WO2021038975A1 - ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 - Google Patents

ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 Download PDF

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聡 小林
公一郎 塩谷
之郎 片岡
雄史 関
富穂 松村
安慶 金成
光央 梅津
光 中澤
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Definitions

  • the present invention is a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium (hereinafter referred to as Bifidobacterium or B bacterium) that expresses and secretes a diabody-type monoclonal antibody (BsAb; bispecific monoclonal antibody) useful for immunotherapy of solid tumors. (May) and its pharmaceutical use.
  • Bifidobacterium or B bacterium a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium (hereinafter referred to as Bifidobacterium or B bacterium) that expresses and secretes a diabody-type monoclonal antibody (BsAb; bispecific monoclonal antibody) useful for immunotherapy of solid tumors. (May) and its pharmaceutical use.
  • BsAb diabody-type monoclonal antibody
  • BsAb also called bifunctional antibody
  • BsAb is an artificial divalent antibody that binds to two different antigens, and is different from a natural bivalent antibody that binds to the same antigen.
  • an antibody that binds to an antigen on tumor cells (tumor marker) and CD3, which is an antigen on T cells (T cell marker) (that is, T-BsAb) cross-links tumor cells and T cells.
  • T cell marker an antigen on T cells
  • T cells are activated into cytotoxic T cells and exert an antitumor effect. Since the mid-1980s, a large number of TBsAbs have been researched and developed as antitumor agents.
  • Catumaxomab binds to the tumor marker EpCAM and the T cell marker CD3 and is a constant region. It is a full-length TBsAb containing, and is approved as an antibody drug for the treatment of malignant ascites.
  • Blinatumomab is a low molecular weight TBsAb that binds to the tumor marker CD19 and the T cell marker CD3 and does not contain a constant region, and is an acute lymphoblastic leukemia (ALL; acute lymphoblastic leukemia). ) Is approved as a therapeutic antibody drug.
  • ALL acute lymphoblastic leukemia
  • T-BsAbs When TBsAb is systemically administered to treat solid tumors, there are still problems to be solved. For example, full-length T-BsAbs have a large molecular size and therefore penetrate into solid tumor tissues. It has been pointed out that there is a limit to the number of patients who have cancer, and that even a small dose may cause cytokine release syndrome (CRS). On the other hand, the low-molecular-weight TBsAb has a problem in stability and a short half-life in blood (Non-Patent Document 1).
  • Diabody-type BsAb which is a type of low-molecular-weight BsAb, has a light chain variable region (VL; lightchain variable region) (VL1) derived from the first antibody and a heavy chain variable region (VH;) derived from the second antibody.
  • the first polypeptide having a heavy chain variable region) (VH2) on the same peptide chain, and the VL (VL2) derived from the second antibody and the VH (VH1) derived from the first antibody are the same. It consists of a second polypeptide carried on the polypeptide chain.
  • a method for producing diabody type BsAb a method using Escherichia coli is known (Patent Document 1, Non-Patent Document 2).
  • anaerobic bacteria such as B bacteria as a gene transport carrier
  • Bacteria B When Bacteria B is administered systemically, they specifically engraft in hypoxic sites such as solid tumors, so they have the activity of converting Bacteria into antitumor proteins and antitumor substance precursors into antitumor substances.
  • Bacteria B When transformed with a gene encoding a protein and administered systemically, the gene is specifically expressed locally in the tumor. Therefore, it is possible to deliver a drug whose side effects are unavoidable by systemic administration to the tumor site at a high concentration and continuously.
  • An object of the present invention is to provide a prophylactic or therapeutic agent for solid tumors, including bifidobacteria that exert a sustained and specific antitumor effect on solid cancers and the bifidobacteria. To provide.
  • the present inventor has been diligently conducting research to solve the above problems, and bifidobacteria expressing and secreting diabody-type BsAb that binds to both human CD3 and human tumor cell surface antigens are found in colorectal cancer, colon cancer, and the like. It was found to have cytotoxic activity against solid tumors such as cholangiocarcinoma and antitumor effect against solid tumors. Further, in the diabody type BsAb, the glutamine (Q) at the 38th Kabat number in the light chain variable region (VL) that binds to human CD3 is replaced with glutamic acid (E), and the heavy chain that binds to the human tumor cell surface antigen.
  • VH variable region
  • K lysine
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • the first polypeptide contains VL that binds to human CD3 and VH that binds to human tumor cell surface antigen in the order of amino terminus to carboxyl terminus, and the second polypeptide is carboxyl from the amino terminus.
  • a linker peptide consisting of 4 to 9 amino acids is linked between VL and VH of the first polypeptide and between VL and VH of the second polypeptide, respectively.
  • a secretory signal peptide-linker peptide conjugate containing any of the following amino acid sequences (i) to (iii) is linked to the amino terminus of the first polypeptide and the second polypeptide.
  • (ii) Amino acid sequence having at least 80% sequence identity with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 13
  • the 38 in the VL of the first polypeptide is glutamate, which is the first polypeptide.
  • the 39th amino acid residue of Kabat number in VH is glutamate
  • the 38th amino acid residue of Kabat number in VL of the second polypeptide is lysine
  • the 39th amino acid residue of Kabat number in VH of the second polypeptide is 39th.
  • the amino acid residue of is lysine; or the amino acid residue of Kabat number 38 in VL of the first polypeptide is lysine and the amino acid residue of Kabat number 39 in VH of the first polypeptide is.
  • the bacterium of the genus Bifidobacterium according to any one of the above [1] to [4].
  • the human tumor cell surface antigen is an antigen belonging to the human EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) family, a human EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), or a human PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen).
  • the Bifidobacterium genus bacterium according to any one of 1] to [5].
  • [7] The bacterium of the genus Bifidobacterium according to any one of the above [1] to [6], wherein the antigen belonging to the human EGFR family is human EGFR, human HER2, or human HER3.
  • [8] The bacterium of the genus Bifidobacterium according to any one of the above [1] to [7], wherein the first polypeptide and the second polypeptide are polycistronically expressed.
  • a preventive or therapeutic agent for a solid tumor which comprises the Bifidobacterium genus bacterium according to any one of the above [1] to [9] as an active ingredient.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to the above [10] which is used in combination with an engraftment and / or growth promoter of Bifidobacterium spp. In a solid tumor.
  • the prophylactic or therapeutic agent according to the above [11] wherein the engraftment and / or growth promoter of Bifidobacterium spp. In a solid tumor is maltose.
  • a step of administering a prophylactic or therapeutic agent for solid tumors containing the Bifidobacterium genus bacterium as an active ingredient to a subject in need of prophylaxis or treatment of solid tumors a step of administering a prophylactic or therapeutic agent for solid tumors containing the Bifidobacterium genus bacterium as an active ingredient to a subject in need of prophylaxis or treatment of solid tumors.
  • Bifidobacterium for use in the prevention or treatment of solid tumors or Bifidobacterium for use in the prevention or treatment of solid tumors, including Bifidobacterium; and the use of Bifidobacterium for the production of prophylactic or therapeutic agents for solid tumors; can be mentioned.
  • the Bifidobacterium spp. Has a cancer cell-damaging activity against solid tumors and an antitumor effect against solid tumors, and are therefore effective in preventing or treating solid tumors.
  • the Bifidobacterium spp. Do not grow in normal tissues, but grow only in tumor tissues in an anaerobic environment, and express diabody-type BsAb that specifically binds to both CD3 and tumor cell surface antigens. -For secretion, human T cells expressing CD3 on their surface are recruited to the vicinity of solid tumors expressing tumor cell surface antigens on their surface via such diabody-type BsAbs, and cytotoxic human T cells are recruited.
  • VH indicates a nucleotide sequence encoding VH derived from an anti-human EGFR antibody
  • c-Myc indicates a nucleotide sequence encoding a c-Myc tag
  • His indicates His.
  • the nucleotide sequence encoding the tag is shown, “THu” in the figure indicates a Hu terminator for B bacteria, “P30” in the figure indicates a P30 promoter for B bacteria, and "SP50-L5" in the figure.
  • “PHu” in the figure indicates a Hu promoter (PHu) for B bacterium
  • “SPCMr” in the figure indicates a spectinomycin resistance gene.
  • Lane 1 indicates a size marker.
  • three types of cancer cells TFK-1 cells [Fig. 33A], HCT116 cells [Fig. 33B] ], And the injury activity against RKO cells [FIG. 33C]
  • n 3 of analysis using the cell viability as an index.
  • SP52-L2 indicates a nucleotide sequence encoding a linking peptide of a secretory signal peptide (SP52) and a linker peptide (L2). It is a schematic diagram of the plasmid pLH36-F1 preparation method. It is a schematic diagram of the plasmid pLH36-1_F2 preparation method. It is a schematic diagram of the plasmid pLH36-2_F2 preparation method. It is a schematic diagram of the plasmid pLH36-1 preparation method. It is a schematic diagram of the plasmid pLH36-2 preparation method.
  • HER2 ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from 2 types of Bifizus bacterium transformants (CUM-36-1H strain and CUM-36-2H strain) and 3 types of Bifizus bacterium transformants (FLM-9H strain, FOM) It is a figure which shows the result (n 2) which analyzed the binding property to human CD3 and HER2 about EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from (-22H strain, and DUM-31H strain) using the ELISA method.
  • EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from bifidobacteria transformant DUP-143 strain four types of human colon cancer cell lines (HCT116 [Fig. 59-2A], HT-29 [Fig. 59-2B], RKO [ FIG.
  • DUP-199HAF strain was intravenously administered to cancer-bearing SCID mice on the 1st, 3rd, 5th, 7th, 10th, 12th, 14th, 17th, and 19th days.
  • Results of analysis of viable cell counts of DUP-199HAF strains in tumors, non-tumor tissues (brain, heart, lungs, kidneys, spleen, and liver) and blood on day and day 21 (median n 5) It is a figure which shows. “BLD” in the figure indicates below the detection limit.
  • the "viable cell count of DUP-199HAF strain" on the vertical axis indicates cfu of the DUP-199HAF strain per 1 g of tumor or the non-tumor tissue for tumors and the non-tumor tissue, and per 1 mL of blood for blood. Indicates cfu.
  • the Bifidobacterium genus bacteria have a light chain variable region (VL) that binds to human CD3 (hereinafter sometimes referred to as "CD3 VL”) and a heavy chain variable region (VH) that binds to human tumor cell surface antigens.
  • VL light chain variable region
  • VH heavy chain variable region
  • a second polypeptide (hereinafter, “the second polypeptide of the present case") containing a “tumor VL”) and a VH that binds to human CD3 (hereinafter, sometimes referred to as “CD3 VH”). ); And secretes a diabody-type bispecific antibody (hereinafter, sometimes referred to as “diabody-type BsAb”) composed of the first polypeptide and the second polypeptide of the present case.
  • Bifidobacterium genus bacteria more specifically, a polynucleotide having a nucleotide sequence encoding the first polypeptide of the present case (hereinafter, may be referred to as “the first polypeptide of the present case”) and the present case.
  • the Bifidobacterium genus is the Bifidobacterium genus even if the first polynucleotide and the second polynucleotide of the case are integrated on the chromosome of the Bifidobacterium genus bacterium.
  • the first polynucleotide and the second polynucleotide of the case are the Bifidobacterium.
  • An autonomously replicable vector containing an autonomously replicable vector existing outside the chromosome of a bacterium of the genus Um that is, the first polynucleotide of the present case and the second polynucleotide of the present case] [hereinafter, "the vector of the present case” Bacteria of the genus Bifidobacterium) that retain [may be] are preferable.
  • Promoters are usually operably linked to each of the upstream of the first polynucleotide and the second polynucleotide of the case, the upstream of the first polynucleotide of the case, and the upstream of the second polynucleotide of the case. ..
  • upstream means a direction opposite to the direction in which mRNA transcription proceeds (downstream).
  • promoter means a region to which RNA polymerase (preferably RNA polymerase and basal transcription factor) binds and initiates transcription of mRNA encoded by a gene located downstream thereof. Promoters usually include a transcription initiation site (TSS).
  • TSS transcription initiation site
  • the solid tumor prophylaxis or therapeutic agent of the present invention is a preparation containing the Bifidobacterium spp. As an active ingredient, which is specified for the purpose of "preventing or treating a solid tumor" (hereinafter, "Prevention / Treatment”). (Sometimes referred to as a “therapeutic agent”), where prevention of solid tumors includes prevention of the onset of solid tumors as well as prevention of exacerbation of the symptoms of solid tumors.
  • the prophylactic / therapeutic agent may be used alone as a pharmaceutical product (formulation), or may be further mixed with an additive and used as a form of a composition (pharmaceutical composition).
  • the solid tumor includes both a solid malignant tumor and a benign tumor, and the solid tumor is preferably a solid malignant tumor (that is, a solid cancer).
  • Examples of the solid cancer include colon cancer, head and neck cancer, breast cancer, lung cancer (for example, non-small cell lung cancer), esophageal cancer, gastric cancer, liver cancer, bile sac cancer, bile duct cancer, pancreatic cancer, pancreatic islet cancer, choriocarcinoma, and colon.
  • Examples include sarcoma, soft tissue sarcoma, neuroblastoma, Wilms tumor, retinal blastoma, and melanoma.
  • the "diabody-type bispecific antibody” is a non-covalent bond between "CD3 VL” in the first polypeptide of the present case and "CD3 VH” in the second polypeptide of the present case (for example,). Ion bond, hydrogen bond, van der Waals force; the same applies hereinafter), and the "tumor VL” in the second polypeptide of the present case and the “tumor VH” in the first polypeptide of the present case are non-covalently bonded.
  • An antibody that constitutes a heterodimer of the first polypeptide and the second polypeptide of the present case and specifically binds to both human CD3 and human tumor cell surface antigen that is, the diabody type BsAb). Means.
  • combination of the first polypeptide and the second polypeptide constituting the diabody type BsAb are "CD3 VL” and “CD3 VL” in the order from the amino (N) terminal to the carboxyl (C) terminal.
  • the combination with the second polypeptide of the present case including "tumor VL" and "CD3 VH” can be preferably exemplified in the order of.
  • a secretory signal peptide, a linker peptide, and their conjugate (the C-terminal of the secretory signal peptide and the N-terminal of the linker peptide are linked; the same applies hereinafter), and one or more protein tags are linked to one site.
  • the first polypeptide of the present case contains "tumor VH” and "CD3 VL” in the order of N-terminal to C-terminal, it may be "Tummer VH" or "CD3 VL".
  • N-terminal of tumor VH between "tumor VH” and “CD3 VL” (that is, C-terminal of "tumor VH” and N-terminal of "CD3 VL"), and C of "CD3 VL”
  • the second polypeptide of the present case when the second polypeptide of the present case contains "tumor VL” and "CD3 VH" in the order from the N-terminal to the C-terminal, the N-terminal of "tumor VL” and “tumor” 1, 2, selected from between “VL” and “CD3 VH” (that is, the C-terminal of "tumor VL” and the N-terminal of "CD3 VH") and the C-terminal of "CD3 VH"
  • one or two or more secretory signal peptides, linker peptides, and their linkages, and protein tags may or may not be linked to three sites.
  • the N-terminal of "CD3 VH”, between “CD3 VH” and “tumor VL” That is, a secretory signal peptide, a linker, at one, two, or three sites selected from the C-terminal of "CD3 VH” and the N-terminal of "tumor VL” and the C-terminal of "tumor VL".
  • Peptides, their conjugates, and protein tags may be linked by one or more, or may not be linked.
  • the linker peptide may be any one that does not inhibit the formation of a diabody-type bispecific antibody and its function (that is, the ability to bind to human CD3 and human tumor cell surface antigen), and the length of the linker peptide is long.
  • the linker peptide is used for linking VL and VH, for example, it is an amino acid in the range of 1 to 30, preferably 1 to 20 amino acids, more preferably 2 to 15 amino acids, and further preferably 3 to 3. It is 10 amino acids, most preferably about 6-7 amino acids (4-9 amino acids, 5-8 amino acids, etc.).
  • linker peptide When the linker peptide is used for linking the secretory signal peptide with VL or VH, for example, it is an amino acid in the range of 1 to 30, preferably 1 to 20 amino acids, more preferably 1 to 15 amino acids, and further. It is preferably 1 to 10 amino acids, most preferably 1 to 6 amino acids.
  • the second polypeptide of the present case can be preferably exemplified.
  • a linker peptide consisting of 4 to 9 amino acids linked to the N-terminal of "tumor VL", “tumor VL” and “CD3 VH” can be preferably exemplified.
  • a secretory signal peptide-linker peptide conjugate linked to the linker peptide is preferable from the viewpoint of expression / secretion efficiency of the heterologous polypeptide.
  • Examples of such a secretory signal peptide-linker peptide conjugate include those disclosed in International Publication No. 2016/088376 pamphlet, and specifically those containing the following (i) to (iii). ..
  • protein tag examples include a c-Myc tag, a histidine (His) tag, an HA tag, and a FLAG tag.
  • VL and VH in the Diabody BsAb are not particularly limited, and for example, VL and VH derived from humans; VL and VH derived from non-human animals such as mice and rats; derived from polyclonal antibodies. VL and VH, VL and VH derived from oligoclonal antibodies (mixtures of several to dozens of antibodies), VL and VH derived from monoclonal antibodies; partial regions of VL and VH (eg, complementarity determining regions [CDR] ] Are substituted with regions derived from different species, such as chimeric VL and VH and humanized VL and VH.
  • CD3 VL and CD3 VH include VL and VH derived from an anti-human CD3 antibody whose amino acid sequence is known, for example, VL and VH derived from an anti-human CD3 antibody disclosed in JP-A-2009-520734; VL and VH derived from anti-human CD3 amino acid disclosed in Japanese Patent Table 2008-503449; VL and VH derived from anti-human CD3 amino acid disclosed in Japanese Patent Table 2013-508391; Anti-human CD3 disclosed in Japanese Patent Table 2017-504314. VL and VH derived from amino acids; VL and VH derived from anti-human CD3 antibody disclosed in Japanese Patent Application Laid-Open No.
  • VL consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with amino acid residues 1 to 107 of SEQ ID NO: 1 and at least 80% with amino acid residues 115 to 233 of SEQ ID NO: 2.
  • VH consisting of amino acid sequences having sequence identity of;
  • VL consisting of amino acid sequences having at least 80% sequence identity with amino acid residues 1 to 107 of SEQ ID NO: 3, and positions 115 to 233 of SEQ ID NO: 4.
  • VH consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with an amino acid residue
  • VL consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with amino acid residues 1 to 108 of SEQ ID NO: 5
  • SEQ ID NO: VH consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with amino acid residues 115-236 of 6
  • CDR1 to 3 of H chain and light (L) chain that is, Kabat number 31 to 35 corresponding to H chain CDR1, Kabat number 50 to 65 corresponding to H chain CDR2, and Kabat number 95 corresponding to H chain CDR3. It also contains Kabat numbers 24-34 corresponding to L-chain CDR1, Kabat numbers 50-56 corresponding to L-chain CDR2, and Kabat numbers 89-97 corresponding to L-chain CDR3, and these H chains and Variable regions other than the L-chain CDR1 to 3 (specifically, the framework region [FR]) modified (humanized) into human-derived variable regions are used as "CD3 VL” and "CD3 VH". May be good.
  • the human tumor cell surface antigen may be any antigen existing on the surface of the tumor cell, for example, human B7-H3, human CEA (carcinoembryonic antigen), human DLL3, human EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) family.
  • Antigens belonging to for example, HER [Human Epidermal Growth Factor Receptor] 1 [human EGFR, also referred to as human ErB1], HER2, HER3, HER4), human EpCAM (Epithelial cell adhesion molecule), human GPC3 (Glypican-3), human GPA33 (glycoprotein A33), human MUC16, human P-type cadoherin, human PSMA (Prostate Specific Membrane Antigen), human SSTR2, and human PD-L1 can be mentioned, and their effects have been demonstrated in this example.
  • Antigens belonging to the EGFR family, human EpCAM, and human PSMA are preferable, and as antigens belonging to the human EGFR family, human EGFR, human HER2, and human HER3 can be preferably exemplified.
  • tumor VL and tumor VH include VL and VH derived from anti-human tumor cell surface antigen antibody whose amino acid sequence is known, for example, anti-human B7- disclosed in International Publication No. 2012/147713.
  • VH derived from an anti-human EGFR antibody consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity; consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with amino acid residues 1-108 of SEQ ID NO: 4.
  • VL derived from anti-HER2 antibody consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with the second amino acid residue, and at least 80% sequence identity with the 115th to 233rd amino acid residues of SEQ ID NO: 15.
  • Anti-human PSMA antibody consisting of amino acid sequences with sequence identity
  • examples thereof include VH derived from the body and VL derived from an anti-human PSMA antibody consisting of an amino acid sequence having at least 80% sequence identity with the amino acid residues 1 to 107 of SEQ ID NO: 87.
  • numbering is performed by kabat, and CDR1 to 3 of H chain and L chain, that is, Kabat numbers 31 to 35 corresponding to H chain CDR1 and Kabat number corresponding to H chain CDR2. It has Kabat numbers 95 to 102 corresponding to 50 to 65 and H chain CDR3, and Kabat numbers 24 to 34 corresponding to L chain CDR1, Kabat numbers 50 to 56 corresponding to L chain CDR2, and L chain CDR3.
  • variable region (specifically, FR) other than the H chain and L chain CDR1 to 3 containing the corresponding Kabat numbers 89 to 97, modified (humanized) into a human-derived variable region, is referred to as "tumor VL. And “tumor VH” may be used.
  • the non-covalent bond with "tumor VL” in is an amino acid residue in which "CD3 VL” and “CD3 VH” are close to each other, and / or an amino acid residue in which "tumor VL” and “tumor VH” are close to each other.
  • amino acid residues having opposite charges promotes and stabilizes the non-covalent binding between the first polypeptide of the present case and the second polypeptide of the present case, and further enhances cytotoxic activity and antitumor effect.
  • amino acid residue to be replaced an amino acid residue in a region other than the complementarity determination region (CDR) in VL and VH, for example, a framework region (FR2) between CDR1 and CDR2 can be mentioned.
  • CDR complementarity determination region
  • FR2 framework region
  • glutamine (Q) VL Q38
  • amino acid residues are neutral amino acids and are highly conserved in humans and mice
  • one of the amino acid residues in each combination can be used as a positively charged amino acid (for example, lysine [K], Substituting arginine [R], histidine [H]; the same applies hereinafter) and substituting the other amino acid residue with a negatively charged amino acid (for example, glutamate [E], aspartic acid [D]; the same applies hereinafter)
  • a combination of amino acid residues, each having the opposite charge, can be obtained.
  • the amino acid residue at the 38th Kabat number in "CD3 VL" of the first polypeptide of the present case is Glutamic acid
  • the 39th amino acid residue of Kabat number in the "tumor VH” of the first polypeptide of the present case is glutamic acid
  • the 38th amino acid residue of Kabat number in the "tumor VL” of the second polypeptide of the present case is glutamic acid
  • the 38th amino acid residue of Kabat number in the "tumor VL” of the second polypeptide of the present case Is lysine
  • the amino acid residue at the 39th Kabat number in "CD3 VH” of the second polypeptide of this case is lysine
  • (2) in "CD3 VL" of the first polypeptide of this case is lysine
  • the 38th amino acid residue of Kabat number is lysine
  • the 39th amino acid residue of Kabat number in the "tumor VH" of the first polypeptide of this case is lysine
  • the "tumor VL” of the second polypeptide of this case is It is preferable that the amino acid residue at the 38th Kabat number in "" is glutamate, and the amino acid residue at the 39th Kabat number in "CD3 VH" of the second polypeptide of the present case is glutamate.
  • ... at least 80% sequence identity with the amino acid sequence means that the proportion of amino acids identical to the amino acid sequence to be compared is 80% or more, preferably 85% or more. , More preferably 88% or more, even more preferably 90% or more, even more preferably 93% or more, particularly preferably 95% or more, particularly more preferably 98% or more, most preferably 99% sequence identity. .. Amino acid sequence identity can be determined using known programs such as ClustalW, GENETYX, BLAST and the like.
  • the promoter in the Vector may be any promoter that functions in Bifidobacterium spp.
  • Hu promoter which is a promoter for the expression of a gene encoding a histone-like DNA-binding protein derived from Bifidobacterium longum.
  • P30 promoter J. Microbiology, 2012, 638-643
  • P54 promoter J. Bacteriology, 2005, 5799-5808, J. Microbiology, 2012, 638
  • Promoter of Gap gene derived from Bifidobacterium breve Biotechnol. Lett.
  • the Vector contains a plasmid replication unit that functions in Bifidobacterium spp. So that it can replicate autonomously.
  • replication units include pTB6 (Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Feb; 69 (2): 422-5), pMB1 (Lett Appl Microbiol. 1990 Oct; 11 (4): 220-3), and pTB4 (Bifidobacterium longum). Structural analysis and application of the derived plasmid pTB4 General presentation Program-The Molecular Biology Society of Japan, 1994), pFI2576 (J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr; 19 (4): 403-8), pCIBAO (ApplEnviron Microbiol.
  • the drug resistance gene used for cloning the Vector As the Vector, the drug resistance gene used for cloning the Vector; and screening for Bacteria of the genus Bifidobacterium containing the Vector; and the transcription of the first polynucleotide and the second polynucleotide are terminated. It is preferable that the nucleotide sequence (that is, the terminator) is contained.
  • the terminator is not particularly limited as long as it is a terminator that functions with Bifidobacterium genus bacteria, and specifically, a Hu terminator derived from Bifidobacterium longum; lactic acid dehydrogenation derived from Bifidobacterium longum. D0013 terminator, which is the terminator of the enzyme gene; T572 terminator derived from Bifidobacterium animalis (J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec; 22 (12): 1714-23); BBa_B0015 (T2), which is an artificially designed terminator. ) Terminator); T2 Terminator (International Publication No. 2016/088376);
  • Examples of the drug resistance gene include a spectinomycin resistance gene, a chloramphenicol resistance gene, an erythromycin resistance gene, and an ampicillin resistance gene.
  • the vector may include an Escherichia coli origin of replication (eg, pUCori, pBR322ori), or may be one in which the E. coli origin of replication is removed after cloning and before introduction into a bacterium of the genus Bifidobacterium. ..
  • Escherichia coli origin of replication eg, pUCori, pBR322ori
  • the vector may include an Escherichia coli origin of replication (eg, pUCori, pBR322ori), or may be one in which the E. coli origin of replication is removed after cloning and before introduction into a bacterium of the genus Bifidobacterium. ..
  • the first polypeptide and the second polypeptide are monocistronically expressed (that is, from one mRNA to the first polypeptide or the second poly). Even if one of the peptides is translated), it is expressed polycistronically (that is, one mRNA translates two of the first polypeptide and the second polypeptide of the present case). Although it may be present, those expressed in polycistronic are preferable from the viewpoint of efficiently expressing the first polypeptide of the present case and the second polypeptide of the present case at a ratio of 1: 1.
  • the Bifidobacterium bacterium that polycistronically expresses the first polypeptide and the second polypeptide has a terminator and a promoter between the first polynucleotide and the second polynucleotide. It can be prepared by preparing the present vector which does not contain and contains the ribosome binding region (RBS) and introducing the present vector into a bacterium of the genus Bifidobacterium.
  • RBS ribosome binding region
  • RBS examples include a polynucleotide consisting of 52 nucleotide residues upstream of the translation initiation codon of the Hup gene derived from the Bifidobacterium longum 105-A strain, and 30S derived from the Bifidobacterium longum 105-A strain. Examples thereof include a polynucleotide consisting of 54 nucleotide residues upstream of the translation initiation codon of the ribosomal protein S16 gene.
