KR20160093006A - 미생물의 산내성 조절 방법 - Google Patents

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Abstract

미생물에 있어서 fadD 유전자의 발현을 억제함으로써 산내성을 조절하는 방법, 및 fadD 유전자의 발현량 등을 지표로 하는 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝 방법의 제공.
fadD 유전자를 갖는 미생물에 있어서, fadD 유전자의 발현을 억제하는 것을 특징으로 하는 미생물의 산내성 조절 방법.

Description

미생물의 산내성 조절 방법 {METHOD FOR REGULATING ACID RESISTANCE OF MICROBES}
본 발명은, 미생물의 산내성 (酸耐性) 조절 방법 및 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
최근, 미생물 중에서도, 살아있는 상태에서 장관에 도달하여, 숙주에 대해 유효한 보건 효과를 나타내는 유용 미생물이 주목받고 있다. 이들 유용 미생물에는, 어떤 종의 락토바실러스속 세균이나 비피도 박테리움속 세균이 포함된다. 지금까지, 락토바실러스속 세균에서는, 변비나 설사의 개선 등의 정장 작용 외에, 유방암의 발증 리스크의 경감 작용 (특허문헌 1) 이나 인터류킨 12 산생 유도능 (특허문헌 2), 비피도 박테리움속 세균에서는, 콜레스테롤 흡수 억제 작용 (특허문헌 3) 이나 엘라스타아제 활성 억제 작용 (특허문헌 4) 등과 같은 많은 보건 효과가 보고되어 있다.
이들 유용 미생물이 소화관 내에서 유효하게 기능하여 보건 효과를 발휘하려면, 살아있는 채의 상태에서 소화관 내에 도달할 필요가 있지만, 소화관 내에 도달하기까지는, 온도, pH, 산소, 삼투압, 산 등, 유용 미생물에 있어서 여러 가지 생육 저해 환경이나 생육 저해 물질이 존재하고 있다. 따라서, 이들 미생물을 이용하는 데에 있어서는, 그 미생물이 생육 저해 환경이나 생육 저해 물질에 대해 내성을 갖고 있는지의 여부가 중요하다. 특히, 산은 이들 균이 소화관 내에 도달할 수 있는지의 여부가 큰 요인이 된다. 따라서, 산내성을 갖는 것은, 유용 미생물에 있어서 유리한 성질 중 하나라고 말할 수 있다.
유용 미생물 중에서도, 특히 비피도 박테리움속 세균은, 편성 혐기성균으로, 산소나 저 pH, 고산도에 약하고, 발효 음식품에 있어서는 제조시의 증식이나 보존시의 생존성 등, 취급에 곤란한 점이 많다. 비피도 박테리움속 세균의 보건 효과를 얻으려면, 가능한 한 많은 균이 산 채로 장에 도달할 필요가 있다고 생각되고 있고, 특히 음식품 중에서의 균의 생존성, 즉 음식 후의 장으로의 도달률을 높이는 것이 중요한 팩터로 되어 있다. 이 때문에, 산내성이 증강되고, 장으로의 도달도를 높인 비피도 박테리움속 세균의 필요성은 높다고 말할 수 있다.
산내성을 갖는 유용 미생물로서, 락토바실러스속 세균의 락토바실러스 카제이 YIT9029 (특허문헌 5), 비피도 박테리움속 세균의 비피도 박테리움 브리브 YIT12272 (특허문헌 6) 등이 알려져 있다. 이들 산내성을 갖는 유용 미생물은, 각종 발효유 제품이나 생균 제제 등의 형태로 다수의 시판품이 판매되고 있다. 특히 발효유 음식품은, 우수한 기호성을 갖고 있는 점에서, 계속적으로 음용하기 쉬워, 이들 유용 미생물의 투여에 적합한 것이다.
한편, 미생물의 산내성을 약하게 할 필요성도 존재하여, 미생물의 산내성을 원하는 형태로 조절하는 것은 매우 중요하다.
미생물의 산내성 조절 기구로는, ATP 의존성의 프로톤 펌프에 의해 균체 밖으로 프로톤을 밀어내는 것을 들 수 있다. 그러나, ATP 의존에 의한 본 기구는, 미생물을 저온 보존했을 때에, 미생물의 세포 내 ATP 가 고갈되어, 기능하지 않게 된다고 추측되고, 저온 상태에서도 기능하는 산내성 조절 기구를 이용하여 미생물의 산내성을 조절할 것이 요망되고 있다.
fadD 유전자는, 몇몇의 미생물에 있어서 그 존재가 확인되고, 지방산을 아실 CoA 로 변환하는 효소인 장쇄-지방산 CoA 리가아제 (long-chain-fatty-acid CoA ligase) 로서, 그 기능이 추정되고 있는 유전자이다.
그러나, fadD 유전자와 산내성의 관계는 지금까지 알려져 있지 않다.
국제 공개 제2011/049154호 일본 공개특허공보 2009-155221호 국제 공개 제2007/029773호 국제 공개 제2011/083738호 일본 공개특허공보 2003-219861호 국제 공개 제2011/105335호
본 발명은, 미생물에 있어서 fadD 유전자의 발현을 제어함으로써 산내성을 조절하는 방법, 및 fadD 유전자의 발현량 등을 지표로 하는 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝 방법을 제공하는 것에 관한 것이다.
본 발명자들은, 편성 혐기성균에서 통상 산내성을 갖지 않는 비피도 박테리움속 세균 중에서, 산내성을 갖는 특정의 비피도 박테리움 브리브주 및 그 계통주의 유전자를 망라적으로 해석한 결과, 산내성을 갖는 주에서는 fadD 유전자의 전사량이 현저히 억제되어 있고, fadD 유전자의 발현을 제어함으로써 미생물의 산내성을 조절할 수 있는 것, fadD 유전자의 발현량 등을 지표로 하여 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝이 가능한 것을 알아냈다.
즉, 본 발명은 이하의 1) ∼ 16) 에 관련된 것이다.
1) fadD 유전자를 갖는 미생물에 있어서, fadD 유전자의 발현을 제어하는 것을 특징으로 하는 미생물의 산내성 조절 방법.
2) 산내성이 저온 상태에서 기능이 유지되는 산내성인 1) 의 산내성 조절 방법.
3) fadD 유전자의 발현을 저해 또는 억제하고, 산내성을 증강시키는 1) 또는 2) 의 산내성 조절 방법.
4) 상대 전사량이 1 ％ 이하인 3) 의 산내성 조절 방법.
5) 상대 전사량이 0.1 ％ 이하인 3) 또는 4) 의 산내성 조절 방법.
6) 미생물이 비피도 박테리움속 세균인 1) ∼ 5) 의 산내성 조절 방법.
7) 미생물이 비피도 박테리움·브리브 (Bifidobacterium breve) 인 1) ∼ 6) 의 산내성 조절 방법.
8) 1) ∼ 7) 의 방법에 의해 산내성이 조절된 개변 미생물.
9) 1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 후, 저온 보존한 개변 미생물을 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 경우에, 당해 개변 미생물의 생존율이 개변 전의 미생물의 생존율에 비해 5 배 이상 높은 성질을 갖는 8) 의 개변 미생물.
10) 1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 후, 저온 보존한 개변 미생물을 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 후, 추가로 37 ℃ 에서 60 분간, 담즙산으로 처리한 경우에, 당해 개변 미생물의 생존율이 개변 전의 미생물의 생존율에 비해 10 배 이상 높은 성질을 갖는 9) 의 개변 미생물.
11) fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터의 배열을 개변하는 것에 의한 8) ∼ 10) 의 개변 미생물.
12) fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터에 있어서, 개시 코돈 염기로부터 68 bp 상류의 염기 배열이, 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로 변이하고 있는 8) ∼ 11) 의 개변 미생물.
13) 8) ∼ 12) 의 개변 미생물을 함유하는 음식품.
14) 8) ∼ 12) 의 개변 미생물을 함유하는 의약품.
15) fadD 유전자 및/또는 그 발현 산물의 유무 및/또는 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝 방법.
16) 15) 방법에 의해 얻어진 산내성을 갖는 미생물.
본 발명에 의하면, 육종 개량에 의해 산내성을 갖는 변이주를 취득하지 않고, 산내성이 증강된 개변 미생물을 용이하게 작출할 수 있다. 여기서 얻어지는 산내성은, fadD 유전자의 발현 조절에 의해 획득되는 것으로, 미생물의 배양 후의 ATP 에 의존하는 산내성과는 상이한 점에서, 저온 상태에서도 그 기능이 발휘되는 것이다. 또, 이 개변 미생물은, 생체 내에서의 생존성이 개선되어 있는 점에서, 미생물이 가지는 보건 효과를 보다 확실하게 발휘할 수 있다. 또한, 이 개변 미생물은, 저온 보존하에서의 생존성이 개선되는 점에서, 제품의 보존 기간을 연장할 수 있게 된다. 또한, 제품의 제조시에, 보다 산도가 높은 상태까지 배양 가능하기 때문에, 초기 배양의 균수를 증가시킬 수 있어, 1 회의 배양으로 많은 균수를 회수할 수 있다.
또, 본 발명에 의하면, 산내성이 약해진 개변 미생물을 용이하게 작출할 수 있다. 이와 같은 개변 미생물은, 위산으로 대부분이 사멸되는 점에서, 미생물이 가지는 보건 효과를 위에서는 발휘시키지 않는 미생물로서 사용할 수 있다.
또, 본 발명의 스크리닝 방법에 의하면, 산내성을 갖는 미생물을 간이하게 스크리닝할 수 있다.
도 1 은 비피도 박테리움에 있어서의 fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터 영역의 염기 배열을 비교한 도면이다. 개시 코돈 염기로부터 1 bp 상류의 염기 번호를 -1 로서 표기한다. 사각으로 둘러싼 부분이 변이가 존재하는 지점이다.
도 2 는 fadD 유전자의 상대 전사량 (YIT4008 주에 대하여) 을 나타내는 그래프이다.
도 3 은 fadD 유전자 발현용 플라스미드 DNA 의 제조도이다.
도 4 는 형질 전환체의 fadD 유전자의 상대 전사량 (YIT4008 주에 대하여) 을 나타내는 그래프이다.
도 5 는 산·담즙산 연속 처리 후의 생존율을 나타내는 그래프이다.
본 발명에 있어서의 fadD 유전자의 뉴클레오티드 배열 (배열 번호 1) 및 이것과 높은 유사성을 갖는 복수의 뉴클레오티드 배열이, NCBI 데이터베이스로 등록되어 있고, 지방산을 아실 CoA 로 변환하는 효소인 장쇄-지방산 CoA 리가아제 (long-chain-fatty-acid CoA ligase) 로서 그 기능이 추정되고 있다.
본 발명에 있어서, fadD 유전자의 발현을 제어한다는 것은, fadD 유전자의 발현을 저해 또는 억제하는 것, 혹은 fadD 유전자의 발현을 증강 또는 새롭게 도입하는 것이 포함된다. fadD 유전자의 발현을 저해 또는 억제함으로써, 산내성을 증강시킬 수 있고, fadD 유전자의 발현을 증강 또는 새롭게 도입함으로써, 산내성을 약하게 할 수 있다.
본 발명에 있어서, fadD 유전자의 발현을 제어하는 대상 미생물로는, 특별히 한정되지 않지만, 산내성의 증강이 요구되는 유용한 그램 양성 세균, 그램 음성 세균, 효모 등을 바람직하게 들 수 있다. 그 중에서도 그램 양성 세균이 바람직하고, 특히 생체로의 안전성이 확인되어 있는 락토바실러스속 세균, 비피도 박테리움속 세균이 바람직하다.
락토바실러스속 세균으로는, 락토바실러스·카제이, 락토바실러스·파라카제이, 락토바실러스·지에, 락토바실러스·람노서스 등의 락토바실러스·카제이 그룹에 속하는 세균의 이용이 바람직하고, 특히 락토바실러스·카제이, 락토바실러스·람노서스를 바람직하게 이용할 수 있다.
또, 비피도 박테리움속 세균으로는, 비피도 박테리움·브리브, 비피도 박테리움·롱검, 비피도 박테리움·인판티스, 비피도 박테리움·아돌레센티스, 비피도 박테리움·비피덤, 비피도 박테리움·카테눌라툼, 비피도 박테리움·슈도카테눌라툼, 비피도 박테리움·안귤라텀 등을 들 수 있고, 특히 비피도 박테리움·브리브를 바람직하게 이용할 수 있다.
사람에 있어서 유용한 생리 효과를 나타내는 비피도 박테리움속 세균은, 편성 혐기성균이고, 산소나 저 pH, 고산도에 약하고, 제조시의 증식이나 보존시의 생존성 등, 취급에 곤란한 점이 많은 점에서, 본 발명의 적용 대상이 되는 미생물로서 바람직하다.
본 발명에 있어서, fadD 유전자의 발현을 저해 또는 억제한다는 것은, 전형적으로는, (i) fadD mRNA 로의 fadD 유전자의 전사를 저해 또는 억제하거나, (ii) fadD 단백질로의 fadD mRNA 의 번역을 저해 또는 억제하는 것을 들 수 있는데, 이들에 한정되지 않는다.
fadD 유전자의 발현을 저해하려면, 당해 유전자를 파괴, 결손하면 되고, 이 방법으로는, 완전히 다른 DNA 단편을 유전자의 내부에 삽입하는 삽입 실활법이나, 단계적인 상동 재조합에 의해 표적 유전자의 일부 또는 전부를 결실하는 단계적 이중 교차법을 들 수 있고, 특히 단계적 이중 교차법이 바람직하다.
