CN112998276A - 一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，所述合生元复方制剂包括益生菌与益生元，所述益生菌为以益生元为唯一碳源培养基能够优势生长的益生菌菌株，且该菌株对病原微生物具有抑制作用。本发明合生元复方制剂为益生菌和益生元联合使用，协同增效，与益生元搭配使用可以更好地实现其有益效果，益生菌和益生元的合理组合可以使合生元的有益效果最大化，可以有效地治疗西方式高脂饮食导致的肝脂肪积累并抑制过量低聚果糖摄入引起的肠漏和脓毒症，可以有效地避免因益生元过量摄入导致的不利影响并保留其功能特性，效果显著、安全性高、无毒副作用的优点。
Description
技术领域
本发明属于合生元复方制剂制备技术领域，尤其是一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用。
背景技术
随着社会的发展，人类生活质量和饮食结构发生了巨大的改变。高能量物质(糖类、脂肪等)摄入增加和纤维素摄入减少造成的肠道和肝脏疾病是困扰人类健康的又一大因素。针对膳食纤维的缺失，可溶性纤维被开发用于食品、保健领域。益生元(Prebiotics)是这样一种物质：它是一种膳食补充剂，通过选择性地刺激一种或少数几种菌落中的细菌的生长与活性而对寄主产生有益的影响从而改善寄主健康的不可被消化的食品成分，其中多为可溶性纤维素。
可溶性纤维素因其具有吸水效应，过量的摄入会导致腹痛、腹胀、腹泻的现象，长期过量摄入会导致黏膜损伤进而表现为肠漏的出现，持续的肠漏会导致细菌及其有毒代谢产物(如脂多糖、鞭毛蛋白、磷壁酸等)进入宿主血液引发脓毒症并伴随宿主休克死亡。有研究表明长期大量可溶性纤维素摄入会导致肠道菌群失调进而发生肝癌，在动物研究中也表明低聚糖过量食用会导致肠道炎症。针对这种存在剂量依赖性的可溶性膳食纤维，将其与益生菌搭配形成合生元复方制剂来规划肠道菌群、避免一些肠道致病菌增殖发酵导致的肠-肝病是非常有必要的。
目前，市售的合生元多为将益生菌和益生元简单、随机复合使用，益生菌对益生元的不可利用或利用率较低，大量摄入依然会造成有害菌大量增殖及入血的风险。因此，可高效利用益生元减少腹泻出现并抑制肠道有害菌的益生菌筛选是合生元制备的前提。利用该方式组合的合生元可实现益生菌和益生元的有效作用最大化。
通过检索，尚未发现与本发明专利申请相关的专利公开文献。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用，所述合生元复方制剂包括益生菌与益生元，所述益生菌为以益生元为唯一碳源培养基能够优势生长的益生菌菌株，且该菌株对病原微生物具有抑制作用。
而且，所述益生菌和益生元是符合国家卫生部相关规定的可用于食品、保健、医药的部分；
或者，所述益生菌包括从粪便、环境中筛选出的或已筛选出的可用于食品、保健、医药领域的菌株；
或者，所述病原微生物为肠道致病菌。
而且，所述肠道致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肺炎克雷伯氏菌。
而且，所述益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌。
而且，所述益生元包括菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖。
而且，所述总益生菌与益生元的剂量比例为106-1011CFU/kg：0.04-0.48g/kg。
而且，所述益生菌与益生元的剂量比例为107-1010CFU/kg：0.12-0.24g/kg。
而且，所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为：青春双歧杆菌≥1％、动物双歧杆菌≥1％、两歧双歧杆菌≥1％、长双歧杆菌≥5％、嗜酸乳杆菌≥1％、干酪乳杆菌≥5％、保加利亚乳杆菌≥5％、德氏乳杆菌乳亚种≥1％、发酵乳杆菌≥1％、格氏乳杆菌≥1％、瑞士乳杆菌≥1％、副干酪乳杆菌≥5％、植物乳杆菌≥5％、罗伊氏乳杆菌≥5％、鼠李糖乳杆菌≥1％、嗜热链球菌≥1％、乳酸片球菌≥5％、戊糖片球菌≥5％、乳酸乳球菌≥1％；
益生元组合为：菊粉≥10％、低聚果糖≥5％、异麦芽低聚糖≥5％、低聚半乳糖≥5％、低聚木糖≥5％、大豆低聚糖≥5％、人乳寡糖≥5％；