  • An electroporation method can be mentioned as a method for introducing the present vector into a bacterium belonging to the genus Bifidobacterium.
  • Bifidobacterium genus bacteria examples include Bifidobacterium longum (B. longum), Bifidobacterium breve (B. breve), Bifidobacterium addresscentis (B. adolescentis), and bi. Bifidobacterium bifidum, B. pseudolongum, B. thermophirum, B. infantis , Bifidobacterium animalis (B. animalis), Bifidobacterium anglatum (B. angulatum), Bifidobacterium asteroides (B. asteroides), Bifidobacterium boum (B.
  • Bifidobacterium minimum B. minimum
  • Bifidobacterium mongolia Ens B. Mongolia Enns
  • Bifidobacterium parvulorum B. parvulorum
  • Bifidobacterium pseudocatenulatum B. pseudocatenulatum
  • Bifidobacterium cyclaerophyllum B. psychraerophilum
  • Bifidobacterium prorum B. pullorum
  • Bifidobacterium luminale B. ruminale
  • Bifidobacterium luminantium B. ruminantium
  • Bifidobacterium saeclare B. ruminantium
  • Bifidobacterium scardovii B. scardovii
  • Bifidobacterium subtile B. subtile
  • Bifidobacterium swiss B. suis
  • Bifidobacterium thermacidophilum B. thermacidophilum
  • Bifidobacterium longum Bifidobacterium breve, and bi, which are known to be resident in the human intestine regardless of age.
  • Fidobacterium addresscentis, Bifidobacterium bifidam, and Bifidobacterium infantis are preferred, and Bifidobacterium longum can be preferably exemplified. All of these bacteria can be easily obtained as commercial products or from depository institutions.
  • the strains of each species are not particularly limited.
  • Bifidobacterium longum for example, Bifidobacterium longum 105-A strain, Bifidobacterium longum aE-194b strain, Bi Examples thereof include Fidobacterium longum bs-601 strain, Bifidobacterium longum M101-2 strain, and Bifidobacterium longum ATCC-15707 strain, and among them, Bifidobacterium longum 105-A strain is preferable.
  • Bifidobacterium longum 105-A strain is preferable.
  • Bifidobacterium breve for example, Bifidobacterium breve standard strain (JCM1192), Bifidobacterium breve aS-1 strain, and Bifidobacterium bleve I-53-8W strain can be mentioned.
  • the Bifidobacterium breve standard strain and the Bifidobacterium breve aS-1 strain can be preferably exemplified.
  • Bifidobacterium Infantis for example, Bifidobacterium Infantis standard strain (JCM1222) and Bifidobacterium Infantis I-10-5 strain can be mentioned.
  • Bifidobacterium lactentis for example, Bifidobacterium lactentis standard strain (JCM1210) can be mentioned.
  • Bifidobacterium bifidam for example, the Bifidobacterium bifidam ATCC-11863 strain can be mentioned.
  • the preventive / therapeutic agent is roughly divided into a liquid type and a non-liquid type.
  • the liquid type preventive / therapeutic agent is obtained by purifying the culture solution of Bifidobacterium spp. And adding appropriate physiological saline or fluid replacement or pharmaceutical additives as necessary to an ampoule or vial. It can be manufactured by filling.
  • the non-liquid type preventive / therapeutic agent is frozen or freeze-dried after adding an appropriate protective agent to the liquid type preventive / therapeutic agent and filling it in an ampoule or a vial. It can be manufactured by.
  • As a method for administering the pharmaceutical composition of the present invention both oral administration and parenteral administration are possible, but parenteral administration is preferable, and examples thereof include intravenous administration and local administration.
  • the preventive / therapeutic agents include conventional pharmaceutically acceptable carriers, binders, stabilizers, excipients, diluents, pH buffers, disintegrants, isotonic agents, additives, coating agents, and the like. It may further contain additives such as a solubilizer, a lubricant, a solubilizing agent, a lubricant, a flavoring agent, a sweetening agent, a solvent, a gelling agent, and a nutritional agent. Specific examples of such additives include water, physiological saline, animal fats and oils, vegetable oils, lactose, starch, gelatin, crystalline cellulose, gum, talc, magnesium stearate, hydroxypropyl cellulose, and polyalkylene glycol. Polyvinyl alcohol and glycerin can be exemplified.
  • the prophylactic / therapeutic agent should be used in combination with an agent for promoting the engraftment and / or growth of bifidobacteria in solid tumors in order to promote the engraftment and growth of bifidobacteria in solid tumors.
  • an agent for promoting the engraftment and / or growth of bifidobacteria in solid tumors in order to promote the engraftment and growth of bifidobacteria in solid tumors.
  • accelerators include sugars such as arabinose, xylose, galactose, glucose, maltose, lactose, melibiose, melezitose, raffinose, and lactulose, and among these, the effects are demonstrated in this example described later. Therefore, maltose can be preferably exemplified.
  • the dose of the Bifidobacterium genus is sufficient for the Bifidobacterium genus bacteria to grow at the solid tumor site and for the effective therapeutic amount of the Diabody-type BsAb to be expressed and secreted.
  • it can be appropriately selected according to the size of the tumor volume, the weight, age, and gender of the administration subject, and can be appropriately increased or decreased according to the degree of improvement.
  • the injection preparation with the lowest possible concentration is dispensed in multiple doses or diluted with an appropriate replacement fluid. Continuous infusion is preferred.
  • the cells of the Bifidobacterium genus are divided into 10 4 to 10 12 cfu (Colony Forming Unit) per 1 kg of body weight once or multiple times a day, and continuously for 1 to several days.
  • administer the drug at appropriate intervals.
  • a preparation containing 10 4 to 10 10 cfu / mL of the Bifidobacterium genus bacterium is directly diluted with 1 to 1000 mL per adult or with an appropriate replacement fluid, and 1 Divide into 1 to several times a day and administer continuously for 1 to several days.
  • the bacteria in the case of local administration directly administered to the diseased tissue, it is required that the bacteria engraft and proliferate in the entire diseased tissue as much as possible. Therefore, it is desirable to administer a high-concentration injection to a plurality of places in the diseased tissue.
  • the cells of the Bifidobacterium spp. are administered at 10 4 to 10 12 cfu per 1 kg of body weight 1 to multiple times a day, as needed for 1 to multiple days, continuously or at appropriate intervals. And administer.
  • the cultured cells were cultured under 37 ° C. and 5% CO 2 conditions.
  • Example 1 Preparation of bifidus bacteria (FLM-9H strain, FOM-22H strain, and DUM-31H strain) that express and secrete EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb Human EGFR ⁇ human CD3 diabody type BsAb is expressed.
  • the secreted Bifizus bacterium was prepared according to the method described in the following items [1-1] to [1-5].
  • Diabody type BsAb composed of LH22 polypeptide 1 (see Table 3) consisting of LH22 polypeptide 1 (see Table 3) and LH22 polypeptide 2 (see Table 4) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4 (hereinafter referred to as "LH22 diabody type BsAb”). ); And a diabody composed of LH31 polypeptide 1 (see Table 5) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and LH31 polypeptide 2 (see Table 6) consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 6.
  • LH9 diabody type BsAb consisting of 3 types of DNA (LH9 diabody type BsAb consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 7) in order to produce Bifizus bacterium expressing and secreting type BsAb (hereinafter, sometimes referred to as "LH31 diabody type BsAb");
  • the part surrounded by a square in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody
  • the part surrounded by a double square shows VH derived from anti-human EGFR antibody
  • the peptide (AGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VL derived from anti-human EGFR antibody, the double underlined part shows VH derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide (AGGGGS) between the two indicates a linker peptide. Shown.
  • the part surrounded by a square in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody
  • the part surrounded by a double square shows VH derived from anti-human EGFR antibody
  • the peptide (AGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VL derived from anti-human EGFR antibody, the double underlined part shows VH derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide (AGGGGS) between the two indicates a linker peptide. Shown.
  • the part surrounded by a square in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody
  • the part surrounded by a double square shows VH derived from anti-human EGFR antibody
  • the peptide (AGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VL derived from anti-human EGFR antibody, the double underlined part shows VH derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide (AGGGGS) between the two indicates a linker peptide. Shown.
  • plasmid pLH9-L5 In order to prepare a bifidobacteria that expresses and secretes LH9 diabody type BsAb in B bacteria, a plasmid pLH9-L5 was prepared according to the procedure shown in FIG.
  • PCR reaction 50 pg / ⁇ L of two types of template DNA (linear vector fragment 1 [see FIG. 2], and artificial DNA containing the coding sequence of the above LH9 diabody type BsAb), 0.2 ⁇ M.
  • Two types of primer sets for amplifying the template DNA a set of DEL1 primer and DEL21 primer, and a set of DEL22 primer and DEL20 primer; see FIGS. 2 and 7
  • a PrimeSTAR HS (Premix) kit (Takara Bio).
  • a PCR reaction (30 cycles with 98 ° C. for 10 seconds, 65 ° C. for 5 seconds, and 72 ° C. [about 1 minute per 1000 base pairs] as one cycle) was performed using the PCR fragment. 1 and PCR fragment 2 were prepared.
  • the PCR fragment 1 and the PCR fragment 2 were ligated using an In-Fusion (registered trademark) HD Cloning Kit (manufactured by Takara Bio Inc.). Specifically, the PCR fragment 1 (vector fragment) and the PCR fragment 2 (insert fragment) are added to a microtube at a molar ratio of 1: 1 and then 2 ⁇ L of 5xIn-Fusion HD Enzyme premix and 1 ⁇ L. Cloning Enhancer was added to adjust the reaction volume to 10 ⁇ L. This was kept warm at 37 ° C. for 15 minutes and then further kept warm at 50 ° C. for 15 minutes. For other procedures, the infusion reaction solution was prepared according to the product description of the kit.
  • In-Fusion registered trademark
  • HD Cloning Kit manufactured by Takara Bio Inc.
  • the culture medium was shaken overnight at 37 ° C. in LB liquid medium containing mL spectinomycin, and then the plasmid pLH9-L5 was isolated and purified using the QIAprep Spin Miniprep Kit (manufactured by Kiagen).
  • plasmid pLH22-L5 cm was prepared according to the procedure shown in FIGS. Specifically, first, using the linearized vector fragment 1 as a template, PCR is performed using a primer set of a DEL1 primer and a DEL21 primer to prepare a PCR fragment 3, and the coding sequence of the above LH22 diabody type BsAb.
  • PCR was performed using an artificial DNA containing DEL23 and a primer set of DEL4 primers as a template to prepare PCR fragment 4, and then an infusion reaction using PCR fragment 3 and PCR fragment 4 was performed.
  • an Escherichia coli transformant carrying the plasmid pLH22-L5-F1 according to the method described in the item of "1-2-3"
  • the plasmid pLH22-L5-F1 was isolated and purified (FIGS. 3 and 7). reference).
  • nucleotide sequence encoding the VL derived from the anti-human CD3 antibody of the plasmid pLH22-L5-F1 contained a nucleotide sequence encoding the LH22 polypeptide 2 and a high homology region, a silent mutation (derived from the anti-human CD3 antibody) was present. Substitution of nucleotide residues that does not change the VL amino acid sequence of Specifically, using the plasmid pLH22-L5-F1 as a template, PCR was performed using a primer set of DEL43 primer and pUC6 primer for mutation introduction and a primer set of DEL42 primer and pUC7 primer for mutation introduction, respectively, and PCR fragments were performed.
  • PCR was performed using the DEL19 primer and the DEL20 primer set of plasmids to prepare PCR fragment 8, and then an infusion reaction using PCR fragment 7 and PCR fragment 8 was carried out.
  • the plasmid pLH22-L5 cm was isolated and purified (see FIGS. 4 and 7). The PCR reaction and the infusion reaction were carried out according to the methods described in the above items "1-2-1" and "1-2-2", respectively.
  • plasmid pLH31-L5 was prepared according to the procedure shown in FIGS. 5 and 6. Specifically, first, PCR is performed using a linearized vector fragment 1 as a template and a primer set of DEL1 primer and DEL24 primer is performed to prepare PCR fragment 9, and the coding sequence of the above LH31 diabody type BsAb.
  • PCR was performed using an artificial DNA containing DEL25 primer and a primer set of DEL4 primer as a template to prepare PCR fragment 10, and then an infusion reaction using PCR fragment 9 and PCR fragment 10 was performed.
  • an Escherichia coli transformant carrying the plasmid pLH31-L5-F1 according to the method described in the item "1-2-3"
  • the plasmid pLH31-L5-F1 was isolated and purified (FIGS. 5 and 7). reference).
  • PCR was performed using the plasmid pLH31-L5-F1 as a template and a primer set of DEL1 primer and DEL18 primer to prepare PCR fragment 11, and an artificial DNA containing the coding sequence of the above LH31 diabody type BsAb was used as a template. Then, PCR was performed using the DEL19 primer and the primer set of the DEL20 primer to prepare the PCR fragment 12, and then the infusion reaction using the PCR fragment 11 and the PCR fragment 12 was carried out, and the above "1-2-3" was performed.
  • the plasmid pLH31-L5 was isolated and purified (see FIGS. 6 and 7).
  • the PCR reaction and the infusion reaction were carried out according to the methods described in the above items "1-2-1" and "1-2-2", respectively.
  • an electric shock (2 kV, 25 ⁇ F, 200 ⁇ ) was performed, and 800 ⁇ L of IMR liquid medium and 50 ⁇ L of vitamin C-added solution (350 mg / mL ascorbic acid, 20 mg / mL L-) were placed in a cuvette (2 mm gap).
  • a mixture with cysteine hydrochloride monohydrate and 110 mg / mL sodium carbonate) was added immediately and collected in a sterilized 2 mL microtube.
  • the lid of the tube was loosened, and the tube was placed in a closed container together with an oxygen scavenger / carbon dioxide generator (Aneropack [registered trademark], Kenki, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Ltd.) and kept warm for 3 hours in an incubator set at 37 ° C.
  • an oxygen scavenger / carbon dioxide generator (Aneropack [registered trademark], Kenki, manufactured by Mitsubishi Gas Chemical Company, Ltd.) and kept warm for 3 hours in an incubator set at 37 ° C.
  • Each bacterial suspension after heat retention was applied to 75 ⁇ g / mL spectinomycin-containing IMR agar medium.
  • These plates were placed in a closed container together with the above oxygen scavenger / carbon dioxide generating agent, and cultured in an incubator set at 37 ° C. for 2 days.
  • the colonies formed on the above-mentioned Spectinomycin-containing IMR agar medium are cultivated, drawn on a 75 ⁇ g / mL Spectinomycin-containing BL-bS agar medium, placed in a closed container together with a deoxidizing / carbon dioxide gas generating agent, and placed at 37 ° C.
  • Bifidobacterium longum 105-A strain FLM-9H strain
  • plasmid pLH22-L5 cm which carries three types of bifidobacteria transformants, that is, plasmid pLH9-L5, after culturing in the incubator set in Bifidobacterium longum 105-A strain (FOM-22H strain) carrying the plasmid pLH31-L5 and Bifidobacterium longum 105-A strain (DUM-31H strain) carrying the plasmid pLH31-L5 were obtained.
  • Bifidobacterium longum 105-A strain FLM-9H strain
  • plasmid pLH22-L5 cm which carries three types of bifidobacteria transformants, that is, plasmid pLH9-L5, after culturing in the incubator set in Bifidobacterium longum 105-A strain (FOM-22H strain) carrying the
  • Example 2 Expression / secretion evaluation (WB) of FLM-9H strain, FOM-22H strain, and DUM-31H strain.
  • the above-mentioned three types of bifidobacteria transformants express and secrete EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the following [2-1]. And, it was confirmed according to the method described in the item of [2-2].
  • the mixture was added so as to be mL, and 100 ⁇ L of the above preculture solution was inoculated and then anaerobically cultured at 37 ° C. for 18 hours to prepare the main culture medium. After centrifuging the main culture solution, the culture supernatant is collected, and 10 ⁇ L of 5 ⁇ sample loading buffer (Pierce Lane Marker Reducing Sample Buffer, manufactured by ThermoFischer Scientific) is mixed with 40 ⁇ L of the culture supernatant and heat-treated at 95 ° C. for 3 minutes. Was performed to prepare a sample for electrophoresis. The same operation was also performed on the Bifidobacterium longum 105-A strain (BE shuttle strain) carrying the BE shuttle vector, which was used as a negative control.
  • sample loading buffer Pulierce Lane Marker Reducing Sample Buffer, manufactured by ThermoFischer Scientific
  • a secondary antibody reaction treatment was performed using a labeled anti-mouse antibody (manufactured by GE Healthcare Japan), and light was emitted using Western Lightning Ultra (manufactured by PerkinElmer). This was analyzed with an imaging analyzer (myECL Imager, manufactured by Thermo Fischer Scientific).
  • Example 3 Evaluation of binding of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from FLM-9H strain, FOM-22H strain, and DUM-31H strain to EGFR / CD3
  • the above three types of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb ( LH9 diabody type BsAb, LH22 diabody type BsAb, and LH31 diabody type BsAb) bind to EGFR and CD3 according to the method described in the following items [3-1] and [3-2]. confirmed.
  • the protein that is, EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb
  • a histidine tag fusion protein purification kit (TALON Metal Infinity Resins, manufactured by Takara Bio Co., Ltd.) and refined. It was concentrated by external filtration (Amicon Ultra-0.5, nominal fractional molecular weight: 10 kDa, manufactured by Merck).
  • Each EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb has an absorbance at 280 nm (A280 value) measured with a spectrophotometer (NanoDrop2000c, manufactured by Thermo Fischer Scientific) and an extinction coefficient of diabody type BsAb (Abs0 of LH9 diabody type BsAb).
  • .1% 1.914, Abs 0.1% of LH22 diabody type BsAb: 1.851, Abs 0.1% of LH31 diabody type BsAb: 1.793), calculated based on 10 (ng / mL) It was adjusted to 100 (ng / mL) and 1000 (ng / mL).
  • the A280 value of Abs 0.1% was calculated using the ProtParam tool (https://web.expasy.org/protparam/) of the gene analysis site Expasy.
  • PBS PBS
  • Tween 20 manufactured by MP Biomedical
  • 25 ⁇ L of each well was dispensed and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours to obtain an antibody (EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb) and an antigen (immobilized human EGFR recombination).
  • the reaction treatment of the protein and the immobilized human CD3E / CD3D heterodimer recombinant protein) was performed. Then, the liquid in each well was removed, and the cells were washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS-T.
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP [Horseradish Peroxidase]
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • Color Solution A and Color Solution B solution containing TMB [3,3', 5,5'-Tetramethylbenzidine], which is a substrate of HRP
  • detection reagents each well. 50 ⁇ L of each was dispensed, and the mixture was allowed to stand at room temperature for 20 minutes in the dark. Then, 25 ⁇ L of Stop Solution (manufactured by R & D Systems) was added to stop the color reaction. The absorbance at 450 nm, which is the absorption wavelength of the TMB-derived dye, was measured, and the value corrected for the absorbance at 570 nm (negative control) (mean ⁇ standard deviation, see vertical axis in FIGS. 8 and 9) was calculated.
  • Example 4 Evaluation of cytotoxic activity of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from the culture supernatants of FLM-9H strain, FOM-22H strain, and DUM-31H strain The above three types of EGFR ⁇ CD3 diabody type It was confirmed that BsAb has cytotoxic activity according to the method described in the following items [4-1] and [4-2].
  • T-LAK T-LAK activate T lymphocytes
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • 10 ⁇ g / mL anti-human CD3 antibody manufactured by BioLegend
  • PBS PBS
  • RPMI-containing 10% inactivated FBS Human PBMC suspended in 1640 medium was seeded and cultured in the presence of 140 U / mL IL-2 for 2 weeks while exchanging the medium every 3 to 4 days to prepare T-LAK.
  • T-LAK is stored in a liquid nitrogen gas phase, and when used for cytotoxic activity measurement, T-LAK is suspended in RPMI-1640 medium containing 10% deactivated FBS and 140 U / mL IL. In the presence of -2, the cells were cultured for 1 week.
  • HCT116 cells obtained from ATCC [American Type Culture. Collection]
  • ATCC American Type Culture. Collection
  • T-LAK was mixed to a T-LAK: HCT116 cell ratio of 5: 1.
  • the above three types of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified according to the method described in the above item “3-1” are serially diluted to a concentration of 100 fM (10-13 M) to 100 pM ( 10-10 M). Was added, the medium volume was adjusted to a total of 100 ⁇ L, and the cells were cultured for 24 hours.
  • each well was washed 3 times with PBS (-), 120 ⁇ L of RPMI-1640 medium containing CellTiter 96 (registered trademark) AQueous One Solution Cell Proliferation Assay (manufactured by Promega) was added, and 37 ° C., 5% CO Incubated at 2 for 10 minutes. Then, the absorbance at 490 nm was measured, and the absorbance at 660 nm was measured as a negative control wavelength.
  • the survival rate of HCT116 cells mean ⁇ standard deviation, see the vertical axis in FIG. 10
  • the value obtained by measuring the wells of Blank was set to 0%, and the wells in which HCT116 cells containing no T-LAK were seeded were measured. The value was calculated assuming that the cell viability was 100%.
  • EGFR ⁇ CD3 diabody type The EC 50 values of the BsAb (i.e., the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb reducing the viability to 50% of HCT116 cells), if the LH9 diabody type BsAb, 2.2PM In the case of LH22 diabody type BsAb, it was 0.25 pM, and in the case of LH31 diabody type BsAb, it was 32 pM.
  • Example 5 Preparation of bifidobacteria (DUM-126H strain) expressing and secreting EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb
  • human EGFR ⁇ human CD3 diabody type Bifidobacterium expressing and secreting BsAb was prepared according to the method described in the following items [5-1] to [5-2].
  • Example 6 Expression / secretion evaluation (WB) of DUM-126H strain
  • DUM-126H strain culture supernatant is used according to the method described in Example 2. The Western blotting method was performed.
  • Example 7 Evaluation of binding of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from DUM-126H strain to CD3
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by the bifidus bacterium transformant (DUM-126H strain) is a human EGFR. It was confirmed that it specifically binds to both human CD3 and human CD3 according to the method described in the following items [7-1] and [7-2].
  • Antibody detection Antigen-antibody reaction treatment was performed with 25 ⁇ L of signal enhancer HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque) containing 0.1 ⁇ g / mL recombinant biotinylated human EGFR (manufactured by Acro Biosystems). It was dispensed into each of the above wells and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. The liquid in each well was removed and washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T.
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • biotinylated human EGFR manufactured by Acro Biosystems
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • Color Solution A and Color Solution B a solution containing TMB, which is a substrate of HRP (manufactured by R & D Systems) as detection reagents
  • 50 ⁇ L of each well is dispensed, shielded from light, and 20 at room temperature. Allowed to stand for minutes.
  • 25 ⁇ L of Stop Solution manufactured by R & D Systems
  • the absorbance at 450 nm which is the absorption wavelength of the TMB-derived dye, was measured, and a value corrected for the absorbance at 570 nm (negative control) (mean ⁇ standard deviation, see vertical axis in FIG. 15) was calculated.
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb ie, LH31 diabody type BsAb
  • DUM-126H strain bifidobacteria transformant
  • Example 8 Amount of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the culture supernatant of the DUM-126H strain. The amount of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the culture supernatant of the bifidobacteria transformant (DUM-126H strain) is as follows. The measurement was performed according to the method described in the items of [8-1] and [8-2].
  • the antibody (EGFR ⁇ CD3 diabody type) was diluted 500-fold with the signal enhancer HIKARIA solution (manufactured by Nacalai Tesque), dispensed into each blocking-treated well by 25 ⁇ L, and allowed to stand at 25 ° C. for 2 hours.
  • BsAb was treated with an antigen (immobilized human CD3E / CD3D heterodimeric recombinant protein). Then, the liquid in each well was removed, and the cells were washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS-T.
  • Antibody detection Antigen-antibody reaction treatment was performed with 25 ⁇ L of signal enhancer HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque) containing 0.05 ⁇ g / mL of recombinant biotinylated protein L (manufactured by Thermo Fischer Scientific). It was dispensed into each of the above wells and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. The liquid in each well was removed and washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T.
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • biotinylated protein L manufactured by Thermo Fischer Scientific
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • Color Solution A and Color Solution B a solution containing TMB, which is a substrate of HRP (manufactured by R & D Systems) as detection reagents
  • 50 ⁇ L of each well is dispensed, shielded from light, and 20 at room temperature. Allowed to stand for minutes.
  • 25 ⁇ L of Stop Solution (manufactured by R & D Systems) was added to stop the color reaction.
  • the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the culture supernatant of the transformant (DUM-126H strain) was quantified.
  • Example 9 Cytotoxic activity of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from DUM-126H strain culture supernatant EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb expressed and secreted by a Bifizus bacterium transformant (DUM-126H strain) was purified according to the method described in the item "7-1" of Example 7, serially diluted to a concentration of 100 fM to 100 pM, and then the viability of HCT116 cells was analyzed according to the method described in Example 4.
  • Example 10 Cytotoxic activity of DUM-126H strain culture supernatant
  • EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb expressed and secreted by a bifidobacteria transformant DUM-126H strain
  • Cytotoxic activity was analyzed using the supernatant. Specifically, prepared by diluting 10 3 fold to 10 6 times the culture supernatant of DUM-126H strain prepared in Example 8, was analyzed viability HCT116 cells according to the method described in Example 4. As a negative control, using those culture supernatant BE shuttle strains were diluted 10 3 fold to 10 6 times, and analyzed similarly.
  • Example 11 In vivo medicinal effect by Mins transplantation method containing DUM-126H strain The antitumor effect of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by DUM-126H strain is borne by HCT116 cells, which are human colon cancer cell lines. In vivo analysis using cancer Scid mice was performed. Specifically, the analysis was performed according to the method described in the following items [11-1] to [11-4].
  • HCT116 cells were cultured in McCoy's 5A medium (manufactured by Sigma-Aldrich) containing 10% FBS (manufactured by Equitech-Bio), and then 7-week-old female Scid mice (manufactured by Sigma-Aldrich).
  • Subcutaneous cancer-bearing mice were prepared by transplanting to (manufactured by Nippon SLC). Cancer-bearing mice having a tumor size of 447.59 to 517.62 mm 3 were divided into three groups: PBS-administered group (12 animals), BE shuttle strain-administered group (14 animals), and DUM-126H strain-administered group (14 animals). (5 days before tumor mince transplantation).
  • 0.2 mL of PBS was intravenously administered to the PBS administration group, and the BE shuttle strain administration group.
  • a frozen preparation of 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0.2 mL BE shuttle strain was administered intravenously to the tail vein, and 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0.2 mL DUM- was administered to the DUM-126H strain administration group.
  • a simple frozen preparation of 126H strain was intravenously administered to the tail vein.
  • 0.2 mL of Mins transplantation solution was subcutaneously transplanted into new 7-week-old female Scid mice, and the PBS group (14 animals), BE shuttle strain group (15 animals), and DUM-126H strain group (15 animals), respectively. ).
  • the viable cell count of the bifidobacteria transformants (BE shuttle strain and DUM-126H strain) contained in the tumor mince at the time of transplantation was measured according to the method described in the item "11-2" below.
  • 1 mL of 10% maltose solution was intraperitoneally administered twice daily for tumors.
  • TGI tumor growth inhibition rate
  • the cells were cultured at ° C. for 3 days. Count the number of colonies formed on the BLFS agar medium and calculate the viable number of bifidobacteria transformants (BE shuttle strain and DUM-126H strain) contained in the tumor before preparing the tumor mince or the transplanted tumor mince. (See “Number of viable cells in tumor” and “Number of viable bacteria in transplanted tumor mince” in Table 8, respectively).
