-Motiv, das der Sequenz von etwa Aminosäure 173 bis etwa Aminosäure 217 entspricht, eine erste EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 222 bis etwa Aminosäure 253 entspricht, eine zweite EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 253 bis etwa Aminosäure 281 entspricht, eine dritte EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 288 bis etwa Aminosäure 321 entspricht, eine vierte EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 328 bis etwa Aminosäure 359 entspricht, eine fünfte EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 366 bis etwa Aminosäure 399 entspricht, eine sechste EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 411 bis etwa Aminosäure 437 entspricht, eine siebte EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 444 bis etwa Aminosäure 475 entspricht, eine achte EGF-ähnliche Wiederholung, die der Sequenz von etwa Aminosäure 484 bis etwa Aminosäure 517 entspricht, eine Transmembrandomäne, die der Sequenz von etwa Aminosäure 530 bis etwa Aminosäure 553 entspricht, sowie eine zytoplasmatische Domäne, die der Sequenz von etwa Aminosäure 554 bis etwa Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 entspricht, auf.
Ein Aminosäure- und Nukleotidsequenzvergleich zwischen den Mitgliedern der Delta1- und Delta3-Proteinfamilie und dem menschlichen Delta3 einerseits und zwischen den Mitgliedern der Delta1-Familie zeigt, daß die Homologie zwischen den Delta3-Familienmitgliedern stärker ist als die Homologie zwischen menschlichem Delta3 und einem der Delta1-Familienmitglieder. Obwohl beispielsweise hDelta3 nur ungefähr 58% Ähnlichkeit mit dem Drosophila-Delta1-Protein, ungefähr 70% Ähnlichkeit mit dem Maus-Delta1-Protein, ungefähr 70% Ähnlichkeit mit dem Ratte-Delta1-Protein, ungefähr 68% Ähnlichkeit mit dem Huhn-Delta1-Protein und ungefähr 68% Ähnlichkeit mit den Xenopus-Delta1-Proteinen aufweist, sind die Delta1-Proteine aus Drosophila, Maus, Ratte, Huhn und Xenopus sehr ähnlich zueinander (z. B. die Proteine aus Maus und Ratte weisen etwa 96% Ähnlichkeit auf). Aus der veröffentlichten PCT-Anmeldung WO97/01571 ist eine partielle Nukleotid- und Aminosäuresequenz eines Proteins mit einer signifikanten Homologie zu Delta1-Familienmitgliedern bekannt, was darauf hindeutet, daß es sich dabei wahrscheinlich um ein menschliches Delta1-Protein handelt. Die Homologie zwischen der partiellen Aminosäuresequenz von menschlichem Delta1 und der Aminosäuresequenz des menschlichen Delta3 ist in Tabelle I angedeutet und zeigt, daß die Proteine von unterschiedlichen Genen codiert werden. Alle diese Aminosäure- und Nukleotidsequenzvergleiche deuten an, daß es sich bei dem menschlichen Delta3 um eine zusätzliche Spezies von Delta-Proteinen handelt, die eine gewisse Sequenz- und Strukturhomologie mit den Delta1-Proteinen teilt.
5.2 Gewebeexpression des hDelta3-Gens
In diesem Beispiel wird die Verteilung des Delta3-Proteins in Gewebe beschrieben, wie sie mittels Northern-Blot-Hybridisierung mit einem 1,6 kb großen Fragment menschlicher Delta3-cDNA, das dem äußersten 3'-Ende der SEQ ID No. 1 entspricht, bestimmt wurde.
Northern-Blot-Hybridisierungen mit den verschiedenen RNA-Proben wurden unter Standardbedingungen durchgeführt und unter stringenten Bedingungen, d. h. in 0,2 × SSC bei 65°C, gewaschen. Bei jeder Probe wurde die Sonde jeweils an eine etwa 3,5 kb große einzelne RNA hybridisiert. Die Ergebnisse der Hybridisierung der Sonde an verschiedene mRNA-Proben sind nachfolgend beschrieben.
