WO2021038975A1 - ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 - Google Patents
ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 Download PDFInfo
- Publication number
- WO2021038975A1 WO2021038975A1 PCT/JP2020/019075 JP2020019075W WO2021038975A1 WO 2021038975 A1 WO2021038975 A1 WO 2021038975A1 JP 2020019075 W JP2020019075 W JP 2020019075W WO 2021038975 A1 WO2021038975 A1 WO 2021038975A1
- Authority
- WO
- WIPO (PCT)
- Prior art keywords
- strain
- polypeptide
- human
- amino acid
- bifidobacterium
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/46—Hybrid immunoglobulins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/7016—Disaccharides, e.g. lactose, lactulose
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
- A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
- A61K31/715—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
- A61K31/716—Glucans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
- A61K35/74—Bacteria
- A61K35/741—Probiotics
- A61K35/744—Lactic acid bacteria, e.g. enterococci, pediococci, lactococci, streptococci or leuconostocs
- A61K35/745—Bifidobacteria
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
- A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
- A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
- C07K16/2809—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against the T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2863—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against receptors for growth factors, growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/32—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against translation products of oncogenes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
- C12N1/38—Chemical stimulation of growth or activity by addition of chemical compounds which are not essential growth factors; Stimulation of growth by removal of a chemical compound
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
- C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
- C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
- C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Virology (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本発明の課題は、固形癌に対して、持続的かつ特異的に抗腫瘍効果を発揮するビフィドバクテリウム属細菌を提供することにある。 ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)とを含む第1のポリペプチド;及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含む第2のポリペプチド;を発現し、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌するビフィドバクテリウム属細菌を作製する。
Description
本発明は、固形腫瘍の免疫療法に有用なダイアボディ型二重特異性抗体(BsAb;bispecific monoclonal antibody)を発現・分泌するビフィドバクテリウム(Bifidobacterium)属細菌(以下、ビフィズス菌やB菌ということがある)や、その医薬用途に関する。
BsAb(二機能性抗体[bifunctional antibody]ともいう)は、2つの異なる抗原に結合する人工2価抗体であり、同一の抗原に結合する天然2価抗体とは異なる。BsAbの中でも、腫瘍細胞上の抗原(腫瘍マーカー)と、T細胞上の抗原(T細胞マーカー)であるCD3とに結合する抗体(すなわち、T-BsAb)は、腫瘍細胞とT細胞を架橋することにより、T細胞を細胞傷害性T細胞へ活性化し、抗腫瘍効果を発揮する。1980年代の半ば以降、多数のT-BsAbが抗腫瘍剤として研究開発されており、例えば、カツマキソマブ(Catumaxomab)は、腫瘍マーカーであるEpCAMと、T細胞マーカーであるCD3とに結合し、定常領域を含む完全長型T-BsAbであり、悪性腹水症の治療用抗体医薬として承認されている。また、ブリナツモマブ(Blinatumomab)は、腫瘍マーカーであるCD19と、T細胞マーカーであるCD3とに結合し、定常領域を含まない低分子型T-BsAbであり、急性リンパ性白血病(ALL;acute lymphoblastic leukemia)の治療用抗体医薬として承認されている。
T-BsAbを全身投与し、固形腫瘍を治療する場合、解決すべき課題が残されており、例えば、完全長型T-BsAbについては、分子サイズが大きいため、固形腫瘍組織内部への浸透性に限界がある上に、投与量を少なくした場合でもサイトカイン放出症候群(CRS;cytokine release syndrome)を惹起する可能性が指摘されている。一方、低分子型T-BsAbについては、安定性に問題がある上に、血中半減期が短いという欠点がある(非特許文献1)。
低分子型BsAbの1種であるダイアボディ型BsAbは、第1の抗体由来の軽鎖可変領域(VL;lightchain variable region)(VL1)と、第2の抗体由来の重鎖可変領域(VH;heavychain variable region)(VH2)とを同一のペプチド鎖上に有する第1のポリペプチド、及び、第2の抗体由来のVL(VL2)と、第1の抗体由来のVH(VH1)とを同一のポリペプチド鎖上に有する第2のポリペプチドからなる。ダイアボディ型BsAbの作製方法として、大腸菌を用いた方法が知られている(特許文献1、非特許文献2)。また、腫瘍細胞表面抗原であるEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)と、T細胞マーカーであるCD3とに結合するダイアボディ型T-BsAbが抗腫瘍活性を有することが多数報告されている(特許文献2~4、非特許文献3)。
一方、固形腫瘍の治療において、B菌等の嫌気性菌を遺伝子輸送担体として利用する方法が注目されている。B菌は全身投与されると固形腫瘍等の低酸素部位に特異的に生着するため、B菌を、抗腫瘍性タンパク質や抗腫瘍性物質前駆体を抗腫瘍性物質に変換する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子で形質転換し、全身投与すると、当該遺伝子は腫瘍局所で特異的に発現する。このため、全身投与では副作用が不可避な薬剤を腫瘍局所に高濃度かつ持続的にデリバリーすることが可能となる。現在、5-フルオロシトシン(5-FC)を5-フルオロウラシル(5-FU)に変換する酵素シトシン・デアミナーゼを発現するB菌について、米国で臨床試験が進められている(特許文献5~10)。
Nat Rev Drug Discov. 2019 Jun 7.doi:10.1038/s41573-019-0028-1
Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul15;90(14):6444-8
Sci Rep. 2017 Jun 6;7(1):2862. doi:10.1038/s41598-017-03101-4
本発明の課題は、固形癌に対して、持続的かつ特異的に抗腫瘍効果を発揮するビフィドバクテリウム属細菌や、該ビフィドバクテリウム属細菌を含む、固形腫瘍の予防又は治療剤を提供することにある。
本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究を進める中で、ヒトCD3及びヒト腫瘍細胞表面抗原の双方に結合するダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌が、大腸癌、結腸癌、胆管癌等の固形癌に対する細胞傷害活性や、固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を有することを見いだした。また、当該ダイアボディ型BsAbにおいて、ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)におけるKabat番号38番目のグルタミン(Q)をグルタミン酸(E)へ置換し、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)におけるKabat番号39番目のQをEへ置換し、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLにおけるKabat番号38番目のQをリジン(K)へ置換するとともに、ヒトCD3に結合するVHにおけるKabat番号39番目のQをKへ置換すると、細胞傷害活性や抗腫瘍効果が上昇することを確認した。本発明は、これらの知見に基づき、完成するに至ったものである。
すなわち、本発明は、以下のとおりである。
〔1〕ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)とを含む第1のポリペプチド;及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含む第2のポリペプチド;を発現し、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌。
〔2〕第1のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒトCD3に結合するVLと、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVHとを含み、第2のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含むことを特徴とする上記〔1〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔3〕第1のポリペプチドのVLとVHとの間、及び第2のポリペプチドのVLとVHとの間に、それぞれ4~9アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されていることを特徴とする上記〔1〕又は〔2〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔4〕第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドのアミノ末端に、それぞれ以下の(i)~(iii)のいずれかのアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチド-リンカーペプチド連結体が連結されていることを特徴とする上記〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(iii)配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
〔5〕第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンである;又は
第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸である;
ことを特徴とする上記〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔6〕ヒト腫瘍細胞表面抗原が、ヒトEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)ファミリーに属する抗原、ヒトEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、又はヒトPSMA(Prostate Specific Membrane Antigen)であることを特徴とする上記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔7〕ヒトEGFRファミリーに属する抗原が、ヒトEGFR、ヒトHER2、又はヒトHER3であることを特徴とする上記〔1〕~〔6〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔8〕第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドが、ポリシストロニックに発現することを特徴とする上記〔1〕~〔7〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔9〕ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする上記〔1〕~〔8〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔10〕上記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有することを特徴とする固形腫瘍の予防又は治療剤。
〔11〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤と併用することを特徴とする上記〔10〕に記載の予防又は治療剤。
〔12〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤が、マルトースであることを特徴とする上記〔11〕に記載の予防又は治療剤。
〔1〕ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)とを含む第1のポリペプチド;及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含む第2のポリペプチド;を発現し、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌。
〔2〕第1のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒトCD3に結合するVLと、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVHとを含み、第2のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含むことを特徴とする上記〔1〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔3〕第1のポリペプチドのVLとVHとの間、及び第2のポリペプチドのVLとVHとの間に、それぞれ4~9アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されていることを特徴とする上記〔1〕又は〔2〕に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔4〕第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドのアミノ末端に、それぞれ以下の(i)~(iii)のいずれかのアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチド-リンカーペプチド連結体が連結されていることを特徴とする上記〔1〕~〔3〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(iii)配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
〔5〕第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンである;又は
第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸である;
ことを特徴とする上記〔1〕~〔4〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔6〕ヒト腫瘍細胞表面抗原が、ヒトEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)ファミリーに属する抗原、ヒトEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、又はヒトPSMA(Prostate Specific Membrane Antigen)であることを特徴とする上記〔1〕~〔5〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔7〕ヒトEGFRファミリーに属する抗原が、ヒトEGFR、ヒトHER2、又はヒトHER3であることを特徴とする上記〔1〕~〔6〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔8〕第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドが、ポリシストロニックに発現することを特徴とする上記〔1〕~〔7〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔9〕ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする上記〔1〕~〔8〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
〔10〕上記〔1〕~〔9〕のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有することを特徴とする固形腫瘍の予防又は治療剤。
〔11〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤と併用することを特徴とする上記〔10〕に記載の予防又は治療剤。
〔12〕固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤が、マルトースであることを特徴とする上記〔11〕に記載の予防又は治療剤。
また本発明の実施の他の形態として、本件ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する、固形腫瘍の予防又は治療剤を、固形腫瘍の予防又は治療を必要とする対象者に投与するステップを含む、固形腫瘍を予防又は治療する方法;や、固形腫瘍の予防又は治療剤として使用するための本件ビフィドバクテリウム属細菌;や、固形腫瘍の予防又は治療における使用のための本件ビフィドバクテリウム属細菌;や、固形腫瘍の予防又は治療剤を製造するための、本件ビフィドバクテリウム属細菌の使用;を挙げることができる。
本件ビフィドバクテリウム属細菌は、固形癌に対する癌細胞傷害活性や固形腫瘍に対する抗腫瘍効果を有するため、固形腫瘍の予防又は治療に効果的である。本件ビフィドバクテリウム属細菌は、正常組織では増殖せず嫌気的環境下にある腫瘍組織内でのみ増殖するとともに、CD3及び腫瘍細胞表面抗原の両方に特異的に結合するダイアボディ型BsAbを発現・分泌するため、その表面にCD3を発現するヒトT細胞が、かかるダイアボディ型BsAbを介して、その表面に腫瘍細胞表面抗原を発現する固形腫瘍の近傍までリクルートされ、細胞傷害性ヒトT細胞へ活性化した結果、上記癌細胞傷害活性や抗腫瘍効果が発揮されたと推測される。また、当該ダイアボディ型BsAbは腫瘍組織内で特異的かつ持続的に分泌されるので、薬効の持続性と正常組織における意図しないヒトT細胞活性化のリスク低減、等の効果が期待できる。
本件ビフィドバクテリウム属細菌は、ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)(以下、「CD3 VL」ということがある)と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)(以下、「腫瘍 VH」ということがある)とを含む第1のポリペプチド(以下、「本件第1のポリペプチド」ということがある);及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVL(以下、「腫瘍 VL」ということがある)と、ヒトCD3に結合するVH(以下、「CD3 VH」ということがある)とを含む第2のポリペプチド(以下、「本件第2のポリペプチド」ということがある);を発現し、本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体(以下、「本件ダイアボディ型BsAb」ということがある)を分泌するビフィドバクテリウム属細菌であり、より具体的には、本件第1のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド(以下、「本件第1のポリヌクレオチド」ということがある)と、本件第2のポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチド(以下、「本件第2のポリヌクレオチド」ということがある)とを有するビフィドバクテリウム属細菌である。本件ビフィドバクテリウム属細菌は、本件第1のポリヌクレオチド及び本件第2のポリヌクレオチドが、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体上に組み込まれたものであっても、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体外で存在する自律複製可能なベクター上に組み込まれたものであってもよいが、簡便性の観点から、本件第1のポリヌクレオチド及び本件第2のポリヌクレオチドが、本件ビフィドバクテリウム属細菌の染色体外で存在する自律複製可能なベクター上に組み込まれたもの(すなわち、本件第1のポリヌクレオチド及び本件第2のポリヌクレオチドを含む自律複製可能なベクター[以下、「本件ベクター」ということがある]を保持するビフィドバクテリウム属細菌)が好ましい。本件第1のポリヌクレオチド及び本件第2のポリヌクレオチドの上流や、本件第1のポリヌクレオチドの上流及び本件第2のポリヌクレオチドの上流のそれぞれには、通常、作動可能にプロモーターが連結されている。ここで「上流」とは、mRNAの転写が進行する方向(下流)とは反対の方向を意味する。
本明細書において、「プロモーター」とは、RNAポリメラーゼ(好ましくは、RNAポリメラーゼ及び基本転写因子)が結合し、その下流に位置する遺伝子がコードするmRNAの転写を開始させる領域を意味する。プロモーターには、通常転写開始点(TSS)が含まれる。
本発明の固形腫瘍の予防又は治療剤は、「固形腫瘍を予防又は治療するため」という用途に特定された、本件ビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有する製剤(以下、「本件予防/治療剤」ということがある)であり、ここで固形腫瘍の予防には、固形腫瘍の発症予防の他、固形腫瘍の症状悪化の予防も含まれる。本件予防/治療剤は、単独で医薬品(製剤)として使用してもよいし、さらに添加剤を混合し、組成物の形態(医薬組成物)として使用してもよい。本明細書において、固形腫瘍には、固形の悪性腫瘍及び良性腫瘍の両方が含まれ、固形腫瘍としては、好ましくは固形悪性腫瘍(すなわち、固形癌)である。
上記固形癌としては、例えば、大腸癌、頭頚部癌、乳癌、肺癌(例えば、非小細胞肺癌)、食道癌、胃癌、肝癌、胆嚢癌、胆管癌、膵癌、膵島細胞癌、絨毛癌、結腸癌、腎細胞癌、副腎皮質癌、膀胱癌、精巣癌、前立腺癌、睾丸癌、卵巣癌、子宮癌、甲状腺癌、扁平上皮癌(類表皮癌)、皮膚癌、脳腫瘍、悪性カルチノイド腫瘍、骨肉腫、軟部組織肉腫、神経芽細胞腫、ウィルムス腫瘍、網膜芽細胞腫、メラノーマを挙げることができる。
本明細書において、「ダイアボディ型二重特異性抗体」とは、本件第1のポリペプチドにおける「CD3 VL」と、本件第2のポリペプチドにおける「CD3 VH」とが非共有結合(例えば、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力;以下、同じ)し、本件第2のポリペプチドにおける「腫瘍 VL」と、本件第1のポリペプチドにおける「腫瘍 VH」とが非共有結合することにより、本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドのヘテロ二量体を構成し、かつ、ヒトCD3及びヒト腫瘍細胞表面抗原の両方に特異的に結合する抗体(すなわち、本件ダイアボディ型BsAb)を意味する。
本件ダイアボディ型BsAbを構成する本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドの組合せとしては、具体的には、アミノ(N)末端からカルボキシル(C)末端の順に「CD3 VL」及び「腫瘍 VH」を含む本件第1のポリペプチドと、N末端からC末端の順に「腫瘍 VL」及び「CD3 VH」を含む本件第2のポリペプチドとの組合せ;N末端からC末端の順に「腫瘍 VH」及び「CD3 VL」を含む本件第1のポリペプチドと、N末端からC末端の順に「CD3 VH」及び「腫瘍 VL」を含む本件第2のポリペプチドとの組合せ;を挙げることができ、これらの中でも、後述する実施例でその効果が実証されているため、N末端からC末端の順に「CD3 VL」及び「腫瘍 VH」を含む本件第1のポリペプチドと、N末端からC末端の順に「腫瘍 VL」及び「CD3 VH」を含む本件第2のポリペプチドとの組合せを好適に例示することができる。
本件第1のポリペプチドとしては、本件第1のポリペプチドが、N末端からC末端の順に「CD3 VL」及び「腫瘍 VH」を含むものである場合、「CD3 VL」のN末端、「CD3 VL」と「腫瘍 VH」との間(すなわち、「CD3 VL」のC末端であり、かつ、「腫瘍 VH」のN末端)、及び「腫瘍 VH」のC末端から選択される1、2、又は3つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体(分泌シグナルペプチドのC末端とリンカーペプチドのN末端とが連結したもの;以下同じ)、並びにタンパク質タグが、1又は2以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよく、また、本件第1のポリペプチドが、N末端からC末端の順に「腫瘍 VH」及び「CD3 VL」を含むものである場合、「腫瘍 VH」のN末端、「腫瘍 VH」と「CD3 VL」との間(すなわち、「腫瘍 VH」のC末端であり、かつ、「CD3 VL」のN末端)、及び「CD3 VL」のC末端から選択される1、2、又は3つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、1又は2以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよい。
また、本件第2のポリペプチドとしては、本件第2のポリペプチドが、N末端からC末端の順に「腫瘍 VL」及び「CD3 VH」を含むものである場合、「腫瘍 VL」のN末端、「腫瘍 VL」と「CD3 VH」との間(すなわち、「腫瘍 VL」のC末端であり、かつ、「CD3 VH」のN末端)、及び「CD3 VH」のC末端から選択される1、2、又は3つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、1又は2以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよく、また、本件第2のポリペプチドが、N末端からC末端の順に「CD3 VH」及び「腫瘍 VL」を含むものである場合、「CD3 VH」のN末端、「CD3 VH」と「腫瘍 VL」との間(すなわち、「CD3 VH」のC末端であり、かつ、「腫瘍 VL」のN末端)、及び「腫瘍 VL」のC末端から選択される1、2、又は3つの部位に、分泌シグナルペプチド、リンカーペプチド、及びそれらの連結体、並びにタンパク質タグが、1又は2以上連結されたものであっても、連結されていないものであってもよい。
上記リンカーペプチドとしては、ダイアボディ型二重特異性抗体の形成やその機能(すなわち、ヒトCD3及びヒト腫瘍細胞表面抗原への結合能)を阻害しないものであればよく、上記リンカーペプチドの長さとしては、リンカーペプチドを、VLとVHの連結に用いる場合、例えば、1~30個の範囲内のアミノ酸であり、好ましくは1~20アミノ酸、より好ましくは2~15アミノ酸、さらに好ましくは3~10アミノ酸、最も好ましくは約6~7アミノ酸(4~9アミノ酸、5~8アミノ酸等)である。また、リンカーペプチドを、分泌シグナルペプチドとVL又はVHとの連結に用いる場合、例えば、1~30個の範囲内のアミノ酸であり、好ましくは1~20アミノ酸、より好ましくは1~15アミノ酸、さらに好ましくは1~10アミノ酸、最も好ましくは1~6アミノ酸である。
本件第1のポリペプチドとしては、後述する本実施例でその効果が実証されているため、本件第1のポリペプチドの「CD3 VL」と「腫瘍 VH」との間に、4~9アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されたものを好適に例示することができ、また、本件第2のポリペプチドとしては、後述する本実施例でその効果が実証されているため、本件第2のポリペプチドの「腫瘍 VL」のN末端、「腫瘍 VL」と「CD3 VH」との間に、4~9アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されたものを好適に例示することができる。
上記分泌シグナルペプチドとしては、異種ポリペプチドの発現・分泌効率の点から、リンカーペプチドと連結した分泌シグナルペプチド-リンカーペプチド連結体が好ましい。かかる分泌シグナルペプチド-リンカーペプチド連結体としては、国際公開第2016/088376号パンフレットに開示されているものや、具体的には、以下の(i)~(iii)を含むものを挙げることができる。
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(iii)配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(iii)配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
上記タンパク質タグとしては、例えば、c-Mycタグ、ヒスチジン(His)タグ、HAタグ、FLAGタグを挙げることができる。
本件ダイアボディ型BsAbにおけるVL及びVHの由来、種類、クラス、形態等は特に制限されず、例えば、ヒト由来のVL及びVH;マウス、ラット等の非ヒト動物由来のVL及びVH;ポリクローナル抗体由来のVL及びVH、オリゴクローナル抗体(数種~数十種の抗体の混合物)由来のVL及びVH、モノクローナル抗体由来のVL及びVH;VL及びVHの一部領域(例えば、相補性決定領域[CDR]を除いた可変領域)を異なる生物種由来の領域に置換したキメラVL及びVHやヒト化VL及びVH等が含まれる。
上記「CD3 VL」及び「CD3 VH」としては、アミノ酸配列が公知である抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH、例えば、特表2009-520734に開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;特表2008-503449に開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;特表2013-508391に開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;特表2017-504314に開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;特表2018-535972に開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;国際公開第2015/146437号パンフレットに開示された抗ヒトCD3抗体由来のVL及びVH;や、具体的には、配列番号1の1~107番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVL、及び配列番号2の115~233番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH;配列番号3の1~107番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVL、及び配列番号4の115~233番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH;配列番号5の1~108番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVL、及び配列番号6の115~236番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなるVH;を挙げることができる。これらVL及びVHのアミノ酸配列を基に、kabatによる番号付け(文献「kabat, E.A. et al.,(1991)NIH Publication No. 91-3242, sequences of proteins of immunological interest」参照)を行い、重(H)鎖及び軽(L)鎖のCDR1~3、すなわち、H鎖CDR1に相当するKabat番号31~35、H鎖CDR2に相当するKabat番号50~65、及びH鎖CDR3に相当するKabat番号95~102を有する、並びに、L鎖CDR1に相当するKabat番号24~34、L鎖CDR2に相当するKabat番号50~56、及びL鎖CDR3に相当するKabat番号89~97を含み、これらH鎖及びL鎖CDR1~3以外の可変領域(具体的には、フレームワーク領域[FR])を、ヒト由来可変領域に改変(ヒト化)したものを、「CD3 VL」及び「CD3 VH」として用いてもよい。
