CN116509903A - 一种增强免疫功能的合生元组合物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种增强免疫功能的合生元组合物，所述合生元组合物包括益生菌与益生元，所述益生菌为双歧杆菌，所述益生元为甘露寡糖。本发明的合生元组合物可增强免疫抑制小鼠的免疫器官指数、巨噬细胞的吞噬指数，改善免疫抑制小鼠血清免疫指标，具有免疫调节的作用。

Description

一种增强免疫功能的合生元组合物及其应用
技术领域
本发明属于生物制剂技术领域，具体涉及一种增强免疫功能的合生元组合物及其应用。
背景技术
合生制剂是指包含有益活菌(益生菌)以及饲养活菌的化合物(益生元)的配方产品。它分为互补型和协同型：互补型的合生制剂，其配方中的益生菌和益生元是独立产生作用的；而协同型的合生制剂，其配方中的益生元是经过精心挑选的，有利于配方中的益生菌生长，可产生更显著的综合效益。
目前商业合生元多添加单一或多种益生菌型产品以及单一或多种益生元型产品，少见益生菌和其特异性益生元的组合产品。国内的乳品公司研发了在酸奶中添加乳双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌等益生菌和低聚果糖为主的益生元，尚缺少益生菌与其特异益生元的组合产品。
双歧杆菌是目前使用最多的益生菌种类之一，属于严格厌氧的革兰氏阳性菌，是人和动物肠道菌群的重要组分，已经被广泛应用于食品、饲料以及医药方面。目前，尚没有以双歧杆菌及其特异性益生元形成协同型合生制剂的报道。
发明内容
为了解决现有技术中存在的技术问题，本发明提供了一种复合益生菌与特异性益生元的组合，尤其是双歧杆菌与甘露寡糖组合的合生制剂，同时发挥益生元和益生菌的健康效用，调节机体免疫能力。
第一方面，本发明提供一种合生元组合物，所述合生元组合物包括益生菌和益生元，所述益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)，所述益生元为甘露寡糖(MOS)；
所述双歧杆菌包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)；青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)；两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)；短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)；婴儿双歧杆菌(Bifidobacterium infantis)；长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)。
所述甘露寡糖包括甘露低聚糖、半乳甘露寡糖、葡甘露寡糖、半乳葡甘露寡糖。
本发明人发现，将益生元甘露寡糖、益生菌双歧杆菌作为合生元组成，对于提高胃肠道免疫能力具有协同作用；甘露寡糖可以作为双歧杆菌的特异性益生元，能增强胃肠道免疫功能，改善免疫抑制的作用。
甘露寡糖作为一种重要的功能性肠道寡糖，在体内的肠道菌群结构测定及体外的菌株发酵实验中表现出促进益生菌双歧杆菌的增殖活性，在提高机体免疫活性、改善肠道菌群结构、降低脂质物质吸收等多方面具有益生活性。
在一些实施方案中，所述合生元组合物中，双歧杆菌和甘露寡糖的重量比为1.0×106～1.0×1014CFU:0.01～2g。
在一些实施方案中，所述合生元组合物中，双歧杆菌的有效活菌数可以为1.0×106CFU、1.0×107CFU、1.0×108CFU、1.0×109CFU、1.0×1010CFU、1.0×1011CFU、1.0×1012CFU、1.0×1013CFU或1.0×1014CFU；甘露寡糖的质量可以为0.01g、0.05g、0.10g、0.20g、0.30g、0.40g、0.50g、0.60g、0.70g、0.80g、0.90g、1.0g、1.2g、1.5g、1.8g或2.0g。