Die Hybridisierung eines RNA aus fötalem Hirn, fötaler Lunge, Leber und Niere enthaltenden Clontech Fetal Multiple Tissue Northern (MTN)-Blots (Clontech, LaJolla, CA) deutete auf das Vorhandensein von Delta3-RNA in jedem dieser fötalen Gewebe hin. Dabei war die Expression in fötaler Lunge und Niere deutlich höher als in fötalem Hirn und fötaler Leber. Die Hybridisierung eines RNA aus adultem Herz, Hirn, adulter Plazenta, Lunge, Leber, adultem Skelettmuskel, adulter Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, adultem Thymus, adulter Prostata, adultem Hoden, Eierstock, Dünndarm, adulter Dickdarmschleimhaut und adulten peripheren Blutleukozyten enthaltenden menschlichen MTNI(Multiple Tissue Northern I)-Blots bzw. MTNII(Multiple Tissue Northern II)-Blots, jeweils von Clontech (Clontech, LaJolla, CA), mit der menschlichen 1,6 kb großen Delta3-Sonde wies auf eine Expression in Herz, Plazenta, Lunge, Skelettmuskel, Niere, Bauchspeicheldrüse, Milz, Thymus, Prostata, Hoden, Eierstock, Dünndarm und Dickdarm hin. Die Expression war besonders stark in adultem Herz, adulter Plazenta, Lunge und adultem Skelettmuskel. Eine Expression wurde auch in adultem Hirn, adulter Leber und adultem Hoden festgestellt. Dagegen wurde keine signifikante Menge an hDelta3-mRNA in adulten peripheren Blutleukozyten nachgewiesen.
Ferner wurde durch eine Northern-Blot-Hybridisierung von Gesamt-mRNA aus jeweils über einen Zeitraum von 24 Stunden mit 10 ng/ml TGF-β1, 10 ng/ml bFGF/25 ng/ml VEGF behandelten oder unbehandelten HMVEC-Zellen angedeutet, daß die Delta3-Expression nach Induktion mit bFGF/VEGF induziert wurde. Dementsprechend wird die Expression von Delta3 in HMV-Endothelzellen als Antwort auf gewisse Wachstumsfaktoren heraufreguliert.
Die Hybridisierung eines RNA aus HL-60-, HeLa-, K562-, MoLT4-, Raji-, SW480-, A549- und G361-Zellen enthaltenden „Krebs”-Northern-Blots zeigte, daß Delta3 in der Kolorektalkarzinomzellinie SW480 auf hohem Niveau exprimiert wird. Somit liegt wenigstens in bestimmten Tumorzellen eine hohe Delta3-Expression vor.
Somit zeigt dieses Beispiel, daß das Delta3-Gen in zahlreichen Geweben exprimiert wird, daß es jedoch in gewissen Geweben, beispielsweise peripheren Blutleukozyten und adultem Herzgewebe (wenigstens bei Verwendung einer Northern-Blot-Hybridisierung) nicht nachweisbar ist, daß es wenigstens in einigen Tumorzellen, beispielsweise Kolonkarzinomzellen, auf relativ hohem Niveau exprimiert wird und daß seine Expression als Antwort auf einige Wachstumsfaktoren, beispielsweise bFGF und VEGF, heraufreguliert werden kann.
5.3 Chromosomale Lokalisierung des hDelta3-Gens
Ein Southern-Blot mit DNA aus einer Reihe monochromosomaler somatischer Mensch/Hamster-Zellhybride wurde mit einer hDelta1cDNA-Sonde sondiert. Die erhaltenen Ergebnisse weisen eindeutig darauf hin, daß das menschliche Delta3-Gen auf Chromosom 15 liegt.
5.4 Erhöhte Expression von hDelta3 in differenzierenden Endothelzellen
Mit diesem Beispiel wird gezeigt, daß die Expression des hDelta3-Gens in differenzierenden Endothelzellen gegenüber nicht differenzierenden Endothelzellen erhöht ist.