上記ヒト腫瘍細胞表面抗原としては、腫瘍細胞の表面に存在する抗原であればよく、例えば、ヒトB7-H3、ヒトCEA(癌胎児性抗原)、ヒトDLL3、ヒトEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)ファミリーに属する抗原(例えば、HER[Human Epidermal Growth Factor Receptor]1[ヒトEGFR、ヒトErB1ともいう]、HER2、HER3、HER4)、ヒトEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、ヒトGPC3(Glypican-3)、ヒトGPA33(glycoprotein A33)、ヒトMUC16、ヒトP型カドヘリン、ヒトPSMA(Prostate Specific Membrane Antigen)、ヒトSSTR2、ヒトPD-L1を挙げることができ、本実施例でその効果が実証されているため、ヒトEGFRファミリーに属する抗原、ヒトEpCAM、及びヒトPSMAが好ましく、ヒトEGFRファミリーに属する抗原としては、ヒトEGFR、ヒトHER2、及びヒトHER3を好適に例示することができる。
上記「腫瘍 VL」及び「腫瘍 VH」としては、アミノ酸配列が公知である抗ヒト腫瘍細胞表面抗原抗体由来のVL及びVH、例えば、国際公開第2012/147713号パンフレットに開示された抗ヒトB7-H3抗体由来のVL及びVH;特表2009-520734に開示された抗ヒトCEA抗体由来のVL及びVH;国際公開第2011/093097号パンフレットに開示された抗ヒトDLL3抗体由来のVL及びVH;国際公開第2011/062112号パンフレットに開示された抗ヒトEGFR抗体由来のVL及びVH;特開2012-158534に開示された抗HER2抗体由来のVL及びVH;特表2013-514793に開示された抗HER3抗体由来のVL及びVH;特表2010-523096に開示された抗ヒトEpCAM抗体由来のVL及びVH;特表2013-529061に開示された抗ヒトMUC16抗体由来のVL及びVH;や、具体的には、配列番号2の1~108番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトEGFR抗体由来のVL、及び配列番号1の114~235番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトEGFR抗体由来のVH;配列番号4の1~108番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトEGFR抗体由来のVL、及び配列番号3の114~234番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗EGFR抗体由来のVH;配列番号14の1~108番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗HER2抗体由来のVL、及び配列番号15の115~233番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗HER2抗体由来のVH;配列番号82の115~234番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトEpCAM抗体由来のVH、及び配列番号83の1~113番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトEpCAM抗体由来のVL;配列番号86の115~235番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトPSMA抗体由来のVH、及び配列番号87の1~107番目のアミノ酸残基と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列からなる、抗ヒトPSMA抗体由来のVL;を挙げることができる。これらVL及びVHのアミノ酸配列を基に、kabatによる番号付けを行い、H鎖及びL鎖のCDR1~3、すなわち、H鎖CDR1に相当するKabat番号31~35、H鎖CDR2に相当するKabat番号50~65、及びH鎖CDR3に相当するKabat番号95~102を有する、並びに、L鎖CDR1に相当するKabat番号24~34、L鎖CDR2に相当するKabat番号50~56、及びL鎖CDR3に相当するKabat番号89~97を含み、これらH鎖及びL鎖CDR1~3以外の可変領域(具体的には、FR)を、ヒト由来可変領域に改変(ヒト化)したものを、「腫瘍 VL」及び「腫瘍 VH」として用いてもよい。
本件第1のポリペプチドにおける「CD3 VL」と、本件第2のポリペプチドにおける「CD3 VH」との非共有結合や、本件第1のポリペプチドにおける「腫瘍 VH」と、本件第2のポリペプチドにおける「腫瘍 VL」との非共有結合は、「CD3 VL」と「CD3 VH」とが近接するアミノ酸残基、及び/又は、「腫瘍 VL」と「腫瘍 VH」とが近接するアミノ酸残基を、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸残基で置換すると、本件第1のポリペプチドと本件第2のポリペプチドとの非共有結合が促進・安定化し、細胞傷害活性や抗腫瘍効果をさらに高めることが可能となる。ここで、置換対象のアミノ酸残基としては、VL及びVHにおいて相補性決定領域(CDR)以外の領域、例えば、CDR1とCDR2の間のフレームワーク領域(FR2)内のアミノ酸残基を挙げることができ、より具体的な、VLにおける置換対象のアミノ酸残基と、VHにおける置換対象のアミノ酸残基との組合せとしては、例えば、VL上Kabat番号38番目のグルタミン(Q)(VL Q38)と、VH上Kabat番号39番目のQ(VH Q39)との組合せ;VL上Kabat番号44番目のプロリン(P)(VL P44)とVH上Kabat番号45番目のロイシン(L)(VH L45)との組合せ;等を挙げることができる。これらアミノ酸残基は、いずれも中性アミノ酸で、ヒト及びマウスにおいて高度に保存されていることから、各組合せのいずれか一方のアミノ酸残基を、正電荷のアミノ酸(例えば、リジン[K]、アルギニン[R]、ヒスチジン[H];以下同じ)に置換し、もう一方のアミノ酸残基を、負電荷のアミノ酸(例えば、グルタミン酸[E]、アスパラギン酸[D];以下同じ)に置換すると、それぞれ反対の電荷を有するアミノ酸残基の組合せを得ることができる。より具体的には、同じポリペプチド上のVH・VL間の会合を抑制することも考慮すると、(1)本件第1のポリペプチドの「CD3 VL」におけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第1のポリペプチドの「腫瘍 VH」におけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第2のポリペプチドの「腫瘍 VL」におけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第2のポリペプチドの「CD3 VH」におけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンであること;や、(2)本件第1のポリペプチドの「CD3 VL」におけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第1のポリペプチドの「腫瘍 VH」におけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンであり、本件第2のポリペプチドの「腫瘍 VL」におけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、本件第2のポリペプチドの「CD3 VH」におけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であること;が好ましい。
本明細書において、「・・・アミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性」とは、比較対象のアミノ酸配列と同一のアミノ酸の割合が80%以上であることを意味し、好ましくは85%以上、より好ましくは88%以上、さらに好ましくは90%以上、さらにより好ましくは93%以上、特に好ましくは95%以上、特により好ましくは98%以上、最も好ましくは99%の配列同一性を意味する。アミノ酸配列の同一性は、ClustalW、GENETYX、BLAST等の公知のプラグラムを用いて決定することができる。
本件ベクターを作製する方法や、本件ベクターを用いて本件ビフィドバクテリウム属細菌を作製する方法は、市販の実験書、例えば、遺伝子マニュアル講談社、高木康敬編遺伝子操作実験法講談社、モレキュラー・クローニング[コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1982)]、モレキュラー・クローニング第2版[コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー(1989)]、メソッズ・イン・エンザイモロジー194(1991)、実験医学別冊・酵母による遺伝子実験法、羊土社(1994)等に記載された方法に従って行うことができる。
本件ベクターにおけるプロモーターとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプロモーターであればよく、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のヒストン様DNA結合タンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるHuプロモーター;P30プロモーター(J. Microbiology, 2012, 638-643);Elongation Factor Tuタンパク質をコードする遺伝子の発現に係るプロモーターであるP54プロモーター(J.Bacteriology, 2005, 5799-5808、J.Microbiology,2012, 638-643);ビフィドバクテリウム・ブレーベ由来Gap遺伝子のプロモーター(Biotechnol.Lett. 2008 30:1983-1988);ビフィドバクテリウム・ロンガム由来AmyB遺伝子のプロモーター(Biotechnol. Lett. 2006 28:163-168);16SrRNAプロモーター(Biotechnol. Lett. 2008 30:165-172);GAPDH(pr-BL1363)遺伝子のプロモーター(Appl Environ Microbiol.200672(11):7401-7405);PRPLプロモーターCancer Gene Ther.200714:151-157);p572(β-glycosidase from B. animalis subsp lactis)遺伝子のプロモーター(J Microbiol Biotechnol.2012 Dec;22(12):1714-23);p919(rplM promoter)(J Microbiol. 2012 Aug;50(4):638-43);p895(rplR promoter)(JMicrobiol. 2012 Aug;50(4):638-43);を挙げることができる。
本件ベクターには、自律複製できるように、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するプラスミド複製ユニットが含まれる。かかる複製ユニットとしては、例えば、pTB6(Biosci Biotechnol Biochem. 2005 Feb;69(2):422-5)、pMB1(Lett Appl Microbiol. 1990 Oct;11(4):220-3)、pTB4(Bifidobacterium longum 由来のプラスミドpTB4の構造解析と応用一般演題 ポスター発表 プログラム-日本分子生物学会、1994)、pFI2576(J Microbiol Biotechnol. 2009 Apr;19(4):403-8)、pCIBAO(Appl Environ Microbiol. 2007 Dec;73(24):7858-66)、pBC1(Plasmid. 2007 Mar;57(2):165-74)、pDOJH10S(Appl Environ Microbiol. 2006 Jan;72(1):527-35)、PKJ50(Microbiology 1999 Mar;145(Pt ):585-92)の複製ユニット、Rep4(配列番号12のヌクレオチド配列からなるポリヌクレオチド、pFI2576の複製ユニット)を挙げることができる。
本件ベクターとしては、本件ベクターのクローニング;及び本件ベクターを含む本件ビフィドバクテリウム属細菌のスクリーニング;に使用する薬剤耐性遺伝子や、本件第1のポリヌクレオチド及び本件第2のポリヌクレオチドの転写を終結させるヌクレオチド配列(すなわち、ターミネーター)を含むものが好ましい。
上記ターミネーターとしては、ビフィドバクテリウム属細菌で機能するターミネーターであれば特に制限されず、具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム由来のHuターミネーター;ビフィドバクテリウム・ロンガム由来の乳酸脱水素酵素遺伝子のターミネーターであるd0013ターミネーター;ビフィドバクテリウム・アニマリス由来のT572ターミネーター(J. Microbiol Biotechnol. 2012 Dec;22(12):1714-23);人工的にデザインされたターミネーターであるBBa_B0015(T2)ターミネーター);T2ターミネーター(国際公開第2016/088376号公報);を挙げることができる。
上記薬剤耐性遺伝子としては、例えば、スペクチノマイシン耐性遺伝子、クロラムフェニコール耐性遺伝子、エリスロマイシン耐性遺伝子、アンピシリン耐性遺伝子を挙げることができる。
本件ベクターとしては、大腸菌複製起点(例えば、pUCori、pBR322ori)を含むものであっても、クローニング後、ビフィドバクテリウム属細菌へ導入する前に、大腸菌複製起点を除去したものであってもよい。
本件ビフィドバクテリウム属細菌において、本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドは、モノシストロニックに発現するもの(すなわち、1つのmRNAから本件第1のポリペプチド又は本件第2のポリペプチドの1つが翻訳されるもの)であっても、ポリシストロニックに発現したもの(すなわち、1つのmRNAから本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドの2つが翻訳されるもの)であってもよいが、本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドを1:1で効率よく発現させる観点から、ポリシストロニックに発現したものが好ましい。本件第1のポリペプチド及び本件第2のポリペプチドをポリシストロニックに発現する本件ビフィドバクテリウム属細菌は、本件第1のポリヌクレオチドと本件第2のポリヌクレオチドの間に、ターミネーター及びプロモーターを含まず、かつリボソーム結合領域(RBS)を含む本件ベクターを作製し、当該本件ベクターをビフィドバクテリウム属細菌へ導入することにより作製することができる。かかるRBSとしては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来のHup遺伝子の翻訳開始コドンの上流52ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチドや、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来の30S ribosomal protein S16遺伝子の翻訳開始コドンの上流54ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチドを挙げることができる。
本件ベクターを、ビフィドバクテリウム属細菌へ導入する方法としては、エレクトロポレーション法を挙げることができる。
本件ビフィドバクテリウム属細菌としては、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム(B. longum)、ビフィドバクテリウム・ブレーベ(B. breve)、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス(B. adolescentis)、ビフィドバクテリウム・ビフィダム(B. bifidum)、ビフィドバクテリウム・シュードロンガム(B.pseudolongum)、ビフィドバクテリウム・サーモフィラム(B. thermophirum)、ビフィドバクテリウム・インファンティス(B.infantis)、ビフィドバクテリウム・アニマリス(B. animalis)、ビフィドバクテリウム・アングラタム(B. angulatum)、ビフィドバクテリウム・アステロイデス(B. asteroides)、ビフィドバクテリウム・ボウム(B. boum)、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム(B. catenulatum)、ビフィドバクテリウム・コエリナム(B. choerinum)、ビフィドバクテリウム・コリネフォルメ(B. coryneforme)、ビフィドバクテリウム・クニクリ(B. cuniculi)、ビフィドバクテリウム・デンティコレンス(B. denticolens)、ビフィドバクテリウム・デンティウム(B. dentium)、ビフィドバクテリウム・ガリクム(B. gallicum)、ビフィドバクテリウム・ガリナラム(B. gallinarum)、ビフィドバクテリウム・グロボサム(B. globosum)、ビフィドバクテリウム・インディクム(B. indicum)、ビフィドバクテリウム・イノピナタム(B. inopinatum)、ビフィドバクテリウム・ラクティス(B. lactis)、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス(B. lactentis)、ビフィドバクテリウム・マグナム(B. magnum)、ビフィドバクテリウム・メリシクム(B. merycicum)、ビフィドバクテリウム・ミニマム(B. minimum)、ビフィドバクテリウム・モンゴリエンス(B. Mongolia Enns)、ビフィドバクテリウム・パルブロラム(B. parvulorum)、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム(B. pseudocatenulatum)、ビフィドバクテリウム・サイクラエロフィラム(B. psychraerophilum)、ビフィドバクテリウム・プロラム(B. pullorum)、ビフィドバクテリウム・ルミナレ(B. ruminale)、ビフィドバクテリウム・ルミナンチウム(B. ruminantium)、ビフィドバクテリウム・サエクラレ(B. saeculare)、ビフィドバクテリウム・スカルドヴィ(B. scardovii)、ビフィドバクテリウム・サブタイル(B. subtile)、ビフィドバクテリウム・スイス(B. suis)、ビフィドバクテリウム・テルマシドフィラム(B. thermacidophilum)を挙げることができ、これらの中でも、年齢に関係なくヒトの腸内に常在していることが知られているビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・ブレーベ、ビフィドバクテリウム・アドレスセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・インファンティスが好ましく、ビフィドバクテリウム・ロンガムを好適に例示することができる。これらの菌は、いずれも市販品として、あるいは、寄託機関等から容易に入手することができる。
また、それぞれの種の菌株についても特に限定されず、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガムの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株、ビフィドバクテリウム・ロンガムaE-194b株、ビフィドバクテリウム・ロンガムbs-601株、ビフィドバクテリウム・ロンガムM101-2株、ビフィドバクテリウム・ロンガムATCC-15707株を挙げることができ、中でもビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株を好適に例示することができる。また、ビフィドバクテリウム・ブレーベの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株(JCM1192)、ビフィドバクテリウム・ブレーベaS-1株、ビフィドバクテリウム・ブレーベI-53-8W株を挙げることができ、中でも、ビフィドバクテリウム・ブレーベ標準株、ビフィドバクテリウム・ブレーベaS-1株を好適に例示することができる。また、ビフィドバクテリウム・インファンティスの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・インファンティス標準株(JCM1222)、ビフィドバクテリウム・インファンティスI-10-5株を挙げることができる。また、ビフィドバクテリウム・ラクテンティスの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ラクテンティス標準株(JCM1210)を挙げることができる。また、ビフィドバクテリウム・ビフィダムの場合、例えば、ビフィドバクテリウム・ビフィダムATCC-11863株を挙げることができる。
本件予防/治療剤は、液体タイプと非液体タイプとに大別される。液体タイプの本件予防/治療剤は、本件ビフィドバクテリウム属細菌の培養液を精製し、これに必要に応じて適当な生理食塩水若しくは補液又は医薬添加物を加えてアンプル又はバイアル瓶などに充填することにより製造することができる。一方、非液体タイプの本件予防/治療剤は、液体タイプの本件予防/治療剤に、適当な保護剤を添加してアンプルやバイアル瓶などに充填した後、凍結するか、あるいは、凍結乾燥することにより製造することができる。本発明の医薬組成物の投与方法としては、経口投与、非経口投与共に可能であるが、非経口投与が好ましく、例えば、静脈内投与、局所投与を挙げることができる。
本件予防/治療剤としては、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、pH緩衝剤、崩壊剤、等張剤、添加剤、被覆剤、可溶化剤、潤滑剤、溶解補助剤、滑沢剤、風味剤、甘味剤、溶剤、ゲル化剤、栄養剤等の添加剤をさらに含むものであってもよい。かかる添加剤としては、具体的に、水、生理食塩水、動物性脂肪及び油、植物油、乳糖、デンプン、ゼラチン、結晶性セルロース、ガム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、ヒドロキシプロピルセルロース、ポリアルキレングリコール、ポリビニルアルコール、グリセリンを例示することができる。
本件予防/治療剤は、固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着や増殖を促進するために、固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖の促進剤と併用することが好ましい。かかる促進剤としては、例えば、アラビノース、キシロース、ガラクトース、グルコース、マルトース、ラクトース、メリビオース、メレジトース、ラフィノース、ラクツロース等の糖類を挙げることができ、これらの中でも、後述する本実施例でその効果が実証されているため、マルトースを好適に例示することができる。
本件ビフィドバクテリウム属細菌の投与量としては、固形腫瘍部位において本件ビフィドバクテリウム属細菌が生育でき、且つ、有効治療量の本件ダイアボディ型BsAbが発現・分泌するのに十分な量である限り特に制限されず、腫瘍体積の大きさ、投与対象者の体重、年齢、性別に応じて適宜選択し、改善の度合いに応じて適宜増減することができる。例えば、静脈内投与の場合、菌塊による塞栓等のリスクを低減することが求められるため、できるだけ低濃度の注射用製剤を複数回に分けて分注するか、又は適当な補液で希釈して持続注入することが好ましい。例えば、成人の場合、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重1kg当たり104~1012cfu(Colony Forming Unit)を1日1~複数回に分け、1~数日間、連続して又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を104~1010cfu/mL含有する製剤を、成人1人あたり1~1000mLを直接、又は適当な補液で希釈して、1日1~数回に分け、1~数日間連続して投与する。また、疾患組織へ直接投与する局所投与の場合、できるだけ疾患組織全体へ菌が生着、増殖することが求められるため、高濃度の注射剤を、疾患組織の複数個所に投与することが望ましい。例えば、成人の場合、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を、体重1kg当たり104~1012cfuを1日1~複数回、必要に応じ1~複数日間、連続して、又は適宜間隔をおいて投与する。より具体的には、本件ビフィドバクテリウム属細菌の菌体を104~1010cfu/mL含有する製剤を、成人1人あたり0.1~100mLを直接、一日数回、必要に応じて1~複数日間連続して投与する。
以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。なお、以下の実施例において、培養細胞は、37℃、5%CO2条件下で培養した。
[実施例1]EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)の作製
ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[1-1]~[1-5]の項目に記載の方法に従って作製した。
ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[1-1]~[1-5]の項目に記載の方法に従って作製した。
1-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのコード配列を含むDNAの合成
3種類のヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb、すなわち、配列番号1のアミノ酸配列からなるLH9ポリペプチド1(表1参照)と、配列番号2のアミノ酸配列からなるLH9ポリペプチド2(表2参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH9ダイアボディ型BsAb」ということがある);配列番号3のアミノ酸配列からなるLH22ポリペプチド1(表3参照)と、配列番号4のアミノ酸配列からなるLH22ポリペプチド2(表4参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH22ダイアボディ型BsAb」ということがある);及び、配列番号5のアミノ酸配列からなるLH31ポリペプチド1(表5参照)と、配列番号6のアミノ酸配列からなるLH31ポリペプチド2(表6参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH31ダイアボディ型BsAb」ということがある);を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、3種類のDNA(配列番号7のヌクレオチド配列からなる、LH9ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1A参照]、配列番号8のヌクレオチド配列からなる、LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1B参照]、及び配列番号9のヌクレオチド配列からなる、LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1C参照])を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した。なお、各ポリペプチド1及びポリペプチド2のN末端には、それぞれ分泌シグナルペプチドSP50(配列番号10の1~56番目のアミノ酸残基)-L5リンカーペプチド(配列番号10の57~61番目のアミノ酸残基)連結体(SP50-L5;配列番号10のアミノ酸配列)が含まれるとともに、各ポリペプチド1及び2のC末端には、それぞれc-Myc(配列番号11の4~13番目のアミノ酸残基)-His(配列番号11の23~28番目のアミノ酸残基)融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が含まれる(図1~6参照)。
3種類のヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb、すなわち、配列番号1のアミノ酸配列からなるLH9ポリペプチド1(表1参照)と、配列番号2のアミノ酸配列からなるLH9ポリペプチド2(表2参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH9ダイアボディ型BsAb」ということがある);配列番号3のアミノ酸配列からなるLH22ポリペプチド1(表3参照)と、配列番号4のアミノ酸配列からなるLH22ポリペプチド2(表4参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH22ダイアボディ型BsAb」ということがある);及び、配列番号5のアミノ酸配列からなるLH31ポリペプチド1(表5参照)と、配列番号6のアミノ酸配列からなるLH31ポリペプチド2(表6参照)とから構成されるダイアボディ型BsAb(以下、「LH31ダイアボディ型BsAb」ということがある);を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、3種類のDNA(配列番号7のヌクレオチド配列からなる、LH9ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1A参照]、配列番号8のヌクレオチド配列からなる、LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1B参照]、及び配列番号9のヌクレオチド配列からなる、LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA[図1C参照])を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した。なお、各ポリペプチド1及びポリペプチド2のN末端には、それぞれ分泌シグナルペプチドSP50(配列番号10の1~56番目のアミノ酸残基)-L5リンカーペプチド(配列番号10の57~61番目のアミノ酸残基)連結体(SP50-L5;配列番号10のアミノ酸配列)が含まれるとともに、各ポリペプチド1及び2のC末端には、それぞれc-Myc(配列番号11の4~13番目のアミノ酸残基)-His(配列番号11の23~28番目のアミノ酸残基)融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が含まれる(図1~6参照)。
1-2 プラスミドpLH9-L5の作製
B菌内でLH9ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図2に示す手順に従って、プラスミドpLH9-L5を作製した。
B菌内でLH9ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図2に示す手順に従って、プラスミドpLH9-L5を作製した。
1-2-1 PCR反応
50pg/μLの2種類の鋳型DNA(線状化したベクター断片1[図2参照]、及び上記LH9ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA)、0.2μMの前記鋳型DNAを増幅する2種類のプライマーセット(DEL1プライマーとDEL21プライマーとのセット、及びDEL22プライマーとDEL20プライマーとのセット;図2及び表7参照)、及びPrimeSTAR HS (Premix)キット(タカラバイオ社製)を用い、PCR反応(98℃にて10秒、65℃にて5秒、72℃にて伸長反応[1000塩基対あたり約1分]を1サイクルとして、30サイクル)を行い、PCR断片1及びPCR断片2を作製した。
50pg/μLの2種類の鋳型DNA(線状化したベクター断片1[図2参照]、及び上記LH9ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNA)、0.2μMの前記鋳型DNAを増幅する2種類のプライマーセット(DEL1プライマーとDEL21プライマーとのセット、及びDEL22プライマーとDEL20プライマーとのセット;図2及び表7参照)、及びPrimeSTAR HS (Premix)キット(タカラバイオ社製)を用い、PCR反応(98℃にて10秒、65℃にて5秒、72℃にて伸長反応[1000塩基対あたり約1分]を1サイクルとして、30サイクル)を行い、PCR断片1及びPCR断片2を作製した。
1-2-2 インフュージョン反応
上記PCR断片1と、上記PCR断片2とを、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結した。具体的には、上記PCR断片1(ベクター断片)と、上記PCR断片2(インサート断片)を、マイクロチューブに1:1のモル比にて添加後、2μLの5xIn-Fusion HD Enzyme premix及び1μLのCloningEnhancerを添加し、反応液容量を10μLに調整した。これを37℃にて15分間保温した後、さらに50℃にて15分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液を調製した。
上記PCR断片1と、上記PCR断片2とを、In-Fusion(登録商標)HD Cloning Kit(タカラバイオ社製)を用いて連結した。具体的には、上記PCR断片1(ベクター断片)と、上記PCR断片2(インサート断片)を、マイクロチューブに1:1のモル比にて添加後、2μLの5xIn-Fusion HD Enzyme premix及び1μLのCloningEnhancerを添加し、反応液容量を10μLに調整した。これを37℃にて15分間保温した後、さらに50℃にて15分間保温した。その他の手順は、キットの製品説明書にしたがい、インフュージョン反応液を調製した。
1-2-3 大腸菌形質転換体の作製と、プラスミドpLH9-L5の精製
上記インフュージョン反応液1μLと、大腸菌HST16CRコンピテント細胞(タカラバイオ社製)を用いて、プラスミドpLH9-L5を保持する大腸菌形質転換体を、製品説明書に従って作製した。大腸菌形質転換体を含む懸濁液を、75μg/mLスペクチノマイシン含有LB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩静置培養した後、寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを、75μg/mLスペクチノマイシン含有LB液体培地にて37℃にて一晩振とう培養し、その後、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドpLH9-L5を単離・精製した。
