JP2005503792A - ハイ・スループット・スクリーニングにおいて同定される骨の恒常性のモジュレーター - Google Patents

ハイ・スループット・スクリーニングにおいて同定される骨の恒常性のモジュレーター Download PDF

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Abstract

本発明は、分子遺伝学および医学の分野に関する。特に、本発明は機能ゲノム科学の分野、即ち、骨の恒常性、例えば骨形成の誘導の調節において機能する遺伝子の同定方法に関する。特に、本発明は骨アルカリホスファターゼ活性の変調を検出するために計画されたハイ・スループット・スクリーニングにおいて同定されたポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドに関する。さらに、本発明は、ベクター、宿主細胞、抗体および発見されたポリヌクレオチドが関与する疾患の検出のための診断方法、およびそのような疾患の治療方法に関する。本発明はさらに新規な治療戦略を開発するために計画された薬剤化合物スクリーニングのための方法及び手段に関する。

Description

【技術分野】
【０００１】
本発明は、分子遺伝学および医学の分野に関する。特に、本発明は機能ゲノム科学の分野に関し、とりわけ、骨の恒常性において役割を果たす新規に同定されたポリヌクレオチドおよびかかるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに関する。さらに、本発明はまた、骨の恒常性において役割を果たすポリヌクレオチドおよびポリペプチドを見出すために計画されたハイ・スループット・スクリーニング方法の開発にも関する。
【背景技術】
【０００２】
今やヒトゲノム配列はほぼ完全に知られていることから、生物医学的研究は新しい時代に入りつつある。明かに個々の単一ＯＲＦだけではなく、スプライス・バリアントももちろん含む多くの予測オープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）をゲノム配列から抽出することができる。細胞と生物の生物学の完全な理解の探究において、新規なタンパク質機能についての研究が次なる必然的一歩である。かかる知識により、疾患を治療するための合理的な薬剤開発が可能となる。
【０００３】
機能ゲノム科学は、新規遺伝子およびコードされるタンパク質によって示される活性を見出すための強力かつ不偏なアプローチである。機能ゲノム科学では、測定可能な特性の増減が解読される、細胞アッセイにおけるｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングが必要である。本発明は、ハイ・スループット・スクリーニングアッセイにおいて単離され、骨の恒常性における機能を有する核酸化合物の同定の方法及び手段を提供する。
【０００４】
骨芽細胞分化：
骨には２種類の異なる細胞タイプが含まれる。骨芽細胞、即ち骨形成細胞と破骨細胞、即ち骨吸収細胞である。その機能を発揮するために、骨はこれらの２つのタイプの細胞の複雑な相互作用により、絶え間無く破壊（吸収）され、そして再構築されている。破骨細胞については、前駆細胞から機能性の破骨細胞への発達に関与する転写因子と増殖因子の詳細なカスケードが確立されている（Karsenty、1999; Teitelbaum、2000）。それに対して骨芽細胞系統についてはほとんど知られていない。胚発生の間に、骨芽細胞分化、即ち「骨形成」は２種類の経路によって起こりうる：軟骨内骨化または膜内（intramembranous）骨化である。成長期および成人において、骨芽細胞は主に骨修復および骨の再形成に関与する。骨芽細胞系統からの細胞は、破骨細胞分化を開始させて制御する分子を合成及び分泌することも知られている。骨芽細胞は間葉起源であり、細胞培養においてはほとんど線維芽細胞と区別がつかない。骨芽細胞分化は、前駆細胞が骨芽細胞へと分化する際に起こり、内在性骨アルカリホスファターゼ活性（ＢＡＰ）の上方制御により特徴付けられる。２つの骨芽細胞−特異的転写産物のみがこれまでに同定されている：１つは転写因子Ｃｏｒｅ−結合因子１（Ｃｂｆａ１）をコードし、もう１つは骨芽細胞機能を阻害する分泌分子であるオステオカルシンをコードする。Ｃｂｆａ１は骨芽細胞分化のマスター調節因子である。骨形成および／またはＣｂｆａ１発現を制御するその他の転写因子がインビトロおよびインビボでの研究により同定されている（図１）。例えば、Ｃｂｆａ１は様々な転写因子、例えばＭｓｘ２、Ｂａｐｘ１またはＨｏｘａ１、あるいは分泌因子、例えばＩｎｄｉａｎ ｈｅｄｇｅｈｏｇ（Ｉｈｈ）あるいは骨形態形成タンパク質２（ＢＭＰ２）によって調節されている。発生及び出生後生活の間にこれら２つの細胞タイプが関与する生物学的プロセスの多様性と重要性により、それらの分化および機能を理解する必要性がある（Karsenty、1999; Teitelbaum、2000）。
【０００５】
骨吸収と骨構築との間の微調整されたバランスが崩れることにより、多くの疾患が引き起こされる。より正確には、破骨細胞活性の増減または骨芽細胞の増殖および分化の増減の結果、様々な疾患が起こる。１つの最も重要な骨疾患は骨粗鬆症であるが、多くのその他の疾患の患者が多数存在する：悪性高カルシウム血症、パジェット病、関節リウマチおよび歯周病などの炎症性骨疾患、骨転移において起こる限局性骨形成、クルゾン症候群、くる病、オプシスモディスプラジア（opsismodysplasia）、ピクノディスオストーシス／トゥールーズ・ロートレック病、骨形成不全症（Karsenty、1999; Teitelbaum、2000; Rodan and Martin、2000; Goltzman、2001; Karsenty、2001）。
【０００６】
組織工学／骨修復：
骨再形成は、同化−骨形成−と異化−骨吸収−プロセスの間の平衡に依存する。骨折後、骨再形成プロセスが骨折の治癒に必要である。しかし、患者の骨折はあまりよく治癒しない場合がよくある。こういった患者は老人及び骨粗鬆症患者である傾向がある。かかる場合、回復を促進するために外科的介入が要求される。骨移植術を伴うかあるいは伴わずに補綴が移植され得る。骨があまりに穴だらけの場合や、以前の移植片が骨にうまく導入されなかった場合などには、現在の医学ではほとんどあるいは全く手が施せない。ここで、以下の方法は有用である可能性がある（Service、2000；米国特許第６１５２９６４号）：間葉前駆細胞を患者の骨髄から単離し、インビトロで骨芽細胞への分化を誘導し、移植片を覆うために用いられるバイオポリマーと混合し、そして細胞−バイオポリマー混合物によって覆われた移植片を移植する。この方法は既存の方法に対していくつかの利点を有する：セメントにより患者の骨から調製される骨片の使用の必要性が軽減する。後者の方法は患者にとって苦痛であることが多い。第二に、分化した細胞が、即座に移植片が周囲の骨に組み込まれるのを助ける。というのは該細胞は骨芽細胞であるからである。第三にこの方法には、移植片が免疫拒絶されるという危険が無い。というのは患者自身の細胞を用いるからである。
【０００７】
それゆえ多能性の骨髄間葉前駆細胞あるいは全能性の幹細胞からインビトロで骨芽細胞への分化を誘導することができる因子を見出すことが重要である。
【０００８】
現在、インビトロで骨芽細胞分化を誘導することができる化合物はわずかしか同定されていない。例えば、デキサメタゾン、または組換えヒト分泌タンパク質では、例えば、ＢＭＰ−２またはＢＭＰ−７（Service、2000）が挙げられる。
【０００９】
それゆれ、骨芽細胞または骨の恒常性に関与するその他の細胞タイプの分化を特異的に誘導する新規なヒト分泌タンパク質を見出すことは非常に興味深い。かかるタンパク質はエキソビボ／インビトロ分化プログラムにおいて利用できる。
【００１０】
しかし、新規な薬剤開発を導くこの分野における研究は、ハイ・スループット・スクリーニング（ＨＴＳ）アッセイの欠除により阻まれている。
【００１１】
骨の恒常性に関する現在のインビトロアッセイ系は、面倒で、時間がかかり、インビボ系に基く場合が多く、実際に自動化には適さない。しかし骨の恒常性の複雑性のために、インビトロアッセイ系はハイ・スループット・スクリーニングにおいて用いられたことが無い。長らく必要性が感じられていたにもかかわらず、骨の恒常性に関するインビトロアッセイは２４、４８あるいは多くとも９６ウェルプレートで行なわれてきた。
【００１２】
今日までＨＴＳの改良のための努力は、ウェルを小さくすることに向けられてきた（小型化）。ウェルのサイズを小さくすることができれば、各プレート上のウェルの数を増やすことにより、より多くの並行試験を行なうことが可能となる。さらにアッセイ容積を小さくすることにより、ウェル当たりの試薬のコストを低減させることができる。さらに、より多くの並行試験を小さいアッセイ容積で行なうことができるため、同時により多くの化合物を試験して薬剤候補化合物を見出すことができることになる。しかし、小型化にはそれ固有のコストがかかり複雑性が伴う。さらに、より小さいウェルの使用により入手可能性が制限されている一次細胞の使用が可能となる。
【００１３】
これらのコストおよび複雑性は、スクリーニング・形式(format)の小型化の３つの主成分と直接関係する。第一に、試験容器を小さくすることができなければならない。第二に、より数が多く、サイズの小さいウェルにすべての必要なアッセイ試薬を正確に分配することができなくてはならない（これは通常同時に多くのウェルに試薬を分配する液体操作ロボットにより達成される）。第三に、高密度アレイにおける試験結果を「解読」することができなければならない。
【００１４】
並行した独立のアッセイが必要となると、各成分によりどれほど小型化が実現可能かあるいはコスト効率がよいかという挑戦と限界が与えられる。例えば、サンプルサイズがより小さければ、より少ない容量の試薬を分配し、より小さいサンプルのシグナルを解読することにおける固有の不確定性によって、サンプル間の統計的変動が大きくなる。
【００１５】
ハイ・スループット・スクリーニングに関する具体的な問題は、発現可能な核酸の標的細胞への効率的な導入に関する。発現可能な核酸を含むアデノウイルスベクターおよびアデノウイルスは標的細胞に効率よく形質導入するために周知のものである。したがって、発現可能な核酸の大きいライブラリーがアデノウイルスベクターおよびアデノウイルスにおいて作られている。しかし該ベクターおよびウイルスは宿主細胞の範囲が制限されている。
【００１６】
アデノウイルスはおよそ３６０００塩基対の直鎖状の二本鎖ＤＮＡ分子を含む。それはおよそ９０−１４０塩基対であるが正確な長さは血清型に依存する同一の逆方向末端反復（ＩＴＲ）を含む。該ウイルスの複製開始点は正確にゲノム末端にあるＩＴＲ中にある。転写単位は初期領域および後期領域にわけられる。複雑なスプライシングおよびポリアデニル化機構によりコアタンパク質、キャプシドタンパク質（ペントン、ヘキソン、繊維および関連タンパク質）、ウイルスプロテアーゼおよびキャプシドのアセンブリーと宿主タンパク質翻訳のシャットダウンに必要なタンパク質をコードする１２より多いＲＮＡ種が生じる（Imperiale et al、1995）。
【００１７】
アデノウイルスと宿主細胞との相互作用は、突出繊維のノブ領域と細胞受容体との相互作用を介して起こる。Ａｄ２、Ａｄ５、およびおそらくより多くのアデノウイルスに対する受容体が「コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体」、即ちＣＡＲタンパク質として知られている（Bergelson et al、1997）。感染の第一段階は、アデノウイルスのその標的細胞に対する結合であり、この工程は繊維タンパク質に媒介される。繊維タンパク質は三量体構造を有し（Stouten et al、1992）その長さはウイルス血清型に依存する（Signas et al、1985; Kidd et al、1993）。異なる血清型のものは構造的に類似のＮ−およびＣ−末端を備えたポリペプチドを有するが、その中央ステム領域が異なっている。ノブは、血清型の間で保存された領域をいくらか含むが、ノブタンパク質は高度の可変性を示し、様々なアデノウイルス受容体が存在することが示唆される。現在では、ヒトアデノウイルスの６種のサブグループが提案されており、これらを合計するとおよを５０種類の異なるアデノウイルス血清型が包含される。血清型は、動物（ウマ、ウサギ）抗血清による定量的中和によって決定される免疫学的特異性に基いて規定される。異なるアデノウイルス血清型は、中和抗体に対する感受性に差があるだけでなく、サブグループＣのアデノウイルス（例えば、Ａｄ２およびＡｄ５）はサブグループＢのアデノウイルス（例えば、Ａｄ３およびＡｄ７）と比較して異なる受容体に結合する（Defer et al、1990; Gall et al、1996）。これらの血清型は少なくとも細胞結合に必要なタンパク質（繊維タンパク質）において異なっている。しかし、（少なくともいくつかの）これらのサブグループのメンバーがＣＡＲに結合することができるという事実は、これらのウイルスが様々な細胞タイプにおいて異なる感染効率を有するということを否定しない。したがって、これらの間でＣＡＲに対する結合能力は共有されているが、異なる血清型での繊維の長さ、ノブ配列およびその他のキャプシドタンパク質（例えば、ペントン塩基）の差により、特定の標的細胞に感染するアデノウイルスの効力が決定される可能性がある。
【００１８】
現在、機能ゲノム科学、遺伝子治療またはワクチン接種に用いられているアデノウイルス遺伝子送達ベクターのほとんどが、サブグループＣアデノウイルスＡｄ２またはＡｄ５由来のものである。該ベクターは、組換えウイルスの複製を無効にするような少なくとも１つの欠失をＥ１領域において有している。この領域に、新規な遺伝情報を導入することができる。動物モデルおよび免疫不全マウスにおけるヒト異種移植において、組換えアデノウイルス、特に血清型５のものが、インビボで肝臓、気道上皮および固形腫瘍に遺伝子を効率的に移入させるのに好適であることが示された（Bout 1996、1997; Blaese et al、1995）。
【００１９】
機能ゲノム科学におけるアデノウイルスベクターの使用には、遺伝子発現ライブラリーの構築およびインビトロおよびインビボの遺伝子バリデーションが含まれ、これには適切な細胞に基くアッセイまたは特定のヒト疾患のための動物モデルが用いられる。アデノウイルス由来の遺伝子移入ベクター（アデノウイルスベクター）は、特に遺伝子移入に好適な数多くの特徴を有する。しかし、アデノウイルスベクターおよびアデノウイルスの使用に関していまだに多くの欠点が存在する。特に、血清型Ａｄ２およびＡｄ５は、肝臓以外の器官にさらなる遺伝物質を送達するのには理想的とはいえない。標準的なＡｄ２またはＡｄ５アデノウイルスベクターおよびアデノウイルスを用いる機能ゲノム科学にとっては、インビトロまたはエキソビボ遺伝子移入は、特に骨の恒常性に関する細胞においては非常に制限される可能性がある。
【００２０】
（発明の概要）
本発明は、１つの態様において、骨の恒常性において機能する遺伝子の同定方法、特に骨芽細胞分化を誘導する遺伝子の同定方法に関する。とりわけ、本発明のスクリーニング方法は、内在性骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）活性の上方制御を測定することによって、前駆細胞の骨芽細胞への分化を誘導することにより機能するポリヌクレオチドおよびポリペプチドを同定する。アレイに並べた(arrayed)核酸ライブラリーを用いてヒト一次間葉前駆細胞（ＭＰＣ）のアレイを形質導入し、ハイ・スループット設定において内在性ＢＡＰ活性を上方制御する核酸を同定する。
【００２１】
別の態様において、本発明はハイ・スループットＢＡＰスクリーニングにおいて同定される、骨芽細胞分化プロセスを促進するポリヌクレオチドおよびそれによってコードされるポリペプチドに関する。
【００２２】
さらに本発明は、ベクター、宿主細胞、抗体および上記ポリヌクレオチドおよびポリペプチドを含む骨芽細胞分化−関連疾患を検出するための診断方法、および特に骨細胞分化だけでなく骨再形成一般についての治療方法にも関する。本発明はさらに、骨細胞分化と骨再形成の両方に影響を及ぼす化合物を同定するために計画された薬剤化合物スクリーニングの方法と手段にも関する。
【００２３】
（発明の詳細な記載）
本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドの同定に用いられる方法は、以下の工程を含む。
（ｉ）アレイに並べた核酸ライブラリーを作成する工程、
（ｉｉ）該核酸ライブラリーをアレイに並べた形式において細胞へ導入する工程、および、
（ｉｉｉ）骨芽細胞分化を判定する工程。
好適な態様において、本発明は、骨の恒常性を調節する、特に、骨芽細胞分化を誘導する外因性ポリペプチドをコードするサンプル核酸を同定する方法を提供する。該方法は以下の工程を含む：
（ａ）多数の独特の発現可能なサンプル核酸のライブラリーを提供する工程、
（ｂ）該外因性ポリペプチドが発現する条件下で該サンプル核酸を真核宿主細胞に導入する工程、および、
（ｃ）該サンプル核酸を骨の恒常性の変調、特に該宿主細胞の骨芽細胞への分化の誘導の検出によって同定する工程。
【００２４】
したがって、「同定する」という語は、特定のサンプル核酸が骨芽細胞分化を誘導するかどうかを認識するプロセスを意味することを理解されたい。したがって、「同定」という語は、サンプル核酸の性質や起源とは関係しない。例えば、該方法において「同定」されたサンプル核酸は、既知であるか未知であるかは関係ない。
【００２５】
「調節」という語は、骨吸収および骨構築を含む骨の恒常性を調節、変化あるいは阻害するサンプル核酸のことを指す。この点に関して、サンプル核酸自体又は該サンプル核酸によってコードされる産物、例えば、ｍＲＮＡまたはポリペプチドが、骨の恒常性に関与する機構に干渉することを理解されたい。
【００２６】
本発明は好ましくは骨の恒常性を調節するサンプル核酸の同定方法に関する。骨の恒常性は、骨吸収と骨構築との間のバランスに関する。換言すると、破骨細胞活性の増減のバランスまたは骨芽細胞増殖および分化の増減のバランスである。したがって、骨の恒常性の変調は、骨吸収と骨構築の間のバランスの確立のことも言うことを理解されたい。
【００２７】
「骨芽細胞分化」または「骨形成」の語は、内在性骨アルカリホスファターゼ活性（ＢＡＰ）の上方制御に関する。ＢＡＰは骨芽細胞分化プログラムの初期マーカーである（Rodan and Harada、1997）。内在性ＢＡＰ活性は、当該技術分野で公知の方法により測定される。特に、メチルウンベリフェリル（methylumbelliferyl）ヘプタホスフェート（ＭＵＰ）溶液（Sigmaカタログ番号M3168）を細胞に添加後、細胞を３７℃で３０分間インキュベートする。必要であれば、反応をＮａ２ＣＯ３溶液の添加により停止させる。次いでその結果生じる蛍光を例えば、蛍光リーダー（Fluostar、BMG）で測定する。当業者であれば必要に応じてＢＡＰ−アッセイを行なうことができると予想される。この点において、「内在性」という語は、宿主細胞の天然または生得的なＢＡＰ活性に関する。
【００２８】
「誘導」という語は、骨芽細胞分化を誘導、上方制御または刺激するポリペプチドのことをいう。この点において、サンプル核酸自体または該サンプル核酸によってコードされる産物が骨芽細胞分化を誘導することを理解されたい。
【００２９】
本発明は特に、本明細書に記載した方法に関することが理解される。該方法において、該サンプル核酸の宿主細胞の骨芽細胞への分化誘導の検出による同定は、内在性骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）活性の測定を含む。
【００３０】
本発明によるサンプル核酸は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ＲＮＡ、以前にクローニングされたＤＮＡ、遺伝子、ＥＳＴ、合成オリゴヌクレオチド、ランダム化配列、アンチセンス核酸、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、遺伝的サプレッサー要素、リボザイム、突然変異ジンクフィンガーをコードするＤＮＡ、抗体配列をコードするＤＮＡあるいはそれらの組合せのいずれであってもよい。サンプル核酸は、全長タンパク質をコードするものでもよいが、部分的、非全長タンパク質またはタンパク質ドメインをコードするものでもよい。この点において「外因性ポリペプチド」という語は、サンプル核酸によってコードされるアミノ酸配列を指すことを理解されたい。
【００３１】
好ましくは、サンプル核酸はベクターまたは対応するウイルスにクローニングされたサンプル核酸のセットまたはライブラリーの一部であり（以下を参照されたい）、サンプル核酸のセットまたはライブラリーは、２から２ｘ１０７の別々のサンプル核酸を含むものであってよく、通常は１００から１ｘ１０６種類のサンプル核酸を含む。
【００３２】
細胞へのサンプル核酸の導入とは、サンプル核酸が当業者に公知のあらゆる方法によって細胞に、形質移入、感染または形質導入されることをいう。核酸は当該技術分野で公知のいかなる方法によって送達してもよく、例えば、リン酸カルシウム共沈および直接針注入が含まれるがこれらに限定されない。核酸は送達媒体、例えば、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈降剤などによって送達してもよい。利用可能なウイルスベクターには、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクター、アデノウイルスあるいはそれらのあらゆる組合せが含まれるがこれらに限定されない。
【００３３】
本明細書に記載する本発明による方法においてアデノウイルスベクターが導入される真核宿主細胞または宿主細胞系は、インビトロで骨芽細胞へと分化誘導され得るいずれの細胞であってもよい。これらの細胞は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌおよびげっ歯類、爬虫類、鳥類、両生類、および魚類を含むがそれらに限定されないあらゆる生物から得られる。宿主細胞は好ましくは間葉起源である。好ましくは真核宿主細胞は間葉多能性細胞（ＭＰＣ）であり、これは間葉幹細胞（ＭＳＣ）とも呼ばれる。より好ましくは真核宿主細胞は、一次ＭＰＣであり、さらに好ましくはヒト一次ＭＰＣである。本出願において、「間葉」という語は、細胞の表現型、即ち、当該技術分野で周知のように、骨芽細胞、軟骨細胞、間質性線維芽細胞、筋芽細胞、神経細胞、前脂肪／脂肪細胞および／または端細胞（tenoblast）へと分化可能な細胞の表現型のことをいう。
【００３４】
したがって、本発明は特に本明細書に記載した方法に関することが理解される。該方法では、該真核宿主細胞は間葉多能性細胞（ＭＰＣ）、好ましくは一次ＭＰＣ、より好ましくは一次ヒトＭＰＣである。
【００３５】
骨芽細胞分化は、間葉細胞の再構築に関し、これに伴いＢＡＰ活性が上方制御される。したがって、「表現型のアッセイ」という語は、好ましくは本発明の方法を用いることによる表現型の対照に対する変化の判定によって、骨の恒常性に関与する１または複数の機構を干渉する（調節する）サンプル核酸の能力の評価に関する。対照はモジュレーターの不在下での特定の表現型を示す。したがってサンプル核酸の影響による間葉細胞の生存も、その生存がモジュレータの結果であるならば、本発明に包含されることが理解されよう。生存および／または増殖の向上により、培養の集密がより早くなる。集密状態はほとんどの分化プログラムの開始を引き起こし、導入されたサンプル核酸とともに作用して骨芽細胞分化プログラムを開始させる。
【００３６】
形質導入細胞の表現型のアッセイとは、各ウェルを対照ウェルと比較した表現型の違いについてスコア付けし、特に対照ウェルと比較したＢＡＰ活性の上方制御をスコア付けすることをいう。対照の設定は当該技術分野で周知であり、例えば、一般に対照ウェルは調査対象のウェルと１つのパラメーターのみにおいて異なるものである。スコア付けは、光学顕微鏡によって、または蛍光マーカーでの細胞の染色後に蛍光顕微鏡によって視覚的に行なうことができ、また、例えば発光、吸光、蛍光、および／またはＦＲＥＴの測定によって行なうこともできる。スコア付けに利用可能な上記技術はすべて当該技術分野で周知である。さらに当業者であれば、特定の必要性に応じて該技術を改変することができることが理解される。ハイ・スループット・スクリーニングのためには自動データ捕捉および画像分析器が好適である。
【００３７】
サンプル核酸を含有する組換えアデノウイルスベクターライブラリーの作成、およびサンプル核酸を含有するウイルスベクターへの対応するパッケージング細胞系、例えば、ＰＥＲ．Ｃ６またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａパッケージング細胞系（米国特許第５９９４１２８号、国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号）への導入による活性の組換えアデノウイルスの産生は、すべて国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号に記載され、さらに実施例において説明されるハイ・スループット設定において基本的に行なわれる。したがって、アデノウイルスライブラリーはアデノウイルスベクターライブラリーに直接由来し、それに匹敵するものである。アデノウイルスベクターライブラリーおよびアデノウイルスライブラリーはともに多数の独特の発現可能なサンプル核酸を含有する。実質的に第一のタイプの１または複数のアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスからなるそれぞれのライブラリーは、少なくとも1つの独特の核酸を水性培地中に含む。アデノウイルスベクターライブラリーとアデノウイルスライブラリーの両方が本発明による方法において利用可能であることを理解されたい。
【００３８】
したがって、本発明は本発明による方法に関し、ここで該ライブラリーは実質的に第一のタイプの１または複数のアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスからなり、水性培地中に少なくとも1つの独特の核酸を含む。
【００３９】
本発明は本発明による方法に関し、ここで該ライブラリーは多数の区画を含み、該区画のそれぞれは、水性培地中に少なくとも1つの独特の核酸を含む、実質的に第1のタイプの１または複数のアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスからなることを理解されたい。
【００４０】
サンプル核酸によってコードされる１または複数の産物を同定し機能を割り当てるために、サンプル核酸の１または複数の産物、例えば、ＲＮＡまたはポリペプチドを発現する組換えアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスが宿主細胞に、ハイ・スループット設定において導入される。
【００４１】
アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの機能ゲノム科学における使用には、遺伝子発現ライブラリーの構築および適切かつ意味のある細胞ベースのアッセイまたは特定のヒト疾患のための動物モデルによるインビトロおよびインビボでの遺伝子バリデーションが含まれる。アデノウイルス由来の遺伝子移入ベクター（アデノウイルスベクター）は特に遺伝子移入に有用な多くの特徴を有する。しかし、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの使用に関する多くの欠点がいまだに存在する。特に、血清型Ａｄ２およびＡｄ５は肝臓以外の器官に遺伝物質を送達するためには理想的ではない。標準的Ａｄ２またはＡｄ５アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを用いる機能ゲノム科学のためのインビトロまたはエキソビボ遺伝子移入は、特に該アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを骨の恒常性に関与する細胞に用いる場合には非常に制限されている。本発明により細胞受容体の数を増加させるかあるいは血清型に特異的な受容体を導入することによって顕著に形質導入効率が向上することが立証された。この点において、「余剰の」受容体の数を増加させることによっても形質導入効率が有意に向上する。様々なアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスライブラリーはＡｄ２またはＡｄ５ウイルスに基くものであるため、Ａｄ２およびＡｄ５のためのＣＡＲ受容体は特に有用である。したがって本発明は、受容体を、該ライブラリーが作成されたアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの繊維タンパク質を認識する宿主細胞に導入する方法に関する。同様に、本発明は該ライブラリーが作成されたアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの繊維タンパク質を認識する宿主細胞における受容体数を増加させる方法に関する。受容体数の増加は、例えば、該受容体をコードする核酸を導入することによって行なわれる。受容体の導入は本明細書に記載する手段にしたがって行なうことができる。本発明は特に、第二のタイプの、すなわちサンプル核酸を含むアデノウイルスベクターとは異なる、アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスによる受容体の導入に関する。第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスは、該サンプル核酸ライブラリーが作成された、多数の独特の発現可能な核酸を含むアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスであることは明かである。同様に第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスとは、繊維タンパク質に対する受容体を特異的にコードする核酸を含むアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスであることは明かである。したがって、「第一のタイプ」または「第二のタイプ」という語は、特定の繊維タンパク質に関するものではない。第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスにおけるＣＡＲ受容体と、第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスにおけるＡｄ５ｆｉｂ５との組合せは特にこの点において有用であることが立証された。
【００４２】
それゆえ、本発明は特に、第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを宿主細胞に導入し、第一のタイプの該アデノウイルスベクターまたはアデノウイルスに対する宿主細胞受容体数を増加させる方法に関し、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの繊維タンパク質に対する宿主細胞受容体をコードする遺伝子を含む第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを提供する工程、
（ｂ）第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを該宿主細胞に、該宿主細胞受容体の発現を可能とする条件下で導入する工程、
（ｃ）第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを提供する工程であって、該第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスはサンプル核酸を含むものである工程、および、
（ｄ）第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを工程（ｂ）の宿主細胞に、第一のタイプのアデノウイルスの繊維タンパク質の、第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスによって提供される宿主細胞受容体への結合を介して導入する工程。
【００４３】
したがって、本発明は特に本発明による方法に関すると考えられ、ここで該方法に先行して以下の工程が行なわれる：
（ａ）第一のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスの繊維タンパク質と相互作用可能な細胞受容体をコードする核酸配列を含む、第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを提供する工程、および、
（ｂ）該第二のタイプのアデノウイルスベクターまたはアデノウイルスを該真核宿主細胞に該宿主細胞における該細胞受容体の発現を可能とする条件下で導入する工程。
【００４４】
ハイ・スループット・スクリーニング
複雑性の観点から、骨の恒常性の維持、特に骨芽細胞分化に関与する因子の潜在数が多く、因子間の関係が複雑であることから、多数の因子をスクリーニングすることが好ましい。それゆえ、本発明の設定において骨の恒常性および特に骨芽細胞分化の変調として規定されるサンプル核酸の機能の測定は、好ましくはハイ・スループットおよび／または小型化された設定において行なわれる。
【００４５】
本明細書において用いる場合、「ハイ・スループット・スクリーニング」または「ＨＴＳ」という用語は、自動化した方法における既知の物（すなわち標的）を未知の物（すなわち被験化合物）のグループ（すなわちライブラリー）に曝すことを含むアッセイを意味し、ここで、標的に関連する反応の進行を、特定の被験化合物の生物活性のレベルに相関する結果についてアッセイする。この標的−関連反応には、結合、例えば受容体へのリガンドの結合が含まれることが多い。ＨＴＳは多くの別々の化合物が並行して試験される方法であり、多数の被験化合物が同時またはほぼ同時にその生物活性についてスクリーニングされる。ここではロボット操作が用いられ、サンプル容量は小さい。
【００４６】
現在もっとも普及している技術は９６ウェルマイクロタイタープレートを用いるものである。この形式では、９６の別々の試験が、１つの８ｃｍｘ１２ｃｍのプラスティックプレート上で同時に行なわれる。該プレートは９６の反応ウェルを含む。これらのウェルでは典型的には５０から５００μｌのアッセイ容量が要求され、プレートに加えて、多くの装置、試薬、ピペッター、ロボット、プレート洗浄器およびプレートリーダーが広範な同種及び異種アッセイのための９６ウェル形式に適合するように市販されている。本発明は特に、９６−ウェル、３８４−ウェルあるいはそれ以上の設定に関する。
【００４７】
したがって、本発明は本明細書に記載の方法に関し、ここで少なくとも１つの工程、例えば導入工程、より好ましくは２以上の工程が小型化および／またはハイ・スループット形式で行なわれる。
【００４８】
本発明のさらなる態様において一次スクリーニングからの候補サンプル核酸が骨の恒常性、特に骨芽細胞分化の真のモジュレーターであるか否かを確認する方法が提供される。したがって、本発明は本発明による、さらに確認工程を含む方法に関する。確認工程において、該サンプル核酸はさらにＡＬＰＬ（ヒトアルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓）、ＡＬＰＩ（ヒトアルカリホスファターゼ腸）、ＡＬＰＰ（ヒトアルカリホスファターゼ胎盤）、および／またはＡＬＰＰ２（ヒトアルカリホスファターゼ胎盤−様）の転写の誘導について確認される。転写の誘導を判定するアッセイは当該技術分野で公知であり、ＡＬＰＬ、ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰ、および／またはＡＬＰＰ２ｍＲＮＡのノザンブロット分析または定量的ＲＴ−ＰＣＲを含むがこれらに限定されない。
【００４９】
当業者であれば、確認アッセイの代わりとなる型式が存在し、あるいは確認アッセイが特定の用途に応じて適用されることが理解できるであろう。これらのアッセイの多様性は当業者の能力の範囲内である。したがって、代わりとなるアッセイ、例えば実施例１０、１１、１２、１３に記載のもの、および本明細書に記載の確認アッセイを改変したものも本発明に含まれる。
【００５０】
同定されるモジュレーター、およびその用途
本発明による方法の結果、骨の恒常性に干渉することができる、特に骨芽細胞分化を誘導することができるモジュレーターまたはサンプル核酸が同定される。骨の恒常性の変調または骨芽細胞への分化は、サンプル核酸それ自体あるいはサンプル核酸によってコードされる産物によって引き起こされる。本発明の１つの態様は、本発明による方法によって同定可能なあらゆる核酸を提供する。
【００５１】
本発明はさらに、一次スクリーニングおよび確認アッセイにおける、骨の恒常性を調節するか、あるいは骨芽細胞分化を誘導する核酸のグループの配列同一性（配列番号：１、３、５、７、および９）および対応するポリペプチド（配列番号：２、４、６、８、および１０）を提供する。
【００５２】
好ましい態様において、本発明は骨芽細胞分化のインデューサーとして同定可能な以下からなる核酸の群から選択される単離核酸を提供する：
（ａ）配列番号：１、３、５、７、または９またはその相補鎖のＤＮＡ配列、
（ｂ）配列番号：１、３、５、７、または９またはその相補鎖に対応するＲＮＡ配列、
（ｃ）（ａ）または（ｂ）で規定されたヌクレオチド配列の１つと特異的にハイブリダイズする核酸、
（ｄ）（ａ）で規定された配列と少なくとも６５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸、
（ｅ）配列番号：２、４、６、８、または１０のアミノ酸配列と少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする核酸、
（ｆ）配列番号：２、４、６、８、または１０のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
（ｇ）配列番号：１、３、５、７、または９あるいは（ａ）から（ｆ）に規定したヌクレオチド配列に対する遺伝コードの結果縮重した核酸、
（ｈ）配列番号：２、４、６、８、または１０のタンパク質をコードする、あるいは（ａ）から（ｈ）に規定したヌクレオチド配列に対して生物間でのコドン使用の差により相違した核酸、
（ｉ）配列番号：２、４、６、８、または１０のタンパク質をコードする、あるいは（ａ）から（ｇ）に規定した対立遺伝子の差によって相違した核酸、
（ｊ）配列番号：１、３、５、７、または９のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片をコードする核酸、
（ｋ）配列番号：１、３、５、７、または９の核酸の遺伝子ファミリーメンバーをコードする核酸、および、
（ｌ）配列番号：２、４、６、８、または１０に規定されるタンパク質をコードする核酸または（ａ）から（ｋ）のいずれかに規定される核酸であって、該配列がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡである核酸。
【００５３】
遺伝コードが縮重していること、すなわち、１つのアミノ酸は１以上のコドンによってコードされる可能性があることは周知である。縮重したコドンは同一のアミノ酸残基をコードするが、異なるヌクレオチドのトリプレットを含む。したがって、特定の骨の恒常性のモジュレーターをコードするポリヌクレオチド配列が与えられると、そのモジュレーターをコードする複数の縮重したポリヌクレオチド配列が存在するであろう。これらの縮重したポリヌクレオチド配列は本発明の範囲に含まれる。
【００５４】
さらに、当業者であれば、異なる生物、細胞、および細胞区画は異なる遺伝コードを用いることを理解しているであろう。したがって、単一のポリヌクレオチド配列はその細胞との関連に応じて異なるポリペプチドをコードし得る。したがって、標準的遺伝コードに加えて、非標準的遺伝コードによってコードされるポリペプチドも本発明に含まれる。これらの非標準的遺伝コードには、脊椎動物ミトコンドリアコード、酵母ミトコンドリアコード、カビ、原生動物、腔腸動物ミトコンドリアコード、マイコプラズマ／スピロプラズマコード、無脊椎動物ミトコンドリアコード、絨毛、ダシクラダシアン（dasycladacean）およびヘキサミタ核コード、棘皮動物ミトコンドリアコード、ユープロチド（euplotid）核コード、細菌及び植物色素体コード、オルターナティブ酵母核コード、ホヤ類ミトコンドリアコード、扁形動物ミトコンドリアコード、眼瞼（blepharisma）核コード、クロロフィシアン（chlorophycean）ミトコンドリアコード、吸虫ミトコンドリアコード、セネデスムズ・オブリクス（scenedesmus obliquus）ミトコンドリアコード、およびトラウストチトリウム（thraustochytrium）ミトコンドリアコードが含まれるがこれらに限定されない。
【００５５】
「免疫学的に活性」という語は、抗体によって認識される、言い替えると抗体に結合される分子またはその特定の断片、例えば、エピトープまたはハプテンを意味すると理解されたい。
【００５６】
好適な態様において、本発明は本発明の核酸のいずれかに特異的にハイブリダイズする少なくとも１０ヌクレオチドの長さの核酸分子を提供する。特に、より長い核酸分子が考慮される。すなわち、約１５、２０、２５、３０、４０、５０、７５、１００、２００またはそれより長いヌクレオチドが含まれる。より短いプローブも有用であることも理解されるべきである（例えば１０、１１、１２、１３または１４ヌクレオチドのもの）。様々なタイプのハイブリダイゼーション技術および形式が当該技術分野で周知である。核酸分子は例えば、放射性同位体または免疫蛍光化合物によって標識することにより、ハイブリッドの検出を可能にすることもできる。したがって、本発明は本発明の核酸の検出方法を提供する。
【００５７】
さらなる態様において、本発明は上記のような少なくとも１５ヌクレオチドの長さの核酸分子を提供し、ここで該核酸分子は本発明の核酸又はその部分を特異的に増幅させるためのプライマーとして作用するものである。該プライマーは例えば、１０、１１、１２、１３、または１４ヌクレオチドのようにより短いものであってもよく、あるいは例えば、１６、１７、１８、１９、２０、２５、または３０ヌクレオチドのようにより長いものであってもよいことを理解されたい。
【００５８】
該プライマー対は例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）、転写媒介増幅（ＴＭＡ）、または核酸配列ベース・増幅（ＮＡＳＢＡ）技術などの当業者に周知の増幅技術において用いることができ、それにより本発明の核酸の増幅とそれに続く検出が可能となる。好ましくは、該プライマーは、本発明の核酸を特異的に増幅するために用いるとよい。したがって、本発明は本発明の核酸の検出方法を提供する。
【００５９】
本発明はまた、配列番号：１、３、５、７、または９に開示されている核酸あるいは対応する相補鎖のヌクレオチド配列のバリアントにも関する。
【００６０】
本発明はまた、配列番号：１、３、５、７、または９に示されるヌクレオチド配列、あるいは対応する相補鎖またはその部分に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、あるいはそれからなる核酸分子にも関する。該部分は好ましくは独特の部分である。
【００６１】
本発明の参照ヌクレオチド配列に対して、少なくとも、例えば９５％の、「同一性」を有するヌクレオチド配列を有する核酸とは、該核酸のヌクレオチド配列が、参照配列に対して同一性を有するが、ただし、該ヌクレオチド配列が参照ヌクレオチド配列の１００ヌクレオチド当たり５の点突然変異を有していてもよいことを表す。言いかえると、参照ヌクレオチド配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するヌクレオチド配列を有する核酸を得るためには、参照配列におけるヌクレオチドの５％までが欠失または他のヌクレオチドによって置換されていてもよく、あるいは参照配列の全ヌクレオチドの５％までの数のヌクレオチドが参照配列に挿入されていてもよい。実践的には、特定の核酸分子が本発明のヌクレオチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の同一性を有するか否かは、公知のアルゴリズムを用いて決定できる。クエリー配列（本発明の配列）と問題の配列の間の最適全体マッチを決定する好ましい方法は、Ｂｌａｓｔサーチ（Altschul et al.、1997）を用いて決定する方法である。
【００６２】
ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件またはより低いストリンジェンシーでの条件下で、配列番号：１、３、５、７、または９として特定された本発明の核酸分子のいずれかの鎖と特異的にハイブリダイズする核酸も、特に本発明に含まれる。「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」とは、一晩、６８℃での、５ｘＳＳＣ（７５０ｍＭ ＮａＣｌ、７５ｍＭクエン酸トリナトリウム）、５０ｍＭリン酸トリナトリウム（ｐＨ７．６）、５ｘデンハルト溶液、１０％デキストラン硫酸および２０μｇ／ｍｌ変性剪断サケ精子ＤＮＡを含む溶液中でのインキュベーション、次いでフィルターの０．１ｘＳＳＣでの約６５℃での洗浄を指す。ハイブリダイゼーションのストリンジェンシーの変化はまず洗浄工程でのＳＳＣの希釈度の変化によって達成される（洗浄バッファーにおけるＳＳＣ濃度が高ければストリンジェンシーは低くなる）。また、洗浄工程での温度の変化によっても達成される（洗浄温度が低ければストリンジェンシーは低くなる）。例えば、低いストリンジェンシー条件には、１ｘＳＳＣおよび５５−６０℃での洗浄が含まれる。高い、および低いストリンジェンシー条件でのハイブリダイゼーションは当業者に周知の原理である（例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory press 1989を参照されたい）。
【００６３】
本発明において提供されるヌクレオチド配列は、該配列がコード領域の一部でしかない場合や上流配列、例えばプロモーターやレギュレーター要素である場合には、該部分ヌクレオチド配列と全長配列を検出するための当該技術分野で公知の様々な方法を用いて伸長させることもできる。
【００６４】
さらに、骨の恒常性の変調において、特に骨芽細胞分化の誘導において役割を果たす本発明によって同定されるタンパク質のなかには、疾患プロセスの特異的マーカーとして作用するものもあるだろう。それゆえ、それらは疾患組織に対する標的特異的薬剤のために用いられる診断マーカーまたは治療マーカーとして利用可能である。
【００６５】
当業者に周知の方法を用いて、少なくとも本発明の核酸の断片とともに適当な転写および翻訳制御要素を含む発現ベクターを構築することができる。これらの方法にはインビトロ組換えＤＮＡ技術、合成技術、およびインビボ遺伝子組換えが含まれる。そのような技術は、例えば、Sambrook et al. Molecular Cloning: A laboratory manual. Cold Spring Harbor laboratory press 1989において記載されている。
【００６６】
本発明は、本発明のサンプル核酸を含むベクターにも関する。本発明は特に組換え発現ベクターを含み、該ベクターは、ベクター配列、適当な原核、真核またはウイルスあるいは合成プロモーター配列、そしてその下流に本発明のサンプル核酸を含む。好ましくは、本発明によるサンプル核酸の発現に用いられるベクターは、大腸菌での発現用のベクター、酵母シャトルベクター、または酵母ツー−ハイブリッドベクター、植物ベクター、昆虫ベクター、哺乳類発現ベクターであり、例えばヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノウイルスベクターまたはそれらの組合せが含まれるがそれらに限定されない。
【００６７】
好適な態様において、本発明は本発明の核酸配列を含むベクターを提供する。したがって、該核酸は骨の恒常性のモジュレーターとして同定可能な核酸の群から選択されるメンバーであり、好ましくは骨芽細胞分化のインデューサーとして同定可能な核酸である。好ましくは該核酸は配列番号：１、３、５、７、または９あるいはそのバリアント、断片またはホモログからなる群から選択されるメンバーである。
【００６８】
好適な態様において該ベクターは発現ベクターであり、ここでヌクレオチド配列は１または複数の制御配列に作動可能に連結しており、それによって原核および／または真核宿主細胞における該配列の発現が可能となる。
【００６９】
好適な態様において、該ベクターはアデノウイルスベクターである。
【００７０】
好適な態様において該ベクターはアデノウイルスアダプターベクターから作成されたものであり、それはレフトＩＴＲおよびＥ２Ｂ領域の部分を含み、そこでＥ１領域は哺乳類プロモーター、ポリリンカー配列、およびポリアデニル化シグナルに置換されている。
【００７１】
当業者に理解されるように、非天然コドンを有する上記の単離ヌクレオチド配列によってコードされる産物を産生するのが好ましい。例えば、特定の原核または真核宿主に好適なコドンを選択してタンパク質発現速度を上昇させ、あるいは所望の特性、例えば、より長い半減期を有するＲＮＡ転写産物を産生させることができ、それによって細胞中の発現可能なポリペプチドの量が上昇し、これは多くの用途に望ましいことである。
【００７２】
本発明のヌクレオチド配列を当該技術分野で一般に知られている方法を用いて操作して、タンパク質をコードする配列を様々な理由のために変化させることができる。これには例えば、遺伝子産物のクローニング、プロセシング、および／または発現を改変させる変化が含まれるがこれに限定されない。ランダム・フラグメンテーションによるＤＮＡシャフリングまたは遺伝子断片または合成オリゴヌクレオチドのＰＣＲ再アセンブリーを用いてヌクレオチド配列を操作することができる。例えば、部位特異的突然変異誘発を用いて新しい制限部位を挿入すること、グリコシル化パターンを変化させること、コドン優先度を変化させること、スプライスバリアントを作ること、突然変異を導入することなどができる。
【００７３】
さらに、天然、修飾、または組換えヌクレオチド配列を本発明の部分または全体核酸配列に連結させて融合タンパク質をコードさせることができる。例えば、本発明の核酸の産物の阻害剤についてペプチドライブラリーをスクリーニングするために、市販の抗体によって認識され得るキメラタンパク質をコードさせることは有用であろう。融合タンパク質を操作してタンパク質コード配列と異種タンパク質配列の間に切断部位を含めることにより、タンパク質を異種部分から切断して精製することができる。融合タンパク質はタンパク質の精製を簡単にするために作ることもできる。例えば、複数ヒスチジン、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ、またはエピトープタグをタンパク質に融合させることができる。かかる融合タンパク質を、ニッケル、グルタチオンまたは抗体カラムに通すことにより、ほとんどの不純物を除くことができる。
【００７４】
さらなる態様において、本発明は、組み込まれた、またはエピソーム性の本発明のヌクレオチド配列のいずれかのコピーまたはその機能的断片を含む宿主細胞を提供する。より好適な態様において、本発明は本発明による核酸配列を含むベクターを含む宿主細胞を提供する。
【００７５】
後者の宿主細胞は、哺乳類、例えば、ヒト、イヌおよびげっ歯類、両生類、爬虫類、鳥類、魚類、線虫、酵母、菌類、細菌、昆虫および植物を含むがそれらに限定されないあらゆる生物から得ることができる。
【００７６】
この点において、「機能的部分」の語は、完全なヌクレオチド配列と実質的に類似であるが同一である必要は無い活性を示す本発明のヌクレオチド配列のあらゆる部分を意味する。すなわち、骨の恒常性を調節することができ、特に骨芽細胞分化を、インビトロとインビボの両方で誘導することができるものである。
【００７７】
好適な態様において、本発明は上記の核酸によってコードされうる単離ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片を提供する。
【００７８】
したがって、本発明は、配列番号：２、４、６、８、または１０に示すアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはそのバリアントまたは誘導体、あるいは免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片に関する。
【００７９】
本発明のタンパク質の「バリアント」とは、それらがホモログである該タンパク質に対してアミノ酸置換、欠失および／または付加を含むペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素であって、骨の恒常性を調節する能力、特に骨芽細胞分化の誘導能力を維持しているものである。言い替えると「バリアント」という語は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質とは異なるポリペプチドまたはタンパク質であるが、その本質的特性、すなわち骨の恒常性の変調、特に骨芽細胞分化の誘導を保持しているものである。かかるバリアントによる骨の恒常性の変調、特に骨芽細胞の分化誘導は、バリアントが関連するタンパク質の機能的活性にかかわらず、骨芽細胞および／または破骨細胞の活性の阻害及び促進に関する。したがって本発明は特にドミナントネガティブおよびドミナントポジティブ、および関連するポリペプチドおよびタンパク質を含む。本発明において、タンパク質の機能的活性は、「機能」に関するものであるし、これはそれ自体で骨の恒常性を調節する能力、特に骨芽細胞分化を誘導する能力に関し（定性的尺度）、また、「活性」に関するものでも有あり、これは骨の恒常性を調節する能力、特に骨芽細胞分化を誘導する能力の分子当たりの量に関する（定量的尺度）。一般に、バリアントは全体的に密接に類似し、そして多くの領域において、本発明のポリペプチドまたはタンパク質と同一性を有する。例えば、該タンパク質のホモログは、該タンパク質の生理活性のアミノ酸配列バリアントからなる。かかるホモログを作成するために、該タンパク質に存在するアミノ酸を類似の特性、例えば、疎水性、親水性、疎水性モーメント、抗原性、α−ヘリックス構造またはβ−シート構造を形成または破壊する性向など、を有するその他のアミノ酸で置換してもよい。アミノ酸置換は典型的には一残基であるが、ポリペプチドに課された機能的束縛に応じてクラスターであってもよい；挿入は通常約１−１０アミノ酸残基程度であり、欠失は約１−２０残基の範囲である。好ましくは、アミノ酸置換は保存的アミノ酸置換を含む。当業者であれば、バリアントについて骨の恒常性を調節する能力、特に骨芽細胞分化を誘導する能力について、本発明において記載されるあらゆるアッセイを用いて簡単に試験することができることを理解するであろう。
