ES2710679T3 - Procedimiento para la determinación rápida de la susceptibilidad bacteriana a los antibióticos que inhiben la síntesis de las proteínas - Google Patents

Abstract

Un método para evaluar rápidamente la susceptibilidad de una muestra de bacterias a un antibiótico inhibidor de la síntesis de las proteínas, que comprende: incubar una primera porción de la muestra de bacterias que experimenta un crecimiento exponencial, con un antibiótico inhibidor de la síntesis de las proteínas; agregar un agente a la primera porción de la muestra de bacterias, que se está incubando con el antibiótico inhibidor de la síntesis de las proteínas, en donde el agente se selecciona de modo tal que induzca una respuesta bacteriana, que depende de la síntesis de las proteínas o recibe la influencia de esta; incubar una segunda porción de la muestra de bacterias que experimenta un crecimiento exponencial con el agente seleccionado para inducir una respuesta bacteriana que depende de la síntesis de las proteínas o recibe la influencia de esta; evaluar la respuesta bacteriana en la primera porción y la segunda porción de la muestra de bacterias y clasificar la muestra de bacterias como susceptible o no susceptible al antibiótico inhibidor de la síntesis de las proteínas, sobre la base de la evaluación de la primera y la segunda porciones de la muestra de bacterias.

Description

DESCRIPCION

Procedimiento para la determinacion rapida de la susceptibilidad bacteriana a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas.

Campo tecnico

La presente invencion se refiere, en general, al campo de la microbiologfa y a la industria de la asistencia sanitaria y, mas en particular, se refiere a una metodologfa para la evaluacion rapida de la susceptibilidad o de la falta de susceptibilidad de las bacterias a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas.

Antecedentes

Los patogenos resistentes a multiples antibioticos presentan un riesgo en continuo aumento para la salud, en particular en entornos clmicos. Los pacientes pueden adquirir infecciones por medios medicos invasivos, pero necesarios, tales como infecciones en las vfas respiratorias durante la ventilacion mecanica, en las vfas urinarias o en los vasos sangumeos, a traves de cateteres o incluso a traves de heridas en la piel, como las incisiones requeridas para cualquier numero de procedimientos medicos. Los pacientes inmunocomprometidos y los internados en unidades de cuidados intensivos (UCI) tienen un mayor riesgo de contraer enfermedades infecciosas nosocomiales, que pueden ser resistentes a uno o mas antibioticos. Por diversas razones, estas infecciones pueden estar asociadas con una alta tasa de mortalidad. Anteriormente, el Centro Europeo para el Control de Enfermedades (ECDC) reporto 25.000 muertes anuales debidas a patogenos multirresistentes.

Los tratamientos tempranos, con antibioticos bien seleccionados proporcionan la mejor defensa contra dichos patogenos multirresistentes. Dada la alta prevalencia de las resistencias, los procedimientos actuales requieren un cultivo bacteriano para la identificacion del microorganismo, seguido de un antibiograma, que suele demorar de 2-3 dfas mientras crecen las bacterias. El paso de cultivar bacterias para construir un antibiograma solo, por lo general, demanda alrededor de un dfa de incubacion o aproximadamente un mmimo de 18 horas.

Dado el penodo relativamente largo necesario para realizar un antibiograma estandar, para comenzar, los antibioticos suelen administrarse en forma empmca. Esta primera lmea de defensa a menudo se basa en antibioticos que, en general, se sabe que son efectivos en funcion del probable patogeno involucrado. Sin embargo, tales tratamientos pueden ser ineficaces en el 20-40 % de los casos, y el hecho de tener que cambiar los antibioticos mas adelante puede reducir las probabilidades de exito. Incluso los supuestos basados en los conocimientos pueden contribuir al uso indebido o al abuso de los antibioticos, lo que se traduce en cepas bacterianas cada vez mas resistentes, mientras los resultados de un antibiograma estan pendientes.

El antibiograma resulta del ensayo clmico de cepas de bacterias aisladas in vitro para determinar la susceptibilidad bacteriana a los antibioticos. Una metodologfa comun para construir un antibiograma basado en la difusion es el metodo de Kirby-Bauer (Bauer AW, Kirby WMM, Sherris JC, Turck M. Antibiotic susceptibility testing by a standardized single disc method. Am J Clin Pathol 1966;45:493-496). En el metodo semicuantitativo de Kirby-Bauer, varios discos que contienen diferentes antibioticos se colocan en diferentes zonas de un cultivo de bacterias ricas en nutrientes. Debido a que el antibiotico se difunde hacia el agar, alejandose del disco, el diametro que rodea al disco en el que no crecen las bacterias sugiere la concentracion inhibitoria minima (CIM) de ese antibiotico a la cepa cultivada de las bacterias.

Santiso y colaboradores, BMC 2011, 11: 191 describen un procedimiento in situ rapido, para la determinacion de la susceptibilidad bacteriana o la resistencia a los antibioticos que inhiben la biosmtesis de peptidoglucanos.

Un metodo cuantitativo puede basarse en la dilucion en una serie de caldos o soluciones de agar que tienen concentraciones progresivamente menores del antibiotico en cuestion. La concentracion mas baja de todas de antibiotico, en la que las bacterias no pueden crecer proporciona la concentracion inhibitoria minima de ese antibiotico para la cepa de bacterias probada. Este metodo cuantitativo se puede emplear de forma rutinaria en los hospitales, por lo general, utilizando paneles comerciales de antibioticos y sistemas semiautomaticos de incubacion y software para la interpretacion de datos, como el MicroScan WalkAway™ (Siemens), Phoenix™ (Becton Dickinson) o Vitek™ 2 (bioMerieux). Con tales sistemas automatizados dependientes del crecimiento, los resultados de susceptibilidad o resistencia a los antimicrobianos de un microorganismo espedfico se pueden obtener en alrededor de 6-9 horas.

Cada uno de los metodos de difusion y dilucion se basa en el principio de inhibir la proliferacion bacteriana en un medio rico en nutrientes y esto requiere tiempo suficiente para muchos ciclos reproductivos de las bacterias. En tal sentido, ambas metodologfas pueden requerir un mmimo de entre 18 horas y 24 horas. Se puede entender que las pruebas convencionales, como los antibiogramas, no resuelven los problemas descritos con anterioridad.

Ademas, se han intentado una serie de enfoques experimentales, con el objetivo de lograr determinaciones mas rapidas de susceptibilidad y resistencia. Sin embargo, esos enfoques experimentales no suplantaron al antibiograma convencional que consume mucho tiempo. Por consiguiente, todavfa existe la necesidad de realizar pruebas de susceptibilidad capaces de determinar rapidamente un tratamiento con antibioticos que permita la administracion rapida y eficaz de tratamientos efectivos con antibioticos y reducir el uso indebido o el abuso de los antibioticos. Compendio de la invencion

Una realizacion de la invencion se refiere a un metodo para evaluar rapidamente la susceptibilidad de las cepas bacterianas a un antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas. El metodo incluye el paso de incubar una primera porcion de la cepa de las bacterias que experimentan un crecimiento exponencial, con un antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas y a las bacterias que se incuban con el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas, un agente seleccionado para inducir una respuesta bacteriana que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta. Una segunda porcion de la cepa de bacterias que experimentan un crecimiento exponencial tambien se incuba con el agente seleccionado para inducir una respuesta bacteriana que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta. Luego, la respuesta bacteriana en la primera porcion y la segunda porcion de la cepa de bacterias se evalua, y la cepa de bacterias se clasifica como susceptible o no susceptible al antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, en funcion de la evaluacion de la primera y segunda porciones de la cepa de las bacterias.

Breve descripcion de los dibujos

Las figuras 1A-F representan imagenes de nucleoides de Escherichia coli obtenidas con un ensayo de Micromax en el ejemplo 1.

Las figuras 2A-F representan imagenes de nucleoides de Escherichia coli obtenidas con un ensayo Micromax en el ejemplo 2.

Las figuras 3A-F representan imagenes de nucleoides de Staphylococcus aureus obtenidas con un ensayo de Micromax en el ejemplo 3.

Las figuras 4A-F representan imagenes de nucleoides de Pseudomonas aeruginosa obtenidas con un ensayo de Micromax en el ejemplo 5.

Las figuras 5A-F representan imagenes de nucleoides de Enterococcus faecalis obtenidas con una variante del ensayo Micromax en el ejemplo 6.

Las figuras 6A-F representan imagenes de nucleoides de Pseudomonas aeruginosa obtenidos con una variante del ensayo Micromax en el ejemplo 7.

Descripcion detallada de la invencion

Las realizaciones de la presente invencion permiten la determinacion rapida de la susceptibilidad bacteriana o de la resistencia a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas bacterianas. Como ejemplo no limitativo, se describen varios antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas bacterianas en Lambert T. Antibiotics that affect the ribosome. Rev Sci Tech Off Int Epiz 2012 31: 57-64. Dichos antibioticos pueden probarse rapidamente de acuerdo con las realizaciones descritas en el presente documento. Estos antibioticos afectan la pared celular bacteriana al interactuar con los ribosomas, los organulos en los que se sintetizan las protemas. Los ribosomas bacterianos son complejos de ribonucleoprotemas ensamblados en dos grandes subunidades, 30S y 50S.

Los ejemplos de familias de antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas incluyen oxazolinidonas, que evitan la formacion del complejo de iniciacion. Las oxazolinidonas parecen unirse al dominio 23S ARNr V de la subunidad ribosomal 50S y ocupan el sitio Aminoacilo (A) de la subunidad ribosomal 50S, lo que induce un cambio conformacional que impide que el ARNt ingrese al sitio y obliga al ARNt a separarse del ribosoma. Las oxazolinidonas que pueden analizarse de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invencion incluyen: eperezolid, linezolid, posizolid, radezolid, ranbezolid, sutezolid, tedizolid, y otros.

