WO2007029773A1 - コレステロール吸収抑制剤 - Google Patents

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WO2007029773A1
WO2007029773A1 PCT/JP2006/317748 JP2006317748W WO2007029773A1 WO 2007029773 A1 WO2007029773 A1 WO 2007029773A1 JP 2006317748 W JP2006317748 W JP 2006317748W WO 2007029773 A1 WO2007029773 A1 WO 2007029773A1
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cholesterol
bifido
animalis
batterium
subspecies
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PCT/JP2006/317748
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Hiroko Hayakawa
Tohru Iino
Fumiyasu Ishikawa
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Kabushiki Kaisha Yakult Honsha
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Definitions

  • the present invention relates to a bifidobacterium bacterium excellent in cholesterol absorption inhibitory activity, and a cholesterol absorption inhibitor containing these bifactacterium bacteria as active ingredients.
  • Cholesterol is present in many cells, and its main physiological role is to maintain cell functions as a constituent of lipoproteins and biological membranes, and to be a raw material for bile acids and various hormones. Have a role. However, it is known that excessive consumption of food with a high content and increased cholesterol in the serum may cause arteriosclerosis, and in the modern diet with many opportunities to consume cholesterol, There is a need to suppress concentrations in the body.
  • Bifidopacteria bacteria are vulnerable to oxygen, gastric acid and bile acids in the body, so if this cell culture is taken orally, it can survive in the digestive tract. However, there is a problem that sufficient effects are often not obtained. For this reason, there is a need for a bifactacterium bacterium that has excellent survival and has the effect of suppressing the increase in serum cholesterol.
  • Bifido Batterium genus Bifido Batterium which has excellent survival properties is Bifido Batterium 'Longam SBT 10254 (FERM P-14820) (Licenses) 3) Bifido Batterium 'Longam (FERM BP-7787) (Patent Document 4) It has excellent residual properties and has an inhibitory effect on serum cholesterol elevation, and Bifido Batterium 'Mouth Ngam BB536, Bifido Batterium' Breve ATCC 15700, Bifidobacterium 'Animalis ATCC 25527 (Non-patent Document 2) The present condition is that there are few choices for such microorganisms that exhibit only cholesterol sedimentation action and have such excellent survival and cholesterol suppression action.
  • microorganisms drugs and foods using these microorganisms are often required to be stored for a long period of time, so high storage stability is required.
  • conventionally known microorganisms have a survival property after long-term storage. Many of them have a low survival rate, especially those with low survival after storage under non-anaerobic conditions.
  • Patent Document 1 JP-A-61-271223
  • Patent Document 2 Japanese Patent Publication No. 6-96537
  • Patent Document 3 Patent No. 3384907
  • Patent Document 4 Japanese Patent Laid-Open No. 2003-238423
  • Non-Patent Document 1 Proceedings of the 6th Annual Meeting of the Japan Bifidobacteria Center, 18 pages, 1987
  • Non-Patent Document 2 Letters in Applied Microbiology, Vol. 21, 149-151, 199
  • the present invention is excellent in survival in the digestive tract, has an action of suppressing absorption of cholesterol in the intestine, is excellent in an action of improving lipid metabolism such as lowering blood cholesterol, and has a survival after storage. It is an object of the present invention to provide a high bifid butterium bacterium and a cholesterol absorption inhibitor using the same.
  • globosum excels in cholesterol elimination and has strong acid resistance. It is resistant to bile acids, has an excellent cholesterol absorption inhibitory effect in the intestine, and has high survival after storage, especially after storage under non-anaerobic conditions.
  • the headline and the present invention were completed.
  • microorganisms used in the present invention bifidobacterium 'animaris'subspecies' animalis YIT 10394, bifidobacterium' sjudron gum 'subspices' globosum YIT 10392 and bifido butterium syuduron gum subspecies' globosam YIT 10393 These were newly discovered microorganisms.
  • the present invention relates to bifido butterium 'animalis' sub-species' animalis YIT 10394, bified butterium' animalis' sub-species' Lactis JCM 1253, bifido butterium animaris sub-species' Lactis JCM 7117
  • the present invention provides a cholesterol absorption inhibitor comprising one or more microorganisms whose active ingredients are also selected as bifud bacterium, cydron gum, subspices and globosum power.
  • the present invention provides one or more microorganisms selected from bifido butterium, animalis, subspices' Lactis JCM 1 253 and bifido buterium, animalis, subspissis, lactis JCM 7117 force as active ingredients. It provides a cholesterol absorption inhibitor.
  • the present invention relates to bifido butterium 'animaris' sub-species' animalis YIT 10394, bifido butterium' syudulongum 'sub-species' globosam YIT 10 392 and bifido butterium shyudron gum subspecies' globosam YIT Ten
  • the present invention provides a cholesterol absorption inhibitor comprising one or more microorganisms selected from 393 as active ingredients.
  • the present invention relates to novel microorganisms, bifidobacterium 'animalis' subspecies.animalis YIT 10394 (FERM ABP—10662), bifid bateratum' seuudron gum.subspices.globosam YIT 10392 (FERM ABP—10660), or Bifido Batterium “Syudu Long Gum”, Subspecies “Grobosam YIT 1039 3 (FERM ABP—10661).
  • Bifido Batterium of the Present Invention 'Animals'Sub-Species' Animals YIT 10394 , Bifido Batterium 'Animals' Subspecies 'Lactis JCM 1253, Bifido Batterium' Animals 'Subspices Lactis JCM 7117 and Bifido Batterium Cyuduron Gum Subspecies' Globosam have only an excellent cholesterol elimination effect. Since it is excellent in tolerance and bile acid resistance, it exhibits an excellent cholesterol absorption inhibitory effect in the intestine and can be used for the purpose of improving lipid metabolism such as lowering blood cholesterol.
  • these microorganisms have a high survival after storage, and in particular, show a high survival even after storage under non-anaerobic conditions. Therefore, the absorption inhibitor of the present invention can be stored for a long period of time. Non-anaerobic storage is also possible.
  • column f is Bifidobatterium cyudron gum, subspices' globosum YIT 10392, bifum Idbataterum ⁇ Shyudlongam ⁇ Subspecies' Grobosum YIT 10393
  • the strain has the following mycological properties. That is, the bacteriological properties of these bacteria are all Gram-positive polymorphic Neisseria gonorrhoeae, non-spore-forming, non-motile, obligate anaerobic, and can grow at 37 ° C. Except for the cholesterol-removing activity, survival rate in artificial gastric juice and growth in bile acid-containing medium, Bifido Batterium, Syudulongum, Subspices, Globosum, Bifido Batterium, Cyuduron Gum, Subspecies Globosum, Bifido Batterium ⁇ Animalis ⁇ Subspecies' Animals have the properties.
  • Species identification of the new strain is performed using 16S rDNA nucleotide sequence
  • the 16S rDNA base sequence of YIT 10392 is 99.6% homologous to bifidobacterium 'sydron gum' subspices globosum (accession No. D86194)
  • the 16S rDNA base sequence of YIT 10393 is bifido butterfly. It shows 99.6% homology with Terium 'Syudron gum' Subspices globosum (accession No. D86194)
  • the 16S rDNA sequence of YIT 10394 is bifido Batterium 'Animals'Subspecies' animalis (accession No.
  • the bacterial species identification using the 16S rDNA base sequence was performed by centrifugally washing the bacterial solution cultured at 37 ° C for 24 hours using GAM medium supplemented with 0.5% glucose.
  • the DNA extracted from the above was used as a saddle type, the entire length of the 16S rDNA sequence was amplified by the PCR method, the base sequence of the amplified product was determined by the dye terminator method, and the obtained base sequence was searched in the database.
  • Bifido Batterium 'Animalis' Subspecies 'Animals YIT 10394 is the microorganism accession number FERM ABP- 10662
  • Bifido Batterium' Syudulongum 'Sub Spices' Globotham YIT 10392 is the microorganism accession number FERM ABP— 10660
  • Bifido Batterium 'Syudulongum' Subspices' Globosum YIT 10393 was transferred to the Patent Organism Depositary, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology as of August 14, 2006, as the microorganism accession number FERM ABP-10661.
  • the depositee before the transfer is the same, and the deposit date is August 18, 2005.
  • the address of the deposit center is postal number 305-8566, 1st, 1st, 1st, 1st, Tsukuba, Higashi, Ibaraki, Japan 6th.
  • the microorganism used in the present invention is the one after producing a fermented milk food and drink using the microorganism and storing it under non-anaerobic conditions (aerobic conditions) at 10 ° C for 21 days.
  • a microorganism having a survival rate of 50% or more is preferred.
  • the microorganism of the present invention has a cholesterol elimination activity of 70% or more preferred by a Bifidobacterium bacterium having a cholesterol elimination activity of 70% or more, a survival rate of 20% or more in artificial gastric juice, and bile Bifidobatterium bacteria having a klett value (bacterial turbidity) of 100 or more in the acid-containing medium are more preferable.
  • the survival rate in artificial gastric juice is about 0 to several percent
  • the growth in bile acid-containing media is about 0 to several tens in terms of cret value (bacterial turbidity). is there.
  • Bacteria with high succinic acid resistance and bile acid resistance selected based on the above values can reach the intestine in a state in which many bacteria are alive.
  • the calculation of the cholesterol elimination activity is carried out, for example, when the microbial cells are allowed to stand together with the artificial lipid micelle, the cholesterol in the supernatant is measured according to a conventional method, and the amount of cholesterol in the supernatant not containing the cells Compared with, it can be done by applying the following equation.
  • Cholesterol disappearance activity (0/0) 1 00 i (cholesterol content of the supernatant containing the cells)
  • Z the amount of cholesterol free supernatants cells
  • the survival rate in the artificial gastric juice can be, for example, the survival rate when stored in an artificial gastric fluid with a pH of 3.0 at 37 ° C for 1 hour.