【００８０】
本発明のタンパク質の挿入アミノ酸配列バリアントは、１または複数のアミノ酸残基がタンパク質において予め決定された部位に導入されたものを言う。挿入は、アミノ末端および／またはカルボキシル末端への融合および配列の内部への１または複数のアミノ酸の挿入を含む。一般に、アミノ酸配列内への挿入はアミノまたはカルボキシル末端への融合よりも小さく、約１から１０残基程度である。本発明のタンパク質の欠失バリアントは、タンパク質のアミノ酸配列から１または複数のアミノ酸が除かれていることにより特徴付けられる。
【００８１】
本発明のタンパク質のアミノ酸バリアントは、当該技術分野で周知のペプチド合成技術、例えば、固相ペプチド合成など、あるいは組換えＤＮＡ操作によって簡単に作ることができる。バリアントタンパク質を作るためのＤＮＡ配列の操作は、置換、挿入または欠失バリアントとして現れるものだが、当該技術分野で周知である。
【００８２】
本発明のタンパク質の「誘導体」とは、ポリペプチドの少なくとも約５の連続したアミノ酸残基を含むが該タンパク質の生物学的活性を保持している、ペプチド、オリゴペプチド、ポリペプチド、タンパク質および酵素をいう。好ましくは、誘導体はタンパク質の少なくとも６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、または１５の連続したアミノ酸残基を含む。「誘導体」はさらに、ポリペプチドの天然形態のアミノ酸配列と比較して、さらなる天然の、変化したグリコシル化、アシル化されたアミノ酸残基または非天然のアミノ酸残基を含んでいてもよい。あるいは、またはさらに、誘導体はポリペプチドの天然形態のアミノ酸配列に対して、１または複数の非−アミノ酸置換基、例えば、レポーター分子またはその他のリガンドを、共有結合又は非共有結合によってアミノ酸配列に結合して含んでいてもよい。例えばレポーター分子はその検出を容易にする。
【００８３】
本発明においては、上記のような新規に同定された骨の恒常性を調節する配列、特に骨芽細胞分化を誘導する配列のホモログ、誘導体および／または免疫学的に活性な断片が実施態様である。
【００８４】
「ホモログ」の語は、非ヒト種における分子であって、本発明の方法において判定して、用量依存性の有無に関わらず、本発明の分子に対応するもの、すなわち骨の恒常性を調節することができるもの、特に骨芽細胞分化を誘導することができるものをいう。
【００８５】
好適な態様において、本発明は、本発明のポリペプチドを産生する方法を提供し、該方法は、上記の本発明の核酸を含む宿主細胞を該ポリペプチドの発現を可能にする条件下で培養する工程および産生したポリペプチドを培養から回収する工程を含む。本発明のポリペプチドの産生のその他の方法は、当該技術分野で周知であり、例えば化学合成によって産生される。
【００８６】
本発明はまた、本発明のアミノ酸配列と少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むかあるいはそれからなるポリペプチドに関し、ここで本発明の該アミノ酸配列、いわゆる参照配列は、少なくとも３０アミノ酸の長さを有する。しかし、３０アミノ酸より短い参照配列については、ポリペプチドは少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の参照配列に対する同一性を有するアミノ酸配列からなる必要がある。
【００８７】
本発明の参照アミノ酸配列に対して、少なくとも例えば９５％の「同一性」を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドとは、参照配列に対して同一性を有するポリペプチドのアミノ酸配列であるが、ただし、アミノ酸配列が参照ポリペプチドアミノ酸配列の１００アミノ酸当たり５つまでのアミノ酸変化を有するものをいう。言い替えると、参照アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を有するポリペプチドを得るためには、参照配列におけるアミノ酸が５％まで欠失または他のアミノ酸によって置換されていてもよいか、あるいは参照配列における全アミノ酸の５％までのアミノ酸が参照配列に挿入されていてもよいことをいう。実践的には、特定のポリペプチドが本発明のポリペプチド配列に対して少なくとも６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９７．５％、９８％、９８．５％、９９％または９９．５％の同一性を有するか否かは、公知のアルゴリズムによって判定することができる。クエリー配列（本発明の配列）と問題の配列の間の最適全体マッチを決定する好ましい方法は、ＢＬＡＳＴｐ（Altschul et al.、1997）を用いて決定する方法である。
【００８８】
本発明は、配列番号：２、４、６、８、または１０、あるいはそれらの機能的な断片に対して少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸の、骨の恒常性の調節のため、特に骨芽細胞分化の誘導のための使用に関することが理解されよう。
【００８９】
同様に、本発明は、配列番号：２、４、６、８、または１０、あるいはそれらの機能的な断片に対して少なくとも６５％の同一性を有するアミノ酸配列を含むタンパク質の、骨の恒常性の調節のため、特に骨芽細胞分化の誘導のための使用に関する。
【００９０】
したがって本発明はまた、配列番号：１、３、５、７、または９あるいはそれらの機能的な断片に対して少なくとも６５％の同一性を有する核酸配列を含む核酸の、骨の恒常性の調節のため、特に骨芽細胞分化の誘導のための使用に関する。
【００９１】
抗体
別の好適な態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたは該ポリペプチドの特定のエピトープを特異的に認識する抗体を提供する。エピトープという語は、動物、好ましくは哺乳類、そしてもっとも好ましくはヒトにおける抗原性または免疫原性の活性を有するポリペプチドの部分をいう。本発明のエピトープ−担持ポリペプチドを用いて当該技術分野に周知の方法を用いて抗体を誘導することができる。該方法には例えば、インビボ免疫化、インビトロ免疫化、ファージディスプレー法またはリボゾームディスプレーが含まれるがそれらに限定されない。
【００９２】
本発明の抗体は、本発明のタンパク質に結合するあらゆるポリクローナルまたはモノクローナル抗体に関する。本明細書において用いる「モノクローナル抗体」という語は、均一な抗体集団を有する抗体組成物のことをいう。該用語は、抗体の種やソースを制限するものではなく、その製造方法に関しても制限するものではない。したがって、「抗体」の語は、ラクダ（ヒトコブラクダおよびフタコブラクダ）由来の抗体も含み、ラマ属由来の抗体も含む。したがって、「抗体」の語は、ファージディスプレー技術または薬剤スクリーニングプログラム由来の抗体も指す。さらに、「抗体」の語は、ヒト化抗体も指し、ヒト化抗体では、免疫グロブリンのフレームワーク領域の少なくとも一部がヒト免疫グロブリン配列由来である。また、「抗体」の語は、米国特許第４９４６７７８号に記載の一本鎖化抗体および抗体フラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆ’（ａｂ）２、Ｆｖ、およびその他のフラグメントであって抗原結合機能および親抗体の特異性を保持しているものも指す。「抗体」の語は、また二量体抗体（diabodies）、三量体抗体（triabodies）または多量体抗体（一価、二価、四価または多価／一特異性、二特異性、多特異性）抗体、および酵素抗体（enzybodies）、すなわち酵素活性を有する人工抗体も指す。アフィニティーまたは特異性を増強させるその他の分子と組合せた抗体も「抗体」の語に含まれる。抗体には修飾形態、例えば、ＰＥＧ化（PEGylated）またはポリシアル酸化形態（Fernandes & Gregoriadis、1997）および共有結合または非共有結合によってポリマーに結合した形態も含まれる。さらに「抗体」の語は、あらゆる性質の抗体−擬似化合物、例えば、脂質、炭水化物、核酸またはアナログ、例えば、ＰＮＡ、アプタマー由来のものも含まれる（Jayasena、1999を参照されたい）。
【００９３】
特定の態様において、本発明の抗体はヒトタンパク質およびその対応するエピトープのマウス、ヤギ、ラットおよび／またはウサギホモログと交差反応する。さらに、本発明のポリヌクレオチドとストリンジェントなハイブリダイゼーション条件（本明細書に記載の条件）下でハイブリダイズする核酸によってコードされるポリペプチドに結合する抗体も本発明に含まれる。したがって、本発明は、本発明のポリペプチドの検出方法を提供し、該方法は、生物サンプルにおける本発明のポリペプチドのレベルの定量的又は定性的測定のための抗体のイムノアッセイにおける抗体の使用を含む。
【００９４】
したがって本発明は、本明細書に記載の核酸またはポリペプチドの、好ましくは本発明の抗体による検出方法も含む。
【００９５】
特に、本発明は、本発明による核酸によってコードされ得るポリペプチドまたは該ポリペプチドの特定のエピトープを特異的に認識する抗体に関する。
【００９６】
本発明の抗体は、本発明のポリペプチドのアゴニストとして作用してもアンタゴニストとして作用してもよい。好ましくは、本発明の抗体は、本明細書に記載の抗原性エピトープに結合するものであり、あるいは本発明のタンパク質の特定の部分に結合するものである。
【００９７】
本発明の抗体は、例えば、骨の恒常性、特に骨芽細胞分化における、本発明のポリペプチドの活性を精製、検出、標的化、および／または阻害するために用いられ、それらにはインビトロおよびインビボの両方での診断及び治療方法、また、薬剤スクリーニングが含まれるがそれらに限定されない（後述）。
【００９８】
アンチセンス技術
アンチセンス技術を用いて遺伝子発現を制御することができる。例えば、遺伝子発現の阻害、即ち、当該技術分野で公知のように転写を阻害することができる。したがって、アンチセンス核酸をアンタゴニスト化合物として利用することができ、また、本発明のポリペプチドの、インビトロおよびインビボの両方での骨の恒常性の変調、特に骨芽細胞分化の誘導、に対する効果を制御するために用いることができる。
【００９９】
したがって、さらなる態様において、本発明は、本発明のアンチセンス核酸をコードする本発明による核酸を含むポリヌクレオチド配列を提供する。かかるアンチセンス核酸は当該技術分野で標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築することができる。
【０１００】
好適な態様において、本発明はアンチセンス核酸をコードする本明細書に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクターを提供する。
【０１０１】
より好適な態様において、該ベクターは発現ベクターであり、ここでアンチセンスポリヌクレオチド配列は１または複数の制御配列に作動可能に連結しており、それによって該配列の原核および／または真核宿主細胞における発現、即ち、転写が可能となる。
【０１０２】
本発明による潜在的アンタゴニストには、触媒的ＲＮＡ、即ちリボザイムも含まれる。リボザイムは、部位特異的認識配列においてｍＲＮＡを切断し、本発明の核酸に対応するｍＲＮＡの破壊に用いることができる。リボザイムの構築および産生は、当該技術分野で周知である。アンチセンスアプローチにおけるように、本発明のリボザイムはアンタゴニスト化合物として利用することができ、細胞に送達することができる。そして例えば、インビトロまたはインビボで破骨細胞および／または骨芽細胞活性を阻害することができ、あるいは骨芽細胞の分化および活性に対する阻害作用を阻害することができ、特に本発明のポリペプチドの骨芽細胞分化の誘導効果を阻害又は刺激することができる。同様に、本発明の核酸、それに由来するＲＮＡ分子、その機能的同等部分または断片は、酵素活性を有していてもよく、ＲＮＡ結合ポリペプチドを破壊してもよく、ｍＲＮＡの内在性センス鎖に結合することによってアンチセンス薬剤として効果を発揮してもよい。これらはすべて骨の恒常性を調節することができるものであり、好ましくは骨芽細胞を誘導できるものであり、さらに好ましくはＢＡＰ発現を上方制御できるものである。
【０１０３】
同様に、本発明の核酸、それに由来するＲＮＡ分子、その機能的同等部分または断片は、骨の恒常性を調節することができる酵素活性を含むものであってよく、好ましくは、骨芽細胞を誘導することができ、さらに好ましくはＢＡＰ発現を上方制御できる酵素活性を含むものである。
【０１０４】
それゆえ、本発明は、遺伝子の転写または発現の調節方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明による核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する工程、および、
（ｂ）標的遺伝子の発現を調節する工程、ここでポリヌクレオチド配列が標的の転写または発現を調節する。
【０１０５】
好適な態様において、本発明は遺伝子発現の調節方法に関し、好ましくは遺伝子発現の上方制御方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明による核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する工程、および、
（ｂ）該ポリヌクレオチド配列によって、該宿主細胞における標的遺伝子の発現を制御、好ましくは上方制御する工程。
【０１０６】
それゆえ、本発明は、骨の恒常性の調節方法、好ましくは骨芽細胞分化の調節方法、とりわけ骨芽細胞分化の誘導の調節方法、さらに好ましくはＢＡＰ発現の上方制御の調節方法に関し、該方法は本発明による核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を宿主細胞に、宿主細胞におけるポリヌクレオチド配列の発現を引き起こし、そして該ポリヌクレオチド配列によって骨の恒常性の変調、骨芽細胞分化、および／またはＢＡＰ発現の上方制御が引き起こされる条件下で導入する工程を含む。
【０１０７】
本発明はさらに、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ、以前は二本鎖ＲＮＡまたはｄｓＲＮＡとして知られた）アプローチの使用により遺伝子発現を制御するための核酸配列を提供する。当該技術分野において（国際特許出願第ＷＯ９９／３２１６９号）、ｓｉＲＮＡを標的細胞に与えることによって該細胞に存在するあらゆる所望のＲＮＡ配列の翻訳／発現を下方制御することができることが記載された。したがって、本発明の核酸は、アンタゴニストまたはアゴニスト化合物として用いることができ、そして本発明のポリペプチドの骨の恒常性の変調、そして特に骨芽細胞分化の誘導および／またはＢＡＰ発現および活性に対する、インビトロおよびインビボでの効果を調節するのに用いることができる。
【０１０８】
また、本発明は薬物としての使用のためのｓｉＲＮＡに関し、これは該ｓｉＲＮＡが該ポリヌクレオチド配列によって、骨芽細胞および／または破骨細胞活性、そして特に骨芽細胞分化の誘導を増強又は拮抗することによって特徴付けられる。
【０１０９】
したがって、本発明は細胞に関し、ここで該細胞には本明細書に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列が導入されている。該細胞は薬物として用いられることが理解されよう。というのは、該細胞を骨の恒常性の障害に関する疾病を患う患者に導入することができるからである。該細胞による再増殖は患者にとって有益である。
【０１１０】
治療および診断
導入部に記載したように、多数の疾患が骨吸収と骨構築の間の微調整されたバランス、即ち骨の恒常性の障害によって起こる。１つの最も重要な骨の恒常性の障害から生じる骨疾患は骨粗鬆症であるが、多くのその他の疾患も骨の恒常性の障害によって起こり、多数の患者が存在する。それらの疾患は、例えば、悪性高カルシウム血症、パジェット病、関節リウマチや歯周病などの炎症性骨疾患、骨格およびその他の骨転移において起こる限局性骨形成、クルゾン症候群、くる病、オプシスモディスプラジア、ピクノディスオストーシス／トゥールーズ・ロートレック病、骨形成不全症などである（Karsenty、1999; Teitelbaum、2000; Rodan and Martin、2000; Goltzman、2001; Karsenty、2001）。したがって、破骨細胞活性の増減または骨芽細胞の増殖および分化の増減により、様々な疾患が起こる。
【０１１１】
それゆえ骨の恒常性がおかされている場合、骨の恒常性を回復することは患者にとって有益であると考えられる。同様に、特定の場合、例えば、骨折または骨粗鬆症の場合、骨芽細胞分化の誘導が患者にとって有益であろうと期待される。
【０１１２】
したがって、本発明は、薬物としての使用のための、本発明による核酸、ポリペプチドまたは抗体に関する。
【０１１３】
好適な態様において、本発明は骨の恒常性の障害、特に骨芽細胞分化の誘導の欠損または減少をともなう疾患の予防、治療および／または緩和のための薬剤の調製のための、本発明による核酸、ポリペプチドまたは抗体の使用に関する。
【０１１４】
好適な態様において、本発明は骨の恒常性の障害、特に骨芽細胞分化の誘導の欠損または減少をともなう疾患の予防、治療および／または緩和のための薬剤の調製のための、本明細書に記載の方法によって同定可能な核酸の使用に関する。
【０１１５】
好適な態様において、本発明は骨の恒常性の障害、特に骨芽細胞分化の誘導の欠損または減少をともなう疾患の予防、治療および／または緩和のための本発明による実質的に精製された核酸、ポリペプチドまたは抗体を含む医薬組成物に関する。医薬組成物は好適な担体を含んでいてもよい。
【０１１６】
本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体に添加する好適な担体は当該技術分野で周知である。
【０１１７】
好適な態様において、本発明はインビトロまたはインビボでの所望の標的細胞における骨の恒常性の調節のための、タンパク質融合体、またはその断片を含む本発明によるポリペプチドを提供する。
【０１１８】
別の態様において、本発明は骨の恒常性の障害を伴う疾患または障害の予防、治療および／または緩和方法を含み、該方法は、患者における本明細書に記載のポリヌクレオチドまたはポリペプチドの発現に干渉することができる分子の使用を含む。
【０１１９】
別の態様において、本発明は骨の恒常性の制御方法を含み、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）所望の宿主細胞に、インビトロまたはインビボで本発明によるサンプル核酸またはサンプル核酸を含む発現ベクターを導入する工程、
（ｂ）該核酸を発現させる工程、および、
（ｃ）該核酸による発現産物または該発現ベクターの産物によって骨の恒常性を調節する工程。
【０１２０】
好適な態様において、本発明はさらに骨芽細胞の分化誘導方法を含み、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）所望の宿主細胞に、インビトロまたはインビボで本発明によるサンプル核酸またはサンプル核酸を含む発現ベクターを導入する工程、
（ｂ）該核酸を発現させる工程、および、
（ｃ）宿主細胞の骨芽細胞への分化を刺激する工程。
【０１２１】
好適な態様において、本発明はインビトロまたはインビボでの所望の標的細胞における骨の恒常性の調節のため、特に骨芽細胞分化のためのタンパク質融合体またはその断片を含むポリペプチドを提供する。例えば、骨芽細胞および／または破骨細胞活性の阻害または骨芽細胞分化の誘導が哺乳類、好ましくはヒト細胞に対するポリペプチドの投与の直接的結果として起こりうる。本発明のポリペプチドを含む組成物の標的細胞への送達は、疎水性結合、親水性結合、イオン性結合および／または共有結合相互作用を介して異種ポリペプチド、異種核酸、毒素、またはプロドラッグとの結合を介して起こりうる。
【０１２２】
細胞核の核へのポリペプチドまたはポリヌクレオチドの送達は、ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを、ショウジョウバエからのアンテナペディアタンパク質の短い成分（１６または７アミノ酸）に融合させることによって達成できる（ペネトラチン（登録商標）、Cyclacel）。アンテナペディアペプチドはポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞の核へと送達する。また、ヒト免疫不全ＴＡＴタンパク質からのタンパク質形質導入ドメイン（ＰＴＤ）および単純ヘルペスウイルス１型（ＨＳＶ−１）ビリオンタンパク質ＶＰ２２はともにポリペプチドまたはポリヌクレオチドに融合させた場合ポリペプチドまたはポリヌクレオチドを細胞へ導く（Cao G et. al. J Neurosci 2002 Jul 1;22(13):5423-31、H Nagahara、et. al Nature Medicine 4、1449 - 1452 (1998)、Morris et al. Biot (2001) vol 19 1173-1176）。
【０１２３】
本発明のさらなる態様は、骨量の減少によって特徴付けられる病状の治療方法を提供し、ここで該方法は、骨量増加を必要とする対象に、骨量増加に有効な量の生物活性ペプチドを投与する工程を含み、ここで該ペプチドは、実質的に配列番号：２、４、６、８、または１０からなる群から選択されるメンバーに対して少なくとも９０％の同一性を有するアミノ酸配列を含む。
【０１２４】
多種多様な発現系を利用することができる。かかる系には、染色体、エピソームおよびウイルス−由来の系、例えば、細菌性プラスミド、バクテリオファージ、トランスポゾン、酵母エピソーム、挿入要素、酵母染色体要素、ウイルス（例えば、バキュロウイルス、パポバウイルス、例えばＳＶ４０、ワクシニアウイルス、アデノウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、オーエスキー病ウイルス、アデノ随伴ウイルス、およびレトロウイルス）由来のベクター、および、それらの組合せ由来のベクター、例えば、プラスミドおよびバクテリオファージ遺伝要素由来のもの、例えばコスミドおよびファージミドが含まれる。発現系は、発現を調節および引き起こす制御領域を含んでいてもよい。一般に、宿主においてポリペプチドを産生させるためにポリヌクレオチドを維持、増殖または発現させるのに好適ないかなる系またはベクターを用いてもよい。適切なヌクレオチド配列は、発現系にあらゆる周知および常套技術を用いて挿入することができる。該技術は例えばSambrook et al.、Molecular Cloning: A Laboratory Manual （前掲）に記載のものなどである。
【０１２５】
本発明の特定の態様において、上記のようなペプチドガイド配列と、配列番号：２、４、６、８、または１０からなる群から選択されるアミノ酸配列との融合体を利用することができる。
【０１２６】
このような製剤は、常套の医薬組成物中において、単回投与または複数回投与、または徐放形態によって送達することができる。投与形態は最も有効な結果を達成するために適宜選択すればよく、好ましくは１日１または複数回の注射による。
【０１２７】
正確な用量、組成物および最適な送達計画の選択は、とりわけ配列番号：２、４、６、８、または１０の選択された化合物またはその誘導体の医薬特性によって影響される。また例えば、処置される症状の性質および重篤度、および患者の身体状態および精神的敏感さによって影響される。代表的な好適な送達計画には、経口、非経口（皮下、経皮、筋肉内および静脈内を含む）、直腸、頬側（舌下を含む）、経皮、および経鼻注入が含まれるがこれらに限定されない。
【０１２８】
医薬上許容される塩とは、配列番号：２、４、６、８、または１０の化合物またはその誘導体の所望の生物活性を保持し、毒性の副作用を示さないものである。そのような塩の例には、以下のものが含まれる。（ａ）無機酸と形成される酸付加塩、例えば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、リン酸、硝酸などとの塩；有機酸と形成される塩、例えば、酢酸、シュウ酸、酒石酸、コハク酸、マレイン酸、フマル酸、グルコン酸、クエン酸、リンゴ酸、アスコルビン酸、安息香酸、タンニン酸、パモン酸、アルギン酸、ポリグルタミン酸、ナフタレンスルホン酸、ナフタレンジスルホン酸、ポリガラクツロン酸などとの塩；（ｂ）多価金属カチオンと形成される塩基付加塩、例えば、亜鉛、カルシウム、ビスマス、バリウム、マグネシウム、アルミニウム、銅、コバルト、ニッケル、カドミウムなどとの塩；または有機カチオンから形成される塩、例えば、Ｎ，Ｎ’−ジベンジルエチレンジアミンまたはエチレンジアミンから形成される塩；または（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組合せ、例えば、亜鉛タンニン酸塩など。本発明のさらなる態様は、活性成分として、本発明の配列番号：２、４、６、８、または１０の化合物あるいはその誘導体あるいはその医薬上許容される塩を、医薬上許容される非毒性担体と混合して含む医薬組成物に関する。上記のように、かかる組成物は非経口（皮下、経皮、筋肉内または静脈内）投与用に調製してもよく、特に液体溶液または懸濁液の形態として調製してもよい；経口または頬側投与、特に錠剤またはカプセルの形態として調製してもよい；直腸、経皮投与用に調製してもよい；そして経鼻投与用、特に粉末、点鼻薬またはエアロゾルの形態で調製してもよい。組成物は便宜に単位用量形態で投与してもよく医薬分野で周知のあらゆる方法によって調製すればよい。例えば、Remington’s Pharmaceutical Sciences、17th ed.、Mack Publishing Company、Easton、Pa.、(1985)に記載のように調製すればよい。非経口投与用製剤は、賦形剤として、滅菌水または滅菌食塩水、アルキレングリコール、例えば、プロピレングリコール、ポリアルキレングリコール、例えば、ポリエチレングリコール、植物由来の油、水素化ナフタレンなどを含んでいてもよい。経口投与用の製剤は、胆汁酸塩またはアシルカルニチンの付加によって増強させてもよい。経鼻投与用の製剤は固体であってもよく、賦形剤、例えば、ラクトースまたはデキストランを含んでいてもよく、あるいは点鼻薬または定量噴霧の形態に用いるための水性または油性の溶液であってもよい。頬側投与用の典型的な賦形剤には、糖類、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、前ゼラチン化デンプンなどが含まれる。
【０１２９】
長期間にわたる対象への本発明の化合物の送達、例えば、１週間から１年間の投与は、所望の放出期間にわたって十分な活性成分を含有する徐放システムの単回投与によって達成することができる。様々な徐放システム、例えば巨大または蓄積型マイクロカプセル、徐放性移植片、浸透圧ポンプ、ベシクル、ミセル、リポソーム、経皮パッチ、イオン注入装置あるいは注射可能用量形態がこの目的のために利用できる。活性成分の送達が望まれる部位への局在化は徐放性装置のさらなる特徴であり、特定の障害の治療において有益であることが明らかであろう。徐放製剤の１つの形態は、ゆっくりと分解する、非毒性、非抗原性ポリマーに分散またはカプセル封入されたポリペプチドまたはその塩を含むものである。ポリマーは例えばコポリ（乳／グリコール）酸であり、これは米国特許第４６７５１８９号に記載されている。化合物または好ましくはその比較的不溶性の塩も、コレステロールまたはその他の脂質マトリックスペレットあるいはシラストマー(silastomer)マトリックス移植片中に製剤してもよい。さらなる遅効性、徐放性の移植片または注射可能な製剤は当業者に明かであろう。例えば、Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems、J. R. Robinson ed.、Marcel Dekker、Inc.、New York、1978、および R. W. Baker、Controlled Release of Biologically Active Agents、John Wiley & Sons、New York、1987を参照されたい。