在一些实施方案中，所述益生菌由包括如下重量份的组分制成：有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的动物双歧杆菌22～25份，例如22份、23份、24份或25份；有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的青春双歧杆菌12～15份，例如12份、13份、14份或15份；有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的两歧双歧杆菌17～20份，例如17份、18份、19份或20份；有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的短双歧杆菌6～7份，例如6份或7份；有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的婴儿双歧杆菌8～10份，例如8份、9份或10份；有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的长双歧杆菌12～15份，例如12份、13份、14份或15份。
在一些实施方案中，所述益生元中，甘露低聚糖、半乳甘露寡糖、葡甘露寡糖、半乳葡甘露寡糖的重量比为6～7:1～1.5:2～2.5:1～1.5，例如，6:1:2:1或7:1.5:2.5:1.5。
第二方面，本发明提供所述合生元组合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：
S1：双歧杆菌在MRS培养基中培养；
S2：取步骤S1得到的经培养的双歧杆菌，离心取菌泥，然后溶于无菌生理盐水中，得到菌泥溶液；
S3：取甘露寡糖用双蒸水溶解形成甘露寡糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的甘露寡糖溶液混合，搅拌均匀，即得到所述的合生元组合物。
在一些实施方案中，步骤S1中，所述培养的时间为20～28h，优选地，培养时间为24h。
在一些实施方案中，步骤S1中，所述培养的温度为35～39℃，优选地，培养温度为37℃。
第三方面，本发明提供一种合生制剂，所述合生制剂包括所述合生元组合物。
在一些实施方案中，所述合生元组合物加入药学上可接受的辅料，制成药物，例如制成散剂、粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂或冻干剂形式的合生制剂。
在一些实施方案中，所述合生元组合物加入食品上可接受的辅料，制成食品，例如制成固体饮料、液体饮料或半固体饮料形式的合生制剂。
在一些实施方案中，每克所述合生制剂中的总有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU，优选为1.0×108～1.0×1012CFU；例如，可以为1.0×106CFU、1.0×107CFU、1.0×108CFU、1.0×109CFU、1.0×1010CFU、1.0×1011CFU、1.0×1012CFU、1.0×1013CFU或1.0×1014CFU。
第四方面，本发明提供所述合生元组合物或所述合生制剂在制备用于增强免疫功能的药物、营养补充剂、功能食品和/或保健食品中的应用。
在一些实施方案中，所述增强免疫功能包括增强胃肠道免疫功能和对免疫抑制的调节作用。
在一些实施方案中，动物或人体所用的合生元组合物或合生制剂中双歧杆菌的总有效活菌数为1×106～1×1014CFU/kg，例如可以为1.0×106CFU/kg、1.0×107CFU/kg、1.0×108CFU/kg、1.0×109CFU/kg、1.0×1010CFU/kg、1.0×1011CFU/kg、1.0×1012CFU/kg、1.0×1013CFU/kg或1.0×1014CFU/kg。
本发明人在研究益生菌与益生元时，惊讶地发现，当将益生菌双歧杆菌和益生元甘露寡糖二者组合使用后，甘露寡糖可以作为双歧杆菌的特异性益生元，对于免疫抑制的小鼠具有免疫调节作用，具有明显的协同增效作用。本发明的合生元组合物的有益效果主要表现在以下方面：
(1)本发明的合生元组合物包括益生菌(双歧杆菌)和益生元(甘露寡糖)，本发明人经过对其发酵过程的研究发现，甘露寡糖作为益生元能够有效促进双歧杆菌的生长和发酵，增加组合中益生菌的数量。
(2)通过对发酵过程中所产生短链脂肪酸(SCFAs)的测定，结果表明，本发明中所述双歧杆菌菌株以甘露寡糖为底物发酵时，能够产生以乙酸和丙酸为主的短链脂肪酸。短链脂肪酸在结肠内不仅能为肠粘膜细胞提供能量，促进细胞的代谢、生长，还可以降低结肠内环境pH值，减少有害菌的生长，防止肠道功能紊乱；此外，乙酸盐对结肠炎症也具有良好的治疗效果。