上記インフュージョン反応液1μLと、大腸菌HST16CRコンピテント細胞(タカラバイオ社製)を用いて、プラスミドpLH9-L5を保持する大腸菌形質転換体を、製品説明書に従って作製した。大腸菌形質転換体を含む懸濁液を、75μg/mLスペクチノマイシン含有LB寒天培地に塗布し、37℃にて一晩静置培養した後、寒天培地上に形成された大腸菌コロニーを、75μg/mLスペクチノマイシン含有LB液体培地にて37℃にて一晩振とう培養し、その後、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)を用いてプラスミドpLH9-L5を単離・精製した。
1-3 プラスミドpLH22-L5cmの作製
B菌内でLH22ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図3及び4に示す手順に従って、プラスミドpLH22-L5cmを作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL21プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片3を作製するとともに、上記LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL23プライマー及びDEL4プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片4を作製した後、PCR断片3及びPCR断片4を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5-F1を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5-F1を単離・精製した(図3及び表7参照)。次に、プラスミドpLH22-L5-F1の抗ヒトCD3抗体由来のVLをコードするヌクレオチド配列中に、LH22ポリペプチド2をコードするヌクレオチド配列と高ホモロジー領域が存在したため、サイレント変異(抗ヒトCD3抗体由来のVLアミノ酸配列は変えないヌクレオチド残基の置換)を導入した。具体的には、プラスミドpLH22-L5-F1を鋳型とし、変異導入用DEL43プライマー及びpUC6プライマーのプライマーセットと、変異導入用DEL42プライマー及びpUC7プライマーのプライマーセットとを用いたPCRをそれぞれ行い、PCR断片5及びPCR断片6を作製後、これら断片を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5-F1cmを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5-F1cmを単離・精製した(図3及び表7参照)。次いで、プラスミドpLH22-L5-F1cmを鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL18プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片7を作製するとともに、上記LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL19プライマー及びDEL20プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片8を作製した後、PCR断片7及びPCR断片8を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5cmを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5cmを単離・精製した(図4及び表7参照)。なお、PCR反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「1-2-1」及び「1-2-2」の項目に記載の方法に従って行った。
B菌内でLH22ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図3及び4に示す手順に従って、プラスミドpLH22-L5cmを作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL21プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片3を作製するとともに、上記LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL23プライマー及びDEL4プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片4を作製した後、PCR断片3及びPCR断片4を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5-F1を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5-F1を単離・精製した(図3及び表7参照)。次に、プラスミドpLH22-L5-F1の抗ヒトCD3抗体由来のVLをコードするヌクレオチド配列中に、LH22ポリペプチド2をコードするヌクレオチド配列と高ホモロジー領域が存在したため、サイレント変異(抗ヒトCD3抗体由来のVLアミノ酸配列は変えないヌクレオチド残基の置換)を導入した。具体的には、プラスミドpLH22-L5-F1を鋳型とし、変異導入用DEL43プライマー及びpUC6プライマーのプライマーセットと、変異導入用DEL42プライマー及びpUC7プライマーのプライマーセットとを用いたPCRをそれぞれ行い、PCR断片5及びPCR断片6を作製後、これら断片を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5-F1cmを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5-F1cmを単離・精製した(図3及び表7参照)。次いで、プラスミドpLH22-L5-F1cmを鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL18プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片7を作製するとともに、上記LH22ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL19プライマー及びDEL20プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片8を作製した後、PCR断片7及びPCR断片8を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH22-L5cmを保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH22-L5cmを単離・精製した(図4及び表7参照)。なお、PCR反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「1-2-1」及び「1-2-2」の項目に記載の方法に従って行った。
1-4 プラスミドpLH31-L5の作製
B菌内でLH31ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図5及び6に示す手順に従って、プラスミドpLH31-L5を作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL24プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片9を作製するとともに、上記LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL25プライマー及びDEL4プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片10を作製した後、PCR断片9及びPCR断片10を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH31-L5-F1を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH31-L5-F1を単離・精製した(図5及び表7参照)。次いで、プラスミドpLH31-L5-F1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL18プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片11を作製するとともに、上記LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL19プライマー及びDEL20プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片12を作製した後、PCR断片11及びPCR断片12を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH31-L5を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH31-L5を単離・精製した(図6及び表7参照)。なお、PCR反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「1-2-1」及び「1-2-2」の項目に記載の方法に従って行った。
B菌内でLH31ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、図5及び6に示す手順に従って、プラスミドpLH31-L5を作製した。具体的には、まず、線状化したベクター断片1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL24プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片9を作製するとともに、上記LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL25プライマー及びDEL4プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片10を作製した後、PCR断片9及びPCR断片10を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH31-L5-F1を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH31-L5-F1を単離・精製した(図5及び表7参照)。次いで、プラスミドpLH31-L5-F1を鋳型とし、DEL1プライマー及びDEL18プライマーのプライマーセットを用いたPCRを行い、PCR断片11を作製するとともに、上記LH31ダイアボディ型BsAbのコード配列を含む人工DNAを鋳型とし、DEL19プライマー及びDEL20プライマーのプライマーセットとを用いたPCRを行い、PCR断片12を作製した後、PCR断片11及びPCR断片12を用いたインフュージョン反応を行い、上記「1-2-3」の項目に記載の方法に従って、プラスミドpLH31-L5を保持する大腸菌形質転換体を作製した後、プラスミドpLH31-L5を単離・精製した(図6及び表7参照)。なお、PCR反応及びインフュージョン反応は、それぞれ、上記「1-2-1」及び「1-2-2」の項目に記載の方法に従って行った。
1-5 FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株の作製
単離・精製した上記3種類のプラスミド(pLH9-L5、pLH22-L5cm、及びpLH31-L5)を、エレクトロポレーションシステム(ジーンパルサーII、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製)を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(元京都薬科大学 加納康正教授より分譲)へ形質転換した。具体的には、電気ショック(2kV、25μF、200Ω)を行い、キュベット(2mmギャップ)に800μLのIMR液体培地と、50μLのビタミンC添加液(350mg/mLのアスコルビン酸、20mg/mLのL-システイン塩酸塩一水和物、及び110mg/mLの炭酸ナトリウムを含む液)との混合液を即時に添加し、これを滅菌済みの2mLマイクロチューブに回収した。その後、チューブの蓋をゆるめて、脱酸素・炭酸ガス発生剤(アネロパック[登録商標]・ケンキ、三菱ガス化学社製)とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて3時間保温した。保温後の各菌懸濁液を75μg/mLスペクチノマイシン含有IMR寒天培地に塗布した。これらのプレートを上記脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて2日間培養した。上記スペクチノマイシン含有IMR寒天培地上に形成したコロニーを釣菌し、75μg/mLスペクチノマイシン含有BL-bS寒天培地に画線後、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて1日間培養し、3種類のビフィズス菌形質転換体、すなわち、プラスミドpLH9-L5を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(FLM-9H株)、プラスミドpLH22-L5cmを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(FOM-22H株)、及びプラスミドpLH31-L5を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUM-31H株)を取得した。
単離・精製した上記3種類のプラスミド(pLH9-L5、pLH22-L5cm、及びpLH31-L5)を、エレクトロポレーションシステム(ジーンパルサーII、バイオ・ラッドラボラトリーズ社製)を用いてビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(元京都薬科大学 加納康正教授より分譲)へ形質転換した。具体的には、電気ショック(2kV、25μF、200Ω)を行い、キュベット(2mmギャップ)に800μLのIMR液体培地と、50μLのビタミンC添加液(350mg/mLのアスコルビン酸、20mg/mLのL-システイン塩酸塩一水和物、及び110mg/mLの炭酸ナトリウムを含む液)との混合液を即時に添加し、これを滅菌済みの2mLマイクロチューブに回収した。その後、チューブの蓋をゆるめて、脱酸素・炭酸ガス発生剤(アネロパック[登録商標]・ケンキ、三菱ガス化学社製)とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて3時間保温した。保温後の各菌懸濁液を75μg/mLスペクチノマイシン含有IMR寒天培地に塗布した。これらのプレートを上記脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて2日間培養した。上記スペクチノマイシン含有IMR寒天培地上に形成したコロニーを釣菌し、75μg/mLスペクチノマイシン含有BL-bS寒天培地に画線後、脱酸素・炭酸ガス発生剤とともに密閉容器に入れ、37℃に設定したインキュベーターにて1日間培養し、3種類のビフィズス菌形質転換体、すなわち、プラスミドpLH9-L5を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(FLM-9H株)、プラスミドpLH22-L5cmを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(FOM-22H株)、及びプラスミドpLH31-L5を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUM-31H株)を取得した。
[実施例2]FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株の発現・分泌評価(WB)
上記3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを、以下の[2-1]及び[2-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
上記3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを、以下の[2-1]及び[2-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
2-1 SDS-サンプルの調製
上記3種類のビフィズス菌形質転換体を、75μg/mLのスペクチノマイシン及び100μLのビタミンC添加液を含むMRS液体培地(ベクトン・ディッキンソン社製)10mLに植菌し、37℃にて24時間嫌気培養し、前培養液を調製した。次に、DMEM液体培地(Cat No. 11885-084、ライフテクノロジーズ社製)及びMRS液体培地を、9:1の割合で混合した培地20mLに、ビタミンC添加液100μLと、スペクチノマイシンを75μg/mLになるよう添加し、上記前培養液100μLを植菌した後、37℃にて18時間嫌気培養し、本培養液を調製した。本培養液を遠心分離後、培養上清を回収し、培養上清40μLに、5×サンプルローディングバッファー(Pierce Lane Marker Reducing Sample Buffer、ThermoFischerScientific社製)10μLを混合し、95℃にて3分間熱処理を行い、電気泳動用サンプルを調製した。同様の操作を、BEシャトルベクターを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(BEシャトル株)についても行い、陰性コントロールとした。
上記3種類のビフィズス菌形質転換体を、75μg/mLのスペクチノマイシン及び100μLのビタミンC添加液を含むMRS液体培地(ベクトン・ディッキンソン社製)10mLに植菌し、37℃にて24時間嫌気培養し、前培養液を調製した。次に、DMEM液体培地(Cat No. 11885-084、ライフテクノロジーズ社製)及びMRS液体培地を、9:1の割合で混合した培地20mLに、ビタミンC添加液100μLと、スペクチノマイシンを75μg/mLになるよう添加し、上記前培養液100μLを植菌した後、37℃にて18時間嫌気培養し、本培養液を調製した。本培養液を遠心分離後、培養上清を回収し、培養上清40μLに、5×サンプルローディングバッファー(Pierce Lane Marker Reducing Sample Buffer、ThermoFischerScientific社製)10μLを混合し、95℃にて3分間熱処理を行い、電気泳動用サンプルを調製した。同様の操作を、BEシャトルベクターを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(BEシャトル株)についても行い、陰性コントロールとした。
2-2 ウェスタンブロッティング法(WB)
上記電気泳動用サンプルを、ミニプロティアン(登録商標)TGXゲル(4~20%)(バイオラッド社製)にて電気泳動し、電気泳動後のゲルを、PVDF膜(Trans-Blot Turbo Mini Format、バイオラッド社製)へトランスブロットTurbo(バイオラッド社製)を用いて転写した。転写後のPVDF膜を、ブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を用いてブロッキング処理した後、マウス抗Hisタグ抗体(ジェンスクリプトジャパン社製)を用いた一次抗体反応処理と、ECL-ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(GE ヘルスケアジャパン社製)を用いた二次抗体反応処理を行い、Western Lightning Ultra(パーキンエルマー社製)を用いて発光させた。これをイメージングアナライザー(myECL Imager、Thermo Fischer Scientific社製)にて解析した。
上記電気泳動用サンプルを、ミニプロティアン(登録商標)TGXゲル(4~20%)(バイオラッド社製)にて電気泳動し、電気泳動後のゲルを、PVDF膜(Trans-Blot Turbo Mini Format、バイオラッド社製)へトランスブロットTurbo(バイオラッド社製)を用いて転写した。転写後のPVDF膜を、ブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を用いてブロッキング処理した後、マウス抗Hisタグ抗体(ジェンスクリプトジャパン社製)を用いた一次抗体反応処理と、ECL-ペルオキシダーゼ標識抗マウス抗体(GE ヘルスケアジャパン社製)を用いた二次抗体反応処理を行い、Western Lightning Ultra(パーキンエルマー社製)を用いて発光させた。これをイメージングアナライザー(myECL Imager、Thermo Fischer Scientific社製)にて解析した。
(結果)
上記3種類のビフィズス菌形質転換体の全ての培養上清中に、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを構成するポリペプチド1及びポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図7参照)。この結果は、上記3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)は、いずれもEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、それぞれLH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
上記3種類のビフィズス菌形質転換体の全ての培養上清中に、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを構成するポリペプチド1及びポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図7参照)。この結果は、上記3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)は、いずれもEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、それぞれLH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
[実施例3]FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEGFR/CD3への結合性評価 上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)が、EGFR及びCD3に結合することを、以下の[3-1]及び[3-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
3-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
上記3種類のビフィズス菌形質転換体を、実施例2に記載の方法に従って培養し、50mLの本培養液を調製した。調製した本培養液を遠心分離し、得られた培養上清を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを80%飽和になるよう少しずつ添加し、4℃にて一晩撹拌し塩析を行った。その後、遠心分離し、沈殿を回収した後、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キット(TALON Methal Affinity Resins、タカラバイオ社製)にてタンパク質(すなわち、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)を精製し、精限外ろ過(アミコンウルトラ-0.5、公称分画分子量: 10KDa,メルク社製)にて濃縮した。各EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、分光光度計(NanoDrop2000c、Thermo Fischer Scientific社製)にて測定した280nmの吸光度(A280値)、及びダイアボディ型BsAbの吸光係数(LH9ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.914、LH22ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.851、LH31ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.793)を基に算出し、10(ng/mL)100(ng/mL)、及び1000(ng/mL)となるように調整した。なお、Abs0.1%のA280値は、遺伝子解析サイト ExPASYのProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)を使用して算出した。
上記3種類のビフィズス菌形質転換体を、実施例2に記載の方法に従って培養し、50mLの本培養液を調製した。調製した本培養液を遠心分離し、得られた培養上清を撹拌しながら、硫酸アンモニウムを80%飽和になるよう少しずつ添加し、4℃にて一晩撹拌し塩析を行った。その後、遠心分離し、沈殿を回収した後、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キット(TALON Methal Affinity Resins、タカラバイオ社製)にてタンパク質(すなわち、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)を精製し、精限外ろ過(アミコンウルトラ-0.5、公称分画分子量: 10KDa,メルク社製)にて濃縮した。各EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、分光光度計(NanoDrop2000c、Thermo Fischer Scientific社製)にて測定した280nmの吸光度(A280値)、及びダイアボディ型BsAbの吸光係数(LH9ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.914、LH22ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.851、LH31ダイアボディ型BsAbのAbs0.1%:1.793)を基に算出し、10(ng/mL)100(ng/mL)、及び1000(ng/mL)となるように調整した。なお、Abs0.1%のA280値は、遺伝子解析サイト ExPASYのProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam/)を使用して算出した。
3-2 ELISA法
3-2-1 抗原・抗体反応処理
2.5μg/mLのヒトEGFR組換えタンパク質(R&D Systems社製)含有液、及び5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLの0.05%Tween20(MP Biomedical社製)を含有するPBS(pH7.4)(以下、「PBS-T」という)にて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。10(ng/mL)、100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを含む液を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARIA液(ナカライテスク社製)にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトEGFR組換えタンパク質、及び固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
3-2-1 抗原・抗体反応処理
2.5μg/mLのヒトEGFR組換えタンパク質(R&D Systems社製)含有液、及び5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLの0.05%Tween20(MP Biomedical社製)を含有するPBS(pH7.4)(以下、「PBS-T」という)にて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。10(ng/mL)、100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを含む液を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARIA液(ナカライテスク社製)にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトEGFR組換えタンパク質、及び固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
3-2-2 抗体の検出
0.1μg/mLのビオチン標識抗Hisタグ抗体(MBLライフサイエンス社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP[Horseradish Peroxidase])(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMB[3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine]を含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図8及び9の縦軸参照)を算出した。
0.1μg/mLのビオチン標識抗Hisタグ抗体(MBLライフサイエンス社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP[Horseradish Peroxidase])(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMB[3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine]を含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図8及び9の縦軸参照)を算出した。
(結果)
吸光度の補正値は、固相化したヒトEGFR組換えタンパク質及びヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質のいずれを用いた場合でも、上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図8及び9参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトEGFR及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、固相化したヒトEGFR組換えタンパク質及びヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質のいずれを用いた場合でも、上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図8及び9参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトEGFR及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを示している。
[実施例4]FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株の培養上清より精製したEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性評価
上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、細胞傷害性活性を有することを、以下の[4-1]及び[4-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、細胞傷害性活性を有することを、以下の[4-1]及び[4-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
4-1 T-LAKの調製
細胞傷害性活性測定に用いるT-LAK(活性化Tリンパ球)を、ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)から作製した。具体的には、25cm2フラスコに10μg/mLの抗ヒトCD3抗体(BioLegend社製)を37℃にて固相化し、PBS(-)にて洗浄後、10%の非働化FBSを含むRPMI-1640培地にて懸濁したヒトPBMCを播種し、140U/mLのIL-2存在下で、3~4日毎に培地交換しながら、2週間培養し、T-LAKを調製した。T-LAKは液体窒素気相中にて保管し、細胞傷害活性測定に用いる際には、T-LAKを10%の非働化FBSを含むRPMI-1640培地にて懸濁し、140U/mLのIL-2存在下で1週間培養を行った。
細胞傷害性活性測定に用いるT-LAK(活性化Tリンパ球)を、ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)から作製した。具体的には、25cm2フラスコに10μg/mLの抗ヒトCD3抗体(BioLegend社製)を37℃にて固相化し、PBS(-)にて洗浄後、10%の非働化FBSを含むRPMI-1640培地にて懸濁したヒトPBMCを播種し、140U/mLのIL-2存在下で、3~4日毎に培地交換しながら、2週間培養し、T-LAKを調製した。T-LAKは液体窒素気相中にて保管し、細胞傷害活性測定に用いる際には、T-LAKを10%の非働化FBSを含むRPMI-1640培地にて懸濁し、140U/mLのIL-2存在下で1週間培養を行った。
4-2 細胞傷害活性の測定法
96ウェルプレートに、2×104cells/100μL/ウェルのヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞(ATCC[American Type Culture. Collection]より入手)を播種し、24時間後、T-LAKを、T-LAK:HCT116細胞比が5:1となるように混合した。同時に、上記「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、100fM(10-13M)~100pM(10-10M)の濃度に段階希釈したものを添加し、培地量が計100μLとなるように調整し、24時間培養した。その後、各ウェルをPBS(-)にて3回洗浄し、CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社製)を含むRPMI-1640培地120μLを添加し、37℃、5%CO2で10分間インキュベートした。その後、490nmの吸光度を測定し、陰性対照波長として660nmの吸光度を測定した。HCT116細胞の生存率(平均値±標準偏差、図10の縦軸参照)は、Blankのウェルを測定した値を細胞生存率0%とし、T-LAK不含のHCT116細胞を播種したウェルを測定した値を細胞生存率100%として算出した。
96ウェルプレートに、2×104cells/100μL/ウェルのヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞(ATCC[American Type Culture. Collection]より入手)を播種し、24時間後、T-LAKを、T-LAK:HCT116細胞比が5:1となるように混合した。同時に、上記「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、100fM(10-13M)~100pM(10-10M)の濃度に段階希釈したものを添加し、培地量が計100μLとなるように調整し、24時間培養した。その後、各ウェルをPBS(-)にて3回洗浄し、CellTiter 96(登録商標)AQueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社製)を含むRPMI-1640培地120μLを添加し、37℃、5%CO2で10分間インキュベートした。その後、490nmの吸光度を測定し、陰性対照波長として660nmの吸光度を測定した。HCT116細胞の生存率(平均値±標準偏差、図10の縦軸参照)は、Blankのウェルを測定した値を細胞生存率0%とし、T-LAK不含のHCT116細胞を播種したウェルを測定した値を細胞生存率100%として算出した。
