CN107002115B - 分析和解释抗微生物敏感性测试的自动化方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于解释抗微生物敏感性测试的不同图像的方法。根据所述方法，可以通过使用参照抗微生物敏感性测试的照片图像库比较照片，来识别抗生素抗性表型，而不需要根据EUCAST或CA‑SFM解释数据解释所述图像；条件是对于给定的表型，可获得相同菌种的几种细菌的照片集合以及可获得相同表型。

Description

分析和解释抗微生物敏感性测试的自动化方法

技术领域

本发明涉及在化学微生物学领域中用于自动化读取和解释微生物对抗微生物剂的敏感性的测试的方法。

背景技术

本发明可主要在细菌学中用于细菌对抗生素的敏感性的测试，该测试被称为“抗菌谱(antibiogrammes)”，以及在感染性疾病的研究中的其它领域，比如真菌对抗真菌剂的敏感性的显微测试，该测试可以称为抗真菌谱。

在本说明书中，术语“抗菌谱”用作测试细菌针对抗生素化合物和测试真菌针对抗真菌化合物的总称。

抗菌谱是一种实验室技术，试图通过评估细菌生长被抑制的程度来测试细菌菌株对一种或多种潜在或已知抗生素的敏感性。原理在于在一种或多种抗生素的存在下，放置细菌培养物并观察培养物的发育和存活的结果。为此，例如可以将多个抗生素浸渍的薄片放置在沉积在固体培养介质上的细菌菌株上。然后，抗生素从薄片扩散，由此在薄片周围产生浓度梯度，其生长抑制区域对于裸眼是可见的，如果细菌对抗生素敏感，则薄片周围出现暗圆环的形式。根据构成抗生素薄片的盘周围的抑制区域的圆的直径，存在三种类型的解释：菌株或细菌可以是敏感的、中等的或抗性的。

这种薄片及其不同剂量的抗生素根据欧洲抗微生物敏感性测试委员会(EuropeanCommittee on Antimicrobial Susceptibility Testing，EUCAST)：www.eucast.org[T.Winstanley,P.Courvalin(2011),"Expert systems in clinical microbiology"Clin.Microbiol.Rev.24:pp.515-556.24/3/515[pli]；10.1128/CMR.00061-101,andR.Leclercq,R.Canton,D.F.Brown,C.G.Giske,P.Heisig,A.P.MacGowan,J.W.Mouton,P.Nordmann,A.C.Rodloff,G.M.Rossolini,C.J.Soussy,M.Steinbakk,T.G.Winstanley,and G.Kahlmeter(2013),"EUCAST Expert rules in antimicrobial susceptibilitytesting"Clin.Microbiologie Infect.19:141-160.10.1111/j.1469-0691.2011.03703.x]和/或法国微生物学会的法国抗菌素委员会(French Comitéde l'Antibiogramme de la Société

de Microbiologie，CA-SFM):www.sfm-microbiologie.org专家系统的建议进行标准化。抗生素薄片由基底材料制成，所述基底材料含有已知浓度的抗生素，并且适合扩散抗生素，比如浸渍有已知浓度的抗生素的吸水纸，依据抗生素，所述浸渍的抗生素大约范围在1微克(μg)至500微克，并且它们由供应商i2a(Montpellier,法国)、BD(Becton Dickinson,美国)、Bio-Rad(Hercules,美国)、Biomerieux(Marcy l'Etoile,法国)销售。

在固相琼脂上用于进行抗菌谱的各种抗生素薄片带有缩写形式的抗生素的名称，以在薄片的顶面标记一到三个字母代码的形式标准化。

结果的读取基本上由测量圆环(微生物菌株的生长被抑制的区域)的直径组成。抑制直径越大，细菌对被测试抗生素的敏感性越高，反之亦然。确定薄片的剂量以便获得圆环直径，所述圆环直径与所讨论的抗生素对被测试细菌的最小抑制浓度(CMI)成比例。

抑制直径以毫米(mm)计，用尺子手工测量或通过使用能够自动读取直径的读数器测量。自动读数器包含扫描仪，其具有照相机和抗生素薄片和位于这些盘周围的抑制区域的探测器。

通过扩散在琼脂介质上进行的抗菌谱，根据EUCAST和/或CA-SFM专家系统的建议解释。

为了解释的目的，存在作为细菌和抗生素的函数的各种表格或图表，其中出现分别为低和高的临界浓度，以及对于在薄片中给定浓度的所述抗生素，分别为大和小的抑制区的临界直径。相对于每种细菌，每种抗生素呈现：

·低临界浓度(和大的临界直径)，低于该临界浓度(和相应地大于临界直径)，细菌被认为对给定抗生素敏感(其中敏感性用字母S标记)；和

·高临界浓度(和小的临界直径)，高于该临界浓度(和相应地小于临界直径)，细菌被认为对给定抗生素具有抗性(其中抗性用字母R标记)；和

·在这两个浓度之间，细菌被认为是中等的(用字母I标记)。

因此，每种细菌相对于每种抗生素通过字母S、I或R表征。为了知道细菌是否对给定的抗生素家族有抗性，通常认为为了发现其谱，仅测试该家族的一个成员是足够的。因此，测量抑制直径使得可以解释抗生素治疗分类。然而，在对各种抗生素的抗性或敏感性方面，单一家族的抗生素不足以发现细菌的完整表型。这就是为什么在抗菌谱中，通过放置含有不同分类或家族或亚家族的抗生素的多个薄片来测试多种抗生素，以获得对各种抗生素家族或亚家族的抗性或敏感性表型。

抗菌谱使医生能够选择合适的抗生素或抗生素组合以有效地治疗患者。

为了能够发现给定细菌菌株的完整表型，因此有必要测试属于不同治疗分类或家族或亚家族的不同抗生素，其最常见的抗性机制是已知的。与下列每个家族或亚家族相关的主要抗生素(其代码在括号中)如下所列：

1)家族：B-内酰胺：

1.1)青霉素亚家族：

1.1.1)G组青霉素：青霉素G(P)，

1.1.2)青霉素M：苯唑西林(OX或OXA)

1.1.3)A组青霉素或氨基青霉素：阿莫西林(AMX)和氨苄青霉素(AM)；

1.1.4)具有非常广谱抗菌活性的青霉素：

·β-内酰胺酶抑制剂：阿莫西林+克拉维酸组合(AMC)

·羧基青霉素：替卡西林(TIC)，替卡西林+克拉维酸组合(TCC)

·脲基青霉素：哌拉西林+他唑巴坦组合(TZP)，

1.2)头孢菌素亚家族：

1.2.1)第一代头孢菌素：头孢噻吩(CF)

