BRPI0609093A2 - linhagens de bactérias de ácido láctico sensìveis a antibióticos - Google Patents

Abstract

LINHAGENS DE BACTéRIAS DE áCIDO LáCTICO SENSìVEIS A ANTIBIóTICOS. Muitas Bifidobacteriaceas probjóticas contêm um tetW ativo que torna as células resistentes à tetraciclina. Isto pode apresentar um risco de transferência horizontal de genes antibióticos funcionais. A presente invenção refere-se a um processo de obtenção de novas cepas sensíveis à tetraciclina do gênero de Bifidobacteriacea (Bifidobacterium sp.). Em particular, a presente invenção refere-se a novas cepas sensíveis a antibióticos obtidas partindo de cepas resistentes a antibióticos e ao uso de tais novas cepas para a preparação de um alimento ou de um produto alimentício ou uma forma de dosagonde compreende organismcs viáveis.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "LINHAGENS DE BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁCTICO SENSÍVEIS A ANTIBIÓTICOS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um método de obtenção de no- vas cepas sensíveis a antibióticos do gênero Bifidobacterium de Bifidobacte-riacea resistente a antibióticos carregando um gene cromossômico de resistência a antibiótico codificado e às cepas que podem ser obtidas através do método. Em particular, a presente invenção refere-se a novas cepas sensíveis a antibióticos obtidas partindo de cepas probióticas resistentes a antibió-

ticos e ao uso de tais novas cepas para a preparação de um alimento ou de um produto alimentício ou de uma forma de dosagem que compreende organismos viáveis. ANTECEDENTE DA INVENÇÃO

As bactérias que fermentam açúcares com a produção de áci-

dos, em particular, o ácido láctico como um componente metabólico principal têm sido conhecidas durante um longo período de tempo. Tais bactérias podem ser encontradas no leite ou em produtos do leite, plantas vivas ou em decomposição, mas também nos intestinos de seres humanos e de animais. Tradicionalmente, estas bactérias têm sido referidas como "bactérias do áci-

do láctico". As bactérias do ácido láctico especificam um grupo bastante he-teróíogo de bactérias microaerofílicas ou anaeróbicas imóveis Gram-positivas que fermentam açúcar com a produção de ácidos incluindo o ácido láctico e compreende, por exemplo, os gêneros Bifidobacterium, Enterococ-cus, Lactobacillus, Lactococcus, Leuconostoc e Pediococcus.

Durante séculos as bactérias do ácido láctico foram utilizadas na

produção de alimentos e produtos alimentícios incluindo a maior parte dos produtos de laticínios e atualmente as bactérias do ácido láctico são essenciais na produção de todos os produtos de leite fermentado tais como iogurte, queijo e manteiga. Além disso, as bactérias do ácido láctico são ampla-

mente utilizadas na indústria de processamento de carne, na indústria de produção de vinhos, na indústria de produção de sucos assim como em um número de outras indústrias.As culturas de bactérias do ácido láctico também encontram u-sos importantes na biopreservação de matérias alimentícias.

A publicação de um grande número de relatos que documentam que várias bactérias lácticas afetam de forma benéfica o bem-estar de seres humanos e/ou de animais atraiu um interesse adicional a este grupo de bactérias. Em particular, foi descoberto que cepas específicas de Lactobacillus ou Bifidobacterium são capazes de colonizar a mucosa intestinal e de auxiliar a manter o bem-estar dos hospedeiros.

A EP 0 768 375 descreve cepas específicas de Bifidobacterium ssp, que são capazes de serem implantadas na flora intestinal e que são capazes de excluir competitivamente a adesão de bactérias patogênicas nas células intestinais. É relatado que estas Bifidobactérias auxiliam na imuno-modulação e assim na manutenção da saúde do indivíduo. O efeito de imu-nomodulação das Bifidobactérias pode ainda ser conferido sobre crianças em gestação. A WO 01/97822, por exemplo, descreve que a ingestão da cepa Bifidobacterium animalis Bb-12® pela mãe durante sua gravidez reduz a ocorrência de doenças atópicas nas crianças. Ainda a WO 03/099037 descreve que a cepa de Bifidobacterium animalis Bb-12® é capaz de modificar de forma benéfica a resposta imunológica. De acordo com Masco e outros (2004), a cepa de Bifidobacterium animalis Bb-12® deve ser corretamente , referida como a cepa Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12®.

Os microorganismos probióticos foram definidos como "Microorganismos vivos que quando administrados em quantidades adequadas conferem um benefício à saúde no hospedeiro" (FAO/WHO 2002). Durante os últimos anos, a documentação sobre as propriedades probióticas das Bifidobactérias e outras bactérias lácticas tem se acumulado. Em geral, a atividade probiótica está associada com cepas específicas. A cepa previamente mencionada de Bifidobacterium animalis Bb-12® assim como a cepa Bifidobacterium lactis HN019 foram relatadas como probióticas (WO 01/97822, WO 03/099037, Zhou e outros (2005), US 6379663).

No mundo todo está bem espalhada a preocupação pública de que o número de bactérias patogênicas resistentes a antibióticos aumentadrasticamente. Todos os dados disponíveis indicam que o aumento perturbador nas bactérias patogênicas resistentes a antibióticos é causado por um uso extensivo e muito liberal de antibióticos na população geral assim como na criação de animais. É um fato bem-estabelecido que muitas bactérias resistentes a

antibióticos carregam determinantes genéticos, genes, que conferem resistência a um ou mais antibióticos. É, além disso, bem sabido que tais determinantes genéticos sob certas circunstâncias podem ser transferidos e podem conferir o fenótipo de resistência a antibióticos às bactérias receptoras. A freqüência da transferência é muito dependente do contexto genético particular em que os genes de resistência a antibióticos são encontrados. Isto é, genes resistentes a antibióticos que residem em plasmídeos ou em transpo-sons demonstraram conferir o fenótipo de resistência a antibióticos às bactérias receptoras em freqüências relativamente altas, enquanto que os deter-minantes codificados nos cromossomos são muito menos sujeitos à transferência.

Por estas razões, pode ser uma preocupação ingerir até mesmo bactérias não patogênicas benéficas se contiverem um determinante de resistência a antibióticos. Esta preocupação é adicionalmente enfatizada no relato do EUROPEAN COMMISSION'S Scientific Committee on Animal Nu-trition (SCAN) sobre Criteria for Assessing the Safety of Micro-Organisms Resistant to Antibiotics of Human Clinicai and Veterinary de 3 de julho de 2001, revisado em 24 de janeiro de 2003, citando que a presença de um gene de resistência conhecido não é aceitável (página 21).

A resistência à tetraciclina é a resistência a antibiótico bacteriana mais comum encontrada na natureza e similarmente é o tipo mais amplamente distribuído de resistência entre bactérias isoladas de animais (Billing-ton 2002). A tetraciclina inibe a síntese de proteínas através da ligação a um sítio isolado de alta afinidade na subunidade ribossomal 30S. Com a tetraci-clina nesta posição, a ligação do aminoacil-tRNA no sítio A é prevenida e assim a síntese de proteínas é bloqueada.

A resistência à tetraciclina pode ser mediada através do efluxoativo da tetraciclina da célula, através da proteção ribissomal por uma ou mais proteínas solúveis, as assim chamadas proteínas de proteção ribosso-mal (RPPs) ou através da inativação enzimática da tetraciclina.

Recentemente, um novo gene de resistência à tetraciclina (Tetr) do tipo proteção do ribossomo, tetW, foi identificado em isolados de rúmen de Butyrivibrio fibrisolvens e um número de outras bactérias do rúmen (Barbosa, 1999).

Embora o determinante tetW esteja amplamente distribuído entre os isolados resistentes à tetraciclina de agentes patogênicos de animais

(Billington 2002), foi uma surpresa para os autores deste pedido de patente descobrir que todas as cepas probióticas conhecidas de Bifidobacterium a-nimalis subs, lactis, incluindo as duas cepas bem-conhecidas de Bifidobacterium Bb-12® e DR10®, carregam um determinante tetW funcional e são resistentes à tetraciclina; em particular porque em um relato recente a cepaDR10® assim como a cepa Bb-12® foram relatadas como sendo sensíveis à tetraciclina (Zhou e outros 2005).

Muito embora experimentos extensos tenham indicado que ò determinante tetW da cepa Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® não pode ser transferido sob situações reais, ainda permanece a preo- cupação de determinantes de resistência a antibióticos em produtos alimen-. tícios. Conseqüentemente, foram tentadas várias abordagens para realizar a inativação ou a remoção do gene tetW em Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® através de mutagênese clássica, envolvendo vários a-gentes mutagênicos, assim como através de manipulação genética direta.Entretanto, até agora todas as tentativas não foram bem-sucedidas. É considerado que uma razão importante para as muitas tentativas sem sucesso seja pelo fato de que o tetW fica localizado no cromossomo das cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subs, lactis.

Assim, seria altamente vantajoso estabelecer um método para ainativação do gene de resistência tetW em Bifidobacteriacea probiótica. Tal método poderia, além disso, ajudar a resolver o problema de fornecimento de variações sensíveis ao antibiótico de Bifidobacteriacea resistentes à te-traciclina probióticas com interesse comercial, que podem satisfazer o requerimento de ausência de genes de resistência funcionais a antibióticos. SUMÁRIO DA INVENÇÃO

O problema anterior foi resolvido através do fornecimento de um método de isolamento de uma cepa sensível à tetraciclina de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriacea) partindo de uma cepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina em que o fenótipo de resistência ao antibiótico é causado pela expressão de um tetW funcional que está integrado de forma estável no seu cromossomo, o dito método compreendendo submeter as célu- Ias tanto a um agente mutagênico químicos quanto a um agente mutagênico físico. Preferencialmente, o agente mutagênico químico compreende o brometo de etídio (EtBr) e o agente mutagênico físico é UV.

Este método parece poder ser geralmente aplicado a Bifidobac-terium sp. resistente à tetraciclina com um tetW funcional integrado de forma estável em seu cromossomo, uma vez que em cada um dos experimentos de mutação que foram realizados com este método era possível isolar variações sensíveis à tetraciclina das duas cepas de Bifidobacterium Bb-12® e HN019(DR10®).

Assim, os aspectos importantes adicionais da invenção são ofornecimento de cepas de Bifidobacterium sp. contendo um tetW codificado cromossomicamente mutado que torna a cepa sensível às tetraciclinas, que podem ser obtidas através do método mencionado anteriormente e do uso de tais cepas de Bifidobacterium para a preparação de um material que pode ser ingerido ou de um medicamento. Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a um

método de inativação de um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteriaceae), o dito método compreendendo submeter uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico. Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a um

método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado, o dito método compreendendo as etapas de: a)inativação do gene tetWem uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional submetendo a dita célula a um agente muta-gênico químico e um agente mutagênico físico b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtida na etapa a) que possui um gene tetW inativado.

Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. sensível à tetraci-clina, o dito método compreendendo as etapas de: a) submissão de uma célula de Bifidobacterium sp. a um agente mutagênico químico e a um agen- te mutagênico físico, em que a célula de Bifidobacterium sp. possui uma Concentração Inibodora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtida na etapa a), em que o dito mutante possui uma Concentração Inibido-

ra Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado.

Em um quinto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração Inibidora Mínima

de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em um sexto aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que contém um tetW codificado cromossomica-mente mutado que torna a célula sensível a tetraciclinas que pode ser obtida através do método da presente invenção.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a uma

célula de Bifidobacterium que é sensível a tetraciclinas por causa de uma mutação no tetW, a dita célula de Bifidobacterium sendo derivada de uma célula progenitora que é resistente a tetraciclinas por causa da presença de um gene tetW localizado no cromossomo.

Em um oitavo aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de

uma célula de Bifidobacterium de acordo com a presente invenção para a preparação de um material que pode ser ingerido ou uma cultura bacteriana.Em um nono aspecto, a presente invenção refere-se a um ali-mento ou a um produto alimentício que compreende a célula bacteriana dapresente invenção.

Em um décimo aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção para usocomo um probiótico.

Em um décimo primeiro aspecto, a presente invenção refere-sea um método de tratamento de um mamífero que compreende a administra-ção de uma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com presente invenção. DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

Em uma modalidade a presente invenção refere-se a um métodode inativação de um gene tetWem uma célula de Bifidobacterium sp. (Bifi-dobacteriaceae), o dito método compreendendo submeter uma célula deBifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

A presente invenção refere-se ainda a um método de prepara-ção de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetWinativado, o dito método compreendendo as etapas de: a) inativação de umgene tetWem uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional submetendo uma célula de Bifidobacterium sp. que compre-ende um gene tetW funcional a um agente mutagênico químico e a um agen-te mutagênico físico.

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp.obtida na etapa a) que possui um gene tetW inativado.

Em uma modalidade adicional a presente invenção refere-se

ainda a um método de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp.sensível à tetraciclina, o dito método compreendendo as etapas de: a) sub-missão de uma célula de Bifidobacterium sp. a um agente mutagênico quí-mico e a um agente mutagênico físico, em que a célula de Bifidobacteriumsp. possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraci-clina/mL ou superior

b) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp.obtida na etapa a), em que o dito mutante possui uma Concentração Inibido-ra Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

A razão pela qual tem sido difícil mutar um gene tetW em umacélula de Bifidobacterium sp. pode ser que o gene fica localizado no cromos-somo das células. Assim, em um método da presente invenção, o gene tetWfuncional pode ser localizado no cromossomo da célula de Bifidobacterium sp.

Assim, em um método da presente invenção o gene tetW inati-vado pode ser localizado no cromossomo da célula de Bifidobacterium sp.

O termo "gene tetW inativado" refere-se no contexto da presenteinvenção a um gene tetW que, se presente em uma célula, não é capaz deexercer sua função normal.

Em particular um gene tetW inativado é um gene que comparadoa um gene tetW funcional compreende uma mutação no quadro aberto deleitura (ORF) do gene, em que a dita mutação pode ser uma mutação dealteração de quadro, introdução de um códon de término ou uma mutaçãoque resulta em uma substituição de aminoácido não conservada. Uma subs-tituição de aminoácido não conservada é definida como uma substituição deum resíduo de aminoácido por um outro resíduo de aminoácido com proprie-dades químicas similares (por exemplo, tamanho, carga ou polaridade), quegeralmente não altera as propriedades funcionais da proteína. Em particular,um gene tetW inativado é um gene tetW que, quando presente em uma célu-la, torna a dita célula sensível à tetraciclina.

O termo "gene tetW funcional" refere-se no contexto da presenteinvenção a um gene tetW que, se presente em uma célula, torna a célularesistente à tetraciclina. Em particular um gene tetW funcional pode ser umgene que compreende um quadro aberto de leitura (ORF) que possui umaseqüência que corresponde às posições 1318-3234 na SEQ ID NO: 22 ouuma seqüência que possui 30%, tal como 40% ou 50% ou 60% ou 70% ou80% ou 85% ou 90% ou 95% ou 99% de homologia à seqüência que corres-ponde às posições 1318-3234 da SEQ ID NO: 22.

Para as finalidades da presente invenção, os alinhamentos deseqüências e o cálculo dos escores de homologia podem ser feitos utilizandoum alinhamento completo de Smith-Waterman, útil para alinhamentos tantode proteínas quanto de DNA. As matrizes de escore pré-estabelecidas BLO-SUM50 e a matriz de identidade são utilizadas para alinhamentos de proteí-nas e de DNA, respectivamente. A penalidade para o primeiro resíduo em um espaço é de 12 para proteínas e de 16 para DNA, enquanto que a pena-lidade para resíduos adicionais em um espaço é de 2 para proteínas e de 4para DNA. O alinhamento pode ser feito com o pacote FASTA versão v20u6(W. R. Pearson e D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Se-quence Analysis", PNAS 85: 2444-2448 e W. R. Pearson (1990) "Rapid and Sensitive Sequence Comparison with FASTP e FASTA", Methods in Enzy-mology, 183: 3' or N-terminal -> C-terminal direction of the nucleic acid oramino acid sequence, respectivamente).

É um resultado da presente invenção que o inventor seja capazde descrever um método geral útil para o isolamento de uma cepa de Bifido- bacterium sp. {Bifidobacteriacea) que contém um fefW mutado em seu cro-mossomo que torna a cepa sensível a tetraciclinas e que é isolado de umacepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina em que o fenótipo deresistência a antibiótico é causado pela expressão de tetW integrado de for-ma estável em seu cromossomo.

A referência à "cepa progenitora" deve ser entendida na presen-te invenção como referência a uma célula de Bifidobacterium sp. que com-preende um gene tetW funcional, uma célula de Bifidobacterium sp. resisten-te à tetraciclina ou uma célula de Bifidobacterium sp. que possui um valor deMIC de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior.

A referência à "cepa sensível a antibiótico" deve ser entendidana presente invenção como referência a uma célula de Bifidobacterium sp.que compreende um gene tetW inativado, uma célula de Bifidobacterium sp.sensível à tetraciclina ou uma célula de Bifidobacterium sp. que possui umvalor de MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

Em uma modalidade da presente invenção, a célula de Bifido-bacterium pode ser uma cepa.

Em uma modalidade adicional os métodos da presente invençãopodem após a etapa a) compreender ainda as etapas de:

i) transferência de um alíquota da cultura tratada com UV paraum meio fresco contendo uma dose de um análogo da penicilina que é pre-judicial para as células que crescem de forma exponencial, mas tolerávelpara as células que não estão crescendo e

ii) cultivo das células no meio que compreende o dito análogo depenicilina sob condições, que promoveriam o crescimento exponencial naausência de penicilina ou de um análogo da penicilina tal como a ampicilina.

O termo "prejudicial a células que crescem de forma exponenci- ai" refere-se no contexto da presente invenção a compostos capazes de re-duzir a taxa de crescimento exponencial das células.

O termo "tolerável" refere-se no contexto da presente invenção acompostos que são bacteriocríticos.

Em uma modalidade, os métodos da presente invenção podem compreender as etapas de:

i) cultivo das células progenitoras ou da célula de Bifidobacteri-um sp. compreendendo um gene tetWfuncional ou que possui uma Concen-.. tração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetracicíina/mL ou superior pa-ra a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial,ii) transferência de uma alíquota das células obtidas na etapa i)

. para meio fresco contendo um agente mutagênico químico,

iii) transferência da cultura obtida na etapa ii) para um ou maisrecipientes para formar uma camada de 0,5 -10 mm de espessura da cultura,

iv) submissão da(s) cultura(s) da etapa iii) a um agente mutagê- nico físico,

v) cultivo das células mutadas da etapa iv) para a obtenção deuma cultura de células em crescimento exponencial,

vi) transferência de uma alíquota das bactérias da etapa v) parauma ou mais placas de Petri contendo um meio de crescimento com ágar adequado, a alíquota das bactérias sendo selecionada para fornecer colô-nias isoladas

vii) identificação das colônias da etapa vi) que adquiriram sensi-bilidade ao antibiótico por plaqueamento de réplicas em placas de Petri come sem antibiótico e

viii) isolamento e expansão das células obtidas na etapa vii).

O agente mutagênico químico e o físico podem ser como descri- to no parágrafo que descreve agentes mutagênicos químicos e físicos quepodem ser utilizados nos métodos da presente invenção.

Pode ser uma vantagem manter ou armazenar as colônias sen-síveis a antibióticos obtidas na etapa viii).

Este procedimento também pode ser descrito como 1) a cultura das células progenitoras para a obtenção de uma cultura de células emcrescimento exponencial, 2) a transferência de uma alíquota das células pa-ra meio fresco contendo brometo de etídio (EtBr), 3) a transferência da cultu-ra para um ou mais recipientes para formar uma camada de 0,5 - 10 mm deespessura de cultura, 4) a submissão da cultura para um tratamento com UV, 5) a cultura das células mutadas para a obtenção de uma cultura de cé-lulas em crescimento exponencial, 6) a transferência de uma alíquota debactérias para uma ou mais placas de Petri para formar colônias isoladas, 7)a identificação das colônias que adquiriram sensibilidade a antibióticos porplaqueamento de réplicas em placas de Petri com e sem antibiótico e 8) o isolamento, a expansão e a manutenção das colônias sensíveis a antibióti-cos identificadas como uma nova cepa sensível a antibióticos.

Em uma modalidade adicional, a cultura obtida na etapa iv) ou 4)pode ser submetida a uma etapa de enriquecimento em relação a mutaçõesque compreende as etapas de: iva) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV

para um meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que éprejudicial para as células em crescimento exponencial, mas tolerável paraas células que não estão em crescimento, e

ivb) cultivo das células no meio contendo o dito análogo de peni- cilina sob condições que promoveriam o crescimento exponencial na ausên-cia de penicilina ou um análogo de penicilina tal como a ampicilina.

Na técnica, os testes de diluição são utilizados para determinaras concentrações inibidoras mínimas (MICs) de agentes antimicrobianos eestes são os métodos de referência para o teste de susceptibilidade antimi-crobiana. Nos testes de diluição, os microorganismos são testados em rela-ção a sua capacidade de produzir crescimento visível em meios adequados e a concentração mais baixa de um agente antimicrobiano que inibe o cres-cimento de um microorganismo é definida como a MIC. Os termos Concen-tração Mínima de Inibição, Concentração Inibidora Mínima e MIC podem serutilizados de forma intercambiável no contexto da presente invenção. A MIC(Concentração Inibidora Mínima) pode ser considerada como a concentra- ção mais baixa de um composto particular que resulta na inibição do cresci-mento visível ou como a concentração mínima do agente antibacteriano emum certo meio de cultura abaixo da qual o crescimento bacteriano não é ini-bido.

