ES2729099T3 - Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios - Google Patents

Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios Download PDF

Info

Publication number
ES2729099T3
ES2729099T3 ES14867867T ES14867867T ES2729099T3 ES 2729099 T3 ES2729099 T3 ES 2729099T3 ES 14867867 T ES14867867 T ES 14867867T ES 14867867 T ES14867867 T ES 14867867T ES 2729099 T3 ES2729099 T3 ES 2729099T3
Authority
ES
Spain
Prior art keywords
microorganism
acid resistance
gene
fadd gene
expression
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
ES14867867T
Other languages
English (en)
Inventor
Hoshitaka Matsumoto
Mika Miura
Mayumi Kiwaki
Tohru Iino
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Yakult Honsha Co Ltd
Original Assignee
Yakult Honsha Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Yakult Honsha Co Ltd filed Critical Yakult Honsha Co Ltd
Application granted granted Critical
Publication of ES2729099T3 publication Critical patent/ES2729099T3/es
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/93—Ligases (6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23C—DAIRY PRODUCTS, e.g. MILK, BUTTER OR CHEESE; MILK OR CHEESE SUBSTITUTES; MAKING THEREOF
    • A23C9/00—Milk preparations; Milk powder or milk powder preparations
    • A23C9/12—Fermented milk preparations; Treatment using microorganisms or enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L29/00—Foods or foodstuffs containing additives; Preparation or treatment thereof
    • A23L29/065—Microorganisms
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23L—FOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L33/00—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof
    • A23L33/10—Modifying nutritive qualities of foods; Dietetic products; Preparation or treatment thereof using additives
    • A23L33/135—Bacteria or derivatives thereof, e.g. probiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/66—Microorganisms or materials therefrom
    • A61K35/74—Bacteria
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/14—Prodigestives, e.g. acids, enzymes, appetite stimulants, antidyspeptics, tonics, antiflatulents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/746—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for lactic acid bacteria (Streptococcus; Lactococcus; Lactobacillus; Pediococcus; Enterococcus; Leuconostoc; Propionibacterium; Bifidobacterium; Sporolactobacillus)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/689—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for bacteria
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y602/00—Ligases forming carbon-sulfur bonds (6.2)
    • C12Y602/01—Acid-Thiol Ligases (6.2.1)
    • C12Y602/01003—Long-chain-fatty-acid-CoA ligase (6.2.1.3)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/156—Polymorphic or mutational markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/158—Expression markers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Nutrition Science (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Un método para regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo, que comprende controlar la expresión del gen fadD presente en el microorganismo.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un método para regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo, a un microorganismo modificado, y a un método de escrutinio para un microorganismo que tiene resistencia a los ácidos.
Antecedentes de la invención
En los últimos años, entre los microorganismos, han atraído la atención los microorganismos útiles que alcanzan el tracto intestinal en un estado viable y muestran efectos eficaces sobre la salud del anfitrión. Estos microorganismos útiles incluyen ciertas bacterias del género Lactobacillus o el género Bifidobacterium. Hasta ahora, se ha informado de una serie de efectos sobre la salud de bacterias del género Lactobacillus que incluyen, además de la regulación de las funciones intestinales, tales como la mejora del estreñimiento o la diarrea, una acción para reducir el riesgo de desarrollo de cáncer de mama (Bibliografía relacionada con patentes 1) y una capacidad para inducir la producción de interleucina-12 (Bibliografía relacionada con patentes 2), y una serie de efectos sobre la salud de bacterias del género Bifidobacterium que incluyen una acción inhibidora de la absorción de colesterol (Bibliografía relacionada con patentes 3) y una acción inhibidora de la actividad de la elastasa (Bibliografía relacionada con patentes 4).
Estos microorganismos útiles son necesarios para alcanzar el interior del tracto digestivo en un estado viable con el fin de actuar eficazmente en el tracto digestivo y ejercer efectos sobre la salud. Sin embargo, existe una variedad de entornos inhibidores del crecimiento o inhibidores del crecimiento tales como la temperatura, el pH, el oxígeno, la presión osmótica y un ácido hasta que los microorganismos útiles alcanzan el interior del tracto digestivo. Por lo tanto, es importante si estos microorganismos son o no resistentes a los entornos inhibidores del crecimiento o los inhibidores del crecimiento al utilizar estos microorganismos. En particular, un ácido es un factor importante para determinar si estas bacterias pueden o no alcanzar el tracto digestivo. Por lo tanto, se puede decir que la resistencia a los ácidos es una de las propiedades ventajosas para los microorganismos útiles.
Entre los microorganismos útiles, en particular, las bacterias del género Bifidobacterium son anaerobios obligados y vulnerables al oxígeno, el bajo pH y la acidez elevada y tienen varias dificultades de manejo, tales como la proliferación en el momento de la fabricación o la capacidad de supervivencia en el momento del almacenamiento en un alimento o bebida fermentados. Para obtener los efectos sobre la salud de las bacterias del género Bifidobacterium, se considera que es necesario que lleguen al intestino en un estado viable tantas bacterias como sea posible, y en particular, es un factor importante aumentar la capacidad de supervivencia de las bacterias en un alimento o bebida, es decir, la tasa de llegada de los mismos al intestino después de comer o beber. Por lo tanto, se puede decir que las bacterias del género Bifidobacterium que tienen una mayor resistencia a los ácidos y una mayor velocidad de llegada al intestino son muy necesarias.
Como microorganismos útiles que tienen resistencia a los ácidos, se conocen Lactobacillus casei YIT9029 del género Lactobacillus (Bibliografía relacionada con patentes 5), Bifidobacterium breve YIT12272 del género Bifidobacterium (Bibliografía relacionada con patentes 6) y similares. Estos microorganismos útiles que tienen resistencia a los ácidos están disponibles como una serie de productos comerciales en forma de diversos tipos de productos lácteos fermentados o preparaciones farmacéuticas viables. En particular, un alimento o bebida de leche fermentada tiene una excelente palatabilidad y, por lo tanto, es fácil de tomar o beber continuamente y es adecuado para la administración de estos microorganismos útiles.