1.2.2)第二代头孢菌素：头孢西丁(头孢霉素类型)(FOX)，头孢呋辛(CXM)

1.2.3)第三代头孢菌素：头孢曲松(CRO)，头孢噻肟(CTX)，头孢他啶(CAZ)，

1.2.4)广谱的第四代头孢菌素：头孢吡肟(FEP)，头孢匹罗(CPO)

1.3)单酰胺菌素亚家族：氨曲南(aztréonam，ATM)

1.4)碳青霉烯亚家族：亚胺培南(IMP或IPM)和厄他培南(ERT)

2)喹诺酮家族：

2.1)第一代喹诺酮：萘啶酸(NA)，

2.2)氟喹诺酮类型的第二代喹诺酮：环丙沙星(CIP)，氧氟沙星(OFX)，培氟沙星(PEF)，左氧氟沙星(LVX)，莫西沙星(MXF)，诺氟沙星(NOR)

3)氨基糖苷(aminosides)家族：庆大霉素(GEN或GM)，阿米卡星(AK或AN)，妥布霉素(TOB或TM)，卡那霉素(K)

4)利福霉素家族：利福平(RA)

5)糖肽家族：万古霉素(VA或VAN)和替考拉宁(TEC)，

6)磺酰胺和二氨基嘧啶家族：甲氧苄啶+磺胺甲恶唑组合＝磺胺甲基异恶唑(SXT)

7)大环内酯家族：红霉素(E)，泰利霉素(TEL)

8)林可酰胺家族：林可霉素(LIN)和克林霉素(CLI或DA)

9)协同菌素(synergistines)或链阳性菌素家族：普那霉素(PT)

10)四环素家族：多西环素(DO或TE)

11)环多肽或多粘菌素家族：粘菌素(COL或CS)

12)呋喃家族：硝基呋喃-呋喃(FT)，呋喃妥因(FUR或NT)

13)氯霉素家族：氯霉素(C)

14)梭链孢酸家族：梭链孢酸(FA)

15)膦酸抗生素家族：磷霉素(FF或FOS)

16)恶唑烷酮家族：利奈唑胺(LNZ)

17)环脂肽家族：替加环素(TGC)

如官方协会比如上述CA-SFM或EUCAST发布的，通过使用对应于含有确定浓度的抗生素或确定的抗生素组合的薄片的临界浓度，指定不同细菌的临界直径的数据的表格或图表来解释结果，是冗长和复杂的并且代表主要限制的方法。

在现有技术(1-6)中，已知用于分析抗菌谱的各种自动技术，其包括获得在基底比如薄片中抗生素周围的扩散盘区域的图像，使用软件计算所述扩散区域的直径，并与通过使用模板的标准方法获得的参照直径进行比较(由国家临床实验室标准委员会(NCCLS)指定的方法)。

发明内容

本发明的目的是提供一种更简单地进行并且更可靠的方法，使得可以避免使用CA-SFM或者甚至EUCAST指定的标准逐个读取和解释薄片周围的抑制区域的圆环的直径。

在本发明中已经发现，不同抗菌谱的图像可以是表型的表征，并且通过使用参照抗菌谱的照片图像库比较照片，可以识别细菌相对于抗生素的抗性表型，而不需要应用EUCAST或CA-SFM解释数据对其进行解释；并且这适用于即使相同表型的不同照片的抗菌谱的两个整体图像的直径或形状可能不同；条件是对于给定的表型，可以获得相同菌种和相同表型的多种细菌的照片的集合。

更确切地说，为此，本发明提供了一种自动分析和解释分析的微生物样本优选细菌的抗菌谱的方法，所述方法用于确定对至少一种抗微生物化合物的抗性或敏感性的表型，优选对多种抗微生物化合物，优选对抗生素化合物，所述表型选自多种不同种类的参照微生物中的每种参照微生物种类的多种不同的参照表型，其中：

a)使用确定的方法，在固体培养介质上，制备分析的微生物样本的抗菌谱，优选属于所述参照微生物种类之一，所述方法包括：

·在所述固体培养介质上，沉积确定浓度的微生物，优选细菌(每毫米的菌落形成单位(CFU/mL))，沉积确定浓度的微生物的样本，优选细菌的样本；

·在所述固体培养介质上，沉积确定数量n的多个基底，优选n＝5至20，更优选n＝6至16，所述基底以确定的排列和确定的形式，优选以薄片的形式，每个含有确定浓度的确定的抗微生物化合物，并且对于所述n种所述基底中的每一种适合于扩散一种或多种不同的确定的抗微生物化合物；和

·在确定的条件下以及确定的持续时间，孵育沉积在所述固体培养介质上的微生物样本，优选范围35℃至37℃的温度下孵育18小时至24小时；和

b)获取在步骤a)中获得的抗菌谱的照片图像，优选使用包含扫描仪和照相机的照片图像捕获装置；和

c)通过使用图像识别软件将步骤b)中获得的照片图像与由所述参照图像组成的数据库中的参照抗菌谱的参照图像进行比较，确定分析的微生物优选细菌样本的所述表型，对于每种参照微生物种类的每种参照表型，所述数据库包含相同微生物的p种不同菌株的抗菌谱的至少p种不同参照图像中的多种，优选p不小于5，更优选p不小于10。

优选地，所有参照抗菌谱使用与分析的抗菌谱相同的所述方法制备。

优选地，所述参照图像和分析的图像是用相同的照片图像捕获装置和在相同条件下拍摄的，尤其是相同的距离、相同的亮度、相同的背景，优选平坦和黑色的背景，以及相同分辨率。

可以理解：

·使用与分析的抗菌谱相同的所述方法制备参照抗菌谱，包括薄片的数量、排列和形式以及细菌浓度和孵育条件，除了它们具有含抗生素化合物和/或抗生素化合物浓度的薄片，其中至少一些对于各种参照表型是不同的；和

·通过测量抗生素薄片周围的生长抑制区域的圆环直径，通过通常的标准方法手工确定在所述数据库中每种参照细菌菌种的不同参照菌株的参照表型，并使用给定的临界直径值的图表，临界直径值对应于所述薄片中给定浓度的抗生素的临界低浓度和临界高浓度，以使得所分析的样本的细菌能够分类为：

·如果薄片周围的抑制圆环的直径大于对应于低临界浓度的直径，则对在所述薄片中包含的抗生素或抗生素的组合敏感；

·如果薄片周围的抑制圆环的直径小于对应于高临界浓度的直径，则对在所述薄片中包含的抗生素或抗生素的组合具有抗性；和

·如果薄片周围的抑制圆环的直径在对应于低临界浓度和高临界浓度的临界直径值之间，相对于在所述薄片中包含的抗生素或抗生素组合是中等的；

·将步骤b)中获得的照片图像与所述参照图像进行比较，如果步骤b)中获得的照片图像与对应于参照细菌的菌种的所述参照表型的所述参照图像的图像相同，或者如果其与所述参照图像至少足够相似，使得可以确定分析的细菌样本的表型为参照细菌的菌种的所述参照表型。最小相似性百分比可以使用对应于相同参照细菌的菌种的相同表型的多个参照图像通过实验确定。