或者，所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为青春双歧杆菌4份、动物双歧杆菌4份、两歧双歧杆菌4份、长双歧杆菌7份、嗜酸乳杆菌4份、干酪乳杆菌7份、保加利亚乳杆菌7份、德氏乳杆菌乳亚种4份、发酵乳杆菌4份、格氏乳杆菌4份、瑞士乳杆菌4份、副干酪乳杆菌7份、植物乳杆菌7份、罗伊氏乳杆菌7份、鼠李糖乳杆菌4份、嗜热链球菌4份、乳酸片球菌7份、戊糖片球菌7份、乳酸乳球菌4份；
益生元组合为菊粉25份、低聚果糖12.5份、异麦芽低聚糖12.5份、低聚半乳糖12.5份、低聚木糖12.5份、大豆低聚糖12.5份、人乳寡糖12.5份。
如上所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用的制备方法，步骤如下：
(1)定量称取：称取益生菌与益生元；
(2)益生菌培养：将益生菌接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
(3)益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
(4)菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
(5)合生元复合制剂的制备：调整菌体密度、益生元含量，将二者进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
如上所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用在功能性饮料和/或食品生产方面中的应用。
本发明的优点和积极效果如下：
1、本发明合生元复方制剂为益生菌和益生元联合使用，不影响益生元的减肥效益，与益生元搭配使用可以更好地实现其有益效果，益生菌和益生元的合理组合可以保留其有益结果并降低其不良现象的出现，可以有效地治疗西方式高脂饮食导致的肝脂肪积累并抑制过量低聚果糖摄入引起的肠漏和脓毒症，可以有效地避免因益生元过量摄入导致的不利影响并保留其功能特性，效果显著、安全性高、无毒副作用的优点。
2、本发明利用部分益生菌可利用益生元的特性筛选出可发酵益生元的益生菌，体外验证益生菌对益生元的利用率和抑制肠道致病菌增长能力。筛选出的益生菌可高效利用益生元并抑制有害菌，可以作为优异的合生元选择菌株。
3、本发明选用的可高效利用益生元的益生菌(青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌)与益生元(菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖)进行组合，可有效预防因低聚果糖过量摄入导致的肠道菌群紊乱引起的肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，并保留其抗炎、降脂的特性。
4、本发明旨在针对因肠道菌群紊乱引起的肠道疾病与益生元不合理使用导致的肝病问题而设计生产的复合功能性饮料和食品，并为相关产品的生产提供研究思路。
附图说明
图1为本发明中确认可高效利用低聚果糖并抑制病原菌的益生菌筛选图；其中，A为益生菌筛选示意图，B为副干酪乳杆菌和戊糖片球菌对低聚果糖的降解曲线，C为副干酪乳杆菌对大肠杆菌的抑菌圈；
图2为本发明中高剂量低聚果糖改善肥胖但造成腹泻和小鼠死亡图；其中，A为小鼠体重变化图，B为小鼠食物摄入量，C为生理盐水或高剂量低聚果糖灌胃4h后小鼠腹泻情况，D为小鼠生存率，E为高剂量低聚果糖死亡小鼠伴随的结直肠出血图；
图3为本发明中益生菌减少腹泻和结直肠负载时间并减少上皮细胞脱落图；其中，A为益生菌降低小鼠腹泻持续时间，B为益生菌改善高剂量低聚果糖导致的盲肠和结直肠充盈，C为结直肠组织H&E染色，D为益生菌避免高剂量低聚果糖摄入导致的小鼠死亡；
图4为本发明中益生菌抑制高剂量低聚果糖导致的肠道菌群紊乱图；其中，A为益生菌摄入抑制高剂量低聚果糖导致的粪便细菌负载升高，B为益生菌改变肠道菌群的主成分分析图(PCA)，C为益生菌改善了高剂量低聚果糖摄入导致的菌群α多样性降低，D为益生菌改善高剂量低聚果糖摄入导致的β-变形杆菌(冈)增殖，E为益生菌改善高剂量低聚果糖摄入导致的嗜黏蛋白阿克曼氏菌(种)过度增殖，F为益生菌改善高剂量低聚果糖摄入导致的艰难梭菌(种)增殖，G为益生菌摄入对肠道乳酸菌(目)丰度的影响，H为益生菌摄入对肠道双歧杆菌(目)丰度的影响；