Há ensaios diferentes para a determinação do valor de MIC para um composto particular. No contexto da presente invenção, o valor de MICpode ser, em particular, determinado de acordo com o método de seleção desusceptibilidade com o teste E descrito por Danielsen e Wind (2003). O mé-todo de seleção de susceptibilidade com o teste E compreende as etapas de:

a) mergulhamento de um swab de algodão esterilizado em uma cultura de uma cepa sensível à tetraciclina que será testada, que foi crescida

. durante a noite,

b) esfriamento da superfície inteira de uma placa de ágar MRS(diâmetro: 8,5 cm) igualmente em três direções com o swab de algodão daetapa a)

c) quando o inóculo. aplicado na etapa b) secar, aplicação da tirado teste E na superfície do ágar através do auxílio de um aplicador manualcom a escala da MIC com a face para cima

d) inóculo da placa de ágar sob condições anaeróbicas ou mi-croaerofílicas em uma posição invertida a 37°C durante a noite e) determinação do valor de MIC através da leitura do valor em

que o limite da elipse de inibição tem interseção com a tira.

Este método e a tira do teste E são também descritos na EP 157071 que é incorporada aqui como referência.

Ainda um outro método para a determinação da ConcentraçãoInibidora Mínima é descrito na FR-A-2 264 089, que é incorporada aqui co-mo referência.

A expressão "resistente à tetraciclina" referé-se a uma bactéria

que possui uma Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina pelomenos maior que 4 ug/mL (EFSA, 2005), por exemplo, pelo menos 5 micro-gramas/mL, tal como pelo menos 8 microgramas/mL, incluindo pelo menos10 microgramas/mL ou ainda pelo menos 15 microgramas de tetraciclina/mL. O valor de MIC pode, em particular, ser como determinado pelo método deseleção de susceptibilidade com o teste E como descrito por Danielsen eWind (2003).

Conseqüentemente, a célula de Bifidobactenum sp. que com-preende um gene tetWfuncional pode, em particular, ter uma Concentração

Inibidora Mínima como descrito anteriormente.

No presente contexto, a expressão "sensível às tetraciclinas"refere-se a uma bactéria que possui uma MIC de 1,5 micrograma/mL ou infe-rior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menos que 0,75 microgra-ma/mL de uma tetraciclina específica do grupo das tetraciclinas. O valor de

MIC pode, em particular, ser como determinado através do método de sele-ção de susceptibilidade com o teste E.

Especificamente, a expressão "sensível à tetraciclina" refere-sea uma bactéria que possui uma MIC de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ouinferior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menor que 0,75 micro-

grama de tetraciclina/mL. O valor de MIC pode, em particular, ser determi-nado através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E. con-seqüentemente, a célula de Bifidobactenum sp. que compreende um genetetW inativado pode, em particular, ter uma Concentração Inibidora Mínimacomo descrito anteriormente.

Como demonstrado no exemplo 12, até agora todas as muta-

ções que são caracterizadas por uma Concentração Inibidora Mínima (MIC)determinada pelo teste E, que é igual ou inferior a 1,5 ug de tet/mL, conti-nham um teM/mutado. Isto abre para um procedimento de seleção, que re-sulta na seleção de cepas de Bifidobactérias sensíveis à tetraciclina, quecom uma alta probabilidade, contêm um gene tetW inativado. Assim, os mé-todos da presente invenção podem compreender ainda uma seleção de mu-tantes sensíveis à tetraciclina que provavelmente contêm particularmente umgene tetW mutado. Este método de seleção pode compreender as etapas aseguir, assim a etapa b) no método da presente invenção descrita anterior-mente pode, em particular, compreender ainda as etapas de:

i) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) das bactérias através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E,

ii) divisão das bactérias em duas classes baseadas no resultadoda seleção de susceptibilidade com o teste E:

Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior deacordo com o teste E eClasse 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 ug/mL de acordo

com o teste E; e

iii) identificação e expansão das bactérias sensíveis a antibióti-. . . cos identificadas em ii) com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior (Classe 1).

Pode ser uma vantagem adicional manter as bactérias sensíveis

a antibióticos obtidas na etapa iii).

"Tetraciclinas" ou "grupo de antibióticos da tetraciclina" refere-seao grupo de antibióticos bacteriostáticos que são produzidos pelas espéciesde Streptomyces e seus derivados semi-sintéticos relacionados. As tetraci-clinas inibem tanto bactérias Gram-positivas e Gram-negativas quanto ric- kettsiae. São caracterizadas por um modo de ação que implica que o antibió-tico se liga de forma reversível ao ribossomo 30S e iniba a ligação do ami-noacil-t-RNA ao sítio receptor no ribossomo 70S. Em adição à própria tetra-ciclina, também terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxicicli-na/doxiciclin, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraci-clina, aureomicina assim como outras clortetraciclinas são consideradas co-mo membros do grupo das tetraciclinas. Conseqüentemente, também ummétodo em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo queconsiste em, mas não limitado à tetraciclina, terramicina, demeclociclina,meclociclina, doxiciclina/doxiciclin, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxite-traciclina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciclinas é uma moda-lidade da presente invenção.O tipo preferido de tetraciclinas é a tetraciclina.

Como mencionado, foram necessárias várias tentativas antes dopresente método ser desenvolvido. É considerado que é a ação combinadatanto de um agente mutagênico químico quanto físico, por exemplo, brometode etídio e luz ultravioleta, que aumenta a chance de uma mutação bem-sucedida do gene tetW.

Para aumentar adicionalmente a probabilidade de sucesso, acultura ou a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetWfuncional ou que possui um valor de MIC de 4 microgramas de tetracicli-na/mL ou superior, pode subseqüentemente à etapa de mutação, isto é, a etapa de submissão da dita cultura ou células a um agente mutagênico quí-mico e físico, ser submetida a uma etapa de enriquecimento em relação amutações que compreende as etapas de:

a) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV parameio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudi- ciai para as células em crescimento exponencial, mas tolerável para as célu-las que não estão em crescimento e

b) cultura das células no meio que compreende o dito análogode penicilina sob condições que promoveriam o crescimento exponencial naausência de um análogo de penicilina.

Considerando que tal "procedimento de seleção com ampicilina"é bem-estabelecido e foi freqüentemente utilizado para bactérias gram-negativas desde 1972 (Miller 1972), é surpreendente que o "procedimentode seleção com ampicilina" para o melhor do presente conhecimento não foipreviamente utilizado em um protocolo de mutação direcionado contra Bifi-dobacteriaceae gram-positivas. Embora algumas Bifidobacteriacea possamcrescer sob condições aeróbicas, é considerado vantajoso quando a culturaé realizada a uma tensão de oxigênio reduzida, por exemplo, através da su-plementação do meio de cultura com cloridrato de cisteína como descrito noexemplo 1.

Em geral, a abordagem mutagênica dual da presente invenção éconsiderada uma escala mais eficaz que quando os agentes mutagênicossão utilizados individualmente.

O agente mutagênico químico pode, em princípio, ser qualquercomposto químico capaz de mutagenizar ácidos nucléicos, em particular, oDNA. Em particular, o agente mutagênico químico pode ser um agente mu-tagênico intercalante que absorve UV, isto é, um composto químico capazde se intercalar tanto com os ácidos nucléicos, tal como o DNA, quanto deabsorção da luz UV. Sem ficar ligado a qualquer teoria, o inventor da presen-te invenção acredita que através da combinação dos compostos intercalan-tes que absorvem UV como agentes mutagênicos químicos e irradiação deUV como o agente mutagênico físico, é possível a obtenção de um certograu de especificidade à seqüência em relação à mutação de uma seqüên-cia de ácido nucléico, tal como o DNA. Por exemplo, o brometo de etídio(EtBr) que é um composto intercalante de absorção de UV não se intercalageralmente aleatoriamente dentro do DNA. De forma geral, a quantidade deEtBr que se intercala dentro do DNA depende, por exemplo, do grau de su-perenrolamento do DNA. Como o grau de DNA superenrolado, pelo menosem eucariotos, se correlaciona com o nível de expressão de um gene parti-cular, é considerado que este possa resultar em um certo grau de especifici-dade à seqüência em relação a onde o EtBr se intercala com o DNA. A pre-sença de EtBr intercalado em uma seqüência de DNA resulta geralmente emmutação(ões) da seqüência de DNA nos locais em que o EtBr é intercaladoquando a dita seqüência é exposta à luz UV. Além disso, o EtBr deve geral-mente se intercalar nos filamentos de seqüências de DNA de trato polidA-polidT ou pelo menos a taxa de intercalação do EtBr com tais seqüências ébaixa comparada com outras seqüências.

Os exemplos de compostos intercalantes de absorção de UVincluem, mas não estão limitados a brometo de etídio (EtBr), etídio, proflavi-na, daunomicina, adriamicina, actinomicina, elipticina, tilorona, m-AMSA,mitramicina, netropsina, irehdiamina A, antramicina, esteptonigrina, bleomi-cina, ditercalínio, triostina e equinomicina. Outros exemplos de tais compos-tos são fornecidos na US 5.391.723, que é incorporada aqui como referência.

O agente mutagênico físico da presente invenção pode em uma modalidade particular ser uma radiação não ionizante com um comprimentode onda mais curto que 800 nm. Um exemplo de tal agente mutagênico físi-co é a radiação por UV.

Conseqüentemente, em uma modalidade da presente invenção,o agente mutagênico químico é um composto intercalante de absorção de UV, tal como qualquer um dos exemplos mencionados anteriormente e oagente mutagênico físico é uma radiação não ionizante com um comprimen-to de onda mais curto que 800 nm, tal como radiação por UV. Em uma mo-dalidade adicional, o agente mutagênico químico é EtBr e o agente mutagê-nico físico é radiação por UV.

Como ilustrado no exemplo 1, a ação combinada de EtBr e a

exposição à luz UV reduz consideravelmente a viabilidade das células ime-diatamente após os tratamentos com EtBr-UV. É considerado que tal abor-dagem dual eficaz pode ser a razão pela qual foi possível atingir uma inati-vação eficiente do gene tetWem Bifidobacteriacea. Assim, em uma modali- dade importante da presente invenção, o tratamento por UV é ajustado pararesultar em uma redução do número de células vivas que é medido atravésdas Unidades Formadoras de Colônias (UFCs) até menos que 20%, tal co-mo menos que 15% ou até mesmo menos que 10% em relação ao númerodas UFCs da cultura imediatamente antes do tratamento por UV. Este ajuste do tratamento por UV pode, em uma modalidade, se realizado na etapa iv)do método.

Em uma modalidade preferida, a concentração de EtBr é ajusta-da para ficar entre 10 e 30 microgramas/mL. Em modalidades adicionais, oanálogo de penicilina utilizado no "procedimento de enriquecimento com ampicilina" é ampicilina que, em particular, pode ser utilizada em uma dosede 50-300 microgramas/mL no meio, em particular, esta dose de ampicilinapode ser utilizada junto com uma concentração de EtBr de 10-30 microgra-mas/mL.

A resistência à tetraciclina e à oxitetraciclina foi observada emcepas de Bifidobacterium catenulatum, Bifidobacteríum longum, Bifidobacte-rium pseudocatenulatum, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium infantis,Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas(Yazid (2000), Lim (1983), Scott (2000), este estudo). O tetW\o\ observadoem cepas resistentes à tetraciclina de Bifidobacterium longum, Bifidobacteri-um pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis (Scotte outros 2000, Moubareck e outros 2005). Entretanto, a resistência à tetraci-

clina não é característica de cepas probióticas de Bifidobacterium. Mouba-reck (2005) relata que Bifidobactérias probióticas em geral parecem ser maissusceptíveis a antibióticos e as duas Bifidobactérias probióticas bem-conhecidas, Bifidobacterium animalis supsp. lactis strain Bb-12® e DR10®foram relatadas como sendo sensíveis à tetraciclina (Zhou e outros 2005).

Ainda, Moubareck (2005) não observou tetW em Bifidobacterium animalis.Surpreendentemente, entretanto; o presente estudo divulgou que tambémcepas probióticas de Bifidobacterium, incluindo cepas probióticas de Bifido-bacterium animalis tais como Bifidobacterium animalis supsp. lactis cepasBb-12® e DR10®, contêm um tetW funcional que torna as bactérias resisten-

tes à tetraciclina.

Assim, nas modalidades atualmente preferidas, a espécie bacte-riana é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea que contémum tetW funcional que torna as bactérias resistentes à tetraciclina. Em umamodalidade preferida adicional, a cepa progenitora bacteriana resistente à

tetraciclina é uma cepa probiótica. Similarmente, a célula de Bifidobacteriumsp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui um valor de MIC de4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior pode ser uma célula probiótica.

A célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende umgene tetW inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de

tetraciclina/mL ou inferior também pode ser uma célula probiótica.

No contexto da presente invenção, o termo "probiótico" deve serentendido como "microorganismos vivos que quando administrados emquantidades adequadas conferem um benefício à saúde ao hospedeiro"(FAO/WHO 2002).

Em particular, as cepas probioticas podem ser cepas que sãocapazes de sobreviver à passagem do esôfago e do estômago e, além dis- so, são capazes de sobreviver à exposição ao ácido biliar que ocorre na par-te superior do intestino. Conseqüentemente, é esperado que uma bactériaprobiótica potencial sobreviva à exposição ao suco gástrico no estômago(exemplo 9) e exibem ainda resistência aos sais biliares (exemplo 10). A ce-pa placebo para tais estudos pode ser, em particular, cepas que não possu- em um efeito probiótico; mais particularmente cepas que não possuem adi-cionalmente um efeito patogênico.

Outro teste para a determinação do fato de uma cepa ser ou nãoconsiderada como sendo probiótica incluem...

Durante os últimos anos, se acumulou uma documentação de propriedades probioticas de Bifidobacteria e outras bactérias lácticas. Emgeral, a atividade probiótica está associada a cepas específicas. A cepa pre-viamente mencionada de Bifidobacterium animalis Bb-12® assim como acepa de Bifidobacterium lactis HN019 foram relatadas como probioticas (WO01/97822, WO 03/099037, Zhou e outros (2005), US 6379663).

As espécies de Bifidobacterium que são úteis na presente inven-ção incluem, mas não estão limitadas a Bifidobacterium adolescentis, Bifido-bacterium animalis, Bifidobacterium asteroids, Bifidobacterium bifidum, Bifi-dobacterium breve, Bifidobacterium catenulatum, Bifi- dobacterium infantis,Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium longum e Bifidobacterium pseudoca- tenulatum e subespécies das mesmas.

A invenção, entretanto, não está limitada a estas Bifidobacteria-cea particulares mencionadas anteriormente. O versado na técnica reconhe-ceria tais Bifidobacteriacea que podem ser úteis no método de acordo com ainvenção, assim como outras bactérias probioticas que contêm um tet W funcional que as torna resistentes às tetraciclinas.

Nas modalidades preferidas, a cepa ou célula, a célula de Bifi-dobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou a célula de Bi-fidobacterium sp. que possui uma MIC de 4 microgramas de tetraciclina/mLou superior, é uma cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis. Emparticular, a dita célula ou cepa é uma célula ou cepa de Bifidobacterium a-nimalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de5 setembro de 2003 de acordo com o Tratado de Budapeste no InternationalRecognition of the Deposit of Microorganisms for the Purposes of PatentProcedure junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkultu-ren sob o número de acesso DSM 15954 ou cepa de Bifidobacterium anima-lis subespécie lactis CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 de a-

cordo com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the De-posit of Microorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a Deuts-che Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de a-cesso DSM 17280.

É digno de nota enfatizar que a nomenclatura de Bifidobacterium

animalis subespécie lactis sofreu alterações ao longo dos anos.

Inicialmente, a cepa de Bifidobacterium Bb-12® foi descrita co-mo uma Bifidobacterium bifidum. Seqüencialmente, foi descoberto que Bifi-dobacterium animalis era mais correto, embora a cepa não fosse uma Bifi-dobacterium animalis típica. A cepa difere em vários aspectos de Bifidobac-

terium animalis como descrito por Meile e outros (1997), que sugeriram o, estabelecimento de uma nova espécie, Bifidobacterium lactis. O nome destaespécie foi posteriormente validado na lista N2 62 em USB (1997). O statusda espécie de Bifidobacterium lactis foi discutido desde a publicação de Mei-les. Recentemente, Cai e outros (2000) publicaram resultados da hibridiza-

ção de DNA-DNA, que mostraram que Bifidobacterium lactis não diferia osuficiente de Bifidobacterium animalis para permitir o status da espécie. Combase nestes resultados, o International Committee on Systematic Bacterio-logy, o Subcomitê em taxonomia de Bifidobacterium, Lactobacillus e orga-nismos relacionados decidiram que Bifidobacterium lactis não pode ser re-

conhecida como uma espécie válida (Minutes, USEM, 2001). Desde então,uma análise taxonômica polifásica foi feita e publicada levando à criação deduas subespécies dentro de Bifidobacterium animalis (Masco e outros,2004) . Bb-12® pertence a uma das subespécies, B. animalis subsp. lactis.Com base em impressões digitais do DNA, parece para os presentes inven-tores que também a cepa bem-conhecida de Bifidobacterium DR10® deveriaser corretamente denominada de B. animalis subsp. lactis. Na literatura, a

cepa DR10®, é também referida como Bifidobacterium lactis HN019 (Zhou

2005) e HOWARU® Bifido (www.danisco.com).

Como ilustrado no exemplo 2, o método da presente invençãopode resultar em duas classes de novos isolados sensíveis a antibiótico umaclasse que expressa um nível intermediário de sensibilidade à tetraciciina,

isto é, isolados com uma MIC variando entre 2 e 4 ug de tetraciclina/mL eisolados com uma MIC menor que 1,5 ug de tetraciclina/mL tal como 0,75 ouaté mesmo 0,5 ug de tetraciclina/mL. Até agora, foram identificados somenteisolados com um tetW inativado em isolados com uma MIC menor que 1,5ug de tetraciclina/mL e em todos os casos foram utilizadas Bifidobacteriacea

possuindo um MIC maior que 10 microgramas de tetraciclina/mL como célu-las progenitoras. Assim, uma modalidade preferida da presente invenção éum método de isolamento de uma cepa sensível à tetraciciina de Bifidobac-terium sp. (Bifidobacteriacea) de uma cepa progenitora bacteriana resistenteà tetraciciina em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciciina

da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas de tetraciclina/mL e aMIC da cepa sensível ao antibiótico é de 1,5 micrograma de tetraciclina/mLou inferior. A cepa progenitora pode ser uma célula de Bifidobacterium sp.que compreende um gene funcional tetWou que possui um valor de MIC de4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior e a cepa sensível a antibiótico

pode ser uma célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende umgene tetW inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma detetraciclina/mL ou inferior.

Uma vez que o grupo de antibióticos da tetraciciina compartilhao mesmo modo de ação, é considerado que a inativação de tetW, em geral,

resultará em uma modificação na sensibilidade a qualquer um do grupo deantibióticos da tetraciciina em uma magnitude similar à alteração observadacom a tetraciciina. Conseqüentemente, uma modalidade da invenção é ummétodo de isolamento de uma cepa de Bifidobacterium sp. (Bifidobacteria-cea) que é sensível a uma ou mais das tetraciclinas de uma cepa progenito-ra bacteriana que é resistente a uma ou mais das tetraciclinas e em que aConcentração Inibidora Mínima (MIC) do dito antibiótico da cepa progenitoraé pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensível a antibiótico. Acepa progenitora pode ser uma célula de Bifidobacterium sp. que compreen-de um gene tetW funcional ou que possui um valor de MIC de 4 microgra-mas de tetraciclina/mL ou superior e a cepa sensível ao antibiótico pode seruma célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW inativado ou que possui um valor de MIC de 1,5 micrograma de tetracicli-na/mL ou inferior.

Os exemplos dos antibióticos do grupo da tetraciclina são repre-sentados pelo grupo de antibióticos que compreende tetraciclina, terramici-na, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaci- clina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina e outras clorte-traciclinas.

Para o bem do presente conhecimento, até agora todas as ce-pas probióticas de Bifidobacterium animalis subs. lactis e um número subs-tancial de outras Bifidobacteriacea carregam um determinante tetW funcional que as tornam resistentes à tetraciclina. O inventor da presente invenção. descobriu de forma surpreendente que era possível fornecer Bifidobacteria-cea que carregam um determinante tet W inativado.

Como ilustrado nos exemplos, é na verdade possível obter vari-ações de cepas probióticas conhecidas de Bifidobacterium sp. que contêm um tetW codificado pelo cromossomo mutado que torna a cepa sensível àstetraciclinas. O fornecimento de tais novas cepas é considerado a modalida-de mais preferida da presente invenção.

Conseqüentemente, em uma modalidade adicional, a presenteinvenção refere-se a uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado. Esta célula pode, em particular, ter uma ConcentraçãoInibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina /ml_.

Em uma modalidade adicional, na célula de Bifidobacterium sp.o gene fef Winativado pode estar localizado no cromossomo das ditas células.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aindaa uma célula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração InibidoraMínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL.