Los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas adicionales incluyen tetraciclinas y glicilciclinas (tigeciclina), que se unen a la subunidad ribosomal 30S, evitando la entrada de los ARN de transferencia (t) de aminoacilo al sitio Aminoacilo (A) del ribosoma que esta bloqueado por el antibiotico. Una lista no exhaustiva de tetraciclinas que pueden analizarse de acuerdo con ciertas realizaciones de la presente invencion incluye: doxiciclina, clortetraciclina, clomociclina, demeclociclina, lemeciclina, meclociclina, metaciclina, minociclina, oxitetraciclina, penimepiciclina, rolitetraciclina y otras.

Otra familia mas de antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas incluye aminoglucosidos, tales como: tobramicina, estrepromicina, dihidroestreptomicina, gentamicina, kanamicina, amikacina, arbekacina, bekanamicina, dibekacina, neomicina, framicetina, paromomicina, ribstamicina, netilmicina, sisomucina, isepamicina, verdamcin, astromicina, higromicina B y otros. Los aminoglucosidos que afectan el inicio, la elongacion y la terminacion de la smtesis de las protemas aumentan la tasa de error con la terminacion prematura de la cadena de peptidilo y tambien afectan la translocacion ribosomal. Se unen a la subunidad 30S, espedficamente al ARN ribosomal (r) 16S y al sitio A de decodificacion de la 2-desoxistreptamina (2-DOS) 4,6-sustituida.

Otras familias mas de antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas incluyen macrolidos, lincosamidas, fenicoles (cloranfenicol), estreptograminas y pleuromutilinas y quinupristina/dalfopristina que bloquean el paso de transferencia de peptidilo de la elongacion del peptido en la subunidad 50S. Se unen al componente 23S ARNr del ribosoma 50S cerca del centro peptidil-transferasa (es decir, el dominio V del 23S ARNr), bloqueando la elongacion de la cadena peptfdica que causa una terminacion prematura y conduce a una disociacion prematura del peptidil-ARNt del ribosoma. Las pleuromutilinas se unen al centro de la peptidil-transferasa, asf como a los fenicoles. Estos ultimos se unen espedficamente a los nucleotidos dentro del bucle central del dominio V del 23S ARNr. Las protemas ribosomicas L16 y el sitio (P) del peptidilo tambien participan en la union. Las ortosomicinas tambien inhiben la traduccion al unirse a la subunidad ribosomal 50S. Los macrolidos que pueden probarse de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion incluyen: azitromicina, claritromicina, diritromicina, eritromicina, fluritromicina, josamicina, midecamicina, miocamicina, oleandomicina, rokitamicina, roxitromicina, espiramicina, troleandomicina, tilosina, cetolidos, telitromicina, cetromicina, solitromicina y otros. Las lincosamidas que pueden analizarse de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion incluyen: clindamicina, lincomicina, pirlimicina y otras. Las estreptograminas que pueden probarse de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion incluyen: pristinamicina, quinupristina/dalfopristina, virginamicina y otras. Las pleuromutilinas que pueden analizarse de acuerdo con diversas realizaciones de la presente invencion incluyen: retapamulina, tiamulina, valnemulina y otras. La familia de antibioticos de anfenicoles que incluye cloranfenicol, azidamfenicol, tiamfenicol, florfenicol y otros tambien puede probarse con ciertas realizaciones de la presente invencion.

Ademas, el acido fusfdico proldbe la smtesis de las protemas al evitar la rotacion del factor de alargamiento G (EF-G) en el ribosoma.

La retapamulina y la mupirocina tambien pueden inhibir la smtesis de las protemas, pero se desconoce su mecanismo preciso.

Los antibioticos adicionales que inhiben la smtesis de las protemas previstos para uso con ciertas realizaciones descritas en el presente documento incluyen aquellos antibioticos que inhiben la deformilasa peptfdica.

Las bacterias resistentes a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas bacterianas se manifiestan mediante una serie de mecanismos, Lambert T. Antibiotics that affect the ribosome. Rev Sci Tech Off Int Epiz 2012 31: 57-64.

Un mecanismo por el cual las bacterias pueden exhibir una resistencia a la smtesis de las protemas que inhiben las bacterias consiste en la inactivacion enzimatica. Las enzimas de desintoxicacion, codificadas principalmente por genes de plasmidos o transposones, pueden metabolizar antibioticos tales como aminoglucosidos, eritromicina, lincosamidas, cloranfenicol y estreptograminas, limitando asf su eficacia antibacteriana.

Otro mecanismo bacteriano que muestra una resistencia a las bacterias inhibidoras de la smtesis de las protemas es la alteracion de la diana. Las mutaciones pueden afectar los ARNr (por ejemplo, 16S ARNr o 23S ARNr) o las protemas ribosomicas (por ejemplo, S12 a la estreptomicina, L4 y L22 a macrolidos) involucradas en la union de antibioticos. Ademas, las metiltransferasas tambien pueden afectar a las dianas. Por ejemplo, el 23S ARNr puede ser metilado en adenina 2058 por enzimas Erm, constitutivas o inducibles, lo que lleva a la resistencia a los macrolidos. En su mayona estan transportados por elementos moviles, lo que representa un riesgo potencial de difusion. La monometilacion da como resultado un bajo nivel de resistencia a la eritromicina, mientras que la dimetilacion confiere una alta resistencia.

Adicionalmente, las protemas de proteccion ribosomica, homologas a los factores de elongacion, confieren resistencia a las tetraciclinas, que previenen posiblemente la actividad antibacteriana inhibidora de la smtesis de las protemas.

Aun otro mecanismo por el cual las bacterias pueden resistir a los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas es por deficiencias en la captacion. Los sistemas de eflujo impenetrables o dependientes de la energfa reducen la concentracion intracelular del antibiotico y pueden producir una resistencia moderada a los aminoglicosidos, y espedficamente a las tetraciclinas en bacterias gram negativas.

Ciertas realizaciones descritas en el presente documento proporcionan un medio para determinar rapidamente si las bacterias son susceptibles o no susceptibles en relacion con los antibioticos que se estan probando. Debe entenderse que el termino “susceptible” corresponde a la definicion del CLSI [Clinical and Laboratory Standards Institute, Instituto de Normas Clfnicas y de Laboratorio] por ejemplo, un microorganismo susceptible muestra un nivel de actividad antimicrobiana asociado con una alta probabilidad de exito terapeutico. Como se usa en el presente documento, el termino “no susceptible” se refiere a aquellos microorganismos que no estan determinados como susceptibles. En la practica, esta definicion abarca las indicaciones del CLSI de microorganismos tanto resistentes como intermedios.

Mientras que algunos metodos previos de deteccion rapida de la susceptibilidad se basan en el crecimiento rapido del tamano celular individual de pequenas cantidades de bacterias, ciertos antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas pueden prevenir este crecimiento, lo que puede presentar un falso positivo para bacterias resistentes en ciertas condiciones.

De acuerdo con las realizaciones de la presente invencion, se induce una respuesta bacteriana que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta. La resistencia bacteriana a los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas puede evaluarse a traves de la capacidad de los antibioticos para suprimir la respuesta bacteriana. Para los fines de esta descripcion, debe entenderse que una “respuesta bacteriana” es un cambio qmmico, biologico, genetico o ffsico en las bacterias a nivel del ADN, al nivel de componente celular o al nivel celular. En algunas realizaciones, la respuesta bacteriana es directa o indirectamente discernible, tal como mediante el uso de ensayos, dispositivos microfluidos o mediante otros protocolos de medicion y/o prueba conocidos por los expertos en la tecnica.

Los ejemplos de respuestas bacterianas a nivel del ADN incluyen el dano del ADN y la fragmentacion del ADN. En particular, el dano o la fragmentacion del ADN que depende al menos parcialmente de la smtesis de las protemas puede indicar la efectividad de los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas. Como ejemplos no limitativos, esta fragmentacion del ADN, que depende al menos parcialmente de la smtesis de las protemas, puede inducirse en algunas bacterias mediante la exposicion a las quinolonas (por ejemplo, norofloxina, ciproflaxina, moxifloxacina y otras). Dado que todas las quinolonas producen una respuesta similar en bacterias gram negativas, a saber, la fragmentacion del ADN, se espera que las quinolonas funcionen bien como un agente para inducir una respuesta bacteriana. Si bien este es el caso de al menos la mayona de las bacterias gram negativas, la resistencia a las quinolonas es posible, y en tales cepas no se puede hacer una determinacion de susceptibilidad con respecto al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas. Se puede inducir una respuesta bacteriana en forma de fragmentacion del ADN con mitomicina C. La mitomicina C presenta un agente robusto para inducir la respuesta bacteriana, porque en la actualidad, no parece haber ninguna resistencia bacteriana natural a la mitomicina C. La mitomicina C parece producir Las respuestas dependientes de la smtesis de las protemas en al menos E. coi, K. pneumonia, P. aeruginosa y A. baumannii y se espera que produzcan una respuesta bacteriana en la mayona de las bacterias gram negativas.

En otras realizaciones, la fragmentacion de ADN que depende de la smtesis de las protemas puede producirse indirectamente, tal como por la lisostafina que digiere parcialmente las paredes celulares bacterianas despues de una exposicion corta, que causa la liberacion de cantidades significativas de desoxirribonucleasa (DNasa). La DNasa es una enzima que, cuando se libera desde la pared celular bacteriana da como resultado la fragmentacion del ADN de una manera que depende de la smtesis de las protemas. Como otro ejemplo, la fragmentacion del ADN se puede inducir incubando bacterias con tensioactivos y/o enzimas que afectan las paredes celulares de las bacterias de una manera que depende de la smtesis de las protemas y que promueve la autolisis. La autolisis en ciertas bacterias puede ser inducida por la incubacion con bilis, desoxicolato, Triton X-100, asf como con la enzima lisozima digestora de peptidoglucanos y los inhibidores de antibioticos de la smtesis de peptidoglucanos.