  • the 0 mL tube was placed on the magnetic stand again to attract the magnetic beads to the wall surface, and then the cleaning liquid was removed to wash the magnetic beads.
  • the same cleaning operation was further performed once on TBS containing 1% Tween 20 and twice on TBS.
  • the adsorbed magnetic beads were suspended in 15.9 ⁇ L of 0.1 M glycine-hydrochloric acid solution (pH 2.0), allowed to stand at room temperature for 10 minutes, and EGFR ⁇ CD3. Diabody type BsAb was eluted.
  • Diabody type BsAb (mutant LH31 diabody type BsAb) serially diluted to 16 ng / mL to 0.015625 ng / mL was incubated at 25 ° C. for 2 hours, respectively. Then, each well was washed with PBS-T and incubated at 25 ° C. for 1 hour in the presence of recombinant biotinylated protein L (manufactured by Thermo Fischer Scientific). Each well was washed with PBS-T and then incubated at 25 ° C. for 30 minutes in the presence of VECTASTAIN Elite ABC reagent (avidin-biotin labeled HRP) (manufactured by Vector).
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP
  • the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the tumor mince was quantified (see “EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb concentration in the tumor mince” in Table 8).
  • ND in the table indicates that the sensitivity is equal to or lower than the detection sensitivity.
  • the viable cell count of the bifidobacteria transformant (BE shuttle strain and DUM-126H strain, respectively) is included in the tumor mince used for transplantation. It was confirmed that the DUM-126H strain expresses and secretes EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb (that is, LH31 diabody type BsAb) (see Table 8).
  • the tumor volume of the BE shuttle strain group mouse was almost the same as the tumor volume of the negative control PBS group mouse, whereas DUM- The tumor volume of the 126H strain group mice was significantly reduced as compared with the tumor volume of the negative control PBS group mice.
  • the tumor growth inhibition rate [TGI] with respect to the PBS group was 49. It was 5% (see FIG. 17). This result indicates that the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by the bifidobacteria transformant (DUM-126H strain) has an antitumor effect.
  • Example 12 Preparation of bifidobacteria (DUP-143 strain and DUP-153 strain) expressing and secreting EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb Separately from the bifidobacteria transformants prepared in Examples 1 and 5. , Human EGFR ⁇ Human CD3 Diabody type BsAb was expressed and secreted by bifidobacteria according to the methods described in the following items [12-1] to [12-4].
  • LH31 polypeptide 1 in which the 39th Q of Kabat number (that is, the 153rd Q of SEQ ID NO: 5) of the EGFR antibody VH is replaced with E (hereinafter, may be referred to as "mutant LH31 polypeptide 1"); SP52-L5 is added to the terminus instead of P50-L5, and the 38th Q of Kabat number (that is, the 38th Q of SEQ ID NO: 6) of the anti-human EGFR antibody VL is replaced with lysine (K).
  • mutant LH31 polypeptide 2 With the LH31 polypeptide 2 in which the 39th Q of Kabat number (that is, the 153rd Q of SEQ ID NO: 6) of the anti-human CD3 antibody VH was replaced with K (hereinafter, may be referred to as “mutant LH31 polypeptide 2”).
  • a plasmid (plasmid p143TLB6a) (see FIG. 26) expressing; was prepared using the same method as in Example 1 according to the procedure shown in FIGS. 18 to 26.
  • Such a plasmid p143TLB6a expresses mutant LH31 polypeptide 1 and mutant LH31 polypeptide 2 polycistronic by inserting RBS1, and EGFR composed of mutant LH31 polypeptide 1 and mutant LH31 polypeptide 2.
  • ⁇ Human CD3 diabody type BsAb (hereinafter, may be referred to as “mutant LH31 diabody type BsAb”) can be secreted.
  • a plasmid (plasmid p153TLB6a) (see FIG. 31) expressing the added mutant LH31 polypeptide 2 was prepared using the same method as in Example 1 according to the procedure shown in FIGS. 27 to 31.
  • Such a plasmid p153TLB6a polycistronics the mutant LH31 polypeptide 1 and the mutant LH31 polypeptide 2 by inserting RBS2, and EGFR ⁇ human CD3 diabody composed of the mutant LH31 polypeptide 1 and the mutant LH31 polypeptide 2.
  • Type BsAb ie, mutant LH31 diabody type BsAb
  • the primer sets used for PCR are shown in Table 7.
  • Example 13 Evaluation of binding of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from DUP-143 strain and DUP-153 strain to CD3 Bifizus bacterium transformants (DUP-143 strain and DUP-153 strain) are expressed and secreted. It was confirmed that the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb specifically binds to both human EGFR and human CD3 according to the methods described in the following items [13-1] and [13-2].
  • Example 14 Amount of EGFR ⁇ CD3 diabody-type BsAb in culture supernatants of DUP-143 and DUP-153 strains In culture supernatants of Bifizus bacterium transformants (DUP-143 and DUP-153) The amount of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb was measured according to the method described in Example 8.
  • the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb (ie, mutant LH31 diabody type BsAb) in the culture supernatant of the DUP-143 strain was 702 ⁇ 63 (ng / mL), and the culture supernatant of the DUP-153 strain. It was confirmed that the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb (that is, mutant LH31 diabody type BsAb) in EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb was 634 ⁇ 46 (ng / mL).
  • Example 15 Ratio of mutant LH31 polypeptide 1 to mutant LH31 polypeptide 2 in mutant LH31 diabody type BsAb derived from DUP-143 strain and DUP-153 strain p143TLB6a and p153TLB6a which are plasmids expressed polycistronically. However, it was confirmed whether the mutant LH31 polypeptide 1 and the mutant LH31 polypeptide 2 were expressed to the same extent.
  • Ammonium sulfate was added to about 50 mL of the culture supernatants of the DUP-143 strain and the DUP-153 strain prepared in Example 14 so as to be 80% saturated, and the mixture was stirred at 4 ° C. overnight to perform salting out. Then, the mixture was centrifuged, the precipitate was collected, dissolved in 1 mL of PBS (-), transferred to a Spectra / Pore 2 dialysis membrane (molecular weight cut off: 12-14 kDa) (manufactured by SPECTRUM), and contained in PBS (-). Dialysis was performed overnight at 4 ° C.
  • the dialysis buffer was changed on the way, and the protein solution after dialysis was transferred to an ultrafiltration device (Amicon Ultra-0.5, nominal molecular weight cut-off; 10KDa) (manufactured by Merck), concentrated to 1/5 volume, and protein.
  • Such an electrophoresis sample is electrophoresed on a Mini-Protian (registered trademark) TGX gel (4 to 20%) (manufactured by Bio-Rad) and stained with a staining solution (Oriole fluorescent gel stain) (manufactured by Bio-Rad). did.
  • the values in the table indicate the intensities of band 1 and band 2 in FIG.
  • Example 16 For each culture supernatant of Example 16] DUP-143 strain and DUP-153 strain cytotoxic activity DUP-143 strain culture supernatant and DUP-153 strain culture supernatant, 10 3 fold to 10 6 A double-diluted product was prepared and the cytotoxic activity was analyzed according to the method described in Example 10.
  • cancer cells in addition to HCT116 cells, TFK-1 cell (Tohoku University Institute of Aging Medicine, Medical Cell Resource Center / Cell Bank), which is a human bile duct cancer cell line, and RKO cell, which is a human colon cancer cell line, (Obtained from ATCC [American Type Culture. Collection]) was used.
  • the survival rate of HCT116 cells is used. (29% and 35%) is more than the effect (83%) (see Example 10) when using the DUM-126H strain (that is, strain B carrying the plasmid p126) culture supernatant.
  • Example 17 Evaluation of cytotoxic activity of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb purified from the culture supernatants of DUP-143 and DUP-153 strains Bifizus bacterium transformants (DUP-143 and DUP-153 strains) ) Expressed and secreted EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb is purified according to the method described in the item “7-1” of Example 7, serially diluted to a concentration of 100 fM to 100 pM, and then described in Example 4. The viability of HCT116 cells was analyzed according to the above method.
  • EC 50 value in the case of using the mutant LH31 diabody type BsAb purified from DUP-143 strain and DUP-153 strain (1.8pM) was used LH31 diabody type BsAb purified from DUM-126H strain than the EC 50 values in the case (8.4pM) (see example 9) was reduced to about 21%.
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb (mutant LH31 diabody type BsAb) expressed / secreted by the DUP-143 strain and the DUP-153 strain is the EGFR ⁇ CD3 diabody expressed / secreted by the DUM-126H strain. It has been shown to have higher cytotoxic activity against cancer cells than type BsAb (LH31 diabody type BsAb), supporting the results of Example 16.
  • Example 18 In vivo medicinal effect by Mins transplantation method including DUP-143 strain and DUP-153 strain The antitumor effect of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by DUP-143 strain and DUP-153 strain in humans.
  • HCT116 cells were cultured in McCoy's 5A medium containing 10% FBS (manufactured by Equitech-Bio), and then subcutaneously transplanted into 9-week-old female Scid mice to prepare cancer-bearing mice.
  • Cancer-bearing mice having a tumor size of 263.83 to 476.70 mm 3 were treated with the BE shuttle strain (12), DUM-126H (12), DUP-143 (12), and DUP. It was divided into 4 groups of -153 strain administration group (12 animals) (5 days before tumor mince transplantation).
  • the BE shuttle strains administration group BE shuttle strains of 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0.2mL
  • the frozen preparation was intravenously administered to the DUM-126H strain group, and a 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0.2 mL simple frozen preparation of the DUM-126H strain was intravenously administered to the DUM-143 strain.
  • the group a simple freeze preparation of DUP-143 strain of 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0.2mL administered into the tail vein, the DUP-153 strain-administered group, 5.0 ⁇ 10 8 cfu / 0 .
  • a simple frozen preparation of 2 mL of DUP-153 strain was administered intravenously to the tail. After 1 to 4 days (4 days to 1 day before tumor mins transplantation) after dividing into 4 groups, 1 mL of 10% maltose solution was intraperitoneally administered twice a day 4 days later (1 day before tumor mins transplantation). 0.2 mL of anti-asiaro GM1 antibody diluted 10-fold with PBS (-) was intraperitoneally administered. Similarly, the anti-asiaro GM1 antibody was intraperitoneally administered to the Scid mice to be subcutaneously transplanted thereafter.
  • each group (BE shuttle strain administration group, DUM-126H strain administration group, DUP-143 strain administration group, and DUP-153 strain administration group) Tumors were removed from the mice, the tumors were pooled, mins was diluted 1.33 times with a 1: 1 mixture of Matrigel (Corning) and HBSS (Life technologies), and cultured T-LAK was obtained. The mixture was mixed so as to be 0.375 ⁇ 10 8 cells / mL, and Teceleukin (manufactured by Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.) was added so as to be 5000 U / mL to prepare a mince transplant solution.
  • Teceleukin manufactured by Shionogi Pharmaceutical Co., Ltd.
  • 0.2 mL of Mins transplantation solution was subcutaneously transplanted into new 7-week-old female Scid mice, and the BE shuttle strain group, DUM-126H strain group, DUP-143 strain group, and DUP-153 strain group (each). 12 animals in the group).
  • the viable count of bifidobacteria transformants (BE shuttle strain, DUM-126H strain, DUP-143 strain, and DUP-153 strain) contained in the tumor before preparing the tumor mince or the transplanted tumor mince is determined. Measured according to the method described in the item "11-2" above (see “Number of viable bacteria in tumor” and “Number of viable bacteria in transplanted tumor mince” in Table 10, respectively), and EGFR contained in tumor mince.
  • the concentration of ⁇ CD3 diabody type BsAb was measured according to the method described in the above items “11-3” and “11-4” (“EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb concentration in tumor mince” in Table 10”. reference).
  • EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb concentration in tumor mince in Table 10”. reference.
  • 1 mL of 10% maltose solution was intraperitoneally administered twice daily for tumors.
  • Mince transplant after 7 days, 11 days, 14 days, and on day 17, to measure the tumor diameter in each group mice, the formula "tumor volume long diameter ⁇ short diameter 2/2" group Calculated (see FIG. 34).
  • ND in the table indicates that the sensitivity is equal to or lower than the detection sensitivity.
  • the tumor mince used for transplantation includes the viable cell count of Bifizus bacterium transformants (BE shuttle strain, DUM-126H strain, DUP-143 strain, and DUP-153 strain).
  • Bizaus bacterium transformants BE shuttle strain, DUM-126H strain, DUP-143 strain, and DUP-153 strain.
  • Three types of Bifizus bacterium transformants (DUM-126H strain, DUP-143 strain, and DUP-153 strain) other than the negative control are EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb (that is, LH31 diabody type BsAb and mutant LH31). It was confirmed that diabody type BsAb) was expressed and secreted (see Table 10).
  • the tumor volume of the DUP-143 strain group mouse and the tumor volume of the DUP-153 strain group mouse were found in the negative control BE shuttle strain group mouse. It was significantly reduced compared to the tumor volume (see FIG. 34).
  • the diabody-type BsAb concentration of the DUP-143 strain and the DUP-153 strain contained in the tumor mince was lower than the diabody-type BsAb concentration of the DUM-126H strain (see Table 10)
  • the tumor The effect of reducing the volume was greater when the DUP-143 strain and the DUP-153 strain were used than when the DUM-126H strain was used (see FIG. 34).
  • the TGI for the BE shuttle strain group was 43.1% in the DUM-126H strain group, whereas it was 60.6% in the DUP-143 strain group.
  • DUP-153 strain was as high as 61.5%.
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb mutant LH31 diabody type BsAb expressed / secreted by the DUP-143 strain
  • the DUP-153 strain is the EGFR ⁇ CD3 diabody expressed / secreted by the DUM-126H strain. It has been shown to have a higher antitumor effect than type BsAb (LH31 diabody type BsAb), supporting the results of Examples 16 and 17.
  • Example 19 Preparation of bifidus bacteria (CUM-36-1H strain and CUM-36-2H strain) expressing and secreting HER2 ⁇ CD3 diabody type BsAb Bifizus expressing and secreting HER2 ⁇ human CD3 diabody type BsAb Bacteria were prepared according to the methods described in the following items [19-1] and [19-2].
  • plasmids pLH36-1 (see FIG. 39) and pLH36-2 (see FIG. 40) were prepared according to the procedure shown in FIGS. 36 to 40. More specifically, the plasmid pLH36-1 has SP50-L5 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 10) and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) on the N-terminal side and C-terminal side, respectively.
  • LH36 polypeptide 1 and SP50-L2 amino acid sequence of SEQ ID NO: 13
  • c-Myc-His fusion tag amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • LH36 polypeptide 2 see FIG. 39.
  • SP50-L5 amino acid sequence of SEQ ID NO: 10
  • c-Myc-His fusion tag amino acid sequence of SEQ ID NO: 11
  • LH36 polypeptide 1 added to the side, SP52-L2 that is, secretory signal peptide SP52 [amino acid residues 1-35 of SEQ ID NO: 18] and L2 linker peptide [amino acid 36-37 of SEQ ID NO: 18] Residue] and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) are plasmids expressing the LH36 polypeptide 2 added to the N-terminal side and C-terminal side, respectively (the amino acid sequence of SEQ ID NO: 11). (See FIG. 40).
  • the primer set used for PCR is shown in Table 7.
  • the part surrounded by a square in the table shows VL derived from anti-HER2 antibody
  • the part surrounded by double square shows VH derived from anti-human CD3 antibody
  • the peptide (AGGGGS) between the two is a linker peptide. Is shown.
  • the part surrounded by a square in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody
  • the part surrounded by double square shows VH derived from anti-HER2 antibody
  • the peptide (AGGGGS) between the two is a linker peptide. Is shown.
  • Example 20 Expression / secretion evaluation (WB) of CUM-36-1H strain and CUM-36-2H strain
  • WB Expression / secretion evaluation
  • Example 21 Evaluation of binding of HER2 ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from CUM-36-1H strain and CUM-36-2H strain to HER2 and human CD3 Bifiz bacterium transformant (CUM-36-1H strain and CUM-36-1H strain and The HER2 ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by CUM-36-2H strain) specifically binds to both HER2 and human CD3, according to the items [21-1] and [21-2] below. Confirmed according to the method described.
  • Antibody detection Antigen-antibody reaction treatment was performed with 25 ⁇ L of signal enhancer HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque) containing 0.1 ⁇ g / mL recombinant biotinylated HER2 (manufactured by Acro Biosystems). It was dispensed into each of the above wells and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. The liquid in each well was removed and washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T.
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • biotinylated HER2 manufactured by Acro Biosystems
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • Color Solution A and Color Solution B a solution containing TMB, which is a substrate of HRP (manufactured by R & D Systems) as detection reagents
  • 50 ⁇ L of each well is dispensed, shielded from light, and 20 at room temperature. Allowed to stand for minutes.
  • 25 ⁇ L of Stop Solution manufactured by R & D Systems
  • the absorbance at 450 nm which is the absorption wavelength of the TMB-derived dye, was measured, and a value corrected for the absorbance at 570 nm (negative control) (mean ⁇ standard deviation, see vertical axis in FIG. 42) was calculated.
  • Example 22 Cytotoxic activity of CUM-36-1H strain culture supernatant and CUM-36-2H strain culture supernatant CUM-36-1H strain culture supernatant and CUM-36-2H strain culture supernatant, respectively. for, what was diluted 10-fold to 10 4 times was prepared according to the process described in example 10, were analyzed cytotoxic activity against TFK-1 cells.
  • Example 23 Preparation of bifidobacteria (EUM-H strain) expressing / secreting EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb Bifidobacterium expressing / secreting human EpCAM ⁇ human CD3 diabody type BsAb is prepared in the following [23-]. It was prepared according to the method described in items 1] and [23-2].
  • a DNA comprising the coding sequence of EUM-H polypeptide 1 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 84 (see FIG. 44) and a coding sequence of EUM-H polypeptide 2 consisting of the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 85.
  • DNA containing (see FIG. 45) was outsourced to Genscript Japan, and after synthesizing, plasmid pEUM-H (see FIG. 46) was prepared according to the procedure shown in FIGS. 44 to 46.
  • the peptide pEUM-H has SP50-L2 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 13) and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) on the N-terminal side and C-terminal side, respectively.
  • EUM-H polypeptide 1 SP52-L2 (ie, secretory signal peptide SP52 [amino acid residues 1-35 of SEQ ID NO: 18] and L2 linker peptide [amino acid 36-37 of SEQ ID NO: 18] Residue] and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) are plasmids expressing EUM-H polypeptide 2 added to the N-terminal side and C-terminal side, respectively. (See FIG. 46).
  • the primer set used for PCR is shown in Table 7.
  • the squared part in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody, the double squared part shows VH derived from anti-human EpCAM antibody, and the peptide (AGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VL derived from anti-human EpCAM antibody, the double underlined part shows VH derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide (AAGGGGS) between them is a linker peptide. Shown.
  • Example 25 Evaluation of binding of EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from EUM-H strain to human EpCAM and human CD3 EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by Bifidus bacterium transformant (EUM-H strain) was confirmed to specifically bind to both human EpCAM and human CD3 according to the method described in the following items [25-1] and [25-2].
  • EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb The EUM-H diabody type BsAb secreted by the bifidobacteria transformant (EUM-H strain) was obtained from the culture supernatant of the EUM-H strain in Example 3 " Purification was performed according to the method described in item 3-1.
  • 25-2 ELISA method 25-2-1 Antigen-antibody reaction treatment 2.5 ⁇ L of human CD3E / CD3D heterodimer recombinant protein (manufactured by AcroBiosystems) -containing solution in 2.5 ⁇ g / mL was dispensed into each well of a 96-well plate. It was solidified by pouring and allowing it to stand at 4 ° C. overnight. The liquid after the immobilization treatment was removed, and each well was washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T. Then, 200 ⁇ L of a blocking solution (Blocking One, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.) diluted 5-fold with distilled water was dispensed and allowed to stand at 25 ° C.
  • a blocking solution Blocking One, manufactured by Nacalai Tesque, Inc.
  • the antibody EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb
  • the antigen immobilized human CD3E / CD3D heterodimer recombinant protein
  • Antibody detection Antigen-antibody reaction treatment was performed with 25 ⁇ L of signal enhancer HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque) containing 0.1 ⁇ g / mL of recombinant biotinylated EpCAM (manufactured by Acro Biosystems). It was dispensed into each of the above wells and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. The liquid in each well was removed and washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T.
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • EpCAM manufactured by Acro Biosystems
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent avidin-biotin labeled HRP
  • signal enhancer HIKARI B solution manufactured by Nacalai Tesque
  • Color Solution A and Color Solution B a solution containing TMB, which is a substrate of HRP (manufactured by R & D Systems) as detection reagents
  • 50 ⁇ L of each well is dispensed, shielded from light, and 20 at room temperature. Allowed to stand for minutes.
  • 25 ⁇ L of Stop Solution manufactured by R & D Systems
  • the absorbance at 450 nm which is the absorption wavelength of the TMB-derived dye, was measured, and a value corrected for the absorbance at 570 nm (negative control) (mean ⁇ standard deviation, see vertical axis in FIG. 48) was calculated.
  • Example 26 The cytotoxic activity method of the diabody purified from the EUM-H strain culture supernatant is the same as in Example 4. However, as the diabody to be added to the cells, a diabody purified from the EUM-H strain culture supernatant was serially diluted to a concentration of 100 fM to 1 nM. The results are shown in FIG.
  • diabody purified from EUM-H line culture supernatant showed cytotoxic activity against HCT116 cells, a human colon cancer cell lines that are EpCAM-positive, EC 50 value is 17.3pM there were. This result indicates that the EpCAM ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted in the culture supernatant of the EUM-H strain has cytotoxic activity against cancer cells such as HCT116 cells.
  • Example 27 Preparation of bifidus bacteria (LH-PUM-H strain and HL-PUM-H strain) expressing and secreting PSMA x CD3 diabody type BsAb Human PSMA x human CD3 diabody type BsAb is expressed and secreted.
  • Bichalus bacterium was prepared according to the method described in the following items [27-1] and [27-2].
  • HL-PUM-H polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 88 [see Table 17] and HL-PUM-H poly consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89.
  • the DNA containing the coding sequence of LH-PUM-H polypeptide 1 consisting of the nucleotide sequence of No. 90 see FIG.
  • pHL-PUM-H see FIG. 55. More specifically, in the plasmid pLH-PUM-H, SP50-L2 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 13) and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) have N-terminal side and C-terminal, respectively.
  • LH-PUM-H polypeptide 1 added to the side, SP52-L2 (that is, secretory signal peptide SP52 [amino acid residues 1-35 of SEQ ID NO: 18] and L2 linker peptide [36-36 of SEQ ID NO: 18] LH-PUM-H polypeptide 2 in which a linking peptide with [37th amino acid residue] and a c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) are added to the N-terminal side and the C-terminal side, respectively. Is a plasmid that expresses (see FIG. 54).
  • the plasmid pHL-PUM-H has SP50-L2 (amino acid sequence of SEQ ID NO: 13) and c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) on the N-terminal side and the C-terminal, respectively.
  • HL-PUM-H polypeptide 1 added to the side, SP52-L2 (that is, secretory signal peptide SP52 [amino acid residues 1-35 of SEQ ID NO: 18] and L2 linker peptide [36-36 of SEQ ID NO: 18] HL-PUM-H polypeptide 2 in which a linking peptide with [37th amino acid residue] and a c-Myc-His fusion tag (amino acid sequence of SEQ ID NO: 11) are added to the N-terminal side and the C-terminal side, respectively.
  • a plasmid that expresses see FIG. 55).
  • the primer set used for PCR is shown in Table 7.
  • the squared part in the table shows VL derived from anti-human CD3 antibody, the double squared part shows VH derived from anti-human PSMA antibody, and the peptide (AGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VL derived from anti-human PSMA antibody, the double underlined part shows VH derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide between the two (AAGGGGS) is the linker peptide. Shown.
  • the squared part in the table shows VH derived from anti-human CD3 antibody, the double squared part shows VL derived from anti-human PSMA antibody, and the peptide (AAGGGGS) between the two is a linker. Shows peptides.
  • the underlined part in the table shows VH derived from anti-human PSMA antibody, the double underlined part shows VL derived from anti-human CD3 antibody, and the peptide (AAGGGS) between the two indicates a linker peptide. Shown.
  • Example 28 Expression / secretion evaluation (WB) of LH-PUM-H strain and HL-PUM-H strain to confirm that the Bifizus bacterium transformants (LH-PUM-H strain and HL-PUM-H strain) express and secrete PSMA ⁇ CD3 diabody type BsAb, according to the method described in Example 2.
  • Western blotting was performed using the culture supernatants of LH-PUM-H strain and HL-PUM-H strain.
  • Example 29 The cytotoxic activity method of the diabody purified from the culture supernatants of the LH-PUM-H strain and the HL-PUM-H strain is the same as in Example 4. However, 22Rv1 cells positive for human PSMA were used as the cells, and as the diabody to be added to the cells, the diabody purified from the culture supernatants of the LH-PUM-H strain and the HL-PUM-H strain (“Example 3" Purification by the same method as in 3-1 ”) was serially diluted to a concentration of 1 pM to 100 nM. The results are shown in FIG.
  • the diabody purified from the culture supernatants of the LH-PUM-H strain and the HL-PUM-H strain showed cytotoxic activity against 22Rv1 cells, which are PSMA-positive human prostate cancer cell lines. shows, EC 50 values were respectively 155.0pM and 232.6PM. The results show that the PSMA ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted in the culture supernatants of the LH-PUM-H strain and the HL-PUM-H strain has cytotoxic activity against cancer cells such as 22Rv1 cells. Is shown.
  • Example 30 Evaluation of binding of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from DUP-143 strain to human HER3 Purified Bifiz bacterium transformant (DUP-143 strain) of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb
  • DUP-143 strain human HER3 Purified Bifiz bacterium transformant (DUP-143 strain) of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb
  • the secreted EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb was purified by the same method as in “7-1” of Example 7.
  • reaction treatment of the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb with the immobilized human HER3 recombinant protein was carried out by allowing the mixture to stand at 25 ° C. for 2 hours. Then, the liquid in each well was removed, and the cells were washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS-T.
  • biotinylated protein L (manufactured by Thermo Fischer Scientific) was prepared at 0.05 ⁇ g / mL with HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque), a signal enhancer containing 1% BSA. , 25 ⁇ L was dispensed into each of the above wells subjected to the antigen-antibody reaction treatment, and allowed to stand at 25 ° C. for 1 hour. The liquid in each well was removed and washed 3 times with 200 ⁇ L PBS-T.
  • VECTASTAIN Elite ABC reagent (avidin-biotin labeled HRP) (manufactured by Vector) was adjusted to 4.0 ⁇ L / mL with a signal enhancer HIKARI B solution (manufactured by Nacalai Tesque) containing 1% BSA, and then each well. 25 ⁇ L of each was dispensed and allowed to stand at 25 ° C. for 30 minutes. Then, the liquid in each well was removed, and the cells were washed 3 times with 200 ⁇ L of PBS-T.
  • Color Solution A and Color Solution B a solution containing TMB, which is a substrate of HRP (manufactured by R & D Systems) as detection reagents
  • 50 ⁇ L of each well is dispensed, shielded from light, and 20 at room temperature. Allowed to stand for minutes.
  • 25 ⁇ L of Stop Solution manufactured by R & D Systems
  • the absorbance at 450 nm which is the absorption wavelength of the TMB-derived dye, was measured, and the value (mean ⁇ standard deviation) corrected for the absorbance at 570 nm (negative control) was calculated (see FIG. 58).