Em uma modalidade adicional, a presente invenção refere-se auma célula de Bifidobacterium sp. que contém um tet W codificado por cro-mossomo mutado que torna a célula sensível às tetraciclinas que pode serobtida através de um método da presente invenção.

A presente invenção refere-se ainda a uma célula de Bifidobac- terium que é sensível às tetraciclinas por causa de uma mutação em tetW, adita célula de Bifidobacterium sendo derivada de uma célula progenitora queé resistente às tetraciclinas por causa da presença de um gene tetW locali-zado no cromossomo.

A nova cepa ou célula, em princípio, pode ser uma variação ou uma mutação de qualquer Bifidobacterium que carregue um tetW codificadopelo cromossomo tornando a cepa resistente às tetraciclinas. As células a-dequadas podem ser selecionadas do grupo de Bifidobacteriacea que com-preende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifi-dobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e sub- espécies das mesmas. Em particular, são preferidas as células classificadascomo Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

As referências à tetraciclina em relação a uma célula de Bifido-bacterium sp. da presente invenção incluem aquelas descritas em relaçãoaos métodos da presente invenção. Similarmente, a célula progenitora pode ser qualquer das mencionadas anteriormente em relação a uma célula pro-genitora útil em um método da presente invenção.

Em geral, são preferidas novas cepas bacterianas que possuemuma Concentração Inibidora Mínima (MIC) de antibiótico que é pelo menos10 vezes menor que a MIC da cepa progenitora resistente a antibiótico.

Conseqüentemente, a Concentração Inibidora Mínima de anti-biótico (MIC) da célula progenitora pode ser pelo menos 10 vezes maior quea MIC da célula sensível a antibiótico.Em particular, a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraci-clina da célula progenitora pode ser de pelo menos 10 microgramas de te-traciclina/mL e a MIC de célula da cepa sensível a antibiótico pode ser de 1micrograma de tetraciclina/mL ou inferior. As células de Bifidobacterium sp. preferidas da presente inven-

ção podem ser aquelas que possuem uma que é de 1,5 micrograma de te-traciclina/mL ou inferior, tal como 1 micrograma/mL ou até mesmo menorque 0,75 micrograma de tetraciclina/mL. O valor de MIC pode, em particular,ser como determinado através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E.

Tais cepas que portam um tetW mutado são modalidades parti-cularmente preferidas da invenção.

A mutação de inativação do gene teftVque torna as novas cepassensíveis às tetraciclinas podem ser tipicamente descritas em relação à se- qüência do gene tetWóa célula progenitora relevante.

Como descrito nos exemplos, as cepas sensíveis à tetraciclinaadequadas com um tetW inativado podem ser conseguidas através da intro-dução de mutações específicas no gene tetW.

Em uma modalidade preferida da invenção, um códon de térmi- no "opal" foi introduzido no tetW através da alteração de uma parte do tetW. codificado por cromossomo caracterizada pela seqüência TCG CTG GGATAC JTG AAC CAG AGT [SEQ ID 1] por TCG CTG GGA TAC TGA ACCAGA GTT [SEQ ID 2], a base deletada no tetW funcional é indicada pelosublinhado. Assim, uma célula de Bifidobacterium que compreende a se- qüência: GGA TAC TGA ACC [SEQ ID 3] ou [ATACTGAA] em seu genetetWé uma modalidade preferida da presente invenção. Foi também obser-vado que o gene tetW poderia ser inativado e resultar na sensibilidade à te-traciclina, através da alteração da parte do tetW codificado por cromossomoque compreende a seqüência: CAG AGC GTG GTT ÇAG TCT GTT CGG [SEQ ID 4] por CAG AGC GTG GTT TAG TCT GTT CGG [SEQ ID 5]. Estamutação introduz um códon de término âmbar no tetWe a base mutada notetW funcional está sublinhada. Tal Bifidobacterium que compreende a se-qüência: GTG GTT TAG TCT [SEQ ID 6] ou [GGTTTAGT] em seu gene tetWé uma outra modalidade preferida da presente invenção. Uma cepa bacteri-ana ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção em que o genetetW inativado ou mutado compreende pelo menos uma seqüência selecio- nada do grupo que consiste em, mas não limitada à SEQ 10 NO: 3 [GGATAC TGA ACC], [ATACTGAA], SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG, TCT],[GGTTTAGT], SEQ ID N2: 27 [AC CAG CGT TTT C] e [CAGCGTTT] é tam-bém uma modalidade da presente invenção.

A introdução dos códigos de término "opal" e "âmbar" na região

que codifica a proteína do gene tetW representa dois eventos molecularesdiferentes. No caso da mutação "opal", foi deletada uma base, enquanto queno caso da âmbar, uma base foi mutada (in casu do par C para T, isto é,uma transição de base).

Deve ser enfatizado que o tetW de uma Bifidobacterium pode

ser inativado através de outros tipos de mutações nos outros sítios de tetW.Isto é ilustrado pela cepa mutante de Bifidobacterium Bb-12Tet-S180 em queo gene tetW compreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C] que re-presenta uma única transversão de base de uma A para uma C na posiçãoN°2731 na SEQ ID 22; e a DR10Tet-S33 e a Bb-12Tet-S79 que compreen-

dem várias mutações em tetW. DB10Tet-S33 compreende duas mutaçõesno tetW descritas pela SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A] (ou[CCCTGCCA]) e pela SEQ ID NO: 29 [AT ATT GTC ATC A] (ou [ATTGT-CAT]) e Bb-12Tet-S79 compreende três mutações descritas por SEQ ID NO:30 [TA GAC GAT GGA A] (ou [GACGATGG]), SEQ ID NO: 31 [CG GTC

CGG GTA A] (ou [GTCCGGGT]) e SEQ ID NO: 32 [CT GAT CCG GCC TT](ou [GATCCGGC]). Assim, em uma modalidade, a célula de Bifidobacteriumsp. da presente invenção pode ser uma célula em que o gene tetW inativadoou mutado compreende uma das combinações de seqüências mencionadasanteriormente.

Assim, a célula de Bifidobacterium sp. de acordo com â presente

invenção pode ser uma célula, em que o gene tetW inativado ou mutadocompreende pelo menos uma seqüência selecionada do grupo da SEQ ID 3[GGATACTGAACC], SEQ ID NO: 6 [GTGGTTTAGTCT], SEQ ID 25 [A-TACTGAA], SEQ ID NO: 27 [ACCAGCGT TTTC], SEQ ID 28 [CGCCCTGC-CACA], SEQ ID 29 [ATATTGTCATCA], SEQ ID 30 [TAGACGATGGAA],SEQ ID 31 [CGGTCCGGGTAA], SEQ ID 32 [CTGATCCG G CCTT], [CAGCGTTT], [GACGATGG], [GTCCGGGT], [ATCCGGCC], [CCTGCCAC],[TTGTCATC], [GGTTTAGT], [GTGGACCG], [CGCCCATT] e [TCCGGCCC].

Em particular, a célula de Bifidobacterium sp. de acordo com apresente invenção pode ser uma célula em que o gene tetW inativado oumutado compreende as seqüências [CCTGCCAC] e [TTGTCATC].

Em uma outra modalidade, a célula de Bifidobacterium sp. de

acordo com a presente invenção pode ser uma célula em que o gene tetWinativado ou mutado compreende as seqüências [GACGATGG],[GTCCGGGT] e [ATCCGGCC].

Até onde a cepa de Bifidobacterium contiver um tetW codificado

por cromossomo mutado tornando a cepa sensível às tetraciclinas e que po-de ser obtida através do método da presente invenção, as cepas sensíveis àtetraciclina resultantes são modalidades da presente invenção.

Uma indicação muito importante do fato de que uma cepa sensí-vel à tetraciclina mutada particularmente contenha provavelmente um gene

tetW mutado, é a determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) da. bactéria através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E.Como demonstrado no exemplo 12, as cepas mutadas podem ser classifica-das em duas classes: Classe 1: cepas com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferi-or; e Classe 2: cepas com uma MIC > 1,5 ug/mL Isto é utilizado em uma

modalidade do método de isolamento de cepas que compreende as etapas de:

a) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) dasbactérias através do método de seleção de susceptibilidade com o teste E,

b) com base no resultado da seleção de susceptibilidade com oteste E, dividindo as bactérias em duas classes:

Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior de

acordo com o teste E, e

Classe 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 ug/mL de acordocom o teste E; e

c) identificação e expansão de tais bactérias sensíveis a antibió-ticos identificadas b) como pertencentes à classe 1.

Em uma modalidade adicional a etapa c) pode incluir manter as bactérias sensíveis a antibióticos. Em particular, a etapa c) pode ser a identi-ficação, a expansão e a manutenção de tais bactérias sensíveis a antibióti-cos identificadas em b) como pertencentes à classe 1 como uma nova cepasensível a antibiótico. A modalidade mais preferida da presente invenção é acepa bacteriana ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepaCHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 28 de abril de 2005 de acordocom o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17281. Esta cepa sensível à tetraciclina contém a mutação "opal" emseu tetW. Esta cepa é particularmente preferida por que é uma mutação dascepas probióticas bem-conhecidas de Bifidobacterium Bb-12®. Além disso,CHCC8902 contém uma deleção de uma única base em tet W caracterizadaem uma taxa de reversão relativamente baixa menor que 1,6 x 10"9 a tor-pando particularmente adequada para ingestão em grandes números (ver oExemplo 4). Como ilustrado in exemplo 9 e 10, a cepa sensível à tetraciclinaBb-12Tet-S139 preservou as características de uma cepa probiótica. Assim,em uma modalidade particularmente preferida da presente invenção, a cepabactériasna sensível à tetraciclina ou a célula de Bifidobacterium sp. da pre- sente invenção é uma cepa probiótica.

Uma outra modalidade preferida da presente invenção é umacepa bactériasna ou a célula de Bifidobacterium sp. da presente invençãoque é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepaCHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 de acordo com o Tratado de Budapeste no International Recognition of the Deposit ofMicroorganisms for the Purposes of Patent Procedure junto a DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acessoDSM17282. Esta cepa sensível à tetraciclina contém a mutação "âmbar" emseu tetW. Esta cepa é também preferida porque é uma mutação da cepaprobiótica bem-conhecida de Bifidobacterium DR10® (CHCC7158).CHCC9070 (DR10Tet-S9X) contém uma transição de uma única base em tetW. Como antecipado pela literatura existente sobre transições de bases, ataxa de reversão é maior, por exemplo, que de mutantes de deleção. No ca-so de CHCC9070 que contém a taxa de retromutação de 1,8 x 10'8. EmboraCHCC9070 seja mais susceptível à reversão que CHCC8902, a cepa é ain-da relativamente estável e conseqüentemente adequada para ingestão.

Como mencionado, algumas Bifidobactérias podem servir comoprobióticos, isto é, como organismos não patogênicos, que possuem benefí-cios para a saúde quando tomados oralmente em alimentos ou cápsulas. Osalvos comuns da ação probiótica são distúrbios intestinais (por exemplo, di-arréia dos viajantes, diarréia associada a antibióticos) ou sintomas intestinais(inchaço, flatulência, desconforto). Ainda, uma faixa mais ampla de benefí-cios (por exemplo, propriedades anticolesterolêmicas, anticarcinogênicas eimunoestimuladoras) é também discutida na literatura de probióticos.

Assim, em uma modalidade adicional, a presente invenção refe-re-se ao uso de uma célula de Bifidobacterium sp. da presente invenção pa- ra a preparação de um material que pode ser ingerido ou de uma cultura. bacteriana.

Assim, em uma modalidade adicional, a célula de Bifidobacteri-um sp. da presente invenção pode ser para uso como um probiotico.

Em particular, a célula de Bifidobacterium sp. da presente inven- ção para uso como um probiotico pode estar na forma de um material que. pode ser ingerido.

Em uma outra modalidade, a presente invenção refere-se aindaa um método de tratamento de um mamífero através da administração deuma célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a presente invenção.

Em particular a célula de Bifidobacterium sp. pode ser fornecidano método na forma de um material que pode ser ingerido.

Os termos "trato gastrointestinal" ou "intestinal" são, no presentecontexto, utilizados de forma intercambiável e refere-sem tanto ao trato gas-trointestinal superior quanto ao inferior que incluem a boca, o esôfago, o es-tômago, o intestino delgado incluindo o duodeno, o jejuno e o íleo e o intesti-no grosso que compreende o cólon e o ceco. A cultura bacteriana pode, em uma modalidade adicional, ser

adicionalmente processada.

As bactérias, isto é, a célula de Bifidobacterium sp., desta inven-ção podem ser fornecidas na forma de um produto alimentício fermentado ouem formas de dosagem formuladas na forma de comprimido (incluindo com-

primidos mastigáveis), uma cápsula (do tipo duro ou mole), um pó, um gra-nulado, uma preparação líquida, uma suspensão, um suplemento oral seco,um suplemento oral úmido, uma formulação para alimentação em tubo secoou uma formulação para alimentação em tubo úmido.

Em uma modalidade, o material que pode ser ingerido é um ali-

mento ou um produto alimentício fermentado preparado através do uso dasBifidobacterias da presente invenção. Conseqüentemente, em uma outramodalidade, a presente invenção refere-se ainda um alimento ou a um pro-duto alimentício que compreende uma célula bacteriana ou uma cepa deacordo com a presente invenção, isto é, uma célula de Bifidobacterium sp.

de acordo com a presente invenção.

O alimento ou o produto alimentício fermentado pode ser adicio-nalmente processado. Em um número de situações, foi relatado que as bac-térias produzem compostos que promovem a saúde durante a fermentação.Em tais casos, poderia ser vantajoso fracionar e/ou concentrar frações do

produto alimentício fermentado. Pode-se ainda imaginar que, em certas situ-ações, seria valioso processar adicionalmente o produto alimentício atravésde pasteurização, muito embora as Bifidobacterias benéficas sejam inativa-das através de tal procedimento.

Entretanto, em geral, é considerado benéfico que o material que

pode ser ingerido compreenda Bifidobacterias vivas em uma quantidade deaproximadamente 105 UFC/g até aproximadamente 1012 UFC/g de materialque pode ser ingerido, uma vez que as células vivas são um pré-requisitopara a obtenção do efeito probiótico.

É considerado que as Bifidobactérias da presente invenção po-dem ser utilizadas para a preparação de uma faixa ampla de materiais quepodem ser ingeridos tais como leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base deleite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes,sorvetes individuais sem palito ou picolés, produtos à base de cereais fer-mentados, fórmulas para bebês e leite de soja.

Uma modalidade importante adicional da presente invenção é o uso das Bifidobactérias da presente invenção para preparar uma composi-ção para o tratamento ou para a prevenção de uma doença, síndrome ouestado de saúde ou para melhorar a digestão de nutrientes ou para melhoraro estado de saúde geral de um ser humano ou de um animal vertebrado.

Uma vez que as Bifidobactérias em geral são consideradas co- mo organismos probióticos (Yazid, 2000) o uso de uma Bifidobactéria dapresente invenção como um probiótico é uma modalidade preferida. A com-posição probiótica da presente invenção pode ser qualquer material que. . possa ser ingerido selecionado do grupo que consiste em leite, coalhada,produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogur- te, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de. queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereaisfermentados, fórmulas para bebês, comprimidos suspensões bacterianaslíquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação em tuboseco ou alimentação em tubo úmido que são produzidos através do uso das Bifidobactérias desta invenção.

Em uma modalidade adicional, a composição compreende aindaum veículo farmaceuticamente aceitável. Como utilizado aqui, o termo "veí-culo farmaceuticamente aceitável" significa um ou mais diluentes de recheiosólidos ou líquidos ou uma ou mais substâncias de encapsulamento que são adequadas para a administração a um ser humano ou um animal que é/sãocompatíveis com os organismos probioticamente ativos. O termo "compatí-vel" refere-se a componentes da composição farmacêutica que são capazesde ser mesclados com o probiótico de uma maneira que não possibilita inte-ração porque reduziria substancialmente a eficiência dos organismos sele-cionados para a invenção sob condições de uso comuns. Os veículos farma-ceuticamente aceitáveis têm que ter uma pureza suficientemente alta e uma toxicidade suficientemente baixa para torná-los adequados para a adminis-tração a seres humanos e animais tratados.

Em modalidades úteis, o material que pode ser ingerido de acor-do com a invenção é adequado para a prevenção ou para o tratamento deuma doença, síndrome ou estado de saúde selecionado do grupo que con-

siste em distúrbios associados a antibióticos, gastroenterite, diarréia incluin-do a diarréia do viajante e a diarréia infantil aguda, intolerância à lactose,infecções gastrointestinais e colonização do trato gastrointestinal por bacté-rias patogênicas incluindo Helicobacter pylori e Clostridium difficile, síndromedo intestino irritavel (IBS), doença inflamatoria dos intestinos (IBD) e outras

síndromes imunomuduladoras, câncer de cólon, infecções e tumores uroge-nitais, infecções vaginais, alergia (especialmente eczema atópico), vacina-ção, colesterolemia e hipertensão.

Em modalidades adicionalmente úteis, o material que pode seringerido de acordo com a invenção é adequado para a prevenção ou para o

tratamento de infecções com agentes patogênicos tais como, por exemplo,Heliobacter pylori, Campylobacter pylori, Staphylococcus aureus, Staphylo-coccus epidermidis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae,Enterococcus faecalis, Hemophilus influenzae, Escherichia coli, Klebsiellapneumoniae, Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marces-

cens, Pseudomonas aeruginosa e Pseudomonas maltophilia, Salmonella sp.e fungos tais como Cândida albicans e Aspergillus fumigatus e combinaçõesdestas espécies.

Nos últimos anos, rotavírus e outros vírus entéricos foram identi-ficados como uma causa principal de diarréia infecciosa. De forma interes-

sante, tanto Bifidobacterium Bb-12® quanto HN019 (DR10®) mostraram pre-venir ou tratar eficientemente infecções também com estes agentes patogê-nicos. Assim, em modalidades úteis, o material que pode ser ingerido de a-cordo com a invenção é utilizado para a prevenção ou para o tratamento deinfecções com rotavírus e outros vírus entéricos.

Pode ser útil combinar dois ou mais dos organismos ativos pro-bioticamente assumidos anteriores, tais como, por exemplo, uma preparação que compreende uma espécie de Lactobacillus e uma espécie de Bifidobac-terium.

Desempenho das cepas mutantes e seus benefícios aos seres humanos

------ A Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (CHCC5445), é

uma cepa extremamente importante para a saúde e o bem-estar de mamífe-ros por causa de suas capacidades probióticas (por exemplo, efeito estabili-zador do sistema imunológico em seres humanos, controle de uma microflo-ra equilibrada no trato digestivo reduzindo ou atuando assim como inibidoresde várias síndromes epidemiologicas etc). Ainda a Bifidobacterium animalissubsp. lactis HN019 (DR10®, CHCC7158), possui um registro impressionan- te de atividade probiótica. Embora ambas estas cepas carreguem um geneativo que codifica resistência à tetraciclina, a resistência bacteriana a antibió-ticos mais proeminente encontrada na natureza (Chopra e Roberts, 2001),ambas foram utilizadas durante muitos anos na produção de alimentos epara o presente conhecimento sem causar qualquer dano. Ao contrário, a- penas efeitos positivos foram atribuídos ao uso destas cepas. Entretanto, o. fato de que ambas as cepas contêm o tetW ativo em seu genoma não possuia possibilidade teórica de transferência da resistência à tetraciclina a outras- e talvez bactérias prejudiciais no sistema digestivo humano. O risco dissoaumenta se as bactérias doadoras ingeridas sobreviverem nos intestinos em grandes números, como no caso com o uso típico de bactérias probióticas. Ainativação do gene tetW nas duas variações, como foi demonstrado aqui,elimina o risco de uma transferência horizontal de genes funcionais resisten-tes a antibióticos. Além da lesão no tetW, as duas cepas sensíveis à tetraci-clina são provavelmente isogênicas as suas cepas-mãe, como sugerido no Exemplo 5 e no Exemplo 6. Assim, pode ser assumido que as duas cepassensíveis à tetraciclina possuem a maior parte, se não todas, das caracterís-ticas que tornam Bb-12® e HN019 (DR10®) probióticas.Em adição, testes de laboratório que envolvem eletroforese emgel bidimensional para a caracterização adicional das cepas mutantes estãosendo realizados para verificar a estrutura básica isogênica com as cepas dotipo selvagem. Conclusão

1) - a inativação do gene de resistência à tetraciclina, tetW, deBifidibacterium animalis ssp lactis Bb-12® e Bifidibacterium animalis ssp lac-tis HN019 (DR10®) foi estabelecida através de uma combinação do agentemutagênico intercalante, brometo de etídio e irradiação sucessiva com ultra- violeta.

2) - cinco dos isolados sensíveis à tetraciclina resultantes origi-nados de Bb-12 ® e de HN019 (DR10®) eram incapazes de crescer em cal-do MRS com tetraciclina em uma concentração acima de 1,5 ug/mL.

3) - a caracterização de um dos isolados mutantes, Bb12Tet-13915 (um derivado de CHCC5445) demonstrou uma alteração de quadro na posi-ção de nucleotídeo N°2722 no gene tetW resultando imediatamente em umcódon de término opal de 170 aminoácidos próximo ao produto gênico. Nooutro mutante, DR10Tet-S9X (um derivado de CHCC7158) um códon detérmino âmbar foi introduzido (posição de nucleotídeo N° 1741), 498 amino- ácidos próximo do produto gênico.