En ciertas realizaciones adicionales, la respuesta bacteriana del dano en el ADN puede ser inducida por agentes alquilantes. Una lista no exhaustiva de agentes alquilantes puede incluir: mostazas nitrogenadas, tales como ciclofosfamida, mecloretamida, uramustina, melfalan, clorambucilo, ifosfamida, bendamustina; diepoxibutano; carzinofilina/azinomicina B; sandramicina, luzopeptinas e isocrisohermidina; biselezin, dfmeros de pirrolobenzodiazepina; analogos dinucleares de cis-DDP; psoralenos; ciclofosfamida, alcaloides de pirrolizida y otros. Quizas puedan emplearse incluso agentes “del tipo alquilantes”, como los platinos, o analogos del platino, para inducir una respuesta bacteriana. Los agentes de tipo alquilante pueden incluir cisplatino, carboplatino, nedaplatino, oxalipatina, satraplatino o tetranitrato de triplatino.

Los ejemplos de respuestas bacterianas a nivel del componente celular pueden incluir dano de la pared celular, que puede ser causado por agentes que inhiben la smtesis de peptidoglucanos o incluso causan la digestion de peptidoglucanos. La familia de antibioticos beta-lactamicos se puede emplear para inducir un dano en la pared celular, de una manera dependiente de la smtesis de las protemas. Como ejemplos no limitantes, los betalactamicos contemplados para su posible uso incluyen penicilinas (penems), cefalosporinas (cefemas), carbapenems. Las betalactamas han demostrado ser efectivas para inducir la respuesta bacteriana en varias especies bacterianas, siendo las cepas de bacterias gram negativas las mas probadas. Sin embargo, las betalactamas solo pueden ser efectivas como agentes para inducir una respuesta bacteriana en cepas de bacterias que no son resistentes a las betalactamas.

Las familias adicionales de antibioticos para inducir esta respuesta bacteriana pueden incluir cicloserina, fosfomicina, bacitracina y glucopeptidos. La lisis de la pared celular o la digestion con peptidoglucano se pueden inducir con lisozima. Debido a que la mayona de las bacterias tienen peptidoglucano, se espera que la lisozima proporcione un agente util para inducir una respuesta bacteriana en bacterias gram negativas y gram positivas.

Los ejemplos de respuestas bacterianas a nivel celular incluyen cambios en el aspecto celular, tales como el tamano de la celula o el agrandamiento celular. En particular, diversos antibioticos y agentes toxicos o daninos para el ADN pueden inducir el agrandamiento celular de una manera que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta.

Se puede apreciar que las respuestas bacterianas pueden ocurrir en multiples niveles en simultaneo, secuencialmente o en intervalos superpuestos. Ademas, ciertos agentes descritos pueden ser capaces de inducir respuestas bacterianas en multiples niveles. En los ejemplos que siguen, la respuesta bacteriana se puede describir en terminos de la respuesta bacteriana que se controla mediante ensayos u otros medios. En algunos casos, la concentracion del agente empleado puede afectar el tipo de respuesta bacteriana que se induce.

En todas las realizaciones, se induce una respuesta bacteriana en las bacterias, tal como en una cepa de bacterias o en una muestra de bacterias. Como ejemplo no limitativo, se puede generar una muestra de bacterias en un entorno clmico, mediante metodos de cultivo conocidos para aislar e identificar bacterias. El agente que induce esta respuesta bacteriana puede inducirse en dos porciones separadas de las bacterias, tales como una primera porcion y una segunda porcion. Las porciones pueden estar separadas espacialmente; como ser, dentro de la misma placa de Petri u otro recipiente de incubacion, o pueden estar separadas ffsicamente, como en placas de Petri o recipientes de incubacion separados. Independientemente de la manera en que se separen la primera porcion y la segunda porcion, puede apreciarse que la designacion de una “primera” y una “segunda” porciones puede considerarse arbitraria con respecto a la ubicacion o la separacion, excepto en la medida en que las porciones esten lo suficientemente separadas para la incubacion en condiciones diferentes. Ademas, la designacion de una “primera” y una “segunda” porciones puede ser arbitraria con respecto a la cronologfa de cualquier incubacion. La primera y la segunda porciones se pueden incubar con sus respectivos tratamientos simultaneamente, uno tras otro, o de manera escalonada. Como un ejemplo no limitativo, el inicio de multiples tratamientos puede ser escalonado, de modo que se logre que esos tratamientos se completen al mismo tiempo o casi al mismo tiempo.

En todas las realizaciones, ambas porciones se someten a un agente que induce una respuesta bacteriana que depende de la smtesis de las protemas o que recibe la influencia de la smtesis de las protemas. Una de las porciones, la primera o la segunda, se preincuba con el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas y la otra no. En todas las realizaciones, una de las porciones de la cepa bacteriana se expone al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas antes de la incubacion con el agente para inducir una respuesta bacteriana. En algunas realizaciones, el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas se introduce en dosis que se reconocen como valores cnticos de susceptibilidad y/o resistencia. Por ejemplo, organizaciones internacionales como el Instituto de Estandares Clmicos y de Laboratorio (CLSI) establecen la concentracion de valor cntico de la susceptibilidad o resistencia para cada antibiotico y microorganismo. La susceptibilidad de una bacteria a un antibiotico puede entenderse en algunos casos con referencia a una concentracion inhibitoria minima (CIM), es decir, la dosis mas baja del antibiotico que inhibe significativamente el crecimiento de las celulas bacterianas.

En algunas realizaciones, se aplica un tratamiento adicional a una porcion de la cepa bacteriana, que puede estar separada de la primera y la segunda porciones. Esta porcion puede considerarse arbitrariamente como una tercera porcion y puede incubarse con la protema inhibidora de la smtesis de las protemas, pero sin inducir la respuesta bacteriana. En algunos casos, este tratamiento adicional puede servir como control, para la comparacion con los tratamientos de la primera y la segunda porciones Este control permite determinar si el propio antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas induce cambios celulares que dificulten la determinacion de la respuesta bacteriana. En otra realizacion, se puede aplicar un tratamiento adicional a otra porcion de la cepa bacteriana, que puede estar separada espacial y/o ffsicamente de las otras porciones. Esta porcion puede permanecer libre del agente que induce la respuesta bacteriana y libre del antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas y puede servir como control. Esta parte puede considerarse arbitrariamente como una cuarta porcion, que puede emplearse junto con la primera y la segunda porciones o junto con la primera, segunda y tercera porciones. Como un ejemplo, la cuarta porcion puede servir como un control que aporte informacion de referencia con respecto a la fragmentacion del ADN o quizas incluso al tamano de la celula. La cuarta porcion puede proporcionar un punto de partida para la comparacion con la porcion sometida solo al agente inductor de respuesta bacteriana. En caso de que no haya diferencias significativas, las bacterias pueden ser resistentes al agente seleccionado para inducir la respuesta bacteriana.

Determinacion rapida de la susceptibilidad o no susceptibilidad a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas: evaluacion de las respuestas a nivel del ADN.

Ejemplo 1

Como una ejemplificacion de los principios descritos con anterioridad, se ensayaron dos cepas de Escherichia coli que credan exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton (figura 1). La primera cepa de Escherichia coli fue una cepa TG1 susceptible tanto al aminoglucosido tobramicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas) como a la quinolona ciprofloxacina (un agente que induce la fragmentacion del ADN mediante la captura de topoisomerasas en el ADN) (figuras 1A-C). La segunda cepa fue un aislado clmico, resistente a la tobramicina y susceptible a la ciprofloxacina (figuras 1D-F). Se aplicaron cuatro tratamientos a cada cepa para distinguir rapidamente la cepa susceptible y resistente a la tobramicina.

Una porcion de ambas cepas bacterianas se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 40 minutos (figuras 1A y D), una dosis indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la tobramicina en el antibiograma estandar basado en microdilucion. Otra porcion de ambas cepas se incubo con ciprofloxacina, a razon de 1 pg/ml durante 30 minutos (figuras 1B y E). Otra porcion mas de ambas cepas se incubo con tobramicina a razon de 4 pg/ml durante 10 minutos, seguido de ciprofloxacina a razon de 1 pg/ml durante 30 minutos, sin eliminar la tobramicina (figura 1C, F). Una porcion final se dejo sin antibiotico.

Despues de cada incubacion, las celulas se procesaron utilizando la variante de la tecnolog^a Micromax, para visualizar los nucleoides, es decir, el ADN cromosomico bacteriano, en todas las celulas de la poblacion. Las celulas de cada cultivo se sumergieron en un microgel de agarosa, en un portaobjetos y se incubaron con una solucion de lisado espedfica para eliminar la pared celular de todas las celulas y liberar en el microgel los nucleoides contenidos dentro de las bacterias. Estos se secaron, se tineron con un fluorocromo de alta sensibilidad para el ADN, como SYBR Gold y se visualizan bajo microscopfa de fluorescencia. La figura 1 ilustra imagenes representativas capturadas en cada una de las condiciones que se describen a continuacion.

Como puede verse en las figuras 1A y D, las celulas incubadas con tobramicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no produjeron ninguna modificacion de los nucleoides. Estos resultados fueron similares en cuanto al aspecto a los de los cultivos sin antibioticos en cepas tanto susceptibles como resistentes a la tobramicina.

Las celulas incubadas con ciprofloxacina sola demostraron nucleoides con muy ADN fragmentado, como se esperaba, ya que ambas cepas son susceptibles a la quinolona, como se ve en las figuras 1B y E.

Las celulas incubadas con tobramicina seguidas de ciprofloxacina demostraron nucleoides con un nivel reducido de fragmentacion de ADN en la cepa susceptible a la tobramicina, la figura 1C. En la cepa resistente de las bacterias, el ADN se fragmento ampliamente, de manera similar a los provenientes del cultivo incubado solo con ciprofloxacina, en la cepa resistente a la tobramicina, la figura 1F.

Las figuras 1A-F ilustran que una preincubacion con tobramicina reduce significativamente el nivel de fragmentacion del ADN causado por la ciprofloxacina en la cepa que es susceptible a la tobramicina, figura 1C, mientras que este efecto decreciente no es evidente en la cepa resistente a la tobramicina. Al igual que en la figura 1E, se observa una gran cantidad de fragmentacion de ADN en la figura 1F.