(3)发酵过程中产生大量乳酸，乳酸的未解离形式作为革兰氏阴性菌外细胞膜的渗透剂，进入后在细菌细胞质内解离通过降低细胞内的pH水平、以细胞质内有机酸和其他抗菌化合物的电离形式积累发挥杀死细菌的作用。肠道中益生菌产生的有机酸使得肠道环境不利于病原菌的积累，达到抵御致病菌侵入和/或保护肠道屏障完整性。此外，双歧杆菌可以通过清除病原体和调节肠道上皮细胞的免疫反应来恢复宿主健康。
(4)双歧杆菌与甘露寡糖联合使用能够有效提高小鼠免疫能力，本发明从吞噬细胞的吞噬指数评价机体的非特异性免疫功能，结果显示甘露寡糖联合双歧杆菌可显著提高免疫抑制小鼠的吞噬指数，且作用效果明显高于单独使用甘露寡糖、单独使用双歧杆菌组以及低聚果糖联合双歧杆菌组，甘露寡糖联合双歧杆菌可提高免疫抑制小鼠巨噬细胞的吞噬能力，从而增强机体的非特异性免疫功能。
(5)本发明研究结果发现联合用药组作用效果明显高于甘露寡糖单独用药组，且小鼠血清IL-2、IL-4、IFN-γ、TNF-α含量较环磷酰胺免疫抑制组小鼠明显升高，表明甘露寡糖联合双歧杆菌作用可促进免疫细胞的增殖及分化，调节Th1/Th2细胞因子的释放从而增强免疫功能。
综上，以双歧杆菌和甘露寡糖作为益生菌和益生元的组合能够发挥协同作用，既可发挥益生菌的生理活性，配合益生元又可选择性地快速增加益生菌的数量，且发酵产物短链脂肪酸(乙酸、乳酸)和甘露糖也具有改善免疫功能的功效。动物实验表明甘露寡糖联合双歧杆菌可通过增强免疫抑制小鼠的免疫器官指数、巨噬细胞的吞噬指数、改善免疫抑制小鼠血清免疫指标至少三方面起到免疫调节的功能。此外，甘露寡糖联合双歧杆菌的免疫增强效果明显高于甘露寡糖单独给药组以及低聚果糖联合双歧杆菌给药组，证明双歧杆菌与甘露寡糖之间存在叠加或者协同的免疫效果。
附图说明
图1示出不同碳源培养基培养双歧杆菌的生长曲线，其中(A)青春双歧杆菌，(B)婴儿双歧杆菌，(C)乳双歧杆菌，(D)两歧双歧杆菌，(E)短双歧杆菌，(F)长双歧杆菌。
图2示出本发明实施例双歧杆菌酵解MOS上清中酸性物质的含量。
图3示出本发明实施例MOS联合双歧杆菌对免疫抑制小鼠吞噬细胞吞噬指数的影响。
图4示出本发明实施例双歧杆菌酵解MOS的体外历程，其中泳道1：mMRS培养基；泳道2：半乳糖；泳道3：甘露一至五糖混合标，由上至下依次为甘露一糖、甘露二糖、甘露三糖、甘露四糖、甘露五糖；泳道4-13：分别为发酵至0h、3h、6h、9h、12h、24h、27h、30h、36h、48h的发酵液上清。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于构成对本发明的任何限制。此外，在以下说明中，省略了对公知结构和技术的描述，以避免不必要地混淆本公开的概念。这样的结构和技术在许多出版物中也进行了描述。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.本发明的合生元组合物1
本实施例提供一种合生元组合物，所述合生元组合物包括：
双歧杆菌：动物双歧杆菌25份、青春双歧杆菌15份、两歧双歧杆菌20份、短双歧杆菌7份、婴儿双歧杆菌10份、长双歧杆菌15份；
甘露寡糖：甘露低聚糖7份、半乳甘露寡糖1.5份、葡甘露寡糖2.5份、半乳葡甘露寡糖1.5份。
双歧杆菌和甘露寡糖的重量比为1.0×1012CFU/kg:1g/kg。
实施例2.本发明的合生元组合物2
本实施例提供一种合生元组合物，所述合生元组合物包括：
双歧杆菌：动物双歧杆菌22份、青春双歧杆菌12份、两歧双歧杆菌17份、短双歧杆菌6份、婴儿双歧杆菌8份、长双歧杆菌12份；
甘露寡糖：甘露低聚糖6份、半乳甘露寡糖1份、葡甘露寡糖2份、半乳葡甘露寡糖1份。
双歧杆菌和甘露寡糖的重量比为1.0×1012CFU/kg:1g/kg。
实施例3.本发明的合生元组合物3
本实施例提供一种合生元组合物，所述合生元组合物包括：
双歧杆菌：动物双歧杆菌24份、青春双歧杆菌13份、两歧双歧杆菌18份、短双歧杆菌6份、婴儿双歧杆菌9份、长双歧杆菌13份；
甘露寡糖：甘露低聚糖7份、半乳甘露寡糖1份、葡甘露寡糖2份、半乳葡甘露寡糖1.5份。
双歧杆菌和甘露寡糖的重量比为1.0×1012CFU/kg:1g/kg。
实施例4.本发明的合生元组合物的各种形式制剂
1.合生元组合物作为功能性添加物生产功能性酸奶：