  • a high value indicates a high survival rate in the gastrointestinal tract.
  • the growth in a bile acid-containing medium can be determined, for example, by measuring the turbidity when cultured in a 0.2% bile acid-containing medium at 37 ° C for 24 hours (Klertt-Summerson colorimeter, No. 66 filter). A high value indicates a high survival rate and proliferation rate in the digestive tract.
  • microorganisms vary depending on the nameers and are also fluid for the reclassification of fungi. Even if the names are different, microorganisms that are substantially the same as the microorganism are included in the microorganism of the present invention. That is, for example, Bifido Batterium 'animaris and Bifido Batterium' Lactis are different. Forces that could be treated as species Masco et al.
  • Bifido Batterium 'Animais' Subspecies 'Lactis ATCC 27536 is the same as Bifido Batterium ⁇ Animalis ⁇ Subspecies ⁇ Lactis JCM 1253
  • Bifido Batterium' Animais 'Subspecies' Lactis ATCC 27674 is the same as Bifido Batterium. Animalis. Sub-species. Lactis JCM 7117, and each is included in the microorganism of the present invention.
  • the strains of the two strains are also classified as Bifido Batterium animalis subspices 'animalis !, but the 16S rDNA base sequences of these two strains are Bifido Batterium animalis subspices' Ratatis ( accession No. X89513). Therefore, in the present invention, Bifido butterium, animalis, subspecies, and lactis were used.
  • the microorganism of the present invention has cholesterol elimination activity and lowers cholesterol, particularly blood cholesterol concentration, as shown in the examples described later.
  • As an agent it is particularly useful as a cholesterol absorption inhibitor with intestinal strength.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention is used to reduce blood cholesterol, decrease triglycerides, decrease VLDL and LDL cholesterol, decrease arteriosclerotic index, increase HDL cholesterol, etc. It is expected to be used for the improvement of hyperlipidemia that frequently occurs due to Mon deficiency and for reducing the risk of developing arteriosclerosis.
  • the microorganism of the present invention exhibits acid resistance and bile acid resistance, as shown in Examples below, and those containing an effective amount thereof are used as cholesterol absorption inhibitors for oral administration. be able to.
  • the microorganism of the present invention has a high survival rate even when stored under fermented milk food and drink under non-aerobic conditions (non-anaerobic storage). What is contained can be used as a cholesterol absorption inhibitor that is stored under aerobic conditions (non-anaerobic storage).
  • the storage temperature can be, for example, 80 to 10 ° C.
  • Microorganisms included as an active ingredient in the cholesterol absorption inhibitor of the present invention include Bifidobacterium 'animalis' subspices 'animalis YIT 10394, Bifidobatterium. Animalis. Subspices.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention includes bifido butterium 'animalis' subspecies 'animalis YIT 10394, bifido butterium' animalis 'sub-species' lactis JCM 1253, bifido butterium 'Animalis' sub-species 'Lactis J CM 7117 and bifluid bataterum' Syudron gum 'sub-species' globosum can be used alone or in combination, and other microorganisms can be used in combination.
  • microorganisms examples include bifido butterium 'animalis'sub-species' animals, bifid buterium'animalis'sub-species' lactis, bifidobacterium cyudron gum sub-species' globosum, bifido butterium adrecens, Bifido Batterium 'Angular Tam, Bifido Batterium' Astereuides, Bifidobacterium 'Bifidum, Bifido Batterium' Breve, Bifido Batterium 'Force Te-Yuratam, Bifido Bata Terium 'Dentium, Bifido Batterium' Gallicum, Bifido Batterium 'Infantasies', Bifido Batterium' Longham, Bifido Batterium Syuducate-Juratham, Bifido Batterium Syudulong
  • Enterococcus bacteria such as Huecaris; Acetobacter bacteria such as Acetobacter's Acet; Dal such as Darconobacter's Oxidance Bacillus bacteria such as Bacillus subtilis; Saccharomyces yeasts such as Saccharomyces; Torlaspora yeasts such as Torrusopora delbruecki; Candida yeasts such as Candida kefia; Taliberomyces marxianus etc.
  • Yeast of the genus Myces Denoriomyces ⁇ Hanse-Denoriomyces yeasts such as Hanse; Pichia yeasts such as Pichia Anomala; Digosaccharomyces yeasts such as Digosaccharomyces roxy; Aspergillus' oryzae, Mucor 'Japonicas, Monascus' Purpleus, Persium' Force Manberi, Rhizomucor 'Psilas, Rhizopus' Alphasas, etc., Aspergillus, Mucor, Monascus, Penicillium, Rhizomucor, Rhizopus Is mentioned.
  • the microorganisms included in the cholesterol absorption inhibitor of the present invention may be lyophilized or may be used as a culture containing these microorganisms in any form. It is preferable that it is in the state of bacteria.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention can be administered in the form of a conventional pharmaceutical preparation by mixing the aforementioned microorganism with a solid or liquid non-toxic pharmaceutical carrier. Examples of such preparations include solid preparations such as tablets, granules, powders and capsules, solutions such as solutions, suspensions and emulsions, and freeze-dried preparations. These preparations can be prepared by conventional means on the preparation.
  • Non-toxic pharmaceutical carriers include, for example, dalcose, lactose, sucrose, starch, mannitol, dextrin, fatty acid glycerides, polyethylene glycol, hydroxyethyl starch, ethylene glycol, polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters, amino acids Gelatin, albumin, water, physiological saline, and the like. Further, if necessary, conventional additives such as a stabilizer, a wetting agent, an emulsifier, a binder, and an isotonic agent can be appropriately added.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention can be ingested in the form of food or drink in addition to ingesting the microorganism as it is or by directly adding it to food.
  • foods and drinks include fermented milk, fermented soymilk, fermented fruit juice, fermented vegetable liquid, fermented rice juice, fermented wort and animal / plant-derived fermented foods and drinks containing the microorganisms of the present invention in the form of viable bacteria. (Pickles, miso, soy sauce, fermented tea, fermented sausage, fermented mayonnaise, cheese, salted salt, etc.), and these foods and drinks can be produced by ordinary methods.
  • the pasteurized milk medium when producing fermented milk, first of all, should be added to the bifact pacterium 'animalis' sub-species 'animalis YIT 10394, bifido buteratum' animalis 'sub-species' Lactis JCM 1253, bifid butter. Inoculate and / or homogenize at least one of Terium 'animaris' sub-species 'Lattice JCM 7117 and bifluid Bataterum' Syudulongum 'sub-species' globosam alone or simultaneously with other microorganisms. Obtain a fermented milk base.
  • the fermented milk of the present invention thus obtained can be a product of any form such as a plain type, a soft type, a fruit flavor type, a solid form, a liquid form, or a frozen form.
  • the food and drink includes animal feed.
  • the microorganism concentration of the present invention in the fermented milk can be, for example, 10 3 to: L0 13 cfuZml.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention is used for ordinary food and drink.
  • Food ingredients such as saccharides, proteins, peptides, lipids, vitamins, minerals, vegetable components such as vegetables, grains, fruits, animal components such as blood, milk, liver, bones, muscles, bacteria, mold, yeast, mushrooms, etc.
  • various sweeteners such as glucose, sucrose, fructose, maltose, glucose fructose liquid sugar, xylose, palatinose, honey, maple syrup, amazake, sorbitol, xylitol, erythritol, ratathitol, palatinit, reduced starch syrup, Various sugar alcohols such as reduced maltose starch syrup, various high sweetness sweeteners such as sucralose and aspartame, various natural sweeteners such as licorice, stevia and glycyrrhizic acid glycosides, sucrose fatty acid esters, glycerin sugar fatty acid esters, lecithin, etc. And various thickeners such as agar, gelatin, carrageenan, guar gum, gum arabic, xanthan gum, pectin and locust bean gum.
  • various minerals such as calcium, magnesium, zinc, iron, manganese, iodine, selenium, copper, cobalt and dolomite or various salts thereof, succinic acid, malic acid, tartaric acid, pyruvic acid, darconic acid, succinic acid, Various acids such as fumaric acid, ascorbic acid, lactic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, phosphoric acid, creatine, methionine, cystine, glutamic acid or various salts of these acids, dartathione, phytine, phytic acid, lignin , Poly ⁇ -glutamic acid and its degradation products, saponin, ferulic acid, aminoaminobutyric acid, oryzanol, chalcone, flavanone, flavone, flavonol, isoflavone, anthocyan, catechin, proanthocyanin, tea leaf polyphenol, curcumid, capsaici Id, sesaminol,
  • various cereal components such as rice, brown rice, barley, wheat, oats, rye, rye, oats, amaranth, amber, millet, buckwheat, sorghum, corn, etc.
  • azuki bean white bean, quince bean, kidney bean, enduma-filled purple bean, yellow bean, black beans, aodaiz, mung bean, broad bean, larvae, ashitapa, kale, turmeric, potato, sweet potato, tomato, yam Gourmet, bell pepper, sesame, cabbage, broccoli, cauliflower, lettuce, green beans, ginger, burdock, celery, radish, rust, avocado, carrot, spinach, onion, garlic, lily, sea bream, perilla, leeks, -la, perth- , Rabbi, Various vegetable ingredients such as mushrooms, shitake mushrooms, mushrooms, lemons, apples, grapes, strawberries, oranges, oysters, guava, bananas, blueberries, blackberries, cranberries, raspberries, cowberry, yam, feijoa, tamari mouth, acerola, Fruit ingredients such as lime, shikusasa, melon, peach, mango, zu, papaya, pineapple, pear,
  • a container made of oxygen-impermeable packaging such as glass or aluminum-coated paper is used for the purpose of enhancing survival during storage.