(結果)
ヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞の生存率は、上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下することが示された(図10参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値(すなわち、HCT116細胞の生存率を50%に低下させるEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度)は、LH9ダイアボディ型BsAbの場合、2.2pMであり、LH22ダイアボディ型BsAbの場合、0.25pMであり、LH31ダイアボディ型BsAbの場合、32pMであった。
ヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞の生存率は、上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下することが示された(図10参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌する上記3種類のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH9ダイアボディ型BsAb、LH22ダイアボディ型BsAb、及びLH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値(すなわち、HCT116細胞の生存率を50%に低下させるEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度)は、LH9ダイアボディ型BsAbの場合、2.2pMであり、LH22ダイアボディ型BsAbの場合、0.25pMであり、LH31ダイアボディ型BsAbの場合、32pMであった。
[実施例5]EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(DUM-126H株)の作製
実施例1で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[5-1]~[5-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
実施例1で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[5-1]~[5-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
5-1 プラスミドp126の作製
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、ビフィズス菌中でのプラスミド複製ユニットであるpTB6をRep4(配列番号12のヌクレオチド配列)へ変更し、かつ、SP50-L5がN末端に付加されたLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2に代えて、SP50-L2(SP50-L5におけるリンカーペプチドの長さを5アミノ酸残基から2アミノ酸残基へ短くしたもの;配列番号13のアミノ酸配列)がN末端に付加されたLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2を発現するプラスミド(プラスミドp126)(図13参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図11~13に示す手順に従って作製した。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、ビフィズス菌中でのプラスミド複製ユニットであるpTB6をRep4(配列番号12のヌクレオチド配列)へ変更し、かつ、SP50-L5がN末端に付加されたLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2に代えて、SP50-L2(SP50-L5におけるリンカーペプチドの長さを5アミノ酸残基から2アミノ酸残基へ短くしたもの;配列番号13のアミノ酸配列)がN末端に付加されたLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2を発現するプラスミド(プラスミドp126)(図13参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図11~13に示す手順に従って作製した。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
5-2 DUM-126H株の作製
プラスミドp126を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp126を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUM-126H株)を取得した。
プラスミドp126を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp126を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUM-126H株)を取得した。
[実施例6]DUM-126H株の発現・分泌評価(WB)
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、DUM-126H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、DUM-126H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
(結果)
DUM-126H株の培養上清中に、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを構成するLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図14参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)は、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
DUM-126H株の培養上清中に、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを構成するLH31ポリペプチド1及びLH31ポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図14参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)は、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
[実施例7]DUM-126H株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのCD3への結合性評価
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEGFRとヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[7-1]及び[7-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEGFRとヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[7-1]及び[7-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
7-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法において、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キットに代えて、κ―軽鎖と高い親和性をもつプロテインLレジン(Piercetm Protein L Agarose、Thermo Scientific社製、cat No. 20510)を用いた方法を行い、DUM-126H株の培養上清から精製した。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例21において精製した、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法において、ヒスチジンタグ融合タンパク質の精製キットに代えて、κ―軽鎖と高い親和性をもつプロテインLレジン(Piercetm Protein L Agarose、Thermo Scientific社製、cat No. 20510)を用いた方法を行い、DUM-126H株の培養上清から精製した。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例21において精製した、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
7-2 ELISA法
7-2-1 抗原・抗体反応処理
抗体(LH31ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理は、実施例3の「3-2-1」の項目に記載の方法に従って行った。
7-2-1 抗原・抗体反応処理
抗体(LH31ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理は、実施例3の「3-2-1」の項目に記載の方法に従って行った。
7-2-2 抗体の検出
0.1μg/mLの組換えビオチン化ヒトEGFR(Acro Biosystems社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図15の縦軸参照)を算出した。
0.1μg/mLの組換えビオチン化ヒトEGFR(Acro Biosystems社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図15の縦軸参照)を算出した。
(結果)
吸光度の補正値は、DUM-126H株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図15の「DUM-126H」参照)。一方、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図15の「CUM36-1H」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びヒトEGFRの両方に特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、DUM-126H株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図15の「DUM-126H」参照)。一方、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図15の「CUM36-1H」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びヒトEGFRの両方に特異的に結合することを示している。
[実施例8]DUM-126H株培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量を、以下の[8-1]及び[8-2]の項目に記載の方法に従って測定した。
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量を、以下の[8-1]及び[8-2]の項目に記載の方法に従って測定した。
8-1 抗原・抗体反応処理
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)を、96ウェルプレートの各ウェルに25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。実施例6において調製したDUM-126H株の培養上清と、後述する実施例13において調製した、濃度既知のDUP-153株由来GFR×CD3ダイアボディ型BsAbとを、それぞれ、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARIA液(ナカライテスク社製)にて500倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)を、96ウェルプレートの各ウェルに25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。実施例6において調製したDUM-126H株の培養上清と、後述する実施例13において調製した、濃度既知のDUP-153株由来GFR×CD3ダイアボディ型BsAbとを、それぞれ、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARIA液(ナカライテスク社製)にて500倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
8-2 抗体の検出
0.05μg/mLの組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、濃度既知のDUP-153株由来GFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した。
0.05μg/mLの組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、濃度既知のDUP-153株由来GFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した。
(結果)
DUM-126H株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、909±43(ng/mL)であることが確認された。
DUM-126H株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、909±43(ng/mL)であることが確認された。
[実施例9]DUM-126H株培養上清より精製したEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製し、100fM~100pMの濃度に段階希釈した後、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。
ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製し、100fM~100pMの濃度に段階希釈した後、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。
(結果)
HCT116細胞の生存率は、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下し、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値は8.4pMであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
HCT116細胞の生存率は、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下し、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値は8.4pMであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
[実施例10]DUM-126H株培養上清の細胞傷害性活性
次に、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを精製せずに、培養上清を用いて、細胞傷害性活性を解析した。具体的には、実施例8で調製したDUM-126H株の培養上清を103倍~106倍希釈したものを用い、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。なお、陰性対照として、BEシャトル株の培養上清を103倍~106倍希釈したものを用いて、同様に解析した。
次に、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを精製せずに、培養上清を用いて、細胞傷害性活性を解析した。具体的には、実施例8で調製したDUM-126H株の培養上清を103倍~106倍希釈したものを用い、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。なお、陰性対照として、BEシャトル株の培養上清を103倍~106倍希釈したものを用いて、同様に解析した。
(結果)
BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、69.2%であったのに対して、DUM-126H株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、57.6%であった(図16参照)。この結果は、DUM-126H株の培養上清を用いた場合でも、HCT116細胞等の癌細胞の生存率を低下できることを示している。
BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、69.2%であったのに対して、DUM-126H株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、57.6%であった(図16参照)。この結果は、DUM-126H株の培養上清を用いた場合でも、HCT116細胞等の癌細胞の生存率を低下できることを示している。
[実施例11]DUM-126H株を含むミンス移植法によるインビボでの薬効
DUM-126H株が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞の担癌Scidマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の[11-1]~[11-4]の項目に記載の方法に従って解析した。
DUM-126H株が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞の担癌Scidマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の[11-1]~[11-4]の項目に記載の方法に従って解析した。
11-1 腫瘍体積の測定
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地(Sigma-Aldrich社製)で培養した後、7週齢のメスのScidマウス(日本エスエルシー社製)に移植して皮下担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが447.59~517.62mm3の担癌マウスをPBS投与群(12匹)、BEシャトル株投与群(14匹)及びDUM-126H株投与群(14匹)の3群に分けた(腫瘍ミンス移植5日前)。その後、1日目(腫瘍ミンス移植4日前)及び2日目(腫瘍ミンス移植3日前)のそれぞれに、PBS投与群には、0.2mLのPBSを尾静脈内投与し、BEシャトル株投与群には5.0×108cfu/0.2mLのBEシャトル株の凍結製剤を尾静脈内投与し、DUM-126H株投与群には、5.0×108cfu/0.2mLのDUM-126H株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与した。3群に分けてから1~4日後(腫瘍ミンス移植4日前~1日前)に、腫瘍部位でのビフィズス菌の生着や増殖を促進するために、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、4日後(腫瘍ミンス移植1日前)にPBS(-)で10倍に希釈した抗アシアロGM1抗体(富士フィルム和光純薬工業社製)0.2mLを腹腔内に投与した。なお、その後皮下移植するScidマウスに対しても同様に、抗アシアロGM1抗体を腹腔内に投与した。3群に分けてから5日後(腫瘍ミンス移植後0日目)に、各群(PBS投与群、BEシャトル株投与群、及びDUM-126H株投与群)のマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍をプールしてミンスをMatrigel(Corning社製)とHBSS(Life technologies社製)の1:1混合液で1.33倍に希釈し、調製後、培養したT-LAKを0.375×108cells/mLとなるように混合し、Teceleukin(塩野義製薬社製)を5000U/mLとなるように添加してミンス移植液を調製した。新たな7週齢のメスのScidマウスに0.2mLのミンス移植液を皮下移植し、それぞれ、PBS群(14匹)、BEシャトル株群(15匹)、及びDUM-126H株群(15匹)とした。なお、移植時点での腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数は、以下の「11-2」の項目に記載の方法に従って測定した。腫瘍ミンス移植後0日目~4日目、7日目~11日目、及び14日目~16日目に、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、腫瘍ミンス移植後7日目、11日目、14日目、及び17日目に、各群マウスにおける腫瘍径を測定し、腫瘍体積を、式「腫瘍体積=長径×短径2/2」基に算出した(図17参照)。腫瘍増殖抑制率[TGI]を、式「TGI=[1-腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(各組換えビフィズス菌株群)/腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(PBS群)]×100」を基に算出した。
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地(Sigma-Aldrich社製)で培養した後、7週齢のメスのScidマウス(日本エスエルシー社製)に移植して皮下担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが447.59~517.62mm3の担癌マウスをPBS投与群(12匹)、BEシャトル株投与群(14匹)及びDUM-126H株投与群(14匹)の3群に分けた(腫瘍ミンス移植5日前)。その後、1日目(腫瘍ミンス移植4日前)及び2日目(腫瘍ミンス移植3日前)のそれぞれに、PBS投与群には、0.2mLのPBSを尾静脈内投与し、BEシャトル株投与群には5.0×108cfu/0.2mLのBEシャトル株の凍結製剤を尾静脈内投与し、DUM-126H株投与群には、5.0×108cfu/0.2mLのDUM-126H株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与した。3群に分けてから1~4日後(腫瘍ミンス移植4日前~1日前)に、腫瘍部位でのビフィズス菌の生着や増殖を促進するために、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、4日後(腫瘍ミンス移植1日前)にPBS(-)で10倍に希釈した抗アシアロGM1抗体(富士フィルム和光純薬工業社製)0.2mLを腹腔内に投与した。なお、その後皮下移植するScidマウスに対しても同様に、抗アシアロGM1抗体を腹腔内に投与した。3群に分けてから5日後(腫瘍ミンス移植後0日目)に、各群(PBS投与群、BEシャトル株投与群、及びDUM-126H株投与群)のマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍をプールしてミンスをMatrigel(Corning社製)とHBSS(Life technologies社製)の1:1混合液で1.33倍に希釈し、調製後、培養したT-LAKを0.375×108cells/mLとなるように混合し、Teceleukin(塩野義製薬社製)を5000U/mLとなるように添加してミンス移植液を調製した。新たな7週齢のメスのScidマウスに0.2mLのミンス移植液を皮下移植し、それぞれ、PBS群(14匹)、BEシャトル株群(15匹)、及びDUM-126H株群(15匹)とした。なお、移植時点での腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数は、以下の「11-2」の項目に記載の方法に従って測定した。腫瘍ミンス移植後0日目~4日目、7日目~11日目、及び14日目~16日目に、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、腫瘍ミンス移植後7日目、11日目、14日目、及び17日目に、各群マウスにおける腫瘍径を測定し、腫瘍体積を、式「腫瘍体積=長径×短径2/2」基に算出した(図17参照)。腫瘍増殖抑制率[TGI]を、式「TGI=[1-腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(各組換えビフィズス菌株群)/腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(PBS群)]×100」を基に算出した。
11-2 腫瘍ミンス中の生菌数の測定
調製した腫瘍ミンスに、プロテアーゼインヒビター(ナカライテスク社製)含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理を行い、ホモジネートを調製した。ホモジネートの一部を分取し、以下の「11-3」の項目に記載の方法に従って、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを測定した。残りのホモジネートを、嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、BLFS寒天培地(250μg/mLの5-フルオロウラシル、及び30μg/mLのスペクチノマイシン含有BL寒天培地)に塗布し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。BLFS寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、腫瘍ミンスを調製する前の腫瘍、又は移植腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数を算出した(それぞれ、表8中の「腫瘍内の生菌数」及び「移植腫瘍ミンス中の生菌数」参照)。
調製した腫瘍ミンスに、プロテアーゼインヒビター(ナカライテスク社製)含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理を行い、ホモジネートを調製した。ホモジネートの一部を分取し、以下の「11-3」の項目に記載の方法に従って、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを測定した。残りのホモジネートを、嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、BLFS寒天培地(250μg/mLの5-フルオロウラシル、及び30μg/mLのスペクチノマイシン含有BL寒天培地)に塗布し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。BLFS寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、腫瘍ミンスを調製する前の腫瘍、又は移植腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数を算出した(それぞれ、表8中の「腫瘍内の生菌数」及び「移植腫瘍ミンス中の生菌数」参照)。
11-3 ELISA解析用腫瘍サンプルの調製
上記ホモジネートに、10×Cell Lysis buffer(500mMのTris-HCl[pH7.5]、1500mMの塩化ナトリウム、5%のNP-40、及び20mMのEDTA)と50×cOmplete(cOmplete[EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001]タブレット1つを、1mLの超純水で溶解して調製したもの)を添加し、撹拌後、氷上に30分間静置した。遠心分離後、上清を回収し、PBS(-)で希釈した後、プロテインL固相化ビーズ(Thermo Fischer Scientific社製)を添加し、4℃で撹拌しながら一晩反応させた。上記磁気ビーズ添加腫瘍上清液を磁気スタンドに立てた新しい2.0mLチューブに移し、反応後のプロテインL固相化ビーズを吸着させた。磁気ビーズが磁気により壁面に吸着した後、上清を除去し、同じ2.0mLチューブに1%Tween20を含むTBS(Tris Buffered Saline)を添加し、ボルテックスミキサーにより磁気ビーズを懸濁させ、2.0mLチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させた後に、洗浄液を除去することで磁気ビーズを洗浄した。同様の洗浄操作をさらに1%Tween20を含むTBSで1回、TBSで2回行った。最後の洗浄後、洗浄液を除去した後、吸着した磁気ビーズを15.9μLの0.1Mのグリシン-塩酸液(pH2.0)に懸濁し、室温にて10分間静置して、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを溶出させた。2.0mLチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させ、上清を新しい1.5mLチューブに回収した後1.59μLの1MのTris-HCl(pH9.0)で中和し、以下の「11-4」の項目に記載のELISA法に用いた。
上記ホモジネートに、10×Cell Lysis buffer(500mMのTris-HCl[pH7.5]、1500mMの塩化ナトリウム、5%のNP-40、及び20mMのEDTA)と50×cOmplete(cOmplete[EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001]タブレット1つを、1mLの超純水で溶解して調製したもの)を添加し、撹拌後、氷上に30分間静置した。遠心分離後、上清を回収し、PBS(-)で希釈した後、プロテインL固相化ビーズ(Thermo Fischer Scientific社製)を添加し、4℃で撹拌しながら一晩反応させた。上記磁気ビーズ添加腫瘍上清液を磁気スタンドに立てた新しい2.0mLチューブに移し、反応後のプロテインL固相化ビーズを吸着させた。磁気ビーズが磁気により壁面に吸着した後、上清を除去し、同じ2.0mLチューブに1%Tween20を含むTBS(Tris Buffered Saline)を添加し、ボルテックスミキサーにより磁気ビーズを懸濁させ、2.0mLチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させた後に、洗浄液を除去することで磁気ビーズを洗浄した。同様の洗浄操作をさらに1%Tween20を含むTBSで1回、TBSで2回行った。最後の洗浄後、洗浄液を除去した後、吸着した磁気ビーズを15.9μLの0.1Mのグリシン-塩酸液(pH2.0)に懸濁し、室温にて10分間静置して、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを溶出させた。2.0mLチューブを再び磁気スタンドに立て磁気ビーズを壁面に吸着させ、上清を新しい1.5mLチューブに回収した後1.59μLの1MのTris-HCl(pH9.0)で中和し、以下の「11-4」の項目に記載のELISA法に用いた。
11-4 ELISA法
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、ブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)で25℃にて2時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、上記「11-3」で調製した腫瘍サンプルと、後述する実施例13においてDUP-153株の培養上清から精製した検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)を16ng/mL~0.015625ng/mLに段階希釈したものとを、それぞれ、25℃で2時間インキュベートした。その後、各ウェルを、PBS-Tにて洗浄し、組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)の存在下、25℃で1時間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)の存在下、25℃で30分間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)の存在下、室温で20分間発色させ、Stop Solution(2Nの硫酸)(R&D Systems社製)にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT(Gen5 2.04)(DSファーマバイオメディカル社製)にて、TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、腫瘍ミンス中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した(表8中の「腫瘍ミンス中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb濃度」参照)。
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、ブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)で25℃にて2時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、上記「11-3」で調製した腫瘍サンプルと、後述する実施例13においてDUP-153株の培養上清から精製した検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)を16ng/mL~0.015625ng/mLに段階希釈したものとを、それぞれ、25℃で2時間インキュベートした。その後、各ウェルを、PBS-Tにて洗浄し、組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)の存在下、25℃で1時間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)の存在下、25℃で30分間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)の存在下、室温で20分間発色させ、Stop Solution(2Nの硫酸)(R&D Systems社製)にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT(Gen5 2.04)(DSファーマバイオメディカル社製)にて、TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、腫瘍ミンス中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した(表8中の「腫瘍ミンス中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb濃度」参照)。