将双歧杆菌联合甘露寡糖制成合生元组合物，用于功能性酸奶的生产。
生牛乳80％、白砂糖9％、乳清蛋白1％、复合稳定剂0.15％、稀奶油2％，加水搅拌充分溶解后，静止水合30分钟，定容至1L，60℃均质，95±1℃杀菌5min，冷却后接种发酵剂(接种量200U/t)，厌氧发酵(时间5～7h)至发酵终点。破乳冷却，添加本发明益生元，无菌灌装后冷藏保存，即为功能型酸奶。
其中，发酵剂采用实施例1的双歧杆菌，益生元采用实施例1的甘露寡糖。
2.合生元组合物作为益生菌添加物生产非乳饮料：
浓缩果汁5％、白砂糖10％、柠檬酸0.3％、柠檬酸钠0.1％、羧甲基纤维素钠0.1％、食用香精，加水至1L，搅拌充分溶解后，60℃均质(均质压力4/16MPa)，95±1℃杀菌20分钟，热灌装，倒瓶杀菌5min，水浴冷却后加入所述合生元组合物(添加量20g/t)，常温存储，即为功能型非乳饮料。3.将合生元组合物制备成散剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成散剂。
4.将合生元组合物制备成粉剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成粉剂。
5.将合生元组合物制备成片剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成片剂。
6.将合生元组合物制备成颗粒剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成颗粒剂。
7.将合生元组合物制备成胶囊剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成胶囊剂。
8.将合生元组合物制备成半固体制剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成半固体制剂。
9.将合生元组合物制备成液体制剂：
取本发明的合生元组合物，加入药学上可以接受的辅料，制成液体制剂。
实验例1.具有免疫调节功能的合生元组合物的制备
将冻存于-80℃条件下的双歧杆菌以2％的接种量接种在MRS培养基中，37℃培养24h，连续培养两代，37℃培养12～16h备用，进行梯度平板计数，取浓度为1×109CFU/mL的菌液，离心取菌泥，然后重置于灭菌厌氧PBS中，备用。
MRS培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏8g/L，酵母浸粉5g/L，葡萄糖20g/L，无水乙酸钠5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁0.58g/L，四水硫酸锰0.19g/L，吐温-80 1mL/L，L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L；灭菌前pH调节为6.5，0.1MPa，121℃灭菌20min。
取制备好的活菌数为1×109CFU/mL的双歧杆菌菌泥0.2mL，加入甘露寡糖冻干粉，得到双歧杆菌活菌数为2×108CFU、甘露寡糖含量为4.6mg的合生元组合物。
其中，所述双歧杆菌的组成与甘露寡糖的组成同实施例1。
实验例2.将甘露寡糖作为培养基唯一碳源对于双歧杆菌增殖的影响
益生菌培养：参照实验例1的方法，将于-80℃冻存的上述6种双歧杆菌分别接入MRS培养基中进行活化培养与传代，后转接至相同的液体培养基，重复三次，获取种子液。
益生菌发酵：将活化后的双歧杆菌种子液离心后弃去上清，用相同体积的无菌生理盐水重悬菌体。将在生理盐水中重悬的菌液以5％的接种量分别接种至无菌的MRS、mMRS(modified MRS，无糖MRS培养基)，MOS-mMRS(添加MOS的无糖MRS培养基)、FOS-mMRS(添加FOS的无糖MRS培养基)培养基中。
MOS-mMRS：将MRS培养基中20g/L的葡萄糖替换成浓度为10g/L的MOS，即配制成为MOS为唯一碳源的发酵培养基。
FOS-mMRS：将MRS培养基中20g/L的葡萄糖替换成浓度为10g/L的FOS(低聚果糖)，即配制成为FOS为唯一碳源的发酵培养基。
CK(mMRS)：除去MRS培养基中20g/L的葡萄糖，即作为空白对照。
发酵过程监测：从益生菌发酵开始每隔3h对发酵液样品进行益生元对双歧杆菌的增殖及代谢的监测，以菌液OD595nm、发酵液pH值、短链脂肪酸产生的变化确定益生菌与优势益生元的组合。