  • Example 31 Evaluation of cytotoxic activity of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from DUP-143 strain Cancer cell lines having different EGFR expression levels and HER3 expression levels, specifically, one type of human epidermis. A total of 6 types of cancer cell line (A-431), 1 type of human non-small cell lung cancer cell line (NCI-H1975), and 4 types of human colon cancer cell line (HCT116, HT-29, RKO, and SW620). The cytotoxic activity of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from the DUP-143 line was evaluated using the cancer cell line of.
  • EGFR and HER3 expression levels in various cancer cell lines are anti-human EGFR antibody (clone AY13) (manufactured by BioLegend) and anti-human, respectively.
  • erbB3 / HER3 antibody (clone 1B4C3) (manufactured by BioLegend)
  • QIFIKIT manufactured by Agilent Technologies
  • quantification was performed according to the protrol attached to the kit.
  • BD FACSCantoII was used for the measurement, and flow cytometry analysis software (Kaluza Ver2.1) (manufactured by BECKMAN COULTER) was used for the analysis.
  • 31-2 Measurement method of cytotoxic activity
  • the above 1 type of human epidermal cancer cell line and 4 types of human colon cancer cell line were seeded on a 96-well plate so as to have 1 ⁇ 10 4 cells / well, respectively.
  • the above one type of human non-small cell lung cancer cell line was seeded on a 96-well plate at 5 ⁇ 10 3 cells / well.
  • Ratio of human PBMCs (“PBMC # 4,” “PBMC # 6”, and “PBMC # 7” in FIGS. 59-1 and 59-2) isolated from 3 donors as effector cells to various cancer cell lines.
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from the DUP-143 strain was diluted to a concentration of 30 fM to 30 pM for A-431, HCT116, HT-29, and SW620.
  • the serially diluted ones were added to each (horizontal axis in FIGS. 59-1 and 59-2), and for NCI-H1975 and RKO, the serially diluted ones were added to a concentration of 1 pM to 1 nM (Fig. 59). -1 and the horizontal axis in Fig. 59-2), the total amount of medium was adjusted to 200 ⁇ L. Then, the cells were cultured in an incubator set at 37 ° C.
  • RPMI-1640 medium containing the reagent was added to each well in an amount of 120 ⁇ L.
  • the absorbance at 490 nm was measured, and the absorbance at 660 nm was measured as a control wavelength.
  • the EC50 value of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb derived from the DUP-143 strain was 1.6 pM for A-431, 9.6 pM for NCI-H1975, 3.6 pM for HT-29, and 4.2 pM for HCT116. It was 38.4 pM for RKO and 3.2 pM for SW620.
  • Example 32 Preparation of bifidobacteria (DUP-199HAF strain) expressing and secreting mutant LH31 diabody type BsAb Separately from the bifidobacteria transformant prepared in Example 12, mutant LH31 diabody type BsAb is expressed.
  • the secreted bifidobacteria were prepared according to the methods described in the following items [32-1] to [32-2].
  • a plasmid (plasmid p199) (see FIG. 62) expressing a mutant LH31 polypeptide 2 fused with a FLAG tag (polypeptide) and a FLAG tag (polypeptide consisting of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 104) was prepared in the same manner as in Example 1. It was prepared according to the procedure shown in FIGS. 60 to 62. The primer sets used for PCR are shown in Table 7.
  • Example 33 Expression / secretion evaluation of DUP-199HAF strain (SDS-PAGE) The method according to the following items "33-1" and "33-2" to confirm that the bifidobacteria transformant (DUP-199HAF strain) expresses and secretes the mutant LH31 diabody type BsAb. Confirmed according to.
  • mutant LH31 diabody type BsAb secreted by the bifidobacteria transformant was obtained from the culture supernatant of the DUP-199HAF strain in Example 7 "7-1".
  • the DUP-199HAF strain culture supernatant was purified by the method described in the item.
  • mutant LH31 diabody type BsAb (SDS-PAGE) To confirm that the bifidobacteria transformant (DUP-199HAF strain) expresses and secretes the mutant LH31 diabody type BsAb, a culture supernatant purified solution of the DUP-199HAF strain according to the method described in Example 15. SDS-PAGE was performed using SDS-PAGE, and fluorescent staining was performed.
  • Example 34 Tissue distribution of Bifizus bacterium and mutation LH31 diabody type BsAb by administration of DUP-199HAF strain to mouse tail vein Tissue distribution of Bichalus bacterium by administration of DUP-199HAF strain to mouse tail vein and mutation in tumor and blood
  • the DUP-199HAF strain was intravenously administered to a cancer-bearing SCID mouse transplanted with HCT116 cells, which is a human colon cancer cell line, and the DUP-199HAF strain in each tissue was administered.
  • HCT116 cells which is a human colon cancer cell line
  • Tumors and non-tumor tissues were removed from mice.
  • blood plasma was collected and collected by centrifugation.
  • 1 mL of the 10% maltose solution was intraperitoneally administered twice a day from the 0th day (administration day) to the day before each excision day with 5 throws and 2 rests.
  • 34-3 Preparation of tumor sample for ELISA analysis To the tumor homogenate prepared in "34-2" above, 10 ⁇ Cell Lysis buffer (500 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1500 mM sodium chloride, 5% NP- Add 40 and 20 mM EDTA) and 50 ⁇ cOmplete (prepared by dissolving one cOmplete [EDTA-free, Roche, Cat # 11873580001] tablet in 1 mL of ultra-pure water) and after stirring. , The supernatant after centrifugation was collected, and a tumor sample for ELISA analysis was prepared.
  • 10 ⁇ Cell Lysis buffer 500 mM Tris-HCl [pH 7.5], 1500 mM sodium chloride, 5% NP- Add 40 and 20 mM EDTA
  • 50 ⁇ cOmplete prepared by dissolving one cOmplete [EDTA-free, Roche, Cat # 11873580001] tablet in 1 mL of ultra-pure water
  • Standard EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb mutant LH31 diabody type BsAb
  • the serially diluted plasma (for tumors) was incubated at 25 ° C. for 2 hours each. Then, each well was washed with PBS-T and incubated at 25 ° C.
  • the absorbance at 450 nm which is the absorption wavelength of TMB-derived dyes
  • the absorbance at 570 nm which is a negative control
  • a standard EGFR ⁇ CD3 diamond body for preparing a calibration curve is measured.
  • the concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb in the tumor and plasma was quantified (see FIG. 65).
  • the DUP-199HAF strain when administered to HCT116 tumor-bearing SCID mice, DUP-199HAF strain bacteria count in tumors, gradually increases, up to 5 days after dosing (median: 4.8 ⁇ 10 7 cfu / g tumor), and up to 19 days after administration viable cell count (median) was observed 10 6 cfu / g tumor more (see FIG. 64).
  • live bacteria of the DUP-199HAF strain were detected in some tissues (spleen, liver, kidney, and heart) on the first day after administration, but the detection level thereafter decreased significantly. However, it was below the detection limit after 5 days after administration (see FIG. 64). This result indicates that the bifidobacteria transformant (DUP-199HAF strain) is tumor-specifically engrafted.
  • the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb concentration derived from the DUP-199HAF strain in the tumor reached the maximum intratumoral concentration (average value: 345888.4 pg / g tumor) on the 5th day after administration of the DUP-199HAF strain, and was administered. Up to the 17th day after that, EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb above the quantification limit (2500 pg / g tumor) was observed in the tumor (see FIG. 65). This result indicates that the bifidobacteria transformant (DUP-199HAF strain) engrafted in the tumor expressed and secreted EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb. The concentration of EGFR ⁇ CD3 diabody-type BsAb derived from the DUP-199HAF strain in plasma was below the quantification limit (250 pg / mL) on average at all time points after administration.
  • Example 35 In vivo antitumor effect of DUP-143 strain
  • human colon cancer cell line HCT116 cells were transplanted and human PBMC was transplanted.
  • In vivo analysis was performed using mice with severe immunodeficiency (NOG mice). Specifically, the analysis was performed according to the method described below.
  • Group 1 Administration of DUP-143 strain without PBMC transfer (7th, 10th, 14th, and 17th days after transplantation)
  • Group 2 Administration of DUP-143 strain (3rd day after transplantation) 7th, 10th, 14th, and 17th days after transplantation)
  • Group 3 PBMC transfer (3rd and 9th days after transplantation) BE shuttle strain administration (7th, 10th day after transplantation) , 14th and 17th days)
  • Group 4 PBMC transfer (3rd and 9th days after transplantation) DUP-143 strain administration (7th, 10th, 14th and 17th days after transplantation) Eyes
  • Group 5 PBMC transfer (3rd and 9th days after transplantation) DUP-143 strain administration (3rd, 6th, 10th, 13th, and 17th days after transplantation)
  • group 6 PBMC transfer (3rd and 9th days after transplantation) DUP-143 strain administration (7th, 9th, 11th, 14th, 16th, and 18th days after transplantation).
  • the PBMC transfer (3rd and 9th days after transplantation) BE shuttle strain administration (7th, 10th, 14th, and 17th days after transplantation) group The tumor volume in the mice of (Group 3) was that of the negative control PBMC-free DUP-143 strain-administered (7th, 10th, 14th, and 17th days after transplantation) group (Group 1). It was almost the same as the tumor volume in (see FIG. 66).
  • DUP-143 strain administration (7th, 9th, 11th, 14th, 16th, and 18th days after transplantation) group (group 6) The tumor volume in the mouse was significantly reduced as compared with the tumor volume in the mouse in the negative control group 1, for example, on the 20th day after transplantation, the tumor growth inhibition rate [TGI] in the mouse in the negative control group 1 was , 43.0% and 45.0%, respectively (see FIG. 66).
  • TGI tumor growth inhibition rate
  • no weight loss was observed in any of the groups (see FIG. 67). This result indicates that the EGFR ⁇ CD3 diabody type BsAb secreted by the bifidobacteria transformant (DUP-143 strain) has an antitumor effect.
  • the present invention contributes to the prevention or treatment of solid tumors (usually solid cancers).

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Abstract

本発明の課題は、固形癌に対して、持続的かつ特異的に抗腫瘍効果を発揮するビフィドバクテリウム属細菌を提供することにある。　ヒトＣＤ３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む第１のポリペプチド；及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬと、ヒトＣＤ３に結合するＶＨとを含む第２のポリペプチド；を発現し、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌するビフィドバクテリウム属細菌を作製する。

Description

ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌
　本発明は、固形腫瘍の免疫療法に有用なダイアボディ型二重特異性抗体（ＢｓＡｂ；bispecific monoclonal antibody）を発現・分泌するビフィドバクテリウム（Bifidobacterium）属細菌（以下、ビフィズス菌やＢ菌ということがある）や、その医薬用途に関する。
　ＢｓＡｂ（二機能性抗体［bifunctional antibody］ともいう）は、２つの異なる抗原に結合する人工２価抗体であり、同一の抗原に結合する天然２価抗体とは異なる。ＢｓＡｂの中でも、腫瘍細胞上の抗原（腫瘍マーカー）と、Ｔ細胞上の抗原（Ｔ細胞マーカー）であるＣＤ３とに結合する抗体（すなわち、Ｔ－ＢｓＡｂ）は、腫瘍細胞とＴ細胞を架橋することにより、Ｔ細胞を細胞傷害性Ｔ細胞へ活性化し、抗腫瘍効果を発揮する。１９８０年代の半ば以降、多数のＴ－ＢｓＡｂが抗腫瘍剤として研究開発されており、例えば、カツマキソマブ（Catumaxomab）は、腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３とに結合し、定常領域を含む完全長型Ｔ－ＢｓＡｂであり、悪性腹水症の治療用抗体医薬として承認されている。また、ブリナツモマブ（Blinatumomab）は、腫瘍マーカーであるＣＤ１９と、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３とに結合し、定常領域を含まない低分子型Ｔ－ＢｓＡｂであり、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ；acute lymphoblastic leukemia）の治療用抗体医薬として承認されている。
　Ｔ－ＢｓＡｂを全身投与し、固形腫瘍を治療する場合、解決すべき課題が残されており、例えば、完全長型Ｔ－ＢｓＡｂについては、分子サイズが大きいため、固形腫瘍組織内部への浸透性に限界がある上に、投与量を少なくした場合でもサイトカイン放出症候群（ＣＲＳ；cytokine release syndrome）を惹起する可能性が指摘されている。一方、低分子型Ｔ－ＢｓＡｂについては、安定性に問題がある上に、血中半減期が短いという欠点がある（非特許文献１）。
　低分子型ＢｓＡｂの１種であるダイアボディ型ＢｓＡｂは、第１の抗体由来の軽鎖可変領域（ＶＬ；lightchain variable region）（ＶＬ１）と、第２の抗体由来の重鎖可変領域（ＶＨ；heavychain variable region）（ＶＨ２）とを同一のペプチド鎖上に有する第１のポリペプチド、及び、第２の抗体由来のＶＬ（ＶＬ２）と、第１の抗体由来のＶＨ（ＶＨ１）とを同一のポリペプチド鎖上に有する第２のポリペプチドからなる。ダイアボディ型ＢｓＡｂの作製方法として、大腸菌を用いた方法が知られている（特許文献１、非特許文献２）。また、腫瘍細胞表面抗原であるＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）と、Ｔ細胞マーカーであるＣＤ３とに結合するダイアボディ型Ｔ－ＢｓＡｂが抗腫瘍活性を有することが多数報告されている（特許文献２～４、非特許文献３）。
　一方、固形腫瘍の治療において、Ｂ菌等の嫌気性菌を遺伝子輸送担体として利用する方法が注目されている。Ｂ菌は全身投与されると固形腫瘍等の低酸素部位に特異的に生着するため、Ｂ菌を、抗腫瘍性タンパク質や抗腫瘍性物質前駆体を抗腫瘍性物質に変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換し、全身投与すると、当該遺伝子は腫瘍局所で特異的に発現する。このため、全身投与では副作用が不可避な薬剤を腫瘍局所に高濃度かつ持続的にデリバリーすることが可能となる。現在、５－フルオロシトシン（５－ＦＣ）を５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）に変換する酵素シトシン・デアミナーゼを発現するＢ菌について、米国で臨床試験が進められている（特許文献５～１０）。
米国特許第６４９２１２３号 特許第３８０３７９０号公報 国際公開第２０１０／１０９９２４号パンフレット 国際公開第２０１５／１４６４３８号パンフレット 特許第３６４２７５５号公報 国際公開第２００９／１２８２７２号公報 国際公開第２００９／１２８２７５号公報 国際公開第２０１１／０９３４６５号公報 国際公開第２０１５／１６６６４０号公報 国際公開第２０１６／０８８３７６号公報
Nat Rev Drug Discov. 2019 Jun 7.doi:10.1038/s41573-019-0028-1 Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul15;90(14):6444-8 Sci Rep. 2017 Jun 6;7(1):2862. doi:10.1038/s41598-017-03101-4
　本発明の課題は、固形癌に対して、持続的かつ特異的に抗腫瘍効果を発揮するビフィドバクテリウム属細菌や、該ビフィドバクテリウム属細菌を含む、固形腫瘍の予防又は治療剤を提供することにある。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、ヒトＣＤ３及びヒト腫瘍細胞表面抗原の双方に結合するダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌が、大腸癌、結腸癌、胆管癌等の固形癌に対する細胞傷害活性や、固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を有することを見いだした。また、当該ダイアボディ型ＢｓＡｂにおいて、ヒトＣＤ３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）におけるKabat番号３８番目のグルタミン（Ｑ）をグルタミン酸（Ｅ）へ置換し、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）におけるKabat番号３９番目のＱをＥへ置換し、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬにおけるKabat番号３８番目のＱをリジン（Ｋ）へ置換するとともに、ヒトＣＤ３に結合するＶＨにおけるKabat番号３９番目のＱをＫへ置換すると、細胞傷害活性や抗腫瘍効果が上昇することを確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
　すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔１〕ヒトＣＤ３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む第１のポリペプチド；及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬと、ヒトＣＤ３に結合するＶＨとを含む第２のポリペプチド；を発現し、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌。
〔２〕第１のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒトＣＤ３に結合するＶＬと、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＨとを含み、第２のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬと、ヒトＣＤ３に結合するＶＨとを含むことを特徴とする上記〔１〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔３〕第１のポリペプチドのＶＬとＶＨとの間、及び第２のポリペプチドのＶＬとＶＨとの間に、それぞれ４～９アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されていることを特徴とする上記〔１〕又は〔２〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔４〕第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのアミノ末端に、それぞれ以下の（i）～（iii）のいずれかのアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチド－リンカーペプチド連結体が連結されていることを特徴とする上記〔１〕～〔３〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
（i）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ii）配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
（iii）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
〔５〕第１のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第１のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第２のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第２のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンである；又は
第１のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第１のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第２のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第２のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸である；
ことを特徴とする上記〔１〕～〔４〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔６〕ヒト腫瘍細胞表面抗原が、ヒトＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）ファミリーに属する抗原、ヒトＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule）、又はヒトＰＳＭＡ（Prostate Specific Membrane Antigen）であることを特徴とする上記〔１〕～〔５〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔７〕ヒトＥＧＦＲファミリーに属する抗原が、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、又はヒトＨＥＲ３であることを特徴とする上記〔１〕～〔６〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔８〕第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、ポリシストロニックに発現することを特徴とする上記〔１〕～〔７〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔９〕ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする上記〔１〕～〔８〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔１０〕上記〔１〕～〔９〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有することを特徴とする固形腫瘍の予防又は治療剤。
〔１１〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び／又は増殖促進剤と併用することを特徴とする上記〔１０〕に記載の予防又は治療剤。
〔１２〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び／又は増殖促進剤が、マルトースであることを特徴とする上記〔１１〕に記載の予防又は治療剤。
　また本発明の実施の他の形態として、本件ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する、固形腫瘍の予防又は治療剤を、固形腫瘍の予防又は治療を必要とする対象者に投与するステップを含む、固形腫瘍を予防又は治療する方法；や、固形腫瘍の予防又は治療剤として使用するための本件ビフィドバクテリウム属細菌；や、固形腫瘍の予防又は治療における使用のための本件ビフィドバクテリウム属細菌；や、固形腫瘍の予防又は治療剤を製造するための、本件ビフィドバクテリウム属細菌の使用；を挙げることができる。
　本件ビフィドバクテリウム属細菌は、固形癌に対する癌細胞傷害活性や固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を有するため、固形腫瘍の予防又は治療に効果的である。本件ビフィドバクテリウム属細菌は、正常組織では増殖せず嫌気的環境下にある腫瘍組織内でのみ増殖するとともに、ＣＤ３及び腫瘍細胞表面抗原の両方に特異的に結合するダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するため、その表面にＣＤ３を発現するヒトＴ細胞が、かかるダイアボディ型ＢｓＡｂを介して、その表面に腫瘍細胞表面抗原を発現する固形腫瘍の近傍までリクルートされ、細胞傷害性ヒトＴ細胞へ活性化した結果、上記癌細胞傷害活性や抗腫瘍効果が発揮されたと推測される。また、当該ダイアボディ型ＢｓＡｂは腫瘍組織内で特異的かつ持続的に分泌されるので、薬効の持続性と正常組織における意図しないヒトＴ細胞活性化のリスク低減、等の効果が期待できる。
ＥＧＦＲｘＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む３種類の人工ＤＮＡ（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ａ］、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ｂ］、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ｃ］）の模式図である。図中の「ＣＤ３　ＶＬ」は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「Ｌ」は、リンカーペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）をコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＥＧＦＲ　ＶＨ」は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ｃ－Ｍｙｃ」は、ｃ－Ｍｙｃタグをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「Ｈｉｓ」は、Ｈｉｓタグをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＴＨｕ」は、Ｂ菌用のＨｕターミネーターを示し、図中の「Ｐ３０」は、Ｂ菌用のＰ３０プロモーターを示し、図中の「ＳＰ５０－Ｌ５」は、分泌シグナルペプチド（ＳＰ５０）とリンカーペプチド（Ｌ５）との連結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＥＧＦＲ　ＶＬ」は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＣＤ３　ＶＨ」は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「Ｔ２」は、Ｂ菌用のＴ２ターミネーターを示す。 プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５作製法の模式図である。図中の「ＰＨｕ」は、Ｂ菌用のＨｕプロモーター（ＰＨｕ）を示し、図中の「ＳＰＣＭｒ」は、スペクチノマイシン耐性遺伝子を示す。 プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１ｃｍ作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍ作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５－Ｆ１作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５作製法の模式図である。 ４種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株［レーン２］、ＦＯＭ－２２Ｈ株［レーン３］、ＤＵＭ－３１Ｈ株［レーン４］、及びＢＥシャトル株［レーン５］）の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ［図中の「ＦＬＭ－９Ｈ」］、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ［図中の「ＦＯＭ－２２Ｈ」］、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ［図中の「ＤＵＭ－３１Ｈ」］）のヒトＥＧＦＲに対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのヒトＣＤ３に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＨＣＴ１１６細胞に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ２－Ｆ１及びｐＬＨ３１－Ｌ２－Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ２作製法の模式図である。 プラスミドｐ１２６作製法の模式図である。 ２種類のビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株［レーン２］、及びＢＥシャトル株［レーン３］）の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ３種類のビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株、ＤＵＰ－１５３株、及びＤＵＭ－１２６Ｈ株）から精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂと、１種類のビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株）から精製したＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、ヒトＣＤ３及びヒトＥＧＦＲに対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 ２種類のビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株及びＢＥシャトル株）の培養上清について、ＨＣＴ１１６細胞に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 ３種類の群（ＰＢＳ群、ＢＥシャトル株群、及びＤＵＭ－１２６Ｈ株群）のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果（ｎ＝１４又は１５の平均値及び標準偏差）を示す図である。図中の「＊＊」及び「＊＊＊」は、one way ANOVA及びTukey's multiple comparison testにより、それぞれ統計学的に有意差（ｐ＜０．０１及びｐ＜０．００１）があることを示す。 プラスミドｐ１２９作製法の模式図である。 プラスミドｐ１３０作製法の模式図である。 プラスミドｐ１３０ＴＬ作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５－Ｆ２－Ｃ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１３３作製法の模式図である。 プラスミドｐ１４３－Ｆ２ＴＬ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１４３ＴＬ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１４３ＴＬ４作製法の模式図である。 プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１５２作製法の模式図である。 プラスミドｐ１５３－Ｆ２ＴＬ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１５３ＴＬ作製法の模式図である。 プラスミドｐ１５３ＴＬ４作製法の模式図である。 プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａ作製法の模式図である。 ＤＵＰ－１４３株由来の変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ（レーン２～４）、及びＤＵＰ－１５３株由来の変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ（レーン５～７）をＳＤＳ－ＰＡＧＥ解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。図中の「バンド１」は、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂにおける変異ＬＨ３１ポリペプチド１に由来するバンドを示し、「バンド２」は、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂにおける変異ＬＨ３１ポリペプチド２に由来するバンドを示す。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ３種類のビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株、ＤＵＰ－１５３株、及びＢＥシャトル株）の培養上清について、３種類の癌細胞（ＴＦＫ－１細胞［図３３Ａ］、ＨＣＴ１１６細胞［図３３Ｂ］、及びＲＫＯ細胞［図３３Ｃ］）に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 ４種類の群（ＢＥシャトル株群、ＤＵＭ－１２６Ｈ株群、ＤＵＰ－１４３株投与群、及びＤＵＰ－１５３株投与群）のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果（ｎ＝１２の平均値及び標準偏差）を示す図である。図中の「＊」は、one way ANOVA及びTukey's multiple comparison testにより、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。 ＨＥＲ２ｘＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを構成するポリペプチドのコード配列を含む２種類の人工ＤＮＡ（ＬＨ３６ポリペプチド１のコード配列を含む人工ＤＮＡ［図３５Ａ］及びＬＨ３６ポリペプチド２のコード配列を含む人工ＤＮＡ［図３５Ｂ］）の模式図である。