本发明的方法通过整体图像识别即刻进行，而不计算在解释抗菌谱的常规方法中手工完成的各种圆环直径。发明人已经发现，尽管抑制圆环直径可以在值的范围内变化，但是仍然属于相对于所讨论的抗生素的相同表型，在实践中，与相同的表型多个参照图像相组合分析多个区域或圆环，使得抗菌谱能够被正确地解释。

本发明方法的另一个优点是它可以自动检测，并且考虑在并排排列的两个不同薄片中含有的两种抗生素之间表现出“协同作用”的表型，并且两种抗生素通常相对于该菌株具有抗性。在琼脂上使用如下事实导致的抗生素在琼脂中扩散的方法产生协同作用，即，如果两种抗生素之间的距离足够小(革兰氏阴性菌在2厘米(cm)至2.5cm的范围内)，其能够在琼脂的共同部分上扩散，并且结果是两种抗生素在该特定位置的组合，这使得可能在适当时看到新的抑制区域的出现，该新的抑制区域是协同作用区域。

在发生协同作用的情况下，可以看到两种抗生素之间的协同作用的机制，因为通常在所讨论的两种抗生素之间出现另外的抑制区域。如果A和B存在相互协同作用，则它可以是以盘A周围的直径朝向盘B扩大的形式。这给出了在薄片A和B周围的两个圆环之间的大致椭圆形的抑制区，其被称为“香槟-软木塞”形状。可能在未来将发现新的协同作用；如果是新的，则可以使用本发明的方法检测协同作用图像的不相似性。

优选地，在步骤c)中，使用所述图像识别软件来比较对应于基底周围的抑制区域的圆环轮廓的形状，且优选还有抗生素薄片上指定的抗生素代码字母和剂量数字，以及更优选地，软件识别薄片排列的顺序。

这种类型的软件用于通过分析植物的叶的轮廓的图像来识别植物种类。还已知的是，名为XnView的图像识别软件，其可以免费访问并在以下描述，并且尤其适用于本发明，因为它因此适应于确定表征的变化，即，各种圆环的各种直径可能以协同作用区域的形式在它们之间的任一侧重叠。

更具体地，确定分析的图像和参照图像之间的最小可接受的相似性百分比，下文称为相似性阈值，如果识别软件评估分析样本的细菌抗菌谱的图像与对应于所述参照细菌菌种的所述参照表型的参照图像之间的相似性百分比不小于最小可接受阈值相似性百分比，优选为最小可接受阈值相似性百分比的至少70％，更优选至少80％，则确定分析样本的细菌表现所述参照细菌的所述参照表型。

识别软件使得可以确定分析的图像和参照图像之间的所述最小可接受的相似性百分比，下面称为相似性阈值。

在一个实施方案中，因此可以确定适用于所有参照表型的共同相似性阈值。

在另一个实施方案中，确定每种参照细菌菌种的每种参照表型的p种不同菌株的不同抗菌谱的所述不同参照图像之间的最小可接受相似性百分比，下文称为参照相似性阈值，优选确定参照相似性阈值百分比，其对应于每种参照细菌菌种的每种参照表型的两种最不同的参照图像之间的最低相似性百分比，如果识别软件评估相似性百分比不小于分析样本的细菌抗菌谱的图像与对应于所述参照细菌菌种的所述参照表型的参照图像之间的所述参照相似性阈值，则分析样本的细菌被确定为表现所述参照细菌的所述参照表型。

在变化实施方案中，所述参照表型是给定的抗生素或抗生素组合抗性或敏感性分类。

在该变化中，抗菌谱可以是E检验，软件可以读取在含有单一抗生素的浓度梯度的条带上提及的最小抑制浓度(CMI)值，其中CMI是在条带周围的椭圆环的最窄端处的值。因此，本发明的方法使得可以避免当操作者用肉眼读取CMI时频繁出现的错误。

在另一变化的实施方案中，参照表型是多种抗生素和/或抗生素组合的抗性或敏感性分类，优选在以薄片形式的基底中。

优选地，所述参照表型包括两种抗生素间的协同作用表型，所述两种抗生素对应于这样两种抗生素，即当两种抗生素单独使用时对于参照细菌是抗性的，并且当两种抗生素组合使用时对于参照细菌是敏感的。这种协同作用现象可以通过在对应于两种抗生素的两个薄片之间的间隔出现抑制区域来识别，参照细菌对于所述两种抗生素是抗性的。

更具体地，所述参照细菌的菌种选自较常见的细菌，即代表引起人类最常见病理的细菌的约80％，并且至少包括大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae)、奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)、产酸克雷伯杆菌(Klebsiella oxytoca)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacea)、产气肠杆菌(Enterobacteraerogenes)、粪肠球菌(Entercoccus faecalis)、绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)。

更具体地，抗菌谱使用包含以下抗生素的薄片制备，并具有对应于以下抗生素的以下标记：AMX用于阿莫西林；AMC用于阿莫西林-克拉维酸；GEN用于庆大霉素；SXT用于甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(磺胺甲基异恶唑)；TIC用于替卡西林；TCC用于替卡西林-克拉维酸；TZP用于哌拉西林-他唑巴坦；CAZ用于头孢他啶；IMP用于亚胺培南；COL或CL用于粘菌素；FOX用于头孢西丁；VAN或VA用于万古霉素；TEC用于替考拉宁；CLI或DA用于克林霉素；CRO用于头孢曲松；FEP用于头孢吡肟；L或LIN用于林可霉素；FUR或NT用于呋喃妥因；CIP用于环丙沙星；OFX用于氧氟沙星；CTX用于头孢噻肟；AK或AN用于阿米卡星；TOB或TM用于妥布霉素；FOX用于头孢西丁；ATM用于氨曲南；ERT用于厄他培南；FF或FOS用于磷霉素；DO用于多西环素；K用于卡那霉素；L或LIN林可霉素；LNZ用于利奈唑胺；NA用于萘啶酸；NOR用于诺氟沙星；MET用于甲硝唑；MEM用于美洛培南；PT用于普那霉素；P用于青霉素G；RA用于利福平；TGC用于替加环素；TEL用于泰利霉素；E用于红霉素和OX或OXA用于苯唑西林。