구체적으로는, fadD 유전자의 일부 또는 전부를 결실하는 경우에는, 결실 영역을 사이에 두는 양측의 영역을 염색체 DNA 로부터 분리하거나, 혹은 PCR 법에 의해 증폭하여 분리하고, 예를 들어 pYSSE3 과 같은 대장균에서는 증식하지만 대상으로 하는 미생물 중에서는 복제를 할 수 없는 플라스미드 벡터에 그것들 DNA 단편을 본래의 방향과 동일한 방향으로 나열한 상태에서 클로닝한다. 다음으로, 얻어지는 재조합 플라스미드 DNA 를, 결실을 일으키게 하려고 하는 미생물에 일렉트로 포레이션법 등을 사용하여 도입하고, 발생하는 항생 물질 내성의 클론으로부터, PCR 법 등에 의해 목적의 결실 영역의 상류 또는 하류의 클로닝한 영역과의 상동 영역에서 재조합을 일으켜 플라스미드가 염색체 상에 삽입된 클론을 선택한다. 이렇게 하여 얻은 클론을, 항생 물질을 포함하지 않는 배지에서 계대 배양을 반복함으로써, 플라스미드가 다시 근접하여 존재하는 상동 영역 간의 재조합에 의해 염색체로부터 이탈하고, 균의 증식에 수반하여 소실됨으로써, 항생 물질 내성을 없앤 클론을 선택한다. 이렇게 하여 얻은 클론으로부터 PCR 법 등에 의해 fadD 유전자 영역을 결실한 클론을 분리할 수 있다.
fadD 유전자의 발현을 억제하려면, 당해 유전자의 mRNA 의 5' 말단 영역과 상보적인 짧은 RNA 를 합성하는 것에 의한, 이른바 RNA 간섭에 의한 방법이나, 그 유전자의 발현을 제어하는 영역 또는 제어 유전자를 파괴 혹은 결손 등을 하여 개변하는 방법을 사용할 수 있고, 특히 그 유전자의 발현을 제어하는 영역의 개변이 바람직하다. 구체적으로는, fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터의 배열을 개변함으로써, 그 유전자의 mRNA 로의 전사량을 많이 하거나 줄이거나 할 수 있다. 여기서, fadD 유전자의 mRNA 로의 전사량을 줄인다는 것은, 상대 전사량이 1 ％ 이하, 바람직하게는 0.1 ％ 이하가 되는 것을 말한다. 상대 전사량이란, 동종의 미생물 중에서 fadD 유전자 야생형인 미생물의 fadD 유전자의 발현량 (예를 들어, mRNA 의 발현량) 으로, fadD 유전자 개변형인 미생물의 fadD 유전자의 발현량을 나눈 것을 말한다. 여기서, fadD 유전자 야생형인 미생물이란, fadD 유전자 또는 그 프로모터의 염기 배열이 변이하고 있지 않고, fadD 유전자의 발현이 증강 혹은 도입 또는 저해 혹은 억제되어 있지 않은 미생물을 말하고, fadD 유전자 개변형인 미생물이란, fadD 유전자 또는 그 프로모터의 염기 배열을 개변하거나 함으로써, fadD 유전자의 발현이 증강 혹은 도입 또는 저해 혹은 억제된 미생물을 말한다.
또, 여기서, 프로모터의 배열을 개변이란, 프로모터 영역에 있어서, DNA 단편을 구성하는 일부의 염기 (예를 들어, 1 ∼ 20 개 정도, 바람직하게는 1 ∼ 10 개, 더욱 바람직하게는 1 ∼ 5 개의 염기) 가 치환, 결실되는 경우, 또는 1 ∼ 수 개의 염기 (예를 들어, 1 ∼ 10 개, 바람직하게는 1 ∼ 5 개의 염기) 가 부가 혹은 삽입되는 경우를 말하고, 예를 들어, fadD 유전자의 프로모터에 있어서, 개시 코돈 염기로부터 68 bp 상류의 염기 배열을 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로 치환하는 것을 말한다.
한편, fadD 유전자의 발현을 증강시키려면, 그 유전자를 도입한 재조합 플라스미드를 대상으로 하는 미생물에 도입하는 것, 그 유전자를 염색체의 다른 장소에 부위 특이적 재조합에 의해 주입함으로써 미생물 내에서의 그 유전자의 카피수를 증가시키는 것, 그 유전자의 프로모터 배열을 개변하고, mRNA 으로의 전사량을 많이함으로써 발현을 증가시키는 것 등의 방법을 들 수 있고, 특히 그 유전자의 카피수를 증가시키는 방법이 바람직하다.
fadD 유전자의 다른 미생물로의 도입 방법으로는, DNA 의 삽입능을 이용한 컨피턴스법, 프로토플라스트를 이용한 프로토플라스트 PEG 법 및 고전압 펄스를 이용한 일렉트로 포레이션법 등을 이용하면 된다. 또, fadD 유전자를 미생물 염색체에 주입하는 경우에는, 상동 재조합을 이용한 방법, 부위 특이적에 주입하는 방법을 사용할 수 있다.
또, fadD 유전자의 카피수를 증가시키는 방법의 구체예로는, 1 개의 미생물 세포당 복수 개의 카피수를 가지는 플라스미드에, fadD 유전자를 그 유전자의 본래의 프로모터 배열과 리보솜 결합 부위를 포함하여 클로닝하거나, 다른 유전자로부터 분리하거나 혹은 화학 합성에 의해 제조한 프로모터와 리보솜 결합 부위의 하류에 그 유전자의 폴리펩티드를 코드하는 영역만을 연결하여 클로닝한 재조합 플라스미드를 제조하고, 미생물 세포 내에 일렉트로포레이션법 등에 의해 도입하는 것을 들 수 있다. 이로써, 미생물 세포 내에서의 그 유전자의 카피수를 높일 수 있다.
본 발명에 있어서, fadD 유전자의 발현이 제어되어, 산내성이 증강되도록 조절된 개변 미생물은, 산내성이 증강되어 있기 때문에, 당해 미생물이 원래 갖는 여러 가지의 생리 효과를 효과적으로 발휘하는 음식품이나 의약품으로서 이용할 수 있다. 또, 산내성이 약해지도록 조절된 개변 미생물은, 예를 들어 당해 미생물이 원래 갖는 여러 가지의 생리 효과를 위에 도달하기 전에 발휘하고, 위에서는 작용하지 않는 미생물로서 이용할 수 있다.
여기서, 산내성이란, 대상 미생물이 갖는 모든 산, 특히 위산이나 담즙산에 대한 내성을 의미하고, 보다 구체적으로는 저온 상태에서도 기능하는 산내성을 의미한다. 즉, 저온 상태에서는 기능하지 않게 된다고 추측되는 ATP 의존에 의한 산내성과는 명확하게 상이하다.
여기서, 저온 상태란, 0 ∼ 10 ℃ 의 상태에 있는 것을 말한다. 구체적으로는 저온 상태에서 보존 (저온 보존) 하는 것을 들 수 있고, 예를 들어 10 ℃ 이하에서 7 일 이상, 5 ℃ 이하에서 14 일 이상, 4 ℃ 에서 14 일 이상 보존하는 것을 들 수 있다.
산내성의 증강이란, 미생물의 fadD 유전자나 그 프로모터를 개변 등을 함으로써 fadD 유전자의 발현이 저해 또는 억제됨으로써, 개변 전의 미생물에 대해 개변 미생물의 산내성이 증강되어 있는 것을 의미한다. 보다 구체적으로는, 1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 개변 미생물을 4 ℃, 7 일간의 조건에서 저온 보존한 후, 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 경우에, 개변 미생물의 생존율 (위산 처리 전의 생균수에 대한 위산 처리 후의 생균수의 비율) 이 개변 전의 미생물에 비해 5 배 이상, 바람직하게는 10 배 이상 높은 성질을 들 수 있다. 또는 4 ℃, 14 일간의 조건에서 보존했을 때에는 30 배 이상, 바람직하게는 50 배 이상, 4 ℃, 19 일간의 조건에서 보존했을 때에는 100 배 이상, 바람직하게는 150 배 이상 높은 성질을 들 수 있다. 또, 1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 개변 미생물을 4 ℃, 7 일간의 조건에서 저온 보존한 후, 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 후, 추가로 37 ℃ 에서 60 분간, 담즙산으로 처리한 경우에, 개변 미생물의 생존율 (위산 및 담즙산의 연속 처리 전의 생균수에 대한 위산 및 담즙산 연속 처리 후의 생균수의 비율) 이 개변 전의 미생물에 비해 10 배 이상, 바람직하게는 30 배 이상 높은 성질을 들 수 있고, 또는 4 ℃, 14 일간의 조건에서 보존했을 때에는 100 배 이상, 바람직하게는 200 배 이상 높은 성질을 들 수 있다. 여기서, 위산 및 담즙산으로는, 예를 들어 국제 공개 제2011/105335호에 기재된, 인공 위액 (pH 3.3), 인공 담즙 (1.0 ％ 우담즙 (Oxgall)) 을 사용할 수 있다.
