KR101774995B1 - 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법 및 이를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템 - Google Patents
다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법 및 이를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법 및 이를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 표준 방법에 비해 최대 6-7 배의 빠른 속도로 정확한 결과를 판정할 수 있다.
Description
본 발명은 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법 및 이를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명에 따른 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 신속한 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)의 표준 방법에 비해 최대 6-7 배의 빠른 속도로 정확한 결과를 판정할 수 있다.
항균제 감수성 검사(Antimicrobial Susceptibility Test, AST)는 감염증 치료에 사용할 항균제의 효과를 예측하기 위한 것으로, 최소억제농도(MIC, minimal inhibitory concentration)를 기준으로 감수성 여부를 판정하는 방법을 의미한다.
종래에는 서로 다른 약물에 대한 세포의 반응 검사를 수행할 때 세포를 액체 또는 고체 배지에 넣고 검사하고자 하는 약물을 액체 배지와 섞거나 또는 고체 배지 위에 약물을 흡수시킨 종이 디스크를 올려 세포와 반응시킨 다음 세포의 약물에 대한 성장반응을 혼탁도(흡광도)로 측정하여 약물에 대한 반응을 측정하였다. 그러나 이러한 방식은 개별 세포의 변화보다 통계학적인 정보를 수집하는 방법이고 통계학적인 결과를 얻기 위해서 세포 수가 어느 정도(보통 1ml 당 천만 개체) 이상 자라야 하기 때문에 배양 시간이 오래 걸리는 문제가 있다(보통 16~24시간). 또한, 약물에 대한 개별 세포에서 발생하는 변화의 관측과 운동성이 있는 개별 세포의 실시간 관측은 불가능하며, 약물을 주입하는 방법에 있어서 개별 약물에 대해서 개별적으로 주입하는 과정이 필요하여 많은 수의 약물을 검사하는데 시간과 노력이 많이 요구된다.
게다가, 고체 배지에서의 항균제 감수성 검사의 경우 KB-test는 약물을 올릴 수 있는 개수가 한정되어서 기본 수십 가지의 항균제의 감수성 검사를 위해서 많은 수의 한천배지 플레이트가 요구된다. 이런 검사시간을 최소화한 자동화 장비인 VITEK 시스템인 경우에도 마찬가지로 균의 탁도가 일정 수준 이상 증가해야 하기 때문에 보통 12 시간 이상의 오랜 시간이 소요되는 한계가 있다. 또한 기존 방법은 테스트 환경이 인체 내 환경과 다르므로 실제로 인체 내 일어나는 현상과 많은 차이점이 있을 수 있다(Gregory G. Anderson, et al.(2003), "Intracellular Bacterial Biofilm-Like Pods in Urinary Tract Infections", Science 301, 105; Gallo et al.(2011),"Demonstration of Bacillus cereus in Orthopaedic-Implant-Related Infection with Use of a Multi-Primer Polymerase Chain Reaction-Mass Spectrometric Assay.", J Bone Joint Surg Am, 93).
종래의 항균제 감수성 검사의 한계를 극복하기 위하여, 초기 단계에서 미생물의 분열을 관찰할 수 있는, 소위 신속한 항균제 감수성 검사 (Rapid AST, RAST) 방법으로서, 예를 들면, 미세유체 채널 내의 미생물 세포의 수를 측정하는 방법, 미생물 중량과 관련된 자성 비드의 회전 속도를 측정하는 방법, 액적 내의 미생물 세포의 대사 활성으로 인한 형광 시그널을 측정하는 방법, 및 이미지 내의 미생물 점유 영역을 계산함으로써 항균제에 대한 감수성을 측정하는 방법이 알려져 있다.
그러나, 항생제에 대한 미생물의 반응은 매우 이질적(heterogeneous)일 뿐만 아니라 다양한 항생제 조건에 특이적임에도 불구하고, 상기 알려진 방법들은 미생물이 "성장(growing)" 하는지 여부에 대한 관찰만을 기초로 한 것이다. 즉, 미생물 세포가 "성장" 또는 "무-성장" 외에도 다른 항생제 조건 하에서 겪을 수도 있는 다양한 모양 변화를 고려함이 없이, 단순히 미생물 세포의 "성장" 여부 만을 관찰한 것으로서, 항균제 감수성 결과에 대한 신뢰도를 충분히 제공할 수 없다는 문제가 있었다.
이에 본 발명자들은 항생제에 대한 미생물의 "성장" 여부를 측정하여 항균제 감수성을 판단한 종래 방법과 달리, 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 변화와 Broth Micro-dilution(BMD) 실험 결과와의 관련성을 규명함으로써, 정확하고 신속한 항균제 감수성 검사 방법을 개발하기에 이르렀다.
일 측면에 따르면, 본 발명은 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법으로서,
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 분류하는 단계; 및
(D) 상기 분류된 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 이용하여 항균제 내성 및 감수성을 판단하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 미생물 세포는 미생물의 단일 세포 또는 집단 세포를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 단계 (C)에서 미생물 세포의 모양 및 성장 변화는 분열(dividing), 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 분류될 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 단계 (D)에서 미생물 세포의 모양 및 성장 변화가 분열인 경우 약제 내성으로 판정하고, 미생물 세포의 모양 및 성장 변화가 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성인 경우 약제 감수성(susceptible)으로 판정할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클레브시엘라속(Klebsiella species), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 엔테로박터속(Enterobacter species)을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 필라멘트 형성은 β-lactam 항생제 중에서 페넴류 약물에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 제외한, 미생물의 반응을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 팽창 형성은 β-lactam 항생제 중에서 페넴류 약물에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 포함할 수 있다.
다른 측면에 따르면, 본 발명은 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법으로서,
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 상기 단계 (B)에서 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 관찰하는 단계; 및
(D) 상기 미생물 세포가 분열(dividing)하는 것으로 관찰된 경우 항균제 내성으로 판정하고, 상기 미생물 세포가 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 관찰된 경우 항균제 감수성으로 판정하는 단계를 포함할 수 있다.
