JP6541576B2 - 微生物の酸耐性調節方法 - Google Patents
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Description
一方、微生物の酸耐性を弱くする必要性も存在し、微生物の酸耐性を所望の形で調節することは極めて重要である。
しかしながら、fadD遺伝子と酸耐性との関係はこれまでに知られていない。
1)fadD遺伝子を有する微生物において、fadD遺伝子の発現を制御することを特徴とする、微生物の酸耐性調節方法。
2)酸耐性が、低温状態で機能が維持される酸耐性である1)の酸耐性調節方法。
3)fadD遺伝子の発現を阻害又は抑制し、酸耐性を増強する、1)又は2)の酸耐性調節方法。
4)相対転写量が1%以下である、3)の酸耐性調節方法。
5)相対転写量が0.1%以下である、3)又は4)の酸耐性調節方法。
6)微生物がビフィドバクテリウム属細菌である1)〜5)の酸耐性調節方法。
7)微生物がビフィドバクテリウム・ブレーべである1)〜6)の酸耐性調節方法。
8)1)〜7)の方法により酸耐性が調節された改変微生物。
9)1×108cell/mL以上の菌数に培養した後、低温保存した改変微生物を37℃で60分間、胃酸で処理した場合に、当該改変微生物の生存率が改変前の微生物の生存率に比べ5倍以上高い性質を有する、8)の改変微生物。
10)1×108cell/mL以上の菌数に培養した後、低温保存した改変微生物を37℃で60分間、胃酸で処理した後、さらに37℃で60分間、胆汁酸で処理した場合に、当該改変微生物の生存率が改変前の微生物の生存率に比べ10倍以上高い性質を有する、9)の改変微生物。
11)fadD遺伝子の転写を制御するプロモーターの配列を改変することによる、8)〜10)の改変微生物。
12)fadD遺伝子の転写を制御するプロモーターにおいて、開始コドン塩基から68bp上流の塩基配列が、チミン(T)からシトシン(C)に変異している、8)〜11)の改変微生物。
13)8)〜12)の改変微生物を含有する飲食品。
14)8)〜12)の改変微生物を含有する医薬品。
15)fadD遺伝子及び/又はその発現産物の有無及び/又は発現量を測定することを特徴とする酸耐性を有する微生物のスクリーニング方法。
16)15)の方法により得られた酸耐性を有する微生物。
また、本発明によれば、酸耐性が弱まった改変微生物を容易に作出することができる。このような改変微生物は、胃酸で多くが死滅することから、微生物の持つ保健効果を胃では発揮させない微生物として使用することができる。
また、本発明のスクリーニング方法によれば、酸耐性を有する微生物を簡易にスクリーニングすることができる。
本発明において、fadD遺伝子の発現を制御する対象微生物としては、特に限定されないが、酸耐性の増強が求められる有用なグラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母等が好適に挙げられる。中でもグラム陽性細菌が好ましく、特に生体への安全性が確認されているラクトバチルス属細菌、ビフィドバクテリウム属細菌が好ましい。
ラクトバチルス属細菌としては、ラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・パラカゼイ、ラクトバチルス・ゼアエ、ラクトバチルス・ラムノーサス等のラクトバチルス・カゼイグループに属する細菌の利用が好ましく、特にラクトバチルス・カゼイ、ラクトバチルス・ラムノーサスを好適に利用することができる。
また、ビフィドバクテリウム属細菌としては、ビフィドバクテリウム・ブレーべ、ビフィドバクテリウム・ロンガム、ビフィドバクテリウム・インファンティス、ビフィドバクテリウム・アドレセンティス、ビフィドバクテリウム・ビフィダム、ビフィドバクテリウム・カテヌラタム、ビフィドバクテリウム・シュードカテヌラタム、ビフィドバクテリウム・アンギュラタム等が挙げられ、特にビフィドバクテリウム・ブレーべを好適に利用することができる。
ヒトにとって有用な生理効果を示すビフィドバクテリウム属細菌は、偏性嫌気性菌であり、酸素や低pH、高酸度に弱く、製造時の増殖や保存時の生残性等、取扱いに困難な点が多いことから、本発明の適用対象となる微生物として好適である。
具体的には、fadD遺伝子の一部又は全部を欠失する場合には、欠失領域をはさむ両側の領域を染色体DNAから分離するか、あるいはPCR法によって増幅して分離し、例えばpYSSE3のような大腸菌では増殖するが対象とする微生物中では複製が出来ないプラスミドベクターにそれらDNA断片を本来の向きと同じ向きに並んだ状態でクローニングする。次に、得られる組換えプラスミドDNAを、欠失を起こさせようとする微生物にエレクトロポレーション法等を用いて導入し、生じる抗生物質耐性のクローンから、PCR法等によって目的の欠失領域の上流又は下流のクローニングした領域との相同領域で組換えを起こしてプラスミドが染色体上に挿入したクローンを選択する。こうして得たクローンを、抗生物質を含まない培地で継代培養を繰り返すことによって、プラスミドが再び近接して存在する相同領域間の組換えによって染色体から離脱し、菌の増殖に伴って消失することによって、抗生物質耐性をなくしたクローンを選択する。こうして得たクローンからPCR法等によってfadD遺伝子領域を欠失したクローンを分離することができる。
