JP6626508B2 - 抗菌薬感受性試験を自動で分析及び判定する方法 - Google Patents

抗菌薬感受性試験を自動で分析及び判定する方法 Download PDF

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Description

本発明は、化学微生物学の分野において、抗菌剤に対する微生物の感受性試験を自動で読み取り、判定する方法に関する。
本発明は、主に細菌学の分野において、「アンチバイオグラム」と呼ばれる、抗生物質に対する細菌の感受性試験に適用できる。他の分野でも、例えば、アンチファンゴグラム（ａｎｔｉｆｕｎｇｏｇｒａｍｓ）と呼ばれる、抗真菌剤に対する真菌類の感受性に関する菌学的試験等の感染症研究に適用できる。
本明細書中、「アンチバイオグラム」とは、抗生物質化合物に対する細菌の試験と、抗真菌性化合物に対する真菌類の試験とを総称したものである。
アンチバイオグラムは、細菌の増殖がどの程度阻害されるかを評価することで、一種以上の仮定の又は公知の抗生物質に対する細菌株の感受性を試験するための実験手法である。その原理は、１種以上の抗生物質の存在下に細菌の培地を設置し、培養細菌の成長及び生存結果を観察するというものである。これを実施するためには、例えば、固体培地へ播種した細菌株の上に、抗生物質を含ませた複数枚のペレットを配置できる。そして、抗生物質がペレットから拡散することでペレット周辺に濃度勾配を形成し、細菌が抗生物質に対して感受性を有する場合は、ペレット周辺に裸眼で確認できる暗い輪状の増殖阻止帯が形成される。株又は細菌は、ディスク状の抗生物質ペレットを囲む阻止帯を構成する円の直径により、感受性、中間又は耐性という三種類に判定できる。
これらのペレット及び抗生物質の各用量は、欧州抗菌薬感受性試験法検討委員会（ＥＵＣＡＳＴ、ｗｗｗ．ｅｕｃａｓｔ．ｏｒｇ．）（非特許文献１及び２）並びに／又は仏国微生物学会アンチバイオグラム委員会（Ｃｏｍｉｔｅ ｄｅ ｌ’Ａｎｔｉｂｉｏｇｒａｍｍｅ ｄｅ ｌａ Ｓｏｃｉｅｔｅ Ｆｒａｎｃａｉｓｅ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ（ＣＡ−ＳＦＭ）、ｗｗｗ．ｓｆｍ−ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ．ｏｒｇ）のエキスパートシステムが推奨するものに従って標準化できる。抗生物質ペレットは、既知濃度の抗生物質を含有し且つこれを拡散することができる基質材料（抗生物質の種類により、１〜５００マイクログラム（μｇ）の抗生物質を含浸させたブロッティングペーパー等）で形成されており、ｉ２ａ社（モンペリエ、フランス）、ＢＤ（ベクトン・ディッキンソン）社（米国）、バイオ・ラッド社（ハーキュリーズ、米国）、ビオメリュー社（マーシー・レトワール、フランス）といった業者から販売されている。
寒天の固体相でアンチバイオグラムを実施するのに使用される各種抗生物質ペレットの上面には、１〜３文字のコードで標準化された略号を用いて抗生物質の名称が記載されている。
結果は、輪（微生物株の増殖が阻害された領域）の直径を測定するだけで実質的には読み取れる。阻止円直径が大きいほど、試験した抗生物質に対する細菌の感受性が大きいことを意味し、その逆も同様である。ペレットの用量は、試験した細菌に対する当該抗生物質の最小阻止濃度（ＭＩＣ）に比例した円直径が得られるように決定する。
阻止円直径は、定規を用いて手動で、又は自動で直径を読み取れる読み取り機を用いて、ミリメートル単位で測定する。自動読み取り機は、カメラを備えたスキャナ、及び、抗生物質ペレットとこれらのディスク周辺に位置する阻止帯の検出器とを有する。
寒天培地に拡散させることで得られたアンチバイオグラムは、ＥＵＣＡＳＴ及び／又はＣＡ−ＳＦＭのエキスパートシステムによる推奨に従って判定する。
判定用としては、細菌及び抗生物質に応じた各種の表及びグラフが存在している。そこには高低それぞれの臨界濃度と、ペレットに含まれる抗生物質の所定濃度に対する阻止帯の大小それぞれの臨界直径とが記載されている。各抗生物質は、各細菌に対し以下を示す
・低臨界濃度より低い（大臨界直径より大きい）場合、細菌は抗生物質に対して感受性を有すると考えられる（「Ｓ」で表す）。
・高臨界濃度より高い（小臨界直径より小さい）場合、細菌は抗生物質に対して耐性を有すると考えられる（「Ｒ」で表す）。
・これら二つの濃度間である場合、細菌は中間とする（「Ｉ」で表す）。
従って、各細菌は、各抗生物質に対してＳ、Ｉ又はＲで特徴付けられる。通常、ある細菌がある抗生物質ファミリーに耐性を有するかどうかを知るためには、当該ファミリー内の一物質を試験してその特徴を把握すれば十分であると考えられている。そのため阻止円直径を測定すれば、抗生物質の薬効クラスを判定できる。だが、各種の抗生物質に対する耐性又は感受性の観点から見ると、抗生物質のある一ファミリーだけでは、細菌の表現型を完全には把握できない。そのため、アンチバイオグラムにおいては、異なるクラス又はファミリー又はサブファミリーの抗生物質を含む複数のペレットを配置し、各種の抗生物質ファミリー又はサブファミリーに対する耐性又は感受性表現型を得ることで、複数の抗生物質を試験している。
アンチバイオグラムによれば、医者が適切な抗生物質又は抗生物質の組み合わせを選択して患者を効果的に治療できる。
従って、ある細菌株の表現型を完全に把握するためには、異なる薬効クラス又はファミリー又はサブファミリーに属しており且つ最もよく見られる耐性メカニズムが知られている異なる抗生物質を試験する必要がある。以下の各ファミリー又はサブファミリーの主要な抗生物質（コードを丸カッコ内に示す）を以下に示す。
（１）β−ラクタムファミリー
（１．１）ペニシリンサブファミリー
（１．１．１）ペニシリンＧ群：ペニシリンＧ（Ｐ）
（１．１．２）ペニシリンＭ：オキサシリン（ＯＸ又はＯＸＡ）
（１．１．３）ペニシリンＡ群又はアミノペニシリン：アモキシシリン（ＡＭＸ）及びアンピシリン（ＡＭ）
（１．１．４）超広域スペクトル抗菌活性を有するペニシリン
・β−ラクタマーゼ阻害剤：アモキシシリン＋クラブラン酸（ＡＭＣ）の組み合わせ
・カルボキシペニシリン：チカルシリン（ＴＩＣ）、チカルシリン＋クラブラン酸（ＴＣＣ）の組み合わせ
・ウレイドペニシリン：ピペラシリン＋タゾバクタム（ＴＺＰ）の組み合わせ
（１．２）セファロスポリンサブファミリー
（１．２．１）第１世代セファロスポリン：セファロチン（ＣＦ）
（１．２．２）第２世代セファロスポリン：（セファマイシン系）セフォキシチン（ＦＯＸ）、セフロキシム（ＣＸＭ）
（１．２．３）第３世代セファロスポリン：セフトリアキソン（ＣＲＯ）、セフォタキシム（ＣＴＸ）、セフタジジム（ＣＡＺ）
（１．２．４）第４世代広域スペクトルセファロスポリン：セフェピム（ＦＥＰ）、セフピロム（ＣＰＯ）
（１．３）モノバクタムサブファミリー：アズトレオナム（ＡＴＭ）
（１．４）カルバペネムサブファミリー：イミペネム（ＩＭＰ又はＩＰＭ）及びエルタペネム（ＥＲＴ）
（２）キノロンファミリー
（２．１）第１世代キノロン：ナリジクス酸（ＮＡ），
（２．２）第２世代フルオロキノロン系キノロン：シプロフロキサシン（ＣＩＰ）、オフロキサシン（ＯＦＸ）、ペフロキサシン（ＰＥＦ）、レボフロキサシン（ＬＶＸ）、モキシフロキサシン（ＭＸＦ）、ノルフロキサシン（ＮＯＲ）
（３）アミノグリコシドファミリー：ゲンタマイシン（ＧＥＮ又はＧＭ）、アミカシン（ＡＫ又はＡＮ）、トブラマイシン（ＴＯＢ又はＴＭ）、カナマイシン（Ｋ）
（４）リファマイシンファミリー：リファンピシン（ＲＡ）
（５）グリコペプチドファミリー：バンコマイシン（ＶＡ又はＶＡＮ）及びテイコプラニン（ＴＥＣ）
（６）スルファミド及びジアミノピリミジンファミリー：トリメトプリム＋スルファメトキサゾールの組み合わせ＝コトリモキサゾール（ＳＸＴ）
（７）マクロライドファミリー：エリスロマイシン（Ｅ）、テリスロマイシン（ＴＥＬ）
（８）リンコサミドファミリー：リンコマイシン（ＬＩＮ）及びクリンダマイシン（ＣＬＩ又はＤＡ）