또 다른 측면에 따르면, 본 발명은 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에 관한 것으로, 상기 세포 이미지 분석 시스템은:
(A) 미생물과 항생제의 배양 및 미생물 세포의 모양 및 성장 변화의 이미징을 위한 배양칩;
(B) 미생물 세포의 배양구간을 촬영하여 미생물 세포의 이미지를 검출하는 광학영상분석장치;
(C) 상기 검출된 미생물 세포의 이미지를 분석하여 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이를 추출하여 미생물 세포의 항균제 감수성을 판정할 수 있는 리더(reader)를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법을 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에서, 상기 항균제 감수성은 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이에 따라 분열, 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성을 이용하여 판정될 수 있다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법을 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에서, 상기 광학영상분석장치는 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프, LED 광원 또는 레이저광원을 포함할 수 있다. 상기 광학영상분석장치는 대물렌즈로부터 모아진 세포 이미지 검출을 위한 CCD(Charge Coupled Device) 또는 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 종래의 항균제 감수성 검사 방법에 의해 매우 정확한 판정 결과를 나타낼 수 있다 (실시예 1). 본원발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI에 따른 항균제 감수성 방법에 비해 신속하고 정확한 결과 데이터를 제공할 수 있다 (실시예 2). 본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI의 표준 방법 BMD에 비해 최대 6~7배 빠른 속도로 정확한 판정 결과를 도출할 수 있다 (실시예 4). 또한, 본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 미생물 세포가 필라멘트 성장 및 팽창 성장을 나타내는 경우에도 정확한 판정 결과를 나타낼 수 있다 (실시예 5).
도 1은 실시예 1에 사용된 MAC 2.0TM (Quanta Matrix)를 나타낸다. 도 1(A)는 상기 MAC 칩의 구조를 나타내고, 상기 도 1(B)는 세포배양구간을 나타낸다.
도 2는 본 발명에 따라 측정된 E. coli ATCC 25922의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Amikacin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, Amikacin의 MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포는 거의 분열되지 않았다.
(B) 필라멘트 형성(piperacillin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. MIC 이상의 농도에서 필라멘트가 형성(세포 길이성장)되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 필라멘트 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"으로 판정하였다.
(C) 세포 팽창(imipenem): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 세포가 팽창되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 팽창 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성" 으로 판정하였다.
도 3은 본 발명에 따라 측정된 P. aeruginosa ATCC 27853의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Gentamicin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포SMS 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포는 거의 분열되지 않았다.
(B) 필라멘트 형성(ceftazidime): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. MIC 이상의 농도에서, 필라멘트가 형성되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 필라멘트 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"으로 판정하였다.
(C) 세포 팽창(imipenem): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포의 팽창이 발생하였다. 몇몇 경우에, 세포 팽창뿐만 아니라 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"이라 판정하였다.
도 4는 본 발명에 따라 측정된 S. aureus ATCC 29213의 항생제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Gentamicin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되어 박테리아 세포의 수가 증가하였다. 그러나, MIC 이상의 농도에서 박테리아 세포들은 2개의 세포로 거의 분열하지 않았다.
(B) 상대적 빠른 성장(RRG)(Ciprofloxacin): Ciprofloxacin의 경우, 박테리아 세포는 빠르게 성장하여 2시간 동안 심지어 MIC 농도 또는 MIC 이상의 농도에서 조차도 급격하게 2개의 세포로 분열되었으나, 4시간이 지난 후에는 더 이상 분열하지 않았다. MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이의 성장율의 유의적인 차이가 존재함이 확인되었다. MIC는 상대적 세포 성장으로 결정하였다.
(C) 상대적 느린 성장(RSG)(clindamycin): clindamycin의 경우, MIC 보다 낮은 농도에서도 박테리아 세포가 매우 느리게 분열하였으나, MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 존재하였다. 상기 MIC 값은 상대적 세포 성장으로 결정하였다.
도 5는 본 발명에 따라 측정된 E. faecalis ATCC 29212의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 경우(Vancomycin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포들은 2개의 세포로 분열하여 박테리아 세포들의 수가 증가하였다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 단일 세포들은 2개의 세포로 거의 분열되지 않았다.
(B) 상대적 빠른 성장(RRG)(levofloxacin): levofloacin의 경우, 박테리아 세포들은 심지어 MIC 농도 또는 MIC 보다 높은 농도에서 2시간 내에 2개의 세포들로 분열하였으나, 4시간이 지난 후에는 더 이상 분열되지 않았다. MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 확인되었다.
(C) 상대적 느린 성장(RSG)(linezolid): linezolid의 경우, MIC 보다 낮은 농도에서도, 박테리아는 매우 천천히 성장하였으나, MIC 보다 낮은 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 존재하였다. 상기 MIC 값은 다른 항생제 농도 하에서 상대적 세포 성장으로 결정되었다.
도 6은 실시예 1에서 본 발명에 따른 항균제 감수성 판정 결과를 나타낸다. (*그람-양성 박테리아의 경우, 시간에 따른 이미지는 0, 2 및 4 시간에 촬영되었다. 크기는 20㎛을 나타낸다.)
도 7은 본 발명에 따른 자동화된 세포 이미지 분석 시스템의 이미지 검출 및 항균제 감수성 판단 방법을 나타낸다.
도 8은 실시예 4에서 본 발명에 따른 항균제 감수성 방법과 표준 방법과의 MIC 비교를 나타낸다. 도 8(A)는 실시예 4에서 사용한 대상 균주를 나타낸다. 도 8(B)는 Discrepancy rate (DR) 및 Categorical agreement (CA) 율을 나타내는 표이다. 도 8(C)는 β-lactam 및 non-β-lactam계 항생제에 대한 임상 균주들의 CA 율을 나타낸다 (***P<0.001).
*S: 감수성; I: 중증도 감수성; R: 내성; mE: minor error (표준 방법 BMD에 따르면 R 또는 S로 판정되고 본 발명에 따르면 I로 판정된다; 또는 표준 방법 BMD에 따르면 I로 판정되고 본 발명에 따르면 R 또는 S로 판정된다); ME: major error (표준 방법 BMD에 따르면 S로 판정되고 본 발명에 따르면 R로 판정된다); VME: very major error (표준방법 BMD에 따르면 R로 판정되고 본 발명에 따르면 S로 판정된다); TTR: 결과 측정까지 걸린 시간을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에 따른 필라멘트 형성 및 팽창 형성의 경우 본 발명에 따른 방법을 이용한 오차 감소 결과를 나타낸다. (*P<0.05 및 ***P<0.001).
도 2는 본 발명에 따라 측정된 E. coli ATCC 25922의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Amikacin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, Amikacin의 MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포는 거의 분열되지 않았다.
(B) 필라멘트 형성(piperacillin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. MIC 이상의 농도에서 필라멘트가 형성(세포 길이성장)되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 필라멘트 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"으로 판정하였다.
(C) 세포 팽창(imipenem): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 세포가 팽창되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 팽창 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성" 으로 판정하였다.
도 3은 본 발명에 따라 측정된 P. aeruginosa ATCC 27853의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Gentamicin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포SMS 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포는 거의 분열되지 않았다.