La metodologfa descrita con anterioridad se empleo para determinar rapidamente la susceptibilidad de 12 cepas de E. coli a la tobramicina. Una porcion de cada cepa bacteriana se incubo con tobramicina a la dosis del valor cntico de la susceptibilidad, 4 pg/ml, durante 40 minutos. Una porcion de cada cepa se incubo con ciprofloxacina a razon de 1 pg/ml durante 30 minutos. Otra porcion mas de cada cepa se incubo con tobramicina a razon de 4 pg/ml durante 10 minutos, seguido de ciprofloxacina, a razon de 1 pg/ml durante 30 minutos, sin eliminar la tobramicina. Una porcion final de cada cepa se dejo sin antibiotico. Las cepas de E. coli se identificaron como susceptibles o no segun los niveles de fragmentacion del ADN en la porcion de cada cepa incubada con ciprofloxacina y en la porcion incubada con tobramicina y ciprofloxacina.

Al comparar las cepas analizadas para determinar la cantidad de fragmentacion del ADN, esta metodologfa identifico nueve de las doce cepas como susceptibles a la tobramicina y tres de las doce cepas como no susceptibles. Se realizo un antibiograma estandar obtenido por microdilucion en las mismas cepas, y una comparacion entre los resultados senalo a las mismas nueve cepas como susceptibles, y las mismas tres cepas que fueron no susceptibles (resistentes), segun el criterio MIC-CLSI (valor cntico de la susceptibilidad < 4 pg/ml) fueron identificadas exitosamente por la prueba rapida.

Puede entenderse que la fragmentacion de ADN por la ciprofloxacina depende, al menos en parte, de la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la tobramicina (es decir, en la cepa susceptible a la tobramicina), la fragmentacion del ADN por la ciprofloxacina disminuye. Si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito mediante la tobramicina (es decir, en la cepa resistente (no susceptible) a la tobramicina), la fragmentacion del ADN por ciprofloxacina permanece masiva, sin cambios. Esta distincion proporciona un medio para determinar cepas susceptibles y no susceptibles. Es importante destacar que esta distincion puede discriminarse rapidamente en un ensayo.

Los principios ejemplificados en el ejemplo 1 se confirmaron con el aminoglucosido amikacina. En pocas palabras, una cepa susceptible y resistente del E. coli se expuso a condiciones similares a las descritas en el ejemplo 1, excepto que se utilizo amikacina como el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas. Espedficamente, cada cepa fue sometida a cuatro tratamientos. Una porcion no recibio antibioticos, y otra porcion recibio solo una quinolona, como ciprofloxacina o norfloxacina para inducir la fragmentacion del a Dn . Otra porcion mas recibio un antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas, el aminoglucosido amikacina, seguido por quinolona. Otra porcion recibio solo amikacina. Una porcion final no recibio ningun antibiotico. La susceptibilidad del E. coli a la amikacina se determino con exito a traves de la metodologfa descrita con anterioridad.

Los principios ejemplificados en el ejemplo 1 se confirmaron adicionalmente con el aminoglucosido gentamicina. En resumen, la prueba rapida se realizo en 15 cepas aisladas de E. coli, de acuerdo con la metodologfa descrita con anterioridad, excepto que se utilizo gentamicinina como el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas. La fragmentacion del ADN suprimida se utilizo para caracterizar la susceptibilidad bacteriana, y esas caracterizaciones se verificaron con el antibiograma estandar para la gentamicina por microdilucion. Los resultados se correlacionaron perfectamente, y las 10 cepas susceptibles y las 5 cepas resistentes (no susceptibles) a la gentamicina se identificaron sin ambiguedad con la prueba rapida. Por otra parte, se obtuvieron resultados similares con el cloranfenicol como inhibidor de la smtesis de las protemas y la quinolona ciprofloxacina.

Ejemplo 2

Se ha descubierto que el dano al ADN o la fragmentacion del ADN inducidos por la mitomicina C depende parcialmente de la smtesis de las protemas. La mitomicina C es un agente alquilante que reacciona con la secuencia de nucleosidos de guanina 5'-CpG-3'. Inhibe la replicacion del ADN al reaccionar covalentemente con el ADN, formando enlaces cruzados entre las cadenas complementarias de ADN. La fragmentacion del ADN bacteriano puede ocurrir de manera secundaria, como consecuencia de la reparacion del ADN y la activacion de la respuesta SOS o durante el proceso de muerte celular. La susceptibilidad bacteriana a los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas puede determinarse utilizando mitomicina C como un agente que induce el dano al ADN o la fragmentacion del ADN.

La mitomicina C puede presentar un agente muy solido para inducir la fragmentacion del ADN o el dano del ADN en las bacterias debido a que no se esperan resistencias significativas a la mitomicina C, a diferencia de antibioticos tales como las quinolonas o los inhibidores de la smtesis de la pared celular, descritos con anterioridad. Por esta razon, la mitomicina C puede tener una aplicacion mas amplia a muchas especies y cepas bacterianas.

Las bacterias pueden incubarse con un antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas antes de la adicion de mitomicina C. Si la cepa bacteriana es susceptible al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, el nivel de fragmentacion del ADN del cromosoma bacteriano por la mitomicina C se reduce, en comparacion con el producido por la incubacion con mitomicina C sola. Si las bacterias son resistentes al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, el nivel de fragmentacion del ADN cromosomico por la mitomicina C permanece practicamente sin cambios. El antibiotico no puede actuar, por lo que la smtesis de las protemas es efectiva, y el ADN esta fragmentado por la mitomicina C como de costumbre.

Como ejemplo ilustrativo, dos cepas de Escherichia coli que crecen exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton se incubaron bajo diferentes tratamientos y luego se analizaron, como se ve en la figura 2. Las figuras 2 A-C representan una cepa TG1 susceptible al aminoglucosido tobramicina, un inhibidor de la smtesis de las protemas, y a la mitomicina C, un agente que induce dano en el ADN. La otra cepa ilustrada en las figuras 2 D-F fue un aislado clmico resistente a la tobramicina.

Una porcion de ambas cepas bacterianas se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 90 minutos (figuras 2A y D), una dosis indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la tobramicina en el antibiograma estandar basado en microdilucion. Otra porcion de ambas cepas se incubo con mitomicina C, a razon de 50 pg/ml durante 60 minutos (figuras 2B y E). Otra porcion mas de ambas cepas se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 30 minutos, seguido de mitomicina C a razon de 50 pg/ml durante 60 minutos, sin eliminar la tobramicina (Fig. 2C y F). Una porcion final se dejo sin antibiotico.

Despues de la incubacion, las celulas se procesaron utilizando una variante de la tecnologfa Micromax para visualizar los nucleoides, es decir, el ADN cromosomico bacteriano, en todas las celulas de la poblacion. Las muestras celulares del cultivo se sumergen en un microgel de agarosa en un portaobjetos y se incuban con una solucion de lisado espedfica, para eliminar la pared celular de todas las celulas y los nucleoides contenidos dentro de las bacterias liberan en el microgel. Estos se secan, se tinen con un fluorocromo altamente sensible para el ADN, como el SYBR Gold, y se visualizan bajo microscopfa de fluorescencia. Los nucleoides de E. coli obtenidos usando el ensayo de Micromax se representan en la figura 2, las figuras 2A-C corresponden a una cepa susceptible a tobramicina (TG1), y las figuras 2D-E a una cepa resistente a la tobramicina.

Como se puede ver en las figuras 2A y D, la incubacion con tobramicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no produce modificaciones de los nucleoides que son similares en cuanto a su aspecto a los de los cultivos sin antibioticos, tanto en cepas susceptibles como resistentes a la tobramicina.

Las figuras 2B y E, demuestran que la incubacion con mitomicina C produce nucleoides con ADN fragmentado en ambas cepas, como se esperaba. El nivel de fragmentacion del ADN puede ser variable en los diferentes nucleoides y en las diferentes cepas.

El ensayo representado en la figura 2C ilustra que la incubacion con tobramicina seguida de mitomicina C produjo nucleoides sin fragmentacion observable de ADN en la cepa susceptible a tobramicina. En contraste, la figura 2F ilustra que en las bacterias resistentes al antibiotico inhibidor de protemas (tobramicina en este caso), el ADN permanecio fragmentado, de manera similar a los del cultivo incubado con mitomicina C solamente (figura 2E). A partir de estos resultados, se puede entender que la fragmentacion del ADN por mitomicina C depende en parte de la smtesis de las protemas y que si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la tobramicina (es decir, en la cepa susceptible a la tobramicina), la fragmentacion del ADN por la mitomicina C disminuye o se suprime. Por otro lado, si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito con la tobramicina (es decir, en una cepa no susceptible), la fragmentacion del ADN por la mitomicina C permanece practicamente sin cambios. Las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo. Se podnan usar otros agentes que inducen dano en el a Dn , en lugar de la mitomicina C. La lista es numerosa e incluye principalmente agentes alquilantes, muchos de ellos utilizados en la quimioterapia contra el cancer.