图5为本发明中益生菌降低肠道代谢产物入血和提高免疫球蛋白图；其中，A为益生菌摄入降低血清中脂多糖、鞭毛蛋白、磷壁酸含量，B为益生菌摄入对血清IgA、IgG的影响。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。
一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用，所述合生元复方制剂包括益生菌与益生元，所述益生菌为以益生元为唯一碳源培养基能够优势生长的益生菌菌株，且该菌株对病原微生物具有抑制作用。
较优地，所述益生菌和益生元是符合国家卫生部相关规定的可用于食品、保健、医药的部分；
或者，所述益生菌包括从粪便、环境中筛选出的或已筛选出的可用于食品、保健、医药领域的菌株；
或者，所述病原微生物为肠道致病菌。
较优地，所述肠道致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肺炎克雷伯氏菌。
较优地，所述益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌。
较优地，所述益生元包括菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖。
较优地，所述总益生菌与益生元的剂量比例为106-1011CFU/kg：0.04-0.48g/kg。
较优地，所述益生菌与益生元的剂量比例为107-1010CFU/kg：0.12-0.24g/kg。
较优地，所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为：青春双歧杆菌≥1％、动物双歧杆菌≥1％、两歧双歧杆菌≥1％、长双歧杆菌≥5％、嗜酸乳杆菌≥1％、干酪乳杆菌≥5％、保加利亚乳杆菌≥5％、德氏乳杆菌乳亚种≥1％、发酵乳杆菌≥1％、格氏乳杆菌≥1％、瑞士乳杆菌≥1％、副干酪乳杆菌≥5％、植物乳杆菌≥5％、罗伊氏乳杆菌≥5％、鼠李糖乳杆菌≥1％、嗜热链球菌≥1％、乳酸片球菌≥5％、戊糖片球菌≥5％、乳酸乳球菌≥1％；
益生元组合为：菊粉≥10％、低聚果糖≥5％、异麦芽低聚糖≥5％、低聚半乳糖≥5％、低聚木糖≥5％、大豆低聚糖≥5％、人乳寡糖≥5％；
或者，所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为青春双歧杆菌4份、动物双歧杆菌4份、两歧双歧杆菌4份、长双歧杆菌7份、嗜酸乳杆菌4份、干酪乳杆菌7份、保加利亚乳杆菌7份、德氏乳杆菌乳亚种4份、发酵乳杆菌4份、格氏乳杆菌4份、瑞士乳杆菌4份、副干酪乳杆菌7份、植物乳杆菌7份、罗伊氏乳杆菌7份、鼠李糖乳杆菌4份、嗜热链球菌4份、乳酸片球菌7份、戊糖片球菌7份、乳酸乳球菌4份；
益生元组合为菊粉25份、低聚果糖12.5份、异麦芽低聚糖12.5份、低聚半乳糖12.5份、低聚木糖12.5份、大豆低聚糖12.5份、人乳寡糖12.5份。
如上所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用的制备方法，步骤如下：
(1)定量称取：称取益生菌与益生元；
(2)益生菌培养：将益生菌接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
(3)益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
(4)菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
(5)合生元复合制剂的制备：调整菌体密度、益生元含量，将二者进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
如上所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用在功能性饮料和/或食品生产方面中的应用。
具体地，相关制备及检测实施例如下：
实施例1高效利用低聚果糖的益生菌的筛选
一种可高效利用益生元的益生菌筛选方案(以下以低聚果糖为例)，在益生元存在条件下可显著抑制肠道有害微生物的增殖。
具体实验如下：
(一)材料与试剂