Por otro lado, también es necesario debilitar la resistencia a los ácidos de los microorganismos en algunos casos, y por lo tanto, es significativamente importante regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo de la manera deseada.
En cuanto al mecanismo de regulación de la resistencia a los ácidos de los microorganismos, se menciona el bombeo de protones al exterior de la célula bacteriana por medio de una bomba de protones dependiente de ATP. Sin embargo, se presume que el mecanismo dependiente de ATP no funciona, ya que el ATP intracelular de los microorganismos se agota cuando los microorganismos se almacenan a una temperatura baja, y por lo tanto es deseable regular la resistencia a los ácidos de los microorganismos utilizando un mecanismo de regulación de la resistencia a los ácidos que funcione incluso en un estado de baja temperatura.
El gen fadD es un gen que se ha confirmado que está presente en algunos microorganismos y se supone que codifica una CoA ligasa de ácidos grasos de cadena larga, una enzima para convertir un ácido graso en acil-CoA. Sin embargo, la relación entre el gen fadD y la resistencia a los ácidos no se conocía hasta ahora.
Lista de referencias
Bibliografía relacionada con patentes
Bibliografía relacionada con patentes 1: WO-A-2011/049154
Bibliografía relacionada con patentes 2: JP-A-2009-155221
Bibliografía relacionada con patentes 3: WO-A-2007/029773
Bibliografía relacionada con patentes 4: WO 2011/083738
Bibliografía relacionada con patentes 5: JP-A-2003-219861
Bibliografía relacionada con patentes 6: WO 2011/105335
Compendio de la invención
Problemas a resolver por la invención
La presente invención consiste en proporcionar un método para regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo controlando la expresión del gen fadD y un método de escrutinio para un microorganismo que tiene resistencia a los ácidos utilizando el nivel de expresión del gen fadD como índice.
Medios para resolver los problemas
Los autores de la presente invención han analizado exhaustivamente los genes de una cepa concreta de Bifidobacterium breve que tiene resistencia a los ácidos y sus linajes entre las bacterias del género Bifidobacterium que son anaerobios obligados y generalmente no tienen resistencia a los ácidos, y han encontrado que el nivel de transcripción del gen fadD está significativamente suprimido en una cepa que muestra resistencia a los ácidos, que la resistencia a los ácidos de los microorganismos se puede regular mediante el control de la expresión del gen fadD, y que los microorganismos que tienen resistencia a los ácidos se pueden seleccionar a través del escrutinio utilizando el nivel de expresión del gen fadD o similares como índice.
Específicamente, la presente invención se refiere al objeto de estudio objeto de las reivindicaciones 1 a 10, en particular a los siguientes apartados 1) a 10).
1) Un método para regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo, que comprende controlar la expresión del gen fadD presente en el microorganismo.
2) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con el apartado 1), en donde la resistencia a los ácidos es la resistencia a los ácidos que mantiene una función en un estado de baja temperatura.
3) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con los apartados 1) o 2), en donde la resistencia a los ácidos se mejora inhibiendo o suprimiendo la expresión del gen fadD.
4) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con el apartado 3), en donde un nivel de transcripción relativo es de 1% o menos.
5) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con los apartados 3) o 4), en donde un nivel de transcripción relativo es de 0,1% o menos.
6) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con los apartados 1) a 5), en donde el microorganismo es una bacteria del género Bifidobacterium.
7) El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con los apartados 1) a 6), en donde el microorganismo es Bifidobacterium breve.
8) Un microorganismo modificado, en donde la resistencia a los ácidos está regulada por el método de acuerdo con el apartado 7), en donde se modifica la secuencia de un promotor que controla la transcripción del gen fadD, y en donde, en el promotor que controla la transcripción del gen fadD, una secuencia de bases 68 pb aguas arriba de una base del codón de inicio se muta de timina (T) a citosina (C).
9) Un alimento o bebida, o un producto farmacéutico, que comprende el microorganismo modificado de acuerdo con el apartado 8).
10) Un método de escrutinio para seleccionar un microorganismo que tiene resistencia a los ácidos, comprendiendo el método medir la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión del gen fadD y/o un producto de expresión del mismo.
Efectos de la invención
De acuerdo con la presente invención, es posible producir fácilmente un microorganismo modificado que tenga una mayor resistencia a los ácidos sin adquirir una cepa mutante que tenga resistencia a los ácidos mediante la mejora de la especie. La resistencia a los ácidos obtenida en la presente memoria se adquiere mediante la regulación de la expresión del gen fadD y es diferente de la resistencia a los ácidos que depende de ATP después del cultivo de los microorganismos y, por lo tanto, la función se ejerce incluso en un estado de baja temperatura. Además, el microorganismo modificado presenta una mayor capacidad de supervivencia in vivo y, por lo tanto, puede ejercer de manera más confiable los efectos sobre la salud que tienen los microorganismos. Además, el microorganismo modificado presenta una mayor capacidad de supervivencia en el almacenamiento a baja temperatura, y por lo tanto es posible prolongar el período de almacenamiento del producto. Además, es posible cultivar el microorganismo en un estado que tenga una mayor acidez en el momento de fabricar el producto y, por lo tanto, es posible aumentar el número de microorganismos en el cultivo inicial y recuperar del cultivo una gran cantidad de microorganismos de una sola vez.
Además, de acuerdo con la presente invención, es posible producir fácilmente un microorganismo modificado que muestra un debilitamiento de la resistencia a los ácidos. Un gran número de tales microorganismos modificados son eliminados por el ácido gástrico y, por lo tanto, se pueden utilizar como un microorganismo que no ejerce los efectos sobre la salud que tienen los microorganismos en el estómago.
Además, de acuerdo con el método de escrutinio de la presente invención, es posible seleccionar simplemente un microorganismo que tenga resistencia a los ácidos a través del escrutinio.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 es un diagrama para comparar las secuencias de bases en la región de un promotor que controla la transcripción del gen fadD en Bifidobacterium. El número de la base 1 pb aguas arriba de la base del codón de inicio se indica como -1. La porción rodeada por un cuadrado es el sitio en el que está presente la mutación.