HMVEC-Zellen wurden in 5 Kulturen getrennt und wie folgt behandelt: (1) Zellen wurden durch Wachstum in basalem Endothelwachstumsmedium (EGM) (Clontech), das 10% fötales Kälberserum (FCS) enthält, in den Ruhezustand versetzt; (2) Zellen wurden in komplettem Endothelwachstumsmedium (EGM-MV) (Clontech, Katalog-Nr. CC-3125), das 10% FCS und Wachstumsfaktoren enthält, kultiviert; (3) Zellen wurden durch Kultivierung in EGM-MV in Gegenwart von 10 ng/ml bFGF und 25 ng/ml VEGF zur Proliferation angeregt; (4) Zellen wurden durch Kultivierung in EGM-MV in Gegenwart von 10 ng/ml TGF-β1 zur Proliferation angeregt; und (5) Zellen wurden durch Kultivierung in EGM-MV auf Matrigel zur Differenzierung angeregt. Nach 24stündiger Kultivierung wurden die Zellen geerntet, die RNA wurde extrahiert und einer Northern-Blot-Analyse unterzogen. Die Hybridisierung wurde mit der oben beschriebenen 1,6 kb großen hDelta3-Sonde durchgeführt. Die Ergebnisse deuten an, daß unter den getesteten Kulturbedingungen ruhende Zellen die geringste Menge an hDelta3 (auf einem kaum nachweisbaren Niveau) exprimieren. Proliferierende Zellen exprimieren ein höheres Niveau an hDelta3. Interessanterweise wurde der hDelta3-mRNA-Spiegel in Zellen, die durch Ausplattieren auf Matrigel zur Differenzierung induziert worden waren, stark erhöht.
Somit wird durch dieses Beispiel eindeutig demonstriert, daß die hDelta3-Expression in zur Differenzierung induzierten Zellen und ebenso in zur Proliferation induzierten Zellen stark erhöht ist.
5.5 hDelta3 ist in einem mit ACCPN assoziierten chromosomalen Bereich lokalisiert
Die Lokalisation von hDelta3 auf dem menschlichen Chromosom 15 wurde mittels RH(Radiation Hybrid)-Kartierung bestimmt.
Dabei wurde unter Verwendung eines Vorwärtsprimers mit der Nukleotidsequenz GTTTACATTGCATCCTGGAT (SEQ ID NO. 21) und eines Rückwärtsprimers mit der Nukleotidsequenz CTCTTCTGTTCCTCTGGTTG (SEQ ID NO. 22) vom 3'-nichtranslatierten Bereich des Gens eine STS (Sequence Tagged Site) erzeugt. Die STS wurde zum Screening der RH(Radiation Hybrid)-Reihen Genebridge 4 (Gyapay et al. (1996) Human Molecular Genetics 5: 339) und Stanford G3 (Stewart et al. (1997) Genome Res. 7: 422) verwendet. Diese Reihen wurden aus der Fusion bestrahlter menschlicher Donorzellen mit Nager-Empfängerzellen (Referenz) erhalten und lassen sich zur Positionierung von STS-Markern innerhalb existierender Grundgerüstkarten, zum Ordnen von Markern im interessierenden Bereich ebenso wie zur Ermittlung des Abstands zwischen Markern verwenden.
Die RH-Kartierung wurde mittels PCR unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: 25 ng DNA/20 μl Reaktion, 0,5 μM von jedem Primer, 0,2 mM von jedem Nukleotid, 1,5 mM MgCl₂, 1 × Puffer, wie vom Hersteller des Enzyms bereitgestellt, 35 Zyklen über jeweils 30 Sekunden bei 94°C, 55°C, 72°C.
Die Ergebnisse der RH-Kartierung deuteten an, daß hDelta3 bei 15q12-15, in der Nähe des Grundgerüstmarkers D15S1244 der Stanford-G3-Reihe und in der Nähe des Grundgerüstmarkers D15S144 der Genebridge-4-Reihe, mit einem LOD-Wert von > 3 kartiert ist. Eine Durchsuchung der OMIM-Datenbank (Online Mendelian Inheritence in Man; http://www.ncbi.nlm.nih.gob/Omim/searchomim.html) wies darauf hin, daß dieser Bereich bereits genetisch mit einer neurologischen Störung unter dem Namen Agenesis of the Corpus Callosum with Peripheral Neuropathy (ACCPN) in Verbindung gebracht wurde (Casaubon et al. (1996) Am. J. Hum. Genet. 58: 28).