(B) 필라멘트 형성(ceftazidime): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. MIC 이상의 농도에서, 필라멘트가 형성되었으나, 박테리아 세포의 분열은 일어나지 않았다. 몇몇 경우에, 필라멘트 형성뿐만 아니라 세포 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"으로 판정하였다.
(C) 세포 팽창(imipenem): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되었다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 세포의 팽창이 발생하였다. 몇몇 경우에, 세포 팽창뿐만 아니라 분열이 관찰되었으며, 이는 "내성"이라 판정하였다.
도 4는 본 발명에 따라 측정된 S. aureus ATCC 29213의 항생제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 성장(Gentamicin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포는 2개의 세포로 분열되어 박테리아 세포의 수가 증가하였다. 그러나, MIC 이상의 농도에서 박테리아 세포들은 2개의 세포로 거의 분열하지 않았다.
(B) 상대적 빠른 성장(RRG)(Ciprofloxacin): Ciprofloxacin의 경우, 박테리아 세포는 빠르게 성장하여 2시간 동안 심지어 MIC 농도 또는 MIC 이상의 농도에서 조차도 급격하게 2개의 세포로 분열되었으나, 4시간이 지난 후에는 더 이상 분열하지 않았다. MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이의 성장율의 유의적인 차이가 존재함이 확인되었다. MIC는 상대적 세포 성장으로 결정하였다.
(C) 상대적 느린 성장(RSG)(clindamycin): clindamycin의 경우, MIC 보다 낮은 농도에서도 박테리아 세포가 매우 느리게 분열하였으나, MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 존재하였다. 상기 MIC 값은 상대적 세포 성장으로 결정하였다.
도 5는 본 발명에 따라 측정된 E. faecalis ATCC 29212의 항균제 약물에 대한 MIC 결과를 나타낸다.
(A) 보통 경우(Vancomycin): MIC 보다 낮은 농도에서, 박테리아 세포들은 2개의 세포로 분열하여 박테리아 세포들의 수가 증가하였다. 그러나, MIC 이상의 농도에서, 박테리아 단일 세포들은 2개의 세포로 거의 분열되지 않았다.
(B) 상대적 빠른 성장(RRG)(levofloxacin): levofloacin의 경우, 박테리아 세포들은 심지어 MIC 농도 또는 MIC 보다 높은 농도에서 2시간 내에 2개의 세포들로 분열하였으나, 4시간이 지난 후에는 더 이상 분열되지 않았다. MIC 보다 낮은 농도 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 확인되었다.
(C) 상대적 느린 성장(RSG)(linezolid): linezolid의 경우, MIC 보다 낮은 농도에서도, 박테리아는 매우 천천히 성장하였으나, MIC 보다 낮은 및 MIC 농도/보다 높은 농도 사이에서 성장율의 유의적인 차이가 존재하였다. 상기 MIC 값은 다른 항생제 농도 하에서 상대적 세포 성장으로 결정되었다.
도 6은 실시예 1에서 본 발명에 따른 항균제 감수성 판정 결과를 나타낸다. (*그람-양성 박테리아의 경우, 시간에 따른 이미지는 0, 2 및 4 시간에 촬영되었다. 크기는 20㎛을 나타낸다.)
도 7은 본 발명에 따른 자동화된 세포 이미지 분석 시스템의 이미지 검출 및 항균제 감수성 판단 방법을 나타낸다.
도 8은 실시예 4에서 본 발명에 따른 항균제 감수성 방법과 표준 방법과의 MIC 비교를 나타낸다. 도 8(A)는 실시예 4에서 사용한 대상 균주를 나타낸다. 도 8(B)는 Discrepancy rate (DR) 및 Categorical agreement (CA) 율을 나타내는 표이다. 도 8(C)는 β-lactam 및 non-β-lactam계 항생제에 대한 임상 균주들의 CA 율을 나타낸다 (***P<0.001).
*S: 감수성; I: 중증도 감수성; R: 내성; mE: minor error (표준 방법 BMD에 따르면 R 또는 S로 판정되고 본 발명에 따르면 I로 판정된다; 또는 표준 방법 BMD에 따르면 I로 판정되고 본 발명에 따르면 R 또는 S로 판정된다); ME: major error (표준 방법 BMD에 따르면 S로 판정되고 본 발명에 따르면 R로 판정된다); VME: very major error (표준방법 BMD에 따르면 R로 판정되고 본 발명에 따르면 S로 판정된다); TTR: 결과 측정까지 걸린 시간을 나타낸다.
도 9는 본 발명의 실시예 5에 따른 필라멘트 형성 및 팽창 형성의 경우 본 발명에 따른 방법을 이용한 오차 감소 결과를 나타낸다. (*P<0.05 및 ***P<0.001).
본 명세서에 달리 정의되어 있지 않은 한, 사용된 모든 기술 및 과학 용어는 당업계에 통상의 기술자가 통상적으로 이해하는 바와 같은 의미를 가진다. 본 명세서에 포함되는 용어를 포함하는 다양한 과학적 사전이 잘 알려져 있고, 당업계에서 이용 가능하다. 비록 본 명세서에 설명된 것과 유사 또는 등가인 임의의 방법 및 물질이 본원의 실행 또는 시험에 사용되는 것으로 발견되나, 몇몇 방법 및 물질이 설명되어 있다. 당업자가 사용하는 맥락에 따라, 다양하게 사용될 수 있기 때문에, 특정 방법, 프로토콜 및 시약으로 본 발명을 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 단수형은 문맥이 명확하게 달리 지시하지 않으면 복수의 대상을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 달리 언급되지 않는 한, "또는"은 "및/또는"을 의미한다. 더욱이, 용어 "포함하는" 뿐만 아니라, 다른 형태, 예를 들어, "가지는", "이루어지는" 및 "구성되는"는 제한적이지 않다.
수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.
본 명세서에 제공된 제목은 다양한 면 또는 전체적으로 명세서의 참조로서, 하기의 구현예를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 된다.
본 발명은 다양한 종류의 항생제 및 농도에서 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법 및 이를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템을 제공하고자 한다.