図中の「ＨＥＲ２　ＶＬ」は、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＨＥＲ２　ＶＨ」は、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＨをコードするヌクレオチド配列を示し、図中の「ＳＰ５２－Ｌ２」は、分泌シグナルペプチド（ＳＰ５２）とリンカーペプチド（Ｌ２）との連結ペプチドをコードするヌクレオチド配列を示す。 プラスミドｐＬＨ３６－Ｆ１作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３６－１＿Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３６－２＿Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３６－１作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ３６－２作製法の模式図である。 ３種類のビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株［レーン２］、ＣＵＭ－３６－２Ｈ株［レーン３］、及びＢＥシャトル株［レーン４］）の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ２種類のビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）から精製したＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂと、３種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）から精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、ヒトＣＤ３及びＨＥＲ２に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 ３種類のビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株、ＣＵＭ－３６－２Ｈ株、及びＢＥシャトル株）の培養上清について、ＴＦＫ－１細胞に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 プラスミドｐＥＵＭ－Ｈ＿Ｆ１作製法の模式図である。 プラスミドｐＥＵＭ－Ｈ＿Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＥＵＭ－Ｈ作製法の模式図である。 ２種類のビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株［レーン２］及びＢＥシャトル株［レーン３］）の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）から精製したＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、ヒトＣＤ３及びヒトＥｐＣＡＭに対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）から精製したＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、ＨＣＴ１１６細胞に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 プラスミドｐＬＨ-ＰＵＭ－Ｈ＿Ｆ１作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ-ＰＵＭ－Ｈ＿Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＨＬ-ＰＵＭ－Ｈ＿Ｆ１作製法の模式図である。 プラスミドｐＨＬ-ＰＵＭ－Ｈ＿Ｆ２作製法の模式図である。 プラスミドｐＬＨ-ＰＵＭ－Ｈ作製法の模式図である。 プラスミドｐＨＬ-ＰＵＭ－Ｈ作製法の模式図である。 ３種類のビフィズス菌形質転換体（ＬＨ-ＰＵＭ－Ｈ株［レーン２］、ＨＬ-ＰＵＭ－Ｈ株［レーン３］及びＢＥシャトル株［レーン４］）の培養上清を、抗Ｈｉｓタグ抗体を用いたウェスタンブロッティング法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ２種類のビフィズス菌形質転換体（ＬＨ-ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ-ＰＵＭ－Ｈ株）から精製したＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、２２Ｒｖ１細胞に対する傷害活性を、細胞生存率を指標として解析した結果（ｎ＝３）を示す図である。 ビフィズス菌形質転換体ＤＵＰ－１４３株から精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、ヒトＨＥＲ３に対する結合性を、ＥＬＩＳＡ法を用いて解析した結果（ｎ＝２）を示す図である。 ビフィズス菌形質転換体ＤＵＰ－１４３株から精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、１種類のヒト類表皮癌細胞株（Ａ－４３１［図５９－１Ａ］）及び１種類のヒト非小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５［図５９－１Ｂ］）に対する傷害活性を、細胞傷害率を指標として解析した結果（ｎ＝３ウェル）の代表例を示す図である。 ビフィズス菌形質転換体ＤＵＰ－１４３株から精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂについて、４種類のヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６［図５９－２Ａ］、ＨＴ－２９［図５９－２Ｂ］、ＲＫＯ［図５９－２Ｃ］、及びＳＷ６２０［図５９－２Ｄ］）に対する傷害活性を、細胞傷害率を指標として解析した結果（ｎ＝３ウェル）の代表例を示す図である。 プラスミドｐ１９５作製法の模式図である。 プラスミドｐ１９６作製法の模式図である。 プラスミドｐ１９９作製法の模式図である。 ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株［レーン２］）の培養上清精製物を、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法により解析した結果を示す図である。レーン１は、サイズマーカーを示す。 ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株を担癌ＳＣＩＤマウスへ尾静脈内投与後、１日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目及び２１日目に、腫瘍、非腫瘍組織（脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓）、及び血液におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の生菌数を解析した結果（ｎ＝５の中央値）を示す図である。図中の「ＢＬＤ」は、検出限界未満を示す。縦軸の「ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の生菌数」は、腫瘍や上記非腫瘍組織については、腫瘍又は上記非腫瘍組織１ｇ当たりのＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株のｃｆｕを示し、血液については、血液１ｍＬ当たりのｃｆｕを示す。 ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株を担癌ＳＣＩＤマウスへ尾静脈内投与後、１日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目及び２１日目に、腫瘍におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度を測定した結果（ｎ＝５の平均値）を示す図である。 群１～６のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果（ｎ＝３又は４の平均値及び標準偏差）を示す図である。図中の「＊」は、one way ANOVA及びTukey's multiple comparison testにより、統計学的に有意差（ｐ＜０．０５）があることを示す。 群１～６のマウスにおける体重を測定した結果（ｎ＝３又は４の平均値及び標準偏差）を示す図である。
　本件ビフィドバクテリウム属細菌は、ヒトＣＤ３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）（以下、「ＣＤ３　ＶＬ」ということがある）と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）（以下、「腫瘍　ＶＨ」ということがある）とを含む第１のポリペプチド（以下、「本件第１のポリペプチド」ということがある）；及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬ（以下、「腫瘍　ＶＬ」ということがある）と、ヒトＣＤ３に結合するＶＨ（以下、「ＣＤ３　ＶＨ」ということがある）とを含む第２のポリペプチド（以下、「本件第２のポリペプチド」ということがある）；を発現し、本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体（以下、「本件ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある）を分泌するビフィドバクテリウム属細菌であり、より具体的には、本件第１のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（以下、「本件第１のポリヌクレオチド」ということがある）と、本件第２のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド（以下、「本件第２のポリヌクレオチド」ということがある）とを有するビフィドバクテリウム属細菌である。本件ビフィドバクテリウム属細菌は、本件第１のポリヌクレオチド及び本件第２のポリヌクレオチドが、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体上に組み込まれたものであっても、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体外で存在する自律複製可能なベクター上に組み込まれたものであってもよいが、簡便性の観点から、本件第１のポリヌクレオチド及び本件第２のポリヌクレオチドが、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体外で存在する自律複製可能なベクター上に組み込まれたもの（すなわち、本件第１のポリヌクレオチド及び本件第２のポリヌクレオチドを含む自律複製可能なベクター［以下、「本件ベクター」ということがある］を保持するビフィドバクテリウム属細菌）が好ましい。本件第１のポリヌクレオチド及び本件第２のポリヌクレオチドの上流や、本件第１のポリヌクレオチドの上流及び本件第２のポリヌクレオチドの上流のそれぞれには、通常、作動可能にプロモーターが連結されている。ここで「上流」とは、ｍＲＮＡの転写が進行する方向（下流）とは反対の方向を意味する。
　本明細書において、「プロモーター」とは、ＲＮＡポリメラーゼ（好ましくは、ＲＮＡポリメラーゼ及び基本転写因子）が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするｍＲＮＡの転写を開始させる領域を意味する。プロモーターには、通常転写開始点（ＴＳＳ）が含まれる。
　本発明の固形腫瘍の予防又は治療剤は、「固形腫瘍を予防又は治療するため」という用途に特定された、本件ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する製剤（以下、「本件予防／治療剤」ということがある）であり、ここで固形腫瘍の予防には、固形腫瘍の発症予防の他、固形腫瘍の症状悪化の予防も含まれる。本件予防／治療剤は、単独で医薬品（製剤）として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態（医薬組成物）として使用してもよい。本明細書において、固形腫瘍には、固形の悪性腫瘍及び良性腫瘍の両方が含まれ、固形腫瘍としては、好ましくは固形悪性腫瘍（すなわち、固形癌）である。
　上記固形癌としては、例えば、大腸癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌（例えば、非小細胞肺癌）、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、扁平上皮癌（類表皮癌）、皮膚癌、脳腫瘍、悪性カルチノイド腫瘍、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマを挙げることができる。
　本明細書において、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、本件第１のポリペプチドにおける「ＣＤ３　ＶＬ」と、本件第２のポリペプチドにおける「ＣＤ３　ＶＨ」とが非共有結合（例えば、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力；以下、同じ）し、本件第２のポリペプチドにおける「腫瘍　ＶＬ」と、本件第１のポリペプチドにおける「腫瘍　ＶＨ」とが非共有結合することにより、本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドのヘテロ二量体を構成し、かつ、ヒトＣＤ３及びヒト腫瘍細胞表面抗原の両方に特異的に結合する抗体（すなわち、本件ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を意味する。
　本件ダイアボディ型ＢｓＡｂを構成する本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドの組合せとしては、具体的には、アミノ（Ｎ）末端からカルボキシル（Ｃ）末端の順に「ＣＤ３　ＶＬ」及び「腫瘍　ＶＨ」を含む本件第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端の順に「腫瘍　ＶＬ」及び「ＣＤ３　ＶＨ」を含む本件第２のポリペプチドとの組合せ；Ｎ末端からＣ末端の順に「腫瘍　ＶＨ」及び「ＣＤ３　ＶＬ」を含む本件第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端の順に「ＣＤ３　ＶＨ」及び「腫瘍　ＶＬ」を含む本件第２のポリペプチドとの組合せ；を挙げることができ、これらの中でも、後述する実施例でその効果が実証されているため、Ｎ末端からＣ末端の順に「ＣＤ３　ＶＬ」及び「腫瘍　ＶＨ」を含む本件第１のポリペプチドと、Ｎ末端からＣ末端の順に「腫瘍　ＶＬ」及び「ＣＤ３　ＶＨ」を含む本件第２のポリペプチドとの組合せを好適に例示することができる。
　本件第１のポリペプチドとしては、本件第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に「ＣＤ３　ＶＬ」及び「腫瘍　ＶＨ」を含むものである場合、「ＣＤ３　ＶＬ」のＮ末端、「ＣＤ３　ＶＬ」と「腫瘍　ＶＨ」との間（すなわち、「ＣＤ３　ＶＬ」のＣ末端であり、かつ、「腫瘍　ＶＨ」のＮ末端）、及び「腫瘍　ＶＨ」のＣ末端から選択される１、２、又は３つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体（分泌シグナルペプチドのＣ末端とリンカーペプチドのＮ末端とが連結したもの；以下同じ）、並びにタンパク質タグが、１又は２以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよく、また、本件第１のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に「腫瘍　ＶＨ」及び「ＣＤ３　ＶＬ」を含むものである場合、「腫瘍　ＶＨ」のＮ末端、「腫瘍　ＶＨ」と「ＣＤ３　ＶＬ」との間（すなわち、「腫瘍　ＶＨ」のＣ末端であり、かつ、「ＣＤ３　ＶＬ」のＮ末端）、及び「ＣＤ３　ＶＬ」のＣ末端から選択される１、２、又は３つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、１又は２以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよい。
　また、本件第２のポリペプチドとしては、本件第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に「腫瘍　ＶＬ」及び「ＣＤ３　ＶＨ」を含むものである場合、「腫瘍　ＶＬ」のＮ末端、「腫瘍　ＶＬ」と「ＣＤ３　ＶＨ」との間（すなわち、「腫瘍　ＶＬ」のＣ末端であり、かつ、「ＣＤ３　ＶＨ」のＮ末端）、及び「ＣＤ３　ＶＨ」のＣ末端から選択される１、２、又は３つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、１又は２以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよく、また、本件第２のポリペプチドが、Ｎ末端からＣ末端の順に「ＣＤ３　ＶＨ」及び「腫瘍　ＶＬ」を含むものである場合、「ＣＤ３　ＶＨ」のＮ末端、「ＣＤ３　ＶＨ」と「腫瘍　ＶＬ」との間（すなわち、「ＣＤ３　ＶＨ」のＣ末端であり、かつ、「腫瘍　ＶＬ」のＮ末端）、及び「腫瘍　ＶＬ」のＣ末端から選択される１、２、又は３つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、１又は２以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよい。
　上記リンカーペプチドとしては、ダイアボディ型二重特異性抗体の形成やその機能（すなわち、ヒトＣＤ３及びヒト腫瘍細胞表面抗原への結合能）を阻害しないものであればよく、上記リンカーペプチドの長さとしては、リンカーペプチドを、ＶＬとＶＨの連結に用いる場合、例えば、１～３０個の範囲内のアミノ酸であり、好ましくは１～２０アミノ酸、より好ましくは２～１５アミノ酸、さらに好ましくは３～１０アミノ酸、最も好ましくは約６～７アミノ酸（４～９アミノ酸、５～８アミノ酸等）である。また、リンカーペプチドを、分泌シグナルペプチドとＶＬ又はＶＨとの連結に用いる場合、例えば、１～３０個の範囲内のアミノ酸であり、好ましくは１～２０アミノ酸、より好ましくは１～１５アミノ酸、さらに好ましくは１～１０アミノ酸、最も好ましくは１～６アミノ酸である。
　本件第１のポリペプチドとしては、後述する本実施例でその効果が実証されているため、本件第１のポリペプチドの「ＣＤ３　ＶＬ」と「腫瘍　ＶＨ」との間に、４～９アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されたものを好適に例示することができ、また、本件第２のポリペプチドとしては、後述する本実施例でその効果が実証されているため、本件第２のポリペプチドの「腫瘍　ＶＬ」のＮ末端、「腫瘍　ＶＬ」と「ＣＤ３　ＶＨ」との間に、４～９アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されたものを好適に例示することができる。
　上記分泌シグナルペプチドとしては、異種ポリペプチドの発現・分泌効率の点から、リンカーペプチドと連結した分泌シグナルペプチド－リンカーペプチド連結体が好ましい。かかる分泌シグナルペプチド－リンカーペプチド連結体としては、国際公開第２０１６／０８８３７６号パンフレットに開示されているものや、具体的には、以下の（i）～（iii）を含むものを挙げることができる。
（i）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
（ii）配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
（iii）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
　上記タンパク質タグとしては、例えば、ｃ－Ｍｙｃタグ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、ＨＡタグ、ＦＬＡＧタグを挙げることができる。
　本件ダイアボディ型ＢｓＡｂにおけるＶＬ及びＶＨの由来、種類、クラス、形態等は特に制限されず、例えば、ヒト由来のＶＬ及びＶＨ；マウス、ラット等の非ヒト動物由来のＶＬ及びＶＨ；ポリクローナル抗体由来のＶＬ及びＶＨ、オリゴクローナル抗体（数種～数十種の抗体の混合物）由来のＶＬ及びＶＨ、モノクローナル抗体由来のＶＬ及びＶＨ；ＶＬ及びＶＨの一部領域（例えば、相補性決定領域［ＣＤＲ］を除いた可変領域）を異なる生物種由来の領域に置換したキメラＶＬ及びＶＨやヒト化ＶＬ及びＶＨ等が含まれる。
　上記「ＣＤ３　ＶＬ」及び「ＣＤ３　ＶＨ」としては、アミノ酸配列が公知である抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ、例えば、特表２００９－５２０７３４に開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２００８－５０３４４９に開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１３－５０８３９１に開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１７－５０４３１４に開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１８－５３５９７２に開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；国際公開第２０１５／１４６４３７号パンフレットに開示された抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；や、具体的には、配列番号１の１～１０７番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ、及び配列番号２の１１５～２３３番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ；配列番号３の１～１０７番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ、及び配列番号４の１１５～２３３番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ；配列番号５の１～１０８番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＬ、及び配列番号６の１１５～２３６番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるＶＨ；を挙げることができる。これらＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列を基に、kabatによる番号付け（文献「kabat, E.A. et al.,(1991)NIH Publication No. 91-3242, sequences of proteins of immunological interest」参照）を行い、重（Ｈ）鎖及び軽（Ｌ）鎖のＣＤＲ１～３、すなわち、Ｈ鎖ＣＤＲ１に相当するKabat番号３１～３５、Ｈ鎖ＣＤＲ２に相当するKabat番号５０～６５、及びＨ鎖ＣＤＲ３に相当するKabat番号９５～１０２を有する、並びに、Ｌ鎖ＣＤＲ１に相当するKabat番号２４～３４、Ｌ鎖ＣＤＲ２に相当するKabat番号５０～５６、及びＬ鎖ＣＤＲ３に相当するKabat番号８９～９７を含み、これらＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲ１～３以外の可変領域（具体的には、フレームワーク領域［ＦＲ］）を、ヒト由来可変領域に改変（ヒト化）したものを、「ＣＤ３　ＶＬ」及び「ＣＤ３　ＶＨ」として用いてもよい。
　上記ヒト腫瘍細胞表面抗原としては、腫瘍細胞の表面に存在する抗原であればよく、例えば、ヒトＢ７－Ｈ３、ヒトＣＥＡ（癌胎児性抗原）、ヒトＤＬＬ３、ヒトＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）ファミリーに属する抗原（例えば、ＨＥＲ［Human Epidermal Growth Factor Receptor］１［ヒトＥＧＦＲ、ヒトＥｒＢ１ともいう］、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４）、ヒトＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule）、ヒトＧＰＣ３（Glypican-3）、ヒトＧＰＡ３３（glycoprotein A33）、ヒトＭＵＣ１６、ヒトＰ型カドヘリン、ヒトＰＳＭＡ（Prostate Specific Membrane Antigen）、ヒトＳＳＴＲ２、ヒトＰＤ－Ｌ１を挙げることができ、本実施例でその効果が実証されているため、ヒトＥＧＦＲファミリーに属する抗原、ヒトＥｐＣＡＭ、及びヒトＰＳＭＡが好ましく、ヒトＥＧＦＲファミリーに属する抗原としては、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、及びヒトＨＥＲ３を好適に例示することができる。
　上記「腫瘍　ＶＬ」及び「腫瘍　ＶＨ」としては、アミノ酸配列が公知である抗ヒト腫瘍細胞表面抗原抗体由来のＶＬ及びＶＨ、例えば、国際公開第２０１２／１４７７１３号パンフレットに開示された抗ヒトＢ７－Ｈ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２００９－５２０７３４に開示された抗ヒトＣＥＡ抗体由来のＶＬ及びＶＨ；国際公開第２０１１／０９３０９７号パンフレットに開示された抗ヒトＤＬＬ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；国際公開第２０１１／０６２１１２号パンフレットに開示された抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特開２０１２－１５８５３４に開示された抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１３－５１４７９３に開示された抗ＨＥＲ３抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１０－５２３０９６に開示された抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＬ及びＶＨ；特表２０１３－５２９０６１に開示された抗ヒトＭＵＣ１６抗体由来のＶＬ及びＶＨ；や、具体的には、配列番号２の１～１０８番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬ、及び配列番号１の１１４～２３５番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨ；配列番号４の１～１０８番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬ、及び配列番号３の１１４～２３４番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ＥＧＦＲ抗体由来のＶＨ；配列番号１４の１～１０８番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＬ、及び配列番号１５の１１５～２３３番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＨ；配列番号８２の１１５～２３４番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＨ、及び配列番号８３の１～１１３番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＬ；配列番号８６の１１５～２３５番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＨ、及び配列番号８７の１～１０７番目のアミノ酸残基と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＬ；を挙げることができる。これらＶＬ及びＶＨのアミノ酸配列を基に、kabatによる番号付けを行い、Ｈ鎖及びＬ鎖のＣＤＲ１～３、すなわち、Ｈ鎖ＣＤＲ１に相当するKabat番号３１～３５、Ｈ鎖ＣＤＲ２に相当するKabat番号５０～６５、及びＨ鎖ＣＤＲ３に相当するKabat番号９５～１０２を有する、並びに、Ｌ鎖ＣＤＲ１に相当するKabat番号２４～３４、Ｌ鎖ＣＤＲ２に相当するKabat番号５０～５６、及びＬ鎖ＣＤＲ３に相当するKabat番号８９～９７を含み、これらＨ鎖及びＬ鎖ＣＤＲ１～３以外の可変領域（具体的には、ＦＲ）を、ヒト由来可変領域に改変（ヒト化）したものを、「腫瘍　ＶＬ」及び「腫瘍　ＶＨ」として用いてもよい。
　本件第１のポリペプチドにおける「ＣＤ３　ＶＬ」と、本件第２のポリペプチドにおける「ＣＤ３　ＶＨ」との非共有結合や、本件第１のポリペプチドにおける「腫瘍　ＶＨ」と、本件第２のポリペプチドにおける「腫瘍　ＶＬ」との非共有結合は、「ＣＤ３　ＶＬ」と「ＣＤ３　ＶＨ」とが近接するアミノ酸残基、及び／又は、「腫瘍　ＶＬ」と「腫瘍　ＶＨ」とが近接するアミノ酸残基を、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸残基で置換すると、本件第１のポリペプチドと本件第２のポリペプチドとの非共有結合が促進・安定化し、細胞傷害活性や抗腫瘍効果をさらに高めることが可能となる。ここで、置換対象のアミノ酸残基としては、ＶＬ及びＶＨにおいて相補性決定領域（ＣＤＲ）以外の領域、例えば、ＣＤＲ１とＣＤＲ２の間のフレームワーク領域（ＦＲ２）内のアミノ酸残基を挙げることができ、より具体的な、ＶＬにおける置換対象のアミノ酸残基と、ＶＨにおける置換対象のアミノ酸残基との組合せとしては、例えば、ＶＬ上Kabat番号３８番目のグルタミン（Ｑ）（ＶＬ　Ｑ３８）と、ＶＨ上Kabat番号３９番目のＱ（ＶＨ　Ｑ３９）との組合せ；ＶＬ上Kabat番号４４番目のプロリン（Ｐ）（ＶＬ　Ｐ４４）とＶＨ上Kabat番号４５番目のロイシン（Ｌ）（ＶＨ　Ｌ４５）との組合せ；等を挙げることができる。これらアミノ酸残基は、いずれも中性アミノ酸で、ヒト及びマウスにおいて高度に保存されていることから、各組合せのいずれか一方のアミノ酸残基を、正電荷のアミノ酸（例えば、リジン［Ｋ］、アルギニン［Ｒ］、ヒスチジン［Ｈ］；以下同じ）に置換し、もう一方のアミノ酸残基を、負電荷のアミノ酸（例えば、グルタミン酸［Ｅ］、アスパラギン酸［Ｄ］；以下同じ）に置換すると、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸残基の組合せを得ることができる。より具体的には、同じポリペプチド上のＶＨ・ＶＬ間の会合を抑制することも考慮すると、（１）本件第１のポリペプチドの「ＣＤ３　ＶＬ」におけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第１のポリペプチドの「腫瘍　ＶＨ」におけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第２のポリペプチドの「腫瘍　ＶＬ」におけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第２のポリペプチドの「ＣＤ３　ＶＨ」におけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンであること；や、（２）本件第１のポリペプチドの「ＣＤ３　ＶＬ」におけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第１のポリペプチドの「腫瘍　ＶＨ」におけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第２のポリペプチドの「腫瘍　ＶＬ」におけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第２のポリペプチドの「ＣＤ３　ＶＨ」におけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であること；が好ましい。
　本明細書において、「・・・アミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性」とは、比較対象のアミノ酸配列と同一のアミノ酸の割合が８０％以上であることを意味し、好ましくは８５％以上、より好ましくは８８％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９３％以上、特に好ましくは９５％以上、特により好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、ＣｌｕｓｔａｌＷ、ＧＥＮＥＴＹＸ、ＢＬＡＳＴ等の公知のプラグラムを用いて決定することができる。
　本件ベクターを作製する方法や、本件ベクターを用いて本件ビフィドバクテリウム属細菌を作製する方法は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラー・クローニング［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８２）]、モレキュラー・クローニング第２版［コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー（１９８９）]、メソッズ・イン・エンザイモロジー１９４（１９９１）、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社（１９９４）等に記載された方法に従って行うことができる。
　本件ベクターにおけるプロモーターとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターであればよく、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様ＤＮＡ結合タンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるＨｕプロモーター；Ｐ３０プロモーター（J. Microbiology, 2012, 638-643）；Ｅｌｏｎｇａｔｉｏｎ Ｆａｃｔｏｒ Ｔｕタンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるＰ５４プロモーター（J.Bacteriology, 2005, 5799-5808、J.Microbiology,2012, 638-643）；ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来Ｇａｐ遺伝子のプロモーター（Biotechnol.Lett. 2008 30:1983-1988）；ビフィドバクテリウム・ロンガム由来ＡｍｙＢ遺伝子のプロモーター（Biotechnol. Lett. 2006 28:163-168）；１６ＳｒＲＮＡプロモーター（Biotechnol. Lett. 2008 30:165-172）；ＧＡＰＤＨ（ｐｒ－ＢＬ1363）遺伝子のプロモーター（Appl Environ Microbiol.200672(11):7401-7405）；ＰＲＰＬプロモーターCancer Gene Ther.200714:151-157）；ｐ５７２（β-glycosidase from B. animalis subsp lactis）遺伝子のプロモーター（J Microbiol Biotechnol.2012 Dec;22(12):1714-23）；ｐ９１９(rplM promoter)（J Microbiol. 2012 Aug;50(4):638-43）；ｐ８９５(rplR promoter)（JMicrobiol. 2012 Aug;50(4):638-43）；を挙げることができる。
　本件ベクターには、自律複製できるように、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが含まれる。かかる複製ユニットとしては、例えば、ｐＴＢ６（Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Feb;69(2):422-5）、ｐＭＢ１（Lett Appl Microbiol. 1990 Oct;11(4):220-3）、ｐＴＢ４（Bifidobacterium longum 由来のプラスミドｐＴＢ４の構造解析と応用一般演題 ポスター発表 プログラム－日本分子生物学会、１９９４）、ｐＦＩ２５７６（J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr;19(4):403-8）、ｐＣＩＢＡＯ（Appl Environ Microbiol. 2007 Dec;73(24):7858-66）、ｐＢＣ１（Plasmid. 2007 Mar;57(2):165-74）、ｐＤＯＪＨ１０Ｓ（Appl Environ Microbiol. 2006 Jan;72(1):527-35）、ＰＫＪ５０（Microbiology 1999 Mar;145(Pt ):585-92）の複製ユニット、Ｒｅｐ４（配列番号１２のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、ｐＦＩ２５７６の複製ユニット）を挙げることができる。
　本件ベクターとしては、本件ベクターのクローニング；及び本件ベクターを含む本件ビフィドバクテリウム属細菌のスクリーニング；に使用する薬剤耐性遺伝子や、本件第１のポリヌクレオチド及び本件第２のポリヌクレオチドの転写を終結させるヌクレオチド配列（すなわち、ターミネーター）を含むものが好ましい。
　上記ターミネーターとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターであれば特に制限されず、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のＨｕターミネーター；ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の乳酸脱水素酵素遺伝子のターミネーターであるｄ００１３ターミネーター；ビフィドバクテリウム・アニマリス由来のＴ５７２ターミネーター（J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec;22(12):1714-23）；人工的にデザインされたターミネーターであるＢＢａ＿Ｂ００１５（Ｔ２）ターミネーター）；Ｔ２ターミネーター（国際公開第２０１６／０８８３７６号公報）；を挙げることができる。
　上記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子を挙げることができる。
　本件ベクターとしては、大腸菌複製起点（例えば、ｐＵＣｏｒｉ、ｐＢＲ３２２ｏｒｉ）を含むものであっても、クローニング後、ビフィドバクテリウム属細菌へ導入する前に、大腸菌複製起点を除去したものであってもよい。
　本件ビフィドバクテリウム属細菌において、本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドは、モノシストロニックに発現するもの（すなわち、１つのｍＲＮＡから本件第１のポリペプチド又は本件第２のポリペプチドの１つが翻訳されるもの）であっても、ポリシストロニックに発現したもの（すなわち、１つのｍＲＮＡから本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドの２つが翻訳されるもの）であってもよいが、本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドを１：１で効率よく発現させる観点から、ポリシストロニックに発現したものが好ましい。本件第１のポリペプチド及び本件第２のポリペプチドをポリシストロニックに発現する本件ビフィドバクテリウム属細菌は、本件第１のポリヌクレオチドと本件第２のポリヌクレオチドの間に、ターミネーター及びプロモーターを含まず、かつリボソーム結合領域（ＲＢＳ）を含む本件ベクターを作製し、当該本件ベクターをビフィドバクテリウム属細菌へ導入することにより作製することができる。かかるＲＢＳとしては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株由来のＨｕｐ遺伝子の翻訳開始コドンの上流５２ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチドや、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株由来の30S ribosomal protein S16遺伝子の翻訳開始コドンの上流５４ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
　本件ベクターを、ビフィドバクテリウム属細菌へ導入する方法としては、エレクトロポレーション法を挙げることができる。
　本件ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム（B. longum）、ビフィドバクテリウム・ブレーベ（B. breve）、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス（B. adolescentis）、ビフィドバクテリウム・ビフィダム（B. bifidum）、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム（B．pseudolongum）、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム（B. thermophirum）、ビフィドバクテリウム・インファンティス（B．infantis）、ビフィドバクテリウム・アニマリス（B. animalis）、ビフィドバクテリウム・アングラタム（B. angulatum）、ビフィドバクテリウム・アステロイデス（B. asteroides）、ビフィドバクテリウム・ボウム（B. boum）、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム（B. catenulatum）、ビフィドバクテリウム・コエリナム（B. choerinum）、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ（B. coryneforme）、ビフィドバクテリウム・クニクリ（B. cuniculi）、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス（B. denticolens）、ビフィドバクテリウム・デンティウム（B. dentium）、ビフィドバクテリウム・ガリクム（B. gallicum）、ビフィドバクテリウム・ガリナラム（B. gallinarum）、ビフィドバクテリウム・グロボサム（B. globosum）、ビフィドバクテリウム・インディクム（B. indicum）、ビフィドバクテリウム・イノピナタム（B. inopinatum）、ビフィドバクテリウム・ラクティス（B. lactis）、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス（B. lactentis）、ビフィドバクテリウム・マグナム（B. magnum）、ビフィドバクテリウム・メリシクム（B. merycicum）、ビフィドバクテリウム・ミニマム（B. minimum）、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス（B. Mongolia Enns）、ビフィドバクテリウム・パルブロラム（B. parvulorum）、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム（B. pseudocatenulatum）、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム（B. psychraerophilum）、ビフィドバクテリウム・プロラム（B. pullorum）、ビフィドバクテリウム・ルミナレ（B. ruminale）、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム（B. ruminantium）、ビフィドバクテリウム・サエクラレ（B. saeculare）、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ（B. scardovii）、ビフィドバクテリウム・サブタイル（B. subtile）、ビフィドバクテリウム・スイス（B. suis）、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム（B. thermacidophilum）を挙げることができ、これらの中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを好適に例示することができる。これらの菌は、いずれも市販品として、あるいは、寄託機関等から容易に入手することができる。
　また、それぞれの種の菌株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムａＥ－１９４ｂ株、ビフィドバクテリウム・ロンガムｂｓ－６０１株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＭ１０１－２株、ビフィドバクテリウム・ロンガムＡＴＣＣ－１５７０７株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株を好適に例示することができる。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株（ＪＣＭ１１９２）、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ－１株、ビフィドバクテリウム・ブレーベＩ－５３－８Ｗ株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベａＳ－１株を好適に例示することができる。また、ビフィドバクテリウム・インファンティスの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株（ＪＣＭ１２２２）、ビフィドバクテリウム・インファンティスＩ－１０－５株を挙げることができる。また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株（ＪＣＭ１２１０）を挙げることができる。また、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムＡＴＣＣ－１１８６３株を挙げることができる。
　本件予防／治療剤は、液体タイプと非液体タイプとに大別される。液体タイプの本件予防／治療剤は、本件ビフィドバクテリウム属細菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩水若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。一方、非液体タイプの本件予防／治療剤は、液体タイプの本件予防／治療剤に、適当な保護剤を添加してアンプルやバイアル瓶などに充填した後、凍結するか、あるいは、凍結乾燥することにより製造することができる。本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、局所投与を挙げることができる。