4) - a taxa de reversão para Bb12Tet-S139 é menor que 1,6 x10"9 e a taxa de retromutação para DR10Tet-S9x é de 1,8 x 10"8.

5) - o cultivo, as taxas de acidificação, o perfil de DNA e o trans-criptoma (Exemplo 6) dos mutantes de tet W não eram diferentes das res- pectivas cepas do tipo selvagem.

6) - as análise dos isolados mutantes não divulgaram quaisquerrearranjos ou modificações, mas para tetW, do DNA genômíco como julgadopartindo das análises de fingerprinting do DNA e dos transcriptomas.

7) - os experimentos mostram que Bb12Tet-139 preservou mui- tas das características probióticas de Bb-12 ®.

As Bifidobactérias e outras bactérias do ácido láctico são comu-mente utilizadas como culturas de partida que têm uma finalidade tecnológi-ca na produção de vários alimentos. A indústria mais bem-conhecida queutiliza culturas de partida é a indústria de laticínios, mas as culturas de parti-da também são utilizadas em outras indústrias, por exemplo, na indústria deprocessamento de carne. Assim, uma modalidade da presente invenção é o uso de uma cepa de Bifidobacterium de acordo com a invenção para a pre-paração de uma cultura de partida. As culturas de partida podem ser forneci-das na forma de culturas de partida congeladas ou secas em adição às culturasde partida líquidas. Em uma modalidade adicional, a cultura de partida pode serseca por congelamento, seca por spray ou seca em leito fluidizado.

Uma composição de cultura de partida de acordo com a inven-

ção compreende tipicamente bactérias de uma concentração de células viá-veis, que fica na faixa de 104 até 1012 UFC por grama da composição. Ummétodo conveniente de produção de uma cultura de partida congelada com-preende as etapas a seguir: 1. cultivo de uma cepa bacteriana de acordo

com presente invenção, 2. coleta das células propagadas para fornecer umacultura bacteriana concentrada, 3. congelamento do material bacteriano paraa obtenção de material congelado e 4. embalamento do material seco porcongelamento em um recipiente adequado. Similarmente, um método con-veniente de produção de uma cultura de partida seca por congelamento

compreende as etapas a seguir: 1. cultivo de uma cepa bacteriana de acordo. com as reivindicações presentes na invenção, 2. coleta das células propa-gadas para fornecer uma cultura bacteriana concentrada, 3. congelamentodo material bacteriano para a obtenção de material congelado, 4. sublimaçãoda água do material congelado e 5. embalamento do material seco por con-

gelamento em um recipiente adequado. Ainda, é considerada uma cultura departida seca por spray/leito fluidizado. O congelamento do material bacteria-no pode ser convenientemente realizado mergulhando a cultura concentradaem nitrogênio líquido e coletando o material congelado.

Como descrito na WO 2005/003327 A1, é benéfico adicionar

certos agentes crioprotetores a uma cultura de partida. Assim, uma compo-sição de cultura de partida de acordo com a presente invenção pode com-preender um ou mais agentes crioprotetores selecionados do grupo queconsiste em inosina-5'-monofõsfato (IMP), adenosina-5'-monofosfato (AMP),guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-5'-monoíosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, uracila, citosina, adenosina, gua-nosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hopoxantina, orotidina, timidi-na, inosina e um derivado de qualquer um de tais compostos.A invenção apresentada na forma de reivindicações

Os aspectos e as modalidades da invenção podem ser apresen-tados na forma das assim chamadas reivindicações. Isto é fornecido abaixo.

1. Processo de isolamento a cepa de Bifidobacterium sp. (Bifido- bacteriacea) contendo um tefWmutado em seu cromossomo, a dita mutaçãotornando a cepa sensível às tetraciclinas e a dita cepa é isolada de uma ce-pa bacteriana progenitora resistente à tetraciclina em que o fenótipo de re-sistência a antibiótico é causado pela expressão de tetW integrado de formaestável em seu cromossomo, o dito processo compreendendo submeter as células a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, em que o agentemutagênico químico compreende brometo de etídio (EtBr) e o agente muta-gênico físico é UV.

3. Processo de acordo com as reivindicações 1 ou 2, em que a cepa progenitora bacteriana resistente à tetraciclina é selecionada do grupode cepas que consiste em Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepaCHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 junto aDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o númerode acesso DSM 15954 e, Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17280.

4. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 3, em que oprocesso compreende uma seleção de mutantes sensíveis às tetraciclinasque são particularmente prováveis de conterem um gene tefWmutado, o ditoprocesso de seleção compreendendo as etapas de:

a) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) dasbactérias através do processo de seleção de susceptibilidade com o teste E,b) divisão das bactérias em duas classes com base no resultadoda seleção de susceptibilidade com o teste E:

Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior deacordo com o teste E eClasse 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 ug/mL de acordo

com the teste E; e

c) identificação, expansão e manutenção de tais bactérias sensí-veis a antibióticos identificadas em b) com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior(Classe 1) como uma nova cepa sensível a antibiótico.

5. Processo de acordo com a reivindicação 4, em que as tetraci-

clinas é a tetraciclina.

6. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 5, em que acepa bacteriana progenitora resistente à tetraciclina é uma cepa probiótica.

7. Processo de acordo com as reivindicações 1 até 6, em que a cepa bacteriana sensível à tetraciclina é uma cepa probiótica.

8. Processo de acordo com a reivindicação 1 até 7, em que oprocesso compreende as etapas de:

1) cultura das células progenitoras para a obtenção de uma cul-tura de células em crescimento exponencial,2) transferência de uma alíquota das células para meio fresco

, contendo brometo de etídio (EtBr),

3) transferência da cultura para um ou mais recipientes paraformar uma camada de cultura de 0,5-10 mm de espessura,

4) submissão da cultura a um tratamento com UV,

5) cultura das células mutadas para a obtenção de uma cultura

de células em crescimento exponencial,

6) transferência de uma alíquota de bactérias para uma ou mais

placas de Petri contendo um meio de crescimento com ágar adequado, a

alíquota de bactérias sendo selecionada para fornecer colônias isoladas 7) identificação de tais colônias que adquiriram sensibilidade a

antibiótico através do plaqueamento de réplicas nas placas de Petri com e

sem antibiótico e8) isolamento, expansão e manutenção de tais colônias sensí-veis a antibiótico identificadas como uma nova cepa sensível a antibiótico.

9. Processo de acordo com a reivindicação 8, em que a culturasubseqüente à etapa 4) é submetida a uma etapa de enriquecimento em

relação a mutações que comprende as etapas de:

4a) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV pa-ra meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é preju-dicial às células enr"crescimento exponencial, mas tolerável pelas célulasque não estão em crescimento e 4b) cultura das células no meio que compreende o dito análogo

de penicilina sob condições, que promoveriam o crescimento exponencial naausência de penicilina ou de um análogo de penicilina tal como a ampicilina.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que a cultura é realizada a uma tensão de oxigênio reduzida.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações

anteriores, em que o tratamento com UV da etapa 4) reduz o número de cé-lulas vivas medido através das Unidades Formadoras de Colônia (UFCs) atémenos que 20% em relação ao número das UFCs da cultura imediatamenteantes do tratamento com UV.

12. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1

até 10, em que o análogo de penicilina é a ampicilina que é utilizada a umadose de 50-300 microgramas/mL de meio.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo

de tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxicicli-na/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetracidina, rolitetraci-clina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que a cepa progenitora é selecionada do grupo de Bifidobac-

teriaceas que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudo-catenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacteriumanimalis e subespécies das mesmas.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifidobacterium ani-malis subespécie lactis.

16. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) do antibiótico da cepa progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da cepa sensívela antibiótico.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da tetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e a MIC da tetracicli-na da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma/mL ou inferior.

18. Cepa de Bifidobacterium sp. que contém um tetW codificadopor cromossomo mutado que torna a cepa sensível às tetraciclinas que podeser obtida através do processo de qualquer uma das reivindicações anteriores.

19. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18,

em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo de tetraci-clina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, lime-ciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomicina eoutras clortetraciclinas.

20. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das

. reivindicações 18 ou 19, em que a cepa progenitora é selecionada do grupode Bifidobacteriaceas que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacte-rium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bi-fidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

21. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 20, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifido-bacterium animalis subespécie lactis.

22. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 até 21, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium ani- malis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 desetembro de 2003 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen sob o número de acesso DSM15954.

23. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 até 22, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium ani-malis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17280.

24. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 até 23, em que a Concentração Inibidora Mínima de anti-biótico (MIC) da cepa-progenitora é pelo menos-10 vezes maior que a MICda cepa sensível a antibiótico.

25. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 23, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) datetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e aMIC da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma de tetraciclina/mL ouinferior.

26. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 23, caracterizada pelo fato de que é susceptível a umaconcentração de tetraciclinas que é 1,0 ug/mL ou inferior de acordo com oensaio de seleção da susceptibilidade com o teste E.

27. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 25, em que o gene tetW compreende pelo menos uma

seqüência selecionada do grupo da SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC], da SEQID NO: 6 [GTG.GTT TAG TCT] e da SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT CJ.

28. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 27,em que o gene tetW compreende a SEQ ID 3 [GGA TAC TGA ACC].

29. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 27, em que o gene tetW compreende a SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT].

30. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 27,em que o gene tetW compreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C].

31. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 até 25, em que o gene tetW compreende as seqüências da

SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A] e da SEQ ID NO: 29 [AT ATT GTCATC A].32. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 18 até 25, em que o gene tetWcompreende as seqüências daSEQ ID NO: 30 [TA GAC GAT GGA A], da SEQ ID NO: 31 [CG GTC CGGGTA A] e da SEQ ID NO: 32 [CT GAT CCG GCC TT].33. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18,

que é identificada como Bifidobacterium animalis subespecie lactis cepaCHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 30 de abril de 2005 junto aDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o númerode acesso DSM17281. 34. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 18,

que é identificada como Bifidobacterium animalis subespecie lactis cepaCHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto aDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o númerode acesso DSM 17282. 35. Cepa de Bifidobacterium que é sensível às tetraciclinas por

causa de uma mutação no tetW a dita cepa Bifidobacterium sendo derivadade uma cepa progenitora que é resistente às tetraciclinas por causa da pre-sença de um tetW localizado no cromossomo.

36. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 35, em que as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo que consis-

. te em tetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxicicli-na/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraci-clina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

37. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 ou 36, em que a cepa progenitora é selecionada do grupo

que consiste em Bifidobacteriacea compreendendo Bifidobacterium longum,Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacteri-um lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

38. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 37, em que a cepa progenitora é uma cepa de Bifido-bacterium animalis subespecie lactis.

39. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 38, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium ani-malis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 desetembro de 2003 junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen sob o número de acesso DSM15954.

40. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das

reivindicações 35 até 39, em que a cepa progenitora é Bifidobacterium ani-malis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob onúmero de acesso DSM 17280.

41. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das

reivindicações 35 até 40, em que a Concentração Inibidora Mínima de anti-biótico (MIC) da cepa progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MICda cepa sensível a antibiótico.

42. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 40, em que a Concentração Inibidora Mínima (MIC) da

tetraciclina da cepa progenitora é de pelo menos 10 microgramas/mL e aMIC da cepa sensível a antibiótico é de 1 micrograma de tetraciclina/mL ouinferior.

43. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene

tetWcompreende pelo menos uma seqüência selecionada do grupo da SEQID 3 [GGA TAC TGA ACC], da SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT] e daSEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C].

44. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene

tetW compreende as seqüências da SEQ ID NO: 28 [CG CCC TGC CAC A]e da SEQ ID NO: 29 [AT ATT GTC ATC A].

45. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 42 ou das reivindicações 72 até 74, em que o gene

tetW compreende as seqüências da SEQ ID NO: 30 [TA GAC GAT GGA A],da SEQ ID NO: 31 [CG GTC CGG GTA A] e da SEQ ID NO: 32 [CT GATCCGGCCTT].

46. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43,em que o gene tetWcompreende a SEQ ID NO: 3 [GGA TAC TGA ACC].

47. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43,em que o gene terl/f compreende a SEQ ID NO: 6 [GTG GTT TAG TCT].

48. Cepa de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 43, em que o gene tetW compreende a SEQ ID NO: 27 [AC CAG CGT TTT C].

49. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 46 ou das reivindicações 72 até 74, que é identificadacomo Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC8902 (Bb-12Tet- S139) e depositada em 28 de abril de 2005 junto a Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM 17281.

50. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 45, da reivindicação 47 ou das reivindicações 72 até74, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa ; CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto aDeutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o númerode acesso DSM 17282.

51. Uso de uma cepa de Bifidobacterium como definida emqualquer uma das reivindicações 18 até 50, para a preparação de um mate- rial que pode ser ingerido ou de uma cultura bacteriana.

52. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que a cultura bac-teriana é adicionalmente processada.

53. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o materialque pode ser ingerido é um alimento ou um produto alimentício fermentado.

54. Uso de acordo com a reivindicação 53, em que o alimento ou

o produto alimentício fermentado é adicionalmente processado.

55. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que o materialque pode ser ingerido compreende Bifidobactérias em uma quantidade deaproximadamente 105 UFC/g até aproximadamente 1012 UFC/g de material que pode ser ingerido.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até55, em que o material que pode ser ingerido é uma composição selecionadado grupo que consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base deleite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite,concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebi-das, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, formulas para bebês e leite de soja.

57. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até

56, em que o material que pode ser ingerido é utilizado para a preparação deuma composição para-o tratamento-e/ou para a prevenção-de uma doença,síndrome ou estado de saúde ou para melhorar a digestão de nutrientes ou para melhorar o estado de saúde geral de um ser humano ou de um animalvertebrado.

58. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 51 até

57, em que o material que pode ser ingerido é utilizado como um probiótico.

59. Uso de acordo com as reivindicações 51 ou 58, em que o material que pode ser ingerido é uma composição selecionada do grupo que

consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidi-ficado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, concentradode leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes,produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês, comprimidos,cápsulas, suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral seco, suple-mento oral úmido, alimentação em tubo seco ou alimentação em tubo úmido.

60. Uso de acordo com a reivindicação 51, em que a dita doen-ça, síndrome ou estado de saúde é selecionada do grupo que consiste emdistúrbios associados a antibióticos, gastroenterite, diarréia incluindo a diar- réia dos viajantes e a diarréia infantil aguda, intolerância à lactose, infecçõesgastrointestinais e colonização do trato gastrointestinal por bactérias patogê-nicas incluindo Helicobacter pylori e Clostridium difficile, síndrome do intesti-no irritável (IBS), doença inflamatória dos intestinos (IBD), câncer de cólon,infecções e tumores urogenitais, infecções vaginais, alergia (especialmente eczema atópico), vacinação, colestrolemia e hipertensão.

61. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 57 até60, em que o material que pode ser ingerido é adequado para a prevençãoou para o tratamento de infecções por agentes patogênicos.

62. Alimento ou produto alimentício que compreende a cepabacteriana como definida em qualquer uma das reivindicações 18 até 50.

63. Uso de uma cepa de Bifidobacterium como definida em qualquer uma das reivindicações 18 até 50, para a preparação de uma cultu-ra de partida.

64. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura departida é congelada.

65. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura de partida é seca por congelamento.

66. Uso de acordo com a reivindicação 63, em que a cultura departida é seca por spray/em leito fluidizado.

67. Composição de cultura de partida que compreende a bacté-ria de qualquer uma das reivindicações 18 até 50, preferencialmente em que a composição de cultura de partida possui uma concentração de células viá-veis, que está na faixa de 104 até 1012 UFC por grama da composição.

68. Composição de cultura de partida de acordo com a reivindi-cação 67, que em adição compreende um ou mais agentes crioprotetoresselecionados do grupo que consiste em inosina-5'-monofosfato (IMP), ade- nosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-. 5'-monofosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, u-racila, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina,hipoxantina, orotidina, timidina, inosina e um derivado de qualquer um detais compostos.

69. Processo para a produção de uma cultura de partida conge- lada que compreende as etapas a seguir:

1. cultura de uma cepa bacteriana como definida nas reivindica-ções 18 até 50

2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bac- teriana concentrada,

3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de ma-terial congelado e4. embalamento do material seco por congelamento em um reci-piente adequado.

70. Processo para a produção de uma cultura de partida secapor congelamento que compreende as etapas a seguir:

1. cultura de uma cepa bacteriana como definida nas reivindica-

ções 18 até 50

2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bac-teriana concentrada, ------ -

3. congelamento do material bacteriano para a obtenção de ma- terial congelado,

4. sublimação da água do material congelado e

5. embalamento do material seco por congelamento em um reci-piente adequado.

71. Processo de acordo com as reivindicações 69 ou 70, em que etapa 3 é realizada mergulhando a cultura concentrada em nitrogênio líquido

e coletando o material congelado.

72. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende pelo menos umaseqüência selecionada do grupo de [ATACTGAA], [GGTTTAGT] e [CAGCGTTT].

73. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende as seqüências[CCCTGCCA] e [ATTGTCAT].

74. Cepa de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 35 até 42, em que o gene tetW compreende as seqüências

[GACGATGG], [GTCCGGGT] e [GATCCGGC].

A invenção é ilustrada nos exemplos e nas tabelas não limitan-tes a seguir, em que a Tabela 1 é uma descrição dos oligonucleotídeos utili-zados para as análises de PCR e para o seqüenciamento do DNA do gene tefWque codifica resistência à tetraciclina de Bb-12® e HN019.

A Tabela 2 é a seqüência de DNA de tetWe o gene da transpo-sase a montante, tps, de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12® (SEQID 22). A seqüência de nucleotídeos do gene TetWe as regiões flanqueado-ras de Bifidobacterium animalis subsp. lactis Bb-12®.

A seqüência foi obtida através do seqüenciamento em Chr. Han-sen A/S. A montante fica o quadro aberto de leitura que codifica a transpo- sase, nt. N° 4-966, com o aminoácido representado sob a seqüência de DNA(M. W. aprox. 35 kDa). A seqüência de nt. N° 1318-3234 é o gene que codi-fica resistência à tetraciclina, tetW, com o aminoácido sublinhado sob a se-qüência de DNA. (M. W. aprox. 70 kDa).

A mutação âmbar na posição de nucleotídeo (nt) N° 1741 (nt N°424 em relação ao códon de início de tetW) para a cepa sensível à tetracicli-na, DR10Tet-S9X (CHCC9070), é indicada acima da seqüência de DNA. Amutação de alteração de quadro na posição de nt N° 2722 (nt N°1405 emrelação ao códon de início) para a cepa sensível à tetraciclina, Bb12Tet-S139 (CHCC8902), é indicada acima da seqüência de DNA. *): indica um códon de término.

Tabela 8-1: Lista de cepas de referência utilizadas para verificara detecção específica de Bb-12Tet-S139.

Tabela 9-1: Condições para o teste de estabilidade de culturassecas por congelamento. Tabela 9-2: Sobrevivência de culturas secas por congelamento (%).

Tabela 10-1. Sobrevivência em juco gástrico artificial (%). Médiade três experimentos.

Tabela 11-1. Tolerância aos ácidos biliares. Crescimento bacte-riano em placas de ágar MRS-Cisteína HCI suplementadas com 2 % p/v de sais biliares.

Tabela 12-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetra-ciclina de cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis edois derivados das mesmas.

Tabela 13-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetra- ciclina Bb-12 e 3 novos derivados das mesmas.EXEMPLOS

Exemplo 1: Inativação do gene tetWem duas cepas probióticas de Bifidobac-terium animalis subespécie lactis que expressam resistência à tetraciclina.

Uma abordagem mutagênica forte e dual foi utilizada para inati-var a resistência intrínseca à tetraciclina do genoma de Bifidobacerium ani-malis ssp. lactis cepa Bb-12® e cepa HN019 (DR10®). Isto incluía o trata- mento das células com o agente mutagênico, brometo de etídio (EtBr) se-guido pela irradiação de ultravioleta em uma escala mais forçada que a nor-mal quando os agentes mutagênicos são utilizados individualmente.Cepas e condições de cultura.

As cepas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® e HN019 (DR10®) foram obtidas da coleção de culturas de Chr. Hansen A/S,Horsholm, Denmark. A cepa Bb-12® de B. animalis subsp. lactis tem o nú-mero de acesso CHCC5445 na coleção de culturas de Hansen e é deposita-da junto a Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen(DSMZ) sob o número de acesso DSM 15954. A cepa HN019 (DR10®) B. animalis subsp. lactis foi isolada de um produto com fórmula para bebês dis-ponível comercialmente rotulado Femleaf DR-10 bifidus e vendido na Tailân-dia durante 2000. Possui o número de acesso CHCC7158 na coleção deculturas de Hansen e é depositada junto a DSMZ sob o número de acessoDSM 17280.

As duas cepas que são resistentes à tetraciclina (pelo menos 15

ug/mL, como determinado pelo procedimento com o teste E, Danielsen eWind, 2003), foram cultivadas rotineiramente sob condições anaeróbicas a37°C em caldo Difco-MRS (deMan 1960), suplementado com 0,05% de clo-ridrato de Cisteína (Cisteína-HCI, Merck Chemicals) assim como em ágar MRS (1,5% de ágar) com a mesma concentração de Cisteína-HCI e 15 ugde tetraciclina por mL.