일 구현예에 따르면, 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법이 제공되는바, 상기 방법은:
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 분류하는 단계; 및
(D) 상기 분류된 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 이용하여 항균제 내성 및 감수성을 판단하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 단계 (C)에서 미생물 세포의 모양 및 성장 변화는 분열(dividing), 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 분류되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 있어서, 상기 단계 (D)에서 미생물 세포의 성장 및 변화가 분열인 경우 약제 내성(resistant)으로 판정하고, 미생물 세포의 성장 및 변화가 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성인 경우 약제 감수성(susceptible)으로 판정하는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미생물"은 모든 그람 음성(Gram -) 및 그람 양성(Gram +) 박테리아, 진균 및 고생균 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 구체적으로, 상기 미생물은 엔테로코쿠스(Enterococcus), 스트렙토코쿠스(Streptococcus), 슈도모나스(Pseudomonas), 살모넬라(Salmonella), 대장균(Escherichia coli), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 락토코쿠스(Lactococcus), 락토바실러스(Lactobacillus), 엔테로박테리아(Enterobacteriacae), 크레브시엘라(Klebsiella), 프로비덴시아(Providencia), 프로테우스(Proteus), 모르가넬라(Morganella), 아시네토박터(Acinetobacter), 부르크홀데리아(Burkholderia), 스테노트로포모나스(Stenotrophomonas), 알카리제네스(Alcaligenes) 및 미코박테리움(Mycobacterium)로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 더욱 구체적으로, 상기 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클레브시엘라속(Klebsiella species), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 엔테로박터속(Enterobacter species)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "항생제"는 아미카신(Amikacin), 아목시실린(Amoxicillin), 암피실린(Ampicillin), 아즈트레오남(Aztreonam), 벤질페니실린(Benzylpenicillin), 칼부라닌산(Clavulanic Acid), 세파졸린(Cefazolin), 세페핌(Cefepime), 세포탁심(Cefotaxime), 세포테탄(Cefotetan), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세푸록심(Cefuroxime), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 달포프리스틴(Dalfopristin), 도리페넴(Doripenem), 다프토마이신(Daptomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 아리트로마이신(Erythromycin), 젠타마이(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 레보플록사신(Levofloxacin), 리네졸리드(Linezolid), 메로페넴(Meropenem), 미노사이클린(Minocycline), 목시플록사신(Moxifloxacin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 피페라실린(Piperacillin), 퀴누프리스틴(Quinupristin), 리팜피신(Rifampicin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 설박탐(Sulbactam), 설파메톡시졸(Sulfamethoxazole), 테리트로마이신(Telithromycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 티카르실린(Ticarcillin), 티제사이클린(Tigecycline), 토브라마이신(Tobramycin), 트리메토프림(Trimethoprim) 및 반코마이신(Vancomycin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 "미생물 세포의 모양 및 성장 변화"는 미생물 세포의 항생제에 대한 반응을 의미하는 것으로 분열(dividing), 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation) 분류될 수 있다. 상기 "미생물 세포의 모양 및 성장 변화"는 용어 "미생물 세포의 형태학적 변화"와 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다.
상기 "분열(dividing)"은 무-항생제 및 항생제 내성 조건에서의 미생물 세포가 2개의 세포들로 나뉘어짐으로써 미생물 세포의 수의 증가뿐만 아니라, BMD 실험의 OD 값이 증가하는 것을 의미한다.
상기 "무-변화(no-change)"는 미생물 세포가 항생제에 감수성(susceptible)을 나타내어 성장하지 않음을 의미한다.
상기 "필라멘트 형성(filament formation)"은 미생물 세포가 분열되지는 않으나, 길이성장을 하고 있음을 의미한다. 상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항생제에 대한 미생물의 반응을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항생제 중에서 페넴류 약물에 대한 그람-음성 박테리아의 반응을 제외한, 미생물의 반응을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항생제 중에서 페넴류 약물에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 대장균(Escherichia coli)의 반응을 제외한, 미생물의 반응을 포함할 수 있다.
상기 "팽창 형성(swelling formation)"은 미생물 세포가 분열되지는 않으나, 부풀면서 성장하고 있음을 의미한다. 상기 팽창 형성은 β-lactam계 항생제 중에서 페넴류 약물에 대한 미생물 반응을 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 팽창 형성은 이미페넴 또는 메로페넴에 대한 그람-음성 박테리아의 반응을 포함할 수 있다. 더욱 구체적으로, 상기 팽창 형성은 이미페넴 또는 메로페넴에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)의 반응을 포함할 수 있다.
상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화는 미생물의 단일 또는 집단 세포를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징함으로써 관찰될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 미생물 세포가 분열되지 않아 BMD 실험의 OD 값이 일정한 경우에도 정확하고 신속하게 항균제 감수성 여부를 판정할 수 있다.
다른 구현예에 따르면, 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법이 제공되는바, 상기 방법은:
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 상기 단계 (B)에서 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 관찰하는 단계; 및
(D) 상기 미생물 세포가 분열(dividing)하는 것으로 관찰된 경우 항균제 내성으로 판정하고, 상기 미생물 세포가 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 관찰된 경우 항균제 감수성으로 판정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 한다.
또 다른 구현예에 따르면, 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템이 제공되는바, 상기 세포 이미지 분석 시스템은:
(A) 미생물과 항생제의 배양 및 미생물 세포의 모양 및 성장 변화의 이미징을 위한 배양칩;
(B) 미생물 세포의 배양구간을 촬영하여 미생물 세포의 이미지를 검출하는 광학영상분석장치; 및
(C) 상기 검출된 미생물 세포의 이미지를 분석하여 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이를 추출하여 미생물 세포의 항균제 감수성을 판정할 수 있는 리더(reader)를 포함하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템에서, 상기 항균제 감수성은 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이에 따라 분열, 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성을 이용하여 판정되는 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "배양칩"은 특별히 제한되는 것은 아니나, 본 실시예에서는 MAC 2.0TM(Quanta Matrix)을 사용하였다.
본 명세서에서 사용된 용어 "광학영상분석장치"는 미생물 세포의 배양구간을 촬영하여 미생물 세포의 이미지를 검출하기 위한 것으로, 광학이미지 취득을 위한 가시광선영역에서의 광원으로서 텅스텐 램프, LED 광원 또는 레이저광원을 포함할 수 있다. 상기 광학영상분석장치는 대물렌즈로부터 모아진 세포 이미지 검출을 위한 CCD(Charge Coupled Device) 또는 CMOS(Complementary Metal-Oxide-Semiconductor) 카메라를 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 "리더(reader)"는 검출된 미생물 세포의 이미지를 분석하여 미생물 세포의 항균제 감수성을 판정하기 위한 것으로, 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이를 바탕으로 한다.