1、培养基：MRS培养基(蛋白胨5.0g，胰蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，酵母提取物5.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0g，硫酸锰0.25g，柠檬酸氢二铵2.0g，硫酸镁0.58g，磷酸氢二钾2.0g，牛肉膏5.0g，用蒸馏水定容至1L，调节pH至5.8，115℃条件下灭菌20min)；益生元为唯一碳源MRS培养基(菊粉-MRS、低聚果糖-MRS、低聚木糖-MRS等)：将MRS培养基中葡萄糖依次替换为菊粉、低聚果糖、低聚木糖等益生元。
2、主要试剂：菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖；16S rRNA引物(F：GACTACHVGGGTATCTAATCC；R：CCTACGGGNGGCWGCAG)；大肠杆菌；鼠伤寒沙门氏菌；产气荚膜梭菌；艰难梭菌；肺炎克雷伯氏菌。
3、主要仪器：厌氧培养箱(上海三发科学仪器有限公司)；高效液相色谱仪(Agilent)；高压蒸汽灭菌锅(上海申安医疗器械厂)；PCR仪(Eppendorf)。
(二)可高效利用低聚果糖益生菌的筛选
如图1A-B所示，将16名志愿者提供的新鲜粪便用无菌生理盐水(0.85％m/v)稀释至10-6-10-9倍至不同试管中，三个浓度梯度试管分别吸取0.1mL在低聚果糖-MRS、菊粉-MRS、低聚木糖-MRS平板上用无菌涂布器均匀涂布至无水痕，37℃厌氧培养18-24h，取出并挑取较大的菌落到相应的培养基中厌氧培养18-24h，分离纯化后的菌株进行形态观察、生理生化特性的测定和16S rRNA序列测定等，分别对不同的菌落进行鉴定，达到对其知类辨名的目的，选择符合国家卫生部发表的《可用于食品的菌种名单》的益生菌菌株并保存。将鉴定后的菌种或已保存的益生菌分别接到以低聚果糖为唯一碳源的MRS液态培养基中，37℃厌氧培养18-24h后，利用高效液相色谱仪测定其低聚果糖的消耗量，从而得到可高效利用低聚果糖的益生菌。
(三)肠道有害菌抑制菌株的选择
对筛选出的可高效利用低聚果糖的益生菌株在MRS培养基上活化，将分离自粪便中的大肠杆菌/鼠伤寒沙门氏菌/肺炎克雷伯氏菌/产气荚膜梭菌/艰难梭菌在液态MRS培养基上活化并取0.1mL涂布于固态MRS培养基上，平板上放置3个牛津杯(两两间隔约40mm)，牛津杯中注入100μL活化的益生菌液，37℃厌氧培养24h，测量抑菌圈以评测益生菌对有害菌的抑制作用。
(四)菌种筛选分离结果
本实施例筛选得到的可高效利用低聚果糖并且具有抑制肠道有害菌的益生菌，主要为副干酪乳杆菌、戊糖片球菌，结果见图1C。选取一株或几株筛选出来的可高效利用低聚果糖并且能够抑制肠道有害菌的菌株用于动物实验，并将一株或者多株菌株与益生元进行组合得到合生元复合制剂。
(五)高效降解益生元抑制病原菌的益生菌筛选
如前述的，按照高效利用低聚果糖的益生菌筛选方案筛选可高效利用菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖并抑制病原菌的益生菌，结果见表1、表2。
表1可高效利用菊粉、低聚木糖的益生菌
注：-：益生元消耗＜5％；+：5％≤益生元消耗＜15％；++：15≤益生元消耗＜40％；+++：益生元消耗＞40％；此处为益生菌发酵24h内益生元消耗量。
表2具有高效抑制病原菌的益生菌菌株
注：-：抑菌圈＝0.8cm；+：抑菌圈＜0.9cm；++：0.9cm≤抑菌圈＜1.2cm；+++：抑菌圈＞1.2。
实施例2益生菌对高剂量低聚果糖造成的肠道菌群紊乱、肠漏及脓毒症的保护作用评价
结合动物实验对本发明的益生菌对低聚果糖造成损伤的保护做进一步的研究，以说明本发明的有效性。
(一)高剂量低聚果糖诱导的小鼠脓毒症模型的建立
西方式饮食是造成机体肥胖的重要原因，因此高脂饮食被纳入本研究。根据卫生部规定的低聚果糖摄入量调整小鼠每日灌胃剂量，其中低剂量为8*0.003/0.02＝1.2g/kg小鼠，中剂量为低剂量3倍，高剂量为低剂量6倍，以生理盐水灌胃作对照，在高脂饮食下以表观状况、病理学、腹泻、死亡率等指标，验证小鼠脓毒症模型是否建立成功；建模期间生理盐水组表现为肥胖，高剂量低聚果糖组小鼠表现为灌胃后出现严重腹泻症状并伴随一定几率的小鼠死亡，由H&E染色可知，高剂量低聚果糖组小鼠肠道上皮细胞脱落和黏膜层受损；与生理盐水、中低剂量相比，高剂量低聚果糖小鼠表现为类似于脓毒症现象，血中脂多糖、鞭毛蛋白含量上升，IgA、IgG含量下降。
综上所述，小鼠脓毒症模型建立成功，可进行下一步合生菌的治疗试验。
此外，除了低聚果糖，菊粉和低聚木糖过量摄入同样会引发小鼠脓毒症。