  • the microorganisms of the present invention have high oxygen resistance and do not require a strict anaerobic state as shown in the examples below. Therefore, the container for the cholesterol absorption inhibitor of the present invention is used.
  • Can also be used as a resin having high oxygen permeability polystyrene, polyethylene, polyethylene terephthalate, etc.). Containers using these types of resin have the advantage of lower cost and higher degree of freedom of molding compared to containers made of oxygen-impermeable packaging.
  • the cholesterol absorption inhibitor of the present invention may be made acidic.
  • the pH at 25 ° C can be 2-7, especially 3-6
  • Bifidobatterium bacteria which are active ingredients of the cholesterol absorption inhibitor of the present invention, have been conventionally used as foods and their safety has been confirmed. There are no strict restrictions on the dosage when used as an inhibitor.
  • the preferable dose is 10 5 cfu to 10 13 cfu per day as the number of viable bacteria, and particularly preferably 10 8 cfu to 10 12 cfu.
  • GAM medium was inoculated and cultured anaerobically at 37 ° C. After 24 hours, microbial turbidity was measured with a Klett-Summerson colorimeter (No. 66 filter).
  • the bifido butterium of the present invention 'animalis' sub-species' animalis, bihud-batterium ⁇ animalis ⁇ sub-spicis' ⁇ lactis and bifidobacteria ⁇ cydron gum ⁇ sub-species' globosum Showed high levels and cholesterol elimination activity, and was excellent in acid resistance and bile acid resistance. Moreover, since dead cells had a strong ability to eliminate cholesterol, it was found that these bacteria showed activity in the state of viable bacteria.
  • the amounts of total cholesterol and tridallylide contained in the plasma and liver extracts obtained by force were determined using Detamina TC555 (Kyowa Medix) and Triglyceride ⁇ Test ⁇ Co (Wako Pure Chemical), respectively.
  • the amount of HDL cholesterol contained in the plasma was determined using HDL-cholesterol E test KOKO (Wako Pure Chemical Industries).
  • the amount of VLDL + LDL-cholesterol contained in plasma was determined by subtracting the amount of HDL cholesterol from the total amount of cholesterol.
  • AI 0.507 ⁇ 0.096 0.52 is 0.197 0.598 ⁇ 0.061 0.241 ⁇ 0.178 0.204 ⁇ 0.124 0.001 NS NS
  • TC total cholesterol (tng / dl)
  • TG ⁇ glyceride (mg / dl)
  • HDL-C HLD cholesterol (mg / dl)
  • VLDL + LDL-C VLDL
  • galatato-oligosaccharides are specifically used by Bifidopacteria bacteria. Therefore, it was shown that the administration of fermented milk containing galatato-oligosaccharide caused the growth of bifidobatterium, cydron gum, subspices globosum YIT 10393 force S in the intestine, and effectively reduced blood lipids. It is known that removal of the ovaries increases blood total cholesterol and is useful as a postmenopausal hyperlipidemia model. A comparison of data between the ovariectomized 'unfermented milk' oligosaccharide-free group and the sham-operated group showed that the ovariectomy was successful in this study.
  • fermented milk prepared with Bifido Batterumum Shudulongum Subspices' Globosam YI T 10393 reduced the total cholesterol in the blood, tridalylide, VLDL + LDL-cholesterol, arteriosclerosis index, It has been shown that it has the ability to improve lipid metabolism for various blood lipids other than cholesterol alone, and has the effect of reducing the risk of developing arteriosclerosis.
  • Table 7 shows the pH and viable cell count at the end of the culture
  • Table 8 shows the change in the number of bacteria under non-anaerobic storage
  • Table 9 shows the change in the number of bacteria under anaerobic storage.
  • bifact pacterium used as a control.
  • Longham ATCC 15707 decreased to 9.2 X 10 3 cfu / m after 3 weeks and 8 weeks. After a while, it was undetectable.
  • the Bifidopacteria bacterium of the present invention is a culture that does not fall below 1 X 10 8 cfuZml even if stored for 3 weeks for any strain. The survival rate was over 50% when compared to the end of the feeding.
  • the obtained fermented milk beverage had good appearance and flavor, and the viable cell count immediately after production was 2.5 ⁇ 10 8 cfuZml.
  • the viable cell count after storage at 10 ° C for 21 days was 1.4 X 10 8 cfuZml, and the storage stability was also good.
  • each component was blended according to a conventional method and homogenized to obtain a soft drink.
  • the obtained soft drink was filled in a brown bottle, sealed with an aluminum cap, and heat-treated.
  • the resulting soft drink had good appearance and flavor and good storage stability.

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Abstract

　消化管内での生残性に優れ腸管内でコレステロールの吸収抑制作用を有し、血中コレステロール低下等の脂質代謝改善作用に優れるとともに、保存後の生残性が高いビフィドバクテリウム属細菌、及びこれを用いたコレステロール吸収抑制剤を提供する。 　ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・アニマリスＹＩＴ　１０３９４、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ　１２５３、ビフィドバクテリウム・アニマリス・サブスピーシズ・ラクチスＪＣＭ　７１１７及びビフィドバクテリウム・シュードロンガム・サブスピーシズ・グロボサムから選ばれる１以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤。

Description

明 細 書
コレステロール吸収抑制剤
技術分野