Ejemplo 3

En un ejemplo adicional, se ha encontrado que el dano en el ADN o la fragmentacion del ADN inducida por la desoxirribonucleasa (DNasa) liberada por la lisis de la pared celular del Staphylococcus aureus depende de la smtesis de las protemas. El S. aureus es una bacteria gram positiva que sintetiza y secreta la DNasa, que se almacena en la pared celular. Cuando la pared celular es digerida parcialmente por un tratamiento corto con lisostafina, la DNasa se libera, dando como resultado la fragmentacion del ADN. La fragmentacion del ADN puede visualizarse utilizando el ensayo Micromax (Tamayo M, Santiso R, Gosalvez J, Bou G, Fernandez MC, Fernandez JL. Cell wall active antibiotics reduce chromosomal DNA fragmentation by peptidoglycan hydrolysis in Staphylococcus aureus. Arch Microbiol 2012; 194: 967-975). En una realizacion, las bacterias se incuban con un antibiotico que afecta a la smtesis de las protemas antes de la adicion de lisostafina. Si la cepa bacteriana es susceptible al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, el nivel de fragmentacion del ADN del cromosoma bacteriano por la DNasa se reduce o suprime, en comparacion con el producido por la incubacion con la lisostafina sola. La DNasa es una enzima de naturaleza proteica, que se sintetiza en los ribosomas de S. aureus. Posiblemente, la cantidad de DNasa sintetizada se reduce por el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, por lo que la cantidad de DNasa almacenada en la pared celular disminuye, en comparacion con las celulas de control que no reciben tratamiento con el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas. En tal caso, la lisostafina libera una menor cantidad de DNasa, por lo que el ^a Dⁿ parece menos fragmentado. De lo contrario, si las bacterias no son susceptibles con respecto al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, el nivel de fragmentacion del ADN cromosomico por la DNasa permanece practicamente sin cambios. El antibiotico no puede actuar, por lo que la smtesis de las protemas es efectiva y la produccion de DNasa no se modifica y los nucleoides se fragmentan como de costumbre.

En una ejemplificacion de este principio, se analizaron dos cepas de S. aureus que credan en agar Mueller-Hinton con 5 % de sangre de oveja. Una cepa era susceptible al macrolido azitromicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas) (figuras 3 A-C), y la otra cepa era un aislado clmico resistente a la azitromicina (figuras 3 D-F). El proposito era distinguir rapidamente las cepas susceptibles y no susceptibles a la azitromicina. Los cultivos se procesaron directamente a partir de placas de agar de crecimiento estandar de 18-24 horas, y no fue necesario que las celulas crecieran exponencialmente antes del ensayo.

Cada una de estas cepas se sometio a cuatro tratamientos. Una porcion de ambas cepas se incubo con azitromicina a razon de 2 pg/ml durante 120 minutos; 2 pg/ml era el valor indicado por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la azitromicina. Las celulas se lisaron para liberar los nucleoides y se generaron las imagenes de las figuras 3A y 3D. Otra porcion de cada cepa se incubo con lisostafina, a razon de 10 pg/ml durante 1 minuto. Las figuras 3B y E representan los nucleoides liberados en cada cepa para este tratamiento. Otra porcion mas se incubo con azitromicina, a razon de 2 pg/ml durante 120 minutos, seguida de lisostafina, a razon de 10 pg/ml durante 1 minuto, sin eliminar la azitromicina. Los ensayos para estos tratamientos se pueden ver en las figuras 3C y F. Se dejo una porcion final sin antibioticos.

Despues de la incubacion, las celulas se procesaron utilizando la variante de una tecnologfa Micromax para lisar las celulas con las paredes celulares afectadas. Como se indico con anterioridad, las muestras de las celulas del cultivo se sumergen en un microgel de agarosa en un portaobjetos y se incuban con una solucion de lisis espedfica para eliminar la pared celular en las celulas afectadas por lisosina y liberar en el microgel los nucleoides que contienen las bacterias. Estos se secan, se tinen con un fluorocromo altamente sensible para el ADN, como SYB^r Gold, y se visualizan bajo microscopfa de fluorescencia.

Como puede verse en las figuras 3A y D, la incubacion con azitromicina sola, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no dio lugar a la modificacion del aspecto de las bacterias. Cada cepa parece similar a las de los cultivos sin antibioticos, tanto en cepas susceptibles como resistentes a la azitromicina.

Como se puede ver en las figuras 3B y E, la incubacion con lisostafina da como resultado la liberacion de nucleoides con una gran cantidad de fragmentacion del ADN como se esperaba, debido a la liberacion de DNasa.

La incubacion con azitromicina seguida de lisostafina dio lugar a nucleoides con un nivel muy reducido de fragmentacion de ADN, o incluso con supresion de la fragmentacion de ADN en la cepa susceptible a la azitromicina, como se ve en la figura 3C. En contraste, se observa una importante fragmentacion del ADN, similar a la del cultivo incubado con lisostafina solamente (figura 3E), en la cepa resistente a la azitromicina (figura 3F).

En tal sentido, la fragmentacion del ADN por la DNasa liberada en el S. aureus a traves de la digestion de la pared celular con lisostafina se modula mediante la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la azitromicina (es decir, en la cepa susceptible a la azitromicina), el nivel de DNasa almacenado en la pared celular se reduce, liberando un nivel mas bajo de DNasa despues de la digestion de la pared celular con lisostafina, por lo que la fragmentacion del ADN disminuye. Pero si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito mediante la azitromicina (es decir, en la cepa no susceptible), la fragmentacion del ADN por la DNasa permanece en gran parte, sin cambios. De esta manera, las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo.

Ejemplo 4

En otro ejemplo, se ha determinado que el dano o la fragmentacion del ADN inducido en la respuesta autolttica de Streptococcus pneumoniae depende de la smtesis de las protemas. Cuando el S. pneumoniae (neumococo) gram positivo se incuba con tensioactivos y/o enzimas que afectan a la pared celular, se activa una respuesta enzimatica que da como resultado la autolisis y la fragmentacion del ADN. Esta es una respuesta utilizada con anterioridad como prueba para identificar al S. pneumoniae. Se puede desencadenar una respuesta bacteriana mediante la incubacion con detergentes como la bilis, el desoxicolato o el Triton X-100, asf como la enzima lisozima que digiere el peptidoglucano y los inhibidores de los antibioticos de la smtesis del peptidoglucano, entre otros. La principal autolisina activada es la N-acetilmuramoil-L-alanina amidasa (LytA) (LytA) (Mellroth P, Daniels R, Eberhardt A, Ronnlund D, Blom H, Widengren J, Normark S, Henriques-Normark B. Lyt A, major autolysin of Streptococcus pneumoniae, requires access to nascent peptidoglycan. J Biol Chem 2012, 287: 11018-11029).

Como un ejemplo no limitativo, el agente para inducir la respuesta autolttica que muestra la fragmentacion del ADN puede incluir Triton X-100 al 0,05%, 2 mg/ml de lisozima, EDTA 25 mM, y puede tener un tiempo de incubacion de aproximadamente 5 minutos. El EDTA se puede usar opcionalmente en combinacion con los otros agentes, con el proposito de mejorar la calidad de las imagenes. En una realizacion, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas se proporciona antes de la adicion del tratamiento con Triton-lisozima-EDTA. Si las bacterias son susceptibles al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, la smtesis de las protemas no es efectiva y la frecuencia de las celulas lisadas y que muestran la fragmentacion del ADN se reduce poderosamente, en comparacion con la producida por la incubacion con Triton-lisozima-EDTA solo. Por otro lado, si las bacterias no son susceptibles con respecto al antibiotico que afecta a la smtesis de las protemas, la proporcion de celulas lisadas y que muestran la fragmentacion del ADN cromosomico puede no modificarse o solo reducirse apenas. El antibiotico no puede actuar, por lo que la smtesis de las protemas es efectiva, y el ADN se fragmenta despues del tratamiento autolttico inducido, como de costumbre.

En una ejemplificacion de este principio, se analizaron dos cepas de S. pneumoniae que crecfan en el caldo Mueller-Hinton II complementado con cationes y 2-5 % de sangre de caballo lisada, a 37 ° C con CO2 al 5 %. Una cepa que tema una CMI de 0,25 pg/ml era susceptible y la otra cepa que tema una CIM >32 pg/ml era resistente al macrolido azitromicina (inhibidor de la smtesis de las protemas). El proposito del ensayo era distinguir rapidamente la cepa susceptible y la resistente (es decir, no susceptible) a la azitromicina.

Cada una de estas dos cepas se sometio a cuatro tratamientos. Una primera porcion de ambas cepas se incubo con azitromicina, a una concentracion de 0,5 pg/ml durante 60 minutos. La dosis era la indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la azitromicina en el antibiograma estandar basado en la microdilucion. Otra porcion de ambas cepas se incubo con Triton X-100 al 0,05%, 2 mg/ml de lisozima, EDTA 25 mM, durante 5 minutos. Otra porcion mas de cada cepa se incubo con azitromicina a razon de 0,5 pg/ml durante 60 minutos, seguido de Triton X-100 al 0,05%, 2 mg/ml de lisozima, EDTA 25 mM, por 5 minutos, sin eliminar la azitromicina. Una porcion final de cada cepa permanecio sin ningun antibiotico.

Despues de la incubacion, las celulas se procesaron utilizando la variante de la tecnologfa Micromax para visualizar los nucleoides. De la misma manera indicada con anterioridad, las muestras de las celulas del cultivo se sumergieron en un microgel de agarosa en un portaobjetos y se incubaron con una solucion de lisis espedfica para eliminar la pared celular de todas las celulas y liberar en el microgel los nucleoides contenidos dentro de las bacterias. Mientras que la incubacion se desarrolla, por lo general, durante cinco minutos, en este caso dos minutos a temperatura ambiente demostraron ser suficientes. Los microgeles se secaron, se tineron con un fluorocromo de alta sensibilidad para ADN, como SYBR Gold y se visualizaron bajo microscopfa de fluorescencia.

La incubacion con azitromicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no produjo una modificacion de las bacterias que son similares en cuanto a su aspecto a las de los cultivos sin antibioticos, tanto en cepas susceptibles como resistentes a la azitromicina.

La incubacion con Triton-lisozima-EDTA da como resultado que las celulas lisadas muestren nucleoides con ADN fragmentado, como se esperaba. La proporcion de celulas con fragmentacion de ADN puede ser variable en las diferentes cepas. En este caso, la respuesta bacteriana comprende 84 % y 93 % de fragmentacion de ADN en la cepa susceptible y resistente, respectivamente.

La incubacion con azitromicina seguida por Triton-lisozima-EDTA dio lugar a una fuerte disminucion en el porcentaje de celulas lisadas y con ADN fragmentado en la cepa susceptible a la azitromicina. En particular, el ADN fragmentado estaba en alrededor del 40%, demostrando un 44 % menos de fragmentacion que la incubacion con Triton-lisozima-EDTA solo. En contraste, la proporcion de celulas lisadas y con ADN fragmentado fue del 86 % en la cepa resistente a la azitromicina, solo un 7 % menos.