更具体地，本发明人已经确定了尤其适合于测试引起人类病理的细菌的特定参照表型，所述人类病理尤其是在尿中可检测的，并且由上述抗生素治疗，参照表型是抗性分类或选自以下至少一种表型：

·被称为“野生”的表型：对抗生素不具有获得性抗性的细菌，所述细菌可能具有天然抗性；

·称为“低水平青霉素酶”的表型：产生青霉素酶的细菌，能够在青霉素家族的低抗生素浓度，即低于8毫克/升(mg/L)的浓度下抑制细菌的生长；

·被称为“对抑制剂有抗性的青霉素酶”的表型：产生青霉素酶的细菌，其对所有认为能够使该酶失活的青霉素酶抑制剂具有抗性；

·被称为“高水平青霉素酶”的表型：产生青霉素酶的细菌，能够在青霉素家族的高抗生素浓度，即高于8mg/L的浓度下抑制细菌的生长；

·称为“广谱β-内酰胺酶(ESBL)”的表型：产生β-内酰胺酶的细菌；

·称为“高水平头孢菌素酶”的表型：产生头孢菌素酶的细菌，能够在头孢菌素家族的高抗生素浓度，即高于2mg/L的浓度下抑制细菌生长；

·称为“碳青霉烯酶(Carbapénèmase)”的表型：产生碳青霉烯酶的细菌；

·称为“亚胺培南的选择渗透性”的表型：对亚胺培南具有中等敏感性的细菌；

·“甲氧西林抗性”(以前名称为M组的青霉素，现在由苯唑西林替代，其中所述苯唑西林是属于M组青霉素亚家族的青霉素)，通过获得对β-内酰胺抗生素(B-Lactamines)没有亲和力的新靶标(青霉素结合蛋白2a(PLP2a))对甲氧西林抗性(＝苯唑西林抗性)的细菌；

·称为“氟喹诺酮抗性”的表型：在氟喹诺酮家族的抗生素化合物存在下生长不受抑制的细菌；

·被称为“氨基糖苷抗性”的表型：在氨基糖苷家族的抗生素化合物存在下生长不受抑制的细菌；

·被称为“大环内酯抗性”的表型：在大环内酯家族抗生素化合物存在下生长不受抑制的细菌；

·表型“磺胺甲基异恶唑抗性”：在磺胺甲基异恶唑存在下生长不受抑制的细菌；

·被称为“利福平抗性”的表型：在利福平存在下生长不受抑制的细菌；和

·称为“非典型表型”的表型：未知或不能确定的表型。

青霉素酶是能够破坏(水解)青霉素并使其相对于细菌失活的酶。

头孢菌素酶是能够破坏(水解)头孢菌素并使其相对于细菌失活的酶。

碳青霉烯酶是能够破坏(水解)碳青霉烯并使其相对于细菌失活的酶。

β-内酰胺酶是能够水解青霉素、头孢菌素和单酰胺菌素如氨曲南，而不能水解碳青霉烯或头孢霉素例如头孢西丁的酶。

更具体地，分析的抗菌谱和/或所述数据库包括参照细菌菌种的参照表型，其对应于相对于选自以下组a1)-a6)的六种抗生素化合物的浓度的以下抗性(I，R)或敏感性(S)，优选每组按照以下顺序排列成圆形：

a1)AMX，AMC，TCC，CRO，FEP和IMP，

a2)AMX，AMC，TZP，CRO，FEP和IMP，

a3)AMC，TZP，CRO，FEP，IMP和COL，

a4)AMX，GEN，LIN，FUR，VAN和TEC，

a5)TIC，TCC，TZP，FEP，CAZ和IMP，和

a6)FOX，CLI，SXT，GEN，VAN和TEC。

这些组a1)-a6)对于上述列出的细菌的以下表型尤其相关：

·表型“野生”，

·表型“低水平青霉素酶”，

·表型“对抑制剂有抗性的青霉素酶”

·表型“高水平青霉素酶”

·表型“广谱β-内酰胺酶”(ESBL)，

·表型“高水平头孢菌素酶”，

·表型“碳青霉烯酶”

·表型“亚胺培南的选择渗透性”

·“甲氧西林抗性”，和

·表型“非典型表型”。

更具体地，分析的抗菌谱和/或所述数据库包括以下参照细菌菌种的参照表型，其对应于相对于选自以下组b1)和b2)的16种抗生素化合物的以下抗性(I/R)或敏感性(S)，优选地使它们的薄片从右侧第一行开始按以下的顺序排列在矩形网格中，对于每组四行四个化合物排成列：