（９）シナジスチン（ｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｎｅ）又はストレプトグラミンファミリー：プリスチナマイシン（ＰＴ）
（１０）テトラサイクリンファミリー：ドキシサイクリン（ＤＯ又はＴＥ）
（１１）環状ポリペプチド又はポリミキシンファミリー：コリスチン（ＣＯＬ又はＣＳ）
（１２）フランファミリー：ニトロフラン−フラン（ＦＴ）、ニトロフラントイン（ＦＵＲ又はＮＴ）
（１３）フェニコールファミリー：クロラムフェニコール（Ｃ）
（１４）フシジンファミリー：フシジン酸（ＦＡ）
（１５）ホスホン系抗生物質ファミリー：ホスホマイシン（ＦＦ又はＦＯＳ）
（１６）オキサゾリドンファミリー：リネゾリド（ＬＮＺ）
（１７）環状リポペプチドファミリー：チゲサイクリン（ＴＧＣ）
上述したＣＡ−ＳＦＭ又はＥＵＣＡＳＴ等の公的機関が発行した、異なる細菌の臨界直径（所定濃度の抗生物質又は抗生物質の組み合わせを含むペレットの臨界濃度に相当）を特定している表又はグラフを用いて結果を判定する工程は、冗長且つ複雑であり、重大な制約をもたらす手順であった。
当該技術の現状（非特許文献３〜８）に鑑み、アンチバイオグラムの分析を自動化する各種の方法が知られている。そのような方法としては、基質（ペレット等）内の抗生物質周辺にある拡散ディスクを含む領域の画像を、拡散領域の直径を算出するソフトを用いて入手し、テンプレートを用いた標準方法（米国臨床検査標準委員会（ＮＣＣＬＳ）による方法）で得られた標準直径と比較する方法が挙げられる。
Ｔ．Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ，Ｐ．Ｃｏｕｒｖａｌｉｎ（２０１１），「Ｅｘｐｅｒｔ ｓｙｓｔｅｍｓ ｉｎ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．，Ｖｏｌ．２４，ｐｐ．５１５−５５６，２４／３／５１５［ｐｉｉ］，１０．１１２８／ＣＭＲ．０００６１−１０１ Ｒ．Ｌｅｃｌｅｒｃｑ，Ｒ．Ｃａｎｔｏｎ，Ｄ．Ｆ．Ｂｒｏｗｎ，Ｃ．Ｇ．Ｇｉｓｋｅ，Ｐ．Ｈｅｉｓｉｇ，Ａ．Ｐ．ＭａｃＧｏｗａｎ，Ｊ．Ｗ．Ｍｏｕｔｏｎ，Ｐ．Ｎｏｒｄｍａｎｎ，Ａ．Ｃ．Ｒｏｄｌｏｆｆ，Ｇ．Ｍ．Ｒｏｓｓｏｌｉｎｉ，Ｃ．Ｊ．Ｓｏｕｓｓｙ，Ｍ．Ｓｔｅｉｎｂａｋｋ，Ｔ．Ｇ．Ｗｉｎｓｔａｎｌｅｙ及びＧ．Ｋａｈｌｍｅｔｅｒ（２０１３），「ＥＵＣＡＳＴ Ｅｘｐｅｒｔ ｒｕｌｅｓ ｉｎ ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ」，Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｅ Ｉｎｆｅｃｔ．，１９：１４１−１６０，１０．１１１１／ｊ．１４６９−０６９１．２０１１．０３７０３．ｘ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，１９９８，ｐａｇｅｓ ３０２−３０４，Ｖｏｌｕｍｅ ３６，Ｎｏ．１，Ｋｅｎｔ Ｋｏｒｇｅｎｓｋｉ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ ２０００，ｐａｇｅｓ １６８８−１６９３，Ｖｏｌｕｍｅ ３８，Ｎｏ．４ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ，Ｖｏｌｕｍｅ １０，Ｎｏ．５，２００４，Ｋｏｌｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｐｒｉｌ ２００５，ｐａｇｅｓ １８４６−１８５０，Ｖｏｌｕｍｅ ４３，Ｎｏ．４，Ｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ． Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ，２００８，Ｖｏｌｕｍｅ ７５，ｐａｇｅｓ １７７−１８１ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ，４５（２１５）６１−６５，Ｌｅｐａｇｅ ｅｔ ａｌ．
本発明は、より簡便に実施でき且つ信頼性が高い方法であって、ＣＡ−ＳＦＭ又はＥＵＣＡＳＴにより指定された基準を用いて、ペレットを囲む阻止帯の円の直径を一つずつ読み取って判定する必要のない方法を提供することを目的とする。
本発明によれば、各アンチバイオグラム画像はある表現型に特有のものであり、標準アンチバイオグラムの写真画像群を用いて写真を比較することで、ＥＵＣＡＳＴ又はＣＡ−ＳＦＭの判定データに従って判定することなく、抗生物質に対する細菌の耐性表現型を確認できることが分かった。また、ある表現型について、同じ種及び同じ表現型であるいくつかの細菌の写真群を利用できる場合、同じ表現型を表す異なる写真のアンチバイオグラム２枚の全体像間で直径又は形状が異なっていても適用できる。
これを実施するため、本発明は、具体的には、分析用微生物試料、好ましくは細菌のアンチバイオグラムを自動的に分析及び判定する方法であって、
該方法は、少なくとも１種の抗菌性化合物、好ましくは複数の抗菌性化合物、好ましくは抗生物質化合物に対する耐性又は感受性の表現型を決定し、該表現型は、複数の異なる標準微生物種中の各標準微生物種に対する複数の異なる標準表現型から選択されるものであり、
（ａ）好ましくは上記標準微生物種の一種に属する分析用微生物試料のアンチバイオグラムを所定の方法論で固体培地に作製する工程であって、該方法論が、
・前記固体培地に播種された前記微生物試料（好ましくは細菌試料）微生物（好ましくは細菌）の所定の濃度（１ミリリットルあたりコロニー形成単位（ＣＦＵ／ｍＬ））、
・それぞれ所定の抗菌性化合物１種（又は複数種）を所定の濃度で含有している基質であって、ｎ個の基質それぞれについて異なる１種以上の所定の抗菌性化合物を拡散させることができる、前記固体培地に配置された基質の所定の個数ｎ（ｎは複数）、所定の配列及び形状、好ましくはペレット状、及び、
・上記固体培地に播種した上記微生物試料を培養する所定の条件及び期間、好ましくは３５℃〜３７℃で１８時間〜２４時間、を含む工程、
（ｂ）好ましくはスキャナ及びカメラを備えた写真画像キャプチャ装置を用いて、上記工程（ａ）で得られたアンチバイオグラムの写真画像を入手する工程、及び
（ｃ）画像認識ソフトを使用して、上記工程（ｂ）で得られた写真画像と、標準アンチバイオグラムの標準画像で構築されたデータベース内にある上記標準画像とを比較することで、上記分析用微生物試料、好ましくは細菌の表現型を決定する工程であって、上記データベースは、少なくともｐ個（ｐは複数、好ましくは５以上、より好ましくは１０以上）の異なる標準画像を含んでおり、該標準画像は、各標準微生物種の各標準表現型に対する、同じ微生物の異なるｐ個の株のアンチバイオグラム画像である工程、
を含む方法を提供する。
上記標準アンチバイオグラムは、全て上記分析用アンチバイオグラムと同じ方法論で作製されることが好ましい。
上記標準画像及び分析用画像は、同じ写真画像キャプチャ装置を用いて、同じ条件下、特に同じ距離、同じ明るさ、同じ背景（好ましくは平坦で黒色の背景）及び同じ解像度で撮影されたものであることが好ましい。
以下のことが理解できる。
・標準アンチバイオグラムは、各種標準表現型について少なくとも一部が異なる抗生物質化合物及び／又は抗生物質化合物濃度を有するペレットを含むことを除き、ペレットの数、配置及び形状、並びに細菌濃度及びインキュベート条件の点で、分析用アンチバイオグラムと同じ上記の方法論を用いて用意する。
・上記データベースにおける各標準細菌種の異なる標準株の標準表現型は、抗生物質ペレットを囲む増殖阻止円の直径を測定し、上記ペレット内の抗生物質濃度に対する低臨界濃度及び高臨界濃度に相当する臨界直径値を表すグラフを用いて、分析した試料細菌を以下の通り分類するという通常の標準方法により、手動で決定される。
・ペレットを囲む阻止円の直径が低臨界濃度に相当する直径より大きい場合、上記ペレットに含まれる抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して感受性を有する。