Por consiguiente, puede entenderse que la lisis y la fragmentacion del ADN inducida por Triton-lisozima-EDTA dependen parcialmente de la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la azitromicina (es decir, en la cepa susceptible a la azitromicina), la frecuencia de la celula lisada y que muestra la fragmentacion del ADN inducida por Triton-lisozima-EDTA disminuye notablemente. Pero, si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito mediante la azitromicina (es dedr, en la cepa resistente a la azitromicina), la proporcion de celulas lisadas y con la fragmentacion del ADN inducida por Triton-lisozima-EDTA permanece inalterada o muy reducida. De esta manera, las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo. Se obtuvieron respuestas similares utilizando otros inhibidores antibioticos de la smtesis de las protemas, como el macrolido eritromicina y la tetraciclina doxiciclina.

Determinacion rapida de la susceptibilidad o no susceptibilidad a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas: evaluacion de las respuestas a nivel de la pared celular.

Ejemplo 5

Tambien se ha determinado que en la respuesta de las bacterias a los inhibidores de la smtesis de peptidoglucanos, es decir, el dano de la pared celular, tambien influye la smtesis de las protemas ribosomicas. La estructura de la pared celular bacteriana esta compuesta por el peptidoglucano o murema. Se trata de una cadena lineal constituida por N-acetilglucosamina (NAG) y acido N-acetilmuramico (NAM) alternados. Un tetrapeptido se une al NAM, formando un enlace interpeptfdico con el tetrapeptido de la cadena mas cercana, estabilizando y fortaleciendo la pared celular.

La familia principal de antibioticos que inhiben la smtesis de la pared celular corresponde a las p-lactamas. Estas son agentes bactericidas que interfieren con la formacion del enlace interpeptfdico a traves de la inhibicion de las protemas de union a penicilina (PBP, por sus siglas en ingles), serina proteasas o transpeptidasas, despues de una reaccion irreversible. En segundo lugar, una acumulacion de precursores de peptidoglucanos desencadena hidrolasas o autolisinas de murema, degradando el peptidoglucano y provocando la muerte celular (Kitano K, Tomasz A. Triggering of autolytic cell wall degradation in Escherichia coli by beta-lactam antibiotics. Antimicrob Agents Chemother 1979, 16: 838-848).

En la degradacion del peptidoglucano por agentes que inhiben la smtesis de peptidoglucanos influye la smtesis de las protemas. Las bacterias se incuban primero con un antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, seguido de una incubacion con un antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglucanos. Si las bacterias son susceptibles al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, la alteracion del peptidoglucano de la pared celular bacteriana se reduce, en comparacion con la producida por la incubacion con el antibiotico que inhibe solo la smtesis de peptidoglucanos. Sin embargo, si las bacterias no son susceptibles con respecto al antibiotico que afecta la smtesis de las protemas, el nivel de afectacion del peptidoglucano por el antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglucanos permanece practicamente sin cambios. En este caso, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas no puede actuar, por lo que la smtesis de las protemas es efectiva y el peptidoglucano es degradado por el antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglucanos. Puede ser evidente que este procedimiento solo puede aplicarse cuando la cepa bacteriana de interes es susceptible al antibiotico que inhibe la smtesis de peptidoglucanos.

Como ejemplo de este principio, la figura 4 ilustra ensayos de dos cepas de Pseudomonas aeruginosa que crecen exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton. Ambas cepas fueron susceptibles a la p-lactama meropenem, que inhibe la smtesis de los peptidoglucanos. Una cepa fue susceptible (figuras 4A-C) y la otra resistente (figuras 4D-F) al aminoglucosido tobramicina (inhibidor de la smtesis de las protemas).

Con el fin de distinguir rapidamente las cepas susceptibles y las resistentes (es decir, no susceptibles) a la tobramicina, cada cepa se sometio a cuatro tratamientos. Una porcion de cada cepa se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 75 minutos (figuras 4A, D). La dosis utilizada, fue indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la tobramicina. Las figuras 4B y E ilustran un ensayo de otra porcion de cada cepa, que se incubo con Meropenem, a razon de 0,2 pg/ml durante 60 minutos. Las figuras 4C y F, ilustran ensayos de otra porcion mas de ambas cepas que se incubaron con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 15 minutos, seguido de meropenem a 0,2 pg/ml durante 60 minutos, sin eliminar la tobramicina. Otra porcion mas de ambas cepas se mantuvo sin la adicion de ninguno de los antibioticos.

Despues de la incubacion, las celulas se procesaron utilizando una variante de la tecnologfa Micromax para visualizar la afectacion o no de la pared celular, en funcion de la liberacion o no de los nucleoides contenidos en el interior de las bacterias. De la misma manera descrita con anterioridad, las muestras de celulas del cultivo se sumergen en un microgel de agarosa en un portaobjetos y se incuban con una solucion de lisis espedfica que elimina la pared celular solo en aquellas bacterias cuyo peptidoglucano fue afectado, liberando asf en el microgel los nucleoides contenidos dentro. Las bacterias cuya pared celular esta intacta no se ven afectadas por la solucion de la lisis y no liberan el nucleoide, por lo que permanecen con su forma estandar. Las bacterias procesadas en microgel se secan, se tinen con un fluorocromo de alta sensibilidad para ADN como SYBR Gold y se visualizan bajo microscopfa de fluorescencia.

Las figuras 4A y D ilustran que la incubacion con tobramicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no produce la lisis de la pared celular ni modificaciones de la forma bacteriana, que es similar en cuanto a su aspecto a la de los cultivos sin antibioticos, tanto en las cepas susceptibles como en las resistentes a la tobramicina.

Las figuras 4B y E ilustran que la incubacion con meropenem resulta en la liberacion de nucleoides debido a la afectacion de la pared celular. Ademas, es evidente un fondo de fragmentos de ADN. Este resultado se observo en ambas cepas, ya que son susceptibles a meropenem.

La figura 4C ilustra un ensayo de la cepa susceptible incubada con tobramicina, seguida de meropenem, que dio como resultado bacterias no lisadas sin cambios. En contraste, los nucleoides se liberaron y en la figura 4F se evidencio un fondo de fragmentos de ADN, que representa un ensayo tornado del cultivo resistente en las mismas condiciones. Puede verse que la figura 4F se asemeja a las figuras 4^b y E, los ensayos incubados con meropenem solamente.

Por consiguiente, la degradacion del peptidoglucano por meropenem depende de la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito por la tobramicina (es decir, en la cepa susceptible a la tobramicina), se evita la afectacion del peptidoglucano por meropenem. Pero si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito por la tobramicina (es decir, en la cepa resistente a la tobramicina), la afectacion del peptidoglucano por meropenem permanece sin cambios. De esta manera, las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo.

Ademas, ejemplificando el concepto descrito con anterioridad, se procesaron doce cepas de Klebsiella pneumoniae, 7 susceptibles y 5 resistentes a la tobramicina, utilizando el mismo razonamiento y procedimiento. Espedficamente, una porcion de cada una se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml, durante 75 min. Otra porcion se incubo con Meropenem, a razon de 1 pg/ml durante 60 minutos. Otra porcion mas se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 15 minutos, seguido de meropenem, a razon de 1 pg/ml durante 60 minutos, sin eliminar la tobramicina. Una porcion final quedo sin antibioticos.

En una evaluacion de las cepas sometidas a ensayo, se identificaron correctamente todas las cepas susceptibles y resistentes (es decir, no susceptibles) a la tobramicina con la prueba rapida. En las cepas susceptibles, la inhibicion exitosa de la smtesis de las protemas por la tobramicina no produjo la aparicion de lisis de la pared celular por meropenem cuando se uso el ensayo Micromax. De lo contrario, en las cepas resistentes a la tobramicina, la smtesis de las protemas no se inhibio por el aminoglucosido, por lo que no se suprimio la afectacion de la pared celular por meropenem.

Ejemplo 6

Otra respuesta celular afectada por la smtesis de las protemas es la lisis celular por digestion con peptidoglucanos, que se puede inducir con enzimas lfticas de la pared celular, como la lisozima. Cuando una bacteria gram positiva, como el Enterococcus, se incuba con lisozima, cataliza la hidrolisis de los enlaces beta-1,4-glicosfdicos entre el acido N-acetilmuramico y la N-acetilglucosamina del peptidoglucano de la pared celular. El tratamiento posterior con una solucion de lisis da como resultado que la mayona de las celulas se lisen ligeramente, lo que propaga el contenido de citoplasma, incluidas las fibras del ADN interno-nucleoide. En ciertas realizaciones de la presente invencion, se ha demostrado que cuando se inhibe la smtesis de las protemas ribosomicas bacterianas, el numero de celulas lisadas por la solucion de lisado de lisozima disminuye considerablemente. Sin embargo, cuando la bacteria no es susceptible a la dosis de eritromicina o cloranfenicol, el porcentaje de celulas lisadas practicamente no cambia con respecto al cultivo de control solo incubado con lisozima pero sin el antibiotico.

Como ejemplo, dos cepas de Enterococcus faecalis que crecen exponencialmente en caldo de Mueller-Hinton se incubaron en cuatro condiciones diferentes y luego se analizaron. Una cepa fue susceptible al macrolido eritromicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas) (CIM: 0,125 pg/ml) y la otra fue resistente (CIM > 128 pg/ml). Cada cepa se sometio a cuatro tratamientos con el proposito de distinguir rapidamente la cepa susceptible de la cepa resistente a la eritromicina.

Una porcion de cada cepa se incubo con eritromicina, a razon de 0,5 pg/ml durante 75 minutos. La dosis fue la indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la eritromicina en el antibiograma estandar basado en la microdilucion. Otra porcion de ambas cepas se incubo con lisozima, 1 mg/ml, por 10 minutos, a 37 °C. Otra porcion mas de ambas cepas se incubo con eritromicina, a razon de 0,5 pg/ml durante 75 minutos, seguido de lisozima 1 mg/ml durante los ultimos 10 minutos, a 37 °C.