5.6 Identifizierung von Delta-Therapeutika
In diesem Beispiel wird ein einfacher Test zur Isolierung von Delta-Therapeutika (z. B. Agonist oder Antagonist einer Delta-Bioaktivität), z. B. Delta3-Therapeutika, beschrieben. Wenigstens teilweise aufgrund der in den vorhergehenden Beispielen beschriebenen Ergebnisse können Delta-Therapeutika zur Behandlung verschiedener Krankheiten, einschließlich neurologischer Krankheiten und/oder hyper- oder hypoproliferativer Krankheiten sowie mit Defekten der Gefäßversorgung assoziierten Krankheiten oder Leiden eingesetzt werden. Darüber hinaus lassen sich Delta3-Therapeutika zumindest teilweise aufgrund der Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz und Struktur zwischen den verschiedenen Delta-Proteinen zur Behandlung von mit einer anomalen Delta3-Aktivität oder einer anomalen anderen Delta-Aktivität als der Delta3-Aktivität assoziierten Krankheiten oder Leiden einsetzen. In ähnlicher Weise lassen sich Delta3-Therapeutika ebenso wie andere Delta-Therapeutika als Delta3-Therapeutika zur Behandlung von mit einer anomalen Delta3-Aktivität assoziierten Krankheiten oder Leiden einsetzen. Der unten angegebene Test läßt sich auf andere Delta-Proteine als Delta3-Proteine anwenden.
Ein Delta3-Therapeutikum läßt sich unter Verwendung eines In-vitro-Tests, bei dem die Wechselwirkung zwischen einem Delta3-Protein und einem Delta3-bindenden Protein, z. B. einem Notch-Protein, in Gegenwart und in Abwesenheit einer Testverbindung bestimmt wird, identifizieren. Dabei kann ein lösliches Bindungsfragment eines Delta3-Proteins durch Expression des extrazellulären Anteils von menschlichem Delta3, beispielsweise etwa Aminosäuren 1–529 der SEQ ID No. 2, in E. coli gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Alternativ kann es sich bei dem Delta3-Proteinfragment etwa um Aminosäure 173 bis etwa Aminosäure 517 der SEQ ID NO. 2 handeln. In ähnlicher Weise läßt sich ein Delta3 bindendes Fragment eines Delta3 bindenden Proteins (d. h. eines Delta3-Bindungspartners) rekombinant produzieren. Bei einem Delta3 bindenden Protein kann es sich um ein Notch-Protein handeln, das identifiziert werden kann, indem man beispielsweise bestimmt, ob das Protein zur Bindung an ein Delta3-Protein in der Lage ist. Eine für ein Notch-Protein codierende Nukleinsäure läßt sich erhalten, indem man beispielsweise einen für wenigstens eine EGF-ähnliche Domäne codierenden Anteil eines Notch-Gens unter Verwendung von Primern mit einer von der Nukleotidsequenz eines in GenBank vorhandenen oder aus der PCT-Anmeldung Nr. PCT/US92/03651 oder PCT/US93/09338 bekannten Notch-Gens abgeleiteten Nukleotidsequenz PCR-amplifiziert.