b1)CIP，OFX，TIC，COL，IMP，CTX，TCC，AK，SXT，AMC，CRO，TOB，AMX，ATM，FOX，和GEN，和

b2)SXT，DA，FOX，OXA，PT，GEN，CIP，RA，TEC，VAN，LNZ，FF，TOB，E，DO和NT。

这些组b1)和b2)对于上述列出的细菌的以下表型尤其相关：

·表型“野生”，

·表型组合“高水平青霉素酶”+“氟喹诺酮抗性”+“磺胺甲基异恶唑抗性”+“氨基糖苷抗性”，和

··表型组合“头孢菌素酶”+“氟喹诺酮抗性”+“磺胺甲基异恶唑抗性”+“氨基糖苷抗性”，和

··表型组合“头孢菌素酶+“磺胺甲基异恶唑抗性”+“氨基糖苷抗性”，和

··表型组合“甲氧西林抗性”+“氟喹诺酮抗性”+利福平抗性”+“大环内酯抗性”+“氨基糖苷抗性”。

例如，上述十六种薄片的参照表型对于所谓的“深”感染比如败血症更为尤其有用。

更具体地，在步骤a)中，使用确定的方法，在Muller-Hinton琼脂类型的固体培养介质上，制备参照抗菌谱和分析的细菌样本的抗菌谱，所述方法包括：

·数目(n)6至16个具有范围1μg至300μg的抗生素浓度的盘形式的薄片，以圆形或矩形网格排列；

·分析或参照的样本的确定的细菌浓度(CFU/mL)沉积在所述固体培养介质上，对应于具有不透明度符合McFarland范围内的0.5标准的沉积悬浮液；

·确定的孵育条件和持续时间优选为37℃下18小时至24小时。

更具体地，薄片在培养介质上排列成六个圆形，或者在方形皿中排列在规则的网格上，优选具有16个方形。

在阅读通过非限制性说明给出的以下描述并参考附图时，本发明的其它特征和优点显而易见，其中：

附图说明

图1A和图1B显示了在抗菌谱中识别整体图像轮廓的原理；图1A显示了图1B的图像中的一组抑制区域1至6的总体轮廓；

图2A至图2C是ESBL表型的大肠杆菌菌株的抗菌谱的照片图像，通过本发明方法识别为属于相同表型，相似性百分比在87％至100％的范围；

图2D和图2E是头孢菌素表型的大肠杆菌菌株的抗菌谱的照片图像，通过本发明的方法识别为属于相同表型，相似性百分比为75％；

图3A和图3B是产生高水平青霉素酶的大肠杆菌菌株的抗菌谱的两张照片，并且通过本发明方法识别其相似百分比为80％；

图4A和4B是通过本发明的方法未被识别属于相同表型的表型抗菌谱照片，图4A显示对所有抗生素敏感的大肠杆菌菌株，而图4B显示对所有抗生素具有抗性的大肠杆菌菌株；

图5是两片薄片之间的ESBL表型的大肠杆菌菌株的香槟软木塞形状的协同作用区域的图像(A)，所述两片薄片一个是AMC另一个是CRO；以及

图6A和图6B是相同头孢菌素酶表型的两株肺炎克雷伯杆菌在方形中排列的抗菌谱的照片，并且通过本发明的方法识别相似性百分比为88％。

具体实施方式

目前专家委员会的建议是大约100页的小册子，其中包括对较常见的细菌菌种的数十种抗生素的SIR解释。对于给定的抗生素类型，生物学家可以根据这些建议中的提议，决定测试一种或多种抗生素。在实践中，只有少数抗生素是用于解释的关键抗生素，尤其是对临床医生来说是有用的抗生素，例如如果期望使用青霉素治疗患者，可能仅使用列表中的一个分子。在下面的说明性实施例中，发明人已经确定了六种抗生素，它们代表其它抗生素，用以确定在人类病理中最普遍的十种细菌的某些表型。

1)制备抗菌谱。

使用以下标准方法制备抗菌谱。

1.1)准备细菌样本

接种物通过以下制备：制备直接来自菌落的细菌的悬浮液，放入管中的无菌水中形成溶液，使得溶液表现准确的不透明度，所述不透明度用分光光度计测定，相当于McFarland范围的0.5标准的不透明度。这种细菌悬浮液浓度是标准化的，因为越浓缩的接种物将导致越小的抑制区域的直径，反之亦然。

接种物对应于浓度约为108CFU/mL的大肠杆菌、肺炎克雷伯杆菌、奇异变形杆菌、产酸克雷伯杆菌、阴沟肠杆菌、产气肠杆菌、粪肠球菌、绿脓假单胞菌、金黄色葡萄球菌和表皮葡萄球菌。这些是在人类病理中最常遇到的十种细菌。

1.2)将细菌样本沉积在直径为90mm的有盖培养皿中或在侧边为120mm的方形皿中的固体培养介质上，介质由特异于(EUCAST)抗菌谱的Muller-Hinton琼脂构成。理想情况下，应在制备悬浮液后15分钟(min)内使用。

通过在琼脂介质上扩散的方法进行接种，该方法通过过量的细菌悬浮液加入到Muller-Hinton琼脂中充满。均化后，弃去过量的液体以避免过度接种皿。有必要事先等待琼脂表面干燥，以除去促进细菌入侵的任何微量的水分。

在接种琼脂后15分钟内，沉积抗生素薄片的盘。使用自动点胶机沉积抗生素浸渍的盘，所述自动点胶机将盘牢固地放置在接种并干燥的琼脂的表面上。由于抑制区域重叠，为了限制抗生素之间的干扰，每皿放置的盘数受到限制。测量抑制直径是重要的。然后将抗菌谱在37℃下孵育18小时(h)至24小时。

抗生素薄片由直径为6mm的高品质吸水纸制成，并且依据抗生素，它们以范围约1微克(μg)至300μg的浓度浸渍抗生素。

在以下的实施例中，使用的参照盘由供应商i2a(Montpellier,法国)、BD(BectonDickinson,美国)、Bio-Rad(Hercules,美国)、Biomerieux(Marcy l'Etoile,法国)销售，其含有以下抗生素并带有以下代码和以下剂量：AMX(阿莫西林)25μg:AMC(阿莫西林-克拉维酸)20μg-10μg；GM用于庆大霉素,15μg；SXT(甲氧苄啶-磺胺甲恶唑)1.25/23.75μg；TIC(替卡西林)75μg；TCC(替卡西林-克拉维酸)75/100μg；TZP(哌拉西林-他唑巴坦)75/10μg；CAZ(头孢他啶)30μg；IMP或IPM(亚胺培南)10μg；COL(粘菌素)50μg；FOX(头孢西丁)30μg；VAN(万古霉素)30μg；TEC(替考拉宁)30μg；CLI或DA(克林霉素)2μg；CRO(头孢曲松)30μg；CIP(环丙沙星)5μg；OFX(氧氟沙星)5μg；CTX(头孢噻肟)5μg；AN或AK(阿米卡星)30μg；TM(妥布霉素)10μg；FOX(头孢西丁)30μg；ATM(氨曲南)30μg；ERT(厄他培南)10μg；FF(磷霉素)200μg；DO(多西环素)30μg；K(卡那霉素)1000μg；L(林可霉素)15μs；LNZ(利奈唑胺)10μg；AN(萘啶酸)30μg；NOR(诺氟沙星)10μg；PT(普那霉素)15μg；RA(利福平)5μg；和E(红霉素)15μg。

更确切地说，如下制备琼脂：

·琼脂接种有1毫升(mL)的悬浮液，并用涂布器将容量从中心扩散到边缘，直到整个表面被接种：

·将其干燥3分钟至5分钟；

·将抗生素盘放在皿的底部位置(距离边缘具有某些最小距离)；通过将皿分成与薄片一样多的部分(对于圆形的90mm的皿最多为六份，对于120mm的皿最多为16份)，即，对于圆形皿，围绕圆规律地间隔开2.5厘米的间距，或者对于方形皿，矩形网格间距为3厘米；以及

·在37℃孵育18小时至24小时。

2)读取和解释抗菌谱：

孵育期后，可以看到圆环出现在抗生素盘周围。这些区域对应于细菌生长的抑制直径。对于存在于琼脂上的每种抗生素，由于抗生素浓度梯度，如上所述，存在抑制生长的区域。由于照片是在黑色背景上拍摄的，所以抑制圆环显得更暗，因此在没有细菌生长的区域中，对比度最大。

为了建立参照抗菌谱的库，所述参照抗菌谱适合构成参照细菌的参照表型的参照图像数据库，手工测量圆环的直径，并使用表格和图表来解释它们，如下表A中列出的。

2.1)以大肠杆菌为例，例如期望发现其相对于各种碳青霉烯包括亚胺培南的敏感性，EUCAST[1]和CA-SFM的建议见下表：

表A

对于10μg的抗生素剂量，以mm计的临界直径在<16mm至≥22mm的范围内，这意味着如果直径大于或等于22mm，则菌株对亚胺培南敏感，如果直径在16mm至小于22mm的范围内，该菌株对所讨论的抗生素具有中等的敏感性，以及如果直径小于16mm，则该菌株对亚胺培南具有抗性。