(結果)
まず、BEシャトル株群及びDUM-126H株群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体(それぞれ、BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数が含まれることや、DUM-126H株がEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)を発現・分泌することを確認した(表8参照)。
まず、BEシャトル株群及びDUM-126H株群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体(それぞれ、BEシャトル株及びDUM-126H株)の生菌数が含まれることや、DUM-126H株がEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)を発現・分泌することを確認した(表8参照)。
次に、当該腫瘍ミンスを移植した各群の腫瘍体積を解析した結果、BEシャトル株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のPBS群マウスの腫瘍体積とほとんどかわらなかったのに対して、DUM-126H株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のPBS群マウスの腫瘍体積と比べ、有意に減少し、例えば、腫瘍ミンス移植後17日目において、PBS群に対する腫瘍増殖抑制率[TGI]は49.5%であった(図17参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、抗腫瘍効果があることを示している。
[実施例12]EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(DUP-143株及びDUP-153株)の作製
実施例1及び実施例5で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[12-1]~[12-4]の項目に記載の方法に従って作製した。
実施例1及び実施例5で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、ヒトEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[12-1]~[12-4]の項目に記載の方法に従って作製した。
12-1 プラスミドp143TLB6aの作製
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、Huプロモーター(PHu)をHu-sプロモーター(PHu-s;PHuの3’側の143ヌクレオチド残基からなる断片)(国際公開第2018/062225号公報におけるHu1に相当)へ変更し、P30プロモーターに代えてLH31ポリペプチド2を翻訳するためのリボソーム結合領域(RBS1[具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来のHup遺伝子の翻訳開始コドンの上流52ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド])を挿入するとともに、大腸菌複製起点pUCoriが除去されたプラスミドであって、N末端にSP50-L5に代えてSP50-L2が付加され、抗ヒトCD3抗体VLのKabat番号38番目のグルタミン(すなわち、配列番号5の38番目のグルタミン[Q])がグルタミン酸(E)へ置換されるとともに、抗ヒトEGFR抗体VHのKabat番号39番目のQ(すなわち、配列番号5の153番目のQ)がEへ置換されたLH31ポリペプチド1(以下、「変異LH31ポリペプチド1」ということがある)と;N末端にP50-L5に代えてSP52-L5が付加され、抗ヒトEGFR抗体VLのKabat番号38番目のQ(すなわち、配列番号6の38番目のQ)がリジン(K)へ置換されるとともに、抗ヒトCD3抗体VHのKabat番号39番目のQ(すなわち、配列番号6の153番目のQ)がKへ置換されたLH31ポリペプチド2(以下、「変異LH31ポリペプチド2」ということがある)と;を発現するプラスミド(プラスミドp143TLB6a)(図26参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図18~図26に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドp143TLB6aは、RBS1を挿入したことにより、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2をポリシストロニック(polycistronic)に発現し、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2から構成されるEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(以下、「変異LH31ダイアボディ型BsAb」ということがある)を分泌することができる。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、Huプロモーター(PHu)をHu-sプロモーター(PHu-s;PHuの3’側の143ヌクレオチド残基からなる断片)(国際公開第2018/062225号公報におけるHu1に相当)へ変更し、P30プロモーターに代えてLH31ポリペプチド2を翻訳するためのリボソーム結合領域(RBS1[具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来のHup遺伝子の翻訳開始コドンの上流52ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド])を挿入するとともに、大腸菌複製起点pUCoriが除去されたプラスミドであって、N末端にSP50-L5に代えてSP50-L2が付加され、抗ヒトCD3抗体VLのKabat番号38番目のグルタミン(すなわち、配列番号5の38番目のグルタミン[Q])がグルタミン酸(E)へ置換されるとともに、抗ヒトEGFR抗体VHのKabat番号39番目のQ(すなわち、配列番号5の153番目のQ)がEへ置換されたLH31ポリペプチド1(以下、「変異LH31ポリペプチド1」ということがある)と;N末端にP50-L5に代えてSP52-L5が付加され、抗ヒトEGFR抗体VLのKabat番号38番目のQ(すなわち、配列番号6の38番目のQ)がリジン(K)へ置換されるとともに、抗ヒトCD3抗体VHのKabat番号39番目のQ(すなわち、配列番号6の153番目のQ)がKへ置換されたLH31ポリペプチド2(以下、「変異LH31ポリペプチド2」ということがある)と;を発現するプラスミド(プラスミドp143TLB6a)(図26参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図18~図26に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドp143TLB6aは、RBS1を挿入したことにより、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2をポリシストロニック(polycistronic)に発現し、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2から構成されるEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(以下、「変異LH31ダイアボディ型BsAb」ということがある)を分泌することができる。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
12-2 DUP-143株の作製
プラスミドp143TLB6aを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp143TLB6aを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-143株)を取得した。
プラスミドp143TLB6aを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp143TLB6aを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-143株)を取得した。
12-3 プラスミドp153TLB6aの作製
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、Huプロモーター(PHu)をHu-sプロモーターへ変更し、P30プロモーターに代えてLH31ポリペプチド2を翻訳するためのリボソーム結合領域(RBS2[具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来の30S ribosomal protein S16遺伝子の翻訳開始コドンの上流54ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド])を挿入するとともに、大腸菌複製起点pUCoriが除去されたプラスミドであって、N末端にSP50-L5に代えてSP50-L2が付加された変異LH31ポリペプチド1と、N末端にSP50-L5に代えてSP52-L2が付加された変異LH31ポリペプチド2とを発現するプラスミド(プラスミドp153TLB6a)(図31参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図27~図31に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドp153TLB6aは、RBS2を挿入したことにより、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2をポリシストロニックし、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2から構成されるEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)を、分泌することができる。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
実施例1で作製したプラスミドpLH31-L5(図6参照)において、Huプロモーター(PHu)をHu-sプロモーターへ変更し、P30プロモーターに代えてLH31ポリペプチド2を翻訳するためのリボソーム結合領域(RBS2[具体的には、ビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株由来の30S ribosomal protein S16遺伝子の翻訳開始コドンの上流54ヌクレオチド残基からなるポリヌクレオチド])を挿入するとともに、大腸菌複製起点pUCoriが除去されたプラスミドであって、N末端にSP50-L5に代えてSP50-L2が付加された変異LH31ポリペプチド1と、N末端にSP50-L5に代えてSP52-L2が付加された変異LH31ポリペプチド2とを発現するプラスミド(プラスミドp153TLB6a)(図31参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図27~図31に示す手順に従って作製した。かかるプラスミドp153TLB6aは、RBS2を挿入したことにより、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2をポリシストロニックし、変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2から構成されるEGFR×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)を、分泌することができる。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
12-4 DUP-153株の作製
プラスミドp153TLB6aを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp153TLB6aを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-153株)を取得した。
プラスミドp153TLB6aを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp153TLB6aを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-153株)を取得した。
[実施例13]DUP-143株及びDUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのCD3への結合性評価
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEGFRとヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[13-1]及び[13-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEGFRとヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[13-1]及び[13-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
13-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、DUP-143株及びDUP-153株の培養上清から、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、DUP-143株及びDUP-153株の培養上清から、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
13-2 ELISA法
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを用いたELISA法は、実施例7の「7-2」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例21において精製した、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを用いたELISA法は、実施例7の「7-2」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、後述する実施例21において精製した、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
(結果)
吸光度の補正値は、DUP-143株及びDUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図15の「DUP-143」及び「DUP-153」参照)。一方、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図15の「CUM36-1H」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びヒトEGFRの両方に特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、DUP-143株及びDUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図15の「DUP-143」及び「DUP-153」参照)。一方、CUM-36-1H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図15の「CUM36-1H」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びヒトEGFRの両方に特異的に結合することを示している。
[実施例14]DUP-143株及びDUP-153株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量を、実施例8に記載の方法に従って測定した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb量を、実施例8に記載の方法に従って測定した。
(結果)
DUP-143株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、702±63(ng/mL)であり、DUP-153株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、634±46(ng/mL)であることが確認された。
DUP-143株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、702±63(ng/mL)であり、DUP-153株の培養上清中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)の濃度は、634±46(ng/mL)であることが確認された。
[実施例15]DUP-143株及びDUP-153株由来の変異LH31ダイアボディ型BsAbにおける変異LH31ポリペプチド1と、変異LH31ポリペプチド2との比率
ポリシストロニックに発現するプラスミドであるp143TLB6a及びp153TLB6aが、変異LH31ポリペプチド1と、変異LH31ポリペプチド2を同程度発現するものであるか確認した。
ポリシストロニックに発現するプラスミドであるp143TLB6a及びp153TLB6aが、変異LH31ポリペプチド1と、変異LH31ポリペプチド2を同程度発現するものであるか確認した。
上記実施例14で調製したDUP-143株及びDUP-153株の培養上清約50mLに硫酸アンモニウムを80%飽和になるよう添加し、4℃にて一晩撹拌し、塩析を行った。その後、遠心分離し、沈殿を回収し、PBS(-)1mLにて溶解した後、スペクトラ/ポア2透析膜(分画分子量;12~14kD)(SPECTRUM社製)に移し、PBS(-)中で4℃にて一晩透析を行った。途中で透析バッファーを交換し、透析後のタンパク溶液を限外ろ過デバイス(アミコンウルトラ-0.5、公称分画分子量;10KDa)(メルク社製)に移し、1/5容量に濃縮し、タンパク濃縮液を調製した(n=3)。タンパク濃縮液80μLにサンプルローディングバッファー20μLを混合し、95℃にて3分間熱処理を行い、電気泳動用サンプル(n=3)を調製した。かかる電気泳動用サンプルを、ミニプロティアン(登録商標)TGXゲル(4~20%)(バイオラッド社製)にて電気泳動し、染色液(Oriole蛍光ゲルステイン)(バイオラッド社製)にて染色した。
(結果)
DUP-143株及びDUP-153株にいずれにおいても、変異LH31ポリペプチド1に由来するバンド強度と、変異LH31ポリペプチド2に由来するバンド強度とは、同程度であった(図32及び表9参照)。この結果は、DUP-143株及びDUP-153株由来の変異LH31ダイアボディ型BsAbにおける変異LH31ポリペプチド1と、変異LH31ポリペプチド2とは、ほぼ同じ割合で発現することを示している。
DUP-143株及びDUP-153株にいずれにおいても、変異LH31ポリペプチド1に由来するバンド強度と、変異LH31ポリペプチド2に由来するバンド強度とは、同程度であった(図32及び表9参照)。この結果は、DUP-143株及びDUP-153株由来の変異LH31ダイアボディ型BsAbにおける変異LH31ポリペプチド1と、変異LH31ポリペプチド2とは、ほぼ同じ割合で発現することを示している。
[実施例16]DUP-143株及びDUP-153株の培養上清の細胞傷害性活性
DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清のそれぞれについて、103倍~106倍希釈したものを調製し、実施例10に記載の方法に従って、細胞傷害性活性を解析した。なお、癌細胞として、HCT116細胞に加えて、ヒト胆管癌細胞株であるTFK-1細胞(東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センター・細胞バンク)と、ヒト結腸癌細胞株であるRKO細胞(ATCC[American Type Culture. Collection]より入手)を用いた。
DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清のそれぞれについて、103倍~106倍希釈したものを調製し、実施例10に記載の方法に従って、細胞傷害性活性を解析した。なお、癌細胞として、HCT116細胞に加えて、ヒト胆管癌細胞株であるTFK-1細胞(東北大学加齢医学研究所 医用細胞資源センター・細胞バンク)と、ヒト結腸癌細胞株であるRKO細胞(ATCC[American Type Culture. Collection]より入手)を用いた。
(結果)
BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、78.0%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ103倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、1.2%及び5.4%であった(図33A参照)。また、BEシャトル株の培養上清を104倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、83.4%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ104倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、60.7%及び67.0%であった(図33A参照)。
BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、78.0%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ103倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、1.2%及び5.4%であった(図33A参照)。また、BEシャトル株の培養上清を104倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、83.4%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ104倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、60.7%及び67.0%であった(図33A参照)。
また、BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、69.2%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ103倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、それぞれ、19.9%及び24.4%であった(図33B参照)。また、BEシャトル株の培養上清を104倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、79.0%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ104倍希釈したものを用いた場合、HCT116細胞の生存率は、それぞれ、71.3%及び74.3%であった(図33B参照)。
また、BEシャトル株の培養上清を103倍希釈したものを用いた場合、RKO細胞の生存率は、87.9%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ103倍希釈したものを用いた場合、RKO細胞の生存率は、それぞれ、48.5%及び56.3%であった(図33C参照)。また、BEシャトル株の培養上清を104倍希釈したものを用いた場合、RKO細胞の生存率は、89.7%であったのに対して、DUP-143株の培養上清及びDUP-153株の培養上清を、それぞれ104倍希釈したものを用いた場合、RKO細胞の生存率は、それぞれ、82.6%及び95.0%であった(図33C参照)。
これらの結果は、DUP-143株培養上清や、DUP-153株培養上清中に分泌した変異LH31ダイアボディ型BsAbは、HCT116細胞、TFK-1細胞、RKO細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
また、DUP-143株(すなわち、プラスミドp143TLB6aを保持するB菌株)培養上清や、DUP-153株(すなわち、プラスミドp153TLB6aを保持するB菌株)培養上清を用いた場合、HCT116細胞の生存率を低下させる効果(29%及び35%)は、DUM-126H株(すなわち、プラスミドp126を保持するB菌株)培養上清を用いた場合の当該効果(83%)(実施例10参照)よりも上昇したことから、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbにおいて、抗ヒトCD3抗体由来のVLにおけるKabat番号38番目のQをEへ置換し、抗ヒトEGFR抗体由来のVHにおけるKabat番号39番目のQをEへ置換し、抗ヒトEGFR抗体由来のVLにおけるKabat番号38番目のQをKへ置換するとともに、抗ヒトCD3抗体由来のVHにおけるKabat番号39番目のQをKへ置換すると、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbによる癌細胞傷害活性が上昇する可能性があることを示している。
[実施例17]、DUP-143株及びDUP-153株の培養上清より精製したEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性評価
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製し、100fM~100pMの濃度に段階希釈した後、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株及びDUP-153株)が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、実施例7の「7-1」の項目に記載の方法に従って精製し、100fM~100pMの濃度に段階希釈した後、実施例4に記載の方法に従ってHCT116細胞の生存率を解析した。
(結果)
HCT116細胞の生存率は、DUP-143株及びDUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下し、EC50値は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの場合、1.8±0.9pMであり、DUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの場合、1.8±1.1pMであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
HCT116細胞の生存率は、DUP-143株及びDUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に低下し、EC50値は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの場合、1.8±0.9pMであり、DUP-153株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの場合、1.8±1.1pMであった。この結果は、ビフィズス菌形質転換体が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、変異LH31ダイアボディ型BsAb)は、癌細胞に対して傷害活性を有することを示している。
また、DUP-143株及びDUP-153株から精製した変異LH31ダイアボディ型BsAbを用いた場合のEC50値(1.8pM)は、DUM-126H株から精製したLH31ダイアボディ型BsAbを用いた場合のEC50値(8.4pM)(実施例9参照)よりも約21%まで低下していた。この結果は、DUP-143株やDUP-153株が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)方が、DUM-126H株が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH31ダイアボディ型BsAb)よりも癌細胞に対する細胞傷害性活性が高いことを示しており、実施例16の結果を支持している。
[実施例18]DUP-143株及びDUP-153株を含むミンス移植法によるインビボでの薬効
DUP-143株及びDUP-153株が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞の担癌Scidマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の方法に従って解析した。
DUP-143株及びDUP-153株が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの抗腫瘍効果を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞の担癌Scidマウスを用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下の方法に従って解析した。
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地で培養した後、9週齢のメスのScidマウスに皮下移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが263.83~476.70mm3の担癌マウスをBEシャトル株投与群(12匹)、DUM-126H株投与群(12匹)、DUP-143株投与群(12匹)、及びDUP-153株投与群(12匹)の4群に分けた(腫瘍ミンス移植5日前)。その後、1日目(腫瘍ミンス移植4日前)及び2日目(腫瘍ミンス移植3日前)のそれぞれに、BEシャトル株投与群には5.0×108cfu/0.2mLのBEシャトル株の凍結製剤を尾静脈内投与し、DUM-126H株投与群には、5.0×108cfu/0.2mLのDUM-126H株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与し、DUP-143株投与群には、5.0×108cfu/0.2mLのDUP-143株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与し、DUP-153株投与群には、5.0×108cfu/0.2mLのDUP-153株の簡易凍結製剤を尾静脈内投与した。4群に分けてから1~4日後(腫瘍ミンス移植4日前~1日前)に、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、4日後(腫瘍ミンス移植1日前)にPBS(-)で10倍に希釈した抗アシアロGM1抗体0.2mLを腹腔内に投与した。なお、その後皮下移植するScidマウスに対しても同様に、抗アシアロGM1抗体を腹腔内に投与した。4群に分けてから5日後(腫瘍ミンス移植後0日目)に、各群(BEシャトル株投与群、DUM-126H株投与群、DUP-143株投与群、及びDUP-153株投与群)のマウスから腫瘍を摘出し、腫瘍をプールしてミンスをMatrigel(Corning社製)とHBSS(Life technologies社製)の1:1混合液で1.33倍に希釈し、培養したT-LAKを0.375×108cells/mLとなるように混合し、Teceleukin(塩野義製薬社製)を5000U/mLとなるように添加してミンス移植液を調製した。新たな7週齢のメスのScidマウスに0.2mLのミンス移植液を皮下移植し、それぞれ、BEシャトル株群、DUM-126H株群、DUP-143株群、及びDUP-153株群(各群12匹)とした。なお、腫瘍ミンスを調製する前の腫瘍、又は移植腫瘍ミンスに含まれるビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株、DUM-126H株、DUP-143株、及びDUP-153株)の生菌数は、上記「11-2」の項目に記載の方法に従って測定し(それぞれ、表10中の「腫瘍内の生菌数」及び「移植腫瘍ミンス中の生菌数」参照)、腫瘍ミンスに含まれるEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度は、上記「11-3」及び「11-4」の項目に記載の方法に従って測定した(表10中の「腫瘍ミンス中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb濃度」参照)。腫瘍ミンス移植後0日目~4日目、7日目~11日目、及び14日目~16日目に、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で腹腔内投与し、腫瘍ミンス移植後7日目、11日目、14日目、及び17日目に、各群マウスにおける腫瘍径を測定し、腫瘍体積を、式「腫瘍体積=長径×短径2/2」基に算出した(図34参照)。腫瘍増殖抑制率[TGI]を、式「TGI=[1-腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(各ダイアボディ型BsAb分泌ビフィズス菌株群)/腫瘍ミンス移植後17日の平均腫瘍体積(BEシャトル株群)]×100」を基に算出した。
(結果)
まず、各群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株、DUM-126H株、DUP-143株、及びDUP-153株)の生菌数が含まれることや、陰性対照以外の3種類のビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株、DUP-143株、及びDUP-153株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAbや変異LH31ダイアボディ型BsAb)を発現・分泌することを確認した(表10参照)。
まず、各群において、移植に用いた腫瘍ミンス中に、ビフィズス菌形質転換体(BEシャトル株、DUM-126H株、DUP-143株、及びDUP-153株)の生菌数が含まれることや、陰性対照以外の3種類のビフィズス菌形質転換体(DUM-126H株、DUP-143株、及びDUP-153株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAbや変異LH31ダイアボディ型BsAb)を発現・分泌することを確認した(表10参照)。