La Fig. 2 es un gráfico que ilustra los niveles de transcripción relativos del gen fadD (con respecto a la cepa YIT 4008).
La Fig. 3 es un diagrama para producir un ADN plasmídico para la expresión del gen fadD.
La Fig. 4 es un gráfico que ilustra los niveles de transcripción relativos del gen fadD (con respecto a la cepa YIT 4008) de transformantes.
La Fig. 5 son gráficos que ilustran la tasa de supervivencia después del tratamiento continuo con ácido-ácido biliar.
Modos de llevar a cabo la invención
La secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 1) del gen fadD en la presente invención y una pluralidad de secuencias de nucleótidos que tienen una alta homología con esta se registran en la base de datos del NCBI, y se supone que el gen fadD codifica una CoA ligasa de ácidos grasos de cadena larga, que es una enzima que convierte un ácido graso en acil-CoA.
En la presente invención, controlar la expresión del gen fadD incluye inhibir o suprimir la expresión del gen fadD o potenciar o introducir de nuevo la expresión del gen fadD. Es posible potenciar la resistencia a los ácidos mediante la inhibición o la supresión de la expresión del gen fadD, y es posible debilitar la resistencia a los ácidos aumentando o introduciendo nuevamente la expresión del gen fadD.
En la presente invención, el microorganismo diana en el que se controla la expresión del gen fadD no está particularmente limitado. Sin embargo, los ejemplos de los mismos pueden incluir adecuadamente bacterias gram positivas, bacterias gram negativas y levaduras útiles cuya resistencia a los ácidos se desea potenciar. Entre ellos, son preferibles las bacterias gram positivas, y en particular, son preferibles las bacterias del género Lactobacillus y las bacterias del género Bifidobacterium cuya seguridad para el organismo vivo ha sido confirmada.
En cuanto a las bacterias del género Lactobacillus, es preferible utilizar bacterias pertenecientes al grupo de Lactobacillus casei, tales como Lactobacillus casei, Lactobacillus paracasei, Lactobacillus zeae y Lactobacillus rhamnosus, y es posible utilizar Lactobacillus casei y Lactobacillus rhamnosus en particular.
Además, los ejemplos de las bacterias del género Bifidobacterium pueden incluir Bifidobacterium breve, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium adolescentis, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, y Bifidobacterium angulatum, y es posible utilizar adecuadamente Bifidobacterium breve en particular.
Las bacterias del género Bifidobacterium que muestran efectos fisiológicos útiles para el ser humano son adecuadas como diana de aplicación de la presente invención, ya que son anaerobios obligados y vulnerables al oxígeno, el pH bajo y la alta acidez y tienen varias dificultades en el manejo, tales como la proliferación en el momento de la fabricación o la capacidad de supervivencia en el momento del almacenamiento.
En la presente invención, la inhibición o supresión del gen fadD incluyen típicamente (i) inhibir o suprimir la transcripción del gen fadD al ARNm de fadD y (ii) inhibir o suprimir la traducción del ARNm de fadD en la proteína fadD. Sin embargo, no se limita a esto.
Para la inhibición de la expresión del gen fadD, el gen se puede desorganizar o eliminar a través del método de inactivación por inserción en el que un fragmento de ADN completamente diferente de un gen diana se inserta en el gen, o el método de doble entrecruzamiento por etapas en el que la totalidad o una porción de un gen diana se elimina mediante recombinación homóloga por etapas. Particularmente, el método de doble entrecruzamiento por etapas se emplea de manera preferible.
Específicamente, cuando se elimina la totalidad o una porción del gen fadD, dos regiones que forman un sándwich con la región de deleción se separan del ADN cromosómico o se separan después de la amplificación por PCR, y los dos fragmentos de ADN se clonan en un vector plasmídico (p. ej., pYSSE3) que puede replicar en Escherichia coli pero no en un microorganismo de interés, de modo que los fragmentos estén alineados en la misma dirección que la dirección original. Posteriormente, el ADN plasmídico recombinante resultante se introduce, mediante electroporación o una técnica similar, en un microorganismo en el que se hace que se produzca la deleción. A través de la PCR o una técnica similar, se selecciona, a partir de los clones resistentes a los antibióticos resultantes, un clon en el que el plásmido ha sido insertado en el cromosoma mediante recombinación en una región homóloga a la región clonada anterior aguas arriba o aguas abajo de la región de deleción diana. El clon obtenido de este modo se subcultiva repetidamente en un medio que no contiene antibióticos, para seleccionar de ese modo los clones que han perdido resistencia a los antibióticos mediante la eliminación del plásmido del cromosoma por recombinación entre regiones homólogas flanqueantes y por la desaparición del plásmido en el crecimiento bacteriano. A través de la PCR o una técnica similar, se puede seleccionar, entre los clones así obtenidos, un clon en el que se haya eliminado la región del gen fadD.
La supresión de la expresión del gen fadD se puede llevar a cabo a través del llamado método de interferencia de ARN, en el que se sintetiza un fragmento corto de ARN complementario de la región del extremo 5' del ARNm del gen, o un método en el que un gen regulador o una región para controlar la expresión del gen se interrumpen o se eliminan. Particularmente, se prefiere la modificación de una región para controlar la expresión del gen. Específicamente, el nivel de transcripción del gen fadD en ARNm se puede aumentar o reducir modificando la secuencia de un promotor para controlar la transcripción del gen fadD. Como se emplea en la presente memoria, reducir el nivel de transcripción del gen fadD en ARNm se refiere a que el nivel de transcripción relativo se reduce 1% o menos y preferiblemente 0,1% o menos. El nivel relativo de transcripción se refiere a aquél que se obtiene al dividir el nivel de expresión del gen fadD en un microorganismo que tiene un gen fadD de tipo modificado por el nivel de expresión (por ejemplo, nivel de expresión de ARNm) del gen fadD en un microorganismo que tiene un gen fadD de tipo salvaje entre los microorganismos de la misma especie. Como se emplea en la presente memoria, el microorganismo que tiene un gen fadD de tipo salvaje se refiere a un microorganismo en el que la secuencia de bases del gen fadD o su promotor no está mutada y la expresión del gen fadD no está potenciada o introducida o inhibida o suprimida, y un microorganismo que tiene un gen fadD de tipo modificado se refiere a un microorganismo en el que la expresión del gen fadD se potencia, introduce o inhibe o suprime mediante la modificación o similar de la secuencia de bases del gen fadD o su promotor.