구체적으로, 상기 리더는 4 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역의 값(A3)을 0 시간 일 때의 최초의 이미지에서의 값(A1)으로 나누고, 이를 제1임계치(T1)와 비교하여,
a) A3/A1이 T1 보다 큰 경우 "내성"으로 판정하고,
b) A3/A1이 T1 보다 작을 경우 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)와 비교하여 i) A3/A1 및 A3/A2 (A2: 2시간 이후의 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역)가 각각 T2 및 T3 보다 큰 경우 "내성"으로 판정하고, ii) 그렇지 않은 경우 "감수성"으로 판정할 수 있다. (여기서 상기 임계치 T1, T2 및 T3는 다양한 항생제 조건 하에 다른 성장율을 사용하여 개별적으로 판단된다).이는 하기의 도식 1과 같이 나타낼 수 있다.
[도식 1]
또한, 상기 리더는 임계치(T1, T2 및 T3)에 비해 미생물 세포의 전체 점유 영역이 증가된 경우, 세포 배양 3시간 이후 세포 이미지 중에서 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고,
i) 상기 L3/F3가 T4 보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 "감수성"으로 판단하고, ii) 그렇지 않은 경우 "내성"으로 판정할 수 있다. (여기서 상기 임계치 T1, T2, T3 및 T4는 다양한 항생제 조건 하에 다른 성장율을 사용하여 개별적으로 판단된다). 구체적으로, 상기 리더는 세포배양 3 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역의 값(A3)을 0 시간 일 때의 최초의 이미지에서의 값(A1)으로 나누고, 이를 제1임계치(T1)와 비교하여,
a) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 큰 경우, 세포배양 3 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, i) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, ii) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하고,
b) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 작을 경우 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)와 비교하여, (b-i) A3/A1 및 A3/A2 (A2: 1.5시간 이후의 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역)가 각각 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)보다 큰 경우, 상기 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 상기 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, (b-i-1) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, (b-i-2) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하며, (b-ii) 상기 (b-i)의 조건을 충족하지 않은 경우 감수성으로 판정할 수 있으며, 이는 하기의 도식 2와 같이 나타낼 수 있다.
a) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 큰 경우, 세포배양 3 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, i) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, ii) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하고,
b) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 작을 경우 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)와 비교하여, (b-i) A3/A1 및 A3/A2 (A2: 1.5시간 이후의 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역)가 각각 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)보다 큰 경우, 상기 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 상기 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, (b-i-1) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, (b-i-2) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하며, (b-ii) 상기 (b-i)의 조건을 충족하지 않은 경우 감수성으로 판정할 수 있으며, 이는 하기의 도식 2와 같이 나타낼 수 있다.
[도식 2]:
따라서, 본 발명에 따른 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템은 세포가 분열되지 않아 미생물 세포의 개수(F)가 일정한 경우에도 미생물 세포의 전체 길이(L)를 이용하여 필라멘트 형성 또는 팽창 형성의 경우에도 정확하고 신속하게 항균제 감수성 여부를 판정할 수 있다.
이하, 발명의 이해를 돕기 위해 다양한 실시예를 제시한다. 하기 실시예는 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 발명의 보호범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1: 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사
(1) 대상 균주
CLSI(Clinical and Laboratory Standards Institute)에 따른 4개의 표준 균주 E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 및 E. faecalis ATCC 29212를 대상으로 하였다.
(2) 대상 항생제
E. coli ATCC 25922 및 S. aureus ATCC 29213의 항균제 감수성을 표준 방법과 비교한 대상 항생제는 Amikacin, Amoxicillin/Clavulanic Acid, Ampicillin, Aztreonam, Cefazolin, Cefepime, Cefotaxime, Cefoxitin, Ceftazidime, Ciprofloxacin, Gentamicin, Imipenem, Norfloxacin, Meropenem, Piperacillin, Piperacillin/Tazobactam, Tetracycline, Trimethoprim/Sulfamethoxazole, Ticarcilin, Trcarcillin/Clavulanic acid 및 Tobramycin이고, P. aeruginosa ATCC 27853 및 E. faecalis ATCC 29212에 대해서는 Ampicillin, Amoxicillin/Clavulanic Acid, Ciprofloxacin, Clindamycin, Erythromycin, Gentamicin, Imipenem, Levofloxacin, Linezolid, Oxacillin, Norfloxacin, Penicillin, Rifampin, Streptomycin, Teicoplanin, Tetracycline, Trimethoprim/sulfamethoxazole 및 Vancomycin가 포함되었다.
(3) 미생물 세포의 모양 및 성장 변화에 분석을 이용한 항균제 감수성 검사
도 1에 나타낸 MAC 2.0TM(QuantaMatrix)를 이용하여 표준 탁도로 준비한 4개의 대상 균주를 아가로스 웰에 고정화하고, 100 ㎕부피의 항생제를 일정한 농도를 항생제 웰에 주입하였다. 가열 시스템에 구비된 도립 광학 현미경(Eclipse Ti - Nikon, IX71 - Olympus)에서 S Plan Fluor ELWD 60X (NA 1.49) 렌즈를 통해 MAC 2.0TM(QuantaMatrix)내의 박테리아 세포를 모니터링하고, 전자 증폭 전하 결합 디바이스 카메라(QuantEM:512SC Photometrics for Eclipse Ti)를 사용하여 MAC 2.0TM내의 아가로스 웰과 항균제 웰 사이의 경계 부근에서 시간의 경과에 따른 이미지를 획득하였다. 그 결과를 도 2 내지 도 5에 나타내었다.