2.2)因此，使用下表B所列的参照细菌的206个细菌样本和抗生素薄片(六个具有六种不同抗生素的薄片)，制备了具有以下表C1所列的以下参照表型的参照细菌样本库。

表B

表C1列出了被试参照细菌菌种的各种参照表型，其对应于它们相对于抗生素的抗性或敏感性，其中：

·表型和抗生素代码具有上述含义；

·S表示：对在所述薄片中含有的抗生素或抗生素的组合敏感，薄片周围的抑制圆环的直径大于对应于低临界浓度的直径；

·R表示：对在所述薄片中含有的抗生素或抗生素的组合具有抗性，薄片周围的抑制圆环的直径小于对应于高临界浓度的直径；和

·I表示：相对于在所述薄片中含有的抗生素或抗生素的组合是中等的，薄片周围的抑制圆环的直径位于对应于低临界浓度的临界直径值和高临界浓度的临界直径值之间。

所述数据库含有参照细菌菌种的参照表型，其对应六种抗生素化合物的浓度的相应的抗性(I、R)或敏感性(S)，如表C1所述：

上表C1的薄片在抗菌谱上依次排列为圆形，以在表中从左到右的列顺序，对应围绕圆形的顺时针顺序。

ESBL表型包括头孢曲松与克拉维酸之间的协同作用表型，以及因此在CRO和TCC或AMC之间(对于表中的所有ESBL细菌)。

2.3)本发明人已经证实，该软件还可以识别在具有更多抗生素的方形皿上制备的抗菌谱。他们已经准备了二十五张十六个薄片的抗菌谱，包括：AMX 25μg；AMX 20μg-10μg；GM或GEN 15μg；SXT 1.25μg/23.75μg；TIC 75μg；TCC 75μg/10μg；IMP或IPM 10μg；COL 50μg；CRO 30μg；CIP 5μg；OFX 5μg：CTX 5μg；AN或AK 30μg；TOB 10μg；FOX 30μg；ATM 30μg，CLI或DA 2μg，30μg，30μg，VA或VAN 30μg，FF 200μg，E 15μg，NT或FUR 300μg，PT 15μg，TEC 30μg，LNZ 10μg。

所述数据库包含以下参照表型或以下参照细菌菌种，其对应针对下表C2中提及的16种抗生素的抗性(I/R)或敏感性(S)，其中薄片从右侧第一行开始按以下的顺序排列在矩形网格中，对于每组四行的四个化合物排成列：

表C2

例如，上述十六种薄片的参照表型对于所谓的“深”感染比如败血症更为尤其有用。

3)参照图像库以及通过比较抗菌谱照片图像根据本发明进行解释。

3.1)使用来自法国的Interscience的包括

1200 Interscience ref.437000扫描仪的图像捕获装置拍摄照片。

使用高分辨率扫描仪以标准化的方式拍摄图像，将待拍摄的皿放置在扫描仪中，并且每个场合的亮度、高度以及照片像素的质量都是相同的。每张照片在相同条件下拍摄：

·平坦黑色背景

·使用针对黑色背景以下和/或以上的六种白光组合，通过软件自动调整相同的光/相同亮度

·相同的图像捕获设备：

1200 Interscience ref.437 000

·相同的距离10厘米

·1.5至3范围内的相同尺度。

它提供了分辨率至少为1280×960像素的照片。

3.2)最初，发明人仅寻求通过将该数量限制在较小的数值来标准化抗生素的数量，尤其是针对最常见细菌的单一皿中只有六种抗生素。这导致他们在大量样本上测试该技术的再现性和重复性，以便能够使其自动化。为此，他们拍摄了所有结果的照片，从而建立了具有这些图像的一个数据库。从大量照片中，他们将它们相互比较，发现观察到每种表型的照片似乎是相互可识别的，即使它们是不同的。换句话说，似乎可以基于抗菌谱的一般图像来识别细菌的表型，而不直接测量抗菌谱上的抑制直径，并且不需要使用EUCAST解释数据来解释它们。

此后，他们试图通过使用自动图像识别软件确认此识别。为此，他们利用了可以在线下载的XnView图像识别软件(http://www.xnview.com/fr/，Gougelet Pierre-Emmanuel，10rue Renéde Chateaubriand，La Neuvilette 51100 Reims，法国)。该软件可以创建图像库目录，然后以靶向的方式(在不同的目录中)搜索装有类似图像的计算机，或者在计算机的所有存储盘中搜索。因此，该软件不会受到与所讨论的搜索无关的图像的“干扰”。

与图像库中的照片相比，软件还给出了相片的相似性百分比。每张照片对应于已扫描的叶片。通过扫描仪扫描叶片，以获得白色背景上的绿色叶片，以便简单地分割叶片。此后，图像的颜色被转换成灰度级。通过顺序分析跟踪图像的二进制轮廓。如果找到一个像素，软件会搜索最接近点的极限，以便仅识别轮廓。仅考虑图像的最长边界，将两个目标和孔之间的其它边界视为构成噪声。

发现这样的软件适用于识别抗菌谱的照片，因为只有抑制直径在表型间变化，这导致抗菌谱的整体图像的轮廓的变化，如图1A和图1B所示。因此，该软件能够间接地识别各种抑制直径，并且通过比较作为整体的抗菌谱的图像来产生其表型解释。

图像识别软件将分析的抗菌谱的照片与从参照抗菌谱制备的图像库的参照图像进行比较，实际上它能够识别表现至少70％的相似性或相似度的菌株的照片，如果有的话，从而给出与测试样本相对应的参照表型。如果图像被软件识别为相对于参照图像具有至少70％的相似性，那意味着该细菌具有与参照图像相同的表型，并且软件因此可以赋予其表型。

另一部被开发用于识别图像比如某些植物的叶片照片并从中推导出植物的种类的软件(Novotny P，Suk T(2013)，Leaf recognition of woody species in centralEurope，J.Clin.Microbiol.)，与在事先构成的现有数据库中可以发现的照片相比较，也能够识别抗菌谱的照片。更具体地说，该软件能够通过参照具有给定种类的叶片的多张照片的叶片数据库，使用叶片识别树的种类，这仅通过比较叶片的轮廓而不考虑任何内部或外部轮廓，并且它以轮廓的形状通过类比来确定树的种类。