Además, como se usa emplea en la presente memoria, modificar la secuencia del promotor se refiere a un caso en el que una porción de las bases (por ejemplo, de aproximadamente 1 a 20 bases, preferiblemente de 1 a 10 bases, y más preferiblemente de 1 a 5 bases) que constituyen el fragmento de ADN en la región promotora se ha sustituido o eliminado o un caso en el que se añaden o insertan de 1 a varias bases (por ejemplo, de 1 a 10 bases y preferiblemente de 1 a 5 bases). Por ejemplo, en el promotor del gen fadD, se refiere a que la secuencia de bases de 68 pb aguas arriba de una base del codón de inicio está sustituida de timina (T) a citosina (C).
Mientras tanto, la potenciación de la expresión del gen fadD se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante un método en el que un plásmido recombinante que porta el gen se introduce en un microorganismo de interés; un método en el que el gen se integra en otro sitio del cromosoma a través de recombinación específica del sitio, para aumentar así el número de copias del gen en un microorganismo; o un método en el que el nivel de expresión del gen se incrementa modificando una región promotora del gen e incrementando el nivel de transcripción del gen a ARNm. Es particularmente preferido un método para incrementar el número de copias del gen.
La introducción del gen fadD en otro microorganismo se puede llevar a cabo, por ejemplo, mediante el método de competición que utiliza la capacidad de absorción de ADN, el método de PEG con protoplastos que utiliza un protoplasto, o la electroporación mediante pulsos de alto voltaje. Además, la integración del gen fadD en el cromosoma de un microorganismo se puede llevar a cabo mediante recombinación homóloga o integración específica del sitio.
Adicionalmente, como un método específico para aumentar el número de copias del gen fadD, se puede mencionar un método en el cual el gen fadD (que incluye la secuencia promotora original y el sitio de unión al ribosoma del gen) o el polinucleótido (preparado ligando solamente una región codificante de polipéptido del gen aguas abajo de un promotor y un sito de unión al ribosoma que se ha separado de otro gen o se ha sintetizado químicamente) se clona en un plásmido que tiene una pluralidad de copias por célula microbiana, y se introduce el plásmido en células microbianas a través de electroporación o una técnica similar. Mediante el uso del método, se puede incrementar el número de copias del gen en las células microbianas.
En la presente invención, se puede emplear un microorganismo modificado que ha sido regulado para mostrar una mayor resistencia a los ácidos mediante el control de la expresión del gen fadD para producir un alimento, bebida o producto farmacéutico que muestran eficazmente varios efectos fisiológicos que son intrínsecos al microorganismo, ya que la resistencia a los ácidos del mismo se ha potenciado. Además, se puede emplear un microorganismo modificado que ha sido regulado para mostrar una débil resistencia a los ácidos, por ejemplo, un microorganismo que muestra varios efectos fisiológicos que son intrínsecos al microorganismo antes de que llegue al estómago y que no actúa en el estómago.
Como se emplea en la presente memoria, resistencia a los ácidos significa resistencia a todos los ácidos que tiene un microorganismo de interés, en particular, ácidos gástricos o ácidos biliares, y más específicamente, se refiere a la resistencia a los ácidos que funciona incluso en un estado de baja temperatura. Es decir, la resistencia a los ácidos es claramente diferente de la resistencia a los ácidos dependiente de ATP que se supone que no funciona en un estado de baja temperatura.
Como se emplea en la presente memoria, el estado de baja temperatura significa estar en un estado de 0 a 10°C. Específicamente, se menciona el almacenamiento en un estado de baja temperatura (almacenamiento a baja temperatura), y sus ejemplos incluyen el almacenamiento a 10°C o menos durante 7 días o más, el almacenamiento a 5°C o menos durante 14 días o más, y el almacenamiento a 4°C o menos durante 14 días o más.
La potenciación de la resistencia a los ácidos significa que la resistencia a los ácidos del microorganismo modificado se potencia en comparación con el microorganismo antes de modificarse, ya que la expresión del gen fadD se inhibe o se suprime modificando el gen fadD o su promotor del microorganismo. Más específicamente, se menciona la propiedad que consiste en que la tasa de supervivencia (la proporción del número de bacterias vivas después de un tratamiento con ácido gástrico con respecto al número de bacterias vivas antes del tratamiento con ácido gástrico) del microorganismo modificado es 5 o más veces y preferiblemente 10 o más veces mayor en comparación con la tasa de supervivencia del microorganismo antes de ser modificado cuando el microorganismo modificado que ha sido cultivado a 1 x 108 células/mL o más se almacena a baja temperatura en condiciones de 4°C durante 7 días y a continuación se trata con ácido gástrico a 37°C durante 60 minutos. Alternativamente, se menciona la propiedad que consiste en que la tasa de supervivencia es 30 o más veces y preferiblemente 50 o más veces mayor cuando se almacena en condiciones de 4°C durante 14 días o que la tasa de supervivencia es 100 o más veces y preferiblemente 150 o más veces más alta cuando se almacena en condiciones de 4°C durante 19 días. Además, se menciona la propiedad que consiste en que la tasa de supervivencia (la proporción del número de bacterias vivas después de un tratamiento continuo de ácido gástrico-ácido biliar con respecto al número de bacterias vivas antes del tratamiento continuo de ácido gástrico-ácido biliar) del microorganismo modificado es 10 o más veces y preferiblemente 30 o más veces más alta en comparación con la tasa de supervivencia del microorganismo antes de ser modificado cuando el microorganismo modificado que ha sido cultivado a 1 x 108 células/mL o más se almacena a una temperatura baja en condiciones de 4°C durante 7 días, a continuación se trata con ácido gástrico a 37°C durante 60 minutos y se trata adicionalmente con ácido biliar a 37°C durante 60 minutos, o se menciona la propiedad que consiste en que la tasa de supervivencia es 100 o más veces y preferiblemente 200 o más veces más alta cuando se almacena en condiciones de 4°C durante 14 días. Como se emplea en la presente memoria, como ácido gástrico y ácido biliar, por ejemplo, se pueden emplear jugo gástrico artificial (pH: 3,3) y bilis artificial (bilis bovina al 1,0% (Oxgall)) descritos en el documento WO 2011/105335.