항생제의 종류에 따른 상기 4개의 표준 균주 E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 및 E. faecalis ATCC 29212의 모양 및 성장 변화 특성을 요약하면 하기와 같다:
| E. coli ATCC 25922 | Criteria | Category | Antimicrobial Class |
| Amikacin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Amoxicillin/Clavulanic Acid | Swelling | β-lactams | Penicillins/β-lactamase inhibitor |
| Ampicillin | Filament | β-lactams | penicillins |
| Aztreonam | Filament | β-lactams | monobactams |
| Cefazolin | Filament | β-lactams | cephems |
| Cefepime | Filament | β-lactams | cephems |
| Cefotaxime | Filament | β-lactams | cephems |
| Cefoxitin | Filament | β-lactams | cephems |
| Ceftazidime | Filament | β-lactams | cephems |
| Ciprofloxacin | Normal | Non-β-lactams | fluoroquinolone |
| Gentamicin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Imipenem | Swelling | β-lactams | penems |
| Norfloxacin | Normal | Non-β-lactams | quinolones |
| Piperacillin | Filament | β-lactams | penicillins |
| Piperacillin/Tazobactam | Filament | β-lactams | Penicillins/β-lactamase inhibitor |
| Tetracycline | Normal | Non-β-lactams | tetracyclines |
| Trimethoprim/Sulfamethoxazole | Normal | Non-β-lactams | folate pathway inhibitors |
| P. aeruginosa ATCC 27853 | Criteria | Category | Antimicrobial Class |
| Amikacin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Aztreonam | Filament | β-lactams | monobactams |
| Cefepime | Filament | β-lactams | cephems |
| Cefotaxime | Filament | β-lactams | cephems |
| Ceftazidime | Filament | β-lactams | cephems |
| Ciprofloxacin | Normal | Non-β-lactams | fluoroquinolone |
| Gentamicin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Imipenem | Swelling | β-lactams | penems |
| Meropenem | Swelling | β-lactams | penems |
| Piperacillin | Filament | β-lactams | penicillins |
| Piperacillin/Tazobactam | Filament | β-lactams | Penicillins/ β-lactamase inhibitor |
| Ticarcilin | Filament | β-lactams | penicillins |
| Ticarcillin/Clavulanic acid | Filament | β-lactams | Penicillins/ β-lactamase inhibitor |
| tobramycin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| S. aureus ATCC 29213 | Criteria | Category | Antimicrobial Class |
| Ampicillin | Normal | β-lactams | penicillins |
| Amoxicillin/Clavulanic Acid | Normal | β-lactams | Penicillins/ β-lactamase inhibitor |
| Ciprofloxacin | RRG | Non-β-lactams | fluoroquinolone |
| Clindamycin | RSG | Non-β-lactams | lincosamides |
| erythromycin | RSG | Non-β-lactams | macrolides |
| Gentamicin | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Imipenem | Normal | β-lactams | penems |
| Levofloxacin | RRG | Non-β-lactams | quinolones |
| Linezolid | RSG | Non-β-lactams | oxazolidinones |
| Oxacillin | RRG | β-lactams | penicillins |
| Penicillin | Normal | β-lactams | penicillins |
| Rifampin | RSG | Non-β-lactams | ansamycins |
| Tetracycline | Normal | Non-β-lactams | tetracyclines |
| Trimethoprim/sulfamethoxazole | RRG | Non-β-lactams | folate pathway inhibitors |
| Vancomycin | normal | Non-β-lactams | glycopeptides |
| E. faecalis ATCC 29212 | Criteria | Category | Antimicrobial Class |
| Ampicillin | Normal | β-lactams | penicillins |
| Ciprofloxacin | RRG | Non-β-lactams | fluoroquinolone |
| erythromycin | RSG | Non-β-lactams | macrolides |
| Gentamicin High Level | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Levofloxacin | RRG | Non-β-lactams | quinolones |
| Linezolid | RSG | Non-β-lactams | oxazolidinones |
| Norfloxacin | RRG | Non-β-lactams | quinolones |
| Penicillin | Normal | β-lactams | penicillins |
| Rifampin | RSG | Non-β-lactams | ansamycins |
| Streptomycin High Level | Normal | Non-β-lactams | aminoglycosides |
| Teicoplanin | Normal | Non-β-lactams | glycopeptides |
| Tetracycline | RSG | Non-β-lactams | tetracyclines |
| Vancomycin | Normal | Non-β-lactams | glycopeptides |
(4) 결과
상기 대상 균주들의 모양 및 성장 변화 특성에 따른 항균제 감수성 검사 결과를 종합하여 도 6에 나타내었다. 도 6을 참고하면, CLSI에 따른 표준 방법 AST에 따라 항균제 감수성을 판단하는 경우, 도 6(A)의 경우 BMD에 의한 OD 값이 증가하였으므로 항균제 내성으로 판정되고, 도 6(B) 내지 도 6(D)의 경우 BMD에 의한 OD 값이 감소하였으므로 항균제 감수성으로 판정되었다. 즉, 도 6(C) 및 도 6(D)의 경우 세포가 분열하지는 않지만 성장을 하고 있음에도 항균제 감수성으로 판정됨으로써, AST 판정이 부정확함이 확인되었다.
반면, 본 발명에 따른 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용하여 항균제 감수성 감수성을 판단하는 경우 도 6(A)의 경우 형태학적 패턴이 분열(dividing)을 나타내므로 항균제 내성으로 판정되며, 도 6(B)의 경우 형태학적 패턴이 무-변화(no-change)를 나타내므로 항균제 감수성으로 판정됨이 확인되었다. 특히, 도 6(C)의 경우 형태학적 패턴이 필라멘트 형성(filament formation)을 나타내므로 항균제 감수성으로 판정되며 또한 도 6(D)의 경우 형태학적 패턴이 팽창 형성(swelling formation)을 나타내므로 항균제 감수성으로 판정되었다. 따라서, 본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법은은 종래의 항균제 감수성 검사 방법 비해 매우 정확한 방법임이 확인되었다.
실시예 2. 본원발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법의 정확성 및 신속성 판단
상기 4개의 표준 균주 E. coli ATCC 25922, S. aureus ATCC 29213, P. aeruginosa ATCC 27853 및 E. faecalis ATCC 29212에 대하여 본 발명에 따른 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 이용한 MIC(minimal inhibitory concentration) 측정 결과를 CLSI에 따른 MIC quality control(QC)와 비교하였다. 그 결과를 하기의 표 5에 나타내었다.
[표 5] 본원발명에 따른 MIC와 CLSI에 따른 MIC quality control비교
상기 표 5로부터 알 수 있듯이, 본원발명에 따른 미생물 세포의 모양 및 성장 변화에 따른 MIC 값은 CLSI에 따른 MIC quality control 범위 내에 포함된다는 것이 확인되었다. 또한, CLSI에 따른 MIC 결과는 일반적으로 16-20 시간이 소요되는데 반해 본원발명에 따른 MIC 방법을 이용하는 경우 약 3-4 시간 만에 측정되었다. 따라서, 본원발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI에 따른 항균제 감수성 검사 방법에 비해 정확하고 신속한 데이터를 제공할 수 있음이 확인되었다.
실시예 3. 자동화된 세포 이미지 분석 시스템을 이용한 항균제 감수성 검사 방법
자동화된 이미지 분석 프로그램을 MATLAB R2013a (MathWorks)로 코드화하였다. RGB 형식의 가공되지 않은 이미지에서 노이즈를 없애고 우선 박테리아 특징과 백그라운드 만을 나타내는 이진 형식(binary format)으로 이미지를 획득하였다. 이미지 내의 박테리아 특징에 대한 픽셀 정보를 계산함으로써 박테리아 세포의 영역, 개수 및 길이에 대한 정보를 획득하고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
실시예 4. 본원발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법과 표준 방법과의 MIC 비교
(1) 대상 균주
서울대학교 병원(SNUH, 149주)과 인천 성모병원 (ISMH, 40주) 환자의 다양한 임상 검체에서 분리된 189주를 대상으로 하였다 (42 E. coli, 34 P. aeruginosa, 30 K. pneumoniae, 45 S. aureus 및 38 Enterococcus spp.).