　本件予防／治療剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の添加剤をさらに含むものであってもよい。かかる添加剤としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
　本件予防／治療剤は、固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着や増殖を促進するために、固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び／又は増殖の促進剤と併用することが好ましい。かかる促進剤としては、例えば、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、ラクツロース等の糖類を挙げることができ、これらの中でも、後述する本実施例でその効果が実証されているため、マルトースを好適に例示することができる。
　本件ビフィドバクテリウム属細菌の投与量としては、固形腫瘍部位において本件ビフィドバクテリウム属細菌が生育でき、且つ、有効治療量の本件ダイアボディ型ＢｓＡｂが発現・分泌するのに十分な量である限り特に制限されず、腫瘍体積の大きさ、投与対象者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。例えば、静脈内投与の場合、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、又は適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕ（Colony Forming Unit）を１日１～複数回に分け、１～数日間、連続して又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり１～１０００ｍＬを直接、又は適当な補液で希釈して、１日１～数回に分け、１～数日間連続して投与する。また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重１ｋｇ当たり１０４～１０１２ｃｆｕを１日１～複数回、必要に応じ１～複数日間、連続して、又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を１０４～１０１０ｃｆｕ／ｍＬ含有する製剤を、成人１人あたり０．１～１００ｍＬを直接、一日数回、必要に応じて１～複数日間連続して投与する。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、培養細胞は、３７℃、５％ＣＯ２条件下で培養した。
［実施例１］ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）の作製
　ヒトＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［１－１］～［１－５］の項目に記載の方法に従って作製した。
１－１　ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含むＤＮＡの合成
　３種類のヒトＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ、すなわち、配列番号１のアミノ酸配列からなるＬＨ９ポリペプチド１（表１参照）と、配列番号２のアミノ酸配列からなるＬＨ９ポリペプチド２（表２参照）とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ（以下、「ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある）；配列番号３のアミノ酸配列からなるＬＨ２２ポリペプチド１（表３参照）と、配列番号４のアミノ酸配列からなるＬＨ２２ポリペプチド２（表４参照）とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ（以下、「ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある）；及び、配列番号５のアミノ酸配列からなるＬＨ３１ポリペプチド１（表５参照）と、配列番号６のアミノ酸配列からなるＬＨ３１ポリペプチド２（表６参照）とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ（以下、「ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある）；を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、３種類のＤＮＡ（配列番号７のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ａ参照］、配列番号８のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ｂ参照］、及び配列番号９のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ［図１Ｃ参照］）を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した。なお、各ポリペプチド１及びポリペプチド２のＮ末端には、それぞれ分泌シグナルペプチドＳＰ５０（配列番号１０の１～５６番目のアミノ酸残基）－Ｌ５リンカーペプチド（配列番号１０の５７～６１番目のアミノ酸残基）連結体（ＳＰ５０－Ｌ５；配列番号１０のアミノ酸配列）が含まれるとともに、各ポリペプチド１及び２のＣ末端には、それぞれｃ－Ｍｙｃ（配列番号１１の４～１３番目のアミノ酸残基）－Ｈｉｓ（配列番号１１の２３～２８番目のアミノ酸残基）融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が含まれる（図１～６参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
１－２　プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５の作製
　Ｂ菌内でＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図２に示す手順に従って、プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５を作製した。
１－２－１　ＰＣＲ反応
　５０ｐｇ／μＬの２種類の鋳型ＤＮＡ（線状化したベクター断片１［図２参照］、及び上記ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡ）、０．２μＭの前記鋳型ＤＮＡを増幅する２種類のプライマーセット（ＤＥＬ１プライマーとＤＥＬ２１プライマーとのセット、及びＤＥＬ２２プライマーとＤＥＬ２０プライマーとのセット；図２及び表７参照）、及びPrimeSTAR HS (Premix)キット（タカラバイオ社製）を用い、ＰＣＲ反応（９８℃にて１０秒、６５℃にて５秒、７２℃にて伸長反応［１０００塩基対あたり約１分］を１サイクルとして、３０サイクル）を行い、ＰＣＲ断片１及びＰＣＲ断片２を作製した。
１－２－２　インフュージョン反応
　上記ＰＣＲ断片１と、上記ＰＣＲ断片２とを、In-Fusion（登録商標）HD Cloning Kit（タカラバイオ社製）を用いて連結した。具体的には、上記ＰＣＲ断片１（ベクター断片）と、上記ＰＣＲ断片２（インサート断片）を、マイクロチューブに１：１のモル比にて添加後、２μＬの5xIn-Fusion HD Enzyme premix及び１μＬのCloningEnhancerを添加し、反応液容量を１０μＬに調整した。これを３７℃にて１５分間保温した後、さらに５０℃にて１５分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液を調製した。
１－２－３　大腸菌形質転換体の作製と、プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５の精製
　上記インフュージョン反応液１μＬと、大腸菌ＨＳＴ１６ＣＲコンピテント細胞（タカラバイオ社製）を用いて、プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５を保持する大腸菌形質転換体を、製品説明書に従って作製した。大腸菌形質転換体を含む懸濁液を、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ寒天培地に塗布し、３７℃にて一晩静置培養した後、寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＬＢ液体培地にて３７℃にて一晩振とう培養し、その後、QIAprep Spin Miniprep Kit（キアゲン社製）を用いてプラスミドｐＬＨ９－Ｌ５を単離・精製した。
１－３　プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍの作製
　Ｂ菌内でＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図３及び４に示す手順に従って、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍを作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片１を鋳型とし、ＤＥＬ１プライマー及びＤＥＬ２１プライマーのプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片３を作製するとともに、上記ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＬ２３プライマー及びＤＥＬ４プライマーのプライマーセットとを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片４を作製した後、ＰＣＲ断片３及びＰＣＲ断片４を用いたインフュージョン反応を行い、上記「１－２－３」の項目に記載の方法に従って、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１を単離・精製した（図３及び表７参照）。次に、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１の抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬをコードするヌクレオチド配列中に、ＬＨ２２ポリペプチド２をコードするヌクレオチド配列と高ホモロジー領域が存在したため、サイレント変異（抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬアミノ酸配列は変えないヌクレオチド残基の置換）を導入した。具体的には、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１を鋳型とし、変異導入用ＤＥＬ４３プライマー及びｐＵＣ６プライマーのプライマーセットと、変異導入用ＤＥＬ４２プライマー及びｐＵＣ７プライマーのプライマーセットとを用いたＰＣＲをそれぞれ行い、ＰＣＲ断片５及びＰＣＲ断片６を作製後、これら断片を用いたインフュージョン反応を行い、上記「１－２－３」の項目に記載の方法に従って、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１ｃｍを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１ｃｍを単離・精製した（図３及び表７参照）。次いで、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５－Ｆ１ｃｍを鋳型とし、ＤＥＬ１プライマー及びＤＥＬ１８プライマーのプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片７を作製するとともに、上記ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＬ１９プライマー及びＤＥＬ２０プライマーのプライマーセットとを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片８を作製した後、ＰＣＲ断片７及びＰＣＲ断片８を用いたインフュージョン反応を行い、上記「１－２－３」の項目に記載の方法に従って、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍを単離・精製した（図４及び表７参照）。なお、ＰＣＲ反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「１－２－１」及び「１－２－２」の項目に記載の方法に従って行った。
１－４　プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５の作製
　Ｂ菌内でＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図５及び６に示す手順に従って、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５を作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片１を鋳型とし、ＤＥＬ１プライマー及びＤＥＬ２４プライマーのプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片９を作製するとともに、上記ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＬ２５プライマー及びＤＥＬ４プライマーのプライマーセットとを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片１０を作製した後、ＰＣＲ断片９及びＰＣＲ断片１０を用いたインフュージョン反応を行い、上記「１－２－３」の項目に記載の方法に従って、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５－Ｆ１を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５－Ｆ１を単離・精製した（図５及び表７参照）。次いで、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５－Ｆ１を鋳型とし、ＤＥＬ１プライマー及びＤＥＬ１８プライマーのプライマーセットを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片１１を作製するとともに、上記ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂのコード配列を含む人工ＤＮＡを鋳型とし、ＤＥＬ１９プライマー及びＤＥＬ２０プライマーのプライマーセットとを用いたＰＣＲを行い、ＰＣＲ断片１２を作製した後、ＰＣＲ断片１１及びＰＣＲ断片１２を用いたインフュージョン反応を行い、上記「１－２－３」の項目に記載の方法に従って、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５を単離・精製した（図６及び表７参照）。なお、ＰＣＲ反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「１－２－１」及び「１－２－２」の項目に記載の方法に従って行った。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000009
１－５　ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株の作製
　単離・精製した上記３種類のプラスミド（ｐＬＨ９－Ｌ５、ｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍ、及びｐＬＨ３１－Ｌ５）を、エレクトロポレーションシステム（ジーンパルサーII、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製）を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（元京都薬科大学　加納康正教授より分譲）へ形質転換した。具体的には、電気ショック（２ｋＶ、２５μＦ、２００Ω）を行い、キュベット（２ｍｍギャップ）に８００μＬのＩＭＲ液体培地と、５０μＬのビタミンＣ添加液（３５０ｍｇ／ｍＬのアスコルビン酸、２０ｍｇ／ｍＬのＬ－システイン塩酸塩一水和物、及び１１０ｍｇ／ｍＬの炭酸ナトリウムを含む液）との混合液を即時に添加し、これを滅菌済みの２ｍＬマイクロチューブに回収した。その後、チューブの蓋をゆるめて、脱酸素・炭酸ガス発生剤（アネロパック［登録商標］・ケンキ、三菱ガス化学社製）とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて３時間保温した。保温後の各菌懸濁液を７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地に塗布した。これらのプレートを上記脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて２日間培養した。上記スペクチノマイシン含有ＩＭＲ寒天培地上に形成したコロニーを釣菌し、７５μｇ／ｍＬスペクチノマイシン含有ＢＬ－ｂＳ寒天培地に画線後、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、３７℃に設定したインキュベーターにて１日間培養し、３種類のビフィズス菌形質転換体、すなわち、プラスミドｐＬＨ９－Ｌ５を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＦＬＭ－９Ｈ株）、プラスミドｐＬＨ２２－Ｌ５ｃｍを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＦＯＭ－２２Ｈ株）、及びプラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＤＵＭ－３１Ｈ株）を取得した。
［実施例２］ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株の発現・分泌評価（ＷＢ）
　上記３種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）が、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを、以下の［２－１］及び［２－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
２－１　ＳＤＳ－サンプルの調製
　上記３種類のビフィズス菌形質転換体を、７５μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン及び１００μＬのビタミンＣ添加液を含むＭＲＳ液体培地（ベクトン・ディッキンソン社製）１０ｍＬに植菌し、３７℃にて２４時間嫌気培養し、前培養液を調製した。次に、ＤＭＥＭ液体培地(Cat No. 11885-084、ライフテクノロジーズ社製)及びＭＲＳ液体培地を、９：１の割合で混合した培地２０ｍＬに、ビタミンＣ添加液１００μＬと、スペクチノマイシンを７５μｇ／ｍＬになるよう添加し、上記前培養液１００μＬを植菌した後、３７℃にて１８時間嫌気培養し、本培養液を調製した。本培養液を遠心分離後、培養上清を回収し、培養上清４０μＬに、５×サンプルローディングバッファー（Pierce Lane Marker Reducing Sample Buffer、ThermoFischerScientific社製）１０μＬを混合し、９５℃にて３分間熱処理を行い、電気泳動用サンプルを調製した。同様の操作を、ＢＥシャトルベクターを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＢＥシャトル株）についても行い、陰性コントロールとした。
２－２　ウェスタンブロッティング法（ＷＢ）
　上記電気泳動用サンプルを、ミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸゲル（４～２０％）（バイオラッド社製）にて電気泳動し、電気泳動後のゲルを、ＰＶＤＦ膜（Trans-Blot Turbo Mini Format、バイオラッド社製）へトランスブロットTurbo（バイオラッド社製）を用いて転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を、ブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）を用いてブロッキング処理した後、マウス抗Ｈｉｓタグ抗体（ジェンスクリプトジャパン社製）を用いた一次抗体反応処理と、ＥＣＬ－ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(GE ヘルスケアジャパン社製）を用いた二次抗体反応処理を行い、Western Lightning Ultra（パーキンエルマー社製）を用いて発光させた。これをイメージングアナライザー（myECL Imager、Thermo Fischer Scientific社製）にて解析した。
（結果）
　上記３種類のビフィズス菌形質転換体の全ての培養上清中に、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを構成するポリペプチド１及びポリペプチド２に由来する２つのバンドが、３０ｋＤａ付近に認められた（図７参照）。この結果は、上記３種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）は、いずれもＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、それぞれＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現し分泌することを示している。
［実施例３］ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＥＧＦＲ／ＣＤ３への結合性評価　上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）が、ＥＧＦＲ及びＣＤ３に結合することを、以下の［３－１］及び［３－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
３－１　ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　上記３種類のビフィズス菌形質転換体を、実施例２に記載の方法に従って培養し、５０ｍＬの本培養液を調製した。調製した本培養液を遠心分離し、得られた培養上清を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを８０％飽和になるよう少しずつ添加し、４℃にて一晩撹拌し塩析を行った。その後、遠心分離し、沈殿を回収した後、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キット（ＴＡＬＯＮ　Ｍｅｔｈａｌ　Ａｆｆｉｎｉｔｙ　Ｒｅｓｉｎｓ、タカラバイオ社製）にてタンパク質（すなわち、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を精製し、精限外ろ過（アミコンウルトラ－０．５、公称分画分子量: １０ＫＤａ，メルク社製）にて濃縮した。各ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、分光光度計（ＮａｎｏＤｒｏｐ２０００ｃ、Thermo Fischer Scientific社製）にて測定した２８０ｎｍの吸光度（Ａ２８０値）、及びダイアボディ型ＢｓＡｂの吸光係数（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂのＡｂｓ０．１％：１．９１４、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂのＡｂｓ０．１％：１．８５１、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂのＡｂｓ０．１％：１．７９３）を基に算出し、１０（ｎｇ／ｍＬ）１００（ｎｇ／ｍＬ）、及び１０００（ｎｇ／ｍＬ）となるように調整した。なお、Ａｂｓ０．１％のＡ２８０値は、遺伝子解析サイト　ＥｘＰＡＳＹのＰｒｏｔＰａｒａｍ　ｔｏｏｌ(https://web.expasy.org/protparam/)を使用して算出した。
３－２　ＥＬＩＳＡ法
３－２－１　抗原・抗体反応処理
　２．５μｇ／ｍＬのヒトＥＧＦＲ組換えタンパク質（R&D Systems社製）含有液、及び５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質（Acro Biosystems社製）含有液を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを２００μＬの０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０(MP Biomedical社製)を含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）（以下、「ＰＢＳ－Ｔ」という）にて３回洗浄した。その後、蒸留水にて５倍に希釈したブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）を２００μＬ分注し、２５℃で２時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１０（ｎｇ／ｍＬ）、１００（ｎｇ／ｍＬ）、又は１０００（ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを含む液を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩＡ液（ナカライテスク社製）にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で２時間静置することにより、抗体（ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ）と、抗原（固相化したヒトＥＧＦＲ組換えタンパク質、及び固相化したヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質）の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。
３－２－２　抗体の検出
　０．１μｇ／ｍＬのビオチン標識抗Ｈｉｓタグ抗体（MBLライフサイエンス社製）２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ［Horseradish Peroxidase］）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で３０分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢ［3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine］を含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度（陰性対照）で補正した値（平均値±標準偏差、図８及び９の縦軸参照）を算出した。
（結果）
　吸光度の補正値は、固相化したヒトＥＧＦＲ組換えタンパク質及びヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質のいずれを用いた場合でも、上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図８及び９参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、ヒトＥＧＦＲ及びヒトＣＤ３の両方に特異的に結合することを示している。
［実施例４］ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株の培養上清より精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性評価
　上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが、細胞傷害性活性を有することを、以下の［４－１］及び［４－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
４－１　Ｔ－ＬＡＫの調製
　細胞傷害性活性測定に用いるＴ－ＬＡＫ（活性化Ｔリンパ球）を、ヒト末梢血単核球細胞（ＰＢＭＣ）から作製した。具体的には、２５ｃｍ２フラスコに１０μｇ／ｍＬの抗ヒトＣＤ３抗体（BioLegend社製）を３７℃にて固相化し、ＰＢＳ（－）にて洗浄後、１０％の非働化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にて懸濁したヒトＰＢＭＣを播種し、１４０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２存在下で、３～４日毎に培地交換しながら、２週間培養し、Ｔ－ＬＡＫを調製した。Ｔ－ＬＡＫは液体窒素気相中にて保管し、細胞傷害活性測定に用いる際には、Ｔ-ＬＡＫを１０％の非働化ＦＢＳを含むＲＰＭＩ－１６４０培地にて懸濁し、１４０Ｕ／ｍＬのＩＬ－２存在下で１週間培養を行った。
４－２　細胞傷害活性の測定法
　９６ウェルプレートに、２×１０４ｃｅｌｌｓ／１００μＬ／ウェルのヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞（ＡＴＣＣ［American Type Culture. Collection］より入手）を播種し、２４時間後、Ｔ－ＬＡＫを、Ｔ－ＬＡＫ：ＨＣＴ１１６細胞比が５：１となるように混合した。同時に、上記「３－１」の項目に記載の方法に従って精製した上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを、１００ｆＭ（１０－１３Ｍ）～１００ｐＭ（１０－１０Ｍ）の濃度に段階希釈したものを添加し、培地量が計１００μＬとなるように調整し、２４時間培養した。その後、各ウェルをＰＢＳ（－）にて３回洗浄し、CellTiter 96（登録商標）AQueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社製）を含むＲＰＭＩ－１６４０培地１２０μＬを添加し、３７℃、５％ＣＯ２で１０分間インキュベートした。その後、４９０ｎｍの吸光度を測定し、陰性対照波長として６６０ｎｍの吸光度を測定した。ＨＣＴ１１６細胞の生存率（平均値±標準偏差、図１０の縦軸参照）は、Ｂｌａｎｋのウェルを測定した値を細胞生存率０％とし、Ｔ－ＬＡＫ不含のＨＣＴ１１６細胞を播種したウェルを測定した値を細胞生存率１００％として算出した。
（結果）
　ヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞の生存率は、上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に低下することが示された（図１０参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記３種類のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂ、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂ、及びＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＥＣ５０値（すなわち、ＨＣＴ１１６細胞の生存率を５０％に低下させるＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度）は、ＬＨ９ダイアボディ型ＢｓＡｂの場合、２．２ｐＭであり、ＬＨ２２ダイアボディ型ＢｓＡｂの場合、０．２５ｐＭであり、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂの場合、３２ｐＭであった。
［実施例５］ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）の作製
　実施例１で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［５－１］～［５－２］の項目に記載の方法に従って作製した。
５－１　プラスミドｐ１２６の作製
　実施例１で作製したプラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５（図６参照）において、ビフィズス菌中でのプラスミド複製ユニットであるｐＴＢ６をＲｅｐ４（配列番号１２のヌクレオチド配列）へ変更し、かつ、ＳＰ５０－Ｌ５がＮ末端に付加されたＬＨ３１ポリペプチド１及びＬＨ３１ポリペプチド２に代えて、ＳＰ５０－Ｌ２（ＳＰ５０－Ｌ５におけるリンカーペプチドの長さを５アミノ酸残基から２アミノ酸残基へ短くしたもの；配列番号１３のアミノ酸配列）がＮ末端に付加されたＬＨ３１ポリペプチド１及びＬＨ３１ポリペプチド２を発現するプラスミド（プラスミドｐ１２６）（図１３参照）を、実施例１と同様の方法を用い、図１１～１３に示す手順に従って作製した。ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
５－２　ＤＵＭ－１２６Ｈ株の作製
　プラスミドｐ１２６を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株への形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐ１２６を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）を取得した。
［実施例６］ＤＵＭ－１２６Ｈ株の発現・分泌評価（ＷＢ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、実施例２に記載の方法に従って、ＤＵＭ－１２６Ｈ株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
（結果）
　ＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清中に、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを構成するＬＨ３１ポリペプチド１及びＬＨ３１ポリペプチド２に由来する２つのバンドが、３０ｋＤａ付近に認められた（図１４参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）は、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現し分泌することを示している。
［実施例７］ＤＵＭ－１２６Ｈ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＣＤ３への結合性評価
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが、ヒトＥＧＦＲとヒトＣＤ３の両方に特異的に結合することを、以下の［７－１］及び［７－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
７－１　ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、実施例３の「３－１」の項目に記載の方法において、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キットに代えて、κ―軽鎖と高い親和性をもつプロテインＬレジン（Piercetm Protein L Agarose、Thermo　Scientific社製、ｃａt No. 20510）を用いた方法を行い、ＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清から精製した。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例２１において精製した、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いた。
７－２　ＥＬＩＳＡ法
７－２－１　抗原・抗体反応処理
　抗体（ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）と、抗原（固相化したヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質）の反応処理は、実施例３の「３－２－１」の項目に記載の方法に従って行った。
７－２－２　抗体の検出
　０．１μｇ／ｍＬの組換えビオチン化ヒトＥＧＦＲ（Acro Biosystems社製）を含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で３０分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度（陰性対照）で補正した値（平均値±標準偏差、図１５の縦軸参照）を算出した。
（結果）
　吸光度の補正値は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図１５の「ＤＵＭ－１２６Ｈ」参照）。一方、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった（図１５の「ＣＵＭ３６－１Ｈ」参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、ヒトＣＤ３及びヒトＥＧＦＲの両方に特異的に結合することを示している。
［実施例８］ＤＵＭ－１２６Ｈ株培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ量
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ量を、以下の［８－１］及び［８－２］の項目に記載の方法に従って測定した。
８－１　抗原・抗体反応処理
　２．５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質（Acro Biosystems社製）を、９６ウェルプレートの各ウェルに２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。その後、蒸留水にて５倍に希釈したブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）を２００μＬ分注し、２５℃で２時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。実施例６において調製したＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清と、後述する実施例１３において調製した、濃度既知のＤＵＰ－１５３株由来ＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂとを、それぞれ、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩＡ液（ナカライテスク社製）にて５００倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で２時間静置することにより、抗体（ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ）と、抗原（固相化したヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質）の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。
８－２　抗体の検出
　０．０５μｇ／ｍＬの組換えビオチン化プロテインＬ（Thermo Fischer Scientific社製）を含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で３０分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度と、陰性対照の５７０ｎｍの吸光度を測定し、濃度既知のＤＵＰ－１５３株由来ＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを基に検量線を作成後、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度を定量した。
（結果）
　ＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）の濃度は、９０９±４３（ｎｇ／ｍＬ）であることが確認された。
［実施例９］ＤＵＭ－１２６Ｈ株培養上清より精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを、実施例７の「７－１」の項目に記載の方法に従って精製し、１００ｆＭ～１００ｐＭの濃度に段階希釈した後、実施例４に記載の方法に従ってＨＣＴ１１６細胞の生存率を解析した。
（結果）
　ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に低下し、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＥＣ５０値は８．４ｐＭであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
［実施例１０］ＤＵＭ－１２６Ｈ株培養上清の細胞傷害性活性
　次に、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを精製せずに、培養上清を用いて、細胞傷害性活性を解析した。具体的には、実施例８で調製したＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清を１０３倍～１０６倍希釈したものを用い、実施例４に記載の方法に従ってＨＣＴ１１６細胞の生存率を解析した。なお、陰性対照として、ＢＥシャトル株の培養上清を１０３倍～１０６倍希釈したものを用いて、同様に解析した。
（結果）
　ＢＥシャトル株の培養上清を１０３倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、６９．２％であったのに対して、ＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清を１０３倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、５７．６％であった（図１６参照）。この結果は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株の培養上清を用いた場合でも、ＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞の生存率を低下できることを示している。
［実施例１１］ＤＵＭ－１２６Ｈ株を含むミンス移植法によるインビボでの薬効
　ＤＵＭ－１２６Ｈ株が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞の担癌Ｓｃｉｄマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の［１１－１］～［１１－４］の項目に記載の方法に従って解析した。
１１－１　腫瘍体積の測定
　ＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ（Equitech-Bio社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Sigma-Aldrich社製）で培養した後、７週齢のメスのＳｃｉｄマウス（日本エスエルシー社製）に移植して皮下担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが４４７．５９～５１７．６２ｍｍ３の担癌マウスをＰＢＳ投与群（１２匹）、ＢＥシャトル株投与群（１４匹）及びＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群（１４匹）の３群に分けた（腫瘍ミンス移植５日前）。その後、１日目（腫瘍ミンス移植４日前）及び２日目（腫瘍ミンス移植３日前）のそれぞれに、ＰＢＳ投与群には、０．２ｍＬのＰＢＳを尾静脈内投与し、ＢＥシャトル株投与群には５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＢＥシャトル株の凍結製剤を尾静脈内投与し、ＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群には、５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＤＵＭ－１２６Ｈ株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与した。３群に分けてから１～４日後（腫瘍ミンス移植４日前～１日前）に、腫瘍部位でのビフィズス菌の生着や増殖を促進するために、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で腹腔内投与し、４日後（腫瘍ミンス移植１日前）にＰＢＳ（－）で１０倍に希釈した抗アシアロＧＭ１抗体（富士フィルム和光純薬工業社製）０．２ｍＬを腹腔内に投与した。なお、その後皮下移植するＳｃｉｄマウスに対しても同様に、抗アシアロＧＭ１抗体を腹腔内に投与した。３群に分けてから５日後（腫瘍ミンス移植後０日目）に、各群（ＰＢＳ投与群、ＢＥシャトル株投与群、及びＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群）のマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍をプールしてミンスをMatrigel（Corning社製）とＨＢＳＳ（Life technologies社製）の１：１混合液で１．３３倍に希釈し、調製後、培養したＴ－ＬＡＫを０．３７５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合し、Teceleukin（塩野義製薬社製)を５０００Ｕ／ｍＬとなるように添加してミンス移植液を調製した。新たな７週齢のメスのＳｃｉｄマウスに０．２ｍＬのミンス移植液を皮下移植し、それぞれ、ＰＢＳ群（１４匹）、ＢＥシャトル株群（１５匹）、及びＤＵＭ－１２６Ｈ株群（１５匹）とした。なお、移植時点での腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体（ＢＥシャトル株及びＤＵＭ－１２６Ｈ株）の生菌数は、以下の「１１－２」の項目に記載の方法に従って測定した。腫瘍ミンス移植後０日目～４日目、７日目～１１日目、及び１４日目～１６日目に、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で腹腔内投与し、腫瘍ミンス移植後７日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、各群マウスにおける腫瘍径を測定し、腫瘍体積を、式「腫瘍体積＝長径×短径２/２」基に算出した（図１７参照）。腫瘍増殖抑制率［ＴＧＩ］を、式「ＴＧＩ＝［１－腫瘍ミンス移植後１７日の平均腫瘍体積（各組換えビフィズス菌株群）/腫瘍ミンス移植後１７日の平均腫瘍体積（PBS群）］×１００」を基に算出した。