・ペレットを囲む阻止円の直径が高臨界濃度に相当する直径より小さい場合、上記ペレットに含まれる抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して耐性を有する。
・ペレットを囲む阻止円の直径が低臨界濃度と高臨界濃度とに相当する臨界直径値の間である場合、上記ペレットに含まれる抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して中間である。
・工程（ｂ）で得られた写真画像を上記標準画像と比較し、工程（ｂ）で得られた写真画像が上記標準細菌種の標準表現型に相当する上記標準画像と一致する場合又は少なくとも十分に類似している場合、分析用細菌試料の表現型は上記標準細菌種の標準表現型であると決定できる。最小類似率は、同じ標準細菌種の同じ表現型に相当する複数の標準画像を用いて実験により決定できる。
本発明の方法では、従来のアンチバイオグラム判定方法において手動で実施していたように各円の直径を算出することなく、画像を即座に包括的に認識する。本発明者らは、当該抗生物質に関して同じ表現型に属していても阻止円の直径はある範囲内で変化し得るにもかかわらず、同じ表現型に対する複数の標準画像と組み合わせて複数の領域又は円を分析することにより、アンチバイオグラムを正確に判定できることを見出した。
本発明に係る方法の他の利点としては、並べて配置した、株に対して通常は抵抗性がある二つの異なるペレットに含まれる２種の抗生物質間で相乗型と呼ばれる表現型を自動で検出及び検討できる点が挙げられる。相乗効果は、寒天法において、寒天上に拡散する抗生物質によって発生する。これは、２種の抗生物質間の距離が十分に小いと（グラム陰性細菌の場合、２〜２．５センチメートル（ｃｍ））、寒天の同じ部分に拡散するためであり、その特定の場所における２種の抗生物質の組み合わせによって、必要に応じて、新たな阻止帯（相乗帯）の出現を可視化することができる。
相乗効果が見られる場合、一般には２種の抗生物質間で別の阻止帯が現れるため、２種の当該抗生物質間の相乗効果のメカニズムを可視化できる。ディスクＡとディスクＢとが相乗効果を示す場合、ディスクＡ周辺の直径が拡大してディスクＢへと進行することがある。この場合、ペレットＡ及びＢ周辺の二円間において阻止帯が「シャンパンコルク」形と呼ばれる略楕円形となる。将来的には、新たな相乗効果が発見されるかもしれない。新規なものである場合、本発明の方法では、相乗画像は非類似であるとして検出される。
上記工程（ｃ）において、上記画像認識ソフトは、基質の周囲の阻止帯に相当する円の輪郭形状、並びに好ましくは抗生物質ペレットに記載された抗生物質コードの文字及び用量の数字を比較するために使用されることが好ましく、上記ソフトは、上記ペレットが配列される順番を認識することがより好ましい。
このようなソフトは、葉の外形の画像を分析してその植物種を認識するのに使用されている。また、後述するＸｎＶｉｅｗという無料の画像認識ソフトも知られており、このソフトによれば、測定する特性の変化、すなわち、相乗帯として重複し得る部分の両側の各円の各直径を考慮するので、本発明に特に好適である。
より具体的には、分析用画像と標準画像との最小許容類似率（以下、類似率閾値という）を決定し、
上記認識ソフトが、分析用細菌試料のアンチバイオグラム画像と、上記標準細菌種の上記標準表現型に対応する標準画像との類似率が最小許容類似率閾値以上であると評価し、好ましくは該最小許容類似率閾値が少なくとも７０％、より好ましくは少なくとも８０％である場合、上記分析用試料の細菌は上記標準細菌の上記標準表現型を示していると判定する。
上記認識ソフトによれば、分析用画像と標準画像との間の最小許容類似率（以下、類似率閾値という）を決定できる。
一実施形態において、全ての標準表現型に適用できる共通の類似率閾値を決定できる。
別の実施形態において、各標準細菌種の各標準表現型に対するｐ個の異なる株の異なるアンチバイオグラム標準画像間における最小許容類似率（以下、標準類似率閾値という）、好ましくは各標準細菌種の各標準表現型に対する標準画像のうち最も異なる２画像間の最低類似率に相当する標準類似率閾値を決定し、
上記認識ソフトが、分析用細菌試料のアンチバイオグラム画像と、上記標準細菌種の上記標準表現型に対応する標準画像との類似率が標準類似率閾値以上であると評価した場合、上記分析用試料の細菌は上記標準細菌の上記標準表現型を示していると判定する。
変更実施形態において、上記標準表現型は、所定の抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対する耐性又は感受性を有する分類である。
この変更実施形態において、上記アンチバイオグラムはＥｔｅｓｔであってもよく、上記ソフトは、単一の抗生物質の濃度勾配を含む帯に示された最小阻止濃度（ＭＩＣ）を読み取ることができる。なお、ＭＩＣは、帯を囲む楕円の最も狭い端部における値である。従って、本発明の方法によれば、操作者が裸眼でＭＩＣを読み取る場合に多く発生する誤差を避けることができる。
別の変更実施形態において、上記標準表現型は、好ましくはペレット状の基質において、複数の抗生物質及び／又は抗生物質の組み合わせに対する耐性又は感受性を有する分類である。
上記標準表現型は、２種の抗生物質間の相乗表現型を含み、上記２種の抗生物質は、別々に摂取した場合は標準細菌が耐性を有する一方、組み合わせて摂取した場合は標準細菌が感受性を有するような２種の抗生物質に相当することが好ましい。このような相乗現象は、標準細菌が耐性を有する２種の抗生物質に相当する２つのペレット間の空間に阻止帯が現れることにより認識できる。
より具体的には、上記標準細菌種は、より一般的な細菌、すなわちヒト疾患で最もよく見られる原因菌の約８０％を占める細菌であって、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及び表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）を含む細菌から選択される。
より具体的には、アンチバイオグラムは、それぞれ以下の略号を有する以下の抗生物質：
アモキシシリン（ＡＭＸ）；アモキシシリン−クラブラン酸（ＡＭＣ）；ゲンタマイシン（ＧＥＮ）；トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＳＸＴ）；チカルシリン（ＴＩＣ）；チカルシリン−クラブラン酸（ＴＣＣ）；ピペラシリン−タゾバクタム（ＴＺＰ）；セフタジジム（ＣＡＺ）；イミペネム（ＩＭＰ）；コリスチン（ＣＯＬ又はＣＬ）；セフォキシチン（ＦＯＸ）；バンコマイシン（ＶＡＮ又はＶＡ）；テイコプラニン（ＴＥＣ）；クリンダマイシン（ＣＬＩ又はＤＡ）；セフトリアキソン（ＣＲＯ）；セフェピム（ＦＥＰ）；リンコマイシン（Ｌ又はＬＩＮ）；ニトロフラントイン（ＦＵＲ又はＮＴ）；シプロフロキサシン（ＣＩＰ）；オフロキサシン（ＯＦＸ）；セフォタキシム（ＣＴＸ）；アミカシン（ＡＫ又はＡＮ）；トブラマイシン（ＴＯＢ又はＴＭ）；セフォキシチン（ＦＯＸ）；アズトレオナム（ＡＴＭ）；エルタペネム（ＥＲＴ）；ホスホマイシン（ＦＦ又はＦＯＳ）；ドキシサイクリン（ＤＯＩ）；カナマイシン（Ｋ）；リンコマイシン（Ｌ又はＬＩＮ）；リネゾリド（ＬＮＺ）；ナリジクス酸（ＮＡ）；ノルフロキサシン（ＮＯＲ）；メトロニダゾール（ＭＥＴ）；メロペネム（ＭＥＭ）；プリスチナマイシン（ＰＴ）；ペニシリンＧ（Ｐ）；リファンピシン（ＲＡ）；チゲサイクリン（ＴＧＣ）；テリスロマイシン（ＴＥＬ）；エリスロマイシン（Ｅ）；及びオキサシリン（ＯＸ又はＯＸＡ）
を含むペレットを用いて形成される。
更により具体的には、本発明者らは、ヒト疾患の原因となる細菌であって、特に尿において検出可能であり上述の抗生物質で治療できる細菌を試験するのにより適切な標準表現型を決定した。これらの標準表現型は、耐性を有する分類であるか、少なくとも以下の表現型：
・「野生型」と呼ばれる表現型：抗生物質に対する獲得耐性を有していない細菌（但し、自然耐性を有し得る）；
・「低レベルペニシリナーゼ」と呼ばれる表現型：低濃度（８ｍｇ／Ｌ未満）のペニシリンファミリー抗生物質で細菌増殖を阻害できる、ペニシリナーゼ産生細菌；