[0001] 本発明は、コレステロールの吸収抑制作用に優れたビフイドバタテリゥム細菌、及び これらビフイドパクテリゥム属細菌を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤に関す る。
背景技術
[0002] コレステロールは、多くの細胞に存在し、主な生理的な役割として、リポ蛋白質や生 体膜の構成成分として細胞の機能を維持すること、胆汁酸や各種ホルモンの原材料 になることなどの役割を担っている。しかしながら、含有量の多い食品を過剰摂取し、 血清中のコレステロールが増えると動脈硬化の原因となることが知られており、コレス テロールを摂取する機会の多い現代の食生活のもとでは、生体内における濃度を抑 制することが求められて 、る。
[0003] そして、ビフイドバタテリゥム ·ビフィダム、ビフイドバタテリゥム ·アドレスセンテイス、ビ フイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバクテリウ ム ·ロンガムの菌体に血中脂質改善作用があることが報告されて 、る (特許文献 1)。 特に、ビフイドバタテリゥム 'ロンガムについては研究が進んでおり、ビフイドバクテリウ ム 'ロンガム SBT 2933R(FERM P— 8743)が優れた効果を有していることが報 告され (非特許文献 1)、この菌体或いは培養物を血清コレステロール上昇抑制剤と して利用することが提案されている（特許文献 2)。しカゝしながら、一般に、ビフイドパク テリゥム属細菌は酸素や、体内中の胃酸や胆汁酸に弱いため、この菌体ゃ培養物を 経口的に摂取した場合には、消化管での生残性が悪ぐ十分な効果が得られないこ とが多いという問題があった。このため、生残性に優れた血清コレステロール上昇抑 制作用を有するビフイドパクテリゥム属細菌が求められている。
[0004] し力しながら、このような生残性に優れたビフイドバタテリゥム属細菌について知られ ているのは、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム SBT 10254 (FERM P- 14820) ( 許文献 3)ゃビフイドバタテリゥム'ロンガム (FERM BP- 7787) (特許文献 4)が生 残性に優れ血清コレステロール上昇抑制作用を示すことや、ビフイドバタテリゥム '口 ンガム BB536、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ ATCC 15700、ビフイドバクテリウム' アニマリス ATCC 25527 (非特許文献 2)がコレステロール沈降作用を示すことなど にすぎず、このような生残性に優れかつコレステロール抑制作用を有する微生物に つ 、ての選択肢は少な!/、のが現状である。
[0005] また、これら微生物を用いた薬剤 ·食品は、しばしば長期保存を余儀なくされること から、高い保存安定性が求められるが、従来知られていた微生物には、長期保存後 の生残性が低いものが多ぐとりわけ、非嫌気条件下の保存後の生残性が低いもの が多かった。
特許文献 1 :特開昭 61— 271223号公報
特許文献 2：特公平 6 - 96537号公報
特許文献 3：特許第 3384907号
特許文献 4：特開平 2003 - 238423号公報
非特許文献 1 :第 6回日本ビフィズス菌センター学術集会予稿集， 18頁， 1987 非特許文献 2 : Letters in Applied Microbiology, Vol. 21, 149- 151, 199
5
発明の開示
発明が解決しょうとする課題
[0006] 従って本発明は、消化管内での生残性に優れ腸管内でコレステロールの吸収抑制 作用を有し、血中コレステロール低下等の脂質代謝改善作用に優れるとともに、保存 後の生残性が高いビフイドバタテリゥム属細菌、及びこれを用いたコレステロール吸 収抑制剤を提供することを目的とする。
課題を解決するための手段
[0007] 本発明者らは、上記目的を達成すべく鋭意検討を重ねた結果、ビフイドパクテリゥム
'アニマリス.サブスピーシズ.アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリゥム'アニマリ ス'サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1253、ビフイドバタテリゥム'アニマリス'サブスピ ーシズ 'ラクチス JCM 7117及びビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピー シズ 'グロボサムが、意外にも、コレステロール消失作用に優れ、かつ強い酸耐性及 び胆汁酸耐性を示し、腸内においても優れたコレステロール吸収抑制作用を有し、 また、保存後の生残性が高ぐとりわけ非嫌気条件下の保存後でも高い生残性を示 すことを見出し、本発明を完成した。なお、本発明に用いる微生物のうち、ビフイドバ クテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394、ビフイドバクテリウ ム'シユードロンガム 'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10392及びビフイドバタテリ ゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ'グロボサム YIT 10393は本発明者らが新 規に見出した微生物である。
[0008] すなわち本発明は、ビフイドバタテリゥム'アニマリス 'サブスピーシズ'アニマリス YI T 10394、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1253、 ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'ラクチス JCM 7117及びビフイドバ クテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム力も選ばれる 1以上の微生 物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提供するものである。
[0009] また、本発明は、ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1 253及びビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシス、 ·ラクチス JCM 7117力ら 選ばれる 1以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提供するも のである。
[0010] また、本発明は、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ'グロボサム YIT 10 392及びビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10
393から選ばれる 1以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤を提 供するものである。
[0011] さらに、本発明は、新規な微生物である、ビフイドバクテリウム'アニマリス'サブスピ 一シズ.アニマリス YIT 10394 (FERM ABP— 10662)、ビフイドバタテリゥム 'シ ユードロンガム.サブスピーシズ.グロボサム YIT 10392 (FERM ABP— 10660) 、又はビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 1039 3 (FERM ABP— 10661)を提供するものである。
発明の効果
[0012] 本発明のビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394 、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1253、ビフイドバタ テリゥム'アニマリス ·サブスピーシズ ·ラクチス JCM 7117及びビフイドバタテリゥム · シユードロンガム ·サブスピーシズ'グロボサムは、優れたコレステロール消失作用を 有するだけでなぐ酸耐性及び胆汁酸耐性に優れていることから、腸内においても優 れたコレステロール吸収抑制作用を発揮し、血中コレステロールの低下等の脂質代 謝改善の目的に利用することができる。また、これらの微生物は、保存後の生残性が 高ぐ特に、非嫌気条件下の保存後でも高い生残性を示すことから、本発明の吸収 抑制剤は、長期保存が可能であり、また、非嫌気保存も可能である。
発明を実施するための最良の形態
[0013] 本発明で用いられるビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ ·グロボ サム (Bindobacterium pseudolongum subsp. gloDosum)としては、 f列 は、 ビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10392、ビ フイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10393力挙げ られる。
[0014] これらビフイドバクテリウム'シユードロンガム 'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 103 92、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10393 、及び本発明で用いられる微生物の一つであるビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブ スピ ~~ンズ 'フ -マリス (Biiiaobacterium animalis subsp. animaiis) YIT 10 394は、コレステロール消失活性が 70%以上、人工胃液での生残率 20%以上、且 つ胆汁酸含有培地での増殖性が、クレット値 (菌体濁度)で 100以上の性質を有する 菌株として本発明者らが単離した新規の菌株である。当該菌株は、以下のような菌学 的性質を有する。すなわち、これらの菌の菌学的性質は、いずれも、グラム陽性多形 性桿菌、芽胞非形成、非運動性、偏性嫌気性であり、 37°Cでの生育が可能であり、 上に示したコレステロール消失活性、人工胃液での生残率及び胆汁酸含有培地で の増殖性以外は、それぞれ順にビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシ ズ ·グロボサム、ビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム、 ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'アニマリスの有する性質を示した。
[0015] 当該新規菌株についての種の同定は、 16S rDNA塩基配列を用いた菌種同定 において、 YIT 10392の 16S rDNA塩基配列がビフイドバクテリウム'シユードロン ガム 'サブスピーシズ ·グロボサム（accession No. D86194)と 99. 6%の相同性を 示すこと、 YIT 10393の 16S rDNA塩基配列がビフイドバタテリゥム 'シユードロン ガム 'サブスピーシズ ·グロボサム（accession No. D86194)と 99. 6%の相同性を 示すこと、及び YIT 10394の 16S rDNA塩基配列がビフイドバタテリゥム 'アニマリ ス'サブスピーシズ'アニマリス（accession No. D86185)と 99. 7%の相同性を示 すことを根拠とした。ここで、 16S rDNA塩基配列を用いた菌種同定は、 0. 5%グ ルコース添加 GAM培地を用い 37°C、 24時間、嫌気 (炭酸ガス置換)培養した菌液 を遠心洗浄した菌体力ゝら抽出した DNAを铸型として、 16S rDNA配列の全長を P CR法によって増幅し、増幅産物の塩基配列を Dye Terminator法により決定し、 得られた塩基配列をデータベースで検索することにより行った。また、これらの菌株が 新規であるとの判断は、基準株と 16SrDNA塩基配列が異なること、 RAPD (Rando m Amplified Polymorphic DNA)法による染色体 DNA多型解析の結果が異 なることを根拠として行った。