Tratamento mutagênico de Mutagenic de Bb-12

Uma alíquota (2%) de uma Bb-12® cultivada durante a noite (on)em MRS foi transferida para caldo MRS fresco (10 mL sem tetraciclina) con- tendo 20 ug/mL de brometo de etídio (EtBr) e incubada até a densidade óp-tica [DO] a 600 nm, de 0,35. As células em crescimento exponencial foramentão submetidas à irradiação com UV (reticulador com UV, Stratagene) emuma placa de Petri aberta durante 5 min (70 mJ/cm2). O tratamento com UVfoi repetido uma vez após um intervalo de escuridão de 5 min à temperaturaambiente. O tratamento foi ajustado para a obtenção de uma letalidade deaproximadamente 90%. A letalidade foi avaliada como a seguir: A viabilidadedas células imediatamente após os tratamentos com EtBr-UV foi determina-da através do plaqueamento das células em ágar MRS sem tetraciclina e aletalidade foi calculada partindo da UFC observada.

— - ■ Um ml_ da cultura que sofreu mutagênese foi então transferido

para 9 ml_ de MRS fresco sem a adição de EtBr e foi então permitido quecrescesse durante um período de 16 horas a 37°C em escuridão completa,em cujo ponto as alíquotas das células tratadas foram inoculadas novamente(1% [vol/vol]) em caldo MRS fresco e permitidas que crescessem durantemais 16 horas.

Exemplo 2: Seleção de variações sensíveis à tetraciclina de duas cepas pro- bióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.Procedimento de seleção

A seleção em relação a isolados sensíveis à tetraciclina foi reali-zada após um procedimento de enriquecimento com ampicilina (Miller, 1972)adaptado para Bifidobacteriae ter sido realizado. Sucintamente, o procedi- mento com ampicilina foi realizado através da transferência de uma alíquota. (1 %) da cultura que sofreu mutagênese com crescimento superado parameio MRS fresco (10 ml_) e cultivando as células até uma D06oo de 0,2 sema adição de tetraciclina. 0,5 mL desta cultura foi utilizado para inocular 10 mLdo caldo MRS contendo 10 microgramas de tetraciclina/mL e incubado du-rante 2 h a 37°C à tensão de oxigênio reduzida, após o que a ampicilina foiadicionada a uma concentração final de 150 microgramas/mL e a cultura foiincubada continuamente durante 16 h a 37°C. Como a ampicilina mata ape-nas células em crescimento (isto é, células TetR) e não as células que nãoestão se dividindo (isto é, células Tef mutantes), a adição da ampicilina po-de ser considerada uma etapa de enriquecimento para o isolamento subse-qüente de mutantes Tef. As células foram coletadas por centrifugação(4.000 x G durante 5 min a 4°C) e lavadas duas vezes com caldo MRS fresco.Após o enriquecimento com ampicilina, a seleção em relação aisolados sensíveis à tetraciclina foi realizada através do plaqueamento dasalíquotas das células lavadas sobre ágar MRS em uma diluição apropriadapara fornecer aproximadamente 150 colônias por placa após a incubação a 37°C durante 20 horas.

As colônias sensíveis à tetraciclina foram identificadas por pla-queamento de réplicas em ágar MRS sem antibióticos e ágar MRS contendo~10 ug~de~tetraciclina por mL, sobre o qual os isolados sensíveis à tetraciclinaeram incapazes de crescer. Finalmente, as colônias sensíveis à tetraciclina foram cultivadas em caldo MRS. O DNA genômico total foi isolado tanto dosclones sensíveis à tetraciclina quanto da cepa resistente à tetraciclina paracaracterização intensiva. A seleção das réplicas resultou em 155 isoladossensíveis à tetraciclina de CHCC5445 de um total de aproximadamente4.000 colônias verificadas. De CHCC7158, foram isoladas 43 colônias sen- síveis à tetraciclina de aproximadamente 1.000 células. Todas estas colôniasforam adicionalmente testadas em caldo MRS líquido contendo tetraciclina(10 ug/mL). Uma fração substancial de falsos positivos (aprox. 85 %) conse-guiu crescer sob estas condições. Os isolados sensíveis à tetraciclina res-tantes foram submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina.

O teste E foi realizado de acordo com o método do fabricante(AB BIODISK, Suécia), ligeiramente modificado por M. Danielsen e A. Wind(2003). Sucintamente, a determinação do valor da Concentração InibidoraMínima (MIC) para os isolados individuais foi realizada mergulhando um swab de algodão esterilizado dentro de uma cultura crescida durante a noiteda cepa sensível à tetraciclina que devia ser testada e esfriando a superfícieinteira de uma placa de ágar MRS (diâmetro: 8,5 cm) igualmente em trêsdireções. Após secar o inóculo aplicado, uma tira de teste E foi aplicada nasuperfície do ágar através do auxílio de um aplicador manual com a escala de MIC voltada para cima. As placas foram inoculadas de forma anaeróbicadurante a noite em uma posição invertida a 37 °C. O valor da MIC foi deter-minado através da leitura do valor em que o limite da elipse de inibição inter-secta a tira. Na maior parte dos casos variava entre 2 e 4 ug/mL Apenasdois isolados, um derivado de CHCC5445, chamado de Bb12Tet-S139 e umderivado de CHCC7158, chamado de DR10Tet-S9X, demonstraram umasensibilidade maior à tetraciclina com um valor de MIC de 0,5 ug/mL.Exemplo 3: Caracterização molecular dos derivados sensíveis à tetraciclinade duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.Amplificacão pela PCR e seqüenciamento do DNA do gene tetW

O DNA genômico foi preparadopartindo de Bb-12® do tipo sel-vagem e dos dois isolados sensíveis à tetraciclina através do uso do proto-

colo Easy-DNA para o isolamento do DNA de bactérias gram-positivas deacordo com as instruções do fabricante (Qiagen).

O gene tetW das variações sensíveis foi caracterizados atravésde análises da PCR de acordo com o protocolo de Innis e Gelfand (1990) e oDNA foi seqüenciado para testar em relação a mutações possíveis em tal

gene. O quadro aberto de leitura inteiro (ORF, aprox. 2,0 kb) de tetWío\ am-plificado partindo de cada isolado em três fragmentos sobrepostos (A, B e C)com três conjuntos de iniciadores (tabela 1, tabela 2).

O Fragmento A (aprox. 785 pb) foi amplificado com o iniciadorsenso: íeM/x.D1, derivado de uma seqüência de 296 pb a montante do có-

don de início do gene tetWe o iniciador anti-sentido: tetWx.R2, derivado do. ORF de tetW. O Fragmento B (aprox. 935 pb) foi amplificado com o iniciadorsenso: tetWx.D4 e o iniciador anti-sentido: tetWx.R5 do ORF de tetW. OFragmento C (920 pb) foi amplificado com o iniciador senso: tefl/Vx.D3 deri-vado do ORF e o iniciador anti-sentido: teíWx.R4 262 pb a jusante do códon

de término do gene tetW.

Os fragmentos amplificados partindo das três reações de PCRforam submetidos à eletroforese em gel de agarose (0,7%) e à coloração emEtBr e foram identificados com iluminação com UV. As bandas correspon-dendo aos três fragmentos gênicos amplificados foram cortadas do gel e o

DNA foi extraído (kit de extração do gel QIAquick da Qiagen). Os produtosda PCR purificados foram clonados no vetor plasmideal, pCR2.1-TOPO (In-vitrogen), para a determinação da seqüência de nucleotídeos utilizando osiniciadores para frente e para trás M13. O seqüenciamento do DNA dos ge-nes tetW de cada um dos isolados sensíveis à tetraciclina individuais comvalores do teste E de 2-4 ug/mL demonstrou que o gene de resistência àtetraciclina não tinha sido afetado ou mutado nestes isolados e era 100% ho- mólogo ao gene tetW na Bb-12® do tipo selvagem representada na Tabela 2.

O seqüenciamento dos genes tetW dos dois isolados com valo-res do teste E para tetraciclina de 0,5 ug tetraciclina/mL mostrou que emambos os casos o gene tetWíol afetado. O Bb12Tet-S139 (um derivado deCHCC5445) demonstrou uma alteração de quadro na posição de nucleotí- deo N°2722, em que um resíduo de timidina foi deletado como ilustrado a-baixo na Tabela 2.

Seqüência de aminoácidos: - Ser Leu Gly Tyr Leu Asn Gln SerBb-12® (CHCC5445) nt N° 2710: - TCG CTG GGA TAC TTG AAC CAG AGT -

Bb12Tet-S139 (CHCC8902) nt N° 2710: - TCG CTG GGA TAC TGA ACC AGA GTT -

Seqüência de aminoácidos: - Ser Leu Gly Tyr opal (códon de

término).

A ilustração acima mostra uma seqüência parcial do gene tetWem CHCC5445. O resíduo de timina sublinhado em Bb-12® (nt: 2722 na se- qüência de tetW) é deletada no mutante de alteração.de quadro, Bb12Tet-S139, resultando em um códon de término opal/sem sentido 170 aminoáci-dos próximo ao produto do gene tetWóo tipo selvagem, [nt N°2722 possui onúmero de posição de nt N° 1405 na seqüência de tetW na Tabela 2, SEQID 22]. O seqüenciamento do DNA do gene tetW do outro isolado sen-

sível à tetraciclina DR10Tet-S9X, um derivado da cepa HN019(CHCC7158), demonstrou uma transição de uma citidina para um resíduo detimidina na posição de nucleotídeo N° 174, gerando imediatamente assimum códon de término da tradução âmbar como apresentado na Tabela 2. Seqüência de aminoácidos: - Gln Ser Vai Vai Gln Ser Vai Arg -

DR10® (HN019, CHCC7158) nt N° 2729: -CAG AGC GTG GTT ÇAG TCTGTT CGG-DR10Tet-S9X (CHCC9070) nt N° 2729: -CAG AGC GTG GTTTAG TCT GTT CGG -

Seqüência de aminoácidos: - Gln Ser Vai Vai âmbar (códon de

término).A ilustração anterior mostra uma seqüência parcial do gene tetW

em CHCC7158, que é idêntica ao gene tetWem CHCC5445. O resíduo decitidina sublinhado em HN019 (nt: 1741) é substituído por um resíduo de ti-midina na cepa mutante, resultando em um códon de término âmbar/semsentido 498 aminoácidos próximo ao produto gênico tetWáo tipo selvagem, [nt N° 1741 possui a posição de nt número N° 424 na seqüência de DNA detetW na Tabela 2, SEQ ID 22].

Exemplo 4: Estabilidade genética dos isolados sensíveis à tetraciclinaBb12Tet-S139 (CHCC8902). DR10Tet-S9X(CHCC9070) e Bb12Tet-S180.Determinação das taxas de retromutacão através do plaqueamento das célu- Ias em áqar MRS com tetraciclina

Um mL de uma cultura da cepa mutante Bb12Tet-S139 (1,6 x10"9 células/mL) cultivado durante a noite foi espalhado com 50 uL cada so-, . bre 20 placas de Petri (diâmetro: 13,8 cm) com ágar MRS suplementadocom tetraciclina (15 ug/mL). Após 24 horas de incubação anaeróbica a 37°C, nenhuma colônia podia ser detectada sobre as placas demonstrando que a, taxa de reversão é menor que 1,6 x 10~9.

O mesmo teste de estabilidade foi realizado para a cepaDR10Tet-S9X. Uma cultura crescida durante a noite desta cepa (1,1 x 10'9células/mL) foi similarmente espalhada com 50 uL cada sobre 20 placas dePetri com ágar MRS suplementado com tetraciclina (15 ug/mL). Após o perí-odo de incubação, foram detectadas 19 colônias resistentes à tetraciclina. Ataxa de reversão para a mutação âmbar foi calculada em 1,8 x 10"8.

A taxa de reversão para a cepa Bb12Tet-S180 foi calculada em

1,7 x10-7. Exemplo 5: Testes fisiológicos e fenotípicos das duas cepas sensíveis à te-traciclina, Bb12Tet-S139 (CHCC8902) e DR10Tet-S9X(CHCC9070).Condições de crescimento de cepas mutantes em caldo MRS.O crescimento da Bb12Tet-S139 e da DR10Tet-S9X foi compa-rado (em triplicatas) com suas cepas-mãe, CHCC5445 e CHCC7158, res-pectivamente, cultivadas sob condições similares em caldo MRS (200 mLcom Cisteína-HCI) ao longo de um período de 24 horas. As amostras para a medida da densidade óptica a 600 nm foram todas monitoradas ao longo doperíodo de incubação. As taxas de crescimento para ambos os mutanteseram similares àquelas das cepas do tipo selvagem parentais indicando queo tratamento mutagênico dos isolados sensíveis à tetraciclina não pareciaimpedir os genes em suas vias fermentativas.

Taxas de acidificação dos dois mutantes de tetW.

A acidificação (caldo MRS), isto é, a conversão do piruvato emácido láctico, foi monitorada (em duplicatas) ao longo de um período de 6horas e comparada com a das cepas-mãe respectivas crescidas sob asmesmas condições. Não foi observada qualquer diferença óbvia na taxa de

acidificação entre os derivados mutantes de CHCC5445 e CHCC7158 e su-as cepas-mãe.

Análise de impressão digital finqerprintinq do DNA.

A eletroforese em gel em campo pulsado do DNA genômico di-gerido com Spel e Xbal proveniente das duas cepas tetW mutantes foi reali-

zada de acordo com os métodos padronizados (Hung e Bandziulis, 1990) enão revelou qualquer rearranjo do padrão cromossômico digerido com Spelou com Xbal quando comparado como o das respectivas cepas do tipo sel-vagem. Isto adiciona evidência a uma estrutura básica isogênica global dosmutantes e das cepas-mãe.

Exemplo 6: A análise da expressão gênica do qenoma inteiro (transcriptômi-ca) mostra que a expressão gênica de Bb12Tet-S139 é indistinguível da deBb-12®.

Materiais & MétodosPlanejamento e produção de microarranjos de qenoma inteiro para Bb12 Os presentes inventores seqüenciaram previamente e montaram

microarranjos de genoma inteiro para Bb12® (Garrigues e outros 2005). Su-cintamente, Bb-12® foi seqüenciado com pistola, resultando em 56 contí-guos. Através da análise adicional das montagens, era evidente que apenasdois por cento das seqüências estavam faltando. Dentro de quase 2,0 Mb daseqüência do genoma, foram identificadas 1612 supostas CDSs (seqüênciascodificadoras). Um oligo específico de 65-75mer foi planejado para cada ge- ne com algumas exceções, tais como supostos genes muito pequenos. Paradois genes, foram planejados vários oligos. Em um todo, foram planejados1569 oligos partindo da seqüência. Em adição, foram planejados mais de100 oligos de controle: Os~ oligos foram "impressos" sobre lâminas Ultra-GAPS (Corning B. V., Schiphol-Rijk, Holanda) em quatro cópias em réplica como descrito anteriormente (Pedersen e outros 2005).

As amostras de RNA foram coletadas em RNAprotect (QIAGEN,Valencia, CA, USA) para estabilizar um perfil de expressão e o RNA total foiisolado (RNeasy, QIAGEN). 10 ug de RNA foram copiados em cDNA utili-zando o CyScribe Post-Labelling Kit com 1,65 ug do nonâmero aleatório co-mo iniciador (Amersham Biosciences, Hillerod, Dinamarca). A condição deteste foi marcada com Cy5 e a condição de referência com Cy3. As duasamostras foram agrupadas e metade delas foi hibridizada ao arranjo. Ao in-vés de 50% de formamida recomendados no protocolo, foram utilizados 60%(estas condições foram estabelecidas previamente utilizando oligos de con- trole). Após aproximadamente 18h de hibridização, o arranjo foi lavado (Cor-. ning B.V.), verificado por varredura e pré-analisado como descrito anterior-mente (Pedersen e outros 2005). Os dados do arranjo foram importados pa-ra Acuity 4.0 (Axon Instruments Inc., Union City, CA, USA) onde foram nor-malizados com LOWESS. Foi criado um conjunto de dados com todos os pontos identificados. Foram removidos os dados dos oligos em que apenas0, 1 ou 2 dos 4 pontos em réplica foram identificados. Similarmente, foramremovidos os dados dos oligos em que o desvio padrão entre Iog2(propor-ção)ões normalizadas era >0,5.Resultados

A expressão gênica de Bb12Tet-139S foi comparada com a de

Bb12 utilizando microarranjos do genoma inteiro. Culturas estacionárias deambas as cepas foram inoculadas a 1% (DO600=0,06) em MRS fresco +0,05% de cisteína • HCI pré-aquecidos a 37°C. A DO600 foi então medida acada 30 min. Na faixa de DO de 0,1-1,0 UA (unidades de absorção), o cres-cimento era exponencial. A taxa de crescimento específica, u, era de 0,50 h'1(R2=0,9977) e 0,51 h"1 (R2=0,9953) para Bb-12® e Bb12Tet-S139, respecti- vãmente. Conseqüentemente, não há diferença significativa entre as taxasde crescimento das duas cepas. Partindo das amostras de RNA em DO=1,0UA (após seis horas e meia de crescimento) foram produzidos microarran-jos7"Bb12Tet-S139e Bb-12® eram as condições de teste e de referência,respectivamente. Dos 1569 genes representados no microarranjo, foram ob-

tidos dados reguladores significativos partindo de 1271 genes.

Como uma regra prática, um gene é freqüentemente considera-do como sendo expresso de forma diferencial se for >2 vezes regulado paramais ou para menos entre as duas condições (ver, por exemplo, Pedersen eoutros 2005). Nenhum dos 1271 genes no conjunto de dados era expresso

diferencialmente mais que >2 vezes. Em comparação, quando Bb12 foi ex-posto a 0,1% de sal biliar, 86 e 123 genes eram >2 vezes regulados paramais e para menos, respectivamente (Garrigues e outros 2005). Entre estesgenes, 17 e 27 eram ainda >4 vezes regulados para mais e para menos,respectivamente. Isto mostra que se o metabolismo da célula for perturbado,

podem ocorrer alterações drásticas em relação à expressão gênica. Simi-larmente, quando 1% do fructooligossacarídeo (FOS) foi adicionado ao meio,apenas 2 genes foram >2 vezes expressos de forma diferencial. Estes 2 ge-nes codificam proteínas envolvidas na utilização de FOS e eram reguladospara mais 5 vezes (Garrigues e outros 2005). Este último experimento mos-

tra que as condições de crescimento podem ser reproduzidas e que pertur-bações que afetam partes particulares do metabolismo podem ser identifica-das. Combinando os resultados acima, é evidente que em relação à expres-são gênica e ao estado fisiológico geral não são observados efeitos adver-sos em Bb12Tet-S139 comparado com Bb-12®. Baseado nisso, pode ser

assumido que Bb12Tet-S139 se comporta como Bb-12® exceto pela sensi-bilidade à tetraciclina.Exemplo 7: Detecção quantitativa específica ao mutante de Bb-12Tet-S139.

A fim de se obter um método para a detecção quantitativa deBB-12TET-S139, foi planejado um ensaio de PCR em tempo real com umasonda dual marcada. O alvo para o ensaio é o gene tetW, mais especifica- mente o sítio de deleção é alvo da sonda dual marcada.Iniciadores e sonda

Os iniciadores foram planejados com o auxílio do programa dis-ponível publicamente "Primer 3"------(http://frodo.wi.mit.edu/cgi-

bin/primer3/primer3_www.cgi). A sonda foi planejada manualmente. Deriva- dos de LNA (ácido nucléico fechado, uma tecnologia de propriedade perten-cente à Exiqon, Vedbaek, Dinamarca) foram incorporados na sonda com afinalidade de possibilitar o encurtamento da sonda e assim obter maior es-pecificidade. A temperatura de anelamento, a estrutura secundária e a hibri-dização de iniciador/sonda foram avaliadas com o auxílio de programas da Exiqon (http://lnatools.com). Os iniciadores foram obtidos da TAGC, Cope-nhagen, Dinamarca, a sonda marcada dual foi obtida da Exiqon, Vedbaek,Dinamarca.. . Reação da PCR em tempo real

A reação da PCR foi corrida no ABI 7500 (Applied Biosystems) sob condições padronizadas: 15 s de desnaturação a 95°C, 1 min de anela-, mento e alongamento a 60°C durante 40 ciclos. Foram utilizados os reagen-tes a seguir: TaqMan® Universal PCR Master Mix (concentrado 2x), 300 nMde iniciador para frente e de iniciador para trás, 200 nM de sonda. O volumede reação era de 25 uL. Resultados

Planejamento do ensaio

O planejamento do ensaio resultou nos iniciadores e na sonda aseguir: iniciador para frente 5'- CAA TAC AAG AGC CGG GTT TC, iniciadorpara trás 5'- GTG CTG ACC GGA CTG TAA TAA A -3', sonda 5'-FAM- AtActgaaccA-TAMRA-3' (FAM = Carbóxi-Fluoresceína; TAMRA = Carbóxi-Tetrametíl-rodamina). As letras minúsculas na seqüência da sonda indicamderivados de LNA. O tamanho do produto de amplificação é de 160 pb.Extração do DNA

O DNA foi extraído partindo de culturas puras com o auxílio do DNeasy Tissue Kit (Qiagen, Alemanha) seguindo as instruções do fabricante para a extração de bactérias gram-positivas. O DNA foi extraído de amostras fecais com o auxílio do QIAamp Stool DNA extraction Kit Qiagen, Alemanha) seguindo as instruções para a detecção de agentes patogênicos como descrito pelo fabricante.