【０１３０】
配列番号：２、４、６、８または１０の化合物およびその誘導体は所与の臨床状態の治療に有用なその他の薬剤と組み合わせて投与してもよい。骨粗鬆症およびその他の骨関連障害を治療する場合、例えば、配列番号：２、４、６、８または１０の化合物およびその誘導体を、食餌性カルシウムサプリメントまたはビタミンＤアナログと組合せて投与してもよい（米国特許第４６９８３２８号を参照されたい）。あるいは、配列番号：２、４、６、８または１０の化合物およびその誘導体を、好ましくは周期性治療計画を用いて、ビスホスホネートと組合せて（例えば米国特許第４７６１４０６号に記載）、または１または複数の骨治療薬、例えばこれらに限定されないがカルシトニンおよびエストロゲンと組合せて投与すればよい。
【０１３１】
本発明の配列番号：２、４、６、８または１０の化合物またはその誘導体は、骨量の減少によって現れる様々な哺乳類の病状の予防及び治療に有用である。特に、本発明の化合物は、ヒトにおける骨粗鬆症および骨減少症の予防および治療処置用に用いられる。さらに本発明の化合物は、その他の骨疾患の予防および治療処置用に用いられる。最後に、本発明の化合物は骨折修復のためのアゴニストおよび高カルシウム血症のためのアンタゴニストとして用いられる。
【０１３２】
１つの好適な態様において、本発明は骨の恒常性の病的障害に関する障害または疾患の治療、緩和または予防のための遺伝子療法を提供する。遺伝子療法は、核酸配列を動物へと導入し、本発明のポリペプチドの発現を達成するものである。この方法には、プロモーターまたはその他の標的組織におけるポリペプチドの発現に必要な遺伝要素に作動可能に連結した本発明のポリペプチドをコードする核酸が必要とされる。かかる遺伝子治療および送達技術は当該技術分野で公知であり、例えば、欧州特許第０７０７０７１号を参照されたい。
【０１３３】
１つの態様において、本発明の核酸は裸の（naked）ポリヌクレオチドとして送達される。裸の核酸という語は、細胞への侵入を補助、誘導または促進する作用をするあらゆる送達媒体と結合していない配列をいい、送達媒体には、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈降剤などが含まれる。裸の核酸は、当該技術分野で公知のあらゆる方法によって送達でき、送達部位への直接的針注射、静脈内注射、局所投与、カテーテル注入、およびいわゆる「遺伝子銃」が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３４】
別の態様において、本発明の核酸は、選択的組織特異的プロモーターおよび／またはエンハンサーと連結させてもよく、その結果得られるハイブリッド遺伝子を標準的方法（例えばLeder et al.、米国特許第４７３６８６６号、これは引用により本出願に含まれる）によって、動物胚の初期発達段階（例えば、授精卵母細胞段階）に導入して、選択した組織において配列番号：２、４、６、８または１０の化合物およびその誘導体が上昇したレベルで発現するトランスジェニック動物を作成すればよい（例えば、骨には、オステオカルシンプロモーター）。かかるプロモーターを用いてトランスジェニック動物における配列番号：２、４、６、８または１０の化合物またはその誘導体の組織特異的発現を直接誘導することができる。別の態様において、本発明の核酸を送達媒体を用いて送達してもよい。媒体としては、例えば、ウイルス配列、ウイルス粒子、リポソーム製剤、リポフェクチンまたは沈降剤などが挙げられる。遺伝子治療用に利用できるウイルスベクターとしては、ヘルペスウイルスベクター、バキュロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、レトロウイルスベクター、アルファウイルスベクター、アデノ随伴ウイルスベクターまたはアデノウイルスベクターあるいはこれらの組合せが挙げられるがこれらに限定されない。好適な態様において、使用されるウイルスベクターは複製欠損のもの、例えば国際特許出願第ＷＯ９９／６４５８２号に記載のアデノウイルスベクターである。
【０１３５】
対象への核酸の送達は、直接的でもよく、この場合対象は直接核酸または核酸−担持ベクターに曝され、あるいは間接的でもよく、この場合、細胞がまずインビトロで核酸によって形質転換され、次いで対象に移植される。これら２つのアプローチはそれぞれインビボまたはエキソビボ遺伝子治療として知られており、よく記載されている。さらに、本発明によるポリペプチドを用いてバイオ医薬品を作ることができる。「バイオ医薬品」という語は、組換えまたは合成によって産生されたポリペプチドまたはタンパク質のことをいう。組換えまたは合成によってポリペプチドまたはタンパク質を産生する方法は当該技術分野で周知であり、例えば、Sambrook et al. (1987)に記載されている。該バイオ医薬品をインビボで、例えば静脈内または皮下に投与してもよい。あるいは、該バイオ医薬品をインビボで、例えば患者の細胞を単離した後、細胞を該バイオ医薬品で処理することによって投与してもよい。その後、該処理された細胞を該患者に再導入すればよい。
【０１３６】
より好適な態様において、本発明は、骨の恒常性の病的障害を含む障害および疾患を治療、緩和または予防するための遺伝子療法を提供し、該療法は、本発明によるベクターの使用を含む。
【０１３７】
例えば治療目的で、本発明の核酸またはポリペプチドが導入される細胞には、あらゆる所望の入手可能な細胞型が含まれ、これには間葉細胞、間葉細胞の前駆細胞および様々な幹細胞、特に間葉幹細胞が含まれるがこれらに限定されない。
【０１３８】
好適な態様において、本発明は骨の恒常性の病的障害を含む障害の治療、緩和または予防方法を提供し、該方法は、かかる治療を必要とする患者における、ポリヌクレオチドの発現を干渉することができる、および／または本発明のポリペプチドの発現および／または機能的活性を干渉することができる分子の使用を含む。
【０１３９】
したがって、本発明は本明細書に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列が導入された細胞に関する。該細胞は薬物として利用できることが理解できよう。というのは該細胞は骨の恒常性の障害に関する病状をわずらう患者に導入することができるからである。該細胞による再増殖は患者にとって有益である。
【０１４０】
本発明は動物のゲノムに安定に組みこまれた１または複数のコピーの本発明の核酸を含むトランスジェニック非−ヒト動物または本発明の核酸の発現を調節する調節要素を含む動物に関することが理解されよう。
【０１４１】
遺伝子は様々な方法によりノックアウトすることができる。それゆえ本発明の好適な態様はノックアウト非−ヒト動物に関し、該動物は本発明の核酸をコードする１または２の対立遺伝子の欠失を含むか、あるいは該核酸の１または複数のエキソンの欠失を含む。あるいは該動物はゲノム領域において標的化突然変異を含み、ゲノム領域には調節配列が含まれ本発明のあらゆる核酸配列が含まれる。一般にノックアウトの結果、特定の遺伝子の機能が失われる。
【０１４２】
本発明のさらにより好適な態様は、本発明によるトランスジェニックまたはノックアウト非−ヒト動物の骨の恒常性、特に、骨芽細胞分化、および／または骨の恒常性に影響を与える疾患のためのモデル系としての使用に関する。
【０１４３】
別の態様において、本発明は所望の標的細胞におけるインビトロ、インビボまたはエキソビボでの骨の恒常性の調節のための抗体に基く治療法を提供する。
【０１４４】
抗体に基く治療法には哺乳類、好ましくはヒト細胞に抗−ポリペプチドまたは抗−ポリヌクレオチド抗体を投与することを含む。抗−ポリペプチドおよび抗−ポリヌクレオチド抗体の産生方法は、当該技術分野で公知である。かかる抗体は当該技術分野で公知の医薬上許容される組成物として提供される。
【０１４５】
本発明は、そのうえでマトリックスが増殖する基体(substrate)の生産方法を提供し、これは好ましくはロード・ベアリング移植片の提供に用いられ、これには関節補綴、例えば、人工臀部関節、膝関節および指関節、および顎顔面移植片、例えば歯科用移植片が含まれる。それはまた、例えば、骨欠陥および損傷又は失われた骨の増強、除去または再構築における使用のための特別の手術装置、例えば、スペーサー、または骨充填機にも利用できる。骨形成は、誘発性および誘導性プロセスによって石灰化を変化させることにより最適化することができる。ロード・ベアリング移植片（好ましくは上記のマトリックスによって被覆されたもの）の提供と上記のマトリックスを含む骨フィラーを組合せることにより、本発明による有利な方法が構成される。
【０１４６】
本発明の方法は、修正手術、即ち以前の手術装置を除く必要がある場合にも非常に好適である。
【０１４７】
未分化細胞は、分化の初期段階にある多能性の細胞であり、即ち、いまだその最終機能を有しておらず、ほとんどあらゆる所望の細胞型に誘導しうるものである。特に、例えば、骨芽細胞または破骨細胞へといまだに分化していない細胞である。かかる細胞は特に血液細胞および骨髄に存在する細胞、および脂肪組織由来の細胞である。さらに、ＭＰＣへと分化する可能性のある細胞は本発明に含まれ、これには、例えば、全能性の幹細胞、例えば胚幹細胞が含まれる。特に好適な未分化細胞は骨髄細胞であり、これには造血性細胞および特に間質性細胞が含まれる。髄細胞、特に間質性細胞が、その元の環境から取り出した場合に、骨形成プロセスにおいて非常に有効であることが見出された。
【０１４８】
未分化細胞は直接基体に適用してもよいが、基体に適用する前に基体の不在下で増殖させるのが好ましい。後者の態様では、細胞は増殖の後もほぼ未分化のままであり、本発明の目的のために、それらはいまだに未分化であると称される。その後に細胞を分化させる。分化は好適な誘導物質、例えば糖質コルチコイド、例えばデキサメタゾンの存在によって誘導又は促進される。特に好適な分化誘導物質は、本発明のポリヌクレオチドおよびポリペプチドである。
【０１４９】
未分化細胞の使用により、数々の利点がもたらされる。第一に、その低い分化度は、より高い増殖速度を意味し、好適に誘導され制御された機能を徐々に有するようになる。さらに、これらの細胞を培養することによって、有機及び無機成分を含む所望の骨マトリックスが生産できるだけでなく、培地中およびマトリックス中に、組織の増殖および既存の生組織への適応に必須ないくつかの因子が生じる。また、培地は移植プロセスにおいてともに用いられる、増殖因子などの活性の因子のソースとなりうる。さらに、かかる未分化細胞は、例えば成熟骨細胞と比べて大量かつ容易に入手できることが多く、回収の際の罹患率が低い。１００μｍもの厚さのマトリックスを、未分化細胞の使用の結果として産生することができる。
【０１５０】
使用される細胞は同種異型（allogeneou）細胞でもよいが、移植されるのと同じ対象に由来する細胞、即ち自己細胞の使用が好ましい。
【０１５１】
未分化細胞を適用し、培養する基体は金属、例えば、チタン、コバルト／クロム合金またはステンレス鋼であってもよく、生理活性の表面、例えば、リン酸カルシウム、ポリマー表面、例えばポリエチレンなどであってもよい。あまり好ましくは無いが、シリカ質材料、例えばガラスセラミックスも、基体として用いることができる。リン酸カルシウムは基体の不可欠な成分ではないが、最も好ましくは、チタンなどの金属およびリン酸カルシウムである。基体は多孔性であってもそうでなくてもよい。
【０１５２】
細胞は例えば、１０３−１０６／ｃｍ２、特に１０４−２ｘ１０５細胞／ｃｍ２の割合で与えるとよい。
【０１５３】
本発明による方法において用いる培地は通常知られている培地、例えばＭＥＭ（最小必須培地）などでよい。好ましくは培地は条件培地である。この点に関して、条件培地とは、類似の細胞が以前に培養されており、培地が該細胞によって分泌されたポリペプチドなどの、細胞増殖と細胞増加に重要な因子を含むものであることを理解されたい。
【０１５４】
好ましくは、本発明のポリヌクレオチドは該ポリヌクレオチドが発現する条件下で細胞に導入される。また、本発明のポリペプチドは細胞に対して与えられる。
【０１５５】
細胞は十分にマトリックス層を産生するようしばらく培養される。例えば、マトリックス層は少なくとも０．５μｍ、特に１から１００μｍ、とりわけ１０−５０μｍの厚さを有する。細胞を培地と例えば２−１５週間、特に４−１０週間接触させるとよい。
【０１５６】
基体に与えられた場合、マトリックスの産生の結果、基体の表面積を少なくとも５０％、特に少なくとも８０％を被覆する連続的または準連続的コーティングが生じる。
【０１５７】
したがって、本発明はまた、特に未分化細胞の分化および骨芽細胞の形成および骨マトリックスの連続的形成のための、骨組織産生の誘導のための本明細書に記載の核酸またはポリペプチドの使用にも関する。
【０１５８】
好適な態様において、本発明はしたがって骨組織のインビトロ産生方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）未分化哺乳類細胞を基体に適用して細胞基体を形成させる工程、
（ｂ）本発明のポリヌクレオチドを該細胞に導入するか、あるいは本発明によるポリペプチドと細胞基体を、未分化細胞が骨芽細胞へと分化するのに十分な時間接触させ、連続的骨マトリックスを産生する工程。
【０１５９】
好適な態様において、骨マトリックスは少なくとも基体の表面において約０．５μｍの厚さを有する。
【０１６０】
別の態様において、本発明は移植片の産生方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）ヒトの間葉多能性細胞（ＭＰＣ）を、例えば、骨髄、脂肪組織またはその他のＭＰＣを含有する自己ソースから単離する工程、
（ｂ）本発明による核酸を含むポリヌクレオチド配列をＭＰＣに導入することにより、あるいは本発明によるポリペプチドを該ＭＰＣに与えることにより、ＭＰＣから骨芽細胞へのエキソビボ分化を誘導する工程、
（ｃ）工程（ｃ）の骨芽細胞をマトリックスまたはマトリックス−形成材料と混合する工程、および、
（ｄ）工程（ｂ）の骨芽細胞で合成移植片を被覆するか、あるいは工程（ｃ）の骨芽細胞とマトリックスまたはマトリックス−形成材料の混合物で被覆し、移植片を産生する工程。
【０１６１】
別の態様において、本発明は、移植片の産生方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）骨髄、脂肪組織またはその他のＭＰＣを含有する自己ソースからヒトの間葉多能性細胞（ＭＰＣ）を単離する工程、
（ｂ）本発明による核酸を含むポリヌクレオチド配列を該ＭＰＣに導入することにより、あるいは、本発明によるポリペプチドを該ＭＰＣに与えることにより、該ＭＰＣから骨芽細胞へのエキソビボ分化を誘導し、これによって移植片が産生される工程、および、（ｃ）工程（ｂ）の骨芽細胞を混合する工程。
【０１６２】
さらに別の態様において工程（ｂ）の骨芽細胞をマトリックスまたはマトリックス−形成材料と混合させることにより、移植片を産生する。
【０１６３】
マトリックスまたはマトリックス−形成材料と混合され、本発明の方法により産生されたエキソビボで分化した骨芽細胞を用いて骨髄移植術またはエキソビボで分化したＭＰＣを有効に移植するために用いることができるあらゆる経路によって静脈内、皮下への移植を行なう。
【０１６４】
別の態様において、本発明は未分化細胞から骨芽細胞または破骨細胞への分化のための、本発明のポリペプチドの使用に関する。
【０１６５】
別の態様において、本発明は本明細書に記載した方法によって入手できる分化細胞の、移植片の製造のための使用に関する。
【０１６６】
好適な態様において、本発明は骨の欠陥の治療用組成物に関し、該組成物は、骨の欠陥を満たすために用いられるマトリックスまたはマトリックス−形成材料および、骨芽細胞分化を誘導するのに十分な濃度の本発明のポリペプチドを含む。
【０１６７】
別の好適な態様において、本発明は骨の欠陥の治療用組成物に関し、該組成物は、骨の欠陥を満たすために用いられるマトリックスまたはマトリックス−形成材料と、有効な量の形質移入可能な本発明によるベクターを含む。
【０１６８】
好適な態様において、本発明は薬物としての使用のための本発明の核酸、ポリペプチドまたは抗体を提供する（疾患の治療および診断の両方のためのもの）。本発明による該治療は、上記又は下記の、骨の恒常性の病的障害または骨芽細胞分化の誘導の不在または減少を含む疾患または障害の予防、治療および／または緩和に関する。
【０１６９】
したがって、本発明は本明細書に記載の核酸、ポリペプチドまたは抗体の、調節を失った骨の恒常性、特に骨芽細胞分化の不在または低下を検出するための診断キットの調製のための使用に関する。
【０１７０】
さらなる態様において、本発明は、対象における、例えば異常な骨芽細胞分化を含む骨の恒常性の障害に関する病状またはかかる病状への罹患性を診断する方法を提供し、該方法は、以下の工程を含む：
（ａ）生物サンプルにおける、ゲノムおよび該核酸の調節配列中の突然変異を含む、本発明による核酸における突然変異の有無を判定する工程、および、
（ｂ）該突然変異の有無に基いて病状または病状に対する罹患性を診断する工程。
【０１７１】
さらなる態様において、本発明は対象における異常な骨芽細胞分化に関する病状または該病状に対する罹患性を診断する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
ａ）本発明の核酸に対応する該対象のｍＲＮＡサンプルまたは本発明の核酸のゲノム配列に対応する該対象のゲノムＤＮＡサンプルを得る工程；
ｂ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列を決定する工程；
ｃ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列と、本発明の核酸または本発明の核酸をコードするデータベースから得られるゲノム配列とを比較する工程；および、
ｄ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列と、本発明の核酸または本発明の核酸をコードするデータベースから得られるゲノム配列との相違を同定する工程。
【０１７２】
対象のｍＲＮＡが本発明の核酸に「対応する」とは、対象のｍＲＮＡが本発明の核酸と同じ遺伝子から転写されることを意味することを理解されたい。さらに、対象のゲノムＤＮＡが本発明の核酸をコードするゲノム配列に「対応する」とは、対象のゲノムＤＮＡが本発明の核酸と同じ遺伝子をコードすることを意味することを理解されたい。
【０１７３】
ＧｅｎＢａｎｋなどのデータベースをサーチすることにより核酸に対して同一性を有する領域（エキソン）を含むゲノム配列を同定することができることは当該技術分野で周知である。かかるゲノム配列はしたがって、核酸をコードすると称される。
【０１７４】
さらに別の態様において、本発明は対象における例えば異常な骨芽細胞分化を含む骨の恒常性の障害に関する病状または病状に対する罹患性を診断する方法に関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）生物サンプルにおける本発明の核酸または本発明のポリペプチドの発現の存在又は量を決定する工程、および、
（ｂ）例えば異常な骨芽細胞分化を含む骨の恒常性の障害に関する病状または病状に対する罹患性を、該核酸または該ポリペプチドの発現の存在又は量に基いて診断する工程。
【０１７５】
別の態様において、本発明は対象における骨の恒常性の障害に関する病状および／または病状に対する罹患性を診断する方法を提供し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明の核酸をコードする遺伝子の染色体転座の存在を判定する工程、および、
（ｂ）該遺伝子の染色体転座の存在に基いて骨の恒常性の障害に関する病状および／または病状に対する罹患性を診断する工程。
【０１７６】
本発明において記載される診断とは好ましくは、本発明のプローブ、プライマーまたは抗体を用いた検出手段によって達成される。
【０１７７】
好適な態様において、本発明は、患者における、例えば異常な骨芽細胞分化を含む調節を失った骨の恒常性を検出する診断キットを提供し、該キットは、本発明の核酸、本発明によるプローブまたはプライマー、本発明のポリペプチド、または本発明の抗体を、好適なバッファーとともに含み、また検出手段または検出形式部分（例えば、膜などの固体担体）を含む。上記に基く診断キットを設計するための好適な形式および技術は当該技術分野で周知である。好ましい形式にはあらゆる当該技術分野で公知のマイクロアレイ形式が含まれる。
【０１７８】
薬剤スクリーニング
本発明は、骨の恒常性の障害、特に骨芽細胞分化の欠失または減少および／または破骨細胞増殖、分化および活性の増加によって特徴付けられる（またはそれに関連する）障害の治療に用いられる化合物または薬剤の同定方法を提供する。かかる方法は、本明細書において「薬剤スクリーニングアッセイ」または「バイオアッセイ」と称され、典型的には、候補／被験化合物または薬剤の、本発明のタンパク質、特に配列番号：２、４、６、８、または１０、あるいはあらゆるその誘導体、ホモログ、免疫学的に活性な機能的な断片と相互作用する（例えば結合する）能力、本発明のタンパク質と標的分子との相互作用を調節する能力、および／または本発明の核酸の発現および／または本発明のタンパク質の活性を調節する能力についてスクリーニングする工程を含む。１または複数のこれらの能力を有する候補／被験化合物または薬剤は薬剤として、病的な骨の恒常性の障害、調節を失った本発明の核酸の発現および／または調節を失った本発明のタンパク質の機能的活性によって特徴付けられる障害の治療のために利用できる。候補／被験化合物、例えば抗体、低分子、例えば、小有機分子およびペプチド、およびその他の薬剤候補は、例えば、コンビナトリアルライブラリーおよび天然物ライブラリーから入手できる。
【０１７９】
治療用化合物のスクリーニングは、あらゆる当該技術分野で公知の薬剤スクリーニング技術とすればよい。
【０１８０】
したがって、本発明は本明細書に記載の核酸、ポリペプチドまたは抗体の、骨の恒常性、特に骨芽細胞分化を干渉する薬剤、被験化合物または抗体を同定するための薬剤または被験化合物スクリーニングのための使用に関する。
【０１８１】
１つの態様において、本発明は、本発明のポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのバリアントまたは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片と相互作用（例えば結合）する候補／被験化合物をスクリーニングするための薬剤スクリーニングアッセイを提供する。典型的には該アッセイは無細胞アッセイであり、本発明のポリペプチドまたはタンパク質、そのバリアントまたは誘導体、その触媒的活性または免疫原性活性な、および／または機能的な断片と、候補／被験化合物とを、例えば、候補／被験化合物と、本発明のポリペプチドまたはタンパク質、あるいはそのバリアントまたは誘導体、あるいはその免疫学的に活性な、および／または機能的な断片と相互作用（例えば結合）し、複合体を形成する条件下で混合する工程、および複合体の形成を検出する工程を含み、ここで、候補化合物が本発明のポリペプチドまたはタンパク質、そのバリアントまたは誘導体、あるいは免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片と相互作用（例えば結合）する能力は、該複合体中の候補／被験化合物の存在によって示される。本発明のタンパク質と候補化合物の間の複合体の形成は、例えば、標準的イムノアッセイを用いて定量できる。
【０１８２】
かかる試験において用いられる本発明のタンパク質、その触媒性または免疫原性の断片あるいはそのオリゴペプチドは、溶液中に遊離であってもよく、固体支持体に固定されていてもよく、細胞表面に担持されていてもよく、細胞内に位置していてもよい。
【０１８３】
別の態様において、本発明は、本発明のタンパク質と、本発明のタンパク質が通常相互作用する分子（標的分子）または本発明のタンパク質を特異的に認識する抗体との相互作用（おそらく本発明のタンパク質の機能的活性）を調節する（例えば、刺激または阻害する）候補／被験化合物を同定するためのスクリーニングアッセイを提供する。かかる標的分子の例には、本発明のタンパク質と同じシグナル伝達経路にあるタンパク質、例えば、本発明のタンパク質のシグナル伝達経路タンパク質の上流（活性の刺激剤および阻害剤の両方を含む）または下流で機能するものが含まれる。
【０１８４】
典型的には、アッセイは無細胞アッセイであり、以下の工程を含む。本発明のポリペプチドまたはタンパク質、タンパク質標的分子および候補／被験化合物を、例えば候補化合物の存在を除いては、本発明のポリペプチドまたはタンパク質が標的分子と相互作用（例えば結合）する条件下で混合する工程、および本発明のポリペプチドまたはタンパク質を含む複合体の形成を検出する工程、または本発明のポリペプチドまたはタンパク質と標的分子との相互作用／反応を検出する工程。かかる標的分子に例には、本発明のタンパク質と同じシグナル伝達経路にあるタンパク質、例えば、本発明のタンパク質のシグナル伝達経路の上流（活性の刺激剤および阻害剤の両方を含む）又は下流で機能するタンパク質あるいはリガンドまたは既知の受容体または本発明のポリペプチドまたはタンパク質を特異的に認識する抗体が含まれる。
【０１８５】
本発明のポリペプチドおよびタンパク質由来の、バリアントまたは誘導体あるいは触媒性、または免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片も上記の薬剤スクリーニングアッセイに利用できることが理解される。
【０１８６】
別の態様において、本発明は、本発明による核酸または本発明によるポリペプチドの活性、好ましくは骨の恒常性の変調、そしてより好ましくは骨芽細胞分化の誘導に協同する被験化合物の同定のための薬剤スクリーニングアッセイを提供し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）宿主細胞を提供する工程、
（ｂ）被験化合物と、本発明による核酸または本発明によるポリペプチドとを、該被験化合物が該本発明による核酸または本発明によるポリペプチドと相互作用する条件下で混合する工程、
（ｃ）工程（ｂ）の産物を該宿主細胞に与える工程、および、
（ｄ）該宿主細胞の骨芽細胞分化の誘導を判定し、それによって該被験化合物の協同活性を同定する工程。
【０１８７】
別の態様において、本発明は骨芽細胞分化を誘導するタンパク質と標的分子との相互作用を調節する被験化合物の同定のための薬剤スクリーニングアッセイを提供し、これは以下の工程を含む：
（ａ）（ｉ）被験化合物、
（ｉｉ）本発明によるポリペプチドまたはそのバリアントあるいは誘導体、またはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる剤、および、