Despues de la incubacion con lisozima, las celulas se procesaron utilizando una variante de la tecnologfa Micromax, para visualizar los nucleoides, es decir, la propagacion del ADN cromosomico bacteriano, en todas las celulas de la poblacion. Las muestras de los cultivos se sumergieron en un microgel de agarosa, en un portaobjetos y se incubaron con una solucion de lisado espedfica para eliminar la pared celular de todas las celulas y liberar en el microgel los nucleoides contenidos dentro de las bacterias. Estos se secaron, se tineron con un fluorocromo altamente sensible para el ADN, como SYBR Gold, y se visualizan bajo microscopfa de fluorescencia.

Como puede verse mejor en la figura 5B, la cepa susceptible a la eritromicina sometida a ensayo contema un 92,13 % de celulas lisadas que liberaban fibras nucleoides despues de la incubacion con lisozima y la solucion de lisis. Como se muestra en la figura 5C, el porcentaje de celulas lisadas se redujo a 3,87 % en la cepa incubada con eritromicina, antes de la introduccion de la lisozima. Como se ve en la figura 5E, la cepa resistente a la eritromicina probada, despues de la incubacion con lisozima y solucion de lisis, contema un 97,36 % de celulas parcialmente lisadas con fibras de nucleoide en expansion. La incubacion previa con eritromicina no modifico este porcentaje en la cepa resistente. La figura 5F representa la cepa resistente probada que tiene un 96,77 % de celulas lisadas. Para generalizar estos hallazgos, se ha reproducido un patron de respuesta similar en cuatro cepas mas susceptibles a la eritromicina y en trece cepas mas resistentes a la eritromicina de Enterococcus. Esta respuesta inhibitoria no se obtuvo despues de la incubacion con quinolonas como la ciprofloxacina, por lo que el efecto parece ser mas espedfico de la inhibicion de la smtesis de las protemas ribosomicas bacterianas.

Por consiguiente, la lisis celular por enzimas ltticas de la pared celular, como la lisozima, aparece afectada adversamente por la inhibicion de la smtesis de las protemas en el Enterococcus, y posiblemente tambien en otras especies. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la eritromicina (es decir, en la cepa susceptible a la eritromicina), la lisis celular por lisozima y el ensayo de Micromax disminuye y la mayona de las celulas aparecen con su forma estandar cercana. Pero si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito por la eritromicina (es decir, en la cepa resistente a la eritromicina), la lisis celular por lisozima y el ensayo de Micromax no se suprime o esta mucho menos reprimida y la mayona de las bacterias permanecen lisadas, liberando asf los nucleoides. De esta manera, las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo.

Determinacion rapida de la susceptibilidad o no susceptibilidad a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas: evaluacion de las respuestas a nivel morfologico.

En realizaciones adicionales, se ha encontrado que la smtesis de las protemas afecta la modificacion del aspecto celular, como la ampliacion celular inducida por agentes tales como antibioticos, agentes toxicos o daninos para el ADN.

Ejemplo 7

Se ha demostrado previamente que las bacterias susceptibles a los antibioticos que inhiben la smtesis de las protemas, como la p-lactama, por ejemplo, las cefalosporinas, como la ceftazidima o los carbapenems, como el meropenem, pueden inducir el agrandamiento celular en las cepas susceptibles a dosis espedficas del antibiotico. Ahora se ha determinado que esta ampliacion depende tambien de la smtesis de las protemas, por lo que este efecto se puede suprimir en las cepas bacterianas susceptibles a un antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, mientras que el efecto permanece en las cepas no susceptibles.

Como ejemplo, se sometieron a ensayo dos cepas de Pseudomonas aeruginosa que credan exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton. Estas dos cepas fueron susceptibles a la p-lactama ceftazidima, que inhibe la smtesis de los peptidoglucanos. Una cepa fue susceptible y la otra, resistente al aminoglucosido tobramicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas). Con el fin de distinguir rapidamente la cepa susceptible de la resistente a la tobramicina, cada cepa se sometio a cuatro tratamientos.

Una porcion de cada cepa se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml (el valor cntico de susceptibilidad segun el CLSI) durante 75 minutos. Un ensayo de esta porcion se representa en las figuras 6A y D. Otra porcion de cada cepa se incubo con ceftazidima, a razon de 0,5 pg/ml durante 60 minutos. Un ensayo de esta porcion se representa en las figuras 6B y D. Otra porcion de ambas cepas se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml, durante 15 minutos, seguido de ceftazidima, a razon de 0,5 pg/ml, durante 60 minutos, sin eliminar la tobramicina. Los ensayos de estas cepas se pueden ver en las figuras 6C y F, respectivamente. Una porcion final de cada cepa no fue tratada con ningun antibiotico.

Despues de la incubacion con los antibioticos, las celulas se procesaron utilizando una variante de la tecnologfa Micromax, para visualizar la ampliacion o no de las bacterias. Las muestras de cada cultivo se sumergieron en un microgel de agarosa en un portaobjetos, se secaron, se tineron con un fluorocromo de alta sensibilidad para el ADN, como SYBR Gold, y se visualizaron bajo microscopfa de fluorescencia para visualizar la forma y el tamano de las celulas.

Las figuras 6A y D, ilustran que la incubacion con tobramicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no afecta la forma ni el tamano de las bacterias en las cepas susceptibles o resistentes. Ambas cepas son similares en cuanto a su aspecto a los cultivos sin antibioticos.

Las figuras 6B y E, representan ensayos de bacterias incubadas con ceftazidima que dan como resultado un aumento significativo de las celulas. Se observan resultados similares en ambas cepas, ya que ambas son susceptibles a la ceftazidima.

La figura 6C ilustra un ensayo de las bacterias susceptibles incubadas con tobramicina, seguida de ceftazidima, que da como resultado bacterias de tamano similar a las incubadas con tobramicina sola (figura 6A) o bacterias no tratadas. En contraste, la figura 6F representa un ensayo de la cepa resistente, incubada en las mismas condiciones en las que las bacterias paredan agrandadas de manera similar a las del cultivo incubado con ceftazidima solamente (figura 6E).

Por consiguiente, la ampliacion por la ceftazidima depende de la smtesis de las protemas y, en tal sentido, los efectos supresores de las protemas que inhiben la smtesis de las protemas pueden emplearse para la determinacion rapida de la susceptibilidad a los antibioticos inhibidores de la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito por la tobramicina (como fue el caso en la cepa susceptible a la tobramicina), se suprime el aumento de tamano celular por meropenem. Pero si la smtesis de las protemas no se inhibe con exito por la tobramicina (como lo fue en la cepa resistente a la tobramicina), el aumento de tamano celular por meropenem no se suprime y las bacterias parecen de mayor longitud. De esta manera, las cepas susceptibles y no susceptibles se pueden discriminar rapidamente con el ensayo.

Ejemplo 8

Se ha descubierto, ademas, que dosis relativamente bajas de mitomicina C, un agente alquilante que induce el dano en el ADN (ver el ejemplo 3) tambien puede afectar el aspecto morfologico de las bacterias. En particular, las dosis reducidas de mitomicina C pueden provocar el agrandamiento bacteriano o alteraciones en el tamano. Ademas, se ha descubierto que esta modificacion de la forma celular depende de la smtesis de las protemas. En tal sentido, esta modificacion puede ser suprimida o reducida en las cepas susceptibles al antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas. Por el contrario, la modificacion de la forma celular permanece en cepas no susceptibles.

Como ejemplo, dos cepas de Escherichia coli que crecen exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton se incubaron en cuatro condiciones diferentes y luego se analizaron. Una cepa fue susceptible y la otra, resistente al aminoglucosido tobramicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas). Con el fin de distinguir rapidamente las cepas susceptibles de las no susceptibles de tobramicina, cada cepa se incubo en cuatro condiciones.

Una porcion de cada cepa se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml, durante 90 minutos. Como se describio con anterioridad, esta dosis esta indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la tobramicina en el antibiograma estandar basado en la microdilucion. Otra porcion de ambas cepas se incubo en mitomicina C, a razon de 0,5 pg/ml, durante 60 minutos. Otra porcion mas de cada cepa se incubo con tobramicina, a razon de 4 pg/ml durante 30 minutos, seguido de mitomicina C, a razon de 0,5 pg/ml durante 60 minutos, sin eliminar la tobramicina. Una porcion final de ambas cepas no se incubo con ninguno de los antibioticos.

Despues de la incubacion, las celulas se procesaron utilizando una variante de la tecnologfa Micromax para visualizar cualquier agrandamiento o no de las bacterias. Las muestras de las celulas tomadas del cultivo se sumergieron en un microgel de agarosa en un portaobjetos, se secaron, se tineron con un fluorocromo altamente sensible para el ADN, como el SYBR Gold, y se visualizaron bajo microscopfa de fluorescencia para visualizar la forma y el tamano de la celula. Las imagenes fueron similares a las correspondientes a la figura anterior.

Las bacterias sometidas a ensayo revelaron que la incubacion con tobramicina, el antibiotico que inhibe la smtesis de las protemas, no afecta la forma ni el tamano de las bacterias, que es similar en cuanto a su aspecto a la de los cultivos sin antibioticos, tanto en cepas susceptibles como resistentes a la tobramicina.

La incubacion con mitomicina C dio como resultado un aumento significativo de celulas tanto en las cepas susceptibles como en las resistentes del E. coli.

En la cepa susceptible de las bacterias, la incubacion con tobramicina seguida de mitomicina C dio como resultado bacterias de tamano similar a las incubadas con tobramicina sola o con bacterias no tratadas. En contraste, las bacterias resistentes incubadas con tobramicina seguida de mitomicina C paredan agrandadas, de manera similar a las del cultivo incubado con mitomicina C sola.