Cuando el microorganismo modificado de la presente invención se incorpora a un alimento o bebida o en un producto farmacéutico, se pueden emplear células vivas, células calentadas (células muertas) o células liofilizadas del microorganismo. Alternativamente, se puede emplear un producto cultivado que contiene el microorganismo, o se pueden emplear células procesadas del microorganismo. Preferiblemente, se emplean células vivas del microorganismo.
Cuando el microorganismo modificado de la presente invención se emplea en un producto farmacéutico, el microorganismo se puede mezclar con un portador no tóxico farmacéutico sólido o líquido, y la mezcla se puede administrar en forma de un producto farmacéutico convencional. Los ejemplos de tal producto farmacéutico incluyen productos sólidos tales como comprimidos, gránulos, polvo y cápsulas; productos líquidos tales como soluciones, suspensiones y emulsiones; y productos liofilizados. Tal producto farmacéutico se puede preparar mediante una técnica habitual para la producción farmacéutica. Los ejemplos del portador no tóxico farmacéutico mencionado anteriormente incluyen glucosa, lactosa, sacarosa, almidón, manitol, dextrina, glicérido de ácido graso, polietilenglicol, hidroxietilalmidón, etilenglicol, éster de ácido graso de polioxietilen sorbitán, aminoácidos, gelatina, albúmina, agua y solución salina. Si fuera necesario, el producto farmacéutico puede contener adecuadamente un aditivo convencional tal como un estabilizador, un humectante, un emulsionante, un aglutinante, un agente osmótico o un excipiente.
El microorganismo modificado de la presente invención también se puede incorporar a un alimento o bebida además del producto farmacéutico mencionado anteriormente. Cuando el microorganismo se incorpora a un alimento o bebida, el microorganismo se puede emplear tal cual o mezclar con diversos ingredientes nutricionales. El alimento o bebida resultante se puede emplear para producir un alimento saludable o material alimentario que exhibe eficazmente diversos efectos fisiológicos que son intrínsecos al microorganismo, ya que la resistencia a los ácidos se ha regulado de una manera deseada. Específicamente, cuando el microorganismo modificado obtenido a través del método de la presente invención se incorpora a un alimento o bebida, el microorganismo se puede mezclar apropiadamente con un aditivo que se puede emplear en un alimento o bebida, y la mezcla se puede preparar, por medios convencionales, en una forma adecuada para uso comestible; por ejemplo, gránulos, partículas, comprimidos, cápsulas o pasta. El microorganismo se puede añadir a una variedad de alimentos; por ejemplo, productos cárnicos procesados (p. ej., jamón y salchichas), productos pesqueros procesados (p. ej., kamaboko y chikuwa), pan, confitería, mantequilla y leche en polvo. Alternativamente, el microorganismo se puede añadir a bebidas tales como agua, zumo de frutas, leche, bebidas refrescantes y bebidas de té. Como se emplea en la presente memoria, el alimento o bebida abarca alimentos para animales.
Los ejemplos de los alimentos o bebidas de la presente invención incluyen alimentos y bebidas fermentados producidos por el uso del microorganismo de la presente invención, tales como leche fermentada, bebidas con bacterias de ácido láctico, leche de soja fermentada, zumo de fruta fermentada y extracto de plantas fermentadas. Tal comida o bebida fermentada se puede producir a través de un método habitual. Por ejemplo, un producto lácteo fermentado se puede producir a través del siguiente procedimiento. En primer lugar, solo el microorganismo modificado de la presente invención se inocula en un medio de leche esterilizado, o el microorganismo modificado y otro microorganismo se inoculan simultáneamente al medio, seguido de cultivo, y el producto cultivado se homogeneiza para producir así una base de leche fermentada. Posteriormente, se añade un jarabe preparado por separado y se mezcla con la base de leche fermentada, y la mezcla se homogeneiza por medio de, por ejemplo, un homogeneizador, seguido de la adición de un sabor a la mezcla resultante, para así producir un producto final. El producto lácteo fermentado producido de este modo puede estar en cualquier forma, tal como un producto de tipo plano que no contiene jarabe (edulcorante), un producto de tipo blando, un producto de tipo de sabor a fruta, un producto sólido o un producto líquido.
El microorganismo producido a través del método de la presente invención y regulado para exhibir una mayor resistencia a los ácidos exhibe una alta resistencia a los ácidos incluso en un estado de baja temperatura, y por lo tanto exhibe una alta capacidad de supervivencia en un producto que contiene ácido. Por lo tanto, la reducción del número de células vivas o el aumento en la tasa de muerte celular se suprimen durante el almacenamiento a baja temperatura del producto. Además, la especificación del producto se mantiene fácilmente, y el producto exhibe eficazmente efectos fisiológicos generales (p. ej., regulación de las funciones intestinales) de un microorganismo (p. ej., una bacteria del género Lactobacillus). Cuando la resistencia a los ácidos de una cepa bacteriana del género Lactobacillus o Bifidobacterium que originalmente tiene un efecto fisiológico específico (p. ej., el efecto anticanceroso o el efecto de erradicación de Helicobacter pylori) se potencia a través del método de la presente invención, la cepa bacteriana se puede aplicar a varios alimentos y bebidas, y el efecto fisiológico de la cepa bacteriana se puede potenciar en virtud de la mejora de la capacidad de supervivencia de la cepa bacteriana.
Además, el microorganismo producido a través del método de la presente invención y regulado para exhibir una resistencia a los ácidos debilitada es destruido principalmente por el ácido gástrico. Por lo tanto, el microorganismo puede ser utilizado como un microorganismo que exhibe varios efectos fisiológicos que son intrínsecos al microorganismo antes de llegar al estómago y no actúa en el estómago.