（ｉｉｉ）被験化合物の不在下で該剤と相互作用する標的分子、
をその相互作用を可能とする条件下で混合する工程、および、
（ｂ）該剤と標的分子、または該剤と被験化合物を含む複合体の形成を検出する工程。
【０１８８】
別の態様において、本発明は骨芽細胞分化を調節、好ましくは増強または拮抗する被験化合物の同定のための薬剤スクリーニングアッセイを提供し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）宿主細胞上で、被験化合物がタンパク質標的分子と相互作用する条件下で、被験化合物とタンパク質標的分子とを混合する工程、
（ｂ）該宿主細胞の骨芽細胞分化の誘導を判定する工程、
（ｃ）本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、またはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片と、タンパク質標的分子とを宿主細胞上で、該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、またはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片が該タンパク質標的分子と相互作用する条件下で混合する工程、および、
（ｄ）該宿主細胞の骨芽細胞分化の誘導を判定する工程、
（ｅ）工程（ｂ）と工程（ｄ）を比較しての骨芽細胞分化の誘導の差異を判定し、それによって骨芽細胞分化を調節、好ましくは拮抗または増強する被験化合物を同定する工程。
【０１８９】
別の好適な態様において、本発明は本発明の核酸を含む骨芽細胞分化遺伝子の発現を調節する被験化合物の同定のための薬剤スクリーニング方法を提供し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）本発明による核酸を含む発現ベクターを形質移入された宿主細胞を提供する工程、
（ｂ）被験化合物を該宿主細胞に導入する工程、および、
（ｃ）該核酸によってコードされるポリペプチドの発現レベルを測定する工程。
【０１９０】
別の好適な態様において、本発明は、以下の工程を含む競合薬剤スクリーニングアッセイを提供する：
（ａ）本発明による抗体を提供し、該抗体と、本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、またはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる薬剤との結合についての被験化合物を混合させる工程、ここで該抗体と該被験化合物は該薬剤への結合について競合する、そして、
（ｂ）該薬剤に対する該抗体と該被験化合物との相対結合アフィニティーを判定する工程。
【０１９１】
別の好適な態様において、本発明は複合体中の結合パートナー間の相互作用を調節する化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイを提供し、ここで該結合パートナーの少なくとも一方が、本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる薬剤であり、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）被験化合物と複合体とを、複合体における相互作用を調節するのに十分な時間接触させる工程；
（ｂ）複合体の相互作用における変化について該複合体をモニターする工程；および、
（ｃ）該複合体における相互作用を変化させる被験化合物を同定する工程。
【０１９２】
本発明のヌクレオチド配列がコード領域の一部でしかない場合、当該技術分野で公知の様々な方法を用いることによってヌクレオチド配列を延長させてコード配列を完全なものにすることができる。同様に、本発明のヌクレオチド配列に当該技術分野で公知の様々な方法を用いて該ヌクレオチド配列に対応する遺伝子を同定することができる。これには、調節要素、例えばプロモーター、エンハンサー、サイレンサー、転写開始部位、ＣｐＧ−島、内部リボゾーム移行部位などが含まれる。したがって、本発明は、本発明において同定される配列の調節要素に正にまたは負に影響を及ぼすことができる分子を対象または宿主細胞に与えることにより、該核酸の発現を調節する手段及び方法を提供する。かかる方法としては例えば、薬剤、遺伝子調節要素、キメラ・ジンク・フィンガー−含有タンパク質または当該技術分野で公知のあらゆる方法が挙げられる。
【０１９３】
特に、本発明は、本発明による１または複数の遺伝子の発現を調節する被験化合物の同定のための薬剤スクリーニング方法を提供し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）本発明による核酸に対応する遺伝子を含む宿主細胞を提供する工程、
（ｂ）該遺伝子の発現を被験化合物が調節する条件下で、該宿主細胞に被験化合物を導入する工程、および、
（ｃ）該遺伝子の発現を判定し、それによって該遺伝子の発現を調節する被験化合物を同定する工程。
【０１９４】
複合体形成の検出には、複合体の調節的定量が含まれ、例えば、本発明のタンパク質の誘導効果を測定することが含まれる。候補化合物の存在下での（候補化合物の不在下で検出されたものと比較しての）統計的有意差、例えば本発明のタンパク質と標的分子との相互作用の減少（例えば本発明のタンパク質と標的分子との間の複合体の形成における減少）は本発明のタンパク質と標的分子の間の相互作用の変調（例えば、刺激または阻害）を示す。本発明のタンパク質と標的分子との間の複合体の形成の変調は、例えば、イムノアッセイを用いて定量することができる。
【０１９５】
それゆえ、本発明は、複合体における結合パートナー間の相互作用を調節する化合物の同定のための薬剤スクリーニングアッセイを含み、ここで少なくとも該結合パートナーの一方は、本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片であり、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）複合体における相互作用を調節するのに十分な時間、複合体と被験化合物とを接触させる工程；そしてその後、
（ｂ）相互作用における変化について該複合体をモニタリングする工程、これによって相互作用における変化が検出されると、相互作用を調節する化合物が同定される。
【０１９６】
複合体における結合パートナー間の相互作用に対するモジュレーターは、本明細書に記載の方法によって同定された場合、本発明に含まれることが明かである。特に、本発明は、本明細書に記載のあらゆる方法によって同定可能な産物または化合物を含む。
【０１９７】
また、本発明は本明細書に記載のアッセイによって同定され得る化合物と医薬上許容される担体とを混合する工程を含む組成物の産生方法も含む。
【０１９８】
本発明は、本明細書に記載のあらゆる方法によって同定可能な産物または化合物を含む組成物も包含することは明らかであろう。
【０１９９】
さらに、本発明は、本明細書に記載のあらゆる方法によって同定され得る産物または化合物の薬物としての使用も含む。
【０２００】
上記の薬剤スクリーニングアッセイを行なうためには、本発明のタンパク質またはその標的分子のいずれかを固定化してタンパク質の一方または両方の非複合形態からの複合体の分離を簡単にすること、あるいはアッセイを自動化させることによって簡単になる。候補化合物の存在下または不在下での本発明のタンパク質の標的分子に対する相互作用（例えば、結合）は、反応物を含有するのに好適な容器で達成される。そのような容器の例としては、マイクロタイタープレート、試験管、微量遠心管が含まれる。１つの態様において、マトリックスへのタンパク質の結合を可能にするドメインを付加する融合タンパク質を提供することができる。例えば、本発明のタンパク質に「Ｈｉｓ」タグを付加し、次いでＮｉ−ＮＴＡマイクロタイタープレート（Paborsky et al.、1996）に吸着させてもよいし、本発明のタンパク質とＰｒｏｔＡとの融合体をＩｇＧに吸着させ、次いでこれを細胞溶解液（例えば、（３５）Ｓ−標識化したもの）および候補化合物と混合し、そして混合物を複合体形成を導く条件下で（例えば、塩およびｐＨについての生理条件）インキュベートしてもよい。インキュベーションの後、プレートを洗浄して非結合標識を除き、そしてマトリックスを固定化する。放射能の量は直接測定してもよく、あるいは複合体の解離後の上清において測定してもよい。あるいは、複合体をマトリックスから解離させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離し、そしてビーズ画分にみられる本発明のタンパク質に結合しているタンパク質のレベルを標準的電気泳動技術を用いてゲルから定量してもよい。
【０２０１】
マトリックスにタンパク質を固定化するその他の技術を本発明の薬剤スクリーニングアッセイに用いてもよい。例えば、本発明のタンパク質またはその標的分子のいずれかをビオチンとストレプトアビジンとの結合を利用して固定化してもよい。本発明のビオチン化したタンパク質分子は、ビオチン−ＮＨＳ（Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミド）から当該技術分野で周知の技術を用いて調製でき（例えば、ビオチン化キット、Pierce Chemicals、Rockford、Ill.）、そしてストレプトアビジン−コーティングされた９６ウェルプレート（Pierce Chemical）のウェルに固定化することができる。あるいは、本発明のタンパク質と反応するが、タンパク質とその標的分子との結合を干渉しない抗体をプレートのウェルに誘導体化させ、本発明のタンパク質を抗体結合によってウェル中にトラップしてもよい。上記のように、本発明のタンパク質に結合するタンパク質および候補化合物の調製物を本発明のタンパク質を含むプレートのウェル中でインキュベートし、ウェル中にトラップされた複合体の量を定量してもよい。かかる複合体の検出方法には、ＧＳＴ−固定化複合体についての上記の方法に加えて、本発明のタンパク質に対する標的分子と反応する抗体を用いた複合体の免疫検出、本発明のタンパク質と反応し標的分子と競合する抗体を用いた免疫検出；および標的分子に結合する酵素活性の検出に基く酵素結合アッセイが含まれる。
【０２０２】
本発明のタンパク質に対して好適な結合アフィニティーを有する化合物のハイ・スループット・スクリーニングを提供する薬剤スクリーニングのためのその他の技術は、「Determination of Amino Acid Antigeneity」Geysen HN、国際特許出願ＷＯ第８４／０３５６４号（１３／０９／８４公表）に詳細に記載されており、これらは引用により本出願に含まれる。要約すると、多種多様の小ペプチド被験化合物が固体基体、例えばプラスチック・ピンまたはその他の表面で合成される。タンパク質被験化合物は、本発明のタンパク質の断片と反応し、そして洗浄される。結合した本発明のタンパク質は次ぎに当該技術分野で周知の方法によって検出される。精製された本発明のタンパク質は直接上記の薬剤スクリーニング技術において使用するためにプレートにコーティングしてもよい。あるいは、非−中和抗体を用いてペプチドを捕獲し、固体担体上にそれを固定化してもよい。
【０２０３】
本発明はまた、本発明のタンパク質と結合することができる中和抗体が、本発明のタンパク質に対する結合について被験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイも含む。このようにして、抗体を用いて本発明のタンパク質の有する１または複数の抗原決定基を共有するタンパク質の存在を検出することができる。特に、本発明は以下の工程を含む競合薬剤スクリーニングアッセイに関する：
（ａ）本発明による抗体と被験化合物とを、ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片に対する結合について競合させる工程、および、
（ｂ）該被験化合物と比較しての該抗体の競合の量を測定する工程。
【０２０４】
さらに別の態様において、本発明は、病的な骨の恒常性の障害、骨芽細胞分化に対する干渉、本発明の核酸の調節を失った発現または本発明のタンパク質の調節を失った機能的活性によって特徴付けられる（またはそれに関連する）障害の治療において使用することができる化合物の同定方法を提供する（例えば、薬剤スクリーニングアッセイ）。同様に、本発明は、病的な骨の恒常性の障害、骨芽細胞分化に対する干渉、本発明の核酸の調節を失った発現または本発明のタンパク質の調節を失った機能的活性によって特徴付けられる（またはそれに関連する）障害の治療において使用することができる化合物の同定方法を提供する（例えば、薬剤スクリーニングアッセイ）。該方法は典型的には、化合物または薬剤の本発明の核酸の発現または本発明のタンパク質の機能的活性を調節する能力をアッセイする工程を含み、それにより病的な骨の恒常性の障害、骨芽細胞分化に対する干渉、本発明の核酸の調節を失った発現または本発明のタンパク質の調節を失った機能的活性によって特徴付けられる（またはそれに関連する）障害の治療において使用される化合物が同定される。
【０２０５】
好適な態様において本発明は異常な骨芽細胞分化を含む疾患または障害を予防、治療および／または緩和するために有用なポリヌクレオチドまたはポリペプチド被験化合物を同定する薬剤化合物スクリーニングアッセイを提供し、これは以下の工程を含む：
（ａ）被験化合物と本発明による核酸とを接触させる工程、および、
（ｂ）該化合物が該核酸と相互作用するか否かを判定する工程。
【０２０６】
好ましくは、本発明は調節を失った骨の恒常性によって特徴付けられる障害の治療において使用することができる化合物を同定するための薬剤スクリーニングアッセイに関し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）本発明による核酸、またはその部分、または本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）工程（ａ）の細胞に対して試験すべき化合物を、該化合物が該核酸、またはその部分、または該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片と相互作用することができる条件下で与える工程、
（ｃ）工程（ｂ）の化合物が該核酸、またはその部分の発現あるいは該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片の活性または量を調節する能力をアッセイする工程、および、
（ｄ）調節を失った骨の恒常性によって特徴付けられる障害の治療のための化合物を同定する工程。
【０２０７】
本明細書に記載の薬剤スクリーニングアッセイによって同定された化合物を用いて、例えば、調節を失った骨の恒常性または調節を失った骨芽細胞分化によって特徴付けられるかあるいはそれに関連する障害を治療することができる。
【０２０８】
好適な態様において本発明は、骨の恒常性の障害に関する疾患または障害を予防、治療および／または緩和するための薬剤スクリーニングアッセイを提供し、該アッセイは以下の工程を含む：
（ａ）スクリーニングされる化合物と、本発明による核酸、または本発明によるポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片を接触させる工程、および、
（ｂ）該化合物が該核酸または該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片の活性に影響を与えるか否か、好ましくは該活性に拮抗するか否かを判定する工程。
【０２０９】
本発明はまた、本発明のポリペプチドに結合することができる中和抗体がポリペプチドまたはその断片に対する結合について被験化合物と特異的に競合する競合薬剤スクリーニングアッセイの使用も含む。このように、抗体を用いて本発明のポリペプチドと１または複数の抗原性エピトープを共有するペプチドの存在を検出することができる。特に、本発明のポリペプチドまたはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片の発現または機能的活性を調節する抗体を同定するためのスクリーニングアッセイに関し、該方法は以下の工程を含む：
（ａ）本発明のポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片を含む細胞を提供する工程、
（ｂ）該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片の発現および／または活性を測定する工程、
（ｃ）本発明の抗体を工程（ａ）の細胞に、該抗体が該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片と相互作用できる条件下で与える工程、
（ｄ）該抗体が、該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片に結合した後に、該ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片の発現および／または活性の変調を判定する工程。
【０２１０】
本明細書に記載したアッセイには、酵素結合免疫吸着検定法（ＥＬＩＳＡ）または細胞ベースの酵素結合免疫吸着検定法（ＣＥＬＩＳＡ）が含まれるがこれらに限定されない。かかるアッセイにより、本発明のポリペプチド対象の発現または機能に影響を与えるか調節する化合物または分子のライブラリーを用いて核酸断片、ポリペプチド、および治療用化合物のスクリーニングが可能となる。本発明のポリペプチド対象の発現は、標的又は被験化合物によって影響を受けるか、誘導されるかあるいは阻害される。特定の場合、該標的または被験化合物は受容細胞に導入される遺伝子の発現産物である。該遺伝子は、例えば、遺伝子発現ライブラリー由来のものでもよい。該受容細胞には、ヒト細胞が含まれるがこれに限定されない。該遺伝子発現ライブラリーには、アデノウイルス発現ライブラリーが含まれるがこれに限定されない。
【０２１１】
本明細書で引用されるすべての特許、刊行物（公表された特許文献を含む）の開示およびデータベース登録番号および寄託登録番号は、引用により本出願にその個々の特許、刊行物、データベース登録番号および寄託登録番号が本出願に開示されていると同じ程度に、その全体が本出願に含まれる。
【０２１２】
以下の図面および実施例は本発明の態様を例示するものであり、本発明を限定するものではないことを理解されたい。本発明は具体的に記載された方法以外によっても実施することができ、これらはすべて添付の特許請求の範囲に含まれる。
【実施例】
【０２１３】
（実施例１）
ライブラリー構築
アデノウイルスベクター形式（胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔ（商標）ｃＤＮＡライブラリー）においてアレイに並べたヒト胎盤ｃＤＮＡ発現ライブラリーを構築し、アルカリホスファターゼアッセイを用いてスクリーニングした。アレイに並べたアデノウイルスライブラリーの概念に関する詳細は、国際特許出願ＷＯ９９／６４５８２号（Arrayed adenoviral libraries for performing functional Genomics（機能ゲノム科学を行なうためのアレイに並べたアデノウイルスライブラリー））に記載されている。胎盤アデノウイルスｃＤＮＡライブラリーの作成は他の文献に記載されている（欧州特許出願第０１８７００３８．５号）。
（実施例２）
【０２１４】
ＢＭＰ−２対照ウイルスの作成
ヒトＢＭＰ−２の長いＥＳＴを有するＩＭＡＧＥクローンをIncyte Genomesから購入した：ＩＭＡＧＥクローン２１６３１２９、２１８９１８３および５６２９９７は、それぞれＧｅｎｂａｎｋ番号が、ＡＩ４９７６０６、ＡＩ５３７７８１およびＡＡ０８６００８である。細菌穿刺をアンピシリン含有寒天プレートに画線し、３７℃での一晩の培養後に得られたシングルコロニーをコロニーＰＣＲにかけて、ヒトＢＭＰ−２の開始および停止コドンにわたるプライマーを用いてＤＮＡインサートを確認した。対応するプライマーの配列は以下のとおりである：
5’-GGTTGTGGGTGTCGCTAGTGGATCCCGC（配列番号：１１）
および、
5’-GCGAAGCTTACCATGGTGGCCGGGACCC（配列番号：１２）。
予測された長さのＰＣＲ産物に対応する細菌コロニーを取り上げ、液体ＬＢ培地に播種し３７℃で一晩培養した。プラスミドを選抜したコロニーから抽出し、インサートを上記のＰＣＲプライマーを用いたＰＣＲにより単離した。その結果得られたＰＣＲ産物をＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化し、前もって同じ制限酵素で消化しておいたアデノウイルスベクターｐＩＰｓｐＡｄａｐｔ６にライゲーションした。ＢＭＰ−２ｃＤＮＡを含有するプラスミドを単離し、インサートをＰＣＲ反応中に導入された可能性のある突然変異について配列分析によって確認した。野生型ヒトＢＭＰ−２ｃＤＮＡと同一性を有するｃＤＮＡインサートを含有するクローンをこのようにして得、アデノウイルスベクターに挿入した。
（実施例３）
【０２１５】
ｈＣＡＲのアデノウイルス−媒介発現を用いたヒトＭＰＣの感染効率の上昇
間葉前駆細胞（ＭＰＣ）はＡｄ５ウイルスによって形質導入するのが難しい。アデノウイルス感染はアデノウイルス繊維タンパク質の球状ノブ(knob)ドメインと宿主細胞受容体との複合体の形成によって開始する。Ａｄ５（およびその他のアデノサブグループＡ、Ｃ、Ｄ、ＥおよびＦのメンバー）に対する繊維受容体は、コクサッキーウイルスおよびアデノウイルス受容体（ＣＡＲ）として同定されている（Bergelson et al.、1997）。したがって、ＣＡＲ受容体を担持しないか、あるいは該受容体を非常に低い基礎レベルで発現する細胞は、Ａｄ５ウイルスを含むこれらアデノウイルスベクターのいずれによっても感染を効率的に行うのが難しい。かかる細胞をより効率的に感染させるひとつの方法は、グループＢからのＡｄウイルスを用いることか、あるいは異なる受容体を介して細胞に入ることができる繊維バリアント（例えば、Ａｄ５ｆｉｂ３５またはＡｄ５ｆｉｂ５１）を用いることである。このアプローチは非常に有用であることが判明しているが、Ａｄ５において作成された既存の胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡライブラリーに用いることはできない。それゆえ代替ストラテジーを開発し、ここでは、細胞が胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡライブラリーウイルスに感染するに先立ってｈＣＡＲ（ヒト受容体）を発現するＡｄ５またはＡｄ５繊維バリアントによってまず感染される。このアプローチの原理は、実質的にあらゆる単一の細胞系またはポリクローナル一次細胞集団を感染させることができるものであり、これを図２に示す。Ａｄ５ウイルス（またはバリアント）を含有するｈＣＡＲの形質導入効率は中程度であるが、ライブラリーウイルスによる効率的な感染が結果的に可能となるアデノウイルス媒介トランスファーの後に十分なｈＣＡＲ受容体がＭＰＣ表面に発現しうる。
【０２１６】
上記のアデノウイルスによるＭＰＣの感染方法は以下のようにして最適化した：
ＭＰＣを３８４ウェルプレートにウェル当たり１０００細胞の密度で播種し、感染多重度（ＭＯＩ）１０、５０、または２５０にてＡｄ５−ｈＣＡＲを用いて感染した。Ａｄ５Ｃ０１−ｅＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）対照ウイルスをＭＯＩ１０００、５０００または２５０００にて用いた。感染効率を６日後に蛍光顕微鏡を用いて分析した（Zeiss Axiovert 25、4X 対物レンズ））。Ａｄ５Ｃ０１−ｅＧＦＰによる単一感染について、大多数のＭＰＣを感染させるには高いＭＯＩが要求された（図３を参照されたい）。しかし、Ａｄ５−ｈＣＡＲを用いたＡｄ５Ｃ０１−ｅＧＦＰウイルスによるＭＯＩ１０００での二重感染は感染効率を単一感染と比較して有意に上昇させた。これらのデータにより感染効率を増加させるためにＡｄ５−ｈＣＡＲ二重感染を用いることの有効性が示された。この実験を６ウェルプレートに播種したＭＰＣ細胞について繰り返した。６ウェルプレート形式を用いて、蛍光標示式細胞分取器（ＦＡＣＳ）によるＡｄ５−ｅＧＦＰ形質移入効率の定量分析のための細胞数を増加させた。図４に示すように、Ａｄ５−ｅＧＦＰとＡｄ５−ｈＣＡＲの二重感染により、図３において得られた結果どおりに単一Ａｄ５−ｅＧＦＰ感染と比べて形質移入効率の上昇が示された。
【０２１７】
二重感染においては、単一感染と比較してＭＰＣを感染するために用いうるＡｄ５−ｅＧＦＰのタイターはかなり低くてよい。これは機能ゲノム科学スクリーニングにとって重要な経費節減因子をあらわす。
【０２１８】
Ａｄ５Ｃ１５−ｈＣＡＲとＡｄ５Ｃ２０−ｈＣＡＲが、Ａｄ５（ｆｉｂ５）−ｈＣＡＲと類似のＭＯＩにてヒトＭＰＣ上でのＡｄ５（ｆｉｂ５）ウイルスの感染効率を上昇させるかも調べた（データは示さず）。
【０２１９】
本特許出願に記載されたすべてのウイルスはＥ１Ａ、Ｅ１ＢおよびＥ２Ａ遺伝子が欠損しており繊維バリアント５を備えたＡｄ５ゲノム骨格を有する。本節において記載したウイルスＡｄ５Ｃ１５−ｈＣＡＲとＡｄ５Ｃ２０−ｈＣＡＲのみが、繊維修飾（ｆｉｂ５の代わりに、Ｃ１５またはＣ２０）を有し、そのゲノムにおいてＥ２Ａ遺伝子が欠失していない。
（実施例４）
【０２２０】
内在性アルカリホスファターゼの検出のためのハイ・スループット・スクリーニング方法の開発
アッセイについての記載：
間葉前駆細胞が適当な因子（例えば、ＢＭＰ２、図１を参照されたい）の存在下で骨芽細胞に分化するかを調べた。かかる因子をスクリーニングするためのアッセイを、骨芽細胞分化プログラムにおける初期マーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＰ）酵素の活性をモニターすることにより開発した。ＭＰＣを３８４ウェルプレートに播種し、１日後にＡｄ５ｆｉｂ５−ｈＣＡＲおよび個々のＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔウイルス（実施例３に記載のように）で同時に共感染させた。感染（ｄｐｉ）の６日後、細胞のアルカリホスファターゼ活性を測定した（図５）。
【０２２１】
アッセイ設定：
補綴移植／置換手術を受けた患者の骨髄から単離したＭＰＣをIsotisから得た。細胞を播種するための最適な細胞密度を、透明な底を有する黒色の３８４ウェルプレート(Costar or Nunc)にＭＰＣをウェル当たり５００、１０００、１５００、または２０００細胞の密度で播種することによって決定した。細胞の播種の１日後、ＭＰＣの骨芽細胞分化を誘導する因子（デキサメタゾンまたは組換えヒトＢＭＰ−２）または促進する因子（ベータ・グリセロホスフェート）を含有する溶液（１００ｘストック溶液としてIsotisから得た）を培地に個別にまたは組み合わせて添加した（図６を参照されたい）。６日後、内在性ＡＰ活性の上方制御を以下のように測定した：