因此，在验证期间可以与表型同时自动提供治疗建议，以便临床医生拥有所有数据。

因此，以大肠杆菌为例，发明人开始从大肠杆菌的42个临床分离株的抗菌谱的照片中创建照片目录。在这42张照片中，他们为每个给定的表型选择了几张。每个照片都被赋予一个新的名称作为其表型的函数，并且询问软件是否可以识别与参照表型相似的其它表型，以发现软件开始出现关于表型识别的错误相似性百分比。

通过以5％的步骤逐步降低相似性百分比，发现为使该软件无错误地识别相同表型的不同抗菌谱的照片所需的最小相似性百分比为70％。

图2A至2C显示了XnView图像识别软件能够给出具有以下相似性的ESBL表型大肠杆菌细菌正确的表型：

·图2A和图2B的图像之间为100％；和

·图2A和图2C的图像之间为87％。

图2D和图2E示出了XnView图像识别软件能够给出具有以下相似性的头孢菌素酶表型大肠杆菌细菌正确的表型：

·图2D和图2E的图像为74％，和

·图2A和图2D的图像之间为65％，主要区别在于对于ESBL，AMX和TCC之间存在协同作用区域(图2A至2C)，以及对于头孢菌素酶表型，AMX和TCC之间缺失协同作用区域。

图3A和3B示出了软件能够从42个表现多种表型的大肠杆菌样本的42张照片的数据库中，识别表现相同的“高水平青霉素酶”表型大肠杆菌细菌的照片，并且具有相似性为80％。

图4A和图4B是两种大肠杆菌菌株的抗菌谱照片：图4A的菌株对所有测试的抗生素敏感(野生菌株)，而图4B的菌株对所有抗生素具有抗性。

图5显示可以通过显示两种抗生素之间向上的协同作用机制的协同作用的图像，来解释非常特定的抗性机制。

在图5中，具有广谱β-内酰胺酶(ESBL)抗生素抗性机制的大肠杆菌细菌在两种特定抗生素之间表现协同作用：头孢曲松(β-内酰胺家族的第三代头孢菌素)和阿莫西林+克拉维酸组合(阿莫西林是氨基青霉素+β-内酰胺酶抑制剂)。这种协同作用可以直接在琼脂上看到，因为在并排放置的这些抗生素的两个薄片之间出现一个“香槟软木塞”形状的小抑制区域，并且这些抗生素通常相对于该菌株具有抗性。识别抗菌谱的整体图像，能够鉴定两种抗生素之间的这种协同作用机制类型。

发明人已经证实，该软件还可以识别用方形皿制备并具有更多数量的抗生素的抗菌谱。他们制备了十六个薄片的二十五张抗菌谱，每个具有上述的各种表型。

图6A和图6B显示，该软件能够从9个表现各种表型、具有88％相似性的肺炎克雷伯杆菌样本的9张照片的数据库中，识别表现出肺炎克雷伯杆菌细菌相同表型(“头孢菌素酶+氨基糖苷抗性和磺胺甲基异恶唑抗性”)的抗菌谱的图片。

该软件能够将具有至少70％相似性的照片识别为具有相同表型的相同参照细菌的照片。

这种相似性比例保证对颜色的识别，对抗生素代码的字母的识别，和对标记在盘上的浓度剂量的数字的识别，以及对圆环的图像的轮廓的识别。沉积在琼脂上的每种抗生素具有用于识别的两个或三个字母的代码(对应于抗生素名称的缩写)，并用于验证存在于琼脂上的抗生素确实是正确的抗生素。抗生素的剂量也被标记。例如，在亚胺培南盘上可以看到代码“IPM 10μg”，其对应于10μg剂量的亚胺培南的盘。最后，软件识别以圆形或方形排列的薄片是正确的。

图像的轮廓和形状是两个不同的概念。图像的形状包括图像的整体形状，而在本说明书中图像的轮廓是指图像的单个部分，比如，例如仅仅是抑制区域的轮廓，如图1A和图1B中所见的。

假设对于单个表型，直径可以变化(参见上面，例如在16mm至22mm的范围为I，如果>16为R，或者如果>22为S)，在数据库中相同表型的参照图像的数量越大，识别表型越好，即使在不改变解释的情况下，直径也有一点差异。

在已知图像的数据库的基础上，无论数据库中的图像数量如何，该软件能够以快速的方式同时搜索最相似的图像。此外，软件可以自动产生完整的解释以及各种分析报告和治疗建议(评论等，取决于专家委员会的建议)。

软件的使用包括以下步骤：

a)选择含有待分析的抗菌谱的照片的文件；

b)从工具中选择“搜索类似文件”，以便能够进行图像识别；

c)选择含有参照图像库的文件以与待分析的图像进行比较；和

d)指定相似性百分比，例如，相似性百分比为73％。

比较使得每对图像产生计算出的相似性值，并且如果该值大于73％的最小容差，则该对被认为是相似的，并且两个图像属于相同的参照表型。

参照图像库可以扩展到人类中经常发现的所有细菌，即约200种不同的细菌菌种，或实际上扩展到所有细菌(已经在人类中至少一次分离出约2000种)。

添加参照图像用于改善解释，并针对给定表型增加相似性阈值百分比。

参考文献

1)Journal of Clinical Microbiology,1998 302-304页,36卷,No.1,KentKorgenski等人.

2)Journal of Clinical Microbiology,2000年4月,1688-1693页,38卷,No.4.

3)Clinical Microbiology and Infection,10卷,No.5-2004Kolbert等人.

4)Journal of Clinical Microbiology,2005年4月,1846-1850页,43卷,No.4–Bert等人.

5)Journal of Microbiological Methods,2008,75卷,177-181页.

6)International Journal of Antimicrobial Agents,45(215)61-65–Lepage等人.