Die Testverbindungen können dann getestet werden, um zu bestimmen, ob sie die Wechselwirkung zwischen dem Delta3 und dem Delta3 bindenden Protein hemmen, indem man einen Test vom ELISA-Typ verwendet. Dementsprechend wird entweder das rekombinant produzierte Delta3-Protein oder das Delta3 bindende Protein, z. B. Notch-Protein, an eine Festphasenoberfläche gebunden und das jeweils andere Protein markiert, indem man beispielsweise das Protein mit einem Epitop-Tag versieht, für das ein Antikörper zur Verfügung steht (z. B. FLAG-Epitop, erhältlich von International Biotechnologies, Inc.). So kann man beispielsweise das Delta3-Protein an die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte (96-Loch-Platte) durch Inkubation des Proteins über Nacht bei einer Konzentration von 10 μg/ml in PBS binden. Nach Blockierung unbesetzter Stellen auf der Platte mit einer BSA-Lösung werden verschiedene Mengen an Testverbindungen und dem rekombinant produzierten Delta3 bindenden Protein in einem für eine spezifische Wechselwirkung zwischen den Proteinen geeigneten Puffer in die Vertiefungen gegeben. Nach einer Inkubationszeit von mehreren Stunden werden die Vertiefungen mit Puffer gespült und die Menge an an die Vertiefungen gebundenem Delta3 bindendem Protein bestimmt. Die Menge an gebundenem Protein läßt sich bestimmen, indem man die Vertiefungen mit einem Anti-Tag-, bzw. Anti-myc-, Antikörper inkubiert, der dann mittels Enzym-Immunoassay nachgewiesen werden kann. Die Menge an gebundenem Protein wird dann durch Bestimmen der optischen Dichte unter Verwendung eines ELISA-Ablesegeräts bestimmt. Eine geringere Menge an Delta3 bindendem Protein in einer Vertiefung, die eine Testverbindung enthielt, gegenüber einer Vertiefung, die keine Testverbindung enthielt, deutet darauf hin, daß die Testverbindung die Wechselwirkung zwischen Delta3 und einem Delta3 bindendem Protein hemmt.
Ein Delta3-Therapeutikum läßt sich ebenso identifizieren, indem man einen Reportertest verwendet, bei dem das Niveau der Expression eines Reporterkonstrukts unter der Kontrolle eines Delta3-Promotors in Gegenwart oder Abwesenheit einer Testverbindung gemessen wird. Ein Delta3-Promotor läßt sich durch das Screening einer genomischen Bank mit einer Delta3-cDNA, die vorzugsweise das 5'-Ende der cDNA enthält, isolieren. Ein Teil des Delta3-Promotors, der typischerweise eine Länge von etwa 50 bis etwa 500 Basenpaare aufweist, wird dann stromaufwärts von einem Reportergen, beispielsweise einem Luciferase-Gen, in einem Plasmid kloniert. Dieses Reporterkonstrukt wird dann in Zellen, beispielsweise Nervenzellen oder Endothelzellen transfiziert. Die transfizierten Zellen werden anschließend in Vertiefungen einer Multiwell-Platte verteilt und verschiedene Konzentrationen von Testverbindungen in die Vertiefungen gegeben. Nach mehrstündiger Inkubation wird das Expressionsniveau des Reporterkonstrukts gemäß im Fachgebiet bekannten Verfahren bestimmt. Ein Unterschied im Niveau der Expression des Reporterkonstrukts in mit der Testverbindung inkubierten transfizierten Zellen gegenüber ohne die Testverbindung inkubierten transfizierten Zellen deutet darauf hin, daß die Testverbindung zur Modulation der Expression des Delta3-Gens fähig ist und es sich somit um ein Delta3-Therapeutikum handelt.
Hinterlegung von Mikroorganismen
Eine für ein menschliches Vollängen-Delta-Protein codierende Nukleinsäure ist in einem Plasmid enthalten, das bei der American Type Culture Collection (ATCC) am 5. März 1997 hinterlegt und der ATCC Accession Number 98348 zugeordnet wurde. SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche zu wenigstens 75% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch ist; b) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche zu wenigstens 85% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch ist; c) einem Nukleinsäuremolekül, das eine Nukleotidsequenz umfaßt, welche zu wenigstens 95% mit der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder einem Komplement davon identisch ist; d) einem Nukleinsäuremolekül, das ein Fragment von wenigstens 150 Nukleotiden der Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 3, der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder eines Komplements davon umfaßt; e) einem Nukleinsäuremolekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:3 oder der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids, oder ein Komplement davon umfaßt; f) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Polypeptid codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder eine von der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids codierte Aminosäuresequenz umfaßt; und g) einem Nukleinsäuremolekül, das für ein Fragment eines Polypeptids codiert, welches die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 oder die Aminosäuresequenz des von der cDNA-Insertion des bei der ATCC unter der Zugangsnummer 98348 hinterlegten Plasmids codierten Polypeptids umfaßt, wobei das Fragment wenigstens 50 zusammenhängende Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 oder des von der cDNA-Insertion des bei der ATCC als Accession Number 98348 hinterlegten Plasmids codierten Polypeptids umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Polypeptid löslich ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 2, wobei das Polypeptid ferner heterologe Polypeptide umfaßt.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, wobei das Polypeptidfragment Aminosäure 554 bis Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 umfaßt.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu wenigstens 80% zu einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu wenigstens 80% zu einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 554 bis Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, codierend für ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, die zu wenigstens 90% zu einer Aminosäuresequenz von wenigstens 50 zusammenhängenden Aminosäuren gemäß SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, 5, 6 oder 7 wobei das Polypeptid wenigstens eine Bioaktivität aufweist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, umfassend eine Nukleotidsequenz, die zu wenigstens 90% mit einer Sequenz von wenigstens 150 Nukleotiden der SEQ ID No. 1, welche nicht in den Nukleinsäuresequenzen mit GenBank Accession Nos. X80903, U78889, U26590, L42229, U70843, AA142228, X80903, T33770, T33811, T07963, R32717 oder T07962 vorhanden ist, identisch ist.
Isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, 5, 6 oder 7, die ferner eine Markierung umfaßt.
Vektor, umfassend eine isolierte Nukleinsäure nach Anspruch 1, 5, 6 oder 7.
Wirtszelle, umfassend einen Vektor nach Anspruch 11.
Isoliertes Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: a) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche zu wenigstens 75% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 homolog ist; b) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche zu wenigstens 85% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 homolog ist; c) einem Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche zu wenigstens 95% mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 homolog ist; d) einem Polypeptid, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt; und e) einem Fragment eines Polypeptids, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 2 umfaßt, wobei das Fragment wenigstens 50 aufeinanderfolgende Aminosäuren der SEQ ID NO: 2 umfaßt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Polypeptid wenigstens einen Anteil der extrazellulären Domäne der SEQ ID NO: 2 umfaßt, wobei der Anteil von Aminosäure 173 bis Aminosäure 217 der SEQ ID NO: 2 reicht.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 14, wobei es sich um ein Fusionsprotein mit einem heterologen Polypeptid handelt.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, das aus einer cytoplasmatischen Domäne von Aminosäure 554 bis Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 besteht.
Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche zu wenigstens 80% zu einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 1 bis Aminosäure 529 der SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz von wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren umfaßt, die zu wenigstens 80% mit einer Aminosäuresequenz von Aminosäure 554 bis Aminosäure 685 der SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isoliertes Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz umfaßt, welche zu wenigstens 90% zu einer Aminosäuresequenz von wenigstens 50 aufeinanderfolgenden Aminosäuren gemäß SEQ ID No. 2 homolog ist.
Isoliertes Polypeptid nach Anspruch 13, 17, 18 oder 19, das wenigstens eine Bioaktivität aufweist.
Antikörper oder Antikörperfragment, der bzw. das selektiv an das Polypeptid nach Anspruch 13, 17, 18 oder 19 bindet.
Antikörper oder Antikörperfragment nach Anspruch 21, der bzw. das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) polyklonalen Antikörpern; (b) monoklonalen Antikörpern; (c) F(ab)-Fragmenten; (d) F(ab')2-Fragmenten.
Antikörper nach Anspruch 21 oder 22, der an eine nachweisbare Substanz oder an einen zytotoxischen Arzneistoff konjugiert ist.
Antikörper nach Anspruch 23, wobei die nachweisbare Substanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: (a) Enzymen; (b) fluoreszierenden Stoffen; (c) chemilumineszierenden Stoffen; (d) biolumineszierenden Stoffen.
Verwendung des Antikörpers oder Antikörperfragments nach Anspruch 21 oder 22 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zellproliferations- und/oder -differenzierungsstörungen.
Verwendung nach Anspruch 25, wobei der Antikörper bzw. das Antikörperfragment ferner ein zytotoxisches Peptid umfaßt.
Verwendung eines isolierten Nukleinsäuremoleküls, ausgewählt aus einer der SEQ ID Nos: 16, 17, 18, 19 oder 20, das zur Modulation der Expression des Polypeptids nach Anspruch 13 fähig ist, zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zellproliferations- und/oder -differenzierungsstörungen.