Teste de especificidade ~

A especificidade do ensaio foi testada contra o tipo selvagem, algumas cepas de referência de Bifidobacterium (ver a tabela 8-1) e o DNA fecal de camundongo e humano.

O ensaio era completamente específico para BB-12TET-S139 e não foi observada qualquer amplificação acima do limite para o tipo selvagem ou qualquer uma das outras amostras de Bifidobacterium. Tabela 8-1: Lista de cepas de referência utilizadas para verificar a detecção específica de Bb-12Tet-S139.

<table>table see original document page 58</column></row><table>

Conclusão

Assim, este ensaio pode ser utilizado para identificar identify Bi- fidobacterium animalis ssp. lactis cepa BB- 12TET-S139.

Exemplo 8: Produção e estabilidade de culturas secas por congelamento

Foi realizada uma verificação da capacidade das cepas secas por congelamento formuladas de sobreviver a 30°C durante 3 semanas em 2 níveis diferentes de oxigênio e umidade.Materiais:

Bb-12® (DSM 15954); 2 volumes secos por congelamento e uma mistura de Bb-12Tet-S139 (DSM 17281). 2 volumes secos por congelamento e uma mistura. No total 6 amostras são utilizadas para o estudo. Os volumes secos por congelamento são produzidos de acordo com uma receita padronizada. As misturas são um volume seco por congelamento moído misturado com dextrose com uma atividade de água menor que 0,15. Métodos:

Cada amostra é dividida em 3 partes, que são tratadas como indicado na tabela 9-1 durante 3 semanas.

Tabela 9-1: Condições para o teste de estabilidade de culturas secas por congelamento.

<table>table see original document page 59</column></row><table>

Após o período de teste, é realizada uma análise de UFC/g duas vezes-em todas as amostras. ' UFC/g

Uma quantidade conhecida de amostra é homogeneizada com diluente e são preparadas diluições decimais. As diluições apropriadas são misturadas com Ágar MRS da OXOID adicionado de 0,05 % de cloridrato de

cisteína, então incubadas durante 3 dias a 37°C em uma câmara anaeróbica utilizando AnaerGen® da OXOID. São utilizadas pelo menos 4 placas de Pe-tri com 30 até 300 colônias para censo. Sobrevivência:

A sobrevivência é calculada como a seguir: % de Sobrevivência: (Log de UFC/g na amostra após tratamento

*100)/( Log de UFC/g na amostra de referência).Resultados:

São mostrados na tabela 9-2 abaixo. Tabela 9-2: Sobrevivência de culturas secas por congelamento (%)

<table>table see original document page 60</column></row><table>

Conclusão:

Não há diferença entre Bb-12® e Bb-12Tet-S139 em relação a sua sobrevivência durante 3 semanas a +30°C ou a sua sobrevivência em "alubags" seladas a +30°C e aprox. 15% de umidade relativa. Isto é verdadeiro tanto para culturas puras secas por congelamento assim como para culturas misturadas com excipientes (misturas).

Exemplo 9: Sobrevivência em suco gástrico artificial

A sobrevivência de uma bactéria probiótica ao longo do trato gastrointestinal humano é considerada como sendo um fator importanta>para, sua funcionalidade probiótica.

A cepa Bb-12® de Bifidobacterium animalis subsp. lactis possui

uma excelente tolerância ao suco gástrico e ao sal biliar. O teste in vitro utilizado para a tolerância a ácidos se baseia na medida da sobrevivência após sua exposição a um suco gástrico artificial.

A Bb-12Tet-S139 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis, culti-vada sob condições anaeróbicas durante a noite em MRS (Difco) a 37 °C, foi testada em relação a sua tolerância ao suco gástrico artificial comparada à BB-12.

O suco gástrico foi produzido misturando 2,0 g de cloreto de sódio (Merck 1.06404.1000) e 3,2 g de pó de pepsina (Sigma P-7000) em á-25 gua. Então 80 ml_ de ácido clorídrico a 1 M foram adicionados e a mistura foidiluída até 1000 ml_ com H20. O ajuste final até pH=2 foi feito com NaOH 5 M. A cultura bacteriana crescida durante a noite foi lavada três vezes com 0,9 % de diluente de solução salina suplementado com 1,5% de triptona a pH=7 e então adicionada ao suco gástrico seguido pela amostragem em in- tervalos de tempo diferentes.

A taxa de sobrevivência das células de cada amostra foi analisada através do plaqueamento das células em ágar MRS suplementado com 0,05% de Cisteína HCI e da determinação do número de unidades formadoras de colônias (u.f.c). As células foram expostas ao suco gástrico (pH=2) a 37°C até 90 min. O conjunto de dados (ver a tabela 10-1) foi analisado através do teste U de Mann-Whitney.

Tabela 10-1. Sobrevivência em suco gástrico artificial (%). Média de três experimentos<table>table see original document page 61</column></row><table> " Conclusão

Não foi observada qualquer diferença significativa entre BB-12® e Bb-12Tet-S139 em relação à tolerância aos ácidos gástricos. Exemplo 10: Tolerância aos ácidos biliares.

A sobrevivência de qualquer bactéria probiótica potencial ao lon- go do trato gastrointestinal humano é considerada como sendo importante para sua funcionalidade probiótica. A cepa Bb-12® de Bifidobacterium ani-malis subsp. lactis possui uma excelente resistência ao sal biliar.

No presente experimento, a cepa Bb-12Tet-S 139 de Bifidobacterium animalis subsp. lactis foi testada em relação a sua resistência aos extratos biliares bovinos e suínos comparada à de Bb-12®.

A tolerância para a bile foi analisada através do plaqueamento das células em placas de ágar suplementado com sal biliar de concentra-ções variáveis essencialmente como descrito por Noriega L. e outros Int. J. Food Microbiol 94, 79-86, 2004. As determinações da Concentração Inibido-ra Mínima (MIC) de ambas as cepas foram feitas em placas de ágar MRS-Cisteína HCI suplementado com diluições em série de duas vezes de extrato 5 biliar bovino (Sigma B3883) e biliar suíno (Sigma B8631) em concentrações de 2% até 0,062% p/v. Resultados

Foi mostrado que ambas as cepas eram tolerantes a concentrações de sais biliares de até pelo menos 2%. 10 Os experimentos foram realizados em triplicata. Os resultados

são mostrados na tabela 11-1.

Tabela 11-1. Tolerância aos ácidos biliares. Crescimento bacteriano em placas de ágar MRS-Cisteína HCI suplementado com 2 % p/v de sais biliares.

<table>table see original document page 62</column></row><table> + indica crescimento bacteriano evidente em todas as placas de ágar Conclusão

Tanto Bb-12® quanto Bb-12Tet-S139 são tolerantes a pelo menos 2% de ácidos biliares, indicando uma Concentração Inibidora Mínima que é maior que 2% para ambas as cepas. A tolerância aos sais biliares é indicativa da adaptação às condições no trato gastrointestinal.

Exemplo 11: Três novos derivados sensíveis à tetraciclina de duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis - isolamento e caracterização molecular dos mesmos.

Os três novos derivados foram cultivados, mutados, selecionado e caracterizados como descrito nos Exemplos 1, 2 e 3.

Bb-12Tet-S79 e Bb-12Tet-S180 são derivados de Bifidobacteri-um animalis subespécie lactis Bb-12®. DR10Tet-S33 é um derivado de

HN019(DR10®).

Bb-12Tet-S180,

O seqüenciamento do DNA do gene tetWúo isolado sensível à tetraciclina Bb-12Tet-S180, um derivado de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma transversão de uma a-denina para um resíduo de citidina na posição de nucleotídeo N° 2731 na Tab. 2 (SEQ ID 22) gerando uma substituição de aminoácido de uma Serina por uma Arginina como apresentado abaixo. Seqüência de aminoácidos: - Tyr Leu Asn Gln Ser Phe Gln Asn

Bb-12 (CHCC5445) nt N° 2719 - TAC TTG AAC CAG AGT TTT CAA AAC

Bb-12Tet-S180 nt N°2719 - TAC TTG AAC CAG CGT TTT CAA AAC Seqüência de aminoácidos: Tyr Leu Asn Gln Arg Phe Gln Asn

A seqüência anterior mostra uma seqüência de aminoácidos parcial do gene tetWencontrada em CHCC5445. O resíduo de adenina sublinhado em CHCC5445 (nt: 2731) é substituído por um resíduo de citidina na cepa mutante, resultando em uma substituição de aminoácido de 168 ami-. noácidos antes do códon de término da tradução. Vários DR10tet-S33 e Bb-12Tet-S79 mutantes. O seqüenciamento do DNA dos genes tetW dos isolados sensí-

. veis à tetraciclina DR10Tet-S33 e Bb-12Tet-S79 demonstrou substituições de dois e três nucleotídeos, respectivamente, das quais cada uma deu origem a uma substituição de aminoácido no produto do gene tetW como descrito abaixo. DR10tet-S33,

nt N° 1546[G] para 1546[T] no tripleto GGC para J_GC resultou em uma substituição de aminoácido de Glicina por Cisteína.

nt N° 1774[A] para 1774[G] no tripleto ATC para GTC resultou em uma substituição de aminoácido de Isoleucina por Valina. Ver a Tab. 2 (SEQ ID 22). Bb-12Tet-S79.

nt N° 1358[C] para 1358[A] no tripleto GÇT para GAT resultouem uma substituição de aminoácido de Alanina por Ácido aspártico.

nt N° 3023[A] para 3023[G] no tripleto CAG para CGG resultou em uma substituição de aminoácido de Glutamina por Arginina.

nt N° 3095[T] para 3095[C] no tripleto CTG para CÇG resultou em uma substituição de aminoácido de Leucina por Prolina. Ver a Tab. 2 (SEQID22). Sensibilidade,

Os isolados sensíveis à tet foram submetidos à seleção de sus-ceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Da-10 nielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina. O resultado é resumido na tabela 12-1 abaixo: Tabela 12-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetraciclina de cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis e dois derivados das mesmas.

<table>table see original document page 64</column></row><table>Exemplo 12: Classificação de variações sensíveis à tetraciclina de duas cepas probióticas de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

Como mencionado no Exemplo 2, aproximadamente 85 % dos supostos isolados "sensíveis à tetraciclina" conseguiram crescer em caldo MRS líquido contendo tetraciclina (10 ug/mL) Sob estas condições. Os 15% restantes dos isolados sensíveis à tetraciclina foram então submetidos à seleção de susceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Danielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina.Em geral, o teste E revelou duas classes de mutantes sensíveis à tetraciclina:

Ciasse 1: Crescimento a uma concentração de tetraciclina de 1,5 ug/mL ou inferior de acordo com o teste E; e 5 Classe 2: Crescimento a concentrações de tetraciclina > 1,5 ug/mL;

O gene teWfoi analisado em um número representativo de mutantes sensíveis à tetraciclina da Classe 1 e da Classe 2.

O resultadosendo:

Classe 1: Crescimento a uma concentração de tetraciclina < 1,5 ug/mL; são mutantes sensíveis à tetraciclina que são caracterizados por possuírem deleções de nucleotídeos (nt) ou substituições de nt, das quais algumas resultam na introdução de códons de término no quadro aberto de leitura do gene tetWe

Classe 2: Crescimento a concentrações de tetraciclina > 1,5 ug/mL; nenhuma mutação em tetW. Esta classe de mutações é mais provavelmente causada por mutações nas paredes celulares ou nas proteínas de transporte. . . Conclusão

Até agora, todas as mutações que são caracterizadas por um valor de teste E < 1,5 ug de tet/mL continham um tetW mu\%çij£. Isto abre . para um procedimento de seleção, que resulta na seleção de Bifidobactérias sensíveis à tetraciclina que, com uma alta probabilidade, contêm um gene fefWinativado.

Exemplo 13: Três derivados sensíveis à tetraciclina adicionais de uma cepa probiótica de Bifidobacterium animalis subespécie lactis - isolamento e caracterização molecular dos mesmos.

Os três novos derivados foram cultivados, mutados, selecionados e caracterizados como descrito nos Exemplos 1, 2 e 3.

Bb-12teMAS73, Bb-12teMAS14 e Bb-12teM/-S4 são derivados de Bifidobacterium animalis subespécie lactis Bb-12®. Bb-12tefW-S73,

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isoladosensível à tetraciclina Bb-12teftV-S73, um derivado de Bifidobacterium ani-malis subespecie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de uma timidina para um resíduo de guanina na posição de nucleotídeo N° 1573 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (TAC > GAC) gerando uma substituição de a-5 minoácido de uma Tirosina por um Ácido Aspártico. Bb-12tefW-S14.

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isolado sensível à tetraciclina Bb-12teMAS14, um-derivado de Bifidobacterium ani-malis subespecie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de uma timina para um resíduo de citosina na posição de nucleotídeo N° 2869 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (TCA > CCA) gerando uma substituição de aminoáci-do de uma Serina por uma Prolina. Bb-12tertV-S4.

O seqüenciamento do DNA do gene tetW partindo do isolado 15 sensível à tetraciclina Bb-12tefl/V-S4, um derivado de Bifidobacterium anima-lis subespecie lactis Bb-12® (CHCC5445), demonstrou uma alteração de uma adenina para um resíduo de guanina na posição de nucleotídeo N° 3176 na Tab. 2 (SEQ ID 22) (CAG > CGG) gerando uma substituição de uma Glutamina por uma Arginina.

Sensibilidade,

Os isolados sensíveis à tet foram submetidos à seleção de sus-ceptibilidade com o teste E de acordo com os métodos descritos por M. Da-nielsen e A. Wind (2003), para determinar seu limite de sensibilidade à tetraciclina. O resultado é resumido na tabela 13-1 abaixo:

Tabela 13-1. Concentrações Inibidoras Mínimas (MICs) de tetraciclina Bb-12 e 3 novos derivados da mesma.

<table>table see original document page 66</column></row><table>LISTAGEM DE REFERÊNCIAS

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tic susceptibility profiles of new probiotic Lactobacillus and Bifidobacterium strains. International Journal of Food Microbiology 98: 211 -217.Em Relação aos Organismos Depositados

Para todos os organismos microbianos mencionados no presente pedido de patente, se aplica o que vem a seguir.

Em relação às designações às quais a Patente Européia está buscando, uma amostra de microorganismos depositados será tornada disponível até a publicação da menção da expedição da Patente Européia ou até a data em que o pedido de patente por recusado ou retirado ou for con-sideradoeomo sendo retirado,- apenas pelo envio detal amostra a um perito nomeado pela pessoa que está requisitando a amostra e aprovado i) pelo Requerente e/ou ii) pelo escritório de patentes europeu (EPO), sempre que aplicável. (Rule 28 (4) e 30 28 (5) EPC).

INDICAÇÕES EM RELAÇÃO AO MICROORGANISMO OU A OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO DEPOSITADO Tabela 1

Oligonucleotídeos utilizados para as análise da PCR e seqüen-

ciamento do DNA do gene tetW que codifica resistência à tetraciclina de Bb-12.<table>table see original document page 69</column></row><table>

* A numeração se baseia na seqüência de DNA ilustrada na tabela 2. O pre- fixo "D" indica um iniciador direto derivado do filamento senso. O prefixo "R" indica um iniciador inverso complementar ao filamento senso. Tabela 2

A seqüência de DNA de tetW flanqueada pelo gene da transpo-sase a montante, tps, de Bifidobacterium animalis Bb-12 (SEQ ID 22).1 ORF que codifica uma Transposase

CAGATGACGATTTCCGCATTCAGCGACGAACTGGCACAGGTGCGGACGAAGAAAAAAGCA ------------------------------------------------------------ 60

GTCTACTGCTAAAGGCGTAAGTCGCTGCTTGACCGTGTCCACGCCTGCTTCTTTTTTCGT MTILAFS DELAQVRTKKKA

TTTCTCGACCAGATTGAACGGATCGTCCCGTGGAAGGAATGGCTTGCCATGATTCAGCCG

------------------------------------------------------------ 12o

AAAGAGCTGGTCTAACTTGCCTAGCAGGGCACCTTCCTTACCGAACGGTACTAAGTCGGC FLDQI E RI V P W KEWLAMIQP

TGCTATTACAAAGGAGAGCGCGGCAACAAACCCTATCCGCTGGAGATCATGCTCCGACTG

---^------------------------------------------•__---_-------- 180

ACGATAATGTTTCCTCTCGCGCCGTTGTTTGGGATAGGCGACCTCTAGTACGAGGCTGAC CYYKGERGNKPYPLEIMLRL

TATCTGCTGCAAAACCTCTATGACCTGAGTGACGAGGCCACGGTGGCAGAAGCCATCGAC

------------------------------------------------------------ 240

ATAGACGACGTTTTGGAGATACTGGACTCACTGCTCCGGTGCCACCGTCTTCGGTAGCTG YLLQNLYDLSDEATVAEAID

AGCCGCGCATTTTCGGAGTTCTGCGGCGTCGATTCCAGCAACCAGGTTCCGAACGGGGAT -------------------------------.----------_------------------ 300

TCGGCGCGTAAAAGCCTCAAGACGCCGCAGCTAAGGTCGTTGGTCCAAGGCTTGCGCCTA SRAFSEFCGVDSSNQVPNGD

ACTCTTGGCCGGTTCCGGAACTTGCTGATCAAGAACGGACTGCAGGAGAAGCTGTTCGCT ------------------------------------------------------------ 360

TGAGAACCGGCCAAGGCCTTGAACGACTAGTTCTTGCCTGACGTCCTCTTCGACAAGCGA T LGRFRNLL I KNGLQEKLFA

CAGGTGGTAGCAGCGCTCATGGAACGTGGCCTCATTCTGAAAAAGGGCACCATTGTAGAT

------------------------------------------------------------ 420

GTCCACCATCGTCGCGAGTACCTTGCACCGGAGTAAGACTTTTTCCCGTGGTAACATCTA QVVAALME R GLI LKKGT I V ■ D

TCCACCATCATTTCCGCCCCCTCTTCTACCAAGAATAAGGAAAAGAAACGGGATCCGGAT ------------------_----------------------------------------- 480

AGGTGGTAGTAAAGGCGGGGGAGAAGATGGTTCTTATTCCTTTTCTTTGCCCTAGGCCTA STIISAPSSTKNKEKKRDPD

GCCCACCAAGTCAAGAAGGGCAACACCTGGCACTTTGGGTACAAAGCGCATATCGGCGTG ------------------------------------------------------------ 540

CGGGTGGTTCAGTTCTTCCCGTTGTGGACCGTGAAACCCATGTTTCGCGTATAGCCGCAC AHQVKKGNTWHFGYKAHIGVGACAAGGACAGCGGACTGGTTCACACAGTGGAAGCTACACCGGCAAATGTCCACGACGTT

---------------------------------.--------------------------- 600

CTGTTCCTGTCGCCTGACCAAGTGTGTCACCTTCGATGTGGCCGTTTACAGGTGCTGCAA D K D S GLV H TVEAT PANVH DV

GCGGAAGTGCCGAAATTATTGACGGGAGAGGAAGAAACAGTCTATGGAGACAGCGGTTAT

-----------------------------------_---------_-------------- 660

CGCCTTCACGGCTTTAATAACTGCCCTCTCCTTCTTTGTCAGATACCTCTGTCGCCAATA AEVPKLLTGEEETVYGDSGY

CTCGGCGCAGGTAAGCGCGAAGATGCCGTAGTCCGAAACAAAGCTGGCCGGAAAATCAAG

------------------------------------------------------------ 720

GAGCCGCGTCCATTCGCGCTTCTACGGCATCAGGCTTTGTTTCGACCGGCCTTTTAGTTC L G AGK R É"'D AVV R N K A G R Kl K

TACAAGATCAATCGTCGTCCATCGCAGATGAAGAAACTGAGCAAAAGCGGGCAGTACGCA

------------------------------------------------------------ 780

ATGTTCTAGTTAGCAGCAGGTAGCGTCTACTTCTTTGACTCGTTTTCGCCCGTCATGCGT YKINRRPSQMKKLSKSGQYA

GCAAAGAAAGCGGAACGGGCGAAATCCTCAGTGCGAGCAAAAGTAGAGCATGTATTCGGT

------------------------------------------------------------ 840

CGTTTCTTTCGCCTTGCCCGCTTTAGGAGTCACGCTCGTTTTCATCTCGTACATAAGCCA AKKAERAKS SVRAKVEHVFG

GTCGTTAAGAAGCAGCTGCGCTTCCGAAAAACGCGATACCGAGGGCTTGAAAAGCAACAA

---i--------------------------------------------------------- 990

CAGCAATTCTTCGTCGACGCGAAGGCTTTTTGCGCTATGGCTCCCGAACTTTTCGTTGTT VVKKQLRFRKTRY RGLEKQQ

GCCAAATTCAATATCATGTTTGCGTTGGCAAATCTGATTCTGGCTGACAGACCCTGTCTG

-------------------------:----------------------------------- 960

CGGTTTAAGTTATAGTACAAACGCAACCGTTTAGACTAAGACCGACTGTCTGGGACAGAC AKFNIMFALANLILADRPCL

Término da Transposase

GCAGCTTGAGTCAGTGCGCCTTTGCGGACAAAAAATTCGGAGGTTATCCACAGTTTTTAT ------------------------------------------------------------ 1020