また、ここで、プロモーターの配列を改変とは、プロモーター領域において、DNA断片を構成する一部の塩基(例えば、1〜20個程度、好ましくは1〜10個、さらに好ましくは1〜5個の塩基)が置換、欠失される場合、又は1〜数個の塩基(例えば、1〜10個、好ましくは1〜5個の塩基)が付加若しくは挿入される場合をいい、例えば、fadD遺伝子のプロモーターにおいて、開始コドン塩基から68bp上流の塩基配列をチミン(T)からシトシン(C)に置換することをいう。
ここで、酸耐性とは、対象微生物が有するあらゆる酸、特に胃酸や胆汁酸に対する耐性を意味し、より具体的には低温状態でも機能する酸耐性を意味する。すなわち、低温状態では機能しなくなると推測されるATP依存による酸耐性とは明確に異なる。
ここで、低温状態とは、0〜10℃の状態にあることを云う。具体的には低温状態で保存(低温保存)することが挙げられ、例えば10℃以下で7日以上、5℃以下で14日以上、4℃で14日以上保存することが挙げられる。
酸耐性の増強とは、微生物のfadD遺伝子やそのプロモーターを改変等することでfadD遺伝子の発現が阻害又は抑制されることにより、改変前の微生物に対して改変微生物の酸耐性が増強していることを意味する。より具体的には、1×108cell/mL以上の菌数に培養した改変微生物を4℃、7日間の条件で低温保存した後、37℃で60分間、胃酸で処理した場合に、改変微生物の生存率(胃酸処理前の生菌数に対する胃酸処理後の生菌数の割合)が改変前の微生物に比べ5倍以上、好ましくは10倍以上高い性質が挙げられる。又は4℃、14日間の条件で保存した際には30倍以上、好ましくは50倍以上、4℃、19日間の条件で保存した際には100倍以上、好ましくは150倍以上高い性質が挙げられる。また、1×108cell/mL以上の菌数に培養した改変微生物を4℃、7日間の条件で低温保存した後、37℃で60分間、胃酸で処理した後、さらに37℃で60分間、胆汁酸で処理した場合に、改変微生物の生存率(胃酸及び胆汁酸の連続処理前の生菌数に対する胃酸及び胆汁酸連続処理後の生菌数の割合)が改変前の微生物に比べ10倍以上、好ましくは30倍以上高い性質が挙げられ、又は4℃、14日間の条件で保存した際には100倍以上、好ましくは200倍以上高い性質が挙げられる。ここで、胃酸及び胆汁酸としては、例えば国際公開第2011/105335号に記載の、人口胃液(pH3.3)、人工胆汁(1.0% 牛胆汁(Oxgall))を用いることができる。
また、本発明の方法により得られた酸耐性が弱まるように調節された微生物は、胃酸で多くが死滅することから、当該微生物が元来有する種々の生理効果を胃に到達する前に発揮し、胃では作用しない微生物として利用することができる。
ここで、fadD遺伝子及び/又はその発現産物の測定は、fadD遺伝子や当該遺伝子由来のmRNAを検出し得るプローブやプライマーを用いて、微生物における標的とする遺伝子の有無、コピー数や発現量をサザーンハイブリダイゼーション法やノーザンハイブリダイゼーション法、DNAマイクロアレイやRT−PCR法により行うことができる。また、ポリペプチドの量を紫外吸収法、BCA法(ビシンコニン酸法)、ローリー法のような分光光度法や電気泳動法により行うことができる。そして、fadD遺伝子やその発現産物の有無、それらの発現量により、目的の微生物(酸耐性を有する微生物)を選択すればよい。
ここで、使用されるプライマー等の核酸断片としては、本発明の遺伝子の塩基配列に関する情報をもとにして化学合成されたヌクレオチド等が一般的に使用できるが、当該ヌクレオチドとしては、配列番号1に示す塩基配列に対応する部分ヌクレオチド配列であって、10〜50個の連続した塩基、好ましくは15〜35個の連続した塩基が好ましい。
以下、実施例によって本発明の内容をさらに詳細に説明する。
酸耐性を有するビフィドバクテリウム ブレーベ YIT 12272(FERM BP−11320)と、その系統株であるビフィドバクテリウム ブレーベ YIT 4008(FERM BP−4538)およびビフィドバクテリウム ブレーベ YIT 4065(FERM BP−6223)のfadD遺伝子の周辺の塩基配列を、定法に従ってダイターミネーター法により解読し、比較した。その結果、YIT 12272では、fadD遺伝子のプロモーターにおいて、開始コドン塩基から68bp上流の塩基配列が、チミン(T)からシトシン(C)に変異しており、その転写量が変化している可能性が考えられた。fadD遺伝子のプロモーターにおける変異箇所を図1に示す。