Como se describió anteriormente, la resistencia a los ácidos de los microorganismos aumenta cuando se inhibe o suprime la expresión del gen fadD. Por lo tanto, se puede seleccionar un microorganismo que exhibe resistencia a los ácidos a través del escrutinio utilizando el nivel de expresión del gen fadD y/o un producto de expresión del mismo como índice. Es decir, el microorganismo que exhibe resistencia a los ácidos se puede seleccionar a través de escrutinio midiendo la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión del gen fadD y/o un producto de expresión del mismo. Los ejemplos de un producto de expresión de un gen pueden incluir ARNm y un polipéptido, y los ejemplos del polipéptido pueden incluir un polipéptido de una secuencia de aminoácidos representada por SEC ID NO: 9.
Para la medición del nivel de expresión del gen fadD y/o un producto de expresión del mismo, la presencia o ausencia del gen fadD en un microorganismo, el número de copias del gen o el nivel de expresión del mismo se determina mediante hibridación de Southern, hibridación Northern, micromatrices de ADN o RT-PCR mediante el uso de una sonda o cebador que pueda detectar el gen fadD o el ARNm derivados de allí. Alternativamente, la cantidad de un polipéptido se determina mediante el método de absorción ultravioleta, espectrofotometría tal como el método BCA (método del ácido bicinconínico) o el método de Lowry, o la electroforesis. Un microorganismo de interés (microorganismo que tiene resistencia a los ácidos) se selecciona basándose en la presencia o ausencia del gen fadD o un producto de expresión del mismo o el nivel de expresión del mismo.
Con el fin de realizar con eficacia la modificación mencionada anteriormente del gen o el escrutinio de microorganismos, preferiblemente, se emplea un vector recombinante que contiene el polinucleótido de SEC ID NO: 1 o una porción del mismo, un cebador para PCR o RT-PCR que contiene una porción (fragmento) del polinucleótido de SEQ ID NO: 1, un cebador para PCR o RT-PCR que puede amplificar el polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o una porción del mismo, o un fragmento de ácido nucleico para hibridación que contiene un polinucleótido que hibrida específicamente con el polinucleótido de SEQ ID NO: 1 o una porción del polinucleótido.
El fragmento de ácido nucleico (por ejemplo, cebador) que se puede emplear en la presente invención es generalmente, por ejemplo, un nucleótido sintetizado químicamente sobre la base de la información sobre la secuencia de nucleótidos del gen de la presente invención. Preferiblemente, dicho nucleótido tiene una secuencia parcial de nucleótidos correspondiente a la secuencia de nucleótidos de SEC ID NO: 1, e incluye de 10 a 50 nucleótidos consecutivos (preferiblemente de 15 a 35 nucleótidos consecutivos).
La presente invención se describirá a continuación con más detalle por medio de los Ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1 Confirmación del sitio de mutación en la región promotora del gen fadD
Las secuencias de bases en la vecindad del gen fadD de Bifidobacterium breve YIT 12272 (FERM BP-11320) que tienen resistencia a los ácidos y Bifidobacterium breve YIT 4008 (FERM BP-4538) y Bifidobacterium breve YIT 4065 (FERM BP-6223) que fueron sus linajes se determinaron mediante el método del terminador con colorante de acuerdo con el método convencional y se compararon entre sí. Como resultado, se ha considerado que existe la posibilidad de que la secuencia de bases de 68 pb aguas arriba de la base del codón de inicio en el promotor del gen fadD en YIT 12272 haya sido mutada de timina (T) a citosina (C), lo que da como resultado un cambio en el nivel de transcripción del gen fadD. El sitio de mutación en el promotor del gen fadD se ilustra en la Fig. 1.
Ejemplo 2 Análisis del nivel de transcripción del gen fadD
Bifidobacterium breve YIT 12272 con resistencia a los ácidos y Bifidobacterium breve YIT 4008 y Bifidobacterium breve YIT 4065, que eran sus linajes, se cultivaron anaerobiamente a 37°C utilizando medio MILS (Iwata y Morishita, Letter in Applied Microbiology, vol. 9, 165-168, 1989). Para el cultivo anaerobio, la fase gaseosa se reemplazó por gas nitrógeno, el cierre se realizó con un tapón de butilo, seguido de un cultivo estático.
El ARN total se extrajo de cada cepa en la fase de crecimiento logarítmico utilizando el RNeasy Mini Kit (fabricado por QIAGEN). A continuación, se preparó una solución de ADNc utilizando 1 |jg de ARN y el Kit de Síntesis de ADNc de la 1a hebra PrimeScript (fabricado por TAKARA BIO INC.). Se realizó una PCR en tiempo real (95°C durante 30 segundos, seguida de 40 ciclos de 95°C durante 5 segundos y 60°C durante 34 segundos) utilizando la solución de ADNc preparada a partir de cada cepa como molde, la SYBR Premix Ex Taq. (fabricada por TAKARA BIO INC.) y los cebadores mostrados en la Tabla 1 con el ABI PRISM 7500 (fabricado por Applied Biosystems por Thermo Fisher Scientific Inc.), para medir así los niveles de transcripción del gen fadD y el gen de ARN 16S. Cabe señalar que la corrección entre muestras se realizó utilizando el nivel de transcripción del gen de ARN 16S como un patrón interno.
Tabla 1
Figure imgf000008_0001
El nivel de transcripción del gen fadD en cada cepa se ilustra en la Fig. 2 como un valor relativo con respecto a YIT 4008 que tiene un gen fadD de tipo salvaje. El nivel de transcripción del gen fadD en YIT 4065 fue comparable al de YIT 4008. Sin embargo, el nivel de transcripción se redujo en gran medida en YIT 12272 en el que se produjo una mutación aguas arriba del gen fadD, y el nivel de transcripción relativo del mismo fue de 0,1% o menos en comparación con el de YIT 4008 y fue de 0,1% o menos incluso en comparación con el de YIT 4065.