CGTCGAACTCAGTCACGCGGAAACGCCTGTTTTTTAAGCCTCCAATAGGTGTCAAAAATA A A *

TCGGCACCTGCTGTATAATGCGGATTGTGGCATTTGTGCGGTGTTGCCTTAAATAAAACT ------------------------------------------------------------ 1080

AGCCGTGGACGACATATTACGCCTAACACCGTAAACACGCCACAACGGAATTTATTTTGA

ATAATCAAATAGTGGGAACAAAGGATTATGATAGTCCCTTTTGTAGGGGCTTAGTTTTTT ------------------------------------------------------------ 1140

TATTAGTTTATCACCCTTGTTTCCTAATACTATCAGGGAAAACATCCCCGAATCAAAAAA

GTACCCAATTTAAGAATACTTTTGCCTTATCAATTTTGACATATCCCCAAAAACAGCACT ------------------------------------------------------.------- 1200

CATGGGTTAAATTCTTATGAAAACGGAATAGTTAAAACTGTATAGGGGTTTTTGTCGTGACACAAACAGGTGTATGCTGTATATGTGTATGTCCGCAAATTATCATCCCCAGTGGTAAAA --------------------------.---------------------------------- 1260

GTGTTTGTCCACATACGACATATACACATACAGGCGTTTAATAGTAGGGGTCACCATTTT

Início da Tetraciclina

GTATTTTACTGCTGGGGATTTTTATGCCCTTCGGGGCAGTAAAGGGAGGACAATCACATG

------------------------------------------------------------ X320

CATAAAATGACGACCCCTAAAAATACGGGAAGCCCCGTCATTTCCCTCCTGTTAGTGTAC

M

AAAATAATCAATATTGGAATTCTTGCCCATGTAGACGCTGGAAAGACGACCTTGACGGAG -------------------.----------------------------------------- 1380

TTTTATTAGTTATAACCTTAAGAACGGGTACATCTGCGACCTTTCTGCTGGAACTGCCTC Kl INI GI LAHV DAGKTTLTE

AGCCTGCTATATGCCAGCGGAGCCATTTCAGAACCGGGGAGCGTCGAAAAAGGGACAACG

----.-------------------------------------------------------- 1440

TCGGACGATATACGGTCGCCTCGGTAAAGTCTTGGCCCCTCGCAGCTTTTTCCCTGTTGC SLLYAS GAI SE PGSVEKGTT

AGGACGGACACCATGCTTTTGGAGCGGCAGCGTGGGATTACCATTCAAGCGGCAGTCACT ------------------------------------------------------------ 1500

TCCTGCCTGTGGTACGAAAACCTCGCCGTCGCACCCTAATGGTAAGTTCGCCGTCAGTGA RTDTMLL ERQRGI T IQAAVT

TCCTTCCAGTGGCACAGATGTAAAGTCAACATTGTGGATACGCCCGGCCACATGGATTTT

-----------------:------------------------------------------- 1560

AGGAAGGTCACCGTGTCTACATTTCAGTTGTAACACCTATGCGGGCCGGTGTACCTAAAA SFQWHRCKVNIVDTPGHMDF

TTGGCGGAGGTGTACCGCTCTTTGGCTGTTTTAGATGGGGCCATCTTGGTGATCTCCGCT ------------------------------------------------------------ 1620

AACCGCCTCCACATGGCGAGAAACCGACAAAATCTACCCCGGTAGAACCACTAGAGGCGA LAEVY RS LAVL DGAI LVI SA

AAAGATGGCGTGCAGGCCCAGACCCGTATTCTGTTCCATGCCCTGCGGAAAATGAACATT

------------------------------------------------------------ 1680

TTTCTACCGCACGTCCGGGTCTGGGCATAAGACAAGGTACGGGACGCCTTTTACTTGTAA KDGVQAQTR I L FHALRKMN I

CCCACCGTTATCTTTATCAACAAGATCGACCAGGCTGGCGTTGATTTGCAGAGCGTGGTT -----------------------------------------_------------------ 1740

GGGTGGCAATAGAAATAGTTGTTCTAGCTGGTCCGACCGCAACTAAACGTCTCGCACCAA PTVIFINKI DQAGVDLQSVV

nt N° 1741 -C substituído por T em DR10Tet-S9X

CAGTCTGTTCGGGATAAGCTCTCCGCCGATATTATCATCAAGCAGACGGTGTCGCTGTCC ------------------------------------------------------------ 1800

GTCAGACAAGCCCTATTCGAGAGGCGGCTATAATAGTAGTTCGTCTGCCACAGCGACAGG QSVRDKLSADI.I IKQTVSLS* (âmbar)

CCGGAAATAGTCCTGGAGGAAAATACCGACATAGAAGCATGGGATGCGGTCATCGAAAAT --------------------------_-------------------------:-------- 1860

GGCCTTTATCAGGACCTCCTTTTATGGCTGTATCTTCGTACCCTACGCCAGTAGCTTTTA PEIVLEENT.DIEAWDAVIEN

AACGATAAATTATTGGAAAAGTATATCGCAGGAGAACCAATCAGCCGGGAAAAACTTGTG

------------------------------------------------------------ 192o

TTGCTATTTAATAACCTTTTCATATAGCGTCCTCTTGGTTAGTCGGCCCTTTTTGAACAC NDKLLEKYIAGEPISREKLV

CGGGAGGAACAGCGGCGGGTTCAAGACGCCTCCCTGTTCCCGGTCTATTATGGCAGCGCC ------------------------------------------------------------ 1980

r GCCCTCCTTGTCGCCGCCCAAGTTCTGCGGAGGGACAAGGGCCAGATAATACCGTCGCGG REEQRRVQDASLFPVYYGSA

AAAAAGGGCCTTGGCATTCAACCGTTGATGGATGCGGTGACAGGGCTGTTCCAACCGATT

------------------------------------------------------------ 2040

TTTTTCCCGGAACCGTAAGTTGGCAACTACCTACGCCACTGTCCCGACAAGGTTGGCTAA KKGLGIQPLMDAVTGLFQPI

GGGGAACAGGGGAGCGCCGCCCTATGCGGCAGCGTTTTCAAGGTGGAGTATACAGATTGC

------------_---_-------------------------_----------------- 2100

CCCCTTGTCCCCTCGCGGCGGGATACGCCGTCGCAAAAGTTCCACCTCATATGTCTAACG GEQGSAALCGSVFKVEYTDC

GGCCAGCGGCGTGTCTATCTACGGCTATACAGCGGAACGCTGCGCCTGCGGGATACGGTG

------------------------------------------------------------ 2160

CCGGTCGCCGCACAGATAGATGCCGATATGTCGCCTTGCGACGCGGACGCCCTATGCCAC GQRRVYLRLYSGTLRLRDTV

GCCCTGGCCGGGAGAGAAAAGCTGAAAATCACAGAGATGCGTATTCCATCCAAAGGGGAA

------------------------------------.------------------------ 2220

CGGGACCGGCCCTCTCTTTTCGACTTTTAGTGTCTCTACGCATAAGGTAGGTTTCCCCTT ALAGREKLKI TEMRI PSKGE

ATTGTTCGGACAGACACCGCTTATCCGGGTGAAATTGTTATCCTTCCCAGCGACAGCGTG

----------.-------------------------------------------------- 2280

TAACAAGCCTGTCTGTGGCGAATAGGCCCACTTTAACAATAGGAAGGGTCGCTGTCGCAC IVRTDTAYPGEIVILPSDSV

' AGGTTAAACGATGTATTAGGGGACCCAACCCGGCTCCCTCGTAAAAGGTGGCGTGAGGAC

------------------------------------------------------------ 2340

TCCAATTTGCTACATAATCCCCTGGGTTGGGCCGAGGGAGCATTTTCCAGCGCACTCCTG RLNDVLGDPTRLPRKRWREDCCCCTCCCCATGCTGCGGACGTCGATTGCGCCGAAAACGGCAGCGCAAAGAGAACGGCTG

------------------------------------------------------------ 2400

GGGGAGGGGTACGACGCCTGCAGCTAACGCGGCTTTTGCCGTCGCGTTTCTCTTGCCGAC PL PMLRTS I APKTAAQRERL

CTGGACGCTCTTACGCAACTTGCGGATACTGACCCGCTTTTGCGCTGCGAGGTGGATTCC

-------------_--------------------------------------_------- 24 60

GACCTGCGAGAATGCGTTGAACGCCTATGACTGGGCGAAAACGCGACGCTCCACCTAAGG LDALiTQLADTDPLLRCBVDS

ATCACCCATGAGATCATTCTTTCTTTTTTGGGCCGGGTGCAGTTGGAGGTTGTTTCCGCT

------------------------------------------------------------ 2520

TAGTGGGTACTCTAGTAAGAAAGAAAAAACCCGGCCCACGTCAACCTCCAACAAAGGCGA I T H E I I LS FLG RVQLEVV SA

TTGCTGTCGGAAAAATACAAGCTTGAAACAGTGGTAAAGGAACCCACCGTCATTTATATG

---------------------------------------------:--------------- 2580

AACGACAGCCTTTTTATGTTCGAACTTTGTCACCATTTCCTTGGGTGGCAGTAAATATAC LLS E KYKLETVVKEPTVI Y M

GAGCGGCCGCTCAAAGCAGCCÀGCCACACCATCCATATCGAGGTGCCGCCCAACCCGTTT

--------------------.---------------------------------------- 2640

CTCGCCGGCGAGTTTCGTCGGTCGGTGTGGTAGGTATAGCTCCACGGCGGGTTGGGCAAA ERPLKAASHTIHIEVPPNPF

TGGGCATCCATCGGACTGTCTGTTACACCACTCCCGCTTGGCTCCGGTGTACAATACAAG

-----------------------------------------------------------_ 2700

ACCCGTAGGTAGCCTGACAGACAATGTGGTGAGGGCGAACCGAGGCCACATGTTATGTTC WASIGLSVTPLPLGSGVQYK

nt 2722-T deletado em Bb12Tet-S139

AGCCGGGTTTCGCTGGGATACTTGAACCAGAGTTTTCAAAACGCTGTCAGGGATGGTATC

-------------------------------------.----------------------- 2760

TCGGCCCAAAGCGACCCTATGAACTTGGTCTCAAAAGTTTTGCGACAGTCCCTACCATAG SRVSLGYLNQSFQNAVRDGI G Y * (opal)

CGTTACGGGCTGGAGCAGGGCTTGTTCGGCTGGAACGTAACGGACTGTAAGATTTGCTTT

--------------------------------------------------.---------- 2820

GCAATGCCCGACCTCGTCCCGAACAAGCCGACCTTGCATTGCCTGACATTCTAAACGAAA RYGLEQGLFGWNVTDCKICF

GAATACGGGCTTTATTACAGTCCGGTCAGCACGCCGGCGGACTTCCGCTCATTGGCCCCG

------------------------------------------------------------ 2880

CTTATGCCCGAAATAATGTCAGGCCAGTCGTGCGGCCGCCTGAAGGCGAGTAACCGGGGC EYGLYYS PVSTPADFRSLAPATTGTATTGGAACAGGCATTGAAGGAATCAGGGACGCAACTGCTGGAACCTTATCTCTCC

----------------------------------------------------------- 2940

TAACATAACCTTGTCCGTAACTTCCTTAGTCCCTGCGTTGACGACCTTGGAATAGAGAGG IVLEQALKESGTQliLEPYLS

TTCACCCTCTATGCGCCCCGGGAATATCTTTCCAGGGCTTATCATGATGCACCGAAATAC ------------------------------------------------------------ 3000

AAGTGGGAGATACGCGGGGCCCTTATAGAAAGGTCCCGAATAGTACTACGTGGCTTTATG FTLYAPREYLSRAYHDAPKY

TGTGCCACCATCGAAACGGTCCAGGTAAAAAAGGATGAAGTTGTCTTTACTGGCGAGATT

------------------------------------------------------------ 3060

ACACGGTGGTAGCTTTGCCAGGTCCATTTTTTCCTACTTCAACAGAAATGACCGCTCTAA CATI ETVQVKKDEVVFTGEI

CCCGCCCGCTGTATACAGGCATACCGTACTGATCTGGCCTTTTACACCAACGGGCAGAGC

-----------------------------------------------------------_ 312o

GGGCGGGCGACATATGTCCGTATGGCATGACTAGACCGGAAAATGTGGTTGCCCGTCTCG PARCIQAYRTDLAFYTNGQS

GTATGCCTTACAGAACTGAAAGGGTATCAGGCCGCTGTCGGCAAGCCAGTCATCCAGCCC ------------------------------------------------------------ 3180

CATACGGAATGTCTTGACTTTCCCATAGTCCGGCGACAGCCGTTCGGTCAGTAGGTCGGG VCLTELKGYQAA. VGKPVIQP

Término da Tetraciclina

CGCCGTCCAAACAGCCGCCTGGACAAGGTGCGCCATATGTTCAGTAAGATCACTTGATAC -------------_--------------.-------------------------------- 3240

GCGGCAGGTTTGTCGGCGGACCTGTTCCACGCGGTATACAAGTCATTCTAGTGAACTATG RRPNSRLDKVRHMFSKIT*

Seqüência de nucleotídeos do transposon TetW inativo de Bifi-dobacterium animalis subsp. Lactis Bb-12®. A seqüência foi obtida através do seqüenciamento em Chr. Hansen A/S. A montante está o quadro aberto 5 de leitura que codifica a transposase, nt. N° 4-966, com o aminoácido representado sob a seqüência de DNA (M.W. de aproximadamente 35 kDa). A seqüência de nt. N° 1318-3234 é o gene que codifica resistência à tetraciclina, tetW, com o aminoácido representado sob a seqüência de DNA (M.W. de aproximadamente 70 kDa). 10 A mutação âmbar na posição de nt N° 1741 (ntN° 424 em rela-

ção ao códon de início de tetW) para a cepa sensível à tetraciclina, DR10Tet-S9X (CHCC9070), é indicada acima da seqüência de DNA.A mutação de alteração de quadro na posição de nt N° 2722 (nt N° 1405 em relação ao códon de início) para a cepa sensível à tetraciclina, Bb12Tet-S139 (CHCC8902), é indicada acima da seqüência de D NA.

*): indica um códon de término.Listagem de Seqüência

<110> Chr. Hansen A/S Chr. Hansen A/S

<120> LINHAGENS DE BACTÉRIAS DE ÁCIDO LÁCTICO SENSÍVEIS A ANTIBIÓTICOS

<130> P2195DK00

<150> EP 05010216.9 <151> 2005-05-11

<160> 32

<170> Patentln versão 3.3

<210> 1 <211> 24 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis. <400> 1

tcgctgggat acttgaacca gagt 24

<210> 2 <211> 24 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis. <400> 2

tcgctgggat actgaaccag agtt 24

<210> 3 <211> 12 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <400> 3

ggatactgaa cc 12

<210> 4 <211> 24 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <400> 4

cagagcgtgg ttcagtctgt tcgg 24

<210> 5 <211> 24 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <400> 5

cagagcgtgg tttagtctgt tcgg 24

<210> 6 <211> 12<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis <400> 6

gtggtttagt ct 12

<210> 7

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<22Ú>

<2 23> Oligonucleotídeo usado para análise era PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 7

gagcatcgct taattccttc gagggg 26

<210> 8

<211> 29

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<2 23> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 8

cgaggggact ttggcccacc gctgggtgg 2 9

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 9

gcaggcaggc acgtccatcc gcctc 25

<210> 10

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 10

ggcttctgcc accgtggcct cgtcac 2 6

<210> 11<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<22Q>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente deDNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 11

cctgtccttg tccacgccga tatgcgc 27

<210> 12

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<2 23> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente deDNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 12

cggcacctgc tgtataatgc ggattgtggc 30

<210> 13

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente deDNA da.resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12- para detalhes,, ver tabela 1.

<400> 13

gtgggaacaa aggattatga tagtccc 27

<210> 14

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<2 23> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente deDNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 14

ggctggcgtt gatttgcaga gcgtgg 2 6

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220><223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 15

gcagacggtg tcgctgtccc cgg 23

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo. usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 16

ccggggacag cgacaccgtc tgc 23

<210> 17

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de

DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1. <400> 17

ggagcggccg ctcaaagcag ccagcc 2 6

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 18

ggctggctgc tttgagcggc cgctcc 2 6

<210> 19

<211> 27

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12 - para detalhes, ver tabela 1.

<400> 19gcccaaaacg ggttgggcgg cacctcg 27

<210> 20

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 20

ccagcccgta acggatacca tece 24

<210> 21

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<2 23> Oligonucleotídeo usado para análise em PCR e seqüencialmente de DNA da resistência à tetracilina-codificando o gene tetW de Bb-12

- para detalhes, ver tabela 1.

<400> 21

gatggtcgca tgatcggcgg ggtcactccc 30

<210> 22 <211> 3240 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis. <400> 22

cagatgacga tttccgcatt cagcgacgaa ctggcacagg tgcggacgaa gaaaaaagca 60

tttctcgacc agattgaacg gatcgtcccg tggaaggaat ggcttgccat gatteageeg 120

tgctattaca aaggagagcg cggcaacaaa ccctatccgc tggagatcat gctccgactg 180

tatctgctgc aaaacctcta tgacctgagt gacgaggcca cggtggcaga agccatcgac 240

agccgcgcat tttcggagtt ctgcggcgtc gattecagea accaggttcc gaacggggat 300

actcttggcc ggttccggaa cttgctgatc aagaacggac tgcaggagaa gctgttcgct 3 60

caggtggtag cagcgctcat ggaacgtggc ctcattctga aaaagggcac cattgtagat 420

tccaccatca tttccgcccc ctcttctacc aagaataagg aaaagaaacg ggatccggat 480

gcccaccaag tcaagaaggg caacacctgg cactttgggt acaaagcgca tatcggcgtg 540

gacaaggaca gcggactggt tcacacagtg gaagctacac cggcaaatgt ccacgacgtt 600

gcggaagtgc cgaaattatt gacgggagag gaagaaacag tctatggaga cagcggttat 660

ctcggcgcag gtaagcgcga agatgccgta gtccgaaaca aagctggccg gaaaatcaag 720

tacaagatca atcgtcgtcc ategeagatg aagaaactga gcaaaagcgg gcagtacgca 780

gcaaagaaag cggaacgggc gaaatcctca gtgcgagcaa aagtagagca tgtattcggt 840gtcgttaaga agcagctgcg cttccgaaaa acgcgatacc gagggcttga aaagcaacaa 900

gccaaattca atatcatgtt tgcgttggca aatctgattc tggctgacag accctgtctg 960

gcagcttgag tcagtgcgcc tttgcggaca aaaaattcgg aggttatcca cagtttttat 1020

tcggcacctg ctgtataatg cggattgtgg catttgtgcg gtgttgcctt aaataaaact 1080 ataatcaaat agtgggaaca aaggattatg atagtccctt ttgtaggggc ttagtttttt 1140

gtacccaatt taagaatact tttgccttat caattttgac atatccccaa aaacagcact 1200

cacaaacagg tgtatgctgt atatgtgtat gtccgcaaat tatcatcccc agtggtaaaa 12 60

gtattttact gctggggatt tttatgccct tcggggcagt aaagggagga caatcacatg 132 0

aaaataatca atattggaat tcttgcccat gtagacgctg gaaagacgac cttgacggag 1380

agcctgctat atgccagcgg agccatttca gaaccgggga gcgtcgaaaa agggacaacg 1440

aggacggaca ccatgctttt ggagcggcag cgtgggatta ccattcaagc ggcagtcact 1500

tccttccagt ggcacagatg taaagtcaac attgtggata cgcccggcca catggatttt 1560

ttggcggagg tgtaccgctc tttggctgtt ttagatgggg ccatcttggt gatctccgct 1620

aaagatggcg tgcaggccca gacccgtatt ctgttccatg ccctgcggaa aatgaacatt 1680 cccacc gtta tctttatcaa caagatcgac caggctggcg ttgatttgca gagcgtggtt 1740

cagtctgttc gggataagct ctccgccgat attatcatca agcagacggt gtcgctgtcc 1800

ccggaaatag tcctggagga aaataccgac atagaagcat gggatgcggt catcgaaaat 1860aacgataaat tattggaaaa gtatatcgca ggagaaccaa tcagccggga aaaacttgtg 1920

cgggaggaac agcggcgggt tcaagacgcc tccctgttcc cggtctatta tggcagcgcc 1980

aaaaagggcc ttggcattca accgttgatg gatgcggtga cagggctgtt ccaaccgatt 2040

ggggaacagg ggagcgccgc cctatgcggc agcgttttca aggtggagta tacagattgc 2100

ggccagcggc gtgtctatct acggctatac agcggaacgc tgcgcctgcg ggatacggtg 2160

gccctggccg ggagagaaaa gctgaaaatc acagagatgc gtattccatc caaaggggaa 2220

attgttcgga cagacaccgc ttatccgggt gaaattgtta tccttcccag cgacagcgtg 2280aggttaaacg atgtattagg ggacccaacc cggctccctc gtaaaaggtg gcgtgaggac 2340

cccctcccca tgctgcggac gtcgattgcg ccgaaaacgg cagcgcaaag agaacggctg 2400

ctggacgctc ttacgcaact tgcggatact gacccgcttt tgcgctgcga ggtggattcc 2460

atcacccatg agatcattct ttcttttttg ggccgggtgc agttggaggt tgtttccgct 2520

ttgctgtcgg aaaaatacaa gcttgaaaca gtggtaaagg aacccaccgt catttatatg 2580

gagcggccgc tcaaagcagc cagccacacc atccatatcg aggtgccgcc caacccgttt 2 640

tgggcatcca tcggactgtc tgttacacca ctcccgcttg gctccggtgt acaatacaag 2700agccgggttt cgctgggata cttgaaccag agttttcaaa acgctgtcag ggatggtatc 2760

cgttacgggc tggagcaggg cttgttcggc tggaacgtaa cggactgtaa gatttgcttt 2820

gaatacgggc tttattacag tccggtcagc acgccggcgg acttccgctc attggccccg 2880

attgtattgg aacaggcatt gaaggaatca gggacgcaac tgctggaacc ttatctctcc 2940

ttcaccctct atgcgccccg ggaatatctt tccagggctt atcatgatgc accgaaatac 3000

tgtgccacca tcgaaacggt ccaggtaaaa aaggatgaag ttgtctttac tggcgagatt 3060

cccgcccgct gtatacaggc ataccgtact gatctggcct tttacaccaa cgggcagagc 3120

gtatgcctta cagaactgaa agggtatcag gccgctgtcg gcaagccagt catccagccc 3180 cgccgtccaa acagccgcct ggacaaggtg cgccatatgt tcagtaagat cacttgatac 3240