不同碳源培养基培养双歧杆菌的生长曲线结果如图1所示。由图1所示的FOS-mMRS和MOS-mMRS生长曲线图可知，与已经大规模商品化的益生元低聚果糖相比，本申请的双歧杆菌在以甘露寡糖为唯一碳源的培养基MOS-mMRS中具有更好的增殖效果。
实验例3.合生元组合物在发酵产生短链脂肪酸方面的应用
短链脂肪酸含量的测定：
(1)短链脂肪酸的提取：利用短链脂肪酸等在强酸中的电离度降低，并辅以乙醚萃取的方式提取发酵液中的短链脂肪酸。检测并分析发酵过程中短链脂肪酸种类和含量的变化情况，使用乙醚萃取后的短链脂肪酸使用滤膜过滤至色谱瓶中备用。
(2)高效液相色谱法检SCFAs含量：经过萃取处理后的发酵液于色谱瓶中4℃保存备用，混合酸的上样标为：乳酸、乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸的混合物。HPLC的检测条件：色谱柱为Hi-Plex H(4.6×250mm，Agilent)，流动相为5mmol/L H2SO4与超纯水1:1(流动相配制完成后，均采用尼龙膜进行抽滤)，流动相流速为0.3mL/min，进样量为10μL。
根据实验例2的发酵过程检测结果，双歧杆菌酵解MOS上清中酸性物质的含量如图2所示。双歧杆菌在酵解甘露寡糖时能够产生以乙酸、丙酸、丁酸、乳酸等为主的酸性代谢副产物，降低培养基pH，短链脂肪酸及乳酸的产生是益生菌与益生元在肠道内发挥免疫功能的重要物质，对于改善和提高免疫功能具有积极影响。
通过不同种类益生元与双歧杆菌发酵结果的比较，本发明的双歧杆菌与甘露寡糖的合生元组合物能够合理发挥益生菌与益生元的协同增效作用，与低聚果糖相比甘露寡糖能够有效促进双歧杆菌的增殖，具有较好的推广价值。
实验例4.双歧杆菌酵解MOS的体外历程
配制10mg/mL甘露寡糖混合标、半乳糖的标准品，制成终浓度为1％的标准品待用。取0h、3h、6h、9h、12h、24h、27h、30h、36h、48h共计10个时间点冻存的菌液，于室温下融化，12000rpm离心10min，将上清分别转移至新的离心管中，以上清液作为上样液。以甘露寡糖混合标、半乳糖、mMRS培养基和发酵液上清共计13个样品为点样液，上样量3μL。点样完成的薄层板于展开剂中展开两次，完全晾干后在显色剂中浸润并吹干，于预热的115℃烤箱中加热5min显色，即可看到糖组分的变化情况，拍照记录并保存实验结果。如图4所示，可以清晰地看出双歧杆菌酵解MOS的体外历程。
实验例5.MOS联合双歧杆菌对小鼠免疫调节的效果评价
无特定病原体级雄性ICR小鼠(18～22g)，实验室条件下，20℃，12h昼/夜循环，自由进食进水，适应性喂养一周。小鼠随机分为6组。每组15只，分别为对照组、模型组、甘露寡糖组MOS 100mg/(kg·d)、双歧杆菌组109CFU/mL、甘露寡糖双歧杆菌联用组MOS+109CFU/mL、低聚果糖双歧杆菌联用组FOS+109CFU/mL。除对照组外，其余各组实验动物于实验1～3d腹腔注射环磷酰胺80mg/(kg·d)，建立免疫抑制模型。于实验4～21d分别灌胃给予不同组别的各样品。末次给药24h后称质量，摘取眼球取血并制备血清。取血后解剖分离胸腺、脾脏、肝脏、肾脏及心脏后并称取质量，计算脏器指数。
实验结论：
(1)合生元对免疫抑制小鼠脏器指数的影响
表1甘露寡糖联合双歧杆菌对免疫抑制小鼠脏器指数的影响
注：*与模型组相比，差异显著(P＜0.05)；**与模型组相比，差异极显著(P<0.01)。下同。
胸腺及脾脏属于重要的免疫器官，胸腺及脾脏指数可以指明机体的免疫功能及预后情况。由表1可知，甘露寡糖MOS联合双歧杆菌组的小鼠胸腺指数明显增加，且差异显著，单独使用甘露寡糖MOS组和单独使用双歧杆菌组胸腺指数增加不明显，此外FOS联用双歧杆菌组胸腺指数也有显著增加。甘露寡糖联合双歧杆菌组小鼠胸腺、脾脏、心脏，肝脏指数均高于寡糖单独给药组。表明甘露寡糖联合益生菌双歧杆菌可明显改善环磷酰胺诱导的免疫抑制小鼠的免疫器官指数。
(2)合生元对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬指数的影响
利用碳清除实验检测不用样品对免疫抑制小鼠巨噬细胞吞噬活性的影响，结果如图3所示，模型组小鼠吞噬指数与对照组相比均明显下降，且差异显著，表明免疫抑制小鼠造模成功，同时由结果可知，MOS联合益生菌可增强免疫抑制小鼠的吞噬细胞的吞噬能力，达到增强免疫的效果。