次に、当該腫瘍ミンスを移植した各群の腫瘍体積を解析した結果、DUP-143株群マウスの腫瘍体積や、DUP-153株群マウスの腫瘍体積は、陰性対照のBEシャトル株群マウスの腫瘍体積と比べ、有意に減少した(図34参照)。また、腫瘍ミンス中に含まれるDUP-143株やDUP-153株のダイアボディ型BsAb濃度は、DUM-126H株のダイアボディ型BsAb濃度よりも少なかったにもかかわらず(表10参照)、腫瘍体積の減少効果は、DUM-126H株を用いた場合よりも、DUP-143株やDUP-153株を用いた場合の方が大きかった(図34参照)。具体的には、腫瘍ミンス移植後17日目において、BEシャトル株群に対するTGIは、DUM-126H株群では43.1%であったのに対して、DUP-143株群では60.6%、DUP-153株では61.5%と高かった。この結果は、DUP-143株やDUP-153株が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)方が、DUM-126H株が発現・分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(LH31ダイアボディ型BsAb)よりも抗腫瘍効果が高いことを示しており、実施例16及び17の結果を支持している。
[実施例19]HER2×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)の作製
HER2×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[19-1]及び[19-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
HER2×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[19-1]及び[19-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
19-1 プラスミドpLH36-1及びpLH36-2の作製
HER2×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号14のアミノ酸配列からなるLH36ポリペプチド1[表11参照]と、配列番号15のアミノ酸配列からなるLH36ポリペプチド2[表12参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「LH36ダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、LH36ポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図35A参照)と、配列番号17のヌクレオチド配列からなる、LH36ポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図35B参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図36~40に示す手順に従って、プラスミドpLH36-1(図39参照)及びpLH36-2(図40参照)を作製した。プラスミドpLH36-1は、より具体的には、SP50-L5(配列番号10のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド1と、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド2とを発現するプラスミドである(図39参照)。また、プラスミドpLH36-2は、より具体的には、SP50-L5(配列番号10のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド2とを発現するプラスミドである(図40参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
HER2×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号14のアミノ酸配列からなるLH36ポリペプチド1[表11参照]と、配列番号15のアミノ酸配列からなるLH36ポリペプチド2[表12参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「LH36ダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号16のヌクレオチド配列からなる、LH36ポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図35A参照)と、配列番号17のヌクレオチド配列からなる、LH36ポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図35B参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図36~40に示す手順に従って、プラスミドpLH36-1(図39参照)及びpLH36-2(図40参照)を作製した。プラスミドpLH36-1は、より具体的には、SP50-L5(配列番号10のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド1と、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド2とを発現するプラスミドである(図39参照)。また、プラスミドpLH36-2は、より具体的には、SP50-L5(配列番号10のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH36ポリペプチド2とを発現するプラスミドである(図40参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
19-2 CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株の作製
プラスミドpLH36-1及びpLH36-2を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpLH36-1を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(CUM-36-1H株)と、プラスミドpLH36-2を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(CUM-36-2H株)を取得した。
プラスミドpLH36-1及びpLH36-2を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpLH36-1を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(CUM-36-1H株)と、プラスミドpLH36-2を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(CUM-36-2H株)を取得した。
[実施例20]CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株の発現・分泌評価(WB)
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が、HER2×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が、HER2×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
(結果)
CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清中に、HER2×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図41参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)は、HER2×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH36ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清中に、HER2×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図41参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)は、HER2×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH36ダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
[実施例21]CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbのHER2及びヒトCD3への結合性評価
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が分泌するHER2×CD3ダイアボディ型BsAbが、HER2及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[21-1]及び[21-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が分泌するHER2×CD3ダイアボディ型BsAbが、HER2及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[21-1]及び[21-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
21-1 HER2×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が分泌するLH36ダイアボディ型BsAbを、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株の培養上清から、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
ビフィズス菌形質転換体(CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株)が分泌するLH36ダイアボディ型BsAbを、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株の培養上清から、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
21-2 ELISA法
21-2-1 抗原・抗体反応処理
抗体(LH36ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理は、実施例3の「3-2-1」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、実施例3において精製した、3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
21-2-1 抗原・抗体反応処理
抗体(LH36ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理は、実施例3の「3-2-1」の項目に記載の方法に従って行った。また、ネガティブコントロールとして、実施例3において精製した、3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを用いた。
21-2-2 抗体の検出
0.1μg/mLの組換えビオチン化HER2(Acro Biosystems社製)を含むシグナ
ル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図42の縦軸参照)を算出した。
0.1μg/mLの組換えビオチン化HER2(Acro Biosystems社製)を含むシグナ
ル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図42の縦軸参照)を算出した。
(結果)
吸光度の補正値は、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(それぞれ、図42の「CUM-36-1H」及び「CUM-36-2H」参照)。一方、3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図42の「FLM-9H」、「FOM-22H」、及び「DUM-31H」参照)。この結果は、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株が発現・分泌するHER2×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH36ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びHER2の両方に特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株由来のHER2×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(それぞれ、図42の「CUM-36-1H」及び「CUM-36-2H」参照)。一方、3種類のビフィズス菌形質転換体(FLM-9H株、FOM-22H株、及びDUM-31H株)由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図42の「FLM-9H」、「FOM-22H」、及び「DUM-31H」参照)。この結果は、CUM-36-1H株及びCUM-36-2H株が発現・分泌するHER2×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH36ダイアボディ型BsAb)は、ヒトCD3及びHER2の両方に特異的に結合することを示している。
[実施例22]CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清の細胞傷害性活性
CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清のそれぞれについて、10倍~104倍希釈したものを調製し、実施例10に記載の方法に従って、TFK-1細胞に対する細胞傷害性活性を解析した。
CUM-36-1H株培養上清及びCUM-36-2H株培養上清のそれぞれについて、10倍~104倍希釈したものを調製し、実施例10に記載の方法に従って、TFK-1細胞に対する細胞傷害性活性を解析した。
(結果)
BEシャトル株の培養上清を10倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、95.0%であったのに対して、CUM-36-1H株の培養上清及びCUM-36-2H株の培養上清を、それぞれ10倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、3.1%及び4.7%であった(図43参照)。また、BEシャトル株の培養上清を102倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、107.2%であったのに対して、CUM-36-1H株の培養上清及びCUM-36-2H株の培養上清を、それぞれ102倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、26.2%及び18.3%であった(図43参照)。この結果は、CUM-36-1H株の培養上清や、CUM-36-2H株の培養上清中に分泌したHER2×CD3ダイアボディ型BsAbは、TFK-1細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
BEシャトル株の培養上清を10倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、95.0%であったのに対して、CUM-36-1H株の培養上清及びCUM-36-2H株の培養上清を、それぞれ10倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、3.1%及び4.7%であった(図43参照)。また、BEシャトル株の培養上清を102倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、107.2%であったのに対して、CUM-36-1H株の培養上清及びCUM-36-2H株の培養上清を、それぞれ102倍希釈したものを用いた場合、TFK-1細胞の生存率は、それぞれ、26.2%及び18.3%であった(図43参照)。この結果は、CUM-36-1H株の培養上清や、CUM-36-2H株の培養上清中に分泌したHER2×CD3ダイアボディ型BsAbは、TFK-1細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
[実施例23]EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(EUM-H株)の作製
ヒトEpCAM×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[23-1]及び[23-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
ヒトEpCAM×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[23-1]及び[23-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
23-1 プラスミドpEUM-Hの作製
ヒトEpCAM×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号82のアミノ酸配列からなるEUM-Hポリペプチド1[表13参照]と、配列番号83のアミノ酸配列からなるEUM-Hポリペプチド2[表14参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「EUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号84のヌクレオチド配列からなる、EUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図44参照)と、配列番号85のヌクレオチド配列からなる、EUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図45参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図44~46に示す手順に従って、プラスミドpEUM-H(図46参照)を作製した。プラスミドpEUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたEUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたEUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図46参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
ヒトEpCAM×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号82のアミノ酸配列からなるEUM-Hポリペプチド1[表13参照]と、配列番号83のアミノ酸配列からなるEUM-Hポリペプチド2[表14参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「EUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号84のヌクレオチド配列からなる、EUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図44参照)と、配列番号85のヌクレオチド配列からなる、EUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図45参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図44~46に示す手順に従って、プラスミドpEUM-H(図46参照)を作製した。プラスミドpEUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたEUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたEUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図46参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
23-2 EUM-H株の作製
プラスミドpEUM-Hを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpEUM-Hを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(EUM-H株)を取得した。
プラスミドpEUM-Hを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株への形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpEUM-Hを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(EUM-H株)を取得した。
[実施例24]EUM-H株の発現・分泌評価(WB)
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、EUM-H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、EUM-H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
(結果)
EUM-H株培養上清中に、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図47参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)は、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、EUM-Hダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
EUM-H株培養上清中に、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図47参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)は、EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、EUM-Hダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
[実施例25]EUM-H株由来のEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbのヒトEpCAM及びヒトCD3への結合性評価
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEpCAM及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[25-1]及び[25-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbが、ヒトEpCAM及びヒトCD3の両方に特異的に結合することを、以下の[25-1]及び[25-2]の項目に記載の方法に従って確認した。
25-1 EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEUM-Hダイアボディ型BsAbを、EUM-H株の培養上清から、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEUM-Hダイアボディ型BsAbを、EUM-H株の培養上清から、実施例3の「3-1」の項目に記載の方法に従って精製した。
25-2 ELISA法
25-2-1 抗原・抗体反応処理
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(AcroBiosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbと、陰性対照として100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbとを、それぞれ1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI A液(ナカライテスク社製)にて50倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
25-2-1 抗原・抗体反応処理
2.5μg/mLのヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(AcroBiosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbと、陰性対照として100(ng/mL)、又は1000(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbとを、それぞれ1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI A液(ナカライテスク社製)にて50倍に希釈し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で2時間静置することにより、抗体(EpCAM×CD3ダイアボディ型BsAb)と、抗原(固相化したヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質)の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
25-2-2 抗体の検出
0.1μg/mLの組換えビオチン化EpCAM(Acro Biosystems社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で1時間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図48の縦軸参照)を算出した。
0.1μg/mLの組換えビオチン化EpCAM(Acro Biosystems社製)を含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で1時間静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差、図48の縦軸参照)を算出した。
(結果)
吸光度の補正値は、EUM-H株由来のEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図48の「EUM-H」参照)。一方、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図48の「DUP-143」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbは、ヒトCD3及びEpCAMの両方に特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、EUM-H株由来のEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図48の「EUM-H」参照)。一方、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbでは、吸光度の補正値の増加は認められなかった(図48の「DUP-143」参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(EUM-H株)が分泌するEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbは、ヒトCD3及びEpCAMの両方に特異的に結合することを示している。
[実施例26]EUM-H株培養上清より精製したダイアボディの細胞傷害性活性
方法は実施例4と同様である。ただし、細胞に添加するダイアボディとして、EUM-H株培養上清より精製したダイアボディを、100fMから1nMの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図49に示した。
方法は実施例4と同様である。ただし、細胞に添加するダイアボディとして、EUM-H株培養上清より精製したダイアボディを、100fMから1nMの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図49に示した。
(結果)
図49に示すとおり、EUM-H株培養上清より精製したダイアボディは、EpCAM陽性であるヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞に対して細胞傷害活性を示し、EC50値は17.3pMであった。この結果は、EUM-H株の培養上清中に分泌したEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbは、HCT116細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
図49に示すとおり、EUM-H株培養上清より精製したダイアボディは、EpCAM陽性であるヒト結腸癌細胞株であるHCT116細胞に対して細胞傷害活性を示し、EC50値は17.3pMであった。この結果は、EUM-H株の培養上清中に分泌したEpCAM×CD3ダイアボディ型BsAbは、HCT116細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
[実施例27]PSMA×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)の作製
ヒトPSMA×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[27-1]及び[27-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
ヒトPSMA×ヒトCD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[27-1]及び[27-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
27-1 プラスミドpLH-PUM-H及びpHL-PUM-Hの作製
ヒトPSMA×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号86のアミノ酸配列からなるLH-PUM-Hポリペプチド1[表15参照]と、配列番号87のアミノ酸配列からなるLH-PUM-Hポリペプチド2[表16参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「LH-PUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある]を発現・分泌するビフィズス菌や、配列番号88のアミノ酸配列からなるHL-PUM-Hポリペプチド1[表17参照]と、配列番号89のアミノ酸配列からなるHL-PUM-Hポリペプチド2[表18参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「HL-PUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号90のヌクレオチド配列からなる、LH-PUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図50参照)と、配列番号91のヌクレオチド配列からなる、LH-PUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図51参照)や、配列番号92のヌクレオチド配列からなる、HL-PUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図52参照)と、配列番号93のヌクレオチド配列からなる、HL-PUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図53参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図50~55に示す手順に従って、プラスミドpLH-PUM-H(図54参照)及びpHL-PUM-H(図55参照)を作製した。プラスミドpLH-PUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH-PUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH-PUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図54参照)。プラスミドpHL-PUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたHL-PUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたHL-PUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図55参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
ヒトPSMA×ヒトCD3ダイアボディ型BsAb(具体的には、配列番号86のアミノ酸配列からなるLH-PUM-Hポリペプチド1[表15参照]と、配列番号87のアミノ酸配列からなるLH-PUM-Hポリペプチド2[表16参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「LH-PUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある]を発現・分泌するビフィズス菌や、配列番号88のアミノ酸配列からなるHL-PUM-Hポリペプチド1[表17参照]と、配列番号89のアミノ酸配列からなるHL-PUM-Hポリペプチド2[表18参照]とから構成されるダイアボディ型BsAb[以下、「HL-PUM-Hダイアボディ型BsAb」ということがある])を発現・分泌するビフィズス菌を作製するために、配列番号90のヌクレオチド配列からなる、LH-PUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図50参照)と、配列番号91のヌクレオチド配列からなる、LH-PUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図51参照)や、配列番号92のヌクレオチド配列からなる、HL-PUM-Hポリペプチド1のコード配列を含むDNA(図52参照)と、配列番号93のヌクレオチド配列からなる、HL-PUM-Hポリペプチド2のコード配列を含むDNA(図53参照)を、ジェンスクリプトジャパン社に委託し、合成した後、図50~55に示す手順に従って、プラスミドpLH-PUM-H(図54参照)及びpHL-PUM-H(図55参照)を作製した。プラスミドpLH-PUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH-PUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたLH-PUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図54参照)。プラスミドpHL-PUM-Hは、より具体的には、SP50-L2(配列番号13のアミノ酸配列)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたHL-PUM-Hポリペプチド1と、SP52-L2(すなわち、分泌シグナルペプチドSP52[配列番号18の1~35番目のアミノ酸残基]とL2リンカーペプチド[配列番号18の36~37番目のアミノ酸残基]との連結ペプチド)及びc-Myc-His融合タグ(配列番号11のアミノ酸配列)が、それぞれN末端側及びC末端側に付加されたHL-PUM-Hポリペプチド2を発現するプラスミドである(図55参照)。なお、PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