(二)动物实验方案
将6-7周龄雄性C57BL/6J小鼠(20±2g)随机分成4组(对照组、模型组、益生菌1组、益生菌2组)，每组20只，不同益生菌组分别给予相应剂量的益生菌，其余干预过程相同，治疗期间，仅对模型组进行灭菌生理盐水灌胃，不进行治疗，灌胃期间出现腹泻、血中脂多糖、鞭毛蛋白升高且伴随小鼠死亡，说明脓毒症模型建立成功。
(三)实验结论
1、高剂量低聚果糖抑制肥胖，但导致严重腹泻及小鼠死亡
如图2所示，利用高剂量低聚果糖进行干预后小鼠体重减轻而食物摄入量不变，结果表明低聚果糖具有一定的减肥效果。但在实验过程中持续利用高剂量低聚果糖进行灌胃干预后，观察到所有利用高剂量低聚果糖进行干预的小鼠均出现腹泻情况，不仅如此，个别小鼠出现死亡，并且死亡小鼠伴随着结肠出血现象。最终结果表明，高剂量低聚果糖虽然具有一定的抵抗肥胖的作用，但还会导致严重的腹泻甚至死亡现象。
(2)本发明的益生菌可以改善小鼠肠漏、腹泻状况
利用高剂量低聚果糖进行灌胃，同时利用本发明中不同组别的益生菌干预一段时间后，对同一组别不同时间段的小鼠进行观察发现，利用益生菌干预后小鼠无明显体重增加现象但明显缩短小鼠腹泻时间，不仅如此，利用益生菌干预后还可以有效降低肠道体积、增加黏液层厚度并避免小鼠死亡，如图3所示。结果表明，益生菌在利用低聚糖并缓解持续性腹泻中有重要作用。
(3)本发明的益生菌具有抑制肠道菌群紊乱的作用
腹泻会改变小鼠肠道菌群，16S rRNA测序结果表明低聚果糖会改变小鼠肠道菌群。在一定范围内低聚果糖具有调节肠道菌群的功能，但利用高剂量低聚果糖进行灌胃引起小鼠腹泻后，低聚果糖对肠道菌群的调节功能则被扰乱，造成肠道菌群紊乱。过量的可溶性纤维的摄入导致吸水和肠道体积增大，粘液降解细菌的可及性上升导致脓毒症。在这种情况下，多余的低聚果糖和紊乱的微生物会介导粘液层损伤，因此本申请人假设具有高低聚果糖代谢活性和致病菌抑制的益生菌具有改善黏液层的作用。从健康人中分离出的益生菌副干酪乳杆菌和戊糖片球菌，具有优异的低聚果糖代谢和抑制病原体增殖的特性，病原菌包括大肠杆菌、伤寒沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、艰难梭菌和产气梭菌。
如图4所示，利用益生菌对高剂量低聚果糖引起的腹泻小鼠进行干预后发现高剂量低聚果糖导致小鼠菌群负载、菌群结构、α多样性改变，而益生菌对这些现象具有改善作用，此外益生菌改善了因高剂量低聚果糖导致的Betaproteobacteria、嗜黏蛋白艾克曼氏菌、艰难梭菌增殖。
灌胃前收集粪便，定量粪便中微生物含量，结果表明，两种益生菌处理均降低了细菌负载。PCA分析表明，利用益生菌进行干预改变了微生物区系的结构，α多样性也有所增加，不仅如此，部分益生菌干预还增加了粪便中乳酸杆菌科和双歧杆菌科的相对丰度，抑制了粘液降解菌的过度生长。因此可以发现，使用益生菌可以改变肠道微生物群，抑制粘液层降解，减少血清细菌代谢物，抵抗脓毒症。
(4)本发明的益生菌降低细菌代谢产物入血并提高免疫球蛋白水平
研究表明，肠漏被认为与各种代谢疾病有关，其特征是微生物及其代谢物能够通过粘膜层进入血流。如图5所示，测定血清中三种典型的微生物细胞壁组分脂多糖(LPS)、鞭毛蛋白和磷壁酸(TA)，高剂量低聚果糖增加了血清中LPS、鞭毛蛋白水平，但益生菌可逆转这种现象。此外，高剂量低聚果糖血清免疫球蛋白a(IgA)和g(IgG)显著降低，表明肠道免疫力弱，部分益生菌可恢复IgA和IgG。
实施例3一种合生元复合制剂制备的方法
本发明提供一种技术方案：一种有助于缓解由高剂量低聚果糖引起的肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂。该有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂配方如下：益生菌组合为青春双歧杆菌2.5％、动物双歧杆菌2.5％、两歧双歧杆菌2.5％、长双歧杆菌5％、嗜酸乳杆菌2.5％、干酪乳杆菌5％、保加利亚乳杆菌5％、德氏乳杆菌乳亚种2.5％、发酵乳杆菌2.5％、格氏乳杆菌2.5％、瑞士乳杆菌2.5％、副干酪乳杆菌22.5％、植物乳杆菌5％、罗伊氏乳杆菌5％、鼠李糖乳杆菌2.5％、嗜热链球菌2.5％、乳酸片球菌5％、戊糖片球菌20％、乳酸乳球菌2.5％，益生元组合为菊粉20％、低聚果糖30％、异麦芽低聚糖10％、低聚半乳糖10％、低聚木糖10％、大豆低聚糖10％、人乳寡糖10％。