１１－２　腫瘍ミンス中の生菌数の測定
　調製した腫瘍ミンスに、プロテアーゼインヒビター（ナカライテスク社製）含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理を行い、ホモジネートを調製した。ホモジネートの一部を分取し、以下の「１１－３」の項目に記載の方法に従って、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを測定した。残りのホモジネートを、嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、ＢＬＦＳ寒天培地（２５０μｇ／ｍＬの５－フルオロウラシル、及び３０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン含有ＢＬ寒天培地）に塗布し、嫌気条件下で３７℃にて３日間培養した。ＢＬＦＳ寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、腫瘍ミンスを調製する前の腫瘍、又は移植腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体（ＢＥシャトル株及びＤＵＭ－１２６Ｈ株）の生菌数を算出した（それぞれ、表８中の「腫瘍内の生菌数」及び「移植腫瘍ミンス中の生菌数」参照）。
１１－３　ＥＬＩＳＡ解析用腫瘍サンプルの調製
　上記ホモジネートに、１０×Cell Lysis buffer（５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５００ｍＭの塩化ナトリウム、５％のＮＰ-４０、及び２０ｍＭのＥＤＴＡ）と５０×cOmplete（cOmplete［EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001］タブレット１つを、１ｍＬの超純水で溶解して調製したもの）を添加し、撹拌後、氷上に３０分間静置した。遠心分離後、上清を回収し、ＰＢＳ（－）で希釈した後、プロテインＬ固相化ビーズ（Thermo Fischer Scientific社製）を添加し、４℃で撹拌しながら一晩反応させた。上記磁気ビーズ添加腫瘍上清液を磁気スタンドに立てた新しい２．０ｍＬチューブに移し、反応後のプロテインＬ固相化ビーズを吸着させた。磁気ビーズが磁気により壁面に吸着した後、上清を除去し、同じ２．０ｍＬチューブに１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳ（Tris Buffered Saline）を添加し、ボルテックスミキサーにより磁気ビーズを懸濁させ、２．０ｍＬチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させた後に、洗浄液を除去することで磁気ビーズを洗浄した。同様の洗浄操作をさらに１％Ｔｗｅｅｎ２０を含むＴＢＳで１回、ＴＢＳで２回行った。最後の洗浄後、洗浄液を除去した後、吸着した磁気ビーズを１５．９μＬの０．１Ｍのグリシン－塩酸液（ｐＨ２．０）に懸濁し、室温にて１０分間静置して、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを溶出させた。２．０ｍＬチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させ、上清を新しい１．５ｍＬチューブに回収した後１．５９μＬの１ＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ（ｐＨ９．０）で中和し、以下の「１１－４」の項目に記載のＥＬＩＳＡ法に用いた。
１１－４　ＥＬＩＳＡ法
　２．５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質（Acro Biosystems社製）含有液を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、ＰＢＳ-Ｔにて洗浄後、ブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）で２５℃にて２時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、ＰＢＳ-Ｔにて洗浄後、上記「１１－３」で調製した腫瘍サンプルと、後述する実施例１３においてＤＵＰ－１５３株の培養上清から精製した検量線作成用標準ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を１６ｎｇ/ｍＬ～０．０１５６２５ｎｇ/ｍＬに段階希釈したものとを、それぞれ、２５℃で２時間インキュベートした。その後、各ウェルを、ＰＢＳ-Ｔにて洗浄し、組換えビオチン化プロテインＬ（Thermo Fischer Scientific社製）の存在下、２５℃で１時間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ-Ｔにて洗浄後、VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）の存在下、２５℃で３０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ-Ｔにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）の存在下、室温で２０分間発色させ、Stop Solution（２Ｎの硫酸）（R&D Systems社製）にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT（Gen5 2.04）（ＤＳファーマバイオメディカル社製）にて、ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度と、陰性対照の５７０ｎｍの吸光度を測定し、検量線作成用標準ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを基に検量線を作成後、腫瘍ミンス中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度を定量した（表８中の「腫瘍ミンス中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度」参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
 表中の「ＮＤ」は、検出感度以下であることを示す。
（結果）
　まず、ＢＥシャトル株群及びＤＵＭ－１２６Ｈ株群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体（それぞれ、ＢＥシャトル株及びＤＵＭ－１２６Ｈ株）の生菌数が含まれることや、ＤＵＭ－１２６Ｈ株がＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現・分泌することを確認した（表８参照）。
　次に、当該腫瘍ミンスを移植した各群の腫瘍体積を解析した結果、ＢＥシャトル株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のＰＢＳ群マウスの腫瘍体積とほとんどかわらなかったのに対して、ＤＵＭ－１２６Ｈ株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のＰＢＳ群マウスの腫瘍体積と比べ、有意に減少し、例えば、腫瘍ミンス移植後１７日目において、ＰＢＳ群に対する腫瘍増殖抑制率［ＴＧＩ］は４９．５％であった（図１７参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、抗腫瘍効果があることを示している。
［実施例１２］ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）の作製
　実施例１及び実施例５で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［１２－１］～［１２－４］の項目に記載の方法に従って作製した。
１２－１　プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａの作製
　実施例１で作製したプラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５（図６参照）において、Ｈｕプロモーター（ＰＨｕ）をＨｕ－ｓプロモーター（ＰＨｕ－ｓ；ＰＨｕの３’側の１４３ヌクレオチド残基からなる断片）（国際公開第２０１８／０６２２２５号公報におけるＨｕ１に相当）へ変更し、Ｐ３０プロモーターに代えてＬＨ３１ポリペプチド２を翻訳するためのリボソーム結合領域（ＲＢＳ１［具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株由来のＨｕｐ遺伝子の翻訳開始コドンの上流５２ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド］）を挿入するとともに、大腸菌複製起点ｐＵＣｏｒｉが除去されたプラスミドであって、Ｎ末端にＳＰ５０－Ｌ５に代えてＳＰ５０－Ｌ２が付加され、抗ヒトＣＤ３抗体ＶＬのKabat番号３８番目のグルタミン（すなわち、配列番号５の３８番目のグルタミン［Ｑ］）がグルタミン酸（Ｅ）へ置換されるとともに、抗ヒトＥＧＦＲ抗体ＶＨのKabat番号３９番目のＱ（すなわち、配列番号５の１５３番目のＱ）がＥへ置換されたＬＨ３１ポリペプチド１（以下、「変異ＬＨ３１ポリペプチド１」ということがある）と；Ｎ末端にＰ５０－Ｌ５に代えてＳＰ５２－Ｌ５が付加され、抗ヒトＥＧＦＲ抗体ＶＬのKabat番号３８番目のＱ（すなわち、配列番号６の３８番目のＱ）がリジン（Ｋ）へ置換されるとともに、抗ヒトＣＤ３抗体ＶＨのKabat番号３９番目のＱ（すなわち、配列番号６の１５３番目のＱ）がＫへ置換されたＬＨ３１ポリペプチド２（以下、「変異ＬＨ３１ポリペプチド２」ということがある）と；を発現するプラスミド（プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａ）（図２６参照）を、実施例１と同様の方法を用い、図１８～図２６に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａは、ＲＢＳ１を挿入したことにより、変異ＬＨ３１ポリペプチド１及び変異ＬＨ３１ポリペプチド２をポリシストロニック（polycistronic）に発現し、変異ＬＨ３１ポリペプチド１及び変異ＬＨ３１ポリペプチド２から構成されるＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（以下、「変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある）を分泌することができる。ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
１２－２　ＤＵＰ－１４３株の作製
　プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株への形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＤＵＰ－１４３株）を取得した。
１２－３　プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａの作製
　実施例１で作製したプラスミドｐＬＨ３１－Ｌ５（図６参照）において、Ｈｕプロモーター（ＰＨｕ）をＨｕ－ｓプロモーターへ変更し、Ｐ３０プロモーターに代えてＬＨ３１ポリペプチド２を翻訳するためのリボソーム結合領域（ＲＢＳ２［具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株由来の30S ribosomal protein S16遺伝子の翻訳開始コドンの上流５４ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド］）を挿入するとともに、大腸菌複製起点ｐＵＣｏｒｉが除去されたプラスミドであって、Ｎ末端にＳＰ５０－Ｌ５に代えてＳＰ５０－Ｌ２が付加された変異ＬＨ３１ポリペプチド１と、Ｎ末端にＳＰ５０－Ｌ５に代えてＳＰ５２－Ｌ２が付加された変異ＬＨ３１ポリペプチド２とを発現するプラスミド（プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａ）（図３１参照）を、実施例１と同様の方法を用い、図２７～図３１に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａは、ＲＢＳ２を挿入したことにより、変異ＬＨ３１ポリペプチド１及び変異ＬＨ３１ポリペプチド２をポリシストロニックし、変異ＬＨ３１ポリペプチド１及び変異ＬＨ３１ポリペプチド２から構成されるＥＧＦＲ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を、分泌することができる。ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
１２－４　ＤＵＰ－１５３株の作製
　プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株への形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＤＵＰ－１５３株）を取得した。
［実施例１３］ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＣＤ３への結合性評価
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが、ヒトＥＧＦＲとヒトＣＤ３の両方に特異的に結合することを、以下の［１３－１］及び［１３－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
１３－１　ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株の培養上清から、実施例７の「７－１」の項目に記載の方法に従って精製した。
１３－２　ＥＬＩＳＡ法
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いたＥＬＩＳＡ法は、実施例７の「７－２」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例２１において精製した、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いた。
（結果）
　吸光度の補正値は、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図１５の「ＤＵＰ－１４３」及び「ＤＵＰ－１５３」参照）。一方、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった（図１５の「ＣＵＭ３６－１Ｈ」参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、ヒトＣＤ３及びヒトＥＧＦＲの両方に特異的に結合することを示している。
［実施例１４］ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ量
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ量を、実施例８に記載の方法に従って測定した。
（結果）
　ＤＵＰ－１４３株の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）の濃度は、７０２±６３（ｎｇ／ｍＬ）であり、ＤＵＰ－１５３株の培養上清中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）の濃度は、６３４±４６（ｎｇ／ｍＬ）であることが確認された。
［実施例１５］ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株由来の変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂにおける変異ＬＨ３１ポリペプチド１と、変異ＬＨ３１ポリペプチド２との比率
　ポリシストロニックに発現するプラスミドであるｐ１４３ＴＬＢ６ａ及びｐ１５３ＴＬＢ６ａが、変異ＬＨ３１ポリペプチド１と、変異ＬＨ３１ポリペプチド２を同程度発現するものであるか確認した。
　上記実施例１４で調製したＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株の培養上清約５０ｍＬに硫酸アンモニウムを８０％飽和になるよう添加し、４℃にて一晩撹拌し、塩析を行った。その後、遠心分離し、沈殿を回収し、ＰＢＳ（－）１ｍＬにて溶解した後、スペクトラ／ポア２透析膜（分画分子量；１２～１４ｋＤ）（SPECTRUM社製）に移し、ＰＢＳ（－）中で４℃にて一晩透析を行った。途中で透析バッファーを交換し、透析後のタンパク溶液を限外ろ過デバイス（アミコンウルトラ－０．５、公称分画分子量；１０ＫＤａ）（メルク社製）に移し、１／５容量に濃縮し、タンパク濃縮液を調製した（ｎ＝３）。タンパク濃縮液８０μＬにサンプルローディングバッファー２０μＬを混合し、９５℃にて３分間熱処理を行い、電気泳動用サンプル（ｎ＝３）を調製した。かかる電気泳動用サンプルを、ミニプロティアン（登録商標）ＴＧＸゲル（４～２０％）（バイオラッド社製）にて電気泳動し、染色液（Oriole蛍光ゲルステイン）（バイオラッド社製）にて染色した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
 表中の値は、図３２のバンド１及びバンド２の強度を示す。
（結果）
　ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株にいずれにおいても、変異ＬＨ３１ポリペプチド１に由来するバンド強度と、変異ＬＨ３１ポリペプチド２に由来するバンド強度とは、同程度であった（図３２及び表９参照）。この結果は、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株由来の変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂにおける変異ＬＨ３１ポリペプチド１と、変異ＬＨ３１ポリペプチド２とは、ほぼ同じ割合で発現することを示している。
［実施例１６］ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株の培養上清の細胞傷害性活性
　ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清のそれぞれについて、１０３倍～１０６倍希釈したものを調製し、実施例１０に記載の方法に従って、細胞傷害性活性を解析した。なお、癌細胞として、ＨＣＴ１１６細胞に加えて、ヒト胆管癌細胞株であるＴＦＫ－１細胞（東北大学加齢医学研究所　医用細胞資源センター・細胞バンク）と、ヒト結腸癌細胞株であるＲＫＯ細胞（ＡＴＣＣ［American Type Culture. Collection］より入手）を用いた。
（結果）
　ＢＥシャトル株の培養上清を１０３倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、７８．０％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０３倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、それぞれ、１．２％及び５．４％であった（図３３Ａ参照）。また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０４倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、８３．４％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０４倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、それぞれ、６０．７％及び６７．０％であった（図３３Ａ参照）。
　また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０３倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、６９．２％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０３倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、それぞれ、１９．９％及び２４．４％であった（図３３Ｂ参照）。また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０４倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、７９．０％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０４倍希釈したものを用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、それぞれ、７１．３％及び７４．３％であった（図３３Ｂ参照）。
　また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０３倍希釈したものを用いた場合、ＲＫＯ細胞の生存率は、８７．９％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０３倍希釈したものを用いた場合、ＲＫＯ細胞の生存率は、それぞれ、４８．５％及び５６．３％であった（図３３Ｃ参照）。また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０４倍希釈したものを用いた場合、ＲＫＯ細胞の生存率は、８９．７％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株の培養上清及びＤＵＰ－１５３株の培養上清を、それぞれ１０４倍希釈したものを用いた場合、ＲＫＯ細胞の生存率は、それぞれ、８２．６％及び９５．０％であった（図３３Ｃ参照）。
　これらの結果は、ＤＵＰ－１４３株培養上清や、ＤＵＰ－１５３株培養上清中に分泌した変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂは、ＨＣＴ１１６細胞、ＴＦＫ－１細胞、ＲＫＯ細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
　また、ＤＵＰ－１４３株（すなわち、プラスミドｐ１４３ＴＬＢ６ａを保持するＢ菌株）培養上清や、ＤＵＰ－１５３株（すなわち、プラスミドｐ１５３ＴＬＢ６ａを保持するＢ菌株）培養上清を用いた場合、ＨＣＴ１１６細胞の生存率を低下させる効果（２９％及び３５％）は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株（すなわち、プラスミドｐ１２６を保持するＢ菌株）培養上清を用いた場合の当該効果（８３％）（実施例１０参照）よりも上昇したことから、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂにおいて、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬにおけるKabat番号３８番目のＱをＥへ置換し、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＨにおけるKabat番号３９番目のＱをＥへ置換し、抗ヒトＥＧＦＲ抗体由来のＶＬにおけるKabat番号３８番目のＱをＫへ置換するとともに、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨにおけるKabat番号３９番目のＱをＫへ置換すると、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂによる癌細胞傷害活性が上昇する可能性があることを示している。
［実施例１７］、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株の培養上清より精製したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性評価
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株）が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを、実施例７の「７－１」の項目に記載の方法に従って精製し、１００ｆＭ～１００ｐＭの濃度に段階希釈した後、実施例４に記載の方法に従ってＨＣＴ１１６細胞の生存率を解析した。
（結果）
　ＨＣＴ１１６細胞の生存率は、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に低下し、ＥＣ５０値は、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの場合、１．８±０．９ｐＭであり、ＤＵＰ－１５３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの場合、１．８±１．１ｐＭであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
　また、ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株から精製した変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いた場合のＥＣ５０値（１．８ｐＭ）は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株から精製したＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いた場合のＥＣ５０値（８．４ｐＭ）（実施例９参照）よりも約２１％まで低下していた。この結果は、ＤＵＰ－１４３株やＤＵＰ－１５３株が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）方が、ＤＵＭ－１２６Ｈ株が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）よりも癌細胞に対する細胞傷害性活性が高いことを示しており、実施例１６の結果を支持している。
［実施例１８］ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株を含むミンス移植法によるインビボでの薬効
　ＤＵＰ－１４３株及びＤＵＰ－１５３株が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞の担癌Ｓｃｉｄマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の方法に従って解析した。
　ＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ（Equitech-Bio社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地で培養した後、９週齢のメスのＳｃｉｄマウスに皮下移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが２６３．８３～４７６．７０ｍｍ３の担癌マウスをＢＥシャトル株投与群（１２匹）、ＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群（１２匹）、ＤＵＰ－１４３株投与群（１２匹）、及びＤＵＰ－１５３株投与群（１２匹）の４群に分けた（腫瘍ミンス移植５日前）。その後、１日目（腫瘍ミンス移植４日前）及び２日目（腫瘍ミンス移植３日前）のそれぞれに、ＢＥシャトル株投与群には５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＢＥシャトル株の凍結製剤を尾静脈内投与し、ＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群には、５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＤＵＭ－１２６Ｈ株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与し、ＤＵＰ－１４３株投与群には、５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＤＵＰ－１４３株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与し、ＤＵＰ－１５３株投与群には、５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＤＵＰ－１５３株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与した。４群に分けてから１～４日後（腫瘍ミンス移植４日前～１日前）に、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で腹腔内投与し、４日後（腫瘍ミンス移植１日前）にＰＢＳ（－）で１０倍に希釈した抗アシアロＧＭ１抗体０．２ｍＬを腹腔内に投与した。なお、その後皮下移植するＳｃｉｄマウスに対しても同様に、抗アシアロＧＭ１抗体を腹腔内に投与した。４群に分けてから５日後（腫瘍ミンス移植後０日目）に、各群（ＢＥシャトル株投与群、ＤＵＭ－１２６Ｈ株投与群、ＤＵＰ－１４３株投与群、及びＤＵＰ－１５３株投与群）のマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍をプールしてミンスをMatrigel（Corning社製）とＨＢＳＳ（Life technologies社製）の１：１混合液で１．３３倍に希釈し、培養したＴ－ＬＡＫを０．３７５×１０８ｃｅｌｌｓ／ｍＬとなるように混合し、Teceleukin（塩野義製薬社製)を５０００Ｕ／ｍＬとなるように添加してミンス移植液を調製した。新たな７週齢のメスのＳｃｉｄマウスに０．２ｍＬのミンス移植液を皮下移植し、それぞれ、ＢＥシャトル株群、ＤＵＭ－１２６Ｈ株群、ＤＵＰ－１４３株群、及びＤＵＰ－１５３株群（各群１２匹）とした。なお、腫瘍ミンスを調製する前の腫瘍、又は移植腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体（ＢＥシャトル株、ＤＵＭ－１２６Ｈ株、ＤＵＰ－１４３株、及びＤＵＰ－１５３株）の生菌数は、上記「１１－２」の項目に記載の方法に従って測定し（それぞれ、表１０中の「腫瘍内の生菌数」及び「移植腫瘍ミンス中の生菌数」参照）、腫瘍ミンスに含まれるＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度は、上記「１１－３」及び「１１－４」の項目に記載の方法に従って測定した（表１０中の「腫瘍ミンス中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度」参照）。腫瘍ミンス移植後０日目～４日目、７日目～１１日目、及び１４日目～１６日目に、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で腹腔内投与し、腫瘍ミンス移植後７日目、１１日目、１４日目、及び１７日目に、各群マウスにおける腫瘍径を測定し、腫瘍体積を、式「腫瘍体積＝長径×短径２/２」基に算出した（図３４参照）。腫瘍増殖抑制率［ＴＧＩ］を、式「ＴＧＩ＝［１－腫瘍ミンス移植後１７日の平均腫瘍体積（各ダイアボディ型ＢｓＡｂ分泌ビフィズス菌株群）/腫瘍ミンス移植後１７日の平均腫瘍体積（ＢＥシャトル株群）］×１００」を基に算出した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
 表中の「ＮＤ」は、検出感度以下であることを示す。
（結果）
　まず、各群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体（ＢＥシャトル株、ＤＵＭ－１２６Ｈ株、ＤＵＰ－１４３株、及びＤＵＰ－１５３株）の生菌数が含まれることや、陰性対照以外の３種類のビフィズス菌形質転換体（ＤＵＭ－１２６Ｈ株、ＤＵＰ－１４３株、及びＤＵＰ－１５３株）が、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂや変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現・分泌することを確認した（表１０参照）。
　次に、当該腫瘍ミンスを移植した各群の腫瘍体積を解析した結果、ＤＵＰ－１４３株群マウスの腫瘍体積や、ＤＵＰ－１５３株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のＢＥシャトル株群マウスの腫瘍体積と比べ、有意に減少した（図３４参照）。また、腫瘍ミンス中に含まれるＤＵＰ－１４３株やＤＵＰ－１５３株のダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株のダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度よりも少なかったにもかかわらず（表１０参照）、腫瘍体積の減少効果は、ＤＵＭ－１２６Ｈ株を用いた場合よりも、ＤＵＰ－１４３株やＤＵＰ－１５３株を用いた場合の方が大きかった（図３４参照）。具体的には、腫瘍ミンス移植後１７日目において、ＢＥシャトル株群に対するＴＧＩは、ＤＵＭ－１２６Ｈ株群では４３．１％であったのに対して、ＤＵＰ－１４３株群では６０．６％、ＤＵＰ－１５３株では６１．５％と高かった。この結果は、ＤＵＰ－１４３株やＤＵＰ－１５３株が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）方が、ＤＵＭ－１２６Ｈ株が発現・分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）よりも抗腫瘍効果が高いことを示しており、実施例１６及び１７の結果を支持している。
［実施例１９］ＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）の作製
　ＨＥＲ２×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［１９－１］及び［１９－２］の項目に記載の方法に従って作製した。
１９－１　プラスミドｐＬＨ３６－１及びｐＬＨ３６－２の作製
　ＨＥＲ２×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（具体的には、配列番号１４のアミノ酸配列からなるＬＨ３６ポリペプチド１［表１１参照］と、配列番号１５のアミノ酸配列からなるＬＨ３６ポリペプチド２［表１２参照］とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ［以下、「ＬＨ３６ダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある］）を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号１６のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ３６ポリペプチド１のコード配列を含むＤＮＡ（図３５Ａ参照）と、配列番号１７のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ３６ポリペプチド２のコード配列を含むＤＮＡ（図３５Ｂ参照）を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図３６～４０に示す手順に従って、プラスミドｐＬＨ３６－１（図３９参照）及びｐＬＨ３６－２（図４０参照）を作製した。プラスミドｐＬＨ３６－１は、より具体的には、ＳＰ５０－Ｌ５（配列番号１０のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ３６ポリペプチド１と、ＳＰ５０－Ｌ２（配列番号１３のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ３６ポリペプチド２とを発現するプラスミドである（図３９参照）。また、プラスミドｐＬＨ３６－２は、より具体的には、ＳＰ５０－Ｌ５（配列番号１０のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ３６ポリペプチド１と、ＳＰ５２－Ｌ２（すなわち、分泌シグナルペプチドＳＰ５２［配列番号１８の１～３５番目のアミノ酸残基］とＬ２リンカーペプチド［配列番号１８の３６～３７番目のアミノ酸残基］との連結ペプチド）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ３６ポリペプチド２とを発現するプラスミドである（図４０参照）。なお、ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
 表中の四角で囲った部分は、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ＨＥＲ２抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
１９－２　ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株の作製
　プラスミドｐＬＨ３６－１及びｐＬＨ３６－２を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株への形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐＬＨ３６－１を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株）と、プラスミドｐＬＨ３６－２を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＣＵＭ－３６－２Ｈ株）を取得した。
［実施例２０］ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株の発現・分泌評価（ＷＢ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）が、ＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、実施例２に記載の方法に従って、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
（結果）
　ＣＵＭ－３６－１Ｈ株培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株培養上清中に、ＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂに由来する３０ｋＤａ付近のバンドが認められた（図４１参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）は、ＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３６ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現し分泌することを示している。
［実施例２１］ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＨＥＲ２及びヒトＣＤ３への結合性評価
　ビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）が分泌するＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが、ＨＥＲ２及びヒトＣＤ３の両方に特異的に結合することを、以下の［２１－１］及び［２１－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
２１－１　ＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株）が分泌するＬＨ３６ダイアボディ型ＢｓＡｂを、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株の培養上清から、実施例３の「３－１」の項目に記載の方法に従って精製した。
２１－２　ＥＬＩＳＡ法
２１－２－１　抗原・抗体反応処理
　抗体（ＬＨ３６ダイアボディ型ＢｓＡｂ）と、抗原（固相化したヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質）の反応処理は、実施例３の「３－２－１」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、実施例３において精製した、３種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを用いた。
２１－２－２　抗体の検出
　０．１μｇ／ｍＬの組換えビオチン化ＨＥＲ２（Acro Biosystems社製）を含むシグナ
ル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で３０分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度（陰性対照）で補正した値（平均値±標準偏差、図４２の縦軸参照）を算出した。
（結果）
　吸光度の補正値は、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株由来のＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（それぞれ、図４２の「ＣＵＭ－３６－１Ｈ」及び「ＣＵＭ－３６－２Ｈ」参照）。一方、３種類のビフィズス菌形質転換体（ＦＬＭ－９Ｈ株、ＦＯＭ－２２Ｈ株、及びＤＵＭ－３１Ｈ株）由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった（図４２の「ＦＬＭ－９Ｈ」、「ＦＯＭ－２２Ｈ」、及び「ＤＵＭ－３１Ｈ」参照）。この結果は、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株が発現・分泌するＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３６ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、ヒトＣＤ３及びＨＥＲ２の両方に特異的に結合することを示している。
［実施例２２］ＣＵＭ－３６－１Ｈ株培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株培養上清の細胞傷害性活性
　ＣＵＭ－３６－１Ｈ株培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株培養上清のそれぞれについて、１０倍～１０４倍希釈したものを調製し、実施例１０に記載の方法に従って、ＴＦＫ－１細胞に対する細胞傷害性活性を解析した。
（結果）
　ＢＥシャトル株の培養上清を１０倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、９５．０％であったのに対して、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株の培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株の培養上清を、それぞれ１０倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、それぞれ、３．１％及び４．７％であった（図４３参照）。また、ＢＥシャトル株の培養上清を１０２倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、１０７．２％であったのに対して、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株の培養上清及びＣＵＭ－３６－２Ｈ株の培養上清を、それぞれ１０２倍希釈したものを用いた場合、ＴＦＫ－１細胞の生存率は、それぞれ、２６．２％及び１８．３％であった（図４３参照）。この結果は、ＣＵＭ－３６－１Ｈ株の培養上清や、ＣＵＭ－３６－２Ｈ株の培養上清中に分泌したＨＥＲ２×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、ＴＦＫ－１細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
［実施例２３］ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＥＵＭ－Ｈ株）の作製
　ヒトＥｐＣＡＭ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［２３－１］及び［２３－２］の項目に記載の方法に従って作製した。
２３－１　プラスミドｐＥＵＭ－Ｈの作製
　ヒトＥｐＣＡＭ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（具体的には、配列番号８２のアミノ酸配列からなるＥＵＭ－Ｈポリペプチド１［表１３参照］と、配列番号８３のアミノ酸配列からなるＥＵＭ－Ｈポリペプチド２［表１４参照］とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ［以下、「ＥＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある］）を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号８４のヌクレオチド配列からなる、ＥＵＭ－Ｈポリペプチド１のコード配列を含むＤＮＡ（図４４参照）と、配列番号８５のヌクレオチド配列からなる、ＥＵＭ－Ｈポリペプチド２のコード配列を含むＤＮＡ（図４５参照）を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図４４～４６に示す手順に従って、プラスミドｐＥＵＭ－Ｈ（図４６参照）を作製した。プラスミドｐＥＵＭ－Ｈは、より具体的には、ＳＰ５０－Ｌ２（配列番号１３のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＥＵＭ－Ｈポリペプチド１と、ＳＰ５２－Ｌ２（すなわち、分泌シグナルペプチドＳＰ５２［配列番号１８の１～３５番目のアミノ酸残基］とＬ２リンカーペプチド［配列番号１８の３６～３７番目のアミノ酸残基］との連結ペプチド）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＥＵＭ－Ｈポリペプチド２を発現するプラスミドである（図４６参照）。なお、ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＥｐＣＡＭ抗体由来のＶＬを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
２３－２　ＥＵＭ－Ｈ株の作製
　プラスミドｐＥＵＭ－Ｈを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株への形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐＥＵＭ－Ｈを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＥＵＭ－Ｈ株）を取得した。