・「阻害剤耐性ペニシリナーゼ」と呼ばれる表現型：この酵素を不活化できると考えられる全てのペニシリナーゼ阻害剤に対して耐性を有する、ペニシリナーゼ産生細菌；
・「高レベルペニシリナーゼ」と呼ばれる表現型：高濃度（８ｍｇ／Ｌ超）のペニシリンファミリー抗生物質で細菌増殖を阻害できる、ペニシリナーゼ産生細菌；
・「広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＢＳＢＬ）」と呼ばれる表現型：β−ラクタマーゼ産生細菌；
・「高レベルセファロスポリナーゼ」と呼ばれる表現型：高濃度（２ｍｇ／Ｌ超）のセファロスポリンファミリー抗生物質で細菌増殖を阻害できる、セファロスポリナーゼ産生細菌；
・「カルバペネマーゼ」と呼ばれる表現型：カルバペネマーゼ産生細菌；
・「イミペネム選択透過性」と呼ばれる表現型：イミペネムに対して中間の感受性を有する細菌；
・「メチシリン耐性」（ペニシリンＭ群に対する以前の名称で、現在はペニシリンＭ群サブファミリーに属するペニシリンであるオキサシリンに置き換えられている）：β−ラクタム系に対する親和性を有していない新規な標的を獲得したメチシリン耐性（＝オキサシリン耐性）細菌（ペニシリン結合タンパク２ａ）；
・「フルオロキノロン類耐性」と呼ばれる表現型：フルオロキノロンファミリー抗生物質化合物の存在下ではその増殖が阻害されない細菌；
・「アミノグリコシド類耐性」と呼ばれる表現型：アミノグリコシドファミリー抗生物質化合物の存在下ではその増殖が阻害されない細菌；
・「マクロライド類耐性」と呼ばれる表現型：マクロライドファミリー抗生物質化合物の存在下ではその増殖が阻害されない細菌；
・「コトリモキサゾール耐性」と呼ばれる表現型：コトリモキサゾールの存在下ではその増殖が阻害されない細菌；
・「リファンピシン耐性」と呼ばれる表現型：リファンピシンの存在下ではその増殖が阻害されない細菌；及び
・「非定型」と呼ばれる表現型：未知又は決定できない表現型
から選択される少なくとも一つである。
ペニシリナーゼは、ペニシリンを破壊（加水分解）し、細菌に対して不活化できる酵素である。
セファロスポリナーゼは、セファロスポリン類を破壊（加水分解）し、細菌に対して不活化できる酵素である。
カルバペネマーゼは、カルバペネム類を破壊（加水分解）し、細菌に対して不活化できる酵素である。
β−ラクタマーゼは、ペニシリン類、セファロスポリン類及びモノバクタム類（アズトレオナム）を加水分解する一方、カルバペネム類及びセファマイシン類（セフォキシチン等）は加水分解しない酵素である。
更により具体的には、分析した上記アンチバイオグラム及び／又は上記データベースは、下記群（ａ１）〜（ａ６）：
（ａ１）ＡＭＸ、ＡＭＣ、ＴＣＣ、ＣＲＯ、ＦＥＰ及びＩＭＰ，
（ａ２）ＡＭＸ、ＡＭＣ、ＴＺＰ、ＣＲＯ、ＦＥＰ及びＩＭＰ，
（ａ３）ＡＭＣ、ＴＺＰ、ＣＲＯ、ＦＥＰ、ＩＭＰ及びＣＯＬ，
（ａ４）ＡＭＸ、ＧＥＮ、ＬＩＮ、ＦＵＲ、ＶＡＮ及びＴＥＣ，
（ａ５）ＴＩＣ、ＴＣＣ、ＴＺＰ、ＦＥＰ、ＣＡＺ及びＩＭＰ、並びに
（ａ６）ＦＯＸ、ＣＬＩ、ＳＸＴ、ＧＥＮ、ＶＡＮ及びＴＥＣ
から選択された抗生物質化合物６種の濃度に対して耐性（Ｉ、Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する標準細菌種の標準表現型を含み、
好ましくは、各群について、上記した順番で円状に配置されている。
より具体的には、これらの（ａ１）群〜（ａ６）群は、上述の細菌について以下の表現型：
・表現型「野生型」、
・表現型「低レベルペニシリナーゼ」、
・表現型「阻害剤耐性ペニシリナーゼ」、
・表現型「高レベルペニシリナーゼ」、
・表現型「広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＢＳＢＬ）」、
・表現型「高レベルセファロスポリナーゼ」、
・表現型「カルバペネマーゼ」、
・表現型「イミペネム選択透過性」、
・「メチシリン耐性」
・表現型「非定型」
に関連する。
更により具体的には、分析した上記アンチバイオグラム及び／又は上記データベースは、下記群（ｂ１）及び（ｂ２）：
（ｂ１）ＣＩＰ、ＯＦＸ、ＴＩＣ、ＣＯＬ、ＩＭＰ、ＣＴＸ、ＴＣＣ、ＡＫ、ＳＸＴ、ＡＭＣ、ＣＲＯ、ＴＯＢ、ＡＭＸ、ＡＴＭ、ＦＯＸ及びＧＥＮ、並びに
（ｂ２）ＳＸＴ、ＤＡ、ＦＯＸ、ＯＸＡ、ＰＴ、ＧＥＮ、ＣＩＰ、ＲＡ、ＴＥＣ、ＶＡＮ、ＬＮＺ、ＦＦ、ＴＯＢ、Ｅ、ＤＯ及びＮＴ
から選択された抗生物質化合物１６種に対して耐性（Ｉ／Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する標準細菌種の標準表現型を含み、
好ましくは、各群について、これらのペレットは右側の第１行から上記の順番で、４化合物の４行が列状に配列された格子状に配置されている。
より具体的には、これらの（ｂ１）群及び（ｂ２）群は、上述の細菌について以下の表現型：
・表現型「野生型」、
・「高レベルペニシリナーゼ」＋「フルオロキノロン類耐性」＋「コトリモキサゾール耐性」＋「アミノグリコシド類耐性」を組み合わせた表現型
・「セファロスポリナーゼ」＋「フルオロキノロン類耐性」＋「コトリモキサゾール耐性」＋「アミノグリコシド類耐性」を組み合わせた表現型
・「セファロスポリナーゼ」＋「コトリモキサゾール耐性」＋「アミノグリコシド耐性」を組み合わせた表現型
・「メチシリン耐性」＋「フルオロキノロン類耐性」＋「リファンピシン耐性」＋「マクロライド類耐性」＋「アミノグリコシド類耐性」を組み合わせた表現型
に関連する。
より具体的には、上記した１６種のペレットに対するこれらの標準表現型は、敗血症等のいわゆる深部感染症に有用である。
更により具体的には、上記工程（ａ）において、上記標準アンチバイオグラム及び上記分析用細菌試料のアンチバイオグラムは、ミューラー・ヒントン寒天型の固体培地で所定の方法論を用いて作製され、上記方法論は、
・円状又は格子状に配置した、抗生物質濃度が１０〜３００μｇであるディスク状のペレットをｎ個（ｎ＝６〜１６）、
・濁度がマクファーランド範囲の標準液番号で０．５となる沈殿懸濁液に相当する、上記固体培地に播種した分析用試料又は標準試料の所定の細菌濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）、及び、
・所定の培養条件及び時間が３７℃で好ましくは１８〜２４時間である。
更により具体的には、上記ペレットは、６個が培地上で円形に配置されているか、角皿に、好ましくは１６個の正方形を含む規則的な格子状に配置されている。
本発明に係る他の特徴及び利点は、以下の説明を読み、添付の図面を参照することで更に理解できるが、本発明はこれらに限定されない。
図１Ａ及び１Ｂは、アンチバイオグラムにおける全体像の輪郭を認識する原理を表し、図１Ａは、図１Ｂの画像における一連の阻止帯１〜６の全体的な輪郭を表す。 図２Ａ〜２Ｃは、本発明の方法によって８７％〜１００％の類似率で同じ表現型に属すると認識されたＢＳＢＬ表現型Ｅ．ｃｏｌｉ株のアンチバイオグラム写真である。 図２Ｄ及び２Ｅは、本発明の方法によって７５％の類似率で同じ表現型に属すると認識されたセファロスポリナーゼ表現型Ｅ．ｃｏｌｉ株のアンチバイオグラム写真である。 図３Ａ及び３Ｂは、本発明の方法によって類似率８０％と認識された高レベルペニシリナーゼ産生Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株の２枚のアンチバイオグラム写真である。 図４Ａ及び４Ｂは、本発明の方法によって同じ表現型には属さないと認識された表現型のアンチバイオグラム写真であり、図４Ａは、全ての抗生物質に対して感受性を有するＥ．ｃｏｌｉ株を表し、図４Ｂは、全ての抗生物質に対して耐性を有するＥ．ｃｏｌｉ株を表す。 図５は、二つのペレット（ＡＭＣ及びＣＲＯ）間でＢＳＢＬ表現型Ｅ．ｃｏｌｉ株に対して形成されたシャンパンコルク形（Ａ）の相乗帯の画像である。 図６Ａ及び６Ｂは、本発明の方法によって類似率８８％と認識された同じセファロスポリナーゼ表現型Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅの二つの株に対して正方形に配置されたアンチバイオグラム写真である。