培養上清を細胞から取り出し、各ウェルに１０μｌのメチルウンベリフェリルヘプタホスフェート（methylumbelliferyl heptaphosphate（ＭＵＰ））溶液（Sigmaカタログ番号M3168）を添加する前に細胞をＰＢＳで１回洗浄した。次いでプレートを３７℃で３０分間インキュベートし、酵素反応を各ウェルに５μＬの１ＭＮａ２ＣＯ３溶液を添加することによって停止させた。ＡＰ活性によるＭＵＰ基質の切断によって生じた蛍光を蛍光プレートリーダー（Fluostar、BMG）で測定した。未処理細胞および、デキサメタゾン（ＤＥＸ）、ベータ・グリセロホスフェート（ｂＧＰ）、組換えヒトＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２）またはそれら因子の組み合わせで処理した細胞から得た相対蛍光ユニット（ＲＬＵ）を比較した（図６）。アルカリホスファターゼ活性は明らかにデキサメタゾンおよびＢＭＰ２処理によって上方制御されていた（図６）。ベータ・グリセロホスフェートによる細胞の処理またはベータ・グリセロホスフェートとその他の因子の組み合わせによる細胞の処理によっては（相乗的に）内在性ＡＰ活性は上方制御されなかった。細胞密度５００にて播種した細胞からのシグナルは、より高い密度（１０００、１５００、または２０００）で播種したものからのものと比べて弱かったため、前者の密度は低すぎると考えた。１０００、１５００または２０００の細胞密度から得られたシグナルは同程度であったので、確実に内在性ＡＰ活性の上方制御の検出を可能とする細胞の最小数、すなわちウェル当たり１０００細胞をさらなる実験に用いた。
【０２２２】
アデノウイルス感染を用いるアッセイ確認(validation)
アッセイを陽性対照として骨形態形成タンパク質２ウイルス（Ａｄ５−ＢＭＰ２）を用いて確認した。Ａｄ５−ｅＧＦＰまたはＡｄ５−空ウイルスを陰性対照として用い、バックグラウンド効果および細胞のウイルス感染の効果をそれぞれ評価した。ＭＰＣを３８４ウェルプレートにウェル当たり１０００細胞の密度で播種し、１日後陰性対照または陽性対照ウイルスのいずれかをＭＯＩ１０００で、Ａｄ５−ｈＣＡＲウイルスをＭＯＩ１００で組み合わせて共感染を用いて感染させた。ＭＯＩ１００のＡｄ５−ｈＣＡＲでの単一感染を対照に含めた。内在性ＡＰ活性を上記のように感染の３、６、８および１０日後に測定した。Ａｄ５−ＢＭＰ２ウイルスは明らかに内在性ＡＰ活性をバックグラウンドより高く上方制御し（図７）、ＭＰＣにおけるウイルス−媒介ＢＭＰ２発現は骨芽細胞分化の誘導に対してｒｈＢＭＰ２またはデキサメタゾンと類似の効果を誘発することが示された。さらに、内在性ＡＰ活性は感染の６日後に強く上方制御され、さらに感染後８または１０日後には上昇しなかった。最大の検出が得られる最も早い時期はしたがって感染後６日目であり、この時期を更なる実験におけるＡＰ活性の測定に用いた。
【０２２３】
Ａｄ５−ＢＭＰ２を陽性対照として用いて、ＭＰＣに感染の６日後に添加するＭＵＰ試薬についての最適インキュベーション時間を決定した。０、５、１０、２０および６０分のインキュベーション時間を３７℃で比較した（図８）。シグナル対ノイズ比は０、５、１０および２０分のインキュベーションで同程度であったが６０分では落ちた。１５分のインキュベーション時間をハイ・スループット・スクリーニング・モードにおける上記のプロトコールを行うために最適であると考えた。
【０２２４】
図８に記載した実験において、反応をＮａ２ＣＯ３溶液の添加によって停止させていることに注意されたい。この実験およびその他の実験により、ＭＵＰ基質の添加の４５分以内に蛍光シグナルを読む限りは停止溶液を添加することによる利益はないことが明らかとなった。さらに、ＭＵＰを添加する前の細胞の洗浄によって細胞を洗浄するよりも良いシグナル対ノイズ比が得られるわけではなかった。それゆえ洗浄工程を以後の実験においては省略した。
（実施例５）
【０２２５】
３８４ウェル形式において６５００のアデノウイルスを用いたパイロットＡＰスクリーニング
数万のアレイに並べたアデノウイルスのライブラリーをスクリーニングするために、実施例４において記載したアッセイをハイ・スループット・スクリーニングに適用した。
【０２２６】
対照プレートの調製
ＢＭＰ２、ｅＧＦＰ、ＰＰＡＲ−ガンマ、またはルシフェラーゼ導入遺伝子を形質導入した様々な対照ウイルスまたは空ウイルス（そのゲノム中に導入遺伝子を含まないウイルスとして定義する）を含有する９６ウェル対照プレートを調製した。対照プレートのレイアウトを図９に示す。これらウイルスをライブラリーウイルスについて記載したように増殖させた。０日目に２２，５００のＰｅｒＣ６細胞を９６ウェルプレートの各ウェルに２００μｌのＰｅｒＣ６培地中に播種した。１日目に、１μＬのウイルスストックをこのプレートのウェルに添加した。数日後、完全な細胞変性効果（ＣＰＥ）が各ウイルス−含有ウェルについて確認され、細胞を凍結融解サイクル（それぞれ−８０℃および室温）に付しその結果得られた増殖したウイルスを含有する粗溶解液のアリコットを新しい９６ウェルプレートに入れた。プレートをシールし（Nuncから得たシール、カタログ番号236366）、−８０℃で次に使うまで保存した。
【０２２７】
ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーのスクリーニングのためのプロトコール
０日目に、ＭＰＣ細胞を、透明の底を有する黒色の３８４ウェルプレート（Costar or Nunc）に、６０μｌの培地中でウェル当たり１０００細胞の密度で播種した。１日後、１０□ｌのＡｄ５−ｈＣＡＲウイルス（１０７ウイルス粒子／ｍｌ）を９６チャンネルディスペンザー（Hydra290、Robbins Scientific）によって９６ウェルＡｄ５−ｈＣＡＲウイルスストックプレートのウェルから３８４ウェルプレートの各ＭＰＣ含有ウェルに移した。同じ日に、対照ウイルスまたはＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーからのウイルスを３８４ウェルプレート中のＭＰＣに添加した。対照ウイルスまたはＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーウイルスを担持するプレートを室温で解凍し、２μｌの各ウイルス（平均２ｘ１０９ウイルス粒子／ｍｌと見積もられる）を９６チャンネルディスペンザー（Hydra100、Robbins Scientific）によって個々のＭＰＣ含有ウェルに移した。対照プレートからのウイルスを４連でスクリーニングした。ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーからのウイルスを二連でスクリーニングした。新たに感染させた細胞を含有するプレートを次いで３７℃でインキュベートした。感染の６日後、すべての培養上清を吸引し、そして１５μｌのＭＵＰを各ウェルに添加した。プレートを３７℃で１５分間インキュベートし、ＡＰ活性について蛍光プレートリーダー（Fluostar、BMG）を用いてモニターした。対照プレートについての典型的な実験から得られた結果を図１０に示す。
【０２２８】
データ分析
FluoStarから得たデータを以下のように分析した：
対照プレートについて、Ａｄ５−ＢＭＰ２ウイルスを除くすべてのウイルスについて得られた相対蛍光ユニットの平均を計算した。これらのデータポイントについての標準偏差も算出した。次いでヒットコーリング（calling）についてのカットオフ値を平均プラス標準偏差の３倍と予め設定した。このカットオフ値を超える値は９９％をこえるスコア付けの統計的可能性を持って確実にバックグラウンドを超える。ＢＭＰウイルスについて得たすべてのシグナルは明らかにこのカットオフ値を超え（図１０）、これによりこのアプローチの有効性が示された。したがって、このライブラリースクリーニングプロトコールにしたがって対照プレートを加工した場合擬陽性または擬陰性は見られなかった。
【０２２９】
ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーからのウイルスをスクリーニングした場合、バックグラウンドはすべてのデータポイントの平均をとることによって算出した。平均は、同じスクリーニングラウンドの中のプレートによってわずかに異なるため、２つのカットオフ値を評価した；１つは所与のプレートにおけるすべてのデータポイントについて計算した平均プラス標準偏差の３倍とし、もう１つはスクリーニングラウンドにおけるすべてのプレートのすべてのデータポイントについて計算した平均プラス標準偏差の３倍とした。
【０２３０】
標準偏差の３倍を用いた場合でもヒットの割合はかなり高く多数の擬陽性が取られたので、カットオフ値を後で、すべてのデータポイントについて計算した標準偏差の３．４倍を用いることによってより厳しくした。
【０２３１】
ＡＰアッセイにおいて６５００のＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔウイルスをスクリーニングしたところ、６５のウイルスのスコアがカットオフ値を超えた。これら６５のウイルスのスコアのうち１０が平均プラス標準偏差の４倍より高いスコアであった。
【０２３２】
骨形成を促進する因子と知られているＦｏｓＢ（Sabatakos et al.、2000）が、より強いスコアを示すヒット（平均プラス標準偏差の９倍の値）としてこのアッセイにおいて同定された。全長ＦｏｓＢのｍＲＮＡから作成された天然のスプライスバリアントであるデルタＦｏｓＢは以前に、Sabatakosおよびその同僚によってマウスにおけるインビボの骨芽細胞の増殖と分化の強力なインデューサーであると記載されており、したがって、本発明者らの知見が裏付けられる。骨芽細胞分化において役割を果たすことが確認されたＦｏｓＢの同定によりさらに本発明者らのアッセイが確認される。このｃＤＮＡが６５００のウイルスのかなり穏やかなスクリーニングにより見出されたことにより、骨細胞分化において重要な役割を果たす遺伝子産物を見つけることができるハイ・スループット・スクリーニング方法の速度が立証された。
（実施例６）
【０２３３】
パイロットＡＰスクリーニングからのヒットの再スクリーニング
実施例５において記載したＡＰスクリーニングにおいて同定された６５のウイルスを元のウイルスストックから再増殖させた。これは、９６ウェルプレートにウェル（２００μｌのＤＭＥＭ＋１０％ＦＢＳ）当たり４ｘ１０４細胞の密度で播種したＰｅｒＣ．６／Ｅ２Ａ細胞を、ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリープレートからの１μｌの元のウイルスストック溶液によって感染させることによって達成した。これらプレートを６日間インキュベーションした後、ＣＰＥがほとんどのウェルで観察され、そしてプレートを３７℃のインキュベーターから−８０℃のフリーザーに移した。Ｖ−底９６ウェルプレートにおいて解凍した際にこれらのウイルスのアリコットを作成し、次いでこれをＡＰスクリーニングにおいて再スクリーニングした。後者は実施例５に記載のように行った。元のヒットウイルスから、５のウイルスが再スクリーニングにおいて陽性のスコアを示した。
（実施例７）
【０２３４】
確認したヒットの配列同定
配列決定分析のために、ヒットアデノウイルスによって発現されるｃＤＮＡの断片を、Ａｄａｐｔプラスミドのマルチクローニングサイトに隣接するベクター配列に相補的なプライマーを用いたＰＣＲによって増幅した。以下のプロトコールを用いてこれらのＰＣＲ断片を得た。ＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ細胞を９６ウェルプレートにウェル当たり４０，０００細胞の密度で１８０μｌのＰｅｒＣ６／Ｅ２Ａ培地中に播種した。細胞を次いで一晩１０％ＣＯ２加湿インキュベーター中で３９℃でインキュベートした。１日後、細胞を再増殖させた「ヒットウイルス」からの２μｌの粗細胞溶解液で感染させた。細胞をさらに３４℃、１０％ＣＯ２で、ＣＰＥ（細胞が膨らみ、丸くなることによって明らかになり、典型的には感染の２、３日後）が現れるまでインキュベートした。上清を次いで細胞から除き、５０μｌの溶解バッファー（１ｍｇ／ｍｌのプロテイナーゼＫ（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号745 723）と０．４５％Ｔｗｅｅｎ−２０（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号1335465）を追加したＭｇＣｌ２を含有する１ｘExpand High Fidelityバッファー（Roche Molecular Biochemicals、カタログ番号 1332465））と交換した。混合後、細胞溶解液を無菌微量遠心管に移し、５５℃で２時間インキュベートし、その後１５分間の不活性化工程を９５℃で行った。５μｌの細胞溶解液を次いでＰＣＲマスターミックスに添加した。ＰＣＲマスターミックスは５μｌのＭｇＣｌ２を含有する１０ｘExpand High Fidelity バッファー、１μｌのｄＮＴＰ混合物（各ｄＮＴＰについて１０ｍＭ）、１μｌのｐＣｌｉｐ−ＦＯＲプライマー（１０μＭストック、配列：5’GGT GGG AGG TCT ATA TAA GC、配列番号：１３）、１μｌのｐＡｄａｐｔ−ＲＥＶプライマー（１０μＭストック、配列：５’GGA CAA ACC ACA ACT AGA ATG C、配列番号：１４）、０．７５μｌのExpand High Fidelity ＤＮＡポリメラーゼ（３．５Ｕ／μｌ、Roche Molecular Biochemicals）および３６．２５μｌのＨ２Ｏから構成される。ＰＣＲは、PE Biosystems GeneAmp PCR system 9700において以下のように行った：
ＰＣＲ混合物（全部で５０μｌ）を９５℃で５分；９５℃で３０秒；５５℃で３０秒；６８℃で４分インキュベートし、これを３５サイクル繰り返した。最後に６８℃でのインキュベーションを７分間行った。１０μｌのＰＣＲ混合物を２μｌの６ｘゲルローディングバッファーと混合し、０．５μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含む０．８％アガロースゲルにロードし、増幅産物を分離した。増幅断片のサイズを同じゲルにロードした標準ＤＮＡラダーから評価した。
（実施例８）
【０２３５】
骨芽細胞分化スクリーニングからのヒットのＲＴ−ＰＣＲによる確認
ＲＮＡ抽出
間葉前駆細胞（ＭＰＣ）からのトータルＲＮＡを感染の７日後にＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬（Life Technologies）を用いて製造業者の指示にしたがって抽出した。簡単に説明すると、細胞（２４−ウェルプレート）を３００μｌのＴＲＩｚｏｌ（商標）試薬中でホモゲナイズした。相をクロロホルムの添加により分離し、ＲＮＡを水相からイソプロパノールにより沈降させた。ＲＮＡペレットを７０％エタノールで洗浄し、風乾し、５０μｌのＤＥＰＣ処理Ｈ２Ｏに溶解させた。
【０２３６】
全ＲＮＡ抽出物の濃度をＲｉｂｏＧｒｅｅｎＲＮＡ定量試薬（Molecular Probes）を用いて定量し、最終濃度が４０ｎｇ／μｌとなるように希釈した。
【０２３７】
逆転写ＰＣＲ
遺伝子特異的プライマーをＡＬＰＬ（ヒトアルカリホスファターゼ肝臓／骨／腎臓）およびＡＬＰＩ（ヒトアルカリホスファターゼ腸）、ＡＬＰＰ（ヒトアルカリホスファターゼ胎盤（ＰＬＡＰ））、ＡＬＰＰＬ２（ヒトアルカリホスファターゼ胎盤−様）に対して設計した。ＡＬＰＩ、ＡＬＰＰおよびＡＬＰＰＬ２はヌクレオチドレベルで高度に類似しており、１つのディジェネレート・プライマー対によってＰＣＲ増幅した。
Ｙ＝ＣまたはＴ、Ｍ＝ＡまたはＣ、Ｋ＝ＧまたはＴ、Ｓ＝ＣまたはＧ。
ＢＡＰ−ＦＯＲ：GTGTGGGGTGAAGGCCAATGAGGGC（配列番号：１５）
ＢＡＰ−ＲＥＶ：TCTTCCAGGTGTCAACGAGGTCCAGG（配列番号：１６）
ＰＬＡＰ／ＩＡＰ−ＦＯＲ：GTGCGGGGTCAAGGSCAACTTCCAG（配列番号：１７）
ＰＬＡＰ／ＩＡＰ−ＲＥＶ：YCACAGACKGGTCCAGGGAMGCCTG（配列番号：１８）
ヒトβ−アクチンプライマー（Clontech）をＲＮＡ完全性の確認のために用いた。
【０２３８】
ＲＴ−ＰＣＲはＲＮＡテンプレートが存在するか否かを判定するためのもっとも高感度の技術である。Titan One Tube RT-PCRキット（Roche Molecular Biochemicals カタログ番号 1 855 476）は一段階反応系である。これは第一本鎖合成についてはＡＭＶを、ＰＣＲ工程についてはExpand High Fidelity酵素混合物を基礎とする。プロトコールは実質的に製造業者の指示のとおりとした。
【０２３９】
【表１】
Figure 2005503792
【０２４０】
結論
上記プロトコールを陰性対照、陽性対照（ｅＧＦＰ、ＢＭＰ−２、ＢＭＰ−７、ＰＬＡＰおよびデキサメタゾン）およびヒットＨ４−２について行った。ＢＡＰ発現レベルの上昇（内在性ＢＡＰ発現を上回る）が、Ｈ４−２によって感染したＭＰＣから抽出されたトータルＲＮＡサンプルから検出された。いくつかのサンプルから検出されたおよそ１ｋｂのＰＬＡＰ断片はＲＮＡ抽出物に混入したゲノムＤＮＡから作られた。ＲＮＡサンプルはＤＮａｓｅ処理を施していなかった。
（実施例９）
【０２４１】
分泌タンパク質としての活性についてのヒットの確認
バイオ医薬品は、特異的かつ強力な生理作用を有する分泌ヒトタンパク質である。天然物であるため、これらは治療のための価値のある薬物である。ハイ・スループットＢＡＰスクリーニングから得られたヒットは、それらがインビボまたはエキソビボで送達でき、骨芽細胞分化を誘導することができればバイオ医薬品として用いることができる。
【０２４２】
ハイ・スループットＢＡＰスクリーニングにおいて同定されたヒットの推定バイオ医薬品としての能力を分析するために以下の実験を行った：細胞（以下「産生細胞」と称する）を骨芽細胞分化を誘導するかまたは誘導しない対照ウイルスで感染させた。培養上清を感染の３または４日後（ｄｐｉ）に収集し、新たに播種したＭＰＣ細胞に添加した。培養上清が骨芽細胞分化を誘導する分泌タンパク質を含んでいる場合は、産生細胞からＭＰＣへ培養上清を移した後６日目にこれらタンパク質をアルカリホスファターゼ活性を測定することによって（実施例４および５に記載のように）同定した。
【０２４３】
ＨｅＬａおよびＵ２ＯＳ産生細胞を１０％ＦＢＳを追加したＤＭＥＭ中で培養した。細胞を３８４ウェルプレートに６０μｌの培地中、ウェル当たり５０００細胞の密度で播種した。４時間後、細胞を１μｌの対照（Ａｄ５Ｃ０１−ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＦｏｓＢ、ＰＬＡＰ、ＬａｃＺ、ルシフェラーゼまたはｅＧＦＰ）または増殖したヒットウイルスで感染させた。２または３日後、ＭＰＣ細胞を３８４ウェルプレートに３０μｌの培地中、ウェル当たり９００細胞の密度で播種した。ＭＰＣの播種の1日後、ＨｅＬａまたはＵ２ＯＳ産生細胞から回収した４０μｌの培養上清を９６−チャンネルディスペンザー（Hydra100、Robbins Scientific）によって、３８４ウェルプレートの対応するＭＰＣ−含有細胞に移した。６日後、細胞のアルカリホスファターゼ活性を先に記載したようにしてＭＰＣについて測定した。
（実施例１０）
【０２４４】
Ｈ４−２の特徴
実施例９に記載のアッセイにおいて骨芽細胞分化のインデューサーとして同定されたＨ４−２の特徴を以下に記載する。
【０２４５】
Ｈ４−２ｃＤＮＡインサート配列（図１３ａ、配列番号：１）は推定ノッチ・リガンドである、ヒトデルタ２／Ｄｌｌ４に対応する。このｃＤＮＡは受託番号AB036931として記録されたGenBankにおいて記載されたように、ノッチ・リガンド・デルタ−２についてヒト（Homo sapiens）ｈｄｅｌｔａ２と同一性を有する。この遺伝子はGenBank record NM_ 019074に記載されているように、ヒト（Homo sapiens）デルタ−様４ホモログ（ショウジョウバエ（Drosophila））（ＤＬＬ４）とも称される。AB036931配列と比較すると、Ｈ４−２は該遺伝子における内部ＮｏｔＩ制限部位によって３’末端が切断されている。しかし、全長コード配列はＨ４−２において保存されている。
【０２４６】
プロモーター配列に対して正方向の鎖のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）の位置、そして公表された配列との配列類似性に基づき、第１０ＯＲＦがこのｃＤＮＡのコード配列を表す可能性が高い。正方向の鎖の第１０ＯＲＦは、塩基２７７から塩基２３３４である。ＯＲＦ１０によってコードされるタンパク質は、GenBank record NP_061947のタンパク質配列と完全に一致する（図１３ｂ、配列番号：２）。
【０２４７】
GenBank record NP_061947から、以下のアノテーションが得られた：この遺伝子は、ショウジョウバエデルタ遺伝子のホモログである。デルタ遺伝子ファミリーは、ＤＳＬドメイン、ＦＧＦリピート、および膜貫通ドメインによって特徴付けられるノッチ・リガンドをコードする。
【０２４８】
２つの学術論文により、マウスにおけるこのｃＤＮＡの発現パターンについての情報が提供されいている：強い発現は心臓および肺でみられ、骨格筋および腎臓では弱く、脳および肝臓ではさらに弱いが検出可能な発現がみられる（Krebs et al.、2000; Shutter et al.、2000）。しかし、マウスまたはヒト生物体におけるＤｅｌｔａ２／Ｄｌｌ４の機能についての証拠はない。
【０２４９】
それゆえ、本発明によりＤｅｌｔａ２／Ｄｌｌ４が骨芽細胞分化および骨の恒常性一般において役割を果たす可能性が示されたことにより、本発明に開示する発見は、骨再構築のレギュレーターにおいて新規かつ予期せぬ知見を提供する。
（実施例１１）
【０２５０】
骨芽細胞分化のインデューサーとしてのＤｌｌ４（Ｈ４−２）
Ｈ４−２ｃＤＮＡは全長Ｄｌｌ４タンパク質をコードする。Ｄｌｌ４はノッチ・リガンドのＤｅｌｔａファミリーのメンバーであるため、ノッチ・リガンドであると推定される。Ｄｌｌ４は細胞外領域にＤＳＬおよびＥＧＦ−リピートドメインを有しており、これはノッチ・リガンドに特徴的である（図１５を参照されたい）。ノッチ・リガンドは、ノッチ−細胞内−ドメイン（ＮＩＣＤ）媒介シグナル伝達を誘導する。
【０２５１】
Ｄｌｌ４はＢＡＰを上方制御するが、ＰＬＡＰもＩＡＰも上方制御しない。
リアルタイムＰＣＲデータにより、Ｄｌｌ４は特異的に骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）ｍＲＮＡ上方制御するが（図１７）、胎盤（ＰＬＡＰ）または腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＰ）ｍＲＮＡは上方制御しないことが示され（データは示さず）、Ｄｌｌ４が骨形成能力を有することが示された。
【０２５２】
石灰化
骨形成のプロセスは数々の連続的な現象からなる。骨形成の初期段階において、骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）が上方制御される。４つのアルカリホスファターゼがあるがそのうち１つのみが骨特異的であるため、アルカリホスファターゼ活性自体は絶対に安全な骨形成マーカーではない。それゆえ石灰化などの骨形成のより後期段階で起こるより特異的な現象に注目することが重要である。
【０２５３】
骨組織は、有機物質（例えば、コラーゲン）のマトリックスに埋め込まれた細胞と無機物質（Ｃａ２＋およびリン酸）とからなる。骨石灰化は、分化した骨細胞をそれらが沈着しているマトリックスに対して染色することによってインビトロで示される。Von KossaおよびAlizarin RedS染色によりそれぞれ沈着したカルシウムおよびリン酸が可視化される。
【０２５４】
一次ヒトＭＰＣを６ウェルプレート（Costar or Nunc）にウェル当たり５０，０００細胞の密度で播種した。ＭＰＣを1日後にＡｄ５Ｃ１５−ｈＣＡＲ（ＭＯＩ１０００）およびＡｄ５Ｃ０１−対照またはヒットウイルス（ＭＯＩ、５００、１５００、または４５００）で共感染させた。１００μｇ／ｍｌＬ−アスコルビン酸および１０ｍＭベータ・グリセロホスフェートを追加した培地を、週に３回交換した。ＢＭＰ−２およびｅＧＦＰウイルスをそれぞれ陽性対照および陰性対照として用いた。実験開始の２０から３０日後、細胞をVon Kossa 染色またはAlizarin RedS 染色で染色した。
【０２５５】
Von Kossa 染色した細胞をまず、ＰＢＳで３回洗浄し、次いで４％パラホルムアルデヒドで４℃で４時間固定し、蒸留水で３回洗浄した。５％硝酸銀溶液を添加した後、プレートをＵＶ光に１時間さらした。残りの硝酸銀を２．５％チオ硫酸ナトリウムで中和する前後に細胞を蒸留水で３回すすいだ。リン酸の沈着が黒い集団として可視化され、白色光学顕微鏡下で簡単に撮影できた（図２０、下側パネル）。
【０２５６】
Alizarin RedS染色は以下のように行った：細胞をＰＢＳで２回洗浄し、１０％パラホルムアルデヒドで４℃で４５分間固定し、ＰＢＳで３回洗浄した。細胞を４０ｍＭ Alizarin RedS 水溶液、ｐＨ ４．１−４．３と１０分間インキュベートし、次いで蒸留水で５回洗浄した。染色を白色光を用いて評価および撮影した（図２０、上側パネル）。
（実施例１２）
【０２５７】
Ｄｌｌ４突然変異体
ｐ６Ｄｌｌ４＿Ｈｉｓ
プロリン５２８の後の切断の結果膜貫通ドメインが欠損している可溶性ヒトＤｌｌ４突然変異体を構築した。Ｃ−末端６ヒスチジンアミノ酸タグをタンパク質に付加し、可溶性Ｄｌｌ４タンパク質バリアントの検出と精製を容易にした。
【０２５８】
Ｄｌｌ４突然変異体を構築するために、ＰｆｕＴｕｒｂｏポリメラーゼを用いたＰＣＲ反応において、Ｈ４−２クローンからのｃＤＮＡをテンプレートとして用い、またｐＩｐｓｐＡｄａｐｔ６−Ｈ４−２プラスミドＤＮＡに対する特異的プライマーもともに（hifidelity、Stratagene）用いた。
フォワードプライマー：5’AACCGAGGTCCAAGCCGCATGTGCC3’（配列番号：１９）はＤｌｌ４コード配列のヌクレオチド１２５５から１２７９に特異的にアニーリングする。
リバースプライマー：
【化１】
Figure 2005503792
（配列番号：２０）はＤｌｌ４のコード配列１５６６−１５８４に相補的である。このプライマーは６ヒスチジンをコードする１８ヌクレオチド（下線部）、その後停止コドンとＢａｍＨＩ制限酵素のための認識部位を形成する６のさらなる塩基（太字）を含む。この認識部位は３つのさらなるヌクレオチドによって分解から保護されている。得られたＰＣＲ断片は３５８ｂｐ長であり、これをＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した結果、１６２ｂｐの産物が得られた。元のＨ４−２クローン（ｐＩｐｓｐＡｄａｐｔ６−Ｄｌｌ４）もＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化し、１４１１ｂｐの断片を切り出し、これをＰＣＲ実験からの精製した１６２ｂｐの断片と置換した。このプラスミドの配列をシークエンシングによって確認した。
【０２５９】
このアダプターベクターを用いて国際特許出願ＷＯ９９６４５８２号に記載の方法に従ってアデノウイルスを作成した。
【０２６０】
可溶性Ｄｌｌ４タンパク質：Ｓｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６
アデノウイルスによる形質導入の後、突然変異体タンパク質をＰｅｒ．Ｃ６細胞で産生させた。培養上清を回収し、突然変異体タンパク質をＮｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製した。精製した分子の分析により不純物はわずかであることが判明した。抗−Ｈｉｓ６モノクローナル抗体を用いたウェスタンブロッティングにより、みかけの予測分子量６５−７０ｋＤａで移動するＨｉｓ６−含有タンパク質バンドが明らかとなった（図１８、「Ｗ．ブロット」パネル）。
【０２６１】
Ｓｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６はＡＰ活性を上方制御する
３８４マイクロタイタープレート（Costar；黒色壁、透明底）のウェルを様々なタンパク質濃度の精製したＳｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６でコーティングした（ウェル当たり１５μｌのＳｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６溶液、濃度は１６０から０．０４μｇ／ｍｌ）。１日後、ＭＰＣをウェル当たり１０００細胞の密度で播種した。細胞の播種の６日後、ウェルにおけるＡＰ活性をＭＵＰを用いて測定した（図１９）。ＡＰ活性の最大の上方制御は、プレートが１０μｇ／ｍｌのＳｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６でコーティングされた場合に観察された。
【０２６２】
Ｓｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６によって誘導される石灰化
骨石灰化は、実施例２に記載のように、分化した骨細胞をそれらが沈着したマトリックスについて染色することによってインビトロで可視化することができる。ここでは、全長Ｄｌｌ４リガンドを含有するウイルスを用いる代わりに、６ウェルプレートを精製Ｓｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６でコーティングし、１日後、ヒトＭＰＣをコーティングしたウェルにウェル当たり１００，０００細胞の密度で播種した。２１日後、単層を石灰化について染色した。実験はＨ４−２およびＮＩＣＤについて記載したように行った。
（実施例１３）
【０２６３】
Ｄｌｌ４に対して高いアフィニティーを有する骨形成ノッチ受容体の同定
Ｄｌｌ４はノッチ・リガンドのデルタ・クラスに属する。どの受容体にＤｌｌ４が結合するか、そしてどのノッチ受容体がＤｌｌ４の骨形成シグナルを伝達するかを判定するために、以下の実験を行った：
【０２６４】
Ｄｌｌ４およびノッチ・シグナル伝達
全長ノッチ受容体１、２、３および４のＣ−末端にＧａｌ４−ＶＰ１６融合によってタグ付加した。ノッチ受容体に対するリガンド結合によって、タンパク分解現象によって遊離したノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）は核へ移行する。Ｇａｌ４−ＶＰ１６タグにより、ルシフェラーゼの上流に鎖状のＧａｌ４結合部位を導入したレポーター系を用いた場合、核への移行と外因性ノッチの転写活性の研究が可能となる。外因性ノッチ受容体によって作り出されたシグナルはしたがって内在性ノッチ受容体の存在下で測定することができ、内在性ノッチ受容体はここで用いた実験の設定においてはシグナルを作り出すことができない。さらに、核への移行は（例えば、免疫蛍光によって）測定することができ、外因性に発現した受容体はウェスタンブロッティングによって定量することができる。
【０２６５】
Ｄｌｌ４−ノッチ−媒介シグナル伝達を調べるために、細胞にＣ−末端にＨｉｓ６タグを備えた全長Ｄｌｌ４コンストラクトを含有するベクター、４つのノッチ受容体の１つがＧａｌ４−ＶＰ１６タグに融合したベクター、およびＧａｌ４−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトを含有するベクターを形質導入した。Ｄｌｌ４−ノッチ・シグナル伝達はルシフェラーゼによって生じた発光シグナルを読み取ることによって測定した。発光データをタンパク質の量について規準化した。さらに、４つのノッチ受容体のそれぞれによって、Ｄｌｌ４によって誘導されるルシフェラーゼ活性を、Ｇａｌ４−ＶＰ１６およびＨｉｓ６タグの量についてウェスタンブロッティングによって規準化した。このようにして、４種類の実験から得たデータを比較し、Ｄｌｌ４コンストラクトおよびノッチコンストラクトの両方の形質導入効率について規準化した。
【０２６６】
ノッチ受容体に対するＤｌｌ４の結合
懸濁細胞を４つのタグ付加したノッチ受容体融合コンストラクトの１つおよびＧａｌ４−ルシフェラーゼレポーターコンストラクトによって形質導入した。これら細胞をＳｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６とともにインキュベートした。Ｄｌｌ４のノッチ受容体に対する結合をルシフェラーゼレポーターにより、またＦＡＣＳ分析により測定した。Ｓｏｌ−Ｄｌｌ４−Ｈｉｓ６とのインキュベーションの後、細胞をタグに対する抗体とともにインキュベートした。蛍光標識した抗体により、細胞をＦＡＣＳ分析にかけることでＤｌｌ４の細胞−表面ノッチ受容体に対する結合の分析が容易となる。陰性対照より統計的に高いシグナルを示す、抗体の細胞に対する結合は、Ｄｌｌ４が形質導入された受容体に結合したことを示す。データの規準化は上記のように、ルシフェラーゼレポーターおよびウェスタンブロッティングを用いて行い、タグ付加したＤｌｌ４とノッチタンパク質を定量した。
【０２６７】
あるいは、Ｄｌｌ４に対するノッチ受容体の結合はｓｉＲＮＡアプローチによって測定できる。ＭＰＣ上のそれぞれの内在性ノッチ受容体を別々にｓｉＲＮＡ技術によってノックダウンした。Ｄｌｌ４を細胞に添加し、ＡＰ活性を測定した。ＡＰ活性の減少および欠失は、ノックダウンされた特定のノッチ受容体を介してＤｌｌ４が骨形成効果を発揮することを示す。
【０２６８】
実験方法：
ＭＰＣ細胞を２４ウェルプレートに播種した。翌日、ノッチ受容体の１つに対するｓｉＲＮＡコンストラクトを細胞に導入した。１日後、細胞をＤｌｌ４ｃＤＮＡを有するアデノウイルスによって感染させた。ＡＰ活性を６日後に測定した。２連のウェルにおいてトータルＲＮＡを回収し、リアルタイムＰＣＲに用いた。特定のノッチ受容体およびＢＡＰに対して特異的なプライマー対を用いて特異的受容体の下方制御およびＤｌｌ４−によって媒介されるＢＡＰｍＲＮＡレベルの上方制御を分析した。
【０２６９】
Ｄｌｌ４−ノッチ結合のアフィニティー
Ｄｌｌ４−ノッチ結合のアフィニティーを表面プラズモン共鳴（Biacore）によって測定した。Biacoreは、センサーチップの表面での結合現象を測定し、したがって表面に付着させた反応体が分析の特異性を決定する。相互作用の特異性の試験は、異なる分子が固定化された反応体に結合することができるかを単に確かめることである。結合によりＳＰＲシグナルが迅速に変化し、相互作用が起こったか否かが直接的に明らかになる。
【０２７０】
サンプルをセンサー表面に流すと、結合の進行が直接相互作用が起こる速度に反映される。サンプルの注入後、バッファーを流し、その間の応答が表面上での複合体の解離速度を反映する。結合と解離についての動力学的速度定数は、結果を相互作用モデルの数学的作図に当てはめることにより得られる。
【０２７１】
結合アフィニティーは速度定数測定（解離定数ＫＤは１：１相互作用についての速度定数の比ｋｄ／ｋａである）またはサンプル濃度の関数としての結合の定常状態レベルの測定によって得られる。
【０２７２】
Ｄｌｌ４とノッチ受容体の両方の細胞外ドメインをクローンニングし、インフレームにてエピトープタグに融合させた。タグはヒト細胞、例えばＰｅｒ．Ｃ６細胞における発現後に細胞外ドメインを精製するために用いた。精製したタンパク質を次いで表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）（Biacore）分析にかけ、Ｄｌｌ４のそれぞれのノッチ受容体に対するアフィニティーを調べた。
【０２７３】
組織プロファイリングによるノッチ受容体の骨形成特性の判定
ノッチ受容体は適切な組織に適切な時期に発現した場合にのみ生理学的に骨形成に関与する。それゆえ、ノッチ受容体発現の組織プロファイリングをヒトおよびマウスサンプルにおいて、発生の様々な時期において行った。マウスサンプルは発生研究、特に発生の胚段階においてより入手しやすいので、研究は主にマウスサンプルに対して行った。この研究はヒト組織においても二連で行うことができた。
【０２７４】
マウスから胚発生の３つの段階（産後１１、１６および２１日目）および出生後１、４および２０週間後において骨性組織（骨および／または軟骨）を収集した。次いで組織を、免疫組織化学、リアルタイムＰＣＲまたはインサイチュハイブリダイゼーションによってノッチ受容体の発現について分析した。
【０２７５】
骨形成ノッチ受容体に対するアゴニスト抗体の開発
ノッチ−１抗体のアゴニスト抗体は腫瘍細胞においてアポトーシスを誘導した（国際特許出願ＷＯ００２０５７６Ａ２号）。ノッチ抗体は米国特許第６０９０９２２号にも記載されており、ノッチ受容体に結合した後、ノッチに媒介されるシグナル伝達を誘導する。これらは天然のノッチ・リガンドに比べていくつかの利点を有する：抗体は循環中に安定である。即ち、その半減期は大抵、受容体リガンドのものより長い。免疫原性が天然のリガンドの合成誘導体と比べて低いことも予想される。さらに、二特異的抗体を用いることによって、特異的組織または細胞型、この場合には骨組織に案内することができる。
【０２７６】
アゴニスト抗体は一本鎖Ｆｖ抗体ライブラリーを抗原としてのノッチ受容体の細胞外ドメインとインキュベートすることによって同定される。同定された抗体断片をそれらがＭＰＣとインキュベートした際に、アルカリホスファターゼ活性の上方制御を誘導する能力について試験した。このスクリーニングにおいてスコアした抗体をさらに石灰化研究に付した：ＭＰＣを６ウェルプレートに播種し、抗体断片とともに３−４週間の間インキュベートした。すべての石灰化を誘導する抗体は天然のノッチ・リガンドの代替物として役立つ。
（実施例１４）
【０２７７】
ヒトＤｌｌ４突然変異体の構築
Ａ０１０８１３−Ｄｌｌ４ＦＣ＿ｖ１
ｐ６Ｄｌｌ４＿Ｈｉｓの作成に加えて、免疫グロブリン重鎖定常部断片（Ｆｃ）とのＤｌｌ４の融合体も作成した。
これはいくつかの利点を有する：
１．Ｆｃ部分は溶液中の融合タンパク質の半減期を長くすることができる、
２．Ｆｃ部分はタンパク質Ａセファロースを用いた融合タンパク質の精製の助けとなることができる、
３．キメラのＦｃ部分は二量体化を誘導し、これはＤｌｌ４のその受容体への結合に有利であり得る。
【０２７８】
Ｄｌｌ４可溶性タンパク質形態が、免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ３断片（ＢＣ＿０２５３１４）（Ｆｃ−断片）に融合してなる融合タンパク質を構築した。Ｄｌｌ４−Ｆｃ−融合タンパク質にＣ末端Ｈｉｓ６タグを付加することにより、融合タンパク質をＮｉ２＋−ＮＴＡアフィニティークロマトグラフィーを用いて精製することが可能となる。
【０２７９】
ｐ６Ｄｌｌ４＿ＳＴは上記の可溶性Ｄｌｌ４のコンストラクトであるが、ただし、ヒスチジンタグを付加していないものである。このコンストラクトを用いてＦｃコンストラクトを作成した：ｐ６Ｄｌｌ４＿ＳＴプラスミドからのヒトＤｌｌ４配列をソースＤＮＡとして用いた。
【０２８０】
融合タンパク質を得るため、Ｎ−末端コード配列の停止コドンをＰＣＲによって（上記と同様にして）除いた。
リバースプライマー：5’GGGGGATCCGGGGAAGCTGGGCGGCAAG3’（配列番号：２１）は１５６６−１５８４に特異的にアニーリングし、その後さらに６塩基がＢａｍＨＩ制限酵素の認識部位を形成している。この認識部位は３つのさらなるヌクレオチドによって分解から保護されている。得られたＰＣＲ断片をＣｌａＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化して１４９ｂｐの断片を得た。ｐ６Ｄｌｌ４＿ＳＴプラスミドをＣｌａＩとＢａｍＨＩで消化して、１４５ｂｐの断片を切り出し、これをＰＣＲによって得た精製した１４９ｂｐの断片と交換した。その結果得られたプラスミドにＦｃ断片の挿入の準備をした。まず、ＸｂａＩで消化し、次いでクレノウ処理をして末端平滑化し、次いで精製後ＢａｍＨＩで消化した。
【０２８１】
免疫グロブリン重鎖定常部ガンマ３−断片（Ｆｃ−断片）を末梢血から単離した細胞からのｃＤＮＡに対するＰＣＲによって得た。フォワードプライマー：5’CCCGGATCCCCCAAATCTTGTGACAAAACTCAC3’（配列番号：２２）は、６の付加的な塩基を５’末端に含んでおり、これがＢａｍＨＩ制限酵素の認識部位を形成している。この認識部位は３つのさらなるヌクレオチドによって分解から保護されている。リバースプライマー：5’CGCTCTGAGCTAATGGTGATGGTGATGATGTTTACCCGGAGACAGGGAGAGGCTC3’（配列番号：２３）はモジュラーデザインを有する：これは２３のヌクレオチドに対して特異的にアニーリングし、その後の１８ヌクレオチドが６のヒスチジンをコードし、さらにその後に停止コドン、および９つの付加的なヌクレオチドを含む。得られたＰＣＲ産物は７３１ｂｐ長でありＢａｍＨＩ制限酵素で消化したところ、７２７ｂｐの産物が得られた。
【０２８２】
このＰＣＲ産物を前もって調製したｐ６Ｄｌｌ４＿ＳＴプラスミドにクローニングし、最終的にＡ０１０８１３−Ｄｌｌ４ＦＣ＿ｖ１を得た。このＡ０１０８１３−Ｄｌｌ４ＦＣ＿ｖ１配列をシークエンシングによって確認し、アデノウイルス産生に用いた。
（実施例１６）
【０２８３】
骨芽細胞分化のインデューサーとしてのＮＩＣＤ
ＮＩＣＤは骨芽細胞分化アッセイを用いる骨芽細胞分化のインデューサーである。
【０２８４】
ヒトノッチ（ショウジョウバエ）ホモログ（ＮＯＴＣＨ）ファミリーは４つのメンバーからなる：ＮＯＴＣＨ−１、ＮＯＴＣＨ−２、ＮＯＴＣＨ−３、ＮＯＴＣＨ−４。ノッチタンパク質は膜貫通タンパク質であり、ＥＧＦおよびＬｉｎ−１２／Ｎｏｔｃｈの細胞外ドメインを有する。これらタンパク質は概して発生過程における側面阻害に関与する。
【０２８５】
これらタンパク質の細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ−１、ＮＩＣＤ−２、ＮＩＣＤ−３、ＮＩＣＤ−４）は、アンキリンリピート、ＰＥＳＴ−含有領域および核局在化シグナル領域を含む（Blaumueller et al. (1997) Cell 90、281-291）。ＮＩＣＤはタンパク質−タンパク質相互作用に関与していると考えられている。
【０２８６】
ＮＩＣＤをコードするアデノウイルスベクターがアルカリホスファターゼアッセイを用いてスクリーニングされた。
【０２８７】
ＮＩＣＤ−２
ＮＩＣＤ−２ｃＤＮＡをＰＣＲ法を用いて単離した。以下のＮＩＣＤ−２−特異的プライマーを用いた：
ＮＩＣＤ−２フォワード：5’-CCGGAATTCCATGGCAAAACGAAAGCGTAAGCATG-3’（配列番号：２４）
ＮＩＣＤ−２リバース：5’-CGCGGATCCGTCTCTACACTGGAGGTGGACTC-3’（配列番号：２５）。
フォワードプライマーはＥｃｏＲＩ部位を含み、リバースプライマーはＢａｍＨＩ部位を含む。ＮＩＣＤ−２ｃＤＮＡを胎盤ｃＤＮＡライブラリーからＰＣＲ増幅したが、他のｃＤＮＡライブラリーを用いることもできる。１つの断片が得られ、これをＨｉｎｄＩＩＩおよびＢａｍＨＩ制限酵素で消化した。ｐＩＰｓｐＡｄＡｐｔ６ベクター（米国特許第６３４０５９５号）を同じ酵素で消化し、ゲルで精製し、消化したＮＩＣＤ−２ＰＣＲ断片とのライゲーションに用いた。配列を図１４ａと１４ｂに配列番号：５および配列番号：６として示す。
【０２８８】
ＮＩＣＤ−３
ＮＩＣＤ−３ウイルスを胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーから単離した。ｐＡｄａｐｔプラスミド中に存在するｃＤＮＡインサートの配列決定により、それはGenBank record NM_000435に記載のものとほとんど同一であるが、ただし、ｃＤＮＡが５’末端で切断されている（約４８００ｎｔが欠損している）ことが示された。タンパク質レベルでは、該配列はGenBank record NP_000426のカルボキシ末端の半分の６５９アミノ酸と同一であった。配列を図１４ｃと１４ｄに配列番号：７および配列番号：８として示す。
【０２８９】
ＮＩＣＤ−４
ＮＩＣＤ−４ウイルスを胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔライブラリーから単離した。ｐＡｄａｐｔプラスミド中に存在するｃＤＮＡインサートの配列決定により、それがほぼGenBank record NM_004557ヒトノッチ（ショウジョウバエ）ホモログ４に記載のものと同一であることが示された。細胞内ドメイン・ヒトノッチ（ショウジョウバエ）ホモログ４をコードする配列のみがＮＩＣＤ−４に存在していた。タンパク質レベルでは、該配列はGenBank record NM_004557のカルボキシ末端の半分の４７７アミノ酸と同一であった。配列を図１４ｅと１４ｆに配列番号：９および配列番号：１０として示す。
【０２９０】
本発明において開示した、ＮＩＣＤ−２、ＮＩＣＤ−３およびＮＩＣＤ−４が骨の恒常性に関与し、特に骨芽細胞分化を誘導するという発見は、この配列およびこれによってコードされるタンパク質の機能について新規かつ予期せぬ知見を提供するものである。
（実施例１７）
【０２９１】
骨芽細胞分化のインデューサーとしてのＮＩＣＤ
ＮＩＣＤをさらに特徴付けした。ｃＤＮＡは全長ＮＩＣＤタンパク質をコードする。ＮＩＣＤはノッチ・リガンドであると推定される。というのはそれはノッチ・リガンドのＤｅｌｔａファミリーのメンバーであるからである。ＮＩＣＤはその細胞外領域においてＤＳＬおよびＥＧＦ−リピートドメイン有し、これはノッチ・リガンドの特徴である（図１５を参照されたい）。ノッチ・リガンドは、ノッチ−細胞内−ドメイン（ＮＩＣＤ）によって媒介されるシグナル伝達を誘導する。
【０２９２】
石灰化
骨形成のプロセスはいくつかの連続的現象から構成される。骨形成の初期段階において、骨アルカリホスファターゼ（ＢＡＰ）が上方制御される。４つのアルカリホスファターゼが存在し、そのなかで１つだけが骨特異的であるので、アルカリホスファターゼ活性自体は絶対安全な骨形成マーカーではない。それゆえ石灰化などの骨形成のより遅い段階で起こるより特異的な現象に注目することが重要である。
【０２９３】
骨組織は有機物質のマトリックス（例えば、コラーゲン）に埋め込まれた細胞と無機物質（Ｃａおよびリン酸）から構成される。骨石灰化はインビトロでそれらが沈着したマトリックスについて分化した骨細胞を染色することによって示される。Von Kossa および Alizarin RedS 染色によってそれぞれ沈着したリン酸およびカルシウムの可視化が可能となる。
【０２９４】
一次ヒトＭＰＣを６ウェルプレート（Costar or Nunc）にウェル当たり５０，０００細胞の密度で播種し、１日後Ａｄ５Ｃ１５−ｈＣＡＲ（ＭＯＩ１０００）およびＡｄ５Ｃ０１−対照またはヒットウイルス（ＭＯＩ、５００、１５００、または４５００）で共感染させた。１００μｇ／ｍｌのＬ−アスコルビン酸と１０ｍＭのベータ・グリセロホスフェートを追加した培地を週に３回交換した。実験開始の２０から３０日後、細胞をAlizarin RedS 染色で染色した。Alizarin RedS染色のために、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、次いで１０％パラホルムアルデヒドで４５分間４℃で固定し、再びＰＢＳで３回洗浄した。細胞を４０ｍＭのAlizarin RedS水溶液、ｐＨ４．１−４．３とともに１０分間インキュベートし、その後蒸留水で５回洗浄した。染色を白色光学顕微鏡を用いて評価および撮影した（図２１）。
（実施例１９）
【０２９５】
ＢＡＰハイ・スループット・スクリーニングによって得られた確認されたヒットに対するヒト抗体を選抜するためのヒトＦＡｂファージディスプレー
ここで同定したタンパク質（配列番号：２、４、６、８、または１０によって特徴付けられている）に結合する抗体を単離するために、ヒトＦＡｂ断片をディスプレーするファージを用い、これは軽鎖および重鎖可変部および定常部領域を含む。ヒトＦＡｂファージディスプレーライブラリーを、ｐＣＡＮＴＡＢ６ベクター（McGuiness et al.、1996）の誘導体であるｐＣＥＳ１などのファージディスプレーベクター中に構築した。ライブラリーを繊維状大腸菌ファージｍ１３において構築し、ＦＡｂ配列をマイナーコートタンパク質ｐＩＩＩとのＮ末端融合タンパク質としてディスプレーさせた。ライブラリーはおよそ１０１０種類の配列の複雑性を有していた。
【０２９６】
３つのタイプの標的を用いて配列番号：２、４、６、８、または１０の配列に結合するポリペプチドをディスプレーするファージを選抜した。まず、配列番号：２、４、６、８、または１０の予想細胞外あるいは接近可能なドメインを合成ペプチドとして合成した。このペプチドのＮ末端をビオチン化し、その後はＫＲＲペプチドリンカーおよびそれぞれ配列番号：２、４、６、８、または１０の予想配列とした。
【０２９７】
次に、本発明のタンパク質（配列番号：２、４、６、８、または１０によって特徴付けられる）の部分または全体と、インフレームにグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトース結合タンパク質、Ｈｉｓ６タグまたはその他のタグのいずれかのＯＲＦが結合した融合タンパク質を作成した。その結果得られたタンパク質を大腸菌で発現させた。同様に、Ｈｉｓ６またはその他のタグを配列のＯＲＦにインフレームに融合させてＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａなどの哺乳類発現系で発現させた。次に融合タンパク質を例えば、Ｈｉｓ６−タグ付加したタンパク質についてはＮｉ２＋−ＮＴＡカラム（Qiagen）またはＧＳＴ−タグ付加したタンパク質についてはグルタチオン樹脂（Pharmacia）を用いて精製した。
【０２９８】
第３に、例えば、膜結合ポリペプチドについて、配列番号：２Ａｄ５Ｃ０１＿Ｈｄｅｌｔａ２（Ｈ４−２）を過剰発現する、ヒトＨｅＬａ細胞系由来の細胞系を作成した。過剰発現は定常状態のｍＲＮＡ発現レベルでみてもよく、あるいは、配列番号：２のＯＲＦにインフレームにエピトープタグを融合させることによりタンパク質をタグ付加している場合は、エピトープ−タグ付加したタンパク質の免疫学的検出によってみてもよい。
【０２９９】
配列番号：２、４、６、８、または１０に結合するファージをディスプレーするＦＡｂを選抜するために、以下の選抜手順を行った。Ｆａｂをディスプレーするファージのプールを、多数の異なるＦａｂをディスプレーするファージの複雑な混合物から、４ラウンドにてそれらが有意なアフィニティーにてビオチン化したペプチド、または大腸菌またはＰＥＲ．Ｃ６／Ｅ２Ａなどの哺乳類発現系において発現された精製融合タンパク質に結合する能力よって選抜した。選抜したＦａｂをディスプレーするファージの集団をさらに次の選抜工程によって減少させた：Ｆａｂをディスプレーするファージをさらに３ラウンドにて配列番号：２を過剰発現する細胞からの細胞溶解液において存在する配列番号：２、４、６、８、または１０に結合する能力について選抜した。ビオチン化したペプチドの選抜のために２５０μｌのＦＡｂライブラリー（または先のラウンドから溶出したファージ）を２５０μｌのＰＢＳ中の４％Ｍａｒｖｅｌに混合し、室温で１時間回転させて平衡化した。次いで、ビオチン化したｈＣＡＴ１ペプチド（Ｈ２Ｏ中２０−５００ｎＭ）を添加した。この混合物をローテーター上で室温で１時間インキュベートした後、ＰＢＳ中の２％Ｍａｒｖｅｌ中で平衡化した２５０ｍｌのストレプトアビジン−ダイナビーズ（dynabeads）を添加した。室温で１５分間ローテーター上でインキュベーションした後、ファージが結合したビーズを５回ＰＢＳ／２％Ｍａｒｖｅｌ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、５回ＰＢＳ／０．１％Ｔｗｅｅｎで洗浄し、そして５回ＰＢＳで洗浄した。次いでファージを室温でローテーターで１０分０．１Ｍトリエチルアミンとインキュベーションすることにより溶出し、１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４で中和した。
【０３００】
溶出したファージのタイターを測定し、ＴＧ１中で増幅させた後、次の選抜を行った。
【０３０１】
形質膜に結合した配列番号：２（Ｈ４−２）を発現する細胞の選抜のために、細胞を約８０％集密したところで回収し、ＰＢＳ／１０％ＦＢＳ／２％Ｍａｒｖｅｌに懸濁して最終濃度を少なくとも３ｘ１０６細胞／ｍｌとした。この細胞懸濁液を回転混合板（またはローテーター）上で３０分間インキュベートし、同時にファージをＰＢＳ／１０％ＦＢＳ／２％Ｍａｒｖｅｌ中でプレインキュベートした。次いで細胞を遠心分離し、プレインキュベートしたファージ溶液に再懸濁し、回転混合板（またはローテーター）上で１時間インキュベートした。その後、細胞をＰＢＳ／１０％ＦＢＳ／２％Ｍａｒｖｅｌで５−１０回洗浄し、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞を遠心分離し、０．６ｍｌの水に再懸濁した。その後、０．６ｍｌの２００ｍＭトリエチルアミンを添加した（ボルテックスにかけながら滴下した）。５分後、懸濁液を０．６ｍｌの１ＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を添加（ボルテックスにかけながら滴下）することによって中和した。遠心分離（５分、１４０００ｒｐｍ）の後、上清を新しい遠心管に移し、タイターを測定し、ＴＧ１中で増幅させ、次の選抜を行うか、または最終クローニング工程を行った。
【０３０２】
多様な選抜ラウンドの最後のプールを、特異的ＥＬＩＳＡにおいてビオチン化したペプチドまたは好ましくは融合あるいは精製された全長タンパク質に対する結合について試験した。また、適当な場合はフローサイトメトリー分析によって細胞結合を試験した。ＦＡＢをディスプレーし、配列番号：２の抗原に結合するクローンが単離されたら、二本鎖ファージミドＤＮＡを調製し、これを用いてディスプレーされた可変重鎖および軽鎖のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を決定した。
【０３０３】
Ｆａｂファージまたはそれに由来する抗体は、診断ツールとして利用することができる。例えば免疫組織化学においては、研究手段として、例えばアフィニティークロマトグラフィーにおいては、直接に治療用抗体として、あるいは抗−イディオタイプ抗体の作成により治療用の抗体の作成のために利用することができる。
（実施例２０）
【０３０４】
可溶性ｈＤｅｌｔａ２（Ｈ４−２）の作成およびＢＡＰハイ・スループット・スクリーニングアッセイにおける再スクリーニング
ｈＤｅｌｔａ２（配列番号：２）はノッチ・ファミリーの受容体の、膜貫通リガンドである。配列番号：２（配列番号：４）に由来する可溶性リガンドは膜結合性のリガンドと比べて簡単にバイオ医薬品に変換することができきる。さらに、膜結合型リガンド、例えばＴＮＦ−αは、そのリガンドとしての活性を保持しつつ細胞外環境へと脱落することが多い。可溶性Ｄｅｌｔａ２リガンドは、骨粗鬆症および上記の骨疾患の治療のための薬剤として利用することができる。
【０３０５】
骨芽細胞分化のインデューサーとしての可溶性Ｄｅｌｔａ２の活性を研究するために、Ｈｉｓ６−エピトープタグを配列番号：２の一部である配列番号：４にインフレームに融合させた。さらに、Ｈｉｓ６タグを有さない可溶性のものも作成した。Ｄｅｌｔａ２は２つの疎水性ストレッチを含み、これらが膜貫通ドメインを表す：シグナルペプチドを形成するＮ−末端アミノ酸およびおそらくアミノ酸５２９から５５２を含むＣ末端領域の残基である。後者の疎水性ストレッチはおそらくリガンドを細胞膜、大抵は形質膜に結び付ける膜貫通領域として作用する。当該技術分野で公知の分子生物学的技術を用いて、この疎水性ドメインとこのドメインの下流のアミノ酸を除去した。これは分子の一部を以下のプライマー対を用いて増幅することによって達成された：