본 발명의 개변 미생물을 음식품이나 의약품으로 하는 경우, 균체는, 생균 또는 가열균체 (사균체) 중 어느 것이어도 되고, 또 동결 건조시킨 것이어도 되고, 혹은 이들 미생물을 포함하는 배양물, 균체 처리물로서 이용할 수도 있지만, 생균 상태에서 이용하는 것이 바람직하다.
의약품으로서 사용하는 경우에는, 본 발명의 개변 미생물을 고체 또는 액체의 의약용 무독성 담체와 혼합하여, 관용의 의약품 제제의 형태로 투여할 수 있다. 이와 같은 제제로는, 예를 들어, 정제, 과립제, 산재, 캡슐제 등의 고형제, 용액제, 현탁제, 유제 등의 액제, 동결 건조 제제 등을 들 수 있다. 이들 제제는 제제상의 상투적인 수단에 의해 조제할 수 있다. 상기의 의약용 무독성 담체로는, 예를 들어, 글루코오스, 젖당, 자당, 전분, 만니톨, 덱스트린, 지방산 글리세리드, 폴리에틸렌글리콜, 하이드록시에틸 전분, 에틸렌글리콜, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르, 아미노산, 젤라틴, 알부민, 물, 생리 식염수 등을 들 수 있다. 또, 필요에 따라, 안정화제, 습윤제, 유화제, 결합제, 등장화제, 부형제 등의 관용의 첨가제를 적절히 첨가할 수도 있다.
또, 본 발명의 개변 미생물은, 상기와 같은 제제로 할 뿐만 아니라, 음식품에 배합하여 사용할 수도 있다. 음식품에 배합하는 경우에는, 그대로, 또는 여러 가지의 영양 성분과 함께 함유하게 하면 된다. 이 음식품은, 미생물의 산내성이 원하는 형태로 조절되어 있기 때문에, 당해 미생물이 원래 갖는 여러 가지의 생리 작용을 효과적으로 발휘하는 보건용 식품 또는 식품 소재로서 이용할 수 있다. 구체적으로 본 발명 방법에 의해 얻어진 개변 미생물을 음식품에 배합하는 경우에는, 음식품으로서 사용 가능한 첨가제를 적절히 사용하고, 관용의 수단을 사용하여 식용에 적절한 형태, 즉, 과립상, 입상, 정제, 캡슐, 페이스트 등으로 성형해도 되고, 또 여러 가지의 식품, 예를 들어, 햄, 소세지 등의 식육 가공 식품, 어묵, 치쿠와 등의 수산 가공 식품, 빵, 과자, 버터, 분유에 첨가하여 사용하거나, 물, 과즙, 우유, 청량 음료, 차 음료 등의 음료에 첨가하여 사용해도 된다. 또한, 음식품에는, 동물의 사료도 포함된다.
또한, 음식품으로는, 본 발명의 개변 미생물을 이용한 발효유, 유산균 음료, 발효 두유, 발효 과즙, 발효 식물액 등의 발효 음식품의 예를 들 수 있다. 이들 발효 음식품의 제조는 통상적인 방법에 따르면 된다. 예를 들어 발효유를 제조하는 경우에는, 먼저, 살균한 젖 배지에 본 발명의 개변 미생물을 단독 또는 다른 미생물과 동시에 접종 배양하고, 이것을 균질화 처리하여 발효유 베이스를 얻는다. 이어서, 별도 조제한 시럽 용액을 첨가 혼합하고, 호모게나이저 등으로 균질화하고, 추가로 플레이버를 첨가하여 최종 제품으로 마무리하면 된다. 이와 같이 하여 얻어지는 발효유는, 시럽 (감미료) 을 함유하지 않는 플레인 타입, 소프트 타입, 프루츠 플레이버 타입, 고형상, 액상 등의 어느 형태의 제품으로 할 수도 있다.
본 발명 방법에 의해 얻어진 산내성이 증강되도록 조절된 미생물은, 저온 상태에서도 높은 산내성을 갖는 점에서, 산이 존재하는 제품 중에서의 균의 생존성이 높다. 그 때문에, 저온 보존 중의 생균수의 저하나 사멸 속도의 증가가 억제되고, 제품 규격의 유지가 용이해지고, 락토바실러스속 세균 등의 미생물이 갖는 정장 작용 등의 일반적인 생리 효과를 효과적으로 발휘시킬 수 있다. 또, 항암 작용, 헬리코박터·파일로리의 제균 작용 등의 특이적인 생리 효과를 원래 갖는 락토바실러스속 세균이나 비피도 박테리움속 세균에 대하여, 본 발명 방법에 의해 산내성을 증강시킴으로써, 그 균주를 여러 가지 음식품에 이용하는 것이 가능해짐과 함께, 그 균주의 생존성이 개선됨으로써 그 균주가 갖는 생리 효과를 증강시키는 것이 가능해진다.
또, 본 발명 방법에 의해 얻어진 산내성이 약해지도록 조절된 미생물은, 위산으로 대부분이 사멸되는 점에서, 당해 미생물이 원래 갖는 여러 가지의 생리 효과를 위에 도달하기 전에 발휘하고, 위에서는 작용하지 않는 미생물로서 이용할 수 있다.
상기 서술한 바와 같이, fadD 유전자의 발현이 저해 또는 억제된 경우에 미생물의 산내성이 증강되는 점에서, fadD 유전자 및/또는 그 발현 산물의 발현량 등을 지표로 하여 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝이 가능하다. 즉, fadD 유전자 및/또는 그 발현 산물의 유무 및/또는 발현량을 측정함으로써, 당해 산내성을 갖는 미생물을 스크리닝할 수 있다. 유전자의 발현 산물로는, mRNA 나 폴리펩티드 등을 들 수 있고, 그 폴리펩티드로는, 배열 번호 9 에 나타나는 아미노산 배열로 이루어지는 폴리펩티드를 들 수 있다.
여기서, fadD 유전자 및/또는 그 발현 산물의 측정은, fadD 유전자나 당해 유전자 유래의 mRNA 를 검출할 수 있는 프로브나 프라이머를 사용하고, 미생물에 있어서의 표적으로 하는 유전자의 유무, 카피수나 발현량을 사우던 하이브리다이제이션법이나 노던 하이브리다이제이션법, DNA 마이크로 어레이나 RT-PCR 법에 의해 실시할 수 있다. 또, 폴리펩티드의 양을 자외 흡수법, BCA 법 (비신코닌산법), 로리법과 같은 분광 광도법이나 전기 영동법에 의해 실시할 수 있다. 그리고, fadD 유전자나 그 발현 산물의 유무, 그들의 발현량에 의해 목적으로 하는 미생물 (산내성을 갖는 미생물) 을 선택하면 된다.