最近の専門部会では、より一般的な細菌種に対する数十種類の抗生物質のＳＩＲ判定が記載された１００頁ほどのパンフレットが推奨されている。ある抗生物質クラスについて、生物学者であれば、ここで推奨されている一種以上の抗生物質を試験することを決定できる。実務上は、判定に重要であり且つ最終的に臨床家にとって有用な抗生物質は数種類のみである。臨床家は、例えば、患者を治療するのにペニシリンを使用するのが望ましい場合は、リスト内の分子を１種類のみ使用すると思われるためである。以下の例において、本発明者らは、ヒト疾患で最も一般的な１０種の細菌の表現型を決定するのに、代表的な６種類の抗生物質を決定した。
（１）アンチバイオグラムの作成
アンチバイオグラムは、以下の標準的な方法論を用いて作成した。
（１．１）細菌試料の調製
試験管内滅菌水に溶かしたコロニーをから、分光光度計で正確に測定した溶液の濁度がマクファーランド範囲における０．５標準液の濁度に相当するようにして細菌懸濁液を直接作製することで、接種材料を調製した。接種材料が濃縮されているほど阻止帯の直径が小さくなり、その逆も同様であるため、上記細菌懸濁液の濃度は標準化されている。
上記接種材料は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ、Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ、Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ、Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓについて、濃度が約１０８ＣＦＵ／ｍＬ相当である。これら１０種の細菌は、ヒト疾患において最も頻繁に見られるものである。
（１．２）上記細菌試料を、直径９０ｍｍのペトリ皿又は一辺が１２０ｍｍの角皿内にある固体培地に播種した。培地は、アンチバイオグラム（ＥＵＣＡＳＴ）に特異的なミューラー・ヒントン寒天で構成した。理想的には、懸濁液の調製から１５分以内に使用するべきである。
播種は、過剰量の細菌懸濁液をミューラー・ヒントン寒天に添加してあふれさせることにより、寒天培地上で拡散させる方法で実施した。均質化後、皿へ過剰に接種されないように余分な液体を除去した。細菌の侵入を促す水分を少しも残さないように、寒天表面が乾燥するまで待つ必要がある。
寒天に接種してから１５分以内に、抗生物質ペレットのディスクを配置しなければならない。抗生物質含有ディスクは、自動ディスペンサーを用いて、接種された乾燥寒天の表面上にしっかりと配置した。阻止帯の重複の点から、また、抗生物質間で干渉が起こらないように、１皿あたりのディスク配置数を制限した。阻止円の直径は、測定可能であることが重要である。その後、アンチバイオグラムを３７℃で１８〜２４時間（ｈ）インキュベートした。
上記抗生物質ペレットは、直径６ｍｍの高品質吸収紙製であり、抗生物質の種類によって約１〜３００マイクログラム（μｇ）濃度の抗生物質を含んでいた。
以下の実施例では、ｉ２ａ社（モンペリエ、フランス）、ＢＤ社（ベクトン・ディッキンソン、米国）、バイオ・ラッド社（ハーキュリーズ、米国）、ビオメリュー社（マーシー・レトワール、フランス）等の業者から販売されている、以下のコード及び用量：
ＡＭＸ（アモキシシリン）２５μｇ；ＡＭＣ（アモキシシリン−クラブラン酸）２０μｇ−１０μｇ；ＧＭ（ゲンタマイシン）１５μｇ；ＳＸＴ（トリメトプリム−スルファメトキサゾール）１．２５／２３．７５μｇ；ＴＩＣ（チカルシリン）７５μｇ；ＴＣＣ（チカルシリン−クラブラン酸）７５／１０μｇ；ＴＺＰ（ピペラシリン−タゾバクタム）７５／１０μｇ；ＣＡＺ（セフタジジム）３０μｇ；ＩＭＰ又はＩＰＭ（イミペネム）１０μｇ；ＣＯＬ（コリスチン）５０μｇ；ＦＯＸ（セフォキシチン）３０μｇ；ＶＡＮ（バンコマイシン）３０μｇ；ＴＥＣ（テイコプラニン）３０μｇ；ＣＬＩ又はＤＡ（クリンダマイシン）２μｇ；ＣＲＯ（セフトリアキソン）３０μｇ；ＣＩＰ（シプロフロキサシン）５μｇ；ＯＦＸ（オフロキサシン）５μｇ；ＣＴＸ（セフォタキシム）５μｇ；ＡＮ又はＡＫ（アミカシン）３０μｇ；ＴＭ（トブラマイシン）１０μｇ；ＦＯＸ（セフォキシチン）３０μｇ；ＡＴＭ（アズトレオナム）３０μｇ；ＥＲＴ（エルタペネム）１０μｇ；ＦＦ（ホスホマイシン）２００μｇ；ＤＯ（ドキシサイクリン）３０μｇ；Ｋ（カナマイシン）１０００μｇ；Ｌ（リンコマイシン）１５μｇ；ＬＮＺ（リネゾリド）１０μｇ；ＡＮ（ナリジクス酸）３０μｇ；ＮＯＲ（ノルフロキサシン）１０μｇ；ＰＴ（プリスチナマイシン）１５μｇ；ＲＡ（リファンピシン）５μｇ；及びＥ（エリスロマイシン）１５μｇを有する抗生物質を含有している標準ディスクを使用した。
より正確にいうと、上記寒天は以下の通り作製した。
・寒天に、懸濁液１ミリリットル（ｍＬ）を播種した。散布機を用いて、中心から端部へ表面全体に播種した。
・３〜５分乾燥させた。
・抗生物質ディスクを（端部から一定の最小距離で）皿の底に置いた。ペレット数と同じ数だけ皿を分画して（９０ｍｍ皿に円形で最大６個、あるいは１２０ｍｍ皿に最大１６個）、すなわち、等間隔で、丸皿の場合は２．５ｃｍ間隔で円形に、角皿の場合は３ｃｍ間隔の格子状に、配置した。
・３７℃で１８時間〜２４時間インキュベートした。
（２）アンチバイオグラムの読み取り及び判定
インキュベート期間後、抗生物質ディスクの周囲に円が現れる。これらの領域は細菌増殖に対する阻止円直径に相当する。寒天上に存在する各抗生物質について、抗生物質の濃度勾配により、上述のように増殖が阻害される領域が存在する。黒背景で写真を撮影するため阻止円は暗く見え、細菌が増殖していない領域でコントラストが最大となる。
標準細菌の標準表現型の標準画像データベースを構成するのに好適な標準アンチバイオグラム群を作成するために、円の直径を手動で測定し、以下の表Ａ等の表及びグラフを用いて判定した。
（２．１）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉを例とした場合、例えば、各種のカルバペネム類（イミペネム等）に対する感受性を見出すことが望ましい。また、以下の表には、ＥＵＣＡＳＴ［１］及びＣＡ−ＳＦＭの推奨が記載されている。
表Ａ
Figure 0006626508
抗生物質の用量が１０μｇの場合、臨界直径（ｍｍ）は１６ｍｍ未満且つ２２ｍｍ以上となる。これは、直径が２２ｍｍ以上である場合、株はイミペネムに対して感受性を有しており、直径が１６ｍｍ以上２２ｍｍ未満の場合、株は当該抗生物質に対して中間の感受性を有しており、直径が１６ｍｍ未満の場合、株はイミペネムに対して耐性を有していることを意味する。
（２．２）従って、以下の表Ｂに示した２０６個の標準細菌試料及び抗生物質濾紙（６種の異なる抗生物質を含む濾紙６個）を使用し、以下の表Ｃ１に示した標準表現型を有する標準細菌試料群を作製した。
表Ｂ
Figure 0006626508
表Ｃ１は、試験した標準細菌種の、抗生物質に対する耐性又は感受性に相当する種々の標準表現型を示す。
・表現型及び抗生物質コードは上述したものである。
・Ｓ：上記ペレットに含有される抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して感受性を有し、ペレットを囲む阻止円の直径は、低臨界濃度に相当する直径より大きい。
・Ｒ：上記ペレットに含有される抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して耐性を有し、ペレットを囲む阻止円の直径は、高臨界濃度に相当する直径より小さい。
・Ｉ：上記ペレットに含有される抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対して中間であり、ペレットを囲む阻止円の直径は、低臨界濃度と高臨界濃度とに相当する臨界直径の間である。
上記データベースは、表Ｃ１に示した抗生物質化合物６種の濃度に対する耐性（Ｉ、Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する標準細菌種の標準表現型を含んでいる。
表Ｃ１