[0016] ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394は微生物 受託番号 FERM ABP— 10662として、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブ スピーシズ 'グロボサム YIT 10392は微生物受託番号 FERM ABP— 10660とし て、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ'グロボサム YIT 10393 は微生物受託番号 FERM ABP— 10661として、平成 18年 8月 14日付で、独立行 政法人産業技術総合研究所 特許生物寄託センターに移管した。移管前の寄託先 も同じであり、そこへの寄託日は、平成 17年 8月 18日である。また、当該寄託センタ 一の住所は、郵便番号 305— 8566 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番地 1 中央 第 6である。
[0017] また、本発明で用いられるビフイドバタテリゥム'アニマリス 'サブスピーシズ 'ラクチス
(Bifidobacterium animalis subsp. lactis)jCM 1253及びビフイドバクテリウ ム.アニマリス.サブスピーシズ.ラタチス JCM 7117は、いずれも JCM (Japan Col lection of Microorganisms)及び ATCC American Type Culture Collec tion)力ら入手でき、それぞれの ATCCナンバーは、 ATCC27536及び ATCC276 74である。
[0018] これらのうち、本発明で用いられる微生物としては、微生物を用いて発酵乳飲食品 を製造し、 10°Cで 21日間、非嫌気条件 (好気条件)下で保存した後の当該微生物の 生残率が 50%以上となる微生物が好ましい。
[0019] また、本発明の微生物としては、コレステロール消失活性が 70%以上であるビフィ ドバクテリゥム属細菌が好ましぐコレステロール消失活性が 70%以上、人工胃液で の生残率 20%以上、且つ胆汁酸含有培地での増殖性がクレット値 (菌体濁度)で 10 0以上であるビフイドバタテリゥム属細菌がより好ましい。一般的なビフイドバタテリゥム 属細菌では、人工胃液での生残率は 0〜数％程度、胆汁酸含有培地での増殖性は クレット値 (菌体濁度)で 0〜数十程度である。上記の値によって選抜された高 ヽ酸耐 性及び胆汁酸耐性を有する細菌は、多数の菌が生きた状態で腸内に到達すること ができる。
[0020] ここで、コレステロール消失活性の算出は、例えば、人工脂質ミセルと共に微生物 菌体を静置した際に、上清のコレステロールを常法に従って測定し、菌体を含まない 上清のコレステロール量と比較して、次式に当てはめることにより行うことができる。 コレステロール消失活性（0/0) = 1 00一（菌体を含む上清のコレステロール量) Z( 菌体を含まない上清のコレステロール量） X 100
[0021] また、人工胃液での生残率は、例えば、 pH3. 0の人工胃液で 37°C、 1時間保存し た時の生残率とすることができる。かかる値が高いことは、消化管内での生存率が高 いことを示す。
[0022] また、胆汁酸含有培地での増殖性は、例えば、 0. 2%胆汁酸含有培地で 37°C、 2 4時間培養した時の濁度をクレット値 (Klertt—Summerson比色計、 No. 66フィル ター）で示したものとすることができる。かかる値が高いことは、消化管内での生存率、 増殖率が高いことを示す。
[0023] なお、微生物の属名、種名及び株名は、命名者の違いによって多様であり、また菌 の再分類などのために流動的でもあるので、菌族名、菌種名、菌株名が異なってい ても、微生物として実質的に同一である微生物は、本発明の微生物に含まれる。す なわち、例えば、ビフイドバタテリゥム 'アニマリスとビフイドバタテリゥム 'ラクチスは別 種として扱われることもあった力 これらを Mascoらがビフイドバタテリゥム'アニマリス としてまとめ、その下位分類としてビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'ァ 二マリスとビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'ラクチスの 2亜種とする報 告カ Sなされ (Int. Syst. Envoi. Microbiol 54, 1137— 1143, 2004)、現在に 至っている。従って、本発明のビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ァ- マリス又はビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ ·ラクチスの範囲には、そ れぞれ従前にビフイドバタテリゥム ·アニマリス又はビフイドバタテリゥム ·ラクチスと呼称 されていた菌も包含される。
[0024] また、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス ATCC 27536は、 ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ ·ラクチス JCM 1253と同一であり、 ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス ATCC 27674は、ビフイド バタテリゥム.アニマリス.サブスピーシズ.ラクチス JCM 7117と同一であり、それぞ れ本発明の微生物に含まれる。なお、 JCM及び ATCCでは 、ずれの菌株もビフイド バタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'アニマリスとして分類されて!、るが、これら 2 菌株の 16SrDNA塩基配列は、ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ 'ラタ チス（accession No. X89513)と 100%—致したことから、本発明ではビフイドバタ テリゥム .アニマリス .サブスピーシズ ·ラクチスとした。
[0025] 本発明の微生物は、後記実施例で示すように、コレステロール消失活性を有し、コ レステロール、特に血中コレステロール濃度を低下させることから、これを有効量含有 するものは、コレステロール吸収抑制剤として、とりわけ腸管力ものコレステロール吸 収抑制剤として有用である。本発明のコレステロール吸収抑制剤は、血中コレステロ ールの低下、トリグリセライドの低下、 VLDLや LDLコレステロールの低下、動脈硬化 指数の低下、 HDLコレステロールの上昇等の脂質代謝の改善、閉経後の女性ホル モン欠乏により頻発する高脂血症の改善、動脈硬化の発症リスクの低減のために用 V、ることができると期待される。
[0026] また、本発明の微生物は、後記実施例で示すように、酸耐性及び胆汁酸耐性を示 すので、これを有効量含有するものは、経口投与用のコレステロール吸収抑制剤とし て用いることができる。 [0027] さらに、本発明の微生物は、後記実施例で示すように、発酵乳飲食品で好気条件 下保存 (非嫌気保存)した場合でも高 ヽ生残性を有するので、これを有効量含有する ものは、好気条件下保存 (非嫌気保存)するコレステロール吸収抑制剤として用いる ことができる。保存温度は、例えば、 80〜10°Cとすることができる。
[0028] 本発明のコレステロール吸収抑制剤に有効成分として含められる微生物は、ビフィ ドバクテリゥム'アニマリス'サブスピーシズ'アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリ ゥム.アニマリス.サブスピーシズ.ラクチス JCM 1253、ビフイドバタテリゥム 'アニマリ ス ·サブスピーシズ 'ラクチス JCM 7117及びビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム · サブスピーシズ*グロボサム力も選ばれる 1以上であればよいが、ここで用いられる微 生物の組み合わせとしては、例えば、ビフイドバクテリウム'アニマリス 'サブスピーシ ズ ·ラクチス JCM 1253及びビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ ·ラクチ ス JCM 7117から選ばれる 1以上の組み合わせ、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス 'サ ブスピーシズ'アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブス ピーシズ 'グロボサム YIT 10392及びビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブス ピーシズ.グロボサム YIT 10393から選ばれる 1以上の組み合わせが挙げられる。
[0029] また、本発明のコレステロール吸収抑制剤には、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サ ブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシ ズ'ラクチス JCM 1253、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス J CM 7117、及びビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ'グロボサム を単独もしくは組み合わせて用いるほか、これらと他の微生物を併用することもできる 。このような微生物としては例えば、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ' アニマリス、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス、ビフイドバクテ リウム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム、ビフイドバタテリゥム ·アドレツセ ンテイス、ビフイドバタテリゥム 'アンギュラータム、ビフイドバタテリゥム 'ァステロイデス 、ビフイドバクテリウム'ビフィダム、ビフイドバタテリゥム 'ブレーべ、ビフイドバタテリゥム '力テ-ユラ一タム、ビフイドバタテリゥム 'デンティゥム、ビフイドバタテリゥム 'ガリカム、 ビフイドバタテリゥム 'インファンテイス、ビフイドバタテリゥム 'ロンガム、ビフイドバタテリ ゥム ·シユードカテ-ユラ一タム、ビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシ ズ'シユードロンガム、ビフイドバタテリゥム 'スイス、ビフイドバタテリゥム 'サーモフィラム 等のビフイドバタテリゥム属細菌；ラクトバチルス'ァシドフィルス、ラクトバチルス'ガセ リ、ラクトバチルス ·プランタラム、ラクトバチルス ·力ゼィ、ラクトバチルス ·ジョンソニー、 ラクトバチルス 'クリスパータス、ラクトバチルス ·ラムノーサス、ラクトバチルス 'ケフィァ 、ラクトバチルス 'デルブルツキィ'サブスピーシズ 'デルブルツキィ、ラクトバチルス'デ ルブルツキィ'サブスピーシズ 'ブルガリタス、ラクトバチルス 'ヘルべティカス、ラタトバ チルス 'サリバリウス、ラクトバチルス 'ロイテリ、ラクトバチルス ·マリ、ラタトバチラス 'アミ ロボラス、ラタトバチラス'ァリメンタリウス、ラタトバチラス ·ブヒネリ、ラタトバチラス'ブレ ビス、ラタトバチラス'ガリナラム、ラタトバチラス'フアーメンタム、ラタトバチラス'マルタ ロミタス、ラタトバチラス'パラカゼィ、ラタトバチラス'ペントサス等のラクトバチルス属細 菌；ストレプトコッカス ·サーモフィルス等のストレプトコッカス属細菌；ラタトコッカス ·ラ クチス ·サブスピーシズ ·クレモリス、ラタトコッカス ·ラクチス ·サブスピーシズ ·ラクチス 等のラタトコッカス属細菌；ロイコノストック.