5’AACCGAGGTCCAAGCCGCATGTGCC（フォワード）（配列番号：１９）および
5’CGCGGATCCTCAGGGGAAGCTGGGCGGCAAG（リバース）（配列番号：２６）
または以下のプライマー対：
5’AACCGAGGTCCAAGCCGCATGTGCC（フォワード）（配列番号：１９）および
5’CGCGGATCCTAATGGTGATGGTGATGATGGGGGAAGCTGGGCGGCAAG（リバース）（配列番号：２０）。
【０３０６】
ＰＣＲにより増幅された二本鎖ＤＮＡ産物を制限酵素ＣｌａＩを用いて消化し、親プラスミドにサブクローニングし、これをＰＣＲ−テンプレートとして用いた。第１のプライマー対（配列番号：１９および２６）により、配列番号：４のタグを付加していない可溶性のものが作成され、第二のプライマー対（配列番号：１９および２０）により配列番号：４のＣ−末端にＨｉｓ６がタグ付加された可溶性融合タンパク質が作成された。アデノウイルスをこのプラスミドから開始して実質的に実施例１に記載のようにして作成し、増殖させた。これらを次いで内在性ＢＡＰ活性の上方制御についてＢＡＰスクリーニングにおいてスクリーニングした。配列番号：２の可溶性のもの（配列番号：４およびＨｉｓ−タグ付加した配列番号：４）を次いで野生型配列番号：２の活性および陰性および陽性対照ウイルスと比較した（ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、ＦｏｓＢ、ＰＬＡＰ、ｅＧＦＰ、ＬａｃＺおよびルシフェラーゼ）。
【０３０７】
さらに、上記ウイルスの活性を、実施例１０、４および５に詳細に記載した上清移行実験において比較した。配列番号：２の可溶性形態を含む上清を誘導するＢＡＰについて、例えばＢＡＰ、ＢＭＰ２、ＢＭＰ７、オステオカルセイン、オステオポンチンを含むその他の分化特異的遺伝子の誘導について試験し、またインビボと同様にインビトロで骨形成を誘導する能力があるかについて試験した。
（実施例２１）
【０３０８】
ハイ・スループットＢＡＰ−スクリーニングからのヒットのインビボでの確認
インビボでの骨芽細胞−誘導能力を種々の方法によって試験した。配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の下方制御およびおよび過剰発現について試験した。
【０３０９】
配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の発現の下方制御については、ノックアウト動物、好ましくはマウスを既存の方法に従って作成した。簡単に説明すると、配列番号：２、６、８、または１０をコードする遺伝子の１または複数のエキソンをマウスＥＳ細胞において相同的組換えによって欠失させた。これらＥＳ細胞は、ノックアウトマウスの作成に適しており、当業者に周知の近交系実験用マウスの限られた数の同型接合性株から単離した。１または複数のエキソンの除去をサザンブロットなどの技術によって確認し、ＥＳ細胞の２倍体状態を細胞遺伝学的技術により確認した。予測された微小欠損（microdeletion)を有し、予測数の染色体を有するノックアウトＥＳ細胞を用いて既存の方法に従ってマウスを作成した。その結果得られたキメラマウスを用いて次いでノックアウトマウスのコロニーの作成を開始した。ここで該マウスは１または複数の配列番号：１、２、５、６、７、８、９、および１０に対応する遺伝子のエキソンが欠損している対立遺伝子に関して異型接合体でも同型接合性でもよい。同型接合性および異型接合性ノックアウトマウスを用いて、野生型マウスと比較して、これらのマウスに生じる骨の恒常性を調べた。野生型マウスとは、すなわちインタクトな配列番号：１、２、５、６、７、８、９、および１０に対応する遺伝子を有する同じ近交系同型接合性株からのマウスである。該配列番号の発現の不存在を野生型およびノックアウト動物の骨組織を含む組織に対するウェスタンブロッティングおよびノザンブロッティングによって調べた。配列番号：１、２、５、６、７、８、９、および１０の発現がないことによる効果を、様々な方法によって骨生物学について研究した：本発明者らは、例えば、健康な野生型動物において通常みられる全骨の存在、骨の太さ、骨の長さなどの生理的パラメーターについて分析した。さらに組織化学的技術を用いてさらに詳細に骨を調べた。例えば、石灰化の程度および骨芽細胞の数を調べ、特異的抗体（免疫組織化学）を併用して、骨芽細胞−特異的タンパク質の存在および細胞内での局在について調べた。
【０３１０】
好ましくはマウスにおけるインビボでの配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の過剰発現について、以下の方法を用いた：配列番号：１、３、５、７、および９を、遍在的に発現するプロモーターの下流、または好ましくは骨区画においてのみ発現を引き起こすプロモーターの下流に、真核発現プラスミドにサブクローニングした。上記プロモーターおよび配列番号：１、３、５、７、および９を含むプラスミドを用いて既存の方法によりトランスジェニックマウスを作成した。ＦＶＢ株などのトランスジェニックマウスを作成するのに好適な同型接合性マウス株を用いた。配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の外因性発現をサザンブロットを用いて分析し、マウスゲノムに組み込まれた発現カセットのコピー数を評価した。また抗体が入手可能な場合は、ノザンブロッティングあるいはウェスタンブロッティングも用いた。配列番号：１、２、３、４、５、６、７、８、９、および１０の外因性発現の骨生物学に対する効果をノックアウト動物について先に記載したようにして分析した。
【０３１１】
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【図面の簡単な説明】
【０３１２】
【図１】図１は、骨芽細胞分化と機能の遺伝的制御の概略図である。いくつかの転写因子と分泌因子が骨芽細胞分化プロセスに関与している（Ducy et al.、2000）。
【図２】図２は、Ａｄ５ｈＣＡＲ受容体の外因性発現によるＡｄ５ウイルスの形質導入効率の向上を示す。細胞をまず胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡ発現ライブラリーのＡｄ５ウイルスによる細胞の感染に先立って、ｈＣＡＲ受容体を発現するＡｄ５またはＡｄ５繊維バリアントによって感染させた。この方法により、実質的にそれぞれの単一の細胞系またはポリクローナル一次細胞集団に感染させることが可能となった。
【図３】図３は、上昇量のｈＣＡＲアデノウイルスの存在下でのＡｄ５感染の増加を示す蛍光顕微鏡法による画像である。ｈＣＡＲとＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔウイルスについての最適ＭＯＩが対照実験によって判定された。ＭＰＣを３８４ウェルプレートのウェルに播き、ＭＯＩ１０、５０、および２５０にてＡｄ５Ｃ０１−ｈＣＡＲを用いて共感染させた。Ａｄ５Ｃ０１−ｅＧＦＰ（Ａｄ５−ＧＦＰ）をＭＯＩ、１０００、５０００および２５０００にて用いた。感染効率を６日後に蛍光顕微鏡法を用いて分析した（Zeiss Axiovert 25、４Ｘ対物レンズ）。
【図４】図４は、増加量のｈＣＡＲアデノウイルスの存在下でのＡｄ５感染の増加を示すフローサイトメトリー分析である。右上の説明図は、ＭＰＣの共感染に用いたＭＯＩを示す。Ａｄ５Ｃ０１−ｈＣＡＲについてのＭＯＩはＹ−軸に示され、Ａｄ５Ｃ０１−ｅＧＦＰについてのＭＯＩはＸ−軸に示される。
【図５】図５は、骨芽細胞分化アッセイの原理である。骨髄由来の間葉幹細胞に図２に示すようにＡｄ５Ｃ０１−またはＡｄ５Ｃ１５−またはＡｄ５Ｃ２０−ｈＣＡＲウイルスの存在下で胎盤ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡライブラリーウイルスを感染させた。感染の６日後に、骨アルカリホスファターゼ活性を４−メチルウンベリフェリルヘプタホスフェート（ＭＵＰ）基質の付加後に測定した。
【図６】図６は、ＡＰスクリーニングについての播種密度の最適化を示す。ＭＰＣを３８４ウェルプレートに播き、目的化合物を１日後に添加した。化合物（Ｄｅｘ＝デキサメタゾン、ｂＧＰ＝ベータ・グリセロホスフェート、ＢＭＰ２＝組換えヒトＢＭＰ２）の添加の６日後、アルカリホスファターゼ活性を測定した。相対蛍光ユニットをＹ−軸に示す。
【図７】図７は、ＡＰスクリーニングについての指標の判定を示す。ＭＯＩが１００のＡｄ５Ｃ０１−ｈＣＡＲとＭＯＩが１０００の対照ＡＤ５Ｃ０１ウイルスで共感染させたＭＰＣを、播種の１日後に組換えヒトＢＭＰ２（ｒｈＢＭＰ２）とデキサメタゾン（Ｄｅｘ）とで処理した。３、６、８または１０日後、アルカリホスファターゼ活性を測定した。相対蛍光ユニットをＹ−軸に示す。
【図８】図８は、アルカリホスファターゼ基質についてのインキュベーション時間の長さの決定を示す。ＭＰＣを、ＭＯＩが１００のＡｄ５Ｃ０１−ｈＣＡＲとＭＯＩが１０００のＡＤ５Ｃ０１−ＰＬＡＰまたはＡｄ５Ｃ０１−ＢＭＰ２ウイルスを用いて共感染し、播種の１日後にデキサメタゾン（Ｄｅｘ）で処理した。６日後、アルカリホスファターゼ活性を測定した。ＭＵＰ−溶液とのインキュベーション時間を０、５、１０、２０、６０分間と変動させた。Ｘ−軸に示す各条件の後の「−」は様々なインキュベーション時間の最後に停止−溶液を用いなかったことを示す。そうせずに、サンプルは様々なインキュベーション時間の直後に解読した。相対蛍光ユニットをＹ−軸に示す。
【図９】図９は、対照プレートのレイアウトを示す。９６ウェルプレート形式において対照プレートを準備し、これは以下の導入遺伝子を形質導入する様々な対照ウイルスを含む：ＢＭＰ２、ｅＧＦＰ、ＰＰＡＲ−ガンマ、空ウイルスおよびルシフェラーゼ。
【図１０】図１０は、ハイ・スループット骨芽細胞分化アッセイの散布図を示す。この図は、ＰｈｅｎｏＳｅｌｅｃｔｃＤＮＡライブラリーからの典型的な３８４ウェルプレートについての骨芽細胞分化アッセイにおけるプレート間の変動を示す。プレート中のライブラリーサンプル（それぞれ異なるインサートを含む）についての平均の前後のデータポイントの分散は緊密である。カットオフ値を平均プラス標準偏差の３倍とした。カットオフ値より高いシグナルを生じるサンプルをヒットとして選択した。
【図１１】図１１は、ハイ・スループットＡＰスクリーニングからのヒット・プレートを示す。ヒットＨ４−２は、推定ノッチ・リガンドであるヒトＤｅｌｔａ２／Ｄｌｌ４に対応するｃＤＮＡ配列（図１３ａ、配列番号：１）を含む。
【図１２】図１２ａと１２ｂはＲＴ−ＰＣＲによるヒットの確認を示す。ＭＰＣをＡｄ５Ｃ０１−ｈＣＡＲおよびＡｄ５Ｃ０１対照またはヒットウイルスに感染させた。７日後、ＲＮＡを抽出し、ＢＡＰまたはＰＬＡＰ／ＩＡＰ（ディジェネレート・プライマー対）またはベータ・アクチン対照反応物を増幅する遺伝子特異的プライマーを用いたＰＣＲにかけた。反応産物をアガロースゲルで分離した。
【図１３】図１３ａ−ｄはヒットＨ４−２と可溶性Ｈ４−２のヌクレオチドと推定アミノ酸配列を示す。このｃＤＮＡ（図１３ａ）はノッチ・リガンドｄｅｌｔａ−２についてヒト（Homo sapiens）ｈｄｅｌｔａ２と同一性を有する。これはＧｅｎＢａｎｋにおいて受託番号ＡＢ０３６９３１として寄託されている。この遺伝子に対してヒトｄｅｌｔａ−様４ホモログ（ショウジョウバエ）（ＤＬＬ４）も参照した。これはＧｅｎＢａｎｋにおいてＮＭ_０１９０７４として寄託されている。図１３ｂはＤｌｌ４の推定アミノ酸配列を示す。図１３ｃは、Ｄｌｌ４ポリペプチドの切形および可溶性形態をコードする核酸を示す。図１３ｄは、可溶性Ｄｌｌ４の推定アミノ酸配列を示す。
【図１４】図１４（ａ−ｆ）は、ノッチ細胞内ドメイン−２、−３、および−４ＤＮＡおよび推定アミノ酸配列を示す。図１４ａおよび１４ｂは、ノッチ細胞内ドメイン−２（ＮＩＣＤ−２）の、ＤＮＡ配列（図１４ａ；配列番号：５）および推定アミノ酸配列（図１４ｂ；配列番号：６）を示す。図１４ｃおよび１４ｄは、ＮＩＣＤ−３のＤＮＡ配列（図１４ｃ；配列番号：７）および推定アミノ酸配列（図１４ｄ；配列番号：８）を示す。図１４ｅおよび１４ｆは、ＮＩＣＤ−４のＤＮＡ配列（図１４ｅ；配列番号：９）および推定アミノ酸配列（図１４ｆ；配列番号：１０）を示す。
【図１５】図１５は、Ｄｌｌ４ポリペプチドの模式図を示す。Ｄｌｌ４の模式図を示す。Ｄｌｌ４は７つのＥＧＦ−様ドメインを含み、Ｎ−末端側でＤｅｌｔａ／Ｓｅｒｒａｔｅ／Ｌａｇ−２ドメインに、Ｃ−末端側で膜貫通および細胞内ドメインに隣接している。
【図１６】図１６は、Ｄｅｌｔａ−様リガンド／ノッチシグナル伝達経路を示す。Ｈ４−２／Ｄｌｌ４はノッチ受容体に対するリガンドである。ノッチ受容体は、細胞外および細胞内ドメインを含み、細胞外リガンドから核への移行シグナルに連結している。
【図１７】図１７は、Ｈ４−２発現によるＢＡＰｍＲＮＡの上方制御を示す。ｍＲＮＡをｅＧＦＰ、Ｈ４−２、およびＢＭＰ−２を発現する細胞から単離し、ＢＡＰ−特異的プライマーを用いたＰＣＲにかけた。
【図１８】図１８は、可溶性Ｈ４−２の発現を示す。Ｈｉｓ６−タグ付加されたＨ４−２をＰＥＲ．Ｃ６細胞において発現させ、精製した。ウェスタンブロッティングおよびクーマシー染色は、可溶性Ｈ４−２タンパク質溶液が少しの不純物しか含まないことを示す。
【図１９】図１９は、可溶性Ｈ４−２がＡＰの上方制御を誘導することを示す。マイクロタイタープレートを細胞の播種に先立って様々な濃度の可溶性Ｈ４−２タンパク質で処理した。６日後、ＡＰ活性を測定した。
【図２０】図２０は、可溶性Ｄｌｌ４による石灰化を示す。ＭＰＣ細胞をｅＧＦＰ、ＢＭＰ２、またはＨ４−２のいずれかをコードするアデノウイルスで感染させた。感染の３週間後、細胞をVon Kossa（下側パネル）あるいは、Alizarin RedS染色（上側パネル）で染色し、その結果得られた染色を白色光学顕微鏡を用いて撮影した。
【図２１】図２１は、ノッチ細胞内ドメイン（ＮＩＣＤ）による石灰化を示す。ＭＰＣ細胞をＮＩＣＤ−２、ＮＩＣＤ−３、またはＮＩＣＤ−４のいずれかをコードするアデノウイルスで感染させた。感染の３週間後、細胞をAlizarin RedS 染色で染色しその結果得られた染色を白色光学顕微鏡を用いて撮影した。

Claims (41)

  1. 以下の骨芽細胞分化のインデューサーとして同定可能な核酸の群から選択される単離核酸：
    （ａ）配列番号：１、３、５、７、または９あるいはその相補鎖のＤＮＡ配列、
    （ｂ）配列番号：１、３、５、７、または９あるいはその相補鎖に対応するＲＮＡ配列、
    （ｃ）（ａ）または（ｂ）に規定するヌクレオチド配列の１つの特異的にハイブリダイズする核酸、
    （ｄ）配列番号：２、４、６、８、または１０のアミノ酸配列を含むタンパク質をコードする核酸、
    （ｅ）配列番号：１、３、５、７、または９のＤＮＡ配列によってコードされるタンパク質の免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片をコードする核酸、
    （ｆ）配列番号：２、４、６、８、または１０に規定するタンパク質をコードする核酸、または（ａ）から（ｅ）のいずれかに規定される核酸であって、該配列がＤＮＡ、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡまたは合成ＤＮＡである核酸。
  2. 請求項１に記載の核酸配列を含むベクター。
  3. 該ベクターが発現ベクターであり、ここで核酸配列が、原核および／または真核宿主細胞における該配列の発現を可能にする１または複数の制御配列と作動可能に連結している、請求項２に記載のベクター。
  4. 該ベクターがアデノウイルスベクターである、請求項２または３に記載のベクター。
  5. 該ベクターがレフトＩＴＲとＥ２Ｂ領域の部分を含むアデノウイルスアダプターベクターから作成され、Ｅ１領域が哺乳類プロモーター、ポリリンカー、およびポリアデニル化シグナルによって置換されている、請求項２から４のいずれかに記載のベクター。
  6. 該核酸がアンチセンス核酸をコードする、請求項１に記載の核酸を含むポリヌクレオチド配列。
  7. 請求項６に記載のポリヌクレオチド配列を含むベクター。
  8. 該ベクターが発現ベクターであり、ここでアンチセンスポリヌクレオチド配列が、原核および／または真核宿主細胞において該配列の発現を可能にする１または複数の制御配列に作動可能に連結している、請求項７に記載のベクター。
  9. 以下の工程を含む遺伝子発現を調節する方法：
    （ａ）請求項１に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を宿主細胞に導入する工程、および、
    （ｂ）該ポリヌクレオチド配列が標的遺伝子の転写または発現を調節する、標的遺伝子の発現を調節する工程。
  10. 請求項１に記載の核酸配列を含むポリヌクレオチド配列を宿主細胞に、該宿主細胞における該ポリヌクレオチド配列の発現が導かれる条件下で導入することを含む、骨芽細胞分化を調節する方法。
  11. 請求項１から６の核酸分子または請求項２から５、７または８のベクターの組み込まれたかあるいはエピソーム性のコピーを含む宿主細胞。
  12. 該宿主細胞が、酵母、細菌、昆虫、真菌、植物または哺乳類細胞である、請求項１１に記載の宿主細胞。
  13. 請求項１に記載の核酸によってコードされる単離ポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片。
  14. 配列番号：２、４、６、８、または１０のアミノ酸配列を有するポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片。
  15. 以下の工程を含む請求項１３または１４に記載のポリペプチドの産生方法：
    （ａ）請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターを含む宿主細胞を、ポリペプチドの発現を可能とする条件下で培養する工程、および、
    （ｂ）該培養物から該ポリペプチドを回収する工程。
  16. 請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターによってコードされるポリペプチドまたは該ポリペプチドの特異的エピトープを特異的に認識する抗体を産生する方法。
  17. 請求項１に記載の核酸または請求項１３または１４に記載のポリペプチドを検出する方法。
  18. 薬物として使用するための、請求項１または６に記載の単離組換え核酸または請求項２から５、７または８のいずれかに記載のベクターあるいは該単離組換え核酸によってコードされるポリペプチド。
  19. 骨芽細胞分化の誘導の不在または減少に関する疾患の予防、治療および／または緩和のための薬物の調製のための、請求項１または６に記載の単離組換え核酸または請求項２から５、７または８のいずれかに記載のベクターあるいは該単離組換え核酸によってコードされるポリペプチドの使用。
  20. 医薬上許容される担体と組み合わせて、請求項１または６に記載の実質的に精製された組換え核酸または請求項２から５、７または８のいずれかに記載のベクターあるいは該単離組換え核酸によってコードされるポリペプチドを、骨芽細胞分化の誘導の不在または減少に関する疾患の予防、治療および／または緩和のために医薬上有効な量含む医薬組成物。
  21. 以下の工程を含む骨芽細胞分化を誘導する方法：
    （ａ）請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターを、さらにインビトロまたはインビボで細胞分化することができる所望の宿主細胞に導入する工程、
    （ｂ）該核酸を発現させる工程、および、
    （ｃ）該宿主細胞の骨芽細胞への分化を刺激する工程。
  22. 請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターあるいは請求項１３または１４に記載のポリペプチドの、未分化細胞の骨芽細胞への分化を誘導し、それによって、連続的な骨マトリックスを産生させるための使用。
  23. 以下の工程を含む骨組織のインビトロでの産生方法：
    （ａ）未分化哺乳類細胞を基体に載せて、細胞基体を形成させる工程、
    （ｂ）請求項１に記載のポリヌクレオチドまたは請求項２から５のいずれかに記載のベクターを該細胞に導入するか、あるいは該細胞基体を該ポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドに、該未分化細胞が骨芽細胞に分化するのに十分な時間接触させ、それによって連続的な骨マトリックスを産生させる工程。
  24. 該連続的な骨マトリックスが、該基体の表面上で少なくとも０．５μｍの厚さを有する、請求項２３に記載の方法。
  25. 異常な骨芽細胞分化を検出するための診断キットを調製するための、請求項１または６に記載の単離核酸または請求項２から５、７または８のいずれかに記載のベクターあるいは該単離組換え核酸によってコードされるポリペプチドの使用。
  26. 以下の工程を含む、対象における異常な骨芽細胞分化に関する病状または該病状に対する罹患性を診断する方法：
    ａ）請求項１の核酸に対応する該対象のｍＲＮＡのサンプルまたは請求項１の核酸のゲノム配列に対応する該対象のゲノムＤＮＡのサンプルを得る工程、
    ｂ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列を決定する工程、
    ｃ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列と、データベースから得られる請求項１の核酸または請求項１の核酸をコードするゲノム配列を比較する工程；および、
    ｄ）該対象のｍＲＮＡまたはゲノムＤＮＡの核酸配列と、データベースから得られる請求項１の該核酸または請求項の核酸をコードする該ゲノム配列の相違を同定する工程。
  27. 生物サンプルにおける請求項１の核酸または該核酸によってコードされるポリペプチドの発現の存在または量を判定することを含む、対象における異常な骨芽細胞分化に関する病状または該病状に対する罹患性を診断する方法。
  28. 請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターまたは請求項１３または１４に記載のポリペプチドを含む、患者における異常な骨芽細胞分化を診断するためのキット。
  29. １または複数のコピーの請求項１の核酸を安定にその動物のゲノムに組み込んで含むトランスジェニック非ヒト動物、または請求項１の核酸の発現を調節する調節要素を含む動物。
  30. 請求項１の核酸をコードする１または２の対立遺伝子からの１または複数のエキソンの欠失、あるいは該核酸の１または複数のエキソンの欠失を含むノックアウト非ヒト動物、あるいは、請求項１の核酸配列を含む調節配列を含むゲノム領域において標的化突然変異を含む動物。
  31. モデル系としての請求項３０または３１に記載のトランスジェニックまたはノックアウト非−ヒト動物の使用。
  32. 請求項１、６のいずれかに記載の単離核酸または請求項２から５、７または８に記載のベクターあるいは該核酸によってコードされる単離ポリペプチドの、骨芽細胞分化を誘導または抑制する薬剤の同定のための薬剤化合物スクリーニングのための使用。
  33. 以下の工程を含む骨芽細胞分化を誘導または抑制しうる化合物を同定するための被験化合物のスクリーニングのためのアッセイ：
    （ａ）該被験化合物と請求項１３または１４に記載のポリペプチド、またはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる剤を、該剤が該被験化合物に接触するのを可能にする条件下で混合する工程；および、
    （ｂ）該剤と被験化合物の相互作用の指標である複合体の形成を検出する工程。
  34. 以下の工程を含む異常な骨芽細胞分化を伴う疾患または障害を予防、治療および／または緩和するのに有用なポリヌクレオチドまたはポリペプチド被験化合物を同定するための薬剤化合物スクリーニングアッセイ：
    （ａ）該被験化合物と、請求項１に記載の核酸または請求項２から５のいずれかに記載のベクターとを接触させる工程、そして、
    （ｂ）該化合物が該核酸と相互作用するかを判定する工程。
  35. 以下の工程を含む、骨芽細胞分化を誘導するタンパク質と標的分子との相互作用を調節する被験化合物を同定するための薬剤化合物スクリーニングアッセイ：
    （ａ）（ｉ）被験化合物と、
    （ｉｉ）請求項１３または１４に記載のポリペプチドまたはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる剤、および
    （ｉｉｉ）被験化合物の不在下で該剤が相互作用する標的分子、
    をその相互作用が可能な条件下で混合する工程、そして、
    （ｂ）該剤と標的分子、または該剤と被験化合物を含む複合体の形成を検出する工程。
  36. 請求項１に記載の核酸を含む骨芽細胞分化遺伝子の発現を調節する被験化合物の同定のための薬剤化合物スクリーニング方法であって、該アッセイが以下の工程を含む方法：
    （ａ）請求項１に記載の核酸を含む発現ベクターを形質移入された宿主細胞を提供する工程、
    （ｂ）被験化合物を該宿主細胞に導入する工程、そして、
    （ｃ）該核酸によってコードされるポリペプチドの発現レベルを測定する工程。
  37. 複合体における結合パートナー間の相互作用を調節する化合物を同定するための薬剤化合物スクリーニングアッセイであって、ここで少なくとも該結合パートナーの１つが請求項１３または１４に記載のポリペプチドまたはそのバリアントあるいは誘導体、あるいはその免疫学的に活性なおよび／または機能的な断片からなる剤であり、以下の工程を含む方法：
    （ａ）被験化合物と複合体とを、複合体における相互作用を調節するのに十分な時間接触させる工程；
    （ｂ）該複合体を複合体における相互作用の変化についてモニターする工程；
    （ｃ）該複合体における相互作用を変化させる被験化合物を同定する工程。
  38. 以下の工程を含む移植のための骨芽細胞を産生する方法：
    （ａ）間葉多能性細胞（ＭＰＣ）を含有する骨髄、脂肪組織またはその他の自己ソースからＭＰＣを単離する工程、
    （ｂ）該ＭＰＣの骨芽細胞へのエキソビボでの分化を、請求項1に記載のポリヌクレオチド配列または請求項２から５に記載のベクターを該ＭＰＣに導入することにより、あるいは請求項１３または１４に記載のポリペプチドと該ＭＰＣを接触させることにより、誘導する工程、
    （ｃ）工程（ｂ）において産生された骨芽細胞を単離する工程。
  39. 以下の工程を含む移植片の産生方法：
    （ａ）請求項３８、工程（ｃ）の骨芽細胞とマトリックスまたはマトリックス−形成材料とを混合して骨芽細胞組成物を形成させる工程、そして、
    （ｂ）該骨芽細胞組成物を合成移植片に適用して移植片を産生する工程。
  40. 移植片の製造のための請求項３８によって得られる骨芽細胞の使用。
  41. 骨の欠陥を満たすために用いられるマトリックスまたはマトリックス−形成材料、および請求項１３または１４に記載のポリペプチドまたは請求項１に記載の発現可能なポリヌクレオチドを含む形質移入可能なベクターを、骨芽細胞分化を誘導するのに有効な濃度で含む、骨の欠陥の治療用組成物。
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