Figure 0006626508
表Ｃ１のペレットは、表中左側の列から右側の列へ、円形に時計回りとなるように、アンチバイオグラム上に順次配列した。
ＢＳＢＬ表現型は、（表中、全てのＢＳＢＬ細菌に対して）セフトリアキソンとクラブラン酸、すなわちＣＲＯとＴＣＣ又はＡＭＣとの相乗表現型を含んでいる。
（２．３）本発明者らは、上記ソフトが、より多くの抗生物質を有する角皿に作成したアンチバイオグラムをも認識できることを確認した。本発明者らは、以下に示すペレット１６個のアンチバイオグラムを２５個作成した。
ＡＭＸ ２５μｇ；ＡＭＣ ２０μｇ−１０μｇ；ＧＭ又はＧＥＮ １５μｇ；ＳＸＴ １．２５μｇ／２３．７５μｇ；ＴＩＣ ７５μｇ；ＴＣＣ ７５μｇ／１０μｇ；ＩＭＰ又はＩＰＭ １０μｇ；ＣＯＬ ５０μｇ；ＣＲＯ ３０μｇ；ＣＩＰ ５μｇ；ＯＦＸ ５μｇ：ＣＴＸ ５μｇ；ＡＮ又はＡＫ ３０μｇ；ＴＯＢ １０μｇ；ＦＯＸ ３０μｇ；ＡＴＭ ３０μｇ；ＣＬＩ又はＤＡ ２μｇ、３０μｇ、３０μｇ；ＶＡ又はＶＡＮ ３０μｇ；ＦＦ ２００μｇ；Ｅ １５μｇ；ＮＴ又はＦＵＲ ３００μｇ；ＰＴ １５μｇ；ＴＥＣ ３０μｇ；ＬＮＺ １０μｇ
上記データベースは、以下の表Ｃ２に示した１６種の抗生物質に対する耐性（Ｉ／Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する以下の標準表現型又は標準細菌種を含む。なお、各群について、上記ペレットは、右側の第１行から下記の順番で、４化合物の４行が、列状に配列された格子状に配置した。
表Ｃ２
Figure 0006626508
１６個のペレットを用いた上記標準表現型は、より具体的には、敗血症等のいわゆる「深部」感染症に有用である。
（３）標準画像群、及びアンチバイオグラム写真画像の比較による本発明に係る判定
（３．１）Ｓｃａｎ（登録商標）１２００Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅスキャナ（参照番号：４３７ ０００、ＩＮＴＥＲＳＣＩＥＮＣＥ社、フランス）を備えた画像キャプチャ装置で写真を撮影した。
撮影対象の皿を内部に配置した高解像度スキャナを用いて、標準化した方法で画像を撮影した。写真の明るさ、高さ、及びピクセルで表した画質は常に同じとした。各写真は以下の条件で撮影した。
・平坦な黒背景
・同じ照明／同じ明るさ（ソフトにより自動調整）、６組の白色光セットを黒背景の下及び／又は上に配置
・同じ画像キャプチャ装置（Ｓｃａｎ（登録商標）１２００Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、参照番号：４３７ ０００）
・同じ距離：１０ｃｍ
・同じ目盛：１．５〜３
これにより、解像度が少なくとも１２８０×９６０ピクセルの写真を得た。
（３．２）本発明者らは、まず、抗生物質の数を少ない値（例えば、最も一般的な細菌に対して皿一枚で抗生物質６種）に限定して、その数を標準化しようとした。そのため、自動化できるように、多数の試料に対する本方法の再現性及び繰り返し精度を試験した。そのために、あらゆる結果の写真を撮影し、画像のデータ群を構築した。これら多数の写真をそれぞれ比較し、各表現型の写真が、別々のものでありながら相互に認識可能と思われることを偶然発見した。すなわち、アンチバイオグラムの阻止円直径を直接測定することなく、またＥＵＣＡＳＴ判定データを用いてそれらを判定する必要なしに、アンチバイオグラムの一般画像に基づいて、細菌の表現型を認識でき得ることを発見した。
そして、本発明者らは、自動画像認識ソフトを用いてこの認識を確認しようとした。そのために、オンラインでダウンロード可能な画像認識ソフトＸｎＶｉｅｗ（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ＸｎＶｉｅｗ．ｃｏｍ／ｆｒ／、Ｇｏｕｇｅｌｅｔ Ｐｉｅｒｒｅ−Ｅｍｍａｎｕｅｌ、１０ ｒｕｅ Ｒｅｎｅ ｄｅ Ｃｈａｔｅａｕｂｒｉａｎｄ、Ｌａ Ｎｅｕｖｉｌｅｔｔｅ ５１１００、ランス、フランス）を使用した。このソフトによれば、画像群のディレクトリを生成し、ソフトがインストールされたコンピュータ上で、類似した画像を的を絞って（ｄｅ ｍａｎｉｅｒｅ ｃｉｂｌｅｅ）（異なるディレクトリ内で）、又はコンピュータの全てのストレージ内を検索できる。従って、上記ソフトは、当該検索に関係のない画像で「妨害」されることがない。
また、上記ソフトによれば、ある写真と、比較した画像群内の写真との類似率が得られる。各写真はスキャンした葉に相当する。葉は、白背景に緑の葉（ｄｅｓ ｆｅｕｉｌｌｅｓ ｖｅｒｔｅｓ）を得るために、また葉を容易に区分けするために、スキャナでスキャンした。その後、画像の色をグレースケールに変換した。画像の二値輪郭を逐次解析によりトレースした。ピクセルが見つかった場合、ソフトはその点に最も近い境界を検索し、輪郭のみを識別する。画像の最も長い境界線のみを考慮し、２つの対象間の他の境界線及び穴はノイズとみなされる。
図１Ａ及び１Ｂに示す通り、ある表現型と別の表現型とでは阻止円の直径のみが異なっており、それによってアンチバイオグラム全体像の輪郭も変化するため、このソフトはアンチバイオグラム写真を認識するのに好適であることが分かった。従って、上記ソフトによれば、各種の阻止円直径を間接的に認識でき、アンチバイオグラム画像全体を比較することで、その表現型を判定できる。
上記画像認識ソフトは、分析用アンチバイオグラム写真を、標準アンチバイオグラムから作成した画像群の標準画像と比較する。実務上は、類似率（類似度）が少なくとも７０％である株の写真を認識することができ、もし存在していれば、試験試料に相当する標準表現型が得られる。ある画像について、上記ソフトにより、標準画像に対する類似率が少なくとも７０％であると認識された場合、その細菌は標準画像と同じ表現型を有することを意味しており、従って、上記ソフトはその表現型を提供することになる。
植物が有する葉の写真等の画像を認識して植物種を推定するために開発された他のソフト（Ｐ．Ｎｏｖｏｔｎｙ，Ｔ．Ｓｕｋ（２０１３），Ｌｅａｆ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｏｆ ｗｏｏｄｙ ｓｐｅｃｉｅｓ ｉｎ ｃｅｎｔｒａｌ Ｅｕｒｏｐｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．）でも、前もって構築しておいた既存データ群内で見つかる写真と比較してアンチバイオグラム写真を認識できる。より具体的には、このソフトによれば、葉を用いて、ある種の葉の写真を複数枚含む葉のデータ群を参照することで、木種を認識できる。これは、輪郭の内外にある要素は一切考慮に入れず、葉の輪郭のみを比較して実施できる。また、輪郭形状の類似性に基づいて木種が決定される。
確認中に、表現型だけでなく推奨される治療法も自動で提示されるので、臨床家は全てのデータを入手できる。
従って、例えばＥ．ｃｏｌｉの場合、本発明者らは、Ｅ．ｃｏｌｉから臨床的に単離した４２株のアンチバイオグラム写真から写真ディレクトリを作成することから始めた。これら４２枚の写真から、各表現型に対して数枚を選択した。各写真には、その表現型に従って新たな名称を与え、その標準表現型と類似した他の表現型を認識できるかどうかソフトに要求し、また、どの程度の類似率から、ソフトが表現型の認識を間違え始めるかを確認した。
類似率を５％刻みで少しずつ減少させたところ、異なるアンチバイオグラムであるが同じ表現型の写真をソフトが間違いなく認識できる最小類似率は７０％であることが分かった。
図２Ａ〜図２Ｃは、画像認識ソフトＸｎＶｉｅｗが、ＢＳＢＬ表現型Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の正しい表現型を以下の類似率で提示できることを示す。
・図２Ａ及び図２Ｂの画像間で１００％。
・図２Ａ及び図２Ｃの画像間で８７％。
図２Ｄ及び２Ｅは、画像認識ソフトＸｎＶｉｅｗが、セファロスポリナーゼ表現型Ｅ．ｃｏｌｉ細菌の正しい表現型を以下の類似率で提示できることを示す。
・図２Ｄ及び図２Ｅの画像について７４％。