(2) 실험 방법
상기 분리된 임상 균주들을 sheep blood agar 배지 또는 Mueller Hinton Agar (MHA) 배지에서 성장시켰으며, 실험 전에 각각의 균주들을 20-24 시간 동안 cation-adjusted MHB(CAMHB) 배지에서 계대 배양하였다. 그 후에, 본원 발명에 따른 항균제 감수성 검사 및 참조실험으로서 CLSI에 따른 표준 방법 BMD을 동시에 수행하였다.
(3) MIC 및 판정 결과의 비교
본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 결과를 표준 방법 BMD의 판정 결과와 비교하여, 미국 식약청 가이드라인(U.S. Food and Drug Administration Guidance)에 따라 본원발명의 항균제 감수성 검사 결과라 표준 방법 BMD 판정 결과와 일치하는 경우는 범주 일치(categorical agreement, CA), 두 가지 방법 중 하나에서 중간, 다른 방법에서는 내성 혹은 감수성 결과를 보이는 경우 minor error (mE), 표준방법에서 내성인 결과를 감수성으로 판정한 경우를 very major error (VME), 표준방법에서 감수성인 결과를 내성으로 판정한 경우를 major error (ME)로 정의하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8을 참고하면, 본 발명에 따른 항균제 감수성 검사는 범주 일치가 91.5%이었으며, minor error rate, major error rates, 및 very major error rate가 각각 6.3, 2.9 및 1.4%로서, AST 판정에 대한 FDA의 기준을 만족하는 것으로 나타났다 (mE 10%, ME 3.0%, VME 1.5%, CA 90%). 또한, 그람-음성 균주의 경우, β-lactam계 항생제와의 반응에서 낮은 CA를 나타냈으며, 그람-음성 균주의 경우 β-lactam와 non-β-lactam계 항생제와의 반응에서 유의적인 차이를 나타내지 않는 것으로 나타났다.
따라서, 본 발명에 따른 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 이용한 항균제 감수성 검사 방법은 CLSI의 표준 방법 BMD에 비해 최대 6~7배의 빠른 속도로 정확한 판정 결과를 도출할 수 있음이 확인되었다.
실시예 5. 필라멘트 형성 및 팽창 형성시 본원발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법의 오차율 확인
실시예 4에서 그람-음성 균주 E. coli, P. aeruginosa 및 K. pneumoniae의 β-lactam와 non-β-lactam계 항생제 감수율 판정시 minor error rate, major error rates, 및 very major error rate를 나타내는 그래프를 도 9에 나타내었다.
도 9를 참고하면, β-lactam계 항생제와의 반응의 경우, major error rate는 급격하게 감소하였다 (E. coli: 12.8% 내지 3.7%, 및 P. aeruginosa: 48.1% 내지 9.9%). 이는 β-lactam계 항생제와 그람-음성 균주의 반응에 대한 표준 방법 BMD에 따른 감수성 결과로 인해 내성으로 판정되었음을 의미한다. 그러나, 본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법을 사용하는 경우, 필라멘트 형성의 경우 감수성으로 판정되므로, major error rate을 감소시킬 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 항균제 감수성 검사 방법은 E. coli와 non-β-lactam계 항생제의 반응에서도 ME rate를 감소시킴이 확인되었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예를 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예는 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
Claims (24)
- 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법으로,
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 상기 단계（B)에서 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 분류하는 단계; 및
(D) 상기 분류된 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 이용하여 항균제 내성 및 감수성을 판단하는 단계를 포함하되, 상기 단계 (C)에서, 미생물 세포의 모양 및 성장 변화는 분열(dividing), 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 분류되는 것인, 항균제 감수성 검사 방법. - 제1항에 있어서,
상기 미생물 세포는 미생물의 단일 세포 또는 집단 세포를 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서,
상기 단계 (D)에서, 미생물 세포의 모양 및 성장 변화가 분열인 경우 항균제 내성으로 판정하고, 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화가 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성인 경우 항균제 감수성으로 판정하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클레브시엘라속(Klebsiella species), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 엔테로박터속(Enterobacter species)으로부터 선택되는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 항생제는 아미카신(Amikacin), 아목시실린(Amoxicillin), 암피실린(Ampicillin), 아즈트레오남(Aztreonam), 벤질페니실린(Benzylpenicillin), 칼부라닌산(Clavulanic Acid), 세파졸린(Cefazolin), 세페핌(Cefepime), 세포탁심(Cefotaxime), 세포테탄(Cefotetan), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세푸록심(Cefuroxime), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 달포프리스틴(Dalfopristin), 도리페넴(Doripenem), 다프토마이신(Daptomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 아리트로마이신(Erythromycin), 젠타마이(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 레보플록사신(Levofloxacin), 리네졸리드(Linezolid), 메로페넴(Meropenem), 미노사이클린(Minocycline), 목시플록사신(Moxifloxacin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 피페라실린(Piperacillin), 퀴누프리스틴(Quinupristin), 리팜피신(Rifampicin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 설박탐(Sulbactam), 설파메톡시졸(Sulfamethoxazole), 테리트로마이신(Telithromycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 티카르실린(Ticarcillin), 티제사이클린(Tigecycline), 토브라마이신(Tobramycin), 트리메토프림(Trimethoprim) 및 반코마이신(Vancomycin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항균제에 대한 미생물의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법. - 제7항에 있어서,
상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항균제 중에서 페넴류 약물에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 제외하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제1항에 있어서,
상기 팽창 형성은 β-lactam 항균제 중에서 페넴류 약물에 대한 미생물의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법. - 제9항에 있어서,
상기 팽창 형성은 이미페넴 또는 메로페넴에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사 방법으로,
(A) 미생물을 항생제와 반응시키는 단계;
(B) 상기 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 시간 경과(Time lapse)에 따라 이미징하는 단계;
(C) 상기 단계 (B)에서 얻어진 이미지로부터 미생물 세포의 모양 및 성장 변화를 관찰하는 단계; 및