メセンテロイデス ·サブスピーシズ.タレモリ ス等のロイコノストック属細菌；ぺディォコッカス ·セレピシェ等のぺディォコッカス属細 菌；ェンテロコッカス .フエカリス等のェンテロコッカス属細菌；ァセトバクタ一'ァセチ 等のァセトパクター属細菌；ダルコノバクタ一'ォキシダンス等のダルコノバクター属細 菌；バチルス'ズブチリス等のバチルス属細菌；サッカロマイセス 'セルピシェ等のサッ カロマイセス属酵母；トルラスポラ ·デルブルエツキ一等のトルラスポラ属酵母；キャン ジダ ·ケフィァ等のキャンジダ属酵母；タリべロマイセス ·マルキシアヌス等のクルイべ口 マイセス属の酵母；デノ リオマイセス ·ハンセ-一等のデノ リオマイセス属酵母；ピキ ァ ·ァノマラ等のピキア属酵母；ジゴサッカロマイセス ·ロキシ等のジゴサッカロマイセス 属酵母；ァスペルギルス'オリーゼ、ムコール 'ジャポニカス、モナスカス'プルプレウス 、ぺ-シリウム '力マンベリ、リゾムコール'プシラス、リゾプス 'ァリザス等のァスペルギ ルス属、ムコール属、モナスカス属、ぺニシリウム属、リゾムコール属、リゾプス属のか びなどが挙げられる。
また、本発明のコレステロール吸収抑制剤に含められる微生物は、凍結乾燥したも のであってもよぐあるいはこれら微生物を含む培養物として利用することもできる力 いずれの形態であっても、微生物が生菌の状態であることが好ましい。 [0031] 本発明のコレステロール吸収抑制剤は、前記の微生物を固体又は液体の医薬用 無毒性担体と混合して、慣用の医薬品製剤の形態で投与することができる。このよう な製剤としては、例えば、錠剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤などの固形剤、溶液剤、 懸濁剤、乳剤などの液剤、凍結乾燥製剤などが挙げられる。これらの製剤は製剤上 の常套手段により調製することができる。医薬用無毒性担体としては、例えば、ダルコ ース、乳糖、ショ糖、澱粉、マン-トール、デキストリン、脂肪酸グリセリド、ポリエチレン グリコール、ヒドロキシェチルデンプン、エチレングリコール、ポリオキシエチレンソル ビタン脂肪酸エステル、アミノ酸、ゼラチン、アルブミン、水、生理食塩水などが挙げら れる。また、必要に応じて、安定化剤、湿潤剤、乳化剤、結合剤、等張化剤などの慣 用の添加剤を適宜添加することもできる。
[0032] また、本発明のコレステロール吸収抑制剤は、前記の微生物をそのまま摂取、ある いは食品に直接添加することにより摂取するほか、飲食品の形態で摂取することがで きる。飲食品の好ましい例としては、本発明の微生物を生菌の状態で含有する発酵 乳、発酵豆乳、発酵果汁、発酵植物液、発酵米汁、発酵麦汁や動 ·植物由来素材の 発酵飲食品 (漬物、味噌、醤油、発酵茶、発酵ソーセージ、発酵マヨネーズ、チーズ 、塩辛等）が挙げられ、これら飲食品は通常の方法により製造することができる。例え ば発酵乳を製造する場合は、まず、殺菌した乳培地にビフイドパクテリゥム 'アニマリ ス 'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブス ピーシズ 'ラクチス JCM 1253、ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラタ チス JCM 7117、及びビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ'グロ ボサムのうち少なくとも 1つ以上を単独又は他の微生物と同時に接種培養し、これを 均質化処理して発酵乳ベースを得る。次いで、別途調製したシロップ溶液を添加混 合し、ホモゲナイザー等で均質ィ匕し、更にフレーバーを添加して最終製品に仕上げ ればよい。このようにして得られる本発明の発酵乳は、プレーンタイプ、ソフトタイプ、 フルーツフレーバータイプ、固形状、液状、凍結状等のいずれの形態の製品とするこ ともできる。なお、飲食品には、動物の飼料も含まれる。発酵乳中の本発明の微生物 濃度は、例えば、 103〜： L013cfuZmlとすることができる。
[0033] この場合、本発明のコレステロール吸収抑制剤には、通常の飲食品に用いられる 食品素材、例えば糖類、タンパク質、ペプチド、脂質、ビタミン類、ミネラル類、野菜、 穀物、果実などの植物成分、血液、乳、肝臓、骨、筋肉などの動物成分、細菌、カビ 、酵母、キノコなどの微生物成分あるいは培養物成分、ゲル化剤、固化剤、増粘剤、 香料、着色料、ビフイドパクテリゥム属細菌増殖促進剤、乳酸菌増殖促進剤等を配合 することができる。具体的には、グルコース、シュクロース、フラクトース、マルトース、 ブドウ糖果糖液糖、キシロース、パラチノース、蜂蜜、メイプルシロップ、甘酒等の各 種甘味料、ソルビトール、キシリトール、エリスリトール、ラタチトール、パラチニット、還 元水飴、還元麦芽糖水飴等の各種糖アルコール、スクラロース、アスパルテーム等の 各種高甘味度甘味料、甘草、ステビア、グリチルリチン酸配糖体などの各種天然甘 味料、ショ糖脂肪酸エステル、グリセリン糖脂肪酸エステル、レシチン等の各種乳化 剤、寒天、ゼラチン、カラギーナン、グァーガム、アラビアガム、キサンタンガム、ぺク チン、ローカストビーンガム等の各種増粘 (安定)剤が挙げられる。
このほかにも、タガトース、ラタトース、トレハロース、トレハルロース、ァガロオリゴ糖 、 -ゲロオリゴ糖、ガラタトオリゴ糖、フラタトオリゴ糖、キシロオリゴ糖、ラフイノース、ス タキオース、ラクチュロース、マルトトリオース、イソマルトオリゴ糖、シクロデキストリン、 ダルコサミン、 N—ァセチルダルコサミン等の各種糖質、アルギン酸、アルギン酸ナト リウム、フコィダン、サルガッサン、フルセラン、フノラン、ボルフイラン、ァミナラン、プ ルラン、タラガム、コンニヤクマンナン、ィヌリン、キチン、キトサン、ポリデキストロース、 ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、 13—グルカン、マンナン、ガラクタン、フルクタン、 キシラン、ァラビナン、ァラビノガラタタン、ダルコマンナン、ガラタトマンナン、ビートフ アイバー、オート麦ファイバー、小麦ファイバー、大豆ファイバー、米ファイバー、大麦 ファイバー、キサンタンガム、コーンファイバー、リンゴファイバー、シトラスファイバー、 サイリュームファイバー、パインファイバー、ブルーンファイバー、エンドゥ豆ファイバ 一、バナナファイバー、酢酸菌バクテリアセルロース、乳酸菌菌体細胞壁、ビフイドバ クテリゥム属細菌菌体細胞壁、酵母菌体細胞壁、納豆フラクタン、コラーゲン、納豆ポ リグルタミン酸等の各種食物繊維あるいはそれら食物繊維の各種加水分解物、小麦 フスマ、大麦フスマ、米フスマ、カラス麦フスマ、才ーッ麦フスマ、ライ麦フスマ、サイリ ユウム、米糠、玄米、チッコリー、大豆おから、アップルパルプ、レジスタントスターチ、 大麦麦芽、トウモロコシ種子外皮、乳酸菌菌体、ビフイドパクテリゥム属細菌菌体、ビ ール酵母菌体、ワイン酵母菌体、ワイン粕、酒粕、しょうゆ粕、ビール粕、米麹、麦麹 、豆麹、紅麹、黄麹、納豆粘質物、ブドウ種子抽出物、ローヤルゼリー、プロポリス、ク ロレラ、スピルリナ、ユーグレナ、ワカメ、コンブ、ホンダワラ、ァラメ、カジメ、アサクサノ リ、ァォノリ、ヒジキ、ァォサ、モズク等の難消化性の食物繊維を多く含む各種素材が 挙げられる。
さらに、カルシウム、マグネシウム、亜鉛、鉄、マンガン、ヨウ素、セレン、銅、コバルト 、ドロマイト等の各種ミネラル類あるいはそれらミネラルの各種塩類、クェン酸、リンゴ 酸、酒石酸、ピルビン酸、ダルコン酸、コハク酸、フマル酸、ァスコルビン酸、乳酸、酢 酸、プロピオン酸、酪酸、リン酸、クレアチン、メチォニン、システィン、グルタミン酸な どのアミノ酸等の各種酸類あるいはそれらの酸類の各種塩類、ダルタチオン、フイチ ン、フィチン酸、リグニン、ポリ γ グルタミン酸およびその分解物、サポニン、フエ ルラ酸、 ーァミノ酪酸、 オリザノール、カルコン、フラバノン、フラボン、フラボノ ール、イソフラボン、アントシアン、カテキン、プロアントシァ-ジン、茶葉ポリフエノー ル、クルクミド、カプサイシノイド、セサミノール、ゴマリグナン、テアフラビン、 /3ジケト ン類、カロチノイド類、ァリルィォゥ化合物、イソチオシアナート類、テルペン類、クロ口 フィル類、スフインゴ脂質、ガンダリオシド、 η— 3多価不飽和脂肪酸類、 η— 6多価不 飽和脂肪酸類、共役リノール酸類、リン脂質類、植物ステロール類等の各種成分、グ リシニン、コングリシニン等の大豆タンパク、オボアルブミン、オボムコイド等の卵タン パク、カゼイン、ラクトアルブミン、ラタトフエリン等の乳タンパクおよび乳清タンパク、力 ゼインホスホペプチド、ォリゼニン等の米タンパク、グルテニン、グリアジン等の小麦タ ンパク、魚肉タンパク等の各種タンパク類およびそれらの酵素分解ペプチドおよび酸 分解ペプチド類、ビタミン Α、ビタミン Β群、ビタミン C、ビタミン D群、ビタミン E、ビタミ ン K群、 βカロチン、レチノイン酸、葉酸等の各種ビタミン類、ブラックコホッシュ、セィ ヨウカボチヤ種子、ザクロ種子、セィヨウオトギリソゥ、パッションフラワー、ノ レリアン、 プエラリア.ミリフイカ、ローズマリー、ペパーミント、パセリ、マリーゴーノレド、レモンバ ーム、ョモギ、サフラワー、ダイコン種子、コーヒーノキ、ゥコギ、ユウガオ果実、ミカン 科果皮、イチヨウ葉、ナツメ、クコシ、甘草、霊芝、高麗ニンジン、ガラナ等の各種ェキ ス類、緑茶、紅茶、ウーロン茶、ギムネマ茶、グアバ葉等の各種植物抽出物、コショウ 、サンショウ、シナモン、ターメリック、セイジ、タイム、バジノレ、トウガラシ、ナツメグ等の 各種香辛料が挙げられる。
[0036] また、米、玄米、大麦、小麦、オーツ麦、ライ麦、ノ、トムギ、アマランサス、ァヮ、キビ 、ソバ、モロコシ、トウモロコシ等の各種穀物の成分あるいはそれら穀物の種子の各 種発芽物成分、ァズキ、シロアズキ、キントキマメ、インゲンマメ、エンドゥマ入ムラサ キハナマメ、チヤナマメ、クロダイズ、ァオダィズ、リヨクトウ、ソラマメ、ダイフクマメ、ァ シタパ、ケール、ゥコン、ジャガイモ、サツマィモ、紫サツマィモ、ャマイモ、カボチヤ、 ナス、トマト、二ガウリ、ピーマン、ゴマ、キャベツ、ブロッコリ一、カリフラワー、レタス、 エダマメ、ショウガ、ゴボウ、セロリ、ダイコン、ヮサビ、アボカド、ニンジン、ホウレンソゥ 、タマネギ、ニンニク、ユリ、ラツキヨウ、シソ、ネギ、 -ラ、パース-ップ、ヮラビ、タケノ コ、シィタケ、マッシュルーム等の各種野菜成分、レモン、リンゴ、ブドウ、イチゴ、ォレ ンジ、カキ、グアバ、バナナ、ブルーベリー、ブラックベリー、クランベリー、キイチゴ、 コケモモ、ャマモモ、フェイジョァ、タマリ口、ァセロラ、ライム、シークヮーサ一、メロン 、モモ、マンゴー、ュズ、パパイア、パインアップル、ナシ、プラム、グレープフノレーッ、 カリン、アンズ、ミカン、ザクロ、スイカ、ブルーン、キウイ等の果実成分、ピーナッツ、 アーモンド、ココナッツ、カシューナッツ、マカデミアナッツ、カカオ、タリ、ギンナン、ク ルミ等の各種ナッツ成分、牛乳、脱脂乳、乳清、クリーム、発酵乳、ヨーグルト、乳タン パク、カゼイン、乳清タンパク等の各種乳製品およびそれらの成分、清酒、ブドウ酒、 紹興酒、ビール等の醸造酒類、ウィスキー、ブランデー、ウォッカ等の蒸留酒類等が 挙げられる。