・図２Ａ及び図２Ｄの画像間で６５％。ＢＳＢＬに対してＡＭＸとＴＣＣとの間で相乗帯が存在している（図２Ａ〜図２Ｃ）一方、セファロスポリナーゼ表現型に対してはＡＭＸとＴＣＣとの間で相乗帯は存在していないので、これらは本質的に異なる。
図３Ａ及び３Ｂは、上記ソフトが、様々な表現型のＥ．ｃｏｌｉ試料４２個の写真４２枚で構成されたデータベースから、Ｅ．ｃｏｌｉ細菌について同じ「高レベルペニシリナーゼ」表現型を示すアンチバイオグラム写真を８０％の類似率で認識できることを示す。
図４Ａ及び４Ｂは、２つのＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ株のアンチバイオグラム写真である。図４Ａの株（野生型株）は試験した全ての抗生物質に対して感受性を有しており、図４Ｂの株は全ての抗生物質に対して耐性を有している。
図５は、２種の抗生物質間における相乗メカニズムを示す相乗効果画像により、非常に具体的な耐性メカニズムを判定できることを示す。
図５中、広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＢＳＢＬ）抗生物質に対する耐性メカニズムを有するＥ．ｃｏｌｉ細菌は、特定の２種の抗生物質セフトリアキソン（β−ラクタムファミリーの第３世代セファロスポリン）とアモキシシリン＋クラブラン酸の組み合わせ（アモキシシリンはアミノペニシリン＋β−ラクタム阻害剤）との間で相乗効果を示している。このような相乗効果は、並べて配置した、株に対して通常は耐性である抗生物質の二つのペレット間で「シャンパンコルク」形の小さい阻止帯が現れるため、寒天上で直接観察できる。アンチバイオグラムの全体像を認識することで、２種の抗生物質間におけるこのような相乗メカニズムを識別できる。
本発明者らは、上記ソフトにより、角皿で作成した、多数の抗生物質を含むアンチバイオグラムを認識できることを確認した。本発明者らは、それぞれ上記した各種の表現型を有する１６ペレットのアンチバイオグラムを２５個作成した。
図６Ａ及び６Ｂは、上記ソフトが、各表現型を示すＫ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ試料９個の写真９枚で構成されたデータベースから、Ｋ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ細菌について同じ表現型（「セファロスポリナーゼ＋アミノグリコシド類耐性及びコトリモキサゾール耐性」）を示すアンチバイオグラム写真を８８％の類似率で認識できることを示す。
上記ソフトは、ある写真について、少なくとも７０％の類似率で、同じ表現型を有する同じ標準細菌の写真として認識できる。
この程度の類似率であれば、ディスク上に記載された色、抗生物質コードの文字及び濃度用量の数字と、円画像の輪郭とを確実に認識できる。寒天に播種された抗生物質は、それぞれ識別用の２文字又は３文字のコード（その名称の略号に相当する）を有しており、それによって、寒天上の抗生物質が正しい抗生物質であることを確認できる。また、抗生物質の用量も記載されている。例えば、イミペネムディスク上には「ＩＰＭ １０μｇ」というコードが確認できるが、これは１０μｇ用量のイミペネムディスクに相当する。最後に、上記ソフトは、円状又は正方形状のペレット配置が正しいことを認識する。
画像の輪郭と形状とは、二つの異なるものである。画像の形状は画像の全体的な形状を表す一方、本明細書中における画像の輪郭とは、図１Ａ及び１Ｂに示す通り、画像の単一部分、例えば阻止帯の輪郭のみを意味する。
同じ表現型でも直径が異なる場合があることを考慮すると（上記を参照。例えば、１６〜２２ｍｍの範囲であればＩ、１６超であればＲ、２２ｍｍ超であればＳとする場合。）、たとえ直径が少し異なる場合であっても、データベース内の同じ表現型に対する標準画像の数が多いほど、判定を変更することなくその表現型の認識度は良好となる。
公知画像のデータ群に基づき、上記ソフトは、データ群内の画像の量に関係なく最も類似した画像を同時に高速で検索できる。また、上記ソフトは、分析レポート及び各種の推奨される治療方法（専門部会の推奨に基づくコメント等）と共に、完全な判定を自動で生成できる。
上記ソフトの使用には、以下の工程：
（ａ）分析用アンチバイオグラム写真を含むファイルを選択する工程；
（ｂ）ツールメニューから「類似のファイルを検索」を選択して、画像認識を開始する工程；
（ｃ）分析用画像と比較するための標準画像群を含むファイルを選択する工程；及び
（ｄ）類似率（例えば類似率７３％）を特定する工程
が含まれる。
比較は以下のようにして実施した。すなわち、各画像ペアについて類似率を算出し、この値が最小許容値である７３％より大きければ、このペアは類似していて二つの画像は同じ標準表現型に属すると考えられる。
標準画像群は、ヒトで頻繁に見られる全ての細菌、すなわち約２００種の細菌、あるいは全ての細菌（ヒトにおいて少なくとも一度は単離された約２０００種）にまで拡張してもよい。
標準画像を追加すると、所定の表現型に対する判定が向上し、類似率閾値も上昇する。

Claims (17)

  1. 分析用微生物試料のアンチバイオグラムを自動的に分析及び判定する方法であって、
    該方法は、少なくとも１種の抗菌性化合物に対する耐性又は感受性の表現型を決定し、該表現型は、複数の異なる標準微生物種中の各標準微生物種に対する複数の異なる標準表現型から選択されるものであり、
    （ａ）分析用微生物試料のアンチバイオグラムを所定の方法論で固体培地に作製する工程であって、該方法論が、
    ・前記微生物試料の所定の濃度を前記固体培地に播種し、
    ・それぞれ所定の抗菌性化合物１種（又は複数種）を所定の濃度で含有している基質であって、ｎ個の基質それぞれについて異なる１種以上の所定の抗菌性化合物を拡散させることができる、所定の配列及び形状を有する基質の所定の個数ｎ（ｎは複数）を前記固体培地に配置し、及び、
    ・前記固体培地に播種した前記微生物試料を所定の条件及び期間培養する、を含む工程、
    （ｂ）前記工程（ａ）で得られたアンチバイオグラムの写真画像を入手する工程、及び
    （ｃ）画像認識ソフトを使用して、前記工程（ｂ）で得られた写真画像と、標準アンチバイオグラムの標準画像で構築されたデータベース内にある前記標準画像とを比較することで、前記分析用微生物試料の表現型を決定する工程であって、前記データベースは、少なくともｐ個（ｐは複数）の異なる標準画像を含んでおり、該標準画像は、各標準微生物種の各標準表現型に対する、同じ微生物の異なるｐ個の株のアンチバイオグラム画像である工程、
    を含む方法。
  2. 前記工程（ｃ）において、前記標準アンチバイオグラムは、全て前記分析用アンチバイオグラムと同じ方法論で作製され、前記標準画像及び分析用画像は、同じ写真画像キャプチャ装置を用いて、同じ条件下で撮影されたものであることを特徴とする請求項１に記載の方法。
  3. 前記基質はｎ個（ｎは複数、ｎ＝５〜２０）使用し、前記データベースは少なくともｐ個（ｐは複数）の異なる標準画像を含んでおり、該標準画像は、同じ微生物のｐ個の異なる株のアンチバイオグラム画像であって、ｐは５以上であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記工程（ｃ）において、前記画像認識ソフトは、基質の周囲の阻止帯に相当する円の輪郭形状を比較するために使用されることを特徴とする請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
  5. 前記工程（ｃ）において、前記画像認識ソフトは、抗生物質ペレットに記載された抗生物質コードの文字及び用量の数字を比較するために使用されることを特徴とする請求項４に記載の方法。
  6. 分析用画像と標準画像との最小許容類似率（以下、類似率閾値という）を決定し、
    前記認識ソフトが、分析用細菌試料のアンチバイオグラム画像と、前記標準細菌種の前記標準表現型に対応する標準画像との類似率が最小許容類似率閾値以上であると評価した場合、前記分析用試料の細菌は前記標準細菌の前記標準表現型を示していると判定することを特徴とする請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 前記最小許容類似率閾値が少なくとも７０％である、請求項６に記載の方法。