또한, 상기 서술한 유전자의 개변이나 미생물의 스크리닝을 효율적으로 실시하기 위해서는, 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부를 함유하는 재조합 벡터, 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드의 일부 단편으로 이루어지는 PCR 및 RT-PCR 용 프라이머, 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부를 증폭시킬 수 있는 PCR 및 RT-PCR 용 프라이머, 배열 번호 1 에 나타내는 폴리뉴클레오티드에 특이적으로 하이브리다이즈하는 폴리뉴클레오티드 또는 그 일부로 이루어지는 하이브리다이제이션용의 핵산 단편을 사용하는 것이 바람직하다.
여기서, 사용되는 프라이머 등의 핵산 단편으로는, 본 발명의 유전자의 염기 배열에 관한 정보를 기초로 하여 화학 합성된 뉴클레오티드 등을 일반적으로 사용할 수 있지만, 당해 뉴클레오티드로는, 배열 번호 1 에 나타내는 염기 배열에 대응하는 부분 뉴클레오티드 배열로서, 10 ∼ 50 개가 연속한 염기, 바람직하게는 15 ∼ 35 개가 연속한 염기가 바람직하다.
이하, 실시예에 의해 본 발명의 내용을 더욱 상세하게 설명한다.
실시예
실시예 1 fadD 유전자의 프로모터 영역의 변이 지점의 확인
산내성을 갖는 비피도 박테리움 브리브 YIT 12272 (FERM BP-11320) 와, 그 계통주인 비피도 박테리움 브리브 YIT 4008 (FERM BP-4538) 및 비피도 박테리움 브리브 YIT 4065 (FERM BP-6223) 의 fadD 유전자의 주변의 염기 배열을, 정법에 따라 다이 터미네이터법에 의해 해독하고, 비교하였다. 그 결과, YIT 12272 에서는, fadD 유전자의 프로모터에 있어서, 개시 코돈 염기로부터 68 bp 상류의 염기 배열이, 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로 변이하고 있어, 그 전사량이 변화하고 있을 가능성을 생각할 수 있다. fadD 유전자의 프로모터에 있어서의 변이 지점을 도 1 에 나타낸다.
실시예 2 fadD 유전자의 전사량 해석
산내성을 갖는 비피도 박테리움 브리브 YIT 12272, 그 계통주인 YIT 4008 및 YIT 4065 를 MILS 배지 (Iwata and Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol 9, 165-168, 1989) 를 사용하여 37 ℃ 에서 혐기적으로 배양하였다. 혐기 배양은 기상을 질소 치환하여 부틸 마개를 하고, 정치 (靜置) 배양으로 실시하였다.
대수 증식기의 각 균주로부터 RNeasy Mini Kit (QIAGEN 사 제조) 를 사용하여 Total RNA 를 조제하였다. 또한, 본 RNA 1 ㎍ 을 사용하여 PrimeScript 1 st strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa 사 제조) 에 의해, cDNA 용액을 조제하였다. 각 균주로부터 조제한 cDNA 용액을 주형으로 하고, SYBR Premix Ex Taq (TaKaRa 사 제조) 와 표 1 에 나타낸 프라이머를 사용하여, ABI PRISM 7500 (Applied Biosystems 사 제조) 에 의해 리얼타임 PCR (95 ℃·30 초의 반응 후, 95 ℃·5 초 및 60 ℃·34 초의 반응을 40 사이클) 을 실시하여, fadD 유전자 및 16 SrRNA 유전자의 전사량을 측정하였다. 또한, 16 SrRNA 유전자의 전사량을 내부 표준으로 하여 샘플 간의 보정을 실시하였다.
Figure pct00001
각 균주에 있어서의 fadD 유전자의 전사량을, fadD 유전자가 야생형인 YIT 4008 에 대한 상대치로서 도 2 에 나타냈다. YIT 4065 에 있어서의 fadD 유전자의 전사량은 YIT 4008 로 동일한 정도였지만, fadD 유전자의 상류에 변이가 생긴 YIT 12272 에서는 전사량이 크게 저하되어 있고, YIT 4008 과 비교한 상대 전사량은, 0.1 ％ 이하로, YIT 4065 와 비교해도 0.1 ％ 이하였다.
실시예 3 야생형의 fadD 유전자를 도입한 형질 전환체의 취득 및 형질 전환체의 fadD 유전자의 상대 전사량
fadD 유전자의 산내성에 미치는 영향을 조사하기 위해서, YIT 4008 유래의 fadD 유전자 프로모터 및 fadD 유전자를 YIT 12272 에 도입한 형질 전환체 HM0102 주를 제작하였다.
먼저, YIT 4008 의 게놈 DNA 를 주형으로 하고, KOD-Plus- (TOYOBO 사 제조) 와 표 2 에 나타낸 프라이머를 사용하여, iCycler (Bio-Rad 사 제조) 에 의해 PCR (96 ℃·15 초, 60 ℃·30 초, 72 ℃·150 초의 반응을 30 사이클) 을 실시하고, fadD 유전자의 전체 길이와 그 상류 300 bp 및 하류 100 bp 를 포함하는 DNA 단편 (배열 번호 6) 을 증폭시켰다.
Figure pct00002
증폭시킨 DNA 단편과 일본 공개특허공보 평10-262670호에 기재된 pBE△4 벡터를, 동일한 문헌에 기재된 정법에 따라 제한 효소 EcoRI 로 소화하였다. 양 소화 단편을 사용하여, DNA Ligation Kit Ver. 2.1 (TaKaRa 사 제조) 에 의해 라이게이션 반응을 실시하고, 오리지날 프로모터 지배하에서의 fadD 유전자 발현용 플라스미드 DNA 를 제작하였다. 본 플라스미드 DNA 의 제작도를 도 3 에 나타냈다.
본 플라스미드 DNA 를 일렉트로포레이션법에 의해, 비피도 박테리움 브리브 YIT 12272 에 도입하였다. 일렉트로포레이션은, GENE PULSER II (Bio-Rad 사 제조) 를 사용하고, 200 Ω, 25 μF, 18 ㎸/㎝ 의 조건에서 실시하였다. 그 후, 3 ㎍/㎖ 의 에리트로마이신을 첨가한 MILS 한천 배지에 일렉트로포레이션 반응액을 도말 (塗沫) 하고, 아네로팩 (미츠비시 가스 화학사 제조) 을 사용하여 37 ℃ 에서 72 시간의 혐기 배양을 실시하였다. 발생한 콜로니를 형질 전환체 HM0102 주로서 취득하고, 정법에 따라 알칼리법에 의해 플라스미드 DNA 를 추출하고, 도입한 플라스미드 DNA 가 유지되고 있는 것을 확인하였다.
한편, HM0102 주의 대조로서, pBE△4 벡터만을 YIT 12272 에 도입한 HM0101 주도, 동일한 방법으로 제작하였다.
YIT 12272, HM0101 주 및 HM0102 주의 3 주에 대하여, 실시예 2 에 기재된 방법으로 fadD 유전자의 발현량을 측정하였다. 또한, 형질 전환체인 HM0101 주 및 HM0102 주의 배양은, MILS 배지의 효모 엑기스 농도를 1.5 ％ 로 한 Y-MILS 배지를 사용하고, 종농도가 3 ㎍/㎖ 가 되도록 에리트로마이신을 첨가하여 실시하였다.