Por consiguiente, puede entenderse que el agrandamiento o la expansion de las celulas que induce la mitomicina C depende de la smtesis de las protemas. Si la smtesis de las protemas se inhibe con exito mediante la tobramicina, se reduce o se suprime el agrandamiento celular inducido por la mitomicina C. Pero si la smtesis de las protemas no se inhibida con exito mediante la tobramicina, el agrandamiento celular por la mitomicina C no se suprime, y las bacterias parecen tener una mayor longitud. Esta distincion proporciona un medio para hacer una rapida diferenciacion entre las cepas susceptibles y no susceptibles.

Como se demostro en el ejemplo 8, la evaluacion de la supresion o no del aumento de tamano celular por los inhibidores de antibioticos de la smtesis de las protemas solo se puede realizar en cepas susceptibles al antibiotico inductor de aumento de tamano celular. Sin embargo, la variante que incorpora mitomicina C como agente para inducir una respuesta bacteriana puede tener una aplicacion mas amplia en muchas especies y cepas bacterianas, porque no se esperan resistencias significativas a la mitomicina C.

Este hecho se ha ejemplificado en mayor detalle, mediante el uso de mitomicina C en la rapida deteccion exitosa de la susceptibilidad-resistencia a la tobramicina en el Pseudomonas aeruginosa y el Klebsiella pneumoniae, asf como la susceptibilidad-resistencia a la azitromicina en el Haemophilus influenzae.

En un ejemplo, dos cepas de H. influenzae que credan exponencialmente en un caldo de Mueller-Hinton se incubaron bajo cuatro tratamientos diferentes y luego se analizaron. Una cepa fue susceptible y la otra resistente al macrolido azitromicina (un inhibidor de la smtesis de las protemas). Con el fin de distinguir rapidamente la cepa susceptible de la resistente a la azitromicina, cada cepa se incubo en cuatro grupos de condiciones.

Una parte de cada cepa se incubo con azitromicina, a razon de 4 pg/ml, durante 150 minutos. La dosis de azitromicina correspondio a la dosis indicada por el CLSI como el valor cntico de la susceptibilidad a la azitromicina en los antibiogramas estandar basados en la microdilucion. Otra porcion de cada cepa se incubo con mitomicina C, a razon de 0,5 pg/ml durante 120 minutos. Otra porcion mas se incubo con azitromicina, a razon de 4 pg/ml durante 30 minutos, seguido de mitomicina C, a razon de 0,5 pg/ml, durante 120 minutos, sin eliminar la azitromicina. Una porcion final de cada cepa no se incubo con ningun antibiotico.

En la incubacion de la cepa susceptible con azitromicina seguida de mitomicina C, se obtuvieron bacterias de tamano similar a las incubadas con azitromicina o al control no tratado. De lo contrario, las bacterias parecieron agrandadas de un modo semejante a las del cultivo incubado con mitomicina C solamente, en la cepa resistente a la azitromicina.

Se podnan usar otros agentes que induzcan dano en el ADN o toxicidad celular que resulta en una modificacion de la forma de la celula, en lugar de antibioticos o mitomicina C. Una lista no exhaustiva de agentes potenciales para inducir una respuesta bacteriana a modo de modificaciones de la forma de la celula incluye a los agentes alquilantes, como los que se utilizan a menudo en la quimioterapia contra el cancer.

Como puede entenderse facilmente a partir de lo anterior, los conceptos basicos de la presente invencion pueden realizarse de varias maneras. La invencion implica numerosas y diversas realizaciones que incluyen, aunque no taxativamente, el mejor modo de la invencion.

En tal sentido, las realizaciones o elementos particulares de la invencion revelados por la descripcion o mostrados en las figuras que acompanan a esta solicitud no pretenden ser limitativos, sino ejemplos de las numerosas y variadas realizaciones abarcadas en general por la invencion o los equivalentes comprendidos con respecto a cualquier elemento particular del mismo. Ademas, la descripcion espedfica de una unica realizacion o elemento de la invencion puede no describir explfcitamente todas las realizaciones o los elementos posibles; muchas descripciones se revelan implfcitamente por la descripcion y las figuras.

El alcance de la presente invencion esta limitado unicamente por las reivindicaciones.

Ademas, a los efectos de la presente descripcion y de las reivindicaciones, el termino “un” o “una” de una entidad se refiere a uno o mas de esa entidad; por ejemplo, “un antibiotico” se refiere a uno o mas antibioticos. En este sentido, los terminos “un” o “una”, “uno o mas” y “al menos uno” deben entenderse como sinonimos, segun se los usa en este documento.

Se supone que todos los valores numericos incluidos en este documento estan modificados por expresiones tales como “aproximadamente/alrededor de”, ya sea que se indique en forma explfcita o no. Para los fines de la presente invencion, los intervalos pueden expresarse desde “aproximadamente” un valor particular hasta “alrededor de” otro valor particular. Cuando se expresa tal intervalo, otra realizacion incluye desde un valor particular hasta el otro valor particular. La enumeracion de intervalos numericos por puntos finales incluye todos los valores numericos subsumidos dentro de ese intervalo. Un intervalo numerico de uno a cinco incluye, por ejemplo, los valores numericos 1; 1,5; 2; 2,75; 3; 3,80; 4; 5; etc. Se entendera, ademas, que los puntos finales de cada uno de los intervalos son significativos tanto en relacion con el otro punto final como independientemente del otro punto final. Cuando un valor se expresa como una aproximacion, utilizando el antecedente “alrededor de/aproximadamente”, se entendera que el valor particular forma otra realizacion.

Asimismo, en cuanto a cada termino utilizado, debe entenderse que, a menos que su uso en esta solicitud sea inconsistente con dicha interpretacion, debe entenderse que las definiciones comunes del diccionario se incluyen en la descripcion de cada termino, tal como figura en el Random's House Webster Unabridged Dictionary, segunda edicion.

Claims (16)

REIVINDICACIONES

1. Un metodo para evaluar rapidamente la susceptibilidad de una muestra de bacterias a un antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas, que comprende:

incubar una primera porcion de la muestra de bacterias que experimenta un crecimiento exponencial, con un antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas;

agregar un agente a la primera porcion de la muestra de bacterias, que se esta incubando con el antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas, en donde el agente se selecciona de modo tal que induzca una respuesta bacteriana, que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta;

incubar una segunda porcion de la muestra de bacterias que experimenta un crecimiento exponencial con el agente seleccionado para inducir una respuesta bacteriana que depende de la smtesis de las protemas o recibe la influencia de esta;

evaluar la respuesta bacteriana en la primera porcion y la segunda porcion de la muestra de bacterias y clasificar la muestra de bacterias como susceptible o no susceptible al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas, sobre la base de la evaluacion de la primera y la segunda porciones de la muestra de bacterias.

2. El metodo segun la reivindicacion 1, en el que la respuesta bacteriana comprende: dano al ADN, fragmentacion del ADN, cambios en la pared celular, cambios en la morfologfa celular, una respuesta autolftica, respuestas metabolicas, respuestas bioqmmicas, respuestas fisiologicas, respuestas geneticas o sus combinaciones.

3. El metodo segun la reivindicacion 1 o 2, en el que la respuesta bacteriana comprende dano al ADN o fragmentacion del ADN inducidos en forma directa o indirecta por el agente.

4. El metodo segun la reivindicacion 3, en el que el agente comprende un antibiotico o una sustancia quimioterapeutica.

5. El metodo segun la reivindicacion 4, en el que el agente comprende: un agente alquilante, una quinolona, norfloxacina, ciprofloxacina, monoflaxina, mitomicina C, un detergente, bilis, desoxicolato, Triton X-100, enzimas, lisozima, lisosina, lisostafina, mutanolisina, liticasa o sus combinaciones.

6. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la respuesta bacteriana comprende cambios en la pared celular en forma de dano de la pared celular, inducido directa o indirectamente por un agente.

7. El metodo segun la reivindicacion 6, en el que el agente comprende: beta-lactamas, meropenem, glucopeptidos, antibioticos que danan la pared celular, agentes de digestion de la pared celular o sus combinaciones.

8. Metodo segun la reivindicacion 6, en el que los cambios en la pared celular comprenden la lisis de la pared celular o la digestion de la pared celular, inducida directa o indirectamente por el agente.

9. El metodo segun la reivindicacion 8, en el que el agente comprende: enzima lttica, lisozima, lisostafina, mutanolisina, liticasa o sus combinaciones.

10. El metodo segun la reivindicacion 1 o la reivindicacion 2, en el que la respuesta bacteriana comprende cambios en la morfologfa celular, a modo de cambios en la longitud de las celulas, en el tamano de las celulas o cambios en la forma de las celulas, inducidos directa o indirectamente por el agente.

11. El metodo segun la reivindicacion 10, en el que el agente comprende: un agente que dana al ADN, agentes toxicos, agentes alquilantes, mitomicina C o sus combinaciones.

12. El metodo segun cualquier reivindicacion precedente, en el que el paso de evaluar la respuesta bacteriana en la primera porcion y la segunda porcion de la muestra de bacterias comprende, ademas, comparar la respuesta bacteriana de la primera porcion y la segunda porcion de la muestra de bacterias.

13. El metodo segun la reivindicacion 12, en el que las similitudes en la primera y la segunda porciones de la muestra de bacterias son indicativas de las bacterias que no son susceptibles al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas.

14. El metodo segun la reivindicacion 12, en el que las diferencias en la primera y la segunda porciones de la muestra de bacterias son indicativas de que bacterias son susceptibles al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas.

15. El metodo segun la reivindicacion 12, en el que los efectos obtenidos en la primera porcion constituyen una disminucion o supresion de los efectos obtenidos en la segunda porcion, siendo esto indicativo de bacterias que son susceptibles al antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas.

16. El metodo segun cualquier reivindicacion precedente, en el que la primera porcion de las bacterias que experimentan la respuesta bacteriana se incuba con una dosis que constituye valor cntico del antibiotico inhibidor de la smtesis de las protemas.