Verwendung der Peptide nach Anspruch 13, 17, 18 oder 19 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Zellproliferations- und/oder -differenzierungsstörungen.
Verfahren zur Identifizierung eines Therapeutikums für das Polypeptid nach Anspruch 13, wobei man in dem Verfahren das Polypeptid mit einer Testverbindung in Kontakt bringt und bestimmt, ob die Testverbindung spezifisch an das Polypeptid bindet.
Verfahren zur Identifizierung eines Therapeutikums für das Polypeptid nach Anspruch 13, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Kombinieren des Polypeptids, eines Bindungspartners des Polypeptids sowie einer Testverbindung unter Bedingungen, bei denen das Polypeptid und der Bindungspartner ohne die Testverbindung in der Lage sind, eine Wechselwirkung einzugehen; und (ii) Nachweisen der Ausbildung eines Komplexes zwischen dem Polypeptid und dem Bindungspartner, so daß ein Unterschied in der Ausbildung eines Komplexes zwischen dem Polypeptid und dem Bindungspartner in Gegenwart der Testverbindung gegenüber der Abwesenheit der Testverbindung ein Hinweis dafür ist, daß es sich bei der Testverbindung um ein Therapeutikum für das Polypeptid handelt.
Verfahren zur Identifizierung eines Therapeutikums für das Polypeptid nach Anspruch 13, wobei man in dem Verfahren eine Zelle, die ferner das Polypeptid nach Anspruch 13 umfaßt, mit einer Testverbindung in Kontakt bringt und eine Aktivität des Polypeptids in der in Gegenwart der Testverbindung inkubierten Zelle gegenüber der Aktivität eines Polypeptids in der in Abwesenheit der Testverbindung inkubierten Zelle vergleicht, so daß ein Unterschied in der Aktivität des Polypeptids ein Hinweis darauf ist, daß es sich bei der Testverbindung um ein Therapeutikum für das Polypeptid handelt.
Verfahren zur Bestimmung, ob bei einer Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer Zellproliferations- und/oder -differenzierungsstörung, die durch eine bzw. an der eine anomale Bioaktivität des Polypeptids nach Anspruch 13 verursacht wird bzw. beteiligt ist, besteht, wobei man in dem Verfahren in einer der Untersuchungsperson entnommenen Probe wenigstens eine Bioaktivität des Polypeptids mißt, wobei ein Unterschied in der Bioaktivität des Polypeptids gegenüber der Bioaktivität des Polypeptids in einer Probe aus einer normalen Untersuchungsperson darauf hinweist, daß bei der Untersuchungsperson die Gefahr der Entwicklung einer Zellproliferations- und/oder -differenzierungsstörung, die durch eine bzw. an der eine anomale Bioaktivität des Polypeptids verursacht wird bzw. beteiligt ist, besteht.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei eine Bioaktivität des Polypeptids nach Anspruch 13 durch Messen der Expression eines das Polypeptid codierenden Gens bestimmt wird.
Verfahren zur Bestimmung, ob ein das Polypeptid nach Anspruch 13 codierendes Gen einer Untersuchungsperson eine genetische Läsion enthält, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt: (i) Inkontaktbringen einer Nukleinsäure, die wenigstens einen Anteil des für das Polypeptid codierenden Gens umfaßt, aus einer der Untersuchungsperson entnommenen Probe mit wenigstens einer Nukleinsäuresonde, die zur Wechselwirkung mit einem für das Polypeptid codierenden Wildtyp-Gen in der Lage ist; und (ii) Nachweisen der Ausbildung eines Hybrids zwischen dem Anteil des für das Polypeptid codierenden Gens aus der der Untersuchungsperson entnommenen Probe und der wenigstens einen Nukleinsäuresonde, so daß das Ausmaß der Ausbildung eines Hybrids zwischen dem Anteil des für das Polypeptid codierenden Gens aus der der Untersuchungsperson entnommenen Probe und der wenigstens einen Nukleinsäure einen Hinweis darauf gibt, ob das für das Polypeptid codierende Gen der Untersuchungsperson eine genetische Läsion enthält.