(3)合生元对免疫抑制小鼠血清免疫指标的影响
获取血液样本制备血清后，利用ELISA针对性检测试剂盒，测定血清中IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ、TNF-α、IgG的活性。
表2.MOS联合双歧杆菌对免疫抑制小鼠血清IL-2、IL-4、IL-10的影响
模型组小鼠血清IL-2和IL-4与对照组相比含量明显下降，IL-10含量明显增加，表明环磷酰胺诱导的免疫抑制模型造模成功。结果如表2所示，MOS联合双歧杆菌组中，免疫抑制小鼠血清IL-2含量与模型组相比明显增加，差异极显著。与模型组相比，MOS联合双歧杆菌组免疫抑制小鼠血清IL-4含量显著增加(P＜0.01)，与对照组相当，达到47.15pg/mL。MOS组及MOS联合双歧杆菌组免疫抑制小鼠血清IL-10含量与模型组小鼠相比含量明显降低，且差异极显著(P＜0.01)，小鼠血清中IL-10质量浓度可恢复至正常小鼠水平为56.98pg/mL。
表3.MOS联合双歧杆菌对免疫抑制小鼠血清IFN-γ、TNF-α、Ig G质量浓度的影响
MOS联合双歧杆菌对免疫抑制小鼠血清IFN-γ、TNF-α及IgG质量浓度的影响如表3所示。由结果可知，模型组小鼠血清IFN-γ、TNF-α及Ig G质量浓度与对照组相比均明显下降。各用药组免疫抑制小鼠血清IFN-γ质量浓度与模型组相比含量明显增加，MOS联合双歧杆菌使用组IFN-γ质量浓度高于正常组小鼠，为266.72pg/mL，与模型组小鼠相比，MOS组免疫抑制小鼠血清TNF-α质量浓度明显上升，且差异显著(P＜0.05)，MOS联合双歧杆菌使用组小鼠血清TNF-α质量浓度与模型组相比差异极显著(P＜0.01)，且含量恢复至与对照组大致相当，质量浓度可达268.65pg/mL，对于环磷酰胺诱导的小鼠血清IgG含量的降低，MOS组及双歧杆菌组可使IgG的含量有不同程度的恢复，差异显著或极显著。表明甘露寡糖联合双歧杆菌对于环磷酰胺所致免疫功能的抑制作用有一定的改善作用，且作用活性强于MOS单独用药组。
实验例6.益生菌益生元组合发酵对比例
使用了15种益生菌测试甘露寡糖的体外益生活性，包括6种双歧杆菌菌株：动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、青春双歧杆菌(B.adolescentis)、两歧双歧杆菌(B.bifidum)；短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双歧杆菌(B.infantis)、长双歧杆菌(B.longum)和九种乳杆菌菌株：鼠李糖乳杆菌AS1.2466(Lactobaillus rhamnosus AS 1.2466)、罗伊氏乳杆菌ATCC23272(L.reuteri ATCC 23272)、乳酸乳杆菌AS1.2132(L.delbrueckiisubsp.lactis AS 1.2132)、保加利亚乳杆菌NRRL B-548(L.delbrueckiisubsp.bulgaricus NRRL B-548)、棒状乳杆菌亚种NRRL B-4391(L.coryniformissubsp.coryniformis NRRL B-4391)、干酪乳杆菌干酪亚种NRRLB-1922(L.caseisubsp.casei NRRL B-1922)、干酪乳杆菌AS 1.62(L.casei AS 1.62)、嗜酸乳杆菌NRRL B-4495(L.acidophilus NRRL B-4495)和短乳杆菌NRRLB-4527(L.brevis NRRL B-4527)，益生菌在MRS(de Man，Rogosa和Sharp)中进行发酵和培养。为对不同种益生元促进益生菌的增殖效果进行评价，分别将甘露寡糖、菊粉作为唯一碳源替换培养基中的葡萄糖，终浓度为1.0％(w/v)，将各个活化培养24h的菌种接种至上述培养基中，将初始吸光值OD600调整至0.1，于37℃下静置培养48h，以菊粉/葡萄糖培养基作为阳性对照，不加糖的MRS培养基(CK)作为阴性对照。结果见表4。
表4.益生菌在不同碳源的MRS培养基中的生长特征(OD595)
注：a-d表示Tukey的HSD测试有显著性差异(p＜0.05)。