[0037] ビフイドパクテリゥム属細菌を利用した発酵乳飲食品において、保存時の生残性を 高める目的で、ガラスやアルミコーティング紙等の酸素不透過性の包剤で構成された 容器が主に用いられてきたが、後記実施例に示すとおり、本発明の微生物は、高い 酸素耐性を有し、厳密な嫌気状態を必要としないため、本発明のコレステロール吸 収抑制剤の容器素材には、酸素透過性の高い榭脂（ポリスチレン、ポリエチレン、ポリ エチレンテレフタレート等)も使用できる。これらの榭脂を用いた容器は、酸素不透過 性の包剤で構成された容器と比較して、コストが低ぐ成型の自由度が高い等のメリッ トを有する。
[0038] 本発明のコレステロール吸収抑制剤の有効成分である微生物は、後記実施例に示 すとおり、優れた酸耐性を示すことから、本発明のコレステロール吸収抑制剤は、酸 性とすることができ、例えば、 25°Cにおける pHを 2〜7、特に 3〜6とすることができる
[0039] 本発明のコレステロール吸収抑制剤の有効成分であるビフイドバタテリゥム属細菌 は、従来より食品として利用され、その安全性も確認されているものであることから、こ れをコレステロール吸収抑制剤として使用する場合の投与量に厳格な制限はないが
、その好適な投与量は生菌数として 1日当たり 105cfu〜1013cfuであり、特に 108cfu 〜1012cfuが好ましい。
実施例
[0040] 以下、実施例及び試験例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれ らに何ら制約されるものではない。
〔試験例 1〕
(1)コレステロール消失活性
m— ILS培地（Int. J. Food Microbiol. 81. 131— 136 2003)で 24時間 37。C にて嫌気培養した培養液を 12, 000rpm、 15分、 4°Cで遠心し、菌体を pH5. 5の 1 50mMリン酸緩衝液で洗浄した。遠心洗浄は 3回繰り返したのち濁度（660nmでの 吸光度）が 3 (菌数として 108〜 109cf u/ml)になるように 150mMリン酸緩衝液に懸 濁し、菌体懸濁液を調製した。また菌体懸濁液を 121°Cで 15分オートクレープ処理 を行い、死菌体懸濁液を調製した。
牛胆汁粉末 2g、コレステロール 921mg、リゾフォスファチジルコリン 135mg、モノォ レイン酸 90. 2mg、ォレイン酸 702. 2mgを 150mMリン酸緩衝液 (pH7. 0)に懸濁 し、超音波処理を 12分間行ったのち、 100, 000Gで 18時間 25°Cにて超遠心し、ミ セル層を回収し、人工脂質ミセルを調製した。菌体懸濁液 lml (菌数として 108〜109 cfu)に対して人工脂質ミセルを 150 1カ卩え、 37°Cに静置した。 18時間後、 12, 00 Orpm、 15分、 4°Cで遠心した上清のコレステロールをデタミナ TC555 (協和メデイツ タス)で測定した。対照として、菌体を含まないリン酸緩衝液も同様の操作を行い、下 式によりコレステロール消失活性を算出した。また、死菌体懸濁液についても同様に コレステロール消失活性を算出した。
コレステロール消失活性（0/0) = 1 00一（菌体を含む上清のコレステロール量) Z (菌 体を含まない上清のコレステロール量） X 100
[0041] (2)酸耐性
塩酸で pH3に調製した 50mM Na HPO溶液 10mlに GAM培地（日水）で定常
2 4
期まで培養した菌液 0. 1mlを加え、 37°Cで 1時間処理し、下式により生残率を算出 した。
生残率 (％) = (酸処理後の生菌数) Z (酸処理前の生菌数） X loo
[0042] (3)胆汁酸耐性
GAM培地で定常期まで培養した菌液 30 μ 1を、 0. 2%の胆汁酸を添カ卩した 3mlの
GAM培地に接種し、 37°Cで嫌気的に培養した。 24時間後に菌体濁度を Klett—S ummerson比色計（No. 66フィルター）で測定した。
[0043] 上記（1)〜（3)の試験結果を表 1に示した。
[0044] [表 1]
各菌のコレステロール消失活性、 酸耐性、 胆汁酸耐性の測定結果
Figure imgf000017_0001
NTは未試験であることを示す。
酸耐性において生残率が 1 %以下の場合、 < 1と示した。
胆汁酸耐性において、胆汁酸添加 GAM培地で殆ど生えなかった場合は、目視にて判断し、 一で示した。
[0045] 表 1に示すように、本発明のビフイドバタテリゥム 'アニマリス 'サブスピーシズ 'アニマ リス、ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシス '·ラクチス及びビフイドバクテリウ ム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ'グロボサムは高レ、コレステロール消失活性を示 し、酸耐性、胆汁酸耐性に優れていた。また、死菌体ではコレステロール消失活性を 有さな力つたことから、これらの菌は生菌の状態で活性を示すことが分力つた。
[0046] 次に、上清からのコレステロールの消失力 沈殿によるもの力、変換や分解によるも のかを知る目的で、沈殿部分のコレステロールを測定したところ、上清から消失したコ レステロールは、変換や分解されずに沈殿物中に存在していることが明ら力となった
。以上のことから、上清中のコレステロールは菌体に取り込まれて沈殿した力、或い は、菌体が有する胆汁酸の脱抱合作用等により、脂質ミセルが崩壊して沈殿した可 能性が示唆された。
[0047] 〔試験例 2〕 動物の血中脂質及び肝臓脂質に及ぼす影響
酵母エキス 0. 03%を含んだ 10%脱脂粉乳培地を 121°Cで 15分滅菌し、ビフイド バタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10393を 1 %接種し 24時間嫌気的に培養した。この培養液を同培地に 2%接種し、 37°Cで 46〜54時間 嫌気的に培養した。カゝくして調製された発酵乳中に含まれる生菌数は 3. 7 X 108cfu Zmlであった。この発酵乳を凍結乾燥し、表 2に示した組成で餌を調製した。ここで、 餌における生菌数は 1. O X 106cfu/gであった。一方、対照として、酵母エキス 0. 0 3%を含んだ 10%脱脂粉乳培地を 121°Cで 15分滅菌後、菌は接種せずに凍結乾 燥したものを未発酵乳とし、表 2に示した組成で餌を調製した。
[0048] [表 2]
動物に投与した餌の組成 （％)
オリゴ糖 なし あり
カゼイン 19. 66 19. 66
コーン油 5 5
ビ タ ミ ン 混 合 1 1
(AI -93G)
塩類混合 (A I N-93G) 3. 5 3. 5
コリン重酒石酸 0. 2 0. 2
シュクロース 14. 34 11. 84
α—コーンスターチ 50 50
セルロース 5 5
DL—メチ才ニン 0. 3 0. 3
発酵乳または未発酵乳 1 1
ガラクト才リゴ糖 0 2. 5
[0049] 次に、 8週齢で購入した Wistar系の卵巣摘出ラット（日本 SLC)または偽手術ラット を、 1週間の予備飼育後、 1週間 AIN— 93G精製飼料に馴化させ、体重によって、表 3に示す実験群に群分けした。
[0050] [表 3] 実験群
動物 乳 ガラクト才リゴ糖 % 匹数
sham SM 0 4
0VX SM 0 5
0VX FS 0 5
0VX SM 2. 5 5
0VX FSM 2. 5 5
Sham：偽手術、 0VX：卵巣摘出、 SM：未発酵乳、 FSM：発酵乳 力べして群分けされたラットを、室温 24± 1°C、湿度 55± 5°Cで、それぞれの群に対 応する餌及び水の自由摂取可能条件下、個別ブラケットケージにて 34日間試験飼 料にて飼育した。 1日あたりの生菌数摂取量は約 107cfuZ匹であった。
次に給餌器を取り除き、 4時間後に、ネンブタール麻酔をし、腹大動脈血の採取、 及びかん流して肝臓の採取を行った。肝臓は分析まで— 20°Cで保存し、血液は 30 OOrpm、 15分遠心し、血漿を分離した。肝臓は凍結乾燥後 Folchの方法 (J. Biol. Chem. 226, 497— 509, 1957)により抽出した。
力べして得られた血漿及び肝臓抽出物に含まれる総コレステロール、トリダリセライド の量を、それぞれデタミナ TC555 (協和メディックス）、トリグリセライド Έテストヮコー（ 和光純薬）を使用して求めた。また、血漿に含まれる HDLコレステロールの量を、 H DL—コレステロール Eテストヮコー（和光純薬）を用いて求めた。さらに、血漿に含ま れる VLDL + LDL—コレステロールの量を、総コレステロール量から HDLコレステロ 一ル量を差し引くことにより求めた。
得られた結果をもとに、卵巣摘出群について 2元配置の分散分析を行い、 pを求め た。また、偽手術群と同様の餌を投与した卵巣摘出群について t検定を行った。得ら れた結果を表 4〜6に示す。値は平均値士 SDで表した。なお、表 4〜6において交 互作用とは、発酵乳とガラ外オリゴ糖の間における交互作用を示す。
[表 4]
ビフィドバクテリゥ厶 ンユードロンガム■サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10393で調製した発酵乳が成長に及ほす影響 偽手術 卵巣摘出 分散分析の結果 未発酵乳 未 5¾酵乳 発酵乳 (P<)
ゴ糖 交互作 才リゴ糖なし 才リゴ糖な オリゴ糖ぁ 才リゴ糖な 才リゴ糖あ 発酵乳 オリ
し り し y
初期体重 (g) 157±6 182±7*** 182±6 183±6 182±8 NS NS NS 終体重 (g) 185±6 235±13«ネ 233±8 234± 14 232±5 NS NS NS 体重増加量 (g) 28±2 52±6 52± 10 50±7 NS NS NS 摂食量 （g/34 372± 19 454±37** 433±24 452±35 425± 11 NS NS NS 日） 一
**、 ：偽手術■未発酵乳 ·オリゴ糖な ϋϊϊと卵巣摘出 '未発酵乳 ·オリゴ糖なし群の間に οι、 0. 001で有意差あり。
NS：有意差なし
表 4に示すとおり、卵巣摘出ラットは偽手術群と比較して、既報通り Ci. Comp. Phy siol. Physicol 88 : 183— 193、 1975)体重や摂食量が多くなつた力 卵巣摘出群 の中ではオリゴ糖の有無や発酵乳投与の影響は認められず、良好に成長した。
[表 5]
ビフィドバクテリゥ厶 'シユードロンガム ·サブスピーシズ■グロボサム Y 10393で調製した発酵乳が血中脂質に及ほす 影響
偽手術 卵巣摘出 分散分析の結果 未発酵乳 未発酵乳 発酵乳 (P<) 才リゴ糖なし オリゴ糖なし 才リゴ糖あり オリゴ糖なし 才リゴ糖ぁリ 発酵乳 ォリゴ糖 交互作用
TC 101.7±3.7 1347±8.6* 145.7±25.5 124.5±17.7 120.3±10.3 0.05 NS NS
TG 54.9±11.9 77.1±15.0 74.4±35.3 58.5±17.6 50.5±9.4 0.05 NS NS
HDL-C 67.5±5.3 90.0±15.0* 91.3±16.7 101.3±16.8 100.3±7.1 NS NS NS
VLDL+LDL— C 34.0±42 447±11.2 54.4±9.6 23.2±13.8 20.1±11.9 0.0001 NS NS