  8. 各標準細菌種の各標準表現型に対するｐ個の異なる株の異なるアンチバイオグラム標準画像間における最小類似率閾値（以下、標準類似率閾値という）、及び各標準細菌種の各標準表現型に対する標準画像のうち最も異なる２画像間の最低類似率に相当する標準類似率閾値を決定し、
    前記認識ソフトが、分析用細菌試料のアンチバイオグラム画像と、前記標準細菌種の前記標準表現型に対応する標準画像との類似率が標準類似率閾値以上であると評価した場合、前記分析用試料の細菌は前記標準細菌の前記標準表現型を示していると判定することを特徴とする請求項１〜７のいずれか１項に記載の方法。
  9. 前記標準表現型は、所定の抗生物質又は抗生物質の組み合わせに対する耐性又は感受性を有する分類であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  10. 前記標準表現型は、複数の抗生物質及び／又は抗生物質の組み合わせに対する耐性又は感受性を有する分類であることを特徴とする請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
  11. 前記標準表現型は、２種の抗生物質間の相乗表現型を含み、前記２種の抗生物質は、別々に摂取した場合は標準細菌が耐性を有する一方、組み合わせて摂取した場合は標準細菌が感受性を有するような２種の抗生物質に相当することを特徴とする請求項９に記載の方法。
  12. 前記標準細菌種は、少なくとも大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、クレブシエラ・ニューモニエ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）、プロテウス・ミラビリス（Ｐｒｏｔｅｕｓ ｍｉｒａｂｉｌｉｓ）、クレブシエラ・オキシトカ（Ｋｌｅｂｓｉｅｌｌａ ｏｘｙｔｏｃａ）、エンテロバクター・クロアカエ（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｃｌｏａｃａｅ）、エンテロバクター・アエロゲネス（Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ ａｅｒｏｇｅｎｅｓ）、エンテロコッカス・フェカリス（Ｅｎｔｅｒｏｃｏｃｃｕｓ ｆａｅｃａｌｉｓ）、緑膿菌（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ）、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）及び表皮ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ）から選択されることを特徴とする請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法。
  13. 前記アンチバイオグラムは、それぞれ以下の略号を有する抗生物質：
    アモキシシリン（ＡＭＸ）；アモキシシリン−クラブラン酸（ＡＭＣ）；ゲンタマイシン（ＧＥＮ）；トリメトプリム−スルファメトキサゾール（コトリモキサゾール）（ＳＸＴ）；チカルシリン（ＴＩＣ）；チカルシリン−クラブラン酸（ＴＣＣ）；ピペラシリン−タゾバクタム（ＴＺＰ）；セフタジジム（ＣＡＺ）；イミペネム（ＩＭＰ）；コリスチン（ＣＯＬ又はＣＬ）；セフォキシチン（ＦＯＸ）；バンコマイシン（ＶＡＮ又はＶＡ）；テイコプラニン（ＴＥＣ）；クリンダマイシン（ＣＬＩ又はＤＡ）；セフトリアキソン（ＣＲＯ）；セフェピム（ＦＥＰ）；リンコマイシン（Ｌ又はＬＩＮ）；ニトロフラントイン（ＦＵＲ又はＮＴ）；シプロフロキサシン（ＣＩＰ）；オフロキサシン（ＯＦＸ）；セフォタキシム（ＣＴＸ）；アミカシン（ＡＫ又はＡＮ）；トブラマイシン（ＴＯＢ又はＴＭ）；セフォキシチン（ＦＯＸ）；アズトレオナム（ＡＴＭ）；エルタペネム（ＥＲＴ）；ホスホマイシン（ＦＦ又はＦＯＳ）；ドキシサイクリン（ＤＯＩ）；カナマイシン（Ｋ）；リンコマイシン（Ｌ又はＬＩＮ）；リネゾリド（ＬＮＺ）；ナリジクス酸（ＮＡ）；ノルフロキサシン（ＮＯＲ）；メトロニダゾール（ＭＥＴ）；メロペネム（ＭＥＭ）；プリスチナマイシン（ＰＴ）；ペニシリンＧ（Ｐ）；リファンピシン（ＲＡ）；チゲサイクリン（ＴＧＣ）；テリスロマイシン（ＴＥＬ）；エリスロマイシン（Ｅ）；及びオキサシリン（ＯＸ又はＯＸＡ）
    を含むペレットを用いて形成されることを特徴とする請求項１〜１２のいずれか１項に記載の方法。
  14. 前記標準表現型は、耐性を有する分類であるか、少なくとも以下の表現型：
    表現型「野生型」、
    表現型「低レベルペニシリナーゼ」、
    「阻害剤耐性ペニシリナーゼ」といわれる表現型、
    表現型「高レベルペニシリナーゼ」、
    表現型「広域スペクトルβ−ラクタマーゼ（ＢＳＢＬ）」、
    表現型「高レベルセファロスポリナーゼ」、
    表現型「カルバペネマーゼ」、
    表現型「イミペネム選択透過性」、
    表現型「メチシリン耐性」、
    表現型「フルオロキノロン類耐性」、
    表現型「アミノグリコシド類耐性」、
    表現型「マクロライド類耐性」、
    表現型「コトリモキサゾール耐性」、
    表現型「リファンピシン耐性」及び
    「非定型」として知られる表現型
    から選択されることを特徴とする請求項１〜１３のいずれか１項に記載の方法。
  15. 分析した前記アンチバイオグラム及び／又は前記データベースは、下記群（ａ１）〜（ａ６）：
    （ａ１）ＡＭＸ、ＡＭＣ、ＴＣＣ、ＣＲＯ、ＦＥＰ及びＩＭＰ，
    （ａ２）ＡＭＸ、ＡＭＣ、ＴＺＰ、ＣＲＯ、ＦＥＰ及びＩＭＰ，
    （ａ３）ＡＭＣ、ＴＺＰ、ＣＲＯ、ＦＥＰ、ＩＭＰ及びＣＯＬ，
    （ａ４）ＡＭＸ、ＧＥＮ、ＬＩＮ、ＦＵＲ、ＶＡＮ及びＴＥＣ，
    （ａ５）ＴＩＣ、ＴＣＣ、ＴＺＰ、ＦＥＰ、ＣＡＺ及びＩＭＰ、並びに
    （ａ６）ＦＯＸ、ＣＬＩ、ＳＸＴ、ＧＥＮ、ＶＡＮ及びＴＥＣ
    から選択された抗生物質化合物６種の濃度に対して耐性（Ｉ、Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する標準細菌種の標準表現型を含み、
    各群について、上記した順番で円状に配置されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  16. 分析した前記アンチバイオグラム及び／又は前記データベースは、下記群（ｂ１）及び（ｂ２）：
    （ｂ１）ＣＩＰ、ＯＦＸ、ＴＩＣ、ＣＯＬ、ＩＭＰ、ＣＴＸ、ＴＣＣ、ＡＫ、ＳＸＴ、ＡＭＣ、ＣＲＯ、ＴＯＢ、ＡＭＸ、ＡＴＭ、ＦＯＸ及びＧＥＮ、並びに
    （ｂ２）ＳＸＴ、ＤＡ、ＦＯＸ、ＯＸＡ、ＰＴ、ＧＥＮ、ＣＩＰ、ＲＡ、ＴＥＣ、ＶＡＮ、ＬＮＺ、ＴＯＢ、Ｅ、ＤＯ及びＮＴ
    から選択された抗生物質化合物１６種に対して耐性（Ｉ／Ｒ）又は感受性（Ｓ）に相当する標準細菌種の標準表現型を含み、
    各群について、これらのペレットは右側の第１行から上記の順番で、４化合物の４行が列状に配列された格子状に配置されていることを特徴とする請求項１３に記載の方法。
  17. 前記工程（ａ）において、前記標準アンチバイオグラム及び前記分析用細菌試料のアンチバイオグラムは、ミューラー・ヒントン寒天型の固体培地で所定の方法論を用いて作製され、前記方法論は、
    円状又は格子状に配置した、抗生物質濃度が１０〜３００μｇであるディスク状のペレットをｎ個（ｎ＝６〜１６）、
    濁度がマクファーランド範囲の標準液番号で０．５となる沈殿懸濁液に相当する、前記固体培地に播種した分析用試料又は標準試料の所定の細菌濃度（ＣＦＵ／ｍＬ）、及び、
    所定の培養条件及び時間が３７℃で１８〜２４時間である
    ことを特徴とする請求項１〜１６のいずれか１項に記載の方法。
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