由表4的结果可知，与菊粉相比，甘露寡糖能够有效促进双歧杆菌的增殖；与乳酸菌相比，双歧杆菌在甘露寡糖中具有更好的增殖效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本领域的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的仅为本发明的优选例，并不用来限制本发明，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.一种合生元组合物，其特征在于，所述合生元组合物包括益生菌和益生元，所述益生菌为双歧杆菌(Bifidobacterium)，所述益生元为甘露寡糖；
所述双歧杆菌包括动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)；
所述甘露寡糖包括甘露低聚糖、半乳甘露寡糖、葡甘露寡糖、半乳葡甘露寡糖。
2.根据权利要求1所述的合生元组合物，其特征在于，所述合生元组合物中，双歧杆菌和甘露寡糖的重量比为1.0×106～1.0×1014CFU:0.01～2g。
3.根据权利要求1或2所述的合生元组合物，其特征在于，所述益生菌由包括如下重量份的组分制成：有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的动物双歧杆菌22～25份、有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的青春双歧杆菌12～15份、有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的两歧双歧杆菌17～20份、有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的短双歧杆菌6～7份、有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的婴儿双歧杆菌8～10份、有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU的长双歧杆菌12～15份。
4.根据权利要求1或2所述的合生元组合物，其特征在于，所述益生元中，甘露低聚糖、半乳甘露寡糖、葡甘露寡糖、半乳葡甘露寡糖的重量比为6～7:1～1.5:2～2.5:1～1.5。
5.权利要求1～4任一项所述合生元组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1：双歧杆菌在MRS培养基中培养；
S2：取步骤S1得到的经培养的双歧杆菌，离心取菌泥，然后溶于无菌生理盐水中，得到菌泥溶液；
S3：取甘露寡糖用双蒸水溶解形成甘露寡糖溶液；
S4：将步骤S2得到的菌泥溶液与S3得到的甘露寡糖溶液混合，搅拌均匀，即得到所述的合生元组合物。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述培养的时间为20～28h；和/或，所述培养的温度为35～39℃。
7.一种合生制剂，其特征在于，所述合生制剂包括权利要求1～4任一项的合生元组合物或权利要求5～6任一项的方法制备的合生元组合物；
优选地，所述合生元组合物加入药学上可接受的辅料，制成散剂、粉剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、悬浮剂、乳剂或冻干剂形式的合生制剂；
优选地，所述合生元组合物加入食品上可接受的辅料，制成固体饮料、液体饮料或半固体饮料形式的合生制剂。
8.根据权利要求7所述的合生制剂，其特征在于，每克所述合生制剂中的总有效活菌数为1.0×106～1.0×1014CFU，优选为1.0×108～1.0×1012CFU。
9.权利要求1～4任意一项所述合生元组合物或者权利要求5或6的方法制备的合生元组合物或者权利要求7或8的合生制剂在制备用于增强免疫功能的药物、营养补充剂、功能食品和/或保健食品中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述增强免疫功能包括增强胃肠道免疫功能和对免疫抑制的调节作用。
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