一种如上述的有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂的制备方法，具体方法如下：
1、定量称取：将所有原料按照上述比例进行称取；
2、益生菌培养：将上述各益生菌分别接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
3、益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
4、菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
5、合生元复合制剂的制备：调整菌体密度到107CFU/kg，益生元含量为0.08g/kg，将二者按上述比例进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
6、合生元的预防肠道菌群紊乱、肠漏及脓毒症的作用：对上述获得的合生元制剂用于动物实验，以不添加益生菌的益生元作为对照，灌胃剂量控制在7.2g/kg。结果表明在高剂量下益生元会导致小鼠剧烈腹泻、肠道菌群紊乱、脓毒症并伴随着小鼠死亡，而合生元组腹泻时间缩短并改善肠道菌群与脓毒症且无死亡现象出现。
实施例4一种合生元复合制剂制备的方法
本发明提供一种技术方案：一种有助于缓解由高剂量低聚果糖引起的肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂。该有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂配方如下：益生菌组合为青春双歧杆菌2.5％、动物双歧杆菌2.5％、两歧双歧杆菌2.5％、长双歧杆菌5％、嗜酸乳杆菌2.5％、干酪乳杆菌22.5％、保加利亚乳杆菌20％、德氏乳杆菌乳亚种2.5％、发酵乳杆菌2.5％、格氏乳杆菌2.5％、瑞士乳杆菌2.5％、副干酪乳杆菌5％、植物乳杆菌5％、罗伊氏乳杆菌5％、鼠李糖乳杆菌2.5％、嗜热链球菌2.5％、乳酸片球菌5％、戊糖片球菌5％、乳酸乳球菌2.5％，益生元组合为菊粉10％、低聚果糖10％、异麦芽低聚糖10％、低聚半乳糖10％、低聚木糖10％、大豆低聚糖10％、人乳寡糖40％。
一种如上述的有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂的制备方法，具体方法如下：
1、定量称取：将所有原料按照上述比例进行称取；
2、益生菌培养：将上述各益生菌分别接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
3、益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
4、菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
5、合生元复合制剂的制备：调整菌体密度到108CFU/kg，益生元含量为0.14g/kg，将二者按上述比例进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
6、合生元的预防肠道菌群紊乱、肠漏及脓毒症的作用：对上述获得的合生元制剂用于动物实验，以不添加益生菌的益生元作为对照，灌胃剂量控制在7.2g/kg。结果表明在高剂量下益生元会导致小鼠剧烈腹泻、肠道菌群紊乱、脓毒症并伴随着小鼠死亡，而合生元组腹泻时间减短并改善肠道菌群与脓毒症且无死亡现象出现。
实施例5一种合生元复合制剂制备的方法
本发明提供一种技术方案：一种有助于缓解由高剂量低聚果糖引起的肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂。该有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂配方如下：益生菌组合为青春双歧杆菌2％、动物双歧杆菌2％、两歧双歧杆菌2％、长双歧杆菌10％、嗜酸乳杆菌2％、干酪乳杆菌10％、保加利亚乳杆菌10％、德氏乳杆菌乳亚种2％、发酵乳杆菌2％、格氏乳杆菌2％、瑞士乳杆菌2％、副干酪乳杆菌10％、植物乳杆菌15％、罗伊氏乳杆菌10％、鼠李糖乳杆菌2％、嗜热链球菌2％、乳酸片球菌15％、戊糖片球菌10％、乳酸乳球菌2％，益生元组合为菊粉10％、低聚果糖10％、异麦芽低聚糖10％、低聚半乳糖25％、低聚木糖25％、大豆低聚糖10％、人乳寡糖10％。