酸耐性を有するビフィドバクテリウム ブレーベ YIT 12272、その系統株であるYIT 4008およびYIT 4065をMILS培地(Iwata and Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol 9, 165−168, 1989)を用いて37℃で嫌気的に培養した。嫌気培養は気相を窒素置換してブチル栓をし、静置培養にて行った。
対数増殖期の各菌株よりRNeasy Mini Kit(QIAGEN社製)を用いてTotal RNAを調製した。さらに、本RNA1μgを用いてPrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa社製)により、cDNA溶液を調製した。各菌株から調製したcDNA溶液を鋳型とし、SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa社製)と表1に示したプライマーを用いて、ABI PRISM 7500(Applied Biosystems社製)によりリアルタイムPCR(95℃・30秒の反応後、95℃・5秒および60℃・34秒の反応を40サイクル)を行い、fadD遺伝子および16SrRNA遺伝子の転写量を測定した。なお、16SrRNA遺伝子の転写量を内部標準としてサンプル間の補正を行った。
fadD遺伝子の酸耐性に与える影響を調べるために、YIT 4008由来のfadD遺伝子プロモーターおよびfadD遺伝子をYIT 12272に導入した形質転換体HM0102株を作製した。
まず、YIT 4008のゲノムDNAを鋳型とし、KOD−Plus−(TOYOBO社製)と表2に示したプライマーを用いて、iCycler(Bio−Rad社製)によりPCR(96℃・15秒、60℃・30秒、72℃・150秒の反応を30サイクル)を行い、fadD遺伝子の全長とその上流300bpおよび下流100bpを含むDNA断片(配列番号6)を増幅した。
形質転換体の酸耐性をより明らかに確認するために低温保存後の酸耐性を測定した。上記実施例3に記載の培地で、1×108cell/mL以上の菌数となるよう一晩嫌気培養したHM0101株(培養後菌数:8.5×108cell/mL)およびHM0102株(培養後菌数:8.8×108cell/mL)の各培養液を4℃で嫌気静置保存した。保存0日目、7日目、14日目、19日目および29日目において、胃酸・胆汁酸連続処理を行い、両株の酸耐性を比較した。
胃酸・胆汁酸連続処理は、特許文献6に記載の人工胃液および人工胆汁を用いて以下のように行った。まず予め37℃で保温した人工胃液(pH3.3)10mLに、4℃で保存した培養液0.5mLを添加して撹拌し、37℃で60分間の胃酸処理を行った。さらに、胃酸処理後の溶液2mLに対して、人工胆汁(1.0% Oxgall)1mLと反応緩衝液(0.5%の塩化ナトリウム、0.1%の塩化カリウム、0.3%の炭酸水素ナトリウムを含有するpH8.0の緩衝液)5mLを添加して撹拌し、37℃で60分間の胆汁酸処理を連続的に行った。胃酸処理0分後、同60分後、胃酸・胆汁酸連続処理120分後の各処理液1mLを適宜希釈した後、TOSプロピオン酸寒天培地(ヤクルト薬品工業社製)に塗沫し、アネロパック(三菱ガス化学社製)を用いて37℃で72時間、嫌気的に培養した。出現したコロニー数に総希釈倍率を乗じて培養液1mL当たりの生菌数を求め、酸処理0分後の生菌数に対する、各処理後の生菌数の割合を生存率とした。
ここで、HM0102株は野生型のfadD遺伝子、HM0101株は変異型のfadD遺伝子を有し、それ以外の遺伝子は全く同一であることから、HM0102株はfadD遺伝子改変前微生物、HM0101株はfadD遺伝子改変微生物に相当する。
Claims (8)
- fadD遺伝子を有する微生物において、fadD遺伝子の発現を制御することを特徴とする、微生物の酸耐性調節方法。
- 酸耐性が、低温状態で機能が維持される酸耐性である請求項1記載の酸耐性調節方法。
- fadD遺伝子の発現を阻害又は抑制し、酸耐性を増強する、請求項1又は2記載の酸耐性調節方法。
- 相対転写量が1%以下である、請求項3記載の酸耐性調節方法。
- 相対転写量が0.1%以下である、請求項3又は4記載の酸耐性調節方法。
- 微生物がビフィドバクテリウム属細菌である請求項1〜5のいずれか1項記載の酸耐性調節方法。
- 微生物がビフィドバクテリウム・ブレーべである請求項1〜6のいずれか1項記載の酸耐性調節方法。
- fadD遺伝子及び/又はその発現産物の有無及び/又は発現量を測定することを特徴
とする酸耐性を有する微生物のスクリーニング方法。
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