Ejemplo 3 Producción de transformante con un gen fadD de tipo salvaje introducido y nivel de transcripción relativo del gen fadD en el transformante
Para examinar la influencia del gen fadD sobre la resistencia a los ácidos, se preparó una cepa HM0102 transformante obtenida introduciendo el promotor del gen fadD y el gen fadD derivado de y It 4008 en YIT 12272. Primero, se realizó la PCR (30 ciclos de 96°C durante 15 segundos, 60°C durante 30 segundos y 72°C durante 150 segundos) utilizando el a Dn genómico de YIT 4008 como molde, el KOD-Plus- (TOYOBO CO., LTD.) Y los cebadores mostrados en la Tabla 2 con el iCycler (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.), para amplificar así un fragmento de ADN (SEQ ID NO: 6) que contiene el gen fadD completo, 300 pb aguas arriba del mismo, y 100 pb aguas abajo del mismo.
Tabla 2
Figure imgf000009_0001
La porción subrayada indica la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción.
El fragmento de ADN amplificado y el vector pBEA4 descritos en JP-A-H10-262670 fueron digeridos con la enzima de restricción EcoRI de acuerdo con el método convencional descrito en la misma bibliografía. Los fragmentos digeridos resultantes se ligaron utilizando el kit de ligación de ADN Ver. 2.1 (fabricado por TAKARA BIO INC.), para producir así un ADN plasmídico para la expresión del gen fadD bajo el control del promotor original. El diagrama de preparación del ADN plasmídico se ilustra en la Fig. 3.
El ADN plasmídico se introdujo en Bifidobacterium breve YIT 12272 mediante el método de electroporación. La electroporación se realizó utilizando el GENE PULSER II (fabricado por Bio-Rad Laboratories, Inc.) en las condiciones de 200, 25 pF y 18 kv/cm. Posteriormente, la solución de reacción de electroporación se extendió sobre el medio de agar MILS con un suplemento de 3 pg/mL de eritromicina y se cultivó anaerobiamente a 37°C durante 72 horas utilizando el AnaeroPack (fabricado por MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC.). La colonia así producida se obtuvo como la cepa HM0102 transformante, el ADN plasmídico se extrajo por el método alcalino de acuerdo con el método convencional, y se confirmó que el ADN plasmídico introducido se retuvo.
Mientras tanto, como control de la cepa HM0102, la cepa HM0101 se produjo introduciendo el vector pBEA4 solo en YIT 12272 de una manera similar.
El nivel de expresión del gen fadD se midió para las tres cepas de YIT 12272, la cepa HM0101 y la cepa HM0102 por medio del método descrito en el Ejemplo 2. Se debe observar que el cultivo de la cepa HM0101 y la cepa HM0102 que fueron los transformantes se realizaron utilizando el medio Y-MILS obtenido ajustando la concentración de extracto de levadura del medio MILS a 1,5% y añadiendo eritromicina para obtener una concentración final de 3 pg/mL.
Como resultado de la medición del nivel de transcripción del gen fadD de cada cepa, se encontró que el nivel de transcripción del gen fadD es alto en la cepa HM0102 en la que se han introducido un promotor del gen fadD de tipo salvaje y el gen fadD en comparación con YIT 12272 y la cepa HM0101. El nivel de transcripción del gen fadD en cada cepa se ilustra en la Fig. 4 como un valor relativo con respecto al nivel de transcripción del gen fadD en YIT 4008.
Ejemplo 4 Medición de la resistencia a los ácidos del transformante.
La resistencia al ácido después del almacenamiento a baja temperatura se midió para confirmar más claramente la resistencia al ácido del transformante. Cada solución de cultivo de la cepa HM0101 (número de bacterias después del cultivo: 8,5 * 108 células/mL) y la cepa HM0102 (número de bacterias después del cultivo: 8,8 * 108 células/mL) que habían sido cultivadas anaerobiamente durante una noche a 1 * 108 células/mL o más se almacenaron anaerobiamente y estáticamente a 4°C en el medio descrito en el Ejemplo 3 anterior. Las soluciones de cultivo se sometieron al tratamiento continuo con ácido gástrico-ácido biliar los días 0, 7, 14, 19 y 29 después del inicio del almacenamiento, y se comparó la resistencia a los ácidos de ambas cepas entre sí.
El tratamiento continuo con ácido gástrico/ácido biliar se realizó de la siguiente manera utilizando jugo gástrico artificial y bilis artificial descritos en la Bibliografía Relacionada con Patentes 6. En primer lugar, se añadieron 0,5 mL de la solución de cultivo que se había almacenado a 4°C a 10 mL del jugo gástrico artificial (pH 3,3) que se había mantenido caliente a 37°C de antemano, y la mezcla se agitó para realizar el tratamiento con ácido gástrico a 37°C durante 60 minutos. A continuación, se añadieron 1 mL de bilis artificial (1,0% de Oxgall) y 5 mL de un tampón de reacción (solución de tampón que contenía 0,5% de cloruro de sodio, 0,1% de cloruro de potasio y 0,3% de hidrógeno de sodio y que tenía un pH de 8,0) a 2 mL de la solución después de haber sido sometida al tratamiento con ácido gástrico, y la mezcla se agitó para realizar continuamente el tratamiento con ácido biliar a 37°C durante 60 minutos. Un mililitro de cada una de las soluciones tratadas a los 0 minutos y 60 minutos después del tratamiento con ácido gástrico y 120 minutos después de que el ácido gástrico y el tratamiento continuo con ácido biliar se diluyeran adecuadamente, se aplicaron mediante frotis en el medio de agar con ácido propiónico TOS (fabricado por Yakult Pharmaceutical Industry Co., Ltd.), y se cultivó anaerobiamente con el AnaeroPack (fabricado por MITSUBISHI GAS CHEMICAL COMPANY, INC.) a 37°C durante 72 horas. El número de colonias formadas se multiplicó por el factor de dilución total para determinar el número de bacterias vivas por 1 mL de la solución de

Claims (10)

REIVINDICACIONES
1. Un método para regular la resistencia a los ácidos de un microorganismo, que comprende controlar la expresión del gen fadD presente en el microorganismo.
2. El método para regular la resistencia a los ácidos según la reivindicación 1, en donde la resistencia a los ácidos es una resistencia a los ácidos que mantiene una función en un estado de baja temperatura.
3. El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde la resistencia a los ácidos se potencia inhibiendo o suprimiendo la expresión del gen fadD.