AI 0.507±0.096 0.52は 0.197 0.598±0.061 0.241 ±0.178 0.204± 0.124 0.001 NS NS
*：偽手術 ·未発酵乳■オリゴ糖なし群と卵巣摘出■未発酵乳 ·オリゴ糖なし群の間に 0.05で有意差あり。
TC：総コレステロール (tng/dl)、 TG : 卜リグリセライド（mg/dl)、 HDL-C： HLD コレステロール (mg/dl)、 VLDL + LDL-C： VLDL
+ LDL—コレステロール (mg/dl)、 AI：動脈硬化指数 （VLDL + LDL— CZHDL - C)
NS：有意差なし
[0054] また、表 5に示すとおり、ビフイドバクテリウム'シユードロンガム 'サブスピーシズ 'グ ロボサム YIT 10393で調製した発酵乳の効果は、血中のコレステロール、トリグリセ ライド、 VLDL + LDL—コレステロール、動脈硬化指数に認められ、いずれの項目も 低下させた。特に VLDL + LDL—コレステロールの低下は著しかった。また、これら の項目に対するオリゴ糖の効果や発酵乳とオリゴ糖の交互作用は統計学的には観 察されなかったが、オリゴ糖と発酵乳の併用投与群の血中総コレステロール、トリダリ セライド、 VLDL + LDL—コレステロール、動脈硬化指数の値が最も低い値を示した 。ガラタトオリゴ糖はビフイドパクテリゥム属細菌に特異的に利用されることが知られて いる。したがって、ガラタトオリゴ糖を含む発酵乳を投与することにより、腸管内でビフ イドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10393力 S増殖し 、血中脂質を効果的に低下させることが示された。なお、卵巣を摘出することにより、 血中総コレステロールが上昇し、閉経後高脂血症モデルとして有用であることが知ら れている。卵巣摘出'未発酵乳'オリゴ糖なし群と偽手術群とのデータの比較から、今 回の試験における卵巣摘出手術が成功したことが示された。
[0055] [表 6]
ビフィドバクテリゥ厶'シュ一ドロンガム ·サブスピーシズ ·グロボサム YIT 10393で調製した発酵乳が肝臓脂質に及ほす 影響
偽手術 卵巣摘出 分散分析の結果 未発酵乳 未発酵乳 発酵乳 (Pく） オリゴ糖なし 才リゴ糖なし オリゴ糖あり オリゴ糖なし 才リゴ糖あり 発酵乳 才リゴ糖 交互作用 月干臓盧 6.5±0.6 7.9±0.8* 7.5±0.7 7.6±1.0 7.3±0.5 NS NS NS 総コレステロール（mg/g) 7.4±0.8 7.1±0.3 7.0±0.4 7.3±0.4 7.3±0.4 NS NS NS 総コレステロール（mg/liver) 13.6±1.6 16.6±1.4* 16.0±1.3 16.0±2.6 15.4±0.43 NS NS NS トリダリセライド（mg/g) 72.1±12.7 137.7±26.5** 138.4± 28.8 117.7±29.0 103.3±11.1 0.05 NS NS 卜リグリセライド (mg/li er) 132.4± 23.8 325.8±80.3** 319.1±97.7 268.4± 113.9 220.4±29.6 NS NS NS
*、 n：偽手術 ·未発酵乳，オリゴ糖なし群と卵巣摘出■未発酵乳 ·オリゴ糖なし群の間に順に 0.05、 0.01で有意差あり。
NS：有意差なし
[0056] 表 6に示すように、オリゴ糖の有無や発酵乳投与の有無による肝臓コレステロール 含量への影響はなぐ肝臓への脂質の蓄積はな力つた。トリダリセライドの場合、発酵 乳の投与により肝臓当たりでは統計学的な有意差は観察されな力つたが、肝臓 lg当 たりのトリダリセライド含量が低下した。
以上のように、ビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ'グロボサム YI T 10393で調製した発酵乳は、血中の総コレステロール、トリダリセライド、 VLDL + LDL—コレステロール、動脈硬化指数を低下させたことから、コレステロールのみで はなぐ各種血中脂質に対する脂質代謝改善能を有し、動脈硬化の発症リスクを低 減する効果を有することが明らかとなった。
[0057] 〔試験例 3〕 発酵乳中での生残性の検討
10%の脱脂乳に 0. 03%の酵母エキスを添加して殺菌し、本発明の細菌（ビフイド バタテリゥム.アニマリス.サブスピーシズ.アニマリス YIT 10394、ビフイドバクテリウ ム.アニマリス.サブスピーシズ.ラクチス JCM 1253、 JCM 7117、ビフィドノくクテリ ゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10392、 YIT 10393)をそ れぞれ 2%接種して、 37°Cで pH5. 1 ± 1. 0まで培養し、 5種類の発酵乳を製造した 。また、対照としてビフイドバタテリゥム 'ロンガム ATCC 15707を用いて同様に発 酵乳を製造した。
調製した発酵乳を嫌気保存の場合にはガラス試験管に、非嫌気保存 (好気保存） の場合にはポリプロピレンチューブに 10mlずつ分注し、 10°Cで 12週間保存した。嫌 気保存の場合は N気流下プチルゴム栓で密栓し、非嫌気保存の場合はポリプロピ
2
レンチューブのふたをゆるく締めた。表 7に培養終了時の pH及び生菌数、表 8に非 嫌気保存下の菌数の推移、表 9に嫌気保存下の菌数の推移を示した。
[0058] [表 7] 各菌株の培養終了時の PH及び生菌数
Figure imgf000026_0001
[表 8]
10°C *非嫌気条件保存 （好気条件保存） 下の発酵乳中での各菌株の菌数の推移
Figure imgf000026_0002
-：検出されなかった
[表 9]
10°C ·嫌気条件保存下の発酵乳中での各菌株の菌数の推移
Figure imgf000026_0003
表 8に示すように、非嫌気条件 (好気条件)保存では、対照に用いたビフイドパクテリ ゥム.ロンガム ATCC 15707は 3週間後には 9. 2 X 103cfu/mほで減少し、 8週 間後以降は検出されな力つた。それに対して本発明のビフイドパクテリゥム属細菌は 、いずれの菌株についても 3週間保存しても 1 X 108cfuZmlを下回ることはなぐ培 養終了時と比較した時の生残率は 50%以上となった。また、 12週間保存してもビフ イドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1253、JCM 7117では 1 X 108cfuZmlを下回ることはなぐ残りの 3菌株（ビフイドバタテリゥム 'シユードロン ガム'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10392、 YIT 10393、ビフイドバクテリウム' アニマリス .サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394)も 1〜2オーダー程度の減少に 留まった。
表 9に示すように、嫌気条件保存では、 3週間保存後、ビフイドパクテリゥム 'ロンガ ム ATCC 15707は 1Z10程度まで菌数が低下した力 本発明のビフイドバタテリ ゥム属細菌は培養終了時の菌数をほぼ維持した。ビフイドパクテリゥム 'シユードロン ガム'サブスピーシズ 'グロボサム YIT 10392、 YIT 10393、ビフイドバクテリウム' アニマリス.サブスピーシズ.アニマリス YIT 10394は 12週間保存しても 1Z2〜1Z 6程度にしか菌数は減らず、ビフイドバタテリゥム ·アニマリス ·サブスピーシズ'ラクチ ス JCM 1253、JCM 7117は 12週間後も菌数はほとんど同じであった。
〔処方例 1〕錠剤の製造
下記の処方で各種成分を混合して造粒 ·乾燥 ·整粒した後に、打錠して錠剤を製造 した。
(処方） （mg)
本発明の細菌菌体の乾燥物 υ 20
微結晶セルロース 100
乳糖 80
ステアリン酸マグネシウム 0. 5
メチノレセノレロース 12
D：ビフイドバタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム YIT10392の 生菌体を凍結乾燥して得た。
〔処方例 2〕発酵乳飲料の製造
15%脱脂乳に 3%グルコースを添加して殺菌し、ビフイドバタテリゥム 'シユードロン ガム'サブスピーシズ'グロボサム ΥΙΤ 10393を 1%接種し、 35°Cで 24時間嫌気培 養して発酵乳ベース 21 Ogを得た。一方、砂糖 97g、乳化鉄 0. 2gを水に溶解し、全 量を 790gとして殺菌し、シロップを得た。上記のようにして得られた発酵乳ベースとシ 口ップを混合し、香料を lg添加した後、 15Mpaで均質化して容器に充填して発酵乳 飲料を得た。得られた発酵乳飲料は外観 '風味ともに良好で、製造直後の生菌数は 、 2. 5 X 108cfuZmlであった。また、 10°Cで 21日間保存した後の生菌数は 1. 4 X 108cfuZmlであり、保存安定性も良好であった。
〔処方例 3〕清涼飲料の製造
下記処方により、常法に従って各成分を配合し、均質化して清涼飲料を得た。得ら れた清涼飲料は褐色瓶に充填後、アルミキャップにて封印し、加熱処理を施した。得 られた清涼飲料は外観 ·風味ともに良好で、保存安定性も良好であった。
(処方） (g)
本発明の細菌菌体の乾燥物 υ 5
香料 0. 8
水 100
還元澱粉糖化物 24
果糖 18
"：ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス ΥΙΤ 10394の生菌体 を凍結乾燥して得た。

Claims

請求の範囲
[1] ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス YIT 10394、ビフイド バタテリゥム.アニマリス.サブスピーシズ .ラクチス JCM 1253、ビフイドバクテリウム' アニマリス .サブスピーシズ 'ラクチス JCM 7117及びビフイドバタテリゥム ·シユード口 ンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム力 選ばれる 1以上の微生物を有効成分とするコ レステロール吸収抑制剤。
[2] ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'ラクチス JCM 1253、ビフイドバタ テリゥム ·アニマリス .サブスピーシズ ·ラクチス JCM 7117から選ばれる 1以上の微生 物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤。
[3] ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス ΥΙΤ 10394、ビフイド バタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム ΥΙΤ 10392及びビフイド バタテリゥム ·シユードロンガム ·サブスピーシズ 'グロボサム ΥΙΤ 10393力ら選ばれ る 1以上の微生物を有効成分とするコレステロール吸収抑制剤。
[4] ビフイドバタテリゥム 'アニマリス'サブスピーシズ 'アニマリス ΥΙΤ 10394 (FERM
ΑΒΡ- 10662)、ビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム'サブスピーシズ'グロボサム ΥΙΤ 10392 (FERM ΑΒΡ— 10660)、又はビフイドバタテリゥム 'シユードロンガム 'サブスピーシズ'グロボサム ΥΙΤ 10393 (FERM ABP— 10661)。
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