각 주의 fadD 유전자의 전사량을 측정한 결과, YIT 12272 및 HM0101 주와 비교하여, 야생형의 fadD 유전자 프로모터 및 fadD 유전자를 도입한 HM0102 주에서는, fadD 의 전사량이 높은 것이 판명되었다. 각 주에 있어서의 fadD 유전자의 전사량을, YIT 4008 에서의 전사량에 대한 상대치로서 도 4 에 나타냈다.
실시예 4 형질 전환체의 산내성 측정
형질 전환체의 산내성을 보다 명확하게 확인하기 위해서, 저온 보존 후의 산내성을 측정하였다. 상기 실시예 3 에 기재된 배지에서, 1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수가 되도록 하룻밤 혐기 배양한 HM0101 주 (배양 후 균수：8.5 × 108 cell/㎖) 및 HM0102 주 (배양 후 균수：8.8 × 108 cell/㎖) 의 각 배양액을 4 ℃ 에서 혐기 정치 보존하였다. 보존 0 일째, 7 일째, 14 일째, 19 일째 및 29 일째에 있어서, 위산·담즙산 연속 처리를 실시하여, 양 주의 산내성을 비교하였다.
위산·담즙산 연속 처리는, 특허문헌 6 에 기재된 인공 위액 및 인공 담즙을 사용하여 이하와 같이 실시하였다. 먼저 미리 37 ℃ 에서 보온한 인공 위액 (pH 3.3) 10 ㎖ 에, 4 ℃ 에서 보존한 배양액 0.5 ㎖ 를 첨가하여 교반하고, 37 ℃ 에서 60 분간의 위산 처리를 실시하였다. 또한, 위산 처리 후의 용액 2 ㎖ 에 대하여, 인공 담즙 (1.0 ％ Oxgall) 1 ㎖ 와 반응 완충액 (0.5 ％ 의 염화나트륨, 0.1 ％ 의 염화칼륨, 0.3 ％ 의 탄산수소나트륨을 함유하는 pH 8.0 의 완충액) 5 ㎖ 를 첨가하여 교반하고, 37 ℃ 에서 60 분간의 담즙산 처리를 연속적으로 실시하였다. 위산 처리 0 분후, 동 60 분후, 위산·담즙산 연속 처리 120 분 후의 각 처리액 1 ㎖ 를 적절히 희석한 후, TOS 프로피온산 한천 배지 (야쿠르트 약품 공업사 제조) 에 도말하고, 아네로팩 (미츠비시 가스 화학사 제조) 를 사용하여 37 ℃ 에서 72 시간, 혐기적으로 배양하였다. 출현한 콜로니수에 총 희석 배율을 곱하여 배양액 1 ㎖ 당의 생균수를 구하고, 산처리 0 분 후의 생균수에 대한, 각 처리 후의 생균수의 비율을 생존율로 하였다.
여기서, HM0102 주는 야생형의 fadD 유전자, HM0101 주는 변이형의 fadD 유전자를 갖고, 그 이외의 유전자는 완전히 동일한 점에서, HM0102 주는 fadD 유전자 개변 전 미생물, HM0101 주는 fadD 유전자 개변 미생물에 상당한다.
위산 처리 후 및 위산·담즙산 연속 처리 후의 양 주의 생균수 및 생존율의 측정 결과를 도 5 에, HM0102 주에 대한 HM0101 주의 생존율의 비를 표 3 에 나타냈다. 그 결과, 저온 보존의 날짜가 경과함에 따라, 야생형의 fadD 유전자 프로모터를 도입한 HM0102 주에서는, 위산 처리 및 위산·담즙산 연속 처리 후의 생존율이 대폭 저하되었지만, HM0101 주에서는, 생존율의 저하의 폭이 작고, 산내성이 HM0102 주와 비교하여 증강되어 있었다. HM0101 주의 산내성이 증강되어 있는 것은, 생존율의 비에 있어서도 나타났다. 이와 같이, 산내성의 증강은, 저온 상태에 둔 경우에 의해 현저하게 관찰되었다.
Figure pct00003
이상의 결과로부터 fadD 유전자의 전사 증대는, 미생물, 특히 비피도 박테리움 브리브에 있어서의 산내성을 저하시키는 방향으로 작용하고, 반대로 fadD 유전자의 전사를 저해 또는 억제하는 것은, 미생물, 특히 비피도 박테리움 브리브에 있어서의 산내성을 증강시키는 방향으로 작용하는 것이 밝혀졌다. 이 때문에, fadD 유전자의 전사량을 저하시키는 것은, 배양 후의 세포 내 ATP 량에 의존하지 않고, 미생물의 산내성의 증강에 이용할 수 있다고 생각된다.
<110> KABUSHIKI KAISHA YAKULT HONSHA <120> METHOD FOR REGULATING ACID RESISTANCE OF BACTERIUM <130> YK0078 <150> JP 2013-251362 <151> 2013-12-04 <160> 9 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2034 <212> DNA <213> Bifidobacterium breve <400> 1 ttgtcggtta tcaattcctt tacgcagcac accatcaatc tgacccgcaa ggcactcagg 60 ttgggatccg acttcgttca cccggttcac gacgacactc cggacgagcc cgattatctg 120 tccaatgccg atgtgccgca ggaagccaac atcgaactgc cgcacagcga cgattgggat 180 gacggccatc tgaccgtcac cgacatcgac ccggaaaccg gactgctcac cacgtccact 240 gccggcaatc cgcctctgga cgacggcacg tccatctacg acctgtatgc ggatcgcgcc 300 aagcgcatgg gtgacgaacc gctgtatacc tacaagtccg acaacgaatg ggtgaccgtc 360 accgccaatg agttcctcgc cgaagtgcgt gccgtggcca agggcctgct gcactacggc 420 atcaagaagg gcgacggcgt ggcgttcatg tgccgcacct cctatgactg ggatctgacc 480 gatgcggcca tcatggcctg cggcggcgtg ctggccacca tctacgacac cgactcggcc 540 gaacaaatcc gcaatatcgt caacaattct gacgcgcgtc tgctcatcgt gcaggattcc 600 gccatgcgag agaaggcgga aggcgccgtg gaggaatgcc cctcactcga gcgcatccta 660 tgcatcgaga ccggcgctct tgatgagatc aaggcctatg gtgccggcat ctcggacgag 720 gaactggatg agcgcattga ttcggtcaag aaaaccgatc tgtgctccat tgtgtacacc 780 tctggttcca ccgccgcgcc gaagggcgtg gagatgaccc acgagcacta ctgccagacc 840 gcgctgaacc tgccggacta catgcccgag ctgctgcaca acaagaagaa caccatcctg 900 ctgttcctgc cgcaggccca ctcctttgcc cgcgccatca attacatcgt cgtggcctcg 960 aatatgcata tctacatcgc cgccggcatc aagacgctga ttagtgattt gcaggtggct 1020 aagccgtcca tcatgattgt ggtgccgcgt gtgctggaga aggtgtacaa cgccgcctcc 1080 cagaaggccg gccatggccc caagggcgtg gtgttcgcct ccgccgtggt ggctgcccag 1140 aactacatga aggaaatctc cgccaacggc aaggccagtg cattgacccg tgcccgccgc 1200 gcggccttcg atccgattgt ctactcctca ctgcgtgagg tgctgggtgg acgcatgaag 1260 tggattgtgg ccggcggcgc gccgcttgac cctgaactgc ttgcgttctt ccgcggcgca 1320 agcgtgcccg tctacgaggg ctatggtctg accgaaacca ccgcaccatg cgcgttcaac 1380 ccgctgggaa ccccgttcca cgccgggtcc gtgggcgtcg cgttccccgg cttctcgctg 1440 cgtattgccg aggacggcga gatccaggtc aagggtcgcg ccgtgttccc gcgttatcac 1500 aagaacgatg aggccaccga gctgtcgttc accgaagatg gctggtatgc caccggagat 1560 ttgggccgta tcgacaacga tggcttcctg tacattaccg gccgcaagaa ggatctcatc 1620 atcaccgcag gtggcaagaa tgtggcgccg ggtccgattg aagaggccat tcagcgttgc 1680 gagttcgtgt cccaggcact ggtgctgggc gacaagcgtc cgttcatctc cgcgctgatt 1740 acgctggacg aggagtcttt gcgtccttgg ctggccgcca agggattgga cgagaacatg 1800 tctctggagg acgcctctca gaacgccgcc gtacgcgctg aggtccagaa gtggatcgat 1860 caggccaacg