一种如上述的有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂的制备方法，具体方法如下：
1、定量称取：将所有原料按照上述比例进行称取；
2、益生菌培养：将上述各益生菌分别接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
3、益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
4、菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
5、合生元复合制剂的制备：调整菌体密度到109CFU/kg，益生元含量为0.20g/kg，将二者按上述比例进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
6、合生元的预防肠道菌群紊乱、肠漏及脓毒症的作用：对上述获得的合生元制剂用于动物实验，以不添加益生菌的益生元作为对照，灌胃剂量控制在7.2g/kg。结果表明在高剂量下益生元会导致小鼠剧烈腹泻、肠道菌群紊乱、脓毒症并伴随着小鼠死亡，而合生元组腹泻时间减短并改善肠道菌群与脓毒症且无死亡现象出现。
实施例6一种合生元复合制剂制备的方法
本发明提供一种技术方案：一种有助于缓解由高剂量低聚果糖引起的肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂。该有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂配方如下：益生菌组合为青春双歧杆菌4％、动物双歧杆菌4％、两歧双歧杆菌4％、长双歧杆菌7％、嗜酸乳杆菌4％、干酪乳杆菌7％、保加利亚乳杆菌7％、德氏乳杆菌乳亚种4％、发酵乳杆菌4％、格氏乳杆菌4％、瑞士乳杆菌4％、副干酪乳杆菌7％、植物乳杆菌7％、罗伊氏乳杆菌7％、鼠李糖乳杆菌4％、嗜热链球菌4％、乳酸片球菌7％、戊糖片球菌7％、乳酸乳球菌4％，益生元组合为菊粉25％、低聚果糖12.5％、异麦芽低聚糖12.5％、低聚半乳糖12.5％、低聚木糖12.5％、大豆低聚糖12.5％、人乳寡糖12.5％。
一种如上述的有助于缓解肠道菌群紊乱、肠漏以及脓毒症的合生元复合制剂的制备方法，具体方法如下：
1、定量称取：将所有原料按照上述比例进行称取；
2、益生菌培养：将上述各益生菌分别接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
3、益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
4、菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
5、合生元复合制剂的制备：调整菌体密度到1010CFU/kg，益生元含量为0.24g/kg，将二者按上述比例进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
6、合生元的预防肠道菌群紊乱、肠漏及脓毒症的作用：对上述获得的合生元制剂用于动物实验，以不添加益生菌的益生元作为对照，灌胃剂量控制在7.2g/kg。结果表明在高剂量下益生元会导致小鼠剧烈腹泻、肠道菌群紊乱、脓毒症并伴随着小鼠死亡，而合生元组腹泻时间减短并改善肠道菌群与脓毒症且无死亡现象出现。
尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。
序列表
<110> 天津科技大学
<120> 一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂、制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 16S rRNA引物F(Unknown)
<400> 1
gactachvgg gtatctaatc c 21
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> 16S rRNA引物R(Unknown)
<400> 2
cctacgggng gcwgcag 17
Claims (10)
1.一种预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述合生元复方制剂包括益生菌与益生元，所述益生菌为以益生元为唯一碳源培养基能够优势生长的益生菌菌株，且该菌株对病原微生物具有抑制作用。