(D) 상기 미생물 세포가 분열(dividing)하는 것으로 관찰된 경우 항균제 내성으로 판정하고, 상기 미생물 세포가 무-변화(no-change), 필라멘트 형성(filament formation) 및 팽창 형성(swelling formation)으로 관찰된 경우 항균제 감수성으로 판정하는 단계를 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 미생물 세포는 미생물의 단일 세포 또는 집단 세포를 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 미생물은 엔테로코커스 패시움(Enterococcus faecium), 스타피로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 클레브시엘라속(Klebsiella species), 아시네토박터 바우마니(Acinetobacter baumannii), 슈도모나스 애루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 또는 엔테로박터속(Enterobacter species)으로부터 선택되는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 항생제는 아미카신(Amikacin), 아목시실린(Amoxicillin), 암피실린(Ampicillin), 아즈트레오남(Aztreonam), 벤질페니실린(Benzylpenicillin), 칼부라닌산(Clavulanic Acid), 세파졸린(Cefazolin), 세페핌(Cefepime), 세포탁심(Cefotaxime), 세포테탄(Cefotetan), 세폭시틴(Cefoxitin), 세프포독심(Cefpodoxime), 세프타지딤(Ceftazidime), 세프트리악손(Ceftriaxone), 세푸록심(Cefuroxime), 시프로플록사신(Ciprofloxacin), 달포프리스틴(Dalfopristin), 도리페넴(Doripenem), 다프토마이신(Daptomycin), 에르타페넴(Ertapenem), 아리트로마이신(Erythromycin), 젠타마이(Gentamicin), 이미페넴(Imipenem), 레보플록사신(Levofloxacin), 리네졸리드(Linezolid), 메로페넴(Meropenem), 미노사이클린(Minocycline), 목시플록사신(Moxifloxacin), 니트로푸란토인(Nitrofurantoin), 노르플록사신(Norfloxacin), 피페라실린(Piperacillin), 퀴누프리스틴(Quinupristin), 리팜피신(Rifampicin), 스트렙토마이신(Streptomycin), 설박탐(Sulbactam), 설파메톡시졸(Sulfamethoxazole), 테리트로마이신(Telithromycin), 테트라사이클린(Tetracycline), 티카르실린(Ticarcillin), 티제사이클린(Tigecycline), 토브라마이신(Tobramycin), 트리메토프림(Trimethoprim) 및 반코마이신(Vancomycin)으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택되는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항균제에 대한 미생물의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제15항에 있어서,
상기 필라멘트 형성은 β-lactam계 항균제 중에서 페넴류 약물에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 제외하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제11항에 있어서,
상기 팽창 형성은 β-lactam 항균제 중에서 페넴류 약물에 대한 미생물의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 제17항에 있어서,
상기 팽창 형성은 이미페넴 또는 메로페넴에 대한 슈도모나스 에어루지노사(Pseudomonas aeruginosa) 및 대장균(Escherichia coli)을 포함하는 그람-음성 박테리아의 반응을 포함하는 것인, 항균제 감수성 검사 방법.
- 항생제에 반응하는 미생물 세포의 모양 및 성장 변화 분석을 이용한 항균제 감수성 검사를 위한 자동화된 세포 이미지 분석 시스템으로,
(A) 미생물과 항생제의 배양 및 미생물 세포의 모양 및 성장 변화의 이미징을 위한 배양칩;
(B) 미생물 세포의 배양구간을 촬영하여 미생물 세포의 이미지를 검출하는 광학영상분석장치; 및
(C) 상기 검출된 미생물 세포의 이미지를 분석하여 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이를 추출하여 미생물 세포의 항균제 감수성을 판정할 수 있는 리더(reader)를 포함하는 것으로,
상기 항균제 감수성은 미생물 세포의 전체 점유 영역, 미생물 세포의 개수 및 미생물 세포의 전체 길이에 따라 분열, 무-변화, 필라멘트 형성 및 팽창 형성을 이용하여 판정되는 것인, 자동화된 세포 이미지 분석 시스템. - 삭제
- 제19항에 있어서,
상기 광학영상분석장치는 텅스텐 램프, LED 광원 또는 레이저광원을 포함하는 것인, 자동화된 세포 이미지 분석 시스템.
- 제19항에 있어서,
상기 광학영상분석장치는 CCD(Charge Coupled Device) 또는 CMOS(Complementary Metal Oxide Semiconductor) 카메라를 포함하는 것인, 자동화된 세포 이미지 분석 시스템.
- 제19항에 있어서,
상기 리더는 세포배양 4 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역의 값(A3)을 0 시간 일 때의 최초의 이미지에서의 값(A1)으로 나누고, 이를 제1임계치(T1)와 비교하여,
a) A3/A1이 T1 보다 큰 경우 내성으로 판정하고,
b) A3/A1이 T1 보다 작을 경우 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)와 비교하여 i) A3/A1 및 A3/A2 (A2: 2시간 이후의 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역)가 각각 T2 및 T3 보다 큰 경우 내성으로 판정하고, ii) 그렇지 않은 경우 감수성으로 판정하는 것인, 자동화된 세포 이미지 분석 시스템.
- 제19항에 있어서,
상기 리더는 세포배양 3 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역의 값(A3)을 0 시간 일 때의 최초의 이미지에서의 값(A1)으로 나누고, 이를 제1임계치(T1)와 비교하여,
a) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 큰 경우, 세포배양 3 시간 이후의 최종 이미지에서 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, i) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, ii) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하고,
b) A3/A1이 상기 제1임계치(T1)보다 작을 경우 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)와 비교하여, (b-i) A3/A1 및 A3/A2 (A2: 1.5시간 이후의 이미지에서 미생물 세포의 전체 점유 영역)가 각각 제2임계치(T2) 및 제3임계치(T3)보다 큰 경우, 상기 미생물 세포의 전체 길이(L3)를 상기 미생물 세포의 개수(F3)로 나누고, (b-i-1) 상기 L3/F3가 제4임계치(T4)보다 큰 경우 필라멘트 형성 또는 팽창 형성으로 판단하여 감수성으로 판단하고, (b-i-2) 그렇지 않은 경우 내성으로 판정하며, (b-ii) 상기 (b-i)의 조건을 충족하지 않은 경우 감수성으로 판정하는 것인, 자동화된 세포 이미지 분석 시스템.
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- 2015-10-14 US US14/883,101 patent/US10208328B2/en active Active
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2018
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Patent Citations (2)
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|---|---|---|---|---|
| JP2013538567A (ja) * | 2010-08-12 | 2013-10-17 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 抗菌化合物を同定するおよび抗生物質感受性を決定する方法 |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| J. Clin. Microbiol., Vol. 51, No. 7, pp. 2047-2053 (2013.07.)* |
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| Publication number | Publication date |
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