Claims (14)

1.一种自动分析和解释分析的细菌样本的抗菌谱的方法，所述方法用于确定对至少一种抗微生物化合物的抗性或敏感性的表型，所述表型选自多种不同种类的参照细菌中的每种参照细菌种类的多种不同的参照表型，其中：

a)使用确定的方法，在固体培养介质上，制备分析的细菌样本的抗菌谱，所述方法包括：

·在所述固体培养介质上，沉积确定浓度的细菌样本，所述细菌样本的浓度单位为CFU/mL；

·在所述固体培养介质上，沉积确定数量n的多个基底，其中n在5至20的范围，所述基底以确定的排列和确定的形式，每个含有确定浓度的确定的抗微生物化合物，并且对于n个所述基底中的每一个适合于扩散一种确定的抗微生物化合物；和

·在确定的条件下以及确定的持续时间，孵育沉积在所述固体培养介质上的细菌样本；和

b)获取在步骤a)中获得的抗菌谱的照片图像；和

c)通过使用图像识别软件将步骤b)中获得的照片图像与由参照图像组成的数据库中的参照抗菌谱的参照图像进行比较，确定分析的细菌样本的所述表型，对于每种参照细菌种类的每种参照表型，所述数据库包含多种相同细菌的p种不同菌株的抗菌谱的至少p种不同的参照图像，其中p在6至42的范围，其中所述图像识别软件用于比较对应于基底周围的抑制区域的圆环轮廓的形状。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，所有参照抗菌谱使用与分析的细菌样本的抗菌谱相同方法制备，并且所述参照图像和分析的图像是用相同的照片图像捕获装置和在相同条件下拍摄的，所述相同条件是相同的距离、相同的亮度、相同的背景，以及相同分辨率。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤c)中，其中所述基底是抗生素薄片，且在抗生素薄片上指定抗生素代码字母和剂量数字。

4.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，确定分析的图像和参照图像之间的最小可接受的相似性百分比，下文称为相似性阈值，如果识别软件评估分析样本的细菌抗菌谱的图像与对应于所述参照细菌菌种的所述参照表型的参照图像之间的相似性百分比不小于70％，则确定分析样本的细菌表现所述参照细菌的所述参照表型。

5.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，确定每种参照细菌菌种的每种参照表型的p种不同菌株的不同抗菌谱的所述不同的 参照图像之间的最小阈值相似性百分比，下文称为参照相似性阈值，确定参照相似性阈值百分比，其对应于每种参照细菌菌种的每种参照表型的两种最不同的参照图像之间的最低相似性百分比，如果识别软件评估分析样本的细菌抗菌谱的图像与对应于所述参照细菌菌种的所述参照表型的参照图像之间的相似性百分比不小于参照相似性阈值，则分析样本的细菌被确定为表现所述参照细菌的所述参照表型。

6.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述参照表型是给定的抗生素或抗生素组合抗性或敏感性分类。

7.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，参照表型是多种抗生素和/或抗生素组合的抗性或敏感性分类。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述参照表型包括两种抗生素间的协同作用表型，所述两种抗生素对应于这样两种抗生素，即当两种抗生素单独使用时对于参照细菌是抗性的，并且当两种抗生素组合使用时对于参照细菌是敏感的。

9.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，所述参照细菌菌种选自大肠杆菌Escherichia coli、肺炎克雷伯杆菌Klebsiella pneumoniae、奇异变形杆菌Proteusmirabilis、产酸克雷伯杆菌Klebsiella oxytoca、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacea、产气肠杆菌Enterobacter aerogenes、粪肠球菌Entercoccus faecalis、绿脓假单胞菌Pseudomonas aeruginosa、金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus和表皮葡萄球菌Staphylococcus epidermidis。

10.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，抗菌谱使用包含以下抗生素的薄片制备，并具有对应于所述抗生素的以下标记：AMX用于阿莫西林；AMC用于阿莫西林-克拉维酸；GEN用于庆大霉素；SXT用于甲氧苄啶-磺胺甲恶唑；TIC用于替卡西林；TCC用于替卡西林-克拉维酸；TZP用于哌拉西林-他唑巴坦；CAZ用于头孢他啶；IMP用于亚胺培南；COL或CL用于粘菌素；FOX用于头孢西丁；VAN或VA用于万古霉素；TEC用于替考拉宁；CLI或DA用于克林霉素；CRO用于头孢曲松；FEP用于头孢吡肟；LIN用于林可霉素；FUR或NT用于呋喃妥因；CIP用于环丙沙星；OFX用于氧氟沙星；CTX用于头孢噻肟；AK或AN用于阿米卡星；TOB或TM用于妥布霉素；ATM用于氨曲南；ERT用于厄他培南；FF或FOS用于磷霉素；DO用于多西环素；K用于卡那霉素；LNZ用于利奈唑胺；NA用于萘啶酸；NOR用于诺氟沙星；MET用于甲硝唑；MEM用于美洛培南；PT用于普那霉素；P用于青霉素G；RA用于利福平；TGC用于替加环素；TEL用于泰利霉素；E用于红霉素和OX或OXA用于苯唑西林。

11.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，参照表型是抗性分类或选自以下表型：

·“野生”表型，

·“低水平青霉素酶”表型，

·被称为“对抑制剂有抗性的青霉素酶”的表型，

·“高水平青霉素酶”表型，

·“广谱β-内酰胺酶ESBL”表型，

·“高水平头孢菌素酶”表型，

·“碳青霉烯酶”表型，

·“亚胺培南的选择渗透性”表型，即对亚胺培南具有中等敏感性的细菌，

·“甲氧西林抗性”表型，

·“氟喹诺酮抗性”表型，

·“氨基糖苷抗性”表型，

·“大环内酯抗性”表型，

·“磺胺甲基异恶唑抗性”表型，

·“利福平抗性”表型，和

·称为“非典型表型”的表型，即未知或不能确定的表型。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，分析的抗菌谱和/或所述数据库包括参照细菌菌种的参照表型，其对应于参照细菌相对于选自以下组a1)-a6)的六种抗生素化合物的浓度的抗性、中等的或敏感性：a1)AMX，AMC，TCC，CRO，FEP和IMP，

a2)AMX，AMC，TZP，CRO，FEP和IMP，

a3)AMC，TZP，CRO，FEP，IMP和COL，

a4)AMX，GEN，LIN，FUR，VAN和TEC，

a5)TIC，TCC，TZP，FEP，CAZ和IMP，和

a6)FOX，CLI，SXT，GEN，VAN和TEC。

13.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，分析的抗菌谱和/或所述数据库包括以下参照细菌菌种的参照表型，其对应于参照细菌相对于选自以下组b1)和b2)的16种抗生素化合物的抗性、中等的或敏感性：

b1)CIP，OFX，TIC，COL，IMP，CTX，TCC，AK，SXT，AMC，CRO，TOB，AMX，ATM，FOX，和GEN，和

b2)SXT，DA，FOX，OXA，PT，GEN，CIP，RA，TEC，VAN，LNZ，FF，TOB，E，DO和NT。

14.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其特征在于，在步骤a)中，使用确定的方法，在Muller-Hinton琼脂类型的固体培养介质上，制备参照抗菌谱和分析的细菌样本的抗菌谱，所述方法包括：

·数目(n)6至16个具有范围10μg至300μg的抗生素浓度的盘形式的薄片，以圆形或矩形网格排列；

·浓度单位为CFU/mL的确定浓度的细菌分析或参照样本沉积在所述固体培养介质上，对应于具有不透明度符合McFarland范围内的0.5标准的沉积悬浮液；和

·确定的孵育条件和持续时间为37℃下18小时至24小时。

Images