<210> 23

<211> 20

<212> DNA

<213> artificial

<220>

<223> iniciador a jusante usado para a detecção de Bb-12Tet-S139

<400> 23

caatacaaga gccgggtttc 20

<210> 24

<211> 22

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> iniciador reverso usado para a detecção de Bb-12Tet-S139

<400> 24

gtgctgaccg gactgtaata aa 22

<210> 25

<211> 11

<212> DNA

<213> Artificial

<220>

<223> Sonda de detecção que compreende ácidos nucléicos Locked (LNA)

<220>

<221> misc_feature

<222> (!)..()

<223> A = A ligado à carbóxi-Fluoresceína

<220>

<221> base modificada

<222> (2)..(2)

<223> T = T LNA<220>

<2 21> modified_base

<222> (4)..(10)

<223> LNA C, T, G, A, A, C and C <220>

<221> misc_feature

<222> (11)..()

<223> A = A ligado a carbóxi-tetrametil-rodamina

<400> 25 atactgaacc a

<210> 26 <211> 24 <212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis susp. lactis <400> 26

tacttgaacc agcgttttca aaac

<210> 27

<211> 12

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subsp. lactis

<400> 27 accagcgttt tc

<210> 28

<211> 12

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 28 cgccctgcca ca

<210> 29

<211> 12

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 29 atattgtcat ca

<210> 30

<211> 12

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 30 tagacgatgg aa

<210> 31 <211> 12 <212> DNA<213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 31 cggtccgggt aa

<210> 32

<211> 13

<212> DNA

<213> Bifidobacterium animalis subspecies lactis

<400> 32

ctgatccggc ctt

Claims (76)

1. Processo de inativação de um gene tetW em uma célula de Bifidobacterium sp. {Bifidobacteriaceae), o dito processo compreendendo submeter uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico.

2. Processo de preparação de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado, o dito processo compreendendo as etapas de:a) inativação de um gene tetWem uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional de acordo com a reivindicaçãob) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtido na etapa a) que possui um gene tetW inativado.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, onde a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior.

4. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, onde a célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW inativado possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 microgra-ma de tetraciclina/mL ou inferior.

5. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde o gene tetW funcional fica localizado no cromossomo da célula de Bifidobacterium sp..

6. Processo de preparação uma célula de Bifidobacterium sp. sensível à tetraciclina, o dito processo compreendendo as etapas de:a) submissão uma célula de Bifidobacterium sp. a um agente mutagênico químico e a um agente mutagênico físico, onde a célula de Bifidobacterium sp. possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgra- mas de tetraciclina/mL ou superiorb) isolamento de um mutante da célula de Bifidobacterium sp. obtido na etapa a), onde o dito mutante possui uma Concentração InibidoraMínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

7. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, o agente mutagenico químico é um reagenie químico intercaiante de absorção de UV e o agente mutagenico físico é uma radiação não ionizante com um comprimento de onda mais curto que 800 nm.

8. Processo de acordo com a reivindicação 7, onde o reagente químico intercaiante de absorção de UV é selecionado do grupo que consiste em brometo de etídio (EtBr), etídio, proflavina, daunomicina, adriamicina, actinomicina, elipticina, tilorona, m-AMSA, mitramicina, netropsina, irehdia- mina A, antramicina, etapatonigrina, bleomicina, ditercalínio, triostina e equi-nomicina.

9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 3 a 8, onde a Concentração Inibidora Mínima é determinada através de:a) mergulhamento de um swab de algodão esterilizado em uma cultura, que foi crescida durante a noite, de uma cepa sensível à tetraciclinaque será testada,b) esfriamento da superfície inteira de uma placa de ágar MRS (diâmetro: 8,5 cm) igualmente em três direções com o swab de algodão da etapa a) c) quando o inóculo aplicado na etapa b) secou, aplicação deuma tira do teste E na superfície do ágar através do auxílio de um aplicadormanual com a escala de MIC com a face para cimad) inóculo da placa de ágar anaerobicamente em uma posiçãoinvertida a 37°C durante e) determinação do valor de MIC através da leitura do valor ondeo limite da elipse de inibição faz intersecção com a tira.

10. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 mi- crogramas de tetraciclina/mL ou superior é selecionada do grupo de cepas que consiste em Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 na Deutsche Sammlungvon Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM15954 e, Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abri! de 2005 na Deutsche Sarnmiung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM17280.

11. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2a 10, onde etapa b) compreende as etapas de:i) determinação da Concentração Inibidora Mínima (MIC) das bactérias através do processo de seleção de susceptibilidade pelo teste E,ii) divisão das bactérias em duas classes com base no resultado da seleção de susceptibilidade pelo teste E:Classe 1: bactérias com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior de acordo com o teste E eClasse 2: bactérias com uma MIC acima de 1,5 ug/mL de acordo com o teste E; e iii) identificação e expansão de tais bactérias sensíveis a antibió-ticos identificadas em ii) com uma MIC de 1,5 ug/mL ou inferior (Classe 1).

12. Processo de acordo com a reivindicação 11, onde as tetraci-clinas é tetraciclina.

13. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um genetetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 mi-crogramas de tetraciclina/mL ou superior é uma célula probiótica.

14. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um gene tetW inativado ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior é uma célula probiótica.

15. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde o processo compreende as etapas de:i) cultivo de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial,ii) transferência de uma alíquota das células obtidas na etapa i) para meio fresco contendo brometo de etídio (EtBr),iii) transferência da cultura obtida na etapa ü) para um ou mais recipientes para formar uma camada de cultura de 0,5-10 mm de espessura, iv) submissão da(s) cultura(s) da etapa iii) a um tratamento comUV,v) cultivo das células mutadas obtidas na etapa iv) para a obtenção de uma cultura de células em crescimento exponencial,vi) transferência de uma alíquota de bactérias para uma ou mais placas de Petri contendo um meio de crescimento adequado com ágar, aalíquota das bactérias é selecionada para fornecer colônias isoladas,vii) identificação das colônias da etapa vi) que adquiriram sensibilidade ao antibiótico por plaqueamento de réplicas em placas de Petri com e sem o antibiótico e viii) isolamento e expansão da célula obtida na etapa vii).

16. Processo de acordo com a reivindicação 15, onde a cultura obtida na etapa iv) é submetida a uma etapa de enriquecimento em relação às mutações que compreende as etapas de:iva) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudicial para as células em crescimento exponencial, mas tolerável pelas células que não estão em crescimento, eivb) cultivo das células em um meio que compreende o dito análogo de penicilina sob condições, que promoveriam o crescimento exponen- ciai na ausência de penicilina ou de um análogo de penicilina tal como a am-picilina.

17. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a cultura é realizada a uma tensão de oxigênio reduzida.

18. Processo de acordo com a reivindicação 16, onde o trata- mento com UV da etapa iv) reduz o número de células vivas medido por U-nidades Formadoras de Colônias (UFCs) até menos que 20% em relação ao número das UFCs da cultura imediatamente antes do tratamento com UV.

19. Processo de acordo com a reivindicação 16, onde o análogo de penicilina é ampicilina que é utilizada a uma dose de 50-300 ug/mL de meio,

20. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 5 anteriores, onde as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo detetraciclina, terramicina, demeclociclina, meclociclina, doxiciclina/doxiciclina, limeciclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, rolitetraciclina, aureomi-cina e outras clortetraciclinas.

21. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 anteriores, onde a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um genetetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 mi-crogramas de tetraciclina/mL ou superior é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, 15 Bifidobacterium animalis e subespécies dos mesmos.

22. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 mi-crogramas de tetraciclina/mL ou superior é uma cepa de Bifidobacterium a- nimalis subespécie lactis.

23. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, onde a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de antibiótico de uma célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou uma célula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração Inibido- ra Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior, é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um tetW inativado ou da célula de Bifidobacterium sp. mutante que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

24. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicaçõesanteriores, onde a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina da célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW funcional ou dacélula de Bifidobacterium sp. que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 4 microgramas de tetraciclina/mL ou superior, é pelo menos de 10 microgramas/mL e a MIC de tetraciclina da célula de Bifidobacterium sp. mutante que compreende um tetW inativado ou a célula de Bifidobacterium sp. mutante que possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior, é de 1 microgram/mL ou inferior.

25. Célula de Bifidobacterium sp. que compreende um gene tetW inativado.

26. Célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a reivindicação 25, onde a dita cepa possui uma Concentração Inibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

27. Célula de Bifidobacterium sp. de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 26, onde o gene tetW inativado fica localizado no cromossomo das ditas células.

28. Célula de Bifidobacterium sp. que possui uma ConcentraçãoInibidora Mínima de 1,5 micrograma de tetraciclina/mL ou inferior.

29. Célula de Bifidobacterium sp. que contém um tetW codificado cromossomicamente mutado que torna a célula sensível às tetraciclinas que pode ser obtida através do processo como definido em qualquer uma das reivindicações 2 a 24.

30. Célula de Bifidobacterium sp. de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 29, onde a célula é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lac- tis, Bifidobacterium animalis e subespécies das mesmas.

31. Célula de Bifidobacterium sp. de acordo com a reivindicação 30, onde a célula é da cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

32. Célula de Bifidobacterium que é sensível às tetraciclinas por causa de uma mutação no tetW, a dita célula de Bifidobacterium sendo deri- vada de uma célula progenitora que é resistente às tetraciclinas por causa da presença de um gene tetW localizado no cromossomo.

33. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 26 a 32, onde as tetraciclinas são um antibiótico selecionado do grupo que consiste em tetraciclina, terramicina, demeclociclina, mecloci-clina, doxiciclina/doxiciclin, limeciclina, rnetaciclina, minociclina, oxiteíracicli-na, rolitetraciclina, aureomicina e outras clortetraciclinas.

34. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 32 ou 33, onde a célula progenitora é selecionada do grupo que consiste em Bifidobacteriacea que compreende Bifidobacterium longum, Bifidobacterium pseudocatenulatum, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium lactis, Bifidobacterium animalis e subespécies dos mesmos.

35. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 34,onde a célula progenitora é da cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis.

36. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 35, onde a célula progenitora é da cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC5445 (Bb-12®), depositada em 30 de setembro de 2003 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM15954.

37. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 35, onde a célula progenitora é da cepa de Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC7158, depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM17280.

38. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 até 37, onde a Concentração Inibidora Mínima de antibióti- co (MIC) da célula progenitora é pelo menos 10 vezes maior que a MIC da célula sensível a antibiótico.

39. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 32 até 37, onde a Concentração Inibidora Mínima (MIC) de tetraciclina da célula progenitora é pelo menos 10 microgramas de tetracicli- na/mL e a MIC da célula sensível a antibiótico é de 1,5 micrograma de tetra-ciclina/mL ou inferior.

40. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25 até 39 ou reivindicações 71 até 73, onde o gene tetW ina-tivado ou mutado compreende pelo menos uma seqüência selecionada do grupo da SEQ ID NO: 3 [GGATACTGAACC], SEQ ID NO: 6 [GTGGTT-TAGTCT], SEQ ID NO: 25 [ATACTGAA], SEQ ID NO: 27 [ACCAGCGT TTTC], SEQ ID NO: 28 [CGCCCTGCCACA], SEQ ID NO: 29 [ATATTGT-CATCA], SEQ ID NO: 30 [TAGACGATGGAA], SEQ ID NO: 31 [CGGTCCGGGTAA], SEQ ID NO: 32 [CTGATCCGGCCTT], [CAGCGTTT], [GACGATGG], [GTCCGGGT], [ATCCGGCC], [CCTGCCAC], [TTGTCATC], [GGTTTAGT], [GTGGACCG], [CGCCCATT] e [TCCGGCCC].

41. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25 até 39 ou reivindicações 71 até 73, onde o gene tefWina-tivado ou mutado compreende as seqüências [CCTGCCAC] e [TTGTCATC].

42. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 41 ou reivindicações 71 até 73, onde o gene tetWlna- tivado ou mutado compreende as seqüências SEQ ID NO: 28 [CGCCCTGCCACA] e SEQ ID NO: 29 [ATATTGTCATCA].

43. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 37 ou reivindicações 71 até 73, onde o gene tetW ina-tivado ou mutado compreende as seqüências [GACGATGG], [GTCCGGGT] e [ATCCGGCC].

44. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 41 ou reivindicações 71 até 73, onde o gene tenWina-tivado ou mutado compreende as seqüências SEQ ID NO: 30 [TAGACGATGGAA], SEQ ID NO: 31 [CGGTCCGGGTAA] e SEQ ID NO: 32 [CT- GATCCGGCCTT].

45. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 40, onde o gene tetW inativado ou mutado compreende a SEQ ID NO: 3 [GGATACTGAACC].

46. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 40, 30 onde o gene tetW inativado ou mutado compreende a SEQ ID NO: 6[GTGGTTTAGTCT].

47. Célula de Bifidobacterium de acordo com a reivindicação 40,onde o gene tetW inativado ou mutado compreende a SEQ ID NO: 27 [AC-CAGCGTTTC].

48. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 43 ou reivindicações 71 até 73, que é identificada co- mo Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC8902 (Bb-12Tet-S139) e depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM17281.

49. Célula de Bifidobacterium óe acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 42, reivindicação 43 ou reivindicações 71 até 73, que é identificada como Bifidobacterium animalis subespécie lactis cepa CHCC9070 (DR10Tet-S9X) e depositada em 28 de abril de 2005 junto à Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen sob o número de acesso DSM17282.

50. Uso de uma célula de Bifidobacterium como definida em 15 qualquer uma das reivindicações 25 até 49, para a preparação de um material que pode ser ingerido ou uma cultura bacteriana.

51. Uso de acordo com a reivindicação 50, onde a cultura bacteriana é adicionalmente processada.

52. Uso de acordo com a reivindicação 50, onde o material que 20 pode ser ingerido é um alimento ou um produto alimentício fermentado.

53. Uso de acordo com a reivindicação 52, onde o alimento ou o produto alimentício fermentado é adicionalmente processado.

54. Uso de acordo com a reivindicação 50, onde o material que pode ser ingerido compreende Bifidobácterias em uma quantidade de apro- ximadamente 105 ufc/g até aproximadamente 1012 ufc/g de material que pode ser ingerido.

55. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 até 54, onde o material que pode ser ingerido é uma composição selecionada do grupo que consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidificado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês eleite de soja.

56. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 até55, onde o material que pode ser ingerido é utilizado para a preparação de uma composição para o tratamento e/ou para a prevenção de uma doença,síndrome ou estado de saúde ou para melhorar a digestão de nutrientes ou para aumentar o estado de saúde geral de um ser humano ou de um animal vertebrado.

57. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 50 até56, onde o material que pode ser ingerido é utilizado como um probiótico.

58. Uso de acordo com as reivindicações 50 ou 57, onde o mate-rial que pode ser ingerido é uma composição selecionada do grupo que consiste em leite, coalhada, produtos fermentados à base de leite, leite acidifi-cado, iogurte, frozen iogurte, leite em pó, pós à base de leite, concentrado de leite, queijo, produtos de queijo para espalhar, molhos, bebidas, sorvetes, produtos à base de cereais fermentados, fórmulas para bebês, comprimidos, cápsulas, suspensões bacterianas líquidas, suplemento oral seco, suplemento oral úmido, alimentação em tubo seco ou alimentação em tubo úmido.

59. Uso de acordo com a reivindicação 56, onde a dita doença, síndrome ou estado de saúde é selecionado do grupo que consiste em dis- túrbios associados a antibióticos, gastroenterite, diarréia incluindo a diarréia do viajante e diarréia infantil aguda, intolerância à lactose, infecções gastrointestinais e colonização do trato gastrointestinal por bactérias patogênicas incluindo Helicobacter pylori e Clostridium difficile, síndrome do intestino irri-tável (IBS), doença inflamatória do intestino (IBD), câncer de cólon, infec- ções urogenitais e tumores, infecções vaginais, alergia (especialmente ec-zema atópico), vacinação, colestrolemia e hipertensão.

60. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 56 até 59, onde o material que pode ser ingerido é adequado para a prevenção ou para o tratamento de infecções com agentes patogênicos.

61, Alimento ou produto alimentício que compreende a célulabacteriana como definido em qualquer uma das reivindicações 25 até 49.

62. Uso de uma célula de Bifidobacterium como definida emqualquer uma das reivindicações 25 até 49, para a preparação de uma cultura de partida.

63, Uso de acordo com a reivindicação 62, onde a cultura de partida é congelada.

64. Uso de acordo com a reivindicação 62, onde a cultura departida é seca por congelamento.

65. Uso de acordo com a reivindicação 62, onde a cultura de partida é seca por spray ou seca em leito fluidizado.

66. Composição de cultura de partida que compreende a bacté- ria de qualquer uma das reivindicações 25 até 49, preferencialmente onde acomposição da cultura de partida possui uma concentração de células viáveis, que está na faixa de 104 até 1012 ufc por grama da composição.

67. Composição de cultura de partida de acordo com a reivindicação 66, que em adição compreende um ou mais agentes crioprotetores selecionados do grupo que consiste em inosina-5'-monofosfato (IMP), ade-• nosina-5'-monofosfato (AMP), guanosina-5'-monofosfato (GMP), uranosina-5'-monofosfato (UMP), citidina-5'-monofosfato (CMP), adenina, guanina, u-racila, citosina, adenosina, guanosina, uridina, citidina, hipoxantina, xantina, hipoxantina, orotidina, timidina, inosina e um derivado de qualquer um de tais compostos.

68. Processo para produção de uma cultura de partida congelada que compreende as etapas a seguir:1. cultura de uma célula bacteriana como definida nas reivindicações 25 até 49 2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bac-teriana concentrada,3. congelamento do material bacteriano para obtenção de material congelado e4. embalagem do material seco congelado em um recipiente a- dequado.

69. Processo para a produção de uma cultura de partida seca congelada que compreende as etapas a seguir:·1. cultura de uma célula bacteriana como definida nas reivindicações 25 até 49·2. coleta das células propagadas para fornecer uma cultura bacteriana concentrada,·3. congelamento do material bacteriano para obtenção de mate-rial congelado,·4. sublimação da água do material congelado e·5. embalagem do material seco congelado em um recipiente a-dequado.

70. Processo de acordo com as reivindicações 68 ou 69, ondeetapa a 3 é realizada através do gotejamento da cultura concentrada em nitrogênio líquido e da coleta do material congelado.

71. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 39, onde o gene teM/mutado ou inativado compreen- de pelo menos uma seqüência selecionada do grupo de [ATACTGAA], [GGTTTAGT] e [CAGCGTTT].

72. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 até 39, onde o gene gene tetW mutado ou inativado compreende as seqüências [CCCTGCCA] e [ATTGTCAT].

73. Célula de Bifidobacterium de acordo com qualquer uma dasreivindicações 25 até 39, onde o gene tetW mutado ou inativado compreende as seqüências [GACGATGG], [GTCCGGGT] e [GATCCGGC].

74. Célula de Bifidobacterium sp. de acordo com qualquer uma das reivindicações 25 a 49, para o uso como um probiótico.

75. Processo de tratamento de um mamífero que compreende aadministração de uma célula de Bifidobacterium sp. como definida em qualquer uma das reivindicações 25 a 49.

76. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 24, onde o dito processo após a etapa a) compreende ainda as etapas de:i) transferência de uma alíquota da cultura tratada com UV para meio fresco contendo uma dose de um análogo de penicilina que é prejudicial para as células em crescimento exponencial, mas tolerável para as célu-Ias que não estão em crescimento eii) cultivo das células no meio que composição o dito análogo de penicilina sob condições, que promoveriam o crescimento exponencial na ausência de penicilina ou de um análogo de penicilina tal como a ampicilina.