2.根据权利要求1所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述益生菌和益生元是符合国家卫生部相关规定的可用于食品、保健、医药的部分；
或者，所述益生菌包括从粪便、环境中筛选出的或已筛选出的可用于食品、保健、医药领域的菌株；
或者，所述病原微生物为肠道致病菌。
3.根据权利要求2所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述肠道致病菌包括沙门氏菌、大肠杆菌、产气荚膜梭菌、艰难梭菌、肺炎克雷伯氏菌。
4.根据权利要求1所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、保加利亚乳杆菌、德氏乳杆菌乳亚种、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌、乳酸乳球菌。
5.根据权利要求1所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述益生元包括菊粉、低聚果糖、异麦芽低聚糖、低聚半乳糖、低聚木糖、大豆低聚糖、人乳寡糖。
6.根据权利要求1至5任一项所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述总益生菌与益生元的剂量比例为106-1011CFU/kg：0.04-0.48g/kg。
7.根据权利要求1至5任一项所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述益生菌与益生元的剂量比例为107-1010CFU/kg：0.12-0.24g/kg。
8.根据权利要求1至5任一项所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂，其特征在于：所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为：青春双歧杆菌≥1％、动物双歧杆菌≥1％、两歧双歧杆菌≥1％、长双歧杆菌≥5％、嗜酸乳杆菌≥1％、干酪乳杆菌≥5％、保加利亚乳杆菌≥5％、德氏乳杆菌乳亚种≥1％、发酵乳杆菌≥1％、格氏乳杆菌≥1％、瑞士乳杆菌≥1％、副干酪乳杆菌≥5％、植物乳杆菌≥5％、罗伊氏乳杆菌≥5％、鼠李糖乳杆菌≥1％、嗜热链球菌≥1％、乳酸片球菌≥5％、戊糖片球菌≥5％、乳酸乳球菌≥1％；
益生元组合为：菊粉≥10％、低聚果糖≥5％、异麦芽低聚糖≥5％、低聚半乳糖≥5％、低聚木糖≥5％、大豆低聚糖≥5％、人乳寡糖≥5％；
或者，所述合生元复方制剂中益生菌及益生元的质量组份如下：
益生菌组合为青春双歧杆菌4份、动物双歧杆菌4份、两歧双歧杆菌4份、长双歧杆菌7份、嗜酸乳杆菌4份、干酪乳杆菌7份、保加利亚乳杆菌7份、德氏乳杆菌乳亚种4份、发酵乳杆菌4份、格氏乳杆菌4份、瑞士乳杆菌4份、副干酪乳杆菌7份、植物乳杆菌7份、罗伊氏乳杆菌7份、鼠李糖乳杆菌4份、嗜热链球菌4份、乳酸片球菌7份、戊糖片球菌7份、乳酸乳球菌4份；
益生元组合为菊粉25份、低聚果糖12.5份、异麦芽低聚糖12.5份、低聚半乳糖12.5份、低聚木糖12.5份、大豆低聚糖12.5份、人乳寡糖12.5份。
9.如权利要求1至8任一项所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂的制备方法，其特征在于：步骤如下：
(1)定量称取：称取益生菌与益生元；
(2)益生菌培养：将益生菌接种到MRS液态培养中，37℃培养24h，进行进一步的扩大培养；
(3)益生菌粉的获取：发酵培养后对发酵液进行离心，并用PBS缓冲液清洗3次后，离心得到菌体，利用冷冻干燥法进行冻干，得到冻干菌粉备用，-20℃保存；
(4)菌体密度的确定：对冻干后菌粉采用十倍稀释法稀释至10-5-10-10倍进行活菌计数，得到各个益生菌冻干后菌体密度；
(5)合生元复合制剂的制备：调整菌体密度、益生元含量，将二者进行混合后得到合生元复合制剂，于4℃储存。
10.如权利要求1至8任一项所述的预防益生元过量摄入导致腹泻、肠漏、脓毒症的合生元复方制剂在功能性饮料和/或食品生产方面中的应用。
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