aaggcgtttc ccgcgccgaa tccgtgcgta agttcatcat cctgcctgag 1920 gagttcacac aggagaacgg cctgatgacc gcctccatga aggtcatccg ccccaaggtc 1980 atcaagcgct actccaccct cctcaacacc cagatgtaca ccaagaagaa gtaa 2034 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 2 cacctcctat gactgggatc tgac 24 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 3 tgacgatatt gcggatttgt tc 22 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 4 atcgggcttt gcttggtg 18 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 5 gagcatccgg cattaccac 19 <210> 6 <211> 2434 <212> DNA <213> Bifidobacterium breve <400> 6 aggcggaaca atcggggcaa aagacccgca tttttcgtct tcgcatccct gctgcgtcaa 60 ctcgattgga tgacatctag gcagtagtcg aacgatctcc aaccactatc ggcagtctgt 120 tacccaacaa tcagagcgcc agtgtccatc caccacatag aacctcccaa aacctacggt 180 tgcgtaggct tttcctacgg ttgcgtaagg tgacgagttc gatgtgaacg attacaatct 240 aaggtttgag agcgttcggc ttatgctcga acggcactga aaggtttaca ggagcaagag 300 ttgtcggtta tcaattcctt tacgcagcac accatcaatc tgacccgcaa ggcactcagg 360 ttgggatccg acttcgttca cccggttcac gacgacactc cggacgagcc cgattatctg 420 tccaatgccg atgtgccgca ggaagccaac atcgaactgc cgcacagcga cgattgggat 480 gacggccatc tgaccgtcac cgacatcgac ccggaaaccg gactgctcac cacgtccact 540 gccggcaatc cgcctctgga cgacggcacg tccatctacg acctgtatgc ggatcgcgcc 600 aagcgcatgg gtgacgaacc gctgtatacc tacaagtccg acaacgaatg ggtgaccgtc 660 accgccaatg agttcctcgc cgaagtgcgt gccgtggcca agggcctgct gcactacggc 720 atcaagaagg gcgacggcgt ggcgttcatg tgccgcacct cctatgactg ggatctgacc 780 gatgcggcca tcatggcctg cggcggcgtg ctggccacca tctacgacac cgactcggcc 840 gaacaaatcc gcaatatcgt caacaattct gacgcgcgtc tgctcatcgt gcaggattcc 900 gccatgcgag agaaggcgga aggcgccgtg gaggaatgcc cctcactcga gcgcatccta 960 tgcatcgaga ccggcgctct tgatgagatc aaggcctatg gtgccggcat ctcggacgag 1020 gaactggatg agcgcattga ttcggtcaag aaaaccgatc tgtgctccat tgtgtacacc 1080 tctggttcca ccgccgcgcc gaagggcgtg gagatgaccc acgagcacta ctgccagacc 1140 gcgctgaacc tgccggacta catgcccgag ctgctgcaca acaagaagaa caccatcctg 1200 ctgttcctgc cgcaggccca ctcctttgcc cgcgccatca attacatcgt cgtggcctcg 1260 aatatgcata tctacatcgc cgccggcatc aagacgctga ttagtgattt gcaggtggct 1320 aagccgtcca tcatgattgt ggtgccgcgt gtgctggaga aggtgtacaa cgccgcctcc 1380 cagaaggccg gccatggccc caagggcgtg gtgttcgcct ccgccgtggt ggctgcccag 1440 aactacatga aggaaatctc cgccaacggc aaggccagtg cattgacccg tgcccgccgc 1500 gcggccttcg atccgattgt ctactcctca ctgcgtgagg tgctgggtgg acgcatgaag 1560 tggattgtgg ccggcggcgc gccgcttgac cctgaactgc ttgcgttctt ccgcggcgca 1620 agcgtgcccg tctacgaggg ctatggtctg accgaaacca ccgcaccatg cgcgttcaac 1680 ccgctgggaa ccccgttcca cgccgggtcc gtgggcgtcg cgttccccgg cttctcgctg 1740 cgtattgccg aggacggcga gatccaggtc aagggtcgcg ccgtgttccc gcgttatcac 1800 aagaacgatg aggccaccga gctgtcgttc accgaagatg gctggtatgc caccggagat 1860 ttgggccgta tcgacaacga tggcttcctg tacattaccg gccgcaagaa ggatctcatc 1920 atcaccgcag gtggcaagaa tgtggcgccg ggtccgattg aagaggccat tcagcgttgc 1980 gagttcgtgt cccaggcact ggtgctgggc gacaagcgtc cgttcatctc cgcgctgatt 2040 acgctggacg aggagtcttt gcgtccttgg ctggccgcca agggattgga cgagaacatg 2100 tctctggagg acgcctctca gaacgccgcc gtacgcgctg aggtccagaa gtggatcgat 2160 caggccaacg aaggcgtttc ccgcgccgaa tccgtgcgta agttcatcat cctgcctgag 2220 gagttcacac aggagaacgg cctgatgacc gcctccatga aggtcatccg ccccaaggtc 2280 atcaagcgct actccaccct cctcaacacc cagatgtaca ccaagaagaa gtaagcagag 2340 ctcgagtaca gcaaaaggga gattccaatg gaatctccct ttgttataac cggtcgaagg 2400 ccgattccta gaagccgagg cgttctagtt gctt 2434 <210> 7 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 7 cggaattcag gcggaacaat cggggcaaa 29 <210> 8 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic oligonucleotide <400> 8 cggaattcaa gcaactagaa cgcctcggct 30 <210> 9 <211> 677 <212> PRT <213> Bifidobacterium breve <400> 9 Leu Ser Val Ile Asn Ser Phe Thr Gln His Thr Ile Asn Leu Thr Arg 1 5 10 15 Lys Ala Leu Arg Leu Gly Ser Asp Phe Val His Pro Val His Asp Asp 20 25 30 Thr Pro Asp Glu Pro Asp Tyr Leu Ser Asn Ala Asp Val Pro Gln Glu 35 40 45 Ala Asn Ile Glu Leu Pro His Ser Asp Asp Trp Asp Asp Gly His Leu 50 55 60 Thr Val Thr Asp Ile Asp Pro Glu Thr Gly Leu Leu Thr Thr Ser Thr 65 70 75 80 Ala Gly Asn Pro Pro Leu Asp Asp Gly Thr Ser Ile Tyr Asp Leu Tyr 85 90 95 Ala Asp Arg Ala Lys Arg Met Gly Asp Glu Pro Leu Tyr Thr Tyr Lys 100 105 110 Ser Asp Asn Glu Trp Val Thr Val Thr Ala Asn Glu Phe Leu Ala Glu 115 120 125 Val Arg Ala Val Ala Lys Gly Leu