27-2 LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の作製
プラスミドpLH-PUM-H及びpHL-PUM-Hを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株の形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpLH-PUM-H及びpHL-PUM-Hを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)を取得した。
プラスミドpLH-PUM-H及びpHL-PUM-Hを用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株の形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドpLH-PUM-H及びpHL-PUM-Hを保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)を取得した。
[実施例28]LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の発現・分泌評価(WB)
ビフィズス菌形質転換体(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)が、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
ビフィズス菌形質転換体(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)が、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例2に記載の方法に従って、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株培養上清を用いたウェスタンブロッティング法を行った。
(結果)
LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株培養上清中に、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図56参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)は、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH-PUM-Hダイアボディ型BsAb及びHL-PUM-Hダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株培養上清中に、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAbに由来する30kDa付近のバンドが認められた(図56参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株)は、PSMA×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH-PUM-Hダイアボディ型BsAb及びHL-PUM-Hダイアボディ型BsAb)を発現し分泌することを示している。
[実施例29]LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株培養上清より精製したダイアボディの細胞傷害性活性
方法は実施例4と同様である。ただし、細胞はヒトPSMA陽性である22Rv1細胞を用い、細胞に添加するダイアボディとして、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清より精製したダイアボディ(実施例3の「3-1」と同様の方法にて精製)を、1pMから100nMの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図57に示した。
方法は実施例4と同様である。ただし、細胞はヒトPSMA陽性である22Rv1細胞を用い、細胞に添加するダイアボディとして、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清より精製したダイアボディ(実施例3の「3-1」と同様の方法にて精製)を、1pMから100nMの濃度に段階希釈したものを用いた。結果を図57に示した。
(結果)
図57に示すとおり、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清より精製したダイアボディは、PSMA陽性であるヒト前立腺癌細胞株である22Rv1細胞に対して細胞傷害活性を示し、EC50値はそれぞれ155.0pM及び232.6pMであった。この結果は、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清中に分泌したPSMA×CD3ダイアボディ型BsAbは、22Rv1細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
図57に示すとおり、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清より精製したダイアボディは、PSMA陽性であるヒト前立腺癌細胞株である22Rv1細胞に対して細胞傷害活性を示し、EC50値はそれぞれ155.0pM及び232.6pMであった。この結果は、LH-PUM-H株及びHL-PUM-H株の培養上清中に分泌したPSMA×CD3ダイアボディ型BsAbは、22Rv1細胞等の癌細胞に対して細胞傷害性活性を有することを示している。
[実施例30]DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのヒトHER3への結合性評価
30-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、実施例7の「7-1」と同様の方法で精製した。
30-1 EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、実施例7の「7-1」と同様の方法で精製した。
30-2 ELISA法
30-2-1 抗原・抗体反応処理
1.0μg/mLのヒトHER3組換えタンパク質(Sino Biological社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水(大塚製薬社製)にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。0(ng/mL)、0.1(ng/mL)、1(ng/mL)、10(ng/mL)、又は100(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを含む液を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI A液(ナカライテスク社製)にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注した。25℃で2時間静置することにより、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbと、固相化したヒトHER3組換えタンパク質の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
30-2-1 抗原・抗体反応処理
1.0μg/mLのヒトHER3組換えタンパク質(Sino Biological社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。固相化処理後の液を除去し、各ウェルを200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。その後、蒸留水(大塚製薬社製)にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)を200μL分注し、25℃で2時間静置し、ブロッキング処理を行った。各ウェルのブロッキング液を除去し、200μLのPBS-Tで3回洗浄した。0(ng/mL)、0.1(ng/mL)、1(ng/mL)、10(ng/mL)、又は100(ng/mL)のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを含む液を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI A液(ナカライテスク社製)にて調製し、ブロッキング処理した各ウェルに25μLずつ分注した。25℃で2時間静置することにより、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbと、固相化したヒトHER3組換えタンパク質の反応処理を行った。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。
30-2-2 抗体の検出
組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)にて0.05μg/mLに調製し、25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4.0μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差)を算出した(図58参照)。
組換えビオチン化プロテインL(Thermo Fischer Scientific社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)にて0.05μg/mLに調製し、25μLを、抗原・抗体反応処理を行った上記各ウェルに分注し、25℃で1時間静置した。各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)を、1%BSAを含むシグナル増強剤HIKARI B液(ナカライテスク社製)を用いて4.0μL/mLに調整した後、各ウェルに25μLずつ分注し、25℃で30分静置した。その後、各ウェルの液を除去し、200μLのPBS-Tにて3回洗浄した。検出試薬としてColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)を等量ずつ混ぜた後、各ウェルに50μLずつ分注し、遮光して室温で20分間静置した。その後、Stop Solution(R&D Systems社製)を25μLずつ添加し、呈色反応を停止した。TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度を測定し、570nmの吸光度(陰性対照)で補正した値(平均値±標準偏差)を算出した(図58参照)。
(結果)
吸光度の補正値は、DUM-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図58参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトEGFRに加えて、ヒトHER3に対しても特異的に結合することを示している。
吸光度の補正値は、DUM-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図58参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(すなわち、LH31ダイアボディ型BsAb)は、ヒトEGFRに加えて、ヒトHER3に対しても特異的に結合することを示している。
[実施例31]DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性評価
EGFRの発現量やHER3の発現量が異なる癌細胞株、具体的には、1種類のヒト類表皮癌細胞株(A-431)、1種類のヒト非小細胞肺癌細胞株(NCI-H1975)、及び4種類のヒト結腸癌細胞株(HCT116、HT-29、RKO、及びSW620)の計6種類の癌細胞株を用いて、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性を評価した。
EGFRの発現量やHER3の発現量が異なる癌細胞株、具体的には、1種類のヒト類表皮癌細胞株(A-431)、1種類のヒト非小細胞肺癌細胞株(NCI-H1975)、及び4種類のヒト結腸癌細胞株(HCT116、HT-29、RKO、及びSW620)の計6種類の癌細胞株を用いて、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性を評価した。
31-1 各種癌細胞株におけるEGFR及びHER3の発現量の測定
上記6種類の癌細胞株におけるEGFR及びHER3の発現量は、それぞれ、抗ヒトEGFR抗体(clone AY13)(BioLegend社製)及び抗ヒトerbB3/HER3抗体(clone 1B4C3)(BioLegend社製)と、QIFIKIT(Agilent Technologies社製)とを用い、かかるキットに添付されたプロトロールに従って定量した。測定はBD FACSCantoIIを用い、解析にはフローサイトメトリー解析ソフトウェア(Kaluza Ver2.1)(BECKMAN COULTER社製)を用いた。
上記6種類の癌細胞株におけるEGFR及びHER3の発現量は、それぞれ、抗ヒトEGFR抗体(clone AY13)(BioLegend社製)及び抗ヒトerbB3/HER3抗体(clone 1B4C3)(BioLegend社製)と、QIFIKIT(Agilent Technologies社製)とを用い、かかるキットに添付されたプロトロールに従って定量した。測定はBD FACSCantoIIを用い、解析にはフローサイトメトリー解析ソフトウェア(Kaluza Ver2.1)(BECKMAN COULTER社製)を用いた。
31-2 細胞傷害活性の測定法
上記1種類のヒト類表皮癌細胞株及び4種類のヒト結腸癌細胞株を、それぞれ1×104cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種するとともに、上記1種類のヒト非小細胞肺癌細胞株を、5×103cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞として3ドナーから分離したヒトPBMC(図59-1及び図59-2中の「PBMC#4」、「PBMC#6」、及び「PBMC#7」)を、各種癌細胞株との比率が20:1となるように混合した後、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、A-431、HCT116、HT-29、及びSW620に対しては、30fMから30pMの濃度に段階希釈したものをそれぞれに添加し(図59-1及び図59-2の横軸)、NCI-H1975及びRKOに対しては、1pMから1nMの濃度に段階希釈したものを添加し(図59-1及び図59-2の横軸)、培地量が計200μLとなるようにした。その後、37℃、5%CO2に設定した培養器にて培養を行い、72時間後、ウェルをRPMI-1640培地にて3度洗浄を行い、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社製)試薬を含むRPMI-1640培地を、各ウェルに120μLずつ添加した。測定は490nmの吸光度を測定し、対照波長として660nmの吸光度を測定した。細胞傷害活性は、癌細胞株のみのウェルにおける細胞傷害活性を0%、ブランクのウェルにおける細胞傷害活性を100%として算出した(n=3ウェル)。試験は2回実施した。
上記1種類のヒト類表皮癌細胞株及び4種類のヒト結腸癌細胞株を、それぞれ1×104cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種するとともに、上記1種類のヒト非小細胞肺癌細胞株を、5×103cells/ウェルとなるように96ウェルプレートに播種した。エフェクター細胞として3ドナーから分離したヒトPBMC(図59-1及び図59-2中の「PBMC#4」、「PBMC#6」、及び「PBMC#7」)を、各種癌細胞株との比率が20:1となるように混合した後、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを、A-431、HCT116、HT-29、及びSW620に対しては、30fMから30pMの濃度に段階希釈したものをそれぞれに添加し(図59-1及び図59-2の横軸)、NCI-H1975及びRKOに対しては、1pMから1nMの濃度に段階希釈したものを添加し(図59-1及び図59-2の横軸)、培地量が計200μLとなるようにした。その後、37℃、5%CO2に設定した培養器にて培養を行い、72時間後、ウェルをRPMI-1640培地にて3度洗浄を行い、CellTiter 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay(Promega社製)試薬を含むRPMI-1640培地を、各ウェルに120μLずつ添加した。測定は490nmの吸光度を測定し、対照波長として660nmの吸光度を測定した。細胞傷害活性は、癌細胞株のみのウェルにおける細胞傷害活性を0%、ブランクのウェルにおける細胞傷害活性を100%として算出した(n=3ウェル)。試験は2回実施した。
(結果)
各癌細胞株におけるEGFR及びHER3の発現量を、以下の表19に示す。
各癌細胞株におけるEGFR及びHER3の発現量を、以下の表19に示す。
(結果)
上記6種類の癌細胞株のすべてについて、EGFR及びHER3のいずれか一方、又は両方の発現が認められたが、ヒト類表皮癌細胞株(A-431)におけるEGFR及びHER3の発現量が、最も高く、それぞれ703858(site/cells)及び8622(site/cells)であった(表19参照)上記6種類の癌細胞株に対するDUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性を測定した結果、上記6種類の癌細胞株の細胞傷害率は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図59-1及び図59-2参照)。この結果は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、EGFR又はHER3を発現する癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値は、A-431では1.6pM、NCI-H1975では9.6pM、HT-29では3.6pM、HCT116では4.2pM、RKOでは38.4pM、SW620では3.2pMであった。
上記6種類の癌細胞株のすべてについて、EGFR及びHER3のいずれか一方、又は両方の発現が認められたが、ヒト類表皮癌細胞株(A-431)におけるEGFR及びHER3の発現量が、最も高く、それぞれ703858(site/cells)及び8622(site/cells)であった(表19参照)上記6種類の癌細胞株に対するDUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの細胞傷害性活性を測定した結果、上記6種類の癌細胞株の細胞傷害率は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度依存的に増加することが示された(図59-1及び図59-2参照)。この結果は、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、EGFR又はHER3を発現する癌細胞に対して細胞傷害活性を有することを示している。なお、DUP-143株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbのEC50値は、A-431では1.6pM、NCI-H1975では9.6pM、HT-29では3.6pM、HCT116では4.2pM、RKOでは38.4pM、SW620では3.2pMであった。
[実施例32]変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌(DUP-199HAF株)の作製
実施例12で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[32-1]~[32-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
実施例12で作製したビフィズス菌形質転換体とは別に、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィズス菌を、以下の[32-1]~[32-2]の項目に記載の方法に従って作製した。
32-1 プラスミドp199の作製
C末端にHAタグ(配列番号102のアミノ酸配列からなるポリペプチド)が融合した変異LH31ポリペプチド1と、C末端にc-Mycタグ(配列番号103のアミノ酸配列からなるポリペプチド)及びFLAGタグ(配列番号104のアミノ酸配列からなるポリペプチド)が融合した変異LH31ポリペプチド2とを発現するプラスミド(プラスミドp199)(図62参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図60~62に示す手順に従って作製した。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
C末端にHAタグ(配列番号102のアミノ酸配列からなるポリペプチド)が融合した変異LH31ポリペプチド1と、C末端にc-Mycタグ(配列番号103のアミノ酸配列からなるポリペプチド)及びFLAGタグ(配列番号104のアミノ酸配列からなるポリペプチド)が融合した変異LH31ポリペプチド2とを発現するプラスミド(プラスミドp199)(図62参照)を、実施例1と同様の方法を用い、図60~62に示す手順に従って作製した。PCRに使用したプライマーセットは表7に示す。
32-2 DUP-199HAF株の作製
プラスミドp199を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株の形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp199を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-199HAF株)を取得した。
プラスミドp199を用いたビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株の形質転換は、実施例1と同様の方法で行い、プラスミドp199を保持するビフィドバクテリウム・ロンガム105-A株(DUP-199HAF株)を取得した。
[実施例33]DUP-199HAF株の発現・分泌評価(SDS-PAGE)
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、以下の「33-1」及び「33-2」の項目に記載の方法に従って確認した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、以下の「33-1」及び「33-2」の項目に記載の方法に従って確認した。
33-1 変異LH31ダイアボディ型BsAbの精製
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が分泌する変異LH31ダイアボディ型BsAbを、DUP-199HAF株の培養上清から実施例7の「7-1」の項目に記載の方法において、DUP-199HAF株培養上清を精製した。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が分泌する変異LH31ダイアボディ型BsAbを、DUP-199HAF株の培養上清から実施例7の「7-1」の項目に記載の方法において、DUP-199HAF株培養上清を精製した。
33-2 変異LH31ダイアボディ型BsAbの発現・分泌評価(SDS-PAGE)
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例15に記載の方法に従って、DUP-199HAF株の培養上清精製溶液を用いたSDS-PAGEを行い、蛍光染色を行った。
ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し分泌することを確認するために、実施例15に記載の方法に従って、DUP-199HAF株の培養上清精製溶液を用いたSDS-PAGEを行い、蛍光染色を行った。
(結果)
DUP-199HAF株培養上清中に、変異LH31ダイアボディ型BsAbを構成する変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図63参照)。この結果は、DUP-199HAF株は、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し、分泌することを示している。
DUP-199HAF株培養上清中に、変異LH31ダイアボディ型BsAbを構成する変異LH31ポリペプチド1及び変異LH31ポリペプチド2に由来する2つのバンドが、30kDa付近に認められた(図63参照)。この結果は、DUP-199HAF株は、変異LH31ダイアボディ型BsAbを発現し、分泌することを示している。
[実施例34]DUP-199HAF株のマウス尾静脈投与によるビフィズス菌及び変異LH31ダイアボディ型BsAbの組織分布
DUP-199HAF株のマウス尾静脈投与によるビフィズス菌の組織分布と、腫瘍及び血液中の変異LH31ダイアボディ型BsAb濃度の推移を確認するために、DUP-199HAF株を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞を移植した担癌SCIDマウスへ静脈内投与し、各組織におけるDUP-199HAF株の生菌数と、腫瘍及び血漿におけるDUP-199HAF株からの分泌したEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を経時的に解析した。
DUP-199HAF株のマウス尾静脈投与によるビフィズス菌の組織分布と、腫瘍及び血液中の変異LH31ダイアボディ型BsAb濃度の推移を確認するために、DUP-199HAF株を、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞を移植した担癌SCIDマウスへ静脈内投与し、各組織におけるDUP-199HAF株の生菌数と、腫瘍及び血漿におけるDUP-199HAF株からの分泌したEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を経時的に解析した。
34-1 DUP-199HAF株の担癌マウスへの投与
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地(Sigma-Aldrich社製)で培養した後、8週齢のメスのSCIDマウス(日本エスエルシー社製)に皮下移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが101.54~251.60mm3の担癌マウスに、DUP-199HAF株の簡易凍結製剤を5.0×108 cfu/0.2mLの用量で尾静脈内投与した。投与後、1日目、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、17日目、19日目及び21日目に、それぞれ5匹の担癌マウスから、腫瘍と、非腫瘍組織(脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓)を摘出した。また、血漿は、血液を採取し、遠心分離により分取した。なお、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で0日目(投与日)から5投2休で各摘出日の前日まで腹腔内投与した。
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地(Sigma-Aldrich社製)で培養した後、8週齢のメスのSCIDマウス(日本エスエルシー社製)に皮下移植して担癌マウスを作製した。腫瘍サイズが101.54~251.60mm3の担癌マウスに、DUP-199HAF株の簡易凍結製剤を5.0×108 cfu/0.2mLの用量で尾静脈内投与した。投与後、1日目、3日目、5日目、7日目、10日目、12日目、14日目、17日目、19日目及び21日目に、それぞれ5匹の担癌マウスから、腫瘍と、非腫瘍組織(脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓)を摘出した。また、血漿は、血液を採取し、遠心分離により分取した。なお、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回の頻度で0日目(投与日)から5投2休で各摘出日の前日まで腹腔内投与した。
34-2 DUP-199HAF株生菌数の測定
腫瘍と、非腫瘍組織(脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓)に、それぞれプロテアーゼインヒビター(ナカライテスク社製)含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理をし、組織ホモジネートを調製した。調製した組織ホモジネートと、血液を、それぞれ嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、BLFS寒天培地(250μg/mLの5-フルオロウラシル及び30μg/mLのスペクチノマイシン含有BL寒天培地)に塗布し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。BLFS寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、DUP-199HAF株の生菌数を算出した(図64参照)。なお、組織ホモジネートの一部を回収し、以下の「34-3」の項目に記載の方法に用いた。
腫瘍と、非腫瘍組織(脳、心臓、肺、腎臓、脾臓、及び肝臓)に、それぞれプロテアーゼインヒビター(ナカライテスク社製)含有嫌気性希釈液を添加し、ホモジナイズ処理をし、組織ホモジネートを調製した。調製した組織ホモジネートと、血液を、それぞれ嫌気性希釈液にて適宜希釈した後、BLFS寒天培地(250μg/mLの5-フルオロウラシル及び30μg/mLのスペクチノマイシン含有BL寒天培地)に塗布し、嫌気条件下で37℃にて3日間培養した。BLFS寒天培地上に形成されたコロニー数を数え、DUP-199HAF株の生菌数を算出した(図64参照)。なお、組織ホモジネートの一部を回収し、以下の「34-3」の項目に記載の方法に用いた。
34-3 ELISA解析用腫瘍サンプルの調製
上記「34-2」で調製した腫瘍ホモジネートに、10×Cell Lysis buffer(500mMのTris-HCl[pH7.5]、1500mMの塩化ナトリウム、5%のNP-40、及び20mMのEDTA)と50×cOmplete(cOmplete[EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001]タブレット1つを、1mLの超純水で溶解して調製したもの)を添加し、撹拌後、遠心分離後の上清を回収し、ELISA解析用腫瘍サンプルを調製した。
上記「34-2」で調製した腫瘍ホモジネートに、10×Cell Lysis buffer(500mMのTris-HCl[pH7.5]、1500mMの塩化ナトリウム、5%のNP-40、及び20mMのEDTA)と50×cOmplete(cOmplete[EDTA-free、Roche社製、Cat#11873580001]タブレット1つを、1mLの超純水で溶解して調製したもの)を添加し、撹拌後、遠心分離後の上清を回収し、ELISA解析用腫瘍サンプルを調製した。
34-4 ELISA法
5μg/mL(血漿用)又は2μg/mL(腫瘍用)のヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、蒸留水(大塚製薬社製)にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)で25℃にて2時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、上記「34-3」で調製したELISA解析用腫瘍サンプルと、上記「34-1」で調製した血漿を、DUP-199HAF株の培養上清から精製した検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)を4 ng/mLから0.01 ng/mL(血漿用)及び64 ng/mLから0.015625 ng/mL(腫瘍用)に段階希釈したものを、それぞれ25℃で2時間インキュベートした。その後、各ウェルを、PBS-Tにて洗浄し、抗HAビオチン(Roche社製)の存在下、25℃で1時間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)の存在下、25℃で30分間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)の存在下、室温で20分間発色させ、Stop Solution(2Nの硫酸)(R&D Systems社製)にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT(Gen5 2.04)(DSファーマバイオメディカル社製)にて、TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、腫瘍及び血漿中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した(図65参照)。
5μg/mL(血漿用)又は2μg/mL(腫瘍用)のヒトCD3E/CD3Dヘテロダイマー組換えタンパク質(Acro Biosystems社製)含有液を、96ウェルプレートの各ウェルにそれぞれ25μLずつ分注し、4℃で一晩静置することにより固相化処理した。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、蒸留水(大塚製薬社製)にて5倍に希釈したブロッキング液(Blocking One、ナカライテスク社製)で25℃にて2時間ブロッキング処理を行った。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、上記「34-3」で調製したELISA解析用腫瘍サンプルと、上記「34-1」で調製した血漿を、DUP-199HAF株の培養上清から精製した検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAb(変異LH31ダイアボディ型BsAb)を4 ng/mLから0.01 ng/mL(血漿用)及び64 ng/mLから0.015625 ng/mL(腫瘍用)に段階希釈したものを、それぞれ25℃で2時間インキュベートした。その後、各ウェルを、PBS-Tにて洗浄し、抗HAビオチン(Roche社製)の存在下、25℃で1時間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、VECTASTAIN Elite ABC試薬(アビジン-ビオチン標識HRP)(Vector社製)の存在下、25℃で30分間インキュベートした。各ウェルを、PBS-Tにて洗浄後、検出試薬であるColor Solution A及びColor Solution B(HRPの基質であるTMBを含む液)(R&D Systems社製)の存在下、室温で20分間発色させ、Stop Solution(2Nの硫酸)(R&D Systems社製)にて呈色反応を停止した。POWERSCAN HT(Gen5 2.04)(DSファーマバイオメディカル社製)にて、TMB由来色素の吸収波長である450nmの吸光度と、陰性対照の570nmの吸光度を測定し、検量線作成用標準EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを基に検量線を作成後、腫瘍及び血漿中のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbの濃度を定量した(図65参照)。