［実施例２４］ＥＵＭ－Ｈ株の発現・分泌評価（ＷＢ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）が、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、実施例２に記載の方法に従って、ＥＵＭ－Ｈ株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
（結果）
　ＥＵＭ－Ｈ株培養上清中に、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂに由来する３０ｋＤａ付近のバンドが認められた（図４７参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）は、ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＥＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現し分泌することを示している。
［実施例２５］ＥＵＭ－Ｈ株由来のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのヒトＥｐＣＡＭ及びヒトＣＤ３への結合性評価
　ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）が分泌するＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが、ヒトＥｐＣＡＭ及びヒトＣＤ３の両方に特異的に結合することを、以下の［２５－１］及び［２５－２］の項目に記載の方法に従って確認した。
２５－１　ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）が分泌するＥＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂを、ＥＵＭ－Ｈ株の培養上清から、実施例３の「３－１」の項目に記載の方法に従って精製した。
２５－２　ＥＬＩＳＡ法
２５－２－１　抗原・抗体反応処理
　２．５μｇ／ｍＬのヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質（AcroBiosystems社製）含有液を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。その後、蒸留水にて５倍に希釈したブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）を２００μＬ分注し、２５℃で２時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。１００（ｎｇ／ｍＬ）、又は１０００（ｎｇ／ｍＬ）のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂと、陰性対照として１００（ｎｇ／ｍＬ）、又は１０００（ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂとを、それぞれ１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ａ液（ナカライテスク社製）にて５０倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で２時間静置することにより、抗体（ＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ）と、抗原（固相化したヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質）の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。
２５－２－２　抗体の検出
　０．１μｇ／ｍＬの組換えビオチン化ＥｐＣＡＭ（Acro Biosystems社製）を含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で１時間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度（陰性対照）で補正した値（平均値±標準偏差、図４８の縦軸参照）を算出した。
（結果）
　吸光度の補正値は、ＥＵＭ－Ｈ株由来のＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図４８の「ＥＵＭ－Ｈ」参照）。一方、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった（図４８の「ＤＵＰ－１４３」参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＥＵＭ－Ｈ株）が分泌するＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、ヒトＣＤ３及びＥｐＣＡＭの両方に特異的に結合することを示している。
［実施例２６］ＥＵＭ－Ｈ株培養上清より精製したダイアボディの細胞傷害性活性
　方法は実施例４と同様である。ただし、細胞に添加するダイアボディとして、ＥＵＭ－Ｈ株培養上清より精製したダイアボディを、１００ｆＭから１ｎＭの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図４９に示した。
（結果）
　図４９に示すとおり、ＥＵＭ－Ｈ株培養上清より精製したダイアボディは、ＥｐＣＡＭ陽性であるヒト結腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞に対して細胞傷害活性を示し、ＥＣ５０値は１７．３ｐＭであった。この結果は、ＥＵＭ－Ｈ株の培養上清中に分泌したＥｐＣＡＭ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、ＨＣＴ１１６細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
［実施例２７］ＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株）の作製
　ヒトＰＳＭＡ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［２７－１］及び［２７－２］の項目に記載の方法に従って作製した。
２７－１　プラスミドｐＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ及びｐＨＬ－ＰＵＭ－Ｈの作製
　ヒトＰＳＭＡ×ヒトＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（具体的には、配列番号８６のアミノ酸配列からなるＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１［表１５参照］と、配列番号８７のアミノ酸配列からなるＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２［表１６参照］とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ［以下、「ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある］を発現・分泌するビフィズス菌や、配列番号８８のアミノ酸配列からなるＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１［表１７参照］と、配列番号８９のアミノ酸配列からなるＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２［表１８参照］とから構成されるダイアボディ型ＢｓＡｂ［以下、「ＨＬ－ＰＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ」ということがある］）を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号９０のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１のコード配列を含むＤＮＡ（図５０参照）と、配列番号９１のヌクレオチド配列からなる、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２のコード配列を含むＤＮＡ（図５１参照）や、配列番号９２のヌクレオチド配列からなる、ＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１のコード配列を含むＤＮＡ（図５２参照）と、配列番号９３のヌクレオチド配列からなる、ＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２のコード配列を含むＤＮＡ（図５３参照）を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図５０～５５に示す手順に従って、プラスミドｐＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ（図５４参照）及びｐＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ（図５５参照）を作製した。プラスミドｐＬＨ－ＰＵＭ－Ｈは、より具体的には、ＳＰ５０－Ｌ２（配列番号１３のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１と、ＳＰ５２－Ｌ２（すなわち、分泌シグナルペプチドＳＰ５２［配列番号１８の１～３５番目のアミノ酸残基］とＬ２リンカーペプチド［配列番号１８の３６～３７番目のアミノ酸残基］との連結ペプチド）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＬＨ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２を発現するプラスミドである（図５４参照）。プラスミドｐＨＬ－ＰＵＭ－Ｈは、より具体的には、ＳＰ５０－Ｌ２（配列番号１３のアミノ酸配列）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド１と、ＳＰ５２－Ｌ２（すなわち、分泌シグナルペプチドＳＰ５２［配列番号１８の１～３５番目のアミノ酸残基］とＬ２リンカーペプチド［配列番号１８の３６～３７番目のアミノ酸残基］との連結ペプチド）及びｃ－Ｍｙｃ－Ｈｉｓ融合タグ（配列番号１１のアミノ酸配列）が、それぞれＮ末端側及びＣ末端側に付加されたＨＬ－ＰＵＭ－Ｈポリペプチド２を発現するプラスミドである（図５５参照）。なお、ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＬを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、両者の間のペプチド（ＡＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
 表中の四角で囲った部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＨを示し、２重四角で囲った部分は、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＬを示し、両者の間のペプチド（ＡＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
 表中の下線で示す部分は、抗ヒトＰＳＭＡ抗体由来のＶＨを示し、２重下線で示す部分は、抗ヒトＣＤ３抗体由来のＶＬを示し、両者の間のペプチド（ＡＡＧＧＧＧＳ）は、リンカーペプチドを示す。
２７－２　ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株の作製
　プラスミドｐＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ及びｐＨＬ－ＰＵＭ－Ｈを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株の形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ及びｐＨＬ－ＰＵＭ－Ｈを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株）を取得した。
［実施例２８］ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株の発現・分泌評価（ＷＢ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株）が、ＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、実施例２に記載の方法に従って、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
（結果）
　ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株培養上清中に、ＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂに由来する３０ｋＤａ付近のバンドが認められた（図５６参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株）は、ＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈダイアボディ型ＢｓＡｂ）を発現し分泌することを示している。
［実施例２９］ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株培養上清より精製したダイアボディの細胞傷害性活性
　方法は実施例４と同様である。ただし、細胞はヒトＰＳＭＡ陽性である２２Ｒｖ１細胞を用い、細胞に添加するダイアボディとして、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株の培養上清より精製したダイアボディ（実施例３の「３－１」と同様の方法にて精製）を、１ｐＭから１００ｎＭの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図５７に示した。
（結果）
　図５７に示すとおり、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株の培養上清より精製したダイアボディは、ＰＳＭＡ陽性であるヒト前立腺癌細胞株である２２Ｒｖ１細胞に対して細胞傷害活性を示し、ＥＣ５０値はそれぞれ１５５．０ｐＭ及び２３２．６ｐＭであった。この結果は、ＬＨ－ＰＵＭ－Ｈ株及びＨＬ－ＰＵＭ－Ｈ株の培養上清中に分泌したＰＳＭＡ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、２２Ｒｖ１細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
［実施例３０］ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのヒトＨＥＲ３への結合性評価
３０－１　ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、実施例７の「７－１」と同様の方法で精製した。
３０－２　ＥＬＩＳＡ法
３０－２－１　抗原・抗体反応処理
　１．０μｇ／ｍＬのヒトＨＥＲ３組換えタンパク質（Sino Biological社製）含有液を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。その後、蒸留水（大塚製薬社製）にて５倍に希釈したブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）を２００μＬ分注し、２５℃で２時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔで３回洗浄した。０（ｎｇ／ｍＬ）、０．１（ｎｇ／ｍＬ）、１（ｎｇ／ｍＬ）、１０（ｎｇ／ｍＬ）、又は１００（ｎｇ／ｍＬ）のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを含む液を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ａ液（ナカライテスク社製）にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに２５μＬずつ分注した。２５℃で２時間静置することにより、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂと、固相化したヒトＨＥＲ３組換えタンパク質の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。
３０－２－２　抗体の検出
　組換えビオチン化プロテインＬ（Thermo Fischer Scientific社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）にて０．０５μｇ／ｍＬに調製し、２５μＬを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、２５℃で１時間静置した。各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）を、１％ＢＳＡを含むシグナル増強剤ＨＩＫＡＲＩ Ｂ液（ナカライテスク社製）を用いて４．０μＬ／ｍＬに調整した後、各ウェルに２５μＬずつ分注し、２５℃で３０分静置した。その後、各ウェルの液を除去し、２００μＬのＰＢＳ－Ｔにて３回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに５０μＬずつ分注し、遮光して室温で２０分間静置した。その後、Stop Solution（R&D Systems社製）を２５μＬずつ添加し、呈色反応を停止した。ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度を測定し、５７０ｎｍの吸光度（陰性対照）で補正した値（平均値±標準偏差）を算出した（図５８参照）。
（結果）
　吸光度の補正値は、ＤＵＭ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図５８参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（すなわち、ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）は、ヒトＥＧＦＲに加えて、ヒトＨＥＲ３に対しても特異的に結合することを示している。
［実施例３１］ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性評価
　ＥＧＦＲの発現量やＨＥＲ３の発現量が異なる癌細胞株、具体的には、１種類のヒト類表皮癌細胞株（Ａ－４３１）、１種類のヒト非小細胞肺癌細胞株（ＮＣＩ－Ｈ１９７５）、及び４種類のヒト結腸癌細胞株（ＨＣＴ１１６、ＨＴ－２９、ＲＫＯ、及びＳＷ６２０）の計６種類の癌細胞株を用いて、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性を評価した。
３１－１　各種癌細胞株におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の発現量の測定
　上記６種類の癌細胞株におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の発現量は、それぞれ、抗ヒトＥＧＦＲ抗体（clone AY13）（BioLegend社製）及び抗ヒトｅｒｂＢ３／ＨＥＲ３抗体（clone 1B4C3）（BioLegend社製）と、ＱＩＦＩＫＩＴ（Agilent Technologies社製）とを用い、かかるキットに添付されたプロトロールに従って定量した。測定はＢＤ　ＦＡＣＳＣａｎｔｏＩＩを用い、解析にはフローサイトメトリー解析ソフトウェア（Kaluza Ver2.1）（BECKMAN COULTER社製）を用いた。
３１－２　細胞傷害活性の測定法
　上記１種類のヒト類表皮癌細胞株及び４種類のヒト結腸癌細胞株を、それぞれ１×１０４ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種するとともに、上記１種類のヒト非小細胞肺癌細胞株を、５×１０３ｃｅｌｌｓ／ウェルとなるように９６ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞として３ドナーから分離したヒトＰＢＭＣ（図５９－１及び図５９－２中の「ＰＢＭＣ＃４」、「ＰＢＭＣ＃６」、及び「ＰＢＭＣ＃７」）を、各種癌細胞株との比率が２０：１となるように混合した後、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを、Ａ－４３１、ＨＣＴ１１６、ＨＴ－２９、及びＳＷ６２０に対しては、３０ｆＭから３０ｐＭの濃度に段階希釈したものをそれぞれに添加し（図５９－１及び図５９－２の横軸）、ＮＣＩ－Ｈ１９７５及びＲＫＯに対しては、１ｐＭから１ｎＭの濃度に段階希釈したものを添加し（図５９－１及び図５９－２の横軸）、培地量が計２００μＬとなるようにした。その後、３７℃、５％ＣＯ２に設定した培養器にて培養を行い、７２時間後、ウェルをＲＰＭＩ－１６４０培地にて３度洗浄を行い、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay（Promega社製）試薬を含むＲＰＭＩ－１６４０培地を、各ウェルに１２０μＬずつ添加した。測定は４９０ｎｍの吸光度を測定し、対照波長として６６０ｎｍの吸光度を測定した。細胞傷害活性は、癌細胞株のみのウェルにおける細胞傷害活性を０％、ブランクのウェルにおける細胞傷害活性を１００％として算出した（ｎ＝３ウェル）。試験は２回実施した。
　（結果）
　各癌細胞株におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の発現量を、以下の表１９に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
（結果）
　上記６種類の癌細胞株のすべてについて、ＥＧＦＲ及びＨＥＲ３のいずれか一方、又は両方の発現が認められたが、ヒト類表皮癌細胞株（Ａ－４３１）におけるＥＧＦＲ及びＨＥＲ３の発現量が、最も高く、それぞれ７０３８５８（ｓｉｔｅ/ｃｅｌｌｓ）及び８６２２（ｓｉｔｅ/ｃｅｌｌｓ）であった（表１９参照）上記６種類の癌細胞株に対するＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの細胞傷害性活性を測定した結果、上記６種類の癌細胞株の細胞傷害率は、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度依存的に増加することが示された（図５９－１及び図５９－２参照）。この結果は、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、ＥＧＦＲ又はＨＥＲ３を発現する癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、ＤＵＰ－１４３株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂのＥＣ５０値は、Ａ－４３１では１．６ｐＭ、ＮＣＩ－Ｈ１９７５では９．６ｐＭ、ＨＴ－２９では３．６ｐＭ、ＨＣＴ１１６では４．２ｐＭ、ＲＫＯでは３８．４ｐＭ、ＳＷ６２０では３．２ｐＭであった。
［実施例３２］変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）の作製
　実施例１２で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の［３２－１］～［３２－２］の項目に記載の方法に従って作製した。
３２－１　プラスミドｐ１９９の作製
　Ｃ末端にＨＡタグ（配列番号１０２のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が融合した変異ＬＨ３１ポリペプチド１と、Ｃ末端にｃ－Ｍｙｃタグ（配列番号１０３のアミノ酸配列からなるポリペプチド）及びＦＬＡＧタグ（配列番号１０４のアミノ酸配列からなるポリペプチド）が融合した変異ＬＨ３１ポリペプチド２とを発現するプラスミド（プラスミドｐ１９９）（図６２参照）を、実施例１と同様の方法を用い、図６０～６２に示す手順に従って作製した。ＰＣＲに使用したプライマーセットは表７に示す。
３２－２　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の作製
　プラスミドｐ１９９を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株の形質転換は、実施例１と同様の方法で行い、プラスミドｐ１９９を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム１０５－Ａ株（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）を取得した。
［実施例３３］ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の発現・分泌評価（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）が、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、以下の「３３－１」及び「３３－２」の項目に記載の方法に従って確認した。
３３－１　変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂの精製
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）が分泌する変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の培養上清から実施例７の「７－１」の項目に記載の方法において、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株培養上清を精製した。
３３－２　変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂの発現・分泌評価（ＳＤＳ－ＰＡＧＥ）
　ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）が、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し分泌することを確認するために、実施例１５に記載の方法に従って、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の培養上清精製溶液を用いたＳＤＳ－ＰＡＧＥを行い、蛍光染色を行った。
（結果）
　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株培養上清中に、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを構成する変異ＬＨ３１ポリペプチド１及び変異ＬＨ３１ポリペプチド２に由来する２つのバンドが、３０ｋＤａ付近に認められた（図６３参照）。この結果は、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株は、変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現し、分泌することを示している。
［実施例３４］ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株のマウス尾静脈投与によるビフィズス菌及び変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂの組織分布
　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株のマウス尾静脈投与によるビフィズス菌の組織分布と、腫瘍及び血液中の変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度の推移を確認するために、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株を、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞を移植した担癌ＳＣＩＤマウスへ静脈内投与し、各組織におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の生菌数と、腫瘍及び血漿におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株からの分泌したＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度を経時的に解析した。
３４－１　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の担癌マウスへの投与
　ＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ（Equitech-Bio社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Sigma-Aldrich社製）で培養した後、８週齢のメスのＳＣＩＤマウス（日本エスエルシー社製）に皮下移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが１０１．５４～２５１．６０ｍｍ３の担癌マウスに、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の簡易凍結製剤を５．０×１０８ ｃｆｕ／０．２ｍＬの用量で尾静脈内投与した。投与後、１日目、３日目、５日目、７日目、１０日目、１２日目、１４日目、１７日目、１９日目及び２１日目に、それぞれ５匹の担癌マウスから、腫瘍と、非腫瘍組織（脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓）を摘出した。また、血漿は、血液を採取し、遠心分離により分取した。なお、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回の頻度で０日目（投与日）から５投２休で各摘出日の前日まで腹腔内投与した。
３４－２　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株生菌数の測定
　腫瘍と、非腫瘍組織（脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓）に、それぞれプロテアーゼインヒビター（ナカライテスク社製）含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理をし、組織ホモジネートを調製した。調製した組織ホモジネートと、血液を、それぞれ嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、ＢＬＦＳ寒天培地（２５０μｇ／ｍＬの５－フルオロウラシル及び３０μｇ／ｍＬのスペクチノマイシン含有ＢＬ寒天培地）に塗布し、嫌気条件下で３７℃にて３日間培養した。ＢＬＦＳ寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の生菌数を算出した（図６４参照）。なお、組織ホモジネートの一部を回収し、以下の「３４－３」の項目に記載の方法に用いた。
３４－３　ＥＬＩＳＡ解析用腫瘍サンプルの調製
　上記「３４－２」で調製した腫瘍ホモジネートに、１０×Cell Lysis buffer（５００ｍＭのＴｒｉｓ－ＨＣｌ［ｐＨ７．５］、１５００ｍＭの塩化ナトリウム、５％のＮＰ－４０、及び２０ｍＭのＥＤＴＡ）と５０×cOmplete（cOmplete［EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001］タブレット１つを、１ｍＬの超純水で溶解して調製したもの）を添加し、撹拌後、遠心分離後の上清を回収し、ＥＬＩＳＡ解析用腫瘍サンプルを調製した。
３４－４　ＥＬＩＳＡ法
　５μｇ／ｍＬ（血漿用）又は２μｇ／ｍＬ（腫瘍用）のヒトＣＤ３Ｅ／ＣＤ３Ｄヘテロダイマー組換えタンパク質（Acro Biosystems社製）含有液を、９６ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ２５μＬずつ分注し、４℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、蒸留水（大塚製薬社製）にて５倍に希釈したブロッキング液（Blocking One、ナカライテスク社製）で２５℃にて２時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、上記「３４－３」で調製したＥＬＩＳＡ解析用腫瘍サンプルと、上記「３４－１」で調製した血漿を、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の培養上清から精製した検量線作成用標準ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ（変異ＬＨ３１ダイアボディ型ＢｓＡｂ）を４ ｎｇ／ｍＬから０．０１ ｎｇ／ｍＬ（血漿用）及び６４ ｎｇ／ｍＬから０．０１５６２５ ｎｇ／ｍＬ（腫瘍用）に段階希釈したものを、それぞれ２５℃で２時間インキュベートした。その後、各ウェルを、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄し、抗ＨＡビオチン（Roche社製）の存在下、２５℃で１時間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、ＶＥＣＴＡＳＴＡＩＮ Ｅｌｉｔｅ　ＡＢＣ試薬（アビジン－ビオチン標識ＨＲＰ）（Vector社製）の存在下、２５℃で３０分間インキュベートした。各ウェルを、ＰＢＳ－Ｔにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B（ＨＲＰの基質であるＴＭＢを含む液）（R&D Systems社製）の存在下、室温で２０分間発色させ、Stop Solution（２Ｎの硫酸）（R&D Systems社製）にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT（Gen5 2.04）（ＤＳファーマバイオメディカル社製）にて、ＴＭＢ由来色素の吸収波長である４５０ｎｍの吸光度と、陰性対照の５７０ｎｍの吸光度を測定し、検量線作成用標準ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを基に検量線を作成後、腫瘍及び血漿中のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂの濃度を定量した（図６５参照）。
（結果）
　ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株を、ＨＣＴ１１６担癌ＳＣＩＤマウスへ投与すると、腫瘍におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株生菌数は、徐々に増加し、投与後５日目に最大（中央値：４．８×１０７ｃｆｕ／ｇ腫瘍）となり、投与後１９日目までは生菌数（中央値）が１０６ ｃｆｕ／ｇ腫瘍以上認められた（図６４参照）。一方、非腫瘍組織は、一部の組織（脾臓、肝臓、腎臓、及び心臓）について、投与後１日目にＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の生菌が検出されたものの、その後の検出レベルは大幅に減少し、投与後５日目以降は検出限界未満であった（図６４参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）が腫瘍特異的に生着することを示している。
　また、腫瘍におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度は、ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株の投与後５日目に腫瘍内濃度が最大（平均値：３４５８８．４ｐｇ／ｇ腫瘍）となり、投与後１７日目までは平均値で定量限界（２５００ｐｇ／ｇ腫瘍）以上のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂが腫瘍中に認められた（図６５参照）。この結果は、腫瘍に生着したビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株）が、ＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂを発現・分泌したことを示している。なお、血漿におけるＤＵＰ－１９９ＨＡＦ株由来のＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂ濃度は、投与後全ての時点において、平均値で定量限界（２５０ ｐｇ／ｍＬ）未満であった。
［実施例３５］ＤＵＰ－１４３株によるインビボでの抗腫瘍効果
　ＤＵＰ－１４３株によるインビボでの抗腫瘍効果を確認するために、ヒト大腸癌細胞株であるＨＣＴ１１６細胞を移植し、かつ、ヒトＰＢＭＣを移入した重度免疫不全マウス（ＮＯＧマウス）を用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下に記載の方法に従って解析した。
　ＨＣＴ１１６細胞を、１０％のＦＢＳ（Equitech-Bio社製）を含有するＭｃＣｏｙ’ｓ５Ａ培地（Sigma-Aldrich社製）で培養した後、７週齢のメスのＮＯＧマウス（インビボサイエンス社製）に皮下移植して担癌マウスを作製した。移植後３日目や９日目に、ＰＢＭＣを腹腔内より移入し、また、移植後３日目～１８日目に、５．０×１０８ｃｆｕ／０．２ｍＬのＤＵＰ－１４３株の簡易凍結製剤又はＢＥシャトル株の凍結製剤を、尾静脈内投与した（図６６参照）。各群（群１～６）の構成は、以下のとおりである。群１：ＰＢＭＣ移入なしＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）、群２：ＰＢＭＣ移入（移植後３日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）、群３：ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＢＥシャトル株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）、群４：ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）、群５：ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後３日目、６日目、１０日目、１３日目、及び１７日目）及び群６：ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、９日目、１１日目、１４日目、１６日目、及び１８日目）。なお、凍結製剤の投与後、１０％マルトース溶液を１ｍＬずつ１日２回、５投２休で腹腔内投与した。投与後３日目、６日目、１０日目、１３日目、１７日目、及び２０日目に、各群マウスにおける体重及び腫瘍径を測定した。腫瘍体積を、式「腫瘍体積＝長径×短径２/２」を基に算出した（図６６参照）。腫瘍増殖抑制率［ＴＧＩ］を、式「ＴＧＩ＝［１－移植後２０日の平均腫瘍体積（群２～６）/移植後２０日の平均腫瘍体積（群１）］×１００」を基に算出した。体重比を、式「体重比＝各時点の体重/移植日の体重」を基に算出した（図６７参照）。
（結果）
　各群のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果、ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＢＥシャトル株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）群（群３）のマウスにおける腫瘍体積は、陰性対照であるＰＢＭＣ移入なしＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）群（群１）のマウスにおける腫瘍体積とほとんどかわらなかった（図６６参照）。一方、ＰＢＭＣ移入（移植後３日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、１０日目、１４日目、及び１７日目）群（群２）のマウスにおける腫瘍体積や、ＰＢＭＣ移入（移植後３日目及び９日目）ＤＵＰ－１４３株投与（移植後７日目、９日目、１１日目、１４日目、１６日目、及び１８日目）群（群６）のマウスにおける腫瘍体積は、上記陰性対照の群１のマウスにおける腫瘍体積と比べ、有意に減少し、例えば、移植後２０日目において、陰性対照の群１のマウスに対する腫瘍増殖抑制率［ＴＧＩ］は、それぞれ４３．０％及び４５．０％であった（図６６参照）。一方、体重減少はいずれの群においても認められなかった（図６７参照）。この結果は、ビフィズス菌形質転換体（ＤＵＰ－１４３株）が分泌するＥＧＦＲ×ＣＤ３ダイアボディ型ＢｓＡｂは、抗腫瘍効果があることを示している。
　本発明は、本発明は、固形腫瘍（通常、固形癌）の予防又は治療に資するものである。

Claims (12)

  1. 　ヒトＣＤ３に結合する軽鎖可変領域（ＶＬ）と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域（ＶＨ）とを含む第１のポリペプチド；及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬと、ヒトＣＤ３に結合するＶＨとを含む第２のポリペプチド；を発現し、前記第１のポリペプチド及び前記第２のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌。
  2. 　第１のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒトＣＤ３に結合するＶＬと、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＨとを含み、第２のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するＶＬと、ヒトＣＤ３に結合するＶＨとを含むことを特徴とする請求項１に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  3. 　第１のポリペプチドのＶＬとＶＨとの間、及び第２のポリペプチドのＶＬとＶＨとの間に、それぞれ４～９アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されていることを特徴とする請求項１又は２に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  4. 　第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドのアミノ末端に、それぞれ以下の（i）～（iii）のいずれかのアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチド－リンカーペプチド連結体が連結されていることを特徴とする請求項１～３のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
    （i）配列番号１０に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    （ii）配列番号１３に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
    （iii）配列番号１８に示されるアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列
  5. 　第１のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第１のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第２のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第２のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンである；又は
    第１のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第１のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第２のポリペプチドのＶＬにおけるKabat番号３８番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第２のポリペプチドのＶＨにおけるKabat番号３９番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸である；
    ことを特徴とする請求項１～４のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  6. 　ヒト腫瘍細胞表面抗原が、ヒトＥＧＦＲ（Epidermal Growth Factor Receptor）ファミリーに属する抗原、ヒトＥｐＣＡＭ（Epithelial cell adhesion molecule）、又はヒトＰＳＭＡ（Prostate Specific Membrane Antigen）であることを特徴とする請求項１～５のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  7. 　ヒトＥＧＦＲファミリーに属する抗原が、ヒトＥＧＦＲ、ヒトＨＥＲ２、又はヒトＨＥＲ３であることを特徴とする請求項１～６のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  8. 　第１のポリペプチド及び第２のポリペプチドが、ポリシストロニックに発現することを特徴とする請求項１～７のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  9. 　ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする請求項１～８のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
  10. 　請求項１～９のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有することを特徴とする固形腫瘍の予防又は治療剤。
  11. 　固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び／又は増殖促進剤と併用することを特徴とする請求項１０に記載の予防又は治療剤。
  12. 　固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び／又は増殖促進剤が、マルトースであることを特徴とする請求項１１に記載の予防又は治療剤。
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