Leu His Tyr Gly Ile Lys Lys Gly 130 135 140 Asp Gly Val Ala Phe Met Cys Arg Thr Ser Tyr Asp Trp Asp Leu Thr 145 150 155 160 Asp Ala Ala Ile Met Ala Cys Gly Gly Val Leu Ala Thr Ile Tyr Asp 165 170 175 Thr Asp Ser Ala Glu Gln Ile Arg Asn Ile Val Asn Asn Ser Asp Ala 180 185 190 Arg Leu Leu Ile Val Gln Asp Ser Ala Met Arg Glu Lys Ala Glu Gly 195 200 205 Ala Val Glu Glu Cys Pro Ser Leu Glu Arg Ile Leu Cys Ile Glu Thr 210 215 220 Gly Ala Leu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Gly Ala Gly Ile Ser Asp Glu 225 230 235 240 Glu Leu Asp Glu Arg Ile Asp Ser Val Lys Lys Thr Asp Leu Cys Ser 245 250 255 Ile Val Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Ala Ala Pro Lys Gly Val Glu Met 260 265 270 Thr His Glu His Tyr Cys Gln Thr Ala Leu Asn Leu Pro Asp Tyr Met 275 280 285 Pro Glu Leu Leu His Asn Lys Lys Asn Thr Ile Leu Leu Phe Leu Pro 290 295 300 Gln Ala His Ser Phe Ala Arg Ala Ile Asn Tyr Ile Val Val Ala Ser 305 310 315 320 Asn Met His Ile Tyr Ile Ala Ala Gly Ile Lys Thr Leu Ile Ser Asp 325 330 335 Leu Gln Val Ala Lys Pro Ser Ile Met Ile Val Val Pro Arg Val Leu 340 345 350 Glu Lys Val Tyr Asn Ala Ala Ser Gln Lys Ala Gly His Gly Pro Lys 355 360 365 Gly Val Val Phe Ala Ser Ala Val Val Ala Ala Gln Asn Tyr Met Lys 370 375 380 Glu Ile Ser Ala Asn Gly Lys Ala Ser Ala Leu Thr Arg Ala Arg Arg 385 390 395 400 Ala Ala Phe Asp Pro Ile Val Tyr Ser Ser Leu Arg Glu Val Leu Gly 405 410 415 Gly Arg Met Lys Trp Ile Val Ala Gly Gly Ala Pro Leu Asp Pro Glu 420 425 430 Leu Leu Ala Phe Phe Arg Gly Ala Ser Val Pro Val Tyr Glu Gly Tyr 435 440 445 Gly Leu Thr Glu Thr Thr Ala Pro Cys Ala Phe Asn Pro Leu Gly Thr 450 455 460 Pro Phe His Ala Gly Ser Val Gly Val Ala Phe Pro Gly Phe Ser Leu 465 470 475 480 Arg Ile Ala Glu Asp Gly Glu Ile Gln Val Lys Gly Arg Ala Val Phe 485 490 495 Pro Arg Tyr His Lys Asn Asp Glu Ala Thr Glu Leu Ser Phe Thr Glu 500 505 510 Asp Gly Trp Tyr Ala Thr Gly Asp Leu Gly Arg Ile Asp Asn Asp Gly 515 520 525 Phe Leu Tyr Ile Thr Gly Arg Lys Lys Asp Leu Ile Ile Thr Ala Gly 530 535 540 Gly Lys Asn Val Ala Pro Gly Pro Ile Glu Glu Ala Ile Gln Arg Cys 545 550 555 560 Glu Phe Val Ser Gln Ala Leu Val Leu Gly Asp Lys Arg Pro Phe Ile 565 570 575 Ser Ala Leu Ile Thr Leu Asp Glu Glu Ser Leu Arg Pro Trp Leu Ala 580 585 590 Ala Lys Gly Leu Asp Glu Asn Met Ser Leu Glu Asp Ala Ser Gln Asn 595 600 605 Ala Ala Val Arg Ala Glu Val Gln Lys Trp Ile Asp Gln Ala Asn Glu 610 615 620 Gly Val Ser Arg Ala Glu Ser Val Arg Lys Phe Ile Ile Leu Pro Glu 625 630 635 640 Glu Phe Thr Gln Glu Asn Gly Leu Met Thr Ala Ser Met Lys Val Ile 645 650 655 Arg Pro Lys Val Ile Lys Arg Tyr Ser Thr Leu Leu Asn Thr Gln Met 660 665 670 Tyr Thr Lys Lys Lys 675

Claims (16)

  1. fadD 유전자를 갖는 미생물에 있어서, fadD 유전자의 발현을 제어하는 것을 특징으로 하는 미생물의 산내성 (酸耐性) 조절 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    산내성이 저온 상태에서 기능이 유지되는 산내성인 산내성 조절 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    fadD 유전자의 발현을 저해 또는 억제하고, 산내성을 증강시키는 산내성 조절 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    상대 전사량이 1 ％ 이하인 산내성 조절 방법.
  5. 제 3 항 또는 제 4 항에 있어서,
    상대 전사량이 0.1 ％ 이하인 산내성 조절 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물이 비피도 박테리움속 세균인 산내성 조절 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    미생물이 비피도 박테리움·브리브인 산내성 조절 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 산내성이 조절된 개변 미생물.
  9. 제 8 항에 있어서,
    1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 후, 저온 보존한 개변 미생물을 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 경우에, 당해 개변 미생물의 생존율이 개변 전의 미생물의 생존율에 비해 5 배 이상 높은 성질을 갖는 개변 미생물.
  10. 제 9 항에 있어서,
    1 × 108 cell/㎖ 이상의 균수로 배양한 후, 저온 보존한 개변 미생물을 37 ℃ 에서 60 분간, 위산으로 처리한 후, 추가로 37 ℃ 에서 60 분간, 담즙산으로 처리한 경우에, 당해 개변 미생물의 생존율이 개변 전의 미생물의 생존율에 비해 10배 이상 높은 성질을 갖는 개변 미생물.
  11. 제 8 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서,
    fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터의 배열을 개변하는 것에 의한 개변 미생물.
  12. 제 8 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서,
    fadD 유전자의 전사를 제어하는 프로모터에 있어서, 개시 코돈 염기로부터 68 bp 상류의 염기 배열이, 티민 (T) 에서 시토신 (C) 으로 변이하고 있는 개변 미생물.
  13. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 개변 미생물을 함유하는 음식품.
  14. 제 8 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 기재된 개변 미생물을 함유하는 의약품.
  15. fadD 유전자 및/또는 그 발현 산물의 유무 및/또는 발현량을 측정하는 것을 특징으로 하는 산내성을 갖는 미생물의 스크리닝 방법.
  16. 제 15 항의 방법에 의해 얻어진 산내성을 갖는 미생물.
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