(結果)
DUP-199HAF株を、HCT116担癌SCIDマウスへ投与すると、腫瘍におけるDUP-199HAF株生菌数は、徐々に増加し、投与後5日目に最大(中央値:4.8×107cfu/g腫瘍)となり、投与後19日目までは生菌数(中央値)が106 cfu/g腫瘍以上認められた(図64参照)。一方、非腫瘍組織は、一部の組織(脾臓、肝臓、腎臓、及び心臓)について、投与後1日目にDUP-199HAF株の生菌が検出されたものの、その後の検出レベルは大幅に減少し、投与後5日目以降は検出限界未満であった(図64参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が腫瘍特異的に生着することを示している。
DUP-199HAF株を、HCT116担癌SCIDマウスへ投与すると、腫瘍におけるDUP-199HAF株生菌数は、徐々に増加し、投与後5日目に最大(中央値:4.8×107cfu/g腫瘍)となり、投与後19日目までは生菌数(中央値)が106 cfu/g腫瘍以上認められた(図64参照)。一方、非腫瘍組織は、一部の組織(脾臓、肝臓、腎臓、及び心臓)について、投与後1日目にDUP-199HAF株の生菌が検出されたものの、その後の検出レベルは大幅に減少し、投与後5日目以降は検出限界未満であった(図64参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が腫瘍特異的に生着することを示している。
また、腫瘍におけるDUP-199HAF株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb濃度は、DUP-199HAF株の投与後5日目に腫瘍内濃度が最大(平均値:34588.4pg/g腫瘍)となり、投与後17日目までは平均値で定量限界(2500pg/g腫瘍)以上のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbが腫瘍中に認められた(図65参照)。この結果は、腫瘍に生着したビフィズス菌形質転換体(DUP-199HAF株)が、EGFR×CD3ダイアボディ型BsAbを発現・分泌したことを示している。なお、血漿におけるDUP-199HAF株由来のEGFR×CD3ダイアボディ型BsAb濃度は、投与後全ての時点において、平均値で定量限界(250 pg/mL)未満であった。
[実施例35]DUP-143株によるインビボでの抗腫瘍効果
DUP-143株によるインビボでの抗腫瘍効果を確認するために、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞を移植し、かつ、ヒトPBMCを移入した重度免疫不全マウス(NOGマウス)を用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下に記載の方法に従って解析した。
DUP-143株によるインビボでの抗腫瘍効果を確認するために、ヒト大腸癌細胞株であるHCT116細胞を移植し、かつ、ヒトPBMCを移入した重度免疫不全マウス(NOGマウス)を用いたインビボによる解析を行った。具体的には、以下に記載の方法に従って解析した。
HCT116細胞を、10%のFBS(Equitech-Bio社製)を含有するMcCoy’s5A培地(Sigma-Aldrich社製)で培養した後、7週齢のメスのNOGマウス(インビボサイエンス社製)に皮下移植して担癌マウスを作製した。移植後3日目や9日目に、PBMCを腹腔内より移入し、また、移植後3日目~18日目に、5.0×108cfu/0.2mLのDUP-143株の簡易凍結製剤又はBEシャトル株の凍結製剤を、尾静脈内投与した(図66参照)。各群(群1~6)の構成は、以下のとおりである。群1:PBMC移入なしDUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)、群2:PBMC移入(移植後3日目)DUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)、群3:PBMC移入(移植後3日目及び9日目)BEシャトル株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)、群4:PBMC移入(移植後3日目及び9日目)DUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)、群5:PBMC移入(移植後3日目及び9日目)DUP-143株投与(移植後3日目、6日目、10日目、13日目、及び17日目)及び群6:PBMC移入(移植後3日目及び9日目)DUP-143株投与(移植後7日目、9日目、11日目、14日目、16日目、及び18日目)。なお、凍結製剤の投与後、10%マルトース溶液を1mLずつ1日2回、5投2休で腹腔内投与した。投与後3日目、6日目、10日目、13日目、17日目、及び20日目に、各群マウスにおける体重及び腫瘍径を測定した。腫瘍体積を、式「腫瘍体積=長径×短径2/2」を基に算出した(図66参照)。腫瘍増殖抑制率[TGI]を、式「TGI=[1-移植後20日の平均腫瘍体積(群2~6)/移植後20日の平均腫瘍体積(群1)]×100」を基に算出した。体重比を、式「体重比=各時点の体重/移植日の体重」を基に算出した(図67参照)。
(結果)
各群のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果、PBMC移入(移植後3日目及び9日目)BEシャトル株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群3)のマウスにおける腫瘍体積は、陰性対照であるPBMC移入なしDUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群1)のマウスにおける腫瘍体積とほとんどかわらなかった(図66参照)。一方、PBMC移入(移植後3日目)DUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群2)のマウスにおける腫瘍体積や、PBMC移入(移植後3日目及び9日目)DUP-143株投与(移植後7日目、9日目、11日目、14日目、16日目、及び18日目)群(群6)のマウスにおける腫瘍体積は、上記陰性対照の群1のマウスにおける腫瘍体積と比べ、有意に減少し、例えば、移植後20日目において、陰性対照の群1のマウスに対する腫瘍増殖抑制率[TGI]は、それぞれ43.0%及び45.0%であった(図66参照)。一方、体重減少はいずれの群においても認められなかった(図67参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、抗腫瘍効果があることを示している。
各群のマウスにおける腫瘍体積を解析した結果、PBMC移入(移植後3日目及び9日目)BEシャトル株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群3)のマウスにおける腫瘍体積は、陰性対照であるPBMC移入なしDUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群1)のマウスにおける腫瘍体積とほとんどかわらなかった(図66参照)。一方、PBMC移入(移植後3日目)DUP-143株投与(移植後7日目、10日目、14日目、及び17日目)群(群2)のマウスにおける腫瘍体積や、PBMC移入(移植後3日目及び9日目)DUP-143株投与(移植後7日目、9日目、11日目、14日目、16日目、及び18日目)群(群6)のマウスにおける腫瘍体積は、上記陰性対照の群1のマウスにおける腫瘍体積と比べ、有意に減少し、例えば、移植後20日目において、陰性対照の群1のマウスに対する腫瘍増殖抑制率[TGI]は、それぞれ43.0%及び45.0%であった(図66参照)。一方、体重減少はいずれの群においても認められなかった(図67参照)。この結果は、ビフィズス菌形質転換体(DUP-143株)が分泌するEGFR×CD3ダイアボディ型BsAbは、抗腫瘍効果があることを示している。
本発明は、本発明は、固形腫瘍(通常、固形癌)の予防又は治療に資するものである。
Claims (12)
- ヒトCD3に結合する軽鎖可変領域(VL)と、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合する重鎖可変領域(VH)とを含む第1のポリペプチド;及びヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含む第2のポリペプチド;を発現し、前記第1のポリペプチド及び前記第2のポリペプチドから構成されるダイアボディ型二重特異性抗体を分泌することを特徴とするビフィドバクテリウム属細菌。
- 第1のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒトCD3に結合するVLと、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVHとを含み、第2のポリペプチドが、アミノ末端からカルボキシル末端の順に、ヒト腫瘍細胞表面抗原に結合するVLと、ヒトCD3に結合するVHとを含むことを特徴とする請求項1に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- 第1のポリペプチドのVLとVHとの間、及び第2のポリペプチドのVLとVHとの間に、それぞれ4~9アミノ酸からなるリンカーペプチドが連結されていることを特徴とする請求項1又は2に記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- 第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドのアミノ末端に、それぞれ以下の(i)~(iii)のいずれかのアミノ酸配列を含む分泌シグナルペプチド-リンカーペプチド連結体が連結されていることを特徴とする請求項1~3のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
(i)配列番号10に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(ii)配列番号13に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列
(iii)配列番号18に示されるアミノ酸配列と少なくとも80%の配列同一性を有するアミノ酸配列 - 第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンである;又は
第1のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第1のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、リジンであり、第2のポリペプチドのVLにおけるKabat番号38番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸であり、第2のポリペプチドのVHにおけるKabat番号39番目のアミノ酸残基が、グルタミン酸である;
ことを特徴とする請求項1~4のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。 - ヒト腫瘍細胞表面抗原が、ヒトEGFR(Epidermal Growth Factor Receptor)ファミリーに属する抗原、ヒトEpCAM(Epithelial cell adhesion molecule)、又はヒトPSMA(Prostate Specific Membrane Antigen)であることを特徴とする請求項1~5のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- ヒトEGFRファミリーに属する抗原が、ヒトEGFR、ヒトHER2、又はヒトHER3であることを特徴とする請求項1~6のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- 第1のポリペプチド及び第2のポリペプチドが、ポリシストロニックに発現することを特徴とする請求項1~7のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- ビフィドバクテリウム・ロンガムであることを特徴とする請求項1~8のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌。
- 請求項1~9のいずれかに記載のビフィドバクテリウム属細菌を有効成分として含有することを特徴とする固形腫瘍の予防又は治療剤。
- 固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤と併用することを特徴とする請求項10に記載の予防又は治療剤。
- 固形腫瘍におけるビフィドバクテリウム属細菌の生着及び/又は増殖促進剤が、マルトースであることを特徴とする請求項11に記載の予防又は治療剤。
Priority Applications (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP20856636.4A EP4023245A4 (en) | 2019-08-28 | 2020-05-13 | BIFIDOBACTERIUM SPP. WITH EXPRESSION AND SECRETION OF DIABODY-TYPE BSAB |
JP2021542003A JPWO2021038975A1 (ja) | 2019-08-28 | 2020-05-13 | |
US17/637,124 US20220281998A1 (en) | 2019-08-28 | 2020-05-13 | Bifidobacterium spp. expressing and secreting diabody-type bsab |
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2019155792 | 2019-08-28 | ||
JP2019-155792 | 2019-08-28 | ||
JP2020-023955 | 2020-02-17 | ||
JP2020023955 | 2020-02-17 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
WO2021038975A1 true WO2021038975A1 (ja) | 2021-03-04 |
Family
ID=74685790
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PCT/JP2020/019075 WO2021038975A1 (ja) | 2019-08-28 | 2020-05-13 | ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 |
Country Status (4)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20220281998A1 (ja) |
EP (1) | EP4023245A4 (ja) |
JP (1) | JPWO2021038975A1 (ja) |
WO (1) | WO2021038975A1 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11434291B2 (en) | 2019-05-14 | 2022-09-06 | Provention Bio, Inc. | Methods and compositions for preventing type 1 diabetes |
Citations (17)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS642755B2 (ja) | 1981-10-30 | 1989-01-18 | Ninomya Sangyo Kk | |
US6492123B1 (en) | 1992-12-04 | 2002-12-10 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins and their use |
JP2004242638A (ja) * | 2003-02-17 | 2004-09-02 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | 新規なダイアボディ型二重特異性抗体 |
WO2007029773A1 (ja) * | 2005-09-08 | 2007-03-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | コレステロール吸収抑制剤 |
WO2009128275A1 (en) | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Anaeropharma Science, Inc. | Therapeutic agent for anaerobic diseases |
WO2010109924A1 (ja) | 2009-03-25 | 2010-09-30 | 国立大学法人東北大学 | Lh型二重特異性抗体 |
WO2011062112A1 (ja) | 2009-11-18 | 2011-05-26 | 国立大学法人東北大学 | ヒト型化抗egfr抗体可変領域の高機能性変異体 |
WO2011078332A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
WO2011093465A1 (ja) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 形質転換用プラスミド |
WO2011093097A1 (ja) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | 株式会社未来創薬研究所 | 抗dll3抗体 |
JP2012158534A (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-23 | Takuya Ueda | 抗Her2ヒトモノクローナル抗体 |
WO2012147713A1 (ja) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | 第一三共株式会社 | 抗b7-h3抗体 |
WO2015146438A1 (ja) | 2014-03-26 | 2015-10-01 | 国立大学法人東北大学 | ヒト上皮増殖因子受容体を標的とした二重特異性抗体 |
WO2015146437A1 (ja) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | 国立大学法人東北大学 | 高機能性IgG2型二重特異性抗体 |
WO2015166640A1 (ja) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 異種ポリペプチド発現カセット |
WO2016088376A1 (ja) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 共発現プラスミド |
WO2018062225A1 (ja) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | ビフィドバクテリウム属細菌の遺伝子発現用プロモーター |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP2840091A1 (en) * | 2013-08-23 | 2015-02-25 | MacroGenics, Inc. | Bi-specific diabodies that are capable of binding gpA33 and CD3 and uses thereof |
-
2020
- 2020-05-13 US US17/637,124 patent/US20220281998A1/en active Pending
- 2020-05-13 EP EP20856636.4A patent/EP4023245A4/en active Pending
- 2020-05-13 WO PCT/JP2020/019075 patent/WO2021038975A1/ja unknown
- 2020-05-13 JP JP2021542003A patent/JPWO2021038975A1/ja active Pending
Patent Citations (19)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS642755B2 (ja) | 1981-10-30 | 1989-01-18 | Ninomya Sangyo Kk | |
US6492123B1 (en) | 1992-12-04 | 2002-12-10 | Medical Research Council | Multivalent and multispecific binding proteins and their use |
JP2004242638A (ja) * | 2003-02-17 | 2004-09-02 | Tohoku Techno Arch Co Ltd | 新規なダイアボディ型二重特異性抗体 |
JP3803790B2 (ja) | 2003-02-17 | 2006-08-02 | 株式会社東北テクノアーチ | 新規なダイアボディ型二重特異性抗体 |
WO2007029773A1 (ja) * | 2005-09-08 | 2007-03-15 | Kabushiki Kaisha Yakult Honsha | コレステロール吸収抑制剤 |
WO2009128275A1 (en) | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Anaeropharma Science, Inc. | Therapeutic agent for anaerobic diseases |
WO2009128272A1 (en) | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Anaeropharma Science, Inc. | Expression vector |
WO2010109924A1 (ja) | 2009-03-25 | 2010-09-30 | 国立大学法人東北大学 | Lh型二重特異性抗体 |
WO2011062112A1 (ja) | 2009-11-18 | 2011-05-26 | 国立大学法人東北大学 | ヒト型化抗egfr抗体可変領域の高機能性変異体 |
WO2011078332A1 (ja) * | 2009-12-25 | 2011-06-30 | 中外製薬株式会社 | ポリペプチド多量体を精製するためのポリペプチドの改変方法 |
WO2011093465A1 (ja) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 形質転換用プラスミド |
WO2011093097A1 (ja) | 2010-01-29 | 2011-08-04 | 株式会社未来創薬研究所 | 抗dll3抗体 |
JP2012158534A (ja) | 2011-01-31 | 2012-08-23 | Takuya Ueda | 抗Her2ヒトモノクローナル抗体 |
WO2012147713A1 (ja) | 2011-04-25 | 2012-11-01 | 第一三共株式会社 | 抗b7-h3抗体 |
WO2015146437A1 (ja) | 2014-03-25 | 2015-10-01 | 国立大学法人東北大学 | 高機能性IgG2型二重特異性抗体 |
WO2015146438A1 (ja) | 2014-03-26 | 2015-10-01 | 国立大学法人東北大学 | ヒト上皮増殖因子受容体を標的とした二重特異性抗体 |
WO2015166640A1 (ja) | 2014-05-01 | 2015-11-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 異種ポリペプチド発現カセット |
WO2016088376A1 (ja) | 2014-12-03 | 2016-06-09 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | 共発現プラスミド |
WO2018062225A1 (ja) | 2016-09-28 | 2018-04-05 | 株式会社アネロファーマ・サイエンス | ビフィドバクテリウム属細菌の遺伝子発現用プロモーター |
Non-Patent Citations (26)
Title |
---|
"Methods in Enzymology", vol. 194, 1991 |
"Molecular/Cloning", 1989, COLD SPRING HARBOR LABORATORY |
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 72, no. 1, January 2006 (2006-01-01), pages 527 - 35 |
APPL ENVIRON MICROBIOL, vol. 73, no. 24, December 2007 (2007-12-01), pages 7858 - 66 |
APPL ENVIRON MICROBIOL., vol. 200672, no. 11, pages 7401 - 7405 |
ASANO, R. ET AL.: "Highly enhanced cytotoxicity of a dimeric bispecific diabody, the hEx3 tetrabody", J. BIOL. CHEM., vol. 285, no. 27, 2010, pages 20844 - 20849, XP055110416, DOI: 10.1074/jbc.M110.120444 * |
ASANO, R. ET AL.: "Humanization of the bispecific epidermal growth factor receptor x CD 3 diabody and its efficacy as a potential clinical reagent", CLIN. CANCER RES., vol. 12, no. issue 13, 2006, pages 4036 - 4042, XP003017843, DOI: 10.1158/1078-0432.CCR-06-0059 * |
BIOSCI BIOTECHNOL BIOCHEM., vol. 69, no. 2, February 2005 (2005-02-01), pages 422 - 5 |
BIOTECHNOL. LETT., vol. 28, 2006, pages 163 - 168 |
BIOTECHNOL. LETT., vol. 30, 2008, pages 1983 - 1988 |
CANCER GENE THER, vol. 200714, pages 151 - 157 |
J MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 19, no. 4, April 2009 (2009-04-01), pages 403 - 8 |
J MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 22, no. 12, December 2012 (2012-12-01), pages 1714 - 23 |
J MICROBIOL, vol. 50, no. 4, August 2012 (2012-08-01), pages 638 - 43 |
J. BACTERIOLOGY, 2005, pages 5799 - 5808 |
J. MICROBIOL BIOTECHNOL, vol. 22, no. 12, December 2012 (2012-12-01), pages 1714 - 23 |
J. MICROBIOLOGY, 2012, pages 638 - 643 |
JMICROBIOL, vol. 50, no. 4, August 2012 (2012-08-01), pages 638 - 43 |
LETT APPL MICROBIOL, vol. ll, no. 4, October 1990 (1990-10-01), pages 220 - 3 |
MICROBIOLOGY, vol. 145, March 1999 (1999-03-01), pages 585 - 92 |
NAT REV DRUG DISCOV, 7 June 2019 (2019-06-07) |
PLASMID, vol. 57, no. 2, March 2007 (2007-03-01), pages 165 - 74 |
PROC NATL ACAD SCI U S A., no. 14, 15 July 1993 (1993-07-15), pages 6444 - 8 |
SCI REP, vol. 7, no. 1, 6 June 2017 (2017-06-06), pages 2862 |
THE MOLECULAR BIOLOGY SOCIETY OF JAPAN, 1994 |
YASUYUKI TAKAGI: "Procedure for Experiment in Genetic Engineering", 1982, COLD SPRING HARBOR LABORATORY |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11434291B2 (en) | 2019-05-14 | 2022-09-06 | Provention Bio, Inc. | Methods and compositions for preventing type 1 diabetes |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP4023245A1 (en) | 2022-07-06 |
JPWO2021038975A1 (ja) | 2021-03-04 |
US20220281998A1 (en) | 2022-09-08 |
EP4023245A4 (en) | 2023-08-30 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7160882B2 (ja) | Cd123特異的キメラ抗原受容体でリダイレクトしたt細胞およびそれらの使用方法 | |
JP7300763B2 (ja) | Car発現ベクター及びcar発現t細胞 | |
RU2748281C2 (ru) | Полностью человеческие антитела к мезотелину и иммунные эффекторные клетки, нацеленные на мезотелин | |
US10731127B2 (en) | Chimeric antigen receptors targeting GPC3 and uses thereof | |
JP2022188225A (ja) | 癌治療のための免疫療法とサイトカイン制御療法との組み合わせ | |
CN110582488A (zh) | 具有增强功效的免疫效应细胞疗法 | |
CN107002090B (zh) | 异源多肽表达盒 | |
JP6755465B2 (ja) | 共発現プラスミド | |
AU2020224160A1 (en) | Artificial immunosurveillance chimeric antigen receptor (AI-CAR) and cells expressing the same | |
WO2023109257A1 (zh) | 人源化的bcma抗体和bcma-car-t/bcma-car-dnt细胞 | |
CN113416260A (zh) | 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用 | |
WO2021038975A1 (ja) | ダイアボディ型BsAbを発現・分泌するビフィドバクテリウム属細菌 | |
JP2022513372A (ja) | シアリルルイスaを標的とするキメラ抗原受容体およびその使用 | |
CA2921866A1 (en) | Rna viruses for immunovirotherapy | |
WO2020088365A1 (zh) | 微环dna表达连接her2阳性细胞与效应细胞的桥接分子及其应用 | |
CN115397461A (zh) | 具有cd28突变的嵌合抗原受体及其用途 | |
WO2020176897A1 (en) | Chimeric antigen receptors and uses thereof | |
CN114729059A (zh) | 包含前列腺干细胞抗原(psca)嵌合抗原受体(cars)的组合物和方法 | |
RU2757502C1 (ru) | Генетическая кассета, содержащая кодон-оптимизированные нуклеотидные последовательности генов TRAIL, PTEN и IFNβ-1, и фармацевтическая композиция для лечения онкологических заболеваний | |
US20230340068A1 (en) | Chimeric antigen receptor (car) with cd28 transmembrane domain | |
KR20240035662A (ko) | Ct83을 표적으로 하는 car-t 세포 및 이의 용도 | |
CN117295820A (zh) | 以ccr8作为抗原识别的嵌合抗原受体 | |
CN117529502A (zh) | Cd38嵌合共刺激受体及其用途 | |
CN117247466A (zh) | 抗磷脂酰肌醇蛋白聚糖3的嵌合抗原受体及其用途 | |
CN116410332A (zh) | 抗间皮素纳米抗体嵌合抗原受体及其应用 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
121 | Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application |
Ref document number: 20856636 Country of ref document: EP Kind code of ref document: A1 |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2021542003 Country of ref document: JP Kind code of ref document: A |
|
NENP | Non-entry into the national phase |
Ref country code: DE |
|
ENP | Entry into the national phase |
Ref document number: 2020856636 Country of ref document: EP Effective date: 20220328 |