4. El método para regular la resistencia al ácido según la reivindicación 3, en donde un nivel de transcripción relativo es de 1% o menos.
5. El método para regular la resistencia al ácido de acuerdo con la reivindicación 3 o 4, en donde un nivel de transcripción relativo es de 0,1% o menos.
6. El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el microorganismo es una bacteria del género Bifidobacterium.
7. El método para regular la resistencia a los ácidos de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde el microorganismo es Bifidobacterium breve.
8. Un microorganismo modificado, en donde la resistencia a los ácidos se regula mediante el método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde una secuencia de un promotor que controla la transcripción del gen fadD se modifica, y en donde, en el promotor que controla la transcripción del gen fadD, una secuencia de bases de 68 pb aguas arriba de una base de codón de inicio se muta de timina (T) a citosina (C).
9. Un alimento, bebida o producto farmacéutico, que comprende el microorganismo modificado de acuerdo con la reivindicación 8.
10. Un método de selección para seleccionar un microorganismo que tiene resistencia a los ácidos, comprendiendo el método medir la presencia o ausencia y/o el nivel de expresión del gen fadD y/o un producto de expresión del mismo.
ES14867867T 2013-12-04 2014-12-03 Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios Active ES2729099T3 (es)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2013251362 2013-12-04
PCT/JP2014/081987 WO2015083743A1 (ja) 2013-12-04 2014-12-03 微生物の酸耐性調節方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
ES2729099T3 true ES2729099T3 (es) 2019-10-30

Family

ID=53273504

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
ES14867867T Active ES2729099T3 (es) 2013-12-04 2014-12-03 Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios

Country Status (7)

Country Link
US (1) US9957496B2 (es)
EP (1) EP3081643B1 (es)
JP (1) JP6541576B2 (es)
KR (1) KR102333252B1 (es)
CN (1) CN105793412B (es)
ES (1) ES2729099T3 (es)
WO (1) WO2015083743A1 (es)

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP3946300B2 (ja) 1997-03-27 2007-07-18 株式会社ヤクルト本社 ビフィズス菌用シャトルベクター及びビフィズス菌プラスミドの複製タンパク質遺伝子
JP4076351B2 (ja) 2002-01-25 2008-04-16 株式会社ヤクルト本社 高生残性ラクトバチルス属細菌およびその利用
BRPI0615785B8 (pt) 2005-09-08 2021-05-25 Yakult Honsha Kk composição inibidora da absorção de colesterol compreendendo bactérias do gênero bifidobacterium
JP2007175016A (ja) * 2005-12-28 2007-07-12 Ajinomoto Co Inc Ｌ−グルタミン酸生産菌及びｌ−グルタミン酸の製造方法
JP5209294B2 (ja) 2007-12-25 2013-06-12 株式会社ヤクルト本社 インターロイキン１２産生促進剤
CA3038491A1 (en) * 2008-10-07 2010-04-15 REG Life Sciences, LLC Bacterial host cells engineered to express a carboxylic acid reductase and a thioesterase
ES2701501T3 (es) 2008-10-28 2019-02-22 Reg Life Sciences Llc Célula microbiana para producir alcoholes grasos
EP2471544B1 (en) 2009-10-22 2016-05-25 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Lactobacillus casei for use in reducing risk of developing cancer
EP2522355B1 (en) 2010-01-06 2018-02-21 Kabushiki Kaisha Yakult Honsha Dna damage repair promoter for oral application, and elastase activity inhibitor for oral application
MX2012009799A (es) 2010-02-24 2012-09-12 Yakult Honsha Kk Metodo para construir una nueva bacteria perteneciente al genero bifidobacterium.
WO2013105807A2 (ko) * 2012-01-11 2013-07-18 한국과학기술원 신규한 합성 조절 srna 및 그 제법
WO2014012055A1 (en) * 2012-07-13 2014-01-16 Calysta Energy, Llc Biorefinery system, methods and compositions thereof

Also Published As

Publication number Publication date
JPWO2015083743A1 (ja) 2017-03-16
KR20160093006A (ko) 2016-08-05
US20170022491A1 (en) 2017-01-26
CN105793412A (zh) 2016-07-20
EP3081643A4 (en) 2017-07-05
EP3081643A1 (en) 2016-10-19
KR102333252B1 (ko) 2021-11-30
WO2015083743A1 (ja) 2015-06-11
JP6541576B2 (ja) 2019-07-10
US9957496B2 (en) 2018-05-01
EP3081643B1 (en) 2019-05-29
CN105793412B (zh) 2022-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Bron et al. Genetic characterization of the bile salt response in Lactobacillus plantarum and analysis of responsive promoters in vitro and in situ in the gastrointestinal tract
JP2013511261A (ja) 組換え微生物
US20140227789A1 (en) Stress tolerant bifidobacteria
SG183481A1 (en) Method for constructing novel bacterium belonging to the genus bifidobacterium
BRPI0609093A2 (pt) linhagens de bactérias de ácido láctico sensìveis a antibióticos
Du et al. The influence of surface proteins on the probiotic effects of Lactobacillus pentosus HC-2 in the Litopenaeus vannamei hepatopancreas
EP2287299A1 (en) Gene that imparts oxygen resistance and application thereof
Suardana et al. Probiotic potency and molecular identification of lactic acid bacteria isolated from Bali cattle’s colon, Indonesia
ES2729099T3 (es) Método para regular la resistencia a los ácidos de microbios
US9139837B2 (en) Hydrogen peroxide resistance-imparting gene and method for using same
WO2014142186A1 (ja) ビフィドバクテリウム・ブレーベ株特異的遺伝子
JP7066593B2 (ja) 藻類改変体を含む飲食品、飼料、又は餌料
Lee et al. Expression of the sweet-tasting protein brazzein in Lactobacillus spp.
Mullekom et al. Genetic Characterization of the Bile Salt
Busi Studies on the selection of a strain of lactic acid bacteria to grow at optimal conditions for the production of probiotics
Su Factors contributing to the competitiveness of Lactobacillus reuteri in sourdough and rodent gut
Bron et al. Molecular analysis of host